JP2002541794A

JP2002541794A - Yeast

Info

Publication number: JP2002541794A
Application number: JP2000611653A
Authority: JP
Inventors: ゲルスト−タラス，ウルビ; ダンロップ，ジョン; ケルセル，デイビッド，ピーター
Original assignee: Queen Mary and Westfiled College University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2002-12-10
Also published as: WO2000061728A3; WO2000061728A2; AU3981400A; GB9908458D0

Abstract

(57)【要約】【課題】エラスターゼ及びそれをコードする核酸の医薬における応用を開発する。【解決手段】本発明はヒトエラスターゼＩの突然変異体をコードする核酸配列を含む単離され又は組換えられたポリヌクレオチドを提供する。この突然変異体ヒトエラスターゼＩはコドン（２０７から２２５まで）のいずれか一つ、好ましくはコドン２０８にフレームシフト突然変異を持つ。この突然変異エラスターゼＩは乾癬、湿疹、紅斑性狼蒼、紅斑、及び恐らく癌などの過増殖性皮膚病における寄与因子である。 (57) [Summary] [Object] To develop applications of elastase and a nucleic acid encoding the same in medicine. The present invention provides an isolated or recombinant polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a mutant of human elastase I. This mutant human elastase I has a frameshift mutation at any one of the codons (207 to 225), preferably at codon 208. This mutant elastase I is a contributing factor in hyperproliferative skin diseases such as psoriasis, eczema, erythematous lupus, erythema, and possibly cancer.

Description

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】本発明はエラスターゼ、それをコードする核酸及びこれらの医薬における使用
に関する。The present invention relates to elastase, nucleic acids encoding it and their use in medicine.

【０００２】エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３６）は、「セリンプロテアーゼ」と呼ば
れる酵素の一群であり、該酵素の活性部位におけるセリン残基の反応性により特
徴付けられる。エラスターゼは弾性繊維の特殊なタンパク質であるエラスチンを
分解し、そしてフィブリン、ヘモグロビン及びアルブミンなどの他のタンパク質
を消化する。エラスターゼＩ、II及びIII （又はプロテアーゼＥ）と名付けられ
た、エラスターゼの構造的に関連する三つのタイプのエラスターゼが、哺乳類の
外分泌性膵臓により分泌される幾つかのイソ型と共に同定された（マクドナルド
ら，1982、カワシマら, DNA 6: 163-172, 1987、タニら, J. Biol. Chem. 263:
1231-1239, 1988 、シラスら, J. Biochem (Tokyo) 104: 259-264, 1988)。[0002] Elastase (EC 3.4.21.36) is a group of enzymes called "serine proteases", characterized by the reactivity of serine residues in the active site of the enzyme. Elastase breaks down elastin, a special protein in elastic fibers, and digests other proteins such as fibrin, hemoglobin and albumin. Three structurally related types of elastase, named elastases I, II and III (or protease E), have been identified along with several isoforms secreted by the exocrine pancreas of mammals (McDonald 1982; Kawashima et al., DNA 6: 163-172, 1987; Tani et al., J. Biol. Chem. 263:
1231-1239, 1988, Shirasu et al., J. Biochem (Tokyo) 104: 259-264, 1988).

【０００３】ヒトエラスターゼＩ（ＥＬＡ１）をコードする遺伝子は染色体１２ｑ１３に位
置する（デイビースら，Genomics 29: 766-768, 1995) 。ＥＬＡ１遺伝子の見か
けの構造的完全さにもかかわらず、それは転写サイレントであると報告されてい
る（タニら，J. Biochem (Tokyo) 101:591-599, 1987、カワシマら, DNA Seq 2:
303-312, 1992) 。膵臓小胞細胞におけるヒトエラスターゼＩ遺伝子の進化的サ
イレント化はエンハンサー及びプロモーター因子を不活性化する突然変異による
ように見え（ローズら，Hum Mol Genet 6: 897-903, 1997) 、これは膵臓の特異
的転写にとって極めて重要である（ルーら，Genes Dev 3: 1613-1624, 1989、ス
イフトら, Genes Dev 3: 687-696, 1989、スイフトら, J Biol Chem 269: 12809
-12815, 1994、ローズら, Mol Cell Biol 14: 2048-2057, 1994 、クルーズら,
Mol Cell Biol 15: 4385-4394, 1995)。腎臓、心臓、肺臓、大動脈管内膜、及び
末梢血リンパ球由来のヒト組織ｍＲＮＡのドットブロットでは、³²Ｐ標識ヒトエ
ラスターゼＩＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションを検出できなかった。
エラスターゼＩｍＲＮＡは、ヒト腎臓、肝臓又は心臓ではより感度の高いＲＴ−
ＰＣＲ技法によっても検出されなかった（カワシマら，DNA Seq 2: 303-312, 19
92) 。文献で、膵臓でのヒトエラスターゼＩ活性が記述されているときは、それ
は実際はエラスターゼIIＡであることに注意すべきである。[0003] The gene encoding human elastase I (ELA1) is located on chromosome 12q13 (Davies et al., Genomics 29: 766-768, 1995). Despite the apparent structural integrity of the ELA1 gene, it has been reported to be transcriptionally silent (Tani et al., J. Biochem (Tokyo) 101: 591-599, 1987; Kawashima et al., DNA Seq 2:
303-312, 1992). Evolutionary silencing of the human elastase I gene in pancreatic vesicle cells appears to be due to mutations that inactivate enhancer and promoter elements (Rose et al., Hum Mol Genet 6: 897-903, 1997), Critical for specific transcription (Lou et al., Genes Dev 3: 1613-1624, 1989; Swift et al., Genes Dev 3: 687-696, 1989; Swift et al., J Biol Chem 269: 12809
-12815, 1994; Rose et al., Mol Cell Biol 14: 2048-2057, 1994; Cruise et al.,
Mol Cell Biol 15: 4385-4394, 1995). Dot blots of human tissue mRNA from kidney, heart, lung, aortic intima, and peripheral blood lymphocytes failed to detect hybridization to ³² P-labeled human elastase I DNA probe.
Elastase I mRNA is more sensitive to RT- in human kidney, liver or heart.
It was not detected by the PCR technique (Kawashima et al., DNA Seq 2: 303-312, 19
92). When the literature describes human elastase I activity in the pancreas, it should be noted that it is in fact elastase IIA.

【０００４】ヒトエラスターゼＩの成熟ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は未だ報告されておら
ず、合成的仮定的ｍＲＮＡ配列（受託：Ｅ０１４４７）がゲノム配列から演繹さ
れ、そしてラットエラスターゼＩ遺伝子及びラットｃＤＮＡのヌクレオチド配列
とそれの比較が利用できる（カワシマら，DNA Seq 2: 303-312, 1992)(及び部分
的ｃＤＮＡ１４２ｂｐ断片，受託：Ｄ００１５９）。[0004] The nucleotide sequence of the mature mRNA of human elastase I has not yet been reported, a synthetic putative mRNA sequence (Accession: E01447) was deduced from the genomic sequence, and the nucleotide sequence of the rat elastase I gene and rat cDNA was A comparison thereof is available (Kawashima et al., DNA Seq 2: 303-312, 1992) (and a partial cDNA 142 bp fragment, accession: D00159).

【０００５】本発明者らは、エラスターゼが哺乳類皮膚の基底細胞層に局在することを免疫
組織化学を用いてここに証明した。本発明者らはヒトエラスターゼＩをコードす
るｍＲＮＡが培養したケラチン生成細胞中で発現することをも見出し、そしてこ
れから、２塩基置換によりゲノム配列演繹された配列（カワシマら、DNA Seq 2:
303-312, 1992) とは異なるｃＤＮＡ配列を取得した。幾人かの個体からのゲノ
ムＤＮＡの配列決定及び分析により、驚くべきことに、エラスターゼＩタンパク
質の先端切断を生ずる配列変異体が明らかにされた。先端切断された変異体の二
次構造分析は、先端切断がおそらく基質／酵素複合体の形成に悪影響を与えるこ
とにより、このタンパク質の正常な機能を破壊しうるけれども、それは必ずしも
活性部位の破壊をもたらすことはないであろうことを示した。本発明者らは理論
に拘束されることを望むわけではないが、その突然変異タンパク質はエラスチン
やＢＰＡＧ２などのタンパク質をもはや消化し得ない可能性が高い。このことは
、細胞が分化の際剥がれなくなり、皮膚の肥厚化を生じうることを意味する。こ
うして、この変異体の保持者は、湿疹、乾癬、紅斑性狼蒼、及び紅斑などの過増
殖性皮膚状態を発症する危険がより大きいといいうる。このような無制御細胞増
殖はこの変異体が癌に対する危険因子であることをも意味する。The present inventors have now demonstrated, using immunohistochemistry, that elastase is localized in the basal cell layer of mammalian skin. We have also found that mRNA encoding human elastase I is expressed in cultured keratinocytes, and from this, the sequence deduced by genomic sequence by two base substitutions (Kawashima et al., DNA Seq 2:
303-312, 1992). Sequencing and analysis of genomic DNA from several individuals has surprisingly revealed sequence variants that result in truncation of the elastase I protein. Secondary structure analysis of truncated mutants may indicate that truncation can disrupt the normal function of this protein, possibly by adversely affecting the formation of the substrate / enzyme complex, but it does not necessarily lead to disruption of the active site. Indicated that it would not bring. Although we do not wish to be bound by theory, it is likely that the mutant protein will no longer be able to digest proteins such as elastin and BPAG2. This means that the cells do not detach during differentiation and can result in thickening of the skin. Thus, carriers of this variant may be at greater risk of developing a hyperproliferative skin condition such as eczema, psoriasis, erythematous lupus, and erythema. Such uncontrolled cell growth also means that the variant is a risk factor for cancer.

【０００６】本発明の第一の側面によれば、ヒトエラスターゼＩの突然変異体をコードする
核酸配列を含む単離され又は組換えられたポリヌクレオチドであって、該核酸配
列がコドン２０７から２２５までのいずれか一つでフレームシフト突然変異を有
する図３の配列を含むものであるポリヌクレオチドが提供される。According to a first aspect of the present invention, an isolated or recombinant polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a mutant of human elastase I, wherein the nucleic acid sequence comprises codons 207 to 225. A polynucleotide comprising the sequence of FIG. 3 having a frameshift mutation in any one of the foregoing.

【０００７】該フレームシフト突然変異は該タンパク質のＣ末端の破壊を生じ、おそらく基
質結合に悪影響を与えるのであろう。[0007] The frameshift mutation results in disruption of the C-terminus of the protein, possibly affecting substrate binding.

【０００８】該フレームシフト突然変異はコドン２０８における１個の塩基挿入であること
が好ましい。この１個の塩基挿入の結果、そのＣ末端における２６個のアミノ酸
だけ野性型の先端から切断されることになる。この核酸はｃＤＮＡであることが
好ましく、そして挿入される１個の塩基はシトシンヌクレオチドであることが好
ましい。Preferably, the frameshift mutation is a single base insertion at codon 208. As a result of this one base insertion, only 26 amino acids at the C-terminus will be cleaved from the wild type tip. The nucleic acid is preferably a cDNA and the single base inserted is preferably a cytosine nucleotide.

【０００９】本発明の第二の側面によれば、図５に示すアミノ酸配列（ＥＬＡ１ｖａｒ）
を含み又はその配列と実質的な配列同一性を有するヒトエラスターゼＩの突然変
異体を含む単離されたポリペプチドが提供される。According to a second aspect of the present invention, the amino acid sequence shown in FIG. var)
Or an isolated polypeptide comprising a mutant of human elastase I comprising or having substantial sequence identity to the sequence thereof.

【００１０】この突然変異により惹起される破壊のため、この変異体タンパク質は、乾癬、
湿疹、紅斑性狼蒼、紅斑、及びおそらく癌などの過増殖性皮膚病における寄与因
子でありうる。従って、この変異体の検出はこのような状態への被験者の素因を
指示することになる。[0010] Due to the destruction caused by this mutation, this mutant protein is
It may be a contributing factor in hyperproliferative skin diseases such as eczema, erythematous erythema, erythema, and possibly cancer. Thus, detection of this variant will indicate a subject's predisposition to such a condition.

【００１１】こうして、本発明の第三の側面によれば、過増殖皮膚状態又は癌に対する被験
者の素因を決定する方法であって、被験者におけるＥＬＡ１の対立遺伝子の存在
を検出する工程であり、該対立遺伝子がヒトエラスターゼＩの突然変異対立遺伝
子をコードし且つ図３の核酸配列のコドン２０７から２２５までのいずれか一つ
におけるフレームシフト突然変異を有するものである工程を含む方法が提供され
る。Thus, according to a third aspect of the present invention, there is provided a method for determining a subject's predisposition to a hyperproliferative skin condition or cancer, comprising the step of detecting the presence of an ELA1 allele in the subject, A method is provided wherein the allele encodes a mutant allele of human elastase I and has a frameshift mutation at any one of codons 207 to 225 of the nucleic acid sequence of FIG.

【００１２】該フレームシフト突然変異はコドン２０８における１個の塩基挿入であり、そ
して該挿入される１個の塩基がシトシンヌクレオチドでありうる。The frameshift mutation is a single base insertion at codon 208, and the single base inserted can be a cytosine nucleotide.

【００１３】該対立遺伝子は被験者の染色体１２ｑ１３由来のゲノムＤＮＡセグメントを配
列決定することにより検出されうる。[0013] The allele can be detected by sequencing a genomic DNA segment from chromosome 12q13 of the subject.

【００１４】または、対立遺伝子の検出は、（ｉ）ある反応においてＥＬＡ１対立遺伝子に
選択的にハイブリダイズすることができる一つ以上のポリヌクレオチドプローブ
と被験者由来の核酸試料を混合する工程、及び（ii) 該反応をモニターして該試
料中の該遺伝子対立遺伝子の存在を検出し、それにより被験者が過増殖性皮膚状
態又は癌の危険性があるか否かを示す工程によってもよい。Alternatively, detecting the allele comprises: (i) mixing a nucleic acid sample from the subject with one or more polynucleotide probes capable of selectively hybridizing to the ELA1 allele in a reaction; and ii) monitoring the reaction to detect the presence of the gene allele in the sample, thereby indicating whether the subject is at risk for a hyperproliferative skin condition or cancer.

【００１５】エラスターゼＩの破壊の原因となる遺伝的突然変異を検出し且つ同定するため
に使用しうる、組換えＤＮＡ技法から入手可能な幾つかの方法がある。これらに
は、直接プロービング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法及び一本鎖高次構造
分析（ＳＳＣＡ）が挙げられる。There are several methods available from recombinant DNA technology that can be used to detect and identify genetic mutations that cause elastase I disruption. These include direct probing, the polymerase chain reaction (PCR) method and single-stranded conformation analysis (SSCA).

【００１６】直接プロービングを用いる点突然変異の検出は合成的に若しくはニック翻訳に
より調製されるオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。このＤＮＡプローブ
は、例えば放射標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識などを用い
て、後の、例えばサザンブロット・ハイブリダイゼーション操作において可視化
するために、適当に標識されうる。この標識されたプローブはニトロセルロース
又はナイロン６６基板に結合した試料ＤＮＡと反応させられる。標識されたＤＮ
Ａプローブに相補的なＤＮＡ配列を持つ領域は、再アニーリング反応の結果、そ
れ自体が標識されるようになる。このような標識を示すフィルターの領域を次に
、例えばオートラジオグラフィーにより可視化しうる。The detection of point mutations using direct probing involves the use of oligonucleotide probes prepared synthetically or by nick translation. The DNA probe can be appropriately labeled, for example, using a radiolabel, an enzyme label, a fluorescent label, a biotin-avidin label, etc., for visualization in a subsequent, for example, Southern blot hybridization operation. The labeled probe is reacted with a sample DNA bound to a nitrocellulose or nylon 66 substrate. Labeled DN
The region having the DNA sequence complementary to the A probe is itself labeled as a result of the reannealing reaction. The area of the filter showing such labels can then be visualized, for example, by autoradiography.

【００１７】リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの代替的プロービング法は、ミスマッチプロ
ーブ、即ち突然変異の点を除き標的と完全に相補性を有するプローブの使用を含
む。この標的配列を、次に、両者の間を区別する条件の下で、完全な相補性を有
するオリゴヌクレオチドとミスマッチを含むオリゴヌクレオチドの両方にハイブ
リダイズさせる。反応条件を操作することにより、完全な相補性がある場合にの
みハイブリダイゼーションを得ることが可能である。もしミスマッチが存在する
ならば、そのときはハイブリダイゼーションの有意の減少が起こる。An alternative probing method, such as the ligase chain reaction (LCR), involves the use of mismatched probes, ie, probes that are completely complementary to the target except for the mutation. This target sequence is then hybridized to both oligonucleotides with perfect complementarity and those containing mismatches, under conditions that distinguish between the two. By manipulating the reaction conditions, it is possible to obtain hybridization only when there is perfect complementarity. If a mismatch is present, then a significant decrease in hybridization will occur.

【００１８】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は特定のＤＮＡ配列を顕著な効率で増幅する
技法である。熱安定酵素タックポリメラーゼを用いて行われる、変性、プライマ
ーアニーリング及び伸長のサイクルの反復は所望のＤＮＡ配列の濃度の指数関数
的増大をもたらす。The polymerase chain reaction (PCR) is a technique that amplifies a particular DNA sequence with significant efficiency. Repeated cycles of denaturation, primer annealing and extension performed with the thermostable enzyme Tac Polymerase result in an exponential increase in the concentration of the desired DNA sequence.

【００１９】エラスターゼＩをコードするヌクレオチド配列の知識が与えられれば、目的の
ＤＮＡを両側で挟む配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを調製することが可
能である。各オリゴヌクレオチドは二つの鎖の一方に相補的である。次いで、こ
のＤＮＡを高温（例えば９５℃）で変性し、次に大過剰モル濃度のオリゴヌクレ
オチドの存在下に再アニーリングする。相互に３’末端を指して向いているオリ
ゴヌクレオチドは標的配列の反対鎖にハイブリダイズし、そして４種のデオキシ
リボヌクレオチド三リン酸の存在下に核酸鋳型に沿って酵素的伸長を開始する。
次に最終産物を別のサイクルのために再び変性する。この三工程サイクルが数回
繰り返された後、１００万倍以上のＤＮＡセグメントの増幅が達成できる。次い
で、遺伝的変化の位置決めを行うため、得られたＤＮＡを直接配列決定する。ま
たは、変化したＤＮＡにのみ結合するオリゴヌクレオチドを調製し、その結果突
然変異が存在するときにのみＰＣＲがＤＮＡの増幅を行うようにすることが可能
である。ＰＣＲの後、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョン（ジヘッラら, (1988) Lancet 1: 497) を用いてこの突然変異を検出しうる
。または、特異的対立遺伝子の増幅と呼ばれるＰＣＲ（ＰＡＳＡ）の適用を用い
ることができる。これは１個の塩基対だけが異なる対立遺伝子の間の迅速且つ信
頼しうる区別を行うため差別増幅を用いる。Given knowledge of the nucleotide sequence encoding elastase I, it is possible to prepare a synthetic oligonucleotide complementary to the sequence flanking the DNA of interest. Each oligonucleotide is complementary to one of the two strands. The DNA is then denatured at elevated temperatures (eg, 95 ° C.) and then re-annealed in the presence of a large molar excess of oligonucleotide. Oligonucleotides pointing toward the 3 'end of each other hybridize to the opposite strand of the target sequence and initiate enzymatic extension along the nucleic acid template in the presence of the four deoxyribonucleotide triphosphates.
The final product is then denatured again for another cycle. After this three-step cycle is repeated several times, amplification of the DNA segment of 1,000,000 times or more can be achieved. The resulting DNA is then directly sequenced to locate the genetic alteration. Alternatively, oligonucleotides can be prepared that bind only to the altered DNA, so that PCR will only amplify the DNA when there is a mutation. After PCR, this mutation can be detected using allele-specific oligonucleotide hybridization (Dichella et al., (1988) Lancet 1: 497). Alternatively, an application of PCR (PASA), called amplification of specific alleles, can be used. It uses differential amplification to make quick and reliable distinctions between alleles that differ by only one base pair.

【００２０】さらに別の方法では、ＰＣＲの後に、制限エンドヌクレアーゼ消化を行い、さ
らに得られる生産物の分析を行う。In yet another method, PCR is followed by restriction endonuclease digestion and further analysis of the resulting product.

【００２１】一本鎖高次構造分析（ＳＳＣＡ）（オリタら（1989) Genomics 5: 874 及びオ
リタら，(1990) Genomics 6: 271) は比較的迅速な検出法を提供する。この方法
は少なくとも一部の場合には適当である。Single-stranded conformational analysis (SSCA) (Orita et al. (1989) Genomics 5 : 874 and Orita et al. (1990) Genomics 6: 271) provide a relatively rapid method of detection. This method is suitable at least in some cases.

【００２２】特異的な対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）は一塩基突然変異又は一塩基多
形の迅速な検出法である（ニュートンら（1989) Nucleic Acids Res. 17: 2503
、ニコルスら(1989) Genomics 5: 535、オカヤマら(1989) J. Lab. Clin. Med. 114: 105、ザルカーら, (1990) Anal. Biochem. 186: 64 、ソマーら(1989) May
o Clin. Proc. 64: 1361、ウー(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 275
7)、及びダットンら(1991) Biotechniques 11: 700) 。ＰＡＳＡ（対立遺伝子特
異的増幅としても知られる）は二つのオリゴヌクレオチドプライマーでその一方
が対立遺伝子特異的なものを用いる増幅を含む。所望の対立遺伝子は効率的に増
幅される一方、他方の対立遺伝子（単数又は複数）は、それが対立遺伝子特異的
プライマーの３’末端で又はその付近でミスマッチしているので、僅かしか増幅
されない。[0022] PCR amplification of specific alleles (PASA) is a single nucleotide mutation or single nucleotide multiple
Is a rapid detection method for forms (Newton et al. (1989) Nucleic Acids Res.17: 2503
, Nichols et al. (1989) GenomicsFive: 535, Okayama et al. (1989) J. Lab.Clin. Med. 114: 105, Zulkar et al., (1990) Anal. Biochem.186: 64, Sommer et al. (1989) May
o Clin. Proc.64: 1361, Wu (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86: 275
7), and Dutton et al. (1991) Biotechniques11: 700). PASA (allele specific
(Also known as differential amplification) is one of two oligonucleotide primers
Include amplification using allele specific. The desired allele is efficiently increased
While being spanned, the other allele (s) is
Little amplification due to mismatch at or near the 3 'end of the primer
Not done.

【００２３】同様に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）として知られる方法が、鎌状血球貧血症
を惹起するヘモグロビン対立遺伝子中の一塩基置換を検出するため、成功裏に使
用されてきた（バラニーら（1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 189 、
ワイス（1991) Science 254: 1292)。ＬＣＲプローブは多重異種突然変異を同時
スクリーニングするために組み合わされ、又は多重使用される。Similarly, a method known as the ligase chain reaction (LCR) has been successfully used to detect single base substitutions in the hemoglobin allele causing sickle cell anemia (Barani et al. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 189, Proc.
Weiss (1991) Science 254: 1292). LCR probes are combined or multiplexed to simultaneously screen for multiple heterologous mutations.

【００２４】ＷＯ９８／１４６１６に開示された方法は多形を検出するために使用しうる。
この方法では、分析すべき核酸試料は一本鎖に分離され、その一方が標的鎖とな
る。一ヌクレオチド多形に隣接する塩基まで標的鎖に相補的であり、一ヌクレオ
チド多形を含むプライマー配列を調製し、そして標的鎖にアニーリングする。次
に、ジデオキシヌクレオチドの形で可能な相補的塩基のそれぞれをＤＮＡポリメ
ラーゼと共に標的−プライマー複合体に添加する。この多形に相補的なジデオキ
シヌクレオチド塩基はプライマー配列に組み込まれ、さらなる塩基の添加を阻止
する。次いで、伸長したプライマー配列を質量スペクトル分光法により分析して
それに添加された相補的塩基、従って多形の部位における塩基の同一性を決定す
ることができる。The method disclosed in WO 98/14616 can be used to detect polymorphism.
In this method, a nucleic acid sample to be analyzed is separated into single strands, one of which is a target strand. A primer sequence is prepared that is complementary to the target strand up to the base adjacent to the single nucleotide polymorphism and contains the single nucleotide polymorphism, and anneals to the target strand. Next, each of the possible complementary bases in the form of dideoxynucleotides is added to the target-primer complex along with the DNA polymerase. The dideoxynucleotide base that is complementary to the polymorphism is incorporated into the primer sequence and prevents the addition of additional bases. The extended primer sequence can then be analyzed by mass spectroscopy to determine the complementary base added to it, and thus the identity of the base at the polymorphic site.

【００２５】または、ＷＯ９２／１５７１２に開示された方法は、ＥＬＡ１のどの対立遺伝
子が存在するかを決定するために用いることができる。この方法はＷＯ９８／１
４６１６の方法に次の点で類似する。即ち、プライマーが調製され、標的配列に
アニーリングされ、そしてプライマーが伸長され、１個のジデオキシオリゴヌク
レオチド塩基により停止されるという点である。しかしながら、この方法では、
添加されたジデオキシヌクレオチド塩基はそれに結合した発蛍光団などの特異的
標識により検出される。Alternatively, the method disclosed in WO 92/15712 can be used to determine which alleles of ELA1 are present. This method is described in WO98 / 1
The method is similar to the method of 4616 in the following points. That is, the primer is prepared, annealed to the target sequence, and the primer is extended and terminated by one dideoxyoligonucleotide base. However, in this method,
The added dideoxynucleotide base is detected by a specific label attached to it, such as a fluorophore.

【００２６】異なる対立遺伝子を検出する別の方法は、それぞれの対立遺伝子が長さで一つ
だけ異なるという事実を利用する。こうして、ＰＣＲは二つのセットのＰＣＲプ
ライマー、一つは一方の対立遺伝子に特異的なセットそして他方は他の対立遺伝
子に特異的なセット、を用いて行われる。次いで、ＰＣＲ反応のそれぞれの生産
物を配列決定ゲル上で分離し放射性又は蛍光性ヌクレオチド検出のいずれかによ
り検出することができる。Another method of detecting different alleles takes advantage of the fact that each allele differs by one in length. Thus, PCR is performed with two sets of PCR primers, one set specific for one allele and the other specific for the other allele. The respective products of the PCR reaction can then be separated on a sequencing gel and detected by either radioactive or fluorescent nucleotide detection.

【００２７】対立遺伝子の検出は、（ｉ）被験者からのエラスターゼＩタンパク質試料を免
疫学的アッセイにおいて該対立遺伝子に特異的な抗体試薬と混合する工程、及び
（ii) このアッセイをモニターして抗体試薬とタンパク質試料の間の特異的結合
を測定し、それにより被験者が過増殖性皮膚状態又は癌の危険性があるか否かを
示す工程を含みうる。Detection of the allele comprises: (i) mixing a sample of elastase I protein from the subject with an antibody reagent specific for the allele in an immunological assay; and (ii) monitoring the assay to determine the antibody Measuring the specific binding between the reagent and the protein sample may include indicating whether the subject is at risk for a hyperproliferative skin condition or cancer.

【００２８】この抗体試薬は対立遺伝子に特異的な抗原決定基、好ましくは本発明の第二の
側面に記載のポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体であってもよ
い。このようなモノクローナル抗体は本発明の第五の側面を形成する。[0028] The antibody reagent may be a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigenic determinant specific to the allele, preferably a polypeptide according to the second aspect of the invention. Such a monoclonal antibody forms the fifth aspect of the present invention.

【００２９】モノクローナル抗体はハイブリドーマから製造することができる。ハイブリド
ーマは不死細胞系統を形成するため、骨髄腫細胞と所望の抗体を生産する脾臓細
胞を融合することにより形成できる。これは周知のコーラー及びミルステイン法
である（Nature 256 52-55 (1975))。[0029] Monoclonal antibodies can be produced from hybridomas. Hybridomas can be formed by fusing myeloma cells with spleen cells producing the desired antibody to form an immortal cell line. This is the well-known Kohler and Millstein method (Nature 256 52-55 (1975)).

【００３０】特定のタンパク質に結合するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を生
産する方法は当分野で十分に開発されている。これらは標準的免疫学の教科書、
例えば、ロアットら，Immunology second edition (1989), チャーチル・リビン
グストン, ロンドンで論じられている。[0030] Methods for producing monoclonal and polyclonal antibodies that bind to a particular protein are well developed in the art. These are standard immunology textbooks,
For example, discussed in Roat et al., Immunology second edition (1989), Churchill Livingston, London.

【００３１】完全抗体に加え、本発明は、本発明の第二の側面のポリペプチドに結合できる
その誘導体を含む。In addition to whole antibodies, the present invention includes derivatives thereof capable of binding to the polypeptide of the second aspect of the present invention.

【００３２】こうして、本発明は抗体断片及び合成構築物を含む。抗体断片及び合成構築物
の例は、ドウゴールら，Tibtech 12 372-379 (1994年 9月) に記載されている。Thus, the present invention includes antibody fragments and synthetic constructs. Examples of antibody fragments and synthetic constructs are described in Dougall et al., Tibtech 12 372-379 (September 1994).

【００３３】抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦｖ断片（ロアットら前
掲）が挙げられる。Ｆｖ断片は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子として知られる合成
構築物を生産するように修飾できる。これは分子の安定性に寄与するＶｈ領域と
Ｖｌ領域を共有結合で連結するぺプチドリンカーを含む。[0033] Antibody fragments include, for example, Fab, F (ab ') ₂ and Fv fragments (Roat et al., Supra). Fv fragments can be modified to produce synthetic constructs known as single-chain Fv (scFv) molecules. It contains a peptide linker that covalently links the Vh and Vl regions that contribute to the stability of the molecule.

【００３４】他の合成構築物はＣＤＲぺプチドを含む。これらは抗原結合決定基を含む合成
ぺプチドである。ぺプチド模倣物も使用しうる。これらの分子は通常ＣＤＲルー
プの構造を模倣し且つ抗原相互作用性の側鎖を有する高次構造的に制限された有
機環である。[0034] Other synthetic constructs include CDR peptides. These are synthetic peptides containing antigen binding determinants. Peptide mimetics may also be used. These molecules are usually conformationally restricted organic rings that mimic the structure of CDR loops and have antigen-interacting side chains.

【００３５】合成構築物はキメラ分子を含む。こうして、例えば、ヒト化（若しくは霊長類
化）抗体又はその誘導体は本発明の範囲内にある。ヒト化抗体の一例は、ヒトの
フレームワーク領域を持つがげっ歯類の超可変領域を持つ抗体である。合成構築
物には、分子に抗原結合性に加え幾つかの望ましい特性を付与する共有結合した
部分を含む分子も含まれる。例えば、該部分は標識（例えば、蛍光性若しくは放
射性の標識）又は薬学的に活性な物質であってもよい。[0035] Synthetic constructs include chimeric molecules. Thus, for example, humanized (or primatized) antibodies or derivatives thereof are within the scope of the invention. One example of a humanized antibody is an antibody that has a human framework region but has a rodent hypervariable region. Synthetic constructs also include molecules that contain covalently attached moieties that impart some desirable properties to the molecule in addition to antigen binding. For example, the moiety can be a label (eg, a fluorescent or radioactive label) or a pharmaceutically active substance.

【００３６】本発明の抗体若しくはその誘導体は極めて多様な用途を持つ。それらは本発明
の第二の側面のポリペプチドの生成及び／又は同定に使用できる。それらは本発
明のポリペプチドをスクリーニングするためのキットの形で提供できる。[0036] The antibodies or derivatives thereof of the present invention have very diverse uses. They can be used for the production and / or identification of the polypeptide according to the second aspect of the invention. They can be provided in the form of a kit for screening the polypeptide of the present invention.

【００３７】本発明の第六の側面によれば、ＥＬＡ１遺伝子のコドン２０８における少なく
とも一つの多形の有無を検出する工程を含むヒト被験者の遺伝子分析のための方
法が提供される。According to a sixth aspect of the present invention there is provided a method for genetic analysis of a human subject, comprising the step of detecting the presence or absence of at least one polymorphism at codon 208 of the ELA1 gene.

【００３８】さらなる側面では、本発明は過増殖性皮膚状態又は癌の治療に有用な薬物をス
クリーニングする方法であって、本発明の第二の側面のポリペプチドの活性を阻
害し又は強化する活性について試験化合物をスクリーニングする工程を含む方法
を提供する。また、このスクリーニング方法により検出される薬物、過増殖性皮
膚状態又は癌の治療のための医薬の製造におけるこのような薬物の使用、このよ
うな薬物及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物、このような薬物を含み
、任意選択的に該薬物の使用のための説明書をも含むキット、及び過増殖性皮膚
状態又は癌の治療法であって、患者に該薬物の一つ以上又は該薬物を含む医薬組
成物の薬学的に有効な量を投与する工程を含む方法も本発明の範囲内に含まれる
。In a further aspect, the invention is a method of screening for a drug useful for treating a hyperproliferative skin condition or cancer, wherein the activity inhibits or enhances the activity of the polypeptide of the second aspect of the invention. A method comprising screening a test compound for Also a drug detected by this screening method, the use of such a drug in the manufacture of a medicament for the treatment of a hyperproliferative skin condition or cancer, a pharmaceutical composition comprising such a drug and a pharmaceutically acceptable carrier A kit comprising such a drug, and optionally also instructions for use of the drug, and a method for treating a hyperproliferative skin condition or cancer, wherein the patient has one or more of the drugs. Alternatively, a method comprising the step of administering a pharmaceutically effective amount of a pharmaceutical composition containing the drug is also included in the scope of the present invention.

【００３９】本発明は添付する図面の図３の核酸配列を含む単離され又は組換えられたポリ
ヌクレオチドをも提供する。The present invention also provides an isolated or recombinant polynucleotide comprising the nucleic acid sequence of FIG. 3 of the accompanying drawings.

【００４０】本発明は添付する図面の図５の核酸配列を含む単離され又は組換えられたポリ
ヌクレオチドをも提供する。The present invention also provides an isolated or recombinant polynucleotide comprising the nucleic acid sequence of FIG. 5 of the accompanying drawings.

【００４１】本発明のポリヌクレオチドはベクター中に挿入し、さらなる研究用に大量のＤ
ＮＡ又はＲＮＡを提供するためクローニングできる。適切なベクターを宿主細胞
中に導入して、当業者に知られた技法を用いて本発明のポリペプチドを発現させ
ることができる。The polynucleotides of the present invention can be inserted into vectors and used for large amounts of D for further study.
It can be cloned to provide NA or RNA. Appropriate vectors can be introduced into host cells to express the polypeptides of the invention using techniques known to those skilled in the art.

【００４２】クローニング、タンパク質及びポリペプチドの発現、及びタンパク質の精製の
ための技法は、当業者に周知である。このような種々の技法は、例えば、サムブ
ルックら〔Molecular Cloning 第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス(1989)〕、オウルド及びプリムローズ〔Principles of Gene M
anipulation 第五版、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーショ
ンズ(1994)、及びストライアー〔Biochemistry第四版、W H フリーマン・アンド
・カンパニー(1995)〕に開示されている。適当な発現系を用いることにより、本
発明のポリペプチドはグリコシル化型又は非グリコシル化型で発現しうる。非グ
リコシル化型は大腸菌などの原核宿主中での発現により生産できる。Techniques for cloning, expressing proteins and polypeptides, and purifying proteins are well known to those skilled in the art. Such various techniques are described, for example, in Sambrook et al. (Molecular Cloning Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), Oold and Primrose (Principles of Gene M
Anipulation Fifth Edition, Blackwell Scientific Publications (1994), and Strier [Biochemistry Fourth Edition, WH Freeman and Company (1995)]. By using a suitable expression system, the polypeptides of the invention can be expressed in glycosylated or non-glycosylated form. Non-glycosylated forms can be produced by expression in prokaryotic hosts such as E. coli.

【００４３】Ｎ末端のメチオニンを含むポリペプチドはある発現系を用いて生産しうるが、
他の発現系では成熟ポリペプチドはこの残基を欠く。A polypeptide containing an N-terminal methionine can be produced using certain expression systems,
In other expression systems, the mature polypeptide lacks this residue.

【００４４】こうして、本発明は本発明の第一の側面のポリヌクレオチドを含むベクター及
び該ベクターを含む宿主をも提供する。本発明の第二の側面のポリペプチドは、
このポリペプチドを発現させる条件の下で該宿主をインキュベートする工程及び
次いで該ポリペプチドを精製する工程を含む方法により取得しうる。Thus, the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide of the first aspect of the present invention and a host comprising the vector. The polypeptide of the second aspect of the present invention comprises:
It can be obtained by a method comprising a step of incubating the host under conditions for expressing the polypeptide, and then a step of purifying the polypeptide.

【００４５】本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドが図に示す配列から変わり得るこ
とは当業者には理解されるはずである。It should be understood by those skilled in the art that the polynucleotides and polypeptides of the present invention may vary from the sequences shown in the figures.

【００４６】こうして、図５Ａに示すアミノ酸配列は、種々の理由で付与される付加的なＮ
末端アミノ酸配列及び／又は付加的なＣ末端アミノ酸配列を有しうる。このよう
な付加的な配列付与する技法は当分野で周知である。Thus, the amino acid sequence shown in FIG. 5A may have additional N
It may have a terminal amino acid sequence and / or an additional C-terminal amino acid sequence. Such additional alignment techniques are well-known in the art.

【００４７】付加的な配列は特定のポリペプチドの特性を変えるために付与される。これは
特定の発現系での発現の改善若しくは発現の調節に有用であり得る。例えば、付
加的な配列はプロテアーゼによる切断に対するある程度の保護を付与しうる。付
加的な配列は同定又は精製の助けとなるようにポリペプチドの特性を変える場合
にも有用である。例えば、アフィニティクロマトグラフィーにより単離できる部
分にポリペプチドが連結された融合タンパク質が提供される。この部分は抗原又
はエピトープであり、そしてこのアフィニティカラムは該抗原又はエピトープに
結合する（望ましくは高度の特異性でもって）固定化抗体又は固定化抗体断片を
含んでいてもよい。この融合タンパク質は適当な緩衝液の添加により該カラムか
ら通常溶出できる。[0047] Additional sequences are provided to alter the properties of a particular polypeptide. This may be useful for improving or regulating expression in certain expression systems. For example, additional sequences may provide some protection against cleavage by proteases. Additional sequences are also useful in altering the properties of the polypeptide to aid in identification or purification. For example, provided is a fusion protein in which a polypeptide is linked to a moiety that can be isolated by affinity chromatography. This portion is an antigen or epitope, and the affinity column may contain immobilized antibodies or immobilized antibody fragments that bind (preferably with high specificity) to the antigen or epitope. This fusion protein can usually be eluted from the column by adding an appropriate buffer.

【００４８】しかしながら、付加的Ｎ末端又はＣ末端配列は、本発明の物質を得るために使
用される特定の技法の結果として単に存在し、そしていかなる特定の有利な特性
をも付与する必要がなくてもよい。However, additional N-terminal or C-terminal sequences are merely present as a result of the particular technique used to obtain the materials of the present invention, and need not confer any particular advantageous properties. You may.

【００４９】さらに、変異体（しばしば「突然変異タンパク質」と呼ばれる）を生産するた
めにタンパク質のアミノ酸配列に種々の変更を加えることができることを当業者
は認めるであろう。本発明の変異体の一例は本発明の第二の側面のポリペプチド
、又は一つ以上のアミノ酸を一つ以上の他のアミノ酸で置換することに加えて、
図３又は図５のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。種々
のアミノ酸が類似の性質を持つことを当業者は知っている。ある物質のこのよう
なアミノ酸の一つ以上をこの物質の望ましい活性を失うことなく一つ以上の他の
このようなアミノ酸でしばしば置換できる。こうして、アミノ酸グリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンはしばしば相互に置換できる（脂肪
族側鎖を持つアミノ酸）。これらの考えられる置換の中で、グリシンとアラニン
は相互置換に使用することが好ましく（これらは短い側鎖を持つから）、バリン
、ロイシン及びイソロイシンは相互置換に使用しうる（これらは疎水性の大きな
脂肪族側鎖を持つから）。しばしば相互に置換できる他のアミノ酸としては、フ
ェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を持つアミノ酸）、
リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を持つアミノ酸）、アスパラギ
ン酸塩及びグルタミン酸塩（酸性側鎖を持つアミノ酸）、アスパラギン及びグル
タミン（アミド側鎖を持つアミノ酸）、及びシステイン及びメチオニン（硫黄含
有側鎖を持つアミノ酸）が挙げられる。この性質の置換はしばしば「同類」又は
「半同類」アミノ酸置換と呼ばれる。Further, those skilled in the art will recognize that various changes can be made in the amino acid sequence of a protein to produce variants (often referred to as “mutant proteins”). One example of a variant of the invention is a polypeptide of the second aspect of the invention, or in addition to replacing one or more amino acids with one or more other amino acids.
It is a polypeptide encoded by the polynucleotide of FIG. 3 or FIG. One skilled in the art knows that various amino acids have similar properties. One or more of such amino acids in a substance can often be replaced with one or more other such amino acids without losing the desired activity of the substance. Thus, the amino acids glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine can often be substituted for each other (amino acids with aliphatic side chains). Of these possible substitutions, glycine and alanine are preferably used for mutual substitution (since they have short side chains) and valine, leucine and isoleucine can be used for mutual substitution (these are hydrophobic Because they have large aliphatic side chains). Other amino acids that can often be substituted for each other include phenylalanine, tyrosine and tryptophan (amino acids with aromatic side chains),
Lysine, arginine and histidine (amino acids with basic side chains), aspartate and glutamate (amino acids with acidic side chains), asparagine and glutamine (amino acids with amide side chains), and cysteine and methionine (sulfur-containing side Amino acids having a chain). Substitutions of this nature are often referred to as "conservative" or "semi-conservative" amino acid substitutions.

【００５０】アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入もアミノ酸配列に関してなされうる。物質の特
性を変えるため（例えば、融合タンパク質に関して上に説明したように、同定、
精製又は発現を助けるため）アミノ酸挿入を使用できる。[0050] Amino acid deletions or insertions can also be made with respect to the amino acid sequence. To alter the properties of a substance (eg, as described above for fusion proteins, identification,
Amino acid insertions (to aid purification or expression) can be used.

【００５１】アミノ酸の変更は任意の適当な技法を用いて、例えば部位特異的突然変異誘発
を用いることにより行うことができる。アミノ酸置換又はアミノ酸挿入は天然型
又は非天然型のアミノ酸を用いて行うことができる。天然のアミノ酸が用いられ
ようと合成のアミノ酸が用いられようと、Ｌ−アミノ酸だけが存在することが好
ましい。Amino acid changes can be made using any suitable technique, for example by using site-directed mutagenesis. Amino acid substitution or amino acid insertion can be performed using natural or unnatural amino acids. It is preferred that only L-amino acids are present, whether natural or synthetic amino acids are used.

【００５２】アミノ酸配列の同一性の程度は、任意の二つの配列の間の類似性の最良セグメ
ントを発見するための「ベストフィット」（スミス及びウォータマン，Advances
in Applied Mathematics, 482-489 (1981))などのプログラムを用いて計算でき
る。整列は、シュワルツ及びデイホフ（1979) Atlas of Protein Sequence and
Structure, Dayhof, M.O., Ed pp 353-358により記載されたような、アミノ酸類
似性のマトリックスを用いて得られる配点の最大化に基づいてなされる。The degree of amino acid sequence identity can be measured by a “best fit” (Smith and Waterman, Advances) to find the best segment of similarity between any two sequences.
in Applied Mathematics, 482-489 (1981)). The alignment is based on Schwartz and Deihoff (1979) Atlas of Protein Sequence and
It is based on maximizing the scoring obtained using a matrix of amino acid similarities, as described by Structure, Dayhof, MO, Ed pp 353-358.

【００５３】本発明の単離され又は組換えられたポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重
のため、添付の図面に示すものに一致した配列を持つ必要がないことは、当業者
に理解されるであろう。It will be appreciated by those skilled in the art that the isolated or recombinant polynucleotide of the present invention need not have a sequence corresponding to that shown in the accompanying drawings due to the degeneracy of the genetic code. Will.

【００５４】本発明は上に論じたポリヌクレオチドに相補的な核酸分子をも含む。こうして
、例えば、二本鎖核酸分子の両方の鎖が本発明の範囲内に含まれる（それらが相
互に結合していようといまいと）。また、ｍＲＮＡ分子及び相補的なＤＮＡ分子
（例えば、ｃＤＮＡ分子）も含まれる。[0054] The present invention also includes nucleic acid molecules that are complementary to the polynucleotides discussed above. Thus, for example, both strands of a double-stranded nucleic acid molecule are included within the scope of the present invention (whether or not they are linked to each other). Also, mRNA molecules and complementary DNA molecules (eg, cDNA molecules) are included.

【００５５】上に論じた核酸分子のいずれかにハイブリダイズできる核酸分子も本発明によ
りカバーされる。このような核酸分子は「ハイブリダイズする」核酸分子と本明
細書では呼ばれる。ハイブリダイズする核酸分子は、それらが特異的にハイブリ
ダイズできるとき、例えばプローブ又はプライマーとして有用である。このよう
なハイブリダイズする分子は長さが少なくとも１０ヌクレオチドであることが望
ましく、長さが少なくとも２５又は少なくとも５０ヌクレオチドであることが好
ましい。[0055] Nucleic acid molecules capable of hybridizing to any of the nucleic acid molecules discussed above are also covered by the present invention. Such a nucleic acid molecule is referred to herein as a "hybridizing" nucleic acid molecule. Hybridizing nucleic acid molecules are useful when they can specifically hybridize, for example, as probes or primers. Desirably, such hybridizing molecules are at least 10 nucleotides in length, preferably at least 25 or at least 50 nucleotides in length.

【００５６】ハイブリダイズする分子は厳格なハイブリダイゼーション条件の下でこのよう
な分子にハイブリダイズすることが望ましい。厳格なハイブリダイゼーション条
件の一例は、試みられるハイブリダイゼーションが約０．９モル濃度の塩溶液を
用い約３５℃から約６５℃の温度で行われる。しかしながら、熟練者は、存在す
るプローブの長さ、塩基の組成、イオンの型などの変数を考慮に入れるためにこ
のような条件を適当に変えることができる。It is desirable that the hybridizing molecule hybridize to such a molecule under stringent hybridization conditions. One example of stringent hybridization conditions is where the hybridization attempted is performed at a temperature of about 35 ° C. to about 65 ° C. using an about 0.9 molar salt solution. However, the skilled artisan can alter such conditions appropriately to take into account variables such as the length of the probe present, the composition of the base, the type of ion, and the like.

【００５７】エラスターゼ阻害剤である、皮膚由来の抗ロイコプロテイナーゼ（ＳＫＡＬＰ
：シャークウイークら，Br J Dermatol 122: 631-641, 1990、シャークウイーク
ら，Biochim Biophys Acta 1096: 148-154,1991)、エラフィンとも呼ばれる（ウ
ィードウら，J Biol Chem 265: 14791-14795, 1990) が、これはスケーリング・
スキン障害（scaling skin disorders) を患う患者の皮膚から単離された( チャ
ング, A.ら, 1990) 。ＳＫＡＬＰは好中球のエラスティン分解酵素であるプロテ
イナーゼ３（ウィードウら，Biochem Biophys Res Commun 174: 6-10, 1991) 並
びにブタ膵臓エラスターゼ及びヒト白血球エラスターゼの強力なそして特異的な
阻害剤であることが示された（ウィードウら，J Biol Chem 265: 14791-14795,
1990) 。ＳＫＡＬＰ／エラフィンの結晶構造及び阻害機構は、ヒトエラスターゼ
Ｉのブタ相同体であるそのブタ膵臓エラスターゼとの複合体から決定された（ツ
ネミら，Biochem 35: 11570-11576, 1996)。これはＳＫＡＬＰがエラスターゼＩ
を阻害することを示唆する。An elastase inhibitor, a skin-derived anti-leukoproteinase (SKALP)
Shark Week et al., Br J Dermatol 122: 631-641, 1990; Shark Week et al., Biochim Biophys Acta 1096: 148-154, 1991). But this is scaling
It was isolated from the skin of patients suffering from scaling skin disorders (Chang, A. et al., 1990). SKALP is a potent and specific inhibitor of neutrophil elastin-degrading enzyme, proteinase 3 (Weedow et al., Biochem Biophys Res Commun 174: 6-10, 1991) and porcine pancreatic elastase and human leukocyte elastase. (Weedow et al., J Biol Chem 265: 14791-14795,
1990). The crystal structure and mechanism of inhibition of SKALP / elafin was determined from its complex with porcine pancreatic elastase, a porcine homolog of human elastase I (Tsunemi et al., Biochem 35: 11570-11576, 1996). This is because SKALP is elastase I
To inhibit.

【００５８】ＳＫＡＬＰは乾癬（チャング, A.ら，1990；シャークウイークら，Br J Derma
tol 122: 631-641, 1990、シャークウイークら，Biochim Biophys Acta 1096: 1
48-154,1991)及びウィードウら，J Invest Dermatol 101: 305-309, 1993、ノノ
ムラら, J Invest Dermatol 103: 88-91, 1994）及び創傷治癒（ベルグレンら,
Arch Dermatol Res 288: 458-562, 1996) などの過増殖状態にある表皮のケラチ
ノサイトにより発現される。それは、舌、義歯床、舌の扁桃、歯肉、咽頭、喉頭
蓋、声帯、食道、子宮頸、膣、毛包などの環境的刺激に曝される他の多くの成人
上皮に存在することが報告されてきた（フントら，J Clin Invest 98: 1389-139
9, 1996)。これらの組織の全てにおいて、炎症性細胞の存在が生理学的であり、
そしてＳＫＡＬＰの発現は白血球プロテアーゼに対して保護する働きがあり、そ
れにより上皮の完全性の維持を助けるものと考えられている。SKALP is used for psoriasis (Chang, A. et al., 1990; Shark Week et al., Br J Derma
tol 122: 631-641, 1990, Shark Week et al., Biochim Biophys Acta 1096: 1
48-154, 1991) and Weedow et al., J Invest Dermatol 101: 305-309, 1993; Nonomura et al., J Invest Dermatol 103: 88-91, 1994) and wound healing (Bergren et al., 1993).
Arch Dermatol Res 288: 458-562, 1996) and is expressed by keratinocytes in the hyperproliferative epidermis. It is reported to be present in many other adult epithelia exposed to environmental stimuli such as tongue, denture base, tongue of the tongue, gingiva, pharynx, epiglottis, vocal cords, esophagus, cervix, vagina, hair follicles, etc. (Hunt et al., J Clin Invest 98: 1389-139
9, 1996). In all of these tissues, the presence of inflammatory cells is physiological,
It is believed that the expression of SKALP acts to protect against leukocyte proteases, thereby helping to maintain epithelial integrity.

【００５９】本発明者らはヒトエラスターゼＩが主として表皮の余り分化していない基底細
胞層に限定されることを示した。これに反して、ＳＫＡＬＰは表皮組織のどのタ
イプでも基底層には決して見出されなかった。実際、ＳＫＡＬＰは正常なヒト表
皮には事実上存在しない。このことは、ＳＫＡＬＰが皮膚におけるエラスターゼ
Ｉの正常な生理学的役割を妨害しないことを示唆する。しかしながら、エラスタ
ーゼＩの先端切断変異体は何らかの方法でこの正常な生理学的役割を破壊し、こ
の変異体の保持者に過増殖性皮膚病又は癌を発症させる危険性を増大させる可能
性がある。The inventors have shown that human elastase I is mainly restricted to the less differentiated basal cell layer of the epidermis. In contrast, SKALP was never found in the basal layer of any type of epidermal tissue. In fact, SKALP is virtually absent from normal human epidermis. This suggests that SKALP does not interfere with the normal physiological role of elastase I in the skin. However, truncated mutants of elastase I may in some way disrupt this normal physiological role and increase the risk of developing a hyperproliferative skin disease or cancer in the holder of the mutant.

【００６０】本発明者らは培養したヒト皮膚ケラチノサイトから膵臓エラスターゼＩの全長
転写物をクローニングし配列決定した。本発明者らはまたＥＬＡ１遺伝子のコー
ド領域におけるヌクレオチド多形をも見出した。これはこのタンパク質の先端切
断及びエラスターゼ−ＳＫＡＬＰ複合体の潜在的不安定化をもたらすであろう。
この明細書で言及した先行技術の文献は関連する司法権により許される程度まで
に本明細書にインコーポレートされる。We cloned and sequenced the full-length transcript of pancreatic elastase I from cultured human skin keratinocytes. The present inventors have also found nucleotide polymorphisms in the coding region of the ELA1 gene. This will result in truncation of this protein and potential destabilization of the elastase-SKALP complex.
The prior art documents referred to in this specification are incorporated herein to the extent permitted by the relevant jurisdiction.

【００６１】本発明は下記の制限的でない実施例でさらに記述される。添付する下記の図面
を参照する。The present invention is further described in the following non-limiting examples. Reference is made to the accompanying drawings, in which:

【００６２】材料と方法免疫組織化学免疫染色は、Superfrost (登録商標) プラス（‘ＢＤＨ’ラボラトリー・サプ
ライズ，メルク）顕微鏡用スライドガラス上で凍結皮膚の４−５μｍ切片につい
て行った。新鮮な皮膚を液体窒素中で瞬時凍結し−７０℃で貯蔵した。この材料
を凍結切片化し、この切片を風乾し、標準的免疫組織化学的手法により染色した
。この切片を、製造者の説明書に従って DAKO En Vision ( 商標) ＋システムHR
P (DAB)(ダコ・コーポレーション、カーピンテリア、CA、USA)を用いて染色した
。組織切片を正常ブタ血清（ＰＢＳＡ中で１：５に希釈）でブロックした後、一
次抗体とインキュベートした。抗ブタ膵臓エラスターゼウサギモノクローナル抗
体（ケミコン・インターナショナル・インク、テメキュラ、CA、USA ）を０．１
％ＢＳＡを含むＰＢＳＡ中に１：５０００まで希釈した。対照の切片は、一次抗
体の代わりに、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＡ）、０．１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）と共にインキュベートした。DAKO製の抗ヒト白血球エラスターゼマウ
スモノクローナル抗体を１：５０及び１：１００希釈で用いた。 Materials and Methods Immunohistochemistry Immunostaining was performed on 4-5 μm sections of frozen skin on Superfrost® Plus ('BDH' Laboratory Surprise, Merck) microscope slides. Fresh skin was snap frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C. The material was cryosectioned, the sections air dried and stained by standard immunohistochemical techniques. This section is then prepared according to the manufacturer's instructions with the DAKO En Vision ™ + System HR
Staining was performed using P (DAB) (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA). Tissue sections were blocked with normal porcine serum (diluted 1: 5 in PBSA) and then incubated with the primary antibody. 0.1% anti-porcine pancreatic elastase rabbit monoclonal antibody (Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA)
Diluted 1: 5000 in PBSA with% BSA. Control sections were incubated with phosphate buffered saline (PBSA), 0.1% bovine serum albumin (BSA) instead of the primary antibody. Anti-human leukocyte elastase mouse monoclonal antibody from DAKO was used at 1:50 and 1: 100 dilutions.

【００６３】ＲＮＡ単離ナブサリアら，Keratinocyte methods (レイ, IM, ワット, FM編、ケンブリッ
ジ・ユニバーシティ・プレス), pp 5-12, 1994に記述されたように、ヒト皮膚一
次ケラチノサイトを、放射されたマウス３Ｔ３フィーダーで培養した。ケラチノ
サイトのコンフルエント培養及び瞬時凍結組織試料からの総ＲＮＡを、製造業者
の指示書に従って一工程手順でＲＮＡｚｏｌ（商標）Ｂ（テル−テスト・インク
、フレンズウッド、TX、USA)を用いて単離した。抽出された総ＲＮＡの量及び完
全性は、エチジウム−ブロミド染色アガロースゲル（示していない）での１８Ｓ
及び２８ＳｒＲＮＡの肉眼的検査によりチェックした。Primary human keratinocytes were irradiated as described in RNA isolation Nabsaria et al., Keratinocyte methods (Rey, IM, Watt, FM, Ed., Cambridge University Press), pp 5-12, 1994. The cells were cultured in a mouse 3T3 feeder. Total RNA from confluent cultures of keratinocytes and snap frozen tissue samples was isolated using RNAzol ™ B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA) in a one-step procedure according to the manufacturer's instructions. . The amount and integrity of total RNA extracted was determined by 18S on ethidium-bromide stained agarose gel (not shown).
And 28S rRNA were checked by visual inspection.

【００６４】ＲＴ−ＰＣＲ及びｃＤＮＡのクローニングＲＴ−ＰＣＲのために、GeneAmp(登録商標)RNA PCR Kit (パーキン−エルマー
）を用いた。総ＲＮＡ試料を６５℃で２分間加熱してｍＲＮＡのポリＡセグメン
トをマスクしうるであろう二次構造を破壊し、ＲＮＡの１μｇを、２．５μＭの
オリゴｄ（Ｔ）¹⁶、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのトリス
塩酸ｐＨ８．３、それぞれ１ｍＭのｄＮＴＰ、１Ｕ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤及
び２．５Ｕ／μｌのＭｕＬＶ逆転写酵素、最終容量２０μｌを含むマスター混合
液中にピペットで直接注入した。プライマーのアニーリングのために反応物を室
温で１０分間インキュベートし、ホットトップＰＣＲ装置中で逆転写を４２℃で
３０分間行い、次いで９９℃で５分間の変性を行い、そして５℃で５分間冷却工
程を行った。ＰＣＲ工程のために、遺伝子特異的プライマー及び１ユニットのタ
ックポリメラーゼを添加し、この反応物を２．２ｍＭのＭｇＣｌ₂及び０．２ｍ
ＭのｄＮＴＰに希釈し、最終容量１００μｌとした。増幅は９５℃で３０秒間の
変性、６１℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長の４０サイク
ルをパーキン−エルマーＤＮＡサーマル・サイクラー中で行った。 RT-PCR and cDNA Cloning For RT-PCR, the GeneAmp® RNA PCR Kit (Perkin-Elmer) was used. The total RNA sample was heated at 65 ° C. for 2 minutes to disrupt secondary structures that would mask the polyA segment of mRNA, and 1 μg of RNA was replaced with 2.5 μM oligo d (T) ¹⁶ , 50 mM KCl Pipette in a master mixture containing 5 mM MgCl ₂ , 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1 mM dNTP, 1 U / μl RNase inhibitor and 2.5 U / μl MuLV reverse transcriptase, 20 μl final volume. Was injected directly. Incubate the reaction for 10 minutes at room temperature for primer annealing, reverse transcription at 42 ° C. for 30 minutes in a hot-top PCR device, followed by denaturation at 99 ° C. for 5 minutes and cooling at 5 ° C. for 5 minutes The process was performed. For the PCR step, gene specific primers and one unit of tack polymerase were added and the reaction was reconstituted with 2.2 mM MgCl ₂ and 0.2 mM
Diluted in M dNTPs to a final volume of 100 μl. Amplification was performed in a Perkin-Elmer DNA thermal cycler for 40 cycles of denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, annealing at 61 ° C. for 1 minute, and extension at 72 ° C. for 2 minutes.

【００６５】完全長のヒト膵臓エラスターゼＩ転写物をカバーする二つの重なり合うＰＣＲ
断片を下記のプライマー対を用いて増幅した。即ち、前向きプライマー５’ＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＣＴ３’及び逆向きプライマー５’ＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＡＡＣＴＣ３’ は６３９ｂｐのＮ末端断片を生じ、そして前向きプライマー５’ＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡ３’と逆向きプライマー５’ＴＣＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＣ３’ は３７０ｂｐのＣ末端断片を生ずる。これらの二つの断片の１２５ｂｐの重なり
合う領域はユニークなＰｓｔＩ部位を含む。このＰＣＲ生産物を１．５％アガロ
ースゲル中で分離した。これらの断片を GeneClean (バイオ１０１・インク、ビ
スタ、CA、USA)を用いてゲル精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ、マジソ
ン、 WI 、USA)中にサブクローニングした。このクローンをＰＣＲ並びに追加の
内部プライマーを用いて両方向で配列決定した。異なる皮膚タイプの異なる一次
ケラチノサイト培養からのさらなる断片を精製し、直接配列決定をするために十
分な６３９ｂｐ鋳型を創るため４５ＰＣＲサイクルが要求されたものの、直接配
列決定した。Two Overlapping PCRs Covering Full-Length Human Pancreatic Elastase I Transcript
The fragments were amplified using the following primer pairs. That is, the forward primer 5'CAAGAAGGCAGTGGTCTACT3 'and the reverse primer 5'CTGACATCCAGAGCGAACTC3' yield a 639 bp N-terminal fragment, and the forward primer 5'CAATGGGCAGCTGGCCCAGA3 'and the reverse primer 5'TCGCCAAGTCCTCGCAGTCATCGCATCTCTGCATCCATCTGCATGCTCGTCGCATCTCTGCATCTCTGCATCTCTGCATGCTCTCA, respectively. The 125 bp overlapping region of these two fragments contains a unique PstI site. The PCR products were separated in a 1.5% agarose gel. These fragments were gel purified using GeneClean (Bio 101, Inc., Vista, CA, USA) and subcloned into the pGEM-T vector (Promega, Madison, WI, USA). This clone was sequenced in both directions using PCR as well as additional internal primers. Additional fragments from different primary keratinocyte cultures of different skin types were purified and sequenced directly, although 45 PCR cycles were required to create enough 639 bp template for direct sequencing.

【００６６】ヒトエラスターゼII又はエラスターゼIII の検出のためのＲＴ−ＰＣＲプライ
マーは、対応する酵素の既知のイソ型全てを認識するように設計した。既知のｍ
ＲＮＡ配列を整列させ、ｍＲＮＡの完全な同一領域に基づいてプライマーが選択
された。RT-PCR primers for the detection of human elastase II or elastase III were designed to recognize all known isoforms of the corresponding enzymes. Known m
The RNA sequences were aligned and primers were selected based on the exact same region of the mRNA.

【００６７】ゲンバンク（受託：Ｄ００２３６、Ｅ０１２２０、Ｍ１６６３１、Ｍ１６６５
２、Ｍ１６６５３）に寄託されたｍＲＮＡ配列に基づくエラスターゼII（ＥＬＳ
２）用のＲＴ−ＰＣＲプライマー配列は、４２１ｂｐ５’断片：前向きプライマー５’ＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＧＴＧＧＧ３’ 逆向きプライマー５’ＴＧＴＴＧＧＧＴＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧ３’ ５２０ｂｐ３’断片：前向きプライマー５’ＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＧＣＴＧＧＣＡＧ３’ 逆向きプライマー５’ＧＣＡＡＴＣＡＣＣＧＡＡＴＴＧＡＴＣＣＡＧＴＣＧ３’
そしてエラスターゼIII （ＥＬ３）（ゲンバンク受託：Ｍ１８６９２、Ｊ０３５
１６、Ｅ０１２５７）用：４３０ｂｐ５’断片：前向きプライマー５’ＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧ３’ 逆向きプライマー５’ＡＣＣＡＧＣＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧ３’ ６１５ｂｐ３’断片：前向きプライマー５’ＧＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧ３’ 逆向きプライマー５’ＴＣＧＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧ３’Genbank (Accession: D00236, E01220, M16631, M1665
2, Elastase II (ELS) based on the mRNA sequence deposited in M16653)
The RT-PCR primer sequence for 2) is a 421 bp 5 'fragment: forward primer 5' GCTGGAGCCCTCAGTGTGGG3 'reverse primer 5' TGTTGGTGTAGAATGGTGCCGG3 '520 bp 3' fragment: forward primer 5 '
And elastase III (EL3) (Genbank contract: M18692, J035
16, E01257): 430 bp 5 'fragment: forward primer 5' GCTCAGTTCCCTCCTCCTTGTGG3 'reverse primer 5' ACCAGCCGGAGGGGAGTGAGG3 '615 bp3' fragment: forward primer 5 'GCTCCCGGACCTACCAGGTGCTGCATCGATCGATCGATGCRTG

【００６８】ゲノムＤＮＡの配列決定ＤＮＡはヒト血液試料から Nucleon (登録商標) BACC3 DNA 抽出キット( ヌュ
ークレオン・バイオサイエンシーズ、ストラスクライド、UK) を用い製造業者の
指示に従って単離した。ＰＣＲ反応は６０〜６２℃のプライマーアニーリングで
ＡＢ熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液（「アドバンスド・バイオテクノ
ロジーズ」、エプソム、サレー、UK) を用いて通常のように行った。 Sequencing of genomic DNA DNA was isolated from human blood samples using the Nucleon® BACC3 DNA extraction kit (Nucleon Biosciences, Strathclyde, UK) according to the manufacturer's instructions. The PCR reaction was performed as usual using AB thermostable DNA polymerase and reaction buffer ("Advanced Biotechnologies", Epsom, Surrey, UK) with primer annealing at 60-62 ° C.

【００６９】ゲノムＤＮＡプライマー由来のヒトエラスターゼＩのＰＣＲ増幅用のプライマ
ーをゲンバンク（カワシマらによる寄託 1992 、受託: X62252-X62259)の配列に
基づいて設計した。公表ドメインで隣接配列の数ｂｐのみが利用可能であったエ
キソンについては、プライマーはイントロンを増幅するためそのエキソン中に置
かれた。Long range Advantage (登録商標) ゲノムポリメラーゼミックス（クロ
ーンテック、パロアルト、CA、USA)及び６８℃アニーリング温度を用いて長い断
片のＰＣＲを行った。イントロン６については、ゲノム歩行アプローチ（シーベ
ルトら，Nucleic Acids Res 23: 1087-1088, 1995)に記述された方法) が必要で
あった。アダプター連結ゲノムＤＮＡ断片ライブラリー及びアダプター特異的プ
ライマーはイアングレイ博士から恵与された。一次ＰＣＲ反応は隣接するエキ
ソンの中央における外側のアダプタープライマー及び外側の遺伝子特異的プライ
マーを用いて行った。その後、一次反応物を５０倍希釈し、対応する内側プライ
マーを用いて「ネスティッド」ＰＣＲ反応を行った。この「ネスティッド」ＰＣ
Ｒは明瞭な１本のバンドを生じ、これをカラムで精製し、そして直接配列決定し
た。Primers for PCR amplification of human elastase I from genomic DNA primers were designed based on the sequence of Genbank (deposited by Kawashima et al., 1992, accession: X62252-X62259). For exons where only a few bp of adjacent sequences were available in the published domain, primers were placed in the exon to amplify the intron. Long fragment PCR was performed using the Long range Advantage® Genomic Polymerase Mix (Clontech, Palo Alto, CA, USA) and a 68 ° C. annealing temperature. For Intron 6, a genome walking approach (the method described in Sievert et al., Nucleic Acids Res 23: 1087-1088, 1995) was required. Adapter-linked genomic DNA fragment libraries and adapter-specific primers were kindly provided by Dr. Ian Gray. Primary PCR reactions were performed using outer adapter primers and outer gene-specific primers in the middle of adjacent exons. The primary reaction was then diluted 50-fold and a "nested" PCR reaction was performed using the corresponding inner primer. This "nested" PC
R produced a distinct band which was purified on a column and sequenced directly.

【００７０】得られたイントロン配列に基づいて設計されたプライマー配列を用いて、突然
変異／多形についてヒトエラスターゼＩのコード領域及びスプライス部位をスク
リーニングした。ＥＬＡ１遺伝子の８エキソンを増幅するこのプライマー対は下
記のとおりである（これらのプライマーは本発明の側面を形成する）、エキソン１：前向きプライマー：５’ＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＣＣ３’ 逆向きプライマー：５’ＧＧＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣ３’ エキソン２：前向きプライマー：５’ＣＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣ３’
逆向きプライマー：５’ＡＣＣＡＣＣＴＡＡＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣ３’
エキソン３：前向きプライマー：５’ＣＡＧＣＴＣＮＴＡＧＧＣＴＣＡＡＣＴＧＡＴＣＣＴＣ
３’ 逆向きプライマー：５’ＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＣＣＴＣＴＴＴ
ＣＡＧ３’ エキソン４：前向きプライマー：５’ＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＣＴＡＡＡＧＴＧＧＧＣ
３’ 逆向きプライマー：５’ＣＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＡＴＧＡＧＣＣＡＧＣ３’ エキソン５：前向きプライマー：５’ＧＣＴＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＣＣＣＡＣＣ３’ 逆向きプライマー：５’ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＡＧＣＡＣ３’ エキソン６：前向きプライマー：５’ＣＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＡＧ３’
逆向きプライマー：５’ＡＡＧＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＴＣ３’
エキソン７：前向きプライマー：５’ＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧ
Ｃ３’ 逆向きプライマー：５’ＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＧＣＣＣ３’ エキソン８：ＰＣＲ前向きプライマー：５’ＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＡＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣ
ＴＧ３’ 逆向きプライマー：５’ＡＧＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧ３’ これで前向き配列決定：５’ＧＣＴＣＡＣＧＧＣＣＡＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣ３’The coding and splice sites of human elastase I were screened for mutations / polymorphisms using primer sequences designed based on the resulting intron sequences. This primer pair that amplifies the 8 exons of the ELA1 gene is as follows (these primers form an aspect of the present invention): 2: Forward primer: 5'CTCAGAGAACTCACAGCTGGGGCC3 '
Reverse primer: 5'ACCACCTAAGCCTGATCCCATCC3 '
Exon 3: Forward primer: 5'CAGCCTCNTAGGCTCACTGATCCCTC
3 'reverse primer: 5'GAGAGGGCAAAAATTATATCCCTCTTT
CAG3 'exon 4: forward primer: 5' CCATTCTCCTATCTCTAAAGTGGGGC
3 'reverse primer: 5'CTCCTGGACGAATGAGCCAGC3' exon 5: forward primer: 5 'GCTGCAATACCAATGTCCCACC3' reverse primer: 5 'CCTGGTCTCTGCCCATAAGCAC3' exon 6: forward primer: 5 'CCTGAGCTCAGCTTTCGAGA
Reverse primer: 5'AAGTGAGGGGCATCGAGCAAGATC3 '
Exon 7: forward primer: 5'TTTAGGATTCTGTTTTCCCTCCCCTG
C3 'Reverse primer: 5' AAGGAAGATGACGGCTTGCCC3 'Exon 8: PCR forward primer: 5' GCTTGAGAGTTAGGTTGAGGCTC
TG3 'Reverse primer: 5'AGGGACCCCTGCTCTGGAGGG3' Forward sequencing: 5'GCTCACGGCCATTTCAAGGTC3 '

【００７１】ＰＣＲ生産物をキアクイックＰＣＲ精製カラム（キアゲン）を用いて精製し、 ABI PRISM (商標) ローダミン又は BigDye ( 登録商標) ターミネーター・シー
ケンシング・レディ反応ミックス（パーキン・エルマー）を用いＡＢＩ３７７自
動シーケンサー上で両方の鎖の配列を決定した。The PCR product was purified using a Qiaquick PCR purification column (Qiagen), and ABI377 automated using an ABI PRISM ™ Rhodamine or BigDye® Terminator Sequencing Ready Reaction Mix (Perkin Elmer). Both strands were sequenced on a sequencer.

【００７２】実施例１膵臓のエラスターゼ様タンパク質は正常ヒト皮膚中に存在するそのヒト相同体と８９％のアミノ酸同一性を有する（それぞれの配列の整列は
図５Ａに示す）ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）に対する抗体を形成させた。こ
の抗体を用いてＥＬＡ１タンパク質の存在及び位置について正常なヒト皮膚の切
片をスクリーニングした。この抗体は胸、手のひら、足の裏及び包皮からの正常
なヒトの皮膚の基底層中にエラスターゼ様タンパク質の発現を検出した。 Example 1 Pancreatic elastase-like protein has 89% amino acid identity with its human homologue present in normal human skin (sequence alignment is shown in FIG. 5A). Porcine pancreatic elastase (PPE) Antibodies. Using this antibody, sections of normal human skin were screened for the presence and location of the ELA1 protein. This antibody detected the expression of elastase-like protein in the basal layer of normal human skin from the chest, palms, soles and foreskin.

【００７３】抗ブタ膵臓エラスターゼ抗体を用いて得られたヒトの足の裏の皮膚の免疫組織
化学的染色の結果を図１に示す。ここで、表皮の基底細胞層の明瞭な連続した染
色がｂ）で見られ得る。これは膵臓エラスターゼ様タンパク質がヒトの皮膚に存
在することを示唆するものである。FIG. 1 shows the results of immunohistochemical staining of the human sole skin obtained using an anti-porcine pancreatic elastase antibody. Here, a clear continuous staining of the basal cell layer of the epidermis can be seen in b). This suggests that pancreatic elastase-like protein is present on human skin.

【００７４】ヒト白血球エラスターゼに対して形成された抗体はこのタンパク質を認識しな
かった（示していない）。Antibodies formed against human leukocyte elastase did not recognize this protein (not shown).

【００７５】ヒトの皮膚における膵臓エラスターゼ様タンパク質の存在は、ヒトエラスター
ゼＩ遺伝子のプロモーターエンハンサー領域における変化（ローズら，Hum Mol
Genet 6: 897-903, 1997) が皮膚におけるその発現に悪影響を与えないか否かあ
るいは膵臓から皮膚へと発現を切り換えるのか否かという問題を提起する。そこ
で、ブタ及びマウスの皮膚の凍結切片を同じ抗ＰＰＥ抗体で染色した。この抗体
はこれらの皮膚切片の基底層を明らかに染色したが、毛包及び皮脂腺上皮をも染
色した。これらの観察は、膵臓で該酵素を発現することが知られている他の哺乳
類の皮膚に同様なタンパク質が存在することを示唆する。The presence of a pancreatic elastase-like protein in human skin is due to changes in the promoter enhancer region of the human elastase I gene (Rose et al., Hum Mol
Genet 6: 897-903, 1997) raises the question of whether it does not adversely affect its expression in skin or whether it switches expression from pancreas to skin. Thus, frozen sections of pig and mouse skin were stained with the same anti-PPE antibody. This antibody clearly stained the basal layer of these skin sections, but also stained hair follicles and sebaceous gland epithelium. These observations suggest that similar proteins are present in the skin of other mammals known to express the enzyme in the pancreas.

【００７６】実施例２正常なヒトのケラチノサイトはエラスターゼＩ（ＥＬＡ１）を発現する膵臓エラスターゼ類の間における高レベルのアミノ酸保存のため、抗ＰＰＥ抗
体と他の二つの既知膵臓エラスターゼとの交差反応が排除され得ないであろう。
膵臓エラスターゼＩはヒトの膵臓では存在しないことが証明されたが、ヒト膵臓
からの凍結切片 (cryosections) において腺房細胞の極めて弱い染色がより高濃
度の抗ＰＰＥ抗体で観察され得た。このことはこの抗体が他の膵臓エラスターゼ
をも検出できることを示唆する。 Example 2 Because normal human keratinocytes have a high level of amino acid conservation among pancreatic elastases that express elastase I (ELA1) , cross-reactivity of anti-PPE antibodies with two other known pancreatic elastases is not possible. Will not be excluded.
Although pancreatic elastase I was demonstrated to be absent in the human pancreas, very weak staining of acinar cells in cryosections from the human pancreas could be observed at higher concentrations of anti-PPE antibody. This suggests that this antibody can also detect other pancreatic elastases.

【００７７】従って、３種の既知のエラスターゼ遺伝子（ＥＬＡ１、ＥＬＳ２及びＥＬ３）
すべてに対するｍＲＮＡ特異的プライマーを作成し、ヒトの培養ケラチノサイト
及び新鮮な膵臓組織におけるｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ（材料と方法を参照
）により研究した。Thus, three known elastase genes (ELA1, ELS2 and EL3)
MRNA specific primers for all were generated and the expression of mRNA in human cultured keratinocytes and fresh pancreatic tissue was studied by RT-PCR (see Materials and Methods).

【００７８】二つのヌクレオチド多形がＥＬＡ１遺伝子のエキソン１配列で示唆された（カ
ワシマら，DNA Seq 2: 303-312, 1992、受託 X62258 、X62259) 。従って、両配
列変異体において同一である翻訳開始コドンの上流の領域における遺伝子特異的
プライマーを設計した。Two nucleotide polymorphisms were suggested in the exon 1 sequence of the ELA1 gene (Kawashima et al., DNA Seq 2: 303-312, 1992, accession X62258, X62259). Therefore, gene-specific primers in the region upstream of the translation initiation codon that were identical in both sequence variants were designed.

【００７９】その結果は図２に示す。ここで、Ｋはケラチノサイトから単離された断片を示
し、Ｐは膵臓から単離された断片を示す。該二つのＥＬＡ１特異的断片はケラチ
ノサイトの総ＲＮＡ調製品では見出すことができた（レーン１、２）が、膵臓の
総ＲＮＡ調製品では見出せなかった。FIG. 2 shows the results. Here, K indicates a fragment isolated from keratinocytes, and P indicates a fragment isolated from pancreas. The two ELA1-specific fragments could be found in keratinocyte total RNA preparations (lanes 1, 2), but not in pancreatic total RNA preparations.

【００８０】ＲＴ−ＰＣＲは、ヒト膵臓由来の総ＲＮＡ調製品から、予想された大きさの断
片４個を増幅した（エラスターゼIIの４２１ｂｐ断片及び５２０ｂｐ断片（レー
ン７、８）及びエラスターゼIII の４３０ｂｐ断片及び６１５ｂｐ断片（レーン
１１、１２））。しかしながら、これらの断片は培養したヒト一次ケラチノサイ
ト中では検出されなかった（レーン５、６、９及び１０）。RT-PCR amplified four fragments of the expected size from a total RNA preparation from human pancreas (elastase II 421 bp and 520 bp fragments (lanes 7, 8) and elastase III 430 bp). Fragment and 615 bp fragment (lanes 11, 12)). However, these fragments were not detected in cultured human primary keratinocytes (lanes 5, 6, 9, and 10).

【００８１】このことは、表皮中で抗ＰＰＥ抗体により検出されるタンパク質はヒトエラス
ターゼＩである可能性が高いことを示唆する。This suggests that the protein detected by the anti-PPE antibody in the epidermis is likely to be human elastase I.

【００８２】実施例３ｃＤＮＡ配列分析ヒトケラチノサイトの総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得た６４０ｂｐ断片及
び３７０ｂｐ断片（図２、レーン１、２）のそれぞれ及び該遺伝子コード配列の
全長をｐＧＥＭ−Ｔ中にサブクローニングした。これらの二つの断片の１２５ｂ
ｐの重なり合う領域はユニークなＰｓｔＩ部位を含む。配列決定は材料と方法で
記述したように行った。 Example 3 Analysis of cDNA Sequence Each of the 640 bp fragment and the 370 bp fragment (FIG. 2, lanes 1 and 2) obtained from the total RNA of human keratinocytes by RT-PCR and the full length of the gene coding sequence were expressed in pGEM-T. Subcloned. 125b of these two fragments
The overlapping region of p contains a unique PstI site. Sequencing was performed as described in Materials and Methods.

【００８３】ヒトエラスターゼＩの全長ｃＤＮＡ配列（ゲンバンク受託番号：ＡＦ１２０４
９３）及び配列決定により得られたコード領域のアミノ酸翻訳を図３に示す。The full length cDNA sequence of human elastase I (Genbank accession number: AF1204
93) and the amino acid translation of the coding region obtained by sequencing are shown in FIG.

【００８４】図３において、下線を引いたヌクレオチドは該配列とカワシマら，DNA Seq 2:
303-312, 1992により提案された配列の間の相違を示す。こうして、このｃＤＮ
Ａ配列は提案された配列と比べ二つのヌクレオチド置換（エキソン３におけるｔ
→ｃ及びエキソン７におけるｇ→ａ）を含む。これらの置換はコードされたアミ
ノ酸の交換を招く。即ち、Ｔｒｐ−４４はＡｒｇ残基により置換され、Ａｒｇ−
２４３はＧｌｎ残基により置換される。同じヌクレオチド相違が本発明者らのゲ
ノムＤＮＡ試料の全てにおいても見出された（以下を参照）。しかしながら、こ
れらの変化はカフカス集団とモンゴル集団の間の対立遺伝子多形を反映するもの
かも知れない。In FIG. 3, the underlined nucleotides correspond to the sequence and Kawashima et al., DNA Seq 2:
The differences between the sequences proposed by 303-312, 1992 are shown. Thus, this cDN
The A sequence has two nucleotide substitutions (t in exon 3) compared to the proposed sequence.
→ c and g → a) in exon 7. These substitutions result in a replacement of the encoded amino acid. That is, Trp-44 is replaced by an Arg residue and Arg-
243 is replaced by a Gln residue. The same nucleotide differences were found in all of our genomic DNA samples (see below). However, these changes may reflect allelic variants between the Caucasian and Mongolian populations.

【００８５】触媒的三組のアミノ酸（Ｈｉｓ−６３、Ａｓｐ−１１１及びＳｅｒ−２０６）
は二重下線を付して太字で印刷してある。一重線を付した太字の文字は基質結合
ポケットの口の所に存在するＶａｌ−２２７残基とＴｈｒ−２３９残基を強調し
ており、これらはエラスターゼＩの基質特異性に寄与している。太字イタリック
体で印刷されたアミノ酸はエラフィン（ＳＫＡＬＰ）と酵素複合体の一次接触に
関与する。Catalytic triad of amino acids (His-63, Asp-111 and Ser-206)
Is printed in bold with double underlining. Single-lined bold letters highlight Val-227 and Thr-239 residues at the mouth of the substrate binding pocket, which contribute to the substrate specificity of elastase I. Amino acids printed in bold italics are involved in the primary contact of elafin (SKALP) with the enzyme complex.

【００８６】この遺伝子（受託Ｘ６２２５８）のエキソン１の長さが４０ｂｐだけ異なる二
つの代替的スプライス変異体が提案され（カワシマら，DNA Seq 2: 303-312, 19
92) 、短い型のみがここに同定され得た。これは第一のスプライス部位がケラチ
ノサイトにおけるｍＲＮＡスプライスに優先的に用いられることを意味する。翻
訳産物のシグナルぺプチド（僅か８アミノ酸）は、従って、分泌酵素にとって短
か過ぎる。分泌されるようには見えないが、エラスターゼＩは上の層へのそれら
の移動に際し基底膜からの細胞の脱着に関与しうるであろう。Two alternative splice variants have been proposed in which the length of exon 1 of this gene (Accession X62258) differs by 40 bp (Kawashima et al., DNA Seq 2: 303-312, 19).
92), only the short form could be identified here. This means that the first splice site is used preferentially for mRNA splice in keratinocytes. The translation product signal peptide (only 8 amino acids) is therefore too short for secreted enzymes. Although not appearing to be secreted, elastase I could be involved in detachment of cells from the basement membrane upon their migration to the upper layers.

【００８７】正常なヒトの身体の異なる部位（胸、腹、手のひら）の皮膚から培養された一
次ケラチノサイトの総ＲＮＡ調製品は異なる人種起源の個体からのものと同様に
この二つのヒトエラスターゼＩＲＴ−ＰＣＲ断片について陽性であった。ＲＴ−
ＰＣＲ産物は正常な皮膚の総ＲＮＡ試料からも得られうるであろう。A total RNA preparation of primary keratinocytes cultured from the skin of different parts of the normal human body (chest, abdomen, palms) is used to prepare the two human elastase IRTs as well as from individuals of different ethnic origins. -Positive for PCR fragment. RT-
PCR products could also be obtained from normal skin total RNA samples.

【００８８】実施例４多形は該酵素の活性部位の直ぐ下流に存在するゲノムＤＮＡにおけるＥＬＡ１遺伝子（スプライス部位を含む）のコード領域
を幾人かの個体についてスクリーニングした。 Example 4 The polymorphism was screened for some individuals for the coding region of the ELA1 gene (including the splice site) in the genomic DNA located immediately downstream of the active site of the enzyme .

【００８９】この配列決定から、エキソン７における１個のヌクレオチド多形が明らかにさ
れた。この変異型についての野性型（上部）、ヘテロ接合型（中央）及びホモ接
合型（下部）の個体の配列決定による追跡を図４で比較する。This sequencing revealed a single nucleotide polymorphism in exon 7. The tracking of the wild type (top), heterozygous (center) and homozygous (bottom) individuals for this mutant by sequencing is compared in FIG.

【００９０】余分のＣの挿入は、矢印で示すように、逆鎖（３’→５’）に対する余分のＧ
として現れる。この挿入は５個のグアニジンヌクレオチドの伸びとそれに続く５
個のシトシンヌクレオチドから成る潜在的突然変異「ホットスポット」中にある
。The insertion of the extra C, as indicated by the arrow, caused the extra G to the opposite strand (3 ′ → 5 ′)
Appear as. This insertion is an extension of 5 guanidine nucleotides followed by 5
In a potential mutation "hot spot" consisting of one cytosine nucleotide.

【００９１】図３を参照すると、この「ホットスポット」が該酵素の活性部位ポケットをコ
ードする配列の直ぐ下流にあること、及び該変異体におけるこの挿入が早めの停
止コドンを作らせ仮定的２５８アミノ酸タンパク質を２６アミノ酸だけ短くする
フレームシフトを生じさせることを見ることができる。この変異体のヌクレオチ
ド配列は図５に示す。Referring to FIG. 3, that this “hot spot” is immediately downstream of the sequence encoding the active site pocket of the enzyme, and that this insertion in the mutant creates an early stop codon and putative 258 It can be seen that a frame shift occurs that shortens the amino acid protein by 26 amino acids. The nucleotide sequence of this variant is shown in FIG.

【００９２】ヒトエラスターゼ遺伝子（ＥＬＡ１ヒト）及びその先端切断変異体（ＥＬＡ
１ｖａｒ）のアミノ酸配列は図６Ａに比較してある。触媒的三組のアミノ酸（
Ｈｉｓ−６３、Ａｓｐ−１１１及びＳｅｒ−２０６）は二重下線を付した太字で
示す。二重下線を付し太字イタリックで印刷したアミノ酸は酵素／阻害剤複合体
とＳＫＡＬＰとの一次接触に関与する。一重下線を付した太字の文字は基質結合
ポケットの口の所に存在し、エラスターゼＩの基質特異性に寄与するＶａｌ−２
２７残基とＴｈｒ−２３９残基を強調する。The human elastase gene (ELA1 Human) and its truncated mutant (ELA)
1 The amino acid sequence of var) is compared to FIG. 6A. Catalytic triad of amino acids (
His-63, Asp-111 and Ser-206) are shown in bold and double underlined. Amino acids double-underlined and printed in bold italics are involved in the primary contact of the enzyme / inhibitor complex with SKALP. Single underlined bold letters are located at the mouth of the substrate binding pocket and contribute to Val-2, which contributes to the substrate specificity of elastase I.
Residue 27 and Thr-239 are highlighted.

【００９３】この変異体と関係のない７０人の正常な個体のスクリーニングから、比較的高
頻度の対立遺伝子（約２５％）が明らかにされた。この突然変異についてホモ接
合体である個体は正常であるか明白な皮膚病をもっていないようにみえる。不幸
にも、僅かな表皮の変化を研究するため、この多形（７％）についてのホモ接合
性である個体から皮膚生検を入手することはできなかった。Screening of 70 normal individuals unrelated to this variant revealed a relatively high frequency of alleles (about 25%). Individuals who are homozygous for this mutation do not appear to have normal or overt dermatoses. Unfortunately, no skin biopsies were available from individuals homozygous for this polymorphism (7%) to study subtle epidermal changes.

【００９４】実施例５ＥＬＡ１の二次構造に対する多形の評価見かけ上正常な個体の中に該タンパク質の先端切断変異体が予想外に高い頻度
で存在するので、翻訳されたタンパク質の折り畳みに及ぼすフレームシフトのあ
りうる効果を評価した。 Example 5 Evaluation of Polymorphism for the Secondary Structure of ELA1 The unexpectedly high frequency of truncated variants of the protein in apparently normal individuals has an effect on the folding of the translated protein. The possible effects of frame shifting were evaluated.

【００９５】ＥＬＡ１タンパク質の活性部位は触媒的三組のアミノ酸（Ｈｉｓ−６３、Ａｓ
ｐ−１１１及びＳｅｒ−２０６）を含む。これらの残基は、該タンパク質の二次
構造を安定化するシステイン残基の最後のものを除き全てのものと同様に該フレ
ームシフトの上流にコードされており、影響を受けないでいる（図６Ａの整列を
参照）。The active site of the ELA1 protein contains a catalytic triad of amino acids (His-63, As
p-111 and Ser-206). These residues, like all but the last of the cysteine residues that stabilize the secondary structure of the protein, are encoded upstream of the frameshift and are unaffected (Fig. 6A).

【００９６】二つの仮定的遺伝子産物の二次構造を解析し、ＳＯＰＭタンパク質解析プログ
ラム（ゲウールジョンら，Prot Engineering 7: 157-164, 1994)を用いて比較し
た。その結果を図６Ｂに示す。ここで、矢印はＳｅｒ−２０６を含む活性部位ポ
ケットを示す。二次構造のレベルについては、この多形は末端ヘリックスの前に
ある短いシート−コイル−ターン−コイル−ターン−コイル−シートのループを
切断する形で現れる。このループは、エラフィン／エラスターゼ複合体形成の一
次接触に関与する８個のアミノ酸 (図３を参照）（ツネミら，Biochem 35: 1157
0-11576, 1996)のうちの５個を保持し、並びに基質結合ポケットの口の位置に存
在し、エラスターゼＩの基質特異性に寄与する、鍵となるアミノ酸残基Ｖａｌ−
２２７及びＴｈｒ−２３９（図３で強調）を保持する。これらの観察は、配列変
異体が阻害剤結合能力を失うことなく該酵素の基質特異性を改変することを示唆
する。The secondary structures of the two hypothetical gene products were analyzed and compared using a SOPM protein analysis program (Geourjon et al., Prot Engineering 7: 157-164, 1994). The result is shown in FIG. 6B. Here, the arrow indicates the active site pocket containing Ser-206. At the secondary structure level, this polymorphism manifests itself in breaking a short sheet-coil-turn-coil-turn-coil-sheet loop in front of the terminal helix. This loop contains eight amino acids (see FIG. 3) involved in the primary contact of elafin / elastase complex formation (Tsunemi et al., Biochem 35: 1157).
0-11576, 1996) as well as a key amino acid residue, Val-, which is located at the mouth of the substrate binding pocket and contributes to the substrate specificity of elastase I.
227 and Thr-239 (highlighted in FIG. 3). These observations suggest that the sequence variants alter the substrate specificity of the enzyme without losing inhibitor binding capacity.

[Brief description of the drawings]

【図１】図１は、膵臓のエラスターゼ様タンパク質についての正常なヒトの足裏皮膚の
免疫染色の結果を示す、凍結切片の写真である。ここで、ａ）は染色されていな
い対照の切片（二次ＡＢのみ）を示し、ｂ）は抗ＰＰＥウサギモノクローナル抗
体で染色した切片を示す。FIG. 1 is a photograph of a frozen section showing the results of immunostaining of normal human sole skin for pancreatic elastase-like protein. Here, a) shows an unstained control section (secondary AB only), and b) shows a section stained with an anti-PPE rabbit monoclonal antibody.

【図２】図２は、ケラチノサイト（Ｋ）及び膵臓（Ｐ）からの総ＲＮＡ調製品由来の既
知のヒト膵臓エラスターゼＩ、エラスターゼII 及びエラスターゼIII のＲＴ−
ＰＣＲの結果を示すアガロースゲルの写真である。FIG. 2. RT- of known human pancreatic elastase I, elastase II and elastase III from total RNA preparations from keratinocytes (K) and pancreas (P).
It is a photograph of the agarose gel which shows the result of PCR.

【図３】図３は、一次ケラチノサイトから得られたヒトエラスターゼＩｃＤＮＡの配列
及びそのコード領域のアミノ酸翻訳を示す。FIG. 3 shows the sequence of human elastase I cDNA obtained from primary keratinocytes and the amino acid translation of its coding region.

【図４】図４は、ＥＬＡ１のエキソン７に見出された多形遺伝子座の配列決定追跡の比
較である。上段は変異体についての野性型の個体を示し、中段は変異体について
のヘテロ接合型の個体を示し、そして下段は変異体についてのホモ接合型の個体
を示す。FIG. 4 is a comparison of sequencing traces of the polymorphic locus found in exon 7 of ELA1. The upper row shows wild-type individuals for the mutant, the middle row shows heterozygous individuals for the mutant, and the lower row shows homozygous individuals for the mutant.

【図５】図５は、一次ケラチノサイトから得られた変異体ヒトエラスターゼＩｃＤＮＡ
の配列を示す。FIG. 5 shows a mutant human elastase I cDNA obtained from primary keratinocytes.
The following shows the sequence.

【図６Ａ】図６Ａは、ブタ膵臓エラスターゼ（ＥＬ１ブタ）、ヒトエラスターゼＩ（Ｅ
ＬＡ１ヒト）及びヒトエラスターゼＩ先端切断変異体（ＥＬＡ１ｖａｒ）の
アミノ酸配列の比較を示す。FIG. 6A shows porcine pancreatic elastase (EL1). Pig), human elastase I (E
LA1 Human and human elastase I truncation mutant (ELA1 4 shows a comparison of amino acid sequences of var).

【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＯＰＭソフトウエアを用いるＥＬＡ１ヒト（上段）及びＥＬＡ
１ｖａｒ（下段）についてのタンパク質二次構造の予測を示す。FIG. 6B shows ELA1 using SOPM software. Human (top) and ELA
1 4 shows prediction of protein secondary structure for var (bottom).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ４Ｈ０４５ 9/50 ＺＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 33/574 ＡＧ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ゲルスト−タラス，ウルビイギリス国、イー１４エヌエスロンドン、マイルエンドロード、クイーンメアリーアンドウェストフィールドカレッジ (72)発明者ダンロップ，ジョンイギリス国、イー１４エヌエスロンドン、マイルエンドロード、クイーンメアリーアンドウェストフィールドカレッジ (72)発明者ケルセル，デイビッド，ピーターイギリス国、イー１４エヌエスロンドン、マイルエンドロード、クイーンメアリーアンドウェストフィールドカレッジＦターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA14 BA41 CA04 CA09 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 HA19 4B050 CC04 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA13 QQ02 QQ42 QR32 QR56 QR62 QS25 QS34 4B064 AG27 DA13 DA14 4B065 AA01X AA57X AA72X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA25 CA33 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA76 DA89 EA20 EA28 EA51 FA72 FA73 FA74 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/10 C12Q 1/68 A 4H045 9/50 Z C12Q 1/68 G01N 33/573 A 33/574 A G01N 33/573 C12P 21/08 33/574 C12N 15/00 ZNAA // C12P 21/08 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR , GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD) , TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ) , TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE , ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT , TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Gerst-Talas, Urbi United Kingdom, E14 NS, Mile End Road, Queen Mary and Westfield College (72) Inventor Dunlop John Britain, E14 NS London, Mile End Road, Queen Mary and Westfield College (72) Inventor Kersel, David, Peter United Kingdom, E14 NS London, Mile End Road, Queen Mary and Westfield College F-term (reference) 4B024 AA01 AA12 BA14 BA41 CA04 CA09 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 HA19 4B050 CC04 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA13 QQ02 QQ42 QR32 QR56 QR62 QS25 QS34 4B064 AG27 DA13 CA14 AAXA01A14A01X CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA76 DA89 EA20 EA28 EA51 FA72 FA73 FA74

Claims

[Claims]

1. An isolated nucleic acid sequence encoding a mutant of human elastase I, comprising a nucleic acid sequence comprising the sequence of FIG. 3 having any one of codons 207 to 225 and a frameshift mutation. Or recombinant polynucleotide.

2. The polynucleotide of claim 1, wherein said frameshift mutation is a single base insertion at codon 208.

3. The polynucleotide according to claim 1, wherein the one inserted base is a cytosine nucleotide.

4. A mutant of human elastase I, FIG. 6A (ELA
1 var) or an isolated polypeptide comprising a mutant having substantial sequence identity to that sequence.

5. A method for determining a predisposition of a subject to a hyperproliferative skin condition or cancer, comprising detecting the presence of an allele of ELA1 in the subject, wherein the allele comprises a mutant of human elastase I. 3. A method which encodes and has a frameshift mutation in any one of codons 207 to 225 of the nucleic acid sequence of FIG.

6. The method of claim 5, wherein said frameshift mutation is a single base insertion at codon 208.

7. The method according to claim 6, wherein said one inserted base is a cytosine nucleotide.

8. The genome DN wherein the allele is derived from chromosome 12q13 of the subject.
The method according to claim 5, 6 or 7, wherein the method is detected by sequencing the A segment.

9. The method according to claim 9, wherein the allele is: (i) mixing a nucleic acid sample from the subject with one or more polynucleotide probes capable of selectively hybridizing to the ELA1 allele during the reaction; ii) monitoring the reaction to determine if a gene allele acid is present in the sample, thereby indicating whether the subject is at risk for a hyperproliferative skin condition or cancer Process,
The method according to claim 5, 6 or 7, wherein the method is detected by:

10. The method for detecting alleles comprises: (i) mixing a human elastase I protein sample from a subject with an antibody reagent specific for the allele in an immunological assay; and (ii) 6. The method according to claim 5, comprising monitoring the assay to determine specific binding between the protein samples, thereby indicating whether the subject is at risk for a hyperproliferative skin condition or cancer. A method according to claim 6 or claim 7.

11. The method of claim 10, wherein said antibody reagent is a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigenic determinant specific for an allele.

12. The method according to claim 11, wherein the antibody reagent is a monoclonal antibody that specifically reacts with the polypeptide according to claim 4.

13. A monoclonal antibody which specifically reacts with the polypeptide according to claim 4.

14. A vector comprising the polynucleotide according to claim 1, 2, or 3.

15. A host comprising the vector according to claim 14.

16. A method for obtaining the polypeptide according to claim 4, wherein the step of incubating the host according to claim 15 under conditions for expressing the polypeptide and the step of purifying the polypeptide are then performed. Including methods.