JP2002539161A

JP2002539161A - トロポニンサブユニット、それらの断片および相同体を含む医薬組成物ならびに血管形成を抑制するためのそれらの使用方法

Info

Publication number: JP2002539161A
Application number: JP2000604846A
Authority: JP
Inventors: ソーン，リチャード，エム．; ランサー，マーク，イー．; モーゼス，マーシャ，エー．; ウィエダースチェイン，デミトリ，ジー．
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2002-11-19
Also published as: AU774596B2; CA2367611A1; EP1165059A4; AU3744900A; EP1165059A1; WO2000054770A8; WO2000054770A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、異常な血管形成が関与する疾患または障害の治療のための、治療上有効な量のトロポニンＣ、ＩもしくはＴサブユニット、断片または相同体を含む医薬組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本願は、現在では米国特許第5,837,680号となっている米国特許出願第08/602,
941号（1996年２月16日出願）の継続出願である、係属中の米国特許出願第08/96
1,264号（1997年10月30日出願）の一部継続出願である、係属中の米国特許出願
第09/268,274号（1999年３月15日出願）の一部継続出願である。

【０００２】１．序本発明は、新規な医薬組成物、および異常な血管形成が関与する疾患または障
害の治療のためのそれらの使用方法を提供する。

【０００３】さらに詳細には、本発明は、部分的に、トロポニンサブユニットＣ、Ｉおよび
Ｔならびにそれらの断片が、刺激された内皮細胞の増殖を抑制する、という知見
に基づくものである。治療上有効な量のトロポニンＣ、ＩまたはＴサブユニット
、断片または相同体を含む医薬組成物、ならびにそれらの治療目的での使用の方
法が提供される。

【０００４】２．背景血管形成、つまり新しい血管の発達および形成のプロセスは、正常なものおよ
び病的なものの両者を含む多くの生理学的事象において重要な役割を担っている
。血管形成は、特定のシグナルに応答して起こり、脈管形成増殖シグナルに応答
した血管内皮細胞による基底膜の浸潤、該シグナル源への内皮細胞の移動、なら
びにそれに続いて起こる毛細血管の増殖および形成を特徴とする複合的なプロセ
スを含む。新たに形成された毛細血管を通る血流は、内皮細胞が先に存在する毛
細血管と接触して結合した後で開始する。

【０００５】血管形成の内因性の刺激物質と抑制物質との天然のバランスは、抑制的な影響
の方が優勢であるものである。Rastinejadら、1989，Cell 56:345-355。創傷の
癒合、器官の再生、胚の発生および雌の生殖プロセスのように正常な生理学的条
件下で新生血管形成が起こる、という極めて少ない場合には、血管形成は厳正に
調節され、空間的かつ時間的に範囲が限定される。充実性腫瘍の増殖などを特徴
とする病的な血管形成の条件下では、これらの調節的な制御は行われない。

【０００６】調節されていない血管形成は病的となり、多くの新形成性および非新形成性の
疾患の進行を持続させる。充実性腫瘍の増殖および転移、関節炎、あるタイプの
眼の障害、ならびに乾癬を含む多くの重篤な疾患が、異常な新生血管形成により
支配されている。例えば、Mosesら, 1991, Biotech. 9:630-634；Folkmanら, 19
95, N. Engl. J. Med., 333:1757-1763；Auerbachら, 1985, J. Microvasc. Res
. 29:401-411；Folkman, 1985, Advances in Cancer Research, KleinおよびWei
nhouse編, Academic Press, New York, 175-203頁；Patz, 1982, Am. J. Opthal
mol. 94:715-743；ならびにFolkmanら, 1983, Science 221:719-725による概説
を参照されたい。多くの病理学的症状において、血管形成のプロセスは、疾患の
状態の一因となる。例えば、充実性腫瘍の増殖が血管形成に依存することを示唆
する有意なデータが蓄積されている。FolkmanおよびKlagsbrun, 1987, Science
235:442-447．角膜、水晶体および小柱網の無血管状態の維持は、視覚に対して、ならびに眼
の生理学に対して極めて重要である。いくつかの眼の疾患があり、それらの多く
は失明に至るが、その場合、眼の新生血管形成は、罹患状態に応答して起こる。
これらの眼の障害としては、糖尿病性網膜症、血管形成緑内障、炎症性疾患およ
び眼腫瘍（例えば網膜芽腫）が挙げられる。また、新生血管形成に関連する多く
の他の眼の疾患もあり、例えば、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜
症、黄斑変性、ならびに脈絡膜の新生血管形成に関連する約20種の眼の疾患、お
よび虹彩の新生血管形成に関連する約40種の眼の疾患が挙げられる。例えば、Wa
ltmanら, 1978, Am. J. Ophthal. 85:704-710およびGartnerら, 1978, Surv. Op
hthal. 22:291-312による概説を参照されたい。現在のところ、これらの疾患の
治療は、特に新生血管形成が起こってしまうと不十分であり、失明に至る場合が
多い。研究から、正常な眼組織（角膜および硝子体）に存在する血管抑制因子は
罹患した状態では失われることが示唆されている。

【０００７】血管形成の抑制物質は、根底にある疾患の状態の病理学的進行に対するこのプ
ロセスの関与を制限すること、ならびにそれらの病因を調べる有効な手段を提供
することにおいて、重要な治療的役割を有する可能性がある。例えば、腫瘍新生
血管形成を抑制する物質は、転移性腫瘍増殖の抑制において重要な役割を担う可
能性がある。

【０００８】血管内皮細胞の増殖、移動および浸潤に関連する血管形成の成分は、ポリペプ
チド増殖因子により部分的に調節されることがわかっている。培養下での実験か
ら、適切な増殖因子を含有する培地に曝された内皮細胞が誘導されて、脈管形成
性応答の幾つかまたは全部を誘発することが示されている。in vitroでの内皮増
殖促進活性を有する幾つかのポリペプチドが同定されている。例としては、酸性
および塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ、
血小板由来の内皮細胞増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン-8
、肝細胞増殖因子、プロリフェリン、血管内皮増殖因子および胎盤増殖因子が挙
げられる。例えば、Folkmanら, 1995, N. Engl. J. Med., 333:1757-1763による
概説を参照されたい。

【０００９】幾つかの異なる組織供給源からの抽出物は抗脈管形成活性を含むことが示され
ているが、血小板第４因子、トロンボスポジン、プロタミンおよびトランスフォ
ーミング増殖因子Ｂのような幾つかの分子は、細胞増殖または細胞移動などの血
管形成の異なる面を負に調節することがわかっている。血管形成を抑制できる単
一の組織由来の高分子は、従来技術では同定されていない。例えば、Folkman, J
., 1995, N. Engl. J. Med. 333:1757-1763およびD’Amore, 1985, Prog. Clin.
Biol. Res. 221:269-283による概説を参照されたい。したがって、血管形成の
連続する脱調節された伝播を阻止でき、かつ新生血管形成が顕著な役割を担う疾
患の治療薬として広い適用性を有する可能性のある化学的物質のさらなる同定お
よび特性決定が非常に必要とされている。

【００１０】毛細血管の内皮細胞（「EC」）は、新生血管形成の際に、脈管形成性刺激物質
に応答して増殖する。AusprunkおよびFolkman, 1977, J. Microvasc. Res. 14:1
53-65。酸性または塩基性繊維芽増殖因子（それぞれaFGFおよびbFGF）のような
既知の血管形成刺激因子に応答した内皮細胞の増殖を評価するin vitroアッセイ
は、in vitroでの血管形成のプロセスを模倣するために開発された。このタイプ
のアッセイは、種々の脈管形成因子による毛細血管EC増殖の刺激を実証するため
の選り抜きのアッセイである。Shingら, 1984, Science 223:1296-1298．細胞外マトリックスを介しての脈管形成性刺激物質に向かう毛細血管EC移動の
プロセスはまた、血管形成に必要とされる重要な事象である。例えば、Ausprunk
ら, 1977, J. Microvasc. Res. 14:53-65による概説を参照されたい。このプロ
セスは、in vitroでの新生血管形成のプロセスを模倣するためのもう１つのアッ
セイを提供する。Boydenのチャンバー法（Boyden chamber technique）の変法は
、ECの移動をモニターするために開発された。Boydenら, 1962, J. Exptl. Med.
115:453-456, 実施例４。現在まで、わずかに数種の組織由来EC細胞移動抑制物
質が知られているだけである。例えば、Langerら, 1976, Science 193:70-72に
よる概説を参照されたい。

【００１１】 1970年代初期には、多くのin vivo脈管形成モデルバイオアッセイが広く用い
られた。これらのモデル系として、ウサギの角膜嚢（corneal pocket）、ニワト
リ絨毛尿膜（「CAM」）、ラットの背部肺胞嚢（air sac）およびウサギの気胞（
air chamber）のバイオアッセイが挙げられる。概説として、Bloodら, 1990, Bi
ochem. et Biophys. Acta 1032:89-118を参照されたい。血管形成刺激物質およ
び抑制物質のような大きな分子を放出することができる制御放出性ポリマーの開
発は、これらのアッセイの使用に重要であった。Langerら, 1976, Nature 263:7
97-800。

【００１２】 CAMバイオアッセイでは、受精したニワトリ胚をシャーレ内で培養する。発生
の６日目に、被験サンプルまたは適切な対照物質を含浸させた放出性ポリマーの
ディスク（例えばメチルセルロースのディスク）を、脈管膜の発達端に載せる。
発生の８日目、この移植片の周りの領域を観察し、評価する。試験移植片の周囲
に無血管ゾーンがあれば、胚の新生血管形成の抑制物質が存在することが示され
る。Mosesら, 1990, Science, 248:1408-1410およびTaylorら, 1982, Nature, 2
97:307-312。CAMアッセイにおいて単独で試験された従来記載されている血管形
成抑制物質の報告されている用量は、50μgのプロタミン［Taylorら(1982)］、2
00μgのウシ硝子体抽出物（Luttyら, 1983, Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 24:
53-56）、および10μgの血小板第IV因子［Taylorら(1982)］である。組合せとし
て有効な血管形成抑制物質の報告された最低用量としては、Folkmanら, 1989, S
cience 243:1490により報告されたヘパリン（50μg）とハイドロコルチゾン（60
μg）、およびB-シクロデキストリンテトラデカスルフェート（14μg）とハイド
ロコルチゾン（60μg）である。

【００１３】ウサギ角膜嚢アッセイによれば、エチレン-酢酸ビニル共重合体（「EVAC」）
のポリマーペレットに試験物質を含浸させ、ウサギ角膜の嚢の縁から約１mmのと
ころに外科的に移植する。Langerら, 1976, Science 193:707-72。血管形成抑制
物質について試験するために、一片の癌または幾つかの他の脈管形成性刺激物質
を該ポリマーから離して、縁から２mmのところに移植する。各ウサギの逆側の眼
には、何も含浸させていない対照のポリマーペレットを、同様にして、脈管形成
性刺激物質の隣に移植する。これらの対照角膜では、５〜６日以内に毛細血管が
腫瘍の移植片に向かって増殖し始め、最終的にはブランクのポリマーの上に広が
る。試験角膜では、新しい毛細血管の縁の血管から腫瘍へ向かう指向性の増殖は
低い割合で起こり、その増殖は抑制されて該ポリマー周辺の無血管領域が観察さ
れるようになることが多い。このアッセイは、立体特異的顕微鏡を用いて最大血
管長を測定することにより定量化される。

【００１４】トロポニンは３種のポリペプチドの複合体であり、これは、脊椎動物の筋肉中
のアクチンフィラメントに密接に結合するアクセサリータンパク質である。この
トロポニン複合体は、トロポミオシンの筋肉形態と共に作用して、ミオシンATPa
se活性のCa²⁺依存性を媒介し、それにより筋肉収縮を調節する。トロポニンポリ
ペプチドＴ、ＩおよびＣは、それぞれ、それらのトロポミオシン結合、抑制およ
びカルシウム結合活性によって命名されている。トロポニンＴは、トロポミオシ
ンに結合し、筋肉の細いフィラメント上でのトロポニン複合体の配置に関与する
と考えられる。トロポニンＩはアクチンに結合し、トロポニンＩおよびＴならび
にトロポマイシンにより形成される複合体はアクチンとミオシンとの相互作用を
抑制する。トロポニンＣは、最大４個のカルシウム分子に結合することができる
。研究から、筋肉中のカルシウムのレベルが上昇すると、トロポニンＣにより、
トロポニンＩがアクチン分子上でのその保持が解除され、その結果、トロポマイ
シン分子のシフトが起こり、そのために、アクチン上のミオシン結合部位を露出
させ、ミオシンATPase活性を刺激することが示唆されている。

【００１５】本明細書中の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であ
ると認めるものではない。

【００１６】３．発明の概要本発明は、例えば内皮細胞の増殖を抑制することにより血管形成を抑制するこ
とができる、トロポニンサブユニットＣ、ＩもしくはＴ、またはその断片を治療
上有効な量で含む医薬組成物に関する。本発明はまた、例えば内皮細胞の増殖を
抑制することにより血管形成を抑制することができる、トロポニンサブユニット
Ｃ、ＩもしくはＴの相同体およびその断片の相同体を治療上有効な量で含む医薬
組成物に関する。本発明はさらに、本発明の治療用化合物の投与による新生血管
形成性障害の治療に関する。そのような治療用化合物（本明細書中では「治療薬
（Therapeutics）」と呼ぶ）としては以下のものが挙げられる：トロポニンサブ
ユニットＣ、ＩおよびＴ、ならびにそれらの断片および相同体、特に、抑制（I
’）領域とカルボキシ末端（C’）領域とを含むトロポニンサブユニットＩの断
片。１つの実施形態において、本発明の治療薬は、癌性の症状を治療するために
、例えば充実性腫瘍の増殖を抑制するかその容積を低減するために、または前新
形成性もしくは前悪性状態から新形成性もしくは悪性状態への進行を阻止するた
めに、または転移を抑制するために投与される。別の特定の実施形態では、本発
明の治療薬は、新生血管形成に関連する眼の障害を治療するために投与される。
本明細書で用いる「トロポニンサブユニット」なる用語は、Ｃ、ＩまたはＴとい
う用語の前に付かない場合、包括的にトロポニンサブユニットＣ、ＩまたはＴの
いずれかを意味する。トロポニンＩのアミノ末端領域、抑制領域およびカルボキ
シ末端領域は、それぞれN’、I’およびC’と示される。

【００１７】４．図面の簡単な説明（図面の説明については下記参照）５．発明の詳細な説明本発明は、トロポニンサブユニットをベースとする治療方法および治療用組成
物に関する。本発明は、例えば血管形成を抑制することによる新生血管形成性障
害の治療を提供し、これは本発明の治療用化合物の投与を含んでなる。そのよう
な治療用化合物（本明細書中では「治療薬」と呼ぶ）としては、トロポニンＣ、
ＩおよびＴサブユニット、それらの断片および相同体（総称して「本発明のペプ
チド」と呼ぶ）が含まれる。本発明のペプチドは、培養下でのウシ内皮細胞（EC
）の増殖を、好ましくは約10μM以下のIC₅₀、さらに好ましくは約５μM以下のIC₅₀ 、最も好ましくは約１μM以下のIC₅₀で抑制するという特性を特徴とする。好
ましい実施形態では、本発明の治療薬は、癌性の症状を治療するために、例えば
充実性腫瘍の増殖を抑制するかその容積を低減するために、または前新形成性も
しくは前悪性状態から新形成性もしくは悪性状態への進行を阻止するために、ま
たは転移を抑制するために投与される。別の特定の実施形態では、本発明の治療
薬は、新生血管形成に関連する眼の障害を治療するために投与される。

【００１８】好ましい実施形態において、本発明の治療薬は、トロポニンＣ、トロポニンＩ
、トロポニンＴまたはそれらの組合せの少なくとも１つの断片からなるペプチド
であり、これは血管形成を抑制するのに有効である。さらに好ましくは、該治療
薬は、トロポニンサブユニットＩまたはその断片の抑制（I’）領域およびカル
ボキシ末端（C’）領域（C’＋I’）（配列番号14）からなるペプチドである。

【００１９】特定の実施形態では、本発明のペプチドは、哺乳動物種（例えばヒト、ウサギ
、ラット、マウス、ウシ、ヒツジおよびブタ）の速筋、遅筋および心臓のアイソ
フォーム由来のトロポニンＣ、トロポニンＩおよびトロポニンＴサブユニットま
たはそれらの断片である。

【００２０】別の実施形態では、本発明のペプチドは、好ましくは哺乳動物種（例えばヒト
、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジおよびブタ）の非筋肉組織（例えば軟
骨）由来のトロポニンＣ、トロポニンＩおよびトロポニンＴサブユニットまたは
それらの断片である。

【００２１】本発明にしたがって用いることができるトロポニンサブユニットの例としては
、ヒト速筋（fast twitch）骨格筋由来のトロポニンのサブユニットが挙げられ
（しかし、それに限定されない）、その配列を以下に示す。

【００２２】別の実施形態において、本発明は、トロポニンＣ（配列番号１）もしくはその
断片、トロポニンＩ（配列番号２、１０もしくは１５）もしくはその断片、また
はトロポニンＴ（配列番号３）もしくはその断片に相同なペプチドを包含する。

【００２３】好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、トロポニンＩの断片（配列
番号11〜15）、またはトロポニンＩの断片（配列番号11〜15）の相同体である。

【００２４】特定の実施形態において、本発明の治療薬は、治療上有効な量の別の分子と組
み合わせたものであり、この別の分子とは、血管形成を負に調節するものであり
、血小板第４因子、トロンボスポジン-1、メタロプロテアーゼの組織抑制物質（
TIMP1およびTIMP2）、プロラクチン（16-Kd断片）、アンジオスタチン（プラス
ミンノーゲンの38Kd断片）、bFGF可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子
β、インターフェロンαおよび胎盤プロリフェリン関連タンパク質が挙げられる
が、それらに限定されない。

【００２５】逆説的には、新生血管形成は、腫瘍内での増大した間隙圧力のために化学療法
剤への腫瘍の接近性を徐々に低下させ、このことは、脈管の圧迫および中心壊死
を引き起こす。in vivoでの結果から、脈管形成治療を受けている齧歯動物が、
化学療法剤の腫瘍への送達の増大を示すことが実証されている。Teicherら, 199
4, Int. J. Cancer 57:920-925。したがって、１つの実施形態において、本発明
は、化学療法剤と組み合わせた本発明の医薬組成物を提供する。

【００２６】別の好ましい態様において、本発明の治療薬は、化学療法剤または放射性同位
元素への暴露と組み合わせる。

【００２７】本発明を以下の実施例により説明するが、それら実施例は、特に、トロポニン
サブユニットＣ、ＩおよびＴによる毛細血管内皮細胞の増殖の抑制、ならびにト
ロポニンサブユニットによるin vivoでの毛細血管内皮細胞の移動の抑制および
新生血管形成の抑制を判定するための手段を開示している。

【００２８】開示内容を明確にするために、そして限定しないという目的で、本発明の詳細
な説明は以下に述べるサブセクションに分ける。

【００２９】5.1. トロポニンサブユニット、断片および相同体本発明は、トロポニンサブユニット、その断片および相同体を含む医薬組成物
を提供する。特定の態様において、該サブユニット、断片または相同体は、ハエ
、カエル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、イヌ、サルまたはヒトのトロ
ポニンサブユニットのものである。

【００３０】他の実施形態において、本発明は、トロポニンC（配列番号１）またはその断
片に相同なペプチドを包含する。１つの実施形態において、該ペプチドのアミノ
酸配列は、それが由来するトロポニンCに対して少なくとも80％の同一性を有す
る。他の実施形態において、この同一性は85％を超える。より好適な実施形態に
おいて、この同一性は90％を超える。最も好適な実施形態において、該ペプチド
のアミノ酸配列は、トロポニンCまたはその断片に対して少なくとも95％の同一
性を有する。断片は、一般的には少なくとも10アミノ酸長であり、そして他の実
施形態では、少なくとも20、30、40、50、75および100アミノ酸長である。

【００３１】他の実施形態において、本発明は、低ストリンジェンシー条件下、中程度のス
トリンジェンシー条件下、または高ストリンジェンシー条件下において、トロポ
ニンサブユニット（好ましくはトロポニンC）をコードする核酸の相補配列にハ
イブリダイズ可能な核酸によってコードされるトロポニン提示サブユニット（tr
oponin submit subunit）またはその断片を包含する。

【００３２】他の実施形態において、本発明は、トロポニンI（配列番号2、10または15）ま
たはその断片に相同なペプチドを包含する。１つの実施形態において、該ペプチ
ドのアミノ酸配列は、トロポニンIまたはその断片に対して少なくとも80％の同
一性を有する。他の実施形態において、この同一性は85％を超える。より好適な
実施形態において、この同一性は90％を超える。最も好適な実施形態において、
該ペプチドのアミノ酸配列は、トロポニンIまたはその断片に対して少なくとも9
5％の同一性を有する。断片は、一般的には少なくとも4アミノ酸長であり、そし
て他の実施形態では、少なくとも8、10、20、30、40、50、75および100アミノ酸
長である。

【００３３】他の実施形態において、本発明は、低ストリンジェンシー条件下、中程度のス
トリンジェンシー条件下、または高ストリンジェンシー条件下において、トロポ
ニンサブユニット（好ましくはトロポニンI）をコードする核酸の相補配列にハ
イブリダイズ可能な核酸によってコードされるトロポニン提示サブユニットまた
はその断片を包含する。

【００３４】他の実施形態において、本発明は、トロポニンT（配列番号3）またはその断片
に相同なペプチドを包含する。１つの実施形態において、該ペプチドのアミノ酸
配列は、トロポニンTまたはその断片に対して少なくとも80％の同一性を有する
。他の実施形態において、この同一性は85％を超える。より好適な実施形態にお
いて、この同一性は90％を超える。最も好適な実施形態において、該ペプチドの
アミノ酸配列は、トロポニンTまたはその断片に対して少なくとも95％の同一性
を有する。断片は、一般的には少なくとも10アミノ酸長であり、そして他の実施
形態では、少なくとも20、30、40、50、75、100、150および200アミノ酸長であ
る。

【００３５】他の実施形態において、本発明は、低ストリンジェンシー条件下、中程度のス
トリンジェンシー条件下、または高ストリンジェンシー条件下において、トロポ
ニンサブユニット（好ましくはトロポニンT）をコードする核酸の相補配列にハ
イブリダイズ可能な核酸によってコードされるトロポニン提示サブユニットまた
はその断片を包含する。

【００３６】好適な実施形態において、本発明は、抑制性（I’）およびカルボキシ末端（C
’）領域（C’+I’）（配列番号14）に相同なペプチドを包含する。他の実施形
態において、本発明は、以下に記載する配列番号17のアミノ酸残基（ただしこれ
らに限定されない）に対応するヒトトロポニンI(huTnI) （配列番号17）のC’+I
’領域に相同なペプチドを包含する：すなわち、94〜123（huTnI_94-123）、104
〜133（huTnI_104-133）、114〜143（huTnI_114-143）、129〜153（huTnI_129-153
）、134〜173（huTnI_134-173）、144〜182（huTnI_144-182）、93〜112（huTnI₉₃ _-112 ）、98〜117（huTnI_98-117）、103〜122（huTnI_103-122）、108〜127（huTn
I_108-127）、113〜132（huTnI_113-132）、およびカルボキシ末端領域（C’）、1
18〜137（huTnI_118-137）。

【００３７】他の実施形態は、94〜113（huTnI_94-113）、98〜117（huTnI_98-117）、102〜1
21（huTnI_102-121）、106〜125（huTnI_106-125）、110〜129（huTnI_110-129）お
よび114〜133（huTnI_114-133）を含む。さらに他の実施形態は、ヒトトロポニン
I(huTnI)のカルボキシ末端領域（C’）、116〜123（huTnI_116-123）、118〜125
（huTnI_118-125）、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、12
4〜131（huTnI_124-131）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135 ）、130〜137（huTnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139）、134〜141（huTnI₁ _34-141 ）、および136〜143（huTnI_136-143）を含む。断片は、一般的には少なく
とも4アミノ酸長であり、そして他の実施形態では、少なくとも8、10、20、30、
40、50および75アミノ酸長である。

【００３８】本明細書中「相同な」とは、同じサイズのアミノ酸配列に対する同一性、或い
はアラインメントされた配列（アラインメントは、当分野で公知のコンピュータ
ホモロジープログラムによって行われる）と比較したときの同一性、或いはその
コード核酸であって、高ストリンジェンシー条件下、中程度のストリンジェンシ
ー条件下または低ストリンジェンシー条件下でコード遺伝子配列にハイブリダイ
ズすることができるコード核酸に対する同一性を指す。

【００３９】具体的な例として、相同性決定のためのコンピュータプログラムには、TBLAST
N、BLASTP、FASTA、TEASTAおよびCLUSTALWが含まれるが、これらに限定されない
（PearsonおよびLipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-8; Al
tschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-10; Thompsonら, 1994, Nucleic
Acids Res. 22(22): 4673-80; Higginsら, 1996, Methods Enzymol 266: 383-40
2; Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-10）。これらのコンピュータ
プログラムの各々のデフォルトパラメータは周知であり、これらを使用すべきで
ある。

【００４０】具体的には、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.
gov;相同性を決定するためにはデフォルトパラメータを設定してこのサイトで利
用できる最も最新のバージョンのBLASTプログラムを用いて利用されたい)（Alts
chulら, 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, “The BLAST Algorithm; Al
tschulら, 1997, Nuc. Acids Res. 25: 3387-3402”）は、KarlinおよびAltschu
l（1990, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:2264-68; 1993, Proc. Nat’l Acad.
Sci. USA 90:5873-77）の統計的方法を用いて有意性のある配列類似性を検索す
るために開発された発見的検索アルゴリズム（heuristic search algorithm）で
ある。5つの具体的なBLASTプログラムは、以下のタスクを実行する：１）BLASTP
プログラムはタンパク質配列のデータベースとアミノ酸問合せ配列を比較する；
２）BLASTNプログラムはヌクレオチド配列のデータベースとヌクレオチド問合せ
配列を比較する；３）BLASTXプログラムは、ヌクレオチド問合せ配列（両方の鎖
）の6-フレームの概念的翻訳産物（conceptual translation product）をタンパ
ク質配列のデータベースと比較する：４）TBLASTNプログラムは、タンパク質問
合せ配列を、6つ全てのリーディングフレーム（両方の鎖）で翻訳されたヌクレ
オチド配列のデータベースと比較する；５）TBLASTXプログラムは、ヌクレオチ
ド問合せ配列の6-フレームの翻訳を、ヌクレオチド配列のデータベースの6-フレ
ームの翻訳と比較する。

【００４１】 Smith-Waterman（データベース：European Bioinformatics Institute wwwz.e
bi.ac.uk/bic_sw/）（Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147: 195-1
97）は、配列アラインメントのための非常に正確なアルゴリズムである。

【００４２】 FASTA（Pearsonら, 1988, Proc. Nat’l Acad.Sci. USA, 85:2444-2448を参照
されたい）は、Smith-Watermanアルゴリズムの発見的近似（heuristic approxim
ation）である。BLAST、Smith-WatermanおよびFASTAアルゴリズムの手法および
利点の概説については、Nicholasら, 1998, “A Tutorial on Searching Sequen
ce Databases and Sequence Scoring Methods”(www.psc.edu)およびそこに記載
された参考文献を参照されたい。

【００４３】トロポニンサブユニットおよび断片は、野生型全長トロポニンサブユニットに
関連する１以上の機能的活性を示すことができる機能的に同等な分子を提供する
置換、付加または欠失によってトロポニン配列を改変することによって作製する
ことができると考えられる。このような機能的活性には、血管形成の抑制、転移
の抑制、腫瘍増殖の抑制が含まれるがこれらに限定されない。これらには、トロ
ポニンサブユニット、断片、または主なアミノ酸配列としてトロポニンサブユニ
ットのアミノ酸配列の全体もしくは一部を含む相同体（例えばその配列の中の残
基が機能的に同等なアミノ酸残基で置換されてサイレント変化を起こしている改
変配列等）が含まれるがこれらに限定されない。例えば、その配列の中の１以上
のアミノ酸残基は、機能的同等物として機能する極性の似た他のアミノ酸によっ
て置換されて、サイレント変化をもたらすことができる。その配列の中のアミノ
酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することが
できる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロ
イシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニ
ンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システ
イン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正電荷（塩基性）
アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負電荷（酸性
）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。

【００４４】本発明の１つの実施形態は、上記のように内皮細胞の増殖を抑制することがで
きるトロポニンサブユニットの少なくとも4つの（連続する）アミノ酸の断片か
らなるまたは該断片を含む分子を提供する。他の実施形態において、この分子は
、トロポニンサブユニットの少なくとも8、10、20または50アミノ酸からなる。
特定の実施形態において、このような分子は、トロポニンサブユニットの少なく
とも8、10、20、30、40、50、75、100および150アミノ酸長の断片からなるまた
は該断片を含み、例えばC’+I’（配列番号14）、huTnI_94-123、huTnI_104-133、
huTnI_114-143、huTnI_129-153、huTnI_134-173、huTnI_144-182、huTnI_93-112、huT
nI_98-117、huTnI_103-122、huTnI_108-127、huTnI_113-132、およびカルボキシ末端
領域（C’）huTnI_118-137が挙げられるがこれらに限定されない。

【００４５】他の実施形態は、94〜113（huTnI_94-113）、98〜117（huTnI_98-117）、102〜1
21（huTnI_102-121）、106〜125（huTnI_106-125）、110〜129（huTnI_110-129）お
よび114〜133（huTnI_114-133）を含む。さらに他の実施形態は、カルボキシ末端
領域（C’）、116〜123（huTnI_116-123）、118〜125（huTnI_118-125）、120〜12
7（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、1
26〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-13 ₇ ）、132〜139（huTnI_132-139）、134〜141（huTnI_134-141）、および136〜143
（huTnI_136-143）を含む。

【００４６】好適な実施形態において、該タンパク質は、哺乳動物のトロポニンサブユニッ
トである。より好適な実施形態において、タンパク質は、哺乳動物トロポニンC
、IまたはTサブユニットである。

【００４７】本発明のトロポニンサブユニット、断片および相同体は、組織から得ることが
できる（例えば第6節、実施例１および7；Ebashiら，1968, J. Biochem. 64:465
; Yasuiら, 1968, J. Biol. Chem. 243: 735; Hartshorneら, 1968, Biochem. B
iophys. Res. Commun. 31;647; Shaubら, 1969, Biochem. J. 115:993; Greaser
ら, 1971, J. Biol. Chem. 246: 4226-4733; Brekkeら, 1976, J. Biol. Chem. 251 :866-871;およびYatesら, 1983, J. Biol. Chem. 258:5770-5774を参照され
たい）。あるいは、当分野で公知の様々な方法、たとえば組換え技法（例えば第
6節、実施例1および7を参照されたい）によって作製することができる。

【００４８】トロポニンサブユニットの操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで行い得る
。例えば、トロポニンサブユニットC、IまたはTをコードするクローニングされ
たトロポニン遺伝子配列は、当分野で公知の様々な手法によって改変することが
できる（Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）。この配列
は、制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断し、また望ましければ更
に酵素による改変を更に行い、単離し、in vitroでライゲートすることができる
。トロポニンサブユニットの断片または相同体をコードする遺伝子を作製する際
には、所望のトロポニン活性がコードされている遺伝子領域において翻訳停止シ
グナルによって中断されずに、改変された遺伝子がトロポニンサブユニット遺伝
子と同じ翻訳リーディングフレームの中に残るように、注意を払わなければなら
ない。

【００４９】特定の実施形態において、低ストリンジェンシー条件下で、トロポニン核酸の
相補配列（例えば配列番号13〜17に記載した配列を有するもの）またはトロポニ
ン断片もしくは誘導体をコードする核酸にハイブリダイズ可能である核酸が提供
される。限定するわけではないが、例として、このような低ストリンジェンシー
条件を用いた手法は、以下の通りである（ShiloおよびWeinberg, 1981, Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792も参照されたい）。35％ホルムアミド、
5×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％ BSA
、および500μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、DNAを含むフィルタを40
℃にて6時間、前処理する。同じ溶液中において、以下の変更を加えてハイブリ
ダイゼーションを行う：0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100μg/mlサ
ケ精子DNA、10％（wt/vol）硫酸デキストラン、および5〜20×10⁶cpm ³²P-標識
プローブを用いる。フィルタを、ハイブリダイゼーション混合物中で40°にて18
〜20時間インキュベートした後、2×SSC、25mM Tris-HCl（pH7.4）、5mM EDTAお
よび0.1% SDSを含む溶液中で55℃にて1.5時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液
に取り替えて、更に60℃にて1.5時間インキュベートする。フィルタをブロッテ
ィングして乾燥させ、オートラジオグラフィーにかける。必要であれば、フィル
タを65〜68℃で3回目の洗浄を行い、再度フィルムに露光する。使用可能な他の
低ストリンジェンシー条件は、当分野で周知である（例えば種間ハイブリダイゼ
ーションで使用されるもの等がある）。

【００５０】他の特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下でトロポニン核酸
にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。限定するわけではないが、例として
、このような高ストリンジェンシー条件を用いた手法は、以下の通りである。6
×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％
BSA、および500μg/mlの変性サケ精子DNAを含む緩衝液中で、65℃にて8時間か
ら一晩かけてDNAを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを行う。フィル
タを、100μg/mlの変性サケ精子DNAおよび5〜20×10⁶cpmの³²P標識プローブを含
むプレハイブリダイゼーション混合物中で65℃にて48時間ハイブリダイズする。
フィルタの洗浄は、2×SSC、0.01％ PVP、0.01％ Ficollおよび0.01％ BSAを含
む溶液中で、37℃にて1時間行う。この後、0.1×SSC中で50℃にて45分間洗浄を
行ってからオートラジオグラフィーにかける。使用可能な他の高ストリンジェン
シー条件は、当分野で周知である。

【００５１】他の特定の実施形態において、中程度のストリンジェンシー条件下でトロポニ
ン核酸にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。このようなストリンジェンシ
ーに適した条件の選択は、当分野において周知である（例えばSambrookら、1989
, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい;また、Ausubelら
編, the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory tech
nique manuals, （著作権）1987-1997 Current Protocols,（著作権）1994-1997
John Wiley and Sons, Inc.を参照されたい）。

【００５２】さらに、翻訳、開始、および/または停止配列を作製および/または破壊するた
め、あるいはコード領域に変化を加えおよび/または新しい制限エンドヌクレア
ーゼ部位を形成するかもしくは既存のものを破壊するために、トロポニンサブユ
ニットをコードする核酸配列をin vitroまたはin vivoで突然変異させて、in vi
tro改変を更に容易にすることができる。当分野で公知の任意の突然変異誘発技
法を使用することができる。例えばin vitro部位特異的突然変異誘発（Hutchins
onら, 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551）、TAB（登録商標）リンカー（Pharmac
ia）の使用等が挙げられるが、これらに限定されない。

【００５３】また、トロポニンサブユニットC、IまたはT配列の操作は、タンパク質レベル
で行うこともできる。本発明の範囲内には、または翻訳中もしくは翻訳後に様々
に(例えばアセチル化、リン酸化、カルボキシル化、アミド化、既知の保護基/ブ
ロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子もしくは他の細
胞リガンドへの結合等により)修飾されたトロポニンサブユニットの断片、他の
断片または相同体等も含まれる。様々な化学修飾のうちのいずれも、公知技法に
よって行うことができる。例えば、臭化シアンによる特異的化学的切断、トリプ
シン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH₄、アセチル化、ホル
ミル化、酸化、還元等が挙げられるが、これらに限定されない。

【００５４】さらに、トロポニンサブユニットの断片および相同体を化学合成することがで
きる。例えば、所望のドメインを含む、または所望のin vitro活性を媒介する、
トロポニンサブユニットの部分に対応するペプチドを、ペプチド合成装置を用い
て合成できる。さらに、望ましければ、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸
相同体を、トロポニンサブユニット配列中に置換または付加として導入すること
ができる。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸(common amino acid)のD-
異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン
、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニル
グリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、デザイナーアミノ酸(β-メ
チルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸およびNα-メチルアミノ酸等)が含まれるが
これらに限定されない。

【００５５】特定の実施形態において、本発明は、異なるタンパク質のアミノ酸配列にアミ
ノ末端またはカルボキシ末端がペプチド結合により結合したトロポニンサブユニ
ットまたはその断片(内皮細胞増殖の抑制に関与する少なくとも１つのトロポニ
ンサブユニットのドメインまたはモチーフからなるもの)を含むキメラまたは融
合タンパク質を包含する。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコー
ドする適当な核酸配列を、当分野で公知の方法によって適当なコーディングフレ
ームで互いに連結し、当分野で一般的に知られている方法によって該キメラ産物
を発現させて作成できる。あるいは、このようなキメラ産物は、例えばペプチド
合成装置を用いることにより、タンパク質合成法によって作製してもよい。

【００５６】他の実施形態において、本発明は、血管形成を抑制するための本発明のトロポ
ニンサブユニット、断片または相同体の組合せを包含する。他の実施形態は、ト
ロポニンサブユニット、断片または相同体と、他の血管形成抑制因子との組合せ
を提供する。このような血管形成抑制因子には、血管安定(angiostatic)ステロ
イド、トロンボスポンジン、血小板第IV因子、トランスフォーミング増殖因子β
、インターフェロン、腫瘍壊死因子α、ウシガラス体抽出物、プロタミン、メタ
ロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP-1およびTIMP-2)、プロラクチン(16-
kd断片)、アンギオスタチン(angiostatin；プラスミノーゲンの38-kd断片)；bFG
F可溶性受容体、および胎盤性プロリフェリン関連タンパク質が含まれるが、こ
れらに限定されない。例えばFolkmanら(1995, N. Engl. J. Med. 333:1757-1763
)およびKlagsbrunら(1991, Annu. Rev. Physiol. 53:217-239)による概説を参照
されたい。

【００５７】5.2. トロポニンタンパク質、断片および相同体のアッセイトロポニンサブユニット、断片および相同体の機能的活性および/または治療
上有効な用量は、様々な方法によりin vitroで分析できる。これらの方法は、血
管形成に関与する生理学的プロセスに基づくものであり、これらは本発明の範囲
内に含まれるが、血管形成を抑制するトロポニンサブユニット、断片および相同
体を定義する方法および/または医薬組成物の治療上有効な用量を決定する方法
を限定するものではない。

【００５８】例えば、該方法が、in vitroで毛細血管内皮細胞(EC)の増殖を抑制または妨害
するトロポニンサブユニット、断片および相同体の能力をアッセイする場合、当
分野で公知の様々なバイオアッセイを用いることができる。例えば核酸中への放
射性物質の取込み、比色アッセイおよび細胞計数法などが挙げられるが、これら
に限定されない。

【００５９】内皮細胞増殖の抑制は、細胞の酸性ホスファターゼ活性の比色分析または電子
的細胞計数法によって測定できる。これらの方法は、本発明のトロポニンサブユ
ニット、断片または相同体、およびaFGF等の血管形成刺激因子で処理した後の、
培養物中の内皮細胞の数を測定するための迅速且つ高感度なスクリーニングを提
供する。細胞の酸性ホスファターゼ活性の比色分析は、Connollyら, 1986, J. A
nal. Biochem. 152:136-140に記載されている。この方法(実施例９に記載)に従
って、毛細血管内皮細胞を血管形成刺激因子(aFGF等)および一定範囲の濃度の潜
在的インヒビターで処理する。これらのサンプルをインキュベートして増殖させ
た後に回収し、洗浄し、ホスファターゼ基質を含むバッファー中で溶解させた後
、２度目のインキュベートを行う。塩基性溶液を加えて反応を停止し、405λで
発色を測定する。Conollyらの方法に従って、酸性ホスファターゼ活性と内皮細
胞の数(最大10,000細胞/サンプル)との間に直線関係を得る。また、その酵素レ
ベルが実際のEC数を反映することを確認するために、既知の細胞数から酸性ホス
ファターゼ活性についての標準曲線も生成する。刺激を与えたサンプルの細胞数
を刺激およびインヒビターの両方を与えたサンプルの細胞数と比較することによ
り、抑制率(％)を測定する。

【００６０】内皮細胞の増殖に及ぼすトロポニンサブユニットC、IおよびTの影響を測定す
るための比色分析は、この３つのトロポニンサブユニット全てが、bFGFで刺激し
た内皮細胞の増殖を妨げるが、Balb/c 3T3細胞(非内皮細胞系)の増殖には検出可
能な抑制効果を持たないことを示す。例として、第６節、実施例３および８(後
述)を参照されたい。

【００６１】毛細血管内皮細胞による放射性チミジンの取込みは、潜在的な血管形成インヒ
ビターによる内皮細胞増殖の抑制についてアッセイするための別の手段である。
この方法によると、所定数の毛細血管内皮細胞を、³H-チミジンストック、血管
増殖刺激因子(例えばbFGF等)および検査しようとする特定範囲の濃度の血管形成
インヒビターの存在下で増殖する。インキュベートした後、細胞を回収し、チミ
ジンの取込み具合を測定する。例えば第６節、実施例３を参照されたい。

【００６２】様々な濃度のトロポニンサブユニット、断片または相同体が、血管形成刺激に
応答した毛細血管内皮細胞の移動過程を妨げる能力は、Boydenのチャンバー法を
改良して用いてアッセイできる。例えば第６節、実施例４(後述)を参照されたい
。

【００６３】トロポニンサブユニット、断片および相同体の機能的活性を分析するための他
の手段は、その化合物が毛細血管内皮細胞の方向性のある移動(最終的には毛細
血管が形成される)を抑制する能力の検査を含む。この能力は、例えば、コラー
ゲンゲル上に平板塗布した毛細血管内皮細胞を該インヒビターでチャレンジし、
培養した内皮細胞によって毛細血管様の管構造が形成されるか否かを測定するア
ッセイ方法を用いて評価できる。

【００６４】 in vivoで血管形成を抑制する能力についてのアッセイには、漿尿膜アッセイ
および角膜ポケットアッセイが含まれる(例えば第６節(後述)の実施例10および
実施例11をそれぞれ参照されたい)。また、Polveriniら, 1991, Methods Enzymo
l. 198:440-450も参照されたい。角膜ポケットアッセイに従って、選択した腫瘍
を試験動物の角膜(角膜ポケット状)の中に移植する。潜在的血管形成インヒビタ
ーをこの角膜ポケットに加え、角膜ポケットの新生血管形成を定期的に調べる。
例えば実施例11(後述)を参照されたい。

【００６５】毛細血管内皮細胞の増殖、移動、および/または血管内部形成(blood vessel i
ngrowth)の抑制として定義されるin vivo血管形成を抑制するための治療上有効
な用量は、上記本発明の組成物または該組成物と他の血管形成抑制因子との組み
合わせを用いたin vitro抑制アッセイから外挿することができる。該有効用量は
また、送達方法および手段にも依存する。例えば幾つかの用途において(例えば
乾癬や糖尿病性網膜症の治療などにおいて)、インヒビターは、局所眼部用担体
に含ませて送達される。充実性腫瘍の治療などの他の用途において、インヒビタ
ーは、生体内で分解可能なポリマーインプラントを用いて送達される。

【００６６】5.3. 治療的使用本発明は、血管形成を抑制するための組成物および方法を提供する。本発明は
さらに、本発明の治療用化合物を投与することによる、新生血管形成に関する疾
患もしくは障害の治療または予防のための組成物および方法を提供する。このよ
うな化合物(本明細書中では「治療薬」と称する)は、トロポニンサブユニット、
ならびにその断片および相同体(例えば上記のものなど)を含む。

【００６７】5.3.1. 悪性腫瘍本発明の治療用化合物で治療できる悪性および転位性の症状には、表１に列挙
した充実性腫瘍(このような障害の概説については、Fishmanら, 1985, Medicine
, 第２版, J.B. Lippincott Co., Philadelphia)および白血病などの血液性(blo
od-borne)腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。

【００６８】

【表１】 [表１]悪性腫瘍および関連障害充実性腫瘍肉腫および癌腫線維肉腫粘液肉腫脂肪肉腫軟骨肉腫骨原性肉腫脊索腫血管肉腫内皮肉腫リンパ管肉腫リンパ管内皮肉腫(lymphangioendotheliosarcoma) 骨膜腫中皮腫ユーイング腫瘍平滑筋肉腫横紋筋肉腫大腸癌膵臓癌乳癌卵巣癌前立腺癌扁平上皮癌基底細胞癌腺癌汗腺癌脂腺癌乳頭状癌乳頭状腺癌嚢胞腺癌髄様癌気管支原生癌腎細胞癌肝腫胆管癌絨毛上皮腫精上皮腫胎生期癌ウィルムス腫瘍子宮頸癌睾丸腫瘍肺癌腫小細胞肺癌腫膀胱癌腫上皮癌腫神経膠腫星状膠細胞腫髄芽細胞腫頭蓋咽頭腫脳室上衣細胞腫カポージ肉腫松果体腫血管芽細胞腫聴神経腫乏突起神経膠腫髄膜腫(menangioma) 黒色腫神経芽細胞腫網膜芽細胞腫5.3.2. 眼の障害本発明の治療用化合物で治療できる新生血管形成に関係する眼の障害には、血管新生緑内障糖尿病性網膜症網膜芽細胞腫水晶体後線維増殖症ブドウ膜炎未熟児網膜症黄斑変性角膜移植片新生血管形成ならびに、他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜もしくは虹彩の新生血
管形成に伴う疾患が含まれるが、これらに限定されない。例えばWaltmanら, 197
8, Am. J. Ophthal. 85:704-710およびGartnerら, 1978, Surv. Ophthal. 22: 2
91-312による概説を参照されたい。

【００６９】5.3.3. 他の障害本発明の治療用化合物で治療できる他の障害には、血管腫、関節炎、乾癬、血
管線維腫、じゅく状斑、遅延性創傷治癒、肉芽形成、血友病性関節、過形成性瘢
痕、偽関節骨折、オスラー-ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコ
ーマおよび血管癒着が含まれるが、これらに限定されない。

【００７０】5.4. 治療的又は予防的有用性の実証本発明の治療薬は、所望の治療的又は予防的活性だけでなく治療に有効な用量
の決定のためにin vivoで試験することができる。例えば、そのような化合物を
、ヒトで試験する前に、以下に限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウ
シ、サル、ウサギなどを含む適当な動物モデル系で試験することができる。in v
ivo試験については、ヒトに投与する前に、当分野で公知のいずれかの動物モデ
ル系を用いることができる。

【００７１】5.5. 治療的/予防的投与及び組成物本発明は、血管形成の抑制方法及び被験者に本発明の治療薬を有効量投与する
ことによる治療(及び予防)方法を提供する。好ましい態様では、治療薬を実施例
１及び７で示すように実質的に精製する。被験者は、好ましくは、以下に限定さ
れないが、ウシ、ブタ、ニワトリなどを含む動物であることが好ましく、より好
ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。

【００７２】本発明は、本発明の治療薬を免疫不全の患者(例えば、癌を有する患者又はヒ
ト免疫不全ウイルス(HIV)に感染している患者)に有効量投与することによる治療
及び予防方法も提供する。特に、本発明は、二次感染又はHIV感染又は癌と関係
する疾患を治療又は予防するために用いることができる。

【００７３】さらに、本発明は、本発明の治療薬を、化学療法剤及び/又は放射性同位体照
射と組み合わせて被験者に有効量投与することによる治療及び予防方法をも提供
する。

【００７４】本発明はまた、休眠状態を維持するために緩解期に入っている患者のための本
発明の治療薬の治療及び予防方法をも提供する。

【００７５】種々の送達系(例えば、リポソームカプセル封入、微小粒子、マイクロカプセ
ル、レセプター仲介エンドサイトーシス)が知られており、本発明の治療薬を投
与するために使用できる(例えば、Wu及びWu, 1987, J.Biol. Chem. 262:4429-44
32を参照されたい)。導入方法としては、以下に限定されないが、局所、皮内、
筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼、及び経口経路が挙げられ
る。化合物は、任意の便利な経路(例えば、注入又はボーラス注射によって、上
皮又は皮膚粘膜の裏(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など)を介した吸収)に
よって投与でき、他の生物学的活性試薬と共に投与することができる。投与は局
所的であることが好ましいが、全身的であってもよい。さらに、脳室内注射及び
クモ膜下注射を含むいずれかの好ましい経路で本発明の医薬組成物を中枢神経系
に導入することが望ましく；脳室内注射は、例えば、オーマヤ(Ommaya)リザーバ
などのリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易に行うことがで
きる。例えば、吸入器又はネブライザーの使用、及びエアロゾル化剤との製剤化
によって、肺投与を採用することもできる。

【００７６】特定の実施態様では、本発明の医薬組成物を、治療の必要な領域に局所的に投
与することが望ましく；これは、例えば、限定するものではないが、外科手術の
間の局所注入、局所的適用、例えば、外科手術後の創傷被覆材と共に、注射によ
り、カテーテルにより、座薬により、又はインプラントによって行い得る(イン
プラントは、シリコン膜などの膜又は繊維を含む多孔性、非多孔性、又はゲル状
物質である)。ある実施態様では、悪性腫瘍又は腫瘍性若しくは前腫瘍性組織の
部位(又は前の部位)に直接注射することによって投与できる。

【００７７】局所適用では、精製したトロポニンサブユニットを担体と組み合わせ、所望の
活性に基づいて有効用量を送達する(すなわち、局在的な血管形成、内皮細胞移
動及び/又は毛細血管内皮細胞増殖の抑制を防止するためには、例えば、1.0μM
から1.0mMの有効用量の範囲)。ある実施態様では、トロポニンサブユニット、断
片又は相同体を、乾癬などの疾患の治療のために皮膚に局所的に適用する。担体
は、以下に限定するものではないが、例えば、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト
、発泡体(foam)、噴霧剤、座薬、パッド又はゲル化スティックの形態であり得る
。

【００７８】下記で考察する幾つかの眼疾患を治療するための局所適用治療薬は、緩衝生理
食塩水、鉱油、植物油(例えば、トウモロコシ油又はラッカセイ油)、ワセリン、
ミグリオール182(Miglyol 182)、アルコール溶液、又はリポソーム若しくはリポ
ソーム様生成物などの眼科学的に許容できる賦形剤中に、トロポニンサブユニッ
ト、断片、又は相同体を有効量含んでなる。これらの組成物の幾つかは、防腐剤
、抗酸化剤、抗生物質、免疫抑制剤、及びトロポニンサブユニットに有害な影響
を及ぼさない他の生物学的又は医薬的に有効な試薬をも含む。

【００７９】指向性(directed)内部局所適用では、例えば、潰瘍又は痔疾の治療のための、
トロポニンサブユニット、断片、又は相同体組成物は、以下の成分のいずれか、
又は類似の性質を有する化合物を含有しうる錠剤又はカプセルの形態であり得る
：微結晶セルロース、トラガカントガム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又
はラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル(Primogel)、又はコーンス
ターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロート(Sterotes)など
の潤滑剤(lubricant)；又はコロイダルシリカなどの流動促進剤(glidant)。投薬
単位剤形がカプセルの場合、カプセルは、上記種類の物質に加え、脂肪油などの
液状担体を含有することができる。さらに、投薬単位剤形は、服用量単位の物理
的形態を修飾する種々の他の物質(例えば、糖によるコーティング、セラック(sh
ellac)、又は他の腸溶剤)を含有することができる。

【００８０】座剤は、一般に、0.5重量％〜10重量％の範囲で有効成分を含有し；経口製剤
は、10％〜95％の有効成分を含有するのが好ましい。

【００８１】別の実施態様では、治療薬はベシクル(vesicle)で、特にリポソームで送達で
きる。Langerら, 1990, Science 249:1527-1533；Treatら, 1989, 「感染症及び
癌の治療」中の、「リポソーム」中(in Liposomes in the Therapy of Infectio
us Disease and Cancer), Lopez-Berestein及びFidler編、 Liss, ニューヨーク
, pp. 353-365；Lopez-Berestein, 同書, pp. 317-327を参照されたい。

【００８２】さらに別の実施態様では、治療薬は制御放出系で送達できる。ある実施態様で
は、輸液ポンプを用いてトロポニンサブユニットを投与することができ、例えば
、インスリン又は化学療法剤を特定器官又は腫瘍に送達するために使用するなど
である(上記Langer；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed., 1987, Eng. 14:201；Bu
chwaldら, 1980, Surgery 88:507；Saudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574
を参照されたい)。

【００８３】好ましい形態では、トロポニンサブユニット、断片、又は相同体は、選択され
た部位で調節された期間にわたりトロポニンサブユニット、断片、又は相同体を
放出する生分解性で生体適合性のポリマーインプラントと組み合わせて投与され
る。好ましい重合体物質の例としては、ポリ無水物(polyanhydrides)、ポリオル
トエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニル、並びにこ
れらのコポリマー及び混合物が挙げられる。「制御放出の医学的応用」(Medical
Applications of Controlled Release), Langer及びWise編、1974, CRC Pres.,
Boca Raton, フロリダ；「制御された薬物の生物学的利用率、薬物製品設計及
び性能」(Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Perfor
mance), Smolen及びBall編、1984, Wiley, ニューヨーク；Ranger及びPeppas, 1
983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい。また、L
evyら, 1985, Science 228:190；Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howar
dら, 1989, J. Neurosurg. 71:105を参照されたい。さらに別の実施態様では、
制御放出系は、治療標的(すなわち、脳)の近傍に配置することができ、それによ
って全身用量の一部分のみで足りる(例えば、Goodson,「制御放出の医学的応用
」中, 1989, 前記, 第２巻, pp. 115-138を参照されたい)。

【００８４】他の制御放出系については、Langerによる総説(1990, Science 249:1527-1533
)で考察されている。

【００８５】また、本発明は医薬組成物も提供する。該組成物は、治療に有効な量の治療薬
、及び製薬上許容できる担体を含む。

【００８６】本発明の医薬組成物は、中性形態又は塩形態で製剤化できる。製薬上許容でき
る塩としては、遊離アミノ基を有するもの(例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュ
ウ酸、酒石酸などから誘導されるもの)、及び遊離カルボキシル基を有するもの(
例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イ
ソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン
、プロカインなどから誘導されるもの)が挙げられる。

【００８７】特定の実施態様では、用語「製薬上許容できる」とは、連邦もしくは州政府の
監督官庁に認められているか、又は米国薬局方若しくは動物、及び特にヒトでの
使用のための他の一般的に認められている薬局方に記載されていることを意味す
る。用語「担体」とは、治療薬と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形
剤、又は溶剤(vehicle)をいう。そのような医薬担体は、滅菌液体、例えば、水
、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油(例えば、ラッカセイ油、
ダイズ油、鉱油、ゴマ油など)、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピ
レングリコール又は他の合成溶媒であり得る。医薬組成物を静脈から投与すると
きは、担体として水が好ましい。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグ
リセロール溶液も、特に注射可能な溶液のための液状担体として使用できる。好
ましい医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、
ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク(chalk)、シリカゲル、ステアリン酸
ナトリウム、グリセロール・モノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥
スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが
挙げられる。また、所望ならば、組成物は、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はpH緩
衝剤(例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩など)を含むこともできる。抗菌
剤(例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなど)；抗酸化剤(例えば、
アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど)；キレート化剤(例えば、エチレ
ンジアミン四酢酸など)；及び張度(tonicity)調整のための試薬(例えば、塩化ナ
トリウム又はデキストロースなど)も考えられる。非経口製剤は、アンプル、使
い捨て注射器又はガラス若しくはプラスチック製の複数回用量のバイアル中に封
入することができる。

【００８８】これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉
剤、徐放性製剤などの形態をとりうる。組成物は、伝統的な結合剤及び担体(ト
リグリセリド、微結晶セルロース、トラガカントガム又はゼラチンなど)ととも
に座剤として製剤できる。経口製剤は、標準的な担体(例えば、製薬級のマンニ
トール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリ
ウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど)を含む。好ましい医薬担体の例は、E
.W. Martinによる「レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)
」に記載されている。このような組成物は、好適な量の担体と共に、治療に有効
な量の治療薬を、好ましくは精製された形態で含有し、患者に適切な投与形態を
提供するであろう。製剤は、投与形態に適合させねばならない。

【００８９】好ましい実施態様では、組成物は、日常的な手順に従って、ヒトへの静脈内投
与に適応させた医薬組成物として製剤される。通常、静脈内投与用の組成物は、
滅菌された等張水性バッファーの溶液である。また必要に応じて、組成物は、可
溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤(例えば、リグノカイン
など)を含む。一般的には、成分は単位投薬剤形で、別個に又は一緒に混合され
て、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、密閉容器(
例えば、有効成分量を示すアンプル又はサシェット(sachet))中に提供される。
組成物が輸液によって投与されるべきときは、滅菌された製薬級の水又は生理食
塩水を含む輸液ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を注射によって投与する
ときは、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され、投与の前に成分
を混合することができる。

【００９０】特定の障害又は症状の治療に有効な本発明の治療薬の量は、障害又は症状の性
質に依存するであろうが、標準的な臨床技術によって決定できる。さらに、第5.
2節で考察したようなin vitroアッセイを、最適な投与量範囲の特定を補助する
ためにさらに用いることができる。また、製剤で採用すべき正確な用量は、投与
経路、及び疾患又は障害の重症度に依存するであろうから、医師の判断及び各患
者の状況に応じて決定すべきである。しかしながら、全長のトロポニンサブユニ
ットの静脈内投与に好適な投与量の範囲は一般に、体重１kg当たり約20〜500μg
の活性化合物である。全長のトロポニンサブユニットの鼻腔内投与に好適な投与
量の範囲は一般に、体重１kg当たり約0.01pg〜１mgである。トロポニン断片の静
脈内投与に好適な投与量の範囲は、一般に体重１kg当たり約10μg〜１mgの活性
化合物であり、好ましくは１回の投与当たり約１〜50mg、より好ましくはヒト１
人当たり約１〜20mgである。有効用量は、in vitro又は動物モデル試験バイオア
ッセイ又は動物モデル試験系から導かれる用量−応答曲線から推定できる。

【００９１】上述の用量での投与を繰り返すことができる。好ましい実施態様では、上述の
用量で１週間当たり２〜７回投与される。治療の持続期間は、患者の臨床的進行
度(progress)及び治療への反応性に依存する。

【００９２】また、本発明は、本発明の医薬組成物の１種以上の成分を充填した１個以上の
容器を含む医薬パック又はキットも提供する。そのような容器は、医薬又は生物
学的製品の製造、使用又は販売を監督する政府機関によって規定されている型の
表示(notice)と一体にしてもよい。この表示は、該機関によって、ヒトへの投与
のための製造、使用又は販売が承認されていることを示すものである。

【００９３】本発明の組成物の改質(modification)及び改変(variation)、並びに使用方法
は、当業者であれば、前記の詳細な説明から明らかであろう。そのような改質及
び改変は、添付の特許請求の範囲に包含されるものである。

【００９４】下記の非限定的な実施例は、血管形成刺激剤(angiogenic stimulus)で誘導し
た内皮細胞の増殖をトロポニンサブユニットが抑制するという発見、及び血管形
成を抑制するための、トロポニンサブユニット、断片、又は相同体の有効投与量
の決定手段、並びにトロポニンサブユニットの断片及び相同体(すなわち、血管
形成を抑制しうるそれらのトロポニンサブユニットの断片又は相同体)の同定手
段を明らかにするものである。実施例で用いるトロポニンサブユニットは、後述
のように精製する。

【００９５】6. 実施例実施例１：トロポニンサブユニット成分の精製心臓トロポニンの組織からの単離トロポニン精製のために、以下の手順を用いることができる：Ebashiら, 1968
, J. Biochem. 64:465-477；Yasuiら, 1968, J. Biol. Chem. 243:735-742；Har
tshorneら, 1969, Biochim. Biophys. Acta., 175:30；Schaubら, 1969, Bioche
m. J. 115:993-1004；Greaserら, 1971, J. Biol. Chem. 246:4226-4233；及びG
reaserら, 1973, J. Biol. Chem. 248:2125-2133。ウサギの背中及び脚の筋肉を
取り出し、脂肪及び結合組織を取り除き、磨りつぶす。磨りつぶした筋肉(１kg)
を、20mM塩化カリウム、１mM炭酸水素カリウム、0.1mM塩化カルシウム、及び０
．１mM DTT(ジチオスレイトール)を含有する２リットルの溶液中で５分間撹拌す
る。懸濁液をチーズクロスで濾過し、残渣の洗浄を４回繰り返す。次いで、２リ
ットルの95％エタノールを洗浄した残渣に添加し、10分後に溶液を濾過する。エ
タノール抽出を２回繰り返す。次いで、残渣を２リットルのジエチルエーテルに
よって10分間にわたり３回洗浄する。最後に、残渣を室温で２〜３時間乾燥させ
る。

【００９６】筋肉１kgから得た乾燥した粉末を１M塩化カリウム、25mMトリス(pH8.0)、0.1m
M塩化カルシウム、及び１mM DTTを含有する２リットルの溶液によって22℃で一
晩かけて抽出する。チーズクロスによる濾過後、残渣をもう一度、１リットルの
１M塩化カリウムで抽出する。

【００９７】抽出物を合わせ、４℃に冷却する。固体硫酸アンモニウムを添加し、約40％飽
和(230g/リットル)とする。30分後、溶液を遠心分離し、次いで、上清１リット
ル当たり硫酸アンモニウム125gを添加する(60％飽和)。遠心分離後、５mMトリス
(pH7.5)、0.1mM塩化カルシウム、及び0.1mM DTTを含有する500mlの溶液に沈殿を
溶解し、同じ溶液15リットルに対して６時間、さらに新しい溶液に対して一晩透
析する。

【００９８】固体塩化カルシウムを添加し、最終濃度を１Mとし、１M塩化カリウム溶液を添
加して体積を１リットルにする。次いで、塩酸を添加することによってpHを4.6
に調整し、トロポミオシンの沈殿を遠心分離によって除去する。水酸化カリウム
で上清のpHを7.0に調整し、１リットル当たり450gの硫酸アンモニウムを添加す
る(70％飽和)。５mMトリス(pH7.5)、0.1mM塩化カルシウム、及び0.1mM DTTを含
有する溶液に、沈殿物を溶解し、同じ溶液に対して一晩透析する。固体塩化カリ
ウムを添加して、溶液の濃度を１Mにし、pHを4.6に調整し、生成した沈殿を遠心
分離で除去する。ネスラー(Nessler)反応が陰性になるまで、中和した上清を２m
Mトリス(pH7.5)に対して透析する。トロポニンの最終収量は、通常、新鮮な筋肉
１kg当たり2.5〜3.0gである。

【００９９】心臓トロポニンの組織からの単離死後約30分のウシの心臓を得て、直ちに切り開き、血液をすすぎ、氷に浸す。
左心室を除去し、過剰の脂肪及び結合組織を切り取り、磨りつぶす。特に記載し
ない限り、続く全ての抽出及び調製工程を０〜３℃で行う。磨りつぶした筋肉(5
00g)を0.09Mリン酸二水素カリウム、0.06Mリン酸一水素カリウム、0.3M塩化カリ
ウム、5mM 2-メルカプトエタノールを含有するpH6.8の溶液2.5リットル中で１分
間ウェアリング・ブレンダー(Waring Blender)でホモジナイズする。次いで、ホ
モジナイズした筋肉の懸濁液を30分間撹拌し、1000×gで20分間遠心分離する。
沈殿を再度30分間抽出し、遠心分離する。次いで、残渣を2.5リットルの5mM 2-
メルカプトエタノールで洗浄し、1000×gで10分間遠心分離し、次いで50mM塩化
カリウム、5mMトリス−塩酸(pH8.1)、及び5mM 2-メルカプトエタノールの溶液1.
5リットルで２回連続して洗浄し、遠心分離する。次いで、残渣を50mMトリス−
塩酸(pH８．１)、及び５mM 2-メルカプトエタノールの溶液1.5リットルで２回洗
浄し、遠心分離する。残渣の容積を測定し、残渣を0.5倍容量の３M塩化カリウム
、50mMトリス−塩酸(pH8.1)、及び５mM 2-メルカプトエタノールと混合する。０
℃で16〜20時間の抽出後、懸濁液を15,000×gで10分間遠心分離する。沈殿物を
捨て、0.05N塩酸で上清をpH7.6に調整する。抽出物をナイロンガーゼで濾過する
ことにより、pH調節時に生成する線維状沈殿物を除去する。30〜50％の間の硫酸
アンモニウム飽和度で沈殿するタンパク質を回収し、１M塩化カリウム、及び１m
Mリン酸カリウム(pH6.8)、及び５mM 2-メルカプトエタノールを含有する溶液中
に溶解し、同じ溶液に対して４時間、さらに新たな溶液に対して一晩透析する。
このタンパク質溶液を105,000×gで30分間の遠心分離により純化する。次いで、
0.08〜0.10Mの間のリン酸塩で溶出するタンパク質とともにヒドロキシルアパタ
イトカラムでのクロマトグラフィーによってトロポニンを精製する。Greaserら,
1972, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 37:235-244。抽出の前に-20℃
で貯蔵しておいた心臓のプールバッチを用い、同様の方法でウサギのトロポニン
を調製する。

【０１００】トロポニンサブユニットを、６M尿素中でのDEAE−セファデックス(Sephadex)
クロマトグラフィーによって分離する。ウシ心臓トロポミオシンを、トロポニン
抽出スキーム(上記を参照されたい)から得た50％硫酸アンモニウム飽和上清から
調製する。硫酸アンモニウムを添加して65％飽和とし、沈殿を１M塩化カリウム
、１mMリン酸カリウム(pH7.0)、及び５mM 2-メルカプトエタノールに溶解し、同
溶液に対して透析する。次いでヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによ
ってタンパク質を精製する。

【０１０１】タンパク質定量タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として用いるGornallらのビウ
レット法によって測定する(Gornallら, 1949, J. Biol. Chem., 177:751-766)。

【０１０２】成分の分離 SP-セファデックス及びDEAE-セファデックスを用いるクロマトグラフィーを順
に行うと、３つの心臓トロポニン成分が完全に分離する。

【０１０３】組換えトロポニン単離及び再構成プロトコールトロポニンI及びT 種々のトロポニンサブユニット及びアイソフォーム(isoforms)をコードするDN
Aは当分野で公知である。例えば、Wuら, 1994, DNA Cell. Biol. 13:217-233；S
chreierら, 1990, J. Biol. Chem. 265:21247-21253；及びGahlmannら, 1990, J
. Biol. Chem. 265:12520-12528を参照されたい。

【０１０４】トロポニンサブユニットを発現させるには、当分野で公知の組換え技術を用い
て、そのサブユニットをコードするDNAを多コピー数発現プラスミド(例えば、KP
3998など)中にサブクローニングする。

【０１０５】クローン化されたcDNAを発現させるには、インサート含有pKP1500ベクターで
形質転換された大腸菌を37℃で一晩増殖させ、次いで４リットルのルリア-ベー
タニ(Luria-Bertani; LB)液体培地中に接種し、対数増殖中期まで、42℃で増殖
させる。次いで、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシドを添加して0.5
mMの濃度にし、培養物を42℃で一晩増殖させる。公表されている手順を適用して
、発現されたトロポニンサブユニット、断片、又は相同体を精製することができ
る(Reinachら, 1988, J. Biol. Chem. 250:4628-4633及びXuら, 1988, J. Biol.
Chem. 263:13962-13969)。遠心分離によって細胞を回収し、20mMトリス、20％
スクロース、１mM EDTA、0.2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、１mg/ml
リゾチームのpH7.5の溶液20ml中に懸濁する。氷上で30分間インキュベートした
後、20mMトリス、１mM EDTA、0.2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、0.5m
M DTTの溶液80mlを添加し、フレンチ・プレス(SLM Instruments社製)で細胞を破
壊する。細胞の破片をペレット化し；上清を、飽和硫酸アンモニウム中で35％と
し、氷上で30分間撹拌する。沈降後、上清を、塩化ナトリウムにおいて50mM、塩
化カルシウムにおいて５mM、塩化マグネシウムにおいて１mM、及びDTTにおいて
１mMにし、次いで、1.5×25cmのフェニル−セファロース(Sepharose)(Pharmacia
LKB Biotechnology Inc.社製)カラムにかける。カラムを、最初に50mMトリス、
50mM塩化ナトリウム、５mM塩化カルシウム、１mM塩化マグネシウム、１mM DTT、
pH7.5で洗浄し、次いで50mMトリス、１mM塩化ナトリウム、0.1mM塩化カルシウム
、１mM DTT、pH7.5でタンパク質がそれ以上溶出しなくなるまで洗浄する。次い
で、粗製トロポニンサブユニットを、50mMトリス、１mM EDTA、１mM DTT、pH7.5
で溶出する。トロポニンサブユニット、断片、又は相同体を含有する画分をプー
ルし、25mMトリス、６M尿素(United States Biochem
ical Corp.社製)、１mM塩化マグネシウム、１mM DTT、pH8.0に対して透析し、1.
5×25cmのDE52(Whatman社製)カラムにかける。カラムを０〜0.6M塩化ナトリウム
直線状勾配で溶出する。カラムから溶出したトロポニンサブユニット、断片、又
は相同体を、0.1mM炭酸水素アンモニウム、１mM β-メルカプトエタノールに対
して透析し、凍結乾燥して保存する。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
UV分光測光法によって純度を評価する。通常、精製された組換えトロポニンサブ
ユニット、断片、又は相同体の収量は、細菌培地１リットル当たり６mgと期待さ
れる。

【０１０６】凍結乾燥された組換えタンパク質を、６M尿素、20mMヘペス(Hepes; pH7.5)、0
.5M塩化ナトリウム、２mM EDTA、及び５mM DTTからなるテイクアップ(take up)
バッファーに再懸濁する。混合物を室温で１時間回転(nutate)する。次いで溶液
を、0.5M塩化ナトリウム、20mMヘペス(pH7.5)、及び0.5mM DTTからなる透析バッ
ファーに対して、１回交換して、４℃で６時間にわたり透析する。

【０１０７】各サブユニットについて280λで、タンパク質濃度を測定する。トロポニンIの
伸長係数(extension coefficient)は、0.40であり、トロポニンTでは0.50である
。

【０１０８】トロポニンC 凍結乾燥された組換えタンパク質を、0.1M塩化ナトリウム、20mMヘペス(pH7.5
)、２mM EDTA、及び５mM DTTからなるテイクアップバッファー中に再懸濁する。
この溶液を、0.1M塩化ナトリウム、20mMヘペス(pH7.5)、及び0.5mM DTTからなる
透析バッファーに対して、１回交換して、４℃で６時間にわたり透析する。

【０１０９】 280λでの吸光度を測定することによって、タンパク質濃度を測定する。トロ
ポニンCの伸長係数は、0.18である。

【０１１０】組み合わせたサブユニットの再構成同じ再構成モル比のトロポニンサブユニットC、I、及びTを有するタンパク質
濃縮物を、種々の全ての組み合わせについて維持する。これらの各タンパク質濃
縮物を、0.1M塩化ナトリウム、0.1M塩化カルシウム、５mM DTT、５mMヘペス(pH7
.5)からなる再構成バッファー中に合わせる。0.1M塩化ナトリウム、0.1mM塩化カ
ルシウム、0.5mM DTT、及び５mMヘペス(pH7.5)からなる透析バッファーに対して
、３回交換して、４℃で20〜24時間透析する。

【０１１１】 278λでの吸光度を測定することによって、タンパク質濃度を概算する。トロ
ポニン三量体は、278λで0.45の伸長係数を有する。

【０１１２】実施例２：DNA合成によって測定された内皮細胞増殖抑制トロポニンサブユニット、断片、又は相同体のbFGF刺激ECの増殖への抑制効果
は、下記手順に従って測定できる。

【０１１３】内皮細胞DNA合成１日目に、DMEM/10% CS/1% GPS中の5,000個のウシ毛細血管内皮細胞を、96ウ
エルのゼラチン被覆された組織培養プレートの各ウエル上にプレーティングする
。２日目に、細胞培地を、培地50ml当たり１mg/mlの「コールド(cold)」チミジ
ン10μlで補完された、DMEM、２％CS、１％GPS、0.5％BSA(完全培地)に交換する
。３日目に、完全培地中の試験サンプルに２回添加する。さらに、β線維芽細胞
増殖因子(bFGF)を、適当な対照以外の各ウエルに添加し、最終濃度を0.2ng/ウエ
ルとする。４日目に、１：13で希釈された³H-チミジンストック５μlを各ウエル
に添加し、プレートを５〜６時間インキュベートする。インキュベート後、培地
を吸引し、残留物をPBSで１回、次いでメタノールで２回(それぞれ５分間)、次
いで５％TCAで２回(それぞれ10分間)すすぐ。次いで細胞を水で３回すすぎ、プ
レートを乾燥し、0.3N水酸化ナトリウム100μlを各ウエルに添加する。次いで、
ウエルの内容物をシンチレーションカウンターバイアルに移し、３mlのエコリュ
ーム(Ecolume)を各バイアルに添加する。次いで、サンプルをシンチレーション
カウンターで計数する。

【０１１４】 3T3細胞DNA合成 bFGF刺激3T3細胞でのDNA合成によって、bFGF刺激内皮細胞増殖について得られ
る結果を評価するための対照が提供される。3T3細胞でのDNA合成は、下記の方法
に従って測定することができる。

【０１１５】 BALB/cの3T3細胞をトリプシン消化し、５×10⁴細胞/mlの濃度で再懸濁する。2
00μlのアリコートを0.3cm²のマイクロタイターウエル(Microtest II組織培養プ
レート、Falcon社製)中にプレーティングする。増殖促進因子の培地を使い尽く
させるために、コンフルエンスに達した後２〜３日の間、さらに細胞を最短で５
日間インキュベートする。これらの増殖条件によって、分裂していないBALB/cの
3T3細胞のコンフルエントな単層を得る。試験サンプルを0.15M塩化ナトリウム50
μlに溶解し、[^３H]TdRと一緒に、マイクロタイターウエルに添加する。少なく
とも２４時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞をPBSで洗浄する。
以下の一連の工程によって、細胞を固定し、取り込まれていない[^３H]TdRを除去
する；メタノールを５分間かけて２回添加し、水で４回洗浄し、冷却された５％
TCAを10分間かけて２回添加し、水で４回洗浄する。液体シンチレーションカウ
ント又はHaudenschildら, 1976, M. Exp. Cell Res. 98:175に記載の方法を改変
して用いるオートラジオグラフィーのいずれかによってDNA合成を測定する。シ
ンチレーションカウントでは、0.3N水酸化ナトリウム150μl中で細胞を溶解し、
Packard社製Tri-Carb液体シンチレーションカウンターを用いて、Insta-Gel液体
シンチレーションカクテル(Pachard社製)５ml中で計数を行う。

【０１１６】またオートラジオグラフィーにより、マイクロタイターウエルの底を打ち抜い
て、シリコン接着剤(silastic glue)を塗布したガラススライド上に載せてDNA合
成を定量できる。スライドをNTB2核追跡エマルジョン(Kodak社製)の１g/ml溶液
に浸し、３〜４日間曝露させる。エマルジョンをMicrodol-X溶液(Kodak社製)で1
0分間現像し、蒸留水ですすぎ、Rapid Fixer(Kodak社製)で３分間固定する。オ
ートラジオグラムを、修飾ギムザ染色液によって染色する。少なくとも1000個の
核を各ウエルで計数し、DNA合成を標識核のパーセンテージで示す。試験サンプ
ルを40〜48時間インキュベートした後、グリッドを頼りに、マイクロタイターウ
エル中の細胞数を計数することによって、細胞分裂を測定する。

【０１１７】実施例3：細胞酸性ホスファターゼ活性の比色測定及び電子的細胞計数によって
測定される内皮細胞増殖の抑制本発明のトロポニンサブユニット、相同体、又は誘導体での処置に応答しての
EC増殖の抑制の迅速かつ高感度のスクリーニングは、細胞を様々な濃度の抑制剤
の存在下でインキュベートし、培養物中の内皮細胞の数を、Connolly, et al.,
1986, J. Anal. Biochem. 152:136-140 によって記載される細胞酸性ホスファタ
ーゼ活性の比色測定に基づいて決定することを含む。

【０１１８】毛細血管内皮細胞（EC）の増殖に対するトロポニンの効果は、既知血管形成因
子（bFGF）による内皮細胞増殖の刺激を妨害するこのタンパク質の能力を測定す
るアッセイにおいて測定した。

【０１１９】毛細血管内皮細胞及びBalb／c 3T3細胞を、第1日に、ゼラチンコート96ウェル
細胞培養皿に別々に塗布した（2×10³／0.2ml）。第2日に、細胞を、5％子ウシ
血清（Hyclone）（DMEM／5）及びbFGF（10ng／ml）（FGF Co．）を含むダルベ
ッコ改変イーグル培地（Gibco）でレフし（refed）、1種類以上のトロポニンサ
ブユニットの濃度を増加させる。これらの物質は最終容積の10％を超えない容積
で同時に添加した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Gibco）のみ及びPBS＋bFGF
を収容するウェルを対照として含めた。第5日に、培地を除去して細胞をPBSで洗
浄し、0.1M酢酸ナトリウム（pH5.5）、0.1％Triton X−100^TM及び100mMｐ−ニト
ロフェニルホスフェート（Sigma 104ホスファターゼ基質）を含む100μlのバッ
ファ中で溶解した。37℃で2時間インキュベートした後、10μlの1N NaOHを添加
することで反応を停止させた。高速マイクロプレートリーダー（Bio−Tek）を用
いて発色を405nmで測定した。

【０１２０】刺激に晒されたウェルの細胞数を刺激及びトロポニンサブユニットに晒された
ものと比較することによって抑制パーセントを決定した。

【０１２１】 3種のトロポニンサブユニットの全てが、この比色アッセイによる測定で、bFG
F刺激EC増殖を抑制することが見出された。

【０１２２】トロポニンCは、試験した全ての濃度で、bFGF刺激内皮細胞増殖を用量依存性
の様式で抑制した（図1）。ウシ内皮細胞増殖（「BCE」）の抑制パーセントは、
280nM、1.4μM、2.8μM及び5.6μMの濃度で、それぞれ、54％、86％、83％、及
び100％であった。100％の抑制は、20μg／ウェル（5.6μM)の濃度で観察された
。IC₅₀はbFGF成長因子誘導刺激の50％抑制が観察された濃度を表す。トロポニン
CのIC₅₀は278nMであるものと決定された。

【０１２３】トロポニンIは1及び5μg／ウェルの濃度でbFGF刺激BCE増殖を抑制したが、10
μg／ウェルで試験したサンプルにおいては抑制が観察されなかった（図2）。BC
Eの抑制パーセントは、240nM及び1.2μMの濃度でそれぞれ33％及び46％であった
。トロポニンIのIC₅₀は1.14μMであるものと決定された。

【０１２４】トロポニンTは10及び20μg／ウェルの濃度でbFGF刺激EC増殖を抑制したが、l
及び5μg／ウェル濃度では抑制しなかった（図3）。BCE増殖は1.6μM及び3.3μM
でそれぞれ23％及び62％抑制された。トロポニンTのIC₅₀は2.14μMであるものと
決定された。

【０１２５】トロポニンサブユニットC及びIの組み合わせは試験した全ての濃度でECを抑制
した（図4）。BCEの増殖の抑制パーセントは130nM、645nM、1.3μM及び2.6μMで
それぞれ52％、54％、73％及び47％であった。この組み合わせのIC₅₀は110nMで
あるものと決定された。

【０１２６】トロポニンサブユニットC、I及びTの組み合わせは、360nM（5μg／ウェル、図
5）の濃度で、bFGF刺激BCE増殖を16％抑制することが観察された。

【０１２７】試験したトロポニンサンプルには非内皮細胞型であるBalb／c 3T3細胞の増殖
に対する検出可能な抑制効果はなかった。

【０１２８】実施例4：トロポニンによる毛細血管内皮細胞移動の抑制血管形成性刺激に応答しての毛細血管EC移動の血管形成性プロセスを抑制する
トロポニンサブユニット、断片、又は相同体の能力の決定は、毛細血管EC移動に
対するトロポニンサブユニット、断片、又は相同体の効果を研究するのに用いら
れるBoydenチャンバ技術の変形例を用いて決定することができる。Falk et al.,
1980, J. Immunol. 118:239-247 (1980)。ブラインドウェル（blind-well）Boy
denチャンバは、多孔性膜によって分離されている2つのウェル（上部及び下部）
からなる。J. Exp. Med. 115:453-456 (1962)。既知濃度の成長因子を下部ウェ
ルに入れ、予め決定された数の細胞及びトロポニンサブユニット、断片、又は相
同体を上部ウェルに入れる。細胞は膜の上面に付着し、それを通して移動して膜
下面に付着する。次に、膜を固定し、計数のため、Glaser et al., 1980, Natur
e 288:483-484の方法を用いて染色することができる。

【０１２９】移動は、ブラインドウェルチャンバ（Neuroprobe、no. 025−187）及びフィブ
ロネクチン（PBS中に6.67μg／ml）（ヒト、Cooper）で予め被覆した、8ミクロ
ンの孔を有するポリカーボネート膜（Nucleopore）を用いて測定する。1％子ウ
シ血清を含むDMEM（DMEM／1）で希釈した塩基性FGF（Takeda Co.）を10ng／mlの
濃度で下部ウェルに添加する。上部ウェルには5×10⁵毛細血管EC／mlを入れ、漸
増濃度の精製トロポニンサブユニット、断片又は相同体を精製の24時間以内に用
いる。対照ウェルにはbFGFと共に、又はそれなしで、DMEM／1を入れる。この移
動チャンバを37℃、10％ＣＯ₂中で4時間インキュベートする。その後、膜の上面
に付着する細胞を、ワイパーブレード（Neuroprobe）上で膜を引くことによって
拭い取る。膜を通して下面に移動している細胞を2％グルタルアルデヒド、次い
でメタノール（4℃）中で固定し、ヘマトキシリンで染色する。16油浸領域にお
いて下面に付着する細胞の数を計数し、この数字を対照について得られるものと
比較することによって移動を定量化する。

【０１３０】実施例5：ヒナ漿尿膜アッセイによって決定される、トロポニンによる新生血管
形成のin vivo抑制ヒナ漿尿膜アッセイ（CAM）を、トロポニンサブユニット、断片又は相同体がi
n vivoで新生血管形成を抑制することができるかどうかを決定するのに用いるこ
とができる。Taylor and Folkman, 1982, Nature (London) 297:307-312。胚血
管の成長に対するトロポニンサブユニット、断片又は相同体の効果をヒナ胚を用
いて研究するが、このヒナ胚においては48時間で卵黄嚢に毛細血管が現れ、次の
6−8日にわたって急速に成長する。

【０１３１】受精の3日後、ヒナ胚をそれらの殻から取り出し、プラスチックペトリ皿（100
5、Falcon）に入れる。これらの検体を加湿5％ＣＯ₂中、37℃で維持する。発生
の第6日に、精製トロポニンサブユニット、断片又は相同体のサンプルをメチル
セルロース・ディスク中で混合し、成長しているCAMの高密度外胚葉下（subecto
dermal）叢の上の表面に貼付する。CAMが空のメチルセルロース・ディスクと共
に移植されている対照検体も調製する。CAMの血管分布像をより明確に浮かび上
がらせるため、これらのCAMに墨／リポシンを血管内注入する。Taylor et al.,
1982, Nature 297:307-312。

【０１３２】これらのCAMをトロポニンサブユニット、断片又は相同体に48時間晒した後、
移植片の周辺領域を観察して評価する。墨が充填された、試験移植片を取り巻く
毛細血管が全くない無血管帯を有する試験検体は、胚性新生血管形成の抑制剤の
存在を示す。対照的に、対照検体はメチルセルロースディスクの非常に近くに、
又はそれに接触して、新生血管形成を示す。

【０１３３】試験及び対照検体のCAMに対して組織学的中胚葉研究を行う。これらの検体を4
℃でJB−4プラスチック（Polysciences）に埋め込み、Reichert 2050ミクロトー
ムを用いて3μm切片を切断する。切片をトルイジンブルーで染色し、Kodak TM x
100及び緑色フィルターを用いてZeissフォトマイクロスコープで顕微鏡写真を撮
影する。

【０１３４】実施例6：ウサギ角膜嚢（corneal pocket）アッセイによって決定されるトロポ
ニンによる新生血管形成のin vivoでの抑制体重4−5ポンドのオスNZWウサギを静注用ペントバルビタール（25mg／kg）で
麻酔し、2％キシロカイン溶液を角膜に適用する。眼が突出し、リンゲル液で断
続的にすすいで乾燥を防ぐ。成体ウサギの角膜は直径が約12mmである。無菌技術
を用いてNo.11メスの刃で角膜の中央をおおよそ深さ0.15mm、長さ1.5mm切開する
ことによって角膜内嚢を作製する。幅1.5mmの可鍛性虹彩スパーテルを挿入する
ことにより、角膜支質内に長さ5mmの嚢を形成する。大部分の動物においては、
角膜嚢の末端は角膜−強膜接合部の1mm以内まで延びる。腫瘍単独を移植した22
羽のウサギのより小さいシリーズにおいては、切開を中心から離して開始するこ
とにより、嚢はより長い距離、角膜−強膜接合部から2−6mmに位置する。

【０１３５】第1アッセイにおいては、エチレンビニルアセテート（EVAc）共重合体のポリ
マーペレットに試験物質を含浸させ、ウサギ角膜の嚢の角膜輪部から約1mmに外
科的に移植する。このアッセイ系が血管形成抑制剤の試験に用いられる場合、V2
カルチノーマ又は他の血管形成性刺激物質のいずれかの断片をポリマーの遠位、
角膜輪部から2mmに移植する。各々のウサギの反対の眼には、空の対照ポリマー
ペレットを血管形成性刺激物質に続いて同じ方法で移植する。これらの対照角膜
においては、5−6日で、最終的には空のポリマーを乗り越えて、毛細血管が腫瘍
移植片に向かって成長し始める。試験角膜においては、角膜輪部の血管から腫瘍
に向かう新規毛細血管の方向性成長の速度が低下し、しばしば抑制されてポリマ
ーの周囲に無血管性領域が観察される（図1）。このアッセイは、実体顕微鏡で
最大血管長を測定することによって定量する。

【０１３６】実施例7：軟骨からのトロポニンＩの単離軟骨からのトロポニンＩの精製本発明者が以前記述したプロトコル（Moses, et al., 1990, Science 2488, 1
408-1410）の変形例を用いて、子ウシ肩甲骨からトロポニンＩを精製した。簡単
に述べると、子ウシ肩甲骨を屠殺直後に真空凍結し、使用時まで−20℃で保存し
た。まず骨膜エレベーター（periosteal elevator）（Arista）で、次に全ての
筋肉及び結合組織が除かれるまでメスの刃で軟骨をこすり取った。軟骨切片を2M
NaCl中で抽出し、HCl及び硫酸アンモニウム（25−20％）で沈殿させ、一連の
クロマトグラフィー工程を用いて分画した：4Mグアニジン−HClの存在下におけ
るA−1.5m Sepharose（Bio−Rad）でのゲル濾過、Bio−Rex 70（Bio−Rad）カチ
オン交換カラムでのイオン交換、Sephadex G−75（Superfine）（Pharmacia）カ
ラムでのゲル濾過、Hi−Pore 304カラム（Bio−Rad）での逆相高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）及びProgel−TSK G3000SWXLカラム（3.0cm×7.8mm）（Supel
co）でのゲル濾過。各カラム工程から得られた画分を、下記のように、塩基性線
維芽細胞成長因子（bFGF）によって刺激された毛細血管内皮細胞（EC）増殖を抑
制するそれらの能力について試験した。抑制活性を有する画分をプールし、アミ
ノ酸及び配列解析のためにSavant Speed Vac濃縮器で濃縮した。特別の事情がな
い限り、全ての試薬はSigmaから入手した。

【０１３７】トリプシン消化、HPLC分離及びマイクロシークエンシングタンパク質を各々還元し、Ｓ−カルボキシアミドメチル化してトリプシンを用
いる消化に処した。得られたペプチド混合物を、Zorbax C18 1.0mm×150mm逆相
カラムを用いる、1040ダイオードアレー検出器を備えるHewlett−Packard 1090
HPLCでの狭孔（narrow-bore）高速液体クロマトグラフィーによって分画した。2
05、277nm及び292nmでの示差UV吸光度、ピーク対称性及び解像度に基づいて最適
画分を選択した（Lane, et al., 1991, J. Prot; Chem. 10, 151-160）。次に、
これらの画分を、Thermo Bioanalysis Lasermat 2000（Hemel、英国）を用いる
マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（MALDI−TOF／MS）により、
長さ及び均一性についてさらにスクリーニングした。Finnigan TSQ7000（San Jo
se、CA）三重四極子質量分析計（triple quadrupole mass spectrometer）を用
いるエレクトロスプレーイオン化／タンデム質量分析により、Nashら（Nash, et
al., 1996, Curr; Biol. 6, 968-980）に記載されるように、トリプシン性ペプ
チドの配列を決定した。あるいは、PE／ABD 477A（Foster City、CA）タンパク
質シーケンサーを用いる自動化Edman分解にペプチドを供した。

【０１３８】ヒトトロポニンＩのクローニング及び発現廃棄臨床材料に関する生命倫理ガイドラインに従い、ヒト肋間軟骨組織を得た
。ヒト速筋骨格筋トロポニンIの断片をコードするcDNAを、標準逆転写酵素ポリ
メラーゼ連鎖反応（RT−PCR）により、ヒト軟骨のコアサンプルから単離された
全RNAからヒト速筋骨格筋TnI（Zhu, et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta 12
17, 338-340）のヌクレオチド配列に基づくプライマー：正プライマー5’−GCTC
TGCAAACAGCTGCACGCCAAG−3’（配列番号4）及び逆プライマー5’−GCCCAGCAGGGC
CTTGAGCATGGCA−3’（配列番号5）を用いて増幅し、それをPCR2.1（Invitrogen
）にクローン化して両方向に配列決定した。ヒト速筋骨格筋トロポニンＩの完全
長オープン・リーディング・フレーム（ORF）をコードするcDNAを、ヒト骨格筋m
RNAから、標準PCR条件下でPfuポリメラーゼ（Stratagene）を用い、正プライマ
ー（5’−CTCACCATGGGAGATGAGGAGAAGC−3’）（配列番号6）及び逆プライマー（
5’−GCCTCGAGTGGCCTAGGACTCGGAC−3’）（配列番号7）を用いてクローン化した
。このPCR産物を、5’−Ncol及び3’−XhoI部位を用いて発現ベクターPet24d（N
ovagen）にクローン化し、上記のように配列決定した。

【０１３９】 TnIの組織発現を上記のRT−PCRによって分析した。全RNA（400 ng／サンプル
）をラット骨格筋、肝臓（Clontech）、剣状突起及びSwarmラット軟骨肉腫から
単離した。正（５’−GAACACTGCCCGCCTCTGCACATC−3’）（配列番号8）及び逆（
5’−GAGCCCAGCAGCGCCTTCAGCATG−3’）（配列番号9）プライマーの設計は、ラ
ット速筋骨格筋TnIのヌクレオチド配列に基づいた。

【０１４０】組換え（r）ヒトTnIを標準プロトコル（Sambrook, et al., 1989, Molecular
Cloning: A laboratory manual. (Cold Spring Harbor Press, New York, NY)）
にしたがって発現させた。発現の5時間後、遠心によって細菌を回収した。12,00
0×gで15分間遠心した後、ペレットを1.0mlのバッファA（15mM Tris−HCl、0.1m
M EDTA、pH7.0）に再懸濁させた。細胞を超音波によって破壊した。バッファA中
、12,000×gで15分間の1回の遠心、次いでバッファA中、11,000×gで15分間の1
回の遠心により封入体を単離した。

【０１４１】組換えトロポニンＩの精製洗浄したペレットを6M尿素、0.5M NaCl、5mM HEPES、2mM EDTA、5mM DTT（pH7
.5）に溶解し、上記バッファ中、4℃で6−8時間振盪した（nutated）。次に、こ
のサンプルを0.5M NaCl、5mM HEPES、5mM DTT（pH7.5）に対して透析し、Amicon
濃縮器（YM−10、MWCO 10,000Da）を用いて濃縮した後、Progel−TSK G3000SWXL
カラム（30cm×7.8mm）に適用した。上記バッファ（0.5M NaCl、5mM HEPES、5mM
DTT、pH7.5）を用いてサンプルを溶出した。幾つかの抑制性調製品をQ−Sephar
ose HPカラム（Pharmacia Biotech）でさらに分画し、下記の通り試験したとこ
ろ、生物学的活性に差はなかった。試験に先立ち、精製rTnIを、0.5mM DTTを含
むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に対して透析した。タンパク質濃度は、ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で同時電気泳
動し、かつクーマシーブルーで染色した、既知タンパク質標準（Novex）との走
査型濃度測定比較（IS−1000 Digital Imaging System、バージョン2.00、Alpha
Innotech Corp.）によって決定した。

【０１４２】ウェスタンブロット分析天然TnI（軟骨から上述の通りに精製）、組換えTnI（上述の通りに精製）及び
標準プロトコルに従って下記の通りに調製したウシ軟骨細胞溶解物のサンプルに
対して免疫ブロットを行った。以前に本発明者が記述したように（Moses, et al
., 1990, J. Cell. Biol. 119, 474-481）、一次ウシ肩甲骨軟骨細胞の培養物を
確立して維持した。細胞をPBSですすぎ、各々の10cm培養皿に1mlの煮沸2×濃縮
電気泳動サンプルバッファ（250mM Tris−HCl、pH6.8、4％SDS、10％グリセロー
ル、0.006％ブロモフェノールブルー及び2％B−メルカプトエタノール）を添加
した。これらの皿から使い捨て細胞スクレーパー（Costar）を用いて細胞をこす
り落として微量遠心管に移し、さらに5分間煮沸した。26ゲージ針（Becton Dick
inson）に数回通過させた後、サンプルを遠心（2000×g）によって清澄化し、0.
1％ SDSに希釈し、DO Protein Assay（BioRad）を用いてタンパク質濃度を決定
した。全てのサンプルを、Laemmli（Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685）に
よる4／12％アクリルアミドミニゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って分離した。次に、Transblot装置（Biorad）を用いてタンパク質をニトロセ
ルロース（Hybond−ECL、Amersham）に移し、ウサギ骨格筋TnIに対するモノクロ
ーナル抗体（Advanced Immunochemical Inc.）と共にインキュベートし、ECLウ
ェスタンブロットシステムを製造者のプロトコル（Amersham）に従って用いて発
色させた。

【０１４３】結果毛細血管内皮細胞（EC）の塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）刺激増殖の抑制
を測定するin vitroアッセイを精製をモニターするのに用いた（Moses, et al.,
1990, Science 2488, 1408-1410；Moses, et al., 1990, J. Cell. Biol. 119,
474-481；Connolly, et al., 1986, Anal. Biochem. 152, 136-140）。下記の
一連のクロマトグラフィー工程から得られた全ての軟骨由来の画分をこの抑制生
物活性についてスクリーニングした。抑制活性は、A−1.5mサイズ排除カラムか
らは約25,000Daの分子量で、Biorex 70カチオン交換カラムからは約0.2M NaClで
、Sephadex G−75ゲル濾過カラムからは約23,000Daで、約38.5％のアセトニトリ
ル濃度で、及びProgel−TSK G3000SWXLカラムからは約22,000DaのMrで溶出した
。最終クロマトグラフィー工程から得られた抑制性画分をトリプシン消化に処し
、得られたペプチドをマイクロキャピラリーLC−ESIタンデム質量分析又は自動
化Edman分解によって配列決定した。3つのペプチド断片の配列が得られ、トロポ
ニンＩの断片と同定された（図6）。

【０１４４】文献中には軟骨細胞がTnIを含むというそれ以前の報告が存在しなかったため
、ヒト軟骨TnIをコードするcDNAを標準PCR策を用いてクローン化した（Wu and M
oses, 1996, Gene 18, 243-246）（図7A）。そのPCR産生物の配列決定により、
ヒト速筋骨格筋TnIとの同一性が明らかになった（図7B）（配列番号16）。ラッ
ト剣状突起軟骨、Swarmラット軟骨肉腫及び肝臓のTnI発現レベルもRT−PCRによ
って決定したところ、それらはラット骨格筋のものよりもかなり小さく、肝臓に
おける発現レベルは軟骨又は軟骨肉腫よりも僅かに小さいものと思われた（図7C
）。

【０１４５】抗血管形成因子としての潜在能力を調べるのに十分な量のTnIを得るため、完
全長ヒト速筋骨格筋トロポニンＩをコードするcDNAを発現ベクターpET−24dにク
ローン化し、大腸菌（E. coli）BL21（DE3）p LysS株にトランスフォームした。
組換えヒト骨格筋トロポニンＩの発現レベルは全細胞性タンパク質の約30−40％
であった。精製の後、組換えTnIはSDS−PAGEで約21kDaの単一バンドとして移動
した。

【０１４６】実施例8：毛細血管内皮細胞（EC）増殖細胞培養ウシ副腎皮質から単離した毛細血管EC（Folkman, et al., 1979, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76, 5217-5221）をChildren's Hospital（ボストン、MA）から
入手した。これらの細胞は、von Willebrand因子に対する抗血清での染色及びフ
ルオレセイン化アセチル化低密度リポタンパク質の取り込みによって内皮性であ
ることが示された。細胞を、培養物の状態で、これらのアッセイに備えた3ng／m
l bFGF又は血管内皮細胞成長因子（VEGF）が補足されている10％子ウシ血清（Hy
clone）を含むDME（ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco Laboratories）（DME
／10）中に維持した。

【０１４７】 BALB／cマウス3T3細胞を、従前に記述されているように（Klagsbrun, et al.,
1977, Exp. Cell Res. 105, 99-108）、DME／10、L−グルタミン（292μg／ml
）中に維持した。ウシ大動脈の内層から外植することによって単離したウシ大動
脈平滑筋細胞（SMC）をChildren's Hospital（ボストン、MA）から入手した。こ
れらの細胞を、従前に記述されているように（D'Amore and Smith, 1993, Growt
h Factors 8, 61-75）、非被覆組織培養プラスチック上、DME／10中で培養した
。

【０１４８】簡単に述べると、毛細血管EC（ウェル当たり2,000細胞）を、5％（v／v）子ウ
シ血清が補足されているDMEM中のゼラチン化96ウェル培養プレートに塗布し、24
時間インキュベートした。第2日に、細胞をbFGF（Scios Nova；1ng／ml）で処理
し、試験画分及び／又は精製TnIで攻撃誘発した。VEGFを有糸分裂促進因子とし
て用いる実験については、ウェル当たり800細胞を塗布し、3時間インキュベート
した後、VEGF（Biomedical Technologies Incorporated；30ng／ml）及びTnIを
添加した。対照ウェルは細胞単独及びbFGF又はVEGFで刺激した細胞を収容してい
た。第5日に、成長培地をプレートから取り除いた；界面活性剤Triton x−100及
びホスファターゼ基質p−ニトロフェニルホスフェートを含むバッファ中で細胞
を溶解した。37℃で2時間インキュベートした後、NaOHを添加して反応を停止さ
せた。高速マルチウェルプレートリーダー（Dynatech MR 5000）を用いて発色を
測定した（Moses, et al., 1990, Science 2488, 1408-1410；Moses, et al.,
1990, J. Cell. Biol. 119, 474-481；Connolly, et al., 1986, Anal. Biochem
. 152, 136-140）。本発明者が以前記述した電子細胞計数アッセイ（Moses, et
al., 1990, Science 2488, 1408-1410；Moses, et al., 1990, J. Cell. Biol.
119, 474-481）によってEC抑制活性を確認した。トリチウム化チミジン取り込み
アッセイをShingの方法（Shing, 1990, in Methods In Enzymolqgy, eds. Barne
s, D., Mather, J.P. and Sato, G.H. (Academic Press, New York), pp. 91-95
）に従って行った。

【０１４９】結果精製rTnIをbFGF及びVEGF刺激毛細血管ECを抑制するその能力について試験した
ところ、EC増殖を用量依存及び飽和様式で抑制することが見出され、IC₅₀（増殖
の50％抑制が観察される阻止濃度）は、bFGFが有糸分裂促進因子として用いられ
る場合には約65nM（図9A）、VEGFが用いられる場合には約1.5nM（図9B）であっ
た。天然TnIは毛細血管ECの増殖を等効力（equipotent）様式で抑制した。トリ
チウム化チミジンアッセイでは組換えTnIが毛細血管ECのDNA合成を用量依存及び
飽和様式で抑制することが示され、IC₅₀は約240nMであった。この増殖の抑制は
、TnIが、ウシ大動脈平滑筋細胞及びBalb／c 3T3細胞を含む試験した非内皮細胞
のいずれの成長をも、毛細血管ECに対するIC₅₀値を得るのに必要なTnIの5倍を上
回る用量で試験したときでさえ抑制しかなったという事実を考慮すると、内皮細
胞に独自のものであると考えられる。

【０１５０】実施例9：細胞特異性ウシ大動脈SMC及びBalb c／3T3細胞の増殖がTnIによって抑制されるかどうか
を決定するため、以下のアッセイを行った。SMCをマルチウェル皿（2.1cm²／ウ
ェル）に10,000細胞／ウェルの密度で塗布した。細胞を一晩付着させた後、3ng
／ml PDGF−BB単独又は漸増濃度の精製TnIとの組み合わせのいずれかを含む新鮮
な培地を適用した。37℃、10％CO₂中で72時間インキュベートした後、細胞をPBS
中ですすぎ、トリプシン処理によって脱着させて電子的に計数した。静止状態BA
LB／cマウス3T3細胞に対するTnIの効果は、従前に記載されているように（Shing
, 1990, in Methods in Enzymolqgy, eds. Barnes, D., Mather, J.P. and Sato
, G.H. (Academic Press, New York), pp. 91-95）、96ウェルプレートにおいて
DNAへのトリチウム化チミジンの取り込みを測定することによってアッセイした
。

【０１５１】実施例10：ヒナ漿尿膜（CAM）アッセイ全ての手順は層流フード内で無菌条件下において行った。卵はFavorite Egg I
ncubator（Leahy）内に37℃、相対湿度65％で保存した。発生の第3日に、受精し
た白色レグホン(SPAFAS)の卵を割り、胚を殻から取り出してプラスチックペトリ
皿に入れた。第6日に、天然ウサギTnI（Greaser and Gergely, 1971, J. Biol.
Chem. 246, 4226-4233）及び組換えヒトTnIを含む試験物質並びに適切なバッフ
ァ対照をメチルセルロース・ディスクにおいて混合し、成長しているCAMの高密
度外胚葉下叢の上の表面に貼付した。プラスチックディスク移植の48時間後、解
剖用スコープ（60×）の下で血管反応について卵を検査し、写真撮影した（Mose
s, et al., 1990, Science 2488, 1408-1410；Moses, et al., 1990, J. Cell.
Biol. 119, 474-481）。

【０１５２】このCAMアッセイは、rTnIがin vivoで血管形成の抑制因子であるかどうかを決
定するのに用いた。図10に示される結果は、130ピコモルのrTnIで生じた大きな
無血管帯によって立証されるように、胚の新生血管形成の有意な抑制を示す。こ
の効果は、この用量では試験した卵の66％において、約380ピコモルの用量では
試験した卵の100％において観察された。この観察は、3種類の異なるTnI調製品
を用いる3つの別々のCAMアッセイのセットで再現された。この実験のシリーズに
おいて125を上回るCAMを試験した。

【０１５３】実施例11：マウス角膜嚢アッセイ in vivoでの血管形成の抑制もマウス角膜嚢アッセイ（Chen, et al., 1995, C
ancer. Res. 55, 4230-4233；0' Reilly, et al., 1996, Nat. Med. 2, 689-692
）を用いて示した。簡単に述べると、bFGF（40ng／ml）、スクロース八硫酸塩、
及びHydronを含んでなるペレットを、従前に記述されているように（Mosesらの
米国特許第5,837,680号）、6匹のC57BL／6マウスの角膜微小嚢（micropockets）
に移植した。トロポニンＩ（50mg／kg）を12時間毎に皮下注射によって全身的に
投与した。処置の第6日に、角膜の血管形成をスリットランプ顕微鏡を用いて評
価し、写真撮影した。

【０１５４】結果別のin vivoアッセイ、マウス角膜嚢アッセイにおいて、rTnIの全身投与は、
ビヒクルのみを投与した対照マウスの角膜（図11A）と比較した場合、bFGF誘導
血管形成を有意に抑制した（図11B）。

【０１５５】まとめると、第6節、実施例10及び11に記載されるin vivo研究は、rTnIが、こ
れらの同じアッセイにおいて試験した他の抑制因子（Moses, et al., 1995, in
International Review of Cytology, 161, 1-48）と比較した場合、新生血管形
成の強力な抑制因子であることを示す。

【０１５６】実施例12：B16−BL16メラノーマモデルネズミメラノーマB16−BL6を、10％（v／v）子ウシ血清（Hyclone）、L−グル
タミン及びNaHCO₃が補足されているRPMI 1640中で培養した。細胞をEBSS（Gibco
）で洗浄して、0.25％TRL／0.2％EDTAで3〜5mmトリプシン処理し、これに洗浄の
ために培養バッファを添加した。次に、この調製品を1000rpmで10mm遠心して細
胞ペレットを新鮮な培養培地中に再懸濁させ、コールターカウンターを用いて細
胞数を測定し、トリパンブルーで細胞の生存度を測定した（生存度100％）。こ
の細胞懸濁液を移植のために2.5×10⁵細胞／mlに調整した。B16−BL6細胞（5×1
0⁵／0.2ml）をC57BL／6マウス（約6−7週齢）の尾の静脈に注射した。腫瘍細胞
接種の1日後、毎週2回、1mg／kg（n＝10）もしくは20mg／kg（n＝10）のいずれ
かの用量又はビヒクル（150mM NaCl、20mMクエン酸塩、pH3）で28日間にわたっ
てマウスをrTnIで全身的に処置した。第30日に動物を犠牲にし、肺表面の転移の
数を計数して肺を秤量した。

【０１５７】結果組換えTnIを、B16メラノーマ細胞系の非常に活動的な変種、B16−BL16（Saiki
, et al., 1989 Cancer Res. 49, 3815-3822）によって生じる肺転移をin vivo
で抑制するその能力について試験した。全身的に投与された組換えTnIは、週に2
回のみ投与されたときに1mg／kgの用量で52％（p＜0.04 片側t検定）（n＝10）
、週に2回20mg／kgの用量で64％（p＜0.02；片側t検定）（n＝10）肺転移を抑制
し［肺転移対照（68.6＋／−7.5 SEM）（n＝10）；1mg／kg（32.8＋1−4.8 SEM
）；20mg／kg（25.0＋／−7.5 SEM）］、毒性は観察されなかった（すなわち、
体重又は食欲の喪失がない等）。肺の重量は対照群及び処置群において類似して
いた。

【０１５８】データによって示されるように、TnIは肺転移を抑制した。

【０１５９】実施例13：トロポニンＩの断片を用いる内皮細胞増殖の抑制ウサギ（rb）TnI（配列番号10）（図12）の断片に相当する組換えペプチドを
、第6節、実施例2及び8に記載されるように、bFGF刺激毛細血管ECを抑制する能
力について試験した。rbTnI断片（配列番号11−15）はJha et al., 1996, Bioch
emistry 35(34):11026-11035に従って調製した。表2に示されるように、TnIのア
ミノ末端（N’）領域（aa 1−94）（配列番号11）；N’及び抑制（I’）領域（a
a 1−120）（配列番号12）；I’領域（aa 98−114）（配列番号13）；カルボキ
シ末端（C’）及びI’領域（C’＋I’）（aa 96−181）（配列番号14）；C’領
域（aa 122−181）（配列番号15）；並びにC’＋I’（配列番号14）にN’（配列
番号11）断片を加えた混合物及びN’＋I’（配列番号12）にC’（配列番号15）
断片を加えた混合物に相当する、様々な濃度のペプチドをEC増殖の抑制について
試験した。

【０１６０】表2に示されるように、C’＋I’断片（配列番号14）はEC増殖を有意に抑制し
た。抑制パーセントは0.1μg／ウェル及び0.3μg／ウェルで、それぞれ、54％及
び48％であった。IC₅₀は0.1〜0.2μg／ウェル（0.05μM〜0.1μM）であるものと
決定された。さらに、N’＋I’（配列番号12）断片はC’（配列番号15）断片の
抑制活性を妨害し、N’（配列番号11）断片はC’＋I’（配列番号14）断片の抑
制活性を妨害した。

【０１６１】上記第6節、実施例3に示されるように、完全長TnIは5μg／ウェル（1.2μM）
の濃度でEC増殖を約46％抑制した。したがって、C’＋I’断片は完全長TnIと比
較して25〜50倍のEC抑制活性を有していた。

【０１６２】これらの結果は、トロポニンサブユニットの断片、特にC’＋I’断片（配列番
号14）が、新生血管形成のプロセスを模倣するように開発されたアッセイにおい
てEC増殖を抑制したことを示す。したがって、トロポニンサブユニット断片は血
管形成を抑制する。

【０１６３】

【表２】本明細書で用いられている略語は以下の通りである。DTT、ジチオスレイトー
ル；EGTA、エチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N'-テトラア
セテート；SDS、ドデシル硫酸ナトリウム；SE-、スルホエチル。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、トロポニンＣによるウシ毛細血管内皮細胞（BCE）増殖の抑制を示す
。bFGF刺激BCE増殖の抑制率（％）は、トロポニンＣの濃度（μg／ウェル）の関
数として示す。抑制率（％）は、刺激物質のみで処理した細胞について得られた
結果を、刺激物質および抑制物質の両者に曝したサンプルについて得られた結果
と比較することにより求めた。ウェルの容積は200μlであった。

【図２】図２は、トロポニンＩによる毛細血管BCE増殖の抑制を示す。bFGF刺激BCE増殖
の抑制率（％）は、トロポニンＩの濃度（μg／ウェル）の関数として示す。抑
制率（％）は、図１で説明したようにして求めた。ウェルの容積は200μlであっ
た。

【図３】図３は、トロポニンＴによる毛細血管BCE増殖の抑制を示す。bFGF刺激BCE増殖
の抑制率（％）は、トロポニンＴの濃度（μg／ウェル）の関数として示す。抑
制率（％）は、図１で説明したようにして求めた。ウェルの容積は200μlであっ
た。

【図４】図４は、トロポニンＣおよびＩによるBCE増殖の抑制を示す。bFGF刺激BCE増殖
の抑制率（％）は、トロポニンＣおよびＩの濃度（μg／ウェル）の関数として
示す。抑制率（％）は、図１で説明したようにして求めた。ウェルの容積は200
μlであった。

【図５】図５は、トロポニンＣ、ＩおよびＴによる毛細血管BCE増殖の抑制を示す。bFG
F刺激BCE増殖の抑制率（％）は、トロポニンＣ、ＩおよびＴの濃度（μg／ウェ
ル）の関数として示す。抑制率（％）は、図１で説明したようにして求めた。ウ
ェルの容積は200μlであった。

【図６】図６は、方法の欄で説明したようにして軟骨から精製されたトリプシンペプチ
ドのアミノ酸配列の概略図である。ヒトTnIに対する配列類似性は、ヒトのアイ
ソフォームのアミノ酸配列とのアライメントにより示す。

【図７】図7(A)は、2種の別々のヒト肋間軟骨検体から精製した全RNAから増幅したRT-P
CR産物を示す。遺伝子特異的プライマーを、ヒト速筋骨格筋TnIのcDNA配列に基
づいて設計した。図7(B)は、ヒト速筋骨格筋TnIのcDNA配列（nt189〜nt384）（
配列番号16）に対する同一性を示すこれらのPCR産物のヌクレオチド配列を示す
。図7(C)は、ラットの骨格筋（レーン１）、剣状突起（xyphoid）（レーン２）
、軟骨肉腫（レーン３）および肝臓（レーン４）から精製した全RNA（各レーン
当たり20ng）からのRT-PCR増幅を示す。遺伝子特異的プライマーを、方法の欄で
説明するようにしてラット速筋骨格筋TnIのcDNAに基づいて設計した。

【図８】図８は、精製前（レーンＡ）および精製後（レーンＢ）の組換えヒトTnIのSDS
-PAGEを示す。両者の場合、方法の欄で説明するようにして、約１μgの全タンパ
ク質を電気泳動し、続いて銀染色した。組換えTnIは、約21,000Daの分子量のと
ころに移動した。

【図９】図９は、rTnIによる毛細血管EC増幅の抑制を示す。抑制率（％）は、脈管形成
性刺激物質bFGF（Ａ）およびVEGF（Ｂ）に曝したウェルを、刺激物質および抑制
物質に曝したウェルと比較することにより求めた。各点は、２連の対照および抑
制物質のウェルの平均を示す。これは、４種の異なるEC増幅アッセイの代表的な
実験であり、各々は異なるTnI調製物を調べる。

【図１０】図10は、rTnIによるin vivoでの胚の血管形成の抑制を示す。方法の欄で説明
したようにしてrTnIに48時間曝した後では、双眼解剖顕微鏡を用いて７〜10倍の
倍率で毛細血管および小血管を含まない無血管ゾーンが観察された。このゾーン
は、約380pmoleのTnIにより生じた（Ａ）。緩衝液だけを含有するメチルセルロ
ースディスクを埋め込んだ正常な絨毛尿膜（CAM）を（Ｂ）に示す。

【図１１】図11は、TnIの全身投与によるFGF誘導性血管形成の抑制を示す。第１日目に、
TnI（50mg/kg）を、bFGF（40ng/ml）を含有するペレットを角膜に移植したマウ
スに12時間毎に全身投与した。処理の６日後に、TnI処理角膜（Ｂ）では、対照
の角膜（Ａ）と比較してFGF誘導性新生血管形成の有意な抑制が見られた。

【図１２】図12(A)は、組換えヒトTnI（Hu）の推定アミノ酸配列（配列番号17）および組
換えウサギTnI（Rb）（配列番号10）とのその配列比較を示す。同一の残基はダ
ッシュで示す。図12(B)は、ウサギTnIに基づく種々の組換えTnI欠失断片および
野生型ウサギTnI_w（配列番号10）の概略図である。トロポニンＩの抑制領域はI
’で示し、この領域のアミノ末端側およびカルボキシ末端側に位置する配列は、
それぞれN’およびC’で示す。TnI_1-120、TnI_1-94、TnI_96-181、TnI_122-181はそ
れぞれ、N’とI’の領域、N’、I’とC’の領域、およびC’の領域を含む。各断
片の始点および終点にあるアミノ酸の番号を示す。アミノ酸残基98〜114を含むT
nI_98-114は、Ｉ領域に該当する合成ペプチドである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 35/12 // Ａ６１Ｋ 35/12 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ソーン，リチャード，エム．アメリカ合衆国 02356 マサチュウセッツ州，ノースイーストン，パートリッジウェイ 16 (72)発明者ランサー，マーク，イー．アメリカ合衆国 02030 マサチュウセッツ州，ドヴァー，クレイブルックロード 183 (72)発明者モーゼス，マーシャ，エー．アメリカ合衆国 02146 マサチュウセッツ州，ブルックリン，ディーンロード 64 (72)発明者ウィエダースチェイン，デミトリ，ジー．アメリカ合衆国 02146 マサチュウセッツ州，ブルックリン，ステアーンズロード 11 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA03 DA05 GA11 HA17 4C084 AA02 AA13 BA08 BA20 BA21 BA23 BA44 CA18 CA20 MA52 MA55 NA14 ZA332 ZA592 ZB262 4C087 AA01 AA02 BB28 BB63 BB65 CA04 CA16 MA52 MA55 NA14 ZA33 ZA59 ZB26 4H045 AA10 AA30 CA40 EA20 EA28 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効量のペプチドを投与することを含んでなる、疾患または
障害に関連する血管形成の抑制方法であって、該ペプチドは：ａ．長さが100アミノ酸未満であり；かつｂ．トロポニンサブユニットＩの抑制およびカルボキシ末端領域（配列番号14
）と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項２】前記ペプチドが配列番号14のアミノ酸配列からなる、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】前記疾患または障害が充実性腫瘍である、請求項１に記載の
方法。
【請求項４】前記充実性腫瘍が表１に示す肉腫および癌からなる群から選
ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記疾患または障害が眼の疾患または障害である、請求項１
に記載の方法。
【請求項６】被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記有効量が投与当たり約１から約50mgである、請求項１に
記載の方法。
【請求項８】前記ペプチドが非経口的に投与される、請求項１に記載の方
法。
【請求項９】前記ペプチドが経口的に投与される、請求項１に記載の方法
。
【請求項１０】前記トロポニンサブユニットＩがヒトまたはウシのトロポ
ニンサブユニットＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項１に記
載の方法。
【請求項１２】前記疾患または障害が肺転移である、請求項１に記載の方
法。
【請求項１３】前記トロポニンサブユニットＩが組織に由来する、請求項
１に記載の方法。
【請求項１４】前記組織が結合、筋肉、神経または上皮である、請求項13
に記載の方法。
【請求項１５】前記組織が軟骨である、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】有効量のペプチドを投与することを含んでなる、被験体内
の充実性腫瘍の増殖を抑制するか、または該充実性腫瘍の容積を低減させる方法
であって、該ペプチドは： (a)長さが100アミノ酸未満であり；かつ (b)トロポニンサブユニットＩの抑制およびカルボキシ末端領域（配列番号14
）と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項１７】前記ペプチドが配列番号14のアミノ酸配列からなる、請求
項16に記載の方法。
【請求項１８】前記ペプチドが非経口的に投与される、請求項16に記載の
方法。
【請求項１９】前記ペプチドが経口的に投与される、請求項16に記載の方
法。
【請求項２０】前記充実性腫瘍が表１に示す肉腫および癌からなる群から
選ばれる、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項16に記
載の方法。
【請求項２２】有効量のペプチドを投与することを含んでなる、被験体内
での転移の抑制方法であって、該ペプチドは： (a)長さが100アミノ酸未満であり；かつ (b)トロポニンサブユニットＩの抑制およびカルボキシ末端領域（配列番号14
）と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項２３】前記ペプチドが配列番号14のアミノ酸配列からなる、請求
項22に記載の方法。
【請求項２４】前記被験体が、表１に示す肉腫および癌からなる群から選
ばれる充実性腫瘍を有するヒトである、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項22に記
載の方法。
【請求項２６】ペプチドと製薬上許容される担体とを含む医薬組成物であ
って、該ペプチドは： (a)長さが100アミノ酸未満であり；かつ (b)トロポニンサブユニットＩの抑制およびカルボキシ末端領域（配列番号14
）と80％よりも高い相同性がある、上記組成物。
【請求項２７】前記ペプチドが配列番号14のアミノ酸配列からなる、請求
項26記載の組成物。
【請求項２８】前記トロポニンサブユニットＩがヒトまたはウシのトロポ
ニンサブユニットＩである、請求項26に記載の組成物。
【請求項２９】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項26に記
載の医薬組成物。
【請求項３０】前記トロポニンサブユニットＩが組織に由来する、請求項
26に記載の組成物。
【請求項３１】前記組織が軟骨である、請求項30に記載の組成物。
【請求項３２】前記組織が結合、筋肉、神経または上皮である、請求項30
に記載の組成物。
【請求項３３】ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞
を含んで、該ペプチドが被験体内で発現されるようにする医薬組成物であって、
該ペプチドは： (a)長さが100アミノ酸未満であり；かつ (b)トロポニンサブユニットＩの抑制およびカルボキシ末端領域（配列番号14
）と80％よりも高い相同性がある、上記組成物。
【請求項３４】被験体内での充実性腫瘍の増殖を抑制するか、または該充
実性腫瘍の容積を低減するための方法であって、ペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む組換え細胞を投与して、該被験体内で該ペプチドが発現されるよ
うにすることを含んでなり、該ペプチドは： (a)長さが100アミノ酸未満であり；かつ (b)トロポニンサブユニットＩの抑制およびカルボキシ末端領域（配列番号14
）と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項３５】被験体内での転移の抑制方法であって、ペプチドをコード
するヌクレオチド配列を含む組換え細胞を被験体に投与して、該被験体内で該ペ
プチドが発現されるようにすることを含んでなり、該ペプチドは： (a)長さが100アミノ酸未満であり；かつ (b)トロポニンサブユニットＩの抑制およびカルボキシ末端領域（配列番号14
）と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項３６】ペプチドと製薬上許容される担体とを含む医薬組成物であ
って、該ペプチドは： (a)少なくとも10μMのIC₅₀を有するbFGF刺激ウシ内皮細胞増殖の抑制物質であ
り； (b)長さが少なくとも100個の連続アミノ酸であり；かつ (c)速筋トロポニンサブユニットＣ（配列番号１）、トロポニンサブユニット
Ｉ（配列番号２）、速筋トロポニンサブユニットＴ（配列番号３）からなる群か
ら選ばれるサブユニットと80％よりも高い相同性がある、上記組成物。
【請求項３７】前記トロポニンサブユニットＩが組織に由来する、請求項
36に記載の組成物。
【請求項３８】前記組織が軟骨である、請求項37に記載の組成物。
【請求項３９】ペプチドと製薬上許容される担体とを含む医薬組成物であ
って、該ペプチドは： (a)少なくとも10μMのIC₅₀を有するbFGF刺激ウシ内皮細胞増殖の抑制物質であ
り；かつ (b)速筋トロポニンサブユニットＣ（配列番号１）、トロポニンサブユニット
Ｉ（配列番号２）、速筋トロポニンサブユニットＴ（配列番号３）からなる群か
ら選ばれる、上記組成物。
【請求項４０】前記トロポニンサブユニットＩが組織に由来する、請求項
39に記載の組成物。
【請求項４１】前記組織が軟骨である、請求項40に記載の組成物。
【請求項４２】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項39に記
載の医薬組成物。
【請求項４３】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項42に記
載の医薬組成物。
【請求項４４】ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞
を含んで、該ペプチドが被験体内で発現されるようにする医薬組成物であって、
該ペプチドは： (a)少なくとも10μMのIC₅₀を有するbFGF刺激ウシ内皮細胞増殖の抑制物質であ
り； (b)長さが少なくとも100個の連続アミノ酸であり；かつ (c)速筋トロポニンサブユニットＣ（配列番号１）、トロポニンサブユニット
Ｉ（配列番号２）および速筋トロポニンサブユニットＴ（配列番号３）からなる
群から選ばれるサブユニットと80％よりも高い相同性がある、上記組成物。
【請求項４５】ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞
を含んで、該ペプチドが被験体内で発現されるようにする医薬組成物であって、
該ペプチドは： (a)少なくとも10μMのIC₅₀を有するbFGF刺激ウシ内皮細胞増殖の抑制物質であ
り；かつ (b)速筋トロポニンサブユニットＣ（配列番号１）、トロポニンサブユニット
Ｉ（配列番号２）、速筋トロポニンサブユニットＴ（配列番号３）からなる群か
ら選ばれる、上記組成物。
【請求項４６】配列番号２のアミノ酸残基118〜137（huTnI_118-137）を有
するトロポニンサブユニットＩの領域を含むペプチド。
【請求項４７】有効量のペプチドを投与することを含んでなる、疾患また
は障害に関連する血管形成の抑制方法であって、該ペプチドはトロポニンサブユ
ニットＩ（配列番号２）の抑制領域のアミノ酸残基118〜137（huTnI_118-137）と
80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項４８】前記ペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基118〜137（hu
TnI_118-137）を有するトロポニンサブユニットＩの領域からなる、請求項47に記
載の方法。
【請求項４９】前記疾患または障害が充実性腫瘍である、請求項47に記載
の方法。
【請求項５０】前記充実性腫瘍が、表１に示す肉腫および癌からなる群か
ら選ばれる、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】前記疾患または障害が眼の疾患または障害である、請求項
47に記載の方法。
【請求項５２】前記被験体がヒトである、請求項47に記載の方法。
【請求項５３】前記有効量が投与当たり約１から約50mgである、請求項47
に記載の方法。
【請求項５４】前記ペプチドが非経口的に投与される、請求項47に記載の
方法。
【請求項５５】前記ペプチドが経口的に投与される、請求項47に記載の方
法。
【請求項５６】前記ペプチドがヒトまたはウシ起源のものである、請求項
47に記載の方法。
【請求項５７】前記ペプチドが、前記ペプチドをコードするヌクレオチド
配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項47に記載
の方法。
【請求項５８】前記疾患または障害が肺転移である、請求項47に記載の方
法。
【請求項５９】前記ペプチドが組織に由来する、請求項47に記載の方法。
【請求項６０】前記組織が結合、筋肉、神経または上皮である、請求項59
に記載の方法。
【請求項６１】前記組織が軟骨である、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】疾患または障害に関連する血管形成の抑制方法であって、
配列番号２の残基118〜137（huTnI_118-137）のアミノ酸配列の少なくとも10個の
連続アミノ酸残基を有するペプチドを有効量投与して、血管形成が抑制されるよ
うにすることを含む、上記方法。
【請求項６３】前記ペプチドが、配列番号２の残基118〜137（huTnI_118-1 ₃₇ ）のアミノ酸配列からなる、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】有効量のペプチドを投与することを含んでなる、哺乳動物
における転移の抑制方法であって、該ペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基11
8〜137（huTnI_118-137）を有するトロポニンサブユニットＩの領域と80％よりも
高い相同性がある、上記方法。
【請求項６５】前記哺乳動物が、表１に示す肉腫および癌からなる群から
選ばれる充実性腫瘍を有するヒトである、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項64に記
載の方法。
【請求項６７】ペプチドと製薬上許容される担体とを含む、疾患または障
害に関連する血管形成を抑制するための医薬組成物であって、該ペプチドは、配
列番号２のアミノ酸残基118〜137（huTnI_118-137）と80％よりも高い相同性があ
る、上記組成物。
【請求項６８】疾患または障害に関連する血管形成を抑制するための医薬
組成物であって、配列番号２の残基118〜137（huTnI_118-137）のアミノ酸配列の
少なくとも10個の連続アミノ酸残基を有するペプチドを含む、上記組成物。
【請求項６９】前記ペプチドが、配列番号２の残基118〜137（huTnI_118-1 ₃₇ ）のアミノ酸配列からなる、請求項67または68に記載の組成物。
【請求項７０】前記ペプチドが組織に由来する、請求項67に記載の組成物
。
【請求項７１】前記組織が結合、筋肉、神経または上皮である、請求項70
に記載の組成物。
【請求項７２】前記組織が軟骨である、請求項70に記載の組成物。
【請求項７３】前記ペプチドがヒトまたはウシ起源のものである、請求項
67に記載の組成物。
【請求項７４】前記ペプチドが、該ペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項67または68
に記載の医薬組成物。
【請求項７５】ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞
を含んで、該ペプチドが宿主内で発現されるようにする医薬組成物であって、該
ペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基118〜137（huTnI_118-137）を有するトロ
ポニンサブユニットＩの領域と80％よりも高い相同性がある、上記組成物。
【請求項７６】ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞
を含んで、該ペプチドが宿主内で発現されるようにする医薬組成物であって、該
ペプチドは、配列番号２の残基118〜137（huTnI_118-137）のアミノ酸配列の少な
くとも10個の連続アミノ酸残基を有するトロポニンサブユニットＩの領域である
、上記組成物。
【請求項７７】前記ペプチドが、配列番号２の残基118〜137（huTnI_118-1 ₃₇ ）のアミノ酸配列からなる、請求項76に記載の医薬組成物。
【請求項７８】被験体における充実性腫瘍の増殖を抑制するか、または該
充実性腫瘍の容積を低減するための方法であって、ペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を含む組換え細胞を投与して、該ペプチドが宿主内で発現されるよう
にすることを含んでなり、該ペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基118〜137（
huTnI_118-137）を有するトロポニンサブユニットＩの領域と80％よりも高い相同
性がある、上記方法。
【請求項７９】被験体における転移の抑制方法であって、被験体に、ペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞を投与して、該ペプチドが
宿主内で発現されるようにすることを含んでなり、該ペプチドは、配列番号２の
アミノ酸残基118〜137（huTnI_118-137）を有するトロポニンサブユニットＩの領
域と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項８０】配列番号２の116〜123（huTnI_116-123）、120〜127（huTn
I_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、126〜133
（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-137）、13
2〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）からなる群から選ばれ
るアミノ酸残基を有するトロポニンサブユニットＩの領域を含むペプチド。
【請求項８１】配列番号２のアミノ酸残基130〜137（huTnI_130-137）を有
するトロポニンサブユニットＩの領域を含む、請求項80に記載のペプチド。
【請求項８２】配列番号２のアミノ酸残基132〜139（huTnI_132-139）を有
するトロポニンサブユニットＩの領域を含む、請求項80に記載のペプチド。
【請求項８３】有効量のペプチドを投与することを含んでなる、疾患また
は障害に関連する血管形成の抑制方法であって、該ペプチドは、トロポニンサブ
ユニットＩ（配列番号２）の抑制領域の116〜123（huTnI_116-123）、120〜127（
huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、126
〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-137
）、132〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）からなる群から
選ばれるアミノ酸残基と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項８４】前記ペプチドが、配列番号２の116〜123（huTnI_116-123）
、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI₁₂₄ _-131 ）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（hu
TnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）から
なる群から選ばれるアミノ酸残基を有するトロポニンサブユニットＩの領域から
なる、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】前記ペプチドが、アミノ酸残基130〜137（huTnI_130-137）
を有するトロポニンサブユニットＩの領域からなる、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】前記ペプチドが、アミノ酸残基132〜139（huTnI_132-139）
を有するトロポニンサブユニットＩの領域からなる、請求項84に記載の方法。
【請求項８７】前記疾患または障害が充実性腫瘍である、請求項83に記載
の方法。
【請求項８８】前記充実性腫瘍が、表１に示す肉腫および癌からなる群か
ら選ばれる、請求項87に記載の方法。
【請求項８９】前記疾患または障害が眼の疾患または障害である、請求項
83に記載の方法。
【請求項９０】前記被験体がヒトである、請求項83に記載の方法。
【請求項９１】前記有効量が投与当たり約１から約50mgである、請求項83
に記載の方法。
【請求項９２】前記ペプチドが非経口的に投与される、請求項83に記載の
方法。
【請求項９３】前記ペプチドが経口的に投与される、請求項83に記載の方
法。
【請求項９４】前記ペプチドがヒトまたはウシ起源のものである、請求項
83に記載の方法。
【請求項９５】前記ペプチドが、該ペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項83に記載の
方法。
【請求項９６】前記疾患または障害が肺転移である、請求項83に記載の方
法。
【請求項９７】前記ペプチドが組織に由来する、請求項83に記載の方法。
【請求項９８】前記組織が結合、筋肉、神経または上皮である、請求項97
に記載の方法。
【請求項９９】前記組織が軟骨である、請求項97に記載の方法。
【請求項１００】疾患または障害に関連する血管形成の抑制方法であって
、配列番号２の残基118〜137（huTnI_118-137）の116〜123（huTnI_116-123）、12
0〜127（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131 ）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI₁ _30-137 ）、132〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）からなる
群から選ばれるアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を有するペプ
チドを有効量投与して、血管形成が抑制されるようにすることを含む、上記方法
。
【請求項１０１】前記ペプチドが、アミノ酸残基130〜137（huTnI_130-137 ）を有するトロポニンサブユニットＩの領域からなる、請求項100に記載の方法
。
【請求項１０２】前記ペプチドが、アミノ酸残基132〜139（huTnI_132-139 ）を有するトロポニンサブユニットＩの領域からなる、請求項100に記載の方法
。
【請求項１０３】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）のアミノ酸配列からなる、請求項100に記載の方法。
【請求項１０４】前記ペプチドが、配列番号２の残基132〜139（huTnI₁₃₂ _-139 ）のアミノ酸配列からなる、請求項100に記載の方法。
【請求項１０５】有効量のペプチドを投与することを含んでなる、哺乳動
物における転移の抑制方法であって、該ペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基
を有する116〜123（huTnI_116-123）、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129（hu
TnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜1
35（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139）お
よび134〜141（huTnI_134-141）からなる群から選ばれるトロポニンサブユニット
Ｉの領域と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項１０６】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）のアミノ酸配列からなる、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】前記ペプチドが、配列番号２の残基132〜139（huTnI₁₃₂ _-139 ）のアミノ酸配列からなる、請求項105に記載の方法。
【請求項１０８】前記哺乳動物が、表１に示す肉腫および癌からなる群か
ら選ばれる充実性腫瘍を有するヒトである、請求項105記載の方法。
【請求項１０９】前記ペプチドが、前記タンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項105
に記載の方法。
【請求項１１０】ペプチドと製薬上許容される担体とを含む、疾患または
障害に関連する血管形成を抑制するための医薬組成物であって、該ペプチドは、
配列番号２の116〜123（huTnI_116-123）、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129
（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、126〜133（huTnI_126-133）、12
8〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139 ）および134〜141（huTnI_134-141）からなる群から選ばれるアミノ酸残基と80％
よりも高い相同性がある、上記組成物。
【請求項１１１】前記ペプチドが、配列番号２の116〜123（huTnI_116-123 ）、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI₁ _24-131 ）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（
huTnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）か
らなる群から選ばれる残基のアミノ酸配列からなる、請求項110に記載の医薬組
成物。
【請求項１１２】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）または132〜139（huTnI_132-139）のアミノ酸配列からなる、請求項110に
記載の医薬組成物。
【請求項１１３】疾患または障害に関連する血管形成を抑制するための医
薬組成物であって、配列番号２の116〜123（huTnI_116-123）、120〜127（huTnI₁ _20-127 ）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、126〜133（
huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-137）、132
〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）からなる群から選ばれ
る残基のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を有するペプチドを
含む、上記組成物。
【請求項１１４】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）または132〜139（huTnI_132-139）のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続
アミノ酸残基を有する、請求項113に記載の医薬組成物。
【請求項１１５】前記ペプチドがヒトまたはウシ起源のものである、請求
項110に記載の組成物。
【請求項１１６】前記ペプチドが組織に由来する、請求項110に記載の組
成物。
【請求項１１７】前記組織が結合、筋肉、神経または上皮である、請求項
116に記載の組成物。
【請求項１１８】前記組織が軟骨である、請求項116に記載の組成物。
【請求項１１９】前記ペプチドが、該ペプチドをコードするヌクレオチド
配列を含むように操作された細胞により組換え的に発現される、請求項110また
は113に記載の医薬組成物。
【請求項１２０】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）または132〜139（huTnI_132-139）のアミノ酸配列からなる、請求項119に
記載の組成物。
【請求項１２１】ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細
胞を含んで、該ペプチドが宿主内で発現されるようにする医薬組成物であって、
該ペプチドは、配列番号２の116〜123（huTnI_116-123）、120〜127（huTnI_120-1 ₂₇ ）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、126〜133（huTn
I_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-137）、132〜139
（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）からなる群から選ばれるアミ
ノ酸残基を有するトロポニンサブユニットＩの領域と80％よりも高い相同性があ
る、上記組成物。
【請求項１２２】前記ペプチドが、配列番号２の116〜123（huTnI_116-123 ）、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI₁ _24-131 ）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（
huTnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）か
らなる群から選ばれる残基のアミノ酸配列からなる、請求項121に記載の医薬組
成物。
【請求項１２３】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）のアミノ酸配列からなる、請求項121に記載の医薬組成物。
【請求項１２４】前記ペプチドが、配列番号２の残基132〜139（huTnI₁₃₂ _-139 ）のアミノ酸配列からなる、請求項121に記載の医薬組成物。
【請求項１２５】前記細胞がヒトまたはウシ起源のものである、請求項12
1に記載の組成物。
【請求項１２６】前記細胞が結合、筋肉、神経または上皮細胞である、請
求項121に記載の組成物。
【請求項１２７】前記細胞が軟骨細胞である、請求項121に記載の組成物
。
【請求項１２８】ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細
胞を含んで、該ペプチドが宿主内で発現されるようにする医薬組成物であって、
該ペプチドは、配列番号２の116〜123（huTnI_116-123）、120〜127（huTnI_120-1 ₂₇ ）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTnI_124-131）、126〜133（huTn
I_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137（huTnI_130-137）、132〜139
（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）からなる群から選ばれる残基
のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を有するトロポニンサブユ
ニットＩの領域である、上記組成物。
【請求項１２９】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）のアミノ酸配列からなる、請求項128に記載の医薬組成物。
【請求項１３０】前記ペプチドが、配列番号２の残基132〜139（huTnI₁₃₂ _-139 ）のアミノ酸配列からなる、請求項128に記載の医薬組成物。
【請求項１３１】被験体における充実性腫瘍の増殖を抑制するか、または
該充実性腫瘍の容積を低減するための方法であって、ペプチドをコードするヌク
レオチド配列を含む組換え細胞を投与して、該ペプチドが宿主内で発現されるよ
うにすることを含んでなり、該ペプチドは、配列番号２の116〜123（huTnI_116-1 ₂₃ ）、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、124〜131（huTn
I_124-131）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-135）、130〜137
（huTnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139）および134〜141（huTnI_134-141）
からなる群から選ばれるアミノ酸残基を有するトロポニンサブユニットＩの領域
と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項１３２】前記ペプチドが、配列番号２の残基130〜137（huTnI₁₃₀ _-137 ）のアミノ酸配列からなる、請求項131に記載の方法。
【請求項１３３】前記ペプチドが、配列番号２の残基132〜139（huTnI₁₃₂ _-139 ）のアミノ酸配列からなる、請求項131に記載の方法。
【請求項１３４】被験体における転移の抑制方法であって、ペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞を投与して、該ペプチドが該宿主内
で発現されるようにすることを含んでなり、該ペプチドは、配列番号２の116〜1
23（huTnI_116-123）、120〜127（huTnI_120-127）、122〜129（huTnI_122-129）、
124〜131（huTnI_124-131）、126〜133（huTnI_126-133）、128〜135（huTnI_128-1 ₃₅ ）、130〜137（huTnI_130-137）、132〜139（huTnI_132-139）および134〜141（
huTnI_134-141）からなる群から選ばれるアミノ酸残基を有するトロポニンサブユ
ニットＩの領域と80％よりも高い相同性がある、上記方法。
【請求項１３５】前記ペプチドが、配列番号２の130〜137（huTnI_130-137 ）のアミノ酸配列からなる、請求項134に記載の方法。
【請求項１３６】前記ペプチドが、配列番号２の残基132〜139（huTnI₁₃₂ _-139 ）のアミノ酸配列からなる、請求項134に記載の方法。