JP2003164293A

JP2003164293A - Ｄｎａセンサー本出願は、２００１年９月１８日に出願した、特願３２６９６８（ｊｐｐ２００１−３２６９６８）の優先権を主張し、内容を追加するものである。

Info

Publication number: JP2003164293A
Application number: JP2002111322A
Authority: JP
Inventors: Koji Hayade; 広司早出; Kazunori Ikebukuro; 一典池袋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-09-18
Filing date: 2002-03-09
Publication date: 2003-06-10

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】酸化還元酵素の活性を指標として、標的ＤＮＡ
を高感度に検出する測定法を開発し、簡便で高集積化の
可能な汎用性の高い標的ＤＮＡ検出法を提供すること。【解決手段】酸化還元酵素の一種であるピロロキノリン
キノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素
（ＰＱＱＧＤＨ）あるいはその変異酵素とストレプトア
ビジンを連結したアビジン−酵素複合体を作製し、標的
ＤＮＡと相補的な配列を持つ標識ＤＮＡをプローブとし
て電極上に固定化しこれとビオチン標識標的ＤＮＡとを
ハイブリダイゼーションさせた上でアビジン−酵素複合
体を加え、その酵素活性を指標として標的ＤＮＡを検出
することにより、本発明を完成した。酵素反応により得
られる信号を増幅することができるので高感度なＤＮＡ
の検出が可能になり、更にＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（一塩基多型）の
検出も可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸化還元酵素の酵
素活性を指標として、目的の塩基配列を有するＤＮＡを
検出する原理に関する。

【０００２】

【従来の技術】目的の塩基配列を有するＤＮＡ（以下標
的ＤＮＡと呼ぶ）を検出する場合、それと相補的な塩基
配列を有するＤＮＡを合成し、これをプローブとして標
的とする核酸とのハイブリダイゼーションを検出するの
が一般的である。このハイブリダイゼーションは、一般
に蛍光物質や放射性同位体を結合させたプローブ、すな
わち蛍光物質や放射性同位体で標識したプローブを用
い、標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、その結
果生じるプローブの標識物質が発する信号すなわち蛍光
強度や放射活性を測定することによって検出する。これ
らの蛍光や放射活性を測定する方法は、現在のところｎ
Ｍレベルの標的ＤＮＡの検出が可能であり、かなり高感
度の検出が可能になってきているが、今後標的ＤＮＡの
検出は、発病機構解析や薬剤の作用機作解析、さらには
極微少量微生物、ウィルスの検出へ応用されると考えら
れ、さらに高感度な検出、すなわちｐＭ、ｆＭ、ａＭレ
ベルの解析が必要とされる。その為にはプローブから得
られる信号を数千倍から数万倍に増幅する手段が必要と
なる。さらに最近ＤＮＡチップやマイクロアレイのよう
に、一度に多数の標的ＤＮＡを解析する技術が開発さ
れ、標的核酸あるいはプローブを多数集積したチップが
作製され、さらにその集積度の向上が試みられている。
この際に蛍光を測定する場合は蛍光顕微鏡や共焦点レー
ザー顕微鏡、放射活性を測定する場合はシンチレーショ
ンカウンターが必要であり、高集積度のチップを解析す
るためには、高価で大型の機器を必要とする。今後標的
ＤＮＡの検出は、前述したように様々な分野での応用が
期待されており、その為には特殊な分析機器を有する研
究施設や大学、大病院だけでなく様々な場所で標的ＤＮ
Ａの検出が可能になることが必要である。その為には、
例えば酵素反応の生成物を測定できる電極などの簡単な
計測機器を用いて多数の標的ＤＮＡを検出する技術の開
発が必要不可欠である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、酸化還元酵
素の活性を指標として、標的ＤＮＡを高感度に検出する
測定法を開発し、簡便で高集積化の可能な汎用性の高い
標的ＤＮＡ検出法を提供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、酸化還元酵
素の一種であるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵
素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）とスト
レプトアビジンを連結したアビジン−酵素複合体を作製
し、標的ＤＮＡと相補的な配列を持つ標識ＤＮＡをプロ
ーブとして電極上に固定化しこれとビオチン標識標的Ｄ
ＮＡとをハイブリダイゼーションさせた上でアビジン−
酵素複合体を加え、その酵素活性を指標として標的ＤＮ
Ａを検出することにより、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、酸化還元酵素の一種
であるＰＱＱＧＤＨとストレプトアビジンの複合体を、
標的ＤＮＡと、それに相補的な塩基配列を持つ合成ＤＮ
Ａプローブとをハイブリダイゼーションさせた２本鎖Ｄ
ＮＡに結合させ、ＰＱＱＧＤＨの酵素反応を指標として
２本鎖ＤＮＡの形成を検出することによって標的ＤＮＡ
を検出する原理を提供する。酸化還元酵素としては、Ｆ
ＡＤを補酵素とするものでもＰＱＱを補酵素とするもの
でもよい。また酵素の基質としては、あらゆる化学物質
が考えられるが、本ＤＮＡ検出法の汎用性を考えると安
価な糖類が好ましく、その中でも汎用されているグルコ
ースが好ましい。さらに好ましい酸化還元酵素としては
検出の際に共存物質の影響の少ないグルコース脱水素酵
素（ＧＤＨ）があげられ、その中でも正確な検出が可能
なＰＱＱを補酵素とするＰＱＱＧＤＨがよい。より好ま
しくは、ＰＱＱＧＤＨとしてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤ
Ｈである。また遺伝子組み換えにより特性が変化した、
例えば安定性が向上したＰＱＱＧＤＨは更に好ましい。
また、標的ＤＮＡを検出するためには、何らかの方法で
酸化還元酵素が標的ＤＮＡあるいはプローブＤＮＡに結
合できるように修飾することが好ましい。その為にはス
トレプトアビジンで修飾された酸化還元酵素を用いるこ
とが好ましい。その修飾については化学結合を利用した
ものでもよいし、融合タンパク質法により結合されたも
のでもよい。その酵素反応の検出法としては、従来より
よく使われている比色法など様々な方法が利用できる
が、好ましくは測定系を単純化する事が可能で、微小
化、集積化、量産化が可能な電気化学的測定法である。
酵素の活性を指標とすることにより、標的ＤＮＡとプロ
ーブの１：１のハイブリダーゼーションから得られる信
号を数千倍から数万倍に増幅することが可能になる。

【０００６】本発明はまた、本発明の原理に基づくＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＳＮＰ（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）検出キッ
トならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、ＳＮＰセンサーまたはＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＳＮＰチップ及びマイクロアレイを提供す
る。ＳＮＰについては標的配列の一塩基変異を検出する
事が必要であるが、例えば一塩基の違いにより標的ＤＮ
ＡとプローブＤＮＡがハイブリダイゼーションしない測
定条件を工夫したりすることにより本原理に基づいた高
感度検出は可能である。

【０００７】すなわち本発明は以下のＤＮＡの検出原理
に関する。［１］酸化還元酵素の活性を指標にＤＮＡを検出する原
理。［２］［１］において酸化還元酵素がＦＡＤを補酵素と
することを特徴とするＤＮＡを検出する原理。［３］［１］において酸化還元酵素がＰＱＱを補酵素と
することを特徴とするＤＮＡを検出する原理。［４］［１］において酸化還元酵素が糖類を基質とする
ことを特徴とするＤＮＡを検出する原理。［５］［４］において糖類を基質とする酸化還元酵素が
グルコース脱水素酵素であることを特徴とするＤＮＡを
検出する原理。［６］［５］においてグルコース脱水素酵素の補酵素が
ＦＡＤであることを特色とするグルコース脱水素酵素の
活性を指標にＤＮＡを検出する原理。［７］［５］においてグルコース脱水素酵素の補酵素が
ＰＱＱであることを特色とするＤＮＡを検出する原理。［８］ストレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱＱ
を補酵素とするグルコース脱水素酵素。［９］［８］においてストレプトアビジンとＰＱＱを補
酵素とするグルコース脱水素酵素とを架橋性試薬で結合
させることにより調製したストレプトアビジンを化学的
に結合させたＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵
素。［１０］［８］においてストレプトアビジンとＰＱＱを
補酵素とするグルコース脱水素酵素をグルタルアルデヒ
ドで架橋させることにより調製することを特徴とするス
トレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱＱを補酵素
とするグルコース脱水素酵素。［１１］［８］においてストレプトアビジンとＰＱＱを
補酵素とするグルコース脱水素酵素とをヘテロ二架橋性
試薬で結合させることにより調製したストレプトアビジ
ンを化学的に結合させたＰＱＱを補酵素とするグルコー
ス脱水素酵素。［１２］［８］においてストレプトアビジンをＮ−Ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔ
ｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅさらにスルフォニル基によ
り修飾し、またＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素を４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃ
ｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅで
修飾し、これを反応させることにより調製することを特
徴とするストレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱ
Ｑを補酵素とするグルコース脱水素酵素。［１３］［１〜７］の酸化還元酵素がストレプトアビジ
ンで修飾されていることを特色とする１に記載のＤＮＡ
を検出する原理。［１４］［１３］において［８−１２］記載のストレプ
トアビジンを化学的に結合させたＰＱＱを補酵素とする
グルコース脱水素酵素を酸化還元酵素として用いること
を特色とするＤＮＡを検出する原理。［１５］［１３］において融合タンパク質法により調製
されたストレプトアビジンと結合したＰＱＱを補酵素と
するグルコース脱水素酵素を酸化還元酵素として用いる
ことを特色とするＤＮＡを検出する原理。［１６］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、ＰＱＱを補酵素とし、かつ遺伝子組み換えにより特
性が改変された変異グルコース脱水素酵素であることを
特色とするＤＮＡを検出する原理。［１７］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、ＰＱＱを補酵素とし、かつ遺伝子組み換えにより安
定性が向上した変異グルコース脱水素酵素であることを
特色とするＤＮＡを検出する原理。［１８］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、ＰＱＱを補酵素とし、２つのサブユニットが１また
はそれ以上のジスルフィド結合を介して互いに連結され
ていることを特徴とする水溶性グルコース脱水素酵素で
あることを特色とするＤＮＡを検出する原理。［１８ａ］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵
素が、ＰＱＱを補酵素とし、１またはそれ以上のシステ
イン以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されて
いる水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とす
るＤＮＡを検出する原理。［１９］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔ
ｉｃｕｓ由来の［１８、１８ａ］記載の、ＰＱＱを補酵
素とする水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色
とするＤＮＡを検出する原理。［２０］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、アミノ酸配列の４１５番目のセリン残基がシステイ
ン残基で置換されている［１９］記載の、ＰＱＱを補酵
素とする水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色
とするＤＮＡを検出する原理。［２１］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、アミノ酸配列の３４０番目のアスパラギン残基およ
び４１８番目のチロシン残基が両方ともシステイン残基
で置換されている［１９］記載の、ＰＱＱを補酵素とす
る水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とする
ＤＮＡを検出する原理。［２２］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
遺伝子組み換えにより特性が改変された変異グルコース
脱水素酵素であることを特色とする［８〜１２］記載の
グルコース脱水素酵素。［２３］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
遺伝子組み換えにより安定性が向上した変異グルコース
脱水素酵素であることを特色とする［８〜１２］記載の
グルコース脱水素酵素。［２４］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
２つのサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド
結合を介して互いに連結されていることを特徴とする水
溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とする［８
〜１２］記載のグルコース脱水素酵素。［２４ａ］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素
が２つのサブユニットが１またはそれ以上のシステイン
以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されている
水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とする
［８〜１２］記載のグルコース脱水素酵素。［２５］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃ
ｕｓ由来の［２４、２４ａ記載の水溶性グルコース脱水
素酵素であることを特色とする［８〜１２記載のグルコ
ース脱水素酵素。［２６］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
アミノ酸配列の４１５番目のセリン残基がシステイン残
基で置換されている［２５］記載の、水溶性グルコース
脱水素酵素であることを特色とする［８〜１２］記載の
グルコース脱水素酵素。［２７］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
３４０番目のアスパラギン残基および４１８番目のチロ
シン残基が両方ともシステイン残基で置換されている
［２５］記載の、水溶性グルコース脱水素酵素であるこ
とを特色とする［８〜１２］記載のグルコース脱水素酵
素。［２８］［１〜７、１３〜２１］記載のＤＮＡを検出す
る原理を含むＤＮＡ検出キット。［２９］［１〜７、１３〜２１］記載のＤＮＡを検出す
る原理を含むＤＮＡセンサー。［３０］［２８］においてＤＮＡを検出する原理が電気
化学的であることを特色とするＤＮＡ検出キット。［３１］［２９］においてＤＮＡを検出する原理が電気
化学的であることを特色とするＤＮＡセンサー。［３２］［１〜７、１３〜２１］および［２８、３０］
記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきサルモネラを検
出するＤＮＡ検出キット。［３３］［１〜７、１３〜２１］および［２９、３１］
記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきサルモネラを検
出するＤＮＡセンサー。［３４］［１〜７、１３〜２１］および［２８、３０、
３２］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきＳＮＰ
（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｓｍ：一塩基多型）を検出するＳＮＰ検出キッ
ト。［３５］［１〜７、１３〜２１］および［２９、３１、
３３］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきＳＮＰを
検出するＳＮＰセンサー。［発明の詳細な説明］［３６］［１〜７、１３〜２１］および［２８、３０、
３２、３４］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきヒ
トのｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ
−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）
γ２中の開始コドンから３２番目の塩基のＣがＧに変異
したＳＮＰを検出するＳＮＰ検出キット。［３７］［１〜７、１３〜２１］および［２９、３１、
３３、３５］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきヒ
トのＰＰＡＲ γ２中の開始コドンから３２番目の塩基
のＣがＧに変異したＳＮＰを検出するＳＮＰセンサー。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、酸化還元酵素の活性を
指標として目的の塩基配列を有するＤＮＡを検出するこ
とを特徴とする。例として標的ＤＮＡとプローブＤＮＡ
のハイブリダイゼーションの結果生じる２本鎖ＤＮＡを
酸化還元酵素などにより標識し、この酸化還元酵素の反
応を指標としてハイブリダイゼーション形成を検出する
ことができる。酸化還元酵素はＦＡＤを補酵素とするも
のでもＰＱＱを補酵素とするものでもよい。また酵素の
基質としては、あらゆる化学物質が考えられるが、汎用
性を考えると安価な糖類が好ましく、その中でも汎用さ
れているグルコースが好ましい。酸化還元酵素による標
識には、プローブＤＮＡか標的ＤＮＡのどちらかをビオ
チン標識し、酸化還元酵素はストレプトアビジンと結合
させたアビジン−酸化酵素複合体を利用して双方を結合
させることが考えられる。またプローブＤＮＡと酸化還
元酵素とを化学反応を利用して直接連結させることも考
えられる。こうすることにより標的ＤＮＡとプローブＤ
ＮＡのハイブリダイゼーション形成を、酵素活性を測定
することにより検出することができる。

【０００９】好ましくは酸化還元酵素としては、試料中
の溶存酸素の影響を受けない脱水素酵素であり、高価な
基質を必要としないもの、例えばグルコースデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＤＨ）がよい。さらに好ましくは酵素活性の
高いＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素ＰＱＱ
ＧＤＨがよい。当業者は、他の細菌に由来する水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にしたがって標的
ＤＮＡに相補的塩基配列を持つ合成ＤＮＡと結合させる
ことにより、本発明に利用できるプローブを得ることが
できる。これらのプローブ及びそれを含むＤＮＡ検出キ
ット、センサーシステムも本発明の範囲内である。

【００１０】本発明では酸化還元酵素の一例としてＰＱ
ＱＧＤＨを用いたがこれは、ピロロキノリンキノン（Ｐ
ＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）
であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成
する反応を触媒する。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量
約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々の
グラム陰性菌において広く見いだされている。一方、水
溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａ
ｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその存
在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５４８
−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされアミ
ノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６）。
Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤ
Ｈは、ペリプラズムに局在する、分子量約５０ｋＤａの
２つの同一のサブユニットからなるホモダイマーであ
る。ＰＱＱＧＤＨ活性は、ホモダイマー酵素が形成され
る場合にのみ発現され、サブユニット単独ではＰＱＱＧ
ＤＨ活性を示さないことが報告されている。水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨの生理学的役割はまだよく解明されていない。
本酵素は糖尿病の重要なマーカーである血中グルコース
濃度を定量するのに有用であると考えられる。従来、グ
ルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）あるいは
グルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる
酵素法により定量されていたが、ＧＯＤを用いる方法で
はグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を
定量するためカタラーゼあるいはパーオキシダーゼをア
ッセイ系に添加する必要があった。またＧＯＤを用いる
バイオセンサーの開発も進められてきたが、反応が水溶
液中の溶存酸素濃度に依存することから高濃度のグルコ
ース試料には適さないこと、あるいは溶存酸素濃度によ
って測定値に誤差が生じる可能性があった。そこで、こ
れまでのグルコース酵素定量方法に用いられてきた酵素
にかわる新たな酵素としてＰＱＱＧＤＨの応用が注目さ
れている。ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化
活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結
合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要とし
ないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめ
として、アッセイ分野への応用が期待されている。ま
た、その触媒能力が高いことから様々分野への応用が期
待されている。ＰＱＱＧＤＨにおいては、アミノ酸残基
の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のア
ミノ酸残基が付加されていてもよい。特定の領域のアミ
ノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、酵
素の熱安定性や基質に対する親和性を改良することがで
きる（たとえば、特開平１０−２４３７８６、特願平１
１−１０１１４３、特願平１１−１２４２８５を参
照）。これらの改変されたＰＱＱＧＤＨが連結されたプ
ローブも本発明の範囲内である。

【００１１】合成ＤＮＡと酸化還元酵素を結合させる方
法としては、共有結合等の化学的結合を形成させても、
ストレプトアビジンと酸化還元酵素を何らかの方法で結
合させた結合アビジン−タンパク質複合体を作製し、ビ
オチン標識した合成ＤＮＡとのアビジン−ビオチンの結
合を利用してもよい。

【００１２】ストレプトアビジンと酸化還元酵素を結合
させる方法としては、遺伝子工学的手法の融合タンパク
質法を用いて融合タンパク質を作製してもよいし（特願
２０００−３６６２４８を参照）、リンカーを用いてそ
れぞれに化学的結合を形成させてもよい。

【００１３】好ましくはストレプトアビジンはＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｉ由来、より好まし
くは同ＩＦＯ１３４２９株由来のストレプトアビジンあ
るいはストレプトアビジンのビオチン結合部位の蛋白質
をＰＱＱＧＤＨに連結することによりアビジン−酸化還
元酵素複合体を構築できる。

【００１４】アビジン−酢化還元酵素複合体の製造方法本発明のアビジン−酸化還元酵素複合体は、酸化還元酵
素のＰＱＱＧＤＨとストレプトアビジンとをリンカーを
用いて連結させることにより作製することができる。Ｇ
ＯＤ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子の配列は、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８
９），２１７：４３０−４３６に開示される。また、遺
伝子工学的手法によりアビジンと酸化還元酵素の融合タ
ンパク質を作ることにより作製することができる（特願
２０００−３６６２４８を参照）。

【００１５】アビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体の調製につ
いて以下に述べる。培養液から遠心分離などで菌体を回
収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕する。これ
を超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨ活性を含む水溶性画分を
得ることができる。あるいはアビジン−ＰＱＱＧＤＨ複
合体が不溶性の顆粒として産生されている場合には、細
胞破砕液より遠心分離機によって沈澱として顆粒を回収
し、これを尿素等の変性剤で可溶化したのち、透析によ
り蛋白質立体構造を巻き戻し、活性のある融合蛋白質と
して水溶性画分として回収する。あるいは、適当な宿主
ベクター系を用いることにより、発現したアビジン−Ｐ
ＱＱＧＤＨ複合体を培養液中に分泌させることもでき
る。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣな
どにより精製することにより、アビジン−ＰＱＱＧＤＨ
複合体を調製する。

【００１６】酵素活性の測定方法本発明は酸化還元酵素の活性を測定することにより、標
的ＤＮＡを検出する。酸化還元酵素としてＰＱＱＧＤＨ
を用いる場合、本酵素はＰＱＱを補酵素として、グルコ
ースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒
する作用を有する。酵素活性の測定は、様々な方法が考
えられるが、一般にはＰＱＱＧＤＨによるグルコースの
酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸化還元色素
の呈色反応により定量する。呈色試薬としては、例え
ば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ
（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フ
ェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることが
できる。またグルコースの酸化を電気化学的に測定する
こともできる。この場合検出系として電極を用いるが微
小化、集積化、量産化が容易であり汎用性の高い検出シ
ステムを提供することができる。他にも水晶振動子、表
面プラズモン共鳴などによる測定も可能である。

【００１７】ＤＮＡアッセイキット本発明はまた、本発明の原理に従うＤＮＡアッセイキッ
トを特徴とする。典型的には、キットは、本発明のアビ
ジン−酸化還元酵素複合体などを含む酸化還元酵素標識
プローブＤＮＡ、アッセイに必要な緩衝液、電子受容
体、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース
標準溶液、ならびに使用の指針を含む。電子受容体とし
てはＰＭＳ、ＤＣＩＰ、フェリシアン化カリウム、さら
にシトクロームなどを用いることができる。本発明に従
う標識用酸化還元酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾
燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液と
して提供することができる。好ましくは本発明の融合蛋
白質はホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態
で提供し、使用時にホロ化することもできる。

【００１８】ＤＮＡセンサー、ＤＮＡチップ本発明はまた、本発明の原理に従う酸化還元酵素を用い
るＤＮＡセンサー、ＤＮＡチップを特徴とする。例えば
酸化還元酵素の活性測定に電極を利用できるが、電極と
しては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、
この電極上にプローブＤＮＡを固定化する。固定化方法
としては、アビジン−ビオチンの結合を利用する方法、
架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入す
る方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導
電性ポリマー、酸化還元ポリマーで包括固定する方法な
どがあり、その場合フェロセンあるいはその誘導体に代
表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定
あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組
み合わせて用いてもよい。典型的には、アビジン−ビオ
チンの結合を用いてプローブＤＮＡをカーボン電極上に
固定化した後、ビオチン標識標的ＤＮＡとハイブリダイ
ゼーションさせ、アビジン−酸化還元酵素複合体を添加
して酵素反応生成物を電気化学測定することによりハイ
ブリダイゼーション形成を検出する。本発明はまた、本
発明の原理に基づくＳＮＰ（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）
検出キットならびにＳＮＰセンサーまたはＳＮＰチップ
及びマイクロアレイを提供する。ＳＮＰは標的配列の一
塩基変異を検出する事が必要であるが、例えば一塩基の
違いにより標的ＤＮＡとプローブＤＮＡがハイブリダイ
ゼーションしない測定条件を工夫したりすることにより
上記の方法で高感度検出は可能である。一塩基変異があ
るとハイブリダイゼーションしない条件としては温度や
尿素やホルムアミドなどの変成剤を共存させることが考
えられる。またＳＮＰの部位の一塩基だけハイブリダイ
ゼーションさせるシングルベースハイブリダイゼーショ
ン法やミニシーケンシング法（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．
Ｃ．ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９０）６８４
−９２）に本発明を応用することによってもＳＮＰの検
出が可能である。

【００１９】標的ＤＮＡの検出は、以下のようにして行
うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよ
びＣａＣｌ_２、およびメディエーターを加えて一定温度
に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化
カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いるこ
とができる。またこれらのメディエーターに加えてシト
クロームを添加する場合もある。作用電極としてプロー
ブＤＮＡを固定化した電極（例えばカーボン電極）を用
い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡ
ｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。ビオチン標識標的ＤＮＡ
を添加してプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさ
せた後、アビジン−酸化還元酵素複合体（この場合はア
ビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体）を添加して２本鎖ＤＮＡ
を介してＰＱＱＧＤＨをカーボン電極に固定化した後、
電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、
グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。
標準濃度のＤＮＡ溶液により作製したキャリブレーショ
ンカーブに従い、試料中のＤＮＡ濃度を計算することが
できる。

【００２０】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【実施例１】サルモネラ菌侵入性因子関連遺伝子（ｉｎ
ｖＡ）の電気化学的検出標的ＤＮＡとしてサルモネラ菌の侵入性因子関連遺伝子
（ｉｎｖＡ）遺伝子の一部分を用い、酸化還元酵素とし
てＰＱＱＧＤＨを用いてその酵素活性を指標として電気
化学的に標的ＤＮＡを検出した。

【００２１】（１）アビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体の調
製ストレプトアビジン０．３ｍｇをＰＢＳバッファー３０
０μｌ（１４．３μＭ）に溶かし、ＤＩＭＯに溶かした
２０ｍＭＮ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−
ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｉｏ）ｐｒｏｐｉｐｏｎａｔｅ
（ＳＰＤＰ）５０μｌ（２．９ｍＭ）を入れ３０℃で一
晩反応させた。次にＮＡＰ１０カラムに通し、余分なＳ
ＰＤＰ（分子量：３１２．４）を除いた。試料には１２
ｍｇのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）（終濃
度１５６ｍＭ）を加え、ＳＨ基を導入した。次にＰＱＱ
ＧＤＨ４ｍｇをＭＯＰＳバッファー５００μｌ（１６０
μＭ）に溶かし、その中にＳｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍ
ｉｄｙｌ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］
−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔ
ｅ（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を１ｍｇ（４．６ｍＭ）入
れ４℃で一晩反応させた。次にＮＡＰ１０カラムに通
し、余分なＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除くことによりＰＱ
ＱＧＤＨにマレイミド基を導入した。次に４．９μＭの
ＳＨ基を導入したストレプトアビジン）と４．９μＭマ
レイミド基導入ＰＱＱＧＤＨを３０℃で４時間反応さ
せ、アビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体を調製した（図
１）。

【００２２】（２）調製したアビジン−ＰＱＱＧＤＨ複
合体の確認その後調製されたアビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体をゲル
ろ過クロマトグラフィーにて分子量別に分離した。主要
なＰＱＱＧＤＨの活性が得られた画分に対してＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行ったところ、約１１０ｋＤａにバンドが得
られことから、本方法によりアビジン−ＰＱＱＧＤＨ複
合体が構築されたと考えられる。その後アビジン−ＰＱ
ＱＧＤＨ複合体の活性測定、たんぱく質濃度測定を行っ
た結果、酵素の活性値は約１７８Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅ
ｉｎであった。

【００２３】（３）用いた合成ＤＮＡの配列実験に用いたＤＮＡの塩基配列を以下に示す。標的ＤＮ
Ａは、ほとんど全てのサルモネラ菌が保持している遺伝
子の１つである侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）中の
１８ｍｅｒを用いた。電極に固定するプローブＤＮＡは
ターゲットＤＮＡの相補的配列を持つものを用いた。コ
ントロールＤＮＡとしては以下のランダム配列を持つも
のを用いた。それぞれ５′端をビオチン標識したものを
用いた（なお下図でＢｉｏはビオチンを示す。Ａ，Ｃ，
Ｇ，Ｔはそれぞれの核酸塩基を示す）。標的ＤＮＡ：Ｂｉｏ−ＴＣＧＧＣＡＴＣＡＡＴＡＣＴＣ
ＡＴＣプローブＤＮＡ：Ｂｉｏ−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＴＧＡＴ
ＧＣＣＧＡコントロールＤＮＡ：Ｂｉｏ−ＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴ
ＡＣＴＡＴＣＴ

【００２４】（４）カーボンペースト電極へのプローブ
ＤＮＡの固定化アビジンゲル（アビジン約２．０ｎｍｏｌを含む）を２
ＸＳＳＣ（３０ｍＭクエン酸、３００ｍＭＮａＣｌ
バッファー）で洗って凍結乾燥し、その後アビジンゲル
を２０ｍｇカーボンペースト、ミネラルオイル１滴と混
合し、電極の空孔に詰めた。次にビオチン修飾されたプ
ローブＤＮＡ３．０ｎｍｏｌ溶液１００μｌをアビジン
ゲルが練りこまれたカーボンペースト電極に２５℃、３
０分間反応させた。反応バッファーは０．１Ｍリン酸
バッファー、３００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を用
いた。その後０．２×ＳＳＣバッファーを用いて３回洗
い、非特異吸着したビオチンを反応しないようにするた
めに１２ｎｍｏｌアビジン溶液２００μｌを電極に２５
℃、３０分間反応させた。その後０．２×ＳＳＣバッフ
ァーを用いて３回洗った。さらにハイブリダイゼーショ
ン用ブロッキングバッファー（カゼイン）を電極に対し
て２５℃３０、分間反応させ、これを２回繰り返した。
その後０．２×ＳＳＣバッファーを用いて３回洗った。
全体の検出の模式図を図２に示す。

【００２５】（５）プローブＤＮＡ固定化電極への標的
ＤＮＡのハイブリダイゼーション標的ＤＮＡもしくはコントロールＤＮＡ（１０ｎｍｏｌ
／ｍｌ）を電極に固定されているプローブＤＮＡに対し
て４５℃６０分間ハイブリダイゼーションさせた。反応
バッファーは０．１Ｍリン酸バッファー、３００ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を用いた。反応後、０．２×Ｓ
ＳＣバッファーにて３度洗浄した。

【００２６】（６）ハイブリダイゼーションした標的Ｄ
ＮＡへのアビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体の結合標的ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた電極を、ア
ビジン−ＰＱＱＧＤＨ（０．２Ｕ）、ＰＱＱ（１μ
Ｍ）、ＣａＣｌ_２（１ｍＭ）を含むバッファー（１０ｍ
ＭＭＯＰＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｐＨ６．０））１ｍｌ
中に浸漬し２５℃２０分間反応させた。反応後１０ｍＭ
ＭＯＰＳ１５０ｍＭＮａＣｌ、１５％ｇｌｙｃｅｒ
ｏｌ（ｐＨ６．３）にて３回洗った。

【００２７】（７）グルコース添加に対する電極の応答
測定本電極を作用極とし、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極に
Ｐｔ電極を用い、グルコース添加による応答電流値を測
定した。反応溶液は１ｍＭｍＰＭＳ、１μＭＰＱＱ、
１ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．
０）、全量１０ｍｌとし、印加電位＋１００ｍＶｖｓ
Ａｇ／ＡｇＣｌ、２５℃で測定を行った。その結果を
図３に示す。標的ＤＮＡをハイブリさせたもの（●）
は、プローブのみを電極に固定したもの（▲）、コント
ロールＤＮＡをハイブリさせたもの（◆）、と比較して
顕著な電流応答値を示した。なおアビジンゲルのみを電
極に練りこんだものにアビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体を
加えても低い応答しか得られなかった。本方法によって
目的の塩基配列を持つＤＮＡを特異的に検出できた。

【００２８】（８）ＤＮＡに対する電極の応答曲線本電極を作用極とし、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極に
Ｐｔ電極を用い、ＤＮＡの濃度を変化させて応答電流値
を測定した。反応溶液は６．３ｍＭグルコース、１ｍＭ
ｍＰＭＳ、１μＭＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ_２、１
０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、全量１０ｍｌとし、
印加電位＋１００ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、２５℃
で測定を行った。その結果を図４に示す。１ｘ１０^−８
Ｍから１ｘ１０^−６ＭのＤＮＡに対してその濃度が上が
るにつれて電流応答値は上昇し、両者はほぼ直線的な相
関を示した。その検出加減は０．５ｘ１０^−８Ｍであり
従来のＤＮＡの検出法と比べて十分高感度な検出が可能
であった。

【００２９】

【実施例２】耐熱化ＰＱＱＧＤＨ、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ
を用いたサルモネラ菌ｉｎｖＡ遺伝子の電気化学的検出（１）アビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体及び、アビジン−
Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ複合体の調製グルタルアルデヒドを用いた架橋法によるアビジン修飾
Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓの調製の原理を図５に示す。Ｓｅｒ
４１５ＣｙｓはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓのＰＱＱＧＤＨの４１５番目のセリン
をシステインに変換した変異酵素である。このＰＱＱＧ
ＤＨはダイマーで活性を示すが、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓは
それぞれのモノマーの４１５番目のシステインがジスル
フィド結合を形成することによりダイマー構造を安定化
し、高温での安定性を獲得している。これを用いること
により酵素標識したＤＮＡをハイブリダイゼーションの
際にそのまま利用することが可能になり、より迅速な測
定が可能になると考えられる。すなわち実施例１ではア
ビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体が６０℃でのハイブリダイ
ゼーションで失活してしまうため、ハイブリダイゼーシ
ョンの後に結合しなかったＤＮＡを洗浄し、その後にア
ビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体を添加しハイブリダイゼー
ション産物に結合させ、再び結合しなかったアビジン−
ＰＱＱＧＤＨ複合体ヲ洗浄するという操作が必要であっ
た。アビジン−Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ複合体は６０℃でも
活性を保つため、これらの操作を省略できると考えられ
る。野生型ＰＱＱＧＤＨ及び精製されたＳｅｒ４１５Ｃ
ｙｓ（０．３ｍｇ）を１ｍＭＣａＣｌ_２１μＭＰ
ＱＱ存在下ホロ化した後、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ：アビジ
ン＝１：２、全タンパク質量１ｍｇとなるように混合
し、１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）にて全量を１ｍ
ｌとなるように調製した。次にグルタルアルデヒドを終
濃度０．１％になるように加え、３０分撹拌した。そし
てグルタルアルデヒドの架橋反応を止めるために１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で３時間透析し、
さらに１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）にて６時間以
上透析し調製した。

【００３０】（２）金電極へのＤＮＡの固定化金電極上にプローブＤＮＡを固定化するため、金電極上
にアビジンを固定化し、それを介してビオチン修飾プロ
ーブＤＮＡを固定する方法を用いた。金電極にタンパク
質やＤＮＡを固定化する前に金電極を洗浄するため、電
極をピランハ溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）に室
温で５分間浸した。この操作を２回繰り返した。次に１
ｍＭジチオジプロピオン酸２ｍｌに室温で３０分間金電
極を浸すことによりチオール基を介してジチオプロピオ
ン酸を金電極に結合させ、その後ミリＱ水で洗った。そ
して、５ｍｇ／５０μｌＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙ
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）および５ｍｇ／５０μｌＥ
ＤＣ（１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐ
ｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈ
ｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）水溶液を混合し全量１００
μｌとし、金電極を室温で２０分間浸すことによりジチ
オプロピオン酸にＮＨＳを結合させ、金電極にスクシミ
ド基を導入した。その後１ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．
５）バッファー２ｍｌで洗浄した。次に、金電極にアビ
ジンを結合させるため、０．１５ｍｇ／ｍｌアビジン溶
液（１ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８．５）２ｍｌに金電極
を室温で１時間浸した。そして、反応しなかったスクシ
ミド基を無くすため、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）バッファーにて電極を洗うことにより、反応し
なかったスクシミド基にＴｒｉｓを結合させた。その後
アビジンを固定化した金電極を４ｐｍｏｌ／ｍｌのビオ
チン標識プローブＤＮＡまたはビオチン標識コントロー
ルＤＮＡを含む溶液に２５℃、３０分間浸漬し、金電極
上にプローブＤＮＡを固定化した。固定化には２×ＳＳ
Ｃｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭクエン酸、３００ｍＭ
ＮａＣｌｐＨ７．０）を用いた。反応後電極上に固定
化されなかったＤＮＡを取り除くために０．２×ＳＳＣ
ｂｕｆｆｅｒにて３回洗浄した。なおＤＮＡは実施例１
と同じものを用いた。

【００３１】（３）Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ修飾ターゲット
ＤＮＡの調製４ｐｍｏｌ／ｍｌのビオチン標識されたターゲットＤＮ
Ａと２Ｕアビジン修飾Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓを１０ｍＭ
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）中にて混合し、１０ｍＭＭＯ
ＰＳ（ｐＨ７．０）にて全量９００μｌとなるように調
製した。このサンプルを１時間室温にてインキュベート
することでビオチンとアビジンの結合力を利用してビオ
チン標識ターゲットＤＮＡとアビジン修飾Ｓｅｒ４１５
Ｃｙｓを結合させた。その後Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて５
０００ｇ、３０分間遠心することでアビジン修飾Ｓｅｒ
４１５Ｃｙｓと結合しなかったターゲットＤＮＡを除去
した。

【００３２】（４）ＤＮＡ固定化金電極を用いたＳｅｒ
４１５Ｃｙｓ修飾ターゲットＤＮＡの検出Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ標識ターゲットＤＮＡもしくは野生
型ＰＱＱＧＤＨ標識ターゲットＤＮＡ（２Ｕ，４ｐｍｏ
ｌ／ｍｌ）を含む溶液にプローブＤＮＡを固定化した金
電極を６０℃、１０分間浸漬し、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーションには２×ＳＳＣｂ
ｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）を用いた。反応後ハイブリダ
イゼーションされなかったＤＮＡを取り除くために０．
２×ＳＳＣｂｕｆｆｅｒにて２回、１０ｍＭＭＯＰ
Ｓ（ｐＨ７．０）にて１回洗浄した。反応溶液は終濃度
１ｍＭｍＰＭＳ、１μＭＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ
_２を含む１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）全量１０ｍ
ｌをウォータージャケットセル中に調製し、作用極とし
て構築された電極を、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極に
Ｐｔ電極を用いた三電極方式を用いてグルコース添加に
よる応答電流値を測定した。印加電位＋１００ｍＶｖ
ｓＡｇ／ＡｇＣｌ、２５℃で測定を行った。結果を図
６に示す。Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ標識ターゲットＤＮＡ、
Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ標識コントロールＤＮＡの応答電流
値はグルコース濃度が２０ｍＭ付近までは増加し３０ｍ
Ｍ付近では飽和に達した。またＳｅｒ４１５Ｃｙｓ標識
ターゲットＤＮＡを添加した場合、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ
標識コントロールＤＮＡを添加した場合よりも明らかに
大きな電流応答値が得られた。したがって本システムは
ＤＮＡを塩基配列特異的に検出できると考えられる。Ｄ
ＮＡ野生型ＰＱＱＧＤＨ標識ターゲットＤＮＡ、コント
ロールＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた電極にお
いては共にグルコースに対する応答電流値の増加が見ら
れなかった。このことから６０℃において１０分間ハイ
ブリダイゼーションを行っている間に標識されているＰ
ＱＱＧＤＨが失活したと考えられる。従って酵素標識Ｄ
ＮＡヲハイブリダイゼーション時に添加する場合は、Ｓ
ｅｒ４１５Ｃｙｓ標識ターゲットＤＮＡを用いた場合の
みにおいて６０℃におけるハイブリダイゼーションを検
出できることが示唆された。またターゲットＤＮＡ、プ
ローブＤＮＡの濃度を変化させたときのグルコースに対
する応答電流値を測定した結果を図７に示す。それぞれ
のエラーバーは３回測定したときの誤差を表す。この結
果よりＤＮＡ濃度が１×１０^−１１Ｍより低くなるとタ
ーゲットＤＮＡとコントロールＤＮＡの応答電流値が重
なるため、明確な差を区別できなかった。このことから
検出限界は４×１０^−１１Ｍ程度であると考えられる。

【００３３】

【実施例３】ヒトＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｏｒ−ＡｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒ
（ＰＰＡＲ）γ２のＳＮＰの電気化学的検出ＳＮＰ検出のターゲットとして２型糖尿病に関するＳＮ
Ｐ検出を試みた。現在、日本国内の糖尿病患者は推定で
７００万人で、その９５％が２型糖尿病である。今回検
出に用いたＳＮＰはＰＰＡＲ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ）γ２中の３４番目塩基のｃ→ｇ変異（Ｐ
ｒｏ１２Ａｌａ）であり、これは２型糖尿病にかかわる
ＳＮＰであると言われている。ＰＰＡＲγは高脂肪食下
でエネルギー貯蔵に作用し小型脂肪細胞を作る働きを持
つ典型的な倹約遺伝子である。このＰＰＡＲγは脂肪が
過剰に存在する場合、小型脂肪細胞を大型化し、インシ
ュリン作用を効かなくする作用もあわせ持つ。日本人の
８５％以上はＰＰＡＲγを正常な状態でもつため、近年
の食生活の欧米化、慢性的な運動不足により、肥満、高
脂血症、糖尿病になりやすい。しかし、欧米人はＰＰＡ
Ｒγの３４塩基目にｃ→ｇ変異（Ｐｒｏ１２Ａｌａ）を
持っているため、ＰＰＡＲγが正常に働かないので糖尿
病率は日本人に比べ低いとされている。このような知見
をもとに、今回はモデルＤＮＡとしてＰＰＡＲγの３４
塩基目ｃ→ｇのＳＮＰをターゲットとして用い、その検
出を試みた。（１）用いた合成ＤＮＡの配列実験に用いたＤＮＡの塩基配列を以下に示す。標的ＤＮ
Ａ（ＰＰＡＲ−ＳＮＰ）は、ＰＰＡＲのＳＮＰ部分塗装
補的な配列を持つ３８ｍｅｒを用いた。コントロールＤ
ＮＡ（ＰＰＡＲ）としては、標的ＤＮＡ（ＰＰＡＲ−Ｓ
ＮＰ）と同じ部分でＳＮＰのない配列をもつ３８ｍｅｒ
を用いた。電極に固定するプローブＤＮＡは標的ＤＮＡ
（ＰＰＡＲ−ＳＮＰ）及びコントロールＤＮＡ（ＰＰＡ
Ｒ）共通の相補的配列を持ちＳＮＰ部位直前のところま
での配列を有する２８ｍｅｒを用いた。プローブＤＮＡ
は５′端をビオチン標識したものを用いた（なお下図で
Ｂｉｏはビオチンを示す。Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔはそれぞれの
核酸塩基を示す）。標的ＤＮＡ（ＰＰＡＲ−ＳＮＰ）：ＣＣＴＡＴＴＧＡＣ
ＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡ
ＣＡＣＴコントロールＤＮＡ（ＰＰＡＲ）：ＣＣＴＡＴＴＧＡＣ
ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡ
ＣＡＣＴプローブＤＮＡ：Ｂｉｏ−ＡＧＴＧＴＡＴＣＡＧＴＧ
ＡＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧ

【００３３】（２）ＰＰＡＲのＳＮＰの電気化学的検出ＳＮＰ検出方法の模式図を図８に示す。プローブＤＮＡ
は実施例２と同じ方法で金電極上に固定化した。さらに
ＰＰＡＲ−ＳＮＰとＰＰＡＲＤＮＡは実施例２と同じ
方法で金電極上のプローブＤＮＡとハイブリダイゼーシ
ョンさせた。なおこのＰＰＡＲ−ＳＮＰとＰＰＡＲＤＮ
ＡはＰＱＱＧＤＨでは酵素表紙記されていない。ハイブ
リダイゼーションした２本鎖ＤＮＡが固定された電極に
おいて、ＰｒｏｂｅＤＮＡに対してビオチン修飾ｄＣ
ＴＰ１塩基分を伸長させるため２ＵＴａｑｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ、１ｎｍｏｌビオチン修飾ｄＣＴＰ、１．
５ｍＭ塩化マグネシウムを含むＴａｑｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ
社製、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）１００μｌを添加し、
ＰｒｏｂｅＤＮＡの伸長反応を５０℃、６０分間行っ
た。その電極に対してＰＱＱＧＤＨ−アビジン複合体
（０．２Ｕ）、ＰＱＱ（１μＭ）、ＣａＣｌ_２（１ｍ
Ｍ）を含む１０ｍＭＭＯＰＳ、１５０ｍＭＮａＣ
ｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５％グリセロール（ｐＨ６．
０）（２６）を用いて全量２ｍｌとなるように調製し２
５℃３０分間反応させた。反応後１０ｍＭＭＯＰＳ１
５０ｍＭＮａＣｌ１ｍＭＥＤＴＡ１５％グリセロ
ール（ｐＨ６．０）バッファーにて電極を洗った。反応
溶液は終濃度１ｍＭｍＰＭＳ、１μＭＰＱＱ、１ｍ
ＭＣａＣｌ_２を含む１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．
０）全量１０ｍｌをウォータージャケットセル中に調製
し、作用極として（３）で構築された電極を、参照極に
Ａｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用いた三電極方式を
用いてグルコース添加により、サイクリックボルタンメ
トリー、応答電流値を測定した。応答電流値測定におけ
る印加電位＋１００ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、２５
℃で測定を行った。ＰＰＡＲ−ＳＮＰＤＮＡもしくは
ＰＰＡＲＤＮＡを１×１０^−６Ｍ金電極上に作用させ
たときの応答電流値を図９に示す。この結果からＰＰＡ
Ｒ−ＳＮＰＤＮＡ、ＰＰＡＲＤＮＡの応答電流値は顕
著な差を示し、共にグルコース濃度が２０ｍＭ程度まで
は応答電流値は増加していったが、２０ｍＭを過ぎると
応答電流値が減少していった。従って本検出法でＳＮＰ
を検出できることが示唆された。ＰＰＡＲ−ＳＮＰＤ
ＮＡ、ＰＰＡＲＤＮＡの濃度を変えたときのグルコー
スに対する応答電流値の結果を図１０に示す。ＰＰＡＲ
−ＳＮＰＤＮＡはＤＮＡ濃度が高くなるにつれて応答
電流値が高くなったが、ＰＰＡＲＤＮＡはＤＮＡ濃度
変化に対して応答電流値の変化はなかった。

【発明の効果】上述のように目的の塩基配列を持つＤＮ
ＡやＳＮＰを酸化還元酵素の活性を指標にして検出する
事ができるようになった。特に酸化還元酵素の活性を指
標とすると、試料中の標的ＤＮＡが極少量しか存在しな
くてもその信号を数千倍、数万倍に増幅することが可能
であり、発病機構解析や薬剤の作用機作解析、さらには
極微少量微生物、ウィルスの検出へ応用できると考えら
れる。さらにＤＮＡチップやマイクロアレイのような一
度に多数の標的ＤＮＡを解析する技術においても、酸化
還元酵素の活性を指標にしてＤＮＡが検出できれば、例
えばその検出は電極で行うことが可能であり、その場合
高集積度のチップを簡単に製作・解析することが可能に
なる。今後標的ＤＮＡの検出は、様々な分野での応用が
期待されており、その為には特殊な分析機器を有する研
究施設や大学、大病院だけでなく様々な場所で標的ＤＮ
Ａの検出が可能になることが必要不可欠であり、本発明
はその為の基盤技術を提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】アビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体の調製

【図２】酸化還元酵素を用いた標的ＤＮＡの検出の模式
図

【図３】アビジン−ＰＱＱＧＤＨ複合体添加後のグルコ
ースに対する電流応答値

【図４】ＤＮＡ固定化電極のＤＮＡ濃度に対する応答曲
線

【図５】グルタルアルデヒドを用いた酵素修飾

【図６】ＤＮＡ固定化金電極のグルコースに対する応答
曲線

【図７】ＤＮＡ固定化金電極の添加したＤＮＡ濃度に対
する応答曲線

【図８】ＳＮＰ検出法の模式図

【図９】ＳＮＰ検出用ＤＮＡ固定化金電極のグルコース
に対する応答曲線

【図１０】ＳＮＰ検出用ＤＮＡ固定化金電極の添加した
ＤＮＡ濃度に対する応答曲線

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年６月６日（２００２．６．６）

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】すなわち本発明は以下のＤＮＡの検出原理
に関する。［１］酸化還元酵素の活性を指標にＤＮＡを検出する原
理。［２］［１］において酸化還元酵素がＦＡＤを補酵素と
することを特徴とするＤＮＡを検出する原理。［３］［１］において酸化還元酵素がＰＱＱを補酵素と
することを特徴とするＤＮＡを検出する原理。［４］［１］において酸化還元酵素が糖類を基質とする
ことを特徴とするＤＮＡを検出する原理。［５］［４］において糖類を基質とする酸化還元酵素が
グルコース脱水素酵素であることを特徴とするＤＮＡを
検出する原理。［６］［５］においてグルコース脱水素酵素の補酵素が
ＦＡＤであることを特色とするグルコース脱水素酵素の
活性を指標にＤＮＡを検出する原理。［７］［５］においてグルコース脱水素酵素の補酵素が
ＰＱＱであることを特色とするＤＮＡを検出する原理。［８］ストレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱＱ
を補酵素とするグルコース脱水素酵素。［９］［８］においてストレプトアビジンとＰＱＱを補
酵素とするグルコース脱水素酵素とを架橋性試薬で結合
させることにより調製したストレプトアビジンを化学的
に結合させたＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵
素。［１０］［８］においてストレプトアビジンとＰＱＱを
補酵素とするグルコース脱水素酵素をグルタルアルデヒ
ドで架橋させることにより調製することを特徴とするス
トレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱＱを補酵素
とするグルコース脱水素酵素。［１１］［８］においてストレプトアビジンとＰＱＱを
補酵素とするグルコース脱水素酵素とをヘテロ二架橋性
試薬で結合させることにより調製したストレプトアビジ
ンを化学的に結合させたＰＱＱを補酵素とするグルコー
ス脱水素酵素。［１２］［８］においてストレプトアビジンをＮ−Ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔ
ｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅさらにスルフォニル基によ
り修飾し、またＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素を４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃ
ｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅで
修飾し、これを反応させることにより調製することを特
徴とするストレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱ
Ｑを補酵素とするグルコース脱水素酵素。［１３］［１〜７］の酸化還元酵素がストレプトアビジ
ンで修飾されていることを特色とする１に記載のＤＮＡ
を検出する原理。［１４］［１３］において［８−１２］記載のストレプ
トアビジンを化学的に結合させたＰＱＱを補酵素とする
グルコース脱水素酵素を酸化還元酵素として用いること
を特色とするＤＮＡを検出する原理。［１５］［１３］において融合タンパク質法により調製
されたストレプトアビジンと結合したＰＱＱを補酵素と
するグルコース脱水素酵素を酸化還元酵素として用いる
ことを特色とするＤＮＡを検出する原理。［１６］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、ＰＱＱを補酵素とし、かつ遺伝子組み換えにより特
性が改変された変異グルコース脱水素酵素であることを
特色とするＤＮＡを検出する原理。［１７］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、ＰＱＱを補酵素とし、かつ遺伝子組み換えにより安
定性が向上した変異グルコース脱水素酵素であることを
特色とするＤＮＡを検出する原理。［１８］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、ＰＱＱを補酵素とし、２つのサブユニットが１また
はそれ以上のジスルフィド結合を介して互いに連結され
ていることを特徴とする水溶性グルコース脱水素酵素で
あることを特色とするＤＮＡを検出する原理。［１８ａ］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵
素が、ＰＱＱを補酵素とし、１またはそれ以上のシステ
イン以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されて
いる水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とす
るＤＮＡを検出する原理。［１９］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉ
ｃｕｓ由来の［１８、１８ａ］記載の、ＰＱＱを補酵素
とする水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色と
するＤＮＡを検出する原理。［２０］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、アミノ酸配列の４１５番目のセリン残基がシステイ
ン残基で置換されている［１９］記載の、ＰＱＱを補酵
素とする水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色
とするＤＮＡを検出する原理。［２１］［１〜７、１３〜１５］において酸化還元酵素
が、アミノ酸配列の３４０番目のアスパラギン残基およ
び４１８番目のチロシン残基が両方ともシステイン残基
で置換されている［１９］記載の、ＰＱＱを補酵素とす
る水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とする
ＤＮＡを検出する原理。［２２］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
遺伝子組み換えにより特性が改変された変異グルコース
脱水素酵素であることを特色とする［８〜１２］記載の
グルコース脱水素酵素。［２３］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
遺伝子組み換えにより安定性が向上した変異グルコース
脱水素酵素であることを特色とする［８〜１２］記載の
グルコース脱水素酵素。［２４］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
２つのサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド
結合を介して互いに連結されていることを特徴とする水
溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とする［８
〜１２］記載のグルコース脱水素酵素。［２４ａ］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素
が２つのサブユニットが１またはそれ以上のシステイン
以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されている
水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とする
［８〜１２］記載のグルコース脱水素酵素。［２５］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕ
ｓ由来の［２４、２４ａ記載の水溶性グルコース脱水素
酵素であることを特色とする［８〜１２記載のグルコー
ス脱水素酵素。［２６］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
アミノ酸配列の４１５番目のセリン残基がシステイン残
基で置換されている［２５］記載の、水溶性グルコース
脱水素酵素であることを特色とする［８〜１２］記載の
グルコース脱水素酵素。［２７］ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素が
３４０番目のアスパラギン残基および４１８番目のチロ
シン残基が両方ともシステイン残基で置換されている
［２５］記載の、水溶性グルコース脱水素酵素であるこ
とを特色とする［８〜１２］記載のグルコース脱水素酵
素。［２８］［１〜７、１３〜２１］記載のＤＮＡを検出す
る原理を含むＤＮＡ検出キット。［２９］［１〜７、１３〜２１］記載のＤＮＡを検出す
る原理を含むＤＮＡ１７ンサー。［３０］［２８］においてＤＮＡを検出する原理が電気
化学的であることを特色とするＤＮＡ検出キット。［３１］［２９］においてＤＮＡを検出する原理が電気
化学的であることを特色とするＤＮＡセンサー。［３２］［１〜７、１３〜２１］および［２８、３０］
記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきサルモネラを検
出するＤＮＡ検出キット。［３３］［１〜７、１３〜２１］および［２９、３１］
記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきサルモネラを検
出するＤＮＡセンサー。［３４］［１〜７、１３〜２１］および［２８、３０、
３２］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきＳＮＰ
（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）を検出するＳＮＰ検出キッ
ト。［３５］［１〜７、１３〜２１］および［２９、３１、
３３］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきＳＮＰを
検出するＳＮＰセンサー。［３６］［１〜７、１３〜２１］および［２８、３０、
３２、３４］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきヒ
トのｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ
−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）γ
２中の開始コドンから３２番目の塩基のＣがＧに変異し
たＳＮＰを検出するＳＮＰ検出キット。［３７］［１〜７、１３〜２１］および［２９、３１、
３３、３５］記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきヒ
トのＰＰＡＲ γ２中の開始コドンから３２番目の塩基
のＣがＧに変異したＳＮＰを検出するＳＮＰセンサー。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｑ 1/26 ４Ｂ０６３ 11/06 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/26 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｆ 1/68 33/569 ＦＧ０１Ｎ 27/327 37/00 １０２ 27/416 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/483 Ｆ 33/569 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｆ 37/00 １０２３５３Ｔ 27/46 ３３８３３６ＭＦターム(参考） 2G045 AA28 CB21 DA12 DA13 FB01 FB02 FB05 GC20 4B024 AA11 BA08 CA04 CA05 CA09 DA05 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB16 BB20 CC03 CC08 CC11 FA13 FA15 4B033 NA02 NA23 NB04 NB13 NB43 NC05 NC10 NC12 ND05 NF02 4B050 CC01 CC04 DD02 GG10 LL03 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ03 QQ06 QQ42 QR04 QR08 QR32 QR38 QR41 QR55 QR57 QR62 QR65 QR66 QR72 QR75 QR82 QS12 QS25 QS28 QS34 QS39 QX01 QX04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酸化還元酵素の活性を指標にＤＮＡを検出
する原理。
【請求項２】請求項１において酸化還元酵素がＦＡＤを
補酵素とすることを特徴とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項３】請求項１において酸化還元酵素がＰＱＱを
補酵素とすることを特徴とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項４】請求項１において酸化還元酵素が糖類を基
質とすることを特徴とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項５】請求項４において糖類を基質とする酸化還
元酵素がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする
ＤＮＡを検出する原理。
【請求項６】請求項５においてグルコース脱水素酵素が
補酵素がＦＡＤであることを特色とするグルコース脱水
素酵素の活性を指標にＤＮＡを検出する原理。
【請求項７】請求項５においてグルコース脱水素酵素の
補酵素がＰＱＱであることを特色とするＤＮＡを検出す
る原理。
【請求項８】ストレプトアビジンを化学的に結合させた
ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項９】請求項８においてストレプトアビジンとＰ
ＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素とを架橋性試
薬で結合させることにより調製したストレプトアビジン
を化学的に結合させたＰＱＱを補酵素とするグルコース
脱水素酵素。
【請求項１０】請求項８においてストレプトアビジンと
ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素をグルタル
アルデヒドで架橋させることにより調製することを特徴
とするストレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱＱ
を補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１１】請求項８においてストレプトアビジンと
ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素とをヘテロ
二架橋性試薬で結合させることにより調製したストレプ
トアビジンを化学的に結合させたＰＱＱを補酵素とする
グルコース脱水素酵素。
【請求項１２】請求項８においてストレプトアビジンを
Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３（２−ｐｙｒｉｄｙ
ｌｄｉｔｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅさらにスルフォニ
ル基により修飾し、またＰＱＱを補酵素とするグルコー
ス脱水素酵素を４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙ
ｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌ
ａｔｅで修飾し、これを反応させることにより調製する
ことを特徴とするストレプトアビジンを化学的に結合さ
せたＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素。
【請求項１３】請求項１〜７の酸化還元酵素がストレプ
トアビジンで修飾されていることを特色とする１に記載
のＤＮＡを検出する原理。
【請求項１４】請求項１３において請求項８−１２記載
のストレプトアビジンを化学的に結合させたＰＱＱを補
酵素とするグルコース脱水素酵素を酸化還元酵素として
用いることを特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項１５】請求項１３において融合タンパク質法に
より調製されたストレプトアビジンと結合したＰＱＱを
補酵素とするグルコース脱水素酵素を酸化還元酵素とし
て用いることを特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項１６】請求項１〜７、１３〜１５において酸化
還元酵素が、ＰＱＱを補酵素とし、かつ遺伝子組み換え
により特性が改変された変異グルコース脱水素酵素であ
ることを特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項１７】請求項１〜７、１３〜１５において酸化
還元酵素が、ＰＱＱを補酵素とし、かつ遺伝子組み換え
により安定性が向上した変異グルコース脱水素酵素であ
ることを特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項１８】請求項１〜７、１３〜１５において酸化
還元酵素が、ＰＱＱを補酵素とし、２つのサブユニット
が１またはそれ以上のジスルフィド結合を介して互いに
連結されていることを特徴とする水溶性グルコース脱水
素酵素であることを特色とするＤＮＡを検出する原理。【請求項１８ａ】請求項１〜７、１３〜１５において酸
化還元酵素が、ＰＱＱを補酵素とし、１またはそれ以上
のシステイン以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置
換されている水溶性グルコース脱水素酵素であることを
特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項１９】請求項１〜７、１３〜１５において酸化
還元酵素が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ由来の請求項１８、１８ａ記載の、Ｐ
ＱＱを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素である
ことを特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項２０】請求項１〜７、１３〜１５において酸化
還元酵素が、アミノ酸配列の４１５番目のセリン残基が
システイン残基で置換されている請求項１９記載の、Ｐ
ＱＱを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素である
ことを特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項２１】請求項１〜７、１３〜１５において酸化
還元酵素が、アミノ酸配列の３４０番目のアスパラギン
残基および４１８番目のチロシン残基が両方ともシステ
イン残基で置換されている請求項１９記載の、ＰＱＱを
補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素であることを
特色とするＤＮＡを検出する原理。
【請求項２２】ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素が遺伝子組み換えにより特性が改変された変異グル
コース脱水素酵素であることを特色とする請求項８〜１
２記載のグルコース脱水素酵素。
【請求項２３】ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素が遺伝子組み換えにより安定性が向上した変異グル
コース脱水素酵素であることを特色とする請求項８〜１
２記載のグルコース脱水素酵素。
【請求項２４】ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素が２つのサブユニットが１またはそれ以上のジスル
フィド結合を介して互いに連結されていることを特徴と
する水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色とす
る請求項８〜１２記載のグルコース脱水素酵素。【請求項２４ａ】ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水
素酵素が２つのサブユニットが１またはそれ以上のシス
テイン以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置換され
ている水溶性グルコース脱水素酵素であることを特色と
する請求項８〜１２記載のグルコース脱水素酵素。
【請求項２５】ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素がＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅ
ｔｉｃｕｓ由来の請求項２４、２４ａ記載の水溶性グル
コース脱水素酵素であることを特色とする請求項８〜１
２記載のグルコース脱水素酵素。
【請求項２６】ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素がアミノ酸配列の４１５番目のセリン残基がシステ
イン残基で置換されている請求項２５記載の、水溶性グ
ルコース脱水素酵素であることを特色とする請求項８〜
１２記載のグルコース脱水素酵素。
【請求項２７】ＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素
酵素が３４０番目のアスパラギン残基および４１８番目
のチロシン残基が両方ともシステイン残基で置換されて
いる請求項２５記載の、水溶性グルコース脱水素酵素で
あることを特色とする請求項８〜１２記載のグルコース
脱水素酵素。
【請求項２８】請求項１〜７、１３〜２１記載のＤＮＡ
を検出する原理を含むＤＮＡ検出キット。
【請求項２９】請求項１〜７、１３〜２１記載のＤＮＡ
を検出する原理を含むＤＮＡセンサー。
【請求項３０】請求項２８においてＤＮＡを検出する原
理が電気化学的であることを特色とするＤＮＡ検出キッ
ト。
【請求項３１】請求項２９においてＤＮＡを検出する原
理が電気化学的であることを特色とするＤＮＡセンサ
ー。
【請求項３２】請求項１〜７、１３〜２１および２８、
３０記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきサルモネラ
を検出するＤＮＡ検出キット。
【請求項３３】請求項１〜７、１３〜２１および２９、
３１記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきサルモネラ
を検出するＤＮＡセンサー。
【請求項３４】請求項１〜７、１３〜２１および２８、
３０、３２記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきＳＮ
Ｐ（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）を検出するＳＮＰ検出キッ
ト。
【請求項３５】請求項１〜７、１３〜２１および２９、
３１、３３記載のＤＮＡを検出する原理にもとづきＳＮ
Ｐを検出するＳＮＰセンサー。
【請求項３６】請求項１〜７、１３〜２１および２８、
３０、３２、３４記載のＤＮＡを検出する原理にもとづ
きヒトのｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔ
ｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡ
Ｒ）γ２中の開始コドンから３２番目の塩基のＣがＧに
変異したＳＮＰを検出するＳＮＰ検出キット。
【請求項３７】請求項１〜７、１３〜２１および２９、
３１、３３、３５記載のＤＮＡを検出する原理にもとづ
きヒトのＰＰＡＲ γ２中の開始コドンから３２番目の
塩基のＣがＧに変異したＳＮＰを検出するＳＮＰセンサ
ー。