JP2003098146A - Apparatus for recognizing base sequence, its manufacturing method and its using method - Google Patents

Apparatus for recognizing base sequence, its manufacturing method and its using method

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JP2003098146A JP2001223009A JP2001223009A JP2003098146A JP 2003098146 A JP2003098146 A JP 2003098146A JP 2001223009 A JP2001223009 A JP 2001223009A JP 2001223009 A JP2001223009 A JP 2001223009A JP 2003098146 A JP2003098146 A JP 2003098146A
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Masakazu Baba
Kazuhiro Iida
Hisao Kawaura
Toshimori Sakamoto
Toru Sano
亨 佐野
久雄 川浦
利司 阪本
一浩 飯田
雅和 馬場
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日本電気株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an apparatus for determining the base sequence of DNA inexpensively, efficiently and quickly. SOLUTION: The apparatus is manufactured using semiconductor micromachining technology and comprises two liquid reservoirs separated by an insulation film having pores, two electrodes disposed in two liquid reservoirs, respectively, and a device for measuring a metal ion current passing through the pores when a voltage is applied between the two electrodes.

Description

【発明の詳細な説明】 【0001】 【発明の属する技術分野】本発明は微細配列、特にDN BACKGROUND OF THE INVENTION [0001] [Technical Field of the Invention The present invention is a fine array, in particular DN
A塩基配列の効率の良い微細配列認識装置に関し、更に、特に半導体微細加工技術で作製された小孔を用いたDNAの微細配列認識装置に関する。 Relates efficient fine sequence recognition apparatus A nucleotide sequence, further, in particular, to fine sequence recognition apparatus DNA with small holes made in semiconductor microfabrication technology. 【0002】 【従来の技術】デオキシリボ核酸(DNA)の塩基配列決定やタンパクのアミノ酸配列決定は、信頼性が高く、 [0002] amino acid sequencing of the sequencing and protein BACKGROUND OF THE INVENTION Deoxyribonucleic acid (DNA) is a reliable,
低コストでしかも高速であることが望まれている。 It is desired to be low cost, yet fast. 【0003】DNAの塩基配列決定法として、化学的方法(プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユーエスエー、第74巻、第5 [0003] As the sequencing of DNA, chemical methods (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Vol. 74, No. 5
60頁から第564頁、1977年)と、酵素的方法(プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユーエスエー、第74巻、第54 60 pp. 564 pp., And 1977), enzymatic methods (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Vol. 74, No. 54
63頁から第5467頁、1977年)が1970年代に開発された。 From page 63, pp. 5467, 1977) has been developed in the 1970s. 【0004】化学的方法は、2本鎖DNAを解離させて一本鎖とし、1本鎖DNA中の4種類の塩基のうち1種類だけを分解する方法である。 [0004] Chemical methods, to dissociate the double-stranded DNA and single strands are only a method of decomposing one of the four bases of one strand of DNA. 分解が穏やかであれば、 If decomposition is a gentle,
DNA1分子あたり塩基1個だけランダムな位置で分解される。 Only one base per DNA1 molecule is decomposed at random positions. この結果、長さの異なる一群のDNA断片が得られるが、長さの違いは元のDNA分子中の違った位置にあった4種類の塩基のうち1種類の塩基が分解されたことによる。 As a result, although a group of DNA fragments of different lengths is obtained, the difference in length is by one nucleotide of the four bases were in different locations in the original DNA molecule was degraded. 全塩基に対して同じ操作を行い、それぞれのDNA断片群を並行にゲル電気泳動すると、そのバンドパターンから塩基配列が読み取れる。 Do the same for all base and each DNA fragment group to gel electrophoresis in parallel, the nucleotide sequence is read from the band pattern. 【0005】化学的方法は塩基特異性が低く、不正確であるため、酵素的方法が今日の配列決定の主流である。 [0005] Chemical methods base-specific low, because it is inaccurate, an enzymatic method is a mainstream sequencing today. 【0006】酵素的方法は、まず、配列を決めようとするDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼを用いて生体外でDNA合成を行う。 [0006] Enzymatic methods, first, a DNA to be decide the sequence as a template, performing DNA synthesis in vitro using a DNA polymerase. その際、合成原料である4種類のデオキシリボヌクレオシド三りん酸と1種類の少量のジデオキシリボヌククレオシド三りん酸を加える。 At that time, adding four deoxyribonucleoside triphosphates and one small dideoxyribonucleoside quinuclidine Cleo Sid triphosphate is a synthetic material. ジデオキシリボヌクレオシド三りん酸がDNA鎖に取り込まれると次のヌクレオチドが付加できない。 When dideoxyribonucleoside triphosphate is incorporated into the DNA strand can not be added next nucleotide. 例えば、過剰なデオキシATP(dATP)とジデオキシATP For example, an excess of deoxy ATP (dATP) and dideoxy ATP
(ddATP)が競合すると、DNAポリメラーゼによるDNA鎖の合成はランダムにAのところでストップする。 And (ddATP) conflict, synthesis of a DNA strand by a DNA polymerase to stop at the A randomly. 次に、化学的方法と同じようにゲル電気泳動を行って塩基配列を読み取る。 Next, read the nucleotide sequence by performing the gel electrophoresis in the same way as chemical methods. 【0007】酵素的方法により配列決定できる塩基の長さは数百程度である。 [0007] The length of the base that can sequenced by the enzymatic method is about several hundreds. これはゲル電気泳動の解像度によって制約を受けるからである。 This is because limited by the resolution of gel electrophoresis. そのため、長いDNAを短いDNAに断片化する必要がある。 Therefore, it is necessary to fragment the long DNA into short DNA. まず、DNAを1 First, 1 DNA
0k塩基から100k塩基の長さのクローンにしてすべてのDNAを網羅するDNAライブラリーを作成することからはじめる。 You start by creating a DNA library to cover all DNA was from 0k base length clone 100k base. 各クローンをさらに切断し、分析が可能な長さのDNA断片を作り塩基配列決定を行う。 Each clone was further cut, performing sequencing make DNA fragment analysis possible length. 最後に、塩基配列決定したDNA断片を再構築してもとの完全なDNAの塩基配列を得る。 Finally, to obtain the nucleotide sequence of the complete DNA of the original rebuild the sequenced DNA fragment. この方法は操作が簡単で、並列処理ができるため、今日広く用いられている。 This method is easy to operate, since it is parallel processing, it is widely used today. 【0008】しかし、サブクローンを作成する際、同じ塩基配列を含むDNA断片が多数あるため、実際に塩基配列決定したい部分の10倍から20倍の塩基長を分析することになる。 However, when creating the subclones, the same for DNA fragment containing the nucleotide sequence are many, it would be analyzed actually bases in length from 10 times 20 times the portion to be sequenced. 逆に重複部分が少ないと、塩基配列決定したDNA断片の再構築が難しくなる。 Conversely, when the overlapping portion is small, reconstruction of sequencing the DNA fragment is difficult. 【0009】同じ塩基配列を何度も重複して塩基配列決定する必要がない方法に、プライマーウォーキング法がある(サイエンス、第258巻、第1787頁から第1 [0009] The method need not be sequenced with the same nucleotide sequence also duplicated many times, there is a primer walking method (Science, 258, pp. First from pages 1787
791頁、1992年)。 791 pp., 1992). プライマーウォーキング法では、巨大DNAをそのまま試料DNAとして用いる。 The primer walking method, is directly used as a sample DNA giant DNA. まず試料DNAの一部分の塩基配列を決定する。 First determines the base sequence of the portion of the sample DNA. 次に、決定した塩基配列を元に、塩基配列決定した部分に特異的にハイブリダイズするプライマーを合成して次の部分のDNA塩基配列を決定する。 Then, based on the determined nucleotide sequence, primers that specifically hybridize to nucleotide sequence determination portion combined to determine the DNA base sequence of the following parts. プライマーウォーキング法では、重複して塩基配列決定する部分を最小にできるが、塩基配列決定毎にプライマーを合成する必要がある。 The primer walking method, can a portion overlapping bases sequenced minimum, there is a need to synthesize primers for each sequencing. 【0010】同じく、巨大DNAをそのまま塩基配列決定できる方法に、チャネル法がある(US Paten [0010] Also, the method can be directly sequencing the giant DNA, there is a channel method (US Paten
t 6015714 または プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユーエスエー、第93巻、第13770頁から第13773 t 6015714 or Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 93 Volume, the first from pp. 13770 13773
頁、1996年)。 Page, 1996). チャネル法では、金属イオンを含む溶液を小孔(チャネル)をもつ脂質二重層によって2つに分け、一方の溶液に一本鎖DNAを入れる。 The channel method, a solution containing metal ions in two by a lipid bilayer having a small hole (channel), add single-stranded DNA in one solution. 分けられた溶液に電圧を加えると、負に帯電したDNAは電位差に沿って、小孔を通過して、もう一方の溶液へと移動する。 When a voltage is applied separately obtained solution, charged DNA along the potential negative, through the small holes, moved to the other solution. DNAを構成している各4種類の塩基の大きさが異なるため、塩基の違いによって小孔を塞ぐ割合が異なる。 Since the size of each four bases constituting the DNA is different, the rate of closing a small hole is different depending of the base differences. そのため、小孔のイオン電流を測定すると、塩基の違いによってイオン電流に差が生じる。 Therefore, when measuring the ion current of the small hole, a difference in ion current is generated by the base difference. DNAが小孔を通過している時に、イオン電流を逐次計測することで、 When DNA is passing through the small holes, by sequentially measuring the ion current,
DNAの塩基配列決定ができる。 Can sequencing of DNA. 【0011】小孔には、食中毒菌である黄色ぶどう球菌の毒素であるアルファーヘモリシンや、大腸菌のマルトーポーリンが用いられる。 [0011] small holes, and alpha-hemolysin is a toxin of Staphylococcus aureus is a food poisoning bacteria, the Marteau Pauline E. coli is used. アルファーヘモリシンやマルトーポーリンはチャネルタンパクと呼ばれ、脂質二重層に数ナノメーターの開口部をもつ小孔を形成する。 Alpha hemolysin and Marteau porin called channel proteins, to form a small hole having an opening of a few nanometers to a lipid bilayer. チャネルタンパクは、DNA塩基配列決定の他に、分子アダプターを用いた分子計数(ネイチャー、第398巻、第686頁から第690頁、1999年)や、ポリマーの計数(ネイチャー、第370巻、第279頁から第28 Channel protein, in addition to DNA sequencing, molecular counting using a molecular adapter (Nature, # 398, pp. 690 pages from the 686 pages, 1999) and, counting the polymer (Nature, 370, pp. The 279 pp. 28
1頁、1994年)などのバイオセンサーとして働くことが知られている。 One page, has been known to act as a biosensor, such as 1994). 【0012】 【発明が解決しようとする課題】化学的方法と酵素的方法による塩基配列決定では、同じ塩基配列部分を重複して読む必要があり、塩基配列の規模が大きくなると、手間と時間が膨大にかかる。 [0012] In sequencing by chemical methods and enzymatic methods [0006] should be read in duplicate to the same nucleotide sequence region, the scale of the base sequence increases, time and effort is according to the enormous. 効率を上げるため重複を少なくすると、塩基配列決定した各DNA断片を繋ぎあわせるのが困難となり、元の長いDNA塩基配列を再構成できないという問題があった。 When reducing the overlap to increase efficiency, it is difficult to Awa connecting each DNA fragment sequenced, making it impossible reconstruct the original long DNA sequence. また、クローニングされにくい配列が存在し、読み取られない部分が生じ、再構成できないという問題もあった。 Also, there cloned hardly array is not read portion occurs, there is a problem that can not be reconfigured. 【0013】プライマーウォーキング法では、常に塩基配列決定した部分から次のプライマーを合成して用いるために、塩基配列決定した部分の繋がりは明確である利点がある。 [0013] In the primer walking method, from the portion always sequenced for use by synthesizing the following primers, it leads sequencing portions has the advantage is clear. しかし、塩基配列決定は1本のDNA鎖を片方から順次、数百塩基毎に行う必要があるため処理能力に限界があること、さらに、塩基配列決定した部分を元に合成したプライマーがうまく機能せずに、全塩基配列決定が困難となる問題があった。 However, sequencing sequentially a single DNA strand from one hundreds capacity needs to be performed for each base that there is a limit in further synthesized primer works well based on the nucleotide sequence determined portion without, there is a problem that the entire sequencing difficult. 【0014】チャネル法では、小孔に食中毒菌である黄色ぶどう球菌の毒素のアルファーヘモリシンや、大腸菌のマルトーポーリンなどを用いているために、小孔形成自体に危険を伴う。 [0014] In channel method, due to the use or alpha hemolysin toxin of Staphylococcus aureus is a food poisoning bacteria stoma, and maltose porin of E. coli, dangerous to stoma formation itself. また、小孔の形成は偶然性が伴い、 The formation of the small hole is accompanied by chance,
脂質二重層中に形成されるチャネルの数、位置などを制御することは困難である。 The number of channels formed in the lipid bilayer, it is difficult to control the position or the like. 以上の理由のため、これまで原理実験が行われたにとどまり、塩基配列決定や分子計測が一部の生化学者を除いて、一般に行われることはなかった。 For these reasons, it remains hitherto principle experiment was conducted, except biochemist sequencing and molecular measurement part, did not generally carried out. 【0015】 【発明の目的】上記問題を解決するため、本発明の目的は、DNAを断片DNAに分ける必要がなく、安全で、 [0015] SUMMARY OF THE INVENTION To solve the above problems, an object of the present invention, there is no need to separate the DNA into fragments DNA, safe,
高速、しかも制御性の高い塩基配列決定装置を提供することにある。 Fast, yet to provide a highly controllable sequencing device. 更に、DNAに限らず、分子や細胞など微細な配列の認識を可能にする装置を提供することにある。 Further, there is provided a device which enables recognition of not only the such as DNA, molecular and cellular fine array. 【0016】 【課題を解決するための手段】本発明の構成(A)のD D configuration (A) of [0016] According to an aspect of the present invention
NAの微細配列認識装置では、小孔を持つ絶縁膜と、絶縁膜で分離され金属イオンを含む溶液を入れる二つの液溜め、二つの液溜めのそれぞれに設置された二つの電極と、二つの電極間に電圧を加えるための電圧源、小孔を通過する金属イオンによる電流を計測できる電流計を備える。 A fine sequence recognition apparatus NA is an insulating film having a small hole, the two add a solution containing metal ions are separated by an insulating film liquid reservoir, two installed in each of the two liquid reservoirs and the electrodes, the two voltage source for applying a voltage between the electrodes, comprising an ammeter capable of measuring the current caused by metal ions to pass through the stoma. 【0017】本発明の構成(B)のDNAの微細配列認識装置では、小孔を持つ絶縁膜と、絶縁膜で分離され金属イオンを含む溶液を入れる二つの液溜め、二つの液溜めのそれぞれに設置された二つの電極と、二つの電極間に電圧を加えるための電圧源、小孔を通過する金属イオンによる電流を計測できる電流計、小孔付近に対向した位置に設置された第3、第4の電極と、前記第3と第4 [0017] In fine sequence recognition device of the DNA structure (B) of the present invention, an insulating film having a small hole, a solution of two sump add containing metal ions are separated by an insulating film, each of the reservoirs two liquid and two electrodes disposed in a voltage source for applying a voltage between the two electrodes, a current meter capable of measuring the current caused by metal ions to pass through the small hole, third placed at a position opposed to the vicinity of the ostium a fourth electrode, and the third fourth
の電極間の伝導度を測定できる装置を備える。 Comprising a device capable of measuring the conductivity between electrodes. 【0018】本発明の構成(C)のDNAの微細配列認識装置では、小孔を持つ圧電薄膜と、圧電薄膜で分離され金属イオンを含む溶液を入れる二つの液溜め、前記二つの液溜めのそれぞれに設置された二つの電極と、二つの電極間に電圧を加えるための電圧源、小孔を通過する金属イオンによる電流を計測できる電流計、圧電薄膜の両面に設置された1対の圧電膜制御用電極、圧電膜制御用電極間に電圧を加えるための電圧源を備える。 [0018] In fine sequence recognition device of the DNA structure (C) of the present invention, a piezoelectric thin film having a small hole, the solution reservoirs two liquid add containing metal ions are separated by the piezoelectric thin film, the two liquid reservoir and two electrodes disposed in each of the voltage source for applying a voltage between the two electrodes, a current meter capable of measuring the current caused by metal ions to pass through the small hole, the pair disposed on both surfaces of the piezoelectric thin film piezoelectric comprising film control electrode, a voltage source for applying a voltage between the piezoelectric film control electrode. 【0019】なお、以上の微細配列認識装置は、分子計数、分子ふるい、分子ソータへの転用が可能である。 [0019] The above fine sequence recognition apparatus, molecule counting, molecular sieves, are possible diversion to molecules sorter. 【0020】 【作用】本発明では、半導体微細加工技術を用いて絶縁膜に小孔を形成し、脂質二重層におけるタンパクチャネルの役割を担わせる。 [0020] According to the present invention, the small hole formed in the insulating film by using a semiconductor microfabrication techniques to play a role in protein channels in a lipid bilayer. タンパクチャネルに比べると作製における安全性が高く、かつ制御性がよい。 High safety in manufacturing as compared to a protein channel, and good controllability. また、経時変化や溶液のpHに対して安定性が高い。 Moreover, the high stability against pH changes over time or a solution. 例えば、シリコン窒化膜は経時劣化がなく、また酸あるいはアルカリ溶液に対して耐性があり用いるバッファー液を選ばない。 For example, a silicon nitride film is no deterioration with time, also choose a buffer solution used is resistant to acid or alkaline solution. さらに、メンブレインに加工すると、平坦性が高くまた強度の高い膜ができる。 Furthermore, when processed into membrane, it is highly increased the strength flat membrane. これは、シリコン窒化膜の適度な内部応力のためである。 This is due to the moderate internal stress of the silicon nitride film. 【0021】小孔を形成するには、集束イオンビーム装置によるエッチング、あるいは、高解像度電子線レジスト、例えばカリックスアレーン系の電子線レジストを用いる。 [0021] To form the small hole is etched by a focused ion beam system or a high-resolution electron beam resist, for example, an electron beam resist of calixarene. 【0022】集束イオンビーム装置は、ガリウムなどの固体金属のイオン源から放出される金属イオンを数nm The focused ion beam apparatus, the number nm of metal ions emitted from the ion source of solid metal such as gallium
にまで集束させることができる。 It can be focused to a. 集束したイオンビームを絶縁膜あるいは半導体膜に照射すると、エッチングされて微小な孔を開けることができる。 When irradiating a focused ion beam to the insulating film or a semiconductor film is etched can be opened a small hole. 孔の直径は10n The diameter of the hole 10n
m以下が可能であり、イオンビーム径あるいはイオンドーズを調整することにより孔の直径を変えることができる(ジャーナル・オブ・バキューム・サイエンス・アンド・テクノロジーB、第15巻、第2373頁から第2 m or less can be, by adjusting the ion beam diameter or ion dose can be changed diameter of the hole (Journal of Vacuum Science and Technology B, Vol. 15, pp first 2373 second
378頁、1997年)。 378 pp., 1997). 本集束イオンビーム装置を用いれば、本発明にある小孔を容易に作製することができる。 With the present focused ion beam apparatus, it is possible to easily produce a small hole in the present invention. さらに、タングステンカルボニルガス雰囲気中で、 Furthermore, in the tungsten carbonyl gas atmosphere,
ガリウムイオンを照射すると、タングステンがビームの照射された位置に堆積する。 Upon irradiation with gallium ions, to deposit tungsten is irradiated beam position. このことから、微小な電極を所望の位置に形成することが可能である。 Therefore, it is possible to form a fine electrode at a desired position. 【0023】小孔を形成する第2の方法は、カリックスアレーン系の高解像度電子ビームレジストを用いることである。 The second method of forming a stoma is to use a high-resolution electron beam resist calixarene. カリックスアレーン系の高解像度電子ビームレジストは解像度が高く、カッリクスアレーンで10nm Calixarene high resolution electron beam resist has high resolution, 10 nm in cut Rikusu arene
(アプライド・フィジックス・レター、第68巻、第1 (Applied Physics Letters, Vol. 68, No. 1
297頁より第1299頁、1996年)、クロロメチルカッリクスアレーンで13nm(アプライド・フィジックス・レター、第77巻、第301頁より第303 297 pages from pages 1299, 1996), 13 nm chloromethyl cut Rikusu arene (Applied Physics Letters, Vol. 77, than the 301 pages 303
頁、2000年)である。 Page, which is 2000 years). 【0024】 【発明の実施の形態】次に、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。 DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described in detail with reference to the drawings, embodiments of the present invention. 本発明の微細配列認識装置は図1に示されている。 Fine sequence recognition apparatus of the present invention is shown in FIG. 【0025】(実施例1)図1Aは本発明の実施例1の外観を示している。 [0025] (Embodiment 1) Figure 1A shows an appearance of a first embodiment of the present invention. 流路を設けた基板10の上に絶縁膜11が配置され、さらに絶縁膜11をガラスカバー12 Insulating film 11 on the substrate 10 provided with the flow path is arranged, further a glass cover insulating film 11 12
が覆っている。 It covers. ガラスカバー12には、バッファー入口13とバッファー出口15、試料入口14の入出力ポートが設けられる。 A glass cover 12, the buffer inlet 13 and the buffer exit 15, input and output ports of the sample inlet 14 is provided. 絶縁膜11からは電極に接続された配線が延び、電圧源16と電流計17に接続されている。 Wiring connected to the electrode extends from the insulating film 11, and is connected to a voltage source 16 and the ammeter 17. 【0026】図1Bは本発明の実施例1の内部構造を示している。 [0026] Figure 1B shows the internal structure of the first embodiment of the present invention. (1)流路20を設けた基板10と、(2) (1) and the substrate 10 provided with the flow channel 20, (2)
陽極21および23、陰極22、バッファー入口13およびバッファー出口15から流路20へ通ずるための貫通孔24および26、試料入口14と流路20へ通ずる小孔25が形成された絶縁膜11、(3)バッファー入口13、バッファー出口15、試料入口14が形成されたガラスカバー12、から構成される。 The anode 21 and 23, the cathode 22, the buffer inlet 13 and the buffer through holes 24 and 26 for leading into the flow channel 20 from the outlet 15, the sample inlet 14 and the insulating holes 25 leading into the flow channel 20 is formed film 11, ( 3) buffer inlet 13, a buffer outlet 15, glass cover 12 sample inlet 14 is formed composed. 【0027】試料の溶液およびバッファー溶液は金属イオンを含み導電性とする。 The solution and buffer solution samples and conducting comprises a metal ion. 試料の溶液は陰極22と接触して陰極と等しい電位を持つ、一方、バッファー溶液は陽極21および23と接触して陽極と等しい電位を持つ。 The solution of the sample having the same potential as the cathode in contact with the cathode 22, whereas, the buffer solution having the same potential as the anode in contact with the anode 21 and 23. 試料の溶液とバッファー溶液の電位差は、電圧源1 The potential difference between the solution and the buffer solution of the sample, the voltage source 1
6によって制御される。 It is controlled by 6. 小孔を金属イオンや帯電した分子が通過すると回路に電流が流れ、電流は電流計17で検出される。 Circuit current flows in the molecule pores and metal ions and charge passes, current is detected by the ammeter 17. 【0028】図2Aは絶縁膜11上の小孔25付近を真上から見た図で、本実施例の場合の電極配置を示している。 [0028] Figure 2A is a view from directly above the small holes 25 near on the insulating film 11, shows the arrangement of electrodes in the present embodiment. 陰極22は小孔を取り囲むように配置される。 Cathodes 22 are disposed so as to surround the stoma. 【0029】図3および図4は本発明の実施例1に関する動作原理について説明したものである。 [0029] Figures 3 and 4 are those described for the operation principle of the first embodiment of the present invention. 図3A、図4 Figure 3A, Figure 4
Aは絶縁膜11を貫く小孔25付近の断面図である。 A is a cross-sectional view of the vicinity of the small holes 25 penetrating the insulating film 11. 陽極21および陰極22は、図1では絶縁膜上にあるが、 The anode 21 and cathode 22 is located on the insulating film 1,
本図では模式的に溶液中に表示している。 In this figure it is displayed in the solution schematically. 【0030】図3Aにおいて、絶縁膜11を境にして試料を含む溶液41とバッファー液42に分けられている。 In FIG. 3A, it is divided to the solution 41 and the buffer solution 42 containing the sample to the boundary of the insulating film 11. 各溶液には正または負に帯電した金属イオンが含まれている。 Each solution contains a metal positively or negatively charged ions. 電圧源16を用いて電圧を、陰極22と陽極21の間に加えると、陰極22と等電位である試料を含む溶液41と陽極21と等電位であるバッファー液42 A voltage by using the voltage source 16, the addition between the cathode 22 and anode 21, the buffer solution is equipotential with the solution 41 and the anode 21 including a sample is equipotential with the cathode 22 42
に電位差Vが生じる。 The potential difference V is generated. 小孔の両端に電位差が生じると、 If the potential difference across the ostium caused,
負に帯電した金属イオンは小孔を通過して、陰極側から陽極側へと電位勾配に沿って移動する。 Negatively charged metal ions through the small hole, to move along the potential gradient from the cathode side to the anode side. 一方、正に帯電した金属イオンは小孔を通過して、陽極側から陰極側へと電位勾配に沿って移動する。 On the other hand, positively charged metal ions through the small hole, to move along the potential gradient from the anode side to the cathode side. その結果、金属イオンが電荷を運び、外部回路に電流が生じる。 As a result, it carries metal ions charge, current is generated in an external circuit. 電流の大きさは、小孔を通過する金属イオンの単位時間あたりの数に比例する。 The magnitude of the current is proportional to the number per unit of metal ion transit time through the small holes. 金属イオンの単位時間あたりの数は小孔の断面積S、電位差Vに対して比例の関係にあり、小孔の長さLに対して逆比例の関係にある。 The number per unit of time metal ions are in a proportional relationship with respect to the cross-sectional area S, the potential difference V of the stoma, is inversely proportional to the length L of the small holes. 【0031】図3Aは、さらに、試料として分子44を溶液41に加えた場合を示している。 [0031] Figure 3A also shows a case of adding a molecular 44 as a sample solution 41. 分子44は小孔2 Molecule 44 small holes 2
5の開口幅よりも小さいとする。 5 small to than the opening width of. 試料を含む溶液41とバッファー溶液42の間に電位差Vを加えた時に観測される模式的な電流を図3Bに示す。 A schematic current observed when applying a potential difference V between the solution 41 and the buffer solution 42 containing the sample shown in Figure 3B. 分子Aが小孔を通過すると、小孔の一部が塞がれるため、見かけ上の断面積Sが小さくなる。 If molecules A to pass through a small hole, a part of the small holes are blocked, the cross-sectional area S of the apparent decreases. そのため、小孔を通過する金属イオンの数が変化し、電流が変調される。 Therefore, the number of metal ions passing through the small holes is changed, the current is modulated. 電流の変調の大きさは、小孔を通過する分子のサイズに比例する。 The magnitude of the modulation of the current is proportional to the size of the molecules passing through the small holes. 電流の変調の回数を数えることで溶液中に含まれる試料分子の濃度を知ることでき、変調の大きさで分子のサイズを知ることができる。 Can know the concentration of the sample molecules contained in the solution by counting the number of modulation of the current, it is possible to know the size of the molecules in the size of the modulation. 図3Bの例では、試料分子が3個、小孔を通過したことを示している。 In the example of FIG. 3B, 3 or the sample molecules, shows that has passed through the small holes. 本方法により、分子の計数、サイズ測定が実現できることがわかる。 By this method, the counting of the molecule, it can be seen that the size measurement can be realized. 【0032】図4Aは、試料として一本鎖DNA45を溶液41に加えた場合を示している。 [0032] Figure 4A shows a case of adding the single-stranded DNA45 solution 41 as a sample. 一本鎖DNAはサイズの異なる塩基であるアデニン(a)、チミン(t)、 Adenine single-stranded DNA is a base of different size (a), thymine (t),
グアニン(g)、シトシン(c)が糖―リン酸のバックボーンに結合した鎖状のポリマーである。 Guanine (g), cytosine (c) sugar - is a chain polymer attached to the backbone of the phosphoric acid. 一本鎖DNAが小孔に入ると、電流が変調され、電流の大きさは各塩基によって異なる。 When single-stranded DNA enters the small hole, a current is modulated, the current magnitude different for each base. したがって、電流の変調を観測することで、塩基配列を決定することができる。 Therefore, by observing the modulation of the current, it is possible to determine the nucleotide sequence. 図4Bは、観測電流を模式的に示したもので、本例では、DNAの塩基配列を、 ggtatgccaa ttattcaacg ttac 24 と決定できる。 4B is observed current an illustration schematically, in this example, the base sequence of DNA, it can be determined that ggtatgccaa ttattcaacg ttac 24. 【0033】DNAを構成している塩基のいずれかを修飾することにより、観測電流の変化を大きくすることができる。 [0033] By modifying one of the bases constituting the DNA, it is possible to increase the change of the observation currents. 例えば、前記グアニン(g)に蛍光標識を付加したヌクレオチドをグアニンの位置に挿入する。 For example, to insert the nucleotide of adding a fluorescent label to the guanine (g) at the position of guanine. 小孔を前記標識を付加したグアニンが通過すると観測電流が増大し、グアニンのDNA内での位置をより正確に求めることができる。 And the observed current guanine pores obtained by adding the label passes is increased, it is possible to determine the position in the DNA guanine more accurately. 蛍光標識を付加したグアニン以外にも、 In addition to guanine obtained by adding a fluorescent label,
アデニン(a)、チミン(t)、シトシン(c)を標識で修飾した塩基を用いることにより、より正確な認識が可能となる。 Adenine (a), thymine (t), by using a base having a modified cytosine (c) labeled, thereby enabling more accurate recognition. 【0034】図6は、本発明の実施例1の微細配列認識装置の作製工程を示している。 [0034] FIG 6 shows a manufacturing process of a fine sequence recognition apparatus of the first embodiment of the present invention. 基板としてシリコン基板を用い、半導体微細加工技術を用いて、微細配列認識装置を実際に作製した。 The silicon substrate used as the substrate, using semiconductor microfabrication techniques to actually produce a fine array recognizer. 【0035】(図6A)用いる基板はシリコン基板で、 [0035] (Fig. 6A) used substrate is a silicon substrate,
表面にシリコン窒化膜102、さらにシリコン酸化膜1 Silicon nitride film 102 on the surface, further silicon oxide film 1
01、裏面にシリコン窒素化膜104を気相成長法にて形成する。 01, a silicon nitrogen film 104 is formed by vapor deposition on the back surface. シリコン窒化膜102および104の膜厚は10nmから100nm程度、シリコン酸化膜の膜厚は300nm程度である。 Thickness of the silicon nitride film 102 and 104 100nm order of 10 nm, the film thickness of the silicon oxide film is about 300 nm. 裏面のシリコン窒化膜104をテトラメチルアンモニウムハライド(TMAH)25% The back surface of the silicon nitride film 104 tetramethylammonium halide (TMAH) 25%
を用いてエッチングを行い、シリコン窒化膜102が露出するまで溝105、106、107を形成する。 Etching is performed using the silicon nitride film 102 is formed a groove 105, 106 to expose. TM TM
AHの代わりに水酸化カリウム(KOH)を用いてもよい。 It may be used potassium hydroxide (KOH) instead of AH. 溝105と106および107と106の間の領域も同様にシリコン基板をエッチングする。 The area between the grooves 105 and 106 and 107 and 106 to etch the silicon substrate in the same manner. (図6B)表面のシリコン酸化膜101の一部を開口し、開口部111、112、113を設け、シリコン窒化膜が露出したシリコン窒化膜メンブレン114、11 Opening a portion of the silicon oxide film 101 (Fig. 6B) surface, the openings 111, 112, and 113 provided, the silicon nitride film membrane 114,11 silicon nitride film is exposed
5、116が形成される。 5,116 is formed. (図6C)真空蒸着法を用いて金電極121から126 Gold electrode 121 with reference to (Figure 6C) vacuum deposition 126
を形成する。 To form. 金電極の膜厚は5nmから100nm程度である。 The film thickness of the gold electrode is 100nm order of 5 nm. (図6D)集束イオンビーム装置によりシリコン窒化膜メンブレン114、115、116の一部をエッチングして貫通孔131、133および小孔132を一個以上開ける。 Opening (Figure 6D) focused ion beam device a part of the silicon nitride film membrane 114, 115, 116 are etched through-holes 131, 133 and small holes 132 one or more by. 集束イオンビーム装置を用いる代わりに、カリックスアレーンまたはクロロメチル化カリックスアレーンを用いて電子ビーム露光を行ってエッチングマスクを形成し、反応性イオンエッチングで貫通孔を開けてもよい。 Instead of using a focused ion beam apparatus, an etching mask is formed by performing electron beam exposure using a calixarene or chloromethylated calixarene may open the through hole by reactive ion etching. また、貫通孔131、133はフォトレジストを用いてパターンニングを行った後、反応性イオンエッチング等でエッチングしてもよい。 The through-holes 131 and 133 after the patterning using a photoresist may be etched by reactive ion etching. 小孔132において、集束イオンビーム装置中でイオンビームを、または走査型電子顕微鏡中で電子ビームを照射することにより、コンタミネーションを堆積させ、孔のサイズを狭めることができる。 In the small holes 132, the ion beam in a focused ion beam system, or by irradiating an electron beam in a scanning electron microscope, is deposited contamination, it can be narrowed pore size. または、真空蒸着や電気メッキ法により金属を堆積させてもよい。 Or metal may be a deposited by vacuum deposition or electroplating. 電気メッキ法を用いる際には、小孔を通過する金属イオン数を計測しながら行うと、制御よく孔を狭めることができる。 When using electrical plating method, performed while measuring the metal number ions passing through the small holes, it is possible to narrow the control well bore. (図6E)出入口を設けたガラスカバーを上面へ、さらにガラス基板を裏面へ接着する。 To the upper surface (FIG. 6E) glass cover provided with inlet and outlet, further bonding a glass substrate to the back. 接着は陽極接合によって行う。 Bonding is performed by anodic bonding. 接着はPMMAなどのポリマーを用いて行ってもよい。 Bonding may be performed using a polymer such as PMMA. 【0036】以上の工程より、微細配列認識装置を作製することができる。 [0036] From the above process, it can be produced a minute sequence recognizer. 図9Aは作製した微細配列認識装置の小孔の電子顕微鏡写真である。 Figure 9A is an electron micrograph of the small hole of the fine SEQ device manufactured. 【0037】(実施例2)本発明の実施例2について説明する。 [0037] For Example 2 (Embodiment 2) The present invention will be described. 本発明の実施例2の外観および内部構造は、絶縁膜11上の陰極22の形状と2つの電極31、32が異なる以外は図1Aおよび図1Bと同じである。 Appearance and internal structure of the second embodiment of the present invention, except that the shape and the two electrodes 31 and 32 of the cathode 22 on the insulating film 11 is different from the same as FIG. 1A and 1B. 【0038】図2Bは絶縁膜11上の小孔25付近を真上から見た図で、本実施例の電極配置を示している。 [0038] Figure 2B is a view seen from directly above the small holes 25 near on the insulating film 11, shows the electrode arrangement of the present embodiment. 陰極22とは別に、第3、第4の電極31および32が配置される。 Apart from the cathode 22, the third, fourth electrode 31 and 32 are arranged. 電極31、32は小孔を挟んで近接して配置される。 Electrodes 31 and 32 are arranged close across the ostium. 【0039】第3および第4の電極31および32によって、分子が小孔25を通過している時に、分子の伝導度を測定することができる。 [0039] the third and fourth electrodes 31 and 32, when the molecule is passing through the holes 25, it is possible to measure the conductivity of the molecules. DNAの4種類の塩基は、 Four bases of DNA,
電子雲の形がそれぞれ異なるため、伝導度が異なる。 Since the shape of the electron cloud are different, they have different conductivities. よって、第3および第4の電極31および32間の伝導度によって、塩基配列を知ることができる。 Thus, the conductivity between the third and fourth electrodes 31 and 32, it is possible to know the nucleotide sequence. 陽極22と陰極21間の電流とともに、塩基配列決定を補完する働きをする。 With current between anode 22 and cathode 21, it serves to supplement the sequencing. 【0040】図7は、本発明の実施例2の微細配列認識装置の作製工程を示している。 [0040] Figure 7 shows a manufacturing process of a fine sequence recognition apparatus of the second embodiment of the present invention. 基板としてシリコン基板を用い、半導体微細加工技術を用いて、微細配列認識装置を実際に作製する。 The silicon substrate used as the substrate, using semiconductor microfabrication techniques to actually produce a fine array recognizer. 【0041】(図7A)用いる基板はシリコン基板で、 [0041] (Figure 7A) using the substrate is a silicon substrate,
表面にシリコン窒化膜102、さらにシリコン酸化膜1 Silicon nitride film 102 on the surface, further silicon oxide film 1
01、裏面にシリコン窒素化膜104を気相成長法にて形成する。 01, a silicon nitrogen film 104 is formed by vapor deposition on the back surface. シリコン窒化膜102および104の膜厚は10nmから100nm程度、シリコン酸化膜の膜厚は300nm程度である。 Thickness of the silicon nitride film 102 and 104 100nm order of 10 nm, the film thickness of the silicon oxide film is about 300 nm. 裏面のシリコン窒化膜104をテトラメチルアンモニウムハライド(TMAH)25% The back surface of the silicon nitride film 104 tetramethylammonium halide (TMAH) 25%
を用いてエッチングを行い、シリコン窒化膜102が露出するまで溝105、106、107を形成する。 Etching is performed using the silicon nitride film 102 is formed a groove 105, 106 to expose. TM TM
AHの代わりに水酸化カリウム(KOH)を用いてもよい。 It may be used potassium hydroxide (KOH) instead of AH. 溝105と106および107と106の間の領域も同様にシリコン基板をエッチングする。 The area between the grooves 105 and 106 and 107 and 106 to etch the silicon substrate in the same manner. (図7B)表面のシリコン酸化膜101の一部を開口し、開口部111、112、113を設け、シリコン窒化膜メンブレン114、115、116が形成される。 Opening a portion of the silicon oxide film 101 (Fig. 7B) surface, the openings 111, 112, and 113 provided, the silicon nitride film membrane 114, 115, 116 are formed. (図7C)真空蒸着法を用いて金電極121から126 Gold electrode 121 with reference to (Figure 7C) vacuum deposition 126
を形成する。 To form. 金電極の膜厚は5nmから100nm程度である。 The film thickness of the gold electrode is 100nm order of 5 nm. さらに、集束イオンビーム装置を用いて、電極127を形成する。 Further, by using a focused ion beam apparatus, to form the electrode 127. (図7D)集束イオンビーム装置によりシリコン窒化膜メンブレン114、115、116の一部をエッチングして貫通孔131、133および小孔132を一個以上の開ける。 (Figure 7D) focused ion beam device a part of the silicon nitride film membrane 114, 115, 116 and a through hole 131, 133 and small holes 132 of one or more by etching by. 集束イオンビーム装置を用いる代わりに、カリックスアレーンまたはクロロメチル化カリックスアレーンを用いて電子ビーム露光を行ってエッチングマスクを形成し、反応性イオンエッチングで貫通孔および小孔を開けてもよい。 Instead of using a focused ion beam apparatus, an etching mask is formed by performing electron beam exposure using a calixarene or chloromethylated calixarene may open the through hole and the small hole by reactive ion etching. 小孔132を作製する際、電極127 Making the small hole 132, the electrode 127
を切断することにより、電極134および135を作製する。 By cutting, to form an electrode 134 and 135. また、貫通孔131、133はフォトレジストを用いてパターンニングを行った後、反応性イオンエッチング等でエッチングしてもよい。 The through-holes 131 and 133 after the patterning using a photoresist may be etched by reactive ion etching. (図7E)出入口を設けたガラスカバーを上面へ、さらにガラス基板を裏面へ接着する。 Top surface (Fig. 7E) glass cover provided with inlet and outlet, further bonding a glass substrate to the back. 接着は陽極接合によって行う。 Bonding is performed by anodic bonding. 接着はPMMAなどのポリマーを用いて行ってもよい。 Bonding may be performed using a polymer such as PMMA. 以上の工程より、微細配列認識装置を作製することができる。 From the above steps, it is possible to produce a fine array recognizer. 図9Bは実施例2により作製した微細配列認識装置の小孔の電子顕微鏡写真である。 Figure 9B is an electron micrograph of the small hole of the fine SEQ device manufactured in accordance with Example 2. 【0042】(実施例3)本発明の実施例3について説明する。 [0042] For Example 3 (Embodiment 3) The present invention will be described. 本発明の実施例2の外観および内部構造は、絶縁膜11上の陰極22の形状と2つの電極31、32が異なる以外は図1Aおよび図1Bと同じである。 Appearance and internal structure of the second embodiment of the present invention, except that the shape and the two electrodes 31 and 32 of the cathode 22 on the insulating film 11 is different from the same as FIG. 1A and 1B. また、 Also,
絶縁膜11は圧電効果を有する圧電薄膜とする。 Insulating film 11 is a piezoelectric thin film having piezoelectric effect. 【0043】図2Cは絶縁膜11上の小孔25付近を真上から見た図で、本実施例の電極配置を示している。 [0043] Figure 2C is a view from directly above the small holes 25 near on the insulating film 11, shows the electrode arrangement of the present embodiment. 陰極22とは別に、圧電薄膜制御用の電極33および34 Apart from the cathode 22, electrodes 33 and 34 of the piezoelectric thin film control
が配置される。 There are located. 電極33、34は圧電薄膜35の表面および裏面にそれぞれ配置される。 Electrodes 33 and 34 are arranged respectively on the front and back surfaces of the piezoelectric thin film 35. 【0044】図5は本発明の実施例3に関する動作原理について説明したものである。 [0044] Figure 5 is for explaining the operation principle of the third embodiment of the present invention. 図5Aは圧電薄膜35を貫く小孔25付近の断面図である。 Figure 5A is a cross-sectional view of holes 25 near penetrating the piezoelectric thin film 35. 陽極21および陰極22は、図1では絶縁膜上にあるが、本図では模式的に溶液中に表示している。 The anode 21 and cathode 22 is located on Figure 1, the insulating film, are displayed in the solution schematically in the figure. 【0045】図5Aにおいて、圧電薄膜35を境にして試料を含む溶液41とバッファー液42に分けられている。 In FIG 5A, it is divided into the solution 41 and the buffer solution 42 containing the sample and the piezoelectric thin film 35 as a boundary. 各溶液には正または負に帯電した金属イオンが含まれている。 Each solution contains a metal positively or negatively charged ions. 電圧源16を用いて電圧を、陰極22と陽極21の間に加えると、陰極22と等電位である試料を含む溶液41と陽極21と等電位であるバッファー液42 A voltage by using the voltage source 16, the addition between the cathode 22 and anode 21, the buffer solution is equipotential with the solution 41 and the anode 21 including a sample is equipotential with the cathode 22 42
に電位差Vが生じる。 The potential difference V is generated. 小孔の両端に電位差が生じると、 If the potential difference across the ostium caused,
負に帯電した金属イオンは小孔を通過して、陰極側から陽極側へと電位勾配に沿って移動する。 Negatively charged metal ions through the small hole, to move along the potential gradient from the cathode side to the anode side. 一方、正に帯電した金属イオンは小孔を通過して、陽極側から陰極側へと電位勾配に沿って移動する。 On the other hand, positively charged metal ions through the small hole, to move along the potential gradient from the anode side to the cathode side. その結果、金属イオンが電荷を運び、外部回路に電流が生じる。 As a result, it carries metal ions charge, current is generated in an external circuit. 電流の大きさは、小孔を通過する金属イオンの単位時間あたりの数に比例する。 The magnitude of the current is proportional to the number per unit of metal ion transit time through the small holes. 金属イオンの単位時間あたりの数は小孔の断面積S、電位差Vに対して比例の関係にあり、小孔の長さLに対して逆比例の関係にある。 The number per unit of time metal ions are in a proportional relationship with respect to the cross-sectional area S, the potential difference V of the stoma, is inversely proportional to the length L of the small holes. 【0046】圧電薄膜35上の圧電薄膜制御用電極3 The piezoelectric thin-film control electrode 3 on the piezoelectric thin film 35
3、34の間に電圧を加えると、圧電薄膜が圧縮あるいは伸張される逆圧電効果によって、圧電薄膜の小孔の大きさが変位分27だけ変化する。 When a voltage is applied between the 3,34, the reverse piezoelectric effect of the piezoelectric thin film is compressed or decompressed, the size of the pores of the piezoelectric thin film is changed by the displacement amount 27. 小孔に分子あるいはD Molecules or D in the small hole
NAが通過する際に、上述のように電流が変化するが、 When NA passes, the current as described above is changed,
電流が一定、つまり、通過する金属イオンの数が一定となるように、圧電薄膜制御用電極間に負帰還電圧を加える。 Current is constant, that is, as the number of metal ions passing through is constant, applying a negative feedback voltage across the piezoelectric thin film control electrode. その結果、大きな分子が小孔を塞いでしまう恐れがなくなり、かつ、小孔を通過する分子あるいはDNAの流れが一定に近づく。 As a result, there is no possibility that large molecules would block the small hole, and approaches a constant flow of molecules or DNA to pass through the stoma. 負帰還電圧は分子やDNAの塩基の大きさに比例するから、この負帰還電圧を読み取れば、通過する分子の有無や大きさ、DNAの塩基の種類を知ることができる。 Since the negative feedback voltage is proportional to the magnitude of the base molecule or DNA, if read the negative feedback voltage, it is possible to know whether or molecular size to pass through, the type of base of DNA. 【0047】図8は、本発明の実施例2の微細配列認識装置の作製工程を示している。 [0047] Figure 8 shows a manufacturing process of a fine sequence recognition apparatus of the second embodiment of the present invention. 基板としてシリコン基板を用い、半導体微細加工技術を用いて、微細配列認識装置を実際に作製する。 The silicon substrate used as the substrate, using semiconductor microfabrication techniques to actually produce a fine array recognizer. 【0048】(図8A)用いる基板はシリコン基板で、 [0048] (FIG. 8A) used substrate is a silicon substrate,
表面にシリコン窒化膜102、さらにシリコン酸化膜1 Silicon nitride film 102 on the surface, further silicon oxide film 1
01、裏面にシリコン窒素化膜104を気相成長法にて形成する。 01, a silicon nitrogen film 104 is formed by vapor deposition on the back surface. シリコン窒化膜102および104の膜厚は10nmから100nm程度、シリコン酸化膜の膜厚は300nm程度である。 Thickness of the silicon nitride film 102 and 104 100nm order of 10 nm, the film thickness of the silicon oxide film is about 300 nm. 裏面のシリコン窒化膜104をテトラメチルアンモニウムハライド(TMAH)25% The back surface of the silicon nitride film 104 tetramethylammonium halide (TMAH) 25%
を用いてエッチングを行い、シリコン窒化膜102が露出するまで溝105、106、107を形成する。 Etching is performed using the silicon nitride film 102 is formed a groove 105, 106 to expose. TM TM
AHの代わりに水酸化カリウム(KOH)を用いてもよい。 It may be used potassium hydroxide (KOH) instead of AH. 溝105と106および107と106の間の領域も同様にシリコン基板をエッチングする。 The area between the grooves 105 and 106 and 107 and 106 to etch the silicon substrate in the same manner. (図8B)表面のシリコン酸化膜101の一部を開口し、開口部111、112、113を開け、シリコン窒化膜メンブレン114、115、116が形成される。 Opening a portion of the silicon oxide film 101 (FIG. 8B) surface, opening the opening 111, 112, and 113, the silicon nitride film membrane 114, 115, 116 are formed.
つづいて、スパッタ法によって圧電薄膜の一種であるチタン酸鉛(PZT)150を成長する。 Subsequently, the growth of lead titanate (PZT) 0.99 is a type of the piezoelectric thin film by sputtering. スパッタ法以外にゾル−ゲル法によっても成膜してもよい。 Sol other than sputtering - it may be formed also by gel method. チタン酸鉛(PZT)は、チタン酸バリウム、またはそれらの混合化合物でもよい。 Lead titanate (PZT) may be a barium titanate or a mixture compound thereof. (図8C)反応性イオンエッチングによりシリコン窒化膜の一部をエッチングして、圧電薄膜の両面が露出するようにする。 (Figure 8C) and the portion of the silicon nitride film by reactive ion etching to etch, both sides of the piezoelectric thin film is exposed. 真空蒸着法を用いて金電極121から12 Vacuum deposition of gold electrode 121 with the 12
6、151、および152を形成する。 6,151, and 152 to form. 金電極の膜厚は5nmから100nm程度である。 The film thickness of the gold electrode is 100nm order of 5 nm. (図8D)集束イオンビーム装置によりシリコン窒化膜メンブレン114、115、116の一部をエッチングして貫通孔131、133および小孔132を一個以上の開ける。 (Figure 8D) focused ion beam device a part of the silicon nitride film membrane 114, 115, 116 and a through hole 131, 133 and small holes 132 of one or more by etching by. 集束イオンビーム装置を用いる代わりに、カリックスアレーンまたはクロロメチル化カリックスアレーンを用いて電子ビーム露光を行ってエッチングマスクを形成し、反応性イオンエッチングで貫通孔を開けてもよい。 Instead of using a focused ion beam apparatus, an etching mask is formed by performing electron beam exposure using a calixarene or chloromethylated calixarene may open the through hole by reactive ion etching. また、貫通孔131、133はフォトレジストを用いてパターンニングを行った後、反応性イオンエッチング等でエッチングしてもよい。 The through-holes 131 and 133 after the patterning using a photoresist may be etched by reactive ion etching. (図8E)出入口を設けたガラスカバーを上面へ、さらにガラス基板を裏面へ接着する。 Top surface (Fig. 8E) glass cover provided with inlet and outlet, further bonding a glass substrate to the back. 接着は陽極接合によって行う。 Bonding is performed by anodic bonding. 接着はPMMAなどのポリマーを用いて行ってもよい。 Bonding may be performed using a polymer such as PMMA. 以上の工程より、微細配列認識装置を作製することができる。 From the above steps, it is possible to produce a fine array recognizer. 【0049】 【発明の効果】本発明による微細配列認識装置では、D [0049] In fine SEQ apparatus according to the invention according to the present invention is, D
NAの塩基配列を安価かつ効率的に、しかも迅速に決定できる。 The nucleotide sequence of the NA inexpensively and efficiently, yet can be quickly determined. 【0050】本発明による微細配列認識装置では、半導体微細加工を用いているため、作製における安全性が高く、材質として生体分子を用いていないため、経時変化が少なく、かつ溶液の種類による安定性が高い。 [0050] In fine SEQ apparatus according to the present invention, the use of the semiconductor micromachining, has high safety in manufacturing, does not use a biological molecule as a material, aging is small and stability due to the type of solution It is high. 【0051】 【配列表】 <110> NEC Corporation <120> Device and method for analysis of individual molecules <130> 34103599 <160> 2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <400> 1 ggtatgccaa ttattcaacg ttac 24 [0051] [Sequence Listing] <110> NEC Corporation <120> Device and method for analysis of individual molecules <130> 34103599 <160> 2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <400> 1 ggtatgccaa ttattcaacg ttac twenty four

【図面の簡単な説明】 【図1】微細配列認識装置の外観(A)および内部構造(B) 【図2】小孔周辺の電極配置。 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is an external micro array recognizer (A) and the internal structure (B) [2] electrodes disposed near the stoma. (A)実施例1、(B) (A) Example 1, (B)
実施例2、(C)実施例3記載の微細配列認識装置の小孔周辺の電極配置【図3】(A)実施例1の分子計数としての動作原理と(B)観測される電流。 Example 2, (C) operating principle and (B) as molecular counting of Example 3 electrode arrangement of small holes around the fine sequence recognition apparatus according Fig. 3 (A) Example 1 the observed current. 【図4】(A)実施例1のDNA塩基配列決定の動作原理と(B)観測される電流。 [4] (A) and operating principle of the DNA sequencing Example 1 (B) the observed current. 【図5】(A)実施例3の分子計数としての動作原理と(B)観測される電流。 [5] (A) and operating principle as molecular counting of Example 3 (B) the observed current. 【図6】実施例1の微細配列認識装置の作製工程【図7】実施例2の微細配列認識装置の作製工程【図8】実施例3の微細配列認識装置の作製工程【図9】(A)実施例1および(B)実施例2の微細配列認識装置の小孔部分【符号の説明】 10. Manufacturing process [9] of fine sequence recognition device 6 Example 1 of a manufacturing process [8] Example 3 minute sequence recognition apparatus of a manufacturing process [7] Example 2 of the micro array recognizer ( a) example 1 and (B) [description of symbols] ostium portion of the fine sequence recognition apparatus of the second embodiment 10. . . 流路を設けた基板11. The substrate 11 provided with a flow path. . . 絶縁膜12. Insulating film 12. . . ガラスカバー13. Glass cover 13. . . バッファー入口14. Buffer inlet 14. . . 試料入口15. Sample inlet 15. . . バッファー出口16. Buffer outlet 16. . . 電圧源17. Voltage source 17. . . 電流計20. Current total of 20. . . 流路21、23. The flow path 21, 23. . . 陽極22. Anode 22. . . 陰極24、26. Cathode 24 and 26. . . 貫通孔25. The through-hole 25. . . 小孔31. Small holes 31. . . 第3の電極32. The third electrode 32. . . 第4の電極33、34. Fourth electrodes 33 and 34. . . 圧電膜制御用電極35. Piezoelectric film control electrode 35. . . 圧電薄膜41. The piezoelectric thin film 41. . . 試料溶液42. Sample solution 42. . . バッファー溶液43. Buffer solution 43. . . 金属イオン44. Metal ions 44. . . 試料分子45. Sample molecules 45. . . DNA 46、47. DNA 46,47. . . 保護膜48. The protective film 48. . . 電圧源101. Voltage source 101. . . シリコン酸化膜102、104. Silicon oxide film 102 and 104. . . シリコン窒化膜103. Silicon nitride film 103. . . シリコン基板105、106、107. Silicon substrate 105, 106, and 107. . . エッチング溝111、112、113. Etching grooves 111, 112, and 113. . . 開口部114、115、116. Opening 114, 115 and 116. . . シリコン窒化膜メンブレン121、122、123、124、125、12 Silicon nitride film membrane 121,122,123,124,125,12
6. 6. . . 金電極127. Gold electrode 127. . . タングステン電極131、132、133. Tungsten electrode 131, 132, 133. . . エッチング孔134、135. Etching holes 134 and 135. . . タングステン電極141、142. Tungsten electrodes 141 and 142. . . ガラスカバー150. Glass cover 150. . . チタン酸鉛薄膜151、152、153、154. Lead titanate thin-film 151, 152, 153, and 154. . . 金電極 Gold electrode

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/50 G01N 27/46 336M // C12N 15/09 ZNA 336B 336Z 336G C12N 15/00 ZNAA (72)発明者 飯田 一浩 東京都港区芝五丁目7番1号 日本電気株 式会社内(72)発明者 佐野 亨 東京都港区芝五丁目7番1号 日本電気株 式会社内(72)発明者 馬場 雅和 東京都港区芝五丁目7番1号 日本電気株 式会社内Fターム(参考) 2G045 AA35 DA13 GC20 JA07 2G060 AA06 AC02 AC10 AD06 AE17 AF01 AF06 AF08 AG11 FA01 FB02 HA01 HC07 HC18 HE05 JA06 KA06 4B024 AA11 CA01 CA09 HA13 HA19 4B029 AA07 BB20 FA10 FA12 HA09 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR50 QR56 QS22 QX02 QX04 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) G01N 33/50 G01N 27/46 336M // C12N 15/09 ZNA 336B 336Z 336G C12N 15/00 ZNAA (72) inventor Kazuhiro Iida Tokyo, Minato-ku, Shiba 5-chome No. 7 No. 1 NEC shares in the company (72) inventor Toru Sano Tokyo, Minato-ku, Shiba 5-chome No. 7 No. 1 NEC shares in the company (72) inventor Masakazu Baba Tokyo, Minato-ku, Shiba 5-chome No. 7 No. 1 NEC Co., Ltd. in the F-term (reference) 2G045 AA35 DA13 GC20 JA07 2G060 AA06 AC02 AC10 AD06 AE17 AF01 AF06 AF08 AG11 FA01 FB02 HA01 HC07 HC18 HE05 JA06 KA06 4B024 AA11 CA01 CA09 HA13 HA19 4B029 AA07 BB20 FA10 FA12 HA09 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR50 QR56 QS22 QX02 QX04

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項1】DNAの塩基配列決定を高速に行える装置であって、イオンが透過する小孔(チャネル)を有する電気的絶縁膜を介して分離された、複数の液溜めと、それらそれぞれの液溜め内の溶液に通電する複数の電極で構成され、いずれかの電極間に電圧を印加し、小孔を通過するイオンにより発生する電流を計測することを特徴とする微細配列認識装置。 A device capable to fast sequencing All Claims in claim 1] DNA, isolated via an electrical insulating film having a small hole (channel) which the ions transmitted, a plurality of liquid reservoir and is composed of a plurality of electrodes for energizing the solution in the reservoir their respective liquid, a voltage is applied between one of electrodes, characterized by measuring the current generated by ions passing through the small holes fine sequence recognizer. 【請求項2】前記絶縁膜がシリコン窒化膜、シリコン酸化膜、またはシリコン酸窒化膜であること、あるいは、 Wherein said insulating film is a silicon nitride film, a silicon oxide film or a silicon oxynitride film, or,
    シリコン基板をエッチングしたことにより露出したシリコン窒化膜、シリコン酸化膜、またはシリコン酸窒化膜であることを特徴とする請求項1に記載の微細配列認識装置。 Silicon nitride film exposed by the silicon substrate is etched, fine sequence recognition apparatus according to claim 1, characterized in that a silicon oxide film or a silicon oxynitride film. 【請求項3】計測した電流情報を用いて、小孔を通過するDNAや分子の配列構造決定や計数、選別(ふるい)、ソート(分類)、検索をおこなうことを特徴とする請求項1、2のいずれかに記載の微細配列認識装置。 3. Using the measured current information, the array structure determination and counting of DNA or molecules passing through the small holes, sorting (sieve), sorting (classification), according to claim 1, characterized in that to search, fine sequence recognition apparatus according to any one of 2. 【請求項4】前記溶液に通電する複数の電極以外に、小孔を挟んで対向した電極が設置されることを特徴とする請求項1、2、3のいずれかに記載の微細配列認識装置。 Besides a plurality of electrodes for energizing the wherein said solution, fine sequence recognition apparatus according to any of claims 1, 2, 3, characterized in that the electrodes face each other across a small hole is provided . 【請求項5】前記絶縁膜が圧電薄膜であり、圧電薄膜の両面に電極が形成されたことを特徴とする請求項1、 Wherein said insulating film is a piezoelectric thin film, according to claim 1, characterized in that the electrodes are formed on both surfaces of the piezoelectric thin film,
    2、3のいずれかに記載の微細配列認識装置。 Fine sequence recognition apparatus according to any one of 2, 3. 【請求項6】集束イオンビーム(FIB)技術で前記小孔を形成することを特徴とする請求項1、2、3、4、 6. focused ion beam claim 1, 2, 3, 4, characterized in that to form the small hole in the (FIB) technology,
    5のいずれかに記載の微細配列認識装置の製造方法。 Method for producing a 5 minute sequence recognition apparatus according to any one of. 【請求項7】カリックスアレーン、クロロメチル化カリックスアレーン、またはポリスチレン等の高解像度電子線レジストを用いて前記小孔を形成することを特徴とする請求項1、2、3、4、5のいずれかに記載の微細配列認識装置の製造方法。 7. A calixarene any of claims 1, 2, 3, 4, characterized in that to form the small hole by using high-resolution electron beam resist such as chloromethylated calixarene or polystyrene, method for producing a fine sequence recognition device crab according. 【請求項8】前記小孔を形成した後に、小孔のサイズを狭めるために、真空蒸着法、化学的気相成長法、あるいは、電気メッキ法を用いることを特徴とする請求項1、 Wherein said after forming the small holes, in order to narrow the size of the stoma, a vacuum deposition method, chemical vapor deposition, or claim 1 which comprises using an electroplating method,
    2、3、4、5のいずれかに記載の微細配列認識装置の製造方法あるいは請求項6、7のいずれかに記載の微細配列認識装置の製造方法。 Method for producing a fine sequence recognition device according to any of the manufacturing process or claim 6 minute sequence recognition apparatus according to any one of 2, 3, 4, 5. 【請求項9】前記電気メッキ法を用いる際、小孔を有する絶縁膜が隔てた二つの溶媒間のイオン電流を計測、制御して、小孔の大きさを決めることを特徴とする請求項8に記載の微細配列認識装置の製造方法。 9. When using the electroplating method, measuring the ionic current between the two solvents having an insulating film therebetween having a small hole, the control to, claims, characterized in that to determine the size of the stoma method for producing a fine array recognition apparatus according to 8. 【請求項10】前記電極の形成において、集束イオンビーム(FIB)技術を用いることを特徴とする請求項1、2、3、4、5いずれかに記載の微細配列認識装置の製造方法あるいは請求項6、7、8、9いずれかに記載の微細配列認識装置の製造方法。 In the formation of wherein said electrode method or claims fine sequence recognition apparatus according to claim 1, 2, 3, 4 or which comprises using a focused ion beam (FIB) technique method for producing a fine sequence recognition apparatus according to any one claim 6, 7, 8, 9. 【請求項11】前記小孔を通過する微細配列やDNA塩基は、特定の小孔の特定の時間において一種類が認識されることを特徴とする請求項1、2、3、4、5のいずれかに記載の微細配列認識装置における微細配列認識方法。 Wherein said micro array or DNA bases passing through the small holes, according to claim 1, 2, 3, 4, characterized in that one type is recognized at a particular time for a particular small holes fine SEQ methods in fine sequence recognition apparatus according to any one. 【請求項12】前記小孔を挟んで対向した電極間の伝導度を測定して微細配列を認識することを特徴とする請求項4に記載の微細配列認識装置における微細配列認識方法。 12. microalignment recognition method in finely sequence recognition apparatus according to claim 4, characterized in that to recognize the measured and finely arranged conductivity between the electrodes facing each other across the ostium. 【請求項13】前記絶縁膜が圧電薄膜である場合、圧電薄膜の両面に形成された一対の電極間に電圧を加えた時、圧電薄膜の小孔の大きさが逆圧電効果によって変化する信号を微細配列認識の情報に用いることを特徴とする請求項5に記載の微細配列装置の微細配列認識方法。 When wherein said insulating film is a piezoelectric thin film, when a voltage plus between a pair of electrodes formed on both surfaces of the piezoelectric thin film, the signal size of the small hole of the piezoelectric thin film is changed by the reverse piezoelectric effect fine sequence recognition method of a fine array device according to claim 5, characterized by using the information of the fine array recognize. 【請求項14】前記圧電薄膜の両面に形成された電極間に負帰還電圧を加えて小孔の径を変化させて、小孔を通過するイオンの流れを一定に保ち、前記負帰還電圧を読み取ることによって、通過する分子の有無や大きさ、D 14. varying the diameter of pores by adding a negative feedback voltage between the formed on both surfaces of the piezoelectric thin film electrode, maintain a constant flow of ions through the small hole, the negative feedback voltage it allows the presence or absence of molecules to pass through and size reading, D
    NAの塩基の種類を認識することを特徴とする請求項1 Claim, characterized in that to recognize the type of the NA of the base 1
    3に記載の微細配列認識装置の微細配列認識方法。 Fine sequence recognition method of the fine sequence recognition apparatus according to 3. 【請求項15】DNAを構成する塩基のうち、特定の塩基を修飾して塩基の分子サイズを変えると、前記修飾した塩基が小孔を通過する瞬間のイオン電流の変化が強調され、前記塩基の検出が容易となることを特徴とする請求項1、2、3、4、5のいずれかに記載の微細配列認識装置における微細配列認識方法。 15. Among the bases constituting DNA, changing the molecular size of the to modify the particular base base, the change in instantaneous ion current the modified bases pass through the small holes is emphasized, the base fine SEQ methods in fine sequence recognition apparatus according to any of claims 1, 2, 3, 4, characterized in that the detection becomes easy.
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