JP2002541782A - Fungal β-tubulin gene - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 抗癌性薬物タキソールは、動物細胞中において集合した微小管(MT)中のβ-チューブリンに結合し、細胞周期の停止を引き起こすが、これに対し、タキソールの効果は真菌においては異なるものである。例えば、子嚢菌であるタキソール産生Pestalotiopsis microspora Ne 32は、タキソール耐性(IC50>11.7 M)であり、2種の卵菌種、Pythium ultimumおよびPhytophthora cinnamomiはタキソール感受性である(IC50 0.1μM)。P. microspora、P. ultimumおよびP. cinnamomi由来のβ-チューブリンをコードするcDNAが単離された。P. microspora、P. ultimumおよびP. cinnamomi由来のβ-チューブリンの推定のアミノ酸配列は、(1)タキソールおよびタキソール様物質を検出するための結合アッセイ;(2) 腫瘍サンプルに対するタキソールの薬理学的効果についての診断アッセイ;(3) 特定の残基のタキソール結合に対する効果についての情報を利用することによるタキソール様活性を有する薬物の設計;および(4) タキソール結合に必要な残基を置換することにより構築したP. ultimumのタキソール感受性アイソジェニック株およびタキソール耐性アイソジェニック株を使用することによるタキソールおよびタキソール様活性の検出、に使用することができる。 (57) [Summary] Taxol, an anticancer drug, binds to β-tubulin in microtubules (MT) assembled in animal cells and causes cell cycle arrest, whereas the effect of taxol is It is different in fungi. For example, the ascomycete taxol-producing Pestalotiopsis microspora Ne 32 is taxol resistant (IC 50 > 11.7 M), and two oomycete species, Pythium ultimum and Phytophthora cinnamomi, are taxol sensitive (IC 50 0.1 μM). CDNAs encoding β-tubulin from P. microspora, P. ultimum and P. cinnamomi have been isolated. The deduced amino acid sequences of β-tubulin from P. microspora, P. ultimum and P. cinnamomi are: (1) a binding assay to detect taxol and taxol-like substances; (2) pharmacology of taxol on tumor samples (3) Designing drugs with taxol-like activity by utilizing information about the effect of particular residues on taxol binding; and (4) substituting the residues required for taxol binding It can be used to detect taxol and taxol-like activity by using the taxol-sensitive and taxol-resistant isogenic strains of P. ultimum thus constructed.
Description
【0001】発明の属する技術分野 本発明は、生体に影響を及ぼす組成物ならびに、生物学的診断試薬および生物
学的実験試薬に関する。[0001] TECHNICAL FIELD THE INVENTION The present invention relates, biological affect the composition and to the biological diagnostic reagents and biological experiments reagent.
【0002】発明の背景 TAXOL(登録商標)(Bristol-Myers-Squibb)は、一般名パクリタキセルとして知
られており(以後、本明細書中で「タキソール」と呼ぶ)、乳癌および子宮癌に
対して抗腫瘍活性を示す複雑なジテルペノイドである(Rowinsky, E.K.およびDon
ehower, R.C. 1991 「癌化学療法における臨床薬理学および抗微小管薬剤の使用
」(The clinical pharamacology and use of antimicrotubule agents in cance
r chemotherapeutics) Pharmacol Ther 52:35-84)。その抗腫瘍活性は、集合微
小管(MT)中のβ-チューブリンに結合しこれを安定化する能力による。(Manfredi
, J.J.およびHorwitz, S.B. 1984 「タキソール:新しい作用機構を有する抗有
糸分裂薬剤」(Taxol: an antimitotic agent with a new mechanism of action)
Pharmacol Ther 25:83-125 ; ならびにHorwitz, S.B. 1992 「タキソールの作
用機構」(Mechanism of action of taxol) Trends Pharmacol Sci 13:134-136)
。In vivoでは、タキソールは有糸分裂の間の紡錘体機能に影響し、細胞周期をG
2/M期に停止させる。In vitroでは、タキソールはMT集合を促進し、また、さも
なければ解重合を引き起こす条件下でそれらの分解を阻止する(Schiffら、1979
「タキソールによるin vitroにおける微小管集合の促進」(Promotion of microt
ubule assembly in vitro by taxol) Nature 277:665-667 ; ならびにPamess, J
.およびHorwitz, S.B. 1981 「タキソールはin vitroで重合したチューブリンと
結合する」(Taxol binds to polymerized tubulin in vitro) J Cell Biol 91:4
79-487)。β-チューブリンにおけるタキソールの結合部位は、フォトクロスラベ
リング、電子結晶学および突然変異誘発によって特性評価されており、β-チュ
ーブリンのいくつかの領域を含む(Raoら、1994 「3’-(p-アジドベンズアミド)
タキソールはβ-チューブリンのN末端の31アミノ酸をフォトラベルする」(3’-(
p-Azidobenzamido) taxol photolabels the N-terminal 31 amino acids of β-
tubulin) J Biol Chem 269:3132-3134 ; Raoら、1995 「微小管におけるタキソ
ール結合部位の特性評価」(Characterization of the taxol binding site on t
he microtubule) J Biol Chem 270:20235-20238 ; Nogalesら、1998 「電子結晶
学によるαβ-チューブリン二量体の構造」(Structure of the αβ tubulin di
mer by electron crystallography) Nature 391:199-203 ; Nogalesら、1999 「
微小管の高解像度モデル」(High-resolution model of the microtubule) Cell
95:79-88 ; およびGiannakakouら、1997 「パクリタキセル耐性ヒト子宮癌細胞
は突然変異β-チューブリンを有し、パクリタキセルが駆動する重合に欠陥を示
す」(Paclitaxel-resistant human ovarian cancer cells have mutant β-tubu
lins that exhibit impaired paclitaxel-driven polymerization) J Biol Chem
272:17118-17125)。[0002] Background of the Invention TAXOL (registered trademark) (Bristol-Myers-Squibb) is known as the generic name paclitaxel (hereinafter, referred to as "taxol" herein), with respect to breast cancer and uterine cancer Are complex diterpenoids that exhibit antitumor activity (Rowinsky, EK and Don
ehower, RC 1991, The clinical pharamacology and use of antimicrotubule agents in cancer
r chemotherapeutics) Pharmacol Ther 52: 35-84). Its antitumor activity depends on its ability to bind and stabilize β-tubulin in assembled microtubules (MT). (Manfredi
, JJ and Horwitz, SB 1984 "Taxol: an antimitotic agent with a new mechanism of action"
Pharmacol Ther 25: 83-125; and Horwitz, SB 1992 `` Mechanism of action of taxol '' Trends Pharmacol Sci 13: 134-136)
. In vivo, taxol affects spindle function during mitosis and regulates the cell cycle by G
Stop at 2 / M phase. In vitro, taxols promote MT assembly and prevent their degradation under conditions that would otherwise cause depolymerization (Schiff et al., 1979).
“Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol” (Promotion of microt
ubule assembly in vitro by taxol) Nature 277: 665-667; and Palmes, J
And Horwitz, SB 1981 "Taxol binds to polymerized tubulin in vitro" J Cell Biol 91: 4
79-487). The binding site of taxol on β-tubulin has been characterized by photocross-labeling, electron crystallography and mutagenesis and includes several regions of β-tubulin (Rao et al., 1994 `` 3 '-( (p-azidobenzamide)
Taxol photolabels the N-terminal 31 amino acids of β-tubulin '' (3 '-(
p-Azidobenzamido) taxol photolabels the N-terminal 31 amino acids of β-
tubulin) J Biol Chem 269: 3132-3134; Rao et al., 1995 `` Characterization of the taxol binding site on t ''
he microtubule) J Biol Chem 270: 20235-20238; Nogales et al., 1998 "Structure of the αβ-tubulin dimer by electron crystallography."
mer by electron crystallography) Nature 391: 199-203; Nogales et al., 1999.
High-resolution model of the microtubule Cell
And Giannakakou et al., 1997, `` Paclitaxel-resistant human ovarian cancer cells have mutant β, with paclitaxel-resistant human uterine cancer cells having mutant β-tubulin and exhibiting defects in paclitaxel-driven polymerization. '' -tubu
lins that exhibit impaired paclitaxel-driven polymerization) J Biol Chem
272: 17118-17125).
【0003】 タキソールは元々 Waniらによってセイヨウイチイ(Taxus brevifolia)の内皮
で発見され(Waniら、1971 「植物性抗腫瘍薬剤VI タキサス・ブレビフォリア(Ta
xus brevifolia)由来の新規抗白血病および抗腫瘍薬剤であるタキソールの単離
および構造」(Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of
taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia) J
Am Chem Soc 93:2325-2327)、乾燥師部重量の約0.02%を構成することが示され
ている。イチイの木の限られた資源が、さらなるタキソールの供給源探索を有益
なものにした。[0003] Taxol was originally discovered by Wani et al. In the endothelium of Taxus brevifolia (Wani et al., 1971 "Vegetable antitumor agent VI Taxus brevifolia (Ta
xus brevifolia), a new anti-leukemia and anti-tumor drug, Taxol. (Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of
taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia) J
Am Chem Soc 93: 2325-2327), which has been shown to constitute about 0.02% of the dry phloem weight. The limited resources of the yew tree have made the search for additional sources of taxol useful.
【0004】 1993年、Stierleらが、T. brevifoliaに関連する内部寄生植物であるタキソー
ル産生真菌Taxomyces andreanaeの単離を報告した(Stierleら、1993 「セイヨウ
イチイの内部寄生真菌Taxomyces andreanaeによるタキソールおよびタキサンの
産生」(Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic
fungus of pacific yew) Science 260:214-216)。T. andreanaeは、非常に低い
レベルではあるが(液体培地中24〜50ng/L)、真正のタキソールを産生する。最近
、種々のペスタロチオプシス・マイクロスポラ(Pestalotiopsis microspora)の
種々の株を含む、さらなるタキソール産生真菌が単離されている(Liら、1996 「
ラクウショウ(Taxodium distichum)由来の内部寄生タキソール産生真菌」(Endo
phytic taxol-producing fungi from bald cypress, Taxodium distichum) Micr
obiolog 142:223-226 ; Liら、1998 「Torreya grandifolia由来の内部寄生真菌
ペリコニア種(Periconia sp.)におけるタキソール産生誘導」(The induction of
taxol production in the endophytic fungus-Periconia sp. from Torreya gr
andifolia) J Ind Microbiol Biotechnol 20:259-264 ; Strobelら、1996 「真
菌性内部寄生植物由来タキソールおよび生物多様性問題」(Taxol from fungal e
ndophytes and the issue of biodiversity) J Ind Microbiol 17:417-423 ; な
らびにStrobelら、1996 「Taxus wallachianaの内部寄生真菌Pestalotiopsis mi
crospora由来タキソール」(Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endoph
ytic fungus of Taxus wallachiana) Microbiolog 142:435-440)。1つのP.micro
spora株、Ne52がヒマラヤイチイT.wallachianaの内皮から単離され、液体培地1
リットルあたり約50μgのタキソールを産生している(Strobelら、1996. Microbi
olog 142:435-440; およびLiら、1998. 「Pestalotiopsis microsporaの液体培
養中におけるタキソール産生の刺激」(Stimulation of taxol production in li
quid culture of Pestalotiopsis microspora) Mycol Res 102:461-464)。真菌
源から産生されるタキソールは、イチイから単離されたタキソールと顕微鏡およ
びクロマトグラフィーによって同一であることが報告されており、癌細胞系に対
して同様な薬理学的効果を示した(Strobelら、1996. Microbiolog 142:435-440
)。真菌供与源からのタキソール産生は、タキソールのより広い供給源、生産コ
ストの低減、および増加するタキソールの需要に合致する手段を提供する。[0004] In 1993, Stierle et al. Reported the isolation of a taxol-producing fungus, Taxomyces andreanae, an endoparasitic plant associated with T. brevifolia (Stierle et al., 1993, Taxols and taxanes by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of the yew tree). Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic
fungus of pacific yew) Science 260: 214-216). T. andreanae produces authentic taxol, albeit at very low levels (24-50 ng / L in liquid medium). Recently, additional taxol-producing fungi have been isolated, including various strains of various Pestalotiopsis microspora (Li et al., 1996 ``
Endoparasite Taxol-Producing Fungus from Taxodium distichum ”(Endo
phytic taxol-producing fungi from bald cypress, Taxodium distichum) Micr
obiolog 142: 223-226; Li et al., 1998 `` Induction of taxol production in Periconia sp., an endophytic fungus from Torreya grandifolia '' (The induction of
taxol production in the endophytic fungus-Periconia sp. from Torreya gr
andifolia) J Ind Microbiol Biotechnol 20: 259-264; Strobel et al., 1996 `` Taxol from fungal endophytes and biodiversity issues '' (Taxol from fungal e
(Indophytes and the issue of biodiversity) J Ind Microbiol 17: 417-423; and Strobel et al., 1996 `` Pestalotiopsis mi, an endoparasitic fungus of Taxus wallachiana.
Taxol from crospora '' (Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endoph
ytic fungus of Taxus wallachiana) Microbiolog 142: 435-440). One P.micro
spora strain, Ne52, was isolated from the endothelium of Himalaya yew T. wallachiana and
Produces about 50 μg taxol per liter (Strobel et al., 1996.
olog 142: 435-440; and Li et al., 1998. "Stimulation of taxol production in li"
quid culture of Pestalotiopsis microspora) Mycol Res 102: 461-464). Taxol produced from a fungal source has been reported to be identical by microscopy and chromatography to taxol isolated from yew and showed similar pharmacological effects on cancer cell lines (Strobel et al.). , 1996.Microbiolog 142: 435-440
). Taxol production from fungal sources provides a broader source of taxol, reduced production costs, and a means to meet the increasing demand for taxol.
【0005】 タキソールは、広範囲の生物(これらには、哺乳動物、ウニ、ショウジョウバ
エ(Drosophilia)、アフリカツメガエル(Xenopus)、フィザラム(Physarum)、ハエ
マンサス(Haemanthus)、およびトリパノソーマ(Trypanosoma)を含む)の細胞に対
して毒性を示し(Baumら、1981. 「タキソール(微小管安定化薬剤)がトリパノソ
ーマ・クルーズ(Trypanosoma cruzi)の複製を抑止する」(Taxol, a microtubule
stabilizing agent, blocks the replication of Trypanosoma cruzi) Proc Na
tl Acad Sci USA 78:4571-4575 ; Kelloggら、1989. 「Drosophila初期胚の中心
体、紡錘体、および動原体内のタンパク質」(Proteins in the centrosome, spi
ndle, and kinetochore of the early Drosophila embryo) J Cell Biol 109:29
77-2991 ; ならびに、Manfredi, J.J.およびHorwitz, S.B. 1984. Pharmacol Th
er 25:83-125)、一方、真菌においては、タキソールへの多様な感受性が報告さ
れている。Youngらは、様々な真菌群からの代表的な種に対するタキソール毒性
を試験した(Youngら、1992. 「タキソールおよび各種類似体の抗真菌特性」(Ant
ifungal properties of taxol and various analogues) Experientia 48:882-88
5)。Youngらの研究において、植物病原菌であるPhythium ultimumおよびPhytoph
thora capsiciを含む5種類の卵菌種をタキソール感受性(IC50 0.4〜5.9μM)とし
て同定した。P. capsiciにおいては、タキソールが低濃度で核分裂を阻害し、こ
のことは、タキソールが哺乳動物細胞に対するものと同様な機構で作用すること
を示唆する。対照的に、4種類の子嚢菌種がタキソール耐性(IC50>50μM)として
同定された。この耐性は、真菌の微小管がタキソールと相互作用する能力が低減
していることによることが報告されている。また、タキソールは、精製したS. c
erevisiaeのチューブリンを集合させたMTを安定化できないこと(Bamesら、1992.
「in vitroおよびin vivoにおいて微小管と会合する酵母タンパク質」(Yeast p
roteins associated with microtubules in vitro and in vivo) Mol Biol Cell
3:29-47)、ならびにAspergillus nidulansのMTをほんのわずかに安定化するこ
と(Yoon, Y.およびOakley, B.R. 1995. 「Aspergillus nidulans由来の集合可能
チューブリンの精製および特性評価」(Purification and characterization of
assembly-competent tubulin from Aspergillus nidulans) Biochem 34:6373-63
81)が示されている。[0005] Taxol is a cell of a wide range of organisms, including mammals, sea urchins, Drosophilia, Xenopus, Physarum, Haemanthus, and Trypanosoma. (Bum et al., 1981. "Taxol, a microtubule-stabilizing drug, inhibits replication of Trypanosoma cruzi.") (Taxol, a microtubule
stabilizing agent, blocks the replication of Trypanosoma cruzi) Proc Na
tl Acad Sci USA 78: 4571-4575; Kellogg et al., 1989. "Proteins in the centrosome, spi."
ndle, and kinetochore of the early Drosophila embryo) J Cell Biol 109: 29
77-2991; and Manfredi, JJ and Horwitz, SB 1984. Pharmacol Th
er 25: 83-125) On the other hand, in fungi, various sensitivities to taxol have been reported. Young et al. Tested taxol toxicity against representative species from various fungal groups (Young et al., 1992. “Anti-fungal properties of taxol and various analogs” (Ant
ifungal properties of taxol and various analogues) Experientia 48: 882-88
Five). In a study by Young et al., The plant pathogens Phythium ultimum and Phytoph
Five oomycete species, including thora capsici, were identified as taxol sensitive (IC 50 0.4-5.9 μM). In P. capsici, taxol inhibits nuclear division at low concentrations, suggesting that taxol acts by a mechanism similar to that on mammalian cells. In contrast, four ascomycetes species were identified as taxol resistant (IC 50 > 50 μM). This resistance has been reported to be due to a reduced ability of fungal microtubules to interact with taxol. Taxol is also purified S. c.
Inability to stabilize erevisiae tubulin assembled MT (Bames et al., 1992.
"Yeast protein associated with microtubules in vitro and in vivo" (Yeast p
roteins associated with microtubules in vitro and in vivo) Mol Biol Cell
3: 29-47), and only slightly stabilizing the MT of Aspergillus nidulans (Yoon, Y. and Oakley, BR 1995. Purification and characterization of assemblable tubulin from Aspergillus nidulans). of
assembly-competent tubulin from Aspergillus nidulans) Biochem 34: 6373-63
81) is shown.
【0006】 タキソールの抗癌特性およびタキソール感受性に対する真菌の多様性のため、
タキソール感受性またはタキソール耐性のいずれかであるアイソジェニックな真
菌株を発生させるのに有用な新規なβ-チューブリン遺伝子の単離および/また
は同定に対する継続的な必要性がある。そして、これらのβ-チューブリン遺伝
子および/またはアイソジェニックな真菌株は、抗癌剤のスクリーニングおよび
腫瘍感受性アッセイ用診断テストの開発のために適用することができる。[0006] Due to the fungal diversity for taxol's anti-cancer properties and taxol susceptibility,
There is a continuing need for the isolation and / or identification of novel β-tubulin genes that are useful for generating isogenic fungal strains that are either taxol sensitive or taxol resistant. These β-tubulin genes and / or isogenic fungal strains can then be applied for the screening of anticancer drugs and for the development of diagnostic tests for tumor susceptibility assays.
【0007】発明の概要 1態様において、本発明は、真菌種Pestalotiopsis microsporaのβ-チューブ
リンをコードする精製DNAセグメントまたはその一部分である。好ましくは、該D
NAセグメントは少なくとも1つのタキソール結合部位をコードする。いくつかの
用途のために、該DNAセグメントは、タキソール結合部位Iおよびタキソール結合
部位IIを有するタンパク質をコードすることが好ましい。β-チューブリンとし
て機能するタンパク質をコードするDNAセグメントに関しては、該DNAセグメント
は、タキソール結合部位Iおよびタキソール結合部位IIを有し、α-チューブリン
と相互作用することができるタンパク質をコードする。典型的なDNAセグメント
は、配列番号1の少なくとも一部分を含む。別の典型的なDNAセグメントは、配列
番号1の一部分を含み、該一部分は配列番号1のヌクレオチド75からヌクレオチド
167までのヌクレオチド配列を置換または非置換で含む。別の典型的なDNAセグメ
ントは、配列番号1の一部分を含み、該一部分は配列番号1のヌクレオチド708か
らヌクレオチド764までのヌクレオチド配列を置換または非置換で含む。別の典
型的なDNAセグメントは、配列番号1の一部分を含み、該一部分は配列番号1のヌ
クレオチド708からヌクレオチド764までのヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチ
ド729、ヌクレオチド730、もしくはヌクレオチド731、またはそれらの組合せが
置換されている。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号1のヌクレオチド75か
らヌクレオチド1412までのヌクレオチド配列を含み、β-チューブリンをコード
する。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号1のヌクレオチド75からヌクレオ
チド1412までのヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列中の少なくとも1
個のヌクレオチドが置換されており、β-チューブリンのタキソール結合能は変
化していない。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号1のヌクレオチド75から
ヌクレオチド1412までのヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列中の少なく
とも1個のヌクレオチドが置換されており、β-チューブリンのタキソール結合
能は変化している。[0007] In summary one embodiment of the invention, the present invention is a purified DNA segment, or portion thereof encoding a β- tubulin fungal species Pestalotiopsis microspora. Preferably, the D
The NA segment encodes at least one taxol binding site. For some applications, the DNA segment preferably encodes a protein having taxol binding site I and taxol binding site II. With respect to a DNA segment that encodes a protein that functions as β-tubulin, the DNA segment has a taxol binding site I and a taxol binding site II and encodes a protein that can interact with α-tubulin. A typical DNA segment comprises at least a portion of SEQ ID NO: 1. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 1, wherein the portion is nucleotides 75 to nucleotides of SEQ ID NO: 1.
It contains up to 167 nucleotide sequences, substituted or unsubstituted. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 1, wherein the portion comprises the nucleotide sequence from nucleotide 708 to nucleotide 764 of SEQ ID NO: 1 with or without substitution. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 1, wherein the portion comprises the nucleotide sequence from nucleotide 708 to nucleotide 764 of SEQ ID NO: 1, nucleotide 729, nucleotide 730, or nucleotide 731, or a combination thereof. Has been replaced. Another exemplary DNA segment comprises the nucleotide sequence from nucleotide 75 to nucleotide 1412 of SEQ ID NO: 1 and encodes β-tubulin. Another exemplary DNA segment comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from nucleotide 75 to nucleotide 1412, wherein at least one of the nucleotide sequences
Have been substituted and the ability of β-tubulin to bind taxol has not changed. Another exemplary DNA segment comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from nucleotide 75 to nucleotide 1412, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been substituted and the ability of β-tubulin to bind taxol has been altered. are doing.
【0008】 別の態様において、本発明は、真菌種Pestalotiopsis microsporaのβ-チュー
ブリンの少なくとも一部分を含むアミノ酸配列である。好ましくは、該アミノ酸
配列は少なくとも1つのタキソール結合部位を含む。いくつかの用途のために、
該アミノ酸配列は、タキソール結合部位Iおよびタキソール結合部位IIを有する
タンパク質であることが好ましい。β-チューブリンとして機能することができ
るアミノ酸配列に関しては、該アミノ酸配列は、タキソール結合部位Iおよびタ
キソール結合部位IIを有し、α-チューブリンと相互作用することができる。典
型的なアミノ酸配列は、配列番号2に記載のβ-チューブリンの少なくとも一部分
を含む。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号2の一部分を含み、該一部分は
アミノ酸1〜31を置換または非置換で含む。別の典型的なアミノ酸配列は、配列
番号2の一部分を含み、該一部分はアミノ酸212〜230を置換または非置換で含む
。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号2の一部分を含み、該一部分はアミノ
酸212〜230を含み、アミノ酸219にアミノ酸置換を有する。別の典型的なアミノ
酸配列は、配列番号2の一部分を含み、該一部分は本質的にアミノ酸1〜446から
なり、該一部分がタキソール耐性β-チューブリンとして作用する。別の典型的
なアミノ酸配列は、配列番号2の一部分を含んでなり、該一部分は本質的にアミ
ノ酸1〜446からなり、該一部分のタキソール結合特性を変化させる少なくとも1
個のアミノ酸置換を有する。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号2の一部分
を含み、該一部分は本質的にアミノ酸1〜446からなり、該一部分のタキソール結
合特性を変化させない少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。別の典型的なアミ
ノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸219の周囲の該アミノ酸配列の3次元構造を乱
す任意のアミノ酸で置換されている。In another aspect, the invention is an amino acid sequence comprising at least a portion of β-tubulin of the fungal species Pestalotiopsis microspora. Preferably, the amino acid sequence comprises at least one taxol binding site. For some uses,
The amino acid sequence is preferably a protein having a taxol binding site I and a taxol binding site II. For amino acid sequences that can function as β-tubulin, the amino acid sequence has a taxol binding site I and a taxol binding site II and is capable of interacting with α-tubulin. A typical amino acid sequence comprises at least a portion of β-tubulin as set forth in SEQ ID NO: 2. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 2, which portion includes amino acids 1-31 with or without substitution. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 2, which includes amino acids 212-230, with or without substitution. Another exemplary amino acid sequence includes a portion of SEQ ID NO: 2, which includes amino acids 212-230 and has an amino acid substitution at amino acid 219. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 2, which portion consists essentially of amino acids 1-446, which portion acts as taxol-resistant β-tubulin. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 2, wherein the portion consists essentially of amino acids 1-446, and wherein at least one alters the taxol binding properties of the portion.
Has amino acid substitutions. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 2, wherein the portion consists essentially of amino acids 1-446 and includes at least one amino acid substitution that does not alter the taxol binding properties of the portion. Another exemplary amino acid sequence has been substituted around amino acid 219 of SEQ ID NO: 2 with any amino acid that disrupts the three-dimensional structure of the amino acid sequence.
【0009】 別の態様において、本発明は、真菌種Phythium ultimumのβ-チューブリンを
コードする精製DNAセグメントまたはその一部分である。好ましくは、該DNAセグ
メントは少なくとも1個のタキソール結合部位をコードする。いくつかの用途の
ために、該DNAセグメントは、タキソール結合部位Iおよびタキソール結合部位II
を有するタンパク質をコードしていることが好ましい。β-チューブリンとして
機能するタンパク質をコードするDNAセグメントに関しては、該DNAセグメントは
、タキソール結合部位Iおよびタキソール結合部位IIを有し、αチューブリンと
相互作用することができるタンパク質をコードする。典型的なDNAセグメントは
、配列番号3の少なくとも一部分を含む。別の典型的なDNAセグメントは配列番号
3の一部分を含み、該一部分はヌクレオチド92からヌクレオチド184までを置換
または非置換で含む。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号3の一部分を含み
、該一部分はヌクレオチド725からヌクレオチド781までのヌクレオチド配列を置
換または非置換で含む。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号3の一部分を含
み、該一部分はヌクレオチド725からヌクレオチド781までのヌクレオチド配列を
含み、ヌクレオチド746、ヌクレオチド747、もしくはヌクレオチド748、または
それらの組合せが置換されている。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号3の
ヌクレオチド92からヌクレオチド1429までのヌクレオチド配列を含み、β-チュ
ーブリンをコードする。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号3のヌクレオチ
ド92からヌクレオチド1429までのヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列中
の少なくとも1個のヌクレオチドが置換されており、β-チューブリンのタキソ
ール結合能は変化していない。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号3のヌク
レオチド92からヌクレオチド1429までのヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド
配列中の少なくとも1個のヌクレオチドが置換されており、β-チューブリンの
タキソール結合能は変化している。In another aspect, the invention is a purified DNA segment encoding β-tubulin of the fungal species Phythium ultimum, or a portion thereof. Preferably, the DNA segment encodes at least one taxol binding site. For some applications, the DNA segment comprises taxol binding site I and taxol binding site II.
It preferably encodes a protein having With respect to a DNA segment that encodes a protein that functions as β-tubulin, the DNA segment has a taxol binding site I and a taxol binding site II and encodes a protein that can interact with α-tubulin. A typical DNA segment comprises at least a portion of SEQ ID NO: 3. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 3, which comprises nucleotides 92 to 184, with or without substitution. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 3, which comprises, with or without substitution, the nucleotide sequence from nucleotide 725 to nucleotide 781. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 3, wherein the portion comprises the nucleotide sequence from nucleotide 725 to nucleotide 781, wherein nucleotide 746, nucleotide 747, or nucleotide 748, or a combination thereof, has been replaced. I have. Another exemplary DNA segment comprises the nucleotide sequence from nucleotide 92 to nucleotide 1429 of SEQ ID NO: 3 and encodes β-tubulin. Another exemplary DNA segment comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from nucleotide 92 to nucleotide 1429, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been replaced, and the ability of β-tubulin to bind taxol has been altered. I haven't. Another exemplary DNA segment comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from nucleotide 92 to nucleotide 1429, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been replaced, and the ability of β-tubulin to bind taxol has been altered. are doing.
【0010】 別の態様において、本発明は、真菌種Phythium ultimumのβ-チューブリンの
少なくとも一部分を含むアミノ酸配列である。好ましくは、該アミノ酸配列は少
なくとも1つのタキソール結合部位を含む。いくつかの用途のために、該アミノ
酸配列は、タキソール結合部位Iおよびタキソール結合部位IIを有するタンパク
質であることが好ましい。β-チューブリンとして機能することができるアミノ
酸配列に関しては、該アミノ酸配列は、タキソール結合部位Iおよびタキソール
結合部位IIを有し、α-チューブリンと相互作用することができる。典型的なア
ミノ酸配列は、配列番号4に記載のβ-チューブリンの少なくとも一部分を含む
。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号4の一部分を含み、該一部分はアミノ
酸1〜31を置換または非置換で含む。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号4の
一部分を含み、該一部分はアミノ酸212〜230を置換または非置換で含む。別の典
型的なアミノ酸配列は、配列番号4の一部分を含み、該一部分はアミノ酸212〜23
0を含み、アミノ酸219にアミノ酸置換を有する。別の典型的なアミノ酸配列は、
配列番号4の一部分を含み、該一部分は本質的にアミノ酸1〜446からなり、タキ
ソール感受性β-チューブリンとして作用する。別の典型的なアミノ酸配列は、
配列番号4の一部分を含み、該一部分は本質的にアミノ酸1〜446からなり、該一
部分のタキソール結合特性を変化させる少なくとも1個のアミノ酸置換を有する
。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号4の一部分を含み、該一部分は本質的
にアミノ酸1〜446からなり、該一部分のタキソール結合特性を変化させない少な
くとも1個のアミノ酸置換を含む。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号4のア
ミノ酸219の周囲の該アミノ酸配列の3次元構造を乱す任意のアミノ酸で置換さ
れている。In another aspect, the invention is an amino acid sequence comprising at least a portion of β-tubulin of the fungal species Phythium ultimum. Preferably, the amino acid sequence comprises at least one taxol binding site. For some applications, the amino acid sequence is preferably a protein having taxol binding site I and taxol binding site II. For amino acid sequences that can function as β-tubulin, the amino acid sequence has a taxol binding site I and a taxol binding site II and is capable of interacting with α-tubulin. A typical amino acid sequence comprises at least a portion of β-tubulin as set forth in SEQ ID NO: 4. Another exemplary amino acid sequence includes a portion of SEQ ID NO: 4, wherein the portion includes amino acids 1-31 with or without substitution. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 4, which portion includes amino acids 212-230, with or without substitution. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 4, wherein the portion comprises amino acids 212-23.
Including 0 and having an amino acid substitution at amino acid 219. Another typical amino acid sequence is
It comprises a portion of SEQ ID NO: 4, which portion consists essentially of amino acids 1-446 and acts as a taxol-sensitive β-tubulin. Another typical amino acid sequence is
4 comprising a portion of SEQ ID NO: 4, wherein the portion consists essentially of amino acids 1-446 and has at least one amino acid substitution that alters the taxol binding properties of the portion. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 4, wherein the portion consists essentially of amino acids 1-446 and includes at least one amino acid substitution that does not alter the taxol binding properties of the portion. Another exemplary amino acid sequence has been substituted around amino acid 219 of SEQ ID NO: 4 with any amino acid that disrupts the three-dimensional structure of the amino acid sequence.
【0011】 別の態様において、本発明は、真菌種Phytophthora cinnamomiのβ-チューブ
リンをコードする精製DNAセグメントまたはその一部分であり、該セグメントは
本質的に配列番号5の少なくとも一部分からなる。典型的なDNAセグメントは、配
列番号5の一部分を含み、該一部分はヌクレオチド11からヌクレオチド103までの
ヌクレオチド配列を含む。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号5の一部分を
含み、該一部分はヌクレオチド11からヌクレオチド103までのヌクレオチド配列
を含み、該ヌクレオチド配列において少なくとも1個のヌクレオチドが置換され
ているが、ただし、ヌクレオチドの置換が1個のアミノ酸コードのみを変化させ
る場合、ヌクレオチド81がチミンであり、ヌクレオチド82がアデニン、シトシン
、またははチミンである時にヌクレオチド80がアデニンであり得ないことを条件
とする。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号5の一部分を含み、該一部分は
ヌクレオチド644からヌクレオチド700までのヌクレオチド配列を含む。別の典型
的なDNAセグメントは、配列番号5の一部分を含み、ヌクレオチド644からヌクレ
オチド700までのヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列において少なく
とも1個のヌクレオチドが置換されているが、ただし、ヌクレオチドの置換が1
個のアミノ酸コードのみを変化させる場合、ヌクレオチド666がアデニンであり
、ヌクレオチド667がシトシンまたはチミンである時にヌクレオチド665がアデニ
ンであり得ないことを条件とする。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号5の
一部分を含み、該一部分はヌクレオチド11からヌクレオチド1342までのヌクレオ
チド配列を含み、β-チューブリンをコードする。別の典型的なDNAセグメントは
、配列番号5の一部分を含み、該一部分はヌクレオチド11からヌクレオチド1342
までのヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列において少なくとも1個の
ヌクレオチドが置換されているが、ヌクレオチド置換が1個のアミノ酸コードの
みを変化させる場合、ヌクレオチド666がアデニンであり、ヌクレオチド667がシ
トシンまたはチミンである時にヌクレオチド665がアデニンであり得ないことを
条件とする。別の典型的なDNAセグメントは、配列番号5の一部分を含み、該一部
分はヌクレオチド11からヌクレオチド1342までのヌクレオチド配列を含み、該ヌ
クレオチド配列において少なくとも1個のヌクレオチドが置換されているが、た
だし、ヌクレオチド置換が1個のアミノ酸コードのみを変化させる場合、ヌクレ
オチド666がアデニンであり、ヌクレオチド667がシトシンまたはチミンである時
にヌクレオチド665がアデニンであり得ないことを条件とし、この置換によって
β-チューブリンのタキソール結合能が変化しない。別の典型的なDNAセグメント
は、配列番号5の一部分を含み、該一部分はヌクレオチド11から1342までのヌク
レオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列において少なくとも1個のヌクレオチ
ドが置換されているが、ただし、ヌクレオチド置換が1個のアミノ酸コードのみ
を変化させる場合、ヌクレオチド666がアデニンであり、ヌクレオチド667がシト
シンまたはチミンである時にヌクレオチド665がアデニンであり得ないことを条
件とし、かつ、この置換によってβ-チューブリンのタキソール結合能が変化す
る。In another aspect, the invention is a purified DNA segment encoding β-tubulin of the fungal species Phytophthora cinnamomi, or a portion thereof, wherein the segment consists essentially of at least a portion of SEQ ID NO: 5. A typical DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5, which portion comprises the nucleotide sequence from nucleotide 11 to nucleotide 103. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5, wherein the portion comprises a nucleotide sequence from nucleotide 11 to nucleotide 103, wherein at least one nucleotide has been replaced in the nucleotide sequence, If substitution of a nucleotide changes only one amino acid code, provided that nucleotide 81 cannot be adenine when nucleotide 81 is thymine and nucleotide 82 is adenine, cytosine, or thymine. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5, which portion comprises a nucleotide sequence from nucleotide 644 to nucleotide 700. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5 and comprises a nucleotide sequence from nucleotide 644 to nucleotide 700, wherein at least one nucleotide has been substituted in the nucleotide sequence, provided that the nucleotide substitution has been made. Is 1
If only one amino acid code is changed, provided that nucleotide 666 is adenine and nucleotide 665 cannot be adenine when nucleotide 667 is cytosine or thymine. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5, which portion comprises a nucleotide sequence from nucleotide 11 to nucleotide 1342 and encodes β-tubulin. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5, wherein the portion is from nucleotide 11 to nucleotide 1342.
And wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been replaced, but wherein the nucleotide substitution changes only one amino acid code, nucleotide 666 is adenine and nucleotide 667 is cytosine or thymine. , Provided that nucleotide 665 cannot be adenine. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5, wherein the portion comprises a nucleotide sequence from nucleotide 11 to nucleotide 1342, wherein at least one nucleotide has been replaced in the nucleotide sequence, If the nucleotide substitution changes only one amino acid code, provided that nucleotide 666 cannot be adenine when nucleotide 666 is adenine and nucleotide 667 is cytosine or thymine, this substitution results in β-tubulin Taxol binding ability does not change. Another exemplary DNA segment comprises a portion of SEQ ID NO: 5, wherein the portion comprises the nucleotide sequence from nucleotides 11 to 1342, wherein at least one nucleotide has been replaced in the nucleotide sequence, except that the nucleotide If the substitution changes only one amino acid code, provided that nucleotide 666 is adenine and that nucleotide 665 cannot be adenine when nucleotide 667 is cytosine or thymine, and that the β-tube Alters the ability of phosphorus to bind taxol.
【0012】 別の態様において、本発明は、配列番号6に記載の真菌種Phytophthora cinnam
omiのβ-チューブリンの、少なくとも一部分を含むアミノ酸配列である。典型的
なアミノ酸配列は配列番号6の一部分を含み、該一部分はアミノ酸1〜31を含む
。典型的なアミノ酸配列は、配列番号6の一部分を含み、該一部分はアミノ酸1
〜31を含み、少なくとも1個の置換アミノ酸を有するが、ただし、アミノ酸24が
唯一の置換されているアミノ酸である場合に、それがイソロイシンであり得ない
ことを条件とする。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号6の一部分を含み、
該一部分はアミノ酸212〜230を含む。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号6
の一部を含み、該一部分はアミノ酸212〜230を含み、少なくとも1個の置換アミ
ノ酸を有するが、ただし、アミノ酸219が唯一の置換されているアミノ酸である
場合に、それがアスパラギンであり得ないことを条件とする。別の典型的なアミ
酸配列は、配列番号6の一部を含み、該一部分はアミノ酸212〜230を含み、アミ
ノ酸219にアミノ酸置換を有し、アミノ酸219がアスパラギンでは置換されていな
い。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号6の一部を含み、該一部分は本質的
にアミノ酸1〜446からなり、タキソール感受性β-チューブリンとして作用する
。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番号6の一部を含み、該一部分は本質的に
アミノ酸1〜446からなり、該一部分は少なくとも1個のアミノ酸置換を有するが
、ただし、アミノ酸219が唯一の置換されているアミノ酸である場合に、それが
アスパラギンであり得ないことを条件とし、かつ、このアミノ酸置換によって該
一部分のタキソール結合特性が変化する。別の典型的なアミノ酸配列は、配列番
号6の一部を含み、該一部分が少なくとも一個のアミノ酸置換を有するが、ただ
し、アミノ酸219が唯一の置換されているアミノ酸である場合に、それがアスパ
ラギンであり得ないことを条件とし、かつ、このアミノ酸置換によって該一部分
のタキソール結合特性が変化しない。別の典型的なアミノ酸配列は、アミノ酸21
9が、アミノ酸219の周囲の該アミノ酸配列の3次元構造を乱す、アスパラギン以
外の任意のアミノ酸で置換されている。In another embodiment, the present invention provides a fungal species Phytophthora cinnam as set forth in SEQ ID NO: 6.
2 is an amino acid sequence containing at least a portion of omi β-tubulin. A typical amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 6, wherein the portion comprises amino acids 1-31. A typical amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 6, wherein the portion is amino acid 1
And at least one substituted amino acid, provided that it cannot be isoleucine if amino acid 24 is the only substituted amino acid. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 6,
The portion comprises amino acids 212-230. Another exemplary amino acid sequence is SEQ ID NO: 6
Which comprises amino acids 212-230 and has at least one substituted amino acid, provided that when amino acid 219 is the only substituted amino acid, it cannot be asparagine It is a condition. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 6, which includes amino acids 212-230, has an amino acid substitution at amino acid 219, and amino acid 219 is not substituted with asparagine. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 6, which portion consists essentially of amino acids 1-446 and acts as a taxol-sensitive β-tubulin. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 6, wherein the portion consists essentially of amino acids 1 to 446, wherein the portion has at least one amino acid substitution, with the proviso that amino acid 219 is unique. If it is a substituted amino acid, provided that it cannot be asparagine, and this amino acid substitution alters the taxol binding properties of the portion. Another exemplary amino acid sequence comprises a portion of SEQ ID NO: 6, wherein the portion has at least one amino acid substitution, provided that amino acid 219 is the only substituted amino acid, And the amino acid substitution does not alter the taxol binding properties of the portion. Another typical amino acid sequence is amino acid 21
9 has been replaced by any amino acid other than asparagine that disrupts the three-dimensional structure of the amino acid sequence around amino acid 219.
【0013】 別の態様において、本発明は、真菌種Pestalotiopsis microsporaのβ-チュー
ブリンをコードする精製DNAセグメントまたはその一部を含んでなるベクターで
ある。好ましくは、該ベクターは少なくとも一個のタキソール結合部位をコード
する部分を含む。In another aspect, the invention is a vector comprising a purified DNA segment encoding β-tubulin of a fungal species Pestalotiopsis microspora, or a portion thereof. Preferably, the vector comprises a portion encoding at least one taxol binding site.
【0014】 別の態様において、本発明は、真菌種Phythium ultimumのβ-チューブリンを
コードする精製DNAセグメントまたはその一部を含んでなるベクターである。好
ましくは、該ベクターは少なくとも1個のタキソール結合部位をコードする部分
を含む。In another aspect, the invention is a vector comprising a purified DNA segment encoding β-tubulin of a fungal species Phythium ultimum, or a portion thereof. Preferably, the vector comprises a portion encoding at least one taxol binding site.
【0015】 別の態様において、本発明は、真菌種Phytophthora cinnamomiのβ-チューブ
リンをコードし、本質的に配列番号5又はその一部からなる精製DNAセグメントを
含んでなるベクターである。好ましくは、該ベクターは少なくとも1個のタキソ
ール結合部位をコードする部分を含む。[0015] In another embodiment, the invention is a vector encoding a β-tubulin of the fungal species Phytophthora cinnamomi and comprising a purified DNA segment consisting essentially of SEQ ID NO: 5, or a portion thereof. Preferably, the vector comprises a portion encoding at least one taxol binding site.
【0016】 別の態様において、本発明は、β-チューブリンまたはβ-チューブリン様化合
物のタキソール結合能を測定する方法であり、配列番号6に記載のタキソール耐
性Pestalotiopsis microspora、タキソール感受性Pythium ultimum、またはタキ
ソール耐性Phytophthora cinnamomi由来のβ-チューブリンのタキソール結合部
位を少なくとも1個含むアミノ酸配列に対する抗体で、タキソール結合特性およ
び非タキソール結合特性を識別するような抗体を準備して試薬を調製し;β-チ
ューブリンまたはβ-チューブリン様化合物と該試薬を接触させ;そして、該試
薬中の抗体とβ-チューブリンまたはβ-チューブリン様化合物との結合の程度を
測定することを含み;それによってタキソール耐性Pestalotiopsis microspora
に対する抗体の、β-チューブリンまたはβ-チューブリン様化合物への結合はタ
キソール耐性を示し、および、タキソール結合特性を特異的に認識する抗体の結
合はタキソール感受性を示し;タキソール非結合特性を特異的に認識する抗体の
結合はタキソール感受性を示すとする方法である。1実施形態において、該試薬
中の抗体は、タキソール耐性Pestalotiopsis microspora由来β-チューブリンの
タキソール結合部位を少なくとも1個を含むアミノ酸配列に対して誘導する。別
の実施形態において、該試薬中の抗体は、配列番号2のタキソール結合部位を少
なくとも1個含むアミノ酸配列に対して誘導する。別の実施形態において、該試
薬中の抗体は、タキソール感受性Phythium ultimum由来のβ-チューブリンのタ
キソール結合部位を少なくとも1個含むアミノ酸配列に対して誘導する。別の実
施形態において、該試薬中の抗体は、配列番号4のタキソール結合部位を少なく
とも1個含むアミノ酸配列に対して誘導する。別の実施形態において、該試薬中
の抗体は、配列番号6に記載のタキソール感受性Phytophthora cinnamomi由来β
-チューブリンのタキソール結合部位を少なくとも1個含むアミノ酸配列に対し
て誘導する。別の態様において、該試薬中の抗体は、配列番号678のタキソール
結合部位を少なくとも1個含むアミノ酸配列に対して誘導する。この方法におい
て、β-チューブリンまたはβ-チューブリン様化合物は、組換えにより発現され
たタンパク質、外因的に単離されたタンパク質、合成ペプチド、および細胞培養
物からなる群から選択する。In another embodiment, the present invention is a method for measuring the taxol-binding ability of β-tubulin or a β-tubulin-like compound, wherein the taxol-resistant Pestalotiopsis microspora of SEQ ID NO: 6, a taxol-sensitive Pythium ultimum, Alternatively, an antibody against an amino acid sequence containing at least one taxol-binding site of β-tubulin derived from taxol-resistant Phytophthora cinnamomi, which distinguishes taxol-binding and non-taxol-binding characteristics, is prepared; Contacting the reagent with a tubulin or β-tubulin-like compound; and determining the extent of binding of the antibody in the reagent to β-tubulin or β-tubulin-like compound; thereby Taxol-resistant Pestalotiopsis microspora
Binding of antibodies to β-tubulin or β-tubulin-like compounds to taxol resistance, and binding of antibodies specifically recognizing taxol binding properties to taxol sensitivity; specificity to taxol non-binding properties This is a method in which the binding of an antibody that specifically recognizes taxol sensitivity. In one embodiment, the antibody in the reagent induces an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of taxol-resistant β-tubulin from Pestalotiopsis microspora. In another embodiment, the antibody in the reagent is directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the antibody in the reagent is directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of β-tubulin from taxol-sensitive Phythium ultimum. In another embodiment, the antibody in the reagent is directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of SEQ ID NO: 4. In another embodiment, the antibody in the reagent is a taxol-sensitive Phytophthora cinnamomi-derived β
-Directed against an amino acid sequence containing at least one taxol binding site of tubulin. In another embodiment, the antibody in the reagent is directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of SEQ ID NO: 678. In this method, the β-tubulin or β-tubulin-like compound is selected from the group consisting of a recombinantly expressed protein, an exogenously isolated protein, a synthetic peptide, and a cell culture.
【0017】 別の態様において、本発明は、タキソールまたはタキソール様化合物の存在に
より物質組成物をスクリーニングする方法であり、任意のタキソール感受性生物
由来のα-チューブリンに加えて、配列番号6に記載のPhythium ultimumまたは
タキソール感受性Phytophthora cinnamomi由来の両方のタキソール結合部位を含
むアミノ酸配列を有するβ-チューブリンを準備して試薬を調製し;物質組成物
と試薬を接触させ;そして、物質組成物がMTの集合を促進する能力、または物質
組成物が解離条件下でMTの解離を抑制する能力を測定することを含み;それによ
って、MTの集合を促進する能力または解離を抑制する能力は、物質組成物中にお
けるタキソールまたはタキソール様化合物の存在の可能性を示すこととする方法
である。In another embodiment, the present invention is a method of screening a substance composition by the presence of taxol or a taxol-like compound, wherein in addition to α-tubulin from any taxol-sensitive organism, the method is set forth in SEQ ID NO: 6. A β-tubulin having an amino acid sequence containing both taxol binding sites from Phythium ultimum or taxol-sensitive Phytophthora cinnamomi is prepared to prepare a reagent; contacting the substance composition with the reagent; and Measuring the ability of a substance composition to promote the assembly of, or inhibit the dissociation of, MT under dissociation conditions; thereby, the ability of the substance composition to promote the assembly of, or inhibit the dissociation of, the MT The method is to indicate the possible presence of taxol or a taxol-like compound in an object.
【0018】 別の態様において、本発明は、タキソールまたはタキソール様化合物の存在に
ついて物質の組成物をスクリーニングする方法であり、該方法は、配列番号6の
β-チューブリンを保有するタキソール感受性Phythium ultimumまたはタキソー
ル感受性Phytophthora cinnamomiの菌糸体を準備し;標識タキソールの存在下で
物質の組成物と菌糸体とを接触させ;そして、物質の組成物がβ-チューブリン
と標識タキソールとの結合を競合的に阻害する度合を測定する;ことを含み、そ
の際、タキソール感受性のPhythium ultimumまたはPhytophthora cinnamomi由来
のβ-チューブリンへの標識タキソールの結合をブロックすることができれば、
該物質の組成物はタキソールまたはタキソール様化合物を保有すると判定される
。In another embodiment, the invention is a method of screening a composition of matter for the presence of taxol or a taxol-like compound, the method comprising a taxol-sensitive Phythium ultimum carrying β-tubulin of SEQ ID NO: 6. Or preparing a mycelium of taxol-sensitive Phytophthora cinnamomi; contacting the composition of the substance with the mycelium in the presence of labeled taxol; and the composition of the substance competitively binding β-tubulin to labeled taxol. Measuring the degree of inhibition; including, if able to block the binding of labeled taxol to β-tubulin from taxol-sensitive Phythium ultimum or Phytophthora cinnamomi,
The composition of matter is determined to carry taxol or a taxol-like compound.
【0019】 別の態様において、本発明は、組換えにより発現されたβ-チューブリンまた
はその一部分のタキソール結合特性を変化させる方法であり、該方法は、ベクタ
ーのコード領域内の配列番号1のアミノ酸219におけるコドンの正体を決定し;
そして、アミノ酸219におけるコドンがトレオニン以外の任意のアミノ酸をコー
ドする場合に、該コドン中のヌクレオチドをアミノ酸219がトレオニンをコード
するように置換して、非タキソール結合β-チューブリンまたはその一部分を、
タキソール結合β-チューブリンまたはその一部分に変化させるか、あるいは、
アミノ酸219における該コドンがトレオニンをコードする場合に、該コドン中の
ヌクレオチドをアミノ酸219がトレオニン以外の任意のアミノ酸をコードするよ
うに置換して、タキソール結合β-チューブリンまたはその一部分を、非タキソ
ール結合β-チューブリンまたはその一部分に変化させることを含む。In another embodiment, the invention is a method of altering the taxol binding properties of a recombinantly expressed β-tubulin or a portion thereof, the method comprising the steps of SEQ ID NO: 1 in the coding region of the vector. Determining the identity of the codon at amino acid 219;
Then, when the codon at amino acid 219 encodes any amino acid other than threonine, the nucleotide in the codon is substituted so that amino acid 219 encodes threonine, and the non-taxol-linked β-tubulin or a part thereof is replaced with
Change to taxol-bound β-tubulin or a portion thereof, or
When the codon at amino acid 219 encodes a threonine, the nucleotides in the codon are substituted such that amino acid 219 encodes any amino acid other than threonine to reduce taxol-linked β-tubulin or a portion thereof to non-taxol. Changing to bound β-tubulin or a portion thereof.
【0020】 別の態様において、本発明は、タキソール耐性真菌細胞からタキソール感受性
真菌細胞を作成する方法であり、該方法は、配列番号2中で番号を付けたアミノ
酸219の位置にトレオニンを含むタキソール結合β-チューブリンをコードするDN
Aセグメントを導入することによって、非タキソール感受性真菌細胞を形質転換
することを含み、その際、形質転換された真菌細胞が、発現可能な条件にさらし
たとき、適切な構成プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で該DNAセ
グメントを発現する。[0020] In another embodiment, the invention is a method of making a taxol-sensitive fungal cell from a taxol-resistant fungal cell, the method comprising a taxol comprising threonine at amino acid number 219 numbered in SEQ ID NO: 2. DN encoding bound β-tubulin
Transforming a non-taxol-sensitive fungal cell by introducing an A segment, wherein the transformed fungal cell, when exposed to expressible conditions, has a suitable constitutive or inducible promoter. Express the DNA segment under control.
【0021】 別の態様において、本発明は、配列番号2中で番号を付けたアミノ酸219にトレ
オニンを含むタキソール結合β-チューブリンをコードするDNAセグメントを導入
することによって形質転換されており、発現可能な条件にさらしたとき、適切な
構成プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で該DNAセグメントを発現
する、トランスジェニックタキソール感受性真菌細胞である。In another embodiment, the present invention has been transformed by introducing a DNA segment encoding taxol-linked β-tubulin comprising threonine at amino acid 219 numbered in SEQ ID NO: 2 and expressing A transgenic taxol-sensitive fungal cell that expresses the DNA segment under the control of a suitable constitutive or inducible promoter when exposed to possible conditions.
【0022】 別の態様において、本発明は、タキソール感受性真菌細胞からタキソール耐性
真菌細胞を作成する方法であり、該方法は、配列番号2中で番号を付けたアミノ
酸219のアミノ酸がトレオニンではない、非タキソール結合β-チューブリンをコ
ードするDNAセグメントを導入することによってタキソール感受性真菌細胞を形
質転換することを含み、その際、形質転換された真菌細胞は、発現可能な条件に
さらしたとき、適切な構成プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で該
DNAセグメントを過剰発現する。In another embodiment, the present invention is a method of producing a taxol-resistant fungal cell from a taxol-sensitive fungal cell, wherein the amino acid at amino acid 219 numbered in SEQ ID NO: 2 is not threonine. Transforming a taxol-sensitive fungal cell by introducing a DNA segment encoding a non-taxol-linked β-tubulin, wherein the transformed fungal cell, when exposed to expressible conditions, Under the control of various constitutive or inducible promoters.
Overexpress DNA segments.
【0023】 別の態様において、本発明は、配列番号2中で番号を付けたアミノ酸219にトレ
オニンを含むタキソール結合β-チューブリンをコードするDNAセグメントを導入
することにより形質転換されており、発現可能な条件にさらしたとき、適切な構
成プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で該DNAセグメントを過剰発
現する、トランスジェニックタキソール感受性真菌細胞である。In another embodiment, the present invention has been transformed by introducing a DNA segment encoding taxol-linked β-tubulin comprising threonine at amino acid 219 numbered in SEQ ID NO: 2 and expressing A transgenic taxol-sensitive fungal cell that overexpresses the DNA segment under the control of a suitable constitutive or inducible promoter when exposed to possible conditions.
【0024】 別の態様において、本発明は、タキソールまたはタキソール様化合物の存在に
ついて物質の組成物をスクリーニングする方法であり、該方法は、識別可能なタ
キソール耐性真菌細胞とタキソール感受性真菌細胞を準備し;物質の組成物と該
真菌細胞とを接触させ;そして、該真菌細胞の増殖抑制を測定する;ことを含み
、その際、該物質の組成物がタキソール感受性真菌細胞の増殖を抑制できるが、
タキソール耐性真菌細胞の増殖を抑制できない場合は、該組成物がタキソールま
たはタキソール様化合物を保有すると判定される。この方法は、タキソール耐性
およびタキソール感受性の同質遺伝子によるトランスジェニックな真菌細胞を必
須で含む、識別可能なタキソール耐性真菌細胞およびタキソール感受性真菌細胞
が本質的にトランスジェニックタキソール耐性真菌細胞およびタキソール感受性
アイソジェニック真菌細胞からなる場合に行なうことができる。この方法はまた
、タキソール感受性真菌細胞が誘導される真菌とは無関係の真菌から誘導された
、タキソール耐性真菌細胞を用いて行なうことが可能である。In another aspect, the invention is a method of screening a composition of matter for the presence of taxol or a taxol-like compound, the method comprising providing distinguishable taxol-resistant and taxol-sensitive fungal cells. Contacting a composition of a substance with the fungal cell; and measuring the inhibition of growth of the fungal cell; wherein the composition of the substance can inhibit the growth of a taxol-sensitive fungal cell;
If the growth of taxol-resistant fungal cells cannot be suppressed, it is determined that the composition carries taxol or a taxol-like compound. The method comprises essentially transgenic taxol-resistant and taxol-sensitive fungal cells comprising taxol-resistant and taxol-sensitive isogenic transgenic fungal cells. It can be performed when it consists of fungal cells. The method can also be performed with taxol-resistant fungal cells derived from a fungus independent of the fungus from which the taxol-sensitive fungal cells are derived.
【0025】 別の態様において、本発明は、植物病原菌の増殖を防御する方法であり、該方
法は、植物病原菌のタキソール感受性を判定し、該病原菌がタキソール感受性で
あると判定された場合は、該植物および周辺の土壌をタキソール産生P.microspo
raで処理することを含む。典型的方法においては、植物病原菌のタキソール感受
性をアミノ酸219を同定することによって判定し、アミノ酸219がトレオニンであ
る場合に、該植物をタキソール感受性であると指定する。In another embodiment, the present invention is a method of protecting the growth of a phytopathogenic bacterium, the method comprising determining taxol susceptibility of the phytopathogenic bacterium, Taxol-producing P.microspo
Includes processing with ra. In a typical method, taxol susceptibility of a plant pathogen is determined by identifying amino acid 219, and if amino acid 219 is threonine, the plant is designated as taxol susceptible.
【0026】詳細な説明 本発明の1態様は、β-チューブリンタンパク質をコードするオープンリーディ
ングフレームまたはその一部分を含んでなる単離されたDNAである。対応するcDN
Aが、タキソール耐性Pestalotiopsis microspora Ne32、タキソール感受性Pythi
um ultimumおよびタキソール感受性Pythium cinnamomiから単離され、特性づけ
られている。Pestalotiopsis microspora Ne32由来のβ-チューブリンのヌクレ
オチド配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号1および配列番号2に、Py
thium ultimum由来のものをそれぞれ配列番号3および配列番号4に、Pythium cin
namomi由来のものをそれぞれ配列番号5および配列番号6に示す。本発明の遺伝子
によりコードされるβ-チューブリンのタキソール感受性の特性づけによって、
配列番号2、配列番号4、または配列番号6において番号を付けたβ-チューブリン
のアミノ酸219の正体がタキソール感受性のインジケーターであることが分かっ
た。アミノ酸219の位置にトレオニン(「Thr219」)が存在すると、タキソール
感受性を示すのに対して、アスパラギン(「Asn219」)またはグルタミン(「Gl
n219」)が存在すると、タキソール耐性を示す。[0026] DETAILED DESCRIPTION One aspect of the present invention is an isolated DNA comprising an open reading frame or a portion thereof encoding a β- tubulin protein. Corresponding cDN
A is taxol-resistant Pestalotiopsis microspora Ne32, taxol-sensitive Pythi
um ultimum and taxol-sensitive Pythium cinnamomi have been isolated and characterized. The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of β-tubulin derived from Pestalotiopsis microspora Ne32 are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively, by Py
Those derived from thium ultimum are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively, by Pythium cin
Those derived from namomi are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively. By characterizing the taxol sensitivity of β-tubulin encoded by the gene of the invention,
The identity of amino acid 219 of β-tubulin numbered in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6 was found to be an indicator of taxol sensitivity. The presence of threonine ("Thr219") at amino acid 219 indicates taxol sensitivity, whereas asparagine ("Asn219") or glutamine ("Gl
n219 ”) indicates taxol resistance.
【0027】 別の態様において、本発明は、本明細書中で開示される新規遺伝子によりコー
ドされるβ-チューブリンタンパク質またはタンパク質断片である。本発明のP.u
ltimumおよびP.cinnamomiのβ-チューブリンタンパク質はタキソールと結合でき
ることから、本明細書中に記載のβ-チューブリンをコードする遺伝子から誘導
されたタキソール結合部位を含むタンパク質およびタンパク質断片は、大腸菌お
よび他の系の異種発現によって産生させ、標準方法で精製し、当分野で公知の方
法(Schiffら、1979. Nature 277:665-667)を用いてタキソールおよびタキソール
様物質を検出するin vitroアッセイにおいて使用することができる。例えば、本
発明のβ-チューブリンタンパク質を用いて、潜在的な抗癌剤としてのタキソー
ルまたはタキソール様物質について、植物または真菌抽出物、ならびに合成化合
物をスクリーニングすることができる。特定のアミノ酸を置換、欠失、または改
変させて作製したβ-チューブリンを、タキソールがβ-チューブリンタンパク質
と結合する分子的根拠をさらに調べるための実験ツールとして使用することがで
きる。[0027] In another aspect, the invention is a β-tubulin protein or protein fragment encoded by the novel genes disclosed herein. Pu of the present invention
Because ltimum and P. cinnamomi β-tubulin proteins can bind to taxol, proteins and protein fragments containing a taxol binding site derived from the β-tubulin-encoding gene described herein are E. coli and Produced by heterologous expression in other systems, purified by standard methods, and used in in vitro assays to detect taxol and taxol-like substances using methods known in the art (Schiff et al., 1979.Nature 277: 665-667). Can be used. For example, the β-tubulin proteins of the invention can be used to screen plant or fungal extracts, as well as synthetic compounds, for taxol or taxol-like substances as potential anticancer agents. Β-tubulin generated by substituting, deleting or modifying specific amino acids can be used as an experimental tool to further investigate the molecular basis for taxol binding to β-tubulin protein.
【0028】 別の態様において、本発明のβ-チューブリンの全体または一部分に対する抗
体(ポリクローナルまたはモノクローナル)を用いて、物質の組成物がタキソール
結合特性を有するかどうかを調べるために使用することができる。1方法におい
ては、タキソール感受性β-チューブリンおよび/またはタキソール耐性β-チュ
ーブリンと結合できる抗体を、in situハイブリダイゼーション(Ausbelら、1997
. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons)、Elisa、ま
たはウェスタンブロット用に調製した物質の組成物に接触させる。抗体-抗原結
合の可視化は、当分野で公知の任意の方法、例えば、放射標識第2抗体もしくは
蛍光標識第2抗体、またはペルオキシダーゼおよび/またはアルカリホスファタ
ーゼを使用する比色法により仲介される(Harlow, E.D.およびLane, D. 1988. An
tibodies: A Laboratory Manual)。例えば、アミノ酸219を含む配列番号4の一部
分に対する抗体は、アミノ酸219の位置にトレオニンを有するβ-チューブリンと
は結合するが、アミノ酸219の位置に異なるアミノ酸を有するβ-チューブリンと
は結合しない。そのため、検出可能な結合は、アミノ酸219の位置でのトレオニ
ンの存在、それゆえにタキソールへの感受性、を示す。このタイプのアッセイは
様々な物質の組成物をβ-チューブリンの存在についてスクリーニングするのに
有用であり、これら組成物には植物もしくは微生物などの生存物質、または植物
材料、患者サンプル、もしくは化合物ライブラリーなどの非生存物質が含まれる
。In another embodiment, an antibody (polyclonal or monoclonal) to all or a portion of β-tubulin of the invention may be used to determine whether a composition of matter has taxol binding properties. it can. In one method, antibodies capable of binding to taxol-sensitive β-tubulin and / or taxol-resistant β-tubulin are purified by in situ hybridization (Ausbel et al., 1997).
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons), Elisa, or contact a composition of matter prepared for a Western blot. Visualization of antibody-antigen binding is mediated by any method known in the art, for example, a colorimetric method using a radiolabeled or fluorescently labeled secondary antibody, or peroxidase and / or alkaline phosphatase (Harlow , ED and Lane, D. 1988. An
tibodies: A Laboratory Manual). For example, an antibody against a portion of SEQ ID NO: 4 that includes amino acid 219 binds to β-tubulin having a threonine at amino acid 219 but does not bind to β-tubulin having a different amino acid at amino acid 219 . As such, detectable binding indicates the presence of threonine at amino acid 219, and therefore sensitivity to taxol. This type of assay is useful for screening compositions of various substances for the presence of β-tubulin, which include living substances, such as plants or microorganisms, or plant material, patient samples, or compound live. Includes non-living substances such as rallies.
【0029】 別の態様において、本発明は、タキソール結合およびタキソール感受性に対応
するβ-チューブリンにおける特定のアミノ酸配列の同定に基づいて、タキソー
ルとβ-チューブリンとの相互作用を模倣するタキソール類似体または他の化合
物を設計する方法である。以前に報告された3次元構造(Nogalesら、1998. Natur
e 391:199-203)を使用して、アミノ酸219および周辺領域に関して、抗腫瘍性お
よび抗真菌性化合物を開発し、最適化することができる。さらに、このような情
報を用いて、β-チューブリンタンパク質の特定の位置のアミノ酸を置換するこ
とによって、タキソール感受性を改変した変異型β-チューブリンを作成するこ
とも可能である。In another embodiment, the present invention relates to taxol analogs that mimic the interaction between taxol and β-tubulin based on the identification of specific amino acid sequences in β-tubulin that correspond to taxol binding and taxol sensitivity. A method of designing the body or other compounds. Previously reported three-dimensional structures (Nogales et al., 1998.
e 391: 199-203) can be used to develop and optimize antitumor and antifungal compounds with respect to amino acid 219 and surrounding regions. Further, using such information, it is also possible to prepare a mutant β-tubulin having a modified taxol sensitivity by substituting an amino acid at a specific position of the β-tubulin protein.
【0030】 別の態様において、本発明は、本発明の遺伝子を使用して真菌のアイソジェニ
ック株を作成する方法である。この方法は、タキソール関連の薬理学的研究を、
既知の技術的背景に対して行なうことを可能にする。さらに、本発明は、植物抽
出物、真菌抽出物、他の生物からの抽出物、および合成化合物を、潜在的な抗癌
剤としてのタキソール様物質についてスクリーニングするために、これらのアイ
ソジェニック真菌株(一方はタキソール感受性であり、他方はタキソール耐性で
ある)を使用する方法である。また、本発明は、植物抽出物、真菌抽出物、他の
生物からの抽出物、および合成化合物を、潜在的な抗癌剤としてのタキソール様
物質についてスクリーニングするために、無関係な2種類の真菌株(一方はタキソ
ール感受性であり、他方はタキソール耐性である)を使用する方法である。In another aspect, the invention is a method of making a fungal isogenic strain using a gene of the invention. This method allows taxol-related pharmacological studies,
Allows you to do against a known technical background. In addition, the present invention provides a method for screening plant extracts, fungal extracts, extracts from other organisms, and synthetic compounds for taxol-like substances as potential anti-cancer agents, using these isogenic fungal strains (on the other hand). Are taxol-sensitive and the other is taxol-resistant). The present invention also provides for the screening of plant extracts, fungal extracts, extracts from other organisms, and synthetic compounds for taxol-like substances as potential anti-cancer agents, using two unrelated fungal strains ( One is taxol-sensitive and the other is taxol-resistant).
【0031】 本発明の遺伝子およびタンパク質について、以下の実施例において特徴を記述
する。これらの実施例は本発明の例示であり、本発明を説明するためのものであ
るが、いずれにおいても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでないこ
とが理解される。本発明の構造的特徴を、本発明の範囲から逸脱することなく改
変することができる。The features of the genes and proteins of the present invention are described in the following examples. It is understood that these examples are illustrative of the invention and are intended to illustrate the invention, but should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. The structural features of the invention can be modified without departing from the scope of the invention.
【0032】実施例1:選択した真菌における、異なるタキソール感受性 本発明のβ-チューブリンcDNAの単離に用いた真菌株について、タキソール感
受性を調べた。 Example 1 Different Taxol Sensitivity in Selected Fungi Taxol sensitivity was examined for fungal strains used for the isolation of the β-tubulin cDNA of the present invention.
【0033】 Pestalotiopsis microspora株Ne32(以前に米国特許第5,861,302号で開示され
たもの)について、Montana State Universityよりライセンス供与を受けた。Pyt
hium ultimum(ATCC 26083)、Achlya klebsiana(ATCC 52605)、およびPythium cin
namomi(ATCC 200982)を、American Type Culture Collection(Manassas, VA)から
購入した。タキソールはSigma Chemical Company(St. Louis, MO)から取得した。 P. microspora Ne32、P. ultimum、およびP. cinnamomiの増殖に対するタキソ
ールの影響を試験した。比較のために、P. ultimumに非常に近い卵菌類であるA.
klebsianaもまた、これらの実験に含めた。図1に記載の通り、P. microspora
のタキソールに対する耐性は非常に高く、11.7μMまでであった。これに比べ、A
. klebsianaは中程度の感受性を示し、その増殖は11.7μMのタキソールに対して
は40%まで抑制された。最終的に、P. ultimumおよびP. cinnamomiはこれら4種
のうちで最も感受性が高いことが判明した。P. ultimumおよびP. cinnamomiの増
殖は、低いタキソール濃度であっても抑制された(IC50 0.1μM)。この感受性は
、Hela細胞分裂を抑制するタキソールのレベル(0.25μM)に匹敵する(Schiffら、
1979. Nature 277:665-667)。The Pestalotiopsis microspora strain Ne32 (previously disclosed in US Pat. No. 5,861,302) was licensed from Montana State University. Pyt
hium ultimum (ATCC 26083), Achlya klebsiana (ATCC 52605), and Pythium cin
Namomi (ATCC 200982) was purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). Taxol was obtained from Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). The effect of taxol on the growth of P. microspora Ne32, P. ultimum, and P. cinnamomi was tested. For comparison, A. is an oomycete very close to P. ultimum.
klebsiana was also included in these experiments. As shown in Fig. 1, P. microspora
Was very resistant to taxol, up to 11.7 μM. In comparison, A
klebsiana was moderately sensitive and its growth was inhibited by up to 40% against 11.7 μM taxol. Finally, P. ultimum and P. cinnamomi were found to be the most sensitive of these four species. The growth of P. ultimum and P. cinnamomi was suppressed even at low taxol concentrations (IC 50 0.1 μM). This sensitivity is comparable to taxol levels (0.25 μM) that inhibit Hela cell division (Schiff et al.,
1979. Nature 277: 665-667).
【0034】実施例2:β-チューブリンcDNA配列の単離 β-チューブリンcDNA配列を、P. microspora Ne32、P. ultimum、およびP. ci
nnamomiについて、真菌の菌糸体から単離したRNAから決定した。契約している研
究室によって、自動化ジデオキシヌクレオチド配列決定法を行ってもらった。配
列の比較を、National Center for Biotechnology Informationのインターネッ
ト上のサイトでBLASTプログラムを用いて行った。アミノ酸配列のアライメント
を、ClustalWプログラムを用いて行い、他の分析はMac Vectorプログラムを用い
て行った。 Example 2: Isolation of β-tubulin cDNA sequence The β-tubulin cDNA sequence was isolated from P. microspora Ne32, P. ultimum, and P. ci
For nnamomi, it was determined from RNA isolated from fungal mycelium. Automated dideoxynucleotide sequencing was performed by a contracting laboratory. Sequence comparisons were performed on the Internet site of the National Center for Biotechnology Information using the BLAST program. Amino acid sequence alignments were performed using the ClustalW program, and other analyzes were performed using the Mac Vector program.
【0035】 P. microspora Ne32およびP. ultimumに由来するβ-チューブリンcDNA配列を
単離するために、4種の縮重プライマーを、真菌β-チューブリンアミノ酸配列
における保存モチーフにより設計した。フォワード縮重プライマーであるBTUB1(
5'-CTGGGCYAAGGGYCAYTACACYGAG-3';配列番号7)、アミノ酸残基Trp-Ala-Lys-Gly
-His-Tyr-Thr-Glu(すなわち、一文字表記のアミノ酸コードではWAKGHYTE;配列番
号8)に対応;リバースプライマーBTUB2(5'-CGAAGAARTGRARNCGRGGGAARGG-3';配
列番号9)、アミノ酸残基Pro-Phe-Pro-Arg-Leu-His-Phe-Phe(すなわち、一文字
表記のアミノ酸コードではPFPRLHFF;配列番号10)に対応;フォワードプライマ
ーBTUB3(5'-CGAGCCYTACAACGCYACYCT-3';配列番号11)、アミノ酸残基Glu-Pro-T
yr-Asn-Ala-Thr-Leu(すなわち、一文字表記のアミノ酸コードではEPYNATL;配列
番号12)に対応;およびリバースプライマーBUTB4(5'-CTCGTTCATGTTRSWCTCRGCC
TC-3';配列番号13)、アミノ酸残基Glu-Ala-Glu-Ser-Asn-Met-Asn-Asp(すなわ
ち、一文字表記のアミノ酸コードではEAESNMND;配列番号14)に対応させて設計
した。全てのプライマーは本発明者らの仕様にしたがって、契約している研究室に
よって作製された。To isolate β-tubulin cDNA sequences from P. microspora Ne32 and P. ultimum, four degenerate primers were designed with conserved motifs in the fungal β-tubulin amino acid sequence. The forward degenerate primer BTUB1 (
5'-CTGGGCYAAGGGYCAYTACACYGAG-3 '; SEQ ID NO: 7), amino acid residue Trp-Ala-Lys-Gly
-His-Tyr-Thr-Glu (that is, corresponding to WAKGHYTE in the one-letter code amino acid code; SEQ ID NO: 8); reverse primer BTUB2 (5'-CGAAGAARTGRARNCGRGGGAARGG-3 '; SEQ ID NO: 9), amino acid residue Pro-Phe- Corresponds to Pro-Arg-Leu-His-Phe-Phe (i.e., PFPRLHFF; SEQ ID NO: 10 in single letter amino acid code); forward primer BTUB3 (5'-CGAGCCYTACAACGCYACYCT-3 '; SEQ ID NO: 11), amino acid residue Glu -Pro-T
yr-Asn-Ala-Thr-Leu (ie, EPYNATL in one letter code amino acid code; SEQ ID NO: 12); and reverse primer BUTB4 (5'-CTCGTTCATGTTRSWCTCRGCC
TC-3 '; SEQ ID NO: 13), and designed to correspond to the amino acid residue Glu-Ala-Glu-Ser-Asn-Met-Asn-Asp (that is, EAESNMND; SEQ ID NO: 14 in the one-letter code). All primers were made by contracting laboratories according to our specifications.
【0036】 P. microspora Ne32からβ-チューブリンcDNAを単離するために、5日間増殖
させた菌糸に由来する5μgの全RNAを用いて、プライマーBTUB4を20μlの反応に
おいて使用して第1鎖cDNAを合成した。1μlのcDNA産物をテンプレートとして用
いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を行った。サイクルのプログラムは、ア
ニーリング温度52℃で8サイクル、続いてアニーリング温度62℃で22サイクル行
った。縮重プライマーBTUB3とBTUB4によって、0.8kbの増幅産物が作製され、一
方BTUB2とBTUB3によって、0.3kbの産物が作製された。所望のバンドをGeneclean
(BIO 101, Vista, CA)を用いてゲル精製し、pPCR2.1ベクター(Invitrogen; San
Diego CA)に連結し、E. coli XL1-Blue細胞を形質転換した。インサートを配列
決定し、遺伝子特異的フォワードプライマーNETUB5(5'-GGGTGTCACCACTTGCTTGCGT
TT -3';配列番号15)およびリバースプライマーNETUB6(5'-TCGAGTTTCCGACGAAAG
TGGACGA-3';配列番号16)を合成した。全長クローンを得るために、Marathon c
DNAライブラリーを、1μgのmRNAを用いて、製造者(Clontech, Palo Alto, CA)
の指示にしたがって構築した。このライブラリー1μlを250倍に希釈し、5μl
を用いてcDNA末端迅速増幅(RACE)反応を、製造者の推奨するPCRサイクルプログ
ラムに従って行った。5'RACEでは、ライブラリーアダプタープライマーAP1(Clon
tech)およびプライマーNETUB6によって1.3kbの産物が作製された。3'RACEでは、
プライマーAP1およびNETUB5によって1.0kbの産物が作製された。所望のバンドを
ゲル精製し、pPCRII-TOPOベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)中にクローン化
した。5'RACE産物由来の1〜1105bpの領域を、3'RACE産物由来の1106〜1668bpの
間の領域と、内部BamHI部位で連結し、複合cDNAを作製した(図2)。P. microspo
ra由来の得られた複合cDNAは全長が1668bpであり、TUBB-pmと命名した。そのヌ
クレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号1および配列番号
2において同様に図2中に示す。このcDNAは446アミノ酸のタンパク質をコード
し、計算上、分子量は49,832、pIは4.6である。このタンパク質は、74ヌクレオ
チドの5'非翻訳領域(UTR)と、229ヌクレオチドの3'UTRおよびそれに続く24ヌク
レオチドのポリ(A)テールを含む。配列AATAA(配列番号1のヌクレオチド1539〜1
543)が、動物およびウイルスポリアデニル化シグナルAATAAA(Proudfoot, N. J.
およびBrownlee, G. G. 1976「真核メッセンジャーRNAの3'非コード領域配列」(
3'Non-coding region sequences in eukaryotic messenger RNA), Nature 263:2
11-214)に最も近い類似性を有するものとして、ポリ(A)領域の103bp上流に位置
決定された。To isolate β-tubulin cDNA from P. microspora Ne32, using 5 μg of total RNA from hyphae grown for 5 days, using the primer BTUB4 in a 20 μl reaction in the first strand cDNA was synthesized. A polymerase chain reaction (PCR) reaction was performed using 1 μl of the cDNA product as a template. The cycle program consisted of 8 cycles at an annealing temperature of 52 ° C., followed by 22 cycles at an annealing temperature of 62 ° C. The degenerate primers BTUB3 and BTUB4 produced a 0.8 kb amplification product, while BTUB2 and BTUB3 produced a 0.3 kb product. Geneclean the desired band
(BIO 101, Vista, CA), gel purification and pPCR2.1 vector (Invitrogen; San
Diego CA) and transformed E. coli XL1-Blue cells. The insert was sequenced and the gene-specific forward primer NETUB5 (5'-GGGTGTCACCACTTGCTTGCGT
TT-3 ′; SEQ ID NO: 15) and reverse primer NETUB6 (5′-TCGAGTTTCCGACGAAAG
TGGACGA-3 ′; SEQ ID NO: 16) was synthesized. Marathon c to obtain full-length clones
The DNA library was prepared using 1 μg of mRNA by the manufacturer (Clontech, Palo Alto, CA).
It was constructed according to the instructions. Dilute 1 μl of this library 250-fold and 5 μl
A cDNA end rapid amplification (RACE) reaction was performed according to the manufacturer's recommended PCR cycling program. For 5'RACE, library adapter primer AP1 (Clon
tech) and primer NETUB6 produced a 1.3 kb product. At 3'RACE,
A 1.0 kb product was generated with primers AP1 and NETUB5. The desired band was gel purified and cloned into the pPCRII-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). A region of 1 to 1105 bp derived from the 5 ′ RACE product was ligated to a region between 1106 to 1668 bp derived from the 3 ′ RACE product at an internal BamHI site to prepare a complex cDNA (FIG. 2). P. microspo
The resulting composite cDNA from ra had a total length of 1668 bp and was named TUBB-pm. The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence are similarly shown in FIG. 2 in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. This cDNA encodes a protein of 446 amino acids and has a calculated molecular weight of 49,832 and a pI of 4.6. This protein contains a 74 nucleotide 5 'untranslated region (UTR) followed by a 229 nucleotide 3' UTR followed by a 24 nucleotide poly (A) tail. Sequence AATAA (nucleotides 1539-1 of SEQ ID NO: 1)
543) is an animal and viral polyadenylation signal AATAAA (Proudfoot, NJ
And Brownlee, GG 1976 "3 'non-coding region sequence of eukaryotic messenger RNA" (
3'Non-coding region sequences in eukaryotic messenger RNA), Nature 263: 2
11-214) was located 103 bp upstream of the poly (A) region with the closest similarity.
【0037】 P. ultimumからβ-チューブリンcDNAを単離するために、6日間増殖させた菌
糸に由来する5μgの全RNAを用いて、オリゴdT-プライマー(GibcoBRL, Gaithers
burg, MD)を20μlの反応において使用して第1鎖cDNAを合成した。2μlのcDNA産
物をテンプレートとして用いて、上記と同様のサイクルプログラムで、ポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)反応を行った。縮重プライマーBTUB1とBTUB4によって、1.0kb
の増幅産物が作製され、一方BTUB1とBTUB2によって、0.5kbの産物が作製された
。所望のバンドをゲル精製し、pPCR2.1ベクターに連結した。インサートを配列
決定し、遺伝子特異的フォワードプライマーWT1L-U(5'-CTATCATGTGCACGTACTCGGT
GTGC-3';配列番号17)およびリバースプライマーWT1L-L(5'-CTGGGACGGTCAAAGCA
CGGTACTGC-3';配列番号18)を設計するために使用した。5'RACEのために、第1
鎖cDNAをプライマーWT1L-LをPCR反応においてテンプレートとして用いて合成し
た。プライマーWT1L-LとCap-Switch(Clontech)からは0.95kbの産物が、Advantag
e-GC cDNA PCRキット(Clontech)を用いて作製された。3'RACEのために、第1鎖c
DNAをCapFinder cDNAライブラリー構築キット(Clontech)を用いて合成した。得
られたcDNAをテンプレートとして、プライマーWT1L-UとCDS/3'(Clontech)からは
、それぞれ1.0kbおよび1.1kbの2種類のPCR産物が作製された。PCR断片をゲル精
製し、pPCR2.1ベクターにクローン化した。P. ultimumにおいては、単離された
チューブリンcDNAには2種の型があり、一方の複合cDNAは長さ1650bpであり、も
う一方は1537bpであった。これらの2種のcDNAは、ポリ(A)テールが付加された
位置のみが異なる。5'RACE産物由来の1〜824bpの間の領域を、1.1kb 3'RACE産
物由来の825〜1650bpの間の領域と、内部MfeI部位で連結し、1650bpの複合cDNA
を作製してTUBB-puと命名した。そのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列
を、それぞれ配列番号3および配列番号4において同様に図3中に示す。このcD
NAは446アミノ酸のタンパク質をコードし、計算上、分子量は50,047、pIは4.6で
ある。このタンパク質は、91ヌクレオチドの5'UTRと、199ヌクレオチドの3'UTR
およびそれに続く19ヌクレオチドのポリ(A)領域を含む。2種の不完全ポリアデ
ニル化シグナルが試験的に同定された。1537bp cDNAのポリ(A)領域の57bp上流の
ATATA(配列番号3のヌクレオチド1445〜1449)、および1650bp cDNAのポリ(A)領
域の80bp上流のAATATT(配列番号3のヌクレオチド1546〜1551)である。これらの
cDNAのサイズは、ノーザン分析における転写物のサイズと、以下に示す通りよく
一致し、これらが完全なものであることが示された。To isolate β-tubulin cDNA from P. ultimum, oligo dT-primers (GibcoBRL, Gaithers) were used with 5 μg of total RNA from hyphae grown for 6 days.
burg, MD) in a 20 μl reaction to synthesize first strand cDNA. A polymerase chain reaction (PCR) reaction was performed using 2 μl of the cDNA product as a template and a cycle program similar to the above. 1.0kb with degenerate primers BTUB1 and BTUB4
BTUB1 and BTUB2 produced a 0.5 kb product. The desired band was gel purified and ligated into the pPCR2.1 vector. The insert was sequenced and the gene-specific forward primer WT1L-U (5'-CTATCATGTGCACGTACTCGGT
GTGC-3 ′; SEQ ID NO: 17) and reverse primer WT1L-L (5′-CTGGGACGGTCAAAGCA
CGGTACTGC-3 ′; SEQ ID NO: 18). First for 5'RACE
Strand cDNA was synthesized using primer WT1L-L as a template in a PCR reaction. 0.95 kb product from primers WT1L-L and Cap-Switch (Clontech), Advantag
It was prepared using the e-GC cDNA PCR kit (Clontech). For 3'RACE, first strand c
DNA was synthesized using CapFinder cDNA library construction kit (Clontech). Using the obtained cDNA as a template, two types of PCR products of 1.0 kb and 1.1 kb were produced from the primers WT1L-U and CDS / 3 '(Clontech), respectively. The PCR fragment was gel purified and cloned into the pPCR2.1 vector. In P. ultimum, there were two types of isolated tubulin cDNA, one composite cDNA was 1650 bp in length and the other was 1537 bp. These two cDNAs differ only in the position where the poly (A) tail is added. A region between 1 to 824 bp from the 5 'RACE product was ligated to a region between 825 to 1650 bp from the 1.1 kb 3' RACE product at an internal MfeI site, and a 1650 bp composite cDNA
And named TUBB-pu. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are similarly shown in FIG. 3 in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively. This cD
NA encodes a protein of 446 amino acids with a calculated molecular weight of 50,047 and a pI of 4.6. This protein has a 91 nucleotide 5'UTR and a 199 nucleotide 3'UTR.
And a subsequent 19 nucleotide poly (A) region. Two incomplete polyadenylation signals were experimentally identified. 57 bp upstream of the poly (A) region of the 1537 bp cDNA
ATATA (nucleotides 1445-1449 of SEQ ID NO: 3) and AATATT (nucleotides 1546-1551 of SEQ ID NO: 3) 80 bp upstream of the poly (A) region of the 1650 bp cDNA. these
The size of the cDNA was in good agreement with the size of the transcript in Northern analysis, as shown below, indicating that they were complete.
【0038】 公表されたP. cinnamomi由来のβ-チューブリンcDNA配列(Weerakoonら、1998.
Mycologia 90:85-95)に基づき、4種の遺伝子特異的プライマーを合成した。フ
ォワードプライマーPCBTUB1U(5'-CAGCGACAACATGAGAGAGCTCG-3';配列番号19)は
cDNA配列の270〜292領域に対応し、フォワードプライマーPCBTUB2U(5'-CGATGAGG
TCATGTGCCTGGATAA-3';配列番号20)は867〜890領域に対応する;リバースプラ
イマーPCBTUB3L(5'-AAACGGAGGCACGTGGTGATG-3';配列番号21)は984〜1005領域
に対応し、リバースプライマーPCBTUB4L(5'-CGCGTCTATCTCATCCATTCCTCG-3';配列
番号22)は1596〜1619領域に対応する。The published β-tubulin cDNA sequence from P. cinnamomi (Weerakoon et al., 1998.
Mycologia 90: 85-95), four types of gene-specific primers were synthesized. The forward primer PCBTUB1U (5′-CAGCGACAACATGAGAGAGCTCG-3 ′; SEQ ID NO: 19) is
Corresponding to the 270 to 292 region of the cDNA sequence, the forward primer PCBTUB2U (5'-CGATGAGG
TCATGTGCCTGGATAA-3 ′; SEQ ID NO: 20) corresponds to the 867 to 890 region; reverse primer PCBTUB3L (5′-AAACGGAGGCACGTGGTGATG-3 ′; SEQ ID NO: 21) corresponds to the 984 to 1005 region, and the reverse primer PCBTUB4L (5′- CGCGTCTATCTCATCCATTCCTCG-3 ′; SEQ ID NO: 22) corresponds to the 1596 to 1619 region.
【0039】 5日間増殖させたP. cinnamomi菌糸に由来する5μgの全RNAを用いて、オリゴ
dT-プライマーを20μlの反応において使用して第1鎖cDNAを合成した。1μlのcD
NA産物をテンプレートとして用いてPCRを行った。サイクルのプログラムは、62
℃のアニーリング温度で30サイクル行うものであった。プライマーPCBTUB1UとPC
BTUB4Lによって、1.3kbの増幅産物が作製され、一方PCBTUB2UとPCBTUB4Lによっ
て、0.75kbの産物が作製された。プライマーPCBTUB1UまたはPCBTUB2UをPCBTUB3L
と組み合わせた場合は、増幅産物は作製されなかった。所望のバンドをGeneclea
n(BIO101)を用いてゲル精製し、pPCR2.1ベクター(Invitrogen)に連結し、E. col
i XL1-Blue細胞を形質転換した。1,3kb断片については4個のクローン(クローン
番号C16-1、4、9および10)を、0.75kb断片については1個のクローン(クローン
番号C10-5)を両方向配列決定し、同じ配列で一致していることを見出した。TUBB
-pcと命名した長さ1.3kbのcDNAのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、
それぞれ配列番号5および配列番号6において同様に図4中に示す。このcDNAは
444アミノ酸のβ-チューブリンタンパク質をコードし、計算上、分子量は50kDa
、pIは4.7である。10ヌクレオチドの5'非翻訳領域(UTR)と、5ヌクレオチドの3'
UTRが存在する。Using 5 μg of total RNA from P. cinnamomi hypha grown for 5 days,
First strand cDNA was synthesized using the dT-primer in a 20 μl reaction. 1 μl cD
PCR was performed using the NA product as a template. The cycle program is 62
The annealing was performed at an annealing temperature of 30 ° C. for 30 cycles. Primer PCBTUB1U and PC
BTUB4L produced a 1.3 kb amplification product, while PCBTUB2U and PCBTUB4L produced a 0.75 kb product. Primer PCBTUB1U or PCBTUB2U to PCBTUB3L
No amplification product was produced when combined with. Geneclea the desired band
n (BIO101), ligated into pPCR2.1 vector (Invitrogen), and
i XL1-Blue cells were transformed. Four clones (clone number C16-1, 4, 9 and 10) for the 1.3 kb fragment and one clone (clone number C10-5) for the 0.75 kb fragment were bidirectionally sequenced and Found a match. TUBB
the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a 1.3 kb cDNA designated -pc,
SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are also shown in FIG. This cDNA is
Encodes a 444 amino acid β-tubulin protein with a calculated molecular weight of 50 kDa
, PI is 4.7. 10 nucleotides 5 'untranslated region (UTR) and 5 nucleotides 3'
UTR exists.
【0040】 P. cinnamomiのβ-チューブリンをコードする配列が以前に公表(Weerakoonら
、1998.Mycologia 90:85-95;Genbank受託番号U22050)されており、本明細書に開
示したP. cinnamomiβ-チューブリンの推定アミノ酸配列と、Weerakoonらによっ
て開示されたものと比較した。配列番号5および図4に示したTUBB-pc cDNA配列
はコード領域内で、Weerakoonらによって公表されたものとは36ヌクレオチド(2.
7%)異なる。TUBB-pcから推定されるβ-チューブリンのアミノ酸配列(配列番号
6)とWeerakoonらによって公表されたアミノ酸配列(「U22050」;配列番号23)
とのアライメントを図5に示す。2種の配列は8個のアミノ酸が異なる。このう
ちの4個は保存的変化であるが、他の4個は非保存的変化である。各タキソール
結合部位内に変化が1ヶ所存在する。タキソール結合領域I(アミノ酸1〜31)で
は、TUBB-pcにおけるアミノ酸V24(アミノ酸24の位置がバリンであるもの)は、U2
2050におけるI24 (アミノ酸24の位置がイソロイシンであるもの)とは異なる。タ
キソール結合領域II(アミノ酸212〜23l)では、TUBB-pcにおけるT219(アミノ酸
219の位置がトレオニンであるもの)は、U22050におけるN219(アミノ酸219の位置
がアスパラギンであるもの)とは異なる。The sequence encoding β-tubulin of P. cinnamomi has been published previously (Weerakoon et al., 1998. Mycologia 90: 85-95; Genbank accession number U22050) and is disclosed herein. -The deduced amino acid sequence of tubulin was compared with that disclosed by Weerakoon et al. The TUBB-pc cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 5 and FIG. 4 is 36 nucleotides (2.
7%) different. Amino acid sequence of β-tubulin deduced from TUBB-pc (SEQ ID NO: 6) and the amino acid sequence published by Weerakoon et al. (“U22050”; SEQ ID NO: 23)
5 is shown in FIG. The two sequences differ by 8 amino acids. Four of these are conservative changes, while the other four are non-conservative changes. There is one change within each taxol binding site. In Taxol binding region I (amino acids 1-31), amino acid V24 in TUBB-pc (where amino acid 24 is valine) is U2
Different from I24 at 2050 (where amino acid 24 is isoleucine). In taxol binding domain II (amino acids 212-23l), T219 (amino acids
The 219 position is threonine) is different from the N219 in U22050 (the amino acid 219 position is asparagine).
【0041】 P. microspora(配列番号2)、P, ultimum(配列番号4)およびP. cinnamomi(配
列番号6)由来の推定β-チューブリンアミノ酸配列は、β-チューブリンの予想
される特徴を示すが、それは図6の、ヒトβ2-チューブリン(配列番号24)、Ne
urospora crassa (配列番号25)、A. nidulans benA (配列番号26)、およびA
. klebsiana (配列番号27)に由来するβ-チューブリンとのアライメントによ
り示される。これらの配列を、N-末端ドメイン(アミノ酸1〜205)、中間ドメイ
ン(アミノ酸206〜38l)およびC-末端ドメインに分割できる(Nogalesら、1998.Nat
ure 391 : 199-203)。それらのN-末端ドメインは、GTP結合のために重要な保存
モチーフ[Ala-Ile-Leu-Val-Asp-Leu-Glu-Pro-Gly-Thr-Met-Asp-Ser-Val-Arg、す
なわち一文字表記のアミノ酸コードではAILVDLEPGTMDSVR(配列番号28)、およ
びAla-Val-Leu-Val-Asp-Leu-Glu-Pro-Gly-Thr-Met-Asp-Ser-Val-Arg、すなわち
一文字表記のアミノ酸コードではAVLVDLEPGTMDSVR(配列番号29);配列番号2
、配列番号4、配列番号6、配列番号24、配列番号25、および配列番号26
中のアミノ酸63〜77の間、および配列番号27中のアミノ酸62〜76の間]、リン
酸結合のために重要な保存モチーフ[Gly-Gly-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly、すなわち一
文字表記のアミノ酸コードではGGGTGSG(配列番号30);配列番号2、配列番号
4、配列番号6、配列番号24、配列番号25および配列番号26中のアミノ酸
140〜146の間、および配列番号27中のアミノ酸139〜145の間]、およびMg2+結
合のために重要な保存モチーフ[Asp-Asn-Glu-Ala、すなわち一文字表記のアミノ
酸コードではDNEA(配列番号31);配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列
番号24、配列番号25および配列番号26中のアミノ酸203〜206の間、および
配列番号27中のアミノ酸202〜205の間](Linse, K.およびMandelkow, E.M. 198
8.「β-チューブリンのGTP結合性ペプチド:直接光親和性標識による位置決定と
ヌクレオチド結合性タンパク質との比較」(The GTP-binding peptide of β-tub
ulin: Localization by direct photo affinity labeling and comparison with
nucleotide-binding proteins) J Biol Chem 263:15205-152lO; および Farr,
G.Wおよび Stemlicht, H, 1992,「β-チューブリンのGTP-結合性ドメインの部位
特異的変異誘発」(Site-directed mutagenesis of the GTP-binding domain of
β-tubulin) J Mol Biol 227:307-321)を含む。さらに、N-末端Met-Arg-Glu-Ile
、すなわち一文字表記のアミノ酸コードではMREI(配列番号32)モチーフが、動
物細胞においてβ-チューブリンmRNAの安定性を自動でレギュレートすることが
示された(Yenら、1988.「β-チューブリンの遊離アミノ末端の認識によるβ-チ
ューブリンmRNAの自動制御された不安定性」(Autoregulated instability of β
-tubulin mRNAs by recognition of the nascent amino terminus of β-tubuli
n) Nature 334:580-585)。このモチーフおよび変異体のMet-Arg-Glu-Leu (すな
わち、一文字表記のアミノ酸コードではMREL;配列番号33)は、図6に示す真菌
β-チューブリン中に存在し、同じように機能し得る。C-末端ドメインは、微小
管関連タンパク質(MAPS)および運動タンパク質(motor protein)(Nogalesら、199
8 Nature 391 : 199-203)との相互作用において重要であることが公表されてい
る。C-末端付近の配列は非常に変化しやすく、かつ酸性であるが、これはβ-チ
ューブリンに共通する特徴である(Sullivan, K.F. 1988.「チューブリンイソ型
の構造と利用」(Structure and utilization of tubulin isotypes) Ann Rev Ce
ll Biol 4:687-716)。The deduced β-tubulin amino acid sequences from P. microspora (SEQ ID NO: 2), P, ultimum (SEQ ID NO: 4) and P. cinnamomi (SEQ ID NO: 6) show the expected characteristics of β-tubulin. As shown, it is the human β2-tubulin (SEQ ID NO: 24), Ne in FIG.
urospora crassa (SEQ ID NO: 25), A. nidulans benA (SEQ ID NO: 26), and A
klebsiana (SEQ ID NO: 27), shown by alignment with β-tubulin. These sequences can be split into an N-terminal domain (amino acids 1-205), an intermediate domain (amino acids 206-381) and a C-terminal domain (Nogales et al., 1998.
ure 391: 199-203). Their N-terminal domain is a conserved motif important for GTP binding [Ala-Ile-Leu-Val-Asp-Leu-Glu-Pro-Gly-Thr-Met-Asp-Ser-Val-Arg, In the amino acid code shown, AILVDLEPGTMDSVR (SEQ ID NO: 28), and Ala-Val-Leu-Val-Asp-Leu-Glu-Pro-Gly-Thr-Met-Asp-Ser-Val-Arg, AVLVDLEPGTMDSVR (SEQ ID NO: 29); SEQ ID NO: 2
, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26
Between amino acids 63-77 in SEQ ID NO: 27 and between amino acids 62-76 in SEQ ID NO: 27], a conserved motif important for phosphate binding [Gly-Gly-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly, ie one letter SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26
Between 140-146 and between amino acids 139-145 in SEQ ID NO: 27], and a conserved motif important for Mg2 + binding [Asp-Asn-Glu-Ala, i.e. DNEA in the one letter code amino acid code. SEQ ID NO: 31); between amino acids 203 to 206 in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26, and between amino acids 202 to 205 in SEQ ID NO: 27] (Linse, K. and Mandelkow, EM 198
8. “The GTP-binding peptide of β-tubin: Positioning by direct photoaffinity labeling and comparison with nucleotide-binding protein”
ulin: Localization by direct photo affinity labeling and comparison with
nucleotide-binding proteins) J Biol Chem 263: 15205-152lO; and Farr,
GW and Stemlicht, H, 1992, `` Site-directed mutagenesis of the GTP-binding domain of β-tubulin ''
β-tubulin) J Mol Biol 227: 307-321). Furthermore, N-terminal Met-Arg-Glu-Ile
That is, in the single letter amino acid code, the MREI (SEQ ID NO: 32) motif has been shown to automatically regulate the stability of β-tubulin mRNA in animal cells (Yen et al., 1988. Autoregulated instability of β-tubulin mRNA by recognition of free amino terminus
-tubulin mRNAs by recognition of the nascent amino terminus of β-tubuli
n) Nature 334: 580-585). This motif and the variant Met-Arg-Glu-Leu (ie, MREL in single letter amino acid code; SEQ ID NO: 33) are present in the fungal β-tubulin shown in FIG. 6 and may function similarly. . The C-terminal domain contains microtubule-associated proteins (MAPS) and motor proteins (Nogales et al., 199).
8 Nature 391: 199-203). The sequence near the C-terminus is highly variable and acidic, a feature common to β-tubulin (Sullivan, KF 1988; `` Structure and utilization of tubulin isoforms '' (Structure and utilization of tubulin isotypes) Ann Rev Ce
ll Biol 4: 687-716).
【0042】 異なる生物に由来するβ-チューブリンのアミノ酸配列は良く保存されており
、少なくとも63%の同一性を示す。(Oakley. B.R. 1994.「γ-チューブリン」(G
amma-tubulin) Hyams JS, Lloyd CW(編)「微小管」(Microtubules)中、Wiley-Li
ss, New York pp. 38-45)。表Iは、P. microsporaおよびP. ultimumのβ-チュ
ーブリンアミノ酸配列の、他の生物由来のβ-チューブリンとの同一性の割合を
示す。P. microspora由来のβ-チューブリンは、A. flavus、A. nidulans benA
およびN. crassaなどの糸状子嚢菌と最も高い同一性(93〜97%)を有し、単細胞
子嚢菌および卵菌とは低い同一性(73〜78%)を有する。真菌ではない生物に由来
するβ-チューブリンとの同一性も比較的低い(78〜85%)。これとは対照的に、P
. ultimum由来のβ-チューブリンは、2種の卵菌A. klebsianaおよびP. cinnamo
mi由来のβ-チューブリンとは最も高い同一性(96〜97%)を有するが、子嚢菌由
来のβ-チューブリンとは限られた同一性(71〜78%)を示すのみである。P. ulti
mum由来のβ-チューブリンはまた、らん藻(green algae)C. reinhardtii、原生
動物T thermophila、粘菌 Physarum polycephalumおよび多様な動物などの真菌
ではない生物由来のβ-チューブリンとは比較的高い同一性(86〜93%)を示す。The amino acid sequences of β-tubulin from different organisms are well conserved and show at least 63% identity. (Oakley. BR 1994. “γ-tubulin” (G
(amma-tubulin) Hyams JS, Lloyd CW (ed.) `` Microtubules '' (Microtubules), Wiley-Li
ss, New York pp. 38-45). Table I shows the percent identity of the β-tubulin amino acid sequences of P. microspora and P. ultimum with β-tubulin from other organisms. Β-tubulin from P. microspora is available from A. flavus, A. nidulans benA
And has the highest identity (93-97%) with filamentous ascomycetes such as N. crassa, and low identity (73-78%) with unicellular ascomycetes and oomycetes. The identity with β-tubulin from non-fungal organisms is also relatively low (78-85%). In contrast, P
ultimum-derived β-tubulin is composed of two oomycetes, A. klebsiana and P. cinnamo.
It has the highest identity (96-97%) with β-tubulin from mi, but shows only limited identity (71-78%) with β-tubulin from Ascomycetes. P. ulti
β-tubulin from mum is also relatively higher than β-tubulin from non-fungal organisms such as the green algae C. reinhardtii, the protozoan T thermophila, the slime mold Physarum polycephalum and various animals. Shows identity (86-93%).
【0043】実施例3:ゲノムDNAの抽出とサザン分析 β-チューブリンをコードする遺伝子の多様性により微小管のタキソール依存
特性が変化し得るので、サザン分析を利用してP. microspora Ne32およびP, ult
imumがβ-チューブリン遺伝子の1以上のコピーを有するか否かを調べた。 Example 3 Extraction of Genomic DNA and Southern Analysis The taxol-dependent properties of microtubules can be changed by the diversity of the gene encoding β-tubulin. , ult
It was determined whether imum had one or more copies of the β-tubulin gene.
【表1】 [Table 1]
【0044】 3日間増殖させたP. microspora Ne32またはP. ultimumの菌糸体を回収し、ゲ
ノムDNAをElu-Quik Hi-Volume Genomic キット(Schleicher Schuelle, Neene, N
H)を用いて単離した。5μgのゲノムDNAを37℃で4時間にわたり制限酵素で切断
し、0.8%アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター(Tropix, Bedford, M
A)へ移し、ぬれたフィルターをGS Gene Linker UVチャンバー(Biorad; Hercules
, CA)を用いて架橋させた。標準的な方法によりストリンジェントな条件下でサ
ザンブロット分析を行った(Sambrookら、1989.「分子クローニング、実験室マニ
ュアル」(Molecular Cloning. A laboratory Manual) Cold Spring Harbor Labo
ratory, Cold Spring Harbor, NY)。プライマーNETUB5とNETUB6によってP. micr
ospora β-チューブリンの413bpのPCR断片が作製され、一方プライマーWTIL-Uと
WTIL-Lによって、P. ultimum β-チューブリンの377bpのPCR断片が作製された。
PCR産物をゲル精製し、α-32P dCTPで、Ready-to-Goビーズ(Pharmacia, Piscata
way, NJ)を用いてランダムプライミングにより標識した。プローブをMicro Bio-
Spinカラム(Biorad)により精製した。The mycelium of P. microspora Ne32 or P. ultimum grown for 3 days was collected, and the genomic DNA was transferred to an Elu-Quik Hi-Volume Genomic kit (Schleicher Schuelle, Neene, N.
H). 5 μg of genomic DNA was cut with restriction enzymes at 37 ° C. for 4 hours, separated on a 0.8% agarose gel, and filtered with a nylon filter (Tropix, Bedford, M.D.).
A) and transfer the wet filter to the GS Gene Linker UV chamber (Biorad; Hercules
, CA). Southern blot analysis was performed under stringent conditions by standard methods (Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning. A laboratory Manual) Cold Spring Harbor Labo
ratory, Cold Spring Harbor, NY). P. micr by primers NETUB5 and NETUB6
A 413 bp PCR fragment of ospora β-tubulin was generated, while primer WTIL-U was used.
WTIL-L generated a 377 bp PCR fragment of P. ultimum β-tubulin.
The PCR products were gel purified, with α- 32 P dCTP, Ready-to -Go beads (Pharmacia, Piscata
way, NJ). Probe the Micro Bio-
Purification was performed using a Spin column (Biorad).
【0045】 P. microsporaにおいては、β-チューブリンプローブは、EcoRI、HindIIIまた
はSalIで消化したゲノムDNA由来の単一のバンドとハイブリダイズし、BamHIで消
化したサンプル由来の2種のバンドとハイブリダイズした。P. ultimumにおいて
は、β-チューブリンプローブは、BamHI、SalI、PvulまたはPstlで消化したゲノ
ムDNA由来の単一のバンドとハイブリダイズし、EcoRIで消化したサンプル由来の
2種のバンドとハイブリダイズした。これらの断片のサイズは、対応するcDNAク
ローンの制限エンドヌクレアーゼマップから予想されるものと一致する。β-チ
ューブリン遺伝子は一般的に保存性が高いので、これらの結果はP. microspora
とP. ultimumの双方がβ-チューブリン遺伝子の単一コピーを有することを示し
、これは、真菌類は一般に1または多くとも2、3のβ-チューブリン遺伝子を
有するというこれまでの報告と一致している:(Neffら、1983.「酵母からのβ-
チューブリン遺伝子の単離と、そのin vivoでの必須の機能の実証」(Isolation
of the β-tubulin gene from yeast and demonstration of its essential fun
ction in vivo) Cell 33:211-219; Hiraokaら、1984.「分裂酵母のNDA3遺伝子は
β-tubulinをコードする:低温感受性nda3変異は、紡錘体形成と有糸分裂におけ
る染色体の移動を可逆的にブロックする」(The NDA3 gene of fission yeast en
codes β-tubulin: a cold sensitive nda3 mutation reversibly blocks spind
le formation and chromosome movement in mitosis) Cell 39:349-358; Orbach
ら、1986.「Neurospora crassaベノミル耐性変異体由来のβ-チューブリン遺伝
子のクローニングと特性決定およびその優性選択マーカーとしての使用」(Cloni
ng and characterization of the gene for β-tubulin from a benomyl-resist
ant mutant of Neurospora crassa and its use as a dominant selectable mar
ker) Mol Cell Biol 6:2452-2461; Cameronら、1990.「protoctist由来のβ-チ
ューブリン遺伝子のクローニングと分析」(Cloning and analysis of β-tubuli
n gene from a protoctist) J Biol Chem 265: 15245-15252;およびWeerakoonら
、1998. Mycologia 90:85-95; Mayら、1987.「Aspergillus nidulansのβ-チュ
ーブリン遺伝子は通常多様化している」(Aspergillus nidulans β-tubulin ge
nes are usually divergent) Gene 55:231-243; Panaccioneら、1988.「同種ま
たは異種ベノミル耐性遺伝子で形質転換されたColletotrichum graminicolaは、
予想されるトウモロコシ(corn)に対する病原性を保持する」(Colletotrichum gr
aminicola transformed with homologous and heterologous benomyl-resistanc
e genes retains expected pathogenicity to corn) Mol Plant Microbe Intera
ct 1 :113-120;およびGoldmanら、1993.「Trichoderma virideのβ-チューブリ
ン遺伝子の1つにおけるヌクレオチド置換は、抗細胞分裂薬剤であるメチルベン
ズイミダゾール-2-イル-カルバメートに対する耐性を付与する」(A nucleotide
substitution in one of the β-tubulin genes of Trichoderma viride confer
s resistance to the antimitotic drug methyl benzimidazole-2-yl-carbamate
) Mol Gen Genet 240,73-80)。P. microsporaおよびP. ultimumはβ-チューブリ
ン遺伝子の単一のコピーのみを有するという事実は、それが生物のタキソールに
対する感受性または耐性の性質の原因となっていることを示す。In P. microspora, the β-tubulin probe hybridized with a single band from genomic DNA digested with EcoRI, HindIII or SalI, and hybridized with two bands from a sample digested with BamHI. Soy. In P. ultimum, the β-tubulin probe hybridized with a single band from genomic DNA digested with BamHI, SalI, Pvul or Pstl, and hybridized with two bands from a sample digested with EcoRI. did. The size of these fragments is consistent with that expected from the restriction endonuclease map of the corresponding cDNA clone. Since the β-tubulin gene is generally highly conserved, these results
And P. ultimum both have a single copy of the β-tubulin gene, indicating that fungi generally have one or at most a few β-tubulin genes. Consistent: (Neff et al., 1983. "β-
Isolation of the tubulin gene and demonstration of its essential function in vivo '' (Isolation
of the β-tubulin gene from yeast and demonstration of its essential fun
Cell 33: 211-219; Hiraoka et al., 1984. "The NDA3 gene in fission yeast encodes β-tubulin: cold-sensitive nda3 mutations reversibly shift chromosomes during spindle formation and mitosis. (The NDA3 gene of fission yeast en
codes β-tubulin: a cold sensitive nda3 mutation reversibly blocks spind
le formation and chromosome movement in mitosis) Cell 39: 349-358; Orbach
1986. "Cloning and characterization of the β-tubulin gene from a Neurospora crassa benomyl-resistant mutant and its use as a dominant selectable marker" (Cloni
ng and characterization of the gene for β-tubulin from a benomyl-resist
ant mutant of Neurospora crassa and its use as a dominant selectable mar
ker) Mol Cell Biol 6: 2452-2461; Cameron et al., 1990.``Cloning and analysis of β-tubulin gene from protoctist '' (Cloning and analysis of β-tubuli
n Gene from a protoctist) J Biol Chem 265: 15245-15252; and Weerakoon et al., 1998. Mycologia 90: 85-95; May et al., 1987. "The β-tubulin gene of Aspergillus nidulans is usually diversified." Aspergillus nidulans β-tubulin ge
nes are usually divergent) Gene 55: 231-243; Panaccione et al., 1988; `` Colletotrichum graminicola transformed with a homologous or heterologous benomyl resistance gene,
Retains expected pathogenicity to corn '' (Colletotrichum gr
aminicola transformed with homologous and heterologous benomyl-resistanc
e genes retains expected pathogenicity to corn) Mol Plant Microbe Intera
ct 1: 113-120; and Goldman et al., 1993. "A nucleotide substitution in one of the β-tubulin genes of Trichoderma viride confers resistance to the anti-mitotic agent methylbenzimidazol-2-yl-carbamate. (A nucleotide
substitution in one of the β-tubulin genes of Trichoderma viride confer
s resistance to the antimitotic drug methyl benzimidazole-2-yl-carbamate
) Mol Gen Genet 240, 73-80). The fact that P. microspora and P. ultimum have only a single copy of the β-tubulin gene indicates that it accounts for the sensitive or resistant nature of the organism to taxol.
【0046】実施例4:mRNAの単離とノーザン分析 ノーザンおよびPCR分析により、チューブリンmRNAのP. microspora Ne32およ
びP. ultimumにおける発現レベルを調べた。 Example 4 mRNA Isolation and Northern Analysis The expression level of tubulin mRNA in P. microspora Ne32 and P. ultimum was examined by Northern and PCR analysis.
【0047】 P. ultimumまたはP. microsporaの4個の寒天プラグを40 mlのFM1培地(1Lの
培地あたり5gのソイトン、5gのデキストロース、20gスクロースおよび1gの酵
母エキス)または改変M1D (Liら、1998. Mycol Res 102:461-464)それぞれに接種
し、24℃で250 mlのエルレンマイヤーフラスコ中で振とうさせずに増殖させた。
菌糸体を回収し、Whatman濾紙でブロットして乾燥させた。1gの菌糸体を液体窒
素の存在下で、乳鉢と乳棒を用いて粉砕して粉末とした。粉末を10 mlのTrizol
(GibcoBRL)を含むDounceホモジナイザーに移し、均質化した。全RNAを製造者の
指示に従って単離した。全RNAを炭酸ジエチル処理水に室温で溶解させ、-80℃で
保存した。ノーザンブロットを、標準的な方法によりストリンジェントな条件で
行った(Sambrookら、1989.「分子クローニング:実験室マニュアル」(Molecular
Cloning: A laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spri
ng Harbor, NY)。Four agar plugs of P. ultimum or P. microspora were added to 40 ml of FM1 medium (5 g soytone, 5 g dextrose, 20 g sucrose and 1 g yeast extract per 1 L medium) or modified M1D (Li et al., 1998. Mycol Res 102: 461-464), and grown without shaking in 250 ml Erlenmeyer flasks at 24 ° C.
Mycelium was harvested, blotted on Whatman filter paper and dried. 1 g of mycelium was ground using a mortar and pestle in the presence of liquid nitrogen to obtain a powder. Add 10 ml of Trizol to powder
(GibcoBRL) was transferred to a Dounce homogenizer and homogenized. Total RNA was isolated according to the manufacturer's instructions. Total RNA was dissolved in diethyl carbonate-treated water at room temperature and stored at -80 ° C. Northern blots were performed under stringent conditions by standard methods (Sambrook et al., 1989. Molecular cloning: laboratory manual) (Molecular
Cloning: A laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spri
ng Harbor, NY).
【0048】 ノーザン分析により、P. microspora中のβ-チューブリン転写産物のレベルは
非常に低いことが判明した(データ示さず)。故に、2、5、6、または11日間増
殖させた菌糸体由来の全RNAをcDNAへ変換し、PCR反応でテンプレートとして用い
た。遺伝子特異的プライマーNETUB5およびNETUB6を用いたところ、対数期(2、
5および6日)または定常期(11日)の増殖した菌糸体から413 bpのβ-チューブリ
ンcDNA断片が増幅されたが、テンプレートを含まない対照の反応からは増幅され
なかった。[0048] Northern analysis revealed that levels of β-tubulin transcript in P. microspora were very low (data not shown). Therefore, total RNA from mycelium grown for 2, 5, 6, or 11 days was converted to cDNA and used as a template in a PCR reaction. Using the gene-specific primers NETUB5 and NETUB6, the logarithmic phase (2,
A 413 bp β-tubulin cDNA fragment was amplified from the growing mycelium in the stationary phase (day 5 and 6) or stationary phase (day 11), but not from the template-free control reactions.
【0049】 P. ultimumにおいては全RNAを、2、4、6、7、8および10日間増殖させた
菌糸体から単離し、ノーザン分析に使用した。β-チューブリンプローブを1.5お
よび1.6 kbの2種の転写産物とハイブリダイズしたが、これは単離された2種の
cDNAのサイズと一致している。1.6 kbの転写産物はより多数存在した。In P. ultimum, total RNA was isolated from mycelium grown for 2, 4, 6, 7, 8 and 10 days and used for Northern analysis. The β-tubulin probe hybridized with two transcripts of 1.5 and 1.6 kb, which were the two isolated transcripts.
It matches the size of the cDNA. The 1.6 kb transcript was more numerous.
【0050】実施例5:[3H]タキソールの真菌細胞への結合 動物系においては、[3H]タキソールの非処理細胞への結合を使用して、タキソ
ールと微小管との相互作用が特性決定されている(Manfrediら、1982.「タキソー
ルは細胞微小管に結合する」(taxol binds to cellular microtubules) J Cell
Biol 94:688-696)。P. microsporaおよびP. ultimumの異なるタキソール感受性
がそれらの微小管のタキソール結合特性と相関するか否かを調べるため、本発明
者らはこれらの真菌細胞の[3H]タキソールへの特異的結合能力を調べた。[3H]タ
キソールの真菌細胞への全結合は、微小管への特異的結合と他の細胞構造への非
特異的結合からなる。[3H]タキソールの真菌細胞への結合により、100倍過剰の
非標識タキソールの存在下または不在下での全結合および非特異的結合の値を測
定した。続いて[3H]タキソールの特異的結合を、全結合量と非特異的結合量との
差として計算した。[0050] Example 5: [3 H] in the binding animal systems to fungal cells of Taxol, [3 H] using binding to untreated cells of taxol, interaction of taxol and microtubules characteristics (Manfredi et al., 1982; taxol binds to cellular microtubules) J Cell
Biol 94: 688-696). Since P. microspora and P. ultimum different taxol susceptible investigate whether correlated with taxol binding properties of these microtubules, specific binding of the present inventors to [3 H] taxol these fungal cells The ability was checked. Total binding of [ 3 H] taxol to fungal cells consists of specific binding to microtubules and non-specific binding to other cellular structures. By binding to [3 H] Taxol fungal cells were measured total binding and the value for nonspecific binding in the presence or absence of 100-fold excess of unlabeled taxol. Subsequently, the specific binding of [ 3 H] taxol was calculated as the difference between the total binding and the non-specific binding.
【0051】 新たに調製したP. microspora Ne32,およびP. ultintum由来の菌糸体を、Roux
ボトル中の140 mlの改変M1Dで、24℃で1〜2日間増殖させた。これらの活発に
増殖中の菌糸体を、50 mlコニカルチューブに移し、7,000 rpmで5分間、室温で
遠心分離した。菌糸体を1mlの残存M1D培地と1mlの新たに調製したMID培地に懸
濁した。細胞は、処理しないか、または抗細胞分裂薬物であるチアベンダゾール
で前処理して微小管を脱集合させるかのいずれかとした。前処理した細胞におい
ては、チアベンダゾール (DMSO中)を所望の濃度で添加し、DMSOが全てのサンプ
ルにおいて同じ濃度となるよう調整した。続いてサンプルを室温で3時間インキ
ュベートした。次いで、[3H]タキソール(3.7×107 Bq/ml、Moravek)を所望の濃
度で、100-倍過剰の非標識タキソールの存在下または不在下のいずれかで添加し
た。サンプルを2時間室温でインキュベートし、次いで氷上で急冷した。[3H]タ
キソールのP. microspora細胞への結合は、細胞膜を破壊するためにO.l%(v/v)
Triton X-1OOの存在下で行った。The newly prepared mycelium from P. microspora Ne32 and P. ultintum were
Grow in a bottle with 140 ml of modified M1D at 24 ° C. for 1-2 days. These actively growing mycelium were transferred to a 50 ml conical tube and centrifuged at 7,000 rpm for 5 minutes at room temperature. The mycelium was suspended in 1 ml of residual M1D medium and 1 ml of freshly prepared MID medium. Cells were either untreated or pre-treated with the anti-mitotic drug thiabendazole to disassociate microtubules. For pretreated cells, thiabendazole (in DMSO) was added at the desired concentration and adjusted to the same concentration of DMSO in all samples. The samples were subsequently incubated at room temperature for 3 hours. [ 3 H] taxol (3.7 × 10 7 Bq / ml, Moravek) was then added at the desired concentration, either in the presence or absence of a 100-fold excess of unlabeled taxol. The samples were incubated for 2 hours at room temperature and then quenched on ice. [ 3 H] Taxol binding to P. microspora cells requires Ol% (v / v) to disrupt cell membranes.
Performed in the presence of Triton X-1OO.
【0052】 各GFCフィルター(Whatman; Clifion, NJ)の重さを、分析用天秤を用いて測定
した。P. ultimumについては、菌糸体は、3-ピースフィルター濾紙(Whatman)で
保持したGFCフィルター上にコニカルチューブから移した。コニカルチューブを1
0 mlのMilliQ水(Millipore, Inc.; Bedford, ・MA)で3回洗浄した。GFCフィルタ
ー上の菌糸体を、120 mlのMilliQ水で洗浄した。P. microsporaについては、菌
糸体は5,000 rpmで5分間室温で遠心して回収し、40 mlのMilliQ水で3回洗浄し
た。菌糸体をGFCフィルター上に移して、5mlのMilliQ水でコニカルチューブを
すすいだ後、残りの菌糸体と合わせた。GFCフィルターを一晩、オーブン中、80
℃で乾燥させ、続いて重さを計り、菌糸体の乾燥重量を求めた。フィルターを5
分間、20 mlのCytoscint(Fisher Scientific; Pittsburgh, PA)の下でBeckman L
S3801シンチレーションカウンター中で計数した。特異的結合を、100倍過剰非標
識タキソールの存在下および不在下で結合した[3H]タキソールの差として計算し
た。非特異的結合は、100-倍過剰非標識タキソールの存在下での結合として測定
した。The weight of each GFC filter (Whatman; Clifion, NJ) was measured using an analytical balance. For P. ultimum, the mycelium was transferred from the conical tube onto a GFC filter held by 3-piece filter paper (Whatman). 1 conical tube
Washed three times with 0 ml MilliQ water (Millipore, Inc .; Bedford, MA). The mycelium on the GFC filter was washed with 120 ml of MilliQ water. For P. microspora, mycelia were harvested by centrifugation at 5,000 rpm for 5 minutes at room temperature and washed three times with 40 ml of MilliQ water. The mycelium was transferred to a GFC filter, and the conical tube was rinsed with 5 ml of MilliQ water, and then combined with the remaining mycelium. GFC filter overnight in oven, 80
C. and then weighed to determine the dry weight of mycelium. Filter 5
Beckman L under 20 ml Cytoscint (Fisher Scientific; Pittsburgh, PA)
Counted in an S3801 scintillation counter. Specific binding in the presence of 100-fold excess unlabeled taxol and bound in the absence [3 H] was calculated as the difference of taxol. Non-specific binding was measured as binding in the presence of a 100-fold excess of unlabeled taxol.
【0053】 [3H]タキソールは、P. ultimum細胞に特異的に結合し、特異的結合の量は[3H]
タキソール濃度の関数として増加することが見出された(図7A)。さらに、チアベ
ンダゾールで前処理し集合微小管の量を減少させた細胞においては、[3H]タキソ
ールの特異的結合は量に依存して減少した(図7B)。事実、1mMのチアベンダゾー
ルの処理により、完全に[3H]タキソールの特異的結合を消滅させた。これらの結
果は、タキソールがP. ultimumの微小管と相互作用し得ることを示し、これはこ
の生物がタキソール感受性であることと一致している。[ 3 H] taxol specifically binds to P. ultimum cells and the amount of specific binding is [ 3 H]
It was found to increase as a function of taxol concentration (FIG. 7A). Furthermore, in cells pretreated with thiabendazole to reduce the amount of assembled microtubules, specific binding of [ 3 H] taxol was reduced in a dose-dependent manner (FIG. 7B). In fact, treatment with 1 mM thiabendazole completely abolished the specific binding of [ 3 H] taxol. These results indicate that taxol can interact with microtubules in P. ultimum, which is consistent with the organism being taxol-sensitive.
【0054】 その一方で、最初の実験では非常に少ない量でのP. microsporaに対する[3H]
タキソールの特異的結合が判明した(データ示さず)。この結果は、タキソールと
P. microspora微小管との間の相互作用が不十分だったことによるか、あるいは[ 3 H]タキソールの細胞内蓄積を防ぐ膜バリアによるものと考えられる。動物細胞
においては、タキソールは、その疎水性の特徴による拡散によって、細胞膜を通
過する(Manfrediら、1982. J Cell Biol 94:688-696)。いくつかの場合には、タ
キソールに対する耐性は膜局在化ポンプであって薬物の流出を引き起こすP-糖タ
ンパク質に関連していた(Jachezら、1993 .「複数薬剤耐性細胞のシクロスポリ
ンSDZ PSC 833およびシクロペプチドSDZ 280-446によるタキソール感受性の回復
」(Restoration of taxol sensitivity of multi drug-registant by the cyclo
sporine SDZ PSC 833およびthe cyclopeptide SDZ 280-446) J Natl Cancer Ins
t 85:478-483))。P. microsporaがこのような系を有するか否かについて、入手
し得る情報は存在しない。動物細胞の非イオン性界面活性剤、例えばO.1%(v/v)
NP-40またはTriton X-1OOなどによる処理によって、細胞膜が破壊され、集合し
ていないチューブリンを含む可溶性タンパク質のほとんどが放出されるが、集合
した微小管はそのままの状態であることが示されている(Schliwaら、1981,「界
面活性剤により開かれた細胞における細胞質部分の物質の安定化、およびその組
成物の構造的および生物学的分析」(Stabilization of the cytoplasmic ground
substance in detergent-opened cell and a structural and biochemical ana
lysis of its composition) Proc Natl Acad Sci USA 78:4329-4333; Duerrら、
1981.「細胞質微小管のin situでの分子的分析:遍在的および特異的タンパク質
双方の同定」(Molecular analysis of cytoplasmic microtubules in situ: ide
ntification of both widespread and specific proteins) Cell 24:203-222; M
anfrediら、1982. J Cell Biol 94:688-696)。膜バリアが低い特異的結合率の原
因であるか否かを評価するため、Triton X-lOOの存在下における[3H]タキソール
のP. microspora細胞への結合を行った。Triton X-1OO (O.l%(v/v))で処理した
P. microspora細胞は、全く無いかまたは非常に少ない[3H]タキソールの特異的
結合から75 nMまでの[3H]タキソールで示した(図7A)。さらに、チアベンダゾー
ルで前処理した細胞もまた、Triton X-100の存在下では[3H]タキソールの特異的
結合を全く示さなかった(データ示さず)。これらの結果は、タキソールはP. mic
rosporaの微小管と相互作用し得ないか、またはわずかに相互作用するのみであ
ることを示し、これはこの生物がタキソール耐性であるという事実と一致してい
る。要約すると、[3H]タキソールの結合の結果は、これらの生物中のβ-チュー
ブリンの性質が、特異のタキソール感受性を決定することを示す。On the other hand, in the first experiment, very small amounts of P. microsporaThreeH]
Specific binding of taxol was found (data not shown). This result shows that taxol and
Either due to poor interaction with P. microspora microtubules, or [ Three This is probably due to a membrane barrier that prevents the accumulation of [H] taxol in cells. Animal cells
In this case, taxol crosses the cell membrane by diffusion due to its hydrophobic character.
(Manfredi et al., 1982. J Cell Biol 94: 688-696). In some cases,
Resistance to xol is a membrane-localized pump that causes drug efflux
(Jachez et al., 1993.
Of Taxol Sensitivity by Induced SDZ PSC 833 and Cyclopeptide SDZ 280-446
(Restoration of taxol sensitivity of multi drug-registant by the cyclo
sporine SDZ PSC 833 and the cyclopeptide SDZ 280-446) J Natl Cancer Ins
t 85: 478-483)). Obtain whether P. microspora has such a system
There is no information available. Non-ionic detergents for animal cells, eg 0.1% (v / v)
Treatment with NP-40 or Triton X-1OO destroys cell membranes and causes
Most of the soluble proteins, including tubulin, are released but not assembled
Microtubules have been shown to be intact (Schliwa et al., 1981, ed.
Stabilization of cytoplasmic material in cells opened by surfactants, and sets thereof
Stabilization of the cytoplasmic ground ''
substance in detergent-opened cell and a structural and biochemical ana
lysis of its composition) Proc Natl Acad Sci USA 78: 4329-4333; Duerr et al.,
1981. "In situ molecular analysis of cytoplasmic microtubules: ubiquitous and specific proteins"
(Molecular analysis of cytoplasmic microtubules in situ: ide
ntification of both widespread and specific proteins) Cell 24: 203-222; M
anfredi et al., 1982. J Cell Biol 94: 688-696). Source of low specific binding rate due to low membrane barrier
In the presence of Triton X-lOO to assess whetherThreeH] Taxol
Was bound to P. microspora cells. Treated with Triton X-1OO (O.l% (v / v))
P. microspora cells have no or very few [ThreeH] Taxol specific
From binding to 75 nM [ThreeH] Taxol (FIG. 7A). In addition, cheabendazo
Pretreated with Triton X-100ThreeH] Taxol specific
No binding was shown (data not shown). These results indicate that taxol is P. mic
cannot or only slightly interacts with the microtubules of rospora
This is consistent with the fact that this organism is taxol resistant.
You. In summary,[ThreeThe result of binding of [H] taxol is
Shows that the nature of Brin determines the specific taxol sensitivity.
【0055】 タキソールは、集合したMTにおいてβ-チューブリンに結合することによりMT
を安定化させるが、その結合部位は光架橋(photo cross-linking)電子結晶解析
および突然変異誘発法により特性決定されている。アミノ酸1〜31間の領域、お
よび217〜231間の領域はタキソールのC-3'およびC-2基にそれぞれ架橋すること
が判明した(Raoら、1994. J Biol Chem 269:3132-3134;およびRaoら、1995. J B
iol Chem 270:20235-20238)。近年、β-チューブリンダイマーの構造が、亜鉛誘
導したチューブリンダイマーのシートの電子結晶解析により解析された(Nogales
ら、1998. Nature 391 : 199-203)。タキソールのこの構造への結合のモデリン
グにより、タキソールのC-3'基はβ-チューブリンのアミノ酸15〜25付近(へリッ
クスHlの頂点付近)にあり、またC-2基はアミノ酸212〜222付近(へリックスH6お
よびH6〜H7間のループ付近)にあることが示された。架橋と電子結晶解析の双方
での研究においてアミノ酸15〜25および217〜222が同定されたことは、これらの
領域がタキソール結合に関して重要であることを示す。さらに、電子結晶解析モ
デルもまた、ウシβ-チューブリンのLeu273(M-ループ中に位置)がタキソールの
タキサン環に接触することを示す(Nogalesら、1998. Nature 391 : 199-203)。
さらに、ヒト卵巣細胞においてβ-チューブリンのM40イソ型におけるPhe270また
はAla364での変異により、タキソール耐性が生じる(Giannakakouら、1997. J Bi
ol Chem 272: 17118-17125)。Taxol binds to β-tubulin in assembled MT by
, But its binding site has been characterized by photocross-linking electron crystallography and mutagenesis. The region between amino acids 1-31 and the region between 217-231 were found to crosslink to the C-3 'and C-2 groups of taxol, respectively (Rao et al., 1994. J Biol Chem 269: 3132-3134; And Rao et al., 1995. JB
iol Chem 270: 20235-20238). Recently, the structure of β-tubulin dimer has been analyzed by electron crystallography of zinc-derived tubulin dimer sheets (Nogales
Et al., 1998. Nature 391: 199-203). By modeling the binding of taxol to this structure, the C-3 ′ group of taxol is near amino acids 15-25 of β-tubulin (near the apex of helix H1) and the C-2 group is amino acids 212-222. Near the helix (around the helix H6 and the loop between H6 and H7). The identification of amino acids 15-25 and 217-222 in both cross-linking and electron crystallographic studies indicates that these regions are important for taxol binding. In addition, electron crystallographic models also show that Leu273 of bovine β-tubulin (located in the M-loop) contacts the taxane ring of taxol (Nogales et al., 1998. Nature 391: 199-203).
Furthermore, mutations in human ovary cells at Phe270 or Ala364 in the M40 isoform of β-tubulin result in taxol resistance (Giannakakou et al., 1997.
ol Chem 272: 17118-17125).
【0056】 アミノ酸270、273および364(図6において#で表示)は図6に列挙した真菌β-
チューブリン間では変化していないので、これらの生物における特異のタキソー
ル応答の原因ではない。しかしながら、タキソール耐性またはタキソール感受性
である生物のβ-チューブリンのアミノ酸1〜31および212〜231(それぞれタキソ
ール結合領域IおよびIIと定義する)を比較することにより、タキソール相互
作用に関して重要である残基が判明した。図8は、下記の動物に対するタキソー
ル結合領域Iおよびタキソール結合領域IIのアミノ酸配列の比較を示す。ブタ(
I、配列番号34; II、配列番号35)、ヒトβ2(I、配列番号36; II、
配列番号37)、ショウジョウバエβ1(I、配列番号38; II、配列番号39)
、アフリカツメガエルβ4 (I、配列番号40; II、配列番号41)、テトラヒ
メナ(I、配列番号42; II、配列番号43)、Physarum βl (I、配列番号4
4; II、配列番号45)、P. ultimum(I、配列番号46; II、配列番号47
)、P. cinnamomi(I、配列番号48; II、配列番号49)、A. klebsiana(I、
配列番号50; II、配列番号51)、P. microspora(I、配列番号52; II
、配列番号53)、A. nidulans benA(I、配列番号54; II、配列番号55)
、およびS. cerevisiae(I、配列番号56; II、配列番号57)。Amino acids 270, 273 and 364 (indicated by # in FIG. 6) correspond to the fungal β-types listed in FIG.
As it does not vary between tubulins, it is not responsible for the specific taxol response in these organisms. However, by comparing amino acids 1-31 and 212-231 (defined as taxol binding regions I and II, respectively) of β-tubulin in taxol-resistant or taxol-sensitive organisms, the residuals of taxol interaction are significant. The group turned out. FIG. 8 shows a comparison of the amino acid sequences of taxol binding region I and taxol binding region II for the following animals. pig(
I, SEQ ID NO: 34; II, SEQ ID NO: 35), human β2 (I, SEQ ID NO: 36; II,
SEQ ID NO: 37), Drosophila β1 (I, SEQ ID NO: 38; II, SEQ ID NO: 39)
, Xenopus β4 (I, SEQ ID NO: 40; II, SEQ ID NO: 41), Tetrahymena (I, SEQ ID NO: 42; II, SEQ ID NO: 43), Physarum βl (I, SEQ ID NO: 4)
4; II, SEQ ID NO: 45), P. ultimum (I, SEQ ID NO: 46; II, SEQ ID NO: 47)
), P. cinnamomi (I, SEQ ID NO: 48; II, SEQ ID NO: 49), A. klebsiana (I,
SEQ ID NO: 50; II, SEQ ID NO: 51), P. microspora (I, SEQ ID NO: 52; II
, SEQ ID NO: 53), A. nidulans benA (I, SEQ ID NO: 54; II, SEQ ID NO: 55)
And S. cerevisiae (I, SEQ ID NO: 56; II, SEQ ID NO: 57).
【0057】 タキソール感受性生物、例えばヒト、ブタ、ショウジョウバエ、アフリカツメ
ガエル、テトラヒメナおよびPhysarum由来のβ-チューブリンは、タキソール結
合領域IおよびIIにおいて非常に保存されており、かつアミノ酸15〜25および
217〜222(ショウジョウバエβlのアミノ酸23での保存的置換を除く)の間で同一
である。P. ultimum由来のβ-チューブリンは、上記の配列と比較して4ヶ所の
置換を示すのみであるが、それらのいずれもがアミノ酸l5〜25および217〜222の
間で生じたものではない。この類似性は、P. ultimumが、上記の動物の生物と同
様にタキソール感受性であるという事実と一致する。同様にこれと符合して、こ
れまでの動物チューブリンの生化学的研究、および本明細書で実証された[3H]タ
キソールのP. ultimumへの結合データ(図7Aおよび7B)は、タキソールがこれらの
生物の集合したMT中のβ-チューブリンに結合すること示している(Kelloggら、1
989. J Cell Biol 109:2977-2991;ならびにManfredi, J.J.およびHorwitz, S.B,
1984. Pharmacol Ther 25:83-125)。P. ultimumおよびA. klebsiana由来のβ-
チューブリン配列は、タキソール結合領域IおよびIIにおいて、アミノ酸219
を除いて同一であるが、A. klebsianaはタキソールに対して比較的耐性である(I
C50> 11.7μM)。この感受性の減少は、部分的には、A. klebsianaがアミノ酸219
でアスパラギンを含むが、P. ultimumおよびタキソール感受性生物由来に由来す
る他の6種のβ-チューブリンはトレオニンを含むという事実によるものである
。Taxol-sensitive organisms, such as β-tubulin from humans, pigs, Drosophila, Xenopus, Tetrahymena and Physarum, are highly conserved in Taxol binding regions I and II and have amino acids 15-25 and
217-222 (except for a conservative substitution of Drosophila βl at amino acid 23). Β-tubulin from P. ultimum shows only four substitutions compared to the above sequence, but none of them occurred between amino acids 15-25 and 217-222 . This similarity is consistent with the fact that P. ultimum is as taxol-sensitive as the animal organisms described above. Similarly, in agreement with previous biochemical studies of animal tubulin, and the binding data of [ 3 H] taxol to P. ultimum demonstrated herein (FIGS. 7A and 7B), Bind to β-tubulin in the assembled MT of these organisms (Kellogg et al., 1).
989.J Cell Biol 109: 2977-2991; and Manfredi, JJ and Horwitz, SB,
1984. Pharmacol Ther 25: 83-125). Β- from P. ultimum and A. klebsiana
The tubulin sequence contains amino acids 219 in Taxol binding regions I and II.
A. klebsiana is relatively resistant to taxol (I
C 50 > 11.7 μM). This reduction in sensitivity is due, in part, to the fact that A.
And six other β-tubulins derived from P. ultimum and taxol-sensitive organisms contain threonine.
【0058】 タキソール耐性生物、例えばP. microspora、A. nidulansおよびS. cerevisia
eに由来するβ-チューブリンは、タキソール結合領域IおよびII内で互いに類
似しているが、領域15〜25および217〜222内の7つの位置(19、22、23、25、218
、219および221)中で上述の配列のみが異なっている。本明細書中に示す[3H]タ
キソール結合データ(図7Aおよび7B)は、以前の生化学的研究(Yoon, Y.およびOak
ley, B.R. 1995. Biochem 34:6373-6381;ならびにBamesら、1992. Mol Biol Cel
l 3:29-47)とともに、これらの生物の集合したMT中のβ-チューブリンが、タキ
ソールに効率的に結合できないことを示している。これらの配列は、A. klebsia
naで見られるようにアミノ酸219でアスパラギン(または、S. cerevisiaeの場合
グルタミン)を含み、この置換が部分的ではあるがこれらの真菌におけるタキソ
ール感受性の減少に寄与しているのである。電荷および極性の変化に関与する他
の置換、例えば、Lys19からAlaへの置換、Glu22からGlnへの置換、およびVal23
からThrへの置換もまた、これらの生物のタキソール耐性表現型に寄与する。Taxol-resistant organisms such as P. microspora, A. nidulans and S. cerevisia
β-tubulin from e is similar to each other in taxol binding regions I and II, but at seven positions (19, 22, 23, 25, 218) in regions 15-25 and 217-222.
, 219 and 221) differ only in the above sequences. [ 3 H] taxol binding data presented herein (FIGS. 7A and 7B) were obtained from previous biochemical studies (Yoon, Y. and Oak
ley, BR 1995. Biochem 34: 6373-6381; and Bames et al., 1992. Mol Biol Cel.
l 3: 29-47) show that β-tubulin in the assembled MT of these organisms cannot bind to taxol efficiently. These sequences are from A. klebsia
It contains asparagine (or glutamine in the case of S. cerevisiae) at amino acid 219 as found in na, and this substitution contributes, though partially, to reduced taxol sensitivity in these fungi. Other substitutions involved in changes in charge and polarity, such as Lys19 to Ala, Glu22 to Gln, and Val23
The substitution of Thr for Thr also contributes to the taxol-resistant phenotype of these organisms.
【0059】 以上の結果は、アミノ酸219におけるトレオニンを含む多数の残基が、β-チュ
ーブリンのタキソールへの結合に重要であることを示している。特に、アミノ酸
219はβ-チューブリンのタキソール結合特性の決定に、またその帰結として細胞
のタキソール感受性の決定に重要な役割を果たしている。タキソール感受性種に
由来するβ-チューブリンはThr219(アミノ酸219のトレオニン)を有し、一方でタ
キソール耐性種由来のものはAsn219(アミノ酸219のアスパラギン)またはGlu219(
アミノ酸219のグルタミン)を有する。P. cinnamomiのタキソール感受性は、以前
にWeerakoonらによって報告されたように、TUBB-pc(配列番号6)中のThr219が存
在しAsn219ではないことと一致している。P. microsporaにおいて見られるAsn21
9(アミノ酸219のアスパラギン)の存在は、この種のタキソール耐性と一致してい
る。β-チューブリンにおけるアミノ酸219のトレオニンの存在がタキソール結合
およびタキソール感受性に対応するという情報を用いると、タキソールとβ-チ
ューブリンとの相互作用を模倣する、タキソール類似体または他の化合物を設計
できる。さらに、同様にこのような情報を使用して、タキソール耐性の変異型β
-チューブリンを、アミノ酸219でトレオニンを別のアミノ酸残基に置換すること
により作製できる。The above results indicate that a number of residues including threonine at amino acid 219 are important for β-tubulin binding to taxol. In particular, amino acids
219 plays an important role in determining the taxol binding properties of β-tubulin and, consequently, in determining taxol sensitivity of cells. Β-tubulin from taxol-sensitive species has Thr219 (threonine at amino acid 219), while those from taxol-resistant species have Asn219 (asparagine at amino acid 219) or Glu219 (
Glutamine at amino acid 219). Taxol sensitivity of P. cinnamomi is consistent with the presence of Thr219 and not Asn219 in TUBB-pc (SEQ ID NO: 6), as previously reported by Weerakoon et al. Asn21 found in P. microspora
The presence of 9 (asparagine at amino acid 219) is consistent with this type of taxol resistance. With the information that the presence of threonine at amino acid 219 in β-tubulin corresponds to taxol binding and taxol sensitivity, taxol analogs or other compounds can be designed that mimic the interaction between taxol and β-tubulin . In addition, such information can also be used to make taxol-resistant mutant β
-Tubulin can be made by replacing threonine with another amino acid residue at amino acid 219.
【0060】実施例6:微小管脱集合薬物に対する感受性 数種類のMT-脱集合薬物が、P. microspora Ne32、P. ultimumおよびA. klebsi
anaの増殖に及ぼす影響を調べた。これらの薬物の例には、コルヒチン、コルセ
ミド(コルヒチンの誘導体)および2種のベンズイミダゾール薬物であるノコダゾ
ールおよびチアベンダゾールが含まれる。 Example 6: Sensitivity to Microtubule Disassembly Drugs Several MT-disassembly drugs are identified as P. microspora Ne32, P. ultimum and A. klebsi.
The effects on ana growth were investigated. Examples of these drugs include colchicine, colcemide (a derivative of colchicine) and the two benzimidazole drugs nocodazole and thiabendazole.
【0061】 コルヒチン、コルセミド、ノコダゾールおよびチアベンダゾールは、Sigma Ch
emical Company (St. Louis, MO)より入手した。コルヒチンのストック溶液を水
を用いて調製し、また他のストック溶液をDMSOを用いて調製した。新たに調製し
た菌糸体の寒天プラグ(直径6 mm)を、抗微小管剤の存在下または不在下で、1%
(vlv)のDMSOを含むPDAプレートに移した。真菌コロニーを24℃で、P. ullimumの
場合は24時間にわたり、またP. microsporaおよびA. klebsianaの場合は48時間
にわたり増殖させた。これらの抗細胞分裂剤の増殖阻害作用はコロニーの直径で
測定した。[0061] Colchicine, colcemide, nocodazole and thiabendazole are available from Sigma Ch.
Emical Company (St. Louis, MO). A stock solution of colchicine was prepared using water and other stock solutions were prepared using DMSO. Insert freshly prepared mycelial agar plugs (6 mm diameter) in the presence or absence of anti-microtubule agents with 1%
(vlv) transferred to a PDA plate containing DMSO. Fungal colonies were grown at 24 ° C. for 24 hours for P. ullimum and 48 hours for P. microspora and A. klebsiana. The growth inhibitory effect of these anti-mitotic agents was measured by colony diameter.
【0062】 生化学的および遺伝的証明により、これらの薬物が、チューブリンダイマー中
のβ-チューブリンに結合し、そしてMT脱集合を引き起こすことが示されている(
Davidse, L.C.およびFlach, W. 1978.「チアベンダゾールの真菌チューブリンと
の相互作用」(Interaction of thiabendazole with fugal tubulin)Brochrm Bro
phys Acta 543 82-90; Jung, M.K.およびOakley. B.R. 1990.「チアベンダゾー
ル耐性およびベノミル超感受性を付与するAspergillus nidulansのβ-チューブ
リン遺伝子におけるアミノ酸置換の同定」(Identification of an amino acid s
ubstitution in the β-tubulin gene of Aspergillus nidulans that confers
thiabendazole resistance and benomyl supersensitivity) Cell Motil Cytosk
eleton 11: 87-94;Manfredi, J.J.およびHorwitz. S.B. 1984. Pharmacol Ther
25:83-125)。多くの真菌がコルヒチン耐性であるが(Cameronら、1990. J Biol
Chem 265:15245-15252; Kilmartin, J.V. 1981.「酵母チューブリンのin vitro
自己集合による精製」(Purification of yeast tubulin by self-assembly in v
itro) Biochem 20:3629-3633 ;ならびにDavidse, L.C.およびFlach, W. 1977.「
Aspergillus nidulans変異株での抗細胞分裂剤であるメチルベンズイミダゾール
-2-イルカルバネートに対する耐性メカニズムとしての、真菌チューブリン対す
る特異の結合様式」(Differential binding of methyl benzimidazole-2-yl-car
barnate to fungal tubulin as a mechanism of resistance to this antimitot
ic agent in mutant strain of Aspergillus nidulans) J Cell Biol 72: 174-1
93)、ノコダゾール(Kilmartin, J.V. 1981 . Biochem 20:3629-3633)およびチア
ベンダゾール (Davidse, L.C.およびFlach, W. 1978. Biochim Biophys Acta 54
3 :82-90)に対して感受性であることが判明した。[0062] Biochemical and genetic evidence has shown that these drugs bind to β-tubulin in tubulin dimers and cause MT disassembly (
Davidse, LC and Flach, W. 1978. Interaction of thiabendazole with fugal tubulin. Brochrm Bro
phys Acta 543 82-90; Jung, MK and Oakley. BR 1990. "Identification of an amino acid substitution in the β-tubulin gene of Aspergillus nidulans conferring thiabendazole resistance and benomyl hypersensitivity"
ubstitution in the β-tubulin gene of Aspergillus nidulans that confers
thiabendazole resistance and benomyl supersensitivity) Cell Motil Cytosk
eleton 11: 87-94; Manfredi, JJ and Horwitz. SB 1984. Pharmacol Ther
25: 83-125). Although many fungi are resistant to colchicine (Cameron et al., 1990. J Biol
Chem 265: 15245-15252; Kilmartin, JV 1981.
Purification of yeast tubulin by self-assembly in v
itro) Biochem 20: 3629-3633; and Davidse, LC and Flach, W. 1977.
Methylbenzimidazole is an anti-mitotic agent in Aspergillus nidulans mutants
Differential binding of methyl benzimidazole-2-yl-car as a mechanism of resistance to 2-ylcarbanate
barnate to fungal tubulin as a mechanism of resistance to this antimitot
ic agent in mutant strain of Aspergillus nidulans) J Cell Biol 72: 174-1
93), nocodazole (Kilmartin, JV 1981.Biochem 20: 3629-3633) and thiabendazole (Davidse, LC and Flach, W. 1978.Biochim Biophys Acta 54
3: 82-90).
【0063】 表IIに示す通り、本明細書で試験した3種類の真菌種がコルヒチンおよびコ
ルセミドに対し耐性であり(IC50> lOOμM)、またノコダゾール感受性であった(I
C50 2〜22 μM)。これらの結果は、上述の研究と一致している。対照的に、こ
れらの真菌はチアベンダゾールに対しては異なる感受性であった。P. microspor
aは非常に感受性が高く(IC50 3μM)、一方P. ultimumおよびA. klebsianaは感
受性が低かった(IC50 270〜350 pM)。これらの結果は、β-チューブリンの生化
学的特性がこれらの3種の真菌において異なることを示している。As shown in Table II, the three fungal species tested here were resistant to colchicine and colcemide (IC 50 > 100 μM) and were sensitive to nocodazole (I
C 50 2-22 μM). These results are consistent with the studies described above. In contrast, these fungi were differently sensitive to thiabendazole. P. microspor
a was very sensitive (IC 50 3 μM), while P. ultimum and A. klebsiana were less sensitive (IC 50 270-350 pM). These results indicate that the biochemical properties of β-tubulin are different in these three fungi.
【表2】 [Table 2]
【0064】 β-チューブリンのアミノ酸6、165、167、198、200および241(図6中にアス
タリスクで表示)における変異によって、酵母N. crassa、A. nidulans benAおよ
びTrichoderma virideにおいてチアベンダゾールおよび他のベンズイミダゾール
薬物に対する感受性が変化した(Thomasら、1985.「Saccharomyces cerevisiaeの
β-チューブリン遺伝子における変異の単離と特性決定」(Isolation and charac
terization of mutations in the β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisi
ae) Genetics 112:715-734;Orbachら、1986 Mol Cell Biol 6:2452-2461; Jung
ら、1992.「ベノミル耐性を付与するAspergillus nidulansのβ-チューブリン遺
伝子におけるアミノ酸の変化」(Amino acid alterations in the β-tubulin g
ene of Aspergillus nidulans that coufer benomyl resistance) Cell Motil
Cytoskeleton 22: 170-174; Jung, M.K.およびOakley, B.R. 1990. Cell Motil
Cytoskeleton 17:87-94; Fugimuraら、1992.「アカパンカビのβ-チューブリン
遺伝子における単一のアミノ酸置換により刈るベンダジム耐性とジエトフェンカ
ルブ感受性が付与される」(A single amino-acid substitution in the β-tubu
lin gene of Neurospora confers both cabendazim resistance and diethofenc
arb sensitivity) Curr Genet 21 :399-404;ならびにGoldmanら、1993. Mol Gen
Genet 240:73-80)。これらのP. microspora由来のβ-チューブリン中の6残基
は、他のチアベンダゾール感受性種、例えばN. crassaおよびA. nidulans benA
由来のβ-チューブリンにおいて見られるものと同一である。対照的に、P. ulti
mumおよびA、klebsiana由来のβ-チューブリンは、アミノ酸165、167および200
において異なっている。アミノ酸167におけるフェニルアラニンからチロシンへ
の置換はN. crassaにベンズイミダゾール耐性を与えること(Orbachら、1986. Mo
l Cell Biol 6:2452-2461)、およびP. ultimumおよびA. klebsianaの双方がこの
位置にチロシンを有することがこのような薬物耐性の原因であるという事実が以
前に示されている。要約すると、これらの3種の真菌が示した異なるチアベンダ
ゾール耐性は、図6に示した真菌β-チューブリンの比較と一致していた。Mutations in amino acids 6, 165, 167, 198, 200 and 241 of β-tubulin (indicated by asterisks in FIG. 6) caused thiabendazole and other thiabendazole and other Altered sensitivity to benzimidazole drugs (Thomas et al., 1985; Isolation and characterization of mutations in the β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae) (Isolation and charac
terization of mutations in the β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisi
ae) Genetics 112: 715-734; Orbach et al., 1986 Mol Cell Biol 6: 2452-2461; Jung
Et al., 1992. “Amino acid alterations in the β-tubulin g in Aspergillus nidulans β-tubulin gene conferring benomyl resistance”.
ene of Aspergillus nidulans that coufer benomyl resistance) Cell Motil
Cytoskeleton 22: 170-174; Jung, MK and Oakley, BR 1990. Cell Motil
Cytoskeleton 17: 87-94; Fugimura et al., 1992. (A single amino-acid substitution in the β-tubu
lin gene of Neurospora confers both cabendazim resistance and diethofenc
arb sensitivity) Curr Genet 21: 399-404; and Goldman et al., 1993.Mol Gen
Genet 240: 73-80). The six residues in β-tubulin from these P. microspora are different from other thiabendazole-sensitive species such as N. crassa and A. nidulans benA.
Identical to that found in β-tubulin of origin. In contrast, P. ulti
β-tubulin from mum and A, klebsiana has amino acids 165, 167 and 200
Are different. Substitution of phenylalanine for tyrosine at amino acid 167 confers benzimidazole resistance on N. crassa (Orbach et al., 1986.
l Cell Biol 6: 2452-2461), and the fact that both P. ultimum and A. klebsiana have tyrosine at this position has previously been shown to be responsible for such drug resistance. In summary, the different thiabendazole resistances exhibited by these three fungi were consistent with the comparison of fungal β-tubulin shown in FIG.
【0065】実施例7:タキソール結合性および非結合性β-チューブリンを区別し得る抗体
の調製 モノクローナルまたはポリクローナル抗体を、以下の抗原に対して作製し得る
: l) P. microspora、P. ultimumまたはP. cinnamomiから抽出した天然β-チュ
ーブリン; 2) 例えば大腸菌、酵母および昆虫細胞などの異種系から作製されたP
. microspora、P. ultilnumまたはP. cinnamomiのβ-チューブリン;および3) 配
列番号2、配列番号4または配列番号6および好ましくは少なくとも1種のタキ
ソール結合領域を含む合成ペプチド。この抗体は、標準的なプロトコールによる
Elisaまたはウエスタンブロットを用いて上記のβ-チューブリンと、相互作用さ
せるために用いる(Harlow, E.D.およびLane. D. 1988.「抗体;実験室マニュア
ル」(Antibody: A laboratory Manual))。タキソール結合β-チューブリンとタ
キソール非結合β-チューブリンとを区別できる抗体を、試薬として選択する。 Example 7: Antibodies capable of distinguishing between taxol-binding and non-binding β-tubulin
Preparation of monoclonal or polyclonal antibodies can be made against the following antigens
: l) Natural β-tubulin extracted from P. microspora, P. ultimum or P. cinnamomi; 2) P produced from heterologous systems such as E. coli, yeast and insect cells
.beta.-tubulin of microspora, P. ultilnum or P. cinnamomi; and 3) a synthetic peptide comprising SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and preferably at least one taxol binding region. This antibody is prepared according to standard protocols.
Used to interact with the β-tubulin described above using Elisa or Western blot (Harlow, ED and Lane. D. 1988. “Antibodies; A laboratory Manual”). An antibody that can distinguish between taxol-bound β-tubulin and non-taxol-bound β-tubulin is selected as a reagent.
【0066】 特定の実施例は、少なくとも1つのタキソール結合領域、例えばThr219を含む
タキソール結合領域II、またはThr219がAsn219/Gln219と置換されているタキ
ソール結合領域IIを含む配列番号4または配列番号6に対応する合成ペプチド
に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製するものである。
これらの抗体が、β-チューブリンと相互作用する能力を、標準的なプロトコー
ルを用いるElisaで試験する。Thr219を含むペプチドとは結合するがAsn/Gln219
を含むペプチドとは結合しない抗体を、Thr219含有タキソール結合部位に対する
特異的試薬として選択する。一方、Asn219/Gln219含有ペプチドとは特異的に結
合するが、Thr219含有ペプチドとは結合しない抗体を、Thr219欠損タキソール結
合部位を特異的に認識する試薬として選択する。Particular examples are given in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 comprising at least one taxol binding domain, eg, taxol binding domain II comprising Thr219, or taxol binding domain II wherein Thr219 is replaced by Asn219 / Gln219. A polyclonal or monoclonal antibody to the corresponding synthetic peptide is produced.
The ability of these antibodies to interact with β-tubulin is tested in Elisa using standard protocols. Binds to peptides containing Thr219 but Asn / Gln219
An antibody that does not bind to the peptide containing is selected as a specific reagent for the Thr219-containing taxol binding site. On the other hand, an antibody that specifically binds to the Asn219 / Gln219-containing peptide but does not bind to the Thr219-containing peptide is selected as a reagent that specifically recognizes a Thr219-deficient taxol binding site.
【0067】実施例8:β-チューブリンを検出するスクリーニングアッセイ いくつかのアッセイを用いて、組成物がタキソールと結合し得るβ-チューブ
リンを含むか否かを決定できる。これらのアッセイは多様な組成物をβ-チュー
ブリンの存在についてスクリーニングするのに有用である。ここで用いる「組成
物」には、生物、例えば植物もしくは微生物、または非生物、例えば、植物性材
料もしくは患者由来のサンプルなど含むものとする。 Example 8: Screening Assay for Detecting β-Tubulin Several assays can be used to determine whether a composition contains β-tubulin that can bind to taxol. These assays are useful for screening a variety of compositions for the presence of β-tubulin. As used herein, "composition" is intended to include an organism, such as a plant or microorganism, or a non-organism, such as a plant material or a sample from a patient.
【0068】 第1のアッセイは、当分野でよく知られたノーザンハイブリダイゼーションま
たはサザンハイブリダイゼーション法を用いて行う(Sambrookら、「分子クロー
ニング:実験室マニュアル」(Molecular Cloning: A laboratory Manual) Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989)。全RNA、mRN
AまたはゲノムDNAを組成物から単離し、電気泳動で分離する。コード領域または
少なくとも1種のタキソール結合領域を含むβ-チューブリンの一部(例えば配列
番号1、配列番号3または配列番号5から誘導されたもの)に対応するDNA、合成
オリゴヌクレオチドまたはRNAは、放射性同位体で標識したプローブを合成する
のに用いうる。配列番号1から誘導したプローブとのハイブリダイゼーションに
より、タキソール耐性を有する可能性が高いβ-チューブリンが示されうる。一
方、配列番号3または配列番号5から誘導したプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンにより、タキソール感受性を有する可能性が高いβ-チューブリンが示され
うる。The first assay is performed using Northern or Southern hybridization techniques well known in the art (Sambrook et al., “Molecular Cloning: A laboratory Manual”).
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989). Total RNA, mRN
A or genomic DNA is isolated from the composition and separated by electrophoresis. DNA, synthetic oligonucleotide or RNA corresponding to a coding region or a part of β-tubulin comprising at least one taxol binding region (eg derived from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5) is It can be used to synthesize probes labeled with radioisotopes. Hybridization with a probe derived from SEQ ID NO: 1 may indicate β-tubulin, which is likely to have taxol resistance. On the other hand, hybridization with a probe derived from SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 can indicate β-tubulin that is likely to have taxol sensitivity.
【0069】 第2のアッセイは、標準的なプロトコールによるPCRに基づくアッセイを用い
るものである(Sambrookら、「分子クローニング:実験室マニュアル」(Molecula
r Cloning; A laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ing Harbor, New York, 1989)。ゲノムDNAまたは全RNAもしくはmRNAから変換し
たcDNAの双方をPCRアッセイでテンプレートとして用いる。少なくとも1つのタ
キソール結合領域を含むβ-チューブリンのコード領域に対応する遺伝子特異的
または縮重プライマー(配列番号1、配列番号3または配列番号5から誘導され
たものなど)を合成する。好適なプライマー配列を含むDNAのみが増幅され、その
他の変異型は全て抑制されうる。配列番号3または配列番号5から誘導したもの
であって配列番号1から誘導したものではないプライマーを用いた予想されるサ
イズのPCR断片の増幅は、タキソール結合β-チューブリンである可能性が高いこ
とを示す。一方、配列番号1から誘導したものであって配列番号3または配列番
号5から誘導したものではないプライマーを用いた予想されるサイズのPCR断片
の増幅は、タキソール非結合β-チューブリンである可能性が高いことを示す。
続いてβ-チューブリンの配列決定およびThr219残基の有無の調査により、さら
なる決定がなされるであろう。A second assay uses a PCR-based assay according to standard protocols (Sambrook et al., "Molecular Cloning: Laboratory Manual" (Molecula
r Cloning; A laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ing Harbor, New York, 1989). Both genomic DNA or cDNA converted from total RNA or mRNA are used as templates in PCR assays. Gene-specific or degenerate primers (such as those derived from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5) corresponding to the coding region of β-tubulin containing at least one taxol binding region are synthesized. Only DNA containing suitable primer sequences is amplified, and all other variants can be suppressed. Amplification of a PCR fragment of the expected size using primers derived from SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 but not SEQ ID NO: 1 is likely to be taxol-bound β-tubulin Indicates that On the other hand, amplification of a PCR fragment of the expected size using primers derived from SEQ ID NO: 1 but not SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 may be taxol-unbound β-tubulin It indicates that the property is high.
Subsequent determination of the sequence of β-tubulin and investigation of the presence of the Thr219 residue will be made.
【0070】 第3のアッセイは、標準的なプロトコールによるElisaまたはウエスタンブロ
ットを用いるものである(Harlow, E.D.およびLane, D. 1988.「抗体:実験室マ
ニュアル」(Antibodies: A Laboratory Manual))。組成物の細胞抽出物を調製す
る。合成ペプチド、またはP. microspora、P. ultimunlもしくはP. cinnamomiか
ら抽出した天然β-チューブリン、あるいは異種系、例えば大腸菌、酵母および
昆虫細胞により産生されたものを用いて、ポリクローナルまたはモノクローナル
抗体を作製できる。抗体は、上述のElisaまたはウエスタンブロットに使用でき
る。タキソール結合性のものをタキソール非結合性のものから区別できる抗体が
これらのアッセイで使用される。A third assay uses Elisa or Western blot according to standard protocols (Harlow, ED and Lane, D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual). A cell extract of the composition is prepared. Generate polyclonal or monoclonal antibodies using synthetic peptides or natural β-tubulin extracted from P. microspora, P. ultimunl or P. cinnamomi, or produced by heterologous systems, such as E. coli, yeast and insect cells it can. Antibodies can be used in Elisa or Western blots as described above. Antibodies that can distinguish taxol binding from non-taxol binding are used in these assays.
【0071】実施例9:タキソール感受性およびタキソール耐性である同種同系株の構築 P. ultimumは単一のβ-チューブリンを含む。in vitroでは、そのβ-チューブ
リン遺伝子またはcDNAを、Thr219を異なる残基、例えばAsn219またはGln219変更
するように改変することができる。改変DNA配列を形質転換用ベクター中にクロ
ーン化し、野生型 P. ultimum株を確立された方法により形質転換するために用
いる(Balanceら、1985. Gene 36:321-331)。野生型β-チューブリン遺伝子とこ
のベクター中の改変β-チューブリンとの間で相同組換えが起こる。形質転換さ
れた真菌をタキソール含有培地で選択する。タキソール耐性クローンを選択し、
それらのβ-チューブリンcDNAを配列決定してThr219の不在を確認する。P. cinn
amomiのタキソール耐性同種同系の株を同じように構築し、以下の実施例に記述
するスクリーニングアッセイにおいて使用する。これらの同種同系の株における
唯一の差異は、タキソール感受性株はThr219の存在によりタキソールに結合でき
ることであり;タキソール耐性株はThr219の不在によりタキソールに結合できな
いことである。このようなタキソール耐性株を野生型タキソール感受性株と組み
合わせて、以下の実施例で記述するようなスクリーニングに使用できる。 Example 9 Construction of Taxol-Sensitive and Taxol-Resistant Homologous Strains P. ultimum contains a single β-tubulin. In vitro, the β-tubulin gene or cDNA can be modified to change Thr219 to a different residue, such as Asn219 or Gln219. The modified DNA sequence is cloned into a transformation vector and used to transform a wild-type P. ultimum strain by established methods (Balance et al., 1985. Gene 36: 321-331). Homologous recombination occurs between the wild-type β-tubulin gene and the modified β-tubulin in this vector. The transformed fungi are selected on a taxol-containing medium. Select taxol resistant clones,
The β-tubulin cDNAs are sequenced to confirm the absence of Thr219. P. cinn
A taxol-resistant syngeneic strain of amomi is similarly constructed and used in the screening assays described in the Examples below. The only difference between these syngeneic strains is that taxol-sensitive strains can bind to taxol due to the presence of Thr219; taxol-resistant strains cannot bind to taxol due to the absence of Thr219. Such taxol-resistant strains can be used in combination with wild-type taxol-sensitive strains for screening as described in the Examples below.
【0072】実施例10:タキソールまたはタキソール様化合物の検出のためのスクリーニン グアッセイ いくつかのアッセイにより、組成物中のタキソールまたはタキソール様化合物
を検出できる。これらのアッセイは、多様な組成物をタキソールまたはタキソー
ル様化合物についてスクリーニングするために有用である。組成物には、植物も
しくは微生物などの生物、または植物材料、患者サンプルもしくは化合物ライブ
ラリーなどの非生物が含まれる。[0072] Example 10: screening Guassei Several assays for the detection of taxol or taxol-like compounds, it can detect the taxol or taxol-like compounds in the composition. These assays are useful for screening a variety of compositions for taxol or taxol-like compounds. Compositions include organisms such as plants or microorganisms, or non-living organisms such as plant materials, patient samples or compound libraries.
【0073】 スクリーニング方法の1つは、タキソール耐性P. microsporaをタキソール感
受性P. ultimumまたはP. cinnamomiと組み合わせて用いるものである。タキソー
ルはP. ultimum双方の増殖を、それらのβ-チューブリンに結合して阻害する一
方、タキソールはP. microsporaの増殖には影響を及ぼさない。何故なら、タキ
ソールはP. microsporaのβ-チューブリンとは相互作用しないからである。P. u
ltimumを阻害し得るがP. microsporaを阻害し得ない組成物は、タキソールまた
はタキソール様化合物を含む可能性が高い。One screening method uses taxol-resistant P. microspora in combination with taxol-sensitive P. ultimum or P. cinnamomi. Taxol inhibits the growth of both P. ultimum by binding to their β-tubulin, while Taxol has no effect on the growth of P. microspora. Taxol does not interact with β-tubulin of P. microspora. P. u
Compositions that can inhibit ltimum but not P. microspora are likely to include taxol or a taxol-like compound.
【0074】 上記の実施例に記載の通り、改良されたスクリーニング方法では、P. ultimum
またはP. cinnamomiのタキソール感受性およびタキソール耐性同種同系株を用い
る。組成物を用いて、タキソール感受性株の双方、およびタキソール耐性株の増
殖に対する作用を調べる。タキソール感受性株を阻害するがタキソール耐性株を
阻害しないことが、タキソールまたはタキソール様化合物の存在を示す。一方、
タキソール感受性およびタキソール耐性株の双方を阻害しないことは、タキソー
ルまたはタキソール様化合物の不在を示す。As described in the above examples, the improved screening method involves P. ultimum
Alternatively, a taxol-sensitive and taxol-resistant syngeneic strain of P. cinnamomi is used. The composition is tested for effects on the growth of both taxol-sensitive strains and taxol-resistant strains. Inhibiting a taxol-sensitive strain but not a taxol-resistant strain indicates the presence of taxol or a taxol-like compound. on the other hand,
Failure to inhibit both taxol-sensitive and taxol-resistant strains indicates the absence of taxol or a taxol-like compound.
【0075】 組成物を、タキソールまたはタキソール様化合物の存在に関して、微小管の集
合を安定化する能力、および集合した微小管を、脱重合を引き起こす条件(低温
など)下で安定化させる能力に基づいてスクリーニングできる(Schiffら、1979;
Horwitz, 1981)。これらのアッセイにおいて使用するα-およびβ-チューブリン
は、以下の供与源由来であり得る:l) P. ultimumまたはP. cinnarnomiから抽出
したβ-チューブリンおよびα-チューブリンからなる天然微小管; 2) P. ultimu
mまたはP. cinnamomiから抽出し、他の供与源由来のα-チューブリン、例えば、
ウシα-チューブリンと相互作用させたβ-チューブリン; 3)異種系、例えば 大
腸菌、酵母、昆虫細胞などにより産生された配列番号4または配列番号6の全部
または一部、およびP. ultimun、P. cinnanmomiのいずれかまたは他の供与源由
来のα-チューブリン。組成物がこれらのMTの集合を促進する能力を有し、また
集合したMTの脱集合を起こす条件下で脱集合を防ぐ能力を有する場合、該組成物
がタキソールまたはタキソール様化合物を含む可能性が高い。一方、これらの単
離された化合物は、MTの集合を促進不能でなければならず、またP. microspora
由来のβ-チューブリンからなるMTの脱集合を防止しなければならない。The composition is based on the ability to stabilize the assembly of microtubules with respect to the presence of taxol or a taxol-like compound, and the ability to stabilize the assembled microtubules under conditions that cause depolymerization (such as low temperatures). (Schiff et al., 1979;
Horwitz, 1981). The α- and β-tubulin used in these assays can be from the following sources: l) Natural microtubules consisting of β-tubulin and α-tubulin extracted from P. ultimum or P. cinnarnomi ; 2) P. ultimu
m or α-tubulin extracted from P. cinnamomi and derived from other sources, such as
Β-tubulin interacted with bovine α-tubulin; 3) all or part of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 produced by a heterologous system, such as E. coli, yeast, insect cells, etc., and P. ultimun, Α-tubulin from any of P. cinnanmomi or other sources. If the composition has the ability to promote the assembly of these MTs and the ability to prevent disassembly under conditions that cause disassembly of the assembled MTs, the composition may contain taxol or a taxol-like compound. Is high. On the other hand, these isolated compounds must not be able to promote MT assembly, and P. microspora
The disassembly of MT consisting of β-tubulin of origin must be prevented.
【0076】 別のスクリーニング方法は、P. ultimumまたはP. cinnamomiにおける、タキソ
ールまたはタキソール-様化合物による[3H]タキソールのMTへの結合の競合的阻
害に基づいて行い得る。[3H]タキソールのP. ultimumへの特異的結合は、実施例
5に記載の通り行う。阻害剤の存在下でP. ultimumに特異的に結合した[3H]タキ
ソールの量を100%とした。組成物をアッセイ混合物に添加し、そして該組成物
の存在下でP. ultimumに特異的に結合した[3H]タキソールの量を測定する。[3H]
タキソール特異的結合が減少することは、組成物がタキソール様の性質を有する
ことを示す。組成物の濃度を増加させると[3H]タキソールの結合を完全に阻害で
きる場合には、その化合物がMT中のβ-チューブリンにおける同じ結合部位に結
合する可能性が高いことを示す。Another screening method can be based on the competitive inhibition of [ 3 H] taxol binding to MT by taxol or taxol-like compounds in P. ultimum or P. cinnamomi. Specific binding of [ 3 H] taxol to P. ultimum was described in the Examples
Perform as described in 5. The amount of [ 3 H] taxol specifically bound to P. ultimum in the presence of the inhibitor was taken as 100%. The composition is added to the assay mixture and the amount of [ 3 H] taxol specifically bound to P. ultimum in the presence of the composition is determined. [ 3 H]
A decrease in taxol-specific binding indicates that the composition has taxol-like properties. If increasing the concentration of the composition can completely inhibit the binding of [ 3 H] taxol, it indicates that the compound is likely to bind to the same binding site on β-tubulin in MT.
【0077】 組成物の、タキソールまたはタキソール様化合物についてのスクリーニングは
、上述の方法の1つにより行い得る。好ましくは、最初の2つの方法のうちの1
つを用いて第1のスクリーニングを行う。何故なら、それらは簡便であり、多量
のサンプルを扱い得るからである。第3および第4の方法を、続いてのスクリー
ニングで用いることができる。[0077] Screening of the composition for taxol or a taxol-like compound may be performed by one of the methods described above. Preferably, one of the first two methods
The first screening is performed using one of the two. Because they are simple and can handle large samples. The third and fourth methods can be used in subsequent screening.
【0078】実施例11:患者由来のサンプルのタキソール感受性を区別するためのスクリー ニングアッセイ この診断アッセイにおいては、実施例 7に示したタキソール結合β-チューブ
リンを非結合β-チューブリンと区別し得る抗体を用いる。細胞性タンパク質を
患者サンプル由来の腫瘍検体から抽出し、タキソール結合能を有するかまたは有
しないβ-チューブリンのいずれかの存在を検出する。[0078] Example 11: In the screening assay The diagnostic assay to distinguish taxol sensitivity of sample from the patient, distinguish taxol binding β- tubulin shown in Examples 7 and unbound β- tubulin Use the resulting antibody. Cellular proteins are extracted from tumor samples from patient samples and the presence of either β-tubulin with or without taxol binding is detected.
【0079】 例えば、腫瘍をタキソールに対する耐性についてスクリーニングする診断アッ
セイにおいて、本発明のタキソール感受性およびタキソール耐性β-チューブリ
ンのタキソール結合領域(配列番号2、配列番号4、および配列番号6など)を使
用して、当技術分野でよく知られた方法によりモノクローナルまたはポリクロー
ナル抗体を作製する(Harlow, E.D,およびLane, D. 1988.「抗体:実験室マニュ
アル」(Antibodies: A Laboratory Manual))。例えば、モノクローナル抗体プロ
ーブを、患者サンプル、例えば腫瘍検体と反応させ、タキソール結合能を有する
かまたは結合能を有しないβ-チューブリンの存在を検出できる。抗体-抗原結合
の可視化は、当技術分野で知られたいずれの手段を介するものであってもよい。
例えば、放射性標識されたもしくは蛍光性の2次抗体、または、ペルオキシダー
ゼおよび/もしくはホスファターゼを用いる比色法などである(Harlow. E.D.およ
びLane, D, 1988.「抗体:実験室マニュアル」(Antibody: A Laboratory Manual
))。タキソール結合能を有するβ-チューブリン、すなわちタキソール感受性β-
チューブリンの検出は、タキソール療法に対する陽性応答に対応する。あるいは
、非結合性タキソール耐性β-チューブリンの検出および/またはタキソール感受
性β-チューブリンの不在は、タキソール療法に対する減少した応答または応答
の欠如に相当する。For example, the taxol binding regions of the taxol-sensitive and taxol-resistant β-tubulin of the invention (such as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6) are used in diagnostic assays to screen tumors for resistance to taxol. Then, monoclonal or polyclonal antibodies are produced by methods well known in the art (Harlow, ED, and Lane, D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual). For example, a monoclonal antibody probe can be reacted with a patient sample, eg, a tumor specimen, to detect the presence of β-tubulin with or without taxol binding ability. Visualization of antibody-antigen binding may be via any means known in the art.
For example, a colorimetric method using a radiolabeled or fluorescent secondary antibody or a peroxidase and / or phosphatase (Harlow. ED and Lane, D, 1988. “Antibodies: Laboratory Manual” (Antibody: A Laboratory Manual
)). Β-tubulin with taxol binding ability, that is, taxol sensitive β-
Tubulin detection corresponds to a positive response to taxol therapy. Alternatively, the detection of unbound taxol-resistant β-tubulin and / or the absence of taxol-sensitive β-tubulin corresponds to a reduced or lack of response to taxol therapy.
【0080】実施例12:植物におけるP. microsporaを用いたタキソール感受性の病原性卵
菌のバイオコントロール P. ultimumおよびP. cinnamomiを含む多くの卵菌は、作物に損傷を与え、深刻
な経済的損失をもたらす植物病原菌である。例えば、P. ultimumは豆類の根を腐
らせ、またP. cinnamomiはアボガドの根を腐らせる(ATCC:「糸状菌のカタログ」
(Catalogue of Filamentous Fungi), 第18版、1991)。また卵菌の多くはタキソ
ール感受性である(Youngら、1992.「タキソールおよびその類似体の抗真菌性」(
Antifungal properties of taxol and various analogues) Experientia 48:882
-885)。これらの株の2種、すなわちP. ultimumおよびP. cinnamomiは、アミノ
酸219にトレオニンを含む。 Example 12: Taxol-sensitive pathogenic eggs using P. microspora in plants
Many oomycete containing biocontrol P. ultimum and P. cinnamomi of bacteria, crop damage, a plant pathogen result in serious economic losses. For example, P. ultimum rots legume roots, and P. cinnamomi rots avocado roots (ATCC: Catalog of Filamentous Fungi)
(Catalogue of Filamentous Fungi), 18th edition, 1991). Many of the oomycetes are also taxol-sensitive (Young et al., 1992.
Antifungal properties of taxol and various analogues) Experientia 48: 882
-885). Two of these strains, P. ultimum and P. cinnamomi, contain threonine at amino acid 219.
【0081】 本発明のバイオコントロール方法は2ステップの工程を含む:l) 植物病原菌の
タキソール感受性を調べる、および2) 植物病原菌がタキソール感受性である場
合には、タキソール産生P. microsporaを、感染した植物と周囲の土壌に増殖抑
制タキソール源として適用する。The biocontrol method of the present invention comprises a two-step process: l) examining the phytopathogenic taxol susceptibility, and 2) infecting the taxol-producing P. microspora if the phytopathogenic bacterium is taxol-sensitive. Applied to plants and surrounding soil as a source of anti-proliferative taxol.
【0082】 植物病原菌のタキソール感受性を最初に決定する。タキソール感受性を同定す
る方法の1つは、アミノ酸219でのトレオニンの存在または不在を決定するもの
である。病原菌の正体が知られている場合、DNAおよびタンパク質データベース
を検索し、β-チューブリン配列が報告されているか否かを調べ、報告されてい
れば、アミノ酸219の残基をデータベースから調べる。病原菌のβ-チューブリン
配列が不明な場合には、cDNA配列を単離して分析し、アミノ酸219の残基を調べ
る。病原菌のβ-チューブリン遺伝子中のアミノ酸219におけるトレオニンの存在
はタキソールに対する感受性を示し、それ故にその病原菌はタキソール産生P. m
icrosporaで処理し得るものと示される。アミノ酸219がトレオニンでない場合、
タキソール感受性は、例えばタキソールによる増殖阻害などの他の手法により測
定することが必要となろう。タキソール結合性β-チューブリンの存在を調べる
ための、本明細書に記載した他のスクリーニング方法を用いることもできる。The taxol susceptibility of the plant pathogen is first determined. One method of identifying taxol sensitivity is to determine the presence or absence of threonine at amino acid 219. If the identity of the pathogen is known, the DNA and protein databases are searched to see if a β-tubulin sequence has been reported, and if so, the residue at amino acid 219 from the database. If the pathogen β-tubulin sequence is unknown, the cDNA sequence is isolated and analyzed for amino acid 219 residues. The presence of threonine at amino acid 219 in the pathogen's β-tubulin gene indicates susceptibility to taxol, and therefore the pathogen is taxol-producing P.m.
It is indicated that it can be treated with icrospora. If amino acid 219 is not threonine,
Taxol sensitivity may need to be measured by other techniques, such as growth inhibition by taxol. Other screening methods described herein for determining the presence of taxol-binding β-tubulin can also be used.
【0083】 P. microsporaがタキソールを50μg/lで産生し(Strobelら、1996. Microbiol
142:435-440)、タキソールを真菌細胞外へ分泌することが以前に公表されている
。このタキソール濃度では、P. ultimumおよびP. cinnamomiの増殖が阻害される
(図1参照)。処理のため、P. microsporaを、タキソール感受性病原菌に感染し
た植物または土壌の領域に接種した。P. microsporaの増殖により、これらのタ
キソール感受性生物の増殖を結果的に阻害するタキソールが分泌される。P. microspora produces taxol at 50 μg / l (Strobel et al., 1996. Microbiol
142: 435-440), and has previously been published to secrete taxol outside of fungal cells. This taxol concentration inhibits the growth of P. ultimum and P. cinnamomi
(See FIG. 1). For treatment, P. microspora was inoculated into areas of plants or soil infected with taxol-sensitive pathogens. The growth of P. microspora secretes taxol, which eventually inhibits the growth of these taxol-sensitive organisms.
【0084】実施例13:抗腫瘍剤または抗真菌剤の設計における結晶構造の使用 β-チューブリンの3次元構造を用いて、当技術分野で公知の方法でタキソー
ル様化合物を合理的に設計し得る(Ealickら、1991.「プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ阻害剤の設計における結晶解析およびモデリング法の応用」(Applicati
on of crystallographic and modeling methods in the design of purine nucl
eoside phosphorylase inhibitors) Science 88: 11540-11544; Rossmanら、199
1.「抗ウイルス剤の設計への結晶解析の応用」(Application of crystallograph
y to the design of antiviral agents) Infectious Agents and Disease 1 :3-
lO)。本発明の教示により、タンパク質構造のThr219がタキソールの結合に重要
な役割を果たすという知識をタキソール様化合物へ応用することはまた、タキソ
ール様活性を有する薬剤の開発にも重要なものとして応用し得る。 Example 13 Use of Crystal Structure in the Design of Antitumor or Antifungal Agents Using the three-dimensional structure of β-tubulin, a taxol-like compound was rationally designed by methods known in the art. (Ealick et al., 1991; Application of crystallographic and modeling techniques in the design of purine nucleoside phosphorylase inhibitors) (Applicati
on of crystallographic and modeling methods in the design of purine nucl
eoside phosphorylase inhibitors) Science 88: 11540-11544; Rossman et al., 199
1. “Application of crystallography to design antiviral drugs”
y to the design of antiviral agents) Infectious Agents and Disease 1: 3-
lO). In accordance with the teachings of the present invention, applying the knowledge that the protein structure Thr219 plays an important role in taxol binding to taxol-like compounds may also be applied as important to the development of drugs with taxol-like activity. .
【図1】 図1はP.microspora、P.ultimum、P.cinnamomiおよびA.klebsianaの菌の増殖に
おけるタキソールの影響を示すグラフである。菌糸体は、異なる濃度のタキソー
ルを含有するジャガイモデキストロース寒天(PDA)上で成長させた。タキソール
の阻害効果をコロニー直径で評価し、タキソール非存在下で成長させた菌糸体と
比較した。実験は二重反復試験で行ない、表示データはいくつかの実験の平均値
である。FIG. 1 is a graph showing the effect of taxol on the growth of P. microspora, P. ultimum, P. cinnamomi and A. klebsiana bacteria. Mycelium was grown on potato dextrose agar (PDA) containing different concentrations of taxol. The inhibitory effect of taxol was assessed by colony diameter and compared to mycelia grown in the absence of taxol. The experiments were performed in duplicate and the data shown are the average of several experiments.
【図2】 図2はP.microspora Ne32 cDNA由来のβ-チューブリンのヌクレオチド配列およ
び推定アミノ酸配列であるTUBB-pmを示す。左側の数字はヌクレオチド位置を示
し、右側の数字はアミノ酸位置を示す。遺伝子特異的プライマーNETUB5およびNE
TUB6の配列に下線が引かれている。翻訳開始コドンATGに下線が引かれ、翻訳終
止コドンを星印で示し、そして推定ポリアデニル化シグナルには2重線が引かれ
ている。FIG. 2 shows the nucleotide sequence of β-tubulin derived from P. microspora Ne32 cDNA and the deduced amino acid sequence TUBB-pm. The numbers on the left indicate nucleotide positions and the numbers on the right indicate amino acid positions. Gene-specific primers NETUB5 and NE
The TUB6 sequence is underlined. The translation initiation codon ATG is underlined, the translation stop codon is indicated by an asterisk, and the putative polyadenylation signal is doubled.
【図3】 図3はP.ultimum cDNA由来のβ-チューブリンのヌクレオチド配列および推定ア
ミノ酸配列であるTUBB-puを示す。左側の数字はヌクレオチド位置を示し、右側
の数字はアミノ酸位置を示す。遺伝子特異的プライマーWT1L-UおよびWT1L-Lの配
列を下線で示す。翻訳開始コドンATGを下線で示す、翻訳終止コドンを星印で示
し、そして推定ポリアデニル化シグナルを2重線で示す。FIG. 3 shows the nucleotide sequence of β-tubulin derived from P. ultimum cDNA and TUBB-pu, which is the deduced amino acid sequence. The numbers on the left indicate nucleotide positions and the numbers on the right indicate amino acid positions. The sequences of the gene-specific primers WT1L-U and WT1L-L are underlined. The translation initiation codon ATG is underlined, the translation stop codon is indicated by an asterisk, and the putative polyadenylation signal is indicated by a double line.
【図4】 図4はP.cinnamomi cDNA由来のβ-チューブリンのヌクレオチド配列および導き
出されたアミノ酸配列であるTUBB-pcを示す。左側の数字はヌクレオチド位置を
示し、右側の数字はアミノ酸位置を示す。遺伝子特異的プライマーPCBTUB1U、PC
BTUB2UおよびPCBTUB4Lの配列を下線で示す。翻訳開始コドンATGを###で示し、翻
訳終止コドンを星印で示す。TUBB-pcと、Weerakoonら(Weerakoonら、1998.「Phy
tophthora cinnamomiにおける単一β-チューブリン遺伝子の単離および特性づけ
」(Isolation and characterization of the single β-tubulin gene in Phyto
phthora cinnamomi) Mycologia 90:85-95)によって報告された配列U22050(Genba
nk登録番号)との間で異なるヌクレオチドおよびアミノ酸を2重線で示す。FIG. 4 shows the nucleotide sequence of β-tubulin derived from P. cinnamomi cDNA and the derived amino acid sequence, TUBB-pc. The numbers on the left indicate nucleotide positions and the numbers on the right indicate amino acid positions. Gene-specific primers PCBTUB1U, PC
The sequences of BTUB2U and PCBTUB4L are underlined. The translation start codon ATG is indicated by ###, and the translation stop codon is indicated by an asterisk. TUBB-pc and Weerakoon et al. (Weerakoon et al., 1998.
Isolation and characterization of the single β-tubulin gene in Phyto
phthora cinnamomi) Mycologia 90: 85-95) reported sequence U22050 (Genba
nk accession number) is indicated by a double line.
【図5】 図5は本明細書中で報告したP.cinnamomiにおけるβ-チューブリンのアミノ酸
配列(「TUBB-pc」)とWeerakoonらによる前記のアミノ酸配列(Weerakoonら、19
98. Mycologia 90:85-95)(「U22050」)とを比較するものである。P.cinnamomi
TUBB-pcにおける推定アミノ酸配列の全体を示し、またWeerakoonら(1998)によ
って報告されたU22050(Genbank登録番号)との間で異なる8残基(アミノ酸24、21
9、249、251-253、359、および428)をTUBB-pc配列の下に示す。アミノ酸1-31お
よび212-231(本明細書中においてタキソール結合領域IおよびIIとしてそれぞれ
表示)を配列の上に線で示す。FIG. 5 shows the amino acid sequence of β-tubulin in P. cinnamomi (“TUBB-pc”) as reported herein and the amino acid sequence described above by Weerakoon et al. (Weerakoon et al., 19).
98. Mycologia 90: 85-95) (“U22050”). P.cinnamomi
Shows the entire deduced amino acid sequence in TUBB-pc and eight residues (amino acids 24, 21) that differ from U22050 (Genbank accession number) reported by Weerakoon et al. (1998).
9, 249, 251-253, 359, and 428) are shown below the TUBB-pc sequence. Amino acids 1-31 and 212-231 (designated herein as taxol binding regions I and II, respectively) are indicated by lines above the sequence.
【図6】 図6Aおよび6Bはβ-チューブリンのアミノ酸配列アラインメントを示す。こ
のアラインメントはClustalWアラインメントプログラムを使用して得られた。P.
microspora β-チューブリンのアミノ酸配列の全体を示し、また他のβ-チュー
ブリンにおいて異なる残基を下に示す。左側の数字はヌクレオチド位置を示し、
右側の数字はアミノ酸位置を示す。下線を引いた配列は、GTP結合にとって重要
な領域(アミノ酸63-77)、ホスフェート結合にとって重要な領域(アミノ酸140-14
6)、およびMg2+結合にとって重要な領域(アミノ酸203-206)を示す。アミノ酸1-3
1および212-231(本明細書中においてタキソール結合領域IおよびIIとしてそれぞ
れ表示)を配列の上の線で示す。アミノ酸Phe270、Leu273およびSer364に#で印を
付ける。菌のベンゾイミダゾールに対する耐性のために重要なアミノ酸(アミノ
酸6、165、167、198、200、および241)を星印によって上に印を付ける。アライ
ンメントのギャップをダッシュで示し、各配列の端に$で印を付ける。N.crassa
、A.nidulans benA、A.klebsianaおよびヒトβ2由来のβ-チューブリンに対する
Genbank登録番号を表1に記載する。記載されたP.cinnamomiは配列番号6である。FIGS. 6A and 6B show amino acid sequence alignments of β-tubulin. This alignment was obtained using the ClustalW alignment program. P.
The entire amino acid sequence of microspora β-tubulin is shown, and the different residues in other β-tubulins are shown below. The numbers on the left indicate nucleotide positions,
Numbers on the right indicate amino acid positions. The underlined sequence is a region important for GTP binding (amino acids 63-77) and a region important for phosphate binding (amino acids 140-14
6), and the region important for Mg 2+ binding (amino acids 203-206). Amino acids 1-3
1 and 212-231 (designated herein as taxol binding regions I and II, respectively) are indicated by lines above the sequence. Amino acids Phe270, Leu273 and Ser364 are marked with #. Amino acids important for bacterial resistance to benzimidazole (amino acids 6, 165, 167, 198, 200, and 241) are marked above by an asterisk. Alignment gaps are indicated by dashes and $ is marked at the end of each sequence. N.crassa
Against β-tubulin from A. nidulans benA, A. klebsiana and human β2
The Genbank accession numbers are listed in Table 1. The described P. cinnamomi is SEQ ID NO: 6.
【図7】 図7Aおよび7Bは[3H]タキソールがP.ultimumには特異的に結合するがP.micro
sporaには結合しないことを示すグラフである。図7Aは、P.ultimumに対する[3H
]タキソールの特異的結合は[3H]タキソール濃度に相関して増大するが、P.micro
sporaは特異的結合を全く示さない、またはほんのわずかしか示さないことを表
す。活発に成長する真菌細胞を、異なる濃度の[3H]タキソールと共に、クェンチ
ングを行う前に室温で2時間インキュベートした。特異的結合を、100倍過剰量
の非標識タキソールの存在下と非存在下での[3H]タキソールの結合の差として計
算した。特異的結合はP.ultimumへの結合全体の30-70%に相当するが、P.microsp
oraへの結合全体に対しては5%未満に相当する。P.microspora細胞への[3H]タキ
ソールの結合は、細胞膜を破壊するためにTriton X-100(0.1% v/v)の存在下でお
こなった。図7Bは、微小管脱重合薬品チアベンダゾールの存在下と不在下にお
ける、用量依存的なP.ultimumへの [3H]タキソールの特異的結合の減少を示す。
細胞をチアベンダゾールで処理しないか(0μM)、異なる濃度のチアベンダゾール
で3時間、室温で処理した。つづいて、細胞をクェンチする前に100倍過剰量の
非標識タキソールの存在下と不在下で5nMの[3H]タキソールと2時間インキュベ
ートした。未処理細胞への[3H]タキソールの特異的結合を100%として定義した。
図7Aおよび7Bに示した実験は二重反復試験で行ない、表示データはいくつかの
実験の代表値である。FIGS. 7A and 7B show that [ 3 H] taxol specifically binds to P.ultimum but not P.micro
It is a graph which shows that it does not bind to spora. FIG. 7A shows [ 3 H] against P. ultimum.
Taxol specific binding increases with [ 3 H] taxol concentration, but P.micro
spora indicates no or very little specific binding. Actively growing fungal cells were incubated with different concentrations of [ 3 H] taxol for 2 hours at room temperature before quenching. Specific binding was calculated as the difference in binding of [ 3 H] taxol in the presence and absence of a 100-fold excess of unlabeled taxol. Specific binding represents 30-70% of the total binding to P.ultimum, while P.microsp
This represents less than 5% of the total binding to ora. [ 3 H] Taxol binding to P. microspora cells was performed in the presence of Triton X-100 (0.1% v / v) to disrupt cell membranes. FIG. 7B shows a dose-dependent decrease in [ 3 H] taxol specific binding to P. ultimum in the presence and absence of the microtubule depolymerizing drug thiabendazole.
Cells were not treated with thiabendazole (0 μM) or treated with different concentrations of thiabendazole for 3 hours at room temperature. The cells were then incubated with 5 nM [ 3 H] taxol for 2 hours in the presence and absence of a 100-fold excess of unlabeled taxol before quenching. Specific binding of [ 3 H] taxol to untreated cells was defined as 100%.
The experiments shown in FIGS. 7A and 7B were performed in duplicate and the data shown are representative of several experiments.
【図8】 図8は異なる生物由来のβ-チューブリンのタキソール結合領域I(アミノ酸1-3
1)およびタキソール結合領域II(アミノ酸212-231)のアミノ酸配列を示す。ブタ
β-チューブリンのタキソール結合領域IおよびIIのアミノ酸配列の全体を示し、
他のβ-チューブリンについては異なる残基を示す。それぞれの生物のタキソー
ル感受性を、感受性を「s」、耐性を「r」で示す。架橋および電子結晶学の両方
によってタキソール結合への関与が示された、アミノ酸15-25および212-222に星
印が付けてある。A.klebsianaのタキソール結合領域IIは、その配列内のギャッ
プのためアミノ酸211-230の間にある。ブタβ-チューブリンについてはNogales
らによって記載されており(Nogalesら、1999. Nature 391:199-203)、他の配列
のGenbank登録番号を表Iに示す。本明細書中で表すP.cinnamomiに対する配列は
、配列番号6で示す。FIG. 8 shows taxol binding region I (amino acids 1-3) of β-tubulin from different organisms.
1) and the amino acid sequences of taxol binding region II (amino acids 212-231). Shows the entire amino acid sequence of taxol binding regions I and II of porcine β-tubulin,
Different residues are shown for other β-tubulins. Taxol sensitivity of each organism is indicated by "s" for sensitivity and "r" for resistance. Amino acids 15-25 and 212-222 are indicated by an asterisk, indicating involvement in taxol binding by both crosslinking and electron crystallography. The taxol binding region II of A. klebsiana is between amino acids 211-230 due to a gap in its sequence. Nogales for porcine β-tubulin
(Nogales et al., 1999. Nature 391: 199-203) and Genbank accession numbers for other sequences are shown in Table I. The sequence for P. cinnamomi represented herein is set forth in SEQ ID NO: 6.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成13年10月12日(2001.10.12)[Submission date] October 12, 2001 (2001.10.12)
【手続補正1】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 31/10 A61P 35/00 4H011 35/00 C07K 14/37 4H045 C07K 14/37 C12N 1/13 C12N 1/13 C12Q 1/02 C12Q 1/02 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/50 Z 33/50 33/53 D 33/53 33/566 33/566 C12N 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW Fターム(参考) 2G045 AA40 BB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB04 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 DA06 HA14 4B063 QA13 QA18 QQ07 QQ43 QQ61 QQ79 QR32 QR41 QR48 QR62 QR76 QS25 4B065 AA57X AA57Y AB01 CA44 CA46 4C084 AA17 MA01 NA14 ZB262 ZB352 ZC412 4H011 AA01 DD04 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA15 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 31/10 A61P 35/00 4H011 35/00 C07K 14/37 4H045 C07K 14/37 C12N 1/13 C12N / 13 C12Q 1/02 C12Q 1/02 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/50 Z 33/50 33/53 D 33/53 33/566 33/566 C12N 15/00 ZNAA (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI) , CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW) EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, C R, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI , SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (reference) 2G045 AA40 BB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB04 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 DA06 HA14 4B063 QA13 QA18 QQ07 QQ43 QQ61 QQ79 QR32 QR41 QR48 QR62 QR76 QS25 4B06 5 AA57X AA57Y AB01 CA44 CA46 4C084 AA17 MA01 NA14 ZB262 ZB352 ZC412 4H011 AA01 DD04 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA15 EA28 FA74
Claims (98)
ドする精製されたDNAセグメント又はその一部分。1. A purified DNA segment encoding β-tubulin of the fungal species Pestalotiopsis microspora or a part thereof.
する、請求項1に記載のDNAセグメント。2. The DNA segment of claim 1, wherein said portion encodes at least one taxol binding site.
Iを有するタンパク質をコードする、請求項2に記載のDNAセグメント。3. The method according to claim 1, wherein said portion is taxol binding site I and taxol binding site I.
The DNA segment according to claim 2, which encodes a protein having I.
項3に記載のDNAセグメント。4. The DNA segment according to claim 3, wherein said protein is capable of interacting with α-tubulin.
載のDNAセグメント。5. The DNA segment according to claim 1, comprising at least a portion of SEQ ID NO: 1.
167までのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項5に記載のDNAセグメント。6. The method of claim 1 wherein said portion is from nucleotide 75 to nucleotide 75 of SEQ ID NO: 1.
The DNA segment according to claim 5, comprising up to 167 nucleotide sequences.
置換されている、請求項6に記載のDNAセグメント。7. The DNA segment according to claim 6, wherein at least one nucleotide in said nucleotide sequence has been replaced.
ド764までのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項5に記載のDNAセグメント。8. The DNA segment of claim 5, wherein said portion comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from nucleotide 708 to nucleotide 764.
置換されている、請求項8に記載のDNAセグメント。9. The DNA segment according to claim 8, wherein at least one nucleotide in said nucleotide sequence has been replaced.
はそれらの組合せが置換されている、請求項9に記載のDNAセグメント。10. The DNA segment of claim 9, wherein nucleotide 729, nucleotide 730, nucleotide 731 or a combination thereof has been substituted.
ヌクレオチド配列を含んでなり、β-チューブリンをコードする、請求項5に記
載のDNAセグメント。11. The DNA segment according to claim 5, comprising the nucleotide sequence from nucleotide 75 to nucleotide 1412 of SEQ ID NO: 1 and encoding β-tubulin.
が置換されており、前記β-チューブリンのタキソール結合能が変化していない
、請求項11に記載のDNAセグメント。12. The DNA segment according to claim 11, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been substituted, and the β-tubulin has no change in taxol-binding ability.
が置換されており、前記β-チューブリンのタキソール結合能が変化している、
請求項11に記載のDNAセグメント。13. The method according to claim 13, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been substituted, and the β-tubulin has an altered ability to bind taxol.
The DNA segment according to claim 11.
なくとも一部分を含んでなるアミノ酸配列。14. An amino acid sequence comprising at least a portion of β-tubulin of the fungal species Pestalotiopsis microspora.
でなる、請求項14に記載のアミノ酸配列。15. The amino acid sequence of claim 14, wherein said portion comprises at least one taxol binding site.
位IIを含んでなる、請求項15に記載のアミノ酸配列。16. The amino acid sequence of claim 15, wherein said portion comprises taxol binding site I and taxol binding site II.
16に記載のアミノ酸配列。17. The amino acid sequence of claim 16, wherein said portion is capable of interacting with α-tubulin.
含んでなる、請求項14に記載のアミノ酸配列。18. The amino acid sequence according to claim 14, comprising at least a part of the β-tubulin shown in SEQ ID NO: 2.
請求項18に記載のアミノ酸配列。19. The method according to claim 19, wherein the portion comprises amino acids 1-31 of SEQ ID NO: 2.
An amino acid sequence according to claim 18.
載のアミノ酸配列。20. The amino acid sequence of claim 19, having at least one amino acid substitution.
、請求項18に記載のアミノ酸配列。21. The amino acid sequence of claim 18, wherein said portion comprises amino acids 212-230 of SEQ ID NO: 2.
載のアミノ酸配列。22. The amino acid sequence according to claim 21, having at least one amino acid substitution.
なる、請求項18に記載のアミノ酸配列。23. The amino acid sequence of claim 18, wherein said portion comprises an amino acid substitution at amino acid 219.
り、前記一部分がタキソール耐性β-チューブリンとして作用する、請求項18
に記載のアミノ酸配列。24. The method of claim 18, wherein the portion consists essentially of amino acids 1-446 of SEQ ID NO: 2, and the portion acts as taxol-resistant β-tubulin.
The amino acid sequence according to 1.
るアミノ酸置換を少なくとも1個含む、請求項24に記載のアミノ酸配列。25. The amino acid sequence of claim 24, wherein said portion comprises at least one amino acid substitution that alters the taxol binding properties of said portion.
ないアミノ酸置換を少なくとも1個含む、請求項24に記載のアミノ酸配列。26. The amino acid sequence of claim 24, wherein said portion comprises at least one amino acid substitution that does not alter the taxol binding properties of said portion.
次元構造を乱す任意のアミノ酸で置換されている、請求項14に記載のアミノ酸
配列。27. The amino acid sequence of SEQ ID NO.
15. The amino acid sequence according to claim 14, wherein the amino acid sequence is substituted with any amino acid that disrupts a dimensional structure.
製されたDNAセグメント又はその一部分。28. A purified DNA segment encoding β-tubulin of the fungal species Pythium ultimum, or a portion thereof.
ドする、請求項28に記載のDNAセグメント。29. The DNA segment of claim 28, wherein said portion encodes at least one taxol binding site.
位IIを有するタンパク質をコードする、請求項29に記載のDNAセグメント。30. The DNA segment of claim 29, wherein said portion encodes a protein having taxol binding site I and taxol binding site II.
求項30に記載のDNAセグメント。31. The DNA segment of claim 30, wherein said protein is capable of interacting with α-tubulin.
に記載のDNAセグメント。32. The method of claim 28, comprising at least a portion of SEQ ID NO: 3.
DNA segment according to 1.
ド184までのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項32に記載のDNAセグメント
。33. The DNA segment of claim 32, wherein said portion comprises a nucleotide sequence from nucleotide 92 to nucleotide 184 of SEQ ID NO: 3.
が置換されている、請求項33に記載のDNAセグメント。34. The DNA segment of claim 33, wherein at least one nucleotide in said nucleotide sequence has been replaced.
チド781までのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項32に記載のDNAセグメン
ト。35. The DNA segment of claim 32, wherein said portion comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from nucleotide 725 to nucleotide 781.
が置換されている、請求項35に記載のDNAセグメント。36. The DNA segment of claim 35, wherein at least one nucleotide in said nucleotide sequence has been replaced.
はそれらの組合せが置換されている、請求項35に記載のDNAセグメント。37. The DNA segment of claim 35, wherein nucleotide 746, nucleotide 747, nucleotide 748, or a combination thereof has been substituted.
ヌクレオチド配列を含んでなり、β-チューブリンをコードする、請求項32に
記載のDNAセグメント。38. The DNA segment of claim 32, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from nucleotide 92 to nucleotide 1429 and encoding β-tubulin.
が置換されており、前記β-チューブリンのタキソール結合能が変化していない
、請求項38に記載のDNAセグメント。39. The DNA segment according to claim 38, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence is substituted, and the ability of the β-tubulin to bind taxol is not changed.
が置換されており、前記β-チューブリンのタキソール結合能が変化している、
請求項38に記載のDNAセグメント。40. The method according to claim 40, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence is substituted, and the ability of the β-tubulin to bind to taxol is changed.
A DNA segment according to claim 38.
部分を含んでなるアミノ酸配列。41. An amino acid sequence comprising at least a portion of β-tubulin of the fungal species Pythium ultimum.
項41に記載のアミノ酸配列。42. The amino acid sequence of claim 41, comprising at least one taxol binding site.
43に記載のアミノ酸配列。44. The amino acid sequence of claim 43, wherein said portion is capable of interacting with α-tubulin.
含んでなる、請求項41に記載のアミノ酸配列。45. The amino acid sequence according to claim 41, comprising at least a portion of the β-tubulin shown in SEQ ID NO: 4.
請求項45に記載のアミノ酸配列。46. The method of claim 46, wherein said portion comprises amino acids 1-31 of SEQ ID NO: 4.
An amino acid sequence according to claim 45.
載のアミノ酸配列。47. The amino acid sequence of claim 46, having at least one amino acid substitution.
、請求項45に記載のアミノ酸配列。48. The amino acid sequence of claim 45, wherein said portion comprises amino acids 212-230 of SEQ ID NO: 4.
載のアミノ酸配列。49. The amino acid sequence according to claim 48, having at least one amino acid substitution.
なる、請求項45に記載のアミノ酸配列。50. The amino acid sequence of claim 45, wherein said portion comprises an amino acid substitution at amino acid 219.
り、前記一部分がタキソール感受性β-チューブリンとして作用する、請求項4
5に記載のアミノ酸配列。51. The portion, consisting essentially of amino acids 1-446 of SEQ ID NO: 4, wherein the portion acts as taxol-sensitive β-tubulin.
6. The amino acid sequence according to 5.
るアミノ酸置換を少なくとも1個含む、請求項51に記載のアミノ酸配列。52. The amino acid sequence of claim 51, wherein said portion comprises at least one amino acid substitution that alters the taxol binding properties of said portion.
ないアミノ酸置換を少なくとも1個含む、請求項51に記載のアミノ酸配列。53. The amino acid sequence of claim 51, wherein said portion comprises at least one amino acid substitution that does not alter the taxol binding properties of said portion.
次元構造を乱す任意のアミノ酸で置換されている、請求項41に記載のアミノ酸
配列。54. The amino acid sequence of SEQ ID NO.
42. The amino acid sequence according to claim 41, wherein the amino acid sequence is substituted with any amino acid that disrupts a dimensional structure.
ドし、本質的に配列番号5の少なくとも一部分からなる、精製されたDNAセグメ
ント又はその一部分。55. A purified DNA segment, or a portion thereof, encoding β-tubulin of the fungal species Phytophthora cinnamomi and consisting essentially of at least a portion of SEQ ID NO: 5.
ド103までのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項55に記載のDNAセグメント
。56. The DNA segment of claim 55, wherein said portion comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 from nucleotide 11 to nucleotide 103.
が置換されているが、ただし、ヌクレオチド置換が1個のアミノ酸コードのみを
変化させる場合に、ヌクレオチド81がチミンであり、かつヌクレオチド82がアデ
ニン、シトシン又はチミンであるならば、ヌクレオチド80はアデニンであり得な
い、請求項56に記載のDNAセグメント。57. At least one nucleotide in the nucleotide sequence has been replaced, provided that nucleotide 81 is a thymine and nucleotide 82 is a nucleotide if the nucleotide substitution changes only one amino acid code. 57. The DNA segment of claim 56, wherein if it is adenine, cytosine or thymine, nucleotide 80 cannot be adenine.
チド700までのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項55に記載のDNAセグメン
ト。58. The DNA segment of claim 55, wherein said portion comprises a nucleotide sequence from nucleotide 644 to nucleotide 700 of SEQ ID NO: 5.
が置換されているが、ただし、ヌクレオチド置換が1個のアミノ酸コードのみを
変化させる場合に、ヌクレオチド666がアデニンであり、かつヌクレオチド667が
シトシン又はチミンであるならば、ヌクレオチド665はアデニンであり得ない、
請求項58に記載のDNAセグメント。59. At least one nucleotide in the nucleotide sequence has been substituted, provided that nucleotide substitutions change only one amino acid code, nucleotide 666 is adenine, and nucleotide 667 is substituted. If it is cytosine or thymine, nucleotide 665 cannot be adenine;
A DNA segment according to claim 58.
ヌクレオチド配列を含んでなり、β-チューブリンをコードする、請求項55に
記載のDNAセグメント。60. The DNA segment of claim 55, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 from nucleotide 11 to nucleotide 1342, encoding β-tubulin.
が置換されているが、ただし、ヌクレオチド置換が1個のアミノ酸コードのみを
変化させる場合に、ヌクレオチド666がアデニンであり、かつヌクレオチド667が
シトシン又はチミンであるならば、ヌクレオチド665はアデニンであり得ない、
請求項60に記載のDNAセグメント。61. At least one nucleotide in the nucleotide sequence has been replaced, provided that nucleotide substitutions change only one amino acid code, nucleotide 666 is adenine, and nucleotide 667 is substituted. If it is cytosine or thymine, nucleotide 665 cannot be adenine;
A DNA segment according to claim 60.
が置換されており、前記β-チューブリンのタキソール結合能が変化していない
、請求項60又は61に記載のDNAセグメント。62. The DNA segment according to claim 60 or 61, wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been substituted, and the β-tubulin has no change in taxol-binding ability.
が置換されており、前記β-チューブリンのタキソール結合能が変化している、
請求項60又は61に記載のDNAセグメント。63. wherein at least one nucleotide in the nucleotide sequence has been replaced and the β-tubulin has an altered taxol binding ability;
A DNA segment according to claim 60 or 61.
ューブリンの少なくとも一部分を含んでなるアミノ酸配列。64. An amino acid sequence comprising at least a part of β-tubulin of fungal species Phytophthora cinnamomi shown in SEQ ID NO: 6.
請求項64に記載のアミノ酸配列。65. The portion comprising amino acids 1-31 of SEQ ID NO: 6.
An amino acid sequence according to claim 64.
1個のみのアミノ酸が置換される場合に、アミノ酸24はイソロイシンではない、
請求項65に記載のアミノ酸配列。66. At least one amino acid has been substituted, provided that
When only one amino acid is replaced, amino acid 24 is not isoleucine;
An amino acid sequence according to claim 65.
、請求項64に記載のアミノ酸配列。67. The amino acid sequence of claim 64, wherein said portion comprises amino acids 212-230 of SEQ ID NO: 6.
1個のみのアミノ酸が置換される場合に、アミノ酸219はアスパラギンではない
、請求項67に記載のアミノ酸配列。68. At least one amino acid has been substituted, except that
68. The amino acid sequence of claim 67, wherein amino acid 219 is not asparagine when only one amino acid is replaced.
その場合アミノ酸219はアスパラギンで置換されることはない、請求項64に記
載のアミノ酸配列。69. The portion comprising an amino acid substitution at amino acid 219,
65. The amino acid sequence of claim 64, wherein amino acid 219 is not replaced with asparagine.
り、前記一部分がタキソール感受性β-チューブリンとして作用する、請求項6
4に記載のアミノ酸配列。70. The portion, consisting essentially of amino acids 1-446 of SEQ ID NO: 6, wherein the portion acts as taxol-sensitive β-tubulin.
4. The amino acid sequence according to 4.
だし、1個のみのアミノ酸が置換される場合に、アミノ酸219はアスパラギンで
はなく、該アミノ酸置換は該一部分のタキソール結合特性を変化させるものであ
る、請求項70に記載のアミノ酸配列。71. The portion comprises at least one amino acid substitution, with the proviso that when only one amino acid is replaced, amino acid 219 is not asparagine, and the amino acid substitution reduces the taxol binding properties of the portion. 71. The amino acid sequence of claim 70, which is altered.
だし、1個のみのアミノ酸が置換される場合に、アミノ酸219はアスパラギンで
はなく、該アミノ酸置換は該一部分のタキソール結合特性を変化させないもので
ある、請求項70に記載のアミノ酸配列。72. The portion comprises at least one amino acid substitution, with the proviso that when only one amino acid is replaced, amino acid 219 is not asparagine, and the amino acid substitution reduces the taxol binding properties of the portion. 71. The amino acid sequence of claim 70, which does not change.
す任意のアミノ酸で置換されており、アミノ酸219のみが唯一置換される場合に
、置換したアミノ酸がアスパラギンではない、請求項64に記載のアミノ酸配列
。73. The amino acid substitution around amino acid 219 that is replaced by any amino acid that disrupts the three-dimensional structure of the amino acid sequence, and where only amino acid 219 is the only substitution, the substituted amino acid is not asparagine. The amino acid sequence according to 1.
ードする精製されたDNAセグメント又はその一部分を含んでなるベクター。74. A vector comprising a purified DNA segment encoding β-tubulin of the fungal species Pestalotiopsis microspora, or a portion thereof.
ドする、請求項74に記載のベクター。75. The vector of claim 74, wherein said portion encodes at least one taxol binding site.
製されたDNAセグメント又はその一部分を含んでなるベクター。76. A vector comprising a purified DNA segment encoding β-tubulin of the fungal species Pythium ultimum, or a portion thereof.
ドする、請求項76に記載のベクター。77. The vector of claim 76, wherein said portion encodes at least one taxol binding site.
ドする精製されたDNAセグメント又はその一部分を含んでなり、該DNAセグメント
が本質的に配列番号5からなる、該ベクター。78. The vector comprising a purified DNA segment encoding β-tubulin of the fungal species Phytophthora cinnamomi, or a portion thereof, wherein the DNA segment consists essentially of SEQ ID NO: 5.
ドする、請求項78に記載のベクター。79. The vector of claim 78, wherein said portion encodes at least one taxol binding site.
ル結合能を測定するための方法であって、 タキソール耐性Pestalotiopsis microspora、タキソール感受性Pythium ultim
um、又は配列番号6に示すタキソール感受性Phytophtora cinnamomi由来のβ-チ
ューブリンのタキソール結合部位を少なくとも1つ含んでなるアミノ酸配列に対
して誘導された抗体であって、タキソール結合特性と非タキソール結合特性とを
識別する該抗体を準備して試薬を調製し、 該試薬とβ-チューブリンとを接触させ、 該試薬中の抗体とβ-チューブリン又はβ-チューブリン様化合物との結合の程
度を測定する、 ことを含んでなり、その際、タキソール結合特性を特異的に認識する抗体の結合
はタキソール感受性を示し、タキソール非結合特性を特異的に認識する抗体の結
合はタキソール耐性を示す、上記方法。80. A method for measuring the taxol-binding ability of β-tubulin or a β-tubulin-like compound, comprising: taxol-resistant Pestalotiopsis microspora, taxol-sensitive Pythium ultim
um or an antibody directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol-binding site of taxol-sensitive β-tubulin derived from taxol-sensitive Phytophtora cinnamomi as shown in SEQ ID NO: 6, which comprises taxol-binding properties and non-taxol-binding properties A reagent is prepared by preparing the antibody for identifying the antibody and β-tubulin, and the degree of binding between the antibody in the reagent and β-tubulin or β-tubulin-like compound is determined. Measuring, wherein the binding of the antibody specifically recognizing taxol binding property shows taxol sensitivity, and the binding of the antibody specifically recognizing taxol non-binding property shows taxol resistance, Method.
来のβ-チューブリンのタキソール結合部位を少なくとも1つ含んでなるアミノ
酸配列に対して誘導される、請求項80に記載の方法。81. The method of claim 80, wherein said antibody is directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of β-tubulin from taxol-resistant Pestalotiopsis microspora.
位を少なくとも1つ含んでなる、請求項81に記載の方法。82. The method of claim 81, wherein said amino acid sequence comprises at least one taxol binding site from SEQ ID NO: 2.
チューブリンのタキソール結合部位を少なくとも1つ含んでなるアミノ酸配列に
対して誘導される、請求項80に記載の方法。83. The antibody, wherein the antibody is β-derived from taxol-sensitive Pythium ultimum.
81. The method of claim 80, wherein the method is directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of tubulin.
を少なくとも1つ含んでなる、請求項81に記載の方法。84. The method of claim 81, wherein said amino acid sequence comprises at least one taxol binding site from SEQ ID NO: 4.
hora cinnamomi由来のβ-チューブリンのタキソール結合部位を少なくとも1つ
含んでなるアミノ酸配列に対して誘導される、請求項80に記載の方法。85. The antibody, wherein the antibody is taxol-sensitive Phytopht shown in SEQ ID NO: 6.
81. The method of claim 80, wherein the method is directed against an amino acid sequence comprising at least one taxol binding site of β-tubulin from hora cinnamomi.
、組換えにより発現されたタンパク質、外因的に単離されたタンパク質、合成ペ
プチド及び細胞培養物からなる群より選択される、請求項80、81、82、8
3、84又は85のいずれか1項に記載の方法。86. The β-tubulin or β-tubulin-like protein is selected from the group consisting of a recombinantly expressed protein, an exogenously isolated protein, a synthetic peptide and a cell culture. Claims 80, 81, 82, 8
89. The method according to any one of 3, 84 or 85.
組成物をスクリーニングする方法であって、 任意のタキソール感受性生物体由来のα-チューブリンに加えて、タキソール
感受性Pythium ultimum又は配列番号6に示すタキソール感受性Phytophthora ci
nnamomi由来のタキソール結合部位の双方を含んでなるアミノ酸配列を有するβ-
チューブリンを準備して試薬を調製し、 該試薬と該物質の組成物とを接触させ、 該物質の組成物がMT集合を促進する能力又は集合したMTの脱重合を脱重合条件
下で阻害する能力を測定する、 ことを含んでなり、その際、微小管の集合を促進する能力又は脱重合を阻害する
能力は、該物質の組成物中にタキソール又はタキソール様化合物が存在する可能
性を示すものである、上記方法。87. A method of screening a composition of matter for the presence of taxol or a taxol-like compound, comprising: in addition to α-tubulin from any taxol-sensitive organism, taxol-sensitive Pythium ultimum or SEQ ID NO: 6. Taxol-sensitive Phytophthora ci
β- having an amino acid sequence comprising both taxol binding sites from nnamomi
Preparing tubulin to prepare a reagent, contacting the reagent with the composition of the substance, and inhibiting the ability of the composition of the substance to promote MT assembly or depolymerization of the assembled MT under depolymerization conditions. Measuring the ability to promote the assembly of microtubules or to inhibit depolymerization, the likelihood that taxol or a taxol-like compound is present in the composition of the substance. The method as described above.
組成物をスクリーニングする方法であって、 タキソール感受性Pythium ultimum又は配列番号6に示すタキソール感受性Phy
tophthora cinnamomiの菌糸体を準備し、 該物質の組成物と該菌糸体とを標識タキソールの存在下で接触させ、 該物質の組成物がβ-チューブリンと標識タキソールとの結合を競合的に阻害
する程度を測定する、 ことを含んでなり、その際、タキソール感受性のPythium ultimum又はPhytophth
ora cinnamomiに由来するβ-チューブリンへのタキソールの結合をブロックする
ことができれば、該物質の組成物はタキソール又はタキソール様化合物を保有す
ると判定される、上記方法。88. A method of screening a composition of matter for the presence of taxol or a taxol-like compound, comprising: taxol-sensitive Pythium ultimum or taxol-sensitive Phy represented by SEQ ID NO: 6.
preparing a mycelium of tophthora cinnamomi, contacting the composition of the substance with the mycelium in the presence of labeled taxol, and the composition of the substance competitively inhibits the binding between β-tubulin and labeled taxol Measuring the extent to which the taxol is sensitive to Pythium ultimum or Phytophth
The above method, wherein the composition of the substance is determined to carry taxol or a taxol-like compound if the binding of taxol to β-tubulin derived from ora cinnamomi can be blocked.
のタキソール結合特性を変化させる方法であって、 ベクターのコード領域内の配列番号2のアミノ酸219におけるコドンの正体を
決定し、 アミノ酸219におけるコドンがトレオニン以外の任意のアミノ酸をコードする
場合に、該コドン中のヌクレオチドをアミノ酸219がトレオニンをコードするよ
うに置換して、非タキソール結合β-チューブリン又はその一部分を、タキソー
ル結合β-チューブリン又はその一部分に変化させるか、あるいはアミノ酸219に
おける該コドンがトレオニンをコードする場合に、該コドン中のヌクレオチドを
アミノ酸219がトレオニン以外の任意のアミノ酸をコードするように置換して、
タキソール結合β-チューブリン又はその一部分を非タキソール結合β-チューブ
リン又はその一部分に変化させること、 を含んでなる上記方法。89. A method of altering the taxol binding properties of recombinantly expressed β-tubulin or a portion thereof, comprising determining the identity of the codon at amino acid 219 of SEQ ID NO: 2 in the coding region of the vector, When the codon at amino acid 219 encodes any amino acid other than threonine, the nucleotides in the codon are replaced such that amino acid 219 encodes threonine to convert non-taxol-linked β-tubulin or a portion thereof to taxol-linked changing to β-tubulin or a portion thereof, or, if the codon at amino acid 219 encodes a threonine, replacing the nucleotide in the codon such that amino acid 219 encodes any amino acid other than threonine;
Converting taxol-bound β-tubulin or a portion thereof to non-taxol-bound β-tubulin or a portion thereof.
作成する方法であって、 配列番号2のアミノ酸219にトレオニンを含んでなるタキソール結合β-チュー
ブリンをコードするDNAセグメントを導入することによって、非タキソール感受
性真菌細胞を形質転換することを含んでなり、 その際、形質転換された該真菌細胞が、発現可能な条件にさらしたとき、好適
な構成プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で該DNAセグメントを発現
する、上記方法。90. A method for preparing taxol-sensitive fungal cells from taxol-resistant fungal cells, comprising introducing a DNA segment encoding taxol-binding β-tubulin comprising threonine at amino acid 219 of SEQ ID NO: 2. Transforming a non-taxol-sensitive fungal cell, wherein the transformed fungal cell, when exposed to expressible conditions, under the control of a suitable constitutive or inducible promoter. The above method of expressing a DNA segment.
ソール結合β-チューブリンをコードするDNAセグメントを導入することによって
形質転換されており、発現可能な条件にさらしたとき、好適な構成プロモーター
又は誘導性プロモーターの制御下で該DNAセグメントを発現する、トランスジェ
ニックタキソール感受性真菌細胞。91. A transformant which has been transformed by introducing a DNA segment encoding taxol-linked β-tubulin comprising threonine at amino acid 219 of SEQ ID NO: 2, which is suitable when exposed to expressible conditions. A transgenic taxol-sensitive fungal cell that expresses the DNA segment under the control of a constitutive or inducible promoter.
作成する方法であって、 配列番号2のアミノ酸219がトレオニンではない非タキソール結合β-チューブ
リンをコードするDNAセグメントを導入することによって該タキソール感受性真
菌細胞を形質転換することを含んでなり、 その際、形質転換された真菌細胞が、発現可能な条件にさらしたとき、好適な
構成プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で該DNAセグメントを過剰発
現する、上記方法。92. A method for preparing a taxol-resistant fungal cell from a taxol-sensitive fungal cell, comprising introducing a DNA segment encoding non-taxol-linked β-tubulin wherein amino acid 219 of SEQ ID NO: 2 is not threonine. Transforming a taxol-sensitive fungal cell, wherein the transformed fungal cell, upon exposure to expressible conditions, transforms the DNA segment under the control of a suitable constitutive or inducible promoter. The above method, which is overexpressed.
ソール結合β-チューブリンをコードするDNAセグメントを導入することによって
形質転換されており、発現可能な条件にさらしたとき、好適な構成プロモーター
又は誘導性プロモーターの制御下で該DNAセグメントを過剰発現する、トランス
ジェニックタキソール感受性真菌細胞。93. It has been transformed by introducing a DNA segment encoding taxol-linked β-tubulin comprising threonine at amino acid 219 of SEQ ID NO: 2, which is suitable when exposed to expressible conditions. A transgenic taxol-sensitive fungal cell that overexpresses the DNA segment under the control of a constitutive or inducible promoter.
組成物をスクリーニングする方法であって、 識別可能なタキソール耐性真菌細胞とタキソール感受性真菌細胞を準備し、 該物質の組成物と該真菌細胞とを接触させ、 該真菌細胞の増殖抑制を測定する、 ことを含んでなり、その際、該物質の組成物がタキソール感受性真菌細胞の増殖
を抑制できるがタキソール耐性真菌細胞の増殖を抑制できない場合は、該組成物
がタキソール又はタキソール様化合物を保有すると判定される、上記方法。94. A method of screening a composition of a substance for the presence of taxol or a taxol-like compound, comprising providing a taxol-resistant fungal cell and a taxol-sensitive fungal cell that are identifiable, comprising the composition of the substance and the fungal cell. And measuring the inhibition of the growth of the fungal cell, wherein the composition of the substance can inhibit the growth of taxol-sensitive fungal cells, but cannot inhibit the growth of taxol-resistant fungal cells. Wherein the composition is determined to carry taxol or a taxol-like compound.
感受性真菌細胞が本質的にトランスジェニックタキソール耐性真菌細胞及びアイ
ソジェニックタキソール感受性真菌細胞からなる、請求項94に記載の方法。95. The method of claim 94, wherein said distinguishable taxol-resistant fungal cells and taxol-sensitive fungal cells consist essentially of transgenic taxol-resistant fungal cells and isogenic taxol-sensitive fungal cells.
胞が誘導される真菌とは無関係の真菌から誘導される、請求項94に記載の方法
。96. The method of claim 94, wherein said taxol-resistant fungal cells are derived from a fungus independent of the fungus from which the taxol-sensitive fungal cells are derived.
周囲の土壌をタキソール産生P. microsporaで処理する、 ことを含んでなる、上記方法。97. A method for protecting the growth of plant pathogens, comprising determining the taxol sensitivity of the plant pathogen, and determining that the pathogen is taxol-sensitive, the method comprises: Treating with Taxol-producing P. microspora.
定することによって判定し、アミノ酸219がトレオニンである場合に該植物をタ
キソール感受性であると指定する、請求項97に記載の方法。98. The method of claim 97, wherein said plant pathogen is taxol sensitive by identifying amino acid 219 and designating said plant as taxol sensitive if amino acid 219 is threonine.
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