JP2003135077A - 新規ヒト遺伝子および遺伝子発現産物 - Google Patents

新規ヒト遺伝子および遺伝子発現産物

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ジョン エイチ． アストル
Christopher C Burgess
クリストファー シー． バージェス
Theodore J Catino
セオドア ジェー． カティノ
Poornima Dwivedi
プアナイム ドウィヴェディ
Marcia E Lewis
マルシア イー． リーヴァイス
Gary A Molino
ゲイリー エイ． モリノ
Susan H Myerow
スーザン エイチ． マイロウ
Arunthathi Thiagalingam
アランザッシ シアガリンガム
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】新規ヒト遺伝子、これらの遺伝子によって発現
されるタンパク質、およびこれらのタンパク質の変異体
の提供。 【解決手段】 特定の配列、またはこれに相補的な配列
を含むヌクレオチド配列を含む核酸、特定の配列、また
はこれに相補的な配列にストリンジェント条件下でハイ
ブリダイズするのに十分な特定の核酸配列の領域を含む
プローブ／プライマーを提供することにより達成され
る。本発明はまた、本発明のプローブ、アンチセンス構
築物および抗体を含む上記遺伝子ならびにタンパク質に
関連する診断アッセイおよび治療薬を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸の配列およびそ
れによりコードされたタンパク質、ならびにそれら核酸
の配列に由来するプローブ、コードタンパク質に対する
抗体、および癌細胞、特に結腸癌細胞を検出する診断方
法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】結腸直腸癌は悪性腫瘍性疾患である。西
側世界、特に米国においては結腸直腸癌の発生率が高
い。この型の腫瘍はリンパチャネル及び血管チャネルを
通じて転移することが多い。多くの結腸直腸癌患者がこ
の病気のために最終的には死亡する。実際、米国だけで
も年間６２、０００人が結腸直腸癌で死亡している。
【０００３】しかしながら、早期に診断がなされれば、
癌組織を外科的に除去することで結腸癌を有効に治療す
ることができる。結腸直腸癌は結腸直腸の上皮に生じ、
典型的には発生の初期段階においては血管新生が広範囲
でない(それ故、侵襲的でない)。結腸直腸癌は結腸また
は直腸の上皮管壁細胞の単一の変異細胞のクローン性増
殖の結果生じると考えられている。高度に血管新生がな
され、侵襲的かつ究極に転移性の、全身に蔓延する癌へ
の移行は通常１０年以上を要する。侵襲前に癌が検出さ
れれば、癌組織を外科手術により除去することが有効な
治療となる。しかしながら、結腸直腸癌は痛みや、黒色
タール状便のような臨床症状が発現したときにのみ検出
されることが多い。一般に、そのような症状は疾患がは
っきり確定したときにのみ、多くの場合、転移が起きた
後に現れ、癌組織を外科的に切除した後でも、患者の予
後は思わしくない。従って、結腸直腸癌を早期に検出す
ることが罹患率を顕著に低減する上で重要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】内視鏡検査のような侵
襲的診断方法は癌の可能性のあるポリープのようなもの
の成長を直接目視により同定し、除去し、生検を行うこ
とを可能にする。内視鏡検査は費用が嵩み、不快であ
り、本質的に危険を孕んでいるため、集団をスクリーニ
ングして結腸直腸癌に罹患した者を同定するための実用
的なツールではない。大便サンプルを結腸直腸癌または
前癌状態の存在を示す特徴について非侵襲的に分析する
ことは早期診断の代案として好ましいが、既知の診断方
法にはこの目的を信頼性をもって達成するものはない。
早期に結腸癌を診断するための信頼性があり、非侵襲的
かつ精確な技法があれば多くの人命が救われるであろ
う。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は核酸配列および
それによりコードされているタンパク質、ならびにそれ
ら核酸配列に由来するプローブ、コードされたタンパク
質に対する抗体、および癌細胞、特に結腸癌細胞を検出
するための診断方法を提供する。本明細書に開示した配
列は結腸癌細胞系統および／または結腸癌組織から得ら
れたサンプルにおいて差次的に発現されることが見出さ
れている。
【０００６】一実施形態において、本発明は配列番号
1、３、５または７に示す配列、あるいはそれらに相補
的な配列を含むヌクレオチド配列を含む核酸を提供す
る。この配列はさらにこのヌクレオチド配列に操作可能
に結合されてこれを発現ベクターとして使用するのに適
したヌクレオチド配列にする転写調節配列を含んでいて
もよい。他の実施形態において、この核酸は原核細胞ま
たは真核細胞内で複製可能な発現ベクター内に含まれて
いてもよい。関連する実施形態において、本発明はこの
発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞を提
供する。
【０００７】一実施形態では、本発明は配列番号1、
３、５または７に示す配列あるいはそれらに相補的な配
列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を含む核酸を提供する。この配列は、さら
にこのヌクレオチド配列に操作可能に結合されてこれを
発現ベクターとして使用するのに適したヌクレオチド配
列にする転写調節配列を含んでいてもよい。別の実施形
態において、この核酸は原核細胞または真核細胞内で複
製可能な発現ベクター内に含まれていてもよい。関連す
る実施形態において、本発明はこの発現ベクターでトラ
ンスフェクションした宿主細胞を提供する。
【０００８】別の実施形態において、本発明は配列番号
1、３、５または７に示す配列あるいはそれらに相補的
な配列を含む核酸配列を含む核酸の導入遺伝子をその細
胞に導入したトランスジェニック動物を提供する。別の
実施形態において、本発明は配列番号1、３、５または
７に示す配列を含む配列にストリンジェント条件下でハ
イブリダイズする核酸配列を含む核酸の導入遺伝子を有
するトランスジェニック動物を提供する。この導入遺伝
子は核酸の発現レベル、核酸のｍＲＮＡ転写物の安定
性、またはこの核酸のコード産物の活性を修飾する。
【０００９】さらに別の実施形態において、本発明は配
列番号1、３、５または７に示す配列、あるいは相補的
な配列のうちの一つの少なくとも約８個、少なくとも約
１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、ま
たは少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドないし完全
長まで、あるいは上記配列をその断片とする遺伝子の完
全長までに相当する単離された実質的に純粋な核酸を提
供する。別の実施形態において、本発明は配列番号1、
３、５または７に示す配列またはそれらに相補的な配列
のうちの一つの少なくとも約８個、少なくとも約１２
個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または
少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドないし完全長ま
で、あるいは上記配列をその断片とする遺伝子の完全長
までに相当する核酸プローブにストリンジェント条件下
でハイブリダイズする実質的に純粋な核酸を提供する。
本発明はまた配列番号1、３、５または７に示す配列ま
たはそれらに相補的な配列のうちの一つの少なくとも約
８個、少なくとも約１２個、少なくとも約２５個、また
は少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドないし完全長
までを含み、ヌクレアーゼ、好ましくは内因性エンドヌ
クレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対し
て抵抗性のアンチセンス・オリゴヌクレオチド類縁体を
提供する。別の態様では、本発明は、配列番号１，３，
５または７またはそれらに相補的な配列の一つの少なく
とも役１２個、少なくとも約２５個、ストリンジェント
条件下でハイブリダイズし、ヌクレア−ゼ、好ましくは
内因性エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに
よる切断に対して抵抗性のアンチセンス・オリゴヌクレ
オチド類縁体を提供する。
【００１０】別の実施形態において、本発明は実質的に
精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライ
マーであって、このオリゴヌクレオチドが配列番号1、
３、５または７に示す配列に実質的に相補的な核酸とハ
イブリダイズするのに十分な配列番号1、３、５または
７に示す核酸配列の領域を含み、かつ配列番号1、３、
５または７に示す配列から選択されるセンスまたはアン
チセンス配列の少なくとも約８個、少なくとも約１２
個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または
少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオ
チド配列の領域、ないし配列番号1、３、５もしくは７
に示す配列またはそれらに相補的な配列の一つの完全長
までを含むものを提供する。さらに別の実施形態では、
本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含
むプローブ／プライマーであって、このオリゴヌクレオ
チドが配列番号1、３、５または７に示す配列とハイブ
リダイズするのに十分な、配列番号1、３、５または７
に示す配列に相補的な核酸配列の領域を含むプローブ／
プライマーを提供する。好ましい実施形態では、このプ
ローブは標的核酸と選択的にハイブリダイズする。別の
実施形態では、このプローブは標識基をそれに結合して
検出可能にしたものであってもよい。この標識基は放射
性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素補因子から選
ぶことができる。本発明はさらに少なくとも約１０個、
少なくとも約２５個、少なくとも約５０個または少なく
とも約１００個の異なる上述のようなプローブを固体支
持体上に結合したアレイを提供する。
【００１１】本明細書中で用いられているように、「ハ
イブリダイズするのに十分な」という用語は２つの核酸
配列同士の間の相補性の程度を含め、これら２つの配列
のアニーリングをストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件下で可能とするのに十分な条件をいう。ストリ
ンジェントハイブリダイゼーション条件は当業者にはよ
く知られており、多数の科学教本および実験室用マニュ
アルに記載されている（例えば、Maniatis et al.,1982
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor Press, Inc.参照）。２つの配列が充分にハ
イブリダイズするか否かに影響を与える他の条件として
はＧ／Ｃ含有率、融点および配列長がある。「ハイブリ
ダイズするのに十分な」配列は少なくとも８個ヌクレオ
チド長であり、かつＧ／Ｃ含有率が約５０％以下である
ことが好ましい。
【００１２】さらに別の実施形態では、本発明は正常細
胞に関して、配列番号1、３、５または７に示す配列の
うち少なくとも一つの核酸が少なくとも約０．５倍、少
なくとも約１倍、少なくとも約２倍、または少なくとも
約５０倍差次的に発現する、差次的発現を検出すること
を含む細胞の表現型を決定する方法に関する。さらに別
の態様では、本発明は正常細胞に関して、配列番号1、
３、５または７に示す配列の一つとストリンジェント条
件下でハイブリダイズする少なくとも１種の核酸が少な
くとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２
倍、または少なくとも約５０倍差次的に発現する、差次
的発現を検出することを含む細胞の表現型を決定する方
法に関する。
【００１３】別の態様では、本発明は対象核酸によりコ
ードされたポリペプチドを提供する。一実施形態におい
て、これらポリペプチドは配列番号２、４、６または８
に示す配列あるいはその断片を含む。別の実施形態で
は、本発明は配列番号1、３、５または７に示す配列あ
るいはそれらに相補的な配列のヌクレオチド配列を含む
核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドまたはその断片に関する。これら断片は例えば本ポリ
ペプチドの少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、
少なくとも約３０個または少なくとも約４０個のアミノ
酸を含んでいてもよい。
【００１４】さらに、配列番号２、４、６または８に示
す配列を含むポリペプチドあるいはその断片に特異的に
結合する抗体が提供される。他の実施形態では、本発明
は配列番号1、３、５または７に示すヌクレオチド配列
またはそれらに相補的な配列を含む核酸によりコードさ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片に
結合する抗体に関する。本発明の抗体により結合された
断片は例えば本ポリペプチドの少なくとも約１０個、少
なくとも約２０個、少なくとも約３０個または少なくと
も約４０個のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００１５】さらに別の態様では、本発明は診断方法を
提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号
1、３、５または７に示す配列あるいはそれらに相補的
な配列に示すうちの一つの少なくとも約８個、少なくと
も約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５
個、または少なくとも約４０個の連続ヌクレオチド、あ
るいは上記配列をその断片とする遺伝子の完全長までの
ヌクレオチド配列を含む核酸プローブを準備し、患者か
ら細胞のサンプルを得、および実質的にそのすべてが非
癌性の細胞である第２のサンプルを準備し、この核酸プ
ローブをストリンジェント条件下で上記第１および第２
の細胞サンプルのそれぞれのｍＲＮＡと接触させること
および、（ａ）第１の細胞サンプルのｍＲＮＡとプロー
ブとのハイブリダイゼーション量を、（ｂ）第２の細胞
サンプルのｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーシ
ョン量を比較することにより、患者の細胞の表現型の決
定する方法であって、第１の細胞サンプルのｍＲＮＡの
ハイブリダイゼーションの量を第２の細胞サンプルのｍ
ＲＮＡのハイブリダイゼーションの量に比較して、差異
が少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくと
も約２倍、またはこれらないし少なくとも約５０倍であ
る差異が第１の細胞サンプル中の細胞の表現型を示す、
患者の細胞の表現型を決定方法に関する。表現型を決定
すると云う用語は、遺伝子型を決定することを含むもの
として本明細書において使用する。
【００１６】別の実施形態では、本発明は上述のような
プローブ／プライマーを含む、患者から単離された細胞
のサンプル中の配列番号1、３、５または７に示す配列
あるいはそれらに相補的な配列の核酸を含む核酸のレベ
ルを測定するための、形質転換された（すなわち悪性）
細胞を同定するための試験キットを提供する。いくつか
のある実施形態では、このキットはさらにこのキットを
使用する際の指示（インストラクション）、細胞、検出
可能なタグまたは標識を懸濁または固定するための組成
物、核酸をハイブリッドダイズし易くするための組成
物、細胞を溶解するための組成物、あるいは核酸を精製
するための組成物を含んでいてもよい。
【００１７】別の実施形態では、本発明は正常細胞に関
して配列番号２、４、６または８に示す少なくとも一つ
のタンパク質の差次的発現を検出することを含む細胞の
表現型を決定する方法であって、このタンパク質が少な
くとも約０．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも５
倍、少なくとも２０倍または少なくとも約５０倍差次的
に発現される方法に関する。一実施態様では、このタン
パク質のレベルは免疫測定法により検出される。
【００１８】本発明はさらに、細胞を上述のようなプロ
ーブと接触させることを含む、細胞における配列番号
1、３、５または７の配列あるいはそれに相補的な配列
の一つを含む核酸の存在または不存在を確認する方法に
関する。本発明はさらに、細胞を上述のような抗体と接
触させることを含む、細胞における配列番号２、４、６
または８に示す対象ポリペプチドの存在または不存在を
確認する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本
発明は、患者から細胞のサンプルを集め、このサンプル
細胞から核酸を単離し、この核酸サンプルを配列番号
1、３、５または７に示す核酸配列に、核酸のハイブリ
ダイゼーションと増幅が起きる条件下で、特異的にハイ
ブリダイズする１種以上のプライマーと接触させ、増幅
生成物の存在、不存在または大きさを正常細胞の増幅生
成物と比較することを含む、配列番号1、３、５または
７の配列またはそれに相補的な配列を含む遺伝子におけ
る異常変異（例えば、核酸の欠失、挿入または置換）ま
たは異常メチル化の存在を確認する方法を提供する。
【００１９】一実施形態において、本発明は配列番号
1、３、５または７に示す配列あるいはそれらに相補的
な配列のいずれか一つを含む核酸によりコードされたタ
ンパク質に特異的な抗体を含む、形質転換された（すな
わち悪性）細胞を同定するための試験キットを提供す
る。いくつかのある実施形態では、このキットはさら
に、このキットを使用する際の指示（インストラクショ
ン）、細胞、検出可能なタグまたは標識を懸濁または固
定するための組成物、ポリペプチドを抗体に結合し易く
するための組成物、細胞を溶解するための組成物、ある
いはポリペプチドを精製するための組成物を含んでいて
もよい。
【００２０】別の態様では、本発明は対象核酸を含む薬
学的組成物を提供する。一実施形態では、配列番号1、
３、５または７に示す配列あるいはそれらに相補的な配
列のうちの一つを含む核酸の細胞内における発現レベル
を変更する薬剤の同定が、細胞を提供することと、この
細胞を試験薬剤で処理することと、配列番号1、３、５
または７に示す配列またはそれらに相補的な配列の核酸
のその細胞内における発現レベルを測定することと、こ
の処理細胞における核酸の発現レベルを未処理細胞にお
けるその核酸の発現レベルと比較することにより行わ
れ、ここで、未処理細胞における核酸の発現レベルに比
較した処理細胞における核酸の発現レベルの変化が、細
胞内における核酸の発現レベルを変更する薬剤を表わ
す。本発明はさらにこの方法により同定された薬剤を含
む薬学的組成物を提供する。
【００２１】別の実施形態では、本発明は配列番号1、
３、５または７に示す配列あるいはそれらに相補的な配
列の一つを含むヌクレオチド配列を有する核酸によりコ
ードされたポリペプチド、または配列番号２、４、６ま
たは８に示す配列を有する核酸によりコードされたポリ
ペプチドのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一
実施形態において、本発明は配列番号1、３、５または
７に示す配列あるいはそれらに相補的な配列のうちの１
つとストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列
を含む核酸を含む薬学的組成物に関する。本発明におい
て有用な薬学的組成物はさらに配列番号２、４、６また
は８に示すアミノ酸配列あるいはその断片を含む融合タ
ンパク質、抗体または抗体断片を含んでいてもよい。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明は配列番号1、３、５また
は７に示す完全長ｃＤＮＡ配列あるいはそれに相補的な
配列を有する核酸、およびこれらの配列に対応する遺伝
子、ならびにこれらの核酸および遺伝子によりコードさ
れたポリペプチドおよびタンパク質およびそれらの部分
に関する。
【００２３】本発明はさらに配列番号1、３、５または
７に示すｃＤＮＡ配列にそれぞれ相補的なｍＲＮＡによ
りコードされ、配列番号２、４、６または８に示すアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、それらに限定
されないポリペプチド配列に関する。
【００２４】配列番号２、４、６または８に示すポリペ
プチド（類）あるいはタンパク質（類）の変異体である
ポリペプチド（類）およびタンパク質（類）も本発明の
範囲内に含まれる。これらの変異体は野生型タンパク質
と、野生型タンパク質の生物活性を向上、追加または低
減する１個以上のアミノ酸置換を有する点で異なる。い
ったんアミノ酸の変化が選択されると、その変異体をコ
ードする核酸が本発明によって構築される。そのような
核酸は、配列番号1、３、５または７の変異体であり、
これらも本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】以下の詳細な説明は、本核酸に対応するｃ
ＤＮＡおよびヒト遺伝子の取得または作製方法、これら
核酸および関連する遺伝子の発現方法、これら遺伝子の
構造モチーフの同定方法、核酸に対応する遺伝子により
コードされたタンパク質の機能の同定方法、マッピング
および組織プロファイリングにおけるプローブとしての
核酸の使用方法、抗体産生における対応するポリペプチ
ドおよびタンパク質の使用方法、および治療および診断
目的の核酸、ポリペプチドおよびタンパク質の使用方法
を開示するものである。
【００２６】従って、ある態様において本発明は、腫瘍
組織、特に結腸癌細胞系統において差次的に発現される
核酸、そのような核酸によりコードされるポリペプチド
類、これらのポリペプチドと免疫反応し得る抗体、およ
びそのような組成物の製剤に関する。さらに、本発明
は、例えば対象核酸の異常発現を伴う障害を検出および
治療するための診断用および治療用分析方法、試薬およ
び組成物を提供する。
【００２７】Ｉ．一般 本発明は、一部、ヒトの腫瘍、特に固形腫瘍、例えば乳
癌または結腸癌のような癌腫（カルシノーマ）および肉
腫（サルコーマ）に存在する癌性細胞を同定および／ま
たは分類するための新規な方法に関する。この方法は癌
細胞系統および／または癌組織において、正常な結腸細
胞のような関連する正常細胞に比べて、差次的に発現さ
れる遺伝子を用いることにより、特定の遺伝子の発現の
アップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレ
ーション、すなわち、腫瘍発生に連携している事象（イ
ベント）、により腫瘍細胞を同定または分類する。
【００２８】オンコジーン（発癌遺伝子）のような特定
の遺伝子のアップレギュレーション、すなわち発現の増
加は悪性成長を促進する作用をする。腫瘍抑制遺伝子の
ような遺伝子のダウンレギュレーション、すなわち発現
の低減も悪性成長を促進する。従って、いずれの型の遺
伝子の発現の変化も、患者が癌、例えば結腸癌を発症ま
たはこれに罹患しているおそれがあるか否かを決定する
診断指標となる可能性がある。
【００２９】従って、一態様において、本発明はまた、
ヒトの腫瘍細胞、例えば結腸癌細胞に対する核酸マーカ
ーのようなバイオマーカーを提供する。本発明はまた、
これらの核酸マーカーによりコードされたタンパク質を
提供する。本発明はまた、かかる癌細胞の治療および結
腸癌細胞のような癌性状態の治療に有効な薬剤の同定方
法を提供する。従前の方法とは異なり、本発明は発生の
初期段階における癌細胞を同定するための手段を提供
し、そのため前悪性の細胞をそれらが人体中に蔓延する
前に同定することができる。これにより疑わしい癌性状
態を早期に検出することが可能となり、それらの癌性状
態の治療を、癌性細胞が人体中に蔓延する前に、または
不可逆的癌性状態の発生前に治療することが可能にな
る。
【００３０】ＩＩ．定義 便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲におい
て使用されている特定の用語および句の意味を以下に説
明する。
【００３１】本発明の核酸について用いる「異常な発
現」という用語は、その核酸の発現レベルが健康な組織
におけるその核酸の発現レベルと異なるか、または健康
な対象者に存在するポリペプチドの活性と異なることを
いう。ポリペプチドの活性は、その活性が天然の対応物
の活性よりも強いという理由で異常であってもよい。あ
るいはまた、その活性は、天然の対応物の活性に対して
活性が弱いまたは活性がないという理由で異常であって
もよい。異常な活性はまた活性の変化であってもよい。
例えば、異常なポリペプチドは異なる標的ペプチドと相
互作用するものであってもよい。細胞はその遺伝子の過
剰発現または過少発現のため遺伝子の異常発現レベルを
有することがある。
【００３２】本明細書において使用する「アゴニスト」
（作動薬）という用語は、タンパク質の生物活性を模倣
またはアップレギュレーションする（例えば、高めるま
たは補強する）薬剤を意味する。アゴニストは野生型タ
ンパク質の少なくとも一つの生物活性を有する野生型タ
ンパク質またはその誘導体であってもよい。アゴニスト
はまた遺伝子の発現をアップレギュレーションするかま
たはタンパク質の少なくとも一つの生物活性を向上する
化合物であってもよい。アゴニストはまたポリペプチド
と他の分子、例えば標的ペプチドまたは核酸との相互作
用を向上させる化合物であってもよい。
【００３３】「対立遺伝子」という用語は本明細書にお
いて「対立遺伝子変異体(allelic variant)」と互換的
に用いられるが、これは遺伝子又はその部分の択一的形
態をいう。対立遺伝子は相同染色体上の同一の遺伝子座
または位置を占める。対象が遺伝子の２つの同一の対立
遺伝子を有する場合、この対象はその遺伝子についてホ
モ接合であるといわれる。対象が遺伝子の異なる２つの
対立遺伝子を有する場合、この対象はその遺伝子につい
てヘテロ接合であるといわれる。特定の遺伝子の対立遺
伝子は、相互に単一のヌクレオチドまたはいくつかのヌ
クレオチドが異なっていてもよく、ヌクレオチドの置
換、欠失および／または挿入を含んでいてもよい。遺伝
子の対立遺伝子はまた変異を含む遺伝子の形態であって
もよい。
【００３４】「遺伝子の多型領域の対立遺伝子変異体」
という用語は、他の個体における遺伝子の当該領域に見
出されるいくつかのヌクレオチド配列のうちの一つを有
する遺伝子の領域をいう。
【００３５】本明細書において使用する「アンタゴニス
ト」という用語はタンパク質の少なくとも一つの生物活
性をダウンレギュレーションする（例えば、抑制または
阻害する）薬剤を意味する。アンタゴニストはタンパク
質と他の分子、例えば、標的ペプチドまたは酵素基質と
の間の相互作用を阻害または低減する化合物であっても
よい。アンタゴニストはまた、遺伝子の発現をダウンレ
ギュレーションするかまたは発現されたタンパク質の存
在量を減少させる化合物であってもよい。
【００３６】本明細書において使用する「抗体」という
用語は、例えば任意のアイソタイプの全抗体（ＩｇＧ、
ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）を含むものであり、それら
の断片、および一本鎖の抗体を含み、これらはまた脊椎
動物、例えば哺乳類のタンパク質と特異的に反応し得
る。抗体は通常の技術を用いて断片化することができ、
断片は全抗体について上述したのと同様に、効用につい
てスクリーニングすることができる。従って、この用語
は抗体分子のタンパク質分解により切断または組換えに
より調製された部分であって、特定のタンパク質と選択
的に反応する能力を有する部分のセグメントを含む。そ
のようなタンパク質分解および／または組換え断片の非
限定的な例としては、ペプチド・リンカーにより接合さ
れたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有す
るＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、および一
本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。これらのｓｃＦｖ
は共有結合的または非共有結合的に結合して２つ以上の
結合部位を有する抗体を形成してもよい。本発明はポリ
クローナル、モノクローナル、その他の精製された抗体
調整品および組換え抗体を含む。
【００３７】「アポトーシス」の現象はよく知られてお
り、プログラムされた細胞の死として説明することがで
きる。知られているように、アポトーシスは、細胞が毒
性物質またはその他の外部作用により殺された結果、細
胞が死亡する際の現象である「壊死」とは対照的であ
る。アポトーシスは染色質の濃縮、膜の小泡形成(blebb
ing)およびＤＮＡの断片化を伴い、これらはすべて一般
に顕微鏡検査の際に視認可能である。
【００３８】核酸の異常発現「に関連する」または「を
特徴とする」疾患、障害、または状態は、対象者におけ
る核酸の発現の異常なレベルにより引き起こされる、そ
の寄与による、またはそれを原因とする疾患、障害、ま
たは状態をいう。
【００３９】本明細書において使用するように「ポリペ
プチドの生理活性断片」という用語は、完全長ポリペプ
チドの断片のことをいい、野生型ポリペプチドの活性を
特異的に作動する（模倣する）かまたは拮抗する（阻害
する）ものをいう。この生物活性断片は少なくとも１種
の他の分子、例えば、完全長タンパク質が結合し得るタ
ンパク質、小分子、またはＤＮＡと相互作用する能力を
有する断片であるのが好ましい。
【００４０】「生物学的活性(biological activit
y)」、「生物活性(bioactivity)」、「活性(activit
y)」または「生物学的機能(biological function)」は
互換的に用いられ、本明細書においては、（天然のまた
は変性されたコンフォメーションにおける）ポリペプチ
ド、または任意のその部分配列により直接的または間接
的に奏されるエフェクターまたは抗原機能を意味する。
生物学的活性としては、ポリペプチドへの結合、他のタ
ンパク質または分子への結合、ＤＮＡ結合タンパク質と
しての活性、転写レギュレーターとしての活性、損傷し
たＤＮＡを結合する能力等が挙げられる。生物活性は、
対象ポリペプチドに直接影響を与えることにより調節す
ることができる。あるいはまた、生物活性はポリペプチ
ドのレベルを調節することにより、例えば相当する遺伝
子の発現を調節することにより変更することができる。
【００４１】「バイオマーカー」という用語は、生物分
子、例えば、核酸、ペプチド、ホルモン等のことをい
い、その存在または濃度を病態のような既知の状態で検
出または相関させることができるものをいう。
【００４２】「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿
主細胞」は本明細書においては互換的に使用される。こ
のような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのよう
な細胞の子孫または潜在的子孫をもいう用語である。突
然変異または環境の影響のいずれかにより後の世代に生
じることのある特定の変更のために、そのような子孫は
実際上、親細胞とは同一でないことがあるが、これらも
依然として本明細書において用いられている用語の範囲
内に含まれる。
【００４３】「キメラポリペプチド」または「融合ポリ
ペプチド」は、対象ポリペプチドの一つをコードする第
１のアミノ酸配列と、対象ポリペプチドの任意のドメイ
ンとは異種であり、実質的に相同でないドメイン（例え
ばポリペプチド部分）を定義する第２のアミノ酸配列と
の融合物である。キメラ・ポリペプチドは第１のポリペ
プチドをも発現する生物中（異なるポリペプチド中では
あるが）に見出される異種ドメインを提供してもよく、
または多様な生物によって発現される「種間」、「遺伝
子間」等のポリペプチドの融合構造であってもよい。一
般に、融合ポリペプチドは一般式（Ｘ）n−（Ｙ）m−
（Ｚ）n（式中、Ｙは対象ポリペプチドの一部を表し、
ＸおよびＺはそれぞれ独立に存在しないか、または生物
中に見出される天然の配列に関係していないか、もしく
は対象配列に連続するポリペプチド鎖として見出されな
いアミノ酸配列を表し、ｍは１以上の整数であり、各ｎ
は独立に０または１以上の整数を表す（ｎおよびｍは５
または１０以下であるのが好ましい。）
【００４４】「送達複合体」はターゲティング手段（例
えば、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド
の標的細胞表面に対する高親和性結合および／または標
的細胞による細胞または核への取り込みの増加を生じる
分子）を意味する。ターゲティング手段の例としてはス
テロール類（例えば、コレステロール）、脂質類（例え
ば、カチオン性脂質、ヴィロソーム(virosome)、または
リポソーム）、ウイルス類（例えば、アデノウイルス、
アデノ−関連ウイルス、およびレトロウイルス）、また
は標的細胞特異的結合剤類（例えば、標的細胞特異的受
容体により認識されるリガンド類）が挙げられる。好ま
しい複合体はｉｎ ｖｉｖｏで充分安定で標的細胞によ
る内在化に先立って顕著に見られる脱共役を顕著に防止
する。しかしながら、この複合体は細胞内で適当な条件
下で切断可能であるため、核酸、タンパク質、ポリペプ
チドまたはペプチドは機能的な形態で解放される。
【００４５】よく知られているように、遺伝子または特
定のポリペプチドは個体のゲノム内で単一コピーまたは
多数のコピーとして存在していることがある。そのよう
な複製遺伝子は同一であってもよく、またはヌクレオチ
ド置換、付加または欠失を含むが、全体が実質的に同じ
活性を有するポリペプチドを依然としてコードする修飾
を有しているものであってもよい。「ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列」という用語はこのように特定の個
体内の１種以上の遺伝子をいうことがある。さらに、個
々の生物間にヌクレオチド配列におけるいくつかの差異
が存在することがあり、これらは対立遺伝子と呼ばれ
る。このような対立遺伝子的差異はコードされたポリペ
プチドのアミノ酸配列に差異を生じさせる、または生じ
させないことがあり得るが、依然として同じ生物学的活
性を持つポリペプチドをコードする。
【００４６】「均等(equivalent)」という用語は機能的
に同等のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含むものと了解される。均等なヌクレオチド配列は対立
遺伝子変異体のように、１個以上のヌクレオチドの置
換、付加または欠失があることで異なる配列を含み、従
って、遺伝コードの縮重により配列番号1、３、５また
は７に示す核酸のヌクレオチド配列と異なる配列を含
む。
【００４７】本明細書において使用されているように、
「遺伝子」、「組換え遺伝子」および「遺伝子構築物」
という用語は、オープンリーディングフレームに関連す
る本発明の核酸をいい、エキソンおよび（任意に）イン
トロン配列の両方を含む。
【００４８】「組換え遺伝子」はポリペプチドをコード
し、エキソン配列を含む核酸をいうが、例えば、同類の
または同類ではない染色体遺伝子に由来するイントロン
配列を任意的に含んでいてもよい。「イントロン」とい
う用語は所与の遺伝子に存在するタンパク質に翻訳され
ないＤＮＡ配列をいい、一般にエキソン同士の間に見出
される。
【００４９】細胞の「成長」または「成長状態」という
用語は細胞の分化状態のみならず増殖状態をいう。従っ
て、この用語は細胞の分化状態、例えば、未分化、部分
的分化、または完全分化だけでなく、細胞が、例えば、
Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、前期、中期または終期にある細胞周
期の相をいう。限定するつもりはないが、細胞の分化は
通常細胞の増殖率の低下を伴う。
【００５０】「相同性」、「同一性」および「類似性」
は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列の
類似性をいい、同一性はより厳密な比較である。相同性
および同一性はそれぞれ、比較のために整列してもよい
各配列中の位置を比較することにより決定することがで
きる。比較された配列中の位置が同じ塩基またはアミノ
酸により占められているときは、これらの分子はその位
置において同一である。核酸配列間の相同性、類似性ま
たは同一性の程度は、これらの核酸配列により共有され
ている位置における同一またはマッチするヌクレオチド
の数の関数である。アミノ酸配列の同一性の程度は、こ
れらのアミノ酸配列により共有されている位置における
同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性
または類似性の程度は、これらのアミノ酸配列により共
有されている位置における、つまり構造的に関連してい
るアミノ酸の数の関数である。「未関連」または「非相
同」配列は、本発明の配列の一つと４０％未満の同一
性、好ましくは２５％未満の同一性しか持たない。
【００５１】「％同一」という用語は２つのアミノ酸配
列間または２つのヌクレオチド配列間の配列の同一性を
いう。同一性は比較のために整列してもよい各配列中の
位置を比較することにより決定することができる。比較
された配列中の均等な位置が同じ塩基またはアミノ酸に
より占められているときは、これらの分子はその位置に
おいて同一であり、均等な部位が同じまたは類似のアミ
ノ酸残基（例えば、立体的および／または電子的性質が
類似）により占められているときは、これらの分子はそ
の位置において相同（類似）であるということができ
る。相同性、類似性または同一性の百分率表示は、比較
された配列により共有されている位置における同一また
は類似のアミノ酸の数の関数をいう。ＦＡＳＴＡ、ＢＬ
ＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺをはじめとする種々の整列
アルゴリズムおよび／またはプログラムを使用すること
ができる。ＦＡＳＴＡとＢＬＡＳＴはＧＣＧ配列分析パ
ッケージ（米国ウィスコンシン州マジソン市、ウィスコ
ンシン大学）の一部として入手可能であり、例えばデフ
ォールト設定で使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは
米国メリーランド州ベセスダ市、国立衛生図書館、国立
医学研究室、国立バイオテクノロジー情報センターを通
して入手可能である。一実施形態において、２つの配列
の％同一性はGCGプログラムによりギャップ重み(gap we
ight)を、例えば１、すなわち２つの配列間で各アミノ
酸のギャップが単一のアミノ酸またはヌクレオチドのミ
スマッチであるとみなして重み付けして、決定すること
ができる。
【００５２】整列のための他の技術は、Methods in Enz
ymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolec
ular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Acad
emicPress, Inc., a division of Harcourt Brace &C
o., San Diego, California,USAに記載されている。配
列にギャップを許容する整列プログラムを用いて配列を
整列するのが好ましい。Smith-Watermanは配列の整列に
ギャップを許容するアルゴリスムの一つのタイプであ
る。Meth. Mol. 70-187 (1997)を参照されたい。また、
NeedlemanおよびWunsch整列方法を用いるGAPプログラム
を用いて配列を整列することができる。別の検索戦略と
しては、MASPARコンピュータ上で動作するMPSRCHソフト
ウェアを用いる。MPSRCHはSmith-Watermanアルゴリスム
を使用して超大型並列コンピュータ上で配列の得点を計
算する。このアプローチは遠く隔たって関連している対
を拾い上げる能力を改善し、かつ小さなギャップやヌク
レオチド配列のエラーに対して特に寛容である。核酸に
コードされたアミノ酸配列を用いてタンパク質およびＤ
ＮＡデータベースの両方を検索することができる。
【００５３】個々の配列のデータベースは、Methods in
Enzymology, ed. Doolittleに記載されている。データ
ベースとしてはGenbank、 EMBL、および日本ＤＮＡデー
タバンク（DDBJ）が挙げられる。
【００５４】好ましい核酸は、配列番号1、３、５また
は７の一つに示された配列の核酸配列に対して少なくと
も約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％同一、
さらに好ましくは少なくとも９０％、それよりさらに好
ましくは約９５％同一である配列を有する。配列番号
1、３、５または７の一つにより表された核酸配列と少
なくとも約９０％、さらに好ましくは約９５％、および
もっとも好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一であ
る核酸も、もちろん本発明の範囲内である。好適な実施
形態では、この核酸は哺乳動物起源である。
【００５５】本明細書において使用する「相互作用」と
いう用語は、天然に存在しているタンパク質−タンパク
質、タンパク質−核酸、核酸−核酸、およびタンパク質
−小分子または核酸−小分子間の相互作用のような、分
子間の検出可能な相互作用（例えば、生化学的相互作
用）を含む。
【００５６】本明細書においてＤＮＡまたはＲＮＡのよ
うな核酸について使用する「単離された」という用語
は、巨大分子の天然の供給源に存在する他のＤＮＡまた
はＲＮＡから個々に分離された分子をいう。本明細書で
使用するこの「単離された」という用語はまた、組換え
ＤＮＡ技術により生産されたときは実質的に純粋な、す
なわち細胞物質、ウイルス物質または培地を含まない核
酸またはペプチド、また化学合成されたときは化学的前
駆体または他の化学物質を含まない核酸またはペプチド
をいう。さらに、「単離された核酸」は、天然には断片
としては存在せず、自然状態では見出されない実質的に
純粋なおよび／または精製された核酸断片を含む。「単
離された」という用語は本明細書においてはまた他の細
胞タンパク質から単離されたポリペプチドをいい、実質
的に精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両
方を含むものとして使用する。
【００５７】本明細書において使用する「調節される」
および「差次的に調節された」という用語は、アップレ
ギュレーション（すなわち、活性化または刺激（例え
ば、作動または増強することによる））およびダウンレ
ギュレーション（すなわち、阻害または抑制（例えば、
拮抗、減少または阻害することによる））の両方をいう
ものとして使用する。
【００５８】「突然変異遺伝子」という用語は、突然変
異した遺伝子を有する対象の表現型を、この突然変異し
た遺伝子を持たない対象に比較して変化させる能力を有
する遺伝子の対立遺伝子形態をいう。対象が変化した表
現型を持つこの突然変異に対してホモ接合でなければな
らないときは、この突然変異は劣性といわれる。対象の
遺伝子型を変化させるのに突然変異した遺伝子の１コピ
ーで充分であるならば、この突然変異は優性であるとい
われる。対象が１コピーの突然変異した遺伝子を持ち、
しかもホモ接合の表現型とヘテロ接合対象（その遺伝子
について）の表現型との中間である表現型を持つなら
ば、この突然変異は共優性(co-dominant)といわれる。
【００５９】添付の配列表中に現れる「Ｎ」という記号
は対応するヌクレオチドの正体が未知であることを示
す。「Ｎ」は従って必ずしも任意のヌクレオチド、例え
ばＡ、Ｔ、ＣまたはＧを用いた置換を許容していると解
釈されるべきではなく、むしろ正体が確定されなかった
ヌクレオチドの位置を保持するものとして解釈されるべ
きである。
【００６０】本発明の「非ヒト動物」は齧歯類、非ヒト
霊長類、羊、犬、牛、のような哺乳類、鶏、両生類、爬
虫類等を含む。好ましい非ヒト動物はラットおよびマウ
スを含む齧歯科から選ばれ、最も好ましくはマウスであ
るが、Xenopus属のメンバーなどのトランスジェニック
両生類、およびトランスジェニックニワトリも例えば胚
発生および組織形成に影響を与えることができる薬剤を
理解し同定するための重要なツールを提供することがで
きる。「キメラ動物」という用語は本明細書において、
組換え遺伝子が発現される動物、または動物の細胞全部
ではないがかなりの細胞において組換え遺伝子が見出さ
れる動物をいう。「組織特異的キメラ動物」という用語
は組換え遺伝子の一つが、ある組織では存在しおよび／
または発現または分断されるが、他の組織ではそうでは
ないことを示す。
【００６１】本明細書において使用されているように、
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）お
よびしかるべき場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポ
リヌクレオチド類をいう。この用語はまた、均等物とし
て、ヌクレオチド類縁体から作成されたＲＮＡまたはＤ
ＮＡの類縁体および記載された実施形態に適用可能なよ
うに、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本
鎖ポリヌクレオチドを含むのものとして了解されるべき
である。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒ
ＲＮＡは核酸として言及される分子の代表例である。
【００６２】「配列番号ｘに示すヌクレオチド配列に相
補的なヌクレオチド配列」という用語は、配列番号ｘを
有する核酸鎖の相補的鎖のヌクレオチド配列をいう。
「相補的な鎖」という用語は本明細書において「相補
体」と互換的に使用されている。核酸ストランドの相補
体はコード鎖または非コード鎖の相補体であることがで
きる。
【００６３】「多型性」という用語は、一つの遺伝子ま
たはその部分（例えば、対立遺伝子変異体）の二つ以上
の形が共存していることをいう。少なくとも２つの異な
る形態の遺伝子の部分、すなわち２つの異なるヌクレオ
チド配列が存在する遺伝子の部分、は「遺伝子の多型領
域」という。多型性領域は単一のヌクレオチドであって
もよく、その正体は異なる対立遺伝子で異なる。多型性
領域はまた数ヌクレオチドの長さのものであってもよ
い。
【００６４】「多型遺伝子」は少なくとも一つの多型性
領域を有する遺伝子をいう。
【００６５】本明細書において使用されているように、
「プロモーター」という用語は当該プロモーターに操作
可能に結合された選定されたＤＮＡ配列の発現を調節す
るＤＮＡ配列を意味し、細胞内でこの選定されたＤＮＡ
配列の発現を行う。この用語は「組織特異的」プロモー
ター、すなわちこの選定されたＤＮＡ配列の発現を特定
の細胞（例えば特定の組織の細胞）内でのみ行うプロモ
ーターを包含する。この用語はまたいわゆる「漏出性(l
eaky)」プロモーターをも含む。このプロモーターは、
主に一つの組織において選定されたＤＮＡの発現を調節
するが、他の組織でも発現させる。この用語はまた、非
組織特異的プロモーターおよび構成的に発現されるまた
は誘導することができる（すなわち発現レベルが制御で
きる）プロモーターを包含する。
【００６６】「タンパク質」、「ポリペプチド」および
「ペプチド」という用語は、本明細書において遺伝子産
物に言及する場合は互換的に用いられる。
【００６７】「組換えタンパク質」という用語は、組換
えＤＮＡ技法により生産される本発明のポリペプチドを
いい、一般にポリペプチドをコードするＤＮＡが適当な
発現ベクターに挿入され、このベクターが今度は宿主細
胞を形質転換するのに用いられてヘテロ接合タンパク質
を生成する。さらに、組換え遺伝子に関して、「から得
られる(derived from)」という句は、「組換えタンパク
質」の意味の範囲内において、天然のポリペプチドのア
ミノ酸配列、または天然に存在する形態のポリペプチド
の置換および欠失（切断(truncation)を含む）を含む突
然変異により生成された、天然のポリペプチドのアミノ
酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を含
む。
【００６８】本明細書において使用する「小分子」は、
分子量が約５ｋＤ未満であり、もっとも好ましくは約４
ｋＤ未満である組成物を意味する。小分子は核酸、ペプ
チド、ポリペプチド、ペプチド類似体、炭水化物、脂
質、またはその他の有機（炭素含有）分子または無機分
子であってもよい。多くの製薬会社は、化学的および／
または生物学的混合物、多くの場合真菌、細菌、または
藻類抽出物の膨大なライブラリーを保有し、これらを本
発明のアッセイでスクリーニングして生物活性を調整す
る化合物を特定することができる。
【００６９】本明細書において使用されているように、
「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出
する」という用語は、本発明の核酸分子が、配列番号
１、３、５または７に示す配列あるいはそれらに相補的
な配列、あるいはそれらの天然に存在する突然変異体の
任意の一つに示された核酸の、例えば約６個、１２個、
１５個、２０個、３０個、５０個、１００個、１５０
個、２００個、３００個、３５０個、４００個、５００
個、７５０個または１、０００個の連続ヌクレオチドの
少なくとも一部とハイブリダイズして、異なるタンパク
質をコードする細胞性核酸（例えばｍＲＮＡまたは染色
体ＤＮＡ）に対するバックグラウンドハイブリダイゼー
ションを約１５％未満、好ましくは約１０％未満、さら
に好ましくは約５％未満とする能力をいう。好適な実施
形態では、オリゴヌクレオチド・プローブは特定の核酸
だけを検出し、例えば類似または関連する核酸類または
それらの相補体とは実質的にハイブリダイズしない。
【００７０】「転写調節配列」は、本明細書中を通し
て、開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターな
ど、それらが操作可能に結合しているタンパク質をコー
ドする配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列を指
称するために用いられる総称である。好適な実施形態で
は、一つの遺伝子の転写は、発現が意図する細胞型にお
ける組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列
（または他の転写調節配列）の制御下にある。同様に、
この組換え遺伝子は、天然に存在する型のポリペプチド
の転写を制御する配列と同じかまたはそれとは異なる転
写調節配列の支配下に置くこともできることがわかる。
【００７１】本明細書において使用されているように、
「トランスフェクション」という用語は、核酸を例えば
発現ベクターを介して核酸媒介遺伝子移入により宿主細
胞内に導入することを意味する。本明細書において使用
されているように、「形質転換」は、細胞が外来ＤＮＡ
またはＲＮＡを細胞に取り込んだ結果、細胞の遺伝子型
が変化する過程をいい、例えば形質転換された細胞は組
換えられた形態のポリペプチドを発現するか、または導
入された遺伝子からのアンチセンス発現の場合は、標的
遺伝子の発現を混乱させる。
【００７２】本明細書において使用されているように、
「導入遺伝子」という用語は、細胞内に導入された核酸
配列（またはそのアンチセンス転写物）を意味する。導
入遺伝子は部分的にまたは完全に非相同、すなわちそれ
を導入したトランスジェニック動物または細胞に対して
異種であってもよく、または、それを導入したトランス
ジェニック動物または細胞の内在遺伝子に対して相同で
あってもよいが、その動物のゲノム内に、それが挿入さ
れた細胞のゲノムが変化する（例えば、天然の遺伝子の
位置とは異なる位置に挿入されるかまたはその挿入の結
果ノックアウトが起きる）ように挿入される方法で設計
されているか、または挿入されている。導入遺伝子はま
た細胞内にエピソームの形で存在していてもよい。導入
遺伝子は、１つ以上の転写調節配列および選定された核
酸の発現を最適にするのに必要とされることがある任意
の他の核酸、例えばイントロンを含んでいてもよい。
【００７３】「トランスジェニック動物」は任意の動
物、好ましくは非ヒト哺乳動物、鳥類または両生類であ
って、当該動物の細胞の１個以上が人間の介入により、
例えば、当技術においてよく知られている遺伝子導入技
法により導入された非相同核酸を含有するものをいう。
この核酸は、慎重な遺伝子操作により、例えば、マイク
ロインジェクションにより、または組換えウイルスに感
染させることにより、細胞の前駆体内に導入すること
で、直接的にまたは間接的に細胞内に導入される。遺伝
子操作という用語は、古典的な交雑またはin vitro増殖
を含まず、組換えＤＮＡ分子の導入に関する。この分子
は染色体内で組込まれるか、または染色体外で複製する
ＤＮＡであってもよい。ここに説明する典型的なトラン
スジェニック動物において、導入遺伝子は細胞に、対象
ポリペプチドの一つの組換え形態、例えば、アゴニスト
的またはアンタゴニスト形態のいずれかを発現させる。
しかしながら、例えば、下記のＦＬＰまたはＣＲＥ組換
え酵素依存性構築物のような、組換え遺伝子が沈黙して
いるトランスジェニック動物も意図されている。さら
に、「トランスジェニック動物」はまた、組換えおよび
アンチセンス技法の両方を含む人間の介入により１つ以
上の遺伝子の破壊が起こされた組換え動物をも含む。
【００７４】本明細書において使用する「治療する」と
いう用語は、状態または疾患の少なくとも１つの症状を
改善するだけでなく治癒することをも包含する。
【００７５】「ベクター」という用語は、それに結合し
ている他の核酸を輸送する能力を有する核酸分子をい
う。好適なベクターの一つのタイプはエピソーム、すな
わち、染色体外複製能力を有する核酸である。好適なベ
クターは、それらに結合している核酸の自己複製および
／または発現をする能力を有するものである。それらに
操作可能に結合している遺伝子の発現を指令する能力を
有するベクターは、本明細書においては「発現ベクタ
ー」という。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な
発現ベクターは「プラスミド」の形をしていることが多
い。ここで、「プラスミド」は一般に、ベクターの形に
おいては染色体に結合されていない、円形の二本鎖ＤＮ
Ａループをいう。本明細書においては、プラスミドはベ
クターのもっとも普通に用いられる形であることから
「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられ
ている。しかしながら、本発明は均等な機能を発揮し、
以下に述べるように当技術において知られている他の形
の発現ベクターをも含むものである。
【００７６】「野生型対立遺伝子」という用語は、対象
中に２つのコピーが存在するときに、野生型表現型を生
じる遺伝子の対立遺伝子をいう。特定の遺伝子にはいく
つかの異なる野生型対立遺伝子が存在し得るが、これは
遺伝子における特定のヌクレオチドの変化が、ヌクレオ
チドの変化した遺伝子を２つのコピー有する対象の表現
型に影響を与えないことがあることによる。
【００７７】ＩＩＩ．本発明の核酸 下記のように、本発明の一態様は、単離核酸、変異体お
よび／またはかかる核酸の均等物に関する。
【００７８】配列番号１、３、５、または７、それらに
相補的な配列、あるいは配列番号１、３、５、または７
の配列に特異的にハイブリダイズする配列のような本発
明の核酸は、腫瘍細胞、例えば結腸癌由来細胞系におい
て、（正常組織、例えば正常結腸組織および／または正
常非結腸組織における発現レベルを比較して）差次的に
発現されて同定された。いくつかのある実施形態では、
対象核酸は、少なくとも約０．５倍、少なくとも約２
倍、少なくとも約５倍、少なくとも約２０倍、または少
なくとも約５０倍差次的に発現される。好ましい核酸と
しては、結腸癌組織および結腸癌細胞系の両方において
差次的に発現されて同定される配列細胞が挙げられる。
好ましい実施形態では、本発明の核酸は、腫瘍細胞、特
に結腸癌組織および／または結腸癌由来細胞系において
アップレギュレートされる。別の実施形態では、本発明
の核酸は、腫瘍細胞、特に結腸癌組織および／または結
腸癌由来細胞系においてダウンレギュレートされる。
【００７９】異常増殖細胞における、癌遺伝子のような
アップレギュレートされる遺伝子、または腫瘍サプレッ
サーのようなダウンレギュートされる遺伝子は、診断ま
たは治療技法の対象となり得る。例えば、ｃｄｃ２遺伝
子のアップレギレーションは有糸分裂を誘発する。有糸
分裂不活性剤であるｍｙｔ１遺伝子の過剰発現は、ｃｄ
ｃ２の活性を負の方向に調節する。したがって、異常増
殖は、ｃｄｃ２をアップレギュレートすることか、また
はｍｙｔ１をダウンレギュレートすることにより誘発さ
れ得る。同様に、ｐ５３およびＲｂのような腫瘍サプレ
ッサーのダウンレギュレーションは、腫瘍発生に関与し
ている。
【００８０】本発明のさらなる他の好ましい核酸は、配
列番号１、３、５、または７のうちの１つによりコード
されるポリペプチドの少なくとも一部を含むポリペプチ
ドをコードする。例えば、プローブ／プライマーまたは
アンチセンス分子としての使用に好ましい核酸分子（す
なわち、非コード核酸分子）は、配列番号１、３、５、
または７の配列に実質的に相補的な核酸とハイブリダイ
ズするのに十分な配列番号１、３、５、または７の核酸
配列の領域を含んでいる。プローブ／プライマーとして
の使用に好ましい核酸分子は、配列番号１、３、５、ま
たは７の配列とハイブリダイズするのに十分な配列番号
１、３、５、または７の配列に実質的に相補的な核酸配
列の領域をさらに含んでいる。プローブ／プライマーと
して使用するための本発明の核酸配列は、好ましくは、
少なくとも約１２、２０、３０、５０、６０、７０、８
０、９０、または１００塩基対長から完全遺伝子長まで
である。コード核酸分子は、例えば、約５０、６０、７
０、８０、９０、または１００塩基対から完全遺伝子長
まで含んでいることがある。
【００８１】本発明の別の態様は、配列番号１、３、
５、または７、あるいはそれらに相補的な配列のうちの
１つによって表される核酸配列に、低、中または高スト
リンジェント条件下にてハイブリダイズする核酸を提供
する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な
ストリンジェント条件（例えば、約４５℃にて６．０×
塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続い
て５０℃にて２．０×ＳＳＣの洗浄）は、当業者に既知
であるか、またはCurrent Protocols in Molecular Bio
logy, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-12.3.
6にて見出すことができる。例えば、洗浄工程における
塩濃度は、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジ
ェントから５０℃での約０．２×ＳＳＣの高ストリンジ
ェントまでから選択され得る。さらに、洗浄工程での温
度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェント条件か
ら、約６５℃での高ストリンジェント条件まで高めるこ
とができる。温度および塩の両方を変化させてもよく、
あるいは温度または塩濃度の一方を一定にして、他の変
数を変化させてもよい。好ましい実施形態では、本発明
の核酸は、中程度のストリンジェント条件下にて（例え
ば、約２．０×ＳＳＣおよび約４０℃にて）、配列番号
１、３、５、または７、あるいはそれらに相補的な配列
のうちの１つに結合するであろう。特に好ましい実施形
態では、本発明の核酸は、高ストリンジェント条件下に
て、配列番号１、３、５、または７、あるいはそれらに
相補的な配列のうちの１つに結合するであろう。
【００８２】一実施形態では、本発明は、室温で６×Ｓ
ＳＣの低ストリンジェント条件下にてハイブリダイズ
し、続いて室温で２×ＳＳＣでの洗浄される核酸を提供
する。
【００８３】別の実施形態では、本発明は、約６５℃で
２×ＳＳＣの高ストリンジェント条件下にてハイブリダ
イズし、続いて約６５℃での０．２×ＳＳＣでの洗浄さ
れる核酸を提供する。
【００８４】遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号
１、３、５、または７、あるいはそれらに相補的な配列
のうちの１つにて示されるヌクレオチド配列と異なる配
列を有する核酸もまた、本発明の範囲内である。かかる
核酸は、機能的に等価なペプチド（すなわち、等価な、
または類似の生物学的活性を有するペプチド）をコード
するが、遺伝子コードの縮重に起因して、配列表に示す
配列とは配列の点で異なる。例えば、アミノ酸の多く
は、２つ以上のトリプレットにより表わされる。同じア
ミノ酸を特定するコドン、またはシノニム（例えば、Ｃ
ＡＵおよびＣＡＣはそれぞれヒスチジンをコードする）
は、ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさない
「静(silent)」突然変異をもたらす。しかしながら、対
象ポリペプチドのアミノ酸配列における変化を引き起こ
すＤＮＡ配列多型性が、哺乳動物間に存在するであろう
ことが予想される。当業者は、ポリペプチド活性を有す
るポリペプチドをコードする核酸の１つまたはそれ以上
のヌクレチド（例えば、ヌクレオチドの約３〜５％以
下）におけるこれらの変異が、天然の対立遺伝子変異に
起因して、所定の種の個体間に存在し得ることを理解さ
れるであろう。
【００８５】配列番号１、３、５、または７、あるいは
それらに相補的な配列の核酸によってコードされるタン
パク質のスプライシング変異体、あるいはかかるタンパ
ク質の天然同族体をコードする核酸もまた、本発明の範
囲内である。かかる同族体は、本明細書中にてさらに記
載するように、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲに
よりクローニングされ得る。
【００８６】ポリヌクレオチド配列はまた、対象ポリペ
プチドのための、リーダー配列、例えば天然のリーダー
配列または異種リーダー配列をコードしてもよい。例え
ば、所望のＤＮＡ配列は、宿主細胞からのポリペプチド
の発現および分泌を助けるＤＮＡ配列（例えば、細胞か
らのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列とし
て機能するリーダー配列）と同じリーディングフレーム
にて融合されてもよい。リーダー配列を有するタンパク
質は、プレタンパク質であり、宿主細胞により切断され
るリーダー配列を有して、タンパク質の成熟体を形成す
ることがある。
【００８７】本発明のポリヌクレオチドはまた、フレー
ム中で、マーカー配列（本明細書中にて「タグペプチ
ド」をコードする「タグ配列」とも云う）に融合される
ことができ、本発明のマーキングおよび／または精製を
可能にする。好ましい実施形態では、マーカー配列は、
例えばＰＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒ
スチジンである。多数の他のタグペプチドは、市販され
ている。他の頻繁に用いられるタグとしては、ｃ−ｍｙ
ｃからの１０残基配列を含むｍｙｃ−エピトープ（例え
ば、Ellison et al. (1991) J Biol hem 266:21150-2 1
157）、ｐＦＬＡＧ系(International Biotechnologies,
Inc.)、ｐＥＺＺタンパク質Ａ系(Pharmacia, NJ)、お
よびヘモフィルスインフルエンザ菌赤血球凝集素タンパ
ク質の１６アミノ酸部分が挙げられる。さらに、タグポ
リペプチドと特異的に相互作用する試薬（例えば、抗
体）が入手可能であるか、あるいは調製され得るか、ま
たは同定され得る限り、いずれのポリペプチドもタグと
して使用され得る。
【００８８】下記する例により示されるように、核酸
は、多数の真核細胞のいずれかに存在するｍＲＮＡから
得ることができ、例えば好ましくは、後生動物細胞、よ
り好ましくは脊椎動物細胞、さらに好ましくは哺乳動物
細胞から得られる。本発明の核酸は、成体および胚のゲ
ノムＤＮＡの両方から得ることもまた可能であるはずで
ある。例えば、遺伝子は、当業者に一般的に既知のプロ
トコルに従って、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーか
らクローニングされ得る。ｃＤＮＡは、細胞（例えば、
胚細胞を含む、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、またはヒ
ト細胞）からの全ｍＲＮＡを単離することにより得るこ
とができる。次に、二本鎖ｃＤＮＡは、全ｍＲＮＡから
調製することができ、続いて多数の既知の技法のいずれ
か１つを用いて、適切なプラスミドまたはバクテリオフ
ァージに挿入することができる。遺伝子はまた、本発明
により提供されるヌクレオチド配列情報に従って、確立
されたポリメラーゼ連鎖反応技法を用いてクローニング
することができる。
【００８９】本発明は、この生物学的材料から得られる
核酸のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを、
本発明の範囲内に包含し、ここで、核酸は、配列番号
１、３、５、または７の少なくとも１つの配列の少なく
とも１５個の隣接ヌクレオチドと、ストリンジェント条
件（６５℃での少なくとも約４×ＳＳＣ、または４２℃
での少なくとも４×ＳＳＣ、例えば、参照により本明細
書に援用される米国特許第５，７０７，８２９号を参
照）下にてハイブリダイズする。このことにより、配列
番号１、３、５、または７の少なくとも１５個の隣接ヌ
クレオチドをプローブとして用いる場合、プローブは、
相補的配列を含む（生物学的材料の）遺伝子またはｍＲ
ＮＡと優先的にハイブリダイズし、選択プローブに特有
にハイブリダイズする生物学的材料の核酸の同定および
回収を可能にするであろう。配列番号１、３、５、また
は７の２つ以上からのプローブは、それらが得られたｃ
ＤＮＡが１つのｍＲＮＡに対応する場合、同じ遺伝子ま
たはｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう。１６個以
上のヌクレオチドのプローブを用いることができるが、
１５個のヌクレオチドは、特有の同定に十分な配列であ
る。
【００９０】別の実施形態では、核酸は、正常結腸特定
組織から調製されるライブラリーから単離される。核酸
配列ライブラリーを生産およびプローブするための技法
は、例えば、Sambrook et al, 「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual」(New York, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989)に記載されている。ｃＤＮＡは、配
列番号１、３、５、または７からの配列に基づくプライ
マーを用いることにより調製され得る。一実施形態で
は、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリアデニル化ｍＲＮＡ
からのみ作製することができる。よって、ポリ−Ｔ−プ
ライマーを用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製するこ
とができる。配列番号１、３、５、または７の整列は、
関連ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同定という
結果を生じ得る。本明細書中に開示するポリヌクレオチ
ドのいくつかは、検索手順中にマスキングを受けた繰り
返し領域を含有する。繰り返し領域に関する情報は、以
下に記載する。
【００９１】配列番号１、３、５、または７、あるいは
それらに相補的な配列を有するポリヌクレオチド構築物
は、合成的に生成することができる。あるいは、非常に
多くのオリゴデオキシリボヌクレオチドからの遺伝子お
よび全プラスミドの単一工程構築は、Stemmer et at, G
ene (Amsterdam)(1995) 164 (i): 49-53により記載され
ている。この方法では、構築ＰＣＲ（非常に多くのオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｓ）からの長
いＤＮＡ配列の合成）が記載されている。この方法は、
ＤＮＡシャフリング(Stemmer, Nature (1994) 370:389-
391)に由来し、ＤＮＡリガーゼに依存せず、ＤＮＡポリ
メラーゼに依存して、構築過程中に、さらに長いＤＮＡ
断片を形成する。例えば、ＴＥＭ−１ベータ−ラクタマ
ーゼをコードする遺伝子(bla)を含有する１．１ｋｂ断
片は、各４０ヌクレオチド（ｎｔ）長の５６ｏｌｉｇｏ
ｓの全量から単一反応にて構築され得る。合成遺伝子
は、唯一の選択マーカーとしてテトラサイクリン耐性遺
伝子（Ｔｃ−Ｒ）を含有するベクター中でＰＣＲ増幅さ
れて、クローニングされ得る。アンピシリン（Ａｐ）選
択に依存することなく、Ｔｃ−Ｒコロニーの７６％がＡ
ｐ−Ｒであり、このアプローチを、いかなる遺伝子の迅
速かつ費用効率が高い合成のための一般方法にしてい
る。
【００９２】ＩＶ．当該技術で認識されている方法を用
いた新規遺伝子の機能的および構造的モチーフの同定 核酸、ｃＤＮＡ、または完全遺伝子のヌクレオチド配列
の翻訳は、別個の既知の配列とともに整列され得る。別
個の配列との類似性は、本発明のポリヌクレオチドによ
りコードされるポリペプチドの活性を測定するのに使用
することができる。例えば、ケモカイン配列との類似性
を示す配列は、ケモカイン活性を示し得る。また、２つ
以上の別個の配列との類似性を示す配列は、別個の配列
の一方または両方に特徴的である活性を示すことがあ
る。
【００９３】最も近い隣接物のポリヌクレオチド配列の
完全長配列および断片は、核酸の完全長配列を同定し
て、単離するためのプローブおよびプライマーとして使
用することができる。最も近い隣接物は、核酸の完全長
配列のためのライブラリーを構築するために使用される
べき組織または細胞型を指し示すことができる。
【００９４】典型的に、核酸は、すべての６つのフレー
ムにて翻訳され、別個の配列との最良の整列を確定す
る。配列表にて、本明細書中に開示する配列は、５’か
ら３’配向であり、３つのフレームでの翻訳は、十分で
ある（実施例に記載するように、少数の例外はある
が）。これらのアミノ酸配列は、一般的にクエリー配列
と称され、個々の配列とともに整列されるであろう。
【００９５】核酸配列は、上記に開示する方法のいずれ
かにより、公知の遺伝子と比較することができる。別個
およびクエリー配列の整列の結果は、３つのカテゴリ
ー：高い類似性、弱い類似性、および類似性なしに分け
ることができる。高い類似性から弱い類似性までの別個
の整列の結果は、ポリペプチド活性および／または構造
を決定するための基礎を提供する。
【００９６】個々の結果を類別するためのパラメータと
しては、最強の整列が見られる整列領域長のパーセン
ト、配列同一性パーセント、およびｐ値が挙げられる。
【００９７】整列領域長のパーセントは、最強の整列の
領域にて見られる別個配列の残基の数を数えることによ
り計算される。この数は、クエリー配列の全残基長で除
算して、パーセントが得られる。例を以下に示す：
【００９８】
【化１】
【００９９】整列の領域は、アミノ酸９から始まり、ア
ミノ酸１９で終わる。クエリー配列の全長は、２０アミ
ノ酸である。整列領域長のパーセントは、１１／２０ま
たは５５％である。
【０１００】配列同一性パーセントは、クエリー配列お
よび別個の配列間のアミノ酸マッチの数を数えて、マッ
チの全数を最強整列の領域に見られる別個の配列の残基
の数で除算することにより計算される。上記の例に関し
て、同一性パーセントは、１０マッチを１１個のアミノ
酸で除算したものであるか、または約９０．９％であろ
う。
【０１０１】P値は、整列が偶然に生じた確率である。
単一整列に関して、ｐ値は、Karlinet al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. 87: 2264 (1990)、およびKarlin et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: (1993)に従って計算
することができる。同じクエリー配列を用いた複数整列
のｐ値は、Altschul et al., Genet. 6:119 (1994)に記
載される発見的アプローチを用いて計算することができ
る。ＢＬＡＳＴプログラムのような整列プログラムによ
り、ｐ値を計算することができる。
【０１０２】配列が整列する領域の境界は、上述のDool
ittle, Methods in Enzymology、ＢＬＡＳＴまたはＦ
ＡＳＴＡプログラムに従って、あるいは配列同一性が最
も高い範囲を決定することにより、確定することができ
る。
【０１０３】同一性または類似性を確定するために考え
るべき別の要素は、類似性または同一性の位置である。
強力な局所配列は、配列長が短い場合でさえも類似性を
示す。クエリー配列長全体に散在する配列同一性はま
た、クエリーおよびプロフィール配列間の類似性を示す
ことができる。
【０１０４】高い類似性 高い類似性とみなされるべき整列結果に関して、整列領
域長のパーセントは、典型的には、全クエリー配列長の
少なくとも約５５％、より典型的には少なくとも約５８
％、さらに典型的にはクエリー配列の全残基長の少なく
とも約６０％である。通常は、整列領域の長さのパーセ
ントは、約６２％程度、より通常的には約６４％程度、
さらに通常的には約６６％程度であり得る。
【０１０５】さらに、高い類似性に関して、整列領域は
典型的には少なくとも約７５％、より典型的には少なく
とも約７８％、さらに典型的には少なくとも約８０％の
配列同一性を示す。通常、配列同一性パーセントは、約
８２％程度、より通常的には約８４％程度、さらに通常
的には約８６％程度であり得る。
【０１０６】ｐ値は、これらの方法と併用される。高い
類似性が見られる場合、クエリー配列は、ｐ値が約１０
-2以下、より通常的には約１０-3以下、さらに通常的に
は約１０-4以下である場合にプロフィール配列と高い類
似性を有するとみなされる。より典型的には、ｐ値は、
高い類似性とみなされるべきクエリー配列に関して、約
１０-5以下、より典型的には約１０-10以下、さらに典
型的には約１０-1程度かそれ以下である。
【０１０７】弱い類似性 弱いとみなされる整列結果に関して、整列領域長の最小
パーセントも、整列の最小長も存在しない。弱い類似性
のより良い表示は、整列の領域が、典型的には少なくと
も約１５個、より典型的には少なくとも約２０個、さら
に典型的には少なくとも約２５個のアミノ酸残基長であ
る場合にみなされる。通常は、整列領域長は、約３０個
程度、より通常的には約４０個程度、さらに通常的には
約６０個程度のアミノ酸残基であり得る。
【０１０８】さらに、弱い類似性に関して、整列の領域
は、典型的に、少なくとも約３５％、より典型的には少
なくとも約４０％、さらに典型的には少なくとも約４５
％の配列同一性を示す。通常は、配列同一性パーセント
は、約５０％程度、より通常的には約５５％程度、さら
に通常的には約６０％程度であり得る。
【０１０９】低い類似性が見られる場合、クエリー配列
は、ｐ値が、通常約１０-2以下、より通常的には約１０
-3以下、さらに通常的には約１０-4以下である場合にプ
ロフィール配列と弱い類似性を有するとみなされる。よ
り典型的には、弱い類似性とみなされるクエリー配列に
関して、ｐ値は約１０-5程度、より通常的には約１０
-10程度かそれ以下、さらに通常的には約１０-15程度か
それ以下である。
【０１１０】配列同一性により確定される類似性 配列同一性そのものを用いて、別個の配列に対するクエ
リー配列の類似性を確定し、配列の活性を示すことがで
きる。かかる整列は、好ましくは、ギャップが配列を整
列することを可能にする。典型的に、全クエリー配列に
わたる配列同一性が、少なくとも約１５％、より典型的
には少なくとも約２０％、さらに典型的には少なくとも
約２５％、よりいっそう典型的には少なくとも約５０％
である場合に、クエリー配列は、プロフィール配列に関
連する。類似性の尺度ととしての配列同一性そのもの
は、クエリー配列が、通常的には少なくとも８０残基、
より通常的には９０残基、さらに通常的には少なくとも
９５アミノ酸残基長である場合に最も有用である。より
典型的には、クエリー配列が、好ましくは１００残基
長、より好ましくは１２０残基長、さらに好ましくは１
５０アミノ酸残基長である場合に配列同一性のみに基い
て、類似性を断定することができる。
【０１１１】プロフィール配列および複数整列配列を用
いた整列からの活性測定 核酸の翻訳は、タンパク質ファミリーまたは共通モチー
フを規定するアミノ酸プロフィールとともに整列され得
る。また、核酸の翻訳は、タンパク質ファミリーまたは
モチーフの成員のポリペプチド配列を含む複数配列整列
（ＭＳＡ）に整列され得る。プロフィール配列またはＭ
ＳＡとの類似性または同一性を用いて、核酸または相当
するｃＤＮＡもしくは遺伝子によりコードされるポリペ
プチドの活性を確定することができる。例えば、ケモカ
インプロフィールまたはＭＳＡとの同一性または類似性
を示す配列は、ケモカイン活性を示し得る。
【０１１２】プロフィールは、（１）ファミリーに属す
る成員のアミノ酸配列の整列であるＭＳＡを創出し、
（２）整列の統計的表示を構築することにより、手作業
で設計することができる。かかる方法は、例えば、Birn
ey at al., Nucl. Acid Res. 25(14): 2730-2739 (199
6)に記載されている。
【０１１３】いくつかのタンパク質ファミリーおよびモ
チーフのＭＳＡは、公的に入手可能である。例えば、こ
れらとしては、５４７種のファミリーおよびモチーフの
ＭＳＡが挙げられる。これらのＭＳＡはまた、Sonnhamm
er et al., Proteins 28: 405-420 (1997)に記載されて
いる。他の供給源はまた、ワールドワイドウェブにて入
手可能である。これらのＭＳＡの簡単な説明は、Pascar
ella et al., Prot. Eng. 9(3): 249-251 (1996)に報告
されている。
【０１１４】ＭＳＡからプロフィールを形成するための
技法は、上述のSonnhammer et al.,上述のBirney et a
l.およびMethods in Enzymology, vol. 266:「高分子配
列分析用コンピュータ方式(Computer Methods for Macr
omolecular Sequence Analysis)」, 1996, ed. Doolitt
le, Academic Press, Inc., a division of HarcourtBr
ace & Co., San Diego, California, USAに記載されて
いる。
【０１１５】クエリー配列とタンパク質ファミリーまた
はモチーフ間の類似性は、（ａ）プロフィールに対して
クエリー配列を比較すること、および／または（ｂ）フ
ァミリーまたはモチーフの成員とともにクエリー配列を
整列することにより決定することができる。
【０１１６】典型的に、Searchwiseのようなプログラム
を用いて、プロフィールとしても既知の複数整列の統計
学的表示と、クエリー配列を比較することができる。こ
のプログラムは、上述のBirney et al.に記載されてい
る。配列およびプロフィールを比較するための他の技法
は、上述のSonnhammer et al.、および上述のDoolittel
eに記載されている。
【０１１７】次に、Feng et al., J. Mol. Evol. 25:35
1-360 (1987)およびHiggins et al., CABIOS 5:151-153
(1989)により記載される方法を用いて、ＭＳＡとして
も既知のファミリーまたはモチーフの成員とともにクエ
リー配列を整列させることができる。ＰＩＬＥＵＰのよ
うなコンピュータープログラムを使用することができ
る。以下のFeng et al.を参照されたい。
【０１１８】以下の要素：（１）クエリー配列に見られ
る保存残基の数、（２）クエリー配列に見られる保存残
基の割合、（３）フレームシフトの数、および（４）保
存残基間の間隔を用いて、クエリー配列およびプロフィ
ールまたはＭＳＡ間の類似性が存在するかどうかを決定
する。
【０１１９】配列を翻訳し、かつ整列するいくつかの整
列プログラムは、ヌクレオチド配列を翻訳する際に、任
意数のフレームシフトを行って、最良の整列を生じさる
ことができる。整列を生じるのに必要なフレームシフト
がより少ないほど、クエリーおよびプロフィールまたは
ＭＳＡ間の類似性あるいは同一性がより強力である。例
えば、フレームシフトを起こさないことによって生じた
弱い類似性は、２つのフレームシフトから生じた強い類
似性よりも、クエリー配列の活性または構造をより良く
示すことができる。
【０１２０】好ましくは、整列中に、３つ以下のフレー
ムシフト、より好ましくは２つ以下のフレームシフト、
さらに好ましくは１つ以下のフレームシフトが見られ、
よりいっそう好ましくは、クエリーおよびプロフィール
またはＭＳＡの整列中にフレームシフトは見られない。
【０１２１】保存残基は、ファミリーもしくはモチーフ
の成員のすべてまたはいくつかでの特定位置にて見られ
るアミノ酸である。例えば、最もよく知られるケモカイ
ンは、４つの保存システインを含有する。あるいは、あ
る種類のアミノ酸のみが、ファミリーの成員のすべてま
たはいくつかでの特定位置にて見られる場合に、位置は
保存されているとみなされる。例えば、Ｎ末端位置は、
リシン、アルギニンまたはヒスチジンのような正に荷電
したアミノ酸を含有することができる。
【０１２２】典型的に、一つの種類のアミノ酸または単
一アミノ酸が、すべての種類の成員の少なくとも約４０
％、より典型的には少なくとも約５０％、さらに典型的
には少なくとも約６０％で、特定位置にて見られる場合
に、ポリペプチド残基は保存されている。通常は、一つ
の種類のアミノ酸または単一アミノ酸が、ファミリーま
たはモチーフの成員の少なくとも約７０％、より通常的
には少なくとも約８０％、さらに通常的には少なくとも
約９０％、より一層通常的には少なくとも約９５％で見
られる場合に、残基は保存されている。
【０１２３】３つの非関連アミノ酸、より通常的には２
つの非関連アミノ酸が、成員のいくつかまたはすべてに
おける特定位置にて見られる場合に、残基は保存されて
いるとみなされる。非関連アミノ酸が、すべての種類の
成員の少なくとも約４０％、より典型的には少なくとも
約５０％、さらに典型的には少なくとも約６０％で、特
定位置にて見られる場合に、これらの残基は保存されて
いる。通常、アミノ酸の一種または単一アミノ酸が、フ
ァミリーまたはモチーフの成員の少なくとも約７０％、
より通常的には、少なくとも約８０％、さらに通常的に
は少なくとも約９０％、よりいっそう通常的には少なく
とも約９５％で見られる場合に、残基は保存されてい
る。
【０１２４】クエリー配列が、少なくとも約２５％、よ
り通常的には少なくとも約３０％、さらに通常的には少
なくとも約４０％のプロフィールまたはＭＳＡの保存残
基を含む場合には、クエリー配列は、プロフィールまた
はＭＳＡに対する類似性を有する。典型的に、クエリー
配列が、少なくとも約４５％、より典型的には少なくと
も約５０％、さらに典型的には少なくとも約５５％のプ
ロフィールまたはＭＳＡの保存残基を含む場合には、ク
エリー配列は、プロフィール配列またはＭＳＡに対する
より強力な類似性を有する。
【０１２５】Ｖ．プローブおよびプライマー 腫瘍細胞、特に結腸癌細胞系および組織からの遺伝子の
クローニングから確定されるヌクレオチド配列は、他の
細胞型における（例えば、他の組織由来の）同族体、な
らびに他の哺乳動物生体由来の同族体を同定および／ま
たはクローニングするために設計されるプローブおよび
プライマーの生成をさらに可能にするであろう。プロー
ブ／プライマーとして有用なヌクレオチド配列として
は、配列番号１、３、５、もしくは７に記載の配列、ま
たはそれらに相補的な配列、あるいは配列番号１、３、
５、もしくは７のすべてまたは一部に、ストリンジェン
ト条件下にてハイブリダイズする配列のすべてまたは一
部を挙げることができる。例えば、本発明はまた、実質
的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プ
ライマーを提供し、ここでオリゴヌクレオチドは、少な
くとも約８個、好ましくは約１２個、好ましくは約１５
個、好ましくは約２５個、より好ましくは約４０個の連
続ヌクレオチドから完全長の、配列番号１、３、５、も
しくは７、またはそれらに相補的な配列、あるいはそれ
らの天然に存在する突然変異体からなる群から選択され
るセンスまたはアンチセンス配列に、ストリンジェント
条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含
む。例えば、配列番号１、３、５、または７、あるいは
それらに相補的な配列に表される核酸に基づくプライマ
ーは、その配列の同族体をクローニングするためのＰＣ
Ｒ反応にて使用することができる。
【０１２６】さらなる別の実施形態では、本発明は、少
なくともや約８個、好ましくは約１２個、好ましくは約
１５個、好ましくは約２５個、より好ましくは約４０個
の連続配列から完全長の、配列番号１、３、５、または
７、あるいはそれらの天然に存在する突然変異体からな
る群から選択されるセンスまたはアンチセンス配列に、
中程度のストリンジェント条件下にてハイブリダイズす
るヌクレオチド配列を含むプローブ／プライマーを提供
する。
【０１２７】特に、これらのプローブは、本発明の野生
型遺伝子において突然変異を検出する方法を提供するの
で有用である。本発明の野生型遺伝子に相補的であり、
突然変異体遺伝子とミスマッチを形成し得る核酸プロー
ブを提供し、酵素的または化学的切断により、あるいは
電気泳動移動度におけるシフトにより検出することが可
能である。同様に、対象配列に基づくプローブを用い
て、例えば、予後または診断アッセイにて使用するため
の、同一または同種タンパク質をコードする転写体また
はゲノム配列を検出することが可能である。好ましい実
施形態では、プローブは、それらに結合され、検出可能
な標識基をさらに含み、例えば、標識基は、放射性同位
体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、および酵素補
因子から選択される。
【０１２８】開示する核酸を含む完全長ｃＤＮＡ分子
は、以下のようにして得られる。少なくとも約８個、好
ましくは約１２個、好ましくは約１５個、好ましくは約
２５個、より好ましくは約４０個のヌクレオチドから完
全長の、配列番号１、３、５、または７に表される配
列、あるいはそれらに相補的な配列を含む対象核酸また
はそれらの一部を、米国特許第５，６５４，１７３号、
「分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレ
オチド」新規ヒト遺伝子および遺伝子発現産物（参照に
より本明細書に援用される）に記載されるようなプロー
ブ設計方法、クローニング方法、およびクローン選択技
法を用いてｃＤＮＡライブラリーの成員をハイブリダイ
ズして検出するためのハイブリダイゼーションプローブ
として用いてもよい。ｃＤＮＡライブラリーは、正常組
織または腫瘍組織のような選択された組織から、あるい
は例えば薬剤で処理した哺乳動物の組織から作製されて
もよい。好ましくは、核酸およびｃＤＮＡの両方が発現
遺伝子を表すので、組織は、核酸を生成するのに用いら
れるものと同じである。最も好ましくは、ｃＤＮＡはラ
イブラリーは、本明細書中で実施例にて記載する生物学
的材料から作製される。あるいは、多くのｃＤＮＡライ
ブラリーは、市販されている(Sambrook et al.,Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spr
ing Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989))。
ライブラリー構築に関する細胞型の選択は、核酸関連遺
伝子によりコードされるタンパク質の同一性がわかった
後に行われてもよい。このことは、どの組織および細胞
型が関連遺伝子を発現する可能性が高く、それによりｃ
ＤＮＡを生成するためのｍＲＮＡを含有しているかを示
すであろう。
【０１２９】核酸より大きく、好ましくは自然(native)
メッセージの全配列を含有するライブラリーの成員を得
ることができる。全ｃＤＮＡが得られたことを確認する
ために、ＲＮＡ保護実験を以下のようにして行うことが
できる。ｍＲＮＡへの完全長ｃＤＮＡのハイブリダイゼ
ーションは、ＲＮアーゼ分解からＲＮＡを保護できる。
ｃＤＮＡが完全長でない場合、ハイブリダイズされてな
いｍＲＮＡの部分は、ＲＮアーゼによる分解を受ける。
このことは、当該技術にて既知のように、ポリアクリル
アミドゲル上での電気泳動移動度における変化により、
あるいは放出されるモノリボヌクレオチドの検出によ
り、アッセイされ得る(Sambook et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Ha
rbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989))。部分的
ｃＤＮＡの末端にさらなる配列５’を付加するために、
５’ＲＡＣＥ(PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications (Academic Press, Inc. 1990))を実施し
てもよい。
【０１３０】ゲノムＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡの単離に
類似した様式で、核酸を用いて単離し得る。簡単に言う
と、核酸またはそれらの一部を、ゲノムＤＮＡライブラ
リーに対するプローブとして用いることができる。好ま
しくは、ライブラリーは、核酸を生成するのに用いた細
胞型から得られる。最も好ましくは、ゲノムＤＮＡは、
本明細書中で実施例にて記載する生物学的材料から得ら
れる。かかるライブラリーは、Sambrook et al., 9.4-
9.30に詳述されるように、Ｐ１またはＹＡＣのようなゲ
ノムの大きなセグメントを運搬するのに適切なベクター
中にあってもよい。さらに、ゲノム配列は、ヒトＢＡＣ
ライブラリーから単離することができ、それは例えば、
Research Genetics, Inc., Huntville, Alabama, USAか
ら市販されている。付加する５’または３’配列を得る
ために、ゲノムＤＮＡの隣接または重複断片が単離され
るように、Sambrook et al.に記載されるように、染色
体歩行(chromosome walking)を実施してもよい。これら
は、当該技術にて既知であるように、制限消化酵素およ
びＤＮＡリガーゼを用いて、マッピングされ、統合され
る。
【０１３１】本発明の核酸を用いて、ｃＤＮＡライブラ
リーを構築してプローブするための古典的な方法および
ＰＣＲ法の両方を用いて、対応する完全長遺伝子を単離
することができる。いずれかの方法を用いて、好ましく
は、多数の細胞型にてノーザンブロットを行い、どの細
胞系が最速で当該遺伝子を発現するかを決定してもよ
い。
【０１３２】ｃＤＮＡライブラリーを構築するための古
典的な方法は、上述のSambrook etal.に記載されてい
る。これらの方法を用いて、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから
生産され、ウイルスまたは発現ベクターに挿入すること
ができる。典型的に、ポリ（Ａ）尾を含むｍＲＮＡライ
ブラリーは、ポリ（Ｔ）プライマーを用いて生産され得
る。同様に、ｃＤＮＡライブラリーは、プライマーとし
て本配列を用いて生産することができる。
【０１３３】ＰＣＲ法を用いて、所望の挿入物を含むｃ
ＤＮＡライブラリーの成員を増幅することができる。こ
の場合には、所望の挿入物は、本核酸に対応する完全長
ｃＤＮＡからの配列を含有してもよい。かかるＰＣＲ法
は、遺伝子トラップ、およびＲＡＣＥ方法を含む。
【０１３４】遺伝子トラップは、ベクター中にｃＤＮＡ
ライブラリーの成員の挿入を引き起こすことがある。つ
いで、ベクターを変性させて、一本鎖分子を生産でき
る。次に、ビオチン化オリゴのような基質結合プローブ
を用いて、当該ｃＤＮＡ挿入物をトラプし得る。ビオチ
ン化プローブは、アビジン結合固体基質に連結すること
ができる。ＰＣＲ法を用いて、トラップしたｃＤＮＡを
増幅することができる。完全長遺伝子に対応する配列を
トラップするために、標識プローブ配列は、本発明の核
酸、例えば配列番号１、３、５、または７、あるいはそ
れらに相補的な配列に基づいてもよい。ランダムプライ
マーまたはライブラリーベクターに特異的なプライマー
を用いて、トラップしたｃＤＮＡを増幅することができ
る。かかる遺伝子トラップ技法は、ＰＣＴ国際公開第９
５／０４７４５号(Gruber et al.)および米国特許第
５，５００，３５６号(Gruber et al.)に記載されてい
る。遺伝子トラップ実験を行うためのキットは、例えば
Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USAから
市販されている。
【０１３５】「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」、即ちＲＡＣ
Ｅは、多数の異なるＲＮＡからのｃＤＮＡを増幅するＰ
ＣＲ法である。ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドリンカ
ーに連結され、２つのプライマーを用いるＰＣＲ法によ
り増幅することができる。１つのプライマーは、本核酸
からの配列に基づくものでよく、完全長配列が望まし
い。第２のプライマーは、オリゴヌクレオチドリンカー
にハイブリダイズする配列を含み、ｃＤＮＡを増幅す
る。この方法の説明は、ＰＣＴ国際公開公報第９７／１
９１１０号に報告されている。
【０１３６】ＲＡＣＥの好ましい実施形態では、共通プ
ライマーは、ｃＤＮＡ末端に連結される任意のアダプタ
ー配列にアニールするように設計することができる (Ap
te and Siebert, Biotechniques 15:890-893, 1993; Ed
wards et al., Nuc. Acids Res. 19:5227-5232, 199
1)。単一遺伝子特異的ＲＡＣＥプライマーが、共通プラ
イマーと対をなすと、単一遺伝子特異的プライマーと共
通プライマー間で配列の優先的増幅が起こる。ＲＡＣＥ
において使用するために修飾された市販用ｃＤＮＡプー
ルが入手可能である。
【０１３７】ＰＣＲに基づいた別の方法は、ｃＤＮＡ配
列に関する特定の知識なしで、アンカー末端を用いて、
完全長ｃＤＮＡライブラリーを生成する。この方法は、
ロックドッキングプライマー（Ｉ−ＶＩ）を使用し、こ
こで１つのプライマーであるポリＴＶ（Ｉ−ＩＩＩ）
は、第１の鎖を作り出す真核性ｍＲＮＡのポリＡ尾に固
着し、第２のプライマーであるポリＧＨ（ＩＶ−ＶＩ）
は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（ＴｄＴ）により付加されるポリＣ尾上へ固着する。こ
の方法は、ＰＣＴ国際公開公報第９６／４０９９８号に
記載されている。
【０１３８】遺伝子のプロモーター領域は、ＲＮＡポリ
メラ−ゼＩＬのための開始部位に対して５’に一般に位
置する。何百ものプロモーター領域は、「ＴＡＴＡ」ボ
ックス（ＴＡＴＴＡまたはＴＡＴＡＡのような配列）を
含み、突然変異に対して感受性が高い。プロモーター領
域は、遺伝子のコード領域からのプライマーを用いて、
５’ＲＡＣＥを行うことにより得ることができる。ある
いは、ｃＤＮＡは、ゲノム配列のためのプローブとして
使用することができ、コード領域に対する５’領域は、
「歩行(walking up)」により同定される。
【０１３９】遺伝子が、高度に発現するか、または差次
的に発現する場合、遺伝子からのプロモーターは、異種
遺伝子のための調節構築物において有用であり得る。
【０１４０】いったん完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子が得
られると、変異体をコードするＤＮＡを、部位特異的突
然変異誘発により調製することができ、それはSambrook
15.3-15.63に詳述されている。置換されるべきコドン
またはヌクレオチドの選択により、本明細書での開示に
基づいて、変質タンパク質構造および／または機能を達
成するためにアミノ酸を任意に変化させることが可能で
ある。
【０１４１】生物学的材料からＤＮＡまたはＲＮＡを得
るための他の方法として、本発明の１つ以上の核酸の配
列を有するヌクレオチドを含む核酸を合成することがで
きる。したがって、本発明は、核酸分子の復製および発
現を含む、１つまたはそれ以上の生物学的操作に適し
た、約８個のヌクレオチド（配列番号１、３、５、また
は７、あるいはそれらに相補的な配列のうちの１つによ
り表される核酸に、ストリンジェント条件下にてハイブ
リダイズするか、またはそれと少なくとも８０％同一で
ある、少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相当す
る）から、最大長までの長さに及ぶ核酸分子を包含す
る。本発明は、（ａ）完全遺伝子サイズを有し、かつ配
列番号１、３、５、または７、あるいはそれらに相補的
な配列のうちの少なくとも１つを含む核酸、（ｂ）操作
可能に連結され、融合タンパク質を発現させる少なくと
も１つの付加的遺伝子をさらに含む（ａ）の核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含む発現ベクター、（ｄ）
（ａ）または（ｂ）を含むプラスミド、および（ｅ）
（ａ）または（ｂ）を含む組換えウイルス粒子を含む
が、これらに限定されない。（ａ）の構築は、下記パー
トＩＶに記載するように達成することができる。
【０１４２】本発明の核酸配列は、限定されるものでな
く、Ａ、Ｔ、Ｇ、および／またはＣ（ＤＮＡに関し
て）、ならびにＡ、Ｕ、０、および／またはＣ（ＲＮＡ
に関して）、あるいはイノシンおよびプソイドウリジン
を含むそれらの修飾塩基のいかなる配列であってもよ
い。配列の選択は、所望の機能に依存し、所望のコード
領域、所望のイントロン様領域、および所望の調節領域
により決められる。
【０１４３】ＶＩ．本発明の核酸を運搬するベクター 本発明はさらに、宿主細胞で遺伝子を発現するために使
用できるプラスミドおよびベクターを提供する。宿主細
胞は、どのような原核細胞または真核細胞であってもよ
い。したがって、タンパク質のすべてまたは選択した部
分をコードする、配列番号１、３、５、または７、ある
いはそれらに相補的な配列のいずれか１つに由来するヌ
クレオチド配列を用いて、微生物または真核細胞のプロ
セスを介してポリペプチドの組換え体を産生することが
できる。発現ベクターのような遺伝子構築物へのポリヌ
クレオチド配列の連結、および真核性（酵母、トリ、昆
虫または哺乳動物）または原核性（細菌細胞）宿主への
形質転換またはトランスフェクションは、当該技術にて
既知の標準的手法である。
【０１４４】細胞において核酸の発現を可能にするベク
ターを、発現ベクターと称する。典型的に、発現ベクタ
ーは、少なくとも１つの転写調節配列に操作可能に連結
された核酸を含有する。調節配列は、当該技術分野で認
識されており、対象核酸の発現を誘導するように選択さ
れる。転写調節配列は、Goeddel; Gene Expression Tec
hnology: Methods in Enzymology 185, Academic Pres
s, San Diego CA (1990)に記載されている。一実施形態
では、発現ベクターは、対象ポリペプチドのアゴニスト
活性を有するペプチドをコードする組換え遺伝子、また
は対象ポリペプチドのアンタゴニスト形態であるペプチ
ドをコードする組換え遺伝子を含む。
【０１４５】プラスミドの選択は、増殖が望ましい細胞
の型、および増殖の目的によって決められる。いくつか
のベクターは、大量の所望のＤＮＡ配列を増幅して、製
造するのに有用である。別のベクターは、培養における
細胞の発現に適している。さらに別のベクターは、完全
な動物またはヒトにおける細胞の移入または発現に適し
ている。適切なベクターの選択は、当業者に十分可能で
ある。多くのかかるベクターが市販されている。核酸ま
たは完全長遺伝子は、典型的にはベクターにおける切断
制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ結合を用いてベクター
に挿入される。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、
in vivo での相同組換えにより挿入することができる。
典型的にこれは、所望のヌクレオチドア配列のフランク
上にて、ベクターに相同性の領域を結合することにより
成し遂げられる。相同性の領域は、ヌクレオチドの連結
により、あるいは相同性の領域および所望のヌクレオチ
ド配列の一部の両方を含むプライマーを用いたポリメラ
−ゼ連鎖反応により付加される。
【０１４６】核酸または完全長遺伝子は、所望の発現特
性が適切に得られるように調節配列に連結される。これ
らには、プロモーター（センス鎖の５’末端またはアン
チセンス鎖の３’末端に結合される）、エンハンサー、
ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、および
インデューサーが含まれることがある。プロモーター
は、調節することができるか、または構造的なものであ
る。状況によっては、組織特異的、または発達段階特異
的プロモーターのような条件付きで活性なプロモーター
を使用することが望ましい場合もある。これらは、ベク
ターへの連結のための上述の技法を用いて、所望のヌク
レオチド配列に連結される。当該技術で既知のいずれの
技法を使用してもよい。
【０１４７】上述の宿主細胞、あるいは他の適切な宿主
細胞または微生物のいずれかで、本発明のポリヌクレオ
チドまたは核酸を複製および／または発現させる場合、
得られる複製核酸、ＲＮＡ、発現タンパク質またはポリ
ペプチドは、宿主細胞または微生物の産物として本発明
の範囲内である。この産物は、当該技術にて既知の適切
な手段により回収する。
【０１４８】一旦、核酸に相当する遺伝子が同定される
と、その発現は、遺伝子が自然である細胞において調節
され得る。例えば、細胞の内因性遺伝子は、米国特許第
５，６４１，６７０号の「タンパク質産生およびタンパ
ク質輸送(Protein Production and Protein Deliver
y)」に開示されるような外因性調節配列によって調節さ
れ得る。
【０１４９】多数のベクターが、酵母における組換えタ
ンパク質の発現のために存在する（例えば、参照により
本明細書に援用されるBroach et al (1983) in Experim
ental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inou
ye, Academic Press, p.83を参照）。さらに、アンピシ
リンのような薬剤耐性マーカーを使用することができ
る。実例的実施形態では、ポリペプチドは、配列番号
１、３、５、または７、あるいはそれらに相補的な配列
のうちの１つで表される核酸の１つをサブクローニング
することにより生成される発現ベクターを組換え的に利
用して生産される。
【０１５０】好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌に
おけるベクターの増殖を容易にするための原核性配列、
および真核細胞において発現される１つ以上の真核性転
写ユニットの両方を含有する。プラスミドの調製および
宿主微生物の形質転換に用いる様々な方法は当該技術に
て公知である。原核細胞および真核細胞両方のための他
の適切な発現系、ならびに一般的な組換え手法に関して
は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2' E
d., by Sambrook, Fritsch and Maniatis (ColdSpring
Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17
を参照されたい。
【０１５１】遺伝子、例えば切断型突然変異体のような
遺伝子一部のみを発現することが望ましい場合、発現さ
れるべき所望の配列を含有するオリゴヌクレオチド断片
に、開始コドン（ＡＴＧ）の付加を必要とすることがあ
る。Ｎ末端位置でのメチオニンを、酵素メチオニンアミ
ノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用により酵素的に切断で
きることは、当該技術にて既知である。ＭＡＰは、大腸
菌 (Ben-Bassat et al., (1987) J. Bacteriol. 169:75
1-757)およびネズミチフス菌からクローニングされ、そ
のin vitro 活性は、組換えタンパク質に関して実証さ
れた(Miller etal., (1987) PNAS 84:2718-1722)。した
がって、Ｎ末端メチオニンの除去は、望ましい場合に
は、ＭＡＰを産生する宿主(例えば、大腸菌またはＣＭ
８９またはサッカロミセス・セレビシエ)においてポリ
ペプチドを in vivo にて発現することによって、ある
いは精製ＭＡＰを in vitro で使用することにより（例
えば、上述のMiller et al.の手法）達成できる。
【０１５２】さらに、本発明の核酸構築物はまた、アン
チセンス核酸のような核酸を送達するための遺伝子治療
プロトコルの一部として使用することができる。したが
って、本発明の別の態様は、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドを用いたin vivoまたはin vitroでのトランスフ
ェクションのための発現ベクターを特徴とする。
【０１５３】高度に細胞型特異的なプロモーターおよび
増幅プロモーター要素の制御下にて、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドのような導入遺伝子を提供する核酸分子
および構築物は、ベクター中に組み込んで、ヒトを含む
あらゆる哺乳動物に投与できる。多くのかかるベクター
は市販されており、さらにほかの適切なベクターは、容
易に調製することができ、当業者に明らかである。ベク
ターの正確な設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選
択、および／または発現されるのに望ましいタンパク質
の型のような要因に依存する。適切なベクターは、真核
細胞における発現に適したプラスミドまたはウイルスベ
クター中に所望の構築物を連結することにより生産する
ことができる（例えば、Broach, et al., Experimental
Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye (A
cademic Press, 1983) p.83; Molecular Cloning: A la
boratory Manual, 2nd Ed., ed. Sambrook, et al. (Co
ldspring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapter 16
and 17（それらの全体は、参照することにより本明細
書に援用される）を参照）。
【０１５４】使用することができるベクターの例として
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはＣｏ１Ｅ１のようなプ
ラスミド、アデノウイルス、シンドビスウイルス、シミ
アンウイルス４０、サイトメガロウイルス、ならびにマ
ウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、モロニーマ
ウス白血病ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスのような
レトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定
されない。サルモネラ種、エルシニア・エンテロコリチ
カ、赤痢菌種、コレラ菌、放線菌株ＢＣＧ、およびリス
テリア菌のような細菌ベクターを使用することができ
る。ＭＣおよびＭＣ１のようなミニ染色体、バクテリオ
ファージ、コスミド（λファージのｃｏｓ部位が挿入さ
れたプラスミド）およびレプリコン（非依存性染色体外
複製が可能である遺伝要素）も使用することができる。
【０１５５】上述のベクターは、限定するものではない
が、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、ネ
オマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラ
ムフェニコール、カナマイシンおよびストレプトマイシ
ン耐性に対する耐性を付与する遺伝子を含む、これらの
１つまたはそれ以上の選択可能マーカーをコードする配
列をさらに含むことができる。標的細胞のゲノムへの組
み込みを改良するために（望ましい場合）、レトロウイ
ルスベクターを使用することができ、長い端末反復（Ｌ
ＴＲ）配列を、発現構築物の片側に付加することができ
る（例えば、Vile, et al., Virology 214: 307-313 (1
995)（その全体は、参照することにより本明細書に援用
される）を参照）。
【０１５６】高度に細胞型特異的なプロモーターの制御
下で、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸構築物の送
達は、経口または鼻腔内投与、生物学的衝撃銃(Ballist
ic gun)（「遺伝子銃」）を用いた注射を含む、筋肉
内、皮内、腹腔内または皮下注射を含む、当該技術にて
既知のあらゆる手段によるものであってよい。治療目的
のための核酸の投与は、治療効率を達成するのに必要と
する所望の任意の間隔にて繰り返すことができる。さら
なる構成成分をベクターに付加して、標的細胞へのその
選択送達を改善し、非標的細胞へのその送達を抑制する
ことができる。使用することができるアプローチの例と
しては、Peng and Russell, Cur. Opin. Biotech. 10:
454-457 (1999)（その全体は、参照することにより本明
細書に援用される）に記載されるように、宿主域拡張、
侵入増強、および宿主域制限が挙げられ得る。
【０１５７】ウイルス移入方法のほかに、非ウイルス性
方法もまた、対象核酸、例えば配列番号１、３、５、ま
たは７、あるいはそれらに相補的な配列のうちの１つに
よって表される配列を、動物組織内に導入するために使
用することができる。遺伝子移入のたいていの非ウイル
ス性方法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のため
に哺乳動物細胞によって使用される一般的機構に依存す
る。好ましい実施形態では、本発明の非ウイルス性ター
ゲティング手段は、標的細胞による対象核酸の取り込み
のためのエンドサイトーシス経路に依存する。この型の
典型的なターゲティング手段としては、リポソーム送達
系、ポリリシン結合体、および人工ウイルスエンベロー
プが挙げられる。
【０１５８】配列番号１、３、５、または７、あるいは
それらに相補的な配列のいずれかの核酸、相当するｃＤ
ＮＡ、あるいは完全長遺伝子を用いて、部分的または完
全な遺伝子産物を発現させることができる。適切な核酸
構築物は、例えば、Sambrooket al., (1989) Molecular
Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載
されるように標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、Unit
ed States Dept. of HHS, National Institute of Heal
th (NIH) Guidelines for Recombinantに記載される現
時の規制の下で精製される。
【０１５９】ＤＮＡ研究 核酸によりコードされるポリペプチドは、例えば、細
菌、酵母、昆虫、両性動物系および哺乳動物系を含むあ
らゆる発現系において発現されてもよい。
【０１６０】細菌 細菌における発現系としては、Chang et al., Nature
(1978) 275:615、Goeddel et al., Nature (1979) 281:
5、Goeddel et al., Nucleic Acids Rec. (1980) 8:405
7、欧州特許第０，０３６，７７６号、米国特許第４，
５５１，４３３号、DeBoer et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) (1983) 80:2125、およびSiebenlist et a
l., Cell (1980) 20:269に記載されるものが挙げられ
る。
【０１６１】酵母 酵母における発現系としては、Hinnen et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929、Ito et al.,
J. Bacteriol.(1983) 153:163、Kurtz et al.,Mol. Cel
l. Biol.(1986) 6:142、Kunze et al., J. Basic Micro
biol.(1985) 25: 141、Gleeson et al., J. Gen. Micro
biol.(1986) 132:3459、Roggenkamp etal., Mol. Gen.
Genet.(1986) 202:302、Das et al., J. Bacteriol. (1
984) 158:1165、De Louvencourt et al., J. Bacterio
l.(1983) 154:737、Van den Berget al., Bio/Technolo
gy (1990) 8:135、Kunze et al., J. Basic Microbiol.
(1985) 25:141、Cregg et al., Mol. Cell. Biol.(198
5) 5:3376、米国特許第４，８３７，１４８号および第
４，９２９，５５５号、Beach and Nurse, Nature(198
1) 300:706、Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 1
0:380、Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:4
9、Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1983) 112:284289、Tilburn et al., Gene (1983) 2
6:205221、Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U
SA) (1984) 81:14701474、Kelly and Hynes, EMBO J.
(1985) 4:475479、欧州特許第０ ２２４，２３４号、
および国際公開第９１／００３５７号に記載されるもの
が挙げられる。
【０１６２】昆虫細胞 昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第４，７４
５，０５１号、Friesen et al., (1986), The Molecula
r Biology Of Baculoviruses (W. Doerfler, ed.)にお
ける「バキュロウイルス遺伝子発現の調節(The Regulat
ion of Baculovirus Gene Expression)」、欧州特許第
０ １２７，８３９号、欧州特許第０ １５５，４７６
号、およびVlak et al., J.Gen.Virol. (1988) 69:7657
76、Milleret al., Ann.Rev.Microbiol.(1988) 42:17
7、Carbonell et al., Gene(1988) 73:409、Maeda et a
l., Nature (1985) 315:592594、Lebacq Verheyden et
al.,Mol.Cell.Biol.(1988) 8:3129、Smith et al., Pro
c.Nail.Acad. Sci.(USA) (1985) 82:8404、Miyajima et
al., Gene (1987) 58:273、およびMartin et al., DNA
(1988) 7:99に記載されるように達成される。非常に多
くのバキュロウイルス株および変異株ならびに対応する
宿主由来の許容性昆虫宿主細胞は、Luckow etal., Bio/
Technology (1988) 6:4755、Miller et al., Generic E
ngineering (Setlow, J.K. et al., eds.), Vol. 8 (Pl
enum Publishing, 1986), pp. 277279、およびMaeda et
al., Nature, (1985) 315:592-594に記載されている。
【０１６３】哺乳類細胞 哺乳動物発現は、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:7
61、Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (19
82) 79:6777、Boshart et al., Cell (1985) 41:52 1お
よび米国特許第４，３９９，２１６号に記載されるよう
に達成される。哺乳動物発現の他の特徴は、Ham and Wa
llace, Meth. Enz. (1979) 58:44、Barnes and Sato, A
nal. Biochem. (1980) 102:255、米国特許第４，７６
７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２
７，７６２号、第４，５６０，６５５号、国際公開第９
０／１０３４３０号、国際公開第８７／００１９５号、
および米国再発行第３０，９８５号に記載されるように
助長される。
【０１６４】ＶＩＩ．治療用核酸構築物 本発明の一態様は、アンチセンス治療における、単離核
酸、例えば、配列番号１、３、５、または７、あるいは
それらに相補的な配列の使用に関する。本明細書で使用
するアンチセンス治療とは、細胞ｍＲＮＡおよび／また
はゲノムＤＮＡと、細胞条件下にて特異的にハイブリダ
イズする（例えば、結合する）オリゴヌクレオチド分子
またはそれらの誘導体の投与あるいはその場での(in si
tu) 生成によりその遺伝子の転写および／または翻訳を
抑制することを指す。結合は、従来型塩基対の相補性に
よってでもよく、あるいは例えばＤＮＡ二重鎖に結合す
る場合には、二重らせんの主溝での特異的相互作用によ
ってでもよい。一般に、アンチセンス治療は、当該技術
にて一般的に用いられる技術の範囲を指し、オリゴヌク
レオチド配列に対する特異的結合に依存するあらゆる治
療を含む。
【０１６５】本発明のアンチセンス構築物は、例えば、
細胞にて転写される場合、細胞ｍＲＮＡの少なくとも特
有部分に相補的であるＲＮＡを生産する発現プラスミド
として送達され得る。あるいは、アンチセンス構築物
は、ｅｘ ｖｉｖｏにて生成され、細胞中に導入される
場合に、対象核酸のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列
とハイブリダイズすることにより、発現の抑制を引き起
こすオリゴヌクレオチドプローブである。かかるオリゴ
ヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレア
−ゼ、例えば、エキソヌクレーゼおよび／またはエンド
ヌクレアーゼに耐性である修飾オリゴヌクレオチドであ
り、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにて安定である。アン
チセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための典型
的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホラミデート、ホスホロ
チオエート、およびメチルホスホネート類縁体である
（米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５
６４号および第５，２５６，７７５号も参照）。さら
に、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築
するための一般的なアプローチは、例えば、Van der Kr
olet al. (1988) Bio Techniques 6:958-976、およびSt
ein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668により概
説されている。アンチセンスＤＮＡに関して、転写開始
部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチド（例えば、
所定のヌクレオチド配列の−１０〜＋１０領域）が好ま
しい。
【０１６６】アンチセンスアプローチは、ｍＲＮＡに相
補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の設
計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮ
Ａ転写物に結合し、翻訳を防止するであろう。絶対的相
補性は、好ましいが、必要というわけではない。したが
って、二重鎖アンチセンス核酸の場合には、二重鎖ＤＮ
Ａの一本鎖が試験されてもよく、または三重鎖形成をア
ッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性
の程度およびアンチセンス核酸の長さに依存するであろ
う。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、そ
れはＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含有し、安
定な二重鎖（または場合によっては、三重鎖）はそれで
も形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点
を測定する標準的な手法を用いて、ミスマッチの耐用度
を確認することができる。
【０１６７】ｍＲＮＡの５’末端、例えばＡＵＧ開始コ
ドンを含むまでの５’非翻訳配列、に相補的なオリゴヌ
クレオチドは、翻訳を抑制する際に最も効率的に作用す
るはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配
列に相補的な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を抑制する
際に効果的であることが最近わかった(Wagner, R. 199
4. Nature 372:333)。したがって、遺伝子の５’または
３’非翻訳、非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチ
ドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するためのアンチセ
ンスアプローチにおいて使用されるはずである。ｍＲＮ
Ａの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、
ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡ
コード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、典型的に、より効率の悪い翻訳のインヒビターであ
るが、本発明によれば、使用することも可能である。対
象ｍＲＮＡの５’、３’またはコード領域にハイブリダ
イズするように設計されようとそうでなかろうと、アン
チセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチド長であ
るべきであり、かつ、好ましくは約１００個未満、より
好ましくは約５０個、２５個、１７個または１０個未満
のヌクレオチド長である。
【０１６８】標的配列の選択に関係なく、遺伝子発現を
抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量
化するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を
定量化するｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究が、まず行われる
ことが好ましい。これらの研究は、オリゴヌクレオチド
のアンチセンス遺伝子抑制と非特異的生物学的効果とを
区別する対照を利用することが好ましい。これらの研究
は、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、内部対照
ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することもまた
好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
用いて得られる結果を、対照オリゴヌクレオチドを用い
て得られる結果と比較することが想定される。対照オリ
ゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレチドとほぼ同じ長
さであること、また、オリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列は、標的配列への特異的ハイブリダイゼーション
を防止するのに必要とする量以上はアンチセンス配列と
異ならないことが好ましい。
【０１６９】オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲ
ＮＡまたはキメラ混合物もしくは誘導体、あるいはそれ
らの修飾型、一本鎖または二本鎖であることがある。オ
リゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸
バックボーンにて、例えば分子、ハイブリダイゼーショ
ン等の安定性を改良するために修飾されることがある。
オリゴヌクレオチドはまた、ペプチドのような他の追加
基（例えば、宿主細胞受容体をターゲティングするため
に）、あるいは細胞膜の横断輸送を容易にする薬剤（例
えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 86:6553-6556、Lemaitre et al., 1987, Pro
c. Natl. Acad. Sci. 84:648-652、１９８８年１２月１
５日に公開されたＰＣＴ国際公開公報第８８／０９８１
０号を参照）、または血液脳関門（例えば、１９８８年
４月２５日に公開されたＰＣＴ国際公開公報第８９／１
０１３４号を参照）、ハイブリダイゼーション誘発切断
剤（例えば、Krol et al., 1988, Bio Techniques 6:95
8-976を参照）もしくはインターカレート剤（例えば、Z
on, 1988, Pharm. Res. 5:539-549を参照）を含むこと
がある。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別
の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘
発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤
等に結合されることがある。
【０１７０】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−
フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウ
ラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサン
チン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロ
キシトリエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミ
ノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルア
ミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−
ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペン
テニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノ
シン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニ
ン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メ
チルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、
５−メチルアミノエチルウラシル、５−メトキシアミノ
メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキ
ューオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、
５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペ
ンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、
ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、
２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２
−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシ
ル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシ
ル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラ
シル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロ
ピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジア
ミノプリンを含むがこれらに限定されない群から選択さ
れる少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでもよい。
【０１７１】アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、
アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロー
ス、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含んで
もよい。
【０１７２】アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、
中性ペプチド様バックボーンを含有することもできる。
かかる分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと呼
ばれ、Peny-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad
Sci. U.S.A. 93:14670、およびEglom et al. (1993) Na
ture 365:566に記載されている。ＰＮＡオリゴマーの１
つの利点は、ＤＮＡの中性バックボーンに起因する、培
地のイオン強度に本質的に関係なく、相補的ＤＮＡに結
合するそれらの能力である。さらに別の実施形態では、
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、
ホスホラミデート、ホスホラジアミデート、メチルホス
ホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルム
アセタールまたはそれらの類縁体からなる群から選択さ
れる少なくとも１つの修飾ホスフェートバックボーンを
含む。
【０１７３】さらなる実施形態では、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、a-アノマーオリゴヌクレオチドであ
る。a-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと
特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常の
ｎ−ユニットと対照的に、鎖は、互いに平行している(G
autier et al, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-664
1)。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌク
レオチド(Inoue et al.,1987, Nucl. Acids Res. 15:61
31-12148）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Jnou
e et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330）である。
【０１７４】本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術
において既知の標準的方法により、例えば自動ＤＮＡ合
成機（Biosearch, Applied Biosystems 等から市販され
ているような）を用いて合成してもよい。例として、ホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein et al.
の方法(1988, Nucl. Acids Res. 16:3209)により合成
してもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチド
は、制御された孔ガラスポリマー支持体の使用(Sarin e
t al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448
-7451)等により合成することができる。
【０１７５】コード領域配列に相補的なアンチセンスヌ
クレオチドが使用され得ると同時に、転写非翻訳領域領
域、および開始メチオニンを含む領域に相補的なアンチ
センスヌクレオチドが最も好ましい。
【０１７６】アンチセンス分子は、in vivoにて標的核
酸を発現する細胞に送達することができる。アンチセン
スＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するために多くの方
法が開発されてきた。例えば、アンチセンス分子を、組
織部位に直接的に注入することができるし、あるいは所
望の細胞を標的にするように設計される修飾アンチセン
ス分子（例えば、標的細胞表面上にて発現する受容体も
しくは抗原を特異的に結合するペプチドまたは抗体に連
結されるアンチセンス）を全身投与することができる。
【０１７７】しかしながら、内因性ｍＲＮＡに関する翻
訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達
成することは、多くの場合困難である。したがって、好
ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチド
が強力なpol IIまたはpol IIプロモーターの制御下に置
かれている組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者におい
て標的細胞をトランスフェクトするためのかかる構築物
の使用は、内因性転写物と相補的塩基対を形成し、それ
により標的ｍＲＮＡの翻訳を防止するであろう、十分量
の一本鎖ＲＮＡの転写という結果を生じるであろう。例
えば、ベクターを、細胞に取り込まれるようにｉｎ ｖ
ｉｖｏにて導入することができ、アンチセンスＲＮＡの
転写を誘導する。かかるベクターは、当該技術において
標準的である組換えＤＮＡ技術方法によって構築するこ
とができる。ベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを
生産するように転写され得る限り、エピソームのままで
あり得るか、または染色体性に統合されるようになり得
る。かかるベクターは、プラスミド、ウイルス性、また
は哺乳動物細胞におけおる複製および発現のために当該
技術で既知の他のものであってもよい。アンチセンスＲ
ＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好まし
くはヒト細胞において作用するための当該技術にて既知
のどのようなプロモーターによるものであってもよい。
かかるプロモーターは、誘発性または構造性であり得
る。かかるプロモーターとしては、限定するものではな
いが、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Bernoist and Ch
ambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイル
スの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター(Yam
amoto et al., 1980. Cell 22:787-797)、ヘルペスチミ
ジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチ
オネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al, 1982,Natu
re 296:39-42)等が挙げられる。組織部位、例えば脈絡
叢または視床下部に直接導入され得る組換えＤＮＡ構築
物を調製するために、いかなる型のプラスミド、コスミ
ド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いることもでき
る。あるいは、所望の組織を選択的に感染するウイルス
ベクターを用いることができ（例えば、脳に関してはヘ
ルペスウイルスベクターを用いることができる）、その
場合には、投与は別の経路によって（例えば全身的に）
行うことができる。
【０１７８】本発明の別の態様では、標的ｍＲＮＡ転写
物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子
を用いて、標的ｍＲＮＡの翻訳および標的タンパク質の
発現を防止することができる（例えば、１９９０年１０
月４日に公開されたＰＣＴ国際公開公報第９０／１１３
６４号、Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225
および米国特許第５，０９３，２４６号を参照）。部位
特異的認識配列にてｍＲＮＡを切断するリボザイムは標
的ｍＲＮＡを破壊するために使用できるが、ハンマーヘ
ッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボ
ザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフラ
ンキング領域が指示する位置にてｍＲＮＡを切断する。
唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列、５’
−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボ
ザイムの構築および産生は、当該技術にて既知であり、
Haseloff and Gerlach, 1988, Nature , 334:585-591に
より完全に記載されている。好ましくは、リボザイム
は、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置
するように、すなわち、効率を高めて、非機能性ｍＲＮ
Ａ転写物の細胞内蓄積を最低限にするように操作され
る。
【０１７９】本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ
・サーモフィラ(Tetrahymena Thermophila)にて天然に
存在し（ＩＶＳ、またはＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡとして
既知）、Thomas Cechおよび共同研究者により広範に記
載されている(Zaug, et al.,1984, Science, 224:574-5
78、 Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475、Z
aug, et al., 1986, Nature, 324:429-433、University
Patents Inc.による公開国際特許出願国際公開ＷＯ第
８８／０４３００号、Been and Cech, 1986, Cell, 47:
207-216）もののようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ
（これ以降、「チェック型リボザイム」）をも含む。チ
ェック型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイ
ズする８塩基対活性部位を有し、その後に標的ＲＮＡの
切断が起こる。本発明は、標的遺伝子内に存在する８塩
基対活性部位配列を標的とするチェック型リボザイムを
包含する。
【０１８０】アンチセンスアプローチと同様に、リボザ
イムを、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、タ
ーゲティング等を改良するために）から構成することが
でき、in vivoにて標的遺伝子を発現する細胞に送達さ
れるべきである。送達の好ましい方法は、強力な構造的
pol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下にてリボザ
イムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いることを伴
い、したがって、トランスフェクトされた細胞は、内因
性メッセージを破壊し、翻訳を抑制するのに十分な量の
リボザイムを生産するであろう。リボザイムは、アンチ
センス分子と異なり、触媒性であるので、より低い細胞
内濃度が効率上要求される。
【０１８１】本発明のアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡおよ
びリボザイム分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成の
ために当該技術にて既知のあらゆる方法によって調製す
ることができる。これらの方法には、例えば固相ホスホ
ラミダイト化学合成のような当該技術にて既知のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチ
ドを化学的に合成するための技法が含まれる。あるい
は、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードす
るＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ
転写により生成されてもよい。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ
７またはＳＰ６ポリメラ−ゼプロモーターのような適切
なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様
のベクターに組み込むことができる。あるいは、使用す
るプロモーターに依存して構造的にまたは誘発的にアン
チセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物
は、細胞系に安定に組み込むことができる。
【０１８２】さらに、核酸分子に対する様々な既知の修
飾が、細胞内安定性および半減期を高める手段として導
入されてもよい。考えられ得る修飾としては、分子の
５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまた
はデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付
加、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボ
ーン内でのホスホジエステラーゼ結合というよりはむし
ろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】ＶＩＩＩ．本発明のポリペプチド 本発明は、他の細胞タンパク質、特に通常単離しようと
するポリペプチドに関連することがある他のシグナル伝
達因子および／または転写因子から単離されたポリペプ
チド、または反対に実質的に含まれない、利用可能な単
離ポリペプチドを作製する。本発明の対象ポリペプチド
は、配列番号１、３、５、または７、あるいはそれらに
相補的な配列の核酸によりコードされるポリペプチドを
含む。好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、
または８のアミノ酸配列を有するものである。本発明の
ポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌由来細胞系にお
いて（正常細胞、例えば正常結腸組織および非結腸組織
に比較して）差次的に調節されるタンパク質を含む。好
ましい実施形態では、このポリペプチドは、腫瘍細胞、
特に結腸癌由来細胞系において、アップレギュレートさ
れる。他の実施形態では、このポリペプチドは、腫瘍細
胞、特に結腸癌由来細胞系においてダウンレギュレート
される。異常増殖細胞において、癌遺伝子のようなアッ
プレギュレートされるタンパク質、または腫瘍サプレッ
サーのようなダウンレギュレートされるタンパク質は、
診断または治療技術のための標的となり得る。例えば、
ｃｄｃ２遺伝子のアップレギュレーションは、有糸分裂
を誘発する。有糸分裂不活性剤であるｍｙｔ１遺伝子の
過剰発現は、ｃｄｃ２の活性を負の方向に調節する。し
たがって、異常増殖は、ｃｄｃ２をアップレギュレート
し、またはｍｙｔ１をダウンレギュレートすることによ
り誘発されることがある。
【０１８４】「他の細胞タンパク質（本明細書中では
「混入タンパク質」とも称する）を実質的に含まない」
または「実質的に純粋または精製調製物」という用語
は、混入タンパク質が約２０％未満（乾燥重量で）、好
ましくは約５％未満であるポリペプチドの調製物を包含
すると定義される。対象ポリペプチドの機能性形態は、
本明細書中に記載するようなクローニングされた核酸を
用いることにより、精製調製物としてはじめて調製され
得る。完全長タンパク質、または１つもしくはそれ以上
の特定モチーフおよび／またはドメインに相当する断
片、または任意の大きさに相当する断片、例えば、少な
くとも約５個、１０個、２５個、５０個、７５個、また
は１００個のアミノ酸長の断片は、本発明の範囲内であ
る。
【０１８５】好ましいポリペプチドは、配列番号１、
３、５、または７の核酸配列に相補的なｍＲＮＡ配列と
少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５
％、９７％、または９８％同一である核酸配列によって
コードされるものであり、特に好ましいポリペプチド
は、配列番号２、４、６、または８に記載されるもので
ある。
【０１８６】タンパク質の単離ペプチジル部分は、かか
るペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え
的に産生されるペプチドをスクリーニングすることによ
り得ることができる。さらに、断片は、従来のMerrifie
ld固相ｆ−ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のような当該技
術にて既知の技法を用いて化学的に合成することができ
る。例えば、本発明のポリペプチドは、断片の重複のな
い所望の長さの断片に随意に分割、または好ましくは所
望の長さの重複断片に分割することができる。断片は、
産生され（組換え的に、または化学合成により）、試験
して、野生型（例えば、「標品」）タンパク質のアゴニ
ストまたはアンタゴニストとして機能することができる
ペプチジル断片を同定することができる。
【０１８７】本発明の別の態様は、対象タンパク質の組
換え体に関する。上述するように、自然タンパク質のほ
かに、本発明による好ましい組換えポリペプチドは、配
列番号１、３、５、または７、あるいはそれらに相補的
な配列によってコードされるアミノ酸配列に、少なくと
も約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さら
に好ましくは約８５％、よりいっそう好ましくは約９０
％、さらにいっそう好ましくは約９５％同一である核酸
によりコードされる。配列番号１、３、５、または７、
あるいはそれらに相補的な配列と少なくとも約９８〜９
９％同一である核酸によりコードされるポリペプチドも
また、本発明の範囲内である。また、かかるタンパク質
の少なくとも一部を含むペプチド断片もまた、本発明に
含まれる。
【０１８８】好ましい実施形態では、本発明のポリペプ
チドは、哺乳動物ポリペプチド、さらに好ましくはヒト
ポリペプチドである。特に好ましい実施形態では、ポリ
ペプチドは野生型生物活性を保持する。ある翻訳後修飾
（例えば、リン酸化等）は、非修飾ポリペプチド鎖に比
較して、ポリペプチドの見かけの分子量を増加させるこ
とができることを理解されたい。好ましい実施形態で
は、本発明のポリペプチドは、配列番号２、４、６、ま
たは８の配列を有する。
【０１８９】本発明はさらに、対象ポリペプチドのうち
の１つの組換え体に関する。かかる組換えポリペプチド
は、好ましくは、添付の配列表の野生型（「標品」）ポ
リペプチドの少なくとも１つの生物学的活性のアンタゴ
ニストまたはアゴニストとして機能できるものである。
タンパク質のアミノ酸配列に関して「に進化的に関す
る」という用語は、天然に存在しているアミノ酸配列を
有するポリペプチド、および例えばコンビナトリアル突
然変異誘発により得られるヒトポリペプチドの変異性変
異体の両方を指す。
【０１９０】一般に、タンパク質の活性（例えば、「生
物活性」である）を有する、本明細書中に記載のポリペ
プチドは、配列番号２、４、６、または８のアミノ酸配
列を含み、かつ天然に存在するタンパク質の生物学的／
生化学的活性のすべてまたは一部に類似するか、または
模倣するポリペプチドと定義される。本発明によれば、
ポリペプチドは、タンパク質の天然に存在する形態の特
異的アゴニストまたはアンタゴニストである場合に、生
物学的活性を有する。
【０１９１】化合物、例えばタンパク質またはその変異
体が、１つ以上の上記の生物学的活性を有するかどうか
を確定するためのアッセイは、当該技術において周知で
ある。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、上
記に概略したような活性を有する。
【０１９２】別の実施形態では、ポリペプチドをコード
する配列は、異なるポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む融合遺伝子の一部として組み込むことが
できる。この型の発現系は、ポリペプチドの免疫原性断
片を産生するのが望ましい条件下にて有用でる（例え
ば、欧州特許公報第０２５９１４９号、ならびにEvanse
t al. (1989) Nature 339:3 85、Huang et al. (1988)
J. Virol. 62:3 855、およびSchlienger et al., (199
2) J. Virol. 66:2を参照）。免疫原性を高めるために
融合タンパク質を利用することに加えて、融合タンパク
質はまた、タンパク質の発現を促進することができ、お
よび、したがって本発明のポリペプチドの発現に用いる
ことができることは広く認識されている（例えば、Curr
ent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel e
t al. (N.Y. John Wiley &Sons, 1991)を参照）。別の
実施形態では、精製リーダー配列、例えば組換えタンパ
ク質の所望の部分のＮ末端でのポリ（Ｈｉｓ）／エンテ
ロキナーゼ切断部位配列などをコードする融合遺伝子
は、Ｎｉ2+金属樹脂を用いたアフィニティクロマトグラ
フィにより、発現融合タンパク質の精製を可能とさせ
る。次に、精製リーダー配列は、続いてエンテロキナー
ゼで処理することにより除去され、精製タンパク質を提
供し得る（例えば、Hochuli et al. (1987) J. Chromat
ography 411:177、およびJanknecht et al. PNAS 88:89
72を参照）。
【０１９３】融合遺伝子を作製する技法は、当業者に既
知である。本質的に、種々のポリペプチド配列をコード
する種々のＤＮＡ断片の連結は、連結用平滑末端または
ねじれ型末端、適切な末端を提供するための制限酵素消
化か、適切な付着末端の充填(filling-in)、望ましくな
い連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、
および酵素的連結を用いて、従来の技法に従って行なわ
れる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合
成機を含む従来の技法により合成できる。また、核酸断
片のＰＣＲ増幅は、２つの連続核酸断片間の相補的オー
バーハングをもたらすアンカープライマーを用いて実行
することができ、続いて２つの連続核酸断片をアニール
して、キメラ核酸配列を生成することができる（例え
ば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. A
usubel et al. John Wiley &Sons:1922を参照）。
【０１９４】本発明はさらに、対象ポリペプチドを産生
する方法に関する。例えば、対象ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列の発現を誘導する核酸ベクターで
トランスフェクトした宿主細胞を、ペプチドを発現させ
るのに適切な条件下にて培養することができる。細胞培
養のための適切な培地は、当該技術にて周知である。イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、限外濾過、電気泳動、およびかかるペプチドに特
異的な抗体を用いた免疫親和性精製を含むタンパク質精
製のための当該技術で既知の技法を用いて、組換えポリ
ペプチドを細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方か
ら単離することができる。好ましい実施形態では、組換
えポリペプチドは、ＧＳＴ融合タンパク質のような、精
製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質であ
る。
【０１９５】さらに、ある状況においては、天然に存在
する形態のタンパク質の生物活性のサブセットのみを促
進または抑制するために、アゴニスト（擬似体）または
アンタゴニストのうちの１つとして限定された能力にて
機能する対象ポリペプチドのうちの１つの同族体を提供
することは有利であり得ることが一般的に理解されよ
う。したがって、特定の生物学的効果は、限定された機
能を有する同族体で処理することにより、天然に存在す
る形態の対象タンパク質の生物活性のすべてを対象にす
るアゴニストまたはアンタゴニストでの処理に比較して
少ない副作用で誘発できる。
【０１９６】対象ポリペプチドの各々の同族体は、別個
の点突然変異（複数可）による、または切断によるよう
な突然変異誘発により生成される。例えば、突然変異
は、ポリペプチドから得られるポリペプチドの生物活性
と実質的に同じもの、または単にそのサブセットを保持
する同族体を生じさせる。あるいは、受容体に競合的結
合によるような、天然に存在する形態のタンパク質の機
能を抑制することが可能なアンタゴニスト形態のポリペ
プチドを生成することができる。
【０１９７】本発明の組換えポリペプチドはまた、例え
ばユビキチン結合またはタンパク質に関連する他の酵素
的ターゲティングを改変する突然変異に起因して、タン
パク質分解性切断に耐性であるタンパク質型のような野
生型タンパク質の同族体を含む。
【０１９８】ポリペプチドはまた、化学的に修飾して、
グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチルル基等の
ような他の化学部分との共有結合体または凝集結合体を
形成することにより、誘導体を創出できる。タンパク質
の共有結合誘導体は、タンパク質のアミノ酸側鎖上の、
またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にある官能
基に、化学的部分を結合することにより調製することが
できる。
【０１９９】対象ポリペプチドの構造の修飾は、治療的
または予防的効率、安定性（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで
の貯蔵安定性およびタンパク質分解性分解に対する耐
性）、または翻訳後修飾（例えば、タンパク質のリン酸
化パターンを改変するため）を高めるような目的で行う
ことができる。かかる修飾ペプチドは、天然に存在する
形態のタンパク質の少なくとも１つの活性を保持するよ
うに、あるいはその特異的アンタゴニストを産生するよ
うに設計されると、本明細書中でより詳述するポリペプ
チドの機能的均等物とみなされる。かかる修飾ペプチド
は、例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加により産
生され得る。置換的変異体は、置換保存アミノ酸または
置換非保存アミノ酸であってもよい。
【０２００】例えば、イソロイシンまたはバリンでのロ
イシンの、グルタミン酸でのアスパラギン酸の、セリン
でのトレオニンの単離置換、または構造的に関連したア
ミノ酸でのアミノ酸の類似の置換（すなわち、等配電子
および／または等電位突然変異）は、得られる分子の生
物学的活性に大きな影響を与えないであろうと予期する
ことは合理的である。保存的置換は、側鎖に関連するア
ミノ酸ファミリー内に起こるものである。遺伝的にコー
ドされるアミノ酸は、４つのファミリー：（１）酸性＝
アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リシ
ン、アルギニン、ヒスチジン、（３）無極性＝アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェ
ニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および
（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミ
ン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分け
ることができる。同様の様式で、アミノ酸レパートリー
は、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、
（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、
（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、セリン、トレオニン（ただし、セリ
ンおよびトレオニンは任意に、脂肪族ヒドロキシルとし
て別に分類される）、（４）芳香族＝フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン、（５）アミド＝アスパ
ラギン、グルタミン、および（６）硫黄含有＝システイ
ンおよびメチオニンとして分類することができる（例え
ば、Biochemistry, 2 ed., Ed. by L. Stryer, WH Free
man and Co.: 1981）。ペプチドのアミノ酸配列の変化
が、機能的同族体（例えば、得られたポリペプチドが野
生型形態に類似するか、または拮抗するという意味で機
能性）を生じる結果となるかどうかは、野生型タンパク
質に類似する様式で細胞における応答を生じる能力また
はかかる応答を競合的に抑制する変異体ペプチドの能力
を評価することにより容易に決定することができる。
【０２０１】１つ以上の置換が起こったポリペプチド
は、同様の方法にて容易に試験することができる。変異
体は、タンパク質の特定領域の生物学的活性を保持する
ように設計することができる。非限定的な例では、Osaw
a et al., 1994, Biochemistryand Molecular Internat
ional 34:1003-1009は、数種の異なる種からのタンパク
質のアクチン結合領域について議論している。これらの
種のアクチン結合領域は、それらが「同族残基群」の範
囲内にあるアミノ酸を有するという事実に基づいて、同
族体とみなされる。同族残基は、（一文字アミノ酸記号
表示を用いた）以下の群：ＳＴＡＧ、ＩＬＶＭＦ、ＨＲ
Ｋ、ＤＥＱＮおよびＦＹＷにより判断される。例えば、
Ｓ、Ｔ、ＡまたはＧは、ある位置にあり得て、機能（こ
の場合アクチン結合）は保持される。
【０２０２】アミノ酸置換に関するさらなる案内は、タ
ンパク質進化の研究を利用できる。Go et al., 1980, I
nt. J. Peptide Protein Res. 15: 211-224は、接近し
易さ(accessibility)によって内部または外側としてア
ミノ酸残基部位を類別した。外側部位に関するより頻繁
な置換は、それらの生物機能および、補欠分子族の存在
または非存在に関係なく、同族タンパク質ファミリーの
８セットにおいて一般的であることが確認された。実際
上すべての型のアミノ酸残基は、内部におけるよりも外
側上にてより高い変異性を有していた。変異性および極
性間の相関関係は、それぞれ内部および外側におけるア
ミノ酸残基にて観察されなかった。アミノ酸残基は、そ
の極性に依存して、３つの群のうちの１つに類別され
た：極性（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ａｓｐ、およびＧｌｕ）、弱い極性（Ａｌａ、Ｐｒｏ、
Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒ）、および非極性（Ｃｙ
ｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙ
ｒ、およびＴｒｐ）。タンパク質進化中のアミノ酸置換
は、非常に保存的であり、それぞれ内部または外側にお
けるそれらの８８％または７６％は、３つのうちの同じ
群内にあった。群間の置換は、弱い極性残基が、内部に
おける非極性残基によってより頻繁に、かつ外側上の極
性残基によってより頻繁に置換されるようなものであ
る。
【０２０３】Querol et al., 1996, Prot. Eng. 9:265-
271は、タンパク質の熱安定性を高めるためのアミノ酸
置換に関する一般則を提供する。新たなグリコシル化部
位は、Olsen and Thomsen, 1991, J. Gen. Microbiol.
137:579-585にて論じられるように導入することができ
る。ジスルフィド架橋の付加は、Perry and Wetzel,198
4, Science 226:555-557、Pantoliano et al., 1987, B
iochemistry 26:2077-2082、Matsumura et al., 1989,
Nature 342:291-293、Nishikawa et al., 1990, Protei
n Eng. 3:443-448、Takagi et al., 1990, J. Biol. Ch
em, 265:6874-6878、Clarke et al., 1993, Biochemist
ry 32:4322-43299、およびWakarchuk et al., 1994, Pr
otein Eng. 7:1379-1386により論じられるように導入す
ることができる。
【０２０４】金属結合部位の付加は、Toma et al., 199
1, Biochemistry 30:97-106、およびHaezerbrouck et a
l., 1993, Protein Eng. 6:643-649にしたがって導入す
ることができる。ループにおけるプロリンによる置換
は、Masul et al., 1994, Appl Env. Microbiol. 60:35
79-3584、およびHardy et al., FEBS Lett. 317:89-92
にしたがって行われ得る。
【０２０５】システイン欠失突然変異タンパク質は、本
発明の範囲内にある変異体とみなされる。これらの変異
体は、システインを他のアミノ酸で置換する方法、およ
び置換の生物学的活性および効果を測定する方法を開示
する米国特許第４，９５９，３１４号に開示される方法
にしたがって構築することができる。かかる方法は、か
かる置換（例えば、ジスルフィド結合形成を除去するた
めの）に適切なシステイン残基を有する本発明のタンパ
ク質に適している。
【０２０６】核酸と相関する遺伝子の同一性および機能
を知るために、核酸または対応するアミノ酸配列を、タ
ンパク質ファミリーのプロフィールに対してスクリーニ
ングすることができる。かかるプロフィールは、各ファ
ミリーのタンパク質間の共通する構造モチーフに焦点を
置く。公的に利用可能なプロフィールは、上記に記載し
ている。追加する、または代替的プロフィールは、以下
に記載する。
【０２０７】新規な核酸を既知の配列と比較する際、い
くつかの整列ツールが利用できる。例として、複数配列
整列を創出するＰｉｌｅＵｐが挙げられ、これはFeng e
t al., J. Mol. Evol. (1987) 25:35 1-360に記載され
ている。別の方法のＧＡＰは、Needleman et al., J. M
ol. Biol. (1970) 48:443-453の整列方法を使用する、
ＧＡＰは、配列の包括的な整列に最適である。第３の方
法であるＢｅｓｔＦｉｔは、Smith and Waterman, Adv.
Appl. Math. (1981) 2:482-489のローカルホモロジー
アルゴリズムを用いて、マッチ数を最大にするようにギ
ャップを挿入することにより機能する。
【０２０８】かかるプロフィールの例を以下に示す。
【０２０９】ケモカイン ケモカインは、リンパ球輸送、炎症性疾患、血管新生、
血球新生およびウイルス感染に関与しているタンパク質
ファミリーである。例えば、Rollins, Blood (1997) 90
(3):909-928、およびWells et al., J. Leuk. Biol. (1
997) 61:545-550を参照されたい。米国特許第５，６０
５，８１７号は、胎児脾臓にて発現されるケモカインを
コードするＤＮＡを開示している。米国特許第５，６５
６，７２４号は、ケモカイン様タンパク質および使用方
法を開示している。米国特許第５，６２０，００８号
は、肝臓により発現されるケモカインをコードするＤＮ
Ａを開示している。
【０２１０】コードされるケモカインの突然変異体は、
未変性ケモカインと比較して、少なくとも１つのアミノ
酸の置換、付加、または欠失のあるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドである。断片は、未変性ケモカインと同
じアミノ酸配列を保有し、突然変異体は、アミノおよび
／またはカルボキシル末端配列を欠如していることがあ
る。融合は、突然変異体、断片、またはアミノおよび／
またはカルボキシル末端アミノア酸伸長をも含む未変性
ケモカインである。
【０２１１】アミノ酸変化の数および型は、重大でな
く、かつ、アミノ酸欠失、あるいは未変性ケモカインア
ミノ酸配列に比較してケモカイン中に組み込まれるアミ
ノ酸伸長の長さまたは数も重大ではない。これらの変異
体ポリペプチドのうちの１つをコードするポリヌクレオ
チドは、少なくとも１つの既知のケモカインと少なくと
も約８０％のアミノ酸同一性を保持するであろう。好ま
しくは、これらのポリペプチドは、少なくとも約８５
％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらに好まし
くは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を保持す
るであろう。さらに、変異体は、未変性ケモカインによ
り示される少なくとも１つの活性の、少なくとも８０
％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％を示
すであろう。ケモカイン活性としては、未変性ケモカイ
ンの免疫学的機能、生物学的機能、受容体結合機能、お
よびシグナル伝達機能が挙げられる。
【０２１２】走化性 好中球に関する走化性のためのアッセイは、Walz et a
l., Biochem. Biophys.Res. Commun. (1987) 149:755、
Yoshimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (19
87) 84:9233、およびSchroder et al., J. Immunol. (1
987) 139:3474に、リンパ球に関する走化性のためのア
ッセイは、Larsen et al., Science (1989) 243;1464、
Carr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1994) 9
1:3652に、腫瘍浸潤性リンパ球に関する走化性のための
アッセイは、Liao et al., J. Exp. Med. (1995). 182:
1301に、造血前駆体に関する走化性のためのアッセイ
は、Aiuti et al., J. Exp. Med. (1997) 185:111に、
単球に関する走化性のためのアッセイは、Valente et a
l., Biochem. (1988) 27:4162に、ナチュラルキラー細
胞に関する走化性のためのアッセイは、Loetscher et a
l., J. Immunol. (1996) 156:322およびAllavena et a
l., Eur. J. Immunol. (1994) 24:3233に記載されてい
る。
【０２１３】好酸球を誘引する生物活性を測定するため
のアッセイは、Dahinden et al., J. Exp. Med. (1994)
179:751、Weber et al., J. Immunol. (1995) 154:416
6、およびNoso et al., Biochem. Biophys. Res. Commu
n. (1994) 200:1470に、樹状細胞を誘引するための生物
活性を測定するためのアッセイは、Sozzani et al., J.
Immunol. (1995) 155:3292に、好塩基球を誘引するた
めの生物活性を測定するためのアッセイは、Dahinden e
t al., J. Exp. Med. (1994) 179:751、Alamet al., J.
Immunol. (1994) 152:1298、Alam et al., J. Exp. Me
d. (1992) 176:781に、好中球を活性化するための生物
活性を測定するためのアッセイは、Maghazaci et al.,
Eur. J. Immunol. (1996) 26:315、およびTaub et al.
J. Immunol. (1995) 155:3877に記載される。未変性ケ
モカインは、繊維芽細胞のための分裂促進因子として作
用することができ、Mullenbach et al., J. Biol. Che
m. (1986) 261:719に記載されるようにアッセイされ
る。
【０２１４】受容体結合 未変性ケモカインは、多数の受容体との結合活性を示
す。かかる受容体および結合を検出するためのアッセイ
の説明は、例えば、Murphy et al., Science (1991) 25
3;1280、Combadiere et al., J. Biol. Chem. (1995) 2
70:29671、Daugherty et al., J. Exp. Med. (1996) 18
3:2349、Samson et al., Biochem. (1996)35:3362、Rap
ort et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:17161、Comba
diere etal., J. Leukoc. Biol. (1996) 60:147、Baba
et al., J. Biol. Chem. (1997)23:14893、Yosida et a
l., J. Biol. Chem. (1997) 272: 13803、Arvannitakis
et al., Nature (1997) 385:347に記載され、多くの他
のアッセイが当該技術にて既知である。
【０２１５】キナーゼ活性化 キナーゼ活性化のためのアッセイは、Yen et al., J. L
eukoc. Biol. (1997)61:529、Dubois et al., J. Immun
ol. (1996) 156:1356、Turner et al., J. Immunol. (1
995) 155:2437により記載される。血管新生または細胞
増殖の抑制のためのアッセイは、Malone et al., Scien
ce (1990) 247:77に記載される。グリコサミノグリカン
生産は、未変性ケモカインによって誘発することがで
き、Castoret al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (19
83) 80:765に記載されるようにアッセイされる。好塩基
球からのケモカイン媒介性ヒスタミン放出は、Dahinden
et al., J. Exp. Med. (1989) 170:1787、およびWhite
et al., Immunol. Lett.(1989) 22:151に記載されるよ
うにアッセイされる。ヘパリン結合は、Luster etal.,
J. Exp. Med. (1995) 182:219に記載される。
【０２１６】二量体化活性 ケモカインは、ニ量化活性を有することができ、それは
Burrows et al., Biochem (1994) 33 12741、およびZha
ng et al., Mol. Cell. Biol. (1995) 15:4851に従って
アッセイされる。未変性ケモカインは、ウイルスの炎症
性応答の役割を果たすことができる。この活性は、Bleu
l et al., Nature (1996) 382:829、およびOberlin et
al., Nature (1996) 382:833に記載されるようにアッセ
イすることができる。単球のエキソサイトーシスは、未
変性ケモカインによって促進することができる。かかる
活性のためのアッセイは、Uguccioni et al., Eur. J.I
mmunol. (1995) 25:64に記載されている。未変性ケモカ
インはまた、造血幹細胞増殖を抑制することができる。
かかる活性を試験する方法は、Graham et al.,Nature
(1990) 344:442に報告されている。
【０２１７】デスドメイン(death domain)タンパク質 いくつかのタンパク質ファミリーは、デスドメインモチ
ーフを含有する(Feinstein and Kimchi, TIBS Letters
(1995) 20:242-244)。いくつかのデスドメイン含有タン
パク質は、細胞障害性細胞内シグナル伝達に関与する(C
leveland and Ihle, Cell (1995) 81:479-482, Pan et
al., Science (1997) 276:111-113, Duan and Dixit, N
ature (1997) 385:86-89、およびChinnaiyan et al., S
cience (1996) 274:990-992)。米国特許第５，５６３，
０３９号は、ＴＲＡＤＤ（腫瘍壊死因子受容体−１関連
デスドメイン含有タンパク質）と相同のタンパク質、お
よび該タンパク質の機能的特徴を保持する、ＴＲＡＤＤ
の活性ドメインの修飾、ならびにかかるデスドメインを
含有するタンパク質の機能を試験するためのアポトーシ
スアッセイについて記載している。米国特許第５，６５
８，８８３号は、生物学的に活性なＴＧＦ−Ｂ１ペプチ
ドを開示する。米国特許第５，６７４，７３４号は、Ｃ
末端デスドメインおよびＮ末端キナーゼドメインを含有
するタンパク質ＲＩＰを開示する。
【０２１８】白血病抑制因子（ＬＩＦ） ＬＩＦプロフィールは、ＣＴ−Ｉ（カルジオトロフィン
−１）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＯＳＭ（オ
ンコスタチンＭ）、およびＩＬ−６（インターロイキン
−６）の白血病抑制因子の配列から構築される。このプ
ロフィールは、肝細胞、破骨細胞、神経細胞および心臓
単球を含む多くの細胞型に多面発現効果がある分泌サイ
トカインのファミリーを包含し、かかるタンパク質をコ
ードする付加的された遺伝子を検出するのに使用するこ
とができる。これらの分子は、すべて構造的に関連して
おり、ｓｒｃのような細胞質チロシンキナーゼによる細
胞内シグナル伝達を媒介する共通補助受容体ｇｐ１３０
を共有する。
【０２１９】このファミリーに関連する新規タンパク質
はまた、分泌されて、ｇｐ１３０を活性化し、様々な細
胞型の発達において機能するようである。したがって、
このファミリーの新規成員は、それらが刺激する細胞型
の成長または生存因子として開発されるべき候補物であ
ろう。このサイトカインのファミリーに関するより詳細
については、Pennica et al., Cytokine and Growth Fa
ctor Reviews (1996)7:81-91を参照されたい。米国特許
第５，４２０，２４７号は、ＬＩＦ受容体および融合タ
ンパク質を開示する。米国特許第５，４４３，８２５号
は、ヒトＬＩＰを開示する。
【０２２０】アンジオポイエチン アンジオポイエチン−１は、ＴＩＥ−２チロシンキナー
ゼの分泌リガンドであり、それは、正常血管発達に重要
な血管新生因子として機能する。アンジオポイエチン−
２は、アンジオポイエチン−１の天然アンタゴニストで
あり、したがって、抗血管新生因子として機能する。こ
れらの２つのタンパク質は、構造的に類似しており、同
じ受容体を活性化する(Folkman and D'Amore, Cell (19
96) 87:1153-1155, and Davis et al., Cell (1996) 8
7:1161-1169)。
【０２２１】アンジオポイエチン分子は、２つのドメイ
ン：コイルドコイル領域およびフィブリノーゲン関連領
域から構成される。フィブリノーゲンドメインは、フィ
コリンおよびテネイシンを含む多くの分子中に見られ、
多くの成員とともに構造的に十分規定されている。
【０２２２】受容体タンパク質−チロシンキナーゼ 受容体タンパク質−チロシンキナーゼまたはＲＰＴＫ
は、Lindberg. Annu. Rev. Cell Biol. (1994) 10:25 1
-337に記載されている。
【０２２３】成長因子：上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）お
よび線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ） 成長因子スーパーファミリーの議論に関しては、Growth
Factors: A Practical Approach. Appendix A1 (Ed. M
cKay and Leigh, Oxford University Press, NY, 1993)
pp.237-243を参照されたい。
【０２２４】ＥＧＦおよびＦＧＦに関する整列（ｐｒｅ
ｔｔｙ ｂｏｘ）を、それぞれ図１および図２に示す。
米国特許第４，４４４，７６０号は、酸性脳線維芽細胞
成長因子を開示し、それは、細胞分裂および創傷治癒の
促進にて活性である。米国特許第５，４３９，８１８号
は、ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子をコードする
ＤＮＡを開示し、それは創傷治癒にて活性である。米国
特許第５，６０４，２９３号は、組換えヒト塩基性繊維
芽細胞成長因子を開示し、それは創傷治癒に有用であ
る。米国特許第５，４１０，８３２号は、脳由来の組換
え酸性線維芽細胞成長因子を開示し、それは培養にて中
胚葉および神経外胚葉由来細胞のための分裂促進因子と
して作用し、軟部組織、軟骨組織および筋骨格組織にお
いて創傷治癒を促進する。米国特許第５，３８７，６７
３号は、活性を保持するＦＧＦの生物学的に活性な断片
を開示する。
【０２２５】ＴＮＦファミリーのタンパク質 ＴＮＦファミリーから得られるプロフィールは、以下の
ＴＮＦファミリー成員：神経成長因子（ＮＧＦ）、リン
ホトキシン、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）、ＣＤ４Ｏリガンド、ＴＲＡＩＬ、ｏｘ４０リガン
ド、４−ＩＢＢリガンド、ＣＤ２７リガンド、およびＣ
Ｄ３０−リガンドの配列を整列することにより作り出さ
れる。このプロフィールは、このファミリーのタンパク
質の新たな成員または同族体を構成するタンパク質の配
列を同定するように設計されている。
【０２２６】米国特許第５，６０６，０２３号は、突然
変異体ＴＮＦタンパク質を開示しており、米国特許第
５，５９７，８９９号および米国特許第５，４８６，４
６３号は、ＴＮＦ突然変異タンパク質を開示しており、
米国特許第５，６５２，３５３号は、ＴＮＦ突然変異タ
ンパク質をコードするＤＮＡを開示している。
【０２２７】ＴＮＦファミリーのタンパク質の成員は、
Burrows et al., Biochem. (1994)33: 12741、およびZh
ang et al., Mol. Cell. Biol. (1995) 154851に記載さ
れるように多量体化することがｉｎ ｖｉｔｒｏでわか
っており、またBrowning et al., J. Immunol. (1994)
147:1230. Androlewicz et al., J. Biol. Chem. (199
2) 267: 2542、およびCrowe et al., Science (1994) 2
64:707に記載されるように受容体を結合することがわか
っている。
【０２２８】ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＮＦは、Kriegel et
al., Cell (1988) 53:45、およびMohler et al., Natu
re (1994) 370:218に記載されるように、標的タンパク
質をタンパク分解的に切断し、細胞増殖および分化活性
を明示する。Ｔ細胞または胸腺細胞増殖は、Armitage e
t al., Eur. J. Immunol. (1992) 22:447、Current Pro
tocols in Immunology, ed. J.E. Coligan et al., 3.1
-3.19、Takai et al.,J. Immunol. (1986) 137:3494-35
00、Bertagnoli et al., J. Immunol. (1990)145:1706-
1712、Bertagnoli et al., J. Immunol. (1991) 133:32
7-340、Bertagnoli et al., J. Immunol. (1992) 149:3
778-3783、およびBowman et al., J.Immunol. (1994) 1
52:1756-1761に記載されるようにアッセイされる。Ｂ細
胞増殖およびＩｇ分泌は、Maliszewski, J. Immunol.
(1990) 144:3028-3033、およびAssays for B cell Func
tion: In vitro antibody production, Mond and Bruns
wick, Current Protocols in Immunol., Coligan Ed vo
l 1 pp 3.8.1-3.8.16、John Wiley and Sons, Tronto 1
994、Kebrl et al., Science (1987) 238:1144、および
Boussiotis et al., PNAS USA (1994) 91:7007に記載さ
れるようにアッセイされる。
【０２２９】他のｉｎ ｖｉｖｏ活性としては、Barret
t et al., J. Immunol. (1991) 146:1722、Bjorck et a
l., Eur. J. Immunol. (1993) 23:1771、Clark et al.,
Annu Rev. Immunol. (1991) 9:97、Ranheim et al.,
J. Exp. Med. (1994) 177:925、Yellin, J. Immunol.
(1994) 153:666、およびGruss et al., Blood (1994) 8
4:2305に記載されるように、細胞表面抗原のアップレギ
ュレーション、共刺激分子のアップレギュレーション、
および細胞集合／接着が挙げられる。
【０２３０】造血細胞およびリンパ球新生細胞の増殖お
よび分化はまた、Johansson et al., Cellular Biology
(1995) 15:141-151、Keller et al., Mol. Cell. Bio
l. (1993) 13:473-486、McClanahan et al., Blood (19
93) 81: 2903-2915に記載されるように、胚の分化およ
び造血のためのアッセイを用いて、およびCulture of H
ematopoietic Cells, Freshney et al. eds, pp 1-21,
23-29, 139-162, 163-179, and 265-268, Wiley-Liss,
Inc., New York, NY, 1994, およびHirajama etal., PN
AS USA (1992) 89:5907-5911に記載されるように、幹細
胞生存および分化を検出するためのアッセイを用いて、
ＴＮＦに関してin vivoにて示されている。
【０２３１】ＴＮＦのin vivo活性としてはまた、リン
パ球生存およびアポトーシスが挙げられ、Darzynkewicz
et al., Cytometry (1992) 13:795-808、Gorczca et a
l.,Leukemia (1993) 7:659-670、Itoh et al., Cell (1
991) 66:233-243、Zacharduk, J. Immunol. (1990) 14
5:4037-4045、Zamai et al., Cytometry (1993) 14:891
-897、およびGorczyca et al., Int'l Oncol. (1992)
1:639-648に記載されるようにアッセイされる。
【０２３２】ＴＮＦファミリーのいくつかの成員は、細
胞表面から切断され、他の成員は膜に結合された状態の
ままである。ＴＮＦの三次元構造は、上述のSprang and
Eck, Tumor Necrosis Factorsにて議論されている。
【０２３３】ＴＮＦタンパク質は、膜貫通ドメインを含
む。このタンパク質は、Kriegler et al., Cell (1988)
53:45-53、Perez et al., Cell (1990) 63:251-258、
およびShaw et al., Cell (1986) 46:659-667に記載さ
れるように、より短い可溶型に切断される。ＴＮＦαの
ヒト形態において、膜貫通ドメインは、アミノ酸４６〜
７７間にあり、細胞質ドメインは、位置１〜４５間にあ
る。ＴＮＦの三次元モチーフは、２つのプリーツの付い
たβシートのサンドイッチを含む。各シートは、逆平行
αストランドから構成され、サンドイッチの反対部位に
て互いに面しているαストランドは、Van Ostade et a
l., Protein Engineering (1994) 7(1):5-22、および上
述のSprang et al., Tumor Necrosis Factorsに記載さ
れるように、短いポリペプチドループで結合される。
【０２３４】βシート二次構造に関与するＴＮＦファミ
リータンパク質の残基は、上述のVan Ostade et al., P
rotein Engineering (1994) 7(1):5-22、およびSprang
et al., Tumor Necrosis Factorsに記載されるように同
定された。
【０２３５】ＴＮＦ受容体は、米国特許第５，３９５，
７６０号に開示されている。ＴＮＦ受容体ファミリーか
ら得られるプロフィールは、Ａｐｏｌ／Ｆａｓ、ＴＮＦ
ＲＩおよびＩＩ、デス受容体3（ＤＲ３）、ＣＤ４０、
ｏｘ４０、ＣＤ２７、およびＣＤ３０を含むＴＮＦ受容
体ファミリーの配列を整列することにより創出される。
したがって、このプロフィールは、本発明の核酸から、
このタンパク質のファミリーの新たな成員または同族体
を構成するタンパク質配列を同定するように設計され
る。
【０２３６】腫瘍壊死因子受容体は、ヒトにて２つの形
態：ｐ５５ＴＮＦＲおよびｐ７５ＴＮＦＲにて存在し、
その両方が、リガンドと結合すると細胞内シグナルを提
供する。これらの受容体タンパク質の細胞外ドメイン
は、システインリッチである。受容体のいくつかの形態
は切断されて可溶性受容体を形成するが、受容体は、膜
に結合された状態のままであり得る。可溶性ＴＮＦ受容
体の調節、診断的価値、予後的価値および治療的価値
は、Aderka, Cytokine and Growth Factor Reviews, (1
996) 7(3):231-240にて検討されている。
【０２３７】ＰＤＧＦファミリー 米国特許第５，３２６，６９５号は、血小板由来成長因
子アゴニストを開示し、ＰＤＧＦ−Ｂの生物活性部分は
アゴニストとして使用される。米国特許第４，８４５，
０７５号は、生物学的に活性なＢ鎖ホモ二量体を開示
し、ＰＤＦＧ−Ｂ鎖の変異体および誘導体をも含む。米
国特許第５，１２８，３２１号は、ＰＤＧＦ類縁体およ
び使用方法を開示している。ＰＤＧＦと同じ生物活性を
有するタンパク質が開示されていて、Ａ鎖およびＢ鎖タ
ンパク質を含む。
【０２３８】キナーゼ（ＭＫＫを含む）ファミリー 米国特許第５，６５０，５０１号は、有糸分裂および減
数分裂細胞分裂に関連して、セリン／トレオニンキナー
ゼを開示し、このタンパク質は、そのＮ末端にキナーゼ
ドメインを、Ｃ末端に３ＰＥＳＴ領域を有する。米国特
許第５，６０５，８２５号は、ヒトＰＡＫ６５、セリン
タンパク質キナーゼを開示している。
【０２３９】先述の検討から、本発明の核酸と比較され
得るタンパク質プロフィールの数例が提供される。当業
者は、核酸と相関する遺伝子を同定するために、これら
および他のタンパク質プロフィールを使用することがで
きる。
【０２４０】ＩＸ コード発現産物の機能の測定 リボザイム、アンチセンス構築物、優性ネガティブ突然
変異体、および三重鎖形成を用いて、核酸関連遺伝子の
発現産物の機能を測定することができる。
【０２４１】Ａ．リボザイム トランス切断触媒ＲＮＡ（リボザイム）は、エンドリボ
ヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイ
ムは、特定の標的に関して特異的に設計され、標的メッ
セージは、特異的ヌクレオチド配列を含有しなくてはな
らない。それらは、細胞ＲＮＡの基礎環境にて、部位特
異的にいかなるＲＮＡ種をも切断するように操作され
る。切断事象は、ｍＲＮＡを不安定にし、タンパク質発
現を防止する。重要なことは、リボザイムは、in vitro
またはin vivoの状況にて、表現型の影響を検出するこ
とにより、その機能を確定する目的で、未知の機能を有
する遺伝子の発現を抑制するのに用いることができる。
【０２４２】１つの一般的に用いられるリボザイムモチ
ーフは、ハンマーヘッドであり、それに関しては、基質
配列要件は、最小である。ハンマーヘッドリボザイムの
設計は、Usman et al., Current Opin. Struct. Biol.
(1996) 6:527-533に開示されている。Usmanはまた、リ
ボザイムの治療的使用も検討している。リボザイムはま
た、Long et al., FASEB J. (1993) 7:25、Symons, An
n. Rev. Biochem. (1992) 61:641、Perrotta et al., B
iochem. (1992) 31:16-17、Ojwang et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. (USA) (1992) 89:10802-10806、および
米国特許第５，２５４，６７８号に記載されるように調
製および使用することができる。ＨＩＶ−ＩＲＮＡのリ
ボザイム切断は、米国特許第５，１４４，０１９号に記
載され、リボザイムを用いたＲＮＡの切断方法は、米国
特許第５，１１６，７４２号に記載され、リボザイムの
特異性を増加させる方法は、米国特許第５，２２５，３
３７号、およびKoizumi et al., Nucleic Acid Res. (1
989) 17:7059-7071に記載されている。ハンマーヘッド
構造におけるリボザイム断片の調製および使用もまた、
Koizumi et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17:7059-
7071により記載されている。ヘアピン構造におけるリボ
ザイム断片の調製および使用は、Chowrira andBurke, N
ucleic Acids Res. (1992) 20:2835に記載されている。
リボザイムはまた、Daubendiek and Kool, Nat. Biotec
hnol. (1997) 15(3):273-277に記載されるように転写を
作動する(roll)ことにより作製され得る。
【０２４３】リボザイムのハイブリダイズ領域は、Horn
and Urdea, Nucleic Acids Res. (1989) 17:6959-67に
記載されるように、分岐構造として修飾または調製する
ことができる。リボザイムの基本構造はまた、当業者に
公知の方法にて化学的に改変してもよく、化学的に合成
されたリボザイムは、単量体ユニットで修飾された合成
オリゴヌクレオチド誘導体として投与することができ
る。治療の場合には、Birikh et al., Eur. J. Bioche
m. (1997) 245:1-16に記載されるように、リボザイムの
リポソーム媒介性送達は、細胞取り込みを改良する。
【０２４４】本発明の核酸配列および当該技術にて既知
の方法を用いて、リボザイムは、相当するｍＲＮＡ種を
特異的に結合して切断するよう設計される。したがっ
て、リボザイムは、開示する核酸またはそれらの完全長
遺伝子によりコードされるタンパク質のいずれかの発現
を抑制するための手段を提供する。特異的抑制リボザイ
ムを設計および使用するために、完全長遺伝子は既知で
ある必要はない。未知の機能の核酸またはｃＤＮＡの場
合には、そのヌクレオチド配列に相当するリボザイム
は、標的転写物を切断する際の効力に関して、in vitro
にて試験することができる。In vitroにて切断させるリ
ボザイムは、さらにin vivoにて試験される。リボザイ
ムはまた、Birikh et al., Eur. J. Biochem. (1997) 2
45:1-16に記載されるように、疾患用動物モデルを生成
するのに使用することができる。有効なリボザイムを用
いて、遺伝子の転写を妨害し、細胞における変化を検出
することにより、所定の遺伝子の機能を確定する。遺伝
子が疾患における媒介物質であることが見出されている
場合、有効なリボザイムは、遺伝子の転写および発現を
妨害するための遺伝子治療にて、設計計および送達され
る。
【０２４５】リボザイムの治療的および機能ゲノム適用
は、抑制されるべき遺伝子のコード配列の一部を知るこ
とから始まって進行する。したがって、多くの遺伝子に
関して、部分的核酸配列は、有効リボザイムを構築する
のに適した配列を提供する。標的切断部位は、標的配列
にて選択され、リボザイムは、切断部位に隣接する５’
および３’ヌクレオチド配列に基づいて構築される。レ
トロウイルスベクターは、標的コード配列のｍＲＮＡを
ターゲティングする単量体および多量体ハンマーヘッド
リボザイムを発現するように操作する。これらの単量体
および多量体リボザイムについて、標的ｍＲＮＡを切断
する能力を、in vitroにて試験する。細胞系は、リボザ
イムを発現するレトロウイルスベクターで安定に形質導
入され、形質導入は、ノーザンブロット分析および逆転
写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により確認さ
れる。細胞は、標的ｍＲＮＡの不活性化に関して、疾患
マーカーの発現の低減、または標的ｍＲＮＡの遺伝子産
物の低減のような指標により、スクリーニングされる。
【０２４６】Ｂ．アンチセンス アンチセンス核酸は、ＲＮＡに特異的に結合するよう設
計され、ＤＮＡ複製、逆転写またはメッセンジャーＲＮ
Ａ翻訳の停止を伴って、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−
ＲＮＡ−ハイブリッドを形成させる。選択核酸配列に基
づいたアンチセンスポリヌクレオチドは、対応する遺伝
子の発現を妨げ得る。アンチセンスポリヌクレオチドは
典型的に、転写された鎖としてアンチセンス核酸鎖を含
有するアンチセンス構築物からの発現により、細胞内に
生成される。アンチセンス核酸は、核酸関連ｍＲＮＡに
結合し、および／またはその翻訳を妨げるであろう。対
照細胞およびアンチセンス構築物で処理した細胞の発現
産物を比較して、核酸に対応する遺伝子のタンパク質産
物を検出する。ルーチンな生化学的方法を用いて、タン
パク質を単離して、同定する。
【０２４７】核酸に対応する遺伝子の機能を確定するた
めのアンチセンス方法の使用のための１つの本義は、ア
ンチセンス治療学の生物学的活性である。様々な癌のア
ンチセンス治療は、臨床段階にあり、文献にて広く検討
されている。Reedは、腫瘍におけるＢｃｌ−２遺伝子に
て向けられるアンチセンス治療について（腫瘍細胞系に
おけるＢｃｌ−２の遺伝子移入媒介性過剰発現は、多く
の型の癌薬剤に対する耐性を与える）概説した(Reed,
J.C., N.C.I. (1997) 89:988-990)。ｒａｓのアンチセ
ンス抑制剤の臨床開発のための潜在性は、Cowsert, L.
M., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:359-371によ
り検討されている。さらなる重要なアンチセンス標的と
しては、白血病(Geurtz, A.M., Anti-Cancer Durg Desi
gn (1997) 12:341-358)、ヒトＣ-ｒｅｆキナーゼ(Moni
a, B.P., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:327-33
9)、およびプロテインキナーゼＣ(McGraw et al., Anti
-CancerDrug Design (1997) 12:315-326)が挙げられ
る。
【０２４８】アンチセンス治療における広範な背景文献
および臨床経験が与えられると、当業者は、さらなる考
え得る治療として、本発明の選択核酸を使用することが
できる。核酸の選択範囲は、癌性細胞のゲノムの「ホッ
トスポット」領域への結合について、核酸をまず試験す
ることにより、絞ることができる。核酸が、「ホットス
ポット」に結合すると同定される場合には、相当する癌
細胞におけるアンチセンス化合物として核酸を試験する
ことが明確に正当化される。
【０２４９】Ogunbiyi et al., Gastroenterology (199
7) 113(3):761-766は、結腸癌におけるオーディオロス
(audio loss)の予後用途について記載し、Barks et a
l., Genes, Chromosomes, and Cancer (1997) 19(4):27
8-285は、悪性黒色腫にてＦＩＳＨにより検出される染
色体コピー数の増加について記載し、Nishjzake et a
l., Genes. Chromosomes, and Cancer (1997) 19(4):26
7-272は、原発性乳癌およびそれらの転移における遺伝
的改変、ならびに修飾比較ゲノムハイブリダイゼーショ
ンを用いた直接比較について記載し、Elo et al., Canc
er Research (1997)57(16):3356-3359は、１６ｚ２４．
１−ｑ２４．２でのヘテロ接合性の損失が、前立腺癌の
転移性および攻撃的挙動に非常に関連があることを開示
する。
【０２５０】Ｃ.優性ネガティブ突然変異 核酸関連遺伝子の機能を同定するための代替的方法とし
て、優性ネガティブ突然変異は、ホモ多量体として活性
な相当するタンパク質を得るために、容易に生成され
る。突然変異体ペプチドは、（他の対立遺伝子から作製
される）野生型ポリペプチドと相互作用し、非機能性多
量体を形成する。したがって、突然変異は、基質結合ド
メイン、触媒ドメイン、または細胞局在化ドメインに存
在する。好ましくは、突然変異体ポリペプチドは、過剰
産生されるであろう。かかる効果を有する点突然変異が
作製される。さらに、タンパク質の末端への様々な長さ
の種々ポリペプチドの融合は、優性ネガティブ突然変異
体を生じさせる。優性ネガティブ突然変異体を作製する
ための一般的な戦略を利用できる。Herskowitz, Nature
(1987) 329:219-222を参照されたい。かかる技法は、
機能損失の突然変異を創出するために用いることでき、
タンパク質の機能を決定するのに有用である。
【０２５１】Ｄ.三重鎖形成 内因性遺伝子発現はまた、標的相同組換えを用いて、遺
伝子またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノッ
クアウト」することにより低減させることができる（例
えば、Smithies et al., 1985, Nature 317:230-234; T
homas & Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson
et al., 1989 Cell 5:313-321（それらの各々の全体
は、参照することにより本明細書に援用される）を参
照）。例えば、選択可能マーカーおよび／またはネガテ
ィブ選択可能マーカーを用いて、または用いずに、突然
変異体、内在性遺伝子（遺伝子のコード領域または調節
領域）に相同性であるＤＮＡに隣接される非機能性遺伝
子（または完全に未関連のＤＮＡ配列）を用いて、ｉｎ
ｖｉｖｏにてその遺伝子を発現する細胞をトランスフ
ェクトすることができる。標的相同組換えを介したＤＮ
Ａ構築物の挿入は、遺伝子の不活性化という結果を生じ
る。
【０２５２】あるいは、内因性遺伝子発現は、標的遺伝
子の調節領域（すなわち、遺伝子プロモーターおよび／
またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオ
チド配列を標的とすることにより低減され、体内中の標
的細胞における遺伝子の転写を防止する三重らせん構造
を形成することができる（一般に、Helene, C. 1991,An
ticancer Drug Des., 6(6):569-84、Helene, C., et. a
l., 1992, Ann, N.Y.Accad. Sci., 660:27-396、および
Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15を参
照）。
【０２５３】転写を抑制するための三重らせん形成にて
使用される核酸分子は、好ましくは、一本鎖であり、デ
オキシリボヌクレオチドから構成される。これらのオリ
ゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティン塩基対規
則により三重らせん形成を促進するはずであり、それは
一般に二重鎖のうちの１つの鎖状に存在すべきプリンま
たはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸展を必要と
する。ヌクレオチド配列は、ピリミジン系であってもよ
く、それらは得られる三重らせんの３つの関連鎖を横断
してＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットを生じるであろ
う。ピリミジンに富んだ分子は、その鎖に対して平行な
方向で、二重鎖の一本鎖のプリンに富んだ領域に相補的
な塩基を提供する。さらに、例えばＧ残基の伸展を含む
プリンに富んでいる核酸分子が選択されてもよい。これ
らの分子は、ＧＣ対に富んだＤＮＡ二重鎖内に三重らせ
んを形成し、そこで大部分のプリン残基は、標的二重鎖
の一本鎖上に位置され、三重鎖にて３つの鎖を横断して
ＣＧＣトリプレットを生じるであろう。
【０２５４】あるいは、三重らせん形成のための標的に
される潜在的配列は、「スイッチバック」と呼ばれる核
酸分子を創出することにより、増加させることができ
る。スイッチバック分子は、二重鎖の第１の一本鎖と、
次に他方の一本鎖と塩基対をなすように、５’−３’、
３’−５’の交互方式で合成され、二重鎖の一本鎖上に
存在するべきプリンまたはピリミジンのかなり大きい伸
展の必要性を無くす。
【０２５５】本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮ
Ａ、リボザイムならびに三重らせん分子は、ＤＮＡおよ
びＲＮＡ分子の合成のための当該技術にて既知のあらゆ
る方法によって調製することができる。これらには、例
えば固相ホスホラミダイト化学合成のような、オリゴデ
オキシリボヌクレオチドやオリゴリボヌクレオチドを化
学的に合成する既知の技法を含む。あるいは、ＲＮＡ分
子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列
のin vitroおよびin vivo転写により生成される。かか
るＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモ
ーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター
を組み込む多種多様のベクター中に組み込まれてもよ
い。あるいは、構造的またはまたは誘発的にアンチセン
スＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、使
用するプロモーターに依存して、細胞系に安定に導入す
ることができる。
【０２５６】さらに、核酸分子への様々な周知の修飾
を、細胞内安定性および半減期を高める手段として導入
してもよい。考え得る修飾としては、分子の５’および
／もしくは３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキ
シシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、ある
いはオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン内の
ホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオエー
トまたは２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられるが、これ
らに限定されない。
【０２５７】Ｘ．診断および予後アッセイおよび薬剤ス
クリーニング方法 本発明は、開示する生物マーカー、すなわち開示する核
酸マーカー（配列番号１、３、５、もしくは７、または
それらに相補的な配列、あるいは１つまたは複数の配列
番号１、３、５、または７にハイブリダイズする配
列）、および／またはそれらによりコードされる疾患ま
たは状態のポリペプチドマーカーを検出することによ
り、望ましくない細胞増殖に特徴づけられる疾患または
病状が進展する危険性が、患者にあるかどうかを決める
方法を提供する。
【０２５８】臨床用途では、ヒト組織試料は、本明細書
にて同定される生物マーカーの存在および／または非存
在に関してスクリーニングされ得る。かかる試料は、例
えば針生検材料コア、外科的切除試料、リンパ節組織ま
たは血清を含む、組織試料、全細胞、細胞溶解産物、ま
たは単離核酸を含み得る。例えば、これらの方法は、生
検材料を得ることを含み、それは低温切片化して、全細
胞集団の約８０％に腫瘍細胞を高めることにより任意に
分取する。ある実施形態では、これらの試料から抽出さ
れる核酸は、当該技術にて周知の技法を用いて増幅する
ことができる。検出される選択マーカーレベルを、転移
性、非転移性悪性、良性または正常結腸組織試料の統計
的に妥当な群と比較する。
【０２５９】一実施形態では、診断方法は、患者が、開
示するマーカーの異常ｍＲＮＡおよび／またはタンパク
質レベルを有するかどうか、ノーザンブロット分析、逆
転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、in situ
ハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウエスタンブロ
ットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学など
によって、決めることを含む。上記方法によれば、細胞
を患者から得、開示する生物マーカー、タンパク質のそ
れぞれのレベルまたはｍＲＮＡレベルを測定して、健常
な対象体におけるこれらのマーカーレベルと比較する。
生物マーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡレベルの異常
レベルは、おそらく結腸癌のような癌を示すものであ
る。
【０２６０】したがって、一態様では、本発明は、本明
細書中に開示する特有の核酸マーカーに特異的なプロー
ブおよびプライマーを提供する。したがって、核酸プロ
ーブは、配列番号１、３、５、または７の配列に実質的
に相補的な核酸にハイブリダイズするのに十分な配列番
号１、３、５、または７の核酸配列の領域を含む。プロ
ーブ／プライマーとしての使用に好ましい核酸分子はさ
らに、配列番号１、３、５、または７の配列とハイブリ
ダイズするのに十分な配列番号１、３、５、または７の
配列に実質的に相補的な核酸配列の領域を含むことがで
きる。さらに、プローブ／プライマーとして有用な核酸
配列は、少なくとも約８個のヌクレオチド長、少なくと
も約１２個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約
１５個のヌクレオチド、より好ましくは約２５個のヌク
レオチド、最も好ましくは少なくとも４０個のヌクレオ
チドから全部またはほぼ全部までの、マーカー核酸配列
（この核酸配列は、配列番号１、３、５、または７、あ
るいはそれらに相補的な配列によって表される）のコー
ド配列の一部に相補的であるコード配列のヌクレオチド
配列を含む。
【０２６１】一実施形態では、上記方法は、核酸プロー
ブを用いて、患者からの組織に癌性細胞の存在を確認す
ることを含む。具体的には、上記方法は、下記： 1. 配列番号１、３、５、または７、あるいはそれらに
相補的な配列によって表される核酸配列のコード配列の
一部に相補的であって、かつ、結腸癌細胞のような腫瘍
細胞において差次的に発現するコード配列の、少なくと
も約８個のヌクレオチド長、少なくとも約１２個のヌク
レオチド長、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオ
チド、より好ましくは約２５個のヌクレオチド、最も好
ましくは少なくとも４０個のヌクレオチドから全部また
はほぼ全部までのヌクレオチド配列を含む核酸プローブ
を提供することと、 ２．癌性細胞を潜在的に含む患者から組織試料を得るこ
とと、 ３．実質的にすべてが非癌性である細胞を含有する第２
の組織試料を提供することと、 ４．第１および第２の組織試料各々のＲＮＡと、ストリ
ンジェント条件下にて核酸プローブを接触させること
（すなわち、ノーザンブロットまたはｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションアッセイにおいて）と、 ５．（ａ）第１の組織試料のＲＮＡとのプローブのハイ
ブリダイゼーションの量を、（ｂ）第２の組織試料のＲ
ＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションの量を比較
することとを含み、ここで第１の組織試料のＲＮＡとの
ハイブリダイゼーションの量を第２の組織試料のＲＮＡ
とのハイブリダイゼーションの量と比較して、統計学的
に有意な差異があるとき、第１の組織試料中の癌性細胞
の存在を示す。
【０２６２】一態様では、上記方法は、配列番号１、
３、５、または７、あるいはそれらに相補的な配列によ
って表される所定のマーカー核酸配列から得られるプロ
ーブとの in situ ハイブリダイゼーションを含む。こ
の方法は、癌性、または前癌状態細胞、ならびに標準細
胞を潜在的に含有する所定の型の組織試料と、標識化ハ
イブリダイゼーションプローブを接触させることと、プ
ローブが、同じ組織型の他の細胞を標識する程度と有意
に異なる程度（例えば、少なくとも０．５倍分、少なく
とも２倍分、少なくとも５倍分、少なくとも２０倍分、
または少なくとも５０倍分）に所定の組織型のかなりの
数の細胞を標識するかどうかを確認することを含む。
【０２６３】所定のヒト組織からの試験細胞の表現型
が、例えば、細胞が（ａ）正常、あるいは（ｂ）癌性ま
たは前癌状態であるかどうかを確認する方法であって、
試験細胞のｍＲＮＡを、配列番号１、３、５、または
７、あるいはそれらに相補的な配列によって表される核
酸配列のコード配列の一部に相補的であり、かつ、所定
の組織型の正常細胞に比較して腫瘍細胞において差次的
に発現される配列の少なくとも約８個のヌクレオチド
長、好ましくは約１２個、好ましくは約１５個、好まし
くは約２５個、より好ましくは少なくとも４０個のヌク
レオチド長全部またはほぼ全部までの核酸プローブと接
触させること、およびｍＲＮＡへのプローブのハイブリ
ダイゼーションの概算量を測定することにより、その組
織型の正常細胞のｍＲＮＡに見られる量よりも多いか、
または少ないハイブリダイゼーションの量が、試験細胞
が癌性または前癌状態であることを示す方法もまた本発
明の範囲内である。
【０２６４】あるいは、上記診断アッセイは、マーカー
核酸配列（この核酸配列は、配列番号１、３、５、また
は７、あるいはそれらに相補的な配列により表される）
によりコードされるタンパク質産物を検出するための抗
体を用いて行うことができる。好ましくは、タンパク質
産物は、配列番号２、４、６、または８の配列の１つ以
上の配列を有するものである。したがって、一実施形態
では、アッセイは、試験細胞のタンパク質を、配列番号
１、３、５、または７、あるいはそれらに相補的な配列
により表される核酸の遺伝子産物に特異的な抗体と接触
させること、マーカー核酸配列は、試験細胞と同じ組織
型の正常細胞における所定の対照レベルにて発現される
ものであること、抗体および試験細胞のタンパク質によ
り免疫複合体形成の概算量を測定することを含み、ここ
で試験細胞のタンパク質と形成された免疫複合体の量
が、同じ組織型の正常細胞に比較して統計学的に有意な
差異があるとき、試験細胞が癌性または前癌状態である
ことを示す。
【０２６５】別のかかる方法は、配列番号１，３，５、
または７、あるいはそれらに相補的な配列により表され
るマーカー核酸配列の遺伝子産物に特異的な抗体を提供
する工程、この遺伝子産物は、同じ組織型の非癌性組織
における遺伝子産物レベルよりも多いまたは少ないレベ
ルで、所定の組織型（例えば、結腸組織）の癌性組織に
存在する；所定の組織型の組織の第１の試料を患者から
得る工程、試料は癌性細胞を含む可能性がある；同じ組
織型（それは、同じ患者由来または正常対照、（例えば
別の個体または培養細胞）由来であってもよい）の組織
の第２の試料を得る工程、この第２の試料は、正常細胞
を含有し、本質的に癌性細胞を含有しない；試料中に存
在する抗体およびマーカー核酸配列産物間で免疫複合体
形成を可能にする条件下にて、第１および第２の試料の
タンパク質（これは、溶解されているが分画されていな
い細胞にて、あるいはその場で部分的に精製されてもよ
い）と、抗体を接触させる工程；及び（ａ）第１の試料
中での免疫複合体の量を、（ｂ）第２の試料中での免疫
複合体の量と比較する工程とを含み、ここで第１の試料
における免疫複合体の量が第２の試料における免疫複合
体形成の量と比較して少ないことが、統計学的に有意に
差異あるとき、組織の第１の試料における癌性細胞の存
在を示す。
【０２６６】本発明はさらに、被験体から得られる細胞
試料が、異常量のマーカーポリペプチドを有するかどう
かを確定する方法であって、（ａ）被験体から細胞試料
を得ることと、（ｂ）そのようにして得られた試料にお
けるマーカーペプチドの量を定量的に測定することと、
（ｃ）そのようにして測定したポリペプチドの量を、既
知の標準物質と比較して、それにより被験体から得られ
た細胞試料が、異常量のマーカーポリペプチドを有する
かどうかを確定することを含む方法を提供する。かかる
マーカーポリペプチドは、免疫組織化学アッセイ、ドッ
トブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出され得
る。
【０２６７】イムノアッセイは、細胞試料におけるタン
パク質レベルを定量化するのに一般的に用いられ、多く
の他のイムノアッセイ技法は当該技術にて既知である。
本発明は、特定のアッセイ手法に限定されず、したがっ
て同種および異種の方法の両方を含むものである。本発
明により実施され得る典型的なイムノアッセイとして
は、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノ
アッセイ（ＦＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）、免疫比朧アッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分、または標識基は、
被験体抗体に結合することができ、アッセイ装置および
適合性イムノアッセイ手法の利用可能性により多くの場
合指示される様々な使用方法の要求に適合するように選
択される。上述の様々なイムノアッセイを実施する際に
使用されるべき一般的技法は、当業者に既知である。
【０２６８】別の実施形態では、患者の生物学的液体
（例えば、血液または尿）中のコード産物、すなわち、
配列番号１、３、５、または７、あるいはそれらに相補
的な配列によりコードされる産物のレベルは、患者の細
胞におけるマーカー核酸配列の発現レベルをモニターす
る手段として測定することができる。かかる方法は、患
者から生物学的液体試料を採取する工程、この試料（ま
たは試料由来のタンパク質）をコードマーカーポリペプ
チドに特異的抗体と接触させる工程、抗体による免疫複
合体形成の量を測定する工程を含み、免疫複合体形成の
量は、試料中のマーカーコード産物レベルを示す。この
測定は、正常個体から得た対照試料または同じ個人から
予めもしくはその後に得られた１つ以上の試料における
同じ抗体による免疫複合体形成の量と比較するとき、特
に有益である。
【０２６９】別の実施形態では、上記方法を使用して、
細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を測定する
ことができる。マーカーポリペプチドの量は過剰増殖疾
患、例えば結腸癌の進行に相関する可能性がある。マー
カーポリペプチドレベルを予測的に使用して、細胞試料
が形質転換細胞であるか、または形質転換細胞になりや
すい傾向であるどうかを評価することができる。さら
に、本方法を使用して、形質転換されることが知られて
いる細胞の表現型を評価することができ、表現型決定の
結果は、特定の治療的処方計画を計画する際に有用であ
る。例えば、試料細胞中の非常に高レベルのマーカーポ
リペプチドは、結腸癌のような癌の強力な診断および予
後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察
は、例えばより強力な治療の使用に関する決断において
利用することができる。
【０２７０】上述のように、本発明の一態様は、患者か
ら単離される細胞に関して、マーカーポリペプチドレベ
ルが、試料細胞にて有意に低減されるかどうかを測定す
るための診断アッセイに関する。「有意に低減される」
という用語は、細胞が、類似組織源の正常細胞に比べ
て、マーカーポリペプチドの細胞量が低減している細胞
の表現型を指す。例えば、細胞は、正常対照細胞より
も、約５０％、２５％、１０％、または５％少ないマー
カーポリペプチドを有することがある。特に、アッセイ
では、試験細胞におけるマーカーポリペプチドレベルを
評価し、好ましくは少なくとも１つの対照細胞、例えば
正常細胞および／または既知の表現型を有する形質転換
細胞にて検出されるマーカーポリペプチドと、測定レベ
ルを比較する。
【０２７１】本発明に特に重要なのは、正常または異常
マーカーポリペプチドレベルに関連した細胞数により測
定されるように、マーカーポリペプチドレベルを定量化
する能力である。次に、特定マーカーポリペプチド表現
型を有する細胞の数は、患者の予後と関連するかもしれ
ない。本発明の一実施形態では、病巣のマーカーポリペ
プチド表現型は、異常的に高／低レベルのマーカーポリ
ペプチドを有することがわかっている生検材料における
細胞のパーセントとして測定される。かかる発現は、免
疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ等により検出される。
【０２７２】組織試料を用いる場合、免疫組織化学染色
を使用して、マーカーポリペプチド表現型を有する細胞
の数を測定することができる。かかる染色に関して、組
織の複数ブロックを、生検材料または他の組織試料から
取り出し、プロテアーゼＫまたはペプシンのような薬剤
を用いてタンパク質分解性加水分解に供する。ある実施
形態では、試料細胞から核分画を単離し、核分画におけ
るマーカーポリペプチドレベルを検出するのが望ましい
ことがある。
【０２７３】組織試料は、ホルマリン、グルタルアルデ
ヒド、メタノール等のような試薬を用いた処理により固
定する。次に、マーカーポリペプチドに結合特性を有す
る抗体、好ましくはモノクローナル抗体とともに試料を
インキュベートする。この抗体は、次の結合検出のため
の標識に結合される。免疫複合体形の形成に十分な時
間、試料をインキュベートする。次に、抗体の結合を、
この抗体に結合した標識によって検出する。抗体が標識
化されていない場合は、例えば、抗マーカーポリペプチ
ド抗体のアイソタイプに特異的な二次標識抗体を使用し
てもよい。使用することができる標識の例としては、放
射性核種、蛍光物質、化学発光物質、酵素等が挙げられ
る。
【０２７４】酵素を用いる場合、酵素基質を試料に添加
して、着色または蛍光生成物を用意することができる。
結合体に使用するために適した酵素の例としては、ホー
スラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。市販
されていない場合、かかる抗体−酵素結合体は、当業者
に既知の技法により容易に作ることができる。
【０２７５】一実施形態では、アッセイは、ドットブロ
ットアッセイとして実施される。ドットブロットアッセ
イは、単一細胞に関連したマーカーポリペプチドの平均
量を、既定の細胞数から生じる無細胞抽出物におけるマ
ーカーポリペプチドの量と相関させることにより測定が
可能になるので、組織試料が用いられる場合に特有の用
途が見出される。
【０２７６】同じ型の腫瘍細胞（例えば、胸部および／
または結腸腫瘍細胞）は、別個の癌遺伝子の均一に増加
した発現、または別個の腫瘍サプレッサー遺伝子の均一
に減少した発現を示さないことがあることは、癌文献に
て十分に確立されている。また、所定の型の癌細胞間で
さえも所定のマーカー遺伝子の発現レベルは変化がある
場合があり、単一試験よりむしろ一連の試験における信
頼の必要性がさらに重要視される。したがって、一態様
では、本発明は、診断試験の信頼性および／または精度
を改善するために、多数の本発明のプローブを利用する
一連の試験を提供する。
【０２７７】一実施形態では、本発明はまた、核酸プロ
ーブを組織化アレイにおけるＤＮＡチップ上に固定する
方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィ
を含む様々なプロセスにより固体支持体に結合すること
ができる。例えば、チップは、最大２５０，０００個の
オリゴヌクレオチドを保持することができる(GeneChip,
Affymetrix)。これらの核酸プローブは、配列番号１、
３、５、または７により表されるマーカー核酸配列のコ
ード配列の一部に相補的であり、かつ、結腸癌細胞のよ
うな腫瘍細胞において差次的に発現される配列の少なく
とも約８個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約
１２個長、好ましくは少なくとも約１５個長のヌクレオ
チド、より好ましくは少なくとも約２５個長のヌクレオ
チド、最も好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチ
ド長から、全部またはほぼ全部までのヌクレオチド配列
を含む。本発明は、単一チップ上に核酸マーカーのアレ
イを提供することにより、試験の信頼性が高まるので、
結腸癌のような様々な癌に関して利用可能な試験に著し
く有利になる。
【０２７８】上記方法は、生検材料を得ることを含み、
それは低温切片作製して、全細胞集団の約８０％に腫瘍
細胞を高めることにより任意に分取する。次に、ＤＮＡ
またはＲＮＡを抽出し、増幅して、ＤＮＡチップを用い
て分析し、マーカー核酸配列の存在または非存在を確認
する。
【０２７９】一実施形態では、核酸プローブは、二次元
マトリックスまたはアレイにおいて基材上にスポットす
ることができる。核酸試料を標識化し、続いてプローブ
にハイブリダイズすることができる。プローブ核酸に結
合された標識試料核酸を含む二本鎖核酸は、試料の未結
合部分を洗い落とせば、検出することができる。
【０２８０】プローブ核酸は、ガラス、ニトロセルロー
ス等を含む基材上にスポットされ得る。プローブは、共
有結合、または疎水性相互作用のような非特異的相互作
用により基材に結合され得る。試料核酸は、放射性標
識、フルオロフォア、発色団等を用いて標識化され得
る。
【０２８１】アレイを構築するための技法およびこれら
のアレイを使用する方法が、欧州特許第０７９９８９７
号、ＰＣＴ国際公開第９７／２９２１２号、ＰＣＴ国際
公開第９７１２７３１７号、欧州特許第０７８５２８０
号、ＰＣＴ国際公開９７／０２３５７号、米国特許第
５，５９３，８３９号、米国特許第５，５７８，８３２
号、欧州特許第０７２８５２０号、米国特許第５，５９
９，６９５号、欧州特許第０７２１０１６号、米国特許
第５，５５６，７５２号、ＰＣＴ国際公開第９５／２２
０５８号、および米国特許第５，６３１，７３４号に記
載されている。
【０２８２】さらに、アレイは、遺伝子の差次的発現を
検査するために使用することができ、また遺伝子機能を
測定するために使用することができる。例えば、核酸配
列のいずれかが、正常細胞および癌細胞間にて差次的に
発現されれば，本核酸配列のアレイを用いて測定するこ
とができる。癌細胞における特定のメッセージの高発現
によって、それは対応する正常細胞においては観察され
ないものであり、癌特異的タンパク質の存在を示すこと
ができる。
【０２８３】さらに別の実施形態では、本発明は、その
ポリペプチドが配列番号２、４、６、または８である本
発明のマーカーポリペプチドに対して生成する抗体パネ
ルを用いることを意図している。かかる抗体パネルは、
結腸癌に対する信頼できる診断プローブとして使用する
ことができる。本発明のアッセイは、細胞（例えば、結
腸細胞）を含有する生検材料試料を、１つまたはそれ以
上のコード産物に対する抗体のパネルと接触させて、マ
ーカーペプチドの存在または非存在を確認することを含
む。
【０２８４】本発明の診断方法はまた、治療に対する追
跡処理としてとして使用することができる。例えば、マ
ーカーポリペプチドレベルを定量することにより、現在
のまたはこれまでに用いた癌治療の有効性、ならびに患
者の予後におけるこれらの治療の効果を示し得る。
【０２８５】したがって、本発明は、例えば細胞の腫瘍
原性形質転換から生じる増殖性疾患の診断および表現型
決定の助けとなるために、マーカーペプチドの獲得およ
び／または損失を検出するために利用可能な診断アッセ
イおよび試薬を作製する。
【０２８６】上述の診断アッセイは、同様に予後アッセ
イとして用いるのに適合するようにすることができる。
かかる適用は、腫瘍に進行における特徴的病期に起こる
事象に対する本発明のアッセイの感受性を利用する。所
定のマーカー遺伝子は、非常に早期の病期に、例えば、
ことによると細胞が悪性に不可逆的に発達する前に、ア
ップレギュレートまたはダウンレギュレートされてもよ
く、一方で別のマーカー遺伝子は、もっと後期の病期に
てのみ特徴的に、アップレギュレートまたはダウンレギ
ュレートされてもよい。かかる方法は、試験細胞のｍＲ
ＮＡを、腫瘍進行の異なる段階での癌性細胞または前癌
状態細胞における異なる特徴的レベルにて発現される所
定のマーカー核酸から得られる核酸プローブと接触させ
る工程と、細胞のｍＲＭＡへのプローブのハイブリダイ
ゼーションの概算量を測定する工程を含み、かかる量
が、細胞における遺伝子発現レベルを示し、したがっ
て、細胞の腫瘍進行の病期を示す。または、このアッセ
イは、所定のマーカー核酸の遺伝子産物に特異的な抗体
を用いて行い、試験細胞のタンパク質と接触させる。一
連のかかる試験は、腫瘍の存在および位置を開示するだ
けでなく、臨床医が腫瘍の最適な治療様式を選択し、そ
の治療の成功の見込みを予想することを可能にするであ
ろう。
【０２８７】本発明の方法はまた、腫瘍の臨床経過を追
跡するのに使用することができる。例えば、本発明のア
ッセイは、患者からの組織試料に適用することができ
る。すなわち、患者の癌治療の後に、別の組織試料を取
り出し、試験を繰り返す。治療が成功した場合、癌性ま
たは前癌性細胞の特徴的な差次的発現を示すすべての細
胞を除去することになるか、または、これら細胞におけ
る遺伝子の発現の実質的な増加、おそらく正常レベルに
近づくか、もしくは正常レベルを上回る、をもたらす結
果となるであろう。
【０２８８】さらに別の実施形態では、本発明は、患者
が、配列番号２、４，６、または８のポリペプチドのい
ずれか１つの異常活性に関連した疾患、例えば癌（例え
ば、結腸癌）を発達させる傾向のあるような疾患を発症
する危険性があるかどうかを確認する方法を提供し、こ
こでポリペプチドの異常活性は、（ｉ）マーカーポリペ
プチドをコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす改
変、または（ｉｉ）コード核酸の異所性発現(misexpres
sion)の少なくとも１つを特徴とする遺伝的損傷の存在
または非存在を検出することを特徴とする。例えば、か
かる遺伝的損傷は、（ｉ）核酸配列からの１つ以上のヌ
クレオチドの欠失、(ii)核酸配列への１つ以上のヌクレ
オチドの付加、(iii)核酸配列の１つ以上のヌクレオチ
ドの置換、(iv)核酸配列の総染色体再配列、(v)核酸配
列のメッセンジャーＲＮＡ転写物レベルにおける総変
化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような、核
酸配列の異常修飾、(vii)遺伝子のメッセンジャーＲＮ
Ａ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(v
iii)マーカーポリペプチドの非野生型レベル、(ix)遺伝
子の対立遺伝子損失、および／または(x)マーカーポリ
ペプチドの不適切な翻訳後修飾の少なくとも１つの存在
を確かめることにより検出することができる。
【０２８９】本発明は、コード核酸配列における損傷を
検出するためのアッセイ技法を提供する。これらの方法
としては、配列分析、サザンブロットハイブリダイゼー
ション、制限酵素部位マッピングを含む方法、および分
析されるべき核酸およびプローブ間のヌクレオチド対形
成の非存在の検出を含む方法が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０２９０】特定疾患または障害（例えば、遺伝的疾患
または障害）は、特定の遺伝子の多型領域の特異的対立
遺伝子変異体が関与し、それは必ずしも突然変異タンパ
ク質をコードしない。したがって、被験体における遺伝
子の多型領域の特異的対立遺伝子変異体の存在は、その
被験体を特定疾患または障害を発症しやすくする。遺伝
子における多型領域は、個々の集団における遺伝子のヌ
クレオチド配列を決定することにより同定することがで
きる。多型領域が同定されると、個体の特定集団（例え
ば、結腸癌のような特定疾患を発症した個体）を研究す
ることにより、特定疾患との関連を確認することができ
る。多型領域は、遺伝のいかなる領域にも、例えばエキ
ソン（エキソンのコードまたは非コード領域）、イント
ロンおよびプロモーター領域に見出される。
【０２９１】典型的な実施形態では、遺伝子またはその
天然に存在する突然変異体のセンスもしくはアンチセン
ス配列、あるいはその対象遺伝子もしくはそれらの天然
に存在する突然変異体に本来関連する５’もしくは３’
フランキング配列またはイントロン配列に、ハイブリダ
イズすることが可能なヌクレオチド配列領域を含む核酸
プローブを含む核酸組成物を提供する。細胞の核酸は、
ハイブリダイゼーションしやすくされており、プローブ
を試料の核酸と接触させて、試料核酸へのプローブのハ
イブリダイゼーションを検出する。かかる技法は、欠
失、置換等を含むゲノムまたはｍＲＮＡレベルにおける
損傷または対立遺伝子変異体を検出するために、ならび
にｍＲＮＡ転写物レベルを測定するために使用すること
ができる。
【０２９２】好ましい検出方法は、突然変異または多型
部位に重複し、突然変異または多型領域の周囲にある約
５個、１０個、２０個、２５個、または３０個のヌクレ
オチドを有するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイ
ブリダイゼーションである。本発明の好ましい実施形態
では、対立遺伝子変異体に特異的にハイブリダイズする
ことが可能ないくつかのプローブを固相支持体、例え
ば、「チップ」に結合させる。オリゴヌクレオチドを含
むこれらのチップを用いた突然変異検出分析は、「ＤＮ
Ａプローブアレイ」とも称され、例えばCronin et al.
(1996) Human Mutation 7:244に記載されている。一実
施形態では、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型
領域の対立遺伝子変異体すべてを含む。次に、固相支持
体を試験核酸と接触させて、特異的プローブへのハイブ
リダイゼーションを検出する。したがって、１つ以上の
遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同一性は、簡単なハ
イブリダイゼーション実験にて同定することができる。
【０２９３】ある実施形態では、損傷の検出は、アンカ
ーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，
１９５号および第４，６８３，２０２号を参照）、ある
いはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegran
et al. (1988) Science 241:1077-1080、Nakazawa eta
l. (1994) PNAS 91:360-364（そのうちの後者は、遺伝
子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得
る(sec Abravaya et al. (1995) Nuc Acid Res23:675-6
82)）を参照）にて、プローブ／プライマーを利用する
ことを含む。単なる例証的実施形態では、上記方法は、
(i)患者から細胞試料を収集する工程と、(ii)試料細胞
から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）
を単離する工程と、(iii)核酸試料を、核酸が存在すれ
ば、核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる
ような条件下にて、核酸配列に特異的にハイブリダイズ
する１つ以上のプライマーと、接触させる工程と、(iv)
増幅産物の存在または非存在を検出、または増幅産物の
大きさを検出して対照試料と長さを比較する工程とを含
む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載す
る突然変異を検出するのに使用する技法のいずれかと合
わせて、予備増幅工程として使用することが望ましい場
合があることが予想される。
【０２９４】代替的増幅方法としては、自己持続性配列
複製(Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Aca
d. Sci USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh, D. Y. e
t al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-11
77)、Ｑ−βレプリカーゼ(Lizardi, P.M. et al., 198
8, Bio/Technology 6:1197)、または任意の他の核酸増
幅方法を含み、続いて当業者に周知の技法を用いて増幅
分子を検出する。これらの検出スキームは、かかる分子
の存在する数が非常に少ない場合に、核酸分子の検出に
特に有用である。
【０２９５】対象アッセイの好ましい実施形態では、試
料細胞からの遺伝子における突然変異またはその遺伝子
の対立遺伝子変異体は、制限酵素切断パターンににおけ
る改変により同定される。例えば、試料および対照ＤＮ
Ａを単離し、増幅し（任意に）、１つまたはそれ以上の
制限エンドヌクレアーゼで消化して、断片長の大きさ
を、ゲル電気泳動により測定する。さらに、配列特異的
リボザイムを使用して（例えば、米国特許第５，４９
８，５３１号を参照）、リボザイム切断部位の発達また
は損失による特異的突然変異の存在に関してスコア−す
ることができる。
【０２９６】本発明の別の態様は、異常増殖を特徴とす
る細胞の分化および増殖を調節することが可能な薬剤の
同定に関する。これに関しては、本発明は、マーカー核
酸（配列番号１、３、５、または７、あるいはそれらに
相補的な配列）の発現を調節し、および／またはコード
ポリペプチドの生物活性を改変する、例えば、コードポ
リペプチドの生物活性を抑制する、化合物を確定するた
めのアッセイを提供する。
【０２９７】いくつかのin vivoでの方法を用いて、マ
ーカー核酸（配列番号１、３、５、または７、あるいは
それらに相補的な配列）を調節し、および／またはコー
ドポリペプチドの生物活性を改変する、例えば、コード
ポリペプチドの生物活性を抑制する、化合物を同定する
ことができる。
【０２９８】薬剤スクリーニングは、細胞試料に試験化
合物を添加して、その効果をモニターすることにより行
う。試験化合物が入っていない対応試料もまた、対照と
してモニターする。次に、処理および未処理の細胞を、
限定するものではないが、顕微鏡分析、生存度試験、複
製能力、組織学的検査、細胞に関連した特定ＲＮＡまた
はポリペプチドレベル、細胞または細胞溶解産物により
発現される酵素活性レベル、および他の細胞または化合
物と相互作用する細胞の能力を含む、任意の適切な表現
型基準により、比較する。処理および未処理の細胞間の
差異は、試験化合物に起因する効果を示す。
【０２９９】試験化合物の所望の効果は、癌関連マーカ
ー核酸配列により与えられたあらゆる表現型における効
果を含む。例としては、過剰のｍＲＮＡを制限する試験
化合物、コードタンパク質の産生を制限する試験化合
物、またはタンパク質の機能的効果を制限する試験化合
物が挙げられる。試験化合物の効果は、処理および未処
理の細胞間の結果を比較する際に明らかであろう。
【０３００】したがって、本発明はまた、in vitroにて
核酸マーカー（配列番号１、３、５、または７、あるい
はそれらに相補的な配列）の発現を抑制する薬剤に関し
てスクリーニングする方法を包含し、この方法は、薬剤
がｍＲＮＡの産生を抑制することが可能であるかどうか
を確認するために、マーカー核酸ｍＲＮＡが培養細胞中
にて検出可能である細胞または組織を薬剤に曝露するこ
とと、曝露された細胞または組織におけるｍＲＮＡレベ
ルを測定することとを含み、ここで、細胞系の薬剤への
曝露後のｍＲＮＡレベルの減少が、マーカー核酸ｍＲＮ
Ａ産生の抑制を示す。
【０３０１】あるいは、スクリーニング方法は、マーカ
ータンパク質の産生を抑制すると推測される薬剤に対す
る、マーカータンパク質が培養細胞にて検出可能である
細胞または組織をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングす
ること、および細胞または組織におけるマーカータンパ
ク質レベルを測定することを含み、ここで、細胞または
組織の薬剤への曝露後のマーカータンパク質レベルの減
少が、マーカータンパク質産生の抑制を示す。
【０３０２】本発明はまた、マーカー核酸の発現を抑制
する薬剤に関するｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニング方
法を包含し、この方法は、マーカーｍＲＮＡまたはタン
パク質の産生を抑制すると推測される薬剤に、マーカー
ｍＲＮＡまたはタンパク質が検出可能である腫瘍細胞を
有する哺乳動物を曝露することと、曝露された哺乳動物
の腫瘍細胞におけるマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質
レベルを測定することを含む。哺乳動物の薬剤への曝露
後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの減少
は、マーカー核酸発現の抑制を示す。
【０３０３】したがって、本発明は、試験化合物ととも
に、マーカー核酸（配列番号１、３、５、または７、あ
るいはそれらに相補的な配列）を発現する細胞をインキ
ュベートすることと、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベル
を測定することとを含む方法を提供する。本発明はさら
に、細胞集団におけるマーカー核酸の発現レベルを定量
的に測定する方法、および薬剤が細胞集団におけるマー
カー核酸の発現レベルを増加または減少させることが可
能かどうかを確認する方法を提供する。薬剤が細胞集団
におけるマーカー核酸の発現レベルを増加または減少さ
せることが可能であるかどうかを確認する方法は、
（ａ）対照および薬剤処理細胞集団から細胞抽出物を調
製する工程、（ｂ）細胞抽出物からマーカーポリペプチ
ドを単離する工程、（ｃ）マーカーポリペプチドおよび
このポリペプチドに特異的な抗体間に形成される免疫複
合体の量を定量する（例えば、平行して）することを含
む。本発明のマーカーポリペプチドはまた、その生物活
性についてアッセイすることにより定量することができ
る。マーカー核酸発現の増加を誘発する薬剤は、対照細
胞にて形成される免疫複合体の量と比較して、試験細胞
にて形成される免疫複合体の量を増加させる能力により
同定することができる。同様に、マーカー核酸の発現を
減少させる薬剤は、対照細胞と比較して、処理細胞抽出
物にて形成される免疫複合体の量を減少させる能力によ
り同定することができる。
【０３０４】ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロットハイ
ブリダイゼーションより測定することができる。ｍＲＮ
Ａレベルはまた、ＰＣＲを含む方法により測定すること
ができる。高処理アッセイに使用することができるｍＲ
ＮＡを測定する他の感度の高い方法（例えば、ＤＥＬＦ
ＩＡ終末点検出を用いる方法、および定量方法）は、例
えば、Webb and Hurskainene (1996) Journal of Biomo
lecular Screeening 1:119に記載されている。マーカー
タンパク質レベルは、配列番号２、４、６、または８の
タンパク質産物を特異的に認識する抗体を用いて、免疫
沈降または免疫組織化学により測定することができる。
【０３０５】薬剤スクリーニングアッセイにおいて活性
であると同定される薬剤は、細胞増殖活性を阻止するの
能力に関して試験される候補物である。これらの薬剤
は、細胞、特に結腸細胞の異常増殖を含む障害を治療す
るのに有用であろう。
【０３０６】様々なアッセイ方式については十分であろ
うし、本開示を鑑みて、本明細書に特に記載しないもの
は、それでも当業者に理解されるであろう。例えば、ア
ッセイは、多くの異なる方式で創造することができ、無
細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解産物）
に基づくアッセイ、ならびに無傷細胞を利用する細胞に
基づいたアッセイを含む。
【０３０７】化合物および天然抽出物のライブラリーを
試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムでは、所
定期間中に調査する化合物数を最大にするために、高処
理アッセイが望ましい。精製もしくは半精製タンパク質
または溶解産物を用いて得られ得るような無細胞系にて
実施される本発明のアッセイは、それらが試験化合物に
より媒介される分子標的における変化の迅速な展開、お
よび比較的簡単な検出を可能にするように作られ、多く
の場合、「一次」スクリーニングとして好ましい。さら
に、試験化合物の細胞障害性および／または生物学的利
用能の影響は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系にて一般的に無視す
ることができ、それよりもむしろアッセイは、他のタン
パク質との結合親和性の変化、または分子標的の酵素特
性おける変化にて明らかになるような、分子標的に関す
る薬剤の効果に主として焦点が向けられる。
【０３０８】Ａ．マッピングおよび組織プロファイリン
グプローブにおけるプローブとしての核酸の使用 例えば、ヌクレオチド配列番号１、３、５、または７、
あるいはそれらに相補的な配列から選択される少なくと
も８個の連続ヌクレオチドを含む、上述に記載するポリ
ヌクレオチドプローブは、ヒト染色体の同定および転写
レベルの測定を含む様々な目的のために使用される。核
酸配列の好ましい領域に関する追加する開示は、添付の
表に見出される。
【０３０９】ヌクレオチドプローブは、例えば放射性標
識、蛍光標識、ビオチン化標識、または化学発光標識を
用いて標識され、選択した特定標識に適した周知の方法
により検出される。中期染色体の調製物に、ヌクレオチ
ドプローブがハイブリダイズするためのプロトコルもま
た当該技術にて周知である。ヌクレオチドプローブは、
プローブのヌクレオチド配列に相補的である染色体調製
物におけるヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ
するであろう。核酸に特異的にハイブリダイズするプロ
ーブは、他の非関連配列を提供された背景ハイブリダイ
ゼーションよりも少なくとも５倍、１０倍または２０倍
高い検出シグナルを提供する。
【０３１０】非限定的な例では、市販プログラムが、癌
のような疾患に一般的に関連する染色体の領域を同定す
るのに利用できる。本発明の核酸は、これらの領域をプ
ローブするのに使用することができる。例えば、プロフ
ィール検索により、核酸がキナーゼをコードする遺伝子
に対応すると同定されると、癌関連染色体領域に結合す
るその能力は、腫瘍細胞発達／成長の１つまたはそれ以
上の段階におけるキナーゼとしてのその役割を示唆する
であろう。いくつかの実験が、その役割を解明するのに
要されるであろうが、核酸は、癌診断または治療を進展
する潜在性を有する特定タンパク質を単離するための新
規物質を構成する。
【０３１１】ヌクレオチドプローブを、核酸に対応する
遺伝子の発現を検出するために用いる。例えば、ノーザ
ンブロットでは、ｍＲＮＡを電気泳動的に分離し、プロ
ーブと接触させる。プローブを、特定の大きさのｍＲＮ
Ａ種にハイブリダイズさせて検出する。ハイブリダイゼ
ーションの量を定量して、例えば特定条件下における発
現相対量を測定する。プローブはまた、ポリメラーゼ連
鎖反応による増幅産物を検出するために使用される。反
応産物は、プローブにハイブリダイズして、このハイブ
リッドを検出する。プローブは、発現を検出するための
細胞へのｉｎｓｉｔｕでのハイブリダイゼーション用に
使用される。プローブはまた、配列をハイブリダイズす
る診断検出用にｉｎ ｖｉｖｏにて使用することができ
る。プローブは典型的に、放射性同位体を用いて標識さ
れる。発色団、蛍光発色団および酵素のような他の型の
検出可能な標識を用いてもよい。
【０３１２】特定ｍＲＮＡの発現は、異なる細胞型にて
変わることができ、組織特異的であることができる。異
なる細胞型におけるｍＲＮＡレベルのこの変動は、組織
型を決定するために、核酸プローブアッセイとともに利
用することができる。例えば、配列番号１、３、５、も
しくは７核酸配列またはそれらに相補的な配列と実質的
に同一または相補的な核酸プローブを利用したＰＣＲ、
分岐ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロティング技法
は、標的ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡの存在または非存在
を確認することができる。
【０３１３】ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイの例は、ＰＣＴ国際公開公報第９２／０２５２６号
(Urdea et al.)、および米国特許第５，１２４，２４６
号（Urdea et al.） に記載されており、その両方が、
参照することにより本明細書に援用される。この参照
は、サンドイッチヌクレオチドハイブリハイブリダイゼ
ーションアッセイの例を記載する。
【０３１４】また、少量の標的核酸を検出するための別
の手段は、Mullis et al., Met/i.Enzymol. (1987) 15
5:355-350、米国特許第４，６８３，１９５号、および
米国特許第４，６８３，２０２号（それらのすべてが、
参照することにより本明細書に援用される）に記載され
るように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。２
つのプライマーポリヌクレオチドは、標的核酸とハイブ
リダイズして、反応を開始する(prime)するために使用
される。プライマーは、配列表のポリヌクレオチドに対
して３’および５’内の配列で構成されてもよい。ある
いは、プライマーがこれらのポリヌクレオチドに対して
３’および５’である場合、そのプライマーは、そのヌ
クレオチドまたは相補体にハイブリダイズする必要はな
い。熱安定性ポリメラーゼは、もとの標的核酸を鋳型と
して用いて、プライマーから標的核酸のコピーを創出す
る。大量の標的核酸がポリメラーゼにより生成された後
に、サザンブロットのような方法によりそれを検出す
る。サザンブロット法を用いる場合、標識プローブは、
配列表または相補体のポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするであろう。
【０３１５】さらに、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Samb
rook et al., 「Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual」 (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 19
89)に記載される伝統的なブロッティング技法により検
出することができる。ポリメラーゼ酵素を用いてｍＲＮ
Ａから生成されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、ゲル電気
泳動を用いて精製、分離することができる。次にゲル上
の核酸を、ニトロセルロースのような固体支持体にブロ
ットする。固体支持体を標識プローブに曝露し、続いて
洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブを除去す
る。次に、標識プローブを含有する二重鎖を検出する。
典型的に、プローブは、放射能で標識する。
【０３１６】マッピング 本発明の核酸は、対応する遺伝子が存在する染色体を同
定するために使用される。例えば、in situでのハイブ
リダイゼーション（ＩＳＨ）、または正常中期の広がり
におけるin situでのハイブリダイゼーションにて蛍光
（ＦＩＳＨ）を用いることにより、比較ゲノムハイブリ
ダイゼーションは、ＤＮＡ配列の相対的コピー数におけ
る変化の総ゲノム評価を可能にする。Schwartz and Sam
ad, Current Opinions in Biotechnology (1994) 8:70-
74、Kallioniemi et al., Seminars in Cancer Biology
(1993) 4:41-46、Valdes and Tagle, Methods in Mole
cular Biology (1997) 68:1, Boultwood, ed., Human P
ress, Totowa, NJを参照されたい。
【０３１７】ヒト中期染色体の調製物は、ヒト主要組織
または細胞系から、標準的細胞遺伝学的技法を用いて調
製される。配列番号１、３、５、または７、あるいはそ
れらに相補的な配列のヌクレオチド配列から選択され
る、少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含むヌクレ
オチドプローブを、対応する染色体を同定するために使
用する。ヌクレオチドプローブは、例えば放射性標識、
蛍光標識、ビオチン化標識または化学発光標識を用いて
標識され、選択した特定標識に適した周知の方法により
検出される。ヌクレオチドプローブが、中期染色体の調
製物にハイブリダイズするためのプロトコルもまた、当
該技術にて既知である。ヌクレオチドプローブは、プロ
ーブのヌクレオチド配列に相補的な染色体調製物中のヌ
クレオチド配列に特異的にハイブリダイズするであろ
う。標的遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ
は、非関連のコード配列を提供された背景ハイブリダイ
ゼーションよりも、少なくとも５倍、１０倍または２０
倍高い検出シグナルを提供する。
【０３１８】核酸配列は、例えば照射ハイブリッドまた
は染色体特異的ハイブリッドパネルを用いて、特定の染
色体にマッピングされる。Leach et al., Advances in
Genetics, (1995) 33: 63-99、Walter et al., Nature
Genetics (1994) 7:22-28、Walter and Goodfellow, Tr
ends in Genetics (1992) 9:352を参照されたい。照射
ハイブリッドマッピング用パネルは、Research Genetic
s, Inc., Huntsville,Alabama, USAから入手可能であ
る。様々なパネルを用いたマーカーのためのデータベー
スは、http:/F/shgc-www.stanford.eduおよび他のロケ
ーションにあるワールドワイドウェブにより入手可能で
ある。統計学的プログラムＲＨＭＡＰは、一方の程度を
もう一方に対する相対的見込みの尺度でもって、照射ハ
イブリダイゼーションからのデータに基づいたマップを
構築するために使用することができ、ＲＨＭＡＰは、ht
tp://www.sph.umich.edu/group/statgen/softwareにあ
るワールドワイドウェブにより入手可能である。
【０３１９】かかるマッピングは、既知の機能を有する
他の遺伝子への近似により、標的遺伝子の機能を同定す
る際に有用であり得る。特定症候群または疾患マップが
同じ染色体に位置する場合に、機能はまた、標的遺伝子
のものとされる。
【０３２０】組織プロファイリング 本発明の核酸を用いて、所定の試料が得られる組織型を
決定することができる。例えば、その発生器官もしくは
組織源に特定のマーカーの発現を同定することにより、
その器官または組織によって転移性病巣を同定する。核
酸が特定組織型においてのみ発現し、転移性病巣がその
核酸を発現することが見出される場合、病巣の発生源が
同定される。特定核酸の発現は、対応するｍＲＮＡまた
はタンパク質産物の検出によりアッセイされる。抗体染
色のような免疫学的方法は、特定タンパク質産物を検出
するのに使用される。ハイブリダイゼーション方法は、
限定するものではないが、in situハイブリダイゼーシ
ョンおよびノーザンブロッティングを含み、特定ｍＲＮ
Ａ種を検出するのに用いられ得る。
【０３２１】多型の使用 核酸は、遺伝子の対応領域がヒト集団における多型性で
ある場合には、法医学、遺伝分析、マッピングおよび診
断用途にて有用であろう。核酸の特定の多型は、容疑者
に由来する試料を同定するか、または試料が容疑者に由
来する可能性を除外するために使用することができる。
遺伝子における多型を検出する手段は、限定するもので
はないが、タンパク質多型変異体の電気泳動、制限酵素
切断に対する差次的感受性、および対立遺伝子特異的プ
ローブへのハイブリダイゼーションを含むあらゆる手段
が使用される。
【０３２２】Ｂ．抗体を産生するため核酸およびコード
ポリペプチドの使用 核酸、対応するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、または対応
する完全遺伝子の発現産物を調製して、実験用途、診断
用途および治療用途用の抗体を産生させるために使用す
る。対応する遺伝子が割り当てられていない核酸に関し
ては、このことは、対応する遺伝子を同定する補足的な
方法を提供する。核酸または関連ｃＤＮＡは、上述のよ
うに発現されて、抗体が調製される。これらの抗体は、
コードペプチド上にあるエピトープに特異的であり、細
胞もしくは組織調製物中、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの
発現系の無細胞抽出物中の対応する天然タンパク質を沈
殿させるか、またはそれに結合することができる。
【０３２３】抗体を産生するための免疫原は、本発明の
核酸によりコードされるポリペプチドをアジュバンドと
混合することにより調製される。あるいは、ポリペプチ
ドは、より大きな免疫原性タンパク質に対する融合タン
パク質として作製される。ポリペプチドはまた、キーホ
ールリンペットヘモシアニンのような他のより大きな免
疫原性タンパク質に共有結合される。免疫原は典型的
に、皮内的、皮下的、または筋肉内的に投与される。免
疫原は、ウサギ、ヒツジ、およびマウスのような実験動
物に投与して、抗体を生成させる。任意に、動物脾臓細
胞を単離して、ミエローマ細胞と融合させて、モノクロ
ーナル抗体を分泌するハイブリドーマを形成させる。か
かる方法は、当該技術にて既知である。当該技術にて既
知の別の方法によれば、核酸は、筋肉内注射によるよう
に直接投与され、ｉｎ ｖｉｖｏにて発現される。発現
タンパク質は、タンパク質の投与に匹敵する抗体の産生
を含む様々なタンパク質特異的免疫応答を生成する。
【０３２４】核酸コードタンパク質およびポリペプチド
に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体の
調製は、当該技術にて既知の標準的方法を用いて作製さ
れる。抗体は、配列番号２、４、６、または８のポリペ
プチドに存在するエピトープに特異的に結合する。典型
的に、少なくとも約６個、８個、１０個、または１２個
の連続アミノ酸がエピトープを形成するのに必要とす
る。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープ
は、より多くの、例えば少なくとも約１５個、２５個、
または５０個のアミノ酸を必要とすることがある。さら
に、核酸の短い配列は、既知のタンパク質との交差反応
性の潜在性のために、対応する新規タンパク質を同定す
るための抗体を産生するためのエピトープとしての使用
に不適切であり得る。しかしながら、抗体は、特に抗体
が既知のタンパク質と本発明の核酸によりコードされる
新規ポリペプチドの共通の構造的特徴を同定する場合に
は、他の目的のために、有用である。
【０３２５】ウェスタンブロット法または他の免疫化学
的アッセイにおいて使用される場合、ヒト核酸コードポ
リペプチドに特異的に結合する抗体は、他のタンパク質
を用いて提供される検出シグナルよりも、少なくとも約
５倍、１０倍、あるいは２０倍高い検出シグナルを提供
するはずである。むしろ、核酸Ｔコードポリペプチドを
特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイにおい
て、他のタンパク質を検出せず、溶液から核酸コードタ
ンパク質を免疫沈降させることができる。
【０３２６】ヒト集団における核酸コードポリペプチド
に対する血清抗体の存在について試験するために、当該
技術で既知の方法によって、ヒト抗体の精製を行う。好
ましくは、抗体は、核酸コードタンパク質、ポリペプチ
ド、または融合タンパク質が結合するカラムに抗血清を
通すことにより、親和性を利用して精製される。その
後、結合した抗体は、例えば高塩濃度の緩衝液を用い
て、カラムから溶出させることができる。
【０３２７】上述した抗体に加えて、一本鎖抗体などの
遺伝子操作して抗体誘導体が作製される。
【０３２８】抗体は、当該技術で既知の標準プロトコル
を用いて作製することができる（例えば、Antibodies:A
Laboratory Manual ed.by Harlow and Lane(Cold Spri
ng Harbor Press:1988)を参照）。マウス、ハムスタ
ー、またはウサギなどの哺乳動物は、ペプチドの免疫原
性形態（例えば、抗体応答を誘発することが可能な哺乳
動物ポリペプチドまたは抗原断片、あるいは上記のよう
な融合タンパク質）を用いて免疫化することができる。
【０３２９】一態様では、本発明は、対象ポリペプチド
が、結腸直腸組織または腫瘍組織、特に、結腸癌組織ま
たは結腸癌由来細胞系において、高度に発現されること
を示すモノクローナル抗体を含む。従って、一実施形態
において、本発明は、特に結腸癌診断材料として、一般
の対象ポリペプチドの発現の分析のための診断ツールを
提供する。
【０３３０】タンパク質またはペプチドに対する免疫原
性を与える技法は、キャリアへの結合または当該技術で
既知の他の技法を包括する。タンパク質の免疫原性部分
は、アジュバントの存在下にて、投与することができ
る。免疫化の進行は、血漿または血清における抗体力価
の検出によってモニターすることができる。標準ＥＬＩ
ＳＡ法または他のイムノアッセイは、抗体のレベルを評
価するために、抗原としての免疫原とともに使用するこ
とができる。好ましい実施形態において、対象抗体は、
哺乳動物のタンパク質の抗原決定基、例えば、配列番号
２、４、６、または８、あるいは密接に関連した相同体
（例えば、少なくとも９０％同一、より好ましくは少な
くとも９５％同一）のタンパク質の抗原決定基に免疫特
異的である。
【０３３１】ポリペプチドの抗原調製物を用いた動物の
免疫化に続いて、抗血清を得ることができる、および所
望する場合には、血清から分離されたポリクローナル抗
体を得ることができる。モノクローナル抗体を産生する
ために、抗体産生細胞（リンパ球）を、免疫化された動
物から収集し、ミエローマ細胞などの不死化細胞と、標
準体細胞融合手法により融合して、ハイブリドーマ細胞
を得ることができる。このような技法は、当該技術にお
いて既知であり、例えばハイブリドーマ技法（もとをた
どれば、Kohle and Milstein, (1975) Nature, 256: 49
5-497により開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
技法（Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4:7
2）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するための
ＥＢＶハイブリドーマ技法(Cole et al., (1985) Monoc
lonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc. pp.77-96)が挙げられる。ハイブリドーマ細胞
は、本発明のポリペプチド、およびかかるハイブリドー
マ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体
と特異的に反応性を有する抗体を生産するために免疫化
学的にスクリーニングされ得る。
【０３３２】本明細書において使用される「抗体」とい
う用語は、その断片が対象ポリペプチドの１つと特異的
な反応性を有する断片も包括することを意図するもので
ある。抗体を、従来の技術を使用して断片化することが
でき、その断片は、全抗体に関する上記の方法と同じ方
法にて、利用するためにスクリーニングすることができ
る。例えば、Ｆ（ａｂ）2断片は、抗体をペプシンで処
理することにより生成することができる。得られたＦ
（ａｂ）2断片は、ジスルフィド架橋を減らす処理をし
て、Ｆａｂ断片を産生することができる。本発明の抗体
はさらに、抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域によって
与えられるポリペプチドに対して親和性を有する二重特
異性(bispecific)、一本鎖、ならびにキメラ分子および
ヒト化分子をも包含することを意図するものである。好
ましい実施形態では、抗体（複数可）は、さらにそれ自
体に結合し、検出され得る標識（例えば、標識は放射性
同位体、蛍光性化合物、化学発光性化合物、酵素、また
は酵素補因子であり得る）を含む。
【０３３３】抗体は、例えば、被験者が異常タンパク質
レベルに関連する、結腸癌のような疾患または状態を有
しているかどうか確定すること、あるいは、そのような
障害を患っている個体のための所定の治療法の有効性の
決めることを可能とすることを目的として、個体におけ
るタンパク質レベルをモニターするために使用すること
ができる。ポリペプチドのレベルは、血液試料のような
体液中の細胞から測定することができる。
【０３３４】本発明の抗体の他の応用は、ｇｔ１１、ｇ
ｔ１８−２３、ＺＡＰ、およびＯＲＦ８のような発現ベ
クター中に構築されるｃＤＮＡライブラリーの免疫学的
スクリーニングにある。この型のメッセンジャーライブ
ラリーは、正しいリーディングフレームおよび配向にて
挿入されたコード配列を有し、融合タンパク質を産生す
うｒことができる。例えば、ｇｔｌ１は、アミノ末端が
β−ガラクトシダーゼアミノ酸配列から構成され、カル
ボキシル末端が外来ペプチドから構成される融合タンパ
ク質を産生するであろう。タンパク質の抗原エピトー
プ、例えば、特定のタンパク質の他のオルソログ（orth
olog）または同一種由来の他のパラログ（paralog）
は、例えば抗体と、感染プレートから引き上げられたニ
トロセルロースフィルターを反応させるように、抗体を
用いて検出できる。次に、このアッセイにより検出され
る陽性のファージを、感染プレートから単離することが
できる。したがって、相同体の存在は、ヒトからのアイ
ソフォーム（スプライシング変異体を含む）を交替させ
得るように、他の動物から検出され、クローニングする
ことができる。
【０３３５】別の実施形態において、モノクローナル抗
体のパネルを使用してもよく、各エピトープの関与する
機能は、モノクローナル抗体によって表される。パネル
におけるモノクローナル抗体の結合の損失または撹乱
は、タンパク質、したがって対応する遺伝子の突然変異
的注目を示すであろう。
【０３３６】Ｃ．差次的発現 本発明はまた、ヒトにおける異常または患部組織を同定
するための方法を提供する。上記のようなタンパク質フ
ァミリーのプロフィールに対応する核酸に関して、組織
の選択は、推定される生物学的機能により左右され得
る。特定の核酸に対応する遺伝子の発現は、疾患の疑い
のある第１の組織とヒトの正常組織である第２の組織と
の間で比較される。正常組織は、ヒトのあらゆる組織、
特に脳、胸腺、精巣、心臓、前立腺、胎盤、脾臓、小
腸、骨格筋、膵臓、および結腸の粘膜内層を含むが、そ
れらに限定されない、標的遺伝子を発現する組織であ
る。
【０３３７】異常または罹患の疑いのある組織は、ヒト
の種々な組織型から得ることができるが、好ましくは、
同じ組織型から得られる。例えば、腸ポリープまたは他
の異常成長は、正常な腸組織と比較されるべきである。
２つの組織間の標的遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク
質の差異、例えば、分子量、アミノ酸またはヌクレオチ
ド配列、あるいは相対存在量の差異は、罹患の疑いのあ
るヒトの組織における比較される遺伝子、またはそれを
調節する遺伝子における変化を示す。
【０３３８】２つの組織における標的遺伝子は、当該技
術で既知のあらゆる方法によって比較される。例えば、
２つの遺伝子が配列決定され、罹患の疑いのある組織に
おける遺伝子の配列が、正常組織の遺伝子配列と比較さ
れる。２つの組織における、標的組織、またはその一部
は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、配列表に
示すヌクレオチド配列に基づくヌクレオチドプライマー
を用いて増幅される。増幅遺伝子またはその一部は、配
列番号１、３、５、または７に示される対応するヌクレ
オチド配列から選択されるヌクレオチドプローブにハイ
ブリダイズする。正常ヌクレオチドと比較した罹患の疑
いのある組織における標的組織のヌクレオチド配列の差
異は、疾患における核酸コードタンパク質の役割を示唆
し、治療薬の調製の指標を提供する。
【０３３９】ヌクレオチドプローブは、様々な方法、例
えば、放射性標識、ビオチン化、蛍光による標識、また
は化学発光タグにより標識され、当該技術で既知の標準
的な方法にて検出される。
【０３４０】あるいは、２つの組織における標的ｍＲＮ
Ａも比較する。ポリＡ+ＲＮＡは、２つの組織から 当
該技術で知られているように、単離される。例えば、当
業者は、ノーザンブロットおよび配列表に示すヌクレオ
チド配列から選択されるヌクレオチドプローブを用い
て、２つの組織間の標的ｍＲＮＡ転写物の大きさまたは
量の差異を容易に測定できる。正常細胞における同じ標
的ｍＲＮＡの発現と比較して、罹患の疑いのある組織試
料における標的ｍＲＮＡの発現の増加または減少は、発
現タンパク質が疾患の一因であり、また、治療薬の調製
の指標を提供することを示唆する。
【０３４１】タンパク質を分析するあらゆる方法が、似
かよった試料からの２つの核酸コードタンパク質を比較
するために使用される。２つの組織におけるタンパク質
の大きさは、例えば、２つの組織からのタンパク質抽出
物のウエスタンブロットにおいて核酸コードタンパク質
を検出する本発明の抗体を用いて比較される。発現レベ
ルや組織成分(subcellular)局在化のような他の変化も
また、対応するタンパク質への抗体を用いて、免疫学的
に検出することができる。正常組織における同じ核酸コ
ードタンパク質の発現レベルと比較して、罹患の疑いの
ある組織における核酸コードタンパク質の発現の高いま
たは低いレベルは、発現タンパク質が疾患の一因である
ことを示し、治療薬の調製の別の指標を提供する。。
【０３４２】同様に、罹患の疑いのあるヒト細胞および
ヒト正常組織との間の、遺伝子配列または遺伝子発現産
物、（例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク質）の比較は、
ヒトにおける疾患の進行または寛解を追跡するために用
いられる。
【０３４３】例えば、腫瘍の疑いのある組織における標
的遺伝子の発現の増加または減少は、組織における腫瘍
細胞の存在を示し得る。正常組織における遺伝子の発現
に対する腫瘍組織における標的遺伝子の発現の増加の度
合、または時間の経過においての腫瘍組織における標的
遺伝子の発現の増加量の差異は、当該組織における腫瘍
の進行を評価するために、または時間の経過における治
療プロトコルに対する腫瘍組織の応答をモニターするた
めに用いられる。
【０３４４】任意の２つの細胞型（例えば、低および高
転移腫瘍細胞系、または、治療薬に曝露された、および
曝露されていない組織由来の細胞）の発現パターンを比
較することができる。ヒトにおける疾患の遺伝的な素因
は、胎児組織における標的遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタ
ンパク質を、正常な標的遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタン
パク質と比較することにより検出される。この用途のた
めに用いられる胎児組織は、羊水、絨毛膜絨毛、血液、
およびｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚の割球が挙げられるが、
それらに限定されない。比較可能な正常標的遺伝子は、
任意の組織から得られる。ｍＲＮＡまたはタンパク質
は、標的遺伝子が発現されるヒトの正常組織から得られ
る。胎児の標的遺伝子またはｍＲＮＡのヌクレオチド配
列または大きさの変化のような、あるいは胎児の標的タ
ンパク質の分子量、アミノ酸配列、または相対的存在量
の変化のような差異は、胎児の標的細胞における生殖細
胞系列突然変異を示すことができ、それは疾患に対する
遺伝的素因を示す。
【０３４５】Ｄ. ペプチド類縁体およびアンタゴニス
トに関してスクリーニングするための核酸、およびコー
ドポリペプチドの使用 配列番号２、４、６、または８のポリペプチド、または
本発明の核酸、例えば、配列番号１、３、５、または
７、あるいはそれらに相補的な配列、および対応する完
全長遺伝子によってコードされるポリペプチドを用い
て、該コードポリペプチドの中から、結合パートナー、
例えば受容体などを同定するためのペプチドライブラリ
ーをスクリーニングすることができる。
【０３４６】ペプチドのライブラリーは、米国特許第
５，０１０，１７５号、およびPCT国際公開第９１／１
７８２３号に開示されている方法に従って合成すること
ができる以下に要約すると、ペプチド混合物を調製し、
それをスクリーニングして、次に、所望のシグナル伝達
および受容体結合活性を示すペプチドを同定する。上記
第５，０１０，１７５号の方法においては、適切なペプ
チド合成の支持体（例えば、樹脂）に、適切に保護され
た活性アミノ酸の混合物が結合される。反応混合液中の
各アミノ酸の濃度は、生成物が、開始時点の樹脂に結合
したアミノ酸の等モル混合物であるように、平衡化して
いるか、またはカップリング反応速度に反比例して調節
される。次に、結合したアミノ酸は脱保護され、別の平
衡化しているアミノ酸混合液と反応し、すべての考えら
れるジペプチドの等モル混合液を形成する。この過程
は、所望の長さ（例えば、六量体）のペプチド混合物が
形成されるまで繰り返される。各過程において、すべて
のアミノ酸が含まれる必要はないことに留意されたい。
つまり、いくつかの工程では、１つまたは２つのアミノ
酸のみ含むものであってよく（例えば、ある特定のアミ
ノ酸は、与えられた位置に必要不可欠であることが知ら
れている）、したがって混合物の複雑さが減少される。
ペプチドライブラリーの合成が終了した後、ペプチド混
合物を、選択されたポリペプチドへの結合についてスク
リーニングする。その後、ペプチドは、活性を抑制また
は増強する能力について試験され、続いて、所望の活性
を示すペプチドを分離し、配列決定が行われる。
【０３４７】ＰＣＴ国際公開第９１／１７８２３号に記
載されている方法は似ている。しかしながら、合成樹脂
を活性アミノ酸の混合物と反応させる代わりに、樹脂を
２０の等しい部分に（または、その工程に添加される種
々のアミノ酸の数に対応する部分数に）分け、各アミノ
酸を別個にその樹脂の部分に結合させる。その後、樹脂
の部分を合わせて混合し、再び第２のアミノ酸と反応さ
せる等しい部分数に分けられる。この方法において、各
反応は、容易に行われ完了する。さらに、各工程におけ
るすべての樹脂を合わせるよりもむしろ、平行して部分
を処理することによって、個々の「サブプール」を維持
することができる。こうすることにより、どのペプチド
が、観察されるどの受容体結合またはシグナル伝達活性
に応答するかを決定する過程が簡素化される。
【０３４８】このような場合、例えば、１〜２，０００
の候補を含むサブプールはそれぞれ、本発明の１つ以上
のポリペプチドに曝露される。次に、陽性の結果を生じ
る各サブプール、例えば２０〜１００の候補を含むより
小さなサブプール（サブサブプール）群として再合成
し、再アッセイする。陽性サブサブプールを、別個の化
合物として再合成して、アッセイして高結合定数を示す
ペプチドを最終的に決定することができる。これらのペ
プチドについて、自然活性を抑制または増強する能力に
ついて試験することができる。ＰＣＴ国際公開第９１／
７８２３号、および米国特許第５，１９４，３９２号
（参照することにより本明細書に援用される）に記載さ
れる方法は、すべての合成および再合成が数日単位で行
われ得るように、自動化技法によって平行してこのよう
なプールおよびサブプールの調製を可能としている。
【０３４９】ペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト
は、あらゆる利用可能な方法、例えばシグナル伝達、抗
体結合、受容体結合、分裂促進アッセイ、走化性アッセ
イ等を用いてスクリーニングすることができる。本明細
書に記載される方法が、現時点で好ましい。アッセイ条
件は、理想的には、自然活性がin vivo現れる条件、す
なわち生理的ｐＨ、温度、およびイオン強度に類似させ
るべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニスト
は、被験体に毒性副作用を引き起こさない濃度で、自然
活性の強力な抑制または増強を示すであろう。天然のポ
リペプチドへの結合を競うアゴニストまたはアンタゴニ
ストは、自然の濃度と等しいか、それより高い濃度を必
要とすることがあるが、一方、ポリペプチドに不可逆的
に結合することが可能な抑制剤は、自然濃度付近の濃度
で添加することができる。
【０３５０】このようなスクリーニングおよび実験の最
終的な結果としては、本発明の核酸によってコードされ
る受容体のような少なくとも１つの新規ポリペプチド結
合パートナー、およびこの新規結合パートナーの少なく
とも１つのペプチドアゴニストまたはアンタゴニストが
あろう。かかるアゴニストまたはアンタゴニストは、受
容体が自然のままの細胞、または遺伝子操作の結果、得
られた受容体を有する細胞において、受容体機能を調
節、増強、または抑制するために使用することができ
る。さらに、新規受容体が生物学的に重要な特質を既知
の受容体と共有する場合、アゴニスト／アンタゴニスト
結合に関する情報は、既知の受容体のアゴニスト／アン
タゴニストの改良開発に役立てることができる。
【０３５１】Ｅ． 薬学的組成物および治療的使用 薬学的組成物は、特許請求した本発明のポリペプチド、
抗体、またはポリヌクレオチドが含むことができる。薬
学的組成物は、治療的に有効量の、特許請求した本発明
のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドを含む
であろう。
【０３５２】本明細書中において使用されている「治療
的に有効な量」という用語は、目的とする疾患または状
態を治療、回復、または予防するための、または検出可
能な治療または予防効果を示すための治療薬の量をい
う。効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原レベルに
よって検出することができる。治療効果には、体温の低
下のような身体的な症状における低減も含まれる。対象
体に対する的確な有効量は、被験体の大きさおよび健康
状態、病状の性質および程度、および投与のために選択
される治療法または治療法の組合せによる。従って、前
もって正確な有効な量を特定することは無意味である。
しかしながら、所定の状況における有効量は、ルーチン
な実験によって決定することができ、臨床医の判断に委
ねられる。
【０３５３】本発明の目的のために、有効投与量は、投
与される個体に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋ
ｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮ
Ａ構築物であろう。
【０３５４】薬学的組成物はまた、薬学的に許容される
キャリアを含有することができる。「薬学的に許容され
るキャリア」という用語は、抗体またはポリペプチド、
遺伝子のような治療薬、および他の治療薬を投与するた
めのキャリアを指す。この用語は、組成物を受容する個
体に有害な抗体の産生をそれ自身が誘発せず、不都合な
毒性を伴わず投与できるあらゆる薬学的キャリアを指
す。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、
ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合
体、および不活性ウイルス粒子のような、大きく、ゆっ
くり代謝される高分子であってもよい。このようなキャ
リアは、当該業者において既知である。
【０３５５】薬学的に許容されるな塩、例えば、塩酸
塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような鉱酸
塩、および、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安
息香酸塩等の有機酸塩を、本発明において使用すること
ができる。薬学的に許容される賦形剤に関する詳細な議
論は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mark Pu
b.Co., N.J. 1991)が役に立つ。
【０３５６】治療用組成物における薬学的に許容される
キャリアには、水、生理食塩水、グリセロールおよびエ
タノールのような液体が含まれる。さらに、湿潤剤また
は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等のような助剤物質を、このよ
うな媒体中に存在させることができる。典型的には、治
療用組成物は、液体溶液または懸濁液として注射可能物
質として調製される、また注射前の液体媒体中に溶液ま
たは懸濁液に適した固体形態として調製される。リポソ
ームは薬学的に許容されるキャリアの定義の範囲に包括
される。
【０３５７】送達方法 処方された後、本発明の核酸組成物は、（１）被験体に
直接投与されるか、（２）ex vivoで被験体由来の細胞
に送達されるか、（３）組換えタンパク質の発現のため
にin vitroで送達され得る。
【０３５８】組成物の直接的な送達は、一般的には皮
下、腹腔内、静脈内または筋肉内への注入により達成さ
れるか、または組織の間質へ送達されるであろう。組成
物はまた、腫瘍または病巣に投与され得る。他の投与の
様式として、経口および肺投与、坐薬、および経皮適
用、針、および遺伝子銃または皮下噴射器が挙げられ
る。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは複数用量
スケジュールであり得る。
【０３５９】ex vivo送達および形質転換細胞の被験体
への再移植のための方法は、当該技術において既知であ
り、例えば、国際公開公報第９３／１４７７８号に記載
されている。ex vivo適用において有用な細胞の例とし
て、例えば、幹細胞（特に造血幹細胞）、リンパ細胞、
マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられ
る。
【０３６０】一般に、ex vivoおよびin vitro 適用の
ための核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介性トラ
ンスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン
媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エ
レクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム
中への封入、およびＤＮＡの核への直接的なマイクロイ
ンジェクションによって達成することができ、これらす
べてが当該技術において周知である。
【０３６１】いったん被験体遺伝子が増殖障害（例え
ば、新形成、異形成、および過形成）と相関することが
見出されると、その障害には、核酸または対応するポリ
ペプチドに基づく治療薬の投与による治療を受け入れや
すいであろう。
【０３６２】アンチセンスポリペプチドの調製について
上記で記載している。アンチセンス組成物で治療される
新形成としては、子宮頚癌、黒色腫、結腸直腸腺癌、ウ
ィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、肉腫、筋肉腫、肺癌腫、
慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、単球性白血病お
よび骨髄性白血病のような白血病、細網内腫腫のような
リンパ腫を含むが、これらに限定されない。治療用組成
物によって治療される増殖障害には、脱水性（anhydri
c）遺伝性外胚葉性形成異常、先天性肺胞形成異常、頚
部上皮性形成異常、線維性骨形成異常、乳房形成異常の
ような障害が含まれる。例えば、子宮内膜、副腎、乳
房、前立腺、あるいは甲状腺の過形成または皮膚の偽上
皮腫性増殖のような過形成は、アンチセンス治療用組成
物によって治療される。対応する遺伝子における突然変
異が関係していない障害においてさえも、核酸関連遺伝
子発現のダウンレギュレーションまたは抑制は、治療の
適用となり得る。例えば、核酸関連遺伝子発現の減少
は、増強された遺伝子発現が関係する腫瘍の抑制の一助
となり得る。
【０３６３】アンチセンス組成物の用量および投与手段
の両方は、治療用組成物の特質、患者の病状、年齢、お
よび体重、疾患の進行、および他の関連因子に基づいて
決定される。本発明の治療用アンチセンス試薬剤の投与
としては、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル挿
入投与および箇所投与を含む、局所的または全身投与が
挙げられる。好ましくは、治療用アンチセンス組成物
は、プロモーターおよび核酸のアンチセンス鎖の少なく
とも約１２個、２２個、２５個、３０個、または３５個
の連続ヌクレオチドのポリヌクレオチドセグメントを含
む発現構築物を含む。発現構築物内では、ポリヌクレオ
チドセグメントは、プロモーターより下流側に位置し、
ポリヌクレオチドセグメントの翻訳はプロモーターから
開始される。
【０３６４】様々な方法が、治療用組成物を体内におけ
る特定の部位へ直接投与するために使用される。例え
ば、小さい転移性病異が見出され、腫瘍のある体内に数
箇所の異なる位置に治療用組成物が数回注入される。あ
るいは、腫瘍を配る動脈が同定され、腫瘍に直接組成物
を送達するために、治療用組成物は、そのような動脈に
注入される。壊死性中心を有する腫瘍を吸引し、今や空
となった腫瘍の中心へ組成物を直接注入する。アンチセ
ンス組成物は、例えば組成物の局所適用により腫瘍表面
に直接投与される。Ｘ線画像法は、上記の送達方法のい
くつかの方法で手助けとなるため使用される。
【０３６５】アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノ
ムポリヌクレオチド、または特定組織に対する抗体を含
有する治療組成物の受容体媒介性標的送達もまた用いら
れる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、例えば、Findei
s et al., Trends in Biotechnol. (1993) 11:202-20
5、Chiou et al., (1994) Gene Therapeutics: Methods
And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wol
ff, ed)、Wu & Wu, J.Biol. Chem. (1988) 263:621-2
4、Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542-46、Ze
nke et al., Proc. Nail. Acad. Sci. (USA) (1990) 8
7: 3655-59、Wu etal., J. Biol. Chem. (1991) 266:33
8-42に記載される。好ましくは、本発明の抗体を含有す
る治療組成物の受容体媒介性標的送達は、特定組織に対
する抗体を送達するのに用いられる。
【０３６６】アンチセンスサブゲノムポリヌクレオチド
を含む治療用組成物は、遺伝子治療プロトコルにおいて
局所的投与として、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮ
Ａの範囲で投与される。遺伝子治療プロトコルの期間、
約５００ｎｇ〜５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇ、約５ｍ
ｇ〜約５００ｍｇ、および約２０ｍｇ〜約１００ｍｇの
ＤＮＡもまた使用され得る。アンチセンスサブゲノム核
酸の最終的な有効であるための必要な投与量に影響を及
ぼす、作用方法や形質転換および発現の有効性のような
要素は、考慮すべき事柄である。広範囲の組織にわたっ
てより高い発現が望まれる場合、より多い量のアンチセ
ンスサブゲノム核酸、または投与の連続するプロトコル
において再投与されるのと同じ量、あるいは例えば腫瘍
部位の異なる隣接または接近した組織部分への数回投与
が明白な治療結果をもたらすのに必要であるかもしれな
い。すべての場合において、臨床試験におけるルーチン
な実験によって、最適な治療効果のための特定の範囲が
決定されるであろう。遺伝子治療ベクター、特にレトロ
ウイルスベクターのより完全な記述は、米国特許出願第
０８／８６９，３０９号（本明細書に明示的に援用され
る）および以下の本明細書Ｆ．遺伝子治療に含まれる。
【０３６７】抗炎症活性を有するポリヌクレオチドまた
はタンパク質をコードする遺伝子に関して、適切な使
用、用量、および投与に関しては、米国特許第５，６５
４，１７３号に記載されており、それは参照により本明
細書に援用される。治療用薬剤はまた、米国特許第５，
６５４，１７３号に記載されるように、対象核酸により
コードされるタンパク質およびポリヌクレオチドに対す
る抗体をも含む。
【０３６８】Ｆ．遺伝子治療 本発明の治療用核酸は、遺伝子送達ビヒクルにおいて利
用することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルス起源
または非ウイルス起源であってもよい（一般的に、Joll
y, Cancer Gene Therapy(1994)1:51-64、 Kimura, Huma
n Gene Therapy(1994) 5:845-852、Connelly, Human Ge
ne Therapy (1995) 6:185-193、およびKaplitt, Nature
Genetics(1994)5:148-153を参照）。本発明の治療薬の
コード配列を含む構築物の送達のための遺伝子治療ビヒ
クルは、局所的または全身的に投与することができる。
これらの構築物は、ウイルスまたは非ウイルスベクター
によるアプローチを利用することができる。このような
コード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまた
は異種プロモータを用いて誘発させることができる。コ
ード配列の発現は、構造的または調節的であり得る。
【０３６９】本発明は、所定の選択された核酸分子を運
搬または発現するために構築される組換えレトロウイル
スを用いることができる。用いることが可能なレトロウ
イルスベクターとしては、欧州特許第０４１５ ７３１
号、国際公開第９０／０７９３６号、国際公開第９４／
０３６２２号、国際公開第９３／２５６９８号、国際公
開第９３／２５２３４号、米国特許第５，２１９，７４
０号、国際公開第９３／１１２３０号、国際公開第９３
／１０２１８号、Vile and Hart, Cancer Res.(1993) 5
3:3860-3864、Vile and Hart, Cancer Res. (1993) 53:
962-967、Ramet al., Cancer Res. (1993) 53:83-88、T
akamiya et el., J. Neurosci. Re.s.(1992) 33:493-50
3、Baba et al., J. Neurosurg. (1993) 79:729-735、
米国特許第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２０
０，６５１号、および欧州特許第０ ３４５ ２４２に
記載されるものが挙げられる。好ましい組換えレトロウ
イルスとしては、国際公開第９１／０２８０５号に記載
されるものが挙げられる。
【０３７０】上述のレトロウイルスベクター構築物と共
に使用するのに適したパッケージング細胞系は、容易に
調製され（ＰＣＴ国際公開公報第９５／３０７６３号お
よび第９２／０５２６６号を参照）、組換えベクター粒
子を生産するためのプロデューサー細胞系（ベクター細
胞系ともいう）を創出するために使用することができ
る。本発明における特に好ましい実施形態において、パ
ッケージング細胞系は、ヒト（例えば、ＨＴ１Ｏ８Ｏ細
胞）またはミンク親細胞から作製され、それによって、
ヒト血清における不活性状態で生存できる組換えレトロ
ウイルスを産生することができる。
【０３７１】本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルとして
機能することができるアルファウイルス系ベクターを用
いる。かかるベクターは、多種多様のアルファウイルス
から構築することができ、例えば、シンドビスウイルス
ベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−
６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイル
ス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ１２４
６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ
ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ
ＶＲ１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）が挙げられ
る。かかるベクター系の代表例としては、米国特許第
５，０９１，３０９号、第５，２１７，８７９号、およ
び第５，１８５，４４０号、およびＰＣＴ国際公開公報
第９２／１０５７８号、第９４／２１７９２号、第９５
／２７０６９号、第９５／２７０４４号、および第９５
／０７９９４号に記載されるものが挙げられる。
【０３７２】本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデ
ノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのようなパルボウ
イルスを用いることができる。代表例としては、国際公
開第９３／０９２３９号、Samulski et al., J. Vir.
(1989) 63:3822-3828、Mendelson et al., Virol. (198
8) 166:154-165、およびFlotte et al., PNAS (1993)9
0:10613-10617により開示されるＡＡＶベクターが挙げ
られる。
【０３７３】アデノウイルスベクターの代表例として
は、Berkner, Biotechniques (1988)6:616-627、Rosenf
eld et al., Science (1991) 252:431-434、国際公開第
９３／１９１９１号、Kolls et al., PNAS (1994) 91:2
15-219、Kass-Eisler et al., PNAS (1993) 90:11498-1
1502、Guzman et al., Circulation (1993) 88:2838-28
48、Guzman et at., Cir. Res. (1993) 73:1202-1207、
Zabner et al., Cell(1993) 75:207-216、Li Ct et a
l., Hum. Gene Ther. (1993) 4:403-409、Cailaud et a
l., Eur. J Neurosci. (1993) 5:1287-1291、Vincent e
t al., Nat. Genet. (1993) 5:130-134、Jaffe et al.,
Nat. Genet. (1992) 1:372-378、およびLevrero et a
l., Gene (1991) 101:195-202により記載されるものが
挙げられる。本発明に使用可能な典型的なアデノウイル
ス遺伝子治療ベクターとしては、国際公開第９４／１２
６４９号、国際公開第９３／０３７６９号、国際公開第
９３／１９１９１号、国際公開第９４／２８９３８号、
国際公開第９５／１１９８４号、および国際公開第９５
／００６５５号に記載されるものが挙げられる。Curie
l, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147-154に記載されるよ
うな不活性化(killed)アデノウイルスに連結されたＤＮ
Ａの投与を用いてもよい。
【０３７４】他の遺伝子送達ビヒクルおよび方法を用い
てもよく、不活性化アデノウイルス単独に連結されまた
は連結されてないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（例えば、Cu
riel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147-154）、リガンド
連結ＤＮＡ（例えば、Wu, J.Biol. Chem. (1989) 264:
16985-16987を参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（例
えば、１９９４年５月９日に提出された米国特許出願第
０８／２４０，０３０号、および米国特許出願第０８／
４０４．７９６号を参照）、光重合ヒドロゲル材料の堆
積、米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるよう
なハンドヘルド遺伝子移入パーティクルガン、米国特許
第５，２０６，１５２号および国際公開第９２１１１０
３３号に記載されるような電離放射線、核電荷中和また
は細胞膜との融合が挙げられる。さらなるアプローチ
は、Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411-2418、
およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:
1581-1585に記載されている。
【０３７５】裸のＤＮＡもまた使用することができる。
典型的な裸のＤＮＡの導入方法は、国際公開第９０１１
１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記
載されている。取り込み効率は、生分解性ラテックスビ
ーズを使用して改善することができる。ＤＮＡ被覆ラテ
ックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始
後に、効率よく細胞に輸送される。この方法は、疎水性
を高めるビーズの処理によってさらに改善することがで
き、それによって、エンドソームの破壊を促進し、ＤＮ
Ａを細胞質へ放出する。遺伝子送達ビヒクルとして働く
リポソームについては、米国特許第５，４２２，１２０
号、ＰＣＴ国際公開第９５／１３７９６号、国際公開第
９４／２３６９７号、および国際公開第９１／１４４４
５号、ならびに欧州特許第０５２４９６８号に記載され
ている。
【０３７６】さらに使用に適した非ウイルス送達として
は、Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1994) 91(24): 11581-11585に記載されているアプロー
チのような機械的送達システムが挙げられる。さらに、
コード配列およびかかるものの発現産物は、光重合ヒド
ロゲル材料の沈着により送達され得る。コード配列の送
達に使用することのできる遺伝子送達の他の従来方法と
しては、例えば、米国特許第５，１４９，６５５号に記
載のハンドヘルドの遺伝子移入粒子銃の使用、米国特許
第５，２０６，１５２号およびＰＣＴ国際公開第９２／
１１０３３号に記載の移入遺伝子を活性化するための電
離放射線の使用が挙げられる。
【０３７７】Ｇ．トランスジェニック動物 本発明の一態様は、１つまたはそれ以上の遺伝子の生物
活性が染色体に組込まれた導入遺伝子によって改変され
る生殖細胞系および／または体細胞を有するトランスジ
ェニック非ヒト動物に関する。
【０３７８】好ましい実施形態において、導入遺伝子
は、野生型タンパク質の生物機能の少なくとも一部に拮
抗する優性ネガティブタンパク質のような突然変異タン
パク質をコードする。
【０３７９】さらに別の好ましいトランスジェニック動
物は、導入遺伝子から転写される際に、遺伝子またはそ
のｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズし、遺伝子の発現を
抑制するアンチセンス転写物をコードする導入遺伝子を
含む。
【０３８０】１実施形態において、本発明は、非ヒト動
物細胞または動物細胞（ヒトを含む）を癌にかかりやす
くさせる、所定の特異的な所望の変化を含む、所望の非
ヒト動物または動物細胞を提供する。具体的に本発明
は、腫瘍抑制遺伝子の２つの対立遺伝子のうち少なくと
も１つは不完全である遺伝的に改変された非ヒト動物
（最も好ましくは、マウス）、または培養物中の細胞
（非ヒト動物またはヒト）に関する。これらの腫瘍抑制
対立遺伝子の少なくとも１つの不活性化することによ
り、腫瘍誘発または他の増殖もしくは分化障害、あるい
は、例えばサイトカインまたは成長因子由来の異常シグ
ナル導入によって特徴付けられる障害に対する高い感受
性を動物に生じさせる。遺伝子的に改変されたこの型の
マウスは、遺伝性癌の有用なモデルとして、および発癌
物質の研究の試験動物として利用可能である。本発明
は、さらに研究および医療におけるこのような非ヒト動
物細胞または動物細胞、およびそれらの子孫の使用に関
する。
【０３８１】さらに、本発明におけるトランスジェニッ
ク動物の細胞は他の導入遺伝子（例えば、第２の腫瘍抑
制遺伝子または癌遺伝子の生物学的活性を改変させる導
入遺伝子）を含み得ると考えられる。例えば、第２導入
遺伝子は、ｐ５３、ｐ７３、ＤＣＣ、ｐ２１cip1、ｐ２
７kip1、Ｒｂ、ＭａｄまたはＥ２Ｆのような第２腫瘍抑
制遺伝子の生物活性を機能的に崩壊する力を持ってい
る。あるいは、第２導入遺伝子は、ｒａｓ、ｍｙｃのよ
うな癌遺伝子、ｃｄｃ２５ホスファターゼ、Ｂｃｌ−
２、Ｂｃｌ−６、形質転換成長因子、ｎｅｕ、ｉｎｔ−
３、ポリオーマウイルス中型Ｔ抗原、ＳＶ４０大型Ｔ抗
原、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質、乳頭腫ウィルスＥ
７タンパク質、ＣＤＫ４、またはサイクリンＤ１の調節
の過剰発現または損失を引き起こすことができる。
【０３８２】本発明における好ましいトランスジェニッ
ク非ヒト動物は、遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が染色
体に組み込まれた導入遺伝子によって崩壊される生殖細
胞系および／または体細胞を有し、ここで、導入遺伝子
は、トランスジェニック動物の細胞における導入遺伝子
の存在を確認するための検出可能なシグナルを提供する
マーカー配列を含み、遺伝子の少なくとも一部分を置き
換えるか、または遺伝子に挿入されるか、または野生型
タンパク質の発現を崩壊させる。
【０３８３】本発明のさらに別の態様は、機能的に崩壊
された内因性遺伝子を有する非ヒト動物および幹細胞を
生成させる方法に関する。好ましい実施形態では、上記
方法は、下記の工程を含む： （ｉ）（ａ）遺伝子の少なくとも一部を有する組換え領
域であって、導入遺伝子と当該遺伝子の組換えを誘導す
る組換え領域、および（ｂ）細胞における導入遺伝子の
存在を確認するための検出可能なシグナルを提供するマ
ーカー配列を含む導入遺伝子構築物を構築する工程、
（ｉｉ）導入遺伝子を非ヒト動物の幹細胞に移入する工
程、（ｉｉｉ）導入遺伝子および遺伝子間の正しく標的
された相同組換えを有する幹細胞を選択する工程、（ｉ
ｖ）工程（ｉｉｉ）において確認した細胞を非ヒト胚盤
胞に転移して、得られたキメラ胚盤胞を非ヒト雌に移植
する工程、および（ｖ）正しく標的された組換えを有す
る内因性遺伝子対立遺伝子を有する子孫を回収する工
程。
【０３８４】本発明のさらに別の態様は、（ｉ）試験薬
剤と本発明のトランスジェニック動物に接触させるこ
と、および（ｉｉ）処理動物由来の試料中の形質転換細
胞数を、未処理トランスジェニック動物由来または対照
薬剤で処理したトランスジェニック動物由来の試料中の
形質転換細胞数と比較することにより、薬剤の発癌性の
可能性を評価する方法を提供する。対照薬剤で処理され
ていない形質転換細胞の数に比較した、処理動物におけ
る形質転換細胞の数の差異が、試験化合物の発癌性の可
能性を示唆する。
【０３８５】本発明の別の態様は、試験化合物の抗増殖
活性の評価方法を提供する。好ましい実施形態におい
て、上記方法は、本発明のトランスジェニック動物また
はそのような動物由来の細胞試料を試験薬剤と接触させ
ることと、トランスジェニック動物由来の検体、または
細胞試料における形質転換細胞の数を決定することを含
む。試験薬剤の非存在下における形質転換細胞の数と比
較した、形質転換細胞の数の統計学的に有意な減少は、
試験化合物が潜在的な抗増殖性薬剤であることを示唆す
る。
【０３８６】本発明の実施は、別記しない限り、当該技
術内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トラン
スジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および
免疫学の従来の技法を用いるであろう。かかる技法は、
文献にて充分に説明されている。例えば、Molecular Cl
oning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambroo
k, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Labora
tory Press: 1989)、DNA Cloning, Volumes I and II
(D.N. Glover ed., 1985)、Oligonucleotide Synthesis
(M.J. Gait ed., 1984)、米国特許第４，６８３，１９
５号(Mullis etal.)、Nucleic Acid Hybridization (B.
D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)、Transcription
And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 19
84)、Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan
R. Liss, Inc., 1987)、Immobilized Cells And Enzyme
s (IRL Press, 1986)、B. Perbal, A Practical Guide
ToMolecular Cloning (1984)、the treatise, Methods
in Enzymology (AcademicPress, Inc., N.Y.)、Gene Tr
ansfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller a
nd M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Labor
atory)、MethodsIn Enzymology, Vols. 154 and 155 (W
u et al. edso)、Immunochemical Methods In Cell And
Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academ
ic Press,London, 1987)、Handbook Of Experimental I
mmunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C. Blackwe
ll, eds., 1986)、Manipulating the Mouse Embryo, (C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【０３８７】上述するように、本明細書中に記載する配
列は、特に結腸癌に関して有用性を示すと考えられる。
しかしながら、これらはまた、他の型の癌および他の疾
患状態においても有効であり得る。
【０３８８】本発明について、特に好適な実施形態を記
載している下記の実施例を参照して説明する。しかしな
がら、これらの実施形態は例示的であり、いかなる場合
においても本発明を制限するものと解釈されない。
【０３８９】ＸＩ． 実施例 Ａ． 差次的発現配列の同定 ライブラリーの説明 配列番号１、３、５、または７は、下記に記載されるよ
うに、ＤＥおよびＰＡとして指定されるライブラリーか
ら調達された。ＤＥライブラリーは、規格化された結腸
癌特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリーである。Ｄ
Ｅライブラリーは、結腸癌において発現される配列に特
異的である（近位および遠位のＤｕｋｅｓ’Ｂ,ミクロ
サテライト安定(ＭＳＳ))が、正常結腸組織を含む正常
組織においては発現しない。ＰＡライブラリーは、規格
化された結腸特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリー
である。ＰＡライブラリーは、正常結腸において発現さ
れる配列に特異的であるが、他の正常組織においては発
現しない。
【０３９０】結腸癌特異的ライブラリーの構築 サブトラクト結腸癌特異的ライブラリーは、結腸、末梢
血白血球（ＰＢＬ）、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、小
腸、骨格筋、および前立腺組織のｃＤＮＡから作製され
たプールされるドライバー正常ｃＤＮＡの組み合わせに
対して、プールされている近位(proximal)ステージＢで
あるＭＳＳおよび遠位(distal)ステージＢであるＭＳＳ
腫瘍組織ｃＤＮＡを差し引くことによって作製された。
以下のＲＮＡ試料は、Origene Technologies, Inc., Ro
ckville, Marylandから得られ、プールドライバーｃＤ
ＮＡ：＃ＨＴ−１０１５正常結腸全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１
００５肝臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００４脾臓全ＲＮＡ、
＃ＨＴ−１００９肺全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００３腎臓全
ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００６末梢血白血球全ＲＮＡ、＃Ｈ
Ｔ−前立腺全ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００２心筋ポリＡ＋Ｒ
ＮＡ、＃ＨＭ−１００７腸ポリＡ＋ＲＮＡ、＃ＨＭ−１
００８骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡを合成するために使用され
た。第一鎖ｃＤＮＡは、それぞれＲＮＡ１μｇを使用し
て調製された。５０体積％の正常結腸第一鎖ｃＤＮＡ反
応物および５．５６体積％のそれぞれ残存組織の第一鎖
ｃＤＮＡ反応物各々を含む第一鎖ｃＤＮＡのバイアスプ
ールを調製した。それぞれバイアス第一鎖ｃＤＮＡ反応
プール１μｌを含む８つの個々の増幅反応が１８サイク
ル行われた。８つすべての増幅反応からの二本鎖ｃＤＮ
Ａ産物をプールし、続く差し引きハイブリッド形成法ブ
トラクティブハイブリダイゼーションでの使用のために
精製した。結腸癌特異的サブトラクトライブラリーをＤ
Ｅを称し、このライブラリー由来の個々のクローンは、
ＤＥが前に付けられた番号を用いて引用する。
【０３９１】規格化されたサブトラクトＤＥ結腸癌特異
的およびプール正常ヒト組織特異的ｃＤＮＡライブラリ
ー（上記ドライバーｃＤＮＡの構成成分と同じ）は、公
開されている手法（Daitchenko et al., 1996 PNAS 93:
6025-6030, Gurskaya et al., 1996 Analytical Bioche
mistry 240:90-97）に従い、ＰＣＲ−選択ｃＤＮＡサブ
ストラクションキットＰＴ１１１７−１（Clontech Lab
oratories, Inc.）を用いて生成された。４５倍の質量
過剰のドライバーｃＤＮＡ（４５０ｎｇ）を、それぞれ
サブトラクション実験に用いた。ドライバーｃＤＮＡを
用いたテスターのサブトラクティブハイブリダイゼーシ
ョンは、それぞれ約８〜１２時間毎に２回行なった。サ
ブトラクト癌特異的ＤＥｃＤＮＡは、ｐＣＲ２．１−Ｔ
ＯＰＯプラスミドベクター（Invitrogen Corporation,
Carlsbad CA）に連結され、化学的にウルトラコンピテ
ント（ultracompetent）Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ大腸菌ＸＬ
１Ｏ−Ｇｏｌｄ細胞（Stratagene, La Jolla, CA）に形
質転換された。テスターとドライバー試料を入れ替えた
逆ライブラリーもまた、構築され、このライブラリーは
ＭＤとして称した。
【０３９２】正常結腸特異的ライブラリーの構築 この正常結腸組織特異的ライブラリーは、ユーザーマニ
ュアル（ＰＴ１１１７−１）の指示に従い、Clontech L
aboratories Inc PCR-Select kit, Ｋ１８０４−１を使
用して作製された。
【０３９３】正常サンプル、非癌性サンプル、患者サン
プルについてそれぞれ４つの１００μｌのＳＭＡＲＴ
ＰＣＲ ｃＤＮＡ増幅反応は、それぞれの第一鎖ｃＤＮ
Ａ反応からの１μｌから開始して行われた。各試料は、
次のＰＣＲ条件：９５ Ｃ−ｂ秒、６８ Ｃ ５ｍｍ
で、9600 Perkin Elmer計器を使用して、１８サイクル
のみ増幅された。以下に、増幅されたｃＤＮＡ試料に関
するBayer Diagnostic試料識別番号を示す：ＮＰＢ
（−）２７３４７、ＮＰＢ（−）２７８５９、ＮＰＢ
（−）２８１４７、ＮＰＢ（−）２８１６２、ＮＤＢ
（−）２８８００、ＮＤＢ（−）２９２４３、ＮＤＢ
（−）２９２４４、およびＮＤＢ（−）４２４７２。こ
れらは、近位ステージＢ ＭＳＳおよび遠位ステージＢ
ＭＳＳ癌サンプルを提供する同じ患者から得られる正
常結腸組織試料であり、上述のＤＥライブラリーを調製
するために使用した。等容量の８つの正常結腸ｃＤＮＡ
がプールされた。サブトラクト正常結腸組織特異的ライ
ブラリーは、正常結腸ｃＤＮＡプールを、末梢血白血球
（ＰＢＬ）、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、小腸、骨格
筋、および前立腺の組織ｃＤＮＡから作製されプールさ
れたドライバーｃＤＮＡの組合せに対して差し引くこと
により作製された。以下に、プールされたドライバーｃ
ＤＮＡを合成するために使用したＲＮＡ試料を示す：＃
ＨＴ−１００５肝臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−ｂ００４脾臓全
ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００９肺全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００
３腎臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００６末梢血白血球全ＲＮ
Ａ、＃ＨＴ−前立腺全ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００２心筋ポ
リＡ＋ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００７腸ポリＡ＋ＲＮＡ、お
よび＃ＨＭ−ｂ００８骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡ。第一鎖ｃ
ＤＮＡは、ＲＮＡ１μｇを用いて、各々について調製し
た。続いて、等容量の９つのドライバー組織の第一鎖ｃ
ＤＮＡ反応から構成される、第一鎖ｃＤＮＡプールの反
応を行った。それぞれ１μｌの第一鎖ｃＤＮＡ反応プー
ルを含む８個について増幅反応を１８サイクル行った。
８つすべての増幅反応からの二本鎖ｃＤＮＡ産物はプー
ルされ、続くサブトラクティブハイブリダイゼーション
での使用のために精製された。正常結腸組織特異的サブ
トラクトライブラリーはＰＡと称され、このライブラリ
ー由来の個々のクローンは、番号の前にＰＡが前に付け
られた番号を用いて引用する。
【０３９４】先に列挙したヒト組織から成る、規格化さ
れたサブトラクトＰＡ正常結腸特異的ｃＤＮＡライブラ
リーおよびサブトラクト正常ヒト組織特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーは、公開されている手法（Daitchenko et a
l., 1996 PNAS 93:6025-6030,Gurskaya et al., 1996 A
nalytical Biochemistry 240:90-97）に従い、Clontech
Laboratories, Inc., PCR-Select cDNA subtraction k
it, Ｐ１１１１７−１を使用して作成された。ライブラ
リー構築およびクローニングは、上記のように結腸癌特
異的ライブラリーについて行った。差次的発現のために
分析された１１５２クローンのうち、米国同時係属出願
第０９／３８５,９８２号に記載されているように、約
６９％が差次的に発現した。
【０３９５】サブトラクトライブラリーを作製するのに
用いられたｃＤＮＡはＲｓａＩ（平均約６００塩基対の
大きさの断片を生じる４塩基切断制限エンドヌクレアー
ゼ）で制限されるため、各上記ライブラリーから単離さ
れたそれぞれのＥＳＴは、部分的ｍＲＮＡ翻訳物由来の
配列を表わす。
【０３９６】結腸癌における差次的発現の実証 このライブラリーで見出された差次的に発現された配列
が結腸癌に特異的であることを実証するために、結腸癌
特異的ライブラリー（デラウェア（ＤＥ））、および正
常組織特異的ライブラリー（メリーランド（ＭＤ））か
ら調製されたｃＤＮＡを用いてクローンをスクリーニン
グした。
【０３９７】ｃＤＮＡクローンを、von Stein et al. 1
997, Nucleic Acids Research 25(13):2598-2602によっ
て開発された手法に従い、公開されている方法（Jin et
al., 1997, Biotechniques 23:1083-1086）に従い合成
されたプローブを用いて、差次的発現に関して分析し
た。差次的発現のために分析された１２４８クローンの
うち、米国同時係属出願第０９／３８５,９８２号に記
載されているように、約８３％が差次的に発現した。
【０３９８】差次的に発現したクローンの配列決定およ
び分析 差次的に発現されることが示されたクローンからの挿入
断片のヌクレオチド配列は、サンガー配列決定法によ
り、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドを用いて、
Ｔ７またはＭ１３プロモーター部位からのシングルパス
配列決定によって決定した。配列は、本明細書（ＸＩ.
実施例；Ｂ.公共データベース検索結果）に記載の方法
に従い分析された。
【０３９９】それぞれの核酸は、少なくとも部分的ｍＲ
ＮＡ転写物由来の配列を表わす。
【０４００】本発明の核酸には、配列番号（添付資料参
照）を与えた。核酸配列は、添付の配列表に示す。
【０４０１】差次的に発現されたクローンを同定するた
めの実験の例を、図、「差次的発現分析」に示す。サブ
トラクトクローンからの挿入断片を、上述したように、
増幅し、電気泳動し、そして膜上にブロットした。上述
したように、ＲＳＡ１切断ＤＥおよびＭＤのｃＤＮＡプ
ローブとゲルをハイブリダイズした。
【０４０２】図において、個々のクローンには、各レー
ンの最上部に番号を付与する。すなわち同じクローン
が、上側のブロット（「癌プローブ」）および下側のブ
ロット（「正常プローブ」）がともに同じ垂直なレーン
上に表わされるように、ブロットは、一列に並べられ
た。「０」と標識されたレーンは、過剰発現しているク
ローンを示唆し、すなわち、同じレーンにおける下側の
ブロット（「正常プローブ」）において観察されるバン
ドと比較して、上側のブロット（「癌プローブ」）にお
いて、より濃い顕著なバンドを示す。「Ｕ」と標識され
たレーンは、過少発現しているクローンを示唆し、すな
わち、同じレーンにおける上側のブロット（「癌プロー
ブ」）において観察されるバンドと比較して、下側のブ
ロット（「正常プローブ」）において、より濃い顕著な
バンドを示す。「Ｍ」と標識されたレーンは、癌および
正常細胞においてわずかに過剰発現しているクローンを
示唆する。
【０４０３】Ｂ.公共データベース検索結果 配列番号１、３、５、または７の完全長ｃＤＮＡ配列
は、米国同時係属出願第０９／３８５,９８２号に記載
の部分配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ２検
索により得られた。
【０４０４】５つの配列すべてを分析した。配列は、ま
ず、マスクしてベクター由来の配列を同定し、つづいて
マスクを除去した。残った配列情報を用いて、配列表
（配列番号１、３、５、または７）を作成した。これら
の配列各々は、先に列挙したデータベースに対するＢＬ
ＡＳＴ２検索を遂行するためのクエリー配列として使用
された。ＢＬＡＳＴ２検索は、２つの配列の最適整列を
作成するために、ギャップの導入を可能とする点で、従
来のＢｌａｓｔ検索と異なる。ＢＬＡＳＴ２検索におい
て同定された各完全長配列のＧｅｎＢａｎｋ記録を用い
て、各ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を得
た。
【０４０５】当業者は、せいぜいルーチンな実験を用い
て、本明細書中に記載した本発明の具体的な実施形態に
対する多くの均等物を認識し、または確認することがで
きるであろう。このような具体的な実施形態および均等
物は、上述の特許請求の範囲により包括されるものと意
図される。
【０４０６】すべての特許、公開特許出願、および本明
細書に引用した刊行物は、本明細書中に全面的に記載さ
れているように、参照することにより援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１の核酸配列を示す。
【図２】配列番号２のアミノ酸配列を示す。
【図３】配列番号３の核酸配列を示す。
【図４】配列番号４のアミノ酸配列を示す。
【図５】配列番号５の核酸配列を示す。
【図６】配列番号６のアミノ酸配列を示す。
【図７】配列番号７の核酸配列を示す。
【図８】配列番号８のアミノ酸配列を示す。 SEQUENCE LISTING <110> Astle, Jon Burgess, Christopher Dwivedi, Poornima Lewis, Marcia Molino, Gary Myerow, Susan Thiagalingam, Arunthathi Catino, Theodore <120> Novel Human Genes and Gene Expression Products: II <130> 1657/1015B <140> 09/907,479 <141> 2001-07-17 <150> US 09/385,982 <151> 1999-08-30 <150> US 09/328,111 <151> 1999-06-08 <150> US 60/098,639 <151> 1988-08-31 <150> US 60/117,393 <151> 1998-01-27 <160> 8 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 2646 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atcagcaaca attaaaatat tcacgtggta tctgtagttt aataatggac caacatcaac 60 atttgaataa aacagcagag tcagcatctt cagagaaaaa gaaaacaaga cgctgcaatg 120 gattcaagat gttcttggca gccctgtcat tcagctatat tgctaaagca ctaggtggaa 180 tcattatgaa aatttccatc actcaaatag aaaggagatt tgacatatcc tcttctcttg 240 ctggtttaat tgatggaagc tttgaaattg gaaatttgct tgtgattgta tttgtaagtt 300 actttggatc taaactacac agaccgaagt taattggaat tggttgtctc cttatgggaa 360 ctggaagtat tttgacatct ttaccacatt tcttcatggg atattatagg tattctaaag 420 aaacccatat taatccatca gaaaattcaa catcaagttt atcaacctgt ttaattaatc 480 aaaccttatc attcaatgga acatcacctg agatagtaga aaaagattgt gtaaaggaat 540 ctgggtcaca catgtggatc tatgtcttca tggggaatat gcttcgtggc ataggggaaa 600 cccccatagt accattgggg atttcataca ttgatgattt tgcaaaagaa ggacattctt 660 ccttgtattt aggtagtttg aatgcaatag gaatgattgg tccagtcatt ggctttgcac 720 tgggatctct gtttgctaaa atgtacgtgg atattggata tgtagatctg agcactatca 780 gaataactcc taaggactct cgttgggttg gagcttggtg gcttggtttc cttgtgtctg 840 gactattttc cattatttct tccataccat tttttttctt gccgaaaaat ccaaataaac 900 cacaaaaaga aagaaaaatt tcactatcat tgcatgtgct gaaaacaaat gatgatagaa 960 atcaaacagc taatttgacc aaccaaggaa aaaatgttac caaaaatgtg actggttttt 1020 tccagtcttt gaaaagcatc cttaccaatc ccctgtatgt tatatttctg cttttgacat 1080 tgttacaagt aagcagcttt attggttctt ttacttacgt ctttaaatat atggagcaac 1140 agtacggtca gtctgcatct catgctaact ttttgttggg aatcataacc attcctacgg 1200 ttgcaactgg aatgttttta ggaggattta tcattaaaaa attcaaattg tctttagttg 1260 gaattgccaa attttcattt cttacttcga tgatatcctt cttgtttcaa cttctatatt 1320 tccctctaat ctgcgaaagc aaatcagttg ccggcctaac cttgacctat gatggaaata 1380 attcagtggc atctcatgta gatgtaccac tttcttattg caactcagag tgcaattgtg 1440 atgaaagtca gtgggaacca gtctgtggga acaatggaat aacttacctg tcaccttgtc 1500 tagcaggatg caaatcctca agtggtatta aaaagcatac agtgttttat aactgtagtt 1560 gtgtggaagt aactggtctc cagaacagaa attactcagc acacttgggt gaatgcccaa 1620 gagataatac ttgtacaagg aaatttttca tctatgttgc aattcaagtc ataaactctt 1680 tgttctctgc aacaggaggt accacattta tcttgttgac tgtgaagatt gttcaacctg 1740 aattgaaagc acttgcaatg ggtttccagt caatggttat aagaacacta ggaggaattc 1800 tagctccaat atattttggg gctctgattg ataaaacatg tatgaagtgg tccaccaaca 1860 gctgtggagc acaaggagct tgtaggatat ataattccgt attttttgga agggtctact 1920 tgggcttatc tatagcttta agattcccag cacttgtttt atatattgtt ttcatttttg 1980 ctatgaagaa aaaatttcaa ggaaaagata ccaaggcatc ggacaatgaa agaaaagtaa 2040 tggatgaagc aaacttagaa ttcttaaata atggtgaaca ttttgtacct tctgctggaa 2100 cagatagtaa aacatgtaat ttggacatgc aagacaatgc tgctgccaac taacattgca 2160 ttgattcatt aagatgttat ttttgaggtg ttcctggtct ttcactgaca attccaacat 2220 tctttactta cagtggacca atggataagt ctatgcatct ataataaact ataaaaaatg 2280 ggagtaccca tggttaggat atagctatgc ctttatggtt aagattagaa tatatgatcc 2340 ataaaattta aagtgagagg catggttagt gtgtgataca ataaaaagta attgtttggt 2400 agttgtaact gctaataaaa ccagtgacta gaatataagg gaggtaaaaa ggacaagata 2460 gattaatagc ctaaataaag agaaaagcct gatgccttta aaaaatgaaa cactttggat 2520 gtattactta ggccaaaatc tggcctggat ttatgctata atatatattt tcatgttaag 2580 ttgtatattt ttcagaaatt ataaatatta ttaatttaaa attcgaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaa 2646 <210> 2 <211> 702 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Gln His Gln His Leu Asn Lys Thr Ala Glu Ser Ala Ser Ser 1 5 10 15 Glu Lys Lys Lys Thr Arg Arg Cys Asn Gly Phe Lys Met Phe Leu Ala 20 25 30 Ala Leu Ser Phe Ser Tyr Ile Ala Lys Ala Leu Gly Gly Ile Ile Met 35 40 45 Lys Ile Ser Ile Thr Gln Ile Glu Arg Arg Phe Asp Ile Ser Ser Ser 50 55 60 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Gly Ser Phe Glu Ile Gly Asn Leu Leu Val 65 70 75 80 Ile Val Phe Val Ser Tyr Phe Gly Ser Lys Leu His Arg Pro Lys Leu 85 90 95 Ile Gly Ile Gly Cys Leu Leu Met Gly Thr Gly Ser Ile Leu Thr Ser 100 105 110 Leu Pro His Phe Phe Met Gly Tyr Tyr Arg Tyr Ser Lys Glu Thr His 115 120 125 Ile Asn Pro Ser Glu Asn Ser Thr Ser Ser Leu Ser Thr Cys Leu Ile 130 135 140 Asn Gln Thr Leu Ser Phe Asn Gly Thr Ser Pro Glu Ile Val Glu Lys 145 150 155 160 Asp Cys Val Lys Glu Ser Gly Ser His Met Trp Ile Tyr Val Phe Met 165 170 175 Gly Asn Met Leu Arg Gly Ile Gly Glu Thr Pro Ile Val Pro Leu Gly 180 185 190 Ile Ser Tyr Ile Asp Asp Phe Ala Lys Glu Gly His Ser Ser Leu Tyr 195 200 205 Leu Gly Ser Leu Asn Ala Ile Gly Met Ile Gly Pro Val Ile Gly Phe 210 215 220 Ala Leu Gly Ser Leu Phe Ala Lys Met Tyr Val Asp Ile Gly Tyr Val 225 230 235 240 Asp Leu Ser Thr Ile Arg Ile Thr Pro Lys Asp Ser Arg Trp Val Gly 245 250 255 Ala Trp Trp Leu Gly Phe Leu Val Ser Gly Leu Phe Ser Ile Ile Ser 260 265 270 Ser Ile Pro Phe Phe Phe Leu Pro Lys Asn Pro Asn Lys Pro Gln Lys 275 280 285 Glu Arg Lys Ile Ser Leu Ser Leu His Val Leu Lys Thr Asn Asp Asp 290 295 300 Arg Asn Gln Thr Ala Asn Leu Thr Asn Gln Gly Lys Asn Val Thr Lys 305 310 315 320 Asn Val Thr Gly Phe Phe Gln Ser Leu Lys Ser Ile Leu Thr Asn Pro 325 330 335 Leu Tyr Val Ile Phe Leu Leu Leu Thr Leu Leu Gln Val Ser Ser Phe 340 345 350 Ile Gly Ser Phe Thr Tyr Val Phe Lys Tyr Met Glu Gln Gln Tyr Gly 355 360 365 Gln Ser Ala Ser His Ala Asn Phe Leu Leu Gly Ile Ile Thr Ile Pro 370 375 380 Thr Val Ala Thr Gly Met Phe Leu Gly Gly Phe Ile Ile Lys Lys Phe 385 390 395 400 Lys Leu Ser Leu Val Gly Ile Ala Lys Phe Ser Phe Leu Thr Ser Met 405 410 415 Ile Ser Phe Leu Phe Gln Leu Leu Tyr Phe Pro Leu Ile Cys Glu Ser 420 425 430 Lys Ser Val Ala Gly Leu Thr Leu Thr Tyr Asp Gly Asn Asn Ser Val 435 440 445 Ala Ser His Val Asp Val Pro Leu Ser Tyr Cys Asn Ser Glu Cys Asn 450 455 460 Cys Asp Glu Ser Gln Trp Glu Pro Val Cys Gly Asn Asn Gly Ile Thr 465 470 475 480 Tyr Leu Ser Pro Cys Leu Ala Gly Cys Lys Ser Ser Ser Gly Ile Lys 485 490 495 Lys His Thr Val Phe Tyr Asn Cys Ser Cys Val Glu Val Thr Gly Leu 500 505 510 Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Ala His Leu Gly Glu Cys Pro Arg Asp Asn 515 520 525 Thr Cys Thr Arg Lys Phe Phe Ile Tyr Val Ala Ile Gln Val Ile Asn 530 535 540 Ser Leu Phe Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Phe Ile Leu Leu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Val Gln Pro Glu Leu Lys Ala Leu Ala Met Gly Phe Gln Ser 565 570 575 Met Val Ile Arg Thr Leu Gly Gly Ile Leu Ala Pro Ile Tyr Phe Gly 580 585 590 Ala Leu Ile Asp Lys Thr Cys Met Lys Trp Ser Thr Asn Ser Cys Gly 595 600 605 Ala Gln Gly Ala Cys Arg Ile Tyr Asn Ser Val Phe Phe Gly Arg Val 610 615 620 Tyr Leu Gly Leu Ser Ile Ala Leu Arg Phe Pro Ala Leu Val Leu Tyr 625 630 635 640 Ile Val Phe Ile Phe Ala Met Lys Lys Lys Phe Gln Gly Lys Asp Thr 645 650 655 Lys Ala Ser Asp Asn Glu Arg Lys Val Met Asp Glu Ala Asn Leu Glu 660 665 670 Phe Leu Asn Asn Gly Glu His Phe Val Pro Ser Ala Gly Thr Asp Ser 675 680 685 Lys Thr Cys Asn Leu Asp Met Gln Asp Asn Ala Ala Ala Asn 690 695 700 <210> 3 <211> 1698 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 acaggaggag acagcctccc ggcccgggga ggacaagtcg ctgccacctt tggctgccga 60 cgtgattccc tgggacggtc cgtttcctgc cgtcaactgc cggccgagtt gggtctccgt 120 ggttcaggcc ggctccccct tcctggtctc ccttctcccg ctgggccggt ttatcgggag 180 gagattgtct tccagggcta gcaattggac ttttgatgat gtttgaccca gcggcaggaa 240 tagcaggcaa cgtgatttca aagctgggct cagctcatgt ttcttctctc gtgtaatcgc 300 aaaacccatt ttggagcagg aattccaatc atgtctgtga tggtggtgag aaagaaggtg 360 acacggaaat gggagaaact cccaggcagg aacacctttt gctgtgatgg ccgcgtcatg 420 atggcccggc aaaagggcat tttctacctg acccttttcc tcatcctggg gacatgtaca 480 ctcttcttcg cctttgagtg ccgctacctg gctgttcagc tgtctcctgc catccctgta 540 tttgctgcca tgctcttcct tttctccatg gctacactgt tgaggaccag cttcagtgac 600 cctggagtga ttcctcgggc gctaccagat gaagcagctt tcatagaaat ggagatagaa 660 gctaccaatg gtgcggtgcc gggctaccag cgaccaccgc ctcgtatcaa gaatttccag 720 ataaacaacc agattgtgaa actgaaatac tgttacacat gcaagatctt ccggcctccc 780 cgggcctccc attgcagcat ctgtgacaac tgtgtggagc gcttcgacca tcactgcccc 840 tgggtgggga attgtgttgg aaagaggaac taccgctact tctacctctt catcctttct 900 ctctccctcc tcacaatcta tgtcttcgcc ttcaacatcg tctatgtggc cctcaaatct 960 ttgaaaattg gcttcttgga gacattgaaa gaaactcctg gaactgttct agaagtcctc 1020 atttgcttct ttacactctg gtccgtcgtg ggactgactg gatttcatac tttcctcgtg 1080 gctctcaacc agacaaccaa tgaagacatc aaaggatcat ggacagggaa gaatcgcgtc 1140 cagaatccct acagccatgg caatattgtg aagaactgct gtgaagtgct gtgtggcccc 1200 ttgcccccca gtgtgctgga tcgaaggggt attttgccac tggaggaaag tggaagtcga 1260 cctcccagta ctcaagagac cagtagcagc ctcttgccac agagcccagc ccccacagaa 1320 cacctgaact caaatgagat gccggaggac agcagcactc ccgaagagat gccacctcca 1380 gagcccccag agccaccaca ggaggcagct gaagctgaga agtagcctat ctatggaaga 1440 gacttttgtt tgtgtttaat tagggctatg agagatttca ggtgagaagt taaacctgag 1500 acagagagca agtaagctgt cccttttaat tgtttttctt tggtctttag tcacccagtt 1560 gcacactggg cattttcttg gctggcaagc tttttttaaa atttgctgaa acttcaaggg 1620 cagtggccag gaaggatgtt cagttcacct ctggataaac tgggaaaaat ggggtctctt 1680 ggggccgggc actggttt 1698 <210> 4 <211> 382 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Phe Leu Leu Ser Cys Asn Arg Lys Thr His Phe Gly Ala Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ile Met Ser Val Met Val Val Arg Lys Lys Val Thr Arg Lys Trp 20 25 30 Glu Lys Leu Pro Gly Arg Asn Thr Phe Cys Cys Asp Gly Arg Val Met 35 40 45 Met Ala Arg Gln Lys Gly Ile Phe Tyr Leu Thr Leu Phe Leu Ile Leu 50 55 60 Gly Thr Cys Thr Leu Phe Phe Ala Phe Glu Cys Arg Tyr Leu Ala Val 65 70 75 80 Gln Leu Ser Pro Ala Ile Pro Val Phe Ala Ala Met Leu Phe Leu Phe 85 90 95 Ser Met Ala Thr Leu Leu Arg Thr Ser Phe Ser Asp Pro Gly Val Ile 100 105 110 Pro Arg Ala Leu Pro Asp Glu Ala Ala Phe Ile Glu Met Glu Ile Glu 115 120 125 Ala Thr Asn Gly Ala Val Pro Gly Tyr Gln Arg Pro Pro Pro Arg Ile 130 135 140 Lys Asn Phe Gln Ile Asn Asn Gln Ile Val Lys Leu Lys Tyr Cys Tyr 145 150 155 160 Thr Cys Lys Ile Phe Arg Pro Pro Arg Ala Ser His Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Asp Asn Cys Val Glu Arg Phe Asp His His Cys Pro Trp Val Gly Asn 180 185 190 Cys Val Gly Lys Arg Asn Tyr Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Ile Leu Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Leu Thr Ile Tyr Val Phe Ala Phe Asn Ile Val Tyr Val 210 215 220 Ala Leu Lys Ser Leu Lys Ile Gly Phe Leu Glu Thr Leu Lys Glu Thr 225 230 235 240 Pro Gly Thr Val Leu Glu Val Leu Ile Cys Phe Phe Thr Leu Trp Ser 245 250 255 Val Val Gly Leu Thr Gly Phe His Thr Phe Leu Val Ala Leu Asn Gln 260 265 270 Thr Thr Asn Glu Asp Ile Lys Gly Ser Trp Thr Gly Lys Asn Arg Val 275 280 285 Gln Asn Pro Tyr Ser His Gly Asn Ile Val Lys Asn Cys Cys Glu Val 290 295 300 Leu Cys Gly Pro Leu Pro Pro Ser Val Leu Asp Arg Arg Gly Ile Leu 305 310 315 320 Pro Leu Glu Glu Ser Gly Ser Arg Pro Pro Ser Thr Gln Glu Thr Ser 325 330 335 Ser Ser Leu Leu Pro Gln Ser Pro Ala Pro Thr Glu His Leu Asn Ser 340 345 350 Asn Glu Met Pro Glu Asp Ser Ser Thr Pro Glu Glu Met Pro Pro Pro 355 360 365 Glu Pro Pro Glu Pro Pro Gln Glu Ala Ala Glu Ala Glu Lys 370 375 380 <210> 5 <211> 1908 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 acaagatgga ggattcggcc tcggcctcgc tgtcttctgc agccgctact ggaacctcca 60 cctcgactcc agcggccccg acagcacgga agcagctgga taaagaacag gttagaaagg 120 cagtggacgc tctcttgacg cattgcaagt ccaggaaaaa caattatggg ttgcttttga 180 atgagaatga aagtttattt ttaatggtgg tattatggaa aattccaagt aaagaactga 240 gggtcagatt gaccttgcct catagtattc gatcagattc agaagatatc tgtttattta 300 cgaaggatga acccaattca actcctgaaa agacagaaca gttttataga aagcttttaa 360 acaagcatgg aattaaaacc gtttctcaga ttatctccct ccaaactcta aagaaggaat 420 ataaatccta tgaagccaag ctccgccttc tgagcagttt tgatttcttc cttactgatg 480 ccagaattag gcggctctta ccctcactca ttgggagaca tttctatcaa agaaagaaag 540 ttccagtatc tgtaaacctt ctgtccaaga atttatcaag agagatcaat gactgtatag 600 gtggaacggt cttaaacatt tctaaaagtg gttcttgcag tgctatacgt attggtcacg 660 ttggaatgca aattgagcac atcattgaaa acattgttgc tgtcaccaaa ggactttcag 720 aaaaattgcc agagaagtgg gagagcgtga aactcctgtt tgtgaaaact gagaaatcgg 780 ctgcacttcc catcttttcc tcgtttgtca gcaattggga tgaagccacc aaaagatctt 840 tgcttaataa gaagaaaaaa gaggcaagga gaaaacgaag agaaagaaat tttgaaaaac 900 aaaaggagag gaagaagaag aggcagcagg ctaggaagac tgcatcagtt cttagtaaag 960 atgatgtggc acctgaaagt ggtgatacta cagtgaagaa acctgaatca aagaaggaac 1020 agaccccaga gcatgggaag aaaaaacgtg gcagaggaaa agcccaagtt aaagcaacaa 1080 atgaatccga agacgaaatc ccacagctgg taccaatagg aaagaagact ccagctaatg 1140 aaaaagtaga gattcaaaaa catgccacag gaaagaagtc tccagcaaag agtcctaatc 1200 ccagcacacc tcgtgggaag aaaagaaagg ctttgccagc atctgagacc ccaaaagctg 1260 cagagtctga gaccccaggg aaaagcccag agaagaagcc aaaaatcaaa gaagaggcag 1320 tgaaggaaaa aagtccttcg ctggggaaaa aagatgcgag acagactcca aaaaagccag 1380 aggccaagtt tttcaccact cctagtaaat ctgtgagaaa agcttcccac acccccaaaa 1440 aatggcccaa aaaacccaaa taccccagtc gacctaaagt cagtgattca actggaagga 1500 aacctcaatg ctgcctccag agctttttgg aaatactcag atcctggccg cctttgtaac 1560 cttctctaaa cgtcaggcct ggacttaaaa gattttttaa aacctccata agtagtccag 1620 gggcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaggcagg cggatcacaa 1680 ggtcaacgag atcgagacca tcctggccaa catggtgaaa ccctgtctgt accaaaaata 1740 caaaaattaa ttgggcatgg tggtggacac ctgtaatccc agctactagg gaggctgagg 1800 caggagaatt gcttgaacct gggaggcgga ggttgcagtg agccactgca ctccagcctg 1860 atgacagagc aagactcagt caaaaataaa taaaaataat aaaacctc 1908 <210> 6 <211> 517 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Asp Ser Ala Ser Ala Ser Leu Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr Ser Thr Ser Thr Pro Ala Ala Pro Thr Ala Arg Lys Gln Leu Asp 20 25 30 Lys Glu Gln Val Arg Lys Ala Val Asp Ala Leu Leu Thr His Cys Lys 35 40 45 Ser Arg Lys Asn Asn Tyr Gly Leu Leu Leu Asn Glu Asn Glu Ser Leu 50 55 60 Phe Leu Met Val Val Leu Trp Lys Ile Pro Ser Lys Glu Leu Arg Val 65 70 75 80 Arg Leu Thr Leu Pro His Ser Ile Arg Ser Asp Ser Glu Asp Ile Cys 85 90 95 Leu Phe Thr Lys Asp Glu Pro Asn Ser Thr Pro Glu Lys Thr Glu Gln 100 105 110 Phe Tyr Arg Lys Leu Leu Asn Lys His Gly Ile Lys Thr Val Ser Gln 115 120 125 Ile Ile Ser Leu Gln Thr Leu Lys Lys Glu Tyr Lys Ser Tyr Glu Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Leu Leu Ser Ser Phe Asp Phe Phe Leu Thr Asp Ala Arg 145 150 155 160 Ile Arg Arg Leu Leu Pro Ser Leu Ile Gly Arg His Phe Tyr Gln Arg 165 170 175 Lys Lys Val Pro Val Ser Val Asn Leu Leu Ser Lys Asn Leu Ser Arg 180 185 190 Glu Ile Asn Asp Cys Ile Gly Gly Thr Val Leu Asn Ile Ser Lys Ser 195 200 205 Gly Ser Cys Ser Ala Ile Arg Ile Gly His Val Gly Met Gln Ile Glu 210 215 220 His Ile Ile Glu Asn Ile Val Ala Val Thr Lys Gly Leu Ser Glu Lys 225 230 235 240 Leu Pro Glu Lys Trp Glu Ser Val Lys Leu Leu Phe Val Lys Thr Glu 245 250 255 Lys Ser Ala Ala Leu Pro Ile Phe Ser Ser Phe Val Ser Asn Trp Asp 260 265 270 Glu Ala Thr Lys Arg Ser Leu Leu Asn Lys Lys Lys Lys Glu Ala Arg 275 280 285 Arg Lys Arg Arg Glu Arg Asn Phe Glu Lys Gln Lys Glu Arg Lys Lys 290 295 300 Lys Arg Gln Gln Ala Arg Lys Thr Ala Ser Val Leu Ser Lys Asp Asp 305 310 315 320 Val Ala Pro Glu Ser Gly Asp Thr Thr Val Lys Lys Pro Glu Ser Lys 325 330 335 Lys Glu Gln Thr Pro Glu His Gly Lys Lys Lys Arg Gly Arg Gly Lys 340 345 350 Ala Gln Val Lys Ala Thr Asn Glu Ser Glu Asp Glu Ile Pro Gln Leu 355 360 365 Val Pro Ile Gly Lys Lys Thr Pro Ala Asn Glu Lys Val Glu Ile Gln 370 375 380 Lys His Ala Thr Gly Lys Lys Ser Pro Ala Lys Ser Pro Asn Pro Ser 385 390 395 400 Thr Pro Arg Gly Lys Lys Arg Lys Ala Leu Pro Ala Ser Glu Thr Pro 405 410 415 Lys Ala Ala Glu Ser Glu Thr Pro Gly Lys Ser Pro Glu Lys Lys Pro 420 425 430 Lys Ile Lys Glu Glu Ala Val Lys Glu Lys Ser Pro Ser Leu Gly Lys 435 440 445 Lys Asp Ala Arg Gln Thr Pro Lys Lys Pro Glu Ala Lys Phe Phe Thr 450 455 460 Thr Pro Ser Lys Ser Val Arg Lys Ala Ser His Thr Pro Lys Lys Trp 465 470 475 480 Pro Lys Lys Pro Lys Tyr Pro Ser Arg Pro Lys Val Ser Asp Ser Thr 485 490 495 Gly Arg Lys Pro Gln Cys Cys Leu Gln Ser Phe Leu Glu Ile Leu Arg 500 505 510 Ser Trp Pro Pro Leu 515 <210> 7 <211> 634 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gccagccctc ggaaacgcga agtgagcggc ggggtcgact gacggtaacg gggcagagag 60 gctgttcgca gagctgcgga agatgaatgc cagaggactt ggatctgagc taaaggacag 120 tattccagtt actgaacttt cagcaagtgg accttttgaa agtcatgatc ttcttcggaa 180 aggtttttct tgtgtgaaaa atgaactttt gcctagtcat ccccttgaat tatcagaaaa 240 aaatttccag ctcaaccaag ataaaatgaa tttttccaca ctgagaaaca ttcagggtct 300 atttgctccg ctaaaattac agatggaatt caaggcagtg cagcaggttc agcgtcttcc 360 atttctttca agctcaaatc tttcactgga tgttttgagg ggtaatgatg agactattgg 420 atttgaggat attcttaatg atccatcaca aagcgaagtc atgggagagc cacacttgat 480 ggtggaatat aaacttggtt tactgtaata gtgtgctgtt catggaaacc gagggctgca 540 tcttgtttat agtcatcttt gtactgtaat ttgatgtaca caacattaaa agtactgaca 600 cctgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 634 <210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Asn Ala Arg Gly Leu Gly Ser Glu Leu Lys Asp Ser Ile Pro Val 1 5 10 15 Thr Glu Leu Ser Ala Ser Gly Pro Phe Glu Ser His Asp Leu Leu Arg 20 25 30 Lys Gly Phe Ser Cys Val Lys Asn Glu Leu Leu Pro Ser His Pro Leu 35 40 45 Glu Leu Ser Glu Lys Asn Phe Gln Leu Asn Gln Asp Lys Met Asn Phe 50 55 60 Ser Thr Leu Arg Asn Ile Gln Gly Leu Phe Ala Pro Leu Lys Leu Gln 65 70 75 80 Met Glu Phe Lys Ala Val Gln Gln Val Gln Arg Leu Pro Phe Leu Ser 85 90 95 Ser Ser Asn Leu Ser Leu Asp Val Leu Arg Gly Asn Asp Glu Thr Ile 100 105 110 Gly Phe Glu Asp Ile Leu Asn Asp Pro Ser Gln Ser Glu Val Met Gly 115 120 125 Glu Pro His Leu Met Val Glu Tyr Lys Leu Gly Leu Leu 130 135 140
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８６ 45/00 43/00 １０５ ４Ｈ０４５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/32 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｋ 16/32 1/68 Ａ Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｍ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/574 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ｆ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 バージェス クリストファー シー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02090， ウェストウッド， キャントン テラス 97 (72)発明者 カティノ セオドア ジェー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02702， アッテルボロー， ジョー ポ ール ドライブ 18 (72)発明者 ドウィヴェディ プアナイム アメリカ合衆国 カリフォルニア， アラ モ， ペッブル ドライブ 2054 (72)発明者 リーヴァイス マルシア イー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02025， コへイセット， ホイールライ ト ファーム 67 (72)発明者 モリノ ゲイリー エイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02056， ノーフォーク， エセックス ストリート ３ (72)発明者 マイロウ スーザン エイチ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02421， レキシントン， エリソン ロ ード ５ (72)発明者 シアガリンガム アランザッシ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02420， レキシントン， ウインチェス ター ドライブ 26 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA61 CA04 4B029 AA07 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ08 QQ41 QQ79 QQ91 QR48 QR51 QR56 QR62 QR77 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA21 BA22 BA23 CA17 MA01 NA14 ZB212 ZB262 4C085 AA13 AA14 CC32 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的に精製されたオリゴヌクレオチド
    を含むプローブ／プライマーであって、該オリゴヌクレ
    オチドは、配列番号１、３、５、または７の配列に実質
    的に相補的な核酸とストリンジェント条件下にてハイブ
    リダイズするのに、十分な配列番号１、３、５または７
    の核酸配列の領域を含むプローブ／プライマー。
  2. 【請求項２】 実質的に精製されたオリゴヌクレオチド
    を含むプローブ／プライマーであって、該オリゴヌクレ
    オチドは、配列番号１、３、５、または７の配列とハイ
    ブリダイズするのに、十分な配列番号１、３、５または
    ７の配列に実質的に相補的な核酸配列の領域を含むプロ
    ーブ／プライマー。
  3. 【請求項３】 前記プローブ／プライマーは、配列番号
    １、３、５、または７、あるいはそれらに相補的な配列
    から選択される配列の少なくとも８個の連続ヌクレオチ
    ド領域を含む、請求項１または２に記載のプローブ／プ
    ライマー。
  4. 【請求項４】 固体支持体に結合された請求項１または
    ２に記載の複数のプローブ／プライマーを含むアレイ。
  5. 【請求項５】 検出可能な標識をさらに含む、請求項１
    または２に記載のプローブ／プライマー。
  6. 【請求項６】 前記標識は、放射性同位体、蛍光化合
    物、酵素および酵素補因子からなる群から選択される、
    請求項５に記載のプローブ／プライマー。
  7. 【請求項７】 配列番号２、４、６、または８から選択
    される配列を含むポリペプチドに免疫反応性を示す抗
    体。
  8. 【請求項８】 配列番号１、３、５、または７から選択
    される核酸配列によりコードされる配列を含むポリペプ
    チドに免疫反応性を示す抗体。
  9. 【請求項９】 アンチセンスオリゴヌクレオチド類縁体
    であって、配列番号１、３、５、または７の配列に実質
    的に相補的な核酸と、ストリンジェント条件下にてハイ
    ブリダイズするのに十分な配列番号１、３、５、または
    ７の核酸配列の領域を含む類縁体。
  10. 【請求項１０】 アンチセンスオリゴヌクレオチド類縁
    体であって、配列番号１、３、５、または７の配列とハ
    イブリダイズするのに、十分な配列番号１、３、５、ま
    たは７の配列に実質的に相補的な核酸配列の領域を含む
    類縁体。
  11. 【請求項１１】 前記類縁体は、配列番号１、３、５、
    または７、あるいはそれらに相補的な配列から選択さ
    れ、ヌクレア−ゼによる切断に耐性である配列の少なく
    とも８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項９また
    は１０に記載の類縁体。
  12. 【請求項１２】 患者から単離した細胞試料中の、配列
    番号１、３、５、または７の核酸にストリンジェント条
    件下にてハイブリダイズする核酸レベルを測定するため
    の、請求項５に記載のプローブ／プライマーを含む、形
    質転換細胞の表現型を決定するための試験キット。
  13. 【請求項１３】 配列番号１、３、５、または７、ある
    いはそれらに相補的な配列のいずれか１つによりコード
    されるタンパク質に特異的な抗体を含む、形質転換細胞
    の表現型を決定するための試験キット。
  14. 【請求項１４】 配列番号１、３、５、または７の少な
    くとも１つの核酸核酸配列の差次的発現を、正常細胞に
    比較して検出することを含む、細胞の表現型を確定する
    方法であって、核酸は少なくとも０．５倍差次的に発現
    される方法。
  15. 【請求項１５】 試料中の細胞の表現型を決定する方法
    であって；（ａ）配列番号１、３、５、または７、ある
    いはそれらに相補的な配列のいずれか１つの少なくとも
    ８個の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含
    む核酸プローブを準備すること、（ｂ）癌であると疑わ
    れる細胞を含有する、患者からの第１の試料を準備する
    こと、（ｃ）実質的に非癌性である細胞を含有する、患
    者からの第２の試料を準備すること、（ｄ）該第１およ
    び第２の試料各々と、ストリンジェント条件下にて該核
    酸プローブを接触させること、および（ｅ）（ｂ）該第
    ２の細胞試料のｍＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼ
    ーションの量と、（ａ）該第１の細胞試料のｍＲＮＡと
    のプローブのハイブリダイゼーションの量を比較するこ
    ととを含み、患者からの試料中の細胞の表現型を決定す
    る方法であって、第１の試料のｍＲＮＡとプローブとの
    ハイブリダイゼーションの量と第２の試料のｍＲＮＡと
    プローブとのハイブリダイゼーションの量とを比較する
    工程を含み、第２の試料のハイブリダイゼーションの量
    と比較した第１の試料のｍＲＮＡのハイブリダイゼーシ
    ョンの量における少なくとも約０．５倍の差異が、第１
    の試料中の細胞の表現型を表わす、細胞の表現型を決定
    する方法。
  16. 【請求項１６】 配列番号１、３、５、または７、ある
    いはそれらに相補的な配列のうちの１つを含む核酸によ
    ってコードされる少なくとも１つのタンパク質の、正常
    細胞に比較した、差次的発現を検出することを含み、該
    タンパク質は、少なくとも約０．５倍差次的に発現され
    る、細胞の表現型を決定する方法。
  17. 【請求項１７】 タンパク質の前記差次的発現は、イム
    ノアッセイにて検出される、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 配列番号１、３、５、または７のうち
    の１つに、ストリンジェント条件下にてハイブリダイズ
    する核酸の、細胞における存在または非存在を確認する
    方法であって、請求項５に記載のプローブと該細胞を接
    触させることを含む方法。
  19. 【請求項１９】 配列番号１、３、５、または７、ある
    いはそれらに相補的な配列のうちの１つを含む核酸によ
    りコードされるポリペプチドの、細胞における存在また
    は非存在を確認方法であって、細胞と請求項７に記載の
    抗体とを接触させ、該ポリペプチドとの該抗体の反応を
    検出することを含み、検出される該ポリペプチドの存在
    または量が、癌の存在を示す方法。
  20. 【請求項２０】 配列番号１、３、５、または７、ある
    いはそれらに相補的な配列のうちの１つにおける突然変
    異を検出する方法であって、 （ａ）患者から試料を収集すること、 （ｂ）該試料を、核酸のハイブリダイゼーションおよび
    増幅が起こるような条件下にて、配列番号１、３、５、
    または７の核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つ
    以上のプライマーと接触させること、および （ｃ）正常試料の増幅産物と、増幅産物の存在、非存
    在、または量を比較することを含む、方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号１、３、５、または７の１つ
    またはそれ以上の少なくとも８個の連続核酸から構成さ
    れる核酸配列を含むプローブを用いて癌を検出する方法
    であって、 （ａ）患者から試料を収集すること、 （ｂ）該試料を、核酸のハイブリダイゼーションおよび
    増幅が起こるような条件下にて、配列番号１、３、５、
    または７の核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つ
    以上のプライマーと接触させること、および （ｃ）正常細胞の増幅産物と、増幅産物の存在、非存
    在、または量を比較することを含む、方法。
  22. 【請求項２２】 前記癌は結腸癌である、請求項２１に
    記載の方法。
  23. 【請求項２３】 患者試料において癌を検出する方法で
    あって、該試料と、配列番号２、４、６、または８の１
    つまたはそれ以上の少なくとも一部を含むアミノ酸配列
    を有するポリペプチドに、抗体を接触させることと、該
    ポリペプチドとの該抗体の反応を検出することを含み、
    検出される該ポリペプチドの存在または量が、癌の存在
    を示す方法。
  24. 【請求項２４】 前記癌は結腸癌である、請求項２３に
    記載の方法。
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