JP2003018990A - Method for determining genotype of animal containing mutant line - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、実験動物等の動物
における遺伝子型（ホモ型、ヘテロ型及びヘミ型）を判
定する遺伝子型判別方法に関する。また、本発明は、実
験動物等の動物における遺伝子型（ホモ型、ヘテロ型及
びヘミ型）を判定するための遺伝子型判別キットに関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a genotyping method for determining the genotype (homotype, heterotype and hemitype) in animals such as experimental animals. The present invention also relates to a genotyping kit for determining genotypes (homotype, heterotype, and hemitype) in animals such as experimental animals.
【０００２】[0002]
【従来の技術】バイオサイエンス及びバイオメディカル
サイエンスの研究には、実験動物等のヒト以外の二量体
生物が使用されている。この実験動物としては、自然発
症形質として発見されたミュータント系統或いは人工的
に作出されたミュータント系統が使用されている。この
ようなミュータント系統は、農水産業や工業の分野で広
く利用されている。2. Description of the Related Art Dimeric organisms other than humans such as experimental animals have been used for bioscience and biomedical science research. As this experimental animal, a mutant strain found as a naturally occurring trait or an artificially created mutant strain is used. Such a mutant system is widely used in the fields of agriculture and fisheries and industry.
【０００３】ミュータント系統を利用する際には、ミュ
ータント形質を有するものと、対照としてミュータント
形質を有しないものとが使用され、これらの遺伝子型を
判別しておかなければならない。一方、ミュータント系
統を作出、繁殖又は生産する際には自然交配又は体外受
精等の工学的手法による人工交配が用いられるが、いず
れの場合でも配偶個体又は配偶子における遺伝子型を決
定しておく必要がある。特に、配偶個体又は配偶子にお
ける遺伝子型を見掛け上で判別できない場合には、遺伝
子型の判定方法として後代検定が行われてきた。また、
遺伝子導入によるミュータント系統の遺伝子型を判定す
る方法としては、導入した遺伝子の塩基配列を標的とし
たPCR（polymerase chain reaction）やサザンハイブリ
ダイゼーション法等の核酸検出法が用いられてきた。When utilizing mutant strains, those having a mutant trait and those not having a mutant trait are used as controls, and their genotypes must be distinguished. On the other hand, when producing, breeding or producing a mutant strain, natural mating or artificial mating by an engineering method such as in vitro fertilization is used, but in any case, it is necessary to determine the genotype in the spouse or gamete. There is. In particular, when a genotype in a gamete or gamete cannot be apparently discriminated, a progeny test has been performed as a genotype determination method. Also,
As a method for determining the genotype of a mutant strain by gene introduction, nucleic acid detection methods such as PCR (polymerase chain reaction) targeting the nucleotide sequence of the introduced gene and Southern hybridization have been used.
【０００４】しかしながら、核酸検出法では、導入した
遺伝子がホモ型であるかヘテロ型であるかを容易に判別
することができなかった。また、導入した遺伝子を保持
しない野生型では、PCR法によりDNA断片が増幅せずまた
ハイブリダイズする塩基配列を持たないため、核酸検出
法を用いて偽陰性及び偽陽性を判別することができなか
った。However, the nucleic acid detection method could not easily discriminate whether the introduced gene was homozygous or heterozygous. In addition, in the wild type that does not retain the introduced gene, it is not possible to distinguish false negative and false positive using the nucleic acid detection method because the DNA fragment is not amplified by the PCR method and does not have a hybridizing base sequence. It was
【０００５】さらに、遺伝子を導入して得られるミュー
タント系統においては、当該遺伝子が安定して世代に受
け継がれるという報告（Aigner B, et al., Transgenic
Research 8: 1-8, 1999）がある一方、不安定であると
いう報告（Thompson KL, etal., Toxicologic Patholog
y 26: 548-555, 1998）もある。したがって、導入した
遺伝子の継世代安定性を十分に検討しなければ、遺伝子
型の判定方法そのものが不確実な結果しか得られなくな
るといった問題もある。[0005] Furthermore, in a mutant strain obtained by introducing a gene, the gene is stably transmitted to the generation (Aigner B, et al., Transgenic).
Research 8: 1-8, 1999), but report unstable (Thompson KL, et al., Toxicologic Patholog
y 26: 548-555, 1998). Therefore, there is also a problem that the genotype determination method itself can only give uncertain results unless the transgenerational stability of the introduced gene is thoroughly examined.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、上
述したような実状に鑑み、動物に導入した遺伝子の遺伝
子型を効率的且つ確実に判定することができる遺伝子型
判別方法を提供すること、及び動物に導入した遺伝子の
遺伝子型を効率的且つ確実に判定することができる遺伝
子型判別キットを提供することを目的とする。In view of the above situation, the present invention provides a genotyping method capable of efficiently and reliably determining the genotype of a gene introduced into an animal. And a genotyping kit capable of efficiently and reliably determining the genotype of a gene introduced into an animal.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】上述した目的を達成した
本発明は以下を包含する。
（１）以下の（a）及び（b）に示す工程を含む動物の遺
伝子型判別方法。
（a）上記動物に導入された判定対象の遺伝子の構造に
基づいて設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）法を行う工程。
（b）上記（a）のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によ
って増幅されたDNA断片を解析する工程。The present invention, which achieves the above-mentioned object, includes the following. (1) An animal genotyping method including the steps shown in (a) and (b) below. (A) A step of performing a polymerase chain reaction (PCR) method using a primer designed on the basis of the structure of a gene to be judged introduced into the animal. (B) A step of analyzing the DNA fragment amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method of the above (a).
【０００８】（２）上記（a）工程では、プライマー
を、判定対象の遺伝子の少なくとも一部の塩基配列に基
づいて設計することを特徴とする（１）記載の遺伝子型
判別方法。
（３）上記（a）工程の前に、上記遺伝子の構造を同定
する工程を含むことを特徴とする（１）記載の遺伝子型
判別方法。
（４）上記遺伝子の構造を同定する工程では、当該遺伝
子の少なくとも一部を含む塩基配列を決定することを特
徴とする（３）記載の遺伝子型判別方法。(2) The genotyping method according to (1), wherein in the step (a), the primer is designed based on at least a part of the nucleotide sequence of the gene to be judged. (3) The genotyping method according to (1), which comprises a step of identifying the structure of the gene before the step (a). (4) The genotyping method according to (3), wherein in the step of identifying the structure of the gene, a nucleotide sequence containing at least a part of the gene is determined.
【０００９】（５）上記遺伝子の構造を同定する工程で
は、当該遺伝子とハイブリダイズできる塩基配列を含む
プローブを用いて、上記動物のゲノムに当該遺伝子が導
入されているかを検証することを特徴とする（３）記載
の遺伝子型判別方法。
（６）上記（a）工程の前に、上記遺伝子の継世代的安
定性及び／又は上記遺伝子の個体間での均一性を判定す
ることを特徴とする（１）記載の遺伝子型判別方法。
（７）上記動物は凍結された胚及び/又は当該胚から得
られたコロニーであることを特徴とする（１）記載の遺
伝子型判別方法。(5) The step of identifying the structure of the gene is characterized by verifying whether the gene is introduced into the genome of the animal using a probe containing a nucleotide sequence capable of hybridizing with the gene. The genotyping method according to (3). (6) The genotyping method according to (1), characterized in that before the step (a), the generational stability of the gene and / or the homogeneity of the gene among individuals are determined. (7) The genotyping method according to (1), wherein the animal is a frozen embryo and / or a colony obtained from the embryo.
【００１０】（８）上記動物は、ヒトH-ras遺伝子を導
入したTg-rasH2マウスであることを特徴とする（１）記
載の遺伝子型判別方法。
（９）上記動物は、自然的に起きたミュータント系統で
あることを特徴とする（１）記載の遺伝子型判別方法。
（１０）上記（b）工程の後、PCR法を除く遺伝子構造判
定工程を更に行うことを特徴とする（１）記載の遺伝子
型判別方法。(8) The method for genotyping according to (1), wherein the animal is a Tg-rasH2 mouse into which a human H-ras gene has been introduced. (9) The genotyping method according to (1), wherein the animal is a naturally occurring mutant strain. (10) The genotyping method according to (1), which further comprises a gene structure determination step other than the PCR method after the step (b).
【００１１】（１１）動物に導入された判定対象の遺伝
子の構造に基づいて設計したプライマーと、上記動物の
ゲノムから上記プライマーとともにDNA断片を増幅する
酵素を含む試薬とを含む動物の遺伝子型判別キット。
（１２）以下の（c）及び（d）に示す工程を含む動物の
遺伝子型判別方法。
（c）上記動物に導入された判定対象の遺伝子の構造に
基づいて設計したプローブを用いてクローニングを行う
工程。
（b）上記（c）のクローニングによって同定されたクロ
ーンを解析する工程。(11) Genotyping of an animal containing a primer designed based on the structure of a gene to be determined introduced into an animal and a reagent containing an enzyme for amplifying a DNA fragment from the genome of the animal together with the primer kit. (12) An animal genotyping method comprising the steps (c) and (d) below. (C) A step of cloning using a probe designed based on the structure of the gene to be determined, which has been introduced into the animal. (B) analyzing the clone identified by the cloning in (c) above.
【００１２】（１３）上記（c）工程では、プローブ
を、判定対象の遺伝子の少なくとも一部の塩基配列に基
づいて設計することを特徴とする（１２）記載の遺伝子
型判別方法。
（１４）上記（c）工程の前に、上記遺伝子の構造を同
定する工程を含むことを特徴とする（１２）記載の遺伝
子型判別方法。
（１５）上記遺伝子の構造を同定する工程では、当該遺
伝子の少なくとも一部を含む塩基配列を決定することを
特徴とする（１４）記載の遺伝子型判別方法。(13) The genotyping method according to (12), wherein in the step (c), the probe is designed based on at least a part of the nucleotide sequence of the gene to be judged. (14) The genotyping method according to (12), which comprises a step of identifying the structure of the gene before the step (c). (15) The genotyping method according to (14), wherein in the step of identifying the structure of the gene, a nucleotide sequence containing at least a part of the gene is determined.
【００１３】（１６）上記遺伝子の構造を同定する工程
では、当該遺伝子とハイブリダイズできる塩基配列を含
むプローブを用いて、上記動物のゲノムに当該遺伝子が
導入されているかを検証することを特徴とする（１４）
記載の遺伝子型判別方法。
（１７）上記（a）工程の前に、上記遺伝子の継世代的
安定性及び／又は上記遺伝子の個体間での均一性を判定
することを特徴とする（１２）記載の遺伝子型判別方
法。(16) In the step of identifying the structure of the gene, it is verified whether or not the gene is introduced into the genome of the animal by using a probe containing a nucleotide sequence capable of hybridizing with the gene. Do (14)
The described genotyping method. (17) The method of genotyping according to (12), characterized in that, before the step (a), the gene-generation stability of the gene and / or the homogeneity of the gene among individuals are determined.
【００１４】（１８）上記動物は凍結された胚及び/又
は当該胚から得られたコロニーであることを特徴とする
（１２）記載の遺伝子型判別方法。
（１９）上記動物は、ヒトH-ras遺伝子を導入したTg-ra
sH2マウスであることを特徴とする（１２）記載の遺伝
子型判別方法。
（２０）上記動物は、自然的に起きたミュータント系統
であることを特徴とする（１２）記載の遺伝子型判別方
法。(18) The method of genotyping according to (12), wherein the animal is a frozen embryo and / or a colony obtained from the embryo. (19) The above animal is Tg-ra into which the human H-ras gene has been introduced.
The genotyping method according to (12), which is an sH2 mouse. (20) The method of genotyping according to (12), wherein the animal is a naturally occurring mutant strain.
【００１５】（２１）上記（d）工程の後、クローニン
グを除く遺伝子構造判定工程を更に行うことを特徴とす
る（１２）記載の遺伝子型判別方法。
（２２）動物に導入された判定対象の遺伝子の構造に基
づいて設計したプローブを含む動物の遺伝子型判別キッ
ト。(21) The method of determining a genotype according to (12), further comprising the step of determining a gene structure except for cloning after the step (d). (22) An animal genotyping kit containing a probe designed based on the structure of a gene to be determined that has been introduced into an animal.
【００１６】[0016]
【発明の実施の形態】以下、本発明に係る遺伝子型判別
方法及び遺伝子型判別キットを詳細に説明する。本発明
を適用した遺伝子型判別方法は、動物における遺伝子型
を判定する方法である。ここで、動物とは、ヒト以外の
ほ乳類動物、鳥類、両生類、昆虫、線形動物等を含む意
味である。具体的に、動物としては、マウス、ラット、
ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、
アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、カイコ、セン
チュウ等を例示することができる。また、動物として
は、凍結された配偶子胚、胚から得られたコロニー、等
であっても良い。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The genotyping method and genotyping kit according to the present invention will be described in detail below. The genotyping method to which the present invention is applied is a method for determining a genotype in an animal. Here, the term “animal” is meant to include mammals other than humans, birds, amphibians, insects, nematodes, and the like. Specifically, the animals include mice, rats,
Rabbit, dog, pig, cow, goat, sheep, chicken,
Examples include Xenopus, Drosophila, silkworms, nematodes and the like. The animal may be a frozen gamete embryo, a colony obtained from the embryo, or the like.
【００１７】遺伝子型検出方法は、以下の（a）工程及
び（b）工程を含む。
（a）動物に導入された判定対象の遺伝子の構造に基づ
いて設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）法を行う工程。
（b）上記（a）のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によ
って増幅されたDNA断片を解析する工程。The genotype detection method includes the following steps (a) and (b). (A) A step of performing a polymerase chain reaction (PCR) method using a primer designed based on the structure of a gene to be determined that has been introduced into an animal. (B) A step of analyzing the DNA fragment amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method of the above (a).
【００１８】本方法において、判定対象の遺伝子として
は、いかなる遺伝子であってもよく、何ら限定されな
い。遺伝子としては、例えば、ヒトH-ras遺伝子、v-H-r
as遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ヒトGM-CSF遺伝子、
各種ウイルス遺伝子、プロウイルス遺伝子等を例示する
ことができる。In the present method, the gene to be judged may be any gene and is not limited at all. Examples of genes include human H-ras gene, vHr
as gene, poliovirus gene, human GM-CSF gene,
Examples include various viral genes, proviral genes and the like.
【００１９】また、動物に導入された判定対象の遺伝子
とは、当該遺伝子を動物中に人工的に導入する場合と当
該遺伝子が自然発生的に導入された場合とを含む意味で
ある。換言すると、本方法は、判定対象の遺伝子を従来
公知の方法で導入した人工的なミュータント系統及び判
定対象の遺伝子が自然に導入された自然的なミュータン
ト系統のいずれであってもよい。The gene to be determined introduced into an animal is meant to include the case where the gene is artificially introduced into the animal and the case where the gene is introduced spontaneously. In other words, the present method may be either an artificial mutant line in which the gene to be judged has been introduced by a conventionally known method or a natural mutant line in which the gene to be judged has been naturally introduced.
【００２０】本方法において、「遺伝子の構造」とは、
少なくとも当該遺伝子を含む領域の一次構造、すなわち
塩基配列を含む意味である。また、遺伝子の構造とは、
当該遺伝子を含む領域の塩基配列に限定されず、導入遺
伝子のコピー数、導入方向、部分欠失等の修飾、導入部
位とその近傍の関係等も含む意味である。In the present method, the "gene structure" means
It is meant to include at least the primary structure of the region containing the gene, that is, the base sequence. Also, the structure of a gene
It is not limited to the nucleotide sequence of the region containing the gene, and is meant to include the copy number of the introduced gene, the introduction direction, modification such as partial deletion, and the relationship between the introduced site and its vicinity.
【００２１】本方法においては、上記（a）工程に先立
って、遺伝子の構造を同定する工程を行うことが好まし
い。遺伝子の構造を同定する工程では、従来公知の手法
を用いて遺伝子の構造を決定することができる。例え
ば、蛍光in situハイブリダイゼーション法により動物
中のどの染色体に当該遺伝子が存在するのかを決定し、
その後、当該動物のゲノムライブラリーを作製し、当該
遺伝子と当該遺伝子の近傍部分とを含むクローンをクロ
ーニングし、当該クローンの塩基配列を決定することに
よって、当該遺伝子の構造を決定することができる。ま
た、当該遺伝子を一単位として複数単位の遺伝子が導入
されている場合又は当該遺伝子の一部が塩基の欠失、挿
入或いは置換等により修飾されている場合には、例え
ば、制限酵素地図の作製及び塩基配列の決定により当該
遺伝子の構造を決定することができる。In this method, it is preferable to perform a step of identifying the structure of the gene prior to the step (a). In the step of identifying the structure of the gene, the structure of the gene can be determined using a conventionally known method. For example, by fluorescence in situ hybridization method to determine which chromosome in the animal the gene is present,
Then, the structure of the gene can be determined by preparing a genome library of the animal, cloning a clone containing the gene and a portion near the gene, and determining the nucleotide sequence of the clone. In addition, when a plurality of units of genes are introduced with the gene as one unit or when a part of the gene is modified by deletion, insertion or substitution of bases, for example, construction of a restriction enzyme map. And the structure of the gene can be determined by determining the nucleotide sequence.
【００２２】「遺伝子の構造」を決定する際には、例え
ば、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 200
1に記載されている種々の技術を適宜使用することがで
きる。このような方法により、導入した遺伝子の構造を
特定することができる。また、クローニングには、例え
ば、コスミドベクター等の従来公知のクローニングベク
ターを使用することができる。さらに、塩基配列を決定
する際には、例えば、アプライドバイオシステムズジャ
パン株式会社製のABI PRISM 310及び付属のソフトフェ
アを使用することができる。When determining the “structure of a gene”, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 200
Various techniques described in 1 can be used as appropriate. With such a method, the structure of the introduced gene can be specified. For cloning, a conventionally known cloning vector such as a cosmid vector can be used. Further, when determining the nucleotide sequence, for example, ABI PRISM 310 manufactured by Applied Biosystems Japan Co., Ltd. and attached software can be used.
【００２３】また、本方法では、上記（a）工程に先立
って導入した遺伝子が継世代的に安定して存在するか否
か、及び導入した遺伝子が個体間で均一に存在している
か否かを判定することが好ましい。導入した遺伝子が継
世代的に安定して存在するか否かは、例えば当該遺伝子
にハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブを用
いたサザンハイブリダイゼーションを各世代に対して行
うことによって確認することができる。また、導入した
遺伝子が個体間で均一に存在しているか否は、例えば当
該遺伝子にハイブリダイズできる塩基配列を有するプロ
ーブを用いたサザンハイブリダイゼーションを所定の世
代における各個体に対して行うことによって確認するこ
とができる。このように、導入した遺伝子の継世代的な
安定性及び個体間での均一性を確認することによって、
本方法による遺伝子型の判定結果がより信頼性の高いも
のとなる。Further, in the present method, it is determined whether or not the gene introduced prior to the above step (a) is stably present in a successive generation, and whether or not the introduced gene is evenly present among individuals. Is preferably determined. Whether or not the introduced gene is stably present in successive generations can be confirmed, for example, by performing Southern hybridization for each generation using a probe having a nucleotide sequence capable of hybridizing to the gene. . Whether or not the introduced gene is evenly present among individuals is confirmed by, for example, performing Southern hybridization using a probe having a nucleotide sequence capable of hybridizing with the gene on each individual in a predetermined generation. can do. Thus, by confirming the transgenetic stability of the introduced gene and the homogeneity among individuals,
The genotype determination result by this method becomes more reliable.
【００２４】上記（a）工程においては、先ず、決定し
た遺伝子の構造に基づいて、少なくとも一対のプライマ
ーを設計する。一対のプライマーは、ミューテーション
が招来された遺伝子の一部を増幅するように設計する
か、当該遺伝子に対応する野生型領域の一部を増幅する
ように設計するか、ミューテーションが招来された遺伝
子の一部及び当該遺伝子の近傍の領域を共に増幅するよ
うに設計するか、複数の単位で導入された当該遺伝子間
に位置する連結部分を含む領域を増幅するように設計
か、当該遺伝子の修飾部位を含む領域を増幅するように
設計することができる。In the above step (a), first, at least a pair of primers is designed based on the determined gene structure. The pair of primers are designed to amplify a part of the gene in which the mutation was induced, or to amplify a part of the wild-type region corresponding to the gene, or the mutation was introduced. Designed to amplify a part of the gene and a region near the gene together, or to amplify a region containing a connecting portion located between the genes introduced in a plurality of units, or It can be designed to amplify the region containing the modification site.
【００２５】さらに、本方法では、所定の遺伝子型にお
いて特異的にDNA断片を増幅するように一対のプライマ
ーを設計することが好ましい。すなわち、遺伝子型に対
応して異なるDNA断片を増幅するように一対のプライマ
ーを設計することが好ましい。具体的には、野生型のゲ
ノムにおいてのみDNA断片を増幅させる一対のプライマ
ー及びミュータント系統においてのみDNA断片を増幅さ
せる一対のプライマーをそれぞれ設計することが好まし
い。野生型のゲノムにおいてのみDNA断片を増幅させる
一対のプライマーとは、例えば、所定の遺伝子を導入す
ることによってゲノムから欠失した領域内に設計された
もの或いは当該領域を増幅するように設計されたものを
あげることができる。また、ミュータント系統において
のみDNA断片を増幅させる一対のプライマーとは、導入
した遺伝子の少なくとも一部を含む領域内に設計された
もの或いは当該領域を増幅するように設計されたものを
あげることができる。Further, in this method, it is preferable to design a pair of primers so as to specifically amplify a DNA fragment in a predetermined genotype. That is, it is preferable to design a pair of primers so as to amplify different DNA fragments depending on the genotype. Specifically, it is preferable to design a pair of primers for amplifying the DNA fragment only in the wild type genome and a pair of primers for amplifying the DNA fragment only in the mutant strain, respectively. The pair of primers for amplifying a DNA fragment only in the wild type genome are, for example, those designed in a region deleted from the genome by introducing a predetermined gene or designed to amplify the region. I can give you things. Further, the pair of primers for amplifying a DNA fragment only in the mutant strain can be those designed within the region containing at least a part of the introduced gene or those designed to amplify the region. .
【００２６】また、野生型のゲノムにおいて増幅するDN
A断片とミュータント系統において増幅するDNA断片とが
互いに異なるサイズであるように一対のプライマーを設
計することが好ましい。この場合、一対のプライマー
は、導入した遺伝子を含む領域を増幅するように設計す
ることができる。Also, DN that amplifies in the wild-type genome
It is preferable to design the pair of primers so that the A fragment and the DNA fragment amplified in the mutant strain have different sizes from each other. In this case, the pair of primers can be designed to amplify the region containing the introduced gene.
【００２７】上記（a）工程では、次に、上述したよう
に設計したプライマーを用いて、PCR法によりDNA断片を
増幅する。PCR法に際して鋳型となるDNAは、遺伝子を導
入した動物細胞から通常の方法によって抽出したゲノム
DNAを用いる。動物細胞からゲノムDNAを抽出する方法と
しては、例えば、Molecular Cloning : A Laboratory M
anual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laborator
y Press, 2001等に記載されている方法を適用すること
ができる。また、PCR法の条件としては、特に制限され
ないが、設計したプライマーの塩基配列やタックポリメ
ラーゼの反応特性等に応じて適宜設定することができ
る。さらに、PCR法は、例えば、アプライドバイオシス
テムズジャパン株式会社製の商品名「GeneAmp PCR Syst
em 9600」等の機器を用いて行うことができる。In step (a), the DNA fragment is then amplified by the PCR method using the primers designed as described above. The DNA used as a template in the PCR method is a genome extracted from a gene-transferred animal cell by a conventional method.
Use DNA. As a method for extracting genomic DNA from animal cells, for example, Molecular Cloning: A Laboratory M
anual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laborator
The method described in y Press, 2001, etc. can be applied. The conditions of the PCR method are not particularly limited, but can be set as appropriate according to the designed base sequence of the primer, the reaction characteristics of the tack polymerase, and the like. Further, the PCR method is, for example, a product name “GeneAmp PCR Syst” manufactured by Applied Biosystems Japan Co., Ltd.
It can be performed using a device such as "em 9600".
【００２８】上述したように、本方法では、遺伝子の構
造に基づいて少なくとも一対のプライマーを設計してい
るため、当該プライマーを用いたPCR法により増幅され
るDNA断片のサイズを予測することができる。また、
（a）工程では、複数対のプライマーを用いてPCR法を行
っても良い。As described above, in this method, at least a pair of primers is designed based on the structure of the gene, and therefore the size of the DNA fragment amplified by the PCR method using the primers can be predicted. . Also,
In the step (a), the PCR method may be performed using a plurality of pairs of primers.
【００２９】次に、上記（b）工程では、上記（a）工程
で行ったPCR法で増幅されたDNA断片を解析する。具体的
には、PCR法で増幅されたDNA断片を、例えば、アガロー
スゲルを用いた電気泳動を行うことによってサイズに応
じて分画することができ、上記（a）で行ったPCR法によ
って増幅したDNA断片のサイズを同定することができ
る。なお、サイズに応じて分画したDNA断片は、エチジ
ウムブロマイドで染色することによって紫外線下で目視
可能となる。Next, in the step (b), the DNA fragment amplified by the PCR method performed in the step (a) is analyzed. Specifically, DNA fragments amplified by the PCR method can be fractionated according to size, for example, by performing electrophoresis using agarose gel, and amplified by the PCR method performed in (a) above. The size of the isolated DNA fragment can be identified. The DNA fragments fractionated according to size can be visualized under ultraviolet light by staining with ethidium bromide.
【００３０】この（b）工程によれば、遺伝子を導入し
た動物の遺伝子型を判定することができる。ここで、
「遺伝子型を判定する」とは、対象の動物染色体内に遺
伝子が導入されたか否かを判定すること、及び、遺伝子
が導入された場合には導入した遺伝子がホモ型であるか
ヘテロ型であるかを判定することを含む意味である。According to this step (b), the genotype of the animal into which the gene has been introduced can be determined. here,
"Determining the genotype" is to determine whether the gene was introduced into the target animal chromosome, and when the gene was introduced, whether the introduced gene is homozygous or heterozygous. It is a meaning including determining whether there is.
【００３１】ミューテーションが招来された遺伝子の一
部を増幅するように上記PCR法で用いたプライマーを設
計した場合には、当該PCR法によりDNA断片が増幅したか
否かを電気泳動法により確認する。対象の動物がミュー
タント系統である場合には、電気泳動法の結果、DNA断
片の増幅を確認することができる。これに対して対象の
動物が野生型の場合には、電気泳動法の結果、DNA断片
の増幅を確認することができない。したがって、この場
合、電気泳動法の結果として、DNA断片の増幅の有無を
検出することによって、対象の動物がミュータント系統
か野生型かを判定することができる。When the primers used in the PCR method were designed so as to amplify a part of the gene in which mutation was induced, it was confirmed by electrophoresis whether or not the DNA fragment was amplified by the PCR method. To do. When the target animal is a mutant strain, amplification of the DNA fragment can be confirmed as a result of electrophoresis. On the other hand, when the target animal is a wild type, the amplification of the DNA fragment cannot be confirmed as a result of the electrophoresis method. Therefore, in this case, it is possible to determine whether the target animal is a mutant strain or a wild type by detecting the presence or absence of amplification of the DNA fragment as a result of the electrophoresis method.
【００３２】また、野生型のゲノムにおいてのみDNA断
片を増幅させる一対のプライマー及びミュータント系統
においてのみDNA断片を増幅させる一対のプライマーを
用いてPCR法を行った場合には、当該PCR法により増幅し
たDNA断片の種類を、例えばサイズによって確認する。
対象の動物がミュータント系統のヘテロ型である場合、
二対のプライマーにより２種類のDNA断片が増幅するこ
とを電気泳動法の結果として確認することができる。一
方、対象の動物がミュータント系統のホモ型である場合
には、ミュータント系統においてのみDNA断片を増幅さ
せる一対のプライマーで増幅するDNA断片のみが増幅す
ることを電気泳動法の結果として確認することができ
る。When the PCR method was carried out using a pair of primers for amplifying the DNA fragment only in the wild type genome and a pair of primers for amplifying the DNA fragment only in the mutant strain, the amplification was carried out by the PCR method. The type of DNA fragment is confirmed, for example, by size.
When the target animal is a heterozygous mutant strain,
It can be confirmed as a result of electrophoresis that two kinds of DNA fragments are amplified by two pairs of primers. On the other hand, when the target animal is a homozygous mutant strain, it can be confirmed as a result of electrophoresis that only the DNA fragment amplified by a pair of primers that amplifies the DNA fragment only in the mutant strain is amplified. it can.
【００３３】さらに、野生型のゲノムにおいて増幅する
DNA断片とミュータント系統において増幅するDNA断片と
が互いに異なるサイズであるように一対のプライマーを
用いてPCR法を行った場合には、電気泳動法の結果、増
幅したDNA断片のサイズから対象の動物の遺伝子型を判
定することができる。すなわち、対象の動物がミュータ
ント系統のヘテロ型である場合、電気泳動法の結果とし
て２種類のサイズのDNA断片が増幅する。一方、対象の
動物がミュータント系統のホモ型である場合、電気泳動
法の結果として１種類のDNA断片が増幅する。したがっ
て、この場合、増幅したDNA断片のサイズを確認するこ
とによって、ミュータント系統におけるホモ型及びヘテ
ロ型を判定することができる。Furthermore, amplification in the wild-type genome
When PCR was performed using a pair of primers so that the DNA fragment and the DNA fragment amplified in the mutant strain had different sizes from each other, as a result of the electrophoresis method, the size of the amplified DNA fragment showed the target animal. Can be determined. That is, when the target animal is a heterozygous mutant strain, DNA fragments of two sizes are amplified as a result of electrophoresis. On the other hand, when the target animal is a homozygous mutant strain, one type of DNA fragment is amplified as a result of electrophoresis. Therefore, in this case, the homotype and heterotype in the mutant strain can be determined by confirming the size of the amplified DNA fragment.
【００３４】このようにして、本方法によれば、
ミュータント系統における「ホモ型」及び「ヘテロ
型」
ミュータント系統における「ホモ型」及び「ヘミ型」
野生型における「偽陽性」及び「真陽性」
ミュータント型における「偽陰性」及び「真陰性」
を判別することができる。In this way, according to the present method, "homo-type" and "hetero-type" in mutant lines "homo-type" and "hemi-type" in mutant lines "false positive" and "true positive" in wild-type It is possible to discriminate between "false negative" and "true negative" in the mutant type.
【００３５】なお、上記（b）工程の後、PCR法を除く遺
伝子構造判定工程を更に行うことがより好ましい。PCR
法を除く遺伝子構造判定工程では、例えば、上記（a）
工程で行ったPCR法の結果として得られたDNA断片につい
て塩基配列を決定したりする。このPCR法を除く遺伝子
構造判定工程を行うことによって、上記（b）工程で解
析した結果をより信頼性の高いものにできる。It is more preferable that after the step (b), a gene structure determination step other than the PCR method is further performed. PCR
In the gene structure determination step except the method, for example, the above (a)
The nucleotide sequence of the DNA fragment obtained as a result of the PCR method performed in the step is determined. By performing the gene structure determination step excluding this PCR method, the result analyzed in the above step (b) can be made more reliable.
【００３６】一方、本発明を適用した遺伝子型判別キッ
トは、少なくとも、上述したように設計されたプライマ
ーと、当該プライマーとともに所望のDNA断片を増幅で
きる酵素を含む試薬とを備えている。ここで、所望のDN
A断片を増幅できる酵素とは、判定対象の動物から抽出
されたゲノムDNAを鋳型として、PCR法によりプライマー
間の相補鎖を合成するDNAポリメラーゼを含む意味であ
る。DNAポリメラーゼとしては、宝酒造株式会社製のTaq
DNAポリメラーゼを例示することができる。このような
遺伝子型判別キットを用いることによって、動物に導入
した遺伝子の遺伝子型を効率的且つ確実に判定すること
ができる。On the other hand, the genotyping kit to which the present invention is applied comprises at least the primer designed as described above and a reagent containing the primer and an enzyme capable of amplifying a desired DNA fragment. Where the desired DN
The enzyme capable of amplifying the A fragment is meant to include a DNA polymerase that synthesizes a complementary chain between the primers by PCR using the genomic DNA extracted from the animal to be determined as a template. As DNA polymerase, Taq manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
A DNA polymerase can be illustrated. By using such a genotyping kit, the genotype of a gene introduced into an animal can be efficiently and reliably determined.
【００３７】ところで、本発明を適用した遺伝子型判定
方法は、以下の（c）及び（d）に示す工程を含むもので
あってもよい。
（c）上記動物に導入された判定対象の遺伝子の構造に
基づいて設計したプローブを用いてクローニングを行う
工程。
（d）上記（c）のクローニングによって同定されたクロ
ーンを解析する工程。By the way, the genotyping method to which the present invention is applied may include the following steps (c) and (d). (C) A step of cloning using a probe designed based on the structure of the gene to be determined, which has been introduced into the animal. (D) A step of analyzing the clone identified by the cloning in (c) above.
【００３８】本方法においても、判定対象の遺伝子とし
ては、いかなる遺伝子であってもよく何ら限定されず、
上述したような遺伝子を例示することができる。また、
本方法も、判定対象の遺伝子を従来公知の方法で導入し
た人工的なミュータント系統及び判定対象の遺伝子が自
然に導入された自然的なミュータント系統のいずれであ
ってもよい。本方法においても、上記（c）工程に先立
って、遺伝子の構造を同定する工程を行うことが好まし
い。遺伝子の構造は、上述したように、従来公知の手法
を用いて決定することができる。さらに、本方法でも、
上記（c）工程に先立って、導入した遺伝子が継世代的
に安定して存在するか否か、及び導入した遺伝子が個体
間で均一に存在しているか否かを判定することが好まし
い。In the present method as well, the gene to be judged may be any gene and is not limited at all.
The genes described above can be exemplified. Also,
This method may be either an artificial mutant line in which the gene to be judged is introduced by a conventionally known method or a natural mutant line in which the gene to be judged is naturally introduced. Also in this method, the step of identifying the structure of the gene is preferably performed prior to the step (c). The structure of a gene can be determined using a conventionally known method as described above. Furthermore, this method also
Prior to the above step (c), it is preferable to determine whether or not the introduced gene is stably present in successive generations and whether or not the introduced gene is evenly present among individuals.
【００３９】上記（c）工程においては、先ず、決定し
た遺伝子の構造に基づいて、少なくとも１以上のプロー
ブを設計する。プローブは、ミューテーションが招来さ
れた遺伝子の内部とハイブリダイズするように設計する
か、遺伝子に対応する野生型領域の内部とハイブリダイ
ズするように設計するか、ミューテーションが招来され
た遺伝子及び当該遺伝子の近傍とハイブリダイズするよ
うに設計するか、複数の単位で導入された遺伝子間とハ
イブリダイズするように設計するか、遺伝子の修飾部位
とハイブリダイズするように設計することができる。In the step (c), first, at least one or more probes are designed based on the determined gene structure. The probe is designed to hybridize with the inside of the mutation-induced gene, or with the inside of the wild-type region corresponding to the gene, or the mutation-induced gene and It can be designed to hybridize with the vicinity of a gene, to hybridize between genes introduced in a plurality of units, or to hybridize with a modified site of a gene.
【００４０】さらに、本方法では、所定の遺伝子型にお
いて特異的にハイブリダイズするようにプローブを設計
することが好ましい。すなわち、遺伝子型に対応して特
異的にハイブリダイズするようなプローブを設計するこ
とが好ましい。具体的には、野生型のゲノムにおいての
み特異的にハイブリダイズするようにプローブ及びミュ
ータント系統においてのみ特異的にハイブリダイズする
ようにプローブをそれぞれ設計することが好ましい。野
生型のゲノムにおいてのみ特異的にハイブリダイズする
プローブとは、例えば、所定の遺伝子を導入することに
よってゲノムから欠失した領域の塩基配列に基づいて設
計されたものをあげることができる。また、ミュータン
ト系統においてのみ特異的にハイブリダイズするプロー
ブとは、導入した遺伝子の少なくとも一部を含む領域の
塩基配列に基づいて設計されたものをあげることができ
る。また、プローブとしては、ゲノムを所定の制限酵素
で処理した後のDNA断片において、野生型でハイブリダ
イズする領域とミュータント系統でハイブリダイズする
領域とが互いに異なるサイズであるように設計すること
が好ましい。Further, in this method, it is preferable to design the probe so that it hybridizes specifically with a predetermined genotype. That is, it is preferable to design a probe that specifically hybridizes corresponding to the genotype. Specifically, it is preferable to design the probe so that it specifically hybridizes only in the wild-type genome and the probe so that it specifically hybridizes only in the mutant strain. Examples of the probe that specifically hybridizes only in the wild type genome include those designed based on the nucleotide sequence of the region deleted from the genome by introducing a predetermined gene. The probe specifically hybridized only in the mutant strain may be a probe designed based on the nucleotide sequence of the region containing at least a part of the introduced gene. In addition, the probe is preferably designed so that in the DNA fragment after treating the genome with a predetermined restriction enzyme, the region hybridizing in the wild type and the region hybridizing in the mutant strain have different sizes from each other. .
【００４１】上記（c）工程では、次に、上述したよう
に設計したプローブを用いて、ハイブリダイゼーション
法によりクローニングを行う。クローニングは、例え
ば、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third
Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001
に記載されている種々の技術を適宜使用することができ
る。In the above step (c), next, cloning is carried out by the hybridization method using the probe designed as described above. Cloning is performed, for example, by Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third.
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001
The various techniques described in 1. can be appropriately used.
【００４２】そして、上記（d）工程では、上記（c）の
クローニングによって同定されたクローンを解析する。
すなわち、ミューテーションが招来された遺伝子の内部
とハイブリダイズするように設計したプローブを用いた
場合、ハイブリダイゼーションによって当該遺伝子の存
在を確認することができる。また、当該遺伝子に対応す
る野生型領域の内部とハイブリダイズするように設計し
たプローブを用いた場合、当該野生型領域の存在を確認
することができる。Then, in the step (d), the clone identified by the cloning in the step (c) is analyzed.
That is, when a probe designed to hybridize with the inside of a mutation-induced gene is used, the presence of the gene can be confirmed by hybridization. Further, when a probe designed to hybridize with the inside of the wild type region corresponding to the gene is used, the presence of the wild type region can be confirmed.
【００４３】ゲノムを所定の制限酵素で処理した後のDN
A断片において、野生型でハイブリダイズする領域とミ
ュータント系統でハイブリダイズする領域とが互いに異
なるサイズであるように設計したプローブを用いた場
合、上記制限酵素で処理した後の電気泳動パターンにプ
ローブをハイブリダイズさせることによって、野生型及
びミュータント系統で異なるバンドにシグナルを観察す
ることができる。DN after treating the genome with a predetermined restriction enzyme
In the A fragment, when using a probe designed such that the region hybridizing in the wild type and the region hybridizing in the mutant strain have different sizes from each other, the probe is used in the electrophoresis pattern after treatment with the above restriction enzyme. By hybridizing, signals can be observed in different bands in the wild type and mutant lines.
【００４４】このようにして、本方法によれば、
ミュータント系統における「ホモ型」及び「ヘテロ
型」
ミュータント系統における「ホモ型」及び「ヘミ型」
野生型における「偽陽性」及び「真陽性」
ミュータント型における「偽陰性」及び「真陰性」
を判別することができる。In this way, according to the present method, "homo-type" and "hetero-type" in mutant lines "homo-type" and "hemi-type" in mutant lines "false-positive" and "true-positive" in wild-type It is possible to discriminate between "false negative" and "true negative" in the mutant type.
【００４５】なお、上記（d）工程の後、クローニング
を除く遺伝子構造判定工程を更に行うことがより好まし
い。クローニングを除く遺伝子構造判定工程では、例え
ば、上記（c）工程で行ったクローニングの結果として
得られたクローンを用いてPCR法を行ったり、当該クロ
ーンの塩基配列を決定したりする。このクローニングを
除く遺伝子構造判定工程を行うことによって、上記
（d）工程で解析した結果をより信頼性の高いものにで
きる。After the step (d), it is more preferable to further perform a gene structure determination step except for cloning. In the gene structure determination step excluding cloning, for example, a PCR method is performed using the clone obtained as a result of the cloning performed in the step (c), or the nucleotide sequence of the clone is determined. By performing the gene structure determination step excluding this cloning, the result analyzed in the above step (d) can be made more reliable.
【００４６】一方、本発明を適用した遺伝子型判別キッ
トは、少なくとも、上述したように設計されたプローブ
を備えている。また、遺伝子型判別キットは、プローブ
以外に、当該プローブを用いたハイブリダイゼーション
に使用する緩衝液等の各種試薬を備えるものであっても
良い。このような遺伝子型判別キットを用いることによ
って、動物に導入した遺伝子の遺伝子型を効率的且つ確
実に判定することができる。On the other hand, the genotyping kit to which the present invention is applied includes at least the probe designed as described above. In addition to the probe, the genotyping kit may include various reagents such as a buffer solution used for hybridization using the probe. By using such a genotyping kit, the genotype of a gene introduced into an animal can be efficiently and reliably determined.
【００４７】[0047]
【実施例】以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定さ
れるものではない。実施例１
本実施例は、ヒトTg-rasH2遺伝子を導入した人工ミュー
タント系統を対象動物とし、この対象動物における遺伝
子型を判定する例である。The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples. Example 1 This example is an example in which an artificial mutant strain introduced with the human Tg-rasH2 gene is used as a target animal and the genotype of the target animal is determined.
【００４８】ヒトTg-rasH2遺伝子の安定性の検討
先ず、ヒトTg-rasH2遺伝子が導入されたTg-rasH2マウス
におけるヒトTg-rasH2遺伝子の安定性を検討した。Tg-r
asH2マウスのバッククロスN15世代の凍結胚由来マウス
およびN20世代から骨髄細胞を採取し、メタフェーズ核
板標本を作製した。このメタフェーズ核板標本を用いて
蛍光in situハイブリダイゼーション法によってミュー
テーションがマウス染色体15E3の部位に安定して保持さ
れていることを確認した。蛍光in situハイブリダイゼ
ーション法においてプローブは、pSV2MBras-gpt（Sekiy
a T.et al.,Jpn.J.Cancer Res.76:851-855,1985）を用
いた。 Examination of Stability of Human Tg-rasH2 Gene First, the stability of human Tg-rasH2 gene in Tg-rasH2 mouse into which human Tg-rasH2 gene was introduced was examined. Tg-r
Bone marrow cells were collected from frozen embryo-derived N15 generation mice and N20 generation backcross of asH2 mice to prepare metaphase nuclear plate preparations. Using this metaphase nuclear plate preparation, it was confirmed by fluorescence in situ hybridization that the mutation was stably retained at the mouse chromosome 15E3 site. In the fluorescence in situ hybridization method, the probe is pSV2MBras-gpt (Sekiy
a T. et al., Jpn. J. Cancer Res. 76: 851-855, 1985).
【００４９】また、同様に、バッククロスN15世代凍結
胚由来マウスおよびN20世代由来マウスからそれぞれゲ
ノムDNAを常法に従い抽出した。抽出したそれぞれのゲ
ノムDNAを制限酵素BamHI、NcoIで消化し、サザンハイブ
リダーゼーションの検討によって、両ゲノムは同一の制
限酵素切断断片を示すことを確認した。また、HindIII,
BamHI,HpaI,XhoI,XbaI,NcoI,BglII,SacIを含む制限酵素
を用いたサザンハイブリダイゼーションの成績による解
析によってヒトTg-rasH2遺伝子（約7kb）の挿入単位が3
単位であることを確認した。サザンハイブリダイゼーシ
ョンにおいてプローブは、pSV2MBras-gptインサートに
おける核酸塩基配列1792番から2400番までの核酸分子、
および、核酸塩基配列6241番から6713番までの核酸分子
を用いた。Similarly, genomic DNAs were extracted from the backcross N15 generation frozen embryo-derived mouse and N20 generation mouse by a conventional method. Each of the extracted genomic DNAs was digested with restriction enzymes BamHI and NcoI, and Southern hybridization was examined to confirm that both genomes showed the same restriction enzyme cleavage fragment. Also, HindIII,
Analysis of Southern hybridization using restriction enzymes including BamHI, HpaI, XhoI, XbaI, NcoI, BglII, and SacI revealed that the insertion unit of the human Tg-rasH2 gene (about 7 kb) was 3
It was confirmed to be a unit. In Southern hybridization, the probe is a nucleic acid molecule from nucleobase sequence 1792 to 2400 in pSV2MBras-gpt insert,
In addition, nucleic acid molecules having nucleic acid base sequences 6241 to 6713 were used.
【００５０】これらの検討によりTg-rasH2マウスにおい
ては、ヒトTg-rasH2遺伝子が安定して世代継承されてい
ることが示された。N20世代由来マウス18匹のゲノムDNA
をBamHI制限酵素で消化し、pSV2MBras-gptインサートの
核酸塩基配列1792番から2400番までの核酸分子をプロー
ブとしたサザンハイブリダイゼーションで検討した結
果、すべての個体において20kb、18kbおよび6.9kbの3本
の切断断片を検出することができた。この結果、N20世
代凍結胚由来マウスにおいて、個体間でのヒトTg-rasH2
遺伝子の均一性を確認することができた。From these examinations, it was shown that the human Tg-rasH2 gene was stably inherited in the Tg-rasH2 mouse. Genomic DNA of 18 N20 generation mice
Was digested with BamHI restriction enzyme and examined by Southern hybridization using a nucleic acid molecule from the nucleic acid sequence 1792 to 2400 of the pSV2MBras-gpt insert as a probe. It was possible to detect a cleavage fragment of As a result, human Tg-rasH2 among individuals in N20 generation frozen embryo-derived mice
The homogeneity of the gene could be confirmed.
【００５１】ヒトTg-rasH2遺伝子の構造の検討
導入されているヒトTg-rasH2遺伝子の構造を検討するた
め、N20世代凍結胚由来マウスのゲノムを抽出し、抽出
したゲノムDNAをBamHIとHindIIIで消化した後にサザン
ハイブリダイゼーションを行った。その結果、ヒトTg-r
asH2遺伝子とマウスゲノムのジャンクション部位とを含
むBamHI-HindIII断片は、8kbと7kbであることが明らか
となった。 Examination of the structure of the human Tg-rasH2 gene In order to examine the structure of the introduced human Tg-rasH2 gene, the genome of the N20 generation frozen embryo-derived mouse was extracted, and the extracted genomic DNA was digested with BamHI and HindIII. After that, Southern hybridization was performed. As a result, human Tg-r
The BamHI-HindIII fragment containing the asH2 gene and the mouse genome junction site was revealed to be 8 kb and 7 kb.
【００５２】また、Tg-rasH2マウスから抽出したゲノム
DNAをBamHIとHindIIIで二重消化し、ショ糖密度勾配遠
心法でサイズ分画を行った後、サザンハイブリダイゼー
ションによる解析でヒトTg-rasH2遺伝子断片を含む分画
を確認した。このBamHI-HindIII断片をクローニングベ
クターpBS-IIKS+（東洋紡績株式会社製）のBamHI-HindI
II部位にリガーゼを用いて結合させ、これを以下のPCR
の鋳型とした。PCRの際には、pBS-IIKS+内のヒトTg-ras
H2遺伝子断片方向にむけたプラーマーとヒトTg-rasH2遺
伝子断片内のpBS-IIKS+方向にむけたプライマーとを用
いた。PCRの結果として得られたDNA断片を用いて、PCR
ダイレクトシークエンスを行い、ヒトTg-rasH2遺伝子の
5´上流側および3´上流側のジャンクション部位を同
定、その遺伝子配列を決定した。In addition, the genome extracted from the Tg-rasH2 mouse
The DNA was double-digested with BamHI and HindIII, and size fractionation was performed by sucrose density gradient centrifugation, followed by analysis by Southern hybridization to confirm the fraction containing the human Tg-rasH2 gene fragment. This BamHI-HindIII fragment was cloned into BamHI-HindI of cloning vector pBS-IIKS + (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
It was ligated to the II site using ligase and this was
Was used as the template. During PCR, human Tg-ras in pBS-IIKS +
A primer directed toward the H2 gene fragment and a primer directed toward pBS-IIKS + in the human Tg-rasH2 gene fragment were used. PCR is performed using the DNA fragment obtained as a result of PCR.
Direct sequence is performed to analyze the human Tg-rasH2 gene.
The 5'upstream and 3'upstream junction sites were identified and their gene sequences were determined.
【００５３】次に、ヒトTg-rasH2遺伝子の5´上流側の
塩基配列および3´上流側のジャンクション部位の塩基
配列に基づいてプライマーを設計、合成した。野生型マ
ウスのゲノムDNAを鋳型として合成したプライマーを用
いてPCRを行い、ダイレクトシークエンスによってヒトT
g-rasH2遺伝子に対応する野生型ゲノムの構造を解析し
た。Next, a primer was designed and synthesized based on the base sequence of the 5'upstream side and the base sequence of the junction site on the 3'upstream side of the human Tg-rasH2 gene. PCR was performed using primers synthesized using wild-type mouse genomic DNA as a template, and human T was analyzed by direct sequencing.
The structure of the wild-type genome corresponding to the g-rasH2 gene was analyzed.
【００５４】これらの検討によって、Tg-rasH2マウスに
おける人工ミューテーションは、図１に示すように、マ
ウス野生型ゲノム約2.2kb（以下、この領域を野生型ア
リルと呼ぶ）が欠失し、遺伝子導入に用いたヒトTg-ras
H2遺伝子が3単位順列方向に挿入置換され、上流1単位目
における5´末端150bpの欠失と下流3単位目における3´
末端24bpの欠失した構造（以下、この領域をミュータン
ト型アリルと呼ぶ）であることが明らかとなった。野生
型アリルの核酸塩基配列も明らかにした。As a result of these studies, artificial mutation in Tg-rasH2 mice was confirmed by the deletion of the mouse wild-type genome of about 2.2 kb (hereinafter, this region is referred to as wild-type allele) as shown in FIG. Human Tg-ras used for transfer
The H2 gene was inserted and replaced in the 3 unit permutation direction, resulting in a deletion of the 5'end 150 bp in the first upstream unit and a 3'in the third downstream unit.
It was revealed to have a structure in which the terminal 24 bp was deleted (hereinafter, this region is referred to as mutant allele). The nucleobase sequence of wild-type allele was also revealed.
【００５５】Tg-rasH2マウスの遺伝子型の判定
上記検討によって明らかとなったTg-rasH2マウスにおけ
る遺伝子構造（図１）をもとに、Tg-rasH2マウスの遺伝
子型の判定を行うためのプライマーを以下のように設計
した。 Determination of Genotype of Tg-rasH2 Mouse Based on the gene structure in Tg-rasH2 mouse (FIG. 1) clarified by the above study, primers for determining the genotype of Tg-rasH2 mouse were selected. It was designed as follows.
【００５６】 5Flank2：5’-CTGGGAACATAACTCAGGTCTCTGCAAGTG-3’ NonTgR4：5’-GCCATACATGTCCGGTTAATGTAGCAAGTT-3’ 5JuncR：5’-CTTCAGCAAGCACCTCAGCTGGGAA-3’ 3DeletF：5’-CCACAAGAGGGACTCCTGCTGCCCAC-3’ newdire1：5’-CACAGGGCATGGTAATACTAAGAGATGCCC-3’[0056] 5Flank2: 5'-CTGGGAACATAACTCAGGTCTCTGCAAGTG-3 ' NonTgR4: 5'-GCCATACATGTCCGGTTAATGTAGCAAGTT-3 ' 5JuncR: 5'-CTTCAGCAAGCACCTCAGCTGGGAA-3 ' 3DeletF: 5'-CCACAAGAGGGACTCCTGCTGCCCAC-3 ' newdire1: 5'-CACAGGGCATGGTAATACTAAGAGATGCCC-3 '
【００５７】図２に示すように、5Flank2は、野生型お
よびミュータント型のフォワードプライマーとなり、No
nTgR4は、野生型アリルの一部を認識するリバースプラ
イマーとなり、5JuncRは、ミュータント型アリルの一部
を認識するリバースプライマーとなる。また、3DeletF
は、ミュータント型を認識するフォワードプライマーと
なり、newdire1はミュータント型を認識するリバースプ
ライマーとなる。As shown in FIG. 2, 5Flank2 was used as a wild type and mutant type forward primer, and
nTgR4 serves as a reverse primer that recognizes a part of the wild-type allele, and 5JuncR serves as a reverse primer that recognizes a part of the mutant-type allele. Also, 3DeletF
Is a forward primer that recognizes the mutant type, and newdire1 is a reverse primer that recognizes the mutant type.
【００５８】遺伝子型の判定対象となる動物は、Tg-ras
H2マウスの繁殖生産コロニーにおける任意の産出仔（８
匹）を用いた。なお、この産出仔（８匹）には、野生型
染色体を2本持つ個体、及び野生型染色体とミューテー
ション型染色体とをそれぞれ1本づつ持つ個体がある。Animals to be genotyped are Tg-ras
Arbitrary offspring in breeding production colonies of H2 mice (8
) Were used. The offspring (8) include an individual having two wild-type chromosomes and an individual having one wild-type chromosome and one mutation-type chromosome.
【００５９】産出仔の尾の先端約10mmの組織よりゲノム
DNAを抽出し、PCRの鋳型として使用した。PCRの反応液
組成は、
・ゲノムDNA …2ul(500ng/μl)
・上記プライマー …各1.25μl
(5Flank2およびNonTgR4 各10pmol/μl,5JuncR,3Delelet
eFおよびnewdire1 各2.5pmol/μl)
・dNTP …2ul(各2.5mM)
・rTaq …0.125ul(5U/μl)
・DDW …12.125μl
・PCR buffer …2.5μl(×10)
とした。また、PCRの反応サイクルは、94℃2分の後、94
℃0.5分、68℃0.5分及び72℃1分を１サイクルとして33
サイクル、その後、72℃2分とした。Genome from a tissue of about 10 mm at the tip of the tail of the offspring
DNA was extracted and used as a template for PCR. The composition of the reaction solution for PCR is: -genomic DNA: 2ul (500ng / μl) -the above primers: 1.25μl each (5Flank2 and NonTgR4 10 pmol/μl, 5JuncR, 3Delelet)
eF and newdire1 each 2.5 pmol / μl) ・ dNTP… 2 ul (2.5 mM each) ・ rTaq… 0.125 ul (5 U / μl) ・ DDW… 12.125 μl ・ PCR buffer… 2.5 μl (× 10). The reaction cycle of PCR is 94 ° C for 2 minutes, then 94
℃ 0.5 minutes, 68 ℃ 0.5 minutes and 72 ℃ 1 minute 1 cycle 33
The cycle was followed by 72 ° C for 2 minutes.
【００６０】このPCRにおいて、鋳型となるゲノムDNAに
野生型アリルが存在する場合、5Flank2及びNonTgR4によ
り516bpのDNA断片が増幅する（図２参照）。また、この
PCRにおいて、鋳型となるゲノムDNAにミュータント型ア
リルが存在する場合、5Flank2及び5JuncRにより231bpの
DNA断片が増幅し、3DeletF及びnewdire1により83bpのDN
A断片が増幅する（図２参照）。In this PCR, when a wild-type allele is present in the genomic DNA serving as a template, 5Flank2 and NonTgR4 amplify a 516 bp DNA fragment (see FIG. 2). Also this
In PCR, when mutant alleles are present in the genomic DNA that serves as a template, 231 bp of 5Flank2 and 5JuncR
DNA fragment is amplified and DN of 83bp by 3Delet F and newdire1
The A fragment is amplified (see Figure 2).
【００６１】したがって、PCRを行った後の反応液をア
ガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルをエチジウムブロミ
ド染色したところ、野生型染色体を2本持つ個体におい
ては516bpのDNA断片のみが、野生型とミューテーション
型染色体をそれぞれ1本づつ持つ個体においては、516bp
のDNA断片、231bpのDNA断片及び83bpのDNA断片が検出さ
れる。すなわち、対象の産出仔が野生型染色体を２本持
つ場合には、電気泳動の結果、単一のバンドが検出さ
れ、対象の産出仔が野生型とミューテーション型染色体
をそれぞれ1本づつ持つ場合には、3本の染色バンドが検
出される。また、対象の産出仔が野生型染色体を２本持
つ場合には、対象の産出仔が野生型とミューテーション
型染色体をそれぞれ1本づつ持つ場合と比較して、516bp
のDNA断片のバンドが高濃度に検出される。Therefore, the reaction solution after PCR was subjected to agarose gel electrophoresis and the gel was stained with ethidium bromide. As a result, in the individual having two wild type chromosomes, only the 516 bp DNA fragment was detected as the wild type and the mutation. 516 bp in individuals with one type chromosome each
, A 231 bp DNA fragment and a 83 bp DNA fragment are detected. That is, when the target litter has two wild-type chromosomes, a single band is detected as a result of electrophoresis, and the target litter has one wild-type chromosome and one mutation-type chromosome. In, 3 stained bands are detected. In addition, when the target litter has two wild-type chromosomes, 516bp compared to the case where the target litter has one wild-type chromosome and one mutation-type chromosome
The band of the DNA fragment is detected at high concentration.
【００６２】本例において、８匹の産出仔を用いて上記
PCR及び電気泳動を行った結果を図３及び図４に示す。
なお、これら図３及び図４の電気泳動写真において、レ
ーンの上部に付された「Ｎ」は、泳動パターンの解析か
ら野生型染色体を2本持つ産出仔と同定されたものであ
り、レーンの上部に付された「Ｔ」は、泳動パターンの
解析から野生型とミューテーション型染色体をそれぞれ
1本づつ持つ産出仔と同定されたものである。In this example, 8 offspring were used to
The results of PCR and electrophoresis are shown in FIGS. 3 and 4.
In these electrophoretic photographs of FIGS. 3 and 4, “N” added to the upper part of the lane was identified as the offspring having two wild-type chromosomes from the analysis of the migration pattern. The "T" attached to the upper part indicates that the wild type and mutation type chromosomes are analyzed from the analysis of the migration pattern.
It was identified as a single offspring.
【００６３】次に、電気泳動の結果を更に検証するため
に、上記PCRの反応液を用いてPCRダイレクトシークエン
ス法を行った。その結果、電気泳動により確認された３
本のバンドは、それぞれが期待される5Flank2及びNonTg
R4により増幅した516bpのDNA断片（野生型アリル）、5F
lank2及び5JuncRにより増幅した231bpのDNA断片（ミュ
ーテーション型アリル）及び3DeletF及びnewdire1によ
り増幅した83bpのDNA断片であった。Next, in order to further verify the results of electrophoresis, a PCR direct sequencing method was carried out using the above PCR reaction solution. As a result, 3 confirmed by electrophoresis
The bands of the book are 5Flank2 and NonTg, each expected
516 bp DNA fragment amplified by R4 (wild type allele), 5F
It was a 231 bp DNA fragment (mutation-type allele) amplified by lank2 and 5JuncR, and an 83 bp DNA fragment amplified by 3DeletF and newdire1.
【００６４】[0064]
【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明よ
れば、動物に導入した遺伝子の遺伝子型を効率的且つ確
実に判定することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above in detail, according to the present invention, the genotype of a gene introduced into an animal can be efficiently and reliably determined.
【図１】Tg-rasH2マウスにおける遺伝子構造を示す模式
図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the gene structure in Tg-rasH2 mice.
【図２】Tg-rasH2マウスの遺伝子型の判定を行うための
プライマー（5Flank2、NonTgR4、5JuncR、3DeletF及びn
ewdire1）の位置を示す模式図である。FIG. 2 shows primers (5Flank2, NonTgR4, 5JuncR, 3DeletF and n for determining the genotype of Tg-rasH2 mice.
It is a schematic diagram which shows the position of ewdire1).
【図３】８匹の産出仔のゲノムDNAを用いて行ったPCR反
応液の電気泳動写真である。FIG. 3 is an electrophoretic photograph of a PCR reaction solution carried out using genomic DNA of 8 offspring.
【図４】８匹の産出仔のゲノムDNAを用いて行ったPCR反
応液の電気泳動写真である。FIG. 4 is an electrophoretic photograph of a PCR reaction solution performed using genomic DNA of 8 offspring.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA02 CA09 DA02 HA14 4B063 QA08 QQ43 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 33/566 C12N 15/00 ZNAA F term (reference) 4B024 AA11 CA02 CA09 DA02 HA14 4B063 QA08 QQ43 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34
Claims (22)
動物の遺伝子型判別方法。 （a）上記動物に導入された判定対象の遺伝子の構造に
基づいて設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）法を行う工程。 （b）上記（a）のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によ
って増幅されたDNA断片を解析する工程。1. A method for genotyping an animal, which comprises the following steps (a) and (b): (A) A step of performing a polymerase chain reaction (PCR) method using a primer designed on the basis of the structure of a gene to be judged introduced into the animal. (B) A step of analyzing the DNA fragment amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method of the above (a).
定対象の遺伝子の少なくとも一部の塩基配列に基づいて
設計することを特徴とする請求項１記載の遺伝子型判別
方法。2. The genotyping method according to claim 1, wherein in the step (a), the primer is designed based on at least a part of the nucleotide sequence of the gene to be judged.
造を同定する工程を含むことを特徴とする請求項１記載
の遺伝子型判別方法。3. The genotyping method according to claim 1, further comprising a step of identifying the structure of the gene before the step (a).
当該遺伝子の少なくとも一部を含む塩基配列を決定する
ことを特徴とする請求項３記載の遺伝子型判別方法。4. In the step of identifying the structure of the gene,
The genotyping method according to claim 3, wherein a nucleotide sequence containing at least a part of the gene is determined.
当該遺伝子とハイブリダイズできる塩基配列を含むプロ
ーブを用いて、上記動物のゲノムに当該遺伝子が導入さ
れているかを検証することを特徴とする請求項３記載の
遺伝子型判別方法。5. In the step of identifying the structure of the gene,
The genotyping method according to claim 3, wherein a probe containing a nucleotide sequence capable of hybridizing with the gene is used to verify whether the gene has been introduced into the genome of the animal.
世代的安定性及び／又は上記遺伝子の個体間での均一性
を判定することを特徴とする請求項１記載の遺伝子型判
別方法。6. The genotyping according to claim 1, characterized in that, before the step (a), the transgenetic stability of the gene and / or the homogeneity of the gene among individuals are determined. Method.
胚から得られたコロニーであることを特徴とする請求項
１記載の遺伝子型判別方法。7. The genotyping method according to claim 1, wherein the animal is a frozen embryo and / or a colony obtained from the embryo.
たTg-rasH2マウスであることを特徴とする請求項１記載
の遺伝子型判別方法。8. The genotyping method according to claim 1, wherein the animal is a Tg-rasH2 mouse into which a human H-ras gene has been introduced.
ト系統であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子型
判別方法。9. The genotyping method according to claim 1, wherein the animal is a naturally occurring mutant strain.
子構造判定工程を更に行うことを特徴とする請求項１記
載の遺伝子型判別方法。10. The genotyping method according to claim 1, further comprising a gene structure determination step other than the PCR method after the step (b).
構造に基づいて設計したプライマーと、上記動物のゲノ
ムから上記プライマーとともにDNA断片を増幅する酵素
を含む試薬とを含む動物の遺伝子型判別キット。11. An animal genotyping kit comprising a primer designed on the basis of the structure of a gene to be judged introduced into an animal, and a reagent containing an enzyme for amplifying a DNA fragment from the genome of the animal together with the primer. .
む動物の遺伝子型判別方法。 （c）上記動物に導入された判定対象の遺伝子の構造に
基づいて設計したプローブを用いてクローニングを行う
工程。 （b）上記（c）のクローニングによって同定されたクロ
ーンを解析する工程。12. A method for genotyping an animal, which comprises the following steps (c) and (d): (C) A step of cloning using a probe designed based on the structure of the gene to be determined, which has been introduced into the animal. (B) analyzing the clone identified by the cloning in (c) above.
定対象の遺伝子の少なくとも一部の塩基配列に基づいて
設計することを特徴とする請求項１２記載の遺伝子型判
別方法。13. The genotyping method according to claim 12, wherein in the step (c), the probe is designed based on at least a part of the nucleotide sequence of the gene to be judged.
構造を同定する工程を含むことを特徴とする請求項１２
記載の遺伝子型判別方法。14. The method according to claim 12, further comprising the step of identifying the structure of the gene before the step (c).
The described genotyping method.
は、当該遺伝子の少なくとも一部を含む塩基配列を決定
することを特徴とする請求項１４記載の遺伝子型判別方
法。15. The genotyping method according to claim 14, wherein in the step of identifying the structure of the gene, a nucleotide sequence containing at least a part of the gene is determined.
は、当該遺伝子とハイブリダイズできる塩基配列を含む
プローブを用いて、上記動物のゲノムに当該遺伝子が導
入されているかを検証することを特徴とする請求項１４
記載の遺伝子型判別方法。16. The step of identifying the structure of the gene is characterized by verifying whether the gene has been introduced into the genome of the animal using a probe containing a nucleotide sequence capable of hybridizing with the gene. Claim 14
The described genotyping method.
継世代的安定性及び／又は上記遺伝子の個体間での均一
性を判定することを特徴とする請求項１２記載の遺伝子
型判別方法。17. The genotyping according to claim 12, wherein, before the step (a), the transgenetic stability of the gene and / or the homogeneity of the gene among individuals are determined. Method.
該胚から得られたコロニーであることを特徴とする請求
項１２記載の遺伝子型判別方法。18. The genotyping method according to claim 12, wherein the animal is a frozen embryo and / or a colony obtained from the embryo.
したTg-rasH2マウスであることを特徴とする請求項１２
記載の遺伝子型判別方法。19. The animal according to claim 12, which is a Tg-rasH2 mouse into which a human H-ras gene has been introduced.
The described genotyping method.
ント系統であることを特徴とする請求項１２記載の遺伝
子型判別方法。20. The genotyping method according to claim 12, wherein the animal is a naturally occurring mutant strain.
除く遺伝子構造判定工程を更に行うことを特徴とする請
求項１２記載の遺伝子型判別方法。21. The genotyping method according to claim 12, further comprising the step of determining a gene structure excluding cloning after the step (d).
構造に基づいて設計したプローブを含む動物の遺伝子型
判別キット。22. An animal genotyping kit comprising a probe designed on the basis of the structure of a gene to be judged introduced into an animal.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114134178A (en) * | 2021-12-10 | 2022-03-04 | 中国食品药品检定研究院 | Carcinogenic mouse model and establishing method and application thereof |
-
2001
- 2001-06-26 JP JP2001192784A patent/JP2003018990A/en active Pending
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040302 |