JP2003105081A - Method for manufacturing amino acid-containing polymer by enzyme method - Google Patents
Method for manufacturing amino acid-containing polymer by enzyme methodInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規アスパラギン
酸エステル又はグルタミン酸エステルの製造方法及びア
スパラギン酸エステル又はグルタミン酸エステルを原料
としたポリマーの製造方法に関する。詳細には、本発明
は、α-ポリペプチド結合に富み且つ高い光学純度を有
するLーアスパラギン酸エステル又はLーグルタミン酸エス
テルのポリマーに関する。また、本発明は、β-ペプチ
ド結合に富み且つ高い光学純度を有するLーアスパラギン
酸エステル又はLーグルタミン酸エステルのポリマーに関
する。さらに、本発明は、酵素を用いたそれらのモノマ
ー及びポリマーの製造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a novel aspartic acid ester or glutamic acid ester and a method for producing a polymer using aspartic acid ester or glutamic acid ester as a raw material. In particular, the invention relates to polymers of L-aspartic acid esters or L-glutamic acid esters rich in α-polypeptide bonds and having high optical purity. The present invention also relates to a polymer of L-aspartic acid ester or L-glutamic acid ester which is rich in β-peptide bond and has high optical purity. Furthermore, the present invention relates to a method for producing those monomers and polymers using enzymes.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ポリアクリル酸に代表されるポリカルボ
ン酸は、水溶性の機能性ポリマーとして種々の産業分野
で、例えば、洗浄用ビルダー、分散剤、スケール防止剤
など広く使用されている。しかしながら、これらのポリ
マーは、生分解性が乏しいので、廃液等から河川や土壌
に拡散すると、それらを長期にわたって汚染する危険性
があり、最近は、環境に易しい、生分解性の環境低負荷
型のポリマーの開発が強く望まれている。その中で、ア
スパラギン酸やグルタミン酸のポリマーは、生分解性を
有するとともに生体適合性や生体内吸収性などの有利な
特徴を有することから、アクリル酸ポリマーの代替物と
して利用できるばかりでなく、医薬品、化粧品、金属吸
収剤などさまざまな用途への適用が期待される。2. Description of the Related Art Polycarboxylic acids typified by polyacrylic acid are widely used as water-soluble functional polymers in various industrial fields such as cleaning builders, dispersants and scale inhibitors. However, since these polymers are poor in biodegradability, there is a risk of contaminating them for a long period of time if they diffuse from waste liquids into rivers and soils, and recently, they are environmentally friendly and biodegradable with low environmental load. The development of these polymers is strongly desired. Among them, polymers of aspartic acid and glutamic acid have biodegradability and advantageous characteristics such as biocompatibility and bioavailability, so that they can be used not only as a substitute for acrylic acid polymers but also as pharmaceuticals. , It is expected to be applied to various uses such as cosmetics and metal absorbents.
【０００３】アスパラギン酸やグルタミン酸のポリマー
の製造方法としては、これまでに熱重合やリン酸系触媒
を用いた方法などの化学重合法が報告されている（BIO
INDUSTRY Vol.17, pp.67-72 (2000)）。これらの公知の
重合方法は、いずれもポリイミドを経由し、次いで加水
分解によりアスパラギン酸又はグルタミン酸のポリマー
を生成する工程であるが、このような化学重合法ては、
容易かつ大量にアスパラギン酸のポリマーを提供するこ
とができる反面、得られるポリマーは、D、Lー混合物であ
り、また、αペプチド結合、βペプチド結合及び未反応
のイミド結合が混在するため、生分解性や生体適合性の
面で、未だ満足のいくものではない。さらに、当該ポリ
マー鎖は、D、Lー混合物であるので、ランダムな構造をと
り、その結果、Ｃaイオン封鎖能などの機能が低下する
ばかりか、一般に着色している。As a method for producing a polymer of aspartic acid or glutamic acid, a chemical polymerization method such as thermal polymerization or a method using a phosphoric acid catalyst has been reported so far (BIO).
INDUSTRY Vol.17, pp.67-72 (2000)). These known polymerization methods are all steps of passing through a polyimide and then hydrolyzing to generate a polymer of aspartic acid or glutamic acid.
While it is possible to provide a polymer of aspartic acid easily and in a large amount, the obtained polymer is a D, L-mixture, and since α peptide bond, β peptide bond and unreacted imide bond are mixed, a In terms of degradability and biocompatibility, it is still unsatisfactory. Further, since the polymer chain is a mixture of D and L, it has a random structure, and as a result, not only the functions such as the Ca ion sequestering ability are deteriorated but also it is generally colored.
【０００４】一方、酵素重合によるアスパラギン酸ポリ
マーの合成も研究されてきており、酵素法によると、穏
和な条件下で反応を行うことができ、ラセミ化が起こら
ず高い光学純度を有する生成物を得ることが期待でき
る。また、生成したポリマーが無色であることが実証さ
れている。このような機能を有するアスパラギン酸ポリ
マーを放線菌由来のアルカリ性プロテアーゼを酵素触媒
とした製造技術により合成することも報告された（特開
２０００−12８８９８号公報）。ここで用いる放線菌由
来のアルカリ性プロテアーゼとして特に好ましいもの
は、ストレプトマイセス属に属するもので、ストレプト
マイセス属（Streptomyces sp.)由来のアルカリ性プロ
テアーゼとされているが、酵素が放線菌由来であるため
菌体の大量培養に適しておらず、酵素の工業的利用のた
めの大量生産は現状では困難であるため、経済性の上で
未だ実用化には至っていない。On the other hand, the synthesis of aspartic acid polymers by enzymatic polymerization has also been studied. According to the enzymatic method, the reaction can be carried out under mild conditions, and a product having high optical purity without racemization occurs. Can expect to get. It has also been demonstrated that the polymer produced is colorless. It has also been reported that an aspartic acid polymer having such a function is synthesized by a production technique using an alkaline protease derived from actinomycetes as an enzyme catalyst (JP-A 2000-128898). Particularly preferred as the alkaline protease derived from actinomycetes used herein is that belonging to the genus Streptomyces, which is said to be an alkaline protease derived from the genus Streptomyces (Streptomyces sp . ), But the enzyme is derived from actinomycetes. Therefore, it is not suitable for large-scale culture of bacterial cells, and since it is difficult at present to mass-produce the enzyme for industrial use, it has not yet been put to practical use in terms of economic efficiency.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】リパーゼ又は固定化リ
パーゼを用いることによりアスパラギン酸エステルおよ
びグルタミン酸エステルを合成する方法、また、アミノ
酸エステルを合成原料としたポリL−アスパラギン酸及
びポリL−グルタミン酸及びそれらのコポリマーの製造
方法を提供し、以て使用目的にあわせた生分解性、生体
適合性及び機能性に優れたポリマーを提供することであ
る。[Problems to be Solved by the Invention] Method for synthesizing aspartic acid ester and glutamic acid ester by using lipase or immobilized lipase, and poly L-aspartic acid and poly L-glutamic acid using amino acid ester as a synthetic raw material and those To provide a polymer having excellent biodegradability, biocompatibility and functionality suitable for the intended purpose.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、酵素重合
法において、酵素の種類及び量、水分量、反応温度、反
応時間、基質となるLーアスパラギン酸エステル及びLーグ
ルタミン酸エステルの種類等の諸条件を検討した結果、
リパーゼを酵素触媒としてLーアスパラギン酸ジエステル
及びLーグルタミン酸ジエステルを合成することに成功し
た。また、ジエステルをBacillus subtilis（バチルス
ズブチリス）由来の酵素を触媒として重合させることに
より、これらのホモポリマー及びコポリマーを得ること
に成功した。得られたポリマーは、分子量分子量500〜1
0,000程度のもので、いずれも完全に無色であり、ま
た、Lー体からなることが確認された。さらに、これらの
ポリマーは、線状構造をなしており、末端はアミノ基と
カルボキシル基からなることが確認された。また、これ
らは優れた生分解性を示すことを確認した。Means for Solving the Problems In the enzymatic polymerization method, the inventors of the present invention have investigated the type and amount of enzyme, the water content, the reaction temperature, the reaction time, the type of L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester as substrates, etc. As a result of examining various conditions of
We succeeded in synthesizing L-aspartic acid diester and L-glutamic acid diester using lipase as an enzyme catalyst. In addition, we succeeded in obtaining these homopolymers and copolymers by polymerizing the diester using Bacillus subtilis derived enzyme as a catalyst. The obtained polymer has a molecular weight of 500 to 1
It was confirmed to be about 0,000, completely colorless, and to consist of L-form. Furthermore, it was confirmed that these polymers had a linear structure, and the terminals were composed of amino groups and carboxyl groups. It was also confirmed that these show excellent biodegradability.
【０００７】すなわち、本発明は以下の構成を基本とす
る。
酵素リパーゼ又は固定化リパーゼを用いてアスパラギ
ン酸又はグルタミン酸と低級アルコールから下記の一般
式（１）で表されるアスパラギン酸エステル又は一般式
（２）で表されるグルタミン酸エステルの製造方法。That is, the present invention is based on the following constitution. A method for producing an aspartic acid ester represented by the following general formula (1) or a glutamic acid ester represented by the general formula (2) from aspartic acid or glutamic acid and a lower alcohol using an enzyme lipase or an immobilized lipase.
【０００８】[0008]
【化11】
一般式（１）
（上式において、R1 と R2 は同一又は異なって、炭素
数１〜３個のアルキル基である）。[Chemical 11] General formula (1) (In said formula, R < 1 > and R < 2 > are the same or different and are a C1-C3 alkyl group.).
【０００９】[0009]
【化12】
一般式（２）
（上式において、R3 とR4 は同一又は異なって、炭素数
１〜３個のアルキル基である）。[Chemical 12] General formula (2) (in the above formula, R 3 and R 4 are the same or different and each is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms).
【００１０】リパーゼ又は、固定化リパーゼを用いて
アスパラギン酸又はグルタミン酸と低級アルコールの反
応において、アスパラギン酸又はグルタミン酸の鉱酸塩
を用いることを特徴とする請求項１記載のアスパラギン
酸又はグルタミン酸のエステルの製造方法。[0010] In the reaction of aspartic acid or glutamic acid with a lower alcohol using a lipase or an immobilized lipase, a mineral acid salt of aspartic acid or glutamic acid is used. Production method.
【００１１】Lーアスパラギン酸エステルを原料とし、
バチルスズブチリス属由来のプロテアーゼにより下記一
般式（３）Using L-aspartic acid ester as a raw material,
The following general formula (3) is obtained by using a protease derived from Bacillus subtilis.
【００１２】[0012]
【化13】
一般式（３）
（式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（Ｉ）及び下記の一般式（４）[Chemical 13] Structural unit (I) represented by general formula (3) (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (4)
【００１３】[0013]
【化14】
一般式（４）
（式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（ II ）を基本構造とする分子量500
〜10,000のポリLーアスパラギン酸エステルの製造方法。[Chemical 14] A molecular weight of 500 having a structural unit (II) represented by general formula (4) (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) as a basic structure.
~ 10,000 production method of poly L-aspartic acid ester.
【００１４】Ｌ−グルタミン酸エステルを原料とし、
下記の一般式（５）Using L-glutamic acid ester as a raw material,
The following general formula (5)
【００１５】[0015]
【化15】
一般式（５）
（式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（III）及び下記の一般式（６）[Chemical 15] Structural unit (III) represented by general formula (5) (wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (6)
【００１６】[0016]
【化16】
一般式（６）
（式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位(IV)を基本構造とする分子量500〜10,
000のポリＬ−グルタミン酸エステルの製造方法。[Chemical 16] A molecular weight of from 500 to 10 based on the structural unit (IV) represented by the general formula (6) (wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms)
Of 000 poly L-glutamic acid esters.
【００１７】 Ｌ-アスパラギン酸エステル及びＬ-グ
ルタミン酸エステルを原料とし、バチルスズブチリス属
由来のプロテアーゼにより一般式（３）より誘導される
構造単位（Ｉ）、一般式（４）より誘導される構造単位
（II）、一般式（５）より誘導される構造単位（III）
及び一般式（６）より誘導される構造単位（IV）からな
るＬ-アスパラギン酸エステルとＬ-グルタミン酸エステ
ルとの分子量500〜10,000のコポリマーの製造方法。A structural unit (I) derived from the general formula (3) and a structural unit derived from the general formula (4) using a protease derived from the genus Bacillus tin butyris using L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester as raw materials. (II), structural unit (III) derived from general formula (5)
And a method for producing a copolymer of L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester, which has a structural unit (IV) derived from the general formula (6) and has a molecular weight of 500 to 10,000.
【００１８】[0018]
【化17】 一般式（３） （式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 17] Formula (3) (wherein, R 1 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【００１９】[0019]
【化18】 一般式（４） （式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 18] Formula (4) (wherein, R 1 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【００２０】[0020]
【化19】 一般式（５） （式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 19] Formula (5) (wherein, R 3 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【００２１】[0021]
【化20】 一般式（６） （式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 20] Formula (6) (wherein, R 3 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【００２２】本発明のアスパラギン酸鉱酸塩及びグルタ
ミン酸鉱酸塩、好ましくは塩酸塩のエステル合成に用い
る酵素は、エステル結合に作用する酵素であれば、特に
制限は無いが、入手のしやすさと酵素の熱安定性からリ
パーゼが好ましい。The enzyme used for the ester synthesis of the aspartic acid mineral salt and glutamic acid mineral salt of the present invention, preferably the hydrochloride salt, is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on an ester bond, but it is easily available. Lipase is preferred because of the thermal stability of the enzyme.
【００２３】上記反応において使用するリパーゼには、
豚膵臓リパーゼ(PPL)、Candida rugosa 由来のリパー
ゼ、Pseudomonas由来のリパーゼなどがあり、また固定
化リパーゼとしては、の Novozym 435 （ノボザイムズ
・ジャパン（株）製）及び Lipozyme IM. .RM （ノボザ
イムズ・ジャパン（株）製）などを挙げることができ
る。The lipase used in the above reaction includes
There are porcine pancreatic lipase (PPL), lipase derived from Candida rugosa, lipase derived from Pseudomonas, etc. As immobilized lipase, there are Novozym 435 (manufactured by Novozymes Japan KK) and Lipozyme IM..RM (Novozymes Japan). (Manufactured by Co., Ltd.) and the like.
【００２４】リパーゼの添加量は、合成原料当たり０．
０１〜２重量％、好ましくは０．０５〜０．５重量％で
ある。固定化リパーゼにおいては、合成原料当たり１〜
２００重量％、好ましくは５〜５０重量％である。合成
原料当たりの酵素量が少ないと反応速度が著しく低下
し、逆に多すぎると加水分解反応が顕著になり、目的と
するエステルの収量が低下する。The amount of lipase added was 0.
It is from 1 to 2% by weight, preferably from 0.05 to 0.5% by weight. In the case of immobilized lipase,
It is 200% by weight, preferably 5 to 50% by weight. If the amount of enzyme per synthetic raw material is small, the reaction rate will be remarkably reduced, and if it is too large, the hydrolysis reaction will be remarkable and the yield of the target ester will be reduced.
【００２５】アミノ酸鉱酸塩と低級アルコールのエステ
ル化反応においては、上記リパーゼ又は固定化リパーゼ
と必要によりトルエンのような炭化水素系の有機溶媒を
用いることができるが、反応触媒となる酵素のエステル
化活性を阻害しないものであれば特に制限は無い。一方
アミノ酸原料としては鉱酸塩が望ましく、アルカリ塩や
遊離のアミノ酸ではエステル化反応は進行しない。アミ
ノ酸エステルの合成では、アミノ酸鉱酸塩と低級アルコ
ール及び必要により溶媒を所定量はかり取り、これにリ
パーゼ等の酵素を添加し、25〜90℃、好ましくは50〜80
℃で１〜５日間攪拌を行うことで相当するアミノ酸エス
テルの鉱酸塩を得ることができる。かかるエステルの鉱
酸塩は、アルカリ処理することにより容易にアミノ酸エ
ステルに変えることができる。In the esterification reaction of the amino acid mineral acid salt and the lower alcohol, the above lipase or immobilized lipase and, if necessary, a hydrocarbon organic solvent such as toluene can be used. There is no particular limitation as long as it does not inhibit the activating activity. On the other hand, a mineral acid salt is desirable as the amino acid raw material, and the esterification reaction does not proceed with alkali salts or free amino acids. In the synthesis of an amino acid ester, a predetermined amount of an amino acid mineral acid salt and a lower alcohol and, if necessary, a solvent are weighed, and an enzyme such as lipase is added thereto, and the temperature is 25 to 90 ° C, preferably 50 to 80 ° C.
The mineral acid salt of the corresponding amino acid ester can be obtained by stirring at 1 ° C for 1 to 5 days. The mineral acid salt of such an ester can be easily converted into an amino acid ester by treating with an alkali.
【００２６】本発明のポリマーを製造するには、用いる
酵素は、バチルスズブチルス属由来のプロテアーゼであ
り、具体的にはビオプラーゼ（商品名、ナガセ生化学工
業（株）製）がある。これらの酵素を用いて重合させる
ことにより、Lーアスパラギン酸エステル、Lーグルタミン
酸エステルのホモポリマー又はコポリマーの製造が可能
となる。得られた上記ポリマー又はコポリマーは、分子
量500〜10,000程度のものであるが、さらに好ましくは
分子量1,000〜5,000程度のものが得られる。To produce the polymer of the present invention, the enzyme used is a protease derived from the genus Bacillus tin butyls, and specifically, bioprase (trade name, manufactured by Nagase Seikagaku Corporation). Polymerization using these enzymes makes it possible to produce a homopolymer or copolymer of L-aspartic acid ester or L-glutamic acid ester. The obtained polymer or copolymer has a molecular weight of about 500 to 10,000, and more preferably a molecular weight of about 1,000 to 5,000.
【００２７】本発明においてポリマー生成に用いる酵素
の添加量は、ポリマー当たり固定化酵素１〜100重量
％、好ましくは３〜30重量％である。１重量％未満で
は、重合速度が著しく低下し、100重量％以上では分子
量が若干低下する。用いる酵素は固定化酵素に限らず固
定化しない酵素の場合は、固定化酵素に相当する酵素活
性を示す量であればよい。In the present invention, the amount of the enzyme used for producing the polymer is 1 to 100% by weight, preferably 3 to 30% by weight, of the immobilized enzyme per polymer. If it is less than 1% by weight, the polymerization rate is remarkably reduced, and if it is 100% by weight or more, the molecular weight is slightly reduced. The enzyme to be used is not limited to the immobilized enzyme, and in the case of an enzyme that is not immobilized, it may be an amount that exhibits an enzyme activity corresponding to the immobilized enzyme.
【００２８】本発明の方法では、モノマーであるアミノ
酸エステルの所定量をはかり取り、これに酵素、水及び
溶媒を添加し、10〜70℃、好ましくは30〜60℃で0.5〜
５日間攪拌を行うことでポリマーが得られる。反応温度
をこれ以上高くすると副反応による著しい着色が見ら
れ、また低温では反応性が低下する。In the method of the present invention, a predetermined amount of a monomeric amino acid ester is weighed, and an enzyme, water and a solvent are added thereto, and the mixture is added at 10 to 70 ° C., preferably 30 to 60 ° C.
The polymer is obtained by stirring for 5 days. When the reaction temperature is raised higher than this, remarkable coloration due to side reaction is observed, and the reactivity is lowered at low temperatures.
【００２９】[0029]
【実施例１】試験管にLーアスパラギン酸塩酸塩 100 mg
をはかり取り、Novozym 435 を 10mg 加え、エタノール
0.25 mL 及びトルエン 0.75 mL に溶解して 70゜C で３
日間攪拌して反応を行った。ついで、セライト濾過によ
り酵素を濾別後、エタノールを減圧留去し、Lーアスパラ
ギン酸ジエチル塩酸塩を収率 55 % で得た。[Example 1] L-asparaginic acid hydrochloride 100 mg in a test tube
Weigh out, add 10 mg of Novozym 435, and add ethanol.
Dissolve in 0.25 mL and 0.75 mL of toluene and mix at 70 ° C for 3
The reaction was carried out by stirring for one day. Then, the enzyme was filtered off by Celite filtration, and ethanol was distilled off under reduced pressure to obtain diethyl L-aspartate hydrochloride at a yield of 55%.
【００３０】[0030]
【実施例２】試験管にグルタミン酸塩酸塩 100 mg をは
かり取り、酵素として Novozym 43510 mg を加え、エタ
ノール 1 mL に溶解させ、実施例１と同様 70℃ で３日
間反応を行った。反応終了後、酵素を濾別してエタノー
ル減圧留去してLーグルタミン酸ジエチル塩酸塩を収率 5
0 % で得た。当該塩酸塩を水 45 mL に溶解し、1N水酸
化ナトリウム溶液でpH 7 に調整した。この溶液より 80
mL の酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル相を無水硫
酸ナトリウムで脱水乾燥後、酢酸エチルを留去して Lー
グルタミン酸ジエステルを収率60% で得た。[Example 2] 100 mg of glutamic acid hydrochloride was weighed in a test tube, Novozym 43510 mg was added as an enzyme, dissolved in 1 mL of ethanol, and reacted at 70 ° C for 3 days as in Example 1. After the reaction was completed, the enzyme was filtered off and ethanol was distilled off under reduced pressure to give diethyl L-glutamate hydrochloride in a yield of 5
Got at 0%. The hydrochloride was dissolved in 45 mL of water, and the pH was adjusted to 7 with 1N sodium hydroxide solution. 80 from this solution
The mixture was extracted 3 times with mL of ethyl acetate, the ethyl acetate phase was dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and then ethyl acetate was distilled off to obtain L-glutamic acid diester in a yield of 60%.
【００３１】[0031]
【実施例３】試験管にLーアスパラギン酸塩酸塩 100 mg
をはかり取り、酵素としてNovozym435 を 10 mg 加え、
エタノール 1 mL に溶解させ、70 ℃ で３日間攪拌して
反応を行った。ついで、セライト濾過により酵素を濾
別、エタノールを減圧留去し、Lーアスパラギン酸ジエチ
ル塩酸塩を得た。当該塩酸塩を水 40 mL に溶解し、1N
水酸化ナトリウム溶液で pH 7 とした。この溶液より 7
0 mL の酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル相を無水
硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、酢酸エチルを留去してLー
アスパラギン酸ジエチルを収率 41 % で得た。このジエ
ステル 54 mg に Bacillus subtilis 由来のプロテアー
ゼであるビオプラーゼ16 mg （基質に対して30重量％）
を加え、40 mg の水を添加したアセトニトリル1mlに溶
解させ、アルゴン雰囲気下、攪拌して４０℃で３日間重
合を行った。ついで、水及び溶媒を減圧留去し、クロロ
ホルム-三フッ化酢酸（＝10：0.5）に溶解させ、不溶の
酵素をセライト濾過で除いて、収率98％で分子量3500の
ポリLーアスパラギン酸エステルを得た。[Example 3] L-asparagine hydrochloride 100 mg in a test tube
Weigh out and add 10 mg of Novozym435 as an enzyme,
It was dissolved in 1 mL of ethanol and reacted at 70 ° C. for 3 days with stirring. Then, the enzyme was removed by filtration through Celite, and ethanol was distilled off under reduced pressure to obtain L-aspartic acid diethyl hydrochloride. Dissolve the hydrochloride in 40 mL of water and add 1N.
The pH was adjusted to 7 with sodium hydroxide solution. From this solution 7
The mixture was extracted 3 times with 0 mL of ethyl acetate, the ethyl acetate phase was dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and then ethyl acetate was distilled off to obtain diethyl L-aspartate in a yield of 41%. 54 mg of this diester, 16 mg of biopulase, a protease derived from Bacillus subtilis (30% by weight based on the substrate)
Was dissolved in 1 ml of acetonitrile to which 40 mg of water was added, and the mixture was stirred under an argon atmosphere and polymerized at 40 ° C. for 3 days. Then, the water and the solvent were distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in chloroform-trifluoroacetic acid (= 10: 0.5), the insoluble enzyme was removed by filtration through Celite, and the yield was 98% and the molecular weight of poly-L-aspartic acid ester was 3500. Got
【００３２】[0032]
【実施例４】実施例１及び実施例３で得られたLーアスパ
ラギン酸ジエチル塩酸塩及びLーグルタミン酸ジエチル塩
酸塩をモル比１：１に配合し、酵素ビオプラーゼを用い
て40℃、３日間重合した結果、収率 76%で分子量２６０
０のコポリマー塩酸塩を得た。ついで、 0.5N NaOH
（メタノール：水＝７５：２５）を加え、室温で４時間
攪拌して鹸化を行うことでポリ[(Lーアスパラギン酸ナト
リウム)-co-(Lーグルタミン酸ナトリウム)]を得た。Example 4 L-aspartic acid diethyl hydrochloride and L-glutamic acid diethyl hydrochloride obtained in Examples 1 and 3 were mixed at a molar ratio of 1: 1 and polymerized at 40 ° C. for 3 days by using an enzyme bioprase. As a result, the yield was 76% and the molecular weight was 260.
0 copolymer hydrochloride was obtained. Then, 0.5N NaOH
(Methanol: water = 75: 25) was added and saponification was carried out by stirring at room temperature for 4 hours to obtain poly [(L-sodium aspartate) -co- (sodium L-glutamate)].
【００３３】[0033]
【実施例５】グルタミン酸ジエステル５４mgにBacillus
subtilis由来のプロテアーゼであるビオプラーゼ１１m
g（基質に対して２０重量％）を加え、１２mgの水を添
加し、アルゴン雰囲気下、攪拌して４０℃で２４時間重
合を行った。ついで水を減圧留去し、クロロホルムー三
フッ化酢酸（１０：０．５）に溶解させ、不溶の酵素を
セライト濾過で除いて収率５０％で分子量１２１０のポ
リーＬーグルタミン酸エステルを得た。Example 5 Bacillus was added to 54 mg of glutamic acid diester.
Bioplase 11m, a protease derived from subtilis
g (20% by weight relative to the substrate) was added, 12 mg of water was added, and the mixture was stirred under an argon atmosphere and polymerized at 40 ° C. for 24 hours. Then, the water was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in chloroform-trifluoroacetic acid (10: 0.5), and the insoluble enzyme was removed by filtration through Celite to obtain poly-L-glutamic acid ester having a molecular weight of 1210 and a yield of 50%.
【００３４】[0034]
【実施例６】試料１ｇが完全に二酸化炭素と水に分解し
たときの酸素要求量を理論酸素要求量として下水処理場
の活性汚泥を用いて 25゜Cで攪拌した際に消費される酸
素量から生分解率を求める方法で、本酵素法により合成
したホモポリマー及びコポリマーのナトリウム塩を従来
からの熱重合で合成したLーアスパラギン酸ナトリウムと
比較した。その結果を図１に示す。この結果から、酵素
法により合成したポリＬ−アスパラギン酸塩およびポリ
Ｌ−グルタミン酸塩のホモポリマーの生分解性は、熱重
合のホモポリマーであるポリＬ−アスパラギン酸塩より
優れた生分解性を示し、また、酵素法の場合にＬ−アス
パラギン酸塩とＬ−グルタミン酸塩のコポリマーとする
ことにより生分解性を容易に調節できることが明らかに
なった。[Example 6] Oxygen demand when 1 g of sample is completely decomposed into carbon dioxide and water is used as theoretical oxygen demand, and the amount of oxygen consumed when stirred at 25 ° C using activated sludge in a sewage treatment plant The sodium salts of homopolymers and copolymers synthesized by the present enzymatic method were compared with sodium L-aspartate synthesized by conventional thermal polymerization by the method of determining the biodegradation rate from. The result is shown in FIG. From these results, the biodegradability of the homopolymers of poly L-aspartate and poly L-glutamate synthesized by the enzymatic method was higher than that of poly L-aspartate, which is a homopolymer of thermal polymerization. Also, it was revealed that biodegradability can be easily controlled by using a copolymer of L-aspartate and L-glutamate in the enzymatic method.
【００３５】[0035]
【発明の効果】本発明では、上記状況に鑑み、工業的製
法で大量に製造できる酵素を用いて、アスパラギン酸及
びグルタミン酸のエステルを経済的に製造する方法、及
びジエステルを原料として、Bacillus subtilis由来を
用いてアスパラギン酸及びグルタミン酸のポリマーを提
供できる。すなわち、本発明では、酵素重合法におい
て、酵素の種類及び量、水分量、反応温度、反応時間、
基質となるLーアスパラギン酸エステル及びLーグルタミン
酸エステルの種類等の諸条件を検討した結果、リパーゼ
を酵素触媒としてLーアスパラギン酸ジエステル及びLーグ
ルタミン酸ジエステルを合成できる。また、ジエステル
をBacillus subtilis由来の酵素によって処理すること
により、これらのホモポリマー及びコポリマーを容易に
得ることができる。得られたポリマー分子量500〜10,00
0程度のもので、完全に無色で、機能性、生分解性及び
生体適合性に優れており、その上、安価であるため医薬
品や化粧品の分野における高分子材料として極めて有用
であり、適用範囲も広く環境低負荷型プロセスの開発や
生分解性機能性高分子素材として活用できる。In the present invention, in view of the above situation, a method for economically producing an ester of aspartic acid and glutamic acid using an enzyme that can be produced in a large amount by an industrial production method, and a diester as a raw material, derived from Bacillus subtilis Can be used to provide polymers of aspartic acid and glutamic acid. That is, in the present invention, in the enzymatic polymerization method, the type and amount of enzyme, water content, reaction temperature, reaction time,
As a result of examining various conditions such as types of L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester as substrates, L-aspartic acid diester and L-glutamic acid diester can be synthesized using lipase as an enzyme catalyst. Further, by treating the diester with an enzyme derived from Bacillus subtilis, these homopolymers and copolymers can be easily obtained. Obtained polymer molecular weight 500 ~ 10,00
It is about 0, completely colorless, excellent in functionality, biodegradability and biocompatibility, and at the same time, it is extremely useful as a polymer material in the fields of pharmaceuticals and cosmetics because of its low cost. It can be widely used for the development of environmentally friendly processes and biodegradable functional polymer materials.
【図１】ポリ（L-アスパラギン酸ナトリウム）、ポリ
［（L-アスパラギン酸ナトリウム）-co-（L-グルタミン
酸ナトリウム）］、ポリ（L-グルタミン酸ナトリウム）
の生分解性比較）FIG. 1 Poly (L-sodium aspartate), Poly [(sodium L-aspartate) -co- (sodium L-glutamate)], Poly (sodium L-glutamate)
Comparison of biodegradability)
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１３年１２月１０日（２００１．１２．
１０）[Submission date] December 10, 2001 (2001.12.
10)
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【書類名】 明細書[Document name] Statement
【発明の名称】 酵素法によるアミノ酸含有ポリマーの
製造方法Title: Method for producing amino acid-containing polymer by enzymatic method
【特許請求の範囲】[Claims]
【化１】
一般式（１）
（上式において、Ｒ1とＲ2は同一又は異なって、炭素数
１〜３個のアルキル基である）。[Chemical 1] General formula (1) (in the above formula, R 1 and R 2 are the same or different and each is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms).
【化２】
一般式（２）
（上式において、Ｒ3とＲ4は同一又は異なって、炭素数
１〜３個のアルキル基である）。[Chemical 2] General formula (2) (in the above formula, R 3 and R 4 are the same or different and are alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms).
【化３】
一般式（３）
（式中、Ｒ1は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（Ｉ）及び下記の一般式（４）[Chemical 3] Structural unit (I) represented by general formula (3) (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (4)
【化４】
一般式（４）
（式中、Ｒ2 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（II）を基本構造とする分子量５００
〜１０，０００のポリL-アスパラギン酸エステルの製造
方法。[Chemical 4] A molecular weight of 500 having a structural unit (II) represented by the general formula (4) (wherein R 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) as a basic structure.
~ 10,000 methods for producing poly L-aspartic acid esters.
【化５】
一般式（５）
（式中、Ｒ3は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（III）及び下記の一般式（６）[Chemical 5] Structural unit (III) represented by general formula (5) (wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (6)
【化６】
一般式（６）
（式中、Ｒ4 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位(IV)を基本構造とする分子量５００〜
１０，０００のポリＬ-グルタミン酸エステルの製造方
法。 [Chemical 6] The molecular weight of the structural unit (IV) represented by general formula (6) (wherein R 4 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) as a basic structure is 500 to
How to make 10,000 poly L-glutamic acid esters
Law.
【化７】 一般式（３） （式中、Ｒ1は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 7] Formula (3) (wherein, R 1 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【化８】 一般式（４） （式中、Ｒ2 は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 8] General formula (4) (In formula, R < 2 > is a C1-C3 alkyl group.)
【化９】 一般式（５） （式中、Ｒ3は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 9] Formula (5) (wherein, R 3 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【化10】 一般式（６） （式中、Ｒ4 は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 10] Formula (6) (wherein, R 4 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規アスパラギン
酸エステル又はグルタミン酸エステルの製造方法及びア
スパラギン酸エステル又はグルタミン酸エステルを原料
としたポリマーの製造方法に関する。詳細には、本発明
は、α-ポリペプチド結合に富み且つ高い光学純度を有
するL-アスパラギン酸エステル又はL-グルタミン酸エス
テルのポリマーに関する。また、本発明は、β-ペプチ
ド結合に富み且つ高い光学純度を有するL-アスパラギン
酸エステル又はL-グルタミン酸エステルのポリマーに関
する。さらに、本発明は、酵素を用いたそれらのモノマ
ー及びポリマーの製造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a novel aspartic acid ester or glutamic acid ester and a method for producing a polymer using aspartic acid ester or glutamic acid ester as a raw material. In particular, the present invention relates to polymers of L-aspartic acid ester or L-glutamic acid ester rich in α-polypeptide bonds and having high optical purity. The present invention also relates to a polymer of L-aspartic acid ester or L-glutamic acid ester, which is rich in β-peptide bonds and has high optical purity. Furthermore, the present invention relates to a method for producing those monomers and polymers using enzymes.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ポリアクリル酸に代表されるポリカルボ
ン酸は、水溶性の機能性ポリマーとして種々の産業分野
で、例えば、洗浄用ビルダー、分散剤、スケール防止剤
など広く使用されている。しかしながら、これらのポリ
マーは、生分解性が乏しいので、廃液等から河川や土壌
に拡散すると、それらを長期にわたって汚染する危険性
があり、最近は、環境に易しい、生分解性の環境低負荷
型のポリマーの開発が強く望まれている。その中で、ア
スパラギン酸やグルタミン酸のポリマーは、生分解性を
有するとともに生体適合性や生体内吸収性などの有利な
特徴を有することから、アクリル酸ポリマーの代替物と
して利用できるばかりでなく、医薬品、化粧品、金属吸
収剤などさまざまな用途への適用が期待される。2. Description of the Related Art Polycarboxylic acids typified by polyacrylic acid are widely used as water-soluble functional polymers in various industrial fields such as cleaning builders, dispersants and scale inhibitors. However, since these polymers are poor in biodegradability, there is a risk of contaminating them for a long period of time if they diffuse from waste liquids into rivers and soils, and recently, they are environmentally friendly and biodegradable with low environmental load. The development of these polymers is strongly desired. Among them, polymers of aspartic acid and glutamic acid have biodegradability and advantageous characteristics such as biocompatibility and bioavailability, so that they can be used not only as a substitute for acrylic acid polymers but also as pharmaceuticals. , It is expected to be applied to various uses such as cosmetics and metal absorbents.
【０００３】アスパラギン酸やグルタミン酸のポリマー
の製造方法としては、これまでに熱重合やリン酸系触媒
を用いた方法などの化学重合法が報告されている（BIO
INDUSTRY Vol.１７, pp.６７-７２ (２０００)）。これ
らの公知の重合方法は、いずれもポリイミドを経由し、
次いで加水分解によりアスパラギン酸又はグルタミン酸
のポリマーを生成する工程であるが、このような化学重
合法ては、容易かつ大量にアスパラギン酸のポリマーを
提供することができる反面、得られるポリマーは、D、L-
混合物であり、また、αペプチド結合、βペプチド結合
及び未反応のイミド結合が混在するため、生分解性や生
体適合性の面で、未だ満足のいくものではない。さら
に、当該ポリマー鎖は、D、L-混合物であるので、ランダ
ムな構造をとり、その結果、Ｃａイオン封鎖能などの機
能が低下するばかりか、一般に着色している。As a method for producing a polymer of aspartic acid or glutamic acid, a chemical polymerization method such as thermal polymerization or a method using a phosphoric acid catalyst has been reported so far (BIO).
INDUSTRY Vol.17, pp.67-72 (2000)). These known polymerization methods are all via polyimide,
Next is a step of producing a polymer of aspartic acid or glutamic acid by hydrolysis, but such a chemical polymerization method can easily provide a polymer of aspartic acid in a large amount, while the resulting polymer is D, L-
Since it is a mixture, and α peptide bond, β peptide bond and unreacted imide bond are mixed, it is not yet satisfactory in terms of biodegradability and biocompatibility. Further, since the polymer chain is a D, L-mixture, it has a random structure, and as a result, functions such as Ca ion sequestering ability are deteriorated, and it is generally colored.
【０００４】一方、酵素重合によるアスパラギン酸ポリ
マーの合成も研究されてきており、酵素法によると、穏
和な条件下で反応を行うことができ、ラセミ化が起こら
ず高い光学純度を有する生成物を得ることが期待でき
る。また、生成したポリマーが無色であることが実証さ
れている。このような機能を有するアスパラギン酸ポリ
マーを放線菌由来のアルカリ性プロテアーゼを酵素触媒
とした製造技術により合成することも報告された（特開
２０００−１２８８９８公報）。ここで用いる放線菌由
来のアルカリ性プロテアーゼとして特に好ましいもの
は、ストレプトマイセス属に属するもので、ストレプト
マイセス属（Streptomyces sp.)由来のアルカリ性プロ
テアーゼとされているが、酵素が放線菌由来であるため
菌体の大量培養に適しておらず、酵素の工業的利用のた
めの大量生産は現状では困難であるため、経済性の上で
未だ実用化には至っていない。On the other hand, the synthesis of aspartic acid polymers by enzymatic polymerization has also been studied. According to the enzymatic method, the reaction can be carried out under mild conditions, and a product having high optical purity without racemization occurs. Can expect to get. It has also been demonstrated that the polymer produced is colorless. It was also reported that an aspartic acid polymer having such a function was synthesized by a production technique using an alkaline protease derived from actinomycetes as an enzyme catalyst (JP 2000-128898 A). Particularly preferred as the alkaline protease derived from actinomycetes used herein is that belonging to the genus Streptomyces, which is an alkaline protease derived from the genus Streptomyces (Streptomyces sp.), But the enzyme is derived from actinomycetes. Therefore, it is not suitable for large-scale culture of bacterial cells, and since it is difficult at present to mass-produce the enzyme for industrial use, it has not yet been put to practical use in terms of economic efficiency.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】リパーゼ又は固定化リ
パーゼを用いることによりアスパラギン酸エステル及び
グルタミン酸エステルを合成する方法、また、アミノ酸
エステルを合成原料としたポリL-アスパラギン酸及びポ
リL-グルタミン酸及びそれらのコポリマーの製造方法を
提供し、以て使用目的にあわせた生分解性、生体適合性
及び機能性に優れたポリマーを提供することである。A method for synthesizing aspartic acid ester and glutamic acid ester by using lipase or immobilized lipase, and poly L-aspartic acid and poly L-glutamic acid using amino acid ester as a synthetic raw material and those To provide a polymer having excellent biodegradability, biocompatibility and functionality suitable for the intended purpose.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、酵素重合
法において、酵素の種類及び量、水分量、反応温度、反
応時間、基質となるL-アスパラギン酸エステル及びL-グ
ルタミン酸エステルの種類等の諸条件を検討した結果、
リパーゼを酵素触媒としてL-アスパラギン酸ジエステル
及びL-グルタミン酸ジエステルを合成することに成功し
た。また、ジエステルをBacillus subtilis（バチルス
ズブチリス）由来の酵素を触媒として重合させることに
より、これらのホモポリマー及びコポリマーを得ること
に成功した。得られたポリマーは、分子量５００〜１
０，０００程度のもので、いずれも完全に無色であり、
また、L-体からなることが確認された。さらに、これら
のポリマーは、線状構造をなしており、末端はアミノ基
とカルボキシル基からなることが確認された。また、こ
れらは優れた生分解性を示すことを確認した。[Means for Solving the Problems] In the enzymatic polymerization method, the present inventors have investigated the type and amount of enzyme, the amount of water, the reaction temperature, the reaction time, and the types of L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester as substrates. As a result of examining various conditions such as
We succeeded in synthesizing L-aspartic acid diester and L-glutamic acid diester using lipase as an enzyme catalyst. In addition, we succeeded in obtaining these homopolymers and copolymers by polymerizing the diester using Bacillus subtilis derived enzyme as a catalyst. The obtained polymer has a molecular weight of 500 to 1.
About 10,000, all completely colorless,
It was also confirmed that it consisted of L-body. Furthermore, it was confirmed that these polymers had a linear structure, and the terminals were composed of amino groups and carboxyl groups. It was also confirmed that these show excellent biodegradability.
【０００７】すなわち、本発明は以下の構成を基本とす
る。
酵素リパーゼ又は固定化リパーゼを用いてアスパラギ
ン酸又はグルタミン酸と低級アルコールから下記の一般
式（１）で表されるアスパラギン酸エステル又は一般式
（２）で表されるグルタミン酸エステルの製造方法。That is, the present invention is based on the following constitution. A method for producing an aspartic acid ester represented by the following general formula (1) or a glutamic acid ester represented by the general formula (2) from aspartic acid or glutamic acid and a lower alcohol using an enzyme lipase or an immobilized lipase.
【０００８】[0008]
【化11】
一般式（１）
（上式において、Ｒ1とＲ2は同一又は異なって、炭素数
１〜３個のアルキル基である）。[Chemical 11] General formula (1) (in the above formula, R 1 and R 2 are the same or different and each is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms).
【０００９】[0009]
【化12】
一般式（２）
（上式において、Ｒ3とＲ4は同一又は異なって、炭素数
１〜３個のアルキル基である）。[Chemical 12] General formula (2) (in the above formula, R 3 and R 4 are the same or different and are alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms).
【００１０】リパーゼ又は、固定化リパーゼを用いて
アスパラギン酸又はグルタミン酸と低級アルコールの反
応において、アスパラギン酸又はグルタミン酸の鉱酸塩
を用いることを特徴とする請求項１記載のアスパラギン
酸又はグルタミン酸のエステルの製造方法。[0010] In the reaction of aspartic acid or glutamic acid with a lower alcohol using a lipase or an immobilized lipase, a mineral acid salt of aspartic acid or glutamic acid is used. Production method.
【００１１】L-アスパラギン酸エステルを原料とし、
バチルスズブチリス属由来のプロテアーゼにより下記一
般式（３）Using L-aspartic acid ester as a raw material,
The following general formula (3) is obtained by using a protease derived from Bacillus subtilis.
【００１２】[0012]
【化13】
一般式（３）
（式中、Ｒ1は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（Ｉ）及び下記の一般式（４）[Chemical 13] Structural unit (I) represented by general formula (3) (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (4)
【００１３】[0013]
【化14】
一般式（４）
（式中、Ｒ2 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（II）を基本構造とする分子量５００
〜１０，０００のポリL-アスパラギン酸エステルの製造
方法。[Chemical 14] A molecular weight of 500 having a structural unit (II) represented by the general formula (4) (wherein R 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) as a basic structure.
~ 10,000 methods for producing poly L-aspartic acid esters.
【００１４】Ｌ-グルタミン酸エステルを原料とし、
下記の一般式（５）Using L-glutamic acid ester as a raw material,
The following general formula (5)
【００１５】[0015]
【化15】
一般式（５）
（式中、Ｒ3は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（III）及び下記の一般式（６）[Chemical 15] Structural unit (III) represented by general formula (5) (wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (6)
【００１６】[0016]
【化16】
一般式（６）
（式中、Ｒ4 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位(IV)を基本構造とする分子量５００〜
１０，０００のポリＬ-グルタミン酸エステルの製造方
法。[Chemical 16] The molecular weight of the structural unit (IV) represented by general formula (6) (wherein R 4 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) as a basic structure is 500 to
A method for producing 10,000 poly (L-glutamic acid) ester.
【００１７】 Ｌ-アスパラギン酸エステル及びＬ-グ
ルタミン酸エステルを原料とし、バチルスズブチリス属
由来のプロテアーゼにより一般式（３）より誘導される
構造単位（Ｉ）、一般式（４）より誘導される構造単位
（II）、一般式（５）より誘導される構造単位（III）
及び一般式（６）より誘導される構造単位（IV）からな
るＬ-アスパラギン酸エステルとＬ-グルタミン酸エステ
ルとの分子量５００〜１０，０００のコポリマーの製造
方法。A structural unit (I) derived from the general formula (3) and a structural unit derived from the general formula (4) using a protease derived from the genus Bacillus tin butyris using L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester as raw materials. (II), structural unit (III) derived from general formula (5)
And a method for producing a copolymer of L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester, each of which has a structural unit (IV) derived from the general formula (6) and has a molecular weight of 500 to 10,000.
【００１８】[0018]
【化17】 一般式（３） （式中、Ｒ1は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 17] Formula (3) (wherein, R 1 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【００１９】[0019]
【化18】 一般式（４） （式中、Ｒ2 は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 18] General formula (4) (In formula, R < 2 > is a C1-C3 alkyl group.)
【００２０】[0020]
【化19】 一般式（５） （式中、Ｒ3は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 19] Formula (5) (wherein, R 3 is one to three alkyl groups having a carbon number)
【００２１】[0021]
【化20】 一般式（６） （式中、Ｒ４ は炭素数１〜３個のアルキル基である）[Chemical 20] General formula (6) (In formula, R < 4 > is a C1-C3 alkyl group.)
【００２２】本発明のアスパラギン酸鉱酸塩及びグルタ
ミン酸鉱酸塩、好ましくは塩酸塩のエステル合成に用い
る酵素は、エステル結合に作用する酵素であれば、特に
制限は無いが、入手のしやすさと酵素の熱安定性からリ
パーゼが好ましい。The enzyme used for the ester synthesis of the aspartic acid mineral salt and glutamic acid mineral salt of the present invention, preferably the hydrochloride salt, is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on an ester bond, but it is easily available. Lipase is preferred because of the thermal stability of the enzyme.
【００２３】上記反応において使用するリパーゼには、
豚膵臓リパーゼ(PPL)、Candida rugosa 由来のリパー
ゼ、Pseudomonas由来のリパーゼなどがあり、また固定
化リパーゼとしては、の Novozym ４３５（ノボザイム
ズ・ジャパン（株）製）及び Lipozyme IM.RM （ノボザ
イムズ・ジャパン（株）製）などを挙げることができ
る。The lipase used in the above reaction includes
There are porcine pancreatic lipase (PPL), lipase derived from Candida rugosa, lipase derived from Pseudomonas and the like, and as immobilized lipase, Novozym 435 (manufactured by Novozymes Japan KK) and Lipozyme IM.RM ( Novozymes Japan ( Novozymes Japan ( Novozymes Japan) Co., Ltd.) and the like.
【００２４】リパーゼの添加量は、合成原料当たり０．
０１〜２重量％、好ましくは０．０５〜０．５重量％で
ある。固定化リパーゼにおいては、合成原料当たり１〜
２００重量％、好ましくは５〜５０重量％である。合成
原料当たりの酵素量が少ないと反応速度が著しく低下
し、逆に多すぎると加水分解反応が顕著になり、目的と
するエステルの収量が低下する。The amount of lipase added was 0.
It is from 1 to 2% by weight, preferably from 0.05 to 0.5% by weight. In the case of immobilized lipase,
It is 200% by weight, preferably 5 to 50% by weight. If the amount of enzyme per synthetic raw material is small, the reaction rate will be remarkably reduced, and if it is too large, the hydrolysis reaction will be remarkable and the yield of the target ester will be reduced.
【００２５】アミノ酸鉱酸塩と低級アルコールのエステ
ル化反応においては、上記リパーゼ又は固定化リパーゼ
と必要によりトルエンのような炭化水素系の有機溶媒を
用いることができるが、反応触媒となる酵素のエステル
化活性を阻害しないものであれば特に制限は無い。一方
アミノ酸原料としては鉱酸塩が望ましく、アルカリ塩や
遊離のアミノ酸ではエステル化反応は進行しない。アミ
ノ酸エステルの合成では、アミノ酸鉱酸塩と低級アルコ
ール及び必要により溶媒を所定量はかり取り、これにリ
パーゼ等の酵素を添加し、２５〜９０℃、好ましくは５
０〜８０℃で１〜５日間攪拌を行うことで相当するアミ
ノ酸エステルの鉱酸塩を得ることができる。かかるエス
テルの鉱酸塩は、アルカリ処理することにより容易にア
ミノ酸エステルに変えることができる。In the esterification reaction of the amino acid mineral acid salt and the lower alcohol, the above lipase or immobilized lipase and, if necessary, a hydrocarbon organic solvent such as toluene can be used. There is no particular limitation as long as it does not inhibit the activating activity. On the other hand, a mineral acid salt is desirable as the amino acid raw material, and the esterification reaction does not proceed with alkali salts or free amino acids. In the synthesis of amino acid ester, a predetermined amount of amino acid mineral acid salt, lower alcohol and, if necessary, a solvent are weighed, and an enzyme such as lipase is added thereto, and the temperature is set to 25 to 90 ° C., preferably 5 to 90 ° C.
The mineral acid salt of the corresponding amino acid ester can be obtained by stirring at 0 to 80 ° C. for 1 to 5 days. The mineral acid salt of such an ester can be easily converted into an amino acid ester by treating with an alkali.
【００２６】本発明のポリマーを製造するには、用いる
酵素は、バチルスズブチルス属由来のプロテアーゼであ
り、具体的にはビオプラーゼ（商品名、ナガセ生化学工
業（株）製）がある。これらの酵素を用いて重合させる
ことにより、L-アスパラギン酸エステル、L-グルタミン
酸エステルのホモポリマー又はコポリマーの製造が可能
となる。得られた上記ポリマー又はコポリマーは、分子
量５００〜１０，０００程度のものであるが、さらに好
ましくは分子量１，０００〜５，０００程度のものが得
られる。To produce the polymer of the present invention, the enzyme used is a protease derived from the genus Bacillus tin butyls, and specifically, there is bioprase (trade name, manufactured by Nagase Seikagaku Corporation). Polymerization using these enzymes makes it possible to produce a homopolymer or copolymer of L-aspartic acid ester or L-glutamic acid ester. The obtained polymer or copolymer has a molecular weight of about 500 to 10,000, and more preferably a molecular weight of about 1,000 to 5,000.
【００２７】本発明においてポリマー生成に用いる酵素
の添加量は、ポリマー当たり固定化酵素１〜１００重量
％、好ましくは３〜３０重量％である。１重量％未満で
は、重合速度が著しく低下し、１００重量％以上では分
子量が若干低下する。用いる酵素は固定化酵素に限らず
固定化しない酵素の場合は、固定化酵素に相当する酵素
活性を示す量であればよい。In the present invention, the amount of the enzyme used for polymer formation is 1 to 100% by weight, preferably 3 to 30% by weight, of the immobilized enzyme per polymer. If it is less than 1% by weight, the polymerization rate is remarkably reduced, and if it is 100% by weight or more, the molecular weight is slightly reduced. The enzyme to be used is not limited to the immobilized enzyme, and in the case of an enzyme that is not immobilized, it may be an amount that exhibits an enzyme activity corresponding to the immobilized enzyme.
【００２８】本発明の方法では、モノマーであるアミノ
酸エステルの所定量をはかり取り、これに酵素、水及び
溶媒を添加し、１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃
で０．５〜５日間攪拌を行うことでポリマーが得られ
る。反応温度をこれ以上高くすると副反応による著しい
着色が見られ、また低温では反応性が低下する。In the method of the present invention, a predetermined amount of a monomeric amino acid ester is weighed, an enzyme, water and a solvent are added thereto, and the temperature is 10 to 70 ° C., preferably 30 to 60 ° C.
The polymer is obtained by stirring for 0.5 to 5 days. When the reaction temperature is raised higher than this, remarkable coloration due to side reaction is observed, and the reactivity is lowered at low temperatures.
【００２９】[0029]
【実施例１】試験管にL-アスパラギン酸塩酸塩 １００
mg をはかり取り、Novozym４３５を１０mg 加え、エタ
ノール０．２５mL 及びトルエン０．７５mL に溶解して
７０℃で３日間攪拌して反応を行った。ついで、セラ
イト濾過により酵素を濾別後、エタノールを減圧留去
し、L-アスパラギン酸ジエチル塩酸塩を収率５５％で得
た。Example 1 L-aspartate hydrochloride 100 was added to a test tube.
10 mg of Novozym 435 was added, dissolved in 0.25 mL of ethanol and 0.75 mL of toluene, and stirred at 70 ° C. for 3 days to carry out a reaction. Then, after the enzyme was filtered off by Celite filtration, ethanol was distilled off under reduced pressure to obtain diethyl L-aspartate hydrochloride at a yield of 55%.
【００３０】[0030]
【実施例２】試験管にグルタミン酸塩酸塩 １００mg を
はかり取り、酵素として Novozym４３５を１０mg を加
え、エタノール１mL に溶解させ、実施例１と同様７０
℃で３日間反応を行った。反応終了後、酵素を濾別して
エタノール減圧留去してL-グルタミン酸ジエチル塩酸塩
を収率 ５０％で得た。当該塩酸塩を水 ４５mLに溶解
し、１N水酸化ナトリウム溶液でpH７に調整した。この
溶液より８０mLの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル
相を無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、酢酸エチルを留
去して L-グルタミン酸ジエチルを収率６０％で得た。Example 2 100 mg of glutamic acid hydrochloride was weighed into a test tube, 10 mg of Novozym 435 as an enzyme was added, and dissolved in 1 mL of ethanol.
The reaction was carried out at 0 ° C for 3 days. After the reaction was completed, the enzyme was filtered off and ethanol was distilled off under reduced pressure to obtain diethyl L-glutamic acid hydrochloride at a yield of 50%. The hydrochloride was dissolved in 45 mL of water and adjusted to pH 7 with 1N sodium hydroxide solution. The solution from extracted three times with ethyl acetate 80 mL, dehydrated dry ethyl acetate phase with anhydrous sodium sulfate, and evaporated to remove the ethyl acetate to give the L- glutamic acid di-ethyl in 60% yield.
【００３１】[0031]
【実施例３】試験管にL-アスパラギン酸塩酸塩１００mg
をはかり取り、酵素としてNovozym４３５を１０mg 加
え、エタノール 1mL に溶解させ、７０℃ で３日間攪拌
して反応を行った。ついで、セライト濾過により酵素を
濾別、エタノールを減圧留去し、L-アスパラギン酸ジエ
チル塩酸塩を得た。当該塩酸塩を水４０mLに溶解し、１
N水酸化ナトリウム溶液で pH７とした。この溶液より７
０mLの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル相を無水硫
酸ナトリウムで脱水乾燥後、酢酸エチルを留去してL-ア
スパラギン酸ジエチルを収率４１%で得た。このL-アス
パラギン酸ジエチル ５４mg に Bacillus subtilis 由
来のプロテアーゼであるビオプラーゼ１６mg（基質に対
して３０重量％）を加え、４０mgの水を添加したアセト
ニトリル１mlに溶解させ、アルゴン雰囲気下、攪拌して
４０℃で３日間重合を行った。ついで、水及び溶媒を減
圧留去し、クロロホルム-三フッ化酢酸（＝１０：０．
５）に溶解させ、不溶の酵素をセライト濾過で除いて、
収率９８％で分子量３５００のポリL-アスパラギン酸エ
チルを得た。Example 3 100 mg of L-aspartate hydrochloride in a test tube
The resulting solution was weighed, 10 mg of Novozym 435 as an enzyme was added, dissolved in 1 mL of ethanol, and stirred at 70 ° C. for 3 days to carry out a reaction. Then, the enzyme was removed by filtration through Celite, and ethanol was distilled off under reduced pressure to obtain diethyl L-aspartate hydrochloride. Dissolve the hydrochloride in 40 mL of water,
The pH was adjusted to 7 with N sodium hydroxide solution. 7 from this solution
The mixture was extracted 3 times with 0 mL of ethyl acetate, the ethyl acetate phase was dehydrated and dried over anhydrous sodium sulfate, and then ethyl acetate was distilled off to obtain diethyl L-aspartate in a yield of 41%. This L-Ass
Bioparase 16 mg (30% by weight based on the substrate), a protease derived from Bacillus subtilis, was added to 54 mg of diethyl paraginate and dissolved in 1 ml of acetonitrile containing 40 mg of water, and the mixture was stirred under an argon atmosphere at 40 ° C. for 3 days. Polymerization was carried out. Then, water and the solvent were distilled off under reduced pressure, and chloroform-trifluoroacetic acid (= 10: 0.
5), dissolve insoluble enzyme by Celite filtration,
Poly L- aspartic acid et molecular weight 3500 in 98% yield
Got chill .
【００３２】[0032]
【実施例４】実施例１及び実施例３で得られたL-アスパ
ラギン酸ジエチル塩酸塩及びL-グルタミン酸ジエチル塩
酸塩をモル比１：１に配合し、酵素ビオプラーゼを用い
て４０℃、３日間重合した結果、収率 ７６％で分子量
２６００のコポリマー塩酸塩を得た。ついで、 ０．５N
NaOH （メタノール：水＝７５：２５）を加え、室温で
４時間攪拌して鹸化を行うことでポリ[(L-アスパラギン
酸ナトリウム)-co-(L-グルタミン酸ナトリウム)]を得
た。Example 4 L-aspartic acid diethyl hydrochloride and L-glutamic acid diethyl hydrochloride obtained in Examples 1 and 3 were blended in a molar ratio of 1: 1 and the enzyme bioprase was used at 40 ° C. for 3 days. As a result of the polymerization, a copolymer hydrochloride having a molecular weight of 2600 was obtained with a yield of 76%. Then, 0.5N
NaOH (methanol: water = 75: 25) was added, and saponification was performed by stirring at room temperature for 4 hours to obtain poly [(L-sodium aspartate) -co- (sodium L-glutamate)].
【００３３】[0033]
【実施例５】グルタミン酸ジエチル５４mgにBacillus s
ubtilis由来のプロテアーゼであるビオプラーゼ１１mg
（基質に対して２０重量％）を加え、１２mgの水を添加
し、アルゴン雰囲気下、攪拌して４０℃で２４時間重合
を行った。ついで水を減圧留去し、クロロホルム-三フ
ッ化酢酸（１０：０．５）に溶解させ、不溶の酵素をセ
ライト濾過で除いて収率５０％で分子量１２１０のポリ
Ｌ-グルタミン酸エチルを得た。[Example 5] glutamic acid diethyl 54mg to Bacillus s
Biopulase 11mg, a protease derived from ubtilis
(20% by weight relative to the substrate) was added, 12 mg of water was added, and the mixture was stirred under an argon atmosphere and polymerized at 40 ° C. for 24 hours. Then, water was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in chloroform-trifluoroacetic acid (10: 0.5), and the insoluble enzyme was removed by filtration through Celite to obtain poly L-glutamate ethyl having a molecular weight of 1210 and a yield of 50%. .
【００３４】[0034]
【実施例６】試料１ｇが完全に二酸化炭素と水に分解し
たときの酸素要求量を理論酸素要求量として下水処理場
の活性汚泥を用いて２５℃で攪拌した際に消費される酸
素量から生分解率を求める方法で、本酵素法により合成
したホモポリマー及びコポリマーのナトリウム塩を従来
からの熱重合で合成したL-アスパラギン酸ナトリウムと
比較した。その結果を図１に示す。この結果から、酵素
法により合成したポリＬ-アスパラギン酸塩及びポリＬ-
グルタミン酸塩のホモポリマーの生分解性は、熱重合の
ホモポリマーであるポリＬ-アスパラギン酸塩より優れ
た生分解性を示し、また、酵素法の場合にＬ-アスパラ
ギン酸塩とＬ-グルタミン酸塩のコポリマーとすること
により生分解性を容易に調節できることが明らかになっ
た。Example 6 The oxygen demand when 1 g of a sample was completely decomposed into carbon dioxide and water was used as the theoretical oxygen demand, and the amount of oxygen consumed when stirred at 25 ° C. using activated sludge in a sewage treatment plant was calculated. The sodium salts of homopolymers and copolymers synthesized by this enzymatic method were compared with sodium L-aspartate synthesized by conventional thermal polymerization in the method of determining the biodegradation rate. The result is shown in FIG. From these results, poly-L-aspartate and poly-L- were synthesized by the enzymatic method.
The biodegradability of glutamate homopolymer is superior to that of poly (L-aspartate), which is a homopolymer of thermal polymerization, and in the case of the enzymatic method, L-aspartate and L-glutamate are biodegradable. It was revealed that the biodegradability can be easily controlled by using the copolymer of.
【００３５】[0035]
【発明の効果】本発明では、上記状況に鑑み、工業的製
法で大量に製造できる酵素を用いて、アスパラギン酸及
びグルタミン酸のエステルを経済的に製造する方法、及
びジエステルを原料として、Bacillus subtilis由来を
用いてアスパラギン酸及びグルタミン酸のポリマーを提
供できる。すなわち、本発明では、酵素重合法におい
て、酵素の種類及び量、水分量、反応温度、反応時間、
基質となるL-アスパラギン酸エステル及びL-グルタミン
酸エステルの種類等の諸条件を検討した結果、リパーゼ
を酵素触媒としてL-アスパラギン酸ジエステル及びL-グ
ルタミン酸ジエステルを合成できる。また、ジエステル
をBacillus subtilis由来の酵素によって処理すること
により、これらのホモポリマー及びコポリマーを容易に
得ることができる。得られたポリマー分子量５００〜１
０，０００程度のもので、完全に無色で、機能性、生分
解性及び生体適合性に優れており、その上、安価である
ため医薬品や化粧品の分野における高分子材料として極
めて有用であり、適用範囲も広く環境低負荷型プロセス
の開発や生分解性機能性高分子素材として活用できる。According to the present invention, in view of the above situation, a method for economically producing an ester of aspartic acid and glutamic acid using an enzyme that can be produced in a large amount by an industrial production method, and a diester as a raw material, derived from Bacillus subtilis Can be used to provide polymers of aspartic acid and glutamic acid. That is, in the present invention, in the enzymatic polymerization method, the type and amount of enzyme, water content, reaction temperature, reaction time,
As a result of examining various conditions such as types of L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester as substrates, L-aspartic acid diester and L-glutamic acid diester can be synthesized using lipase as an enzyme catalyst. Further, by treating the diester with an enzyme derived from Bacillus subtilis, these homopolymers and copolymers can be easily obtained. Obtained polymer molecular weight 500-1
It is about 10,000, completely colorless, excellent in functionality, biodegradability and biocompatibility, and at the same time, it is very useful as a polymer material in the fields of pharmaceuticals and cosmetics because it is inexpensive. It has a wide range of applications and can be used as a low-environment-loading process development and biodegradable functional polymer material.
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図１】ポリ（L-アスパラギン酸ナトリウム）、ポリ
[（L-アスパラギン酸ナトリウム）-co-（L-グルタミン
酸ナトリウム）]、ポリ（L-グルタミン酸ナトリウム）
の生分解性比較FIG. 1 Poly (sodium L-aspartate), poly
[(L-sodium aspartate) -co- (sodium L-glutamate)], poly (sodium L-glutamate)
Comparison of biodegradability
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B064 AE17 AE19 AG01 CA21 CA31 CB24 CB30 CC04 CC06 CC12 CE01 CE08 DA01 DA16 4J001 DA01 EA36 FA03 GA20 JA20 JB01 JB50 4J200 AA02 AA11 BA29 DA12 DA21 DA22 DA24 EA11 EA19 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page F-term (reference) 4B064 AE17 AE19 AG01 CA21 CA31 CB24 CB30 CC04 CC06 CC12 CE01 CE08 DA01 DA16 4J001 DA01 EA36 FA03 GA20 JA20 JB01 JB50 4J200 AA02 AA11 BA29 DA12 DA21 DA22 DA24 EA11 EA19
Claims (5)
てアスパラギン酸又はグルタミン酸と低級アルコールか
ら下記の一般式（１）で表されるアスパラギン酸エステ
ル又は一般式（２）で表されるグルタミン酸エステルの
製造方法。 【化１】 一般式（１） （上式において、R1 と R2 は同一又は異なって、炭素
数１〜３個のアルキル基である）。 【化２】 一般式（２） （上式において、R3 とR4 は同一又は異なって、炭素数
１〜３個のアルキル基である）。1. A method for producing an aspartic acid ester represented by the following general formula (1) or a glutamic acid ester represented by the general formula (2) from aspartic acid or glutamic acid and a lower alcohol using an enzyme lipase or an immobilized lipase. Method. [Chemical 1] General formula (1) (In said formula, R < 1 > and R < 2 > are the same or different and are a C1-C3 alkyl group.). [Chemical 2] General formula (2) (in the above formula, R 3 and R 4 are the same or different and each is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms).
スパラギン酸又はグルタミン酸と低級アルコールの反応
において、アスパラギン酸又はグルタミン酸の鉱酸塩を
用いることを特徴とする請求項１記載のアスパラギン酸
又はグルタミン酸のエステルの製造方法。2. An ester of aspartic acid or glutamic acid according to claim 1, wherein a mineral acid salt of aspartic acid or glutamic acid is used in the reaction of aspartic acid or glutamic acid with a lower alcohol using a lipase or an immobilized lipase. Manufacturing method.
バチルスズブチリス属由来のプロテアーゼにより下記一
般式（３） 【化３】 一般式（３） （式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（Ｉ）及び下記の一般式（４） 【化４】 一般式（４） （式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（II ）を基本構造とする分子量500〜
10,000のポリLーアスパラギン酸エステルの製造方法。3. An L-aspartic acid ester as a raw material,
By a protease derived from Bacillus subtilis, the following general formula (3): A structural unit (I) represented by the general formula (3) (in the formula, R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (4): A molecular weight of 500 to 100, which has a structural unit (II) represented by the general formula (4) (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) as a basic structure.
A method for producing 10,000 poly-L-aspartic acid esters.
下記の一般式（５） 【化５】 一般式（５） （式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位（III）及び下記の一般式（６） 【化６】 一般式（６） （式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である）で
表される構造単位(IV)を基本構造とする分子量500〜10,
000のポリＬ−グルタミン酸エステル。4. An L-glutamic acid ester as a raw material,
The following general formula (5): A structural unit (III) represented by general formula (5) (wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) and the following general formula (6): A molecular weight of from 500 to 10 based on the structural unit (IV) represented by the general formula (6) (wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms)
000 poly L-glutamates.
タミン酸エステルを原料とし、バチルスズブチリス属由
来のプロテアーゼにより一般式（３）より誘導される構
造単位（Ｉ）、一般式（４）より誘導される構造単位
（II）、一般式（５）より誘導される構造単位（III）
及び一般式（６）より誘導される構造単位（IV）からな
るＬ-アスパラギン酸エステルとＬ-グルタミン酸エステ
ルとの分子量500〜10,000のコポリマーの製造方法。 【化７】 一般式（３） （式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である） 【化８】 一般式（４） （式中、R1 は炭素数１〜３個のアルキル基である） 【化９】 一般式（５） （式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である） 【化10】 一般式（６） （式中、R3 は炭素数１〜３個のアルキル基である）5. A structural unit (I) derived from general formula (3) and a general formula (4) derived from a Bacillus subtilis-derived protease using L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester as raw materials. Structural unit (II), structural unit (III) derived from general formula (5)
And a method for producing a copolymer of L-aspartic acid ester and L-glutamic acid ester, which has a structural unit (IV) derived from the general formula (6) and has a molecular weight of 500 to 10,000. [Chemical 7] General formula (3) (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) General formula (4) (in the formula, R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) General formula (5) (wherein R 3 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) Formula (6) (wherein, R 3 is one to three alkyl groups having a carbon number)
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|---|---|---|---|
| JP2001302412A JP2003105081A (en) | 2001-09-28 | 2001-09-28 | Method for manufacturing amino acid-containing polymer by enzyme method |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2019133A1 (en) * | 2006-05-23 | 2009-01-28 | Toyo Boseki Kabushiki Kasisha | MICROORGANISM CAPABLE OF PRODUCING gamma-L-PGA, METHOD FOR PRODUCTION OF gamma-L-PGA USING THE MICROORGANISM, CROSSLINKED PRODUCT, AND AGENT FOR EXTERNAL APPLICATION TO THE SKIN |
-
2001
- 2001-09-28 JP JP2001302412A patent/JP2003105081A/en active Pending
Cited By (4)
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| US8703443B2 (en) | 2006-05-23 | 2014-04-22 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | γ-L-PGA producing microorganism, method of producing γ-L-PGA using the microorganism, crosslinked substance produced using the microorganism, and external dermal agent produced using the microorganism |
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