JP2003125785A - ブタＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ）レセプターをコードする断片およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ブタＴＳＨ(Thyroid-stimulating hormone)レ
セプターをコードするＤＮＡ断片およびその用途を提供
する。 【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列、配列番号２で示される塩基配列、また
はこれらの配列において、１個もしくは数個の塩基が欠
失、置換、挿入または付加された配列、あるいはこれら
のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡであって、かつブタ由来ＴＳＨレセプターを
コードするＤＮＡ断片に関する。さらに、本発明は、上
記いずれかのＤＮＡ断片をプラスミドもしくはファージ
に挿入して調製した発現ベクター、及び当該発現ベクタ
ーを用い、宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体
を培養して得られる組換えブタＴＳＨレセプターおよび
その製造法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ブタＴＳＨ(Thyroid-s
timulating hormone)レセプターをコードするＤＮＡ断
片およびその用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】甲状腺刺激ホルモンレセプター（Thyroi
d-Stimulating Hormone Receptor;以下ＴＳＨレセプタ
ーとする）は甲状腺細胞膜上に存在する甲状腺刺激ホル
モン（ＴＳＨ）の受容体である。甲状腺の代表的な疾患
であるグレ−ブス(Graves)病〔バセドウ(Basedow)病〕
は、甲状腺機能が亢進する疾患であり、ＴＳＨレセプタ
ーに対する自己抗体が原因となって発症するとされてい
る。

【０００３】ＴＳＨレセプターに対する自己抗体には、
ＴＳＨレセプターに結合して甲状腺刺激活性を示す抗体
（甲状腺刺激抗体）とＴＳＨレセプターに結合してＴＳ
ＨのＴＳＨレセプターに対する刺激活性を妨げる抗体
（甲状腺刺激阻害抗体）の少なくとも２種類の異なった
活性を持つ抗体が存在していることが知られている。Ｔ
ＳＨレセプターに対する自己抗体の測定は、グレ−ブス
病の診断、病勢把握、病因解析などに利用されており、
測定原理により大きく２つに分類することができる。

【０００４】すなわち、１つの方法は、可溶化ブタ甲状
腺細胞膜画分に患者血清とアイソト−プ標識したＴＳＨ
を加えて反応させ、被検血清中のＴＳＨレセプター自己
抗体による標識化ＴＳＨのＴＳＨレセプターへの結合阻
害率をＴＳＨレセプター自己抗体値として測定する方法
（Methods in Enzymology，74，405〜420(1981)、Endoc
r.Rev.,9,106-120,(1988)）である。

【０００５】また、他の方法は、ポリエチレングリコ−
ル処理により分画した被検血清を測定サンプルとし、こ
れをブタ甲状腺細胞に反応させると、サンプル中の甲状
腺刺激抗体（ＴＳＡｂ）がブタ甲状腺細胞膜上のＴＳＨ
レセプターに結合して細胞中のアデニレートシクラーゼ
が活性化されてｃＡＭＰが産生されるので、被検血清と
コントロール血清におけるｃＡＭＰ産生量の比率からＴ
ＳＡｂ活性を算出する方法（Endoclin.Vol.125,No.1,pp
410-(1985)）である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
方法で使用するブタ由来の甲状腺細胞あるいはその膜画
分の調製は必ずしも簡便とはいえなかった。たとえば、
屠殺したブタより甲状腺組織を取得し、さらに組織をコ
ラゲナ−ゼおよびトリプシン処理により細胞を個々に分
離させた後に凍結させて保存し、これを解凍させてアッ
セイに用いていた。また、細胞調製に用いるブタの個体
差、処理操作時の状況、保存状態等により細胞のロット
間に差が生じる可能性も否定できなかった。

【０００７】このため、組換えＴＳＨレセプターを用い
ることができれば、ＴＳＨレセプターに対する自己抗体
測定のための試薬あるいはキットの調製が簡便になり、
ロット差を生じる危険性も小さくできることが期待され
る。特に、ヒトやイヌ等由来の組換えＴＳＨレセプター
を使用するよりも、ブタ由来の組換えＴＳＨレセプター
を使用した方が、従来法による測定値との解離が少ない
と考えられるため、組換えＴＳＨレセプターとしてはブ
タ由来のものを使用するのが好ましいと考えられてい
た。

【０００８】しかしながら、ヒトやイヌなどのＴＳＨレ
セプター遺伝子に関する報告および当該遺伝子を含むウ
イルスを用いてＣＨＯ細胞やミエローマ細胞を形質転換
し、これら細胞を培養することでヒトＴＳＨレセプター
などを生産する試みは報告されているものの（特表平４
−５０６７５２、特表平５−５０４６８３など）、ブタ
由来のＴＳＨレセプターに関しては、当該レセプターを
コードする遺伝子の解析はもとより、そのアミノ酸配列
さえ報告されていないのが現状である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、ブタ
甲状腺細胞由来のＴＳＨレセプターをコードする遺伝子
をクローニングすべく、ウシ、ヒツジ、ヒト、マウス、
ラット由来の甲状腺ＴＳＨレセプター遺伝子配列をもと
にプライマーを作製し、ブタ甲状腺細胞のＲＮＡを鋳型
にして合成したｃＤＮＡをスクリーニングした結果、ア
ミノ酸７６４個、分子量８６，６４１のタンパク質をコ
−ドする遺伝子を見出し、当該遺伝子の塩基配列は、公
知の動物由来のＴＳＨレセプター遺伝子と類似している
ことを確認した。さらに、この遺伝子を発現させ、その
機能を確認した結果、当該遺伝子はブタＴＳＨレセプタ
ーをコードする遺伝子であることを確認し、得られた組
換えブタＴＳＨレセプターがＴＳＨレセプターに対する
自己抗体の測定に使用できることを見出し、本発明を完
成させた。

【００１０】したがって、本発明は、配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ
酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、
置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるブタ
ＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片に関するもの
である。

【００１１】また、本発明は、配列番号２で示される塩
基配列、または配列番号２で示される塩基配列におい
て、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または
付加された塩基配列を有し、あるいはこれらのＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
であって、かつブタ由来ＴＳＨレセプターをコードする
ＤＮＡ断片に関するものである。

【００１２】さらに、本発明は、上記いずれかのＤＮＡ
断片をプラスミドもしくはファージに挿入して調製した
発現ベクター、及び当該発現ベクターを用い、宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を培養して得られる
組換えブタＴＳＨレセプターおよびその製造法に関する
ものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、配列番号１で示される
アミノ酸配列からなるブタＴＳＨレセプターをコードす
るＤＮＡ断片に関するものである。配列番号１で示され
るアミノ酸配列からなるレセプターは、ＴＳＨレセプタ
ー活性を維持する限りにおいて、配列番号１で示される
アミノ酸配列に限定されるものではなく、配列番号１に
示されるアミノ酸配列における１個もしくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換、修飾または付加されたアミノ酸配列
であってもかまわない。

【００１４】本発明のＤＮＡ断片を塩基配列をもって例
示すれば、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片を挙げることができる。配列番号２で示される塩
基配列を有するＤＮＡ断片は、後述の実施例に詳述する
ように、ブタ甲状腺細胞のＲＮＡを鋳型として合成した
ｃＤＮＡから調製されたものであって、図１の塩基番号
５４〜２３４５番目で示される配列と同一のものであ
り、ＴＳＨレセプターの構造遺伝子に相当する。

【００１５】本発明においては、ブタＴＳＨレセプター
を産生することができる限りにおいて、配列番号２で示
される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、
置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはそれら
のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡ断片も利用することができる。なお、こ
こでいうストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るとは、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．
７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの
水に溶解させたもの）、０．１％ｗ／ｖ Ｎ−ラウロイ
ルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％ ｗ／ｖ ＳＤ
Ｓ、０．５％ ｗ／ｖブロッキング試薬を含む溶液を用
い、６０℃で２０時間程度ハイブリダイゼーション反応
を行ったときにハイブリダイズすることを意味する。

【００１６】本発明のＤＮＡ断片の調製、すなわち、動
物組織より抽出・精製したＲＮＡを鋳型として合成した
ｃＤＮＡからの目的遺伝子のクローニング、クローン化
したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、および発
現ベクターを用いた組換えＴＳＨレセプターの生産など
は、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の
技術であり、具体的には、例えば、「Molecular Clonin
g」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratorie
s, Cold Spring Harbor、New York(1982））に記載の方
法に従って行うことができる。

【００１７】例えば、まず、既にクロ−ニングされてい
る類似の遺伝子の配列を参考にプライマーを合成する。
具体的には、ウシ、ヒツジ、ヒト等のＴＳＨレセプター
遺伝子は既にクロ−ニングされているので（Biochemica
l and Biophysical ResearchCommunications,165,1184
(1984)等を参照）、それらの配列をそのまま用いてプラ
イマーを合成しても良いし、公知動物のＴＳＨレセプタ
ー遺伝子どうしを比較し、共通部分の塩基配列を用いて
プライマーを合成してもよい。

【００１８】次に、合成したプライマーをプローブとし
て、ブタ甲状腺細胞から抽出したＲＮＡを鋳型として合
成したｃＤＮＡ（もしくはｃＤＮＡから公知の方法で作
製されたｃＤＮＡライブラリ−）よりＴＳＨレセプター
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニン
グする。クローニングの方法としては、公知の方法、例
えば、アミノ酸配列にもとづいて化学合成したオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いたプラークまたはコロ
ニーハイブリダイゼーション法〔Molecular Cloning，C
old Spring Harbor Laboratory,(1982)〕等が挙げられ
る。

【００１９】このようにして得られたＤＮＡの塩基配列
は、公知の方法、例えばMaxam-Gilbert法（Pro. Natl.
Acad.Sci., U.S.A. 74,560(1977)）、ジデオキシ法（Nu
cl.Acids. Res.,9,309(1981)）、あるいはデアザ法（Nu
cl. Acids. Res.,14,1319(1986)）などによって決定す
る。

【００２０】決定した塩基配列もしくはそこから推定さ
れるアミノ酸配列を、公知の動物由来ＴＳＨレセプター
のそれと比較することにより、ブタ由来のＴＳＨレセプ
ターをコ−ドするＤＮＡ断片の存在を確認する。上述の
方法を繰り返し行うことにより、ブタＴＳＨレセプター
遺伝子の塩基配列を決定する。

【００２１】遺伝子の両端、つまり５’周辺、Ｎ末端、
Ｃ末端あるいは３’周辺の領域はＰＣＲのプライマーの
設定が困難なため、上述の方法では塩基配列が決定でき
ない場合が多い。そのような場合には、これらの領域の
配列は、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法（宝酒造
（株）製の3'-Full RACE Core Set及び5'-Full RACE Co
re Set等）を用いることにより決定することができる。

【００２２】ＴＳＨレセプターの調製は、プロモーター
等を保有する公知のプラスミドもしくはファージに、上
記クローン化したＴＳＨレセプター遺伝子を挿入して発
現ベクターを調製し、該発現ベクターを用いて形質転換
した細胞（CHO、COSなどの哺乳類由来細胞もしくはSf
9、Sf21等の昆虫細胞等）を自体公知の方法に従って培
養し、ＴＳＨレセプターを産生させる方法をあげること
ができる（例えば、Biochemical and Biophysical Rese
arch Communications Vol.165,No.3,1250-1255(1989)、
特表平４−５０６７５２、J.Immunol.158,2798-2804(19
97)などを参考）。

【００２３】調製した培養物から、膜分離あるいは遠心
分離処理などによりＴＳＨレセプターが産生した細胞を
回収する。回収した細胞はそのまま抗ＴＳＨレセプター
抗体の測定に使用することもでき、また、超音波処理等
により細胞を破砕し、遠心分離、ゲルろ過等を行い種々
の夾雑物を分離後、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、
各種クロマトグラフィー処理等を数種組み合わせて単離
精製し、該測定に使用することもできる。

【００２４】

【発明の効果】本発明者によって、初めてブタ由来ＴＳ
ＨレセプターをコードするＤＮＡ断片を特定することが
でき、このようなＤＮＡ断片を用いて調製した組換えビ
タＴＳＨレセプターは、抗ＴＳＨレセプター抗体測定に
有用である。特に、通常のブタ甲状腺細胞を用いた従来
法と比較すると、組換えビタＴＳＨレセプターを用いた
方がｃＡＭＰの産生量が高く、より高感度に測定可能で
ある。

【００２５】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本願発明が実施例に限定されないことは明らか
である。

【００２６】実施例１：ブタＴＳＨレセプター遺伝子の
塩基配列の決定 （１）プライマー 図２に示すように、既にクローン化されているヒト、ウ
シ、ヒツジ、イヌ、マウス及びラットのＴＳＨレセプタ
ー遺伝子の塩基配列を比較して、２０〜３０塩基の範囲
において５種類の動物でほぼ１００％保存されている領
域を選び、５’プライマーを３種類、３’プライマーを
３種類、合計６種類のプライマーを合成した。５’プラ
イマーにはプライマー番号として奇数を、３’プライマ
ーには偶数を用いた。また、対応箇所として、各プライ
マーがヒトＴＳＨレセプター遺伝子のどの箇所に対応し
ているかを、開始コドンＡＴＧのＡを＋１として表し
た。

【００２７】 プライマー１：5'-GACTTCAGAGTCACCTGCAAGG -3' （22塩基、対応箇所+106〜+127、GC含量54.5%） プライマー２：5'-CAGATGCCAAACTTGCTGAG -3' （20塩基、対応箇所+2074〜+2093、GC含量50.0%） プライマー3：5' -ATGGGCTACAAGTTCCTGAG -3' （20塩基、対応箇所+1234〜+1253、GC含量50.0%） プライマー4：5'-GCCAGTCGATGGCATGGTTGT -3' （21塩基、対応箇所+1445〜+1465、GC含量57.1%） プライマー5：5'-CTGGATGCTGTTTACCTGAAC -3' （21塩基、対応箇所+604〜+624、GC含量47.6%） プライマー6：5'-GGATTCCTCTGATTTTCTTCTG -3' （22塩基、対応箇所+865〜+886、GC含量40.9%）

【００２８】（２）ブタ甲状腺細胞からのＲＮＡの調製 ブタ甲状腺組織をコラゲナ−ゼおよびトリプシン等のプ
ロテア−ゼで処理して個々の細胞に分散させた。約６ｇ
のブタ甲状腺細胞を初発材料として、ＡＧＰＣ法（実験
医学（羊土社）Vol.9 No.15 p99(1991)、バイオ実験イ
ラストレイテッド（秀潤社）第2巻 p161）によってＲＮ
Ａを調製した。この結果、１．７５ｍｇの全ＲＮＡが得
られた。さらにOligotex-dT30（宝酒造（株）製）を用
いてこの全ＲＮＡよりｍＲＮＡを精製した。この結果、
約４０ｍｇのｍＲＮＡが得られ、ＯＤ₂₆₀／ＯＤ₂₈₀値は
１．７５８であった。

【００２９】（３）ＰＣＲ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ^TMＫｉｔ （ＡＭＶ） ｖｅｒ．
１．１（宝酒造（株）製）を用いて、ブタ甲状腺細胞よ
り調製した全ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。
逆転写反応のプライマーはOligo dT-Adaptor primer
（キットに添付）を、酵素はAvian Myeloblastosis Vir
us由来のRiverse transcriptaseを使用し、反応は５５
℃、３０分間行った。

【００３０】次に、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、前述
のプライマーを、No.1とNo.6、No.3とNo.2、No.5とNo.4
をペアにしてＰＣＲを行った。ＰＣＲによる遺伝子の増
幅は、熱変性（９４℃、３０秒）、アニ−リング（５５
℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）のステップを５
０回繰り返すことにより行った。

【００３１】ヒトＴＳＨレセプター遺伝子の塩基配列か
ら計算すると、プライマー１とプライマー６の場合は７
８１塩基、プライマー３とプライマー２の場合は８６４
塩基、プライマー５とプライマー４の場合は８６２塩基
の大きさの断片が増幅されることが予想される。ＰＣＲ
で増幅された３つのＤＮＡ断片を各々アガロ−ス電気泳
動を行ったところ、予想と一致する大きさのＤＮＡ断片
が検出された。それぞれのＤＮＡ断片をアガロ−ス電気
泳動により分離し、その断片を含む箇所をＤＮＡＣＥＬ
Ｌ（第一化学薬品製）を用いて回収・精製した。精製し
たＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、対応するアミノ酸配
列を推定し、他の動物由来の塩基配列およびアミノ酸配
列と比較したところ、良く似ていることが示された。そ
こで、得られた塩基配列をもとに、さらに下記のプライ
マーを合成して上記と同様にＰＣＲを行い、ＴＳＨレセ
プター構造遺伝子のほぼ全領域の塩基配列を決定した。

【００３２】 プライマー9 5'-CACTGACTTCATGTGCATGGC-3' (21塩基、対応箇所+1893〜+1913、52.4%) プライマー10 5'-GGACTGTGATTCCAGCTGCTG-3' (21塩基、対応箇所+268〜+288、57.1%) プライマー11 5'-GACATCAATCCCTGCGAATGC-3' (21塩基、対応箇所+492〜+512、52.4%) プライマー13 5'-GTGAATGCTGTAAATGGTCCC-3' (21塩基、対応箇所+943〜+963、47.6%) プライマー15 5'-ACGCCTACGCCATCATGGCTG-3' (21塩基、対応箇所+1610〜+1630、61.9%) プライマー16 5'-AACAGCATCCAGCTTTGTCCC-3' (21塩基、対応箇所+595〜+615、52.4%) プライマー18 5'-GTCGTAATGGCTGTCAAAGGC-3' (21塩基、対応箇所+1138〜+1158、52.4%) プライマー20 5'-AGAGGAGTCTCAGTGTCCATG-3' (21塩基、対応箇所+1713〜+1733、52.4%)

【００３３】（４）Ｃ末端及び３’周辺領域の塩基配列
の決定 構造遺伝子の両側にあたる５’および３’周辺領域に関
しては、比較した動物間でアミノ酸をコ−ドしている領
域とは異なっていた。得られた構造遺伝子の塩基配列が
比較的ヒト、マウス、ラットに比べてウシやヒツジに近
い傾向が観察されたため、ウシもしくはヒツジの塩基配
列をもとに、３’周辺領域に対応するプライマーの設定
を行った。

【００３４】 プライマー12 5'-CAGCCTAAGTCCTTGTACCACTTA-3' （24塩基、GC含量45.8%） プライマー14 5'-GTGTCGATGGTTGGAATGATGCTC-3' (24塩基、GC含量50.0%) 上記の２つの３’プライマーを上記のプライマー９およ
びプライマー１５と組み合わせてＰＣＲを行ったとこ
ろ、プライマー１４を用いた時に予想される大きさのＤ
ＮＡ断片の増幅が観察された。プライマー９とプライマ
ー１４を用いて得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し
たところ、得られたブタＴＳＨレセプター遺伝子のＣ末
端領域の塩基配列と一致する箇所が存在し、該遺伝子由
来であることが示された。これにより、Ｃ末端領域およ
びその下流の塩基配列が明らかになった。

【００３５】（５）Ｎ末端領域および５’周辺領域の塩
基配列の決定 ３’周辺領域の塩基配列を決定した時と同様に、ウシも
しくはヒツジ由来の塩基配列を参考にして５’周辺領域
に３種類の５’プライマーを設定した。

【００３６】 プライマー7 5'-ATCGCCGAGCACGCAGAGGTAG-3' (22塩基、GC含量63.6%) プライマー17 5'-ATGAGAGGGAGGCGATC-3' (17塩基、GC含量58.8%) プライマー19 5'-GGGCCCGGAGGACGATG-3' (17塩基、GC含量76.5%)

【００３７】ｃＤＮＡを鋳型として上記プライマーを
５’プライマーとして、これに対する３’プライマーと
してプライマー１０および１６を用いてＰＣＲを行った
が、明確に増幅されるＤＮＡ断片は検出されなかったた
め、cDNA PCR Library KitおよびcDNA Synthesis kit
（いずれも宝酒造（株）製）を用いてcDNA PCR Library
の作製を行った。作製したブタ甲状腺細胞由来cDNA PCR
Libraryを鋳型として、５’プライマーとしてＣＡプラ
イマー（cDNA PCR Library Kitに添付）を、３’プライ
マーとしてプライマー２０を用いてＰＣＲを行った。Ｐ
ＣＲ反応液をアガロ−ス電気泳動に供し、ゲルより約１
５００塩基以上のＤＮＡ断片を回収・精製した。

【００３８】この調製したＤＮＡを鋳型として、さらに
ＣＡプライマーおよびプライマー１６を用いてＰＣＲを
行い、得られたＤＮＡ断片を鋳型として、ＣＡプライマ
ーとプライマー１０を用いてＰＣＲを行ったところ、ほ
ぼ予想される大きさのＤＮＡ断片の増幅が観察された。
ＤＮＡ断片を回収・精製し、塩基配列を決定したとこ
ろ、既に明らかになっているプライマー１０より上流の
塩基配列が検出され、この断片がＴＳＨレセプター遺伝
子由来であることが示された。これにより、ＴＳＨレセ
プター遺伝子のＮ末端領域とＡＴＧ開始コドンより５３
塩基上流までの塩基配列が明らかになった。

【００３９】実施例２：ブタＴＳＨレセプター遺伝子の
クロ−ニング 上記で明らかになった塩基配列をもとに、５’周辺領域
に対応する５’プライマーであるプライマー２１と、
３’周辺領域に対応する３’プライマーであるプライマ
ー２２を設計・合成した。

【００４０】 プライマー21 5'-GCTGAAGATGAAGAGATAGCC-3' (21塩基、対応箇所-18〜-38、GC含量47.6%) プライマー22 5'-CTAAGACACCAGCCTAAGTCC-3' (21塩基、対応箇所+2312〜+2332、GC含量52.4%)

【００４１】ブタ甲状腺細胞より調製したｍＲＮＡを鋳
型として、Oligo dT-アダプタ− プライマー（cDNA PCR
Library Kitに添付）、Avian Myeloblastosis Virus由
来のRiverse transcriptaseを用いてｃＤＮＡを合成し
た。さらにこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー２１
及びプライマー２２を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応は、熱変性（９８℃、１０秒）、アニ−リング
（５５℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、２分）のステ
ップを２５回繰り返すことにより行った。増幅したＴＳ
Ｈレセプター遺伝子（ｃＤＮＡ）はアガロ−ス電気泳動
により分離し、回収・精製した。

【００４２】精製したＴＳＨレセプター遺伝子断片を、
パ−フェクトリ− ブラント クロ−ニング キット（Nov
agen社製、宝酒造（株）販売）を用いてプラスミドへク
ローン化した。得られたＴＳＨレセプター遺伝子の塩基
配列は、上記で決定された塩基配列と同一であり、変異
は起こっていなかった。

【００４３】実施例３：組換えブタＴＳＨレセプターの
調製 （１）クロ−ン化したブタＴＳＨレセプタ−遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）のｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔへの組み込み クロ−ン化したブタ甲状腺組織由来のＴＳＨレセプタ−
ｃＤＮＡを鋳型とし、下に示したプライマー２３（ＴＳ
Ｒ３７）とプライマー２４（ＴＳＲ２２）を用いて常法
に従いＰＣＲを行った。 プライマー２３ 5'-GCC CGG CCA CCA TGG GTC TGA CGC
CC-3' プライマー２４ 5'-CTA AGA CAC CAG CCT AAG TCC-3'

【００４４】増幅されたＰＣＲ断片をＴＳＨＲ３７／２
２と名付けた。ＴＳＨＲ３７／２２は、アガロ−ス電気
泳動を行って同ＤＮＡ断片を分離・切り出した後にＤＮ
ＡＣＥＬＬにより回収・精製した。得られたＴＳＨＲ３
７／２２をｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ｋｉｔ （ストラタジ−ン社）を用いて、ｐＣ
ＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔへクロ−ン化し、得られたプラスミ
ドをｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲと名付けた。なお、クローニ
ングの方法はキットに付随している説明書にしたがって
行った。

【００４５】（２）ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲのＣＨＯ−Ｋ
１細胞へのトランスフェクション及びＧ−４１８耐性株
の単離 リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて
ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲＤＮＡをＣＨＯ−Ｋ１細胞（第日
本製薬）へ導入した。トランスフェクション方法はリポ
フェクトアミンに付随している説明書にしたがって行っ
た。トランスフェクション操作後、処理した細胞を４８
時間Ｈａｍ'ｓＦ−１２培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で
培養した。トリプシン処理によってＣＨＯ細胞をプレ−
トから剥がした後、１０分の１量の細胞を新たにＧ−４
１８（ゲンタマイシン誘導体、１６０ｍｇ／Ｌ）を添加
した培地に植え継ぎ培養を行った。

【００４６】２〜３日ごとに培地を交換し、死滅した細
胞を除き、Ｇ−４１８存在下で生育する細胞の培養を続
けた。ある程度Ｇ−４１８を含む培地で細胞が生育した
ら、トリプシン処理によってトランスフェクトしたＣＨ
Ｏ細胞を剥がし、細胞数を計測した。細胞濃度に応じて
Ｇ−４１８添加培地で段階的に希釈を行い、それぞれの
希釈液を９６ｗｅｌｌプレ−トで培養した。さらに２〜
３日後に顕微鏡で観察し、１つのｗｅｌｌに１個のコロ
ニ−しかないものを探し、１１株ほど単離した。この単
離した１１株を培養し、ある程度ｗｅｌｌの底面に覆う
ように生育した段階で、トリプシン処理によって剥がし
て直径１００ｍｍのプレ−トに植え継ぎ培養を続けた。

【００４７】（３）ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲを導入された
ＣＨＯ細胞（トランスフェクタント）の探索 単離した１１個のＧ−４１８耐性ＣＨＯ細胞株を直径２
２ｍｍのｗｅｌｌに２５，０００個／ｗｅｌｌになるよ
うにそれぞれを植え継いで培養した。３日間培養後、培
地を除去し、各ｗｅｌｌに０．５ｍｌの下記組成のＢｉ
ｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（以下、単にＢｉｎｄｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒという）を添加した。さらに５mｌのＩ
^１２５ラベルしたウシ由来ＴＳＨ（以後Ｉ^１２５−ｂＴ
ＳＨと表記）を添加して３７℃で２時間インキュベ−シ
ョンした。

【００４８】インキュベ−ション後、培地を除去し、さ
らに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅ
ｒで１回洗浄した。洗浄後に各ｗｅｌｌに０．５ｍｌの
Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｎ ＮａＯＨ，１％
ＳＤＳ、以下、単にＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒという）
を加えて底面に付着している細胞を可溶化した。可溶化
した細胞を試験管に回収後、さらにｗｅｌｌに０．５ｍ
ｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて洗
浄した。可溶化細胞液とこの洗浄液を合わせてg−カウ
ンタ−でＴＳＨレセプタ−に結合したＩ^１２５−ｂＴＳ
Ｈ量を計測した。なお、コントロ−ルとしてｐＣＭＶ−
Ｓｃｒｉｐｔをトランスフェクトした細胞４株も同様に
培養・検討を行った。この結果を下記表１に示す。

【００４９】表１から明らかなように、ｐＣＭＶ−Ｓｃ
ｒｉｐｔ ｃＤＮＡをトランスフェクションした４株の
結合量（ｃｐｍ）が基準値（ｂａｓａｌ ｌｅｖｅｌ）
と考えられるため、これよりも明らかに高い結合量を示
すｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲトランスフェクタント Ｎｏ．
２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．
７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９及びＮｏ．１１の計９株が、Ｔ
ＳＨレセプタ−を発現していることが示唆された。この
中からより高い結合を示したＮｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎ
ｏ．６及びＮｏ．８株を選び、さらに検討した。

【００５０】

【表１】 なお、表中、ＰｏｒｃｉｎｅはｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲ
を、ＳｃｒｉｐｔはｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔをそれぞれ
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞株を示す。

【００５１】 Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒの組成（ｇ／Ｌ） ＫＣｌ ０．４０ ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．０６ ＮａＨＣＯ_３ ０．３５ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ０．０４８ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ １．００ Ｓｕｃｒｏｓｅ ９５．８４ Bovine Serum Albumin （ＢＳＡ） ２．５

【００５２】（４）ＣＨＯ／ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲトラ
ンスフェクタントの確認 ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲトランスフェクタント Ｎｏ．
３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８の計４株（以後、そ
れぞれＰ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ８と表記）とコントロ−ル
としてｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔトランスフェクタントＮ
ｏ．１と２株（以後、Ｃ１、Ｃ２と表記）を用いて、Ｉ
^１２５−ｂＴＳＨとの結合およびアイソト−プで修飾さ
れていないｂＴＳＨ（ｃｏｌｄ ｂＴＳＨ）添加による
Ｉ^１２５−ｂＴＳＨ結合阻害効果の検討を行った。

【００５３】すなわち、直径１００ｍｍのプレ−トへ５
×１０^５ｃｅｌｌｓ／プレ−トになるように各トランス
フェクタントを植え継いだ。３７℃で３日間ＣＯ_２イン
キュベ−タ−で培養した。培養後培地を除去し、４ｍｌ
の３７℃で保温していたＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ
に置換した。これに４０mｌのＩ^１２５−ｂＴＳＨを添
加して３７℃で２時間インキュベ−ションして結合を検
討した。さらにこの他に２０mｌのｃｏｌｄＴＳＨ（５
０ｍＩＵ／ｍｌ）添加によるＩ^１２５−ｂＴＳＨの結合
阻害も検討した。なお、何れの試験も２連で行った。ま
た。コントロ−ルのＣ１，Ｃ２株は結合のみ検討した。

【００５４】インキュベ−ション後、培地を除去し、さ
らに２ｍｌの氷冷Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒで１回洗
浄した。これに２ｍｌのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添
加してプレ−ト底面に付着している細胞を可溶化し回収
した。さらに１ｍｌの氷冷Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅ
ｒで洗浄した。これら細胞可溶化液と洗浄液を合わせて
g−カウンタ−でＩ^１２５量を計測し、その結果を下記
表２に示す。なお、表２における（−）はｃｏｌｄ ｂ
ＴＳＨ無添加を、（＋）は添加を示している。したがっ
て、（−）ではＩ^１２５−ｂＴＳＨとの結合能を、
（＋）ではｃｏｌｄ ＴＳＨ添加による阻害効果を表し
ている。表２の結果から、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６及びＰ８の
各トランスフェクタントは、コントロ−ルに比べて有意
にＩ^１２５−ｂＴＳＨとの結合能が高く、またその結合
がｂＴＳＨの添加によって阻害されるため、トランスフ
ェクションしたｐｏｒｃｉｎｅＴＳＨＲ遺伝子が発現し
ていることが明らかとなった。

【００５５】

【表２】

【００５６】（５）リガンド（Ｉ^１２５−ｂＴＳＨ）と
の結合能の検討 Ｐ６及びＣ１株を直径２２ｍｍのｗｅｌｌに２５，００
０個／ｗｅｌｌになるようにそれぞれを植え継いで培養
した。３日間培養後、培地を除去し、各ｗｅｌｌに０．
５ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加した。さ
らに５段階（２、４、６、１０及び２０mｌ）にＩ
^１２５−ｂＴＳＨ量を分けて添加して３７℃で２時間イ
ンキュベ−ションした。

【００５７】インキュベ−ション後培地を除去し、さら
に０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ
で１回洗浄した。洗浄後に各ｗｅｌｌに０．５ｍｌのＬ
ｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えて底面に付着している細
胞を可溶化した。可溶化した細胞を試験管に回収後、さ
らにｗｅｌｌに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇｂ
ｕｆｆｅｒを加えて洗浄した。可溶化細胞液とこの洗浄
液を合わせてg−カウンタ−でＴＳＨレセプタ−に結合
したＩ^１２５−ｂＴＳＨ量を計測し、その結果を表３に
示した。なお、何れの試験も２連で行った。

【００５８】表３から明らかなように、Ｐ６の結合量
は、添加Ｉ^１２５−ｂＴＳＨ量が１０mｌ（＝約３００
０ｃｐｍ）まで添加量に相関して上昇しており、添加リ
ガンド量が約３０００と６０００でそれ程差が見られな
いことから、結合が飽和に達していることがわかる。こ
れに対してＣ１の結合量は、添加リガンド量に関係せず
ほぼ一定であり、非特異的結合であることを示唆してい
る。

【００５９】

【表３】

【００６０】（６）ｃｏｌｄ ｂＴＳＨ添加によるリガ
ンド（Ｉ^１２５−ｂＴＳＨ）結合阻害効果の検討 Ｐ６及びＣ１株を直径２２ｍｍのｗｅｌｌに２５，００
０個／ｗｅｌｌになるようにそれぞれを植え継いで培養
した。３日間培養後、培地を除去し、各ｗｅｌｌに０．
５ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加した。こ
れらに１０mｌのＩ^１２５−ｂＴＳＨ量を添加し、さら
に添加ｃｏｌｄ ｂＴＳＨ量を７段階に分けて添加し３
７℃で２時間インキュベ−ションした。なお、添加ｃｏ
ｌｄ ｂＴＳＨ量は、各ｗｅｌｌあたり０、５、１５、
５０、１５０、５００および１５００mＩＵであり、最
終濃度としては０、０．０１、０．０３、０．１、０．
３、１．０及び３．０ｍＩＵ／ｍｌとなる。

【００６１】インキュベ−ション後培地を除去し、さら
に０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ
で１回洗浄した。洗浄後に各ｗｅｌｌに０．５ｍｌのＬ
ｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えて底面に付着している細
胞を可溶化した。可溶化した細胞を試験管に回収後、さ
らにｗｅｌｌに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇｂ
ｕｆｆｅｒを加えて洗浄した。可溶化細胞液とこの洗浄
液を合わせてg−カウンタ−でＴＳＨレセプタ−に結合
したＩ^１２５−ｂＴＳＨ量を計測し、その結果を表４に
示した。なお、何れの試験も２連で検討した。

【００６２】表４から明らかなように、コントロ−ルＣ
１のリガンド結合量がｃｏｌｄ ｂＴＳＨ添加量に影響
されず一定なのに対して、Ｐ６の方はｃｏｌｄ ｂＴＳ
Ｈ添加濃度が高まるにつれて相対的にリガンド結合量が
低下し、ほぼ１ｍＩＵ／ｍｌの濃度で１００％結合が阻
害されている。したがって、Ｐ６のＩ^１２５−ｂＴＳＨ
との結合がｐＴＳＨレセプタ−を介した特異的な結合で
あることが示された。

【００６３】

【表４】

【００６４】（７）ｂＴＳＨ及びＴＳＡｂ刺激によるｃ
ＡＭＰ産生能の検討 体外診断用医薬品ＴＳＡｂキット「ヤマサ」（ヤマサ醤
油製）（以後、単にキットと表記する）を用いて測定し
た。測定方法はキットに付いている添付文書に従って行
った。すなわち、Ｐ６及びＣ１株を直径１１ｍｍのｗｅ
ｌｌに６，０００個／ｗｅｌｌになるようにそれぞれを
植え継いで培養した。６日間培養して細胞がほぼｗｅｌ
ｌ一杯になったら、培地を除去しさらにキットに付いて
いる０．５ｍｌの細胞洗浄液で洗浄した。ｗｅｌｌに５
０mｌの細胞洗浄液を添加した後にキットに付いている
２００mｌの細胞活性判定液（ｂＴＳＨ １００ｍＩＵ
／ｍｌ）もしくはＴＳＡｂを含むヒト血清より調製した
ＩｇＧ分画サンプルを添加して撹拌した。

【００６５】３７℃で４時間インキュベ−ション後，１
０mｌの反応停止液を添加した。この反応液２５mｌをガ
ラスチュ−ブに移し、１００mｌのＩ^１２５−ｃＡＭＰ
液と１００mｌのｃＡＭＰ抗体液を添加して良く撹拌し
た。４℃で一晩インキュベ−ションした後に５００mｌ
のｃＡＭＰ第２抗体液を添加、撹拌した。４℃で３０分
間インキュベ−ション後、１８６０〜１９７０ｇ、４
℃、１５分間の条件で遠心した。アスピレ−タ−で上清
を吸引除去した後に沈殿のＩ^１２５をg−カウンタ−で
測定した。なお、ＴＯＴＡＬ、ＮＳＢサンプルの調製及
びｃＡＭＰ標準曲線の作成はキットの添付文書にしたが
って行った。測定結果は、表５に示す。

【００６６】表５から明らかなように、コントロ−ルの
Ｃ１ではｂＴＳＨやＩｇＧ画分で値が変わらないことか
ら、刺激物質に反応していない事が示された。一方、Ｐ
６は、ｂＴＳＨやＴＳＡｂに反応して、かなり高いｃＡ
ＭＰを産生することから、本発明のＣＨＯ／ｐＴＳＨＲ
（Ｐ６）細胞は、ＴＳＨと特異的に結合し、ＴＳＨとの
結合およびＴＳＡｂによる刺激により、ｃＡＭＰ産生が
起きることから、ｐＴＳＨＲ ｃＤＮＡをトランスフェ
クションしたＣＨＯ細胞で該レセプタ−蛋白が機能を有
した形で発現しているが明らかとなった。さらに、通常
のブタ甲状腺細胞を用いた時よりも組換えビタＴＳＨレ
セプターを用いた方がｃＡＭＰの産生量が高く、より高
感度に測定可能である。

【００６７】

【表５】

【００６８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YAMASA CORPORATION <120> DNA fragment encoding porcine Thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) and use thereof <130> YP2000-019 <140> <141> <160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 764 <212> PRT <213> Porcine <400> 1 Met Ser Leu Thr Pro Leu Leu Gln Leu Ala Leu Leu Leu Ala Leu Pro 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Gly Lys Gly Cys Pro Ser Pro Pro Cys Glu Cys His 20 25 30 Gln Glu Asp Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile His Ser Ile Pro 35 40 45 Pro Leu Pro Pro Asn Thr Gln Thr Leu Lys Phe Ile Glu Thr His Leu 50 55 60 Lys Thr Ile Pro Ser Arg Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser Gln Ser 85 90 95 Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Met Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg 100 105 110 Ser Leu Thr Tyr Ile Asn Pro Gly Ala Leu Lys Asp Leu Pro Leu Leu 115 120 125 Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Arg Ile Phe Pro Asp Leu 130 135 140 Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Val Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Ala Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys 165 170 175 Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val 180 185 190 Gln Gly His Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn 195 200 205 Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val 210 215 220 Phe Ser Gly Pro Thr Leu Leu Asp Val Ser Tyr Thr Ser Val Thr Ala 225 230 235 240 Leu Pro Pro Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn 245 250 255 Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu 260 265 270 Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn 275 280 285 Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser 290 295 300 Ser Ile Arg Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Val Asn Gly 305 310 315 320 Pro Phe Tyr Gln Glu Tyr Glu Glu Asp Leu Gly Asp Ser Ser Val Gly 325 330 335 Asn Lys Glu Asn Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Ser Asn Ser His Tyr 340 345 350 Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln 355 360 365 Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His 370 375 380 Tyr Asp Tyr Thr Val Cys Gly Gly Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro 385 390 395 400 Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Arg Phe 405 410 415 Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Val Leu Val Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Thr Val 435 440 445 Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly 450 455 460 Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr Gln Ser Glu 465 470 475 480 Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr 485 490 495 Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu 500 505 510 Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg 515 520 525 Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Tyr Ala Ile Met Ala Gly 530 535 540 Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile 545 550 555 560 Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr 565 570 575 Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Ile Leu Val Leu Leu Leu Asn Ile Val 580 585 590 Ala Phe Thr Ile Val Cys Ser Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val 595 600 605 Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys 610 615 620 Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Met Cys Met Ala Pro Ile 625 630 635 640 Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Leu Met Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val 645 650 655 Thr Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys 660 665 670 Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp 675 680 685 Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Phe Cys Lys Arg Gln Ala Gln 690 695 700 Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Ser Pro Lys Asn Ser Thr Gly Ile Gln 705 710 715 720 Val Gln Lys Val Thr Gln Asn Met Arg Gln Ser Leu Pro Asn Met Gln 725 730 735 Asp Asp Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Ser His Leu Thr His Lys Lys His 740 745 750 Asp Gln Ile Ser Lys Glu Tyr Lys Gln Thr Val Leu 755 760 <210> 2 <211> 2292 <212> DNA <213> Porcine <400> 2 atgagtctga cgcccctgtt gcagctggcg ctgcttctcg ccctgcccag gagcctcagg 60 gggaaagggt gtccgtctcc gccctgcgaa tgccaccagg aggacgactt cagagtcacc 120 tgcaaggata tccacagcat ccccccctta ccacccaata ctcagacact aaagtttata 180 gagactcatc tgaaaaccat ccccagtcgt gcattttcaa atctgcccaa tatttccagg 240 atctacctgt caatagatgc aactctacag cagctggaat cacagtcctt ctacaatttg 300 agcaaaatga ctcacataga gattcggaat accagaagct taacgtacat aaaccctggt 360 gccctaaaag atctccccct tctaaagttc cttggcattt tcaacactgg acttagaata 420 ttcccagacc tgaccaaagt gtattccact gatgtattct tcatacttga aattacagac 480 aacccttaca tgacatcaat ccctgcgaat gcttttcagg gcctgtgcaa cgaaaccttg 540 acactgaaac tatacaacaa tggctttact tcagtccaag gacatgcttt caatgggaca 600 aagctggatg ctgtttacct gaacaagaat aaatacctga cagttattga caaagatgca 660 tttggaggag ttttcagtgg accaaccttg ctggatgtct cttataccag tgttactgcc 720 ctgccaccca aaggcctgga acacctgaag gaactgatag caagaaatac ttggactcta 780 aagaaacttc cactgtcctt gagtttcctt cacctcacac gagctgacct ttcttatcca 840 agccactgct gtgcttttaa gaatcagaag aagatcagag gaatccttga gtctttaatg 900 tgtaatgaga gcagtattcg gagcctgcgt cagagaaaat ctgtgaatgc tgtaaatggt 960 cccttttacc aagaatatga agaggatctg ggcgacagca gtgttgggaa taaggaaaac 1020 tccaagttcc aggataccca tagcaactcc cattactacg tcttctttga agaacaagag 1080 gatgagatca ttggttttgg ccaagagctc aaaaaccccc aggaagagac ccttcaggcc 1140 tttgacagcc attacgacta caccgtgtgt gggggcagtg aagacatggt gtgcaccccc 1200 aagtcagatg agttcaaccc ctgtgaagac ataatgggct acaggttcct gagaatcgtg 1260 gtgtggttcg ttagcctgct ggctctcctg ggcaatgtct ttgtcctggt catcctcctc 1320 acgagccact acaaactgac ggtcccacgc tttctcatgt gcaacttggc ctttgcagat 1380 ttctgcatgg ggatgtatct gctcctcatt gcctcggtgg acctctacac tcagtctgag 1440 tactacaacc atgccatcga ctggcagaca ggtcccgggt gcaacacggc tggtttcttc 1500 accgtctttg ccagcgagct gtcagtgtac acactaacag tcatcactct ggagcgctgg 1560 tatgccatca ccttcgccat gcgcctggat cgcaagatcc gcctcaggca cgcctacgcc 1620 atcatggctg gcggctgggt ttgctgcttc ctgctcgccc tgctgccttt ggtggggata 1680 agcagctatg ctaaggtcag catctgcctg cccatggaca ctgagactcc tcttgccctg 1740 gcgtatatta tccttgttct gctgctcaac atagttgcct ttaccatcgt ctgctcctgt 1800 tacgtgaaga tctacatcac agtccgaaat ccccagtata acccgggaga caaagacact 1860 aaaattgcca aaaggatggc tgtgttgatc ttcactgact tcatgtgcat ggccccgatc 1920 tccttttacg ccctctcagc acttatgaac aagcctctca tcactgtcac caactccaaa 1980 atcttgctcg ttctcttcta cccacttaac tcctgtgcca acccgttcct ctatgccatt 2040 ttcaccaaag ccttccagag ggatgtgttt atcctgctca gcaagttcgg cttctgtaaa 2100 cgccaggctc aggcataccg gggtcagaga gtgtctccaa agaacagcac tggtattcag 2160 gtccaaaagg ttacccaaaa catgaggcaa agtctcccca acatgcagga tgactatgaa 2220 ctgcttgaaa actcgcatct aacccacaaa aagcatgacc aaatttcaaa ggagtataag 2280 caaacagttt tg 2292 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 3 gacttcagag tcacctgcaa gg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 4 cagatgccaa acttgctgag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 5 atgggctaca agttcctgag 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 6 gccagtcgat ggcatggttg t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 7 ctggatgctg tttacctgaa c 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 8 ggattcctct gattttcttc tg 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 9 cactgacttc atgtgcatgg c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 10 ggactgtgat tccagctgct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 11 gacatcaatc cctgcgaatg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 12 gtgaatgctg taaatggtcc c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 13 acgcctacgc catcatggct g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 14 aacagcatcc agctttgtcc c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 15 gtcgtaatgg ctgtcaaagg c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 16 agaggagtct cagtgtccat g 21 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 17 cagcctaagt ccttgtacca ctta 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 18 gtgtcgatgg ttggaatgat gctc 24 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 19 atcgccgagc acgcagaggt ag 22 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 20 atgagaggga ggcgatc 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 21 gggcccggag gacgatg 17 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 22 gctgaagatg aagagatagc c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 23 ctaagacacc agcctaagtc c 21 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 24 gcccggcca ccatgggtct gacgccc 27 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of TSHR gene <400> 25 ctaagacacc agcctaagtc c 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ブタ由来ＴＳＨレセプター構造遺伝子
（２２９２ｂｐ、７６４個のアミノ酸からなる分子量８
６，６４１のポリペプチドをコードする）を含有するＤ
ＮＡ断片の塩基配列を示したものである。図中、Ｍｅｔ
はブタ由来ＴＳＨレセプター構造遺伝子の翻訳開始コド
ンを、ｓｔｏｐはその停止コドンを示す。

【図２】図２は、本発明のブタ由来ＴＳＨレセプターの
アミノ酸配列を、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラッ
ト、イヌ由来ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列と比較し
て示したものである。図中、porcine はブタ、Humanは
ヒト、Bos taurusはウシ、Ovis ariesはヒツジ、Mus mu
sculusはマウス、Rattusはラット、Canineはイヌ由来の
それぞれのＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を示す。ま
た、図中のアルファベットはアミノ酸の１文字記号で、
以下のアミノ酸を示す。 Ａ：アラニン、Ｒ：アルギニン、Ｎ：アスパラギン、
Ｄ：アスパラギン酸、Ｃ：システイン、Ｑ：グルタミ
ン、Ｅ：グルタミン酸、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジ
ン、Ｉ：イソロイシン、Ｌ：ロイシン、Ｋ：リジン、
Ｍ：メチオニン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｐ：プロリ
ン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、Ｗ：トリプトファ
ン、Ｙ：チロシン、Ｖ：バリン

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なるブタＴＳＨ(Thyroid-stimulating hormone)レセプ
   ターをコードするＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列にお
   いて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入
   または付加されたアミノ酸配列からなるブタＴＳＨレセ
   プターをコードするＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   ブタＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 配列番号２で示される塩基配列におい
   て、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または
   付加された塩基配列を有するブタＴＳＨレセプターをコ
   ードするＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項３または４記載のＤＮＡとストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつブタＴＳ
   ＨレセプターをコードするＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】 請求項１〜５いずれか１項に記載のＤＮ
   Ａ断片をプラスミドもしくはファージに挿入して調製し
   た発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の発現ベクターを用い、宿
   主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して得
   られた組換えブタＴＳＨレセプター。
8. 【請求項８】 請求項６記載の発現ベクターを用い、宿
   主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養してＴ
   ＳＨレセプターを産生させ、培養物からＴＳＨレセプタ
   ーを得ることを特徴とする、組換えブタＴＳＨレセプタ
   ーの製造法。