JP2002539453A - 測定媒体によって生じる蛍光消光を減少する方法 - Google Patents

測定媒体によって生じる蛍光消光を減少する方法

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JP2002539453A JP2000605211A JP2000605211A JP2002539453A JP 2002539453 A JP2002539453 A JP 2002539453A JP 2000605211 A JP2000605211 A JP 2000605211A JP 2000605211 A JP2000605211 A JP 2000605211A JP 2002539453 A JP2002539453 A JP 2002539453A
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rare earth
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マティス，ジェラール
バザン，エルブ
トランケ，エリク
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シ ビオ アンテルナショナル
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、希土類金属クリプテートに結合したオリゴヌクレオチドを含む蛍光複合体を測定媒体に導入することを特徴とする、少なくとも１つの蛍光標識を使用する分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、少なくとも１つの蛍光標識を使用する分析物の蛍光アッセイにおい
て、希土類金属クリプテートに結合したオリゴヌクレオチドを含む蛍光複合体を
使用することに関する。
【０００２】 生物学に関する知識の向上により、生体分子のモニターまたは定量が可能な診
断方法に対する要求が高まっている。
【０００３】 同時に、対照アッセイ法に一般的に伴う放射性標識には不都合がある。一般に
、現在、放射性トレーサーを他の標識、主に蛍光標識に置き換えるための努力が
払われている。理想条件下で蛍光標識を使用すると、放射性トレーサーで得られ
る感度に理論的に等価な高感度を得ることが可能である。
【０００４】 実際には、第１にしばしば高いバックグラウンドノイズが存在するため、第２
に蛍光トレーサーはその環境の変化に一般に極めて敏感であるという事実のため
に、蛍光トレーサーの定量性能には限度がある。pHの微細な変化、極性、溶存酸
素の存在または重原子（例えば、ヨウ素）の接近または吸収基により、（増強ま
たは消光の意味での）量子収量が変化したり、発光波長がシフトする可能性があ
る。
【０００５】 血清中に存在するタンパク質との相互作用によりしばしば蛍光の消光が生じる
ことは公知である。
【０００６】 蛍光測定による分析方法に内在する問題については、総説記事に列挙されてい
る（I. Hemmila, Clin. Chem. 31/3, 359-370 (1985)）。
【０００７】 生物学的サンプルに存在するタンパク質並びに他の生体分子の固有の蛍光から
生じるバックグラウンドノイズに内在する問題は、希土類金属（主にユウロピウ
ム）の錯体から形成される蛍光標識を使用して解決することができ、これによっ
て、特定のシグナルの一時的選択を可能にしている。ユウロピウム錯体の特徴は
寿命（約0.1 ms〜１ms）が特に長いことであり、このため、臨界時間測定（reso
lved-time measurement）例えば、比較的短い寿命（約４ns）を特徴としている
血清タンパク質からのバックグラウンドノイズの上昇を除くことができる。
【０００８】 トリスビピリジンユウロピウム[TBP-(Eu3+)]クリプテートによる核酸の間接標
識（欧州特許第0321353号に記載のクリプテート）は、このクリプテートによっ
て標識された抗DNP抗体を使用して実施されており、このジニトロフェニル（DNP
）基は合成ヌクレオチドの5'末端に導入される（E. Lopezら、Clin. Chem. 39/2
, 196-201 (1993)）。
【０００９】 さらに、TBP-(Eu3+)クリプテートを使用して標識された抗体の使用は、免疫診
察学の領域にまで広がっている。クリプテートをマーカーとして使用すると、非
放射性エネルギー遷移に関与する蛍光の臨界時間測定に基づく均質型イムノアッ
セイを開発することが可能である（G.Mathis ら、 Clin. Chem, 39, 1251 (1993
)）。
【００１０】 均質型の形式は、免疫学的複合体の形成の動力学の実時間モニタリングを可能
にするという顕著な利点を有するが、しかし標識と生体媒体に存在する分子との
間の望ましくない任意の相互作用を除くこと（蛍光の消光）はできない。
【００１１】 媒体にフッ化物イオンを添加することによって、血清媒体における光物理特性
、特に寿命の回復を得ることができ、国際出願WO 92/01224号公報に記載されて
いる。
【００１２】 今回、オリゴヌクレオチド鎖に希土類金属クリプテートを分子と複合させるこ
とによって、新規かつ予想以上の光物理特性を有するクリプテート−オリゴヌク
レオチド蛍光複合体を得ることができることを見出した。
【００１３】 前記複合体は、クリプテートのみと比較して、媒体中に存在する分子との相互
作用から生じる蛍光消光の現象に対してそれほど感受性ではないという有利な特
性を有する。
【００１４】 フッ化物イオンなどの補助剤を使用せずに生物学的媒体において蛍光測定を実
施することが可能である。
【００１５】 従って、クリプテート−オリゴヌクレオチド複合体は、認識規則を有し、パー
トナーに結合可能な生体分子に結合し得る新規の標識を構成する。
【００１６】 抗体またはストレプトアビジンなどのレセプターに結合したクリプテート−オ
リゴヌクレオチド複合体は、その光物理特性（消光に対する耐性）を維持し、ク
リプテート−抗体またはクリプテート−ストレプトアビジン複合体と比較して有
利な特性を有する。
【００１７】 従って、第１の局面によれば、本発明は、希土類金属クリプテートに結合した
オリゴヌクレオチドを含む蛍光複合体が測定媒体に導入されることを特徴とする
、少なくとも１つの蛍光標識を使用する分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒
体によって生じる蛍光消光を減少する方法に関する。
【００１８】 有利な局面において、蛍光複合体は唯一の標識としてまたはアッセイにおける
蛍光標識の１つとして使用される。
【００１９】 本明細書では、用語「分析物」は、任意の物質あるいは物質の基、およびまた
、検出および／または検出に所望されるその類似体を意味することが意図される
。
【００２０】 本発明の特許請求の範囲に記載の方法は、「競合による」または「過剰による
」均質相アッセイのための方法における重要なアプリケーションを含む。
【００２１】 本明細書の残りの部分において、「クリプテート」の概念ならびにまた、使用
され得るマクロ環およびポリ環の命名については、J.M. Lehn、「Struct. Bondi
ng (Berlin)」16, 1, 1973および「Acc. Chem. Res.」11, 49, (1978)に記載さ
れている。
【００２２】 本明細書では、用語「オリゴヌクレオチド」は： リン酸ジエステル型結合を介して相互に結合したリボヌクレオチドまたはデオ
キシリボヌクレオチド単位； あるいは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単位あるいは糖
または塩基上で修飾され、天然のホスホジエステル型相互ヌクレオチド結合（前
記相互ヌクレオチド結合のいくつかは随意にリン酸、ホスホルアミドもしくはホ
スホロチオエート結合で置き換えられる）を介して相互に結合したヌクレオチド
の類似体単位の鎖（これらの様々なオリゴヌクレオチドファミリーについては、
Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1(3), May/June 1990, 77-99に記載され
ている）； あるいは、ホスホジエステル型結合を介して相互に結合したリボヌクレオチド
またはデオキシリボヌクレオチド単位およびアミド結合を介して相互に結合した
ヌクレオシドの類似体単位（一般に「PNA」（ペプチド核酸）と呼ばれ、M. Egho
lmら、J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895-1897に記載されている）の両方を
含む鎖；（そのような鎖は、例えば、R. Vinayakら、Nucleoside & Nucleotide,
1997, 16 (7-9), 1653-1656に記載されている） のいずれか一方を意味することが意図される。
【００２３】 これらのタイプのオリゴヌクレオチドをそれぞれ使用することは、本発明の有
利な側面となる。
【００２４】 用語「類似体」またはヌクレオシド「類似体」は、糖または核酸塩基（nucleo
base）に関する少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチド／ヌクレオシド、もし
くはこれらの修飾の組み合わせを意味することが意図される。例えば、以下の修
飾が挙げられる：
【００２５】 Ｉ．糖に関する修飾（ヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体）： １）（遊離またはリン酸架橋に関与する）水酸基の立体配置が、例えば、バッ
クボーンのβ−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシドまたはβ−Ｄ−キシロ−ペント
フラノシドを有する類似体における天然の立体配置（それぞれ、DNA系列のβ−
Ｄ−エリスロおよびRNA系列のβ−Ｄ−リボである）とは異なる点において、糖
成分を修飾することができる。
【００２６】 ２）例えば、β−Ｄ−リボ−ペントフラノシド−2'−リン酸または3'−デオキ
シ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシド−2'−リン酸誘導体の場合において、
相互ヌクレオチド結合が2'→5'型である点において、構造を修飾することができ
る。
【００２７】 β−Ｄ−キシロ−ペントフラノシド−2'−リン酸などの上記の２つの修飾が構
造に含まれるヌクレオチドも存在する。
【００２８】 ３）4'炭素は対向する立体配置を有する（α−Ｌ−スレオ−ペントフラノシド
−3'−リン酸の場合）点において、構造は天然のモデルとは異なり得る。この差
異は、1'（アノマー位）の炭素の立体配置（α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシ
ド−3'−リン酸の場合）に関連し得る。β−Ｌ−スレオ−ペントフラノシド−3'
−リン酸などの上記の２つの修飾が構造に含まれるヌクレオチド／ヌクレオシド
も存在する。
【００２９】 ４）4'−チオ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシド−3'−リン酸のように、
4'の酸素が炭素（炭素環式（carbocyclic）類似体）またはイオウで置き換えら
れる点において、構造は天然のモデルとは異なり得る。
【００３０】 ５）例えば、バックボーン2'−Ｏ−アルキル−β−Ｄ−リボ−ペントフラノシ
ド−3'−リン酸のように糖の水酸基の１つがアルキル化され、該アルキル基は、
例えば、メチルまたはアリル基である可能性がある点において、構造は天然のモ
デルとは異なり得る。
【００３１】 ６）例えば、1,2−ジデオキシ−Ｄ−エリスロ−ペントフラノース−3−リン酸
のように、糖成分のみが変換される点、または糖がプロパンジオールなどのポリ
オールで置き換えられる点において、構造は天然のモデルとは異なり得る。
【００３２】 II．核酸塩基に関する修飾（ヌクレオチド類似体）： １）2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、4−チオチミン、4−チオウラシ
ルまたは5−エチニルウラシルなどのように、天然の塩基の置換基が修飾される
点において、核酸塩基を修飾することができる。
【００３３】 ２）イソグアノシンまたはイソシトシンなどのように、天然の塩基と比較して
、置換基の位置を変換することができる。
【００３４】 ３）7−デアザグアノシンまたは7−デアザアデニンなどのように、核酸塩基の
窒素原子を炭素原子で置き換えることができる。
【００３５】 さらに、上記のように、例えば、１以上の天然のホスホジエステル結合の酸素
原子を炭素（リン酸系列）、窒素（ホスホルアミド系列）もしくはイオウ（ホス
ホロチオエート）で置き換えることによって、糖単位またはその類似体間の結合
を修飾することもできる。
【００３６】 有利なことに、本発明の請求の範囲に記載の複合体のオリゴヌクレオチドは、
リボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチド単位から成り、それらのう
ち１つは前記単位に導入されるかもしくは作製される官能基、または3'もしくは
5'位の末端リン酸基に結合したスペーサーアームを使用して導入された官能基を
含み得る。
【００３７】 好適な局面によれば、前記単位は5'末端単位または3'末端単位である。
【００３８】 本発明に従って使用し得るオリゴヌクレオチドは、好ましくは、５〜50ヌクレ
オチドの鎖または５〜50ヌクレオチドおよび上記のヌクレオチドもしくはヌクレ
オシド類似体の鎖を含む。
【００３９】 本発明の特定の局面によれば、ホスホジエステル型結合を介して相互に結合し
たリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単位、およびアミド結合を
介して相互に結合したヌクレオシドの類似体単位の鎖から成るオリゴヌクレオチ
ドであって、クリプテートに結合することが意図された末端において少なくとも
５つのホスホジエステル型相互ヌクレオチド結合を含む上記オリゴヌクレオチド
が使用される。
【００４０】 好適な局面において、前記希土類金属クリプテートは、式
【化６】 （式中、Zは３または４価の原子であり、Rは存在しないかまたは水素、水酸基、
アミノ基もしくは炭化水素に基づくラジカルであり、２価のラジカル
【外７】 、
【外８】 および
【外９】 は、それぞれ独立して、随意に１以上のヘテロ原子を含有し、随意にヘテロマク
ロ環で中断される炭化水素に基づく鎖であって、ラジカル
【外１０】 、
【外１１】 および
【外１２】 の少なくとも１つはまた、少なくとも１つの分子単位を含むかまたは錯体形成し
た希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギ
ーを有する分子単位から本質的に成る）のマクロポリ環式化合物と錯体形成した
少なくとも１つの希土類金属塩から成る。
【００４１】 特に、前記希土類金属クリプテートは、分子単位がフェナントロリン、アント
ラセン、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニルおよびターフェニル、アゾベンゼン
、アゾピリジン、ピリジン、ビピリジン、ビスキノリンおよび以下の式： - C2H4 - X1 - C6H4 - X2 - C2H4 - - C2H4 - X1 - CH2 - C6H4 - CH2 - X2 - C2H4 - （式中、X1およびX2は同一であっても異なっていてもよく、酸素、窒素またはイ
オウである）
【化７】 （Xは酸素または水素である） の化合物から選択される式（Ｉ）に対応する。
【００４２】 有利なことに、前記希土類金属クリプテートは、以下のマクロ環式化合物： （22）フェナントロリン；（22）フェナントロリンアミド；（22）アントラセ
ン；（22）アントラセンアミド；（22）ビイソキノリン；（22）ビフェニルビス
ピリジン；（22）ビピリジン；（22）ビピリジンアミド；（22）マクロポリ環の
トリスビピリジン、トリスフェナントロリン、フェナントロリンビスビピリジン
、ビイソキノリンビスビピリジン、ビスピリジンジフェニルビピリジン の１つと錯体形成する希土類金属塩から成る。
【００４３】 そのような化合物については、例えば、欧州特許EP 180 492号に記載されてい
る。
【００４４】 分子単位がビピラジン、ビピリミジンおよびＮオキシド基を含む窒素含有へテ
ロ環から選択される希土類金属イオンと錯体形成するマクロポリ環式クリプテー
ト化合物を使用することもできる。
【００４５】 ビピラジン単位を含有するマクロポリ環式化合物については、F.Bodar-Houill
onら、「New J. Chem.」1996, 20, 1041-1045に記載されている。
【００４６】 ビピリミジンを含有するマクロポリ環式化合物については、J. M. Lehnら、「
Helv. Chim. Acta」1992, 75, 1221に記載されている。
【００４７】 Ｎオキシド基を含む窒素含有へテロ環を含むマクロポリ環式化合物については
、J.M. Lehnら、「Helv. Chim. Acta」1991, 74, 572に記載されている。
【００４８】 もう１つの有利な局面において、前記希土類金属クリプテートは、以下の式II
またはIII：
【化８】 （式中、以下の式：
【化９】 の環は以下の環：
【化１０】 の１つであり； Yは、随意に１以上の二重結合を含有するおよび／または随意に酸素、窒素、
イオウもしくはリンなどの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもし
くはカルボキシアミド基を含有する直鎖または分岐C1〜C20アルキレン基から選
択されるか、C5〜C8シクロアルキレン基から選択されるかあるいはC6〜C14アリ
ーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成るスペーサー基あるいはスペ
ーサーアームであり、前記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は
、随意にアルキル、アリールもしくはスルホン酸基で置換され； Zは生体物質に共有結合可能な官能基であり； Rはメチル基であるかまたは-Y-Z基を表し； R’は水素であるかまたは-COOR''基であって、ここで、R''はC1〜C10アルキル
基であり、好ましくはメチル、エチルまたはtert-ブチル基を表すか、あるいはR
’は-CO-NH-Y-Z基である） の１つに対応するマクロポリ環式化合物と錯体形成する少なくとも１つの希土類
金属塩から成る。
【００４９】 好適な局面によれば、本発明に従って使用される蛍光複合体の希土類金属クリ
プテートは、ユウロピウムクリプテートである。
【００５０】 有利な局面において、前記希土類金属クリプテートは、ユウロピウムクリプテ
ートEuトリスビピリジンまたはEu[ビスジエトキシビピリジン．ビピリジン]であ
る。
【００５１】 希土類金属クリプテートは、好ましくは、直接的またはスペーサーアームを介
するかのいずれかでオリゴヌクレオチドに共有結合する。
【００５２】 用語「直接結合」は、オリゴヌクレオチドの塩基もしくはペントフラノース単
位の１以上の原子に予め導入または作製されている官能基に蛍光標識を結合する
ことを意味することが意図される。
【００５３】 本明細書において、用語「官能基」は、ヌクレオチド成分によって生じるかま
たは当業者に既知の任意の手段によって導入され、クリプテート上もしくはクリ
プテートによって生じるスペーサーアーム上に存在する官能基に直接または活性
化後に共有結合することによって結合可能な任意の官能基を表す。そのような官
能基は特にNH2、COOH、CHO、OHまたはSH官能基であり、該官能基はまた、置換（
ハロゲン化物、スルホン酸塩、エポキシド）または付加（マレイミド型の二重結
合）によって共有結合を提供し得る。これらの官能基は、一般に、それ自体がヌ
クレオチド成分に結合している炭化水素に基づく鎖によって生じる。
【００５４】 これらの官能基を導入する方法については、特に、C. Kessler「Nonisotopic
probing, Blotting and Sequencing」第２版、L.J. Kricka (1995), Ed. Academ
ic Press Ltd., London、66-72頁に記載されている。本発明の好適な局面によれ
ば、希土類金属クリプテートは、スペーサーアームを介してオリゴヌクレオチド
に結合する。用語「スペーサーアーム」は、末端のリン酸を介して、プリンもし
くはピリミジン塩基の原子を介してまたは糖の原子を介して、オリゴヌクレオチ
ドをクリプテートに共有結合させる任意の手段を意味することが意図される。
【００５５】 有利な局面において、前記スペーサーアームは、随意に１以上の二重結合また
は三重結合を含有するおよび／または随意的に酸素、窒素、イオウもしくはリン
などの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもしくはカルボキシアミ
ド基を含有するC1〜C20直鎖または分岐アルキレン基、C5〜C8シクロアルキレン
基およびC6〜C14アリーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成り、前
記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、随意にアルキル、アリ
ールもしくはスルホン酸基で置換される。
【００５６】 特に、前記スペーサーアームは、以下の式の基：
【化１１】 （式中、ｎ＝２〜６である）、および-CONH-(CH2)6-、 （-CONH基を介する結合はクリプテート上で生じる） から選択される。
【００５７】 本発明のさらなる局面によれば、蛍光複合体は、例えば、抗原／抗体対、リガ
ンド／細胞レセプター対、ビオチン／アビジン対または核酸（特に、１本鎖また
はまたは２本鎖RNAもしくはDNA、あるいは１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチ
ド）およびそれらに相補的な塩基を含む核酸から成る対のような相互に特異的に
結合可能な分子の対のメンバーの１つの共有結合する。
【００５８】 本発明の方法の１つの局面によれば、標識として使用される蛍光複合体の蛍光
は、所定の波長においての励起後、蛍光標識によって直接的に発光する。
【００５９】 本発明の方法のもう１つの局面によれば、前記の蛍光複合体の他にもう１つの
蛍光標識がアッセイに使用される。この場合、アッセイにおいて測定される蛍光
は、励起後の複合体（「供与体化合物」と呼ばれる）ともう１つの蛍光分子（「
受容体化合物」と呼ばれる）との間の非放射性エネルギー遷移によって間接的に
発光する。
【００６０】 このような特定の場合、以下の条件を満たす： 第１に、受容体蛍光化合物は、供与体の発光スペクトルの少なくとも一部を含
みこの適用範囲で高いモル吸収を有する吸収スペクトル、および供与体が低い固
有の発光を示す波長範囲にある発光スペクトルを有する； 第２に、受容体および供与体は相互に類似し、それらの遷移双極子の配向はほ
ぼ平行である。
【００６１】 非放射性エネルギー遷移の教示内容の原理については、特に、G. Mathisら、
「Clin. Chem.」1993, 39, 1953-1959に記載されている。
【００６２】 供与体蛍光物質である複合体中のオリゴヌクレオチドに結合している希土類金
属クリプテートは、この場合、ユウロピウムクリプテートであってもよく、供与
体化合物は、例えば、アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、Ｃ-フィコ
シアニンまたはＲ-フィコシアニンから選択し得る。
【００６３】 以下の実施例を用いて本発明を例示する。実施例では以下の省略記号を使用す
るものとする。 BSA：ウシ血清アルブミン DTT：ジチオトレイトール SMCC：4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸のN-ヒドロキシス
クシンイミドエステル SMP：3-マレイミドプロピオン酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル SPDP：N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸 NBFCS：ウシ胎児血清 TEAB：重炭酸トリエチルアンモニウム TEA Ac：10％アセトニトリル含有酢酸トリエチルアンモニウム TCEP：トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
【００６４】 実施例１．血清存在下における遊離クリプテート[TBP-(Eu3+)]の光物理特性： 方法Ａ：LS50タイプのPerkin-Elmer分光蛍光計（spectrofluorimeter）上で蛍
光スペクトルおよび寿命を測定する。
【００６５】 欧州特許出願EP 0 321 353号の実施例４、セクションＡに記載のクリプテート
［(ビスbpy)-(byp-ジメチルエステル)］上でエチレンジアミンを反応させること
によって調製されるクリプテート[TBP-(Eu3+)]-ジアミン（１％トリフルオロ酢
酸を含有する水中アセトニトリルの直線勾配によりC-18カラム上のRP-HPLCによ
り精製し、次いで減圧下で乾燥）のストック溶液（100 Mリン酸緩衝液（pH７）
中９×10-6 M濃度）を調製する。以下の実施例では、このクリプテート[TBP-(Eu
3+)]-ジアミンをK-NH2と省略する。
【００６６】 １）このストック溶液の200μlを400μlの100 mMリン酸緩衝液、pH７で希釈し
、蛍光スペクトル（td＝0.1 ms、tg＝0.4 ms、λ励起＝306 nm、λ発光＝540〜7
50 nm、励起／発光スリット＝10／５、発光時黄色フィルター）および寿命ｔ（t
d＝0.1〜0.6 ms、tg＝0.4 ms、λ励起＝306 nm、λ発光＝620 nm、励起／発光ス
リット＝10／５、発光時黄色フィルター）を測定する。
【００６７】 主線（λem＝616 nm）はリン酸緩衝液中においてtP＝0.60 msの寿命（相関係
数C.C＝0.999）を有することが認められる。
【００６８】 ２）K-NH2のこのストック溶液の200μlを、200μlの100 mMリン酸緩衝液、pH
７と200μlのNBFCSとの混合液で希釈し、同条件下でスペクトルおよび寿命を測
定する。
【００６９】 主線（λem＝616 nm）はリン酸緩衝液中においてtS＝0.15 msの寿命（C.C＝0.
991）を有することが認められる。
【００７０】 表現形式Q＝100-100(tS/tP)により消光因子が求められ、即ち、Q＝100-100(0.
15/0.60)＝75、即ち、75％である。
【００７１】 方法Ｂ： 100 mMリン酸緩衝液中1.8×10-8 M濃度のクリプテート[TBP-(Eu3+)]-ジアミン
のストック溶液を調製する。
【００７２】 黒底マイクロプレート（96ウェルHTRFプレート、Packard）のウェルを、以下
のプロトコルに従って満たす。
【００７３】 条件１：クリプテートの100μlのストック溶液を、100μlの100 mMリン酸緩衝
液、pH７ならびに0.15 M NaClおよび0.1％BSAを含有する100μlの100 mMリン酸
緩衝液、pH７と混合する。２重で測定を行う。この媒体は参照を構成する。
【００７４】 条件２：クリプテートの100μlのストック溶液を、100μlのNBFCSならびに0.1
5 M NaClおよび0.1％BSAを含有する200μlの100 mMリン酸緩衝液、pH７と混合す
る（２重で測定）。
【００７５】 337 nmでのレーザー励起および50μs〜400μsの捕捉窓を使用して、蛍光の臨
界時間測定をDISCOVERY機（Packard）上で測定する。
【００７６】 リン酸緩衝液のみ（条件１）では、620 nmでの発光強度は1.41×105 afu（任
意蛍光単位）であることが認められる。同マイクロプレートの隣接するウェルに
おいて、血清を含有する溶液（条件２）の620 nmでの発光強度は2.9×104 afuを
示す。
【００７７】 リン酸緩衝液中の参照と比較して血清存在下での620 nmにおけるシグナルの強
度の減少によって、血清によって生じる消光の現象を実証することができる。 100−100[E620(血清)/E620(参照)]＝100−100(2.9×104/1.41×105)＝80％
【００７８】 この方法によって、寿命の減少または620 nmでの発光の減少のいずれかから生
じるシグナルの減少を全体的に見積もることが可能である。
【００７９】 本方法は、方法Ａに比較してより低い濃度での操作が可能であり、イムノアッ
セイで認められる条件に極めて近い条件下で手順を実施することによって、いく
つかのサンプルを同時に測定することができる。
【００８０】 実施例２．オリゴデオキシヌクレオチド−クリプテート[TBP-(Eu3+)]の合成およ
び精製： １）アミノヘキシルアームによって機能付けされたオリゴヌクレオチド（AH-O
DN1）の合成： DNAシンセサイザー（Applied Biosystemsタイプ392）を使用し、製造者のプロ
トコルに従い、亜リン酸−ホスホルアミダイト法を介して、固体支持体上でアミ
ノヘキシル（AH）アームで5'末端を修飾された配列5'-AHC ACG CCA CTA GCT CC- 3' のオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）を合成する。Rogetら、「Nucleic Acid
s Res.」17, 7643-7650, (1989)に記載のように、5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチ
ル)-N-4-(6-アミノヘキシル)-2'-デオキシシチジンのトリフルオロアセチル化に
よって調製される5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-N-4-(6-トリフルオロアセト
アミドヘキシル)-2'-デオキシシチジンから得られるN,N-ジイソプロピル-β-シ
アノエチル-ホスホルアミダイトをカップリングすることによって、修飾された
ヌクレオチドを5'に誘導する。
【００８１】 対応する使用手引書に従って、「トリチル−オン」モードでのDNA合成機（App
lied Biosystem 392）上で合成した後、オリゴヌクレオチドを濃アンモニア水溶
液で処理（55℃で16時間）し、「Oligonucleotide synthesis: A practical app
roach.」Ed M.J. Gait.編 IRL Press, Oxfordに記載の方法に従い、50 mM酢酸ト
リエチルアンモニウム中のアセトニトリルの勾配（緩衝液Ａ：５％アセトニトリ
ル、緩衝液Ｂ：50％；流速５ml／分、10％Ｂ〜60％Ｂの勾配（20分間）、60％Ｂ
のイソクラティック勾配（５分間）、次いで60％Ｂ〜100％Ｂの勾配（５分間）
）により、LiChrospherR RP-18E 250-10カラム（10μm）（Merck, Darmstat, Ge
rmany）上HPLCで精製する。主要ピーク（20分間を超える保持時間）に対応する
画分をエバポレートする。エバポレーションおよび水との同時エバポレーション
後、そのようにして得られる部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、80％
酢酸で脱トリチル化（室温、30分間）し、次いで、エバポレーションおよび同時
エバポレーション後、50μlの100 mM重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）、p
H８中に完全に脱保護したオリゴヌクレオチドを採り、1.5 mlのn-ブタノールで
沈殿させる。遠心分離後、上清を捨て、減圧下で乾燥した沈殿物を200μlの水に
採る。このストック溶液（AH-ODN1と呼ばれるオリゴヌクレオチド）は、37 AU26 0 ／mlの吸収を有する。
【００８２】 ２）アミノヘキシルアームによって機能付けされたオリゴヌクレオチド（AH-O
DN1）へのクリプテート[TBP-(Eu3+)]の分子のカップリング： 上記で得られたオリゴヌクレオチド（5.5 AU260、即ち、約39 nmol）のストッ
ク溶液のアリコート部（150μl）を150μlの0.1 M TEAB水溶液、pH 7.8で希釈し
、60μlの活性化されたクリプテート[TBP-(Eu3+)]の溶液（４mg／ml）、即ち、1
71 nmol（約４等量）を添加する。欧州特許出願EP 0 321 353号の実施例４、セ
クションＡに記載の[(ビスbipy)-(bipyジメチルエステル)]ユウロピウムクリプ
テートから得られる[(ビスbipy)-(bipy二塩基酸)]ユウロピウムクリプテート自
体から活性化された(N-ヒドロキシスクシンイミド／ジシクロヘキシルカルボジ
イミド)クリプテート[TBP-(Eu3+)]を即座に調製する。
【００８３】 30分間攪拌した後、15μlの１M TEAB、pH 8.5を添加し、続いて、200μlの容
量が得られるまで減圧（高速減圧）下でエバポレーションし、これを、10％アセ
トニトリルを含有する25 mM TEAAc緩衝液で平衡化したNAP10カラム（Pharmacia
）に充填し、次いで製造者のプロトコルに従って同緩衝液で溶出を行い、取り出
した画分を集めて容量を１mlとし、200μlの容量が得られるまでこの画分を濃縮
（高速減圧）する。
【００８４】 ３）クリプテート[TBP-(Eu3+)]とアミノヘキシルアームによって機能付けされ
たオリゴヌクレオチドとから形成される複合体（複合体KH-ODN1）の精製： 次の条件（緩衝液Ｃ：10％アセトニトリルを含有する20 mM酢酸ナトリウム、p
H５。10％アセトニトリルを含有する１M塩化リチウム。勾配：０〜２分間イソク
ラティック20％Ｄ、20％Ｄ〜60％Ｄの２分間〜30分間勾配、流速１ml／分）を使
用して、モノＱカラム（Pharmacia）上でFPLCによって複合体KH-ODN1を分析する
。
【００８５】 上記の条件下でFPLCによって分析したオリゴヌクレオチドAH-ODN1の保持時間
はRt＝16.4分間である。同条件下で、複合体KH-ODN1の保持時間はRt＝15.4分間
である。
【００８６】 次いで、NAP10カラムから取り出した全ての画分（200μl）をモノＱカラムに
注入し、15分間の保持時間に対応する画分を回収し、300μlまで濃縮し、10％ア
セトニトリルを含有する25 mM TEAAc緩衝液、pH７で平衡化したNAP10カラム上で
脱塩する。製造者のプロトコルに従い、同緩衝液を使用して溶出を行い、取り出
した画分を集めて容量を１mlとする。この画分は純粋な複合体KH-ODN1に対応し
、紫外スペクトルが258 nmで最大を示し（ODN成分）、約305 nmでショルダーを
示す（クリプテート成分）ことを特徴とする。吸収比Ａ260／Ａ305＝4.46は、個
別に採取した複合体の成分のモル吸収の比を計算することによって得られる理論
比：ε260(ODN)＋ε260(クリプテート)/ ε305(クリプテート)＝(135000＋19000
) /30000＝約５
【００８７】 複合体KH-ODN1の構造を図１に示す。
【００８８】 ４）クリプテート−オリゴヌクレオチド複合体（K-ODN2）： 上記のプロトコルに従って合成を反復して行い、オリゴヌクレオチド配列ACG
CCA CTA GCT CCの代わりにGGG GGT TTT TTT TTT (G5T10)を構築する。
【００８９】 実施例３．血清存在下におけるオリゴヌクレオチド−クリプテート[TBP-(Eu3+)]
複合体の光物理特性： 方法Ａ：LS50タイプのPerkin-Elmer分光蛍光計上で蛍光スペクトルおよび寿命
を測定する。
【００９０】 実施例２（３）で得られるオリゴヌクレオチド−クリプテート[TBP-(Eu3+)]複
合体のストック溶液を使用し、吸収を測定する［ε260(複合体) = ε260(ODN) +
ε260(クリプテート)＝約(154 000)］ことによって、見積もられる濃度を3.5×
10-6Mとする。
【００９１】 １）このストック溶液の200μlを水または400μlのリン酸緩衝液、pH７に希釈
し、蛍光スペクトル（td＝0.1 ms、tg＝0.4 ms、λ励起＝306 nm、λ発光＝540
〜750 nm、励起／発光スリット＝10／５、発光時黄色フィルター）およびまた寿
命ｔ（td＝0.1〜0.6 ms、tg＝0.4 mS、λ励起＝306 nm、λ発光＝620 nm、励起
／発光スリット＝10／５、発光時黄色フィルター）を測定する。
【００９２】 水またはリン酸緩衝液において、クリプテート[TBP-(Eu3+)]-ジアミンについ
て慣例的に認められるスペクトルプロフィールとは異なるスペクトルプロフィー
ルが認められ、主線（λem＝620 nm）はtP＝1.1 msの寿命を有する（相関係数C.
C＝0.999）。
【００９３】 ２）このストック溶液の200μlを、200μlの100 mMリン酸緩衝液、pH７と200
μlのNBFCSとの混合液で希釈し、同条件下でスペクトルおよび寿命を測定する。
【００９４】 主線（λem＝620 nm）はリン酸緩衝液中においてtS＝1.1 msの寿命（C.C＝0.9
9）を有することが認められる。
【００９５】 この場合、寿命の減少のため励起は認められない。
【００９６】 方法Ｂ： 実施例２（３）で得られるオリゴヌクレオチド−クリプテート[TBP-(Eu3+)]複
合体のストック溶液を使用する。260 nmで吸収を測定することによって、濃度は
3.5×10-6 Mと見積もられる。２×10-8 Mの最終濃度を得るため、ストック溶液
を100 Mリン酸緩衝液で希釈する。
【００９７】 黒底マイクロプレート（HTRF 96ウェルプレート、Packard）のウェルを、以下
のプロトコルに従って満たす。
【００９８】 条件１：複合体K-ODN1の100μlのストック溶液を、100μlの100 mMリン酸緩衝
液、pH７ならびに0.15 M NaClおよび0.1％BSAを含有する200μlの100 mMリン酸
緩衝液、pH７と混合する。２重で測定を行う。この媒体は参照を構成する。
【００９９】 条件２：複合体K-ODN1の100μlのストック溶液を、100μlのNBFCSならびに0.1
5 M NaClおよび0.1％BSAを含有する100μlの100 mMリン酸緩衝液、pH７と混合す
る（２重で測定）。
【０１００】 337 nmでのレーザー励起および50μs〜400μsの捕捉窓を使用して、蛍光の臨
界時間測定をDISCOVERY機（Packard）上で測定する。
【０１０１】 リン酸緩衝液のみ（条件１）では、620 nmでの発光強度は2.8×105 afu（任意
蛍光単位）であることが認められる。同マイクロプレートの隣接するウェルにお
いて、血清を含有する溶液（条件２）の620 nmでの発光強度は2.8×105 afuを示
す。
【０１０２】 この場合、リン酸緩衝液中の参照と比較して血清存在下での620 nmにおけるシ
グナルの強度の減少は認められない。従って、血清によって生じる消光の現象は
認められない。
【０１０３】 以下の式を使用して算出される消光は： 100−100[E620(血清)/E620(参照)]＝100−100(2.8×105/2.8×105)＝０％ である。
【０１０４】 実施例４：尿酸存在下におけるオリゴヌクレオチド−クリプテート複合体と参照
クリプテート[TBP-(Eu3+)]との光物理特性の比較： 本実施例を使用して、ユウロピウムクリプテート単位を含有する様々な分子の
光物理特性に対する尿酸の影響を比較する。
【０１０５】 評価しようとするクリプテート標識複合体の溶液（約２×10-8 M、実施例3Bを
参照のこと）または参照クリプテート溶液（約２×10-8 M、実施例1Bを参照のこ
と）のいずれかの同一量（100μl）を、マイクロプレートの１系列のウェルにピ
ペッティングする。
【０１０６】 それぞれの系列のウェルにおいて、0.15 M NaClおよび0.1％BSAを含有する200
μlの100 mMリン酸緩衝液、pH７を第１のウェル（スタンダード０）に添加し、
同緩衝液中に上昇濃度の尿酸を含有する200μlの溶液を、（例えば、０、５、10
、20、40および80 mg／lの最終濃度の尿酸を得るために）以後のウェルに添加す
る。
【０１０７】 337 nmでのレーザー励起および50μs〜400μsの捕捉窓を使用して、蛍光の臨
界時間測定をDISCOVERY機（Packard）上で測定する。
【０１０８】 それぞれの系列において、スタンダード０および尿酸のそれぞれの濃度につい
て、620 nmでの発光強度を測定する。それぞれの濃度について、以下の関係を使
用して、消光の百分率を評価する： 100−100[E620 (尿酸)／E620(スタンダード０)]
【０１０９】 結果を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】 クリプテートを含まない参照の消光百分率は、尿酸の濃度の関数として顕著に
上昇することが認められる。一方、クリプテート−オリゴヌクレオチド複合体の
消光百分率は、尿酸の最大濃度についてみても有意に低い。
【０１１２】 具体的には、５mg／mlの濃度において、参照クリプテートK-NH2は79％の消光
を示すが、同条件下で、クリプテート−オリゴヌクレオチド複合体K-ODN2は僅か
28％の消光しか示さない。
【０１１３】 実施例５．クリプテート[TBP-(Eu3+)]−アミノヘキシル−オリゴヌクレオチドマ
レイミド複合体の合成および精製： クリプテートで5'末端およびマレイミド反応基を有するアームで3'末端を機能
付けした配列G5T10のオリゴヌクレオチド（5'K-AH GGG GGT TTT TTT TT MCCAHC
T-3'）の合成。
【０１１４】 ２つのアミノヘキシルアームを有するオリゴヌクレオチドを使用して合成を実
施する。そのうちの１つは、以下のスキームに従って保護する（一般構造MMT-NH
-(CH2)6-(5'ODN3')-(CH2)6-NH2）。 MMT-AH GGG GGT TTT TTT TTAHCT→5'MMT-AH GGG GGT TTT TTT TTMCC-AHCT →5'AH GGG GGT TTT TTT TTMCC-AHCT→( 5'K-AH GGG GGT TTT TTT TT MCC-AHC T
-3')
【０１１５】 モノメトキシトリチル（MMT）基で保護された形で5'末端をアミノヘキシル（A
H）で修飾した配列5'MMT-AH GGG GGT TTT TTT TTAHC T-3'のオリゴヌクレオチド
（ODN）を以下の方法で合成する。
【０１１６】 5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-N-4-(6-トリフルオロアセトアミドヘキシル
)-2'-デオキシシチジンのN,N-ジイソプロピル-β-シアノエチルホスホルアミダ
イト誘導体を、実施例１（１）と同様の方法を使用して、Ｔカラム（１μmol）
にカップリングし、次いで、配列GGG GGT TTT TTT TTを構築することによって合
成を継続し、最後に、合成機の「トリチル-ON」オプションを使用して、モノメ
トキシトリチルアミノヘキシル-シアノエチルホスホルアミダイト誘導体（MMT-C
6−アミノ修飾剤、Cruachem）をカップリングする。オリゴヌクレオチド5'MMT-A
H GGG GGT TTT TTT TTAHCTを濃アンモニア水溶液で処理（55℃で16時間）し、実
施例１（１）に記載のプロトコルに従ってHPLCにより精製する。
【０１１７】 このようにして得られた部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチドを濃縮（高
速減圧）し、アリコート部（0.24μmol）を100μlの0.1 Mリン酸緩衝液、pH８と
ともに採り、100μlのアセトニトリル中５mgのSMCC（15μmol）（Sigma）で処理
する。室温で40分間攪拌後、混合物をその半分の容量まで濃縮（高速減圧）し、
25 mM TEAAc、pH７、５％アセトニトリル中で平衡化したNAP10カラム上で脱塩す
る。構造5'MMT-AH GGG GGT TTT TTT TTMCC-AHCTのオリゴヌクレオチドを含有す
る採取画分（１ml）を乾燥状態までエバポレートし、残渣を１mlの80％酢酸とと
もに採取し、室温で20分後、混合物を濃縮し、水とともに同時エバポレート（高
速減圧）し、次いで、300μlの水で採取する。この段階で、次の構造5'AH GGG G
GT TTT TTT TTMCC-AHCTを有する脱トリチル化オリゴヌクレオチドを得る。
【０１１８】 このオリゴヌクレオチド（300μl中0.175μmol）を300μlの0.1 M TEAB、pH７
で希釈し、次いで、実施例２に記載のように、活性化クリプテート[TBP-(Eu3+)]
の溶液（４mg／ml）の450μl（1.27 nmol、即ち、約７等量）を添加する。
【０１１９】 30分間の攪拌後、200μlの容量が得られるまで、混合液を減圧（高速減圧）下
でエバポレートし、これを、10％アセトニトリルを含有する25 mM TEAAc緩衝液
で平衡化したNAP10カラム（Pharmacia）に充填し、製造者のプロトコルに従って
、同緩衝液で溶出を行う。取り出された画分を集めて容量を１mlとし、200μlの
容量が得られるまで濃縮（高速減圧）する。取り出された画分は、主に、構造（ 5' -K-AH GGG GGT TTT TTT TT MCC-AHC T-3'）の標識オリゴヌクレオチドを含有
し、Sephadex G25を満たしたHR 10/30カラムに注入し、0.1 Mリン酸緩衝液、pH
７で、１ml／分の流速で溶出することによって、このオリゴヌクレオチドを精製
する。８〜11分間の間に溶出した画分を集める。このようにして、純粋なオリゴ
ヌクレオチド5'-K-AH GGG GGT TTT TTT TT MCC-AHC T-3'を含有する溶液の３ml
を得、これは、タンパク質のチオール基へのカップリングために直接使用するこ
とができる（Ａ260／Ａ305比＝７）。
【０１２０】 実施例６．クリプテート[TBP-(Eu3+)]−アミノヘキシル−オリゴヌクレオチド−
マレイミド複合体の抗体へのカップリング： 抗体をSPDP（Pierce）で機能付けし、DTTで還元後、Sephadex G25を満たしたH
R 10/30カラム上で活性化抗体を精製し、0.1 Mリン酸緩衝液、pH７で、１ml／分
の流速で溶出させる。活性化抗体を含有する画分を、マレイミド基で活性化した
クリプテート−オリゴヌクレオチド複合体（5'-K-AH GGG GGT TTT TTT TT MCC-A H C T-3'）とともに合わせて、実施例５に従って調製する。次いで、反応混合液
をSuperdex 200カラム上で精製し、上記のように溶出させ、抗体−オリゴヌクレ
オチド−クリプテート複合体を含有する画分を集める。
【０１２１】 実施例７．クリプテート[TBP-(Eu3+)]−アミノヘキシル−オリゴヌクレオチドマ
レイミド複合体のストレプトアビジンへのカップリング： 実施例６に記載のように、ストレプトアビジンを活性化させ、次いで、マレイ
ミド基で活性化したクリプテート−オリゴヌクレオチド複合体（5'-K-AH GGG GG
T TTT TTT TT MCC-AHC T-3'）を使用して標識し、実施例５に従って調製する。
【０１２２】 実施例８．タンパク質−オリゴヌクレオチド−クリプテート[TBP-(Eu3+)]複合体
の光物理特性： 実施例４のプロトコルに従って、尿酸の存在下で消光百分率を評価する。
【０１２３】 従来の免疫化学プロトコルに従い、（SMCCで活性化された）クリプテートを使
用して、抗体を標識することによって調製される参照クリプテート[TBP-(Eu3+)]
−抗体と比較して、実施例６に記載のプロトコルに従って調製されたクリプテー
ト[TBP-(Eu3+)]−オリゴヌクレオチド−抗体複合体を評価する。
【０１２４】 実施例７に従って調製されたクリプテート[TBP-(Eu3+)]−オリゴヌクレオチド
−ストレプトアビジン複合体も、従来の免疫化学プロトコルに従い、（SMCCで活
性化された）クリプテートを使用してストレプトアビジンを標識することによっ
て調製される参照クリプテート[TBP-(Eu3+)]−ストレプトアビジンと比較して評
価する。
【０１２５】 結果を表２に示す。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】 高濃度の尿酸では、参照クリプテート−複合体は86％の消光を示すが、同条件
下で、クリプテート−抗体複合体は、僅か28％の消光を示すことが認められる。
５〜10 mg／mlの間の隣接する尿酸濃度については、参照複合体の蛍光は50％ま
で減衰するが、本発明の化合物は10％未満の消光を示す。
【０１２８】 同様に、高濃度の尿酸条件下では、参照クリプテート−ストレプトアビジン複
合体は97％の消光を示すが、クリプテート−オリゴヌクレオチド−ストレプトア
ビジン複合体は僅か32％の消光を示す。
【０１２９】 実施例９．クリプテート[TBP-(Eu3+)]−マレイミド複合体のチオール−オリゴヌ
クレオチドへのカップリング： 欧州特許出願EP 0 321 353号の実施例４、セクションＡに記載のクリプテート
[(ビスbipy)-(bipyジメチルエステル)]をエチレンジアミンで処理し、次いで、R
P-HPLCによって精製して得られたクリプテートジアミンをSMCC（Pierce）または
SMP（Pierce）を処理して、マレイミド基を導入するようにする。このようにし
てクリプテート−マレイミド複合体を得る。RP-HPLC上で精製したクリプテート
−マレイミド複合体をチオール−オリゴヌクレオチド（以下のODN4）に結合する
。
【０１３０】 使用したオリゴヌクレオチドは以下の構造を有する： ODN3：DMT-O(CH2)6-SS-(CH2)6-p-d(TTT TTT TTT GGG GGAHCG)3'
【０１３１】 ジスルフィド架橋の形態でチオール官能基をオリゴヌクレオチドの5'末端に導
入する。ホスホルアミダイト（C6-ジスルフィドホスホルアミダイト、Cruachem
Ltd., Glasgow）を介してオリゴヌクレオチドの5'位の末端で機能付けを導入す
る。アンモニア性脱保護および精製（RP-HPLC）後、チオール官能基を除去する
ために、オリゴヌクレオチドをTCEP（Pierce, Rockford, IL）で処理する。
【０１３２】 そのようにして、以下の構造を有するオリゴヌクレオチドが得られる。 ODN4：HS-(CH2)6-p-d(TTT TTT TTT GGG GGAHCG)3'
【０１３３】 156 AU260／mlのODN3の溶液の15μlを85μlの水に添加し、TCEPの１mg／ml溶
液の50μlを添加し、20℃で20分間後、混合液を、（25 mM TEAAc、pH７、５％ア
セトニトリルで平衡化した）NAP 10カラムに充填し、カラムを溶出させ、採取容
積（約９nmのODN4を含有する１ml）を集め、高速減圧で（約100μlまで）濃縮し
、50μlの水中13 nmolのクリプテート−マレイミドを添加する。４℃で１晩のカ
ップリング後、NAP10（上記のような溶出）上で混合液を精製し、オリゴヌクレ
オチド−クリプテート複合体を採取容量（１ml）で溶出させる。遊離のクリプテ
ートの吸収を、分析FPLC（Sepharose G25（Pharmacia）を満たしたHR10/30カラ
ム、10 mMリン酸緩衝液、pH７による溶出）によって確認する。
【０１３４】 このようにして構造[bpy.bpy.bpy-Eu3+]-S-(CH2)6-p-d(TTT TTT TTT GGG GGAH CG)3'のオリゴヌクレオチド−クリプテート[TBP-Eu3+]が得られる。これは3'末
端付近でアミノヘキシルアームを有し、この複合体が生体分子に結合することを
可能にする。
【０１３５】 実施例10．実施例９に従って得られるオリゴヌクレオチド−クリプテート[TBP-E
u3+]複合体の光物理特性： Ａ．寿命 実施例３のプロトコル（方法Ａ）を使用して、実施例９で得られたクリプテー
ト−オリゴヌクレオチド複合体の水希釈中で寿命を測定する。
【０１３６】 水またはリン酸緩衝液では、主線（λem＝620 nm）がtP＝1.33 msの寿命を有
し（相関係数C.C＝0.999）、この長期の寿命は、クリプテート−オリゴヌクレオ
チド複合体について得られる1.1 msの値（実施例３Ａ）に匹敵することが認めら
れる。該クリプテート−オリゴヌクレオチド複合体の合成については、実施例２
に記載されている。
【０１３７】 Ｂ．尿酸による消光 実施例４に記載のように、尿酸による消光百分率を評価して、０、2.5、５、1
0、20、40および80 mg／lの尿酸の最終濃度が得られるようにする。
【０１３８】 遊離のクリプテートの参照サンプルを同じ方法で処理する。
【０１３９】 結果を以下の表３に示す。
【０１４０】
【表３】
【０１４１】 クリプテート−オリゴヌクレオチド複合体の構造は、実施例２に記載の複合体
について認められる尿酸と同じオーダーの尿酸による消光に対する耐性を示すこ
とが認められる。
【０１４２】 同様に、実施例3Aに従う寿命の測定では、主線（λem＝620 nm）がリン酸緩衝
液中においてtS＝1.1 msの寿命（C.C＝0.99）を有することが認められる。
【０１４３】 結論として、クリプテート単位とオリトヌクレオチドとの間の共有結合が作製
される方法は、複合体の光物理特性に対して実質的に何ら影響を及ぼさない。
【０１４４】 実施例11．クリプテート[ビスジエトキシbpy.bpy-(Eu3+)]-マレイミド複合体の
チオール−オリゴヌクレオチドへのカップリング： 本実施例では、２種の4,4'-ジエトキシ-2,2'-ビピリジン単位および１種の4,4
'-ジ(メチルカルボキシレート)-2,2'-ビピリジン単位から構成されるクリプテー
トを使用する。このクリプテートは、還流時にアセトニトリル中炭酸ナトリウム
の存在下、２等量の6,6'-ジブロモメチル-4,4'-ジエトキシ-2,2'-ビピリジンお
よび１等量の6,6'-ジアミノメチル-4,4'-ジ(メチルカルボキシレート)-2,2'-ビ
ピリジン誘導体の縮合によって、欧州特許出願EP 0 321 353号に記載の方法に従
って合成される。このようにしてクリプテート[ビスジエトキシbpy.ジCOOCH3bpy
] NaBrが得られる。次いで、還流時メタノール中のEuCl3.6H2Oにより、このナト
リウムクリプテートをユウロピウムクリプテート[ビスジエトキシbpy.ジCOOCH3b
py-Eu3+]に変換する。次いで、ユウロピウムクリプテートジメチルエステルをエ
チレンジアミンで処理（20℃で４時間）し、得られたユウロピウムクリプテート
ジアミン[ビスジエトキシbpy.(ジ-NH2(CH2)2-NHCO-bpy)-Eu3+]をRP-HPLCにより
精製する。
【０１４５】 参照クリプテートとしてこのクリプテートを使用するが、以下の実施例12では
これをK’NH2と呼ぶ。次いで、マレイミド基を導入するために、該クリプテート
をSMP（Pierce）で処理する。このようにして、クリプテート[ビスジエチトキシ
bpy.bipy-Eu3+]が得られる。実施例９に記載のプロトコルに従って、RP-HPLC上
で精製されたクリプテート−マレイミド複合体を、該実施例に記載のチオール−
オリゴヌクレオチドODN4にカップリングする。このようにして、オリゴヌクレオ
チド−[ビスジエトキシbpy.bpy-(Eu3+)]複合体が得られる。この複合体のUVスペ
クトルは、オリゴヌクレオチドに対応する約260 nmで最大となり、クリプテート
成分に対応する約305 nmおよび337 nmで２つのショルダーを示す。
【０１４６】 実施例12．実施例11に従って得られるオリゴヌクレオチド−クリプテート[ビス
ジエトキシbpy.bpy-(Eu3+)]複合体の光物理特性： リン酸緩衝液におけるオリゴヌクレオチド−クリプテート[ビスジエトキシbpy
.bpy-(Eu3+)]複合体（実施例11）の寿命の測定を、実施例に記載のプロトコルに
従い、対照クリプテートとして、実施例11に記載の化合物K'NH2を使用して実施
する。
【０１４７】 結果を以下の表４に示す。
【０１４８】
【表４】
【０１４９】 従って、血清を伴う参照K'NH2は、リン酸のみで認められる値と比較して、寿
命の有意な低下を生じる消光の現象を示すことが認められる。
【０１５０】 オリゴヌクレオチド−クリプテート[ビスジエトキシbpy.bpy-(Eu3+)]複合体は
血清の影響を受けないことが認められる。
【０１５１】 本実施例は、オリゴヌクレオチド成分の保護効果はクリプテートの構造に依存
しないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、複合体KH-ODN1の構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 トランケ，エリク フランス国，エフ−30130 ポン サン エスプリ，シュマン コロンビア Ｆターム(参考） 2G045 AA13 CA25 CA26 DA01 DA12 DA13 FA12 FA26 FA29 FB03 FB07 FB08 FB12 GC15 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR56 QS03 QS34 QX02

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 希土類金属クリプテートに結合したオリゴヌクレオチドを含
    む蛍光複合体が測定媒体に導入されることを特徴とする、少なくとも１つの蛍光
    標識を使用する分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消
    光を減少する方法。
  2. 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル型結合を介し
    て相互に結合したリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単位の鎖か
    ら成ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキ
    シリボヌクレオチド単位あるいは糖またはは塩基上で修飾され、天然のホスホジ
    エステル型相互ヌクレオチド結合、前記相互ヌクレオチド結合のいくつかは随意
    にリン酸、ホスホルアミドもしくはホスホロチオエート結合で置き換えられる、
    を介して相互に結合したヌクレオチドの類似体単位の鎖から成ることを特徴とす
    る、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル型結合を介し
    て相互に結合したリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単位および
    アミド結合を介して相互に結合したヌクレオシドの類似体単位の両方を含む鎖か
    ら成ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドあるいはデオ
    キシリボヌクレオチド単位から成り、それらのうち１つは前記単位に導入される
    かもしくは作製される官能基、または3'もしくは5'位の末端リン酸基に結合した
    スペーサーアームを使用して導入された官能基を含み得ることを特徴とする、請
    求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記単位は5'末端単位または3'末端単位であることを特徴と
    する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記オリゴヌクレオチドは、５〜50ヌクレオチドの鎖または
    ５〜50ヌクレオチドおよびヌクレオチドもしくはヌクレオシド類似体の鎖を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル型結合を介し
    て相互に結合したリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単位、およ
    びアミド結合を介して相互に結合したヌクレオシドの類似体単位の鎖から成り、
    前記オリゴヌクレオチドは、クリプテートに結合することが意図された末端にお
    いて少なくとも５つのホスホジエステル型相互ヌクレオチド結合を含むことを特
    徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記希土類金属クリプテートは、直接またはスペーサーアー
    ムを介してオリゴヌクレオチドに共有結合することを特徴とする、請求項１〜８
    のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記希土類金属クリプテートは、式 【化１】 （式中、Zは３または４価の原子であり、Rは存在しないかまたは水素、水酸基、
    アミノ基もしくは炭化水素に基づくラジカルであり、２価のラジカル 【外１】 、 【外２】 および 【外３】 は、それぞれ独立して、随意に１以上のヘテロ原子を含有し、随意にヘテロマク
    ロ環で中断される炭化水素に基づく鎖であって、ラジカル 【外４】 、 【外５】 および 【外６】 の少なくとも１つはまた、少なくとも１つの分子単位を含むかまたは錯体形成し
    た希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギ
    ーを有する分子単位から本質的に成る）のマクロポリ環式化合物と錯体形成した
    少なくとも１つの希土類金属塩から成ることを特徴とする、請求項１〜９のいず
    れか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記希土類金属クリプテートは、以下のマクロ環式または
    マクロポリ環式化合物： （22）フェナントロリン；（22）フェナントロリンアミド；（22）アントラセ
    ン；（22）アントラセンアミド；（22）ビイソキノリン；（22）ビフェニルビス
    ピリジン；（22）ビピリジン；（22）ビピリジンアミド；（22）マクロポリ環の
    トリスビピリジン、トリスフェナントロリン、フェナントロリンビスビピリジン
    、ビイソキノリンビスビピリジン、ビスピリジンジフェニルビピリジン；ビピラ
    ジン、ビピリミジンおよびＮオキシド基を含む窒素含有へテロ環から選択される
    分子単位を含むマクロポリ環式化合物 の１つと錯体形成する希土類金属塩から成ることを特徴とする、請求項１０に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記希土類金属クリプテートは、以下の式IIまたはIII： 【化２】 （式中、以下の式： 【化３】 の環は以下の環 【化４】 の１つであり； Yは、随意に１以上の二重結合を含有するおよび／または随意に酸素、窒素、
    イオウもしくはリンなどの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもし
    くはカルボキシアミド基を含有する直鎖または分岐C1〜C20アルキレン基から選
    択されるか、C5〜C8シクロアルキレン基から選択されるかあるいはC6〜C14アリ
    ーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成るスペーサー基あるいはスペ
    ーサーアームであり、前記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は
    、随意にアルキル、アリールもしくはスルホン酸基で置換され； Zは生体物質に共有結合可能な官能基であり； Rはメチル基であるかまたは-Y-Z基を表し； R’は水素であるかまたは-COOR''基であって、ここで、R''はC1〜C10アルキル
    基であり、好ましくはメチル、エチルまたはtert-ブチル基を表すか、あるいはR
    ’は-CO-NH-Y-Z基である） の１つに対応するマクロポリ環式化合物と錯体形成する少なくとも１つの希土類
    金属塩から成ることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記希土類金属クリプテートは、随意に１以上の二重結合
    または三重結合を含有するおよび／あるいは随意に酸素、窒素、イオウもしくは
    リンなどの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもしくはカルボキシ
    アミド含有するC1〜C20直鎖または分岐アルキレン基、C5〜C8シクロアルキレン
    基およびC6〜C14アリーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成るスペ
    ーサーアームを介してオリゴヌクレオチドに結合し、前記アルキレン、シクロア
    ルキレンまたはアリーレン基は、随意にアルキル、アリールまたはもしくはスル
    ホン酸基で置換されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 前記スペーサーアームは、以下の基： 【化５】 （式中、ｎ＝２〜６である）、および-CONH-(CH2)6-であって、-CONH基を介する
    結合はクリプテート上で生じる、 から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記希土類金属クリプテートは、ユウロピウムクリプテー
    トであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記希土類金属クリプテートは、ユウロピウムクリプテー
    トEuトリスビピリジンまたはEu[ビスジエトキシビピリジン．ビピリジン]である
    ことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記蛍光複合体が唯一の標識としてまたはアッセイにおけ
    る蛍光標識の１つとして使用されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれ
    か１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記蛍光複合体は、特に細胞レセプター、抗原、抗体また
    は核酸に特異的に相互に結合可能な分子の対のメンバーの１つに共有結合するこ
    とを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記蛍光複合体に加えて、受容体蛍光化合物を含む蛍光標
    識がアッセイにおいて使用されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか
    １項に記載の方法。
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