JP2002538812A - 昆虫ｐ５３ガン抑制遺伝子及びタンパク質 - Google Patents

昆虫ｐ５３ガン抑制遺伝子及びタンパク質

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Abstract

(57)【要約】 幾つかの昆虫種から単離されたｐ５３ガン抑制因子核酸及びタンパク質のファミリーが記載される。ｐ５３核酸及びタンパク質は後生脊椎動物生物体、例えば、昆虫及び虫、あるいは培養細胞を遺伝的に変更するために使用することができ、ｐ５３の発現又は誤発現を生じる。遺伝的に変更された生物又は細胞はｐ５３タンパク質と相互作用をする潜在的な殺虫剤又は治療薬である候補化合物を同定するスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。それらはまたｐ５３活性を研究し、ｐ５３遺伝子の機能を変調し又は該遺伝子と相互作用をする他の遺伝子を同定するための方法において使用することもできる。ショウジョウバエｐ３３及びＲｂガン抑制因子の核酸及びタンパク質配列がまた記述される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (関連出願の表示) この出願は、１９９９年３月１６日に出願された米国特許出願第０９／２６８
９６９号；及び２０００年２月２３日に出願された同一名称の米国特許出願第６
０／１８４３７３号の一部継続出願である。両出願の全内容を出典明示によりこ
こに取り込むものとする。
【０００２】 (発明の背景) ｐ５３遺伝子は、家族性及び自然発生的なガンを含む、５０以上の異なるタイ
プのヒトのガンにおいて変異しており、ヒトのガンにおいて最も普遍的に変異が
生じている遺伝子であると考えられている（Zambetti及びLevine, FASEB(1993)7
:855-865；Hollstein等、Nucleic Acids Res. (1994)22:3551-3555）。ｐ５３遺
伝子における変異のうち９０％以上がｐ５３の機能を不活性化させる一アミノ酸
を変更するミスセンス突然変異である。ヒトｐ５３の異常な形態は、予後の悪さ
、より悪性度の高い腫瘍、転移及び生存率が５年以下であることに関連がある（
Koshland、Science (1993)262:1953）。 ヒトｐ５３タンパク質は、ＤＮＡ損傷、低酸素血症、ガン遺伝子の活性化を含
む様々な形の細胞ストレスに起因するシグナルの中心的な統合因子として通常は
機能している（Prives、Cell(1998)95:5-8）。これらのシグナル応答において、
蓄積されたｐ５３が細胞周期の停止経路もしくはシグナルの性質及び強さに依存
したアポトーシスを活性化するという結果を伴いながら、ｐ５３タンパク質レベ
ルが多大に増加する。実際に、多数の実験的証拠によりガン抑制因子としてｐ５
３に対する重要な役割が指摘されてきた（Levine、Cell(1997)88:323-331）。例
えば、ホモ接合性のｐ５３「ノックアウト」マウスは発生の段階では正常である
が、生後１年以内にほぼ１００％の腫瘍な発症率を示す（Donehower等、Nature(
1992)356:215-221）。ｐ５３が正常及びガン性の細胞において機能している生化
学的な機構及び経路は、充分に理解されていないが、ｐ５３の機能において一つ
の明らかに重要な点は遺伝子特異的な転写活性化因子としての活性である。既知
のｐ５３応答配列を持つ遺伝子の中で、細胞周期もしくはアポトーシスの制御に
おいてよく特徴付けされているものがいくつかあるが、ＧＡＤＤ４５、ｐ２１/
Ｗａｆ１/Ｃｉｐ１、ｃｙｃｌｉｎＧ、Ｂａｘ、ＩＧＦ-ＢＰ３、及びＭＤＭ２が
含まれる（Levine、Cell(1997)88:323-331）。
【０００３】 ヒトｐ５３は３９３アミノ酸を有するリン酸化タンパク質で、N末端からC末端
にかけて以下に示す順番で結合された構造的及び機能的に異なるドメインに分割
されている：（ａ）転写活性化ドメイン；（ｂ）配列特異的DNA結合ドメイン；
（ｃ）リンカードメイン；（ｄ）オリゴマー化ドメイン；及び（ｅ）塩基性制御
ドメイン。ｐ５３タンパク質の他の構造的な詳細な部分が、様々なストレスに応
答する配列特異的な遺伝子活性化因子としての機能機能との調和を保っている。
例えば、ｐ５３タンパク質のN末端側の最端は酸性残基に富んでおり、他の転写
活性化因子の特徴と一致している（Fields及びJang、Science(1990)249:1046-49
）。これに対して、ｐ５３の最もC端側のドメインは、塩基性残基に富んでおり
、一本鎖DNA、二重鎖DNAの末端および分子内欠失ループと結合する能力を持つ（
Jayaraman及びPrives、Cell(1995)81:1021-1029）。このようなDNA修復の間に生
成されるDNAの形体とｐ５３のC末端側塩基性制御ドメインとの相互作用が、不活
性な状態から標的遺伝子に対し部位特異的にDNAへ結合することができるような
活性化状態への変換を誘起し（Hupp及びLane、Curr. Biol.(1994)4:865-875）、
これによりDNA損傷に応答してｐ５３の機能を制御する一つメカニズムを提供し
ている可能性がある。重要なことには、ｐ５３のN末端側活性化ドメインとC末端
側塩基性制御ドメインの双方が、ストレス誘導シグナルと相関する多くの共有結
合的な修飾を受けている（Prives、Cell(1998)95:5-8）。例えば、N末端側活性
化ドメインはDNA活性化プロテインキナーゼ、ATMキナーゼ及びサイクリン活性化
キナーゼ複合体によるリン酸化の標的となる残基を含んでいる。C末端側塩基性
制御ドメインには、PCAF及びｐ３００アセチル基転移酵素によるアセチル化の標
的となる残基の他、プロテインキナーゼC、サイクリン依存性キナーゼ、カゼイ
ンキナーゼIIによるリン酸化の標的となる残基が含まれている。また、ｐ５３の
活性は、特異的な非共有結合的なタンパク質-タンパク質相互作用によっても調
節されている（Ko及びPrives、Genes Dev.(1996)10:1054-1072）。最も明白なこ
とには、ＭＤＭ２タンパク質は、短く、高度に保存されたタンパク質配列モチー
フであるｐ５３のＮ末端側活性化ドメインの１３番目から２９番目までの残基と
結合する（Kussie等、Science(1996)274:948-953）。ｐ５３が結合する結果とし
て、MDM２はｐ５３の転写活性化を抑制し、さらにｐ５３の分解を促進する。ｐ
５３ガン抑制因子に対する一群の哺乳動物及び脊椎動物のホモログについては記
述されているが、これまでに、二種類の無脊椎動物ホモログだけが軟体動物とヤ
リイカにおいて同定されている。しかし、例えばショウジョウバエ（Drosophila
）のような他の無脊椎動物においてｐ５３ホモログの存在をほのめかすような証
拠はほとんど得られていない。実際、クロスハイブリダイゼーションやPCR法に
よるショウジョウバエｐ５３の単離を試みる多くの直接的な試みは、この種にお
いてｐ５３様遺伝子を同定するには至っていない（Soussi等、Oncogene(1990)5:
945-952）。しかしながら、昆虫細胞において、核クロスハイブリダイゼーショ
ン及び抗体の交差性を用いたDNA損傷に対する応答の他の研究により、ｐ５３-、
ｐ２１-、及びMDM２様遺伝子が存在するとの示唆的な証拠が得られてきた（Bae
等、Exp Cell Res(1995)375:105-106；Yakes、1994、博士論文、ウェイン州立大
学）。それにも関わらず、これまでに昆虫のｐ５３遺伝子もしくはタンパク質が
単離されたとの報告はされていなかった。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）及びその他の昆虫種のような
モデル生物における新規ｐ５３オーソロガス遺伝子の同定により、遺伝学的、分
子学的研究及び潜在的な製薬的、殺虫剤的な標的としてのこれら分子の妥当性確
認のための重要で有用な手立てが提供される。本発明は、多種多様な昆虫種由来
の昆虫ｐ５３遺伝子及びタンパク質を開示する。さらに、ガン抑制に関与してい
るｐ３３及びRb遺伝子のショウジョウバエホモログについても記述する。
【０００４】 （発明の概要） 相互に影響しあう遺伝学的な経路と伴にｐ５３が関与しているような経路を解
析するための遺伝学的スクリーニング方法において使用される昆虫ｐ５３核酸及
びタンパク質を提供することが、本発明の目的である。また、治療上有用性を持
ち、ｐ５３と相互作用する化合物をスクリーニングするための方法を提供するこ
とも本発明の目的である。 上記及び他の目的は、多様な昆虫種におけるｐ５３遺伝子及びタンパク質の同
定と機能解析に関する本発明により提供される。ｐ５３ポリペプチド及びその誘
導体をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。また、ｐ５
３タンパク質を発現もしくは誤った発現をさせるために遺伝学的に修飾した後生
動物の無脊椎動物（例えば、昆虫、体腔動物及び偽体腔動物）のみならず、ｐ５
３核酸分子を含むベクター及び宿主細胞について記述する。 昆虫ｐ５３核酸及びタンパク質の重要な有用性は、それらが潜在的な治療上の
候補化合物もしくはｐ５３タンパク質と相互作用する殺虫剤を同定するためのス
クリーニングアッセイにおいて使用することができるという点である。そのよう
なアッセイは、典型的にはｐ５３ポリペプチドを一又は複数の候補分子に接触さ
せ、候補化合物とｐ５３ポリペプチドとの間になんらかの相互作用を検出するこ
とを含む。このアッセイは、候補化合物をｐ５３タンパク質を発現するように遺
伝学的に操作した培養細胞に添加すること、場合によってはｐ５３タンパク質を
発現するように遺伝学的に操作した後生動物の無脊椎動物に候補化合物を投与す
ることを含んでもよい。 遺伝学的に操作した本発明の後生動物の無脊椎動物は、ｐ５３活性を研究し、
ｐ５３経路の操作に基づいた治療上、殺虫上の戦略を確証するための手法におい
ても使用することができる。これらの方法は典型的にはｐ５３タンパク質の発現
、誤発現により引き起こされるフェノタイプを検出することに関与している。さ
らに、本方法は同様な遺伝学的修飾を有し、また、対象の遺伝子において変異を
有している第二の動物を観察することを含んでいてもよい。二個体の動物のフェ
ノタイプ間におけるなんらかの相違により、ｐ５３タンパク質をコードする遺伝
子の機能を修飾することが可能な対象遺伝子を同定することができる。
【０００５】 （発明の詳細な記述） 無脊椎モデル生物の遺伝学的及び関連技術の使用により、生物学的な経路の解
明を多大に促進し得る（Scangos、Nal. Biotechol. (1997)15:1220-1221；Margo
lis及びDuyk、Nature Biotech. (1998)16:311）。昆虫モデル生物であるドロソ
フィラメラノガスター（Drosophila meranogaster）（ここでは通常「ショウジ
ョウバエ」と称する）を特に使用する。ショウジョウバエにおけるｐ５３核酸及
びそれがコードするタンパク質に対する大規模なサーチが、ｐ５３遺伝子の機能
及び制御を探索、及び薬剤発見過程における標的としての使用のための新規かつ
有用な手段を同定しようとして行われた。また、ｐ５３核酸は以下に示すさらな
る昆虫種において同定された：レプチノタルサデセミィネアータ（Leptinotarsa
decemilineata）（コロラドポテト甲虫、以下ここでは「レプチノタルサ」と称
する）、トリポリウムカスタニューム（Tribolium castaneum）（花甲虫、以下
ここでは「トリボリウム」と称する）、ヘリオティスビレセンス（Heliothis vi
rescens）（タバコ青虫、以下ここでは「ヘリオティス」と称する）。 新たに同定された昆虫ｐ５３核酸は、動物モデルにおける、もしくはｐ５３の
制御、及び薬物又は殺虫剤の標的としてのｐ５３の使用を研究することが可能な
生細胞における変異体フェノタイプの産出のために使用可能である。大規模かつ
系統的な遺伝学的スクリーニングを迅速に行い得ることにより、ショウジョウバ
エのような無脊椎モデル生物の使用は、ｐ５３タンパク質の発現及び誤発現を解
析するのに非常に有用である。従って、本発明はｐ５３タンパク質の合成、活性
及び制御に関わる他の構成成分を同定するための優れたアプローチを提供する。
無脊椎モデル生物を使用したｐ５３の体系的な遺伝学的な解析により、ｐ５３の
経路の構成成分に対する標的化合物の同定及びその妥当性の確認へと通じ得る。
ｐ５３を発現するように遺伝学的に操作されたモデル生物もしくは培養細胞は、
ｐ５３の発現もしくはその活性を調節する能力に対しての候補化合物をスクリー
ンするために使用することができ、その結果、新たな薬物標的、治療薬剤の同定
に有用であり、細胞周期、DNA修復及びアポトーシスに関連した疾患の治療にお
ける診断及び予後予想において有用である。昆虫ｐ５３核酸及びタンパク質の同
定及び/又は単離に使用された条件の詳細は、以下の実施例の項にて記述する。
本発明の様々な非限定実施例、ｐ５３遺伝子及びタンパク質の適用及び使用につ
いては、以下の項で議論されている。ここで挙げた、特許出願を含む全ての参考
文献の全内容は、あらゆる目的のためにそっくりそのまま参考として取り込まれ
ている。さらに、前述の背景の項における文献の引用は、ここに添付される請求
項に対する先行技術のとして承認するということではない。
【０００６】 ｐ５３核酸 昆虫ｐ５３をコードする次の配列は、ここに記述する：配列番号1、ショウジ
ョウバエから単離されたもので、ここではDMｐ５３と称する；配列番号３、レプ
チノタルサから単離されたもので、ここではCPBｐ５３と称する；配列番号７、
トリボリウムから単離されたもので、ここではTRIB-Aｐ５３及びTRIB-Bｐ５３と
それぞれ称する；及び配列番号９、ヘリオティスから単離されたもので、ここで
はHELIOｐ５３と称する。DMｐ５３遺伝子のゲノム配列は、配列番号１８におい
て提示されている。 配列番号１、３、５、７、９及び１８の断片及び誘導体の他、以下に詳細に記
述するように、本発明は、それらの逆相補鎖を含む。また、対象の核酸配列、そ
の誘導体及び断片は、塩基U（ウラシル）をT（チミン）に置換した配列番号１、
３、５、７、９及び１８（又はその誘導体又は断片）の核酸配列を含むRNA分子
でもよい。本発明のDNA及びRNA配列は一本鎖もしくは二本鎖で有り得る。従って
、他に示さない限り、ここで用いられるような「単離した核酸配列」又は「単離
された核酸分子」という言葉は、逆相補鎖、RNA等価物、DNAもしくはRNAの一本
鎖又は二本鎖配列、及び記述される配列のDNA/RNAハイブリッドを含む。
【０００７】 ｐ５３核酸配列の断片は様々な目的に対して用いることができる。干渉RNA（R
NAi）断片、特に二重鎖（ｄｓ）RNAiは、機能欠失フェノタイプの産出に使用す
ることができる。ｐ５３核酸断片は核酸ハイブリダイゼーションのプローブ及び
複製／増幅プライマーとしても有用である。ある種の「アンチセンス」断片、即
ち配列番号１、３、５、７、９、及び１８のいずれかをコードする配列部分の逆
相補鎖である断片は、ｐ５３タンパク質の機能を阻害する点において有用である
。その断片は対応する配列番号１、３、５、７、９、及び１８と特異的にハイブ
リダイズするのに十分な長さである。この断片は、配列番号１、３、５、７、９
、及び１８のいずれか一つの少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より
好ましくは少なくとも３６及び、より好ましくは少なくとも９６の連続するヌク
レオチドからなり、もしくは含む。この断片が他の核酸配列と隣接するとき、連
結された核酸配列の全長は１５ｋｂ以下、好ましくは１０ｋｂ又は５ｋｂ以下、
さらに好ましくは２ｋｂ以下、及びある場合には、好ましくは５００ｂ以下であ
る。好適なｐ５３核酸断片は、５'UTRを備える制御因子を含み、及び/又は一又
は複数の以下のドメインをコードする：活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、リ
ンカードメイン、オリゴマー化ドメイン、及び塩基性制御ドメインである。配列
番号１、３、５、及び配列番号２、４、及び６、８、に対応するアミノ酸配列に
おけるこれらの領域のおおよその位置は、表1に示されている。
【０００８】 さらに好ましくは、少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、さらに好ま
しくは少なくとも３６及び最も好ましくは少なくとも９６の連続したヌクレオチ
ドから成る配列番号７の３５４から４９５ベース及び配列番号９の３１５から４
１４ベースの断片である。 対象の核酸配列は、もっぱら配列番号１、３、５、７、９、及び１８又はその断
片のいずれか一つのから構成されていてよい。場合によっては、対象の核酸配列
及びその断片は標識、ペプチド、細胞膜の透過輸送を促進する薬剤、ハイブリダ
イゼーション誘起切断薬剤もしくはインターカレート剤のような他の構成成分と
結合されていてもよい。対象の核酸配列及びその断片は、他の核酸配列（即ち、
それらは長い配列の部分を含んでもよい）に結合されてもよく、合成/非天然配
列であり、及び/又は単離され、及び/又は精製されており、即ち少なくとも天然
の状態では付随していない物質が伴わない。好ましくは、単離された核酸は、所
定の画分に存在する全核酸重量の少なくとも約０．５％、及びより好ましくは少
なくとも約５％を構成し、好適には組換体つまりそれらは天然の染色体上に結合
されたもの以外のヌクレオチド（ｓ）と結合された非天然配列又は天然配列を含
むものである。 ｐ５３の誘導体核酸配列は、ハイブリダイズする誘導体の核酸がある程度の配
列同一性により、対象の核酸と関連付けられるような緊縮性の条件において、配
列番号１、３、５、７、９、及び１８の核酸配列とハイブリダイズする配列を含
む。核酸分子の一本鎖型が他の核酸分子とアニールできる場合、核酸分子は、ｃ
DNA、ゲノムDNA又はRNAのような他の核酸分子と「ハイブリ可能」である。ハイ
ブリダイゼーションの緊縮性は、核酸がハイブリ可能な条件を問題にしている。
緊縮性の程度は、温度、イオン強度、ｐH及びハイブリダイゼーション、洗浄の
中におけるホルムアミドのような変性剤の存在により調節される。ここで使用さ
れているような、「緊縮性のハイブリダーゼーション条件」という言葉は、DNA
の相補的部分又はDNAとRNAとの間に少なくとも約９０％の配列同一性を確立する
ために、当該技術分野における当業者により通常用いられる言葉である。「中程
度の緊縮性でのハイブリダイゼーション条件」とは、少なくとも約７０％の配列
同一性を有する誘導体を見出すために使用される条件である。最後に、「低い緊
縮性のハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも約５０％の配列同一性を共
有する誘導体核酸分子を単離するために使用される。
【０００９】 最良のハイブリダイゼーションの緊縮性は、実際のハイブリダイゼーション条
件においてはもちろんのこと、ハイブリダイゼーションに続く洗浄の条件におい
ても反映され、所望の結果を得るために条件を変化させる方法は当該技術分野に
おいて周知である。ごく普通に用いられる条件は、容易に利用可能な手順書に詳
細に記されている（例えば、Current Protocol in Molecular Biology, 第１巻
、２．１０章、John Wiley&Sons出版社(1994)；Sambrook等、Molecular cloning
、Cold Spring Harbor(1989)）。好適な誘導体核酸は、以下に示す緊縮性のハイ
ブリダイゼーション条件下で配列番号１、３、５、７、９、及び１８のいずれか
一つとハイブリダイズすることができる：６ｘ単強度クエン酸塩（SSC）（１ｘS
SCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム；pH7）、５ｘデンハード溶液、0.
05% ピロリン酸ナトリウム及び100μg/mlのニシン精子DNAを含む溶液中、６５℃
にて８時間から一晩、核酸を含むフィルターのプレハイブリダイゼーション；６
ｘSSC、１ｘデンハード溶液、100μg/mlの酵母tRNA及び0.05% ピロリン酸ナトリ
ウムを含む溶液中、６５℃にて１８から２０時間ハイブリダイゼーション；及び
0.2ｘSSC及び0.1%SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液中、６５℃にて１
時間、フィルターの洗浄。
【００１０】 配列番号１、３、５、７、９、及び１８のいずれか一つ少なくとも７０％の配
列同一性を有する誘導体の核酸配列は、以下に示すような中程度の緊縮性条件下
にて配列番号１、３、５、７、９、及び１８のいずれか一つとハイブリダイズ化
することができる：35% ホルムアミド、５ｘSSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM E
DTA、0.1% PVP、0.1% フィコール、1% BSA 及び500μg/mlの変性サケ精子DNAを
含む溶液中、４０℃にて６時間、核酸を含むフィルターの前処理；35% ホルムア
ミド、５ｘSSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% フィコー
ル、0.2% BSA、100μg/mlのサケ精子DNA及び10%（重量/容量）硫酸デキストラン
を含む溶液中、４０℃にて１８から２０時間ハイブリダイゼーション；引き続き
２ｘSSC及び0.1%SDSを含む溶液中、５５℃にて１時間の洗浄を２回行う。 他の好適な核酸の誘導体は、以下に示すような低い緊縮性条件下にて配列番号
１、３、５、７、９、及び１８のいずれか一つとハイブリダイズ化することがで
きる： 20% ホルムアミド、５ｘSSC、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、５ｘデンハード
溶液、10% 硫酸デキストラン及び20μg/mlの断片化サケ精子DNAを含む溶液中、
３７℃にて８時間から一晩インキュベーション；同じ緩衝液中、１８から２０時
間ハイブリダイゼーション；及び１ｘSSC中、３７℃にて１時間、フィルターの
洗浄。
【００１１】 ここで用いるように、対象の配列もしくは対象の配列の特定部分に対する「パ
ーセント（％）核酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列
同一性を得るために必要ならば、すべてサーチパラメータは初期設定値に対して
セットしたプログラムWU-BLAST-2.0a19（Altschul等, J.Mol.Biol. (1997)215:
403-410；http://blast.wustl/edu/blast/README.html,；以下「Blast」と通常
は称する）により算出される、間隙を導入した後、対象の核酸配列（もしくはそ
の特定の部分）と同一である候補誘導体核酸配列のパーセントとして定義される
。HSP S及びHSP S2パラメータ値はダイナミック値であり、特定配列の構成及び
対象の配列がサーチされている特定のデータベースの構成に依存するプログラム
自体によって確立される。パーセント（％）核酸配列同一性値は、パーセント同
一性が報告されている配列の長さにより除されるマッチした同一ヌクレオチドの
数により決定される。 誘導体ｐ５３核酸配列は通常は配列番号：１、３、５、７、９又は１８、ある
いはそのドメインコード化領域の何れか一つと少なくとも５０％の配列同一性、
好ましくは少なくとも６０％、７０％又は８０％の配列同一性、より好ましくは
少なくとも８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９０％の配列同
一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。 好適な一実施態様では、誘導体核酸は、配列番号：２、４、６、８又は１０、
あるいは「ｐ５３タンパク質」という小見出しの下に以下に記載するその断片又
は誘導体の何れか一つのｐ５３アミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコード
する。誘導体ｐ５３核酸配列又はその断片は、配列番号：１、３、５、７、９又
は１８の何れか一つと１００％の配列同一性を有しうるが、塩基又は糖部分ある
いはリン酸骨格に一又は複数の修飾を有しているという意味でその誘導体であり
うる。修飾の例は当該分野においてよく知られている（Bailey, Ullmann's Ency
clopedia of Industrial Chemistry (1998), ６版, Wiley and Sons）。かかる
誘導体は変更された安定性又は任意の他の所望の性質をもたらすために使用され
うる。
【００１２】 主題の核酸配列の他のタイプの誘導体は対応するヒト化配列を含む。ヒト化核
酸配列は一又は複数のコドンが、ヒト遺伝子においてより共通に見出されるコド
ンで置換されたものである。好ましくは、置換がない場合に達成されるものより
もより高レベルの発現が哺乳動物において達成されるように十分な数のコドンが
置換されている。次のリストは、各アミノ酸に対して、１０００のコドンに対し
てヒト遺伝子における計算したコドン頻度を示している（Wada等, Nucleic Acid
s Research (1990) 18(Suppl.):2367-2411）： よって、グルタミン酸コドンＧＡＡが、ヒト遺伝子においてより一般的であるコ
ドンＧＡＧで置換されたｐ５３核酸配列はヒト化ｐ５３核酸配列の一例である。
核酸配列のヒト化の詳細な検討はZolotukhin等の米国特許第５８７４３０４号に
提供されている。同様に、各生物中の高度に発現される遺伝子に置いて使用され
る好適なコドンに従って選択される特定のコドンを用いてｐ５３タンパク質の発
現を操作することが望まれる酵母菌、細菌及び植物のような他の生物中での発現
に最適化されたコドンを使用した他の核酸誘導体を産生することができる。好適
なｐ５３タンパク質、断片及び誘導体のより特定の実施態様は小見出し「ｐ５３
タンパク質」として以下において更に検討する。
【００１３】 配列番号：２、４、６、８及び１０、又はその断片あるいは誘導体の何れかの
アミノ酸配列をコードする核酸は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物（例えば、霊
長類、ブタ、ウシ、ネコ、及びイヌ種等々）及び無脊椎動物、例えば節足動物、
特に昆虫種（好ましくは、ショウジョウバエ、Tribolium、Leptinotarsa及びHel
iothis）、acarids、crustacea、molluscs、nematodes、及び他の虫のような、
ｐ５３タンパク質をコードする任意の真核生物種から調製された適当なｃＤＮＡ
ライブラリーから得ることができる。発現ライブラリーは既知の方法を使用して
構築することができる。例えば、ｍＲＮＡを単離して、導入された宿主細胞中で
の発現のための適切な発現ベクターに結合させるｃＤＮＡをつくる。ついで、遺
伝子又は遺伝子産物（例えば、対象の遺伝子を同定するために設計された少なく
とも約２０〜８０の塩基のオリゴヌクレオチド、又は遺伝子産物に特異的に結合
する標識された抗体）を選択するように様々なスクリーニングアッセイを使用す
ることができる。遺伝子及び／又は遺伝子産物をついで既知の方法を使用して宿
主細胞から回収することができる。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をまた使用してｐ５３遺伝子の核酸を単離す
ることができ、そこでは、（上掲のSambrook等により記載されたように）対象の
断片的配列を表すオリゴヌクレオチドプライマーがゲノム又はｃＤＮＡライブラ
リーのような供給源からのＲＮＡ又はＤＮＡ配列を増幅する。また、対象の任意
の種からの相同体を増幅するための変性プライマーを使用してもよい。適当な長
さと配列のＰＣＲ産物が得られたならば、それを標準的な方法によりクローニン
グし配列決定し、完全なｃＤＮＡ又はゲノムクローンを単離するプローブとして
利用することができる。
【００１４】 ｐ５３核酸と誘導体の断片的配列は既知の方法によって合成することができる
。例えば、商業的供給者（例えば、Biosearch, Novato, CA; Perkin-Elmer Appl
ied Biosystems, Foster City, CA）から入手可能な自動ＤＮＡ合成機を使用し
てオリゴヌクレオチドを合成することができる。アンチセンスＲＮＡ配列は、例
えばアンチセンスｐ５３核酸配列を含むベクターからの外因性配列からの転写に
より細胞内に産生させることができる。新たに産生された配列は標準的な方法を
使用して同定し単離することができる。 単離されたｐ５３核酸は任意の適当なクローニングベクター、例えばラムダ誘
導体のようなバクテリオファージ、又はプラスミド、例えばＰＢＲ３２２、ｐＵ
Ｃプラスミド誘導体及びBluescriptベクター（Stratagene, San Diego, CA）中
に挿入することができる。組換え分子は形質転換、形質移入、感染、電気穿孔法
等々を介してハエのような遺伝子組換え動物中に導入することができる。主題の
核酸配列を単離し製造するために好適な方法は当該分野においてよく知られてい
る（上掲のSambrook等; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. 1, 2, 3, 4
(1995) Glover編, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.）。 ｐ５３タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその断片あるいは誘導体
は、挿入タンパク質コード配列の転写と翻訳のために任意の適切な発現ベクター
中に挿入することができる。あるいは、必要な転写及び翻訳シグナルは天然ｐ５
３遺伝子及び／又はその隣接領域により供給されうる。例えばウイルス（例えば
、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等々）に感染させた哺乳動物細胞系；ウ
イルス（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含
む酵母、あるいはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコ
スミドＤＮＡで形質転換した細菌のような微生物のような様々な宿主-ベクター
系を利用してタンパク質コード配列を発現させるのに利用することができる。植
物における発現が望まれるならば、様々な形質転換作成物、ベクター及び方法が
当該分野で知られている（レビューには米国特許第６００２０６８を参照）。ｐ
５３タンパク質の発現は適切なプロモーター／エンハンサーエレメントによって
制御することができる。また、挿入配列の発現を編著凹するか、特定の所望の態
様で遺伝し産物を修飾し加工する宿主細胞株を選択してもよい。
【００１５】 ｐ５３遺伝子産物の発現を検出するためには、発現ベクターはｐ５３遺伝子核
酸に作用可能に結合したプロモーター、一又は複数の複製起点及び一又は複数の
選択マーカー（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性等々）を含みうる。
あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロアッセイ系（例えばイムノアッセ
イ又は細胞分裂周期アッセイ）におけるｐ５３タンパク質の物理的又は機能的性
質に基づくｐ５３遺伝子産物の発現のアッセイによって同定することができる。
ｐ５３タンパク質、断片又は誘導体は場合によっては上述のような融合体、又は
キメラタンパク産物として発現されてもよい。 ｐ５３遺伝子配列を発現する組換え体が同定されたならば、遺伝子産物は標準
的な方法（例えばイオン交換、アフィニティ及びゲル排除クロマトグラフィー；
遠心分離；溶解度差；電気泳動法）を使用して単離し精製することができる。タ
ンパク質のアミノ酸配列は組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列
から演繹することができ、よって標準的な化学的方法（Hunkapiller等, Nature
(1984) 310:105-111）により合成することができる。あるいは、天然ｐ５３タン
パク質は天然源から、標準的な方法（例えば免疫親和性精製法）により精製する
ことができる。
【００１６】 ｐ３３及びＲｂ核酸 本発明はまたショウジョウバエｐ３３（配列番号：１９）及びＲｂ（配列番号
：２１）ガン抑制因子の核酸配列を提供する。これらの配列の誘導体及び断片は
ｐ５３核酸配列に対して上述したのと同じ数の近接ヌクレオチド又は同じ程度の
パーセント同一性を有する。ｐ５３ガン抑制因子核酸及びタンパク質の様々な用
途（例えば遺伝子組換え動物、ガン抑制因子アッセイ等々）に関する以下の開示
はここに開示されるｐ３３及びＲｂガン抑制因子配列にもまた適用される。
【００１７】 ｐ５３タンパク質 CLUSTALWプログラム（Thompson等, Nucleic Acids Research (1994) 22(22):4
673-4680）を用いて、ここに記載された昆虫ｐ５３タンパク質を、ヒト（Zakut-
Houri等, EMBO J. (1985) 4:1251-1255; GenBank gi:129369）、アフリカツメガ
エル（Sousi等, Oncogene (1987) 1:71-78; GenBank gi:129374）、及びヤリイ
カ（GenBank gi:1244762）とアラインメントさせた。得られたアラインメントは
図１に示され、過去に同定されたｐ５３タンパク質の特徴である昆虫ｐ５３タン
パク質の多くの特徴を明らかにしている。構造類似性の一般的な領域については
、ＤＭｐ５３、ＣＰＢｐ５３及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質が大まかに言っ
て３つの領域に分割できる：他の既知のｐ５３ファミリータンパク質と高度の配
列相同性を示しこのタンパク質ファミリーのＤＮＡ結合ドメインに大まかに対応
する中央領域と、かなり少ない相同性を示すが他のｐ５３ファミリータンパク質
と全体長が対応する隣接Ｎ末端及びＣ末端領域である。ＴＲＩＢ-Ｂｐ５３及び
ＨＥＬＩＯｐ５３ｃＤＮＡによりコードされる断片的ポリペプチド配列は中央領
域−保存ＤＮＡ結合ドメインから誘導される多重配列アラインメントにより示さ
れる。有意には、タンパク質配列アラインメントにより、ヒトｐ５３の過去に特
徴付けられたドメインとの配列相同性に基づいて（Sousi及びMay, J. Mol Biol
(1996) 260:623-637; 上掲のLevine; Prives, Cell (1998) 95:5-8）、上記の表
１に列挙されたＤＭｐ５３、ＣＰＢｐ５３及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質中
のドメインのアラインメントが可能になった。
【００１８】 重要なことには、ＤＭｐ５３、ＣＰＢｐ５３及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク
質の最も保存された中央領域はヒトｐ５３のＤＮＡ結合ドメインの既知の機能的
境界にほぼ精確に対応しており、これらのタンパク質がヒトｐ５３のものと類似
したＤＮＡ結合性を示すことが見込まれることを示している。このドメイン中の
保存残基の詳細な検査はヒトｐ５３と昆虫ｐ５３タンパク質間の可能な構造的及
び機能的類似性を更に強調する。先ず、直接のＤＮＡ接触に関与することが知ら
れているヒトｐ５３の残基（Ｋ１２０、Ｓ２４１、Ｒ２４８、Ｒ２７３、Ｃ２７
７及びＲ２８０）はＤＭｐ５３タンパク質中の同一又は類似の残基（Ｋ１１３、
Ｓ２３０、Ｒ２３４、Ｋ２５７、Ｃ２６３及びＲ２６６）、及びＣＰＢｐ５３タ
ンパク質（Ｋ９２、Ｓ２１６、Ｒ２２４、Ｒ２４９、Ｃ２５３及びＲ２５６）、
及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質（Ｋ８８、Ｓ２１３、Ｒ２２０、Ｒ２４５、
Ｃ２４９及びＲ２５２）の同一の残基に対応する。また、このドメインの全体の
折り畳みについては、ヒトｐ５３（Ｃ１７６、Ｈ１７９、Ｃ２３８及びＣ２４２
）のＤＮＡ結合ドメイン中の亜鉛リガンドを配位する４つの重要な残基が、ＤＭ
ｐ５３タンパク質（Ｃ１５６、Ｈ１５９、Ｃ２２７及びＣ２３１）、ＣＰＢｐ５
３タンパク質（Ｃ１４７、Ｈ１５０、Ｃ２１３及びＣ２１７）、及びＴＲＩＢ-
Ａｐ５３タンパク質（Ｃ１４４、Ｈ１４７、Ｃ２１０、Ｃ２１４）において正確
に保存されていることが分かった。更に、驚いたことに、癌において最も頻繁に
変更されるヒトｐ５３の突然変異ホットスポット（Ｒ１７５、Ｇ２４５、Ｒ２４
８、Ｒ２４９、Ｒ２７３及びＲ２８２）は、ＤＭｐ５３タンパク質（Ｒ１５５、
Ｇ２３３、Ｒ２３４、Ｋ２３５、Ｋ２５９及びＲ２６８）、ＣＰＢｐ５３タンパ
ク質（Ｒ１４６、Ｇ２２１、Ｒ２２４、Ｒ２２５、Ｒ２４９及びＫ２５８）、及
びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質（Ｒ１４３、Ｇ２１７、Ｒ２２０、Ｒ２２１、
Ｒ２４５及びＫ２５４）の対応位置における同一か保存されたアミノ酸残基であ
った。
【００１９】 興味深いことに、昆虫ｐ５３はまたヒト、アフリカツメガエル及びヤリイカｐ
５３とは明確な差異を有している。すなわち、昆虫ｐ５３は、次の配列：（Ｒ又
はＫ）（Ｉ又はＶ）Ｃ（Ｓ又はＴ）ＣＰＫＲＤを有する独特のアミノ酸配列をＤ
ＮＡ認識ドメイン内に含む。特に、ＤＭｐ５３のアミノ酸残基２５９から２６７
は配列：ＫＩＣＴＣＰＫＲＤを有しており、ＣＰＢｐ５３の残基２４９から２５
７は配列：ＲＩＣＳＣＰＫＲＤを有しており；ＴＲＩＢ-Ａｐ５３の残基２４５
−２５３は配列：ＲＶＣＳＣＰＫＲＤを有している。これは、次の配列：Ｒ（Ｉ
又はＶ）ＣＡＣＰＧＲＤを有するヒト、アフリカツメガエル及び ヤリイカｐ５３とは対照的である。 過去に同定されたｐ５３とは明確に異なる昆虫ｐ５３の他の領域はＤＮＡ結合
ドメインの亜鉛配位領域にある。次の配列が昆虫ｐ５３内に保存されている：Ｆ
ＸＣ（Ｋ又はＱ）ＮＳＣ（ここでＸ＝任意のアミノ酸）。特に、ＤＭｐ５３の残
基２２５−２３１は配列：ＦＶＣＱＮＳＣを有しており；ＣＰＢｐ５３の残基２
１１−２１７とＴＲＩＢ−Ａｐ５３の残基２０８−２１４は配列ＦＶＣＫＮＳＣ
を有しており；図１に示すようにＨｅｌｉｏ−ｐ５３の対応する残基は配列：Ｆ
ＳＣＫＮＳＣを有している。これに対して、ヒト及びアフリカツメガエルｐ５３
の対応する配列はＹＭＣＮＳＳＣであり、ヤリイカではＦＭＣＬＧＳＣである。
【００２０】 昆虫ｐ５３タンパク質の推定ＤＮＡ結合ドメインにおける高度の構造的相同性
は、インビトロ及びインビボでの機能の試験のために、及び遺伝子組換え昆虫又
は昆虫細胞株中におけるｐ５３経路の遺伝的精査又は操作のためにこれらのｐ５
３遺伝子の誘導体（例えば変異体）型を操作するため重要な意味を持っている。
ヒトｐ５３のドミナントネガティブな形態が、欠陥ＤＮＡ結合ドメインを持つが
機能的オリゴマー形成ドメインを保持している変更タンパク質をつくり出すこと
によって産生された（Brachman等, Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:4091-40
95）。そのようなドミナントネガティブ突然変異型は対象のアッセイにおいてｐ
５３の機能喪失の効果を測定するために極めて有用である。しかして、ヒトｐ５
３の構造及び絹にとって重要であることが知られている残基（例えばヒトｐ５３
のＲ１７５Ｈ、Ｈ１７９Ｎ及びＲ２８０Ｔ）に対応する昆虫ｐ５３タンパク質の
ＤＮＡ結合ドメイン内の高度に保存された位置での突然変異が昆虫ｐ５３タンパ
ク質のドミナントネガティブ型を生じるようである。例えば、ＤＭｐ５３タンパ
ク質においてタンパク質のドミナントネガティブ型を作り出す特異的突然変異は
Ｒ１５５Ｈ、Ｈ１５９Ｎ及びＲ２６６Ｔを含み、ＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質
に対してはＲ１４３Ｈ、Ｈ１４７Ｎ及びＲ２５２Ｔを含む。 ＤＮＡ結合ドメインとは別に、昆虫ｐ５３タンパク質の他のドメインは既知の
ｐ５３ファミリータンパク質と比較してかなり低い相同性を示すが、配列アライ
ンメントにより、その構造と潜在的な機能についての重要な情報が提供される。
特に、丁度ヒトｐ５３タンパク質におけるように、タンパク質のＣ末端の２０−
２５アミノ酸はオリゴマー形成ドメインを越えて伸長する推定上領域を含み、昆
虫ｐ５３タンパク質のこの領域に対してタンパク質の活性の調節における類似の
機能を示唆している。ヒトｐ５３のＣ末端調節ドメインの欠失はタンパク質の構
成的に活性化された形態を産生することが示されているので（Hupp及びLane, Cu
rr. Biol. (1994) 4:865-875）、昆虫ｐ５３タンパク質由来の対応する調節ドメ
インの殆ど又は全ての除去により、活性化されたタンパク質形態が産生されるこ
とが予想される。しかして、昆虫ｐ５３タンパク質の好適な切断型は少なくとも
１０のＣ末端アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５のアミノ酸、最も好まし
くは少なくとも２０のＣ末端アミノ酸を欠く。例えば、ＤＭｐ５３の好適な切断
形は配列番号：２のアミノ酸残基１−３７６、より好ましくは残基１−３７１、
最も好ましくは残基１−３６６を含んでなる。タンパク質のこのような構成的に
活性化された突然変異型はインビボ及びインビトロアッセイを使用するタンパク
質の機能の試験、並びに遺伝子解析のために非常に有用である。
【００２１】 昆虫ｐ５３タンパク質のオリゴマー形成ドメインは、この領域の長さは他のｐ
５３ファミリータンパク質のものと類似しているけれども、他のｐ５３ファミリ
ータンパク質と非常に限られた骨格配列相同性を示す。昆虫タンパク質のこの領
域における配列の相違の度合いは、昆虫ｐ５３タンパク質が脊椎動物又はヤリイ
カ由来のｐ５３タンパク質とヘテロオリゴマーを形成できないであろうという可
能性を生じさせる。そして、ＤＮＡ結合及びオリゴマー形成ドメイン間に位置す
るリンカードメインがまた比較的僅かな配列保存性を示すが、ＤＭｐ５３、ＣＰ
Ｂｐ５３及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質の何れかのこの領域はヒトｐ５３に
おいて同定されたものと類似した予想核局在化シグナルを含む（Shaulsky等, Mo
l Cell Biol (1990) 10:6565-6577）。 昆虫ｐ５３タンパク質のＮ末端の活性化ドメインもまた、この領域の長さはヒ
トｐ５３のものと大まかに言って同じであるが、他のｐ５３ファミリータンパク
質と少ししか配列同一性を示さない。しかし、このドメインの重要な特徴は昆虫
ｐ５３タンパク質中の酸性残基の相対濃度である。従って、ＤＭｐ５３、ＣＰＢ
ｐ５３及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質のこのＮ末端ドメインはヒトｐ５３ド
メインのものに転写活性化ドメインの機能的活性を同様に作用させる可能性があ
る（Thut等, Science (1995) 267:100-104）。興味深いことに、ＤＭｐ５３、Ｃ
ＰＢｐ５３及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３タンパク質は脊椎動物及びヤリイカのｐ５３
ファミリータンパク質のＮ末端に見出される高度に保存された配列モチーフＦｘ
ｘＬＷｘｘＬを保有していないようである。ヒトｐ５３遺伝子では、このモチー
フ中のこれらの保存残基がヒトｐ５３タンパク質とｍｄｍ２の間の特異的な相互
作用に関与する（Kussie等, Science (1996) 274:948-953）。
【００２２】 Ｃ末端及びＮ末端において昆虫ｐ５３と他のｐ５３ファミリーメンバーの間に
配列類似性はないが、ｐ５３のこれらの領域はｐ５３関連タンパク質の二次的な
構造的特徴を含むことに留意することは重要である。例えば、ヒトｐ５３はホモ
四量体としてＤＮＡに結合し、自己会合がタンパク質のＣ末端に位置するβシー
トと両親媒性のαヘリックスにより媒介される。類似のβシート・ターン・αヘ
リックスがＤＭｐ５３のＣ末端に予想される。更に、ヒトｐ５３のＮ末端はｍｄ
ｍ-２タンパク質も結合するのに重要な残基及びトランス活性化ドメインを含む
領域である。ＤＭｐ５３のＮ末端はまた酸性アミノ酸を含み、トランス活性化ド
メインとして機能する可能性が高い。 本発明のｐ５３タンパク質は配列番号：２、４、６、８及び１０又はその断片
もしくは誘導体の何れか一つのアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列からなる
。これらのタンパク質を含んでなる組成物は、ｐ５３タンパク質、断片、又は誘
導体から本質的になるか、あるいは更なる成分（例えば製薬的に許容可能な担体
又は賦形剤、培地等々）を含みうる。ｐ５３タンパク質は典型的には配列番号：
２、４、６、８及び１０又はその断片の何れか一つと所定の度合いの配列同一性
又は配列類似性を共有する。ここで用いられるところでは、主題の配列又は主題
の配列の特定の部分に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列
を整列させ最大のパーセント配列同一性を得るために必要なら間隙を導入した後
の、主題の配列のアミノ酸と同一である候補誘導体アミノ酸配列中のアミノ酸の
パーセントとして定義され、誘導体核酸配列に対して上で検討したものと同じパ
ラメータを用いてＢＬＡＳＴ（上掲のAltschul等）により生成される。％アミノ
酸配列同一性の値はパーセント同一性が報告されている配列長により一致した同
一のアミノ酸の数を除することにより決定される。「パーセント（％）アミノ酸
配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性と同じ計算を行って決定されるが、計算
において同一のアミノ酸に加えて、保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸
置換とは、アミノ酸を、タンパク質の折り畳み又は活性が有意に影響を受けない
ように類似の性質を持つ他のアミノ酸に置換するものである。互いに置換できる
芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり；可
換な疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン及びバリンであり；
可換な極性アミノ酸はグルタミン及びアスパラギンであり；可換な塩基性アミノ
酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンであり；可換な酸性アミノ酸はアスパラ
ギン酸及びグルタミン酸であり；可換な小アミノ酸はアラニン、セリン、シスチ
ン、スレオニン及びグリシンである。
【００２３】 好適な一実施態様では、ｐ５３タンパク質誘導体は配列番号：２、４、６、８
又は１０の何れかの少なくとも１０のアミノ酸、好ましくは少なくとも２５のア
ミノ酸、より好ましくは少なくとも４０のアミノ酸、更により好ましくは少なく
とも５０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００のアミノ酸の近接ひと配
列、そしてある場合には全長と、少なくとも５０％の配列同一性又は類似性、好
ましくは少なくとも６０％、７０％又は８０％の配列同一性又は類似性、より好
ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は類似性、更により好ましくは少なく
とも９０％の配列同一性又は類似性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同
一性又は類似性を共有する。更に好適な誘導体は上記の表Ｉに列挙された配列番
号：２、４及び６のドメインとこれらの％配列同一性を共有する。更に好適な誘
導体は、配列番号：２、４、６、８又は１０、及び好ましくはその機能的ドメイ
ンの何れかの少なくとも１０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１２、より好ま
しくは少なくとも１５、最も好ましくは少なくとも２０のアミノ酸を共有する配
列を含んでなる。更に好適な断片は、配列番号：２、４、６、８又は１０、及び
好ましくはその機能的ドメインの何れかの少なくとも７の近接アミノ酸、好まし
くは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１２、最も好ましくは少なくとも
１７の近接アミノ酸を含んでなる。 他の好適なｐ５３ポリペプチド、断片又は誘導体は、ＲＩＣＳＣＰＫＲＤ、Ｋ
ＩＣＳＣＰＫＲＤ、ＲＶＣＳＣＰＫＲＤ、ＫＶＣＳＣＰＫＲＤ、ＲＩＣＴＣＰＫ
ＲＤ、ＫＩＣＴＣＰＫＲＤ、ＲＶＣＴＣＰＫＲＤ、及びＫＶＣＴＣＰＫＲＤ（す
なわち、式：（Ｒ又はＫ）（Ｉ又はＶ）Ｃ（Ｓ又はＴ）ＣＰＫＲＤの配列）から
なる群から選択される配列からなるか該配列を含む。更に好適なｐ５３ポリペプ
チド、断片又は誘導体は、ＦＸＣＫＮＳＣ及びＦＸＣＱＮＳＣ（ここで、Ｘは任
意のアミノ酸）からなる群から選択される配列からなるか該配列を含む。
【００２４】 ｐ５３タンパク質の何れかの断片又は誘導体は好ましくは、ｐ５３タンパク質
誘導体又は断片が、配列番号：２、４、６、８又は１０の何れかのアミノ酸配列
を含んでなる全長野生型ｐ５３タンパク質に伴う一又は複数の機能的活性を示す
という意味で「機能的に活性」である。一例として、断片又は誘導体は、ｐ５３
タンパク質に対する抗体の産生に関して以下に検討するように、免疫化、ｐ５３
活性の阻害等々のためにイムノアッセイにおいて使用することができるように抗
原性を有しうる。好ましくは、機能的に活性なｐ５３断片又は誘導体は、細胞分
裂周期の調節又は転写調節のようなｐ５３タンパク質に関連する一又は複数の生
物活性を示すものである。ｐ５３タンパク質、誘導体及び断片の機能的活性は当
業者に知られた様々な方法によってアッセイすることができる（Current Protoc
ols in Protein Science (1998) Coligan等編, John Wiley & Sons, Inc., Some
rset, New Jersey）。以下の実施例１２はｐ５３の機能を評価するための様々な
好適なアッセイを記述する。 ｐ５３誘導体は当該分野で散られた様々な方法により製造することができる。
その生産を生じる操作は遺伝子又はタンパク質レベルで生じうる。例えば、クロ
ーン化ｐ５３遺伝子配列は制限エンドヌクレアーゼ（類）によって適切な部位で
切断でき（Well等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA (1986) 317:415）、
これに所望されるならば更に酵素的修飾が続き、単離されインビトロで結合され
、発現されて所望の誘導体を産生する。あるいは、ｐ５３遺伝子がインビトロ又
はインビボで突然変異されて、翻訳、開始及び／又は集結配列を作り及び／又は
破壊し、あるいはコード領域に変動を生じさせ、及び／又は新しい制限エンドヌ
クレアーゼ部位を形成するか先に存在しているものを破壊して、更なるインビト
ロでの修飾を容易にすることができる。化学的突然変異誘発、インビトロ部位特
異的突然変異誘発（Carter等, Nucl. Acids Res. (1986) 13:4331）、ＴＡＢ（
登録商標）リンカー（Parmachia and Upjohn, kalamazoo, MIから入手可能）の
使用等々のような様々な突然変異誘発法が当該分野において知られている。
【００２５】 タンパク質レベルでは、操作は翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化
、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解
性切断、抗体分子又は他の細胞性リガンドへの結合等々を含む。数多くの化学的
修飾の何れも既知の方法（例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、
パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還
元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成等々）によって実施することができる
。誘導体タンパク質はまた、例えばｐ５３タンパク質中へ置換又は付加として非
古典的アミノ酸又は化学アミノ酸類似体を導入するためにペプチド合成機を使用
して化学的に合成することもできる。 異なったタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合を介してそのＮ末端又はＣ
末端が結合した（好ましくはｐ５３タンパク質の一又は複数の構造的又は機能的
ドメインを含む）ｐ５３タンパク質又はその断片を含んでなるキメラ又は融合タ
ンパク質を作成することができる。キメラ産物は標準的な方法を使用して適切な
コード読み枠で所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに結合さ
せ、キメラ産物を発現させることにより作成することができる。キメラ産物はま
た例えばペプチド合成機を使用するタンパク質合成法によって作成されうる。
【００２６】 ｐ３３及びＲｂタンパク質 本発明はまたショウジョウバエｐ３３（配列番号：２０）及びＲｂ（配列番号
：２２）ガン抑制因子のアミノ酸配列を提供する。これらの配列の誘導体及び断
片はｐ５３タンパク質配列について上述したようにして調製することができる。
好適な断片及び誘導体はｐ５３アミノ酸配列に対して上述したものと同じ数の近
接アミノ酸又は同じ程度のパーセント同一性又は類似性を有する。
【００２７】 ｐ５３遺伝子調節エレメント ｐ５３遺伝子調節ＤＮＡエレメント、例えば配列番号：１８のヌクレオチド１
−１２２５内に、又は上記の表Ｉに示されるような配列番号：１、３及び５の５
'ＵＴＲ内に存在するエンハンサー又はプロモーターを用いて、ｐ５３タンパク
質産生を特異的に制御する組織、細胞、遺伝子及び因子を同定することができる
。好ましくは、５'ＵＴＲ内の少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２５
、もっとも好ましくは少なくとも５０の近接ヌクレオチドが使用される。ｐ５３
タンパク質の機能に特異的な成分を分析することから、殺虫剤又は治療用途の何
れかに対してこれらの調節過程を如何にして操作するかの理解、並びにこれらの
過程における機能不全をいかに診断するかの理解を得ることができる。 ｐ５３調節エレメントとの遺伝子融合体を作成できる。ショウジョウバエに対
してここに記載されるもののように、比較的少なく小さい介在配列を持つ緻密な
遺伝子に対しては、典型的には空間的かつ時間的発現パターンを制御する調節エ
レメントが最も近接した遺伝子まで延びるコード領域の直ぐ上流のＤＮＡに見い
だされるものである。調節領域は、発現が容易に検出されるレポータータンパク
質のコード領域に調節ＤＮＡが作用可能に融合している遺伝子融合体を作成する
ために使用することができ、これらの作成物は選択される動物中に導入遺伝子と
して導入される。全調節ＤＮＡ領域を用いるか、調節領域をより小さなセグメン
トに分割して、与えられた細胞タイプ又は発達段階の発現を制御するのに特異的
であるかもしれないサブエレメントを同定することができる。調節配列を含む領
域を解読するための一つの好適な方法はインビトロＣＡＴアッセイ（Mercer, Cr
it. Rev. Euk. Gene Exp.(1992) 2:251-263；上揚のSambrook等；及びGorman等,
Mol. Cell. Biol. (1992) 2:1044-1051）によるものである。これらの遺伝子融
合体の作成に使用することができる更なるレポータータンパク質には大腸菌βガ
ラクトシダーゼと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。これらはインサイ
ツにて直ぐに検出することができ、よって組織学的研究に有用であり、ｐ５３タ
ンパク質を発現する細胞を選別するために使用することができる（O'Kane及びGe
hring PNAS (1987)84(24):9123-9127; Chalfie等, Science (1994) 263:802-805
; 及びCumberledge及びKrasnow (1994) Methods in Cell Biology 44:143-159）
。リコンビナーゼタンパク質、例えばＦＬＰ又はｃｒｅは、部位特異的組換え（
Golic及びLindquist (1989) Cell 59(3):499-509; White等, Science (1996) 27
1:805-807）を通して遺伝子発現を制御するのに使用することができる。リーパ
ータンパク質及び隠れた細胞死タンパク質のような毒性タンパク質は、細胞ある
いはｐ５３タンパク質を合成する細胞においてこの特定のタンパク質の機能を特
異的に調べることが望まれる任意の他のタンパク質の生理機能を評価するために
（Kingston, In Current Protcols in Molecular Biology (1998) Ausubel等, J
ohn Wiley & Sons, Inc. sections 12.0.3-12.10）ｐ５３タンパク質を正常には
発現する細胞を特異的に除去するのに有用である
【００２８】 あるいは、更に以下に記載されるものと同様に、ｐ５３調節エレメントが、ｐ
５３調節エレメント「ドライバー遺伝子」を作り出すために、以下に記載される
ＧＡＬ４又はｔＴＡのような外因性転写活性化因子タンパク質のコード領域に作
用可能に融合したバイナリーレポーター系を用いることができる。バイナリー系
の他の半分については、外因性活性化因子が、それぞれ例えばＵＡＳＧ又はｔＴ
Ａ-応答エレメントのような外因性活性化因子タンパク質の同系の調節エレメン
トに作用可能に融合したレポータータンパク質のコード領域を含む別個の「標的
遺伝子」制御する。バイナリー系の利点は、単一のドライバー遺伝子作成物が、
それぞれが上述したそれ自信の用途を持つ異なったレポータータンパク質をコー
ドする予め作成された標的遺伝子からの転写を活性化するために使用することが
できることである。 ｐ５３調節エレメント-レポーター遺伝子融合体はまた遺伝的相互作用の試験
に有用であり、そこでの目的は、ｐ５３遺伝子の発現を制御し、あるいはｐ５３
タンパク質を発現する組織の成長と分化を促進するのに特定の役割を有する遺伝
子を同定することである。ｐ５３遺伝子調節ＤＮＡエレメントはまたｐ５３遺伝
子の発現を制御する遺伝子調節タンパク質を同定するためのタンパク質-ＤＮＡ
結合アッセイにおいても有用である。遺伝子調節タンパク質は、生細胞又は透過
化細胞内における化学的及び酵素的修飾からのＤＮＡ配列の保護に基づいたイン
ビボフットプリントアッセイ；及びタンパク質抽出物を使用する化学的又は酵素
的修飾からのＤＮＡ配列の保護に基づいたインビトロフットプリントアッセイ、
ニトロセルロースフィルター結合アッセイ及びタンパク質抽出物と混合した放射
性標識調節ＤＮＡエレメントを使用するゲル電気泳動度シフトアッセイを含む、
当業者によく知られている特異的なタンパク質-ＤＮＡ相互作用をプローブする
様々な方法（上掲のKingston）を使用して検出することができる。候補ｐ５３遺
伝子調節タンパク質は一般的な方法とＤＮＡ-アフィニティー精製法を併用して
精製することができる。分子クローニング方策もまたｐ５３遺伝子調節ＤＮＡエ
レメントに特異的に結合するタンパク質を同定するために使用することができる
。例えば、発現ベクター中のショウジョウバエｃＤＮＡライブラリーを用いて、
ｐ５３遺伝子調節エレメントＤＮＡ-結合活性をコードするｃＤＮＡをスクリー
ニングすることができる。同様に、酵母菌「ワン-ハイブリッド」系を用いるこ
とができる（Li及びHerskowitz, Science (1993) 262:1870-1874; Luo等, Biote
chniques (1996) 20(4):564-568; Vidal等, PNAS (1996) 93(19):10315-10320）
。
【００２９】 ガン抑制遺伝子アッセイ ｐ５３ガン抑制遺伝子は、細胞増殖の調節、細胞分裂周期の制御、及びアポト
ーシスの誘導に関与する転写因子をコードしている。これらの領域の各々におい
て昆虫ｐ５３遺伝子の役割を評価するために使用されうる。 転写活性アッセイ その酸性領域のために、野生型ｐ５３はその機能を媒介するためにＤＮＡに特
異的にも非特異的にも結合する（上掲のZambetti及びLevine）。ｐ５３タンパク
質又はその断片による転写の調節は当該分野で知られている任意の方法によって
調べることができる。電気泳動度シフトアッセイを使用してｐ５３が結合するＤ
ＮＡ配列を特徴付けることができ、よってｐ５３により調節される遺伝子の道程
に役立つ。簡単に述べると、細胞を増殖させ、様々な量の野生型又は突然変異さ
れた対象転写因子（この場合はｐ５３）を形質移入し、形質移入後４８時間で収
集し、溶解させて核抽出物を調製する。泳動度シフトアッセイに使用されるショ
ウジョウバエ核抽出物の調製はDignam等, Nucleic Acids Res. (1983) 11:1475-
1489に記載されているようにして行ってもよい。また、結合の標的配列に対応す
る相補一本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、セルフアニールして１０−１５ｎｇ
／μｌの最終濃度にする。二本鎖ＤＮＡを（当該分野で知られた方法により、例
えば７％ポリアクリルアミドゲルで）ゲル電気泳動分析により検証して、２０μ
Ｃｉ[３２Ｐ]γ-ｄＡＴＰで末端標識する。結合を助長する条件下で二本鎖標的
配列と核抽出物を混合して、結果物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
分析する。 ｐ５３が結合するＤＮＡ配列を決定する他の好適な方法はＤＮＡフットプリン
トによる（Schmitz等, Nucleic Acids Research (1978)5:3157-3170）。
【００３０】 アポトーシスアッセイ 様々な方法をアポトーシスを調べるために使用することができる。一つの方法
はアポトーシスの核ＤＮＡ断片化特性を測定する末端デオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ媒介ジゴキシゲニン-１１-ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥ
Ｌ）アッセイである（Lazebnik等, nature (1994) 371-:346-347; White等, Sci
ence (1994) 264:677-683）。また、市販のキットをアポトーシスの検出に使用
することができる（クローンテック(Palo Alto, CA)から入手可能なApoAlert(登
録商標)）。 アポトーシスはまた様々な染色方法によりアッセイすることもできる。アクリ
ジンオレンジを使用して、培養細胞中（Lucas等, Blood (1998) 15:4730-41）及
び無傷のショウジョウバエ組織のアポトーシスを検出することができ、これはま
たナイルブルーで染色することもできる（Abrams等, Development (1993) 117:2
9-43）。ＤＮＡラダーを検出するために使用することができる他のアッセイはア
ガロースゲル上でのＤＮＡの電気泳動と臭化エチジウム染色を用いる（Civielli
等, Int. J. Cancer (1995) 27:673-679；Young, J. Biol. Chem. (1998) 273:2
5198-25202）。
【００３１】 増殖及び細胞分裂周期アッセイ 増殖性細胞はＤＮＡ合成を受けている細胞中へのブロモデオキシウリジン（Ｂ
ＲＤＵ）取り込みと抗ＢＲＤＵ抗体による検出により同定することができる（Ho
shino等, Int. J. Cancer (1986) 38:369; Campana等, J. Immunol. Meth. (198
7) 107:79)。このアッセイはショウジョウバエ胚（Edgar及びO'Farrell, Cell (
1990) 62:469-480）及び成虫原基（Secombe等, Genetics (1998) 149:1867-1882
）におけるＳ相細胞を再現可能に同定するために使用することができる。Ｓ相Ｄ
ＮＡ合成はまたシンチレーションカウンターを使用して[３Ｈ]-チミジン取り込
みを測定することにより定量することもできる（Cgen, Oncogene (1996) 13:139
5-403; Jeoung, J. Biol. Chem. (1995) 270:18367-73）。細胞増殖は経時的に
細胞集団の試料を、例えば血球計とトリパンブルー染色を用いてカウントするこ
とにより測定することができる。 細胞のＤＮＡコンテンツ及び／又は分裂指数は、ヨウ化プロピジウムアッセイ
（Turner等, Prostate (1998) 34:175-81）又はコンピュータ化マイクロデンシ
メーター染色システムを用いたフォイルゲン染色反応（Bacus, Am. J. Pathol.
(1989) 135:783-92）のような当該分野で使用された様々な方法を使用する細胞
のＤＮＡ倍数値に基づいて測定することができる。 ショウジョウバエ細胞増殖に対するｐ５３過剰発現又は機能喪失の効果は、変
更された遺伝子発現を持つ細胞のクローンがショウジョウバエの発達中の羽ディ
スクに産生されるアッセイを使用してインビボでアッセイすることができる（Ne
ufeld等, Cell (1998) 93:1183-93）。クローンはＧＦＰを同時発現し、それに
より分離されたディスクからの突然変異及び野生型細胞のサイズ及びＤＮＡコン
テンツをＦＡＣＳ解析により比較することが可能になる。
【００３２】 腫瘍形成及び形質転換アッセイ ｐ５３タンパク質をアッセイするために使用できる様々なインビボ及びインビ
トロの腫瘍形成アッセイが当該分野で知られている。そのようなアッセイは、病
巣形成（Beenken, J. Surg. Res. (1992) 52:401-5）、インビトロ形質転換（Gi
nsberg, Oncogene. (1991) 6:669-72）、ヌードマウス中の腫瘍形成（Endlich,
Int. J. Radiat. Biol. (1993) 64:715-26）、ショウジョウバエにおける腫瘍形
成（Taotou、Nat．Genet. (1999) 21:177-181）、及び軟観点中での足場非依存
性成長（上掲のEndlich）を検出するために使用することができる。分化の印の
喪失は、分化マーカーの喪失、細胞ラウンディング、付着性の喪失、極性の喪失
、接触阻害性の喪失、足場依存性の喪失、プロテアーゼ放出、糖輸送の増加、血
清要求の減少及び胎児抗原の発現の現れでありうる。
【００３３】 ｐ５３遺伝子の変更された発現を伴う動物及び細胞株の産生と遺伝的分析 線虫及びショウジョウバエのような遺伝的に変更された動物モデル（すなわち
インビボモデル）とｐ５３遺伝子を発現又は誤発現する遺伝子操作された細胞株
のようなインビトロモデルの双方がこれらのタンパク質の機能分析のために有用
である。検出可能なフェノタイプを表すモデル系はｐ５３遺伝子又は他の対象の
遺伝子及び／又はｐ５３の突然変異又は誤発現に関連するフェノタイプの同定と
特徴付けに使用することができる。ここで用いられる「誤発現」という用語は遺
伝子の突然変異による誤発現を包含する。よって、誤発現されたｐ５３タンパク
質は野生型とは異なるアミノ酸配列を有するものでありうる（すなわち、それは
通常のタンパク質の誘導体である）。誤発現されたｐ５３タンパク質はまた一又
は複数のＮ末端又はＣ末端アミノ酸が欠失されたものであり得、よって通常のタ
ンパク質の「断片」である。ここで用いられる「誤発現」はまた異所性発現（例
えば通常の空間的又は時間的発現を変更することによる）、過剰発現（例えば多
重遺伝子コピーによる）、発現不足、非発現（例えば、遺伝子ノックアウト又は
そのままでは正常に起こるであろう発現を阻止することによる）、更に異所性組
織での発現を含む。 インビボ及びインビトロモデルは、それらが、１）ｐ５３遺伝子の欠失及び／
又は挿入を有し、２）ｐ５３遺伝子から由来する干渉ＲＮＡ配列を持ち、３）突
然変異した内在性ｐ５３遺伝子を有しており（例えばｐ５３遺伝子における欠失
、挿入、再配列、又は点突然変異を含む）、及び／又は４）ｐ５３遺伝子の野生
型又は突然変異型の導入遺伝子を含むように、遺伝子操作又は変更されうる。そ
のような遺伝的に変更されたインビボ及びインビトロモデルはｐ５３の合成、活
性化、制御等々に関与する遺伝子及びタンパク質、またｐ５３機能の下流エフェ
クター、ｐ５３により調節される遺伝子等々の同定に有用である。モデル系は、
例えば任意の好適な方法（例えば、直接接触、消化、注入等々）を使用してモデ
ル系に化合物を投与し、フェノタイプにおける任意の変化、例えば運動の欠陥、
致死率等々を観察することにより、ｐ５３と相互作用する潜在的な製薬及び殺虫
化合物を試験するために使用することができる。化学的突然変異誘発、トランス
ポゾン変異、アンチセンスＴＮＡｉ、ｄｓＲＮＡｉ、及び導入遺伝子媒介誤発現
を含む当該分野で良く知られた様々な遺伝子操作及び発現変更方法を使用するこ
とができる。
【００３４】 突然変異誘発による機能喪失突然変異の発生 昆虫ｐ５３遺伝子における機能喪失突然変異は当該分野で知られている幾つか
の変異誘発法の任意のものにより発生させることができる（Ashburner, In Dros
ophila melanogaster: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor, NY,
Cold Spring Harbor Laboratory Press; pp.299-418; Fly pushing: The Theor
y and Practice of Drosophila melanogaster Genetics (1997) Cold Spring Ha
rbor Press, Plainview, NY, 以下「Fly Pushing」）。遺伝子又はゲノムにおい
て突然変異を作り出す方法は照射（例えばＸ線、ＵＶ、又はガンマ線）；薬品（
例えばＥＭＳ、ＭＭＳ、ＥＮＵ、ホルムアルデヒド等々）；及びトランスポゾン
挿入、又はトランスポゾン媒介欠失、例えば以下に記載されるような雄組換えに
より誘発される異形成を含む移動エレメントによる挿入突然変異の使用を含む。
遺伝子の発現を変える他の方法はトランズポゾン（例えばＰ因子、ＥＰ型「過剰
発現トラップ」因子、マリナー因子、piggyBacトランスポゾン、ヘルメス、マイ
ノス、スリーピングビュティ等々）を使用して遺伝子；アンチセンス；二本鎖Ｒ
ＮＡ干渉；ペプチド及びＲＮＡアプタマー；定方向欠失；相同的組換え；ドミナ
ントネガティブな対立遺伝子；及びイントラボディを誤発現する。 ｐ５３遺伝子に隣接して位置するトランスポゾンの挿入は、生殖系列において
誘導されれば、次の世代に安定に伝播される隣接ゲノムＤＮＡの欠失を生じさせ
るために使用することができる。欠失を生じさせるこの方法の有用性は実証され
ており当該分野でよく知られている。Ｐ因子トランスポゾン誘発劣性致死突然変
異（Ｐ致死体）の収集物を用いる形態の一方法が特にショウジョウバエにおける
新規で必須の遺伝子の迅速な同定のために適している（（Cooley等, Science (1
988) 239:1121-1128; Spralding等, PNAS (1995) 92:0824-10830）。Ｐ因子の配
列は知られているので、各トランスポゾン挿入物に隣接するゲノム配列はプラス
ミドレスキュー（Hamilton等, PNAS (1991) 88:2731-2735）又はインバースポリ
メラーゼ連鎖反応（Rehm, http://www.fruitfly.org/methods/）の何れかにより
決定される。Ｐ因子を用いる雄ショウジョウバエにおけるトランスポゾン挿入法
のより最近のバージョンはＰ媒介雄組換えとして知られている（Preston及びEng
els, Genetics (1996) 144:1611-1638）。
【００３５】 ＲＮＡベース法を使用する機能喪失フェノタイプの発生 ｐ５３遺伝子は、例えばアンチセンスＲＮＡのようなＲＮＡ-ベース法によっ
て相性の動物に機能喪失フェノタイプを生じさせることにより、同定され及び／
又は特徴づけられうる（Schubiger及びEdgar, methods in Cell Biology (1994)
44:697-713）。アンチセンスＲＮＡ法の一形態は対象の遺伝子（この場合はｐ
５３遺伝子）に部分的に相同的なアンチセンスＲＮＡでの胚の注入を含む。アン
チセンスＲＮＡ法の他の形態は、一般に動物全体か特定の組織の何れかに多量の
アンチセンスＲＮＡを発現させることができる強力なプロモーターにアンチセン
ス配向に対象の遺伝子の一部を作用可能に結合させることによる対象の遺伝子に
部分的に相同的なアンチセンスＲＮＡの発現を含む。アンチセンスＲＮＡにより
生じせしめられた機能喪失フェノタイプはcactus、pecanex、及びKruppelを含む
幾つかのショウジョウバエ遺伝子に対して過去に報告されている（LaBonne等, D
ev. Biol. (1989) 136(1):1-16; Schuh及びJackle, Genome (1989) 31(1):422-4
25; Geisler等, Cell (1992) 71(4):613-621）。 機能喪失フェノタイプはまた同時抑制法により発生させることもできる（Bing
ham, Cell (1997) 90(3):385-387; Smyth, Curr. Biol. (1997)7(12):793-795;
Que及びJorgensen, Dev. Genet. (1998) 22(1):100-109）。同時抑制は対象遺伝
子の部分的セグメントに対応する有意鎖ＲＮＡの発現又は注入により作り出され
る遺伝子発現低下の現象である。同時抑制効果は植物及び線虫において機能喪失
フェノタイプを発生させるために広範に用いられている。ショウジョウバエにお
ける同時抑制は示されており、そこではＡｄｈ遺伝子の発現の低下がホワイト-
Ａｄｈ導入遺伝子から誘発されている（Pal-Bhadra等, Cell (1997)90(3):479-4
90）。
【００３６】 機能喪失フェノタイプを発生させる他の方法は、二本鎖ＲＮＡ干渉（ｄｓＲＮ
Ａｉ）による。この方法は遺伝子のコード領域から取り出された二本鎖ＲＮＡの
干渉性に基づいており、線虫の遺伝的研究（Fire等, Nature (1998) 391:806-81
1）において非常に有用性があることが証明されており、またショウジョウバエ
において機能喪失フェノタイプを発生させるために使用することもできる（Kenn
erdell及びCarthew, Cell (1998) 95:1017-1026; Misquitta及びPatterson PNAS
(1999)96:1451-1456）。ｐ５３遺伝子のような対象遺伝子の実質的な部分から
取り出された相補的センス及びアンチセンスＲＮＡｓがインビトロで合成され、
注入バッファーにてアニールされ、注入又は他の好適な方法、例えば給餌、ＲＮ
Ａを含むバッファー中に動物を浸漬する等々により動物中に導入される。ついで
、ｄｓＲＮＡ処理動物の子孫について対象のフェノタイプを検査する（ＰＣＴ公
開番号ＷＯ９９／３２６１９）。 ｄｓＲＮＡｉはまたｐ５３配列に作用可能に融合した適切に位置せしめられた
プロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの双方をインビボで同時に
発現させることにより達成することもできる。あるいは、動物の生きた食物をセ
ンス及びアンチセンスＲＮＡを発現するように操作し、動物に給餌することがで
きる。例えば、線虫に操作した大腸菌を給餌し、ショウジョウバエに操作したパ
ン酵母を休止し、例えばLeptinotarsa及びHeliothisのような昆虫及び他の草食
動物にはｄｓＲＮＡを生じるように操作された遺伝子組換え植物を給餌すること
ができる。 ＲＮＡｉはまた標的タンパク質の発現を阻害するために培養ショウジョウバエ
細胞において成功裏に使用されている（http://dixonlab.biochem.med.umich.ed
u/protocols/RNAiExperiments.html）。よって、培養物中の細胞株をＲＮＡｉを
用いて操作して、ｐ５３経路の成分の機能を乱し、研究し、この経路の操作を含
む治療又は殺虫方策の効能を実証することができる。好適なプロトコールは実施
例１３に記載している。
【００３７】 ペプチド及びＲＮＡアプタマーを使用する機能喪失フェノタイプの発生 機能喪失フェノタイプの発生のための他の方法は、タンパク質機能のドミナン
トな阻害剤として作用するペプチド又は小分子であるペプチドアプタマーを使用
するものである。ペプチドアプタマーは標的タンパク質に特異的に結合し、その
機能能力を阻止する（Kolonin及びFinley, PNAS (1998)95:14266-14271）。ペプ
チドアプタマーの高度に選択的な性質のために、それらは特異的なタンパク質を
ターゲティングするためばかりでなく任意のタンパク質の特異的な機能（例えば
転写機能）をターゲティングするために使用することができる。更に、ペプチド
アプタマーは、時間的、空間的又は誘発可能な形で発現を調節するプロモーター
の使用により制御された形で発現されうる。ペプチドアプタマーは優位に作用す
る；従って、それらは機能喪失変異体が利用できないタンパク質を分析するため
に使用することができる。 標的タンパク質に高い親和性と特異性をもって結合するペプチドアプタマーは
当該分野で知られている様々な方法によって単離することができる。一方法では
、それらは酵母のツーハイブリッドスクリーニングによって無作為なペプチドラ
イブラリーから単離される（Xu等, PNAS (1997) 94:12473-12478）。それらはま
たファージライブラリー（Hoogenboom等, Immunotechnology (1998) 4:1-20）又
は化学的に産生されたペプチド／ライブラリーから単離することができる。 ＲＮＡアプタマーは、遺伝子のタンパク質機能を特異的に阻害することができ
るタンパク質の特異的ＲＮＡリガンドである（Good等, Gene Therapy (1997) 4:
45-54; Ellington等, Biotechnol. Annu. Rev. (1995) 1:185-214）。インビト
ロ選択方法を用いて選択された特性を持つＲＮＡアプタマーを同定することがで
きる（Bell等, J. Biol. Chem. (1998) 273:14309-14314）。ＲＮＡアプタマー
はショウジョウバエにおけるタンパク質機能を阻害可能であることが実証されて
いる（Shi等, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1999) 96:10033-10038）。従って、
ＲＮＡアプタマーはｐ５３タンパク質又はその誘導体、あるいはｐ５３タンパク
質と相互作用するタンパク質の発現を減少させるために使用することができる。 遺伝子導入動物を産生してペプチド又はＲＮＡアプタマーをインビボで試験す
ることができる（上掲のKolonin及びFinley）。例えば、所望のアプタマーを発
現する遺伝子導入ショウジョウバエをＰ因子媒介形質転換により産生することが
できる（以下で検討）。ついで、アプタマーを発現する子孫のフェノタイプを特
徴づけることができる。
【００３８】 イントラボディを使用する機能喪失フェノタイプの発生 細胞内に発現された抗体、又はイントラボディは細胞内の標的分子に特異的に
結合してそれを不活性化させるように設計された単鎖抗体分子である。イントラ
ボディは細胞アッセイ及び全生物、例えばショウジョウバエにおいて使用されて
いる（Chen等, Hum. Gen. Ther. (1994) 5:595-601; Hassanzadeh等, Febs Lett
. (1998) 16(1,2):75-80及び81-86）。ｐ５３タンパク質と特異的に反応するイ
ントラボディで誘発可能な発現ベクターが作成されうる。これらのベクターはモ
デル生物中に導入され、アプタマーに対して記載されたものと同じようにして研
究される。 トランスジェネシス 典型的には、（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの何れかからの）ｐ５３遺伝子のコ
ード領域の遺伝子融合体又はアンチセンスＲＮＡｓ、同時抑制ＲＮＡｓ、干渉ｄ
ｓＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ペプチドアプタマー、又は調節が十分に特徴づけ
られている特異的プロモーター及び転写エンハンサー、好ましくは異種性プロモ
ーター／エンハンサー（すなわち、発現されているｐ５３遺伝子に対して非天然
であるプロモーター／エンハンサー）に作用可能に結合したイントラボディをコ
ードするように操作された遺伝子を含むトランスジェニック動物が作られる。 動物のゲノム又は培養細胞中に外因性核酸配列を導入してトランスジェニック
動物又は組換え細胞株をつくる方法はよく知られている。無脊椎動物モデルに対
しては、最も一般的な方法は転移因子の使用を含む。モデル生物のゲノム中に核
酸配列を導入するために使用することができる幾つかの好適な転移因子が存在す
る。転移因子はまたコードされたタンパク質が正しく発現されないように対象遺
伝子に配列を挿入するのに特に有用であり、機能喪失フェノタイプを持つ「ノッ
クアウト」動物を作り出す。ショウジョウバエにおけるＰ因子の使用については
方法がよく確立されている（Rubin及びSpradling, Science (1982) 218:348-53;
米国特許第４６７０３８８号）。また、PiggyBac、hobo、及びhermesのような
様々な種において機能する転移因子が同定されている（Thibault等, Insect Mol
Biol (1999) 8(1):119-23）。
【００３９】 Ｐ因子又は標識Ｐ因子は、局在化されたトランスポゾン源としての使用のため
に前もって存在するＰ因子挿入物の利用性と近接性に依存して、これらの遺伝子
の正確な分子マッピングのため、ショウジョウバエｐ５３遺伝子における機能喪
失突然変異の単離に好適である（Hamilton及びZinn, Methods in Cell Biology
(1994) 44:81-94;及びWolfner及びGoldberg, Methods in Cell Biology (1994)
44:33-80）。典型的には、Ｐ因子を含む動物の検出を可能にする一又は複数の因
子を含む修飾Ｐ因子が使用される。最も頻繁には、例えばショウジョウバエwhit
e又はrosy遺伝子の誘導体のような、ショウジョウバエの目の色に影響を及ぼす
マーカー遺伝子が使用される（上掲のRubin及びSpradling；及びKlemenz等, Nuc
leic Acids Res. (1987) 15810):3947-3959）。しかし、原理的には、任意の遺
伝子をトランスジェニック動物において信頼できかつ容易にスコアがつけられる
フェノタイプ変化を生じさせるマーカーとして使用することができる。様々な他
のマーカーは、アンピシリン耐性のような選択マーカーを持つ細菌プラスミド配
列（Steller及びPirrotta, EMBO. J. (1985) 4:167-171）；及び対象の発生的発
現パターンを持つエンハンサーの存在を検出する弱い普遍的プロモーターに融合
したｌａｃＺ配列（Bellen等, Genes Dev. (1989) 3(9):1288-1300）を含む。突
然変異誘発に有用な他の標識Ｐ因子の例が報告されている（Nucleic Acids rese
arch (1998) 26:85-88; 及びhttp://flybase.bio.indiana.edu）。 ショウジョウバエにおけるトランスポゾン突然変異誘発の好適な方法は、「局
所ホッピング」法を用いる（Tower等（Genetics (1993）133:347-359）。それぞ
れの新しいＰ挿入株を、ＰＣＲに基づくアッセイによって、対象の遺伝子（例え
ばｐ５３）内へのＰ因子の転移について分子的に試験することができる。各反応
に対して、Ｐ因子内に含まれる配列に相同的な一つのＰＣＲプライマーが使用さ
れ、第２のプライマーは対象遺伝子のコード領域又は隣接領域に相同である。Ｐ
ＣＲ反応の産物はアガロースゲル電気泳動法により検出される。得られるＤＮＡ
断片の長さは対象の遺伝子に相対的なＰ因子挿入部位を明らかにする。あるいは
、対象遺伝子のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡから誘導されたＤＮＡプローブを使用
するサザンブロット及び制限酵素マッピングを用いて遺伝子のゲノムＤＮＡを再
配列させる転移事象を検出することができる。対象の遺伝子をマップするＰ転移
事象はヘテロ接合性又はホモ接合性突然変異ショウジョウバエにおけるフェノタ
イプ効果のために評価することができる。
【００４０】 他の実施態様では、対象の遺伝子にＰ挿入を有するショウジョウバエ株を用い
て、既知の方法を使用して局在化された欠失を発生させることができる（Kaiser
, Bioassays (1990) 12(6):297-301; Harnessing the power of Drosophila gen
etics, In Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cells and Molecular
Biology, Goldstein及びFyrberg編, Academic Press, Inc. San Diego, Califo
rnia）。これは、対象の遺伝子を破壊するＰ因子転移が見いだせない場合には特
に有用である。簡単に述べると、対象遺伝子の近くに挿入されたＰ因子を含むハ
エが該因子の切除を誘発するために更なるラウンドの転移にさらされる。トラン
スポゾンが切除した子孫は転位因子に関連する目の色のマーカーの喪失によって
典型的に同定される。得られた子孫はＰ因子の正確な又は不正確な切除の何れか
を持つハエを含み、ここで、不正確な切除事象はしばしばＰ挿入部位に隣接する
ゲノムＤＮＡの欠失を生じる。このような子孫をモレキュラー法によってスクリ
ーニングして、対象の遺伝子からゲノム配列を除く欠失事象を同定し、ヘテロ接
合性及びホモ接合性突然変異ショウジョウバエにおけるフェノタイプ効果が評価
される。 砂金、全ての目を持つ動物に普遍的に利用でき、多様な昆虫種に導入遺伝子を
送達するのに効果的であることが証明された遺伝子導入系が記載されている（Be
rghammer等, Nature (1999) 402:370-371）。この系は、ＴＡＴＡボックス（３
ｘＰ３；Sheng等, Genes Devel. (1997) 11:1122-1131）の上流に位置して３つ
のＰａｘ６結合部位を好ましくは含む、全ての動物種の目の組織において活性な
人工的プロモーター；例えばＧＦＰ又は他の自己蛍光タンパク質遺伝子のような
強く可視的に検出可能なマーカー遺伝子（Pasher等, Gene (1992) 111:229-233;
米国特許第５４９１０８４号)；及び広い範囲の動物種に導入遺伝子を送達可能
な乱交雑ベクター、例えばHermes、PiggyBac、又はmarinerから誘導されたトラ
ンスポゾン系ベクター、あるいは汎親和性ＶＳＶＧ-シュードタイプレトロウイ
ルスに基づくベクター（Burns等, In Vitro Cell Dev Biol Anim (1996) 32:78-
84; Jordan等, Insect Mol Biol (1998) 7:215-222;米国特許第５６７０３４５
号）を含む。同じトランスジェネシス系を様々な系統学的に広範な動物において
使用できるので、比較機能研究が極めて容易になり、害虫管理への新規な利用を
評価するのに特に役に立つ。
【００４１】 機能喪失フェノタイプの作成に加えて、転移因子は遺伝子の（過剰発現を含む
）誤発現を生じる動物のゲノムの任意の領域に更なる遺伝子としてｐ５３、又は
その断片もしくは誘導体を導入するために使用することができる。トランスジェ
ニックショウジョウバエでの遺伝子の誤発現のために特に設計された好適なベク
ターは９Ｋｂ長であり、大腸菌のための複製起点；アンピシリン耐性遺伝子；挿
入された配列を移動させるためのＰ因子転移３'及び５'末端；Whiteマーカー遺
伝子；αチューブリン遺伝子の３'未翻訳領域とｈｓｐ７０エンハンサーのＴＡ
ＴＡ領域を含む発現ユニットを含む。発現ユニットはエンハンサーの挿入のため
に設計された第１の多重クローニング部位（ＭＣＳ）と対象遺伝子の挿入のため
に設計された５００塩基下流に位置する第２のＭＣＳを含む。転移因子の代わり
に、相同的組換え又は標的遺伝子導入法を用いて、異種性ｐ５３遺伝子又は断片
又は誘導体を動物の相同な遺伝子の一方又は両方のコピーに置き換えることがで
きる。導入遺伝子は外因性又は内因性プロモーター因子の何れかの調節の下にあ
り、ミニ遺伝子又は大きなゲノム断片の何れかとして挿入されうる。遺伝子機能
は例えばショウジョウバエを用いて、異所性発現により分析することができる（
Brand等, Methods in Cell Biology (1994) 44:635-654）。 トランスジェニックショウジョウバエの作成のために使用することができるよ
く特徴づけられた異種性プロモーターの例はhsp７０及びhsp８３遺伝子のような
熱ショックプロモーター／エンハンサーを含む。目の組織に特異的なプロモータ
ー／エンハンサーにはeyeless（Mozer及びBenzer, Development (1994) 120:104
9-1058）、sevebless（Bowtell等, PNAS (1991) 88(15):6853-6857）及びglass
応答プロモーター／エンハンサー（Quiring等, Science (1994) 265:785-789）
が含まれる。羽組織に特異的なエンハンサー／プロモーターはdpp又はvestigal
遺伝子から誘導することができる（Staehling-Hampton等, Cell Grwoth Differ.
(1994) 5(6):585-593; Kim等, Nature (1996) 382:133-138）。最後に、ｐ５３
が通常活性である領域にドミナント活性又はドミナントネガティブな導入遺伝子
の活性を制限する必要がある場合には、内因性ｐ５３プロモーターを使用するこ
とが有用でありうる。glass応答性エンハンサー因子を使用するショウジョウバ
エの幼生の目におけるＤＭｐ５３の異所性発現は以下の実施例１２に記載されて
いる。
【００４２】 ショウジョウバエにおいて、外因性ＤＮＡを用いるバイナリー調節系が、広範
な発生段階特異的及び組織特異的パターンでの遺伝子の誤発現を試験する場合に
有用である。バイナリー外因性調節系の二つの例には、酵母菌由来のＵＡＳ／Ｇ
ＡＬ４系（Hay等, PNAS (1997)94(10):5195-5200; Ellis等, Development (1993
) 119(3):855-865）、及び大腸菌由来の「Tet系」（Bello等, Development (199
8) 125:2193-2202）が含まれる。ＵＡＳ／ＧＡＬ４系は酵母ＧＡＬ４転写活性化
因子タンパク質によるプロモーターの調節のためにＵＡＳＧ上流調節配列を用い
る誤発現の十分に確立された強力な方法である（Brand及びPerrimon, Developme
nt (1993) 118(2):401-15）。このアプローチ法では、誤発現される対象の遺伝
子がＵＡＳＧにより調節された適切なプロモーターに作用可能に融合した「targ
et」株と命名されたトランスジェニックショウジョウバエが産生される。特定の
組織、例えば目、羽、神経系、腸、又は筋系においてＧＡＬ４活性化因子タンパ
ク質の発現を指示するプロモーター／エンハンサーにＧＡＬ４コード領域が作用
可能に融合した「ドライバー」株と命名された他のトランスジェニックショウジ
ョウバエ株が産生される。対象の遺伝子は対象の遺伝子に結合したプロモーター
からの転写を推進する転写活性化因子が欠落しているために標的株に発現されな
い。しかし、ＵＡＳ標的株がＧＡＬ４ドライバー株と交雑されると、対象の遺伝
子の誤発現がそのＧＡＬ４株に特徴的な特定のパターンで生じる子孫に誘発され
る。このアプローチ法の技術的な単純さにより、対象の遺伝子を持つ一つのトラ
ンスジェニック標的株を産生し、前に存在するドライバー株のパネルとその標的
株を交雑させることにより、非常に広範な組織において対象の遺伝子の定方向誤
発現の効果を採取することが可能になる。
【００４３】 「Tet」バイナリー調節系では、テトラサイクリン調節転写活性化因子（ｔＴ
Ａ）のコード領域が組織特異的及び／又は発生段階特異的な形でｔＴＡの発現を
指示するプロモーター／エンハンサーに作用可能に融合したトランスジェニック
ショウジョウバエドライバー株が産生される。ドライバー株はトランスジェニッ
クショウジョウバエ標的株に交雑され、そこでは誤発現される対象の遺伝子のコ
ード領域がｔＴＡ応答性調節因子を有するプロモーターに作用可能に融合される
。得られた子孫に十分な量のテトラサイクリンを補填した食物が供給されると、
対象の遺伝子の発現が阻止される。対象の遺伝子の発現は食物からのテトラサイ
クリンの除去により簡単に自在に誘発することができる。また、対象の遺伝子の
発現のレベルは、食物中のテトラサイクリンのレベルを変えることにより調節す
ることができる。よって、誤発現のためのバイナリー調節機構としてのTet系の
使用は、空間的な制御に加えて、対象遺伝子の誤発現の大きさとタイミングを制
御する手段を提供するという利点を有する。従って、例えば胚又は幼生段階のよ
うに発達の初期段階において誤発現されるときにｐ５３遺伝子が致死的な又は有
害な効果を有するならば、成体における遺伝子の機能はなお発達の初期段階の間
に食物にテトラサイクリンを加え、成体段階でのに誤発現を誘発するように後で
テトラサイクリンを除去することにより評価することができる。 突然変異によりタンパク質がタンパク質の野生型コピーの正常な機能に干渉し
、遺伝子の正常なコピーの存在下において機能喪失又は機能減少フェノタイプが
生じうるドミナントネガティブな突然変異は既知の方法を使用して作成すること
ができる（Hershkowitz, nature (1987) 329:219-222）。活性なモノマータンパ
ク質の場合には、例えば高度に活性なプロモーターに突然変異遺伝子を結合させ
ることにより達成される不活性形態の過剰発現が、正常なタンパク質の正味の活
性を有意に低減させるのに十分な天然の基質又はリガンドに対して競合を生じさ
せうる。あるいは、活性な部位の残基への変化がなされ、実際に不可逆な標的と
の会合を生じる。
【００４４】 遺伝子発現の変化のアッセイ 様々な発現分析法を用いて、突然変異ｐ５３遺伝子を発現する他の細胞株又は
動物と比較して野生型ｐ５３遺伝子を発現する細胞株又は動物の間に差次的に発
現される遺伝子を同定することができる。そのような発現プロフィール化法はデ
ィファレンシャルディスプレイ、遺伝子発現の段階分析（ＳＡＧＥ）、遺伝子デ
ータベースクエリーに連結された転写物プロフィール化、核酸アレイ法、サブト
ラクティブハイブリダイゼーション、及びプロテオーム分析（例えば、質量分析
及び二次元タンパク質ゲル）を含む。核酸アレイ法はｐ５３遺伝子に突然変異を
持つ動物と資格して正常な動物におけるゲノム幅発現パターンを決定するために
使用することができる。遺伝子発現プロフィール化はまたｐ５３に機能的な関連
を有しうる他の遺伝子又はタンパク質を同定するために使用することができる。
遺伝子は、ｐ５３遺伝子の突然変異、過剰発現、発現不足、誤発現又はノックア
ウトに続くその発現レベルの変化を検出することによって同定される。
【００４５】 ｐ５３遺伝子突然変異に関連するフェノタイプ 突然変異した又は誤発現したｐ５３遺伝子又は阻害性ＲＮＡｓを持つモデル動
物の単離後に、動物について対象のフェノタイプを注意深く調べる。突然変異し
たｐ５３遺伝子の分析に対しては、変更されたｐ５３遺伝子に対してホモ接合性
でありヘテロ接合性である動物モデルを分析する。研究される特定のフェノタイ
プの例は、致死率；繁殖不能性；採食行動、腫瘍形成、運動性の変更及び医薬へ
の感応性を含む神経筋機能の混乱を含む。ハエにより特異的な幾つかのフェノタ
イプは、成体行動、例えば飛行能力、歩行、毛づくろい、走光性、交尾又は産卵
における変化；感覚器官の応答の変化、成体組織、例えば目、羽、脚、剛毛、触
覚、腸、脂肪体、生殖腺及び筋系の形態、サイズ又は数の変化；幼生組織、例え
ば口部、角皮、内部組織又は成虫原基；又は幼生挙動、例えば採食、脱皮、這う
動き、又は蛹殻形成；あるいは任意の生殖系列又は胚組織における発達欠陥を含
む。 ｐ５３遺伝子を含むゲノム配列は、突然変異がｐ５３遺伝子にあるかどうかを
決定するために、過去に記載されたトランスジェネシス法を使用して、現存する
突然変異昆虫株を操作するために使用することができる。簡単に言えば、生殖系
列形質転換体を、その突然変異が対象の遺伝子の近傍にマップされている昆虫株
の現存する又は新たに作成したパネルに対する相補性試験のために交雑させる（
上掲のFly Pushing）。突然変異フェノタイプの相補性によって判断して、突然
変異株がゲノム断片によりレスキューされていることが発見された場合には、突
然変異株はｐ５３遺伝子に突然変異を有している可能性が高い。この予想は、ｐ
５３遺伝子の損傷を同定するために突然変異株からｐ５３遺伝子を配列化させる
ことにより更に確認できる。
【００４６】 ｐ５３遺伝子を変更する遺伝子の同定 ｐ５３遺伝子における突然変異型は後発現により作られた新しいフェノタイプ
の特徴付けにより、ｐ５３遺伝子と、同じ、関連した、又は相互作用する遺伝的
又は生化学的経路に関与しうる他の遺伝子との間の遺伝的相互作用を試験するこ
とができる。個々の遺伝子を、以下に更に詳細に記載するような大規模な遺伝子
変更スクリーンにおける出発点として使用することができる。あるいは、ＲＮＡ
ｉ法を用いて分析される遺伝子中の機能喪失突然変異をシミュレートすることが
できる。他のよく特徴づけられた遺伝子、特に細胞分裂周期又はアポトーシスの
調節に関与する遺伝子とｐ５３遺伝子に何らかの相互作用があるかどうかを調べ
ることは特に興味深い。 遺伝子変更スクリーニング 無脊椎動物モデル生物を使用する遺伝子変更スクリーニングは、多くの数の動
物を系統的にスクリーニングし、相互作用する遺伝子を同定することが可能にな
るので、ｐ５３遺伝子と相互作用する遺伝子を同定するための特に好適な方法で
ある。ショウジョウバエにおいては、約１００００までの動物のスクリーニング
がパイロットスケールのスクリーニングであると考えられる。中程度のスケール
のスクリーニングは通常約１００００から約５００００のハエを用い、大規模な
スクリーニングは約５００００を越えるハエを用いる。遺伝子変更スクリーニン
グにおいて、ｐ５３遺伝子における突然変異のためにあるいはその誤発現のため
に突然変異フェノタイプを持つ動物は、例えば化学的突然変異誘発又はトランス
ポゾン突然変異誘発によって、更に突然変異誘発される。
【００４７】 典型的なショウジョウバエ遺伝子変更スクリーニングに含まれる手順は当該分
野においてよく知られている（Wolfner及びGoldberg, Methods in Cell Biology
(1994) 44:33-80;及びKarim等, Genetics (1996) 143:315-329）。使用される
手順は変更されうる突然変異誘発遺伝子の正確な性質に応じて異なる。一般的に
機能喪失対立遺伝子の場合のように、突然変異誘発遺伝子が遺伝的に劣性であれ
ば、突然変異誘発遺伝子の一コピーを有する最も典型的には雄、又はある場合に
は雌が、例えばＥＭＳ、ＭＭＳ、ＥＮＵ、トリエチルアミン、ジエポキシアルカ
ン類、ＩＣＲ-１７０、ホルムアルデヒド、Ｘ線、ガンマ線、又は紫外線照射の
ような効果的な突然変異原に暴露される。突然変異誘発された動物は変更される
突然変異遺伝子をまた有する反対の性の動物に交雑される。異所的に発現された
遺伝子の場合に一般的であるように、変更されている突然変異誘発遺伝子が遺伝
的に優性である場合には、野生型雄が突然変異誘発され、変更される突然変異誘
発遺伝子を有する雌に交雑される。 元のフェノタイプの増強か抑制の何れかを示す突然変異誘発され交雑されたハ
エの子孫は、同じフェノタイプ発生経路に関与する「変更遺伝子」と呼ばれる他
の遺伝子に突然変異を有していると思われる。これらの子孫は直ぐにバランサー
染色体を含む成体に交雑され安定な遺伝子系統のファウンダーとして使用される
。また、ファウンダー成体の子孫はフェノタイプの安定性と再現性を確保するた
めに元のスクリーニング条件で再試験される。更なる二次スクリーニングを適切
に用いて、更なる分析のためにそれぞれの新しい変更突然変異系統の適合性を確
認する。
【００４８】 ショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングから生じる変更因子のマッピ
ングに使用される標準的な方法は、可視又は分子遺伝マーカーでの減数分裂マッ
ピング；Ｐ因子挿入に対する雄特異的組換えマッピング；欠陥、複製、及び致死
的Ｐ因子挿入での相補性分析；及び染色体異常の細胞学的分析（上掲のFly Push
ing）を含む。致死的Ｐ因子を補完できない変更突然変異に対応する遺伝子はＰ
因子を囲むゲノム配列のプラスミドレスキューによりクローニングされうる。あ
るいは、変更遺伝子はフェノタイプレスキューと位置クローニングによってマッ
プされうる（上掲のSambrook等）。 新たに同定された変更因子突然変異について、上述の方法を使用してｐ５３遺
伝子に関与する又は関連することが知られている他の対象遺伝子との相互作用を
直接試験することができる。また、新しい変更因子突然変異は細胞分裂周期又は
アポトーシスの調節に関連しているとは信じられていない他の経路における遺伝
子との相互作用について試験することができる。細胞分裂周期又はアポトーシス
に関連している他の遺伝子とで、未関連の経路の遺伝子とではない特定の遺伝的
相互作用を示す新しい変更因子突然変異が特に興味深い。 変更因子突然変異はまた「相補性グループ」を同定するために使用することが
できる。二つの変更因子突然変異は、トランスで双方の突然変異を有する動物が
それぞれの突然変異に個々にホモ接合性である動物と本質的に同じフェノタイプ
を示し、互いにトランスの時に一般に致命的であるならば、同じ相補性グループ
に入ると考えられる（上掲のFly Pishing）。一般に、このようにして定義され
た個々の相補性グループは個々の遺伝子に対応する。
【００４９】 ｐ５３変更遺伝子が同定されると、他の種の相同的な遺伝子が、変更遺伝子Ｄ
ＮＡプローブでのクロスハイブリダイゼーションに基づく手順、変更遺伝子から
誘導されたプライマー配列でのＰＣＲベース方策、及び／又は配列データベース
のコンピューター検索を使用して単離することができる。ｐ５３遺伝子の機能に
関する治療的応用に対しては変更遺伝子のヒト及び齧歯類騒動体が特に興味深い
。 上述したショウジョウバエ遺伝子変更スクリーニングはかなり強力で感度がよ
いが、ｐ５３遺伝子と相互作用する幾つかの遺伝子が、特にその遺伝子の機能の
重複がある場合にはこのアプローチ法において見逃されうる。これは、標準的な
突然変異誘発法において発生させられた突然変異の大部分は機能喪失突然変異で
あるが、機能重複を伴う遺伝子を明らかにしうる機能獲得突然変異が比較的希で
あるためである。系統的な機能獲得遺伝子スクリーニングに特に焦点を当ててい
るショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングの他の方法が開発されている
（Rorth等, Development (1998) 125:1049-1057）。この方法は、（上述した）
ＧＡＬ４／ＵＡＳ系の成分を利用するモジュラー誤発現系に基づいており、「強
化Ｐ」（ＥＰ）因子と命名された変更Ｐ因子が遺伝的に操作されてＧＡＬ４-応
答性ＵＡＳ因子及びプロモーターを含む。得られるトランスポゾンは挿入突然変
異誘発により遺伝子に無作為にタギングするために使用される（上述したＰ因子
突然変異誘発の方法と同様）。それぞれが特異的ＵＡＳタグ遺伝子を含む、ＥＰ
株と命名された何千ものトランスジェニックショウジョウバエ株が産生される。
このアプローチ法は遺伝子の５'末端で挿入されるＰ遺伝子の優先度を利用して
いる。従って、ＥＰ因子の挿入によってタギングされる遺伝子の多くはＧＡＬ４
-調節プロモーターに作用可能に融合し、無作為にタギングされた遺伝子の発現
又は誤発現の増加がＧＡＬ４ドライバー遺伝子での交雑により誘発されうる。
【００５０】 ｐ５３遺伝子の突然変異又は誤発現により誘発されるフェノタイプの変更因子の
系統的な機能獲得遺伝子スクリーニングは、突然変異又は誤発現ｐ５３遺伝子を
含み、更に適当なＧＡＬ４ドライバー導入遺伝子を含む遺伝的バックグラウンド
中に個々に幾千ものショウジョウバエＥＰ株を交雑させることにより実施するこ
とができる。新規な挿入を得るためにＥＰ因子を再び移動させることも可能であ
る。ついで、これらの交雑の子孫について上述のような元の突然変異フェノタイ
プの増強又は抑制を分析する。ｐ５３遺伝子と相互作用する突然変異を持つとし
て同定されたものは、更に、この遺伝的相互作用の再現性と特異性を実証するた
めに試験することができる。突然変異又は誤発現されたｐ５３遺伝子との特異的
な遺伝的相互作用を実証するＥＰ挿入は、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションス
クリーニング法を用いて同定され配列決定されうる物理的にタギングされた新し
い遺伝子を有しており、ＥＰ因子挿入の位置に隣接するゲノムＤＮＡの単離を可
能にする。
【００５１】 ｐ５３と相互作用する分子の同定 ５３タンパク質、又はその誘導体もしくは断片と相互作用するタンパク質又は
他の分子のような分子を同定又はスクリーニングするために様々な方法を使用す
ることができる。該アッセイは、精製されたｐ５３タンパク質、又は細胞株又は
モデル生物、例えばｐ５３タンパク質を発現するように遺伝的に操作されたショ
ウジョウバエを使用しうる。対象の遺伝子／タンパク質と相互作用するタンパク
質及び他の分子を試験する好適なスクリーニング法は当該分野においてよく知ら
れている（例えばＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／３４０９９を参照のこと）。新
たに同定される相互作用する分子は製薬用薬剤の新しい標的を提供しうる。天然
に生じるもの及び／又は合成のものの双方の様々な外因性分子の任意のもの（例
えば小分子又はペプチドのライブラリー、又はファージディスプレイライブラリ
ー）を結合能力についてスクリーニングすることができる。典型的な結合実験で
は、ｐ５３タンパク質又は断片は結合を誘発する条件下で候補分子と混合され、
結合が起こるように十分な時間が確保され、結合した複合体を試験するアッセイ
が実施される。相互作用するタンパク質を見いだすための様々なアッセイが当該
分野において知られている、例えば複合体中のタンパク質に結合する抗体での免
疫沈降に続く、免疫沈降したタンパク質のサイズ分画による分析（例えば変性又
は非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、ウエスタン分析、非変性ゲル電
気泳動法等々である。
【００５２】 ツーハイブリッドアッセイ系 相互作用するタンパク質を同定するための好適な方法はツーハイブリッドアッ
セイ系又はその変形である（Fields及びSong, Nature (1989) 340:245-246;米国
特許第５２８３１７３号；レビューにはBrent及びFinley, Annu. Rev. Genet. (
1997) 31:663-704を参照のこと）。最も一般的に使用されるツーハイブリッドス
クリーニング系は酵母菌を使用して実施される。全ての系は３つの因子を共有す
る：１）ＤＮＡ結合ドメインに融合した「ベイト」タンパク質の合成を指示する
遺伝子；２）ベイトに対して上流の結合部位を有する一又は複数の「レポーター
」遺伝子、及び３）レポーター遺伝子の転写を活性化する活性化ドメインに融合
した「プレイ」タンパク質の合成を指示する遺伝子である。ｐ５３タンパク質と
相互作用するタンパク質のスクリーニングに対して、「ベイト」は好ましくはＤ
ＮＡ結合ドメインへの融合タンパク質として発現されるｐ５３タンパク質であり
；「プレイ」タンパク質はベイトと相互作用する能力を試験され、転写活性化ド
メインへの融合タンパク質として発現されるタンパク質である。プレイタンパク
質は無作為のペプチドを発現する組換え生物学的ライブラリーから得ることがで
きる。
【００５３】 ベイト融合タンパク質は任意の好適なＤＮＡ結合ドメイン、例えば大腸菌LexA
リプレッサータンパク質、又は酵母ＧＡＬ４タンパク質（Bartel等, BioTechniq
ues (1993)14:920-924, Chasman等, Mol. Cell. Biol. (1989)9:4746-4749; Ma
等, Cell (1987) 48:847-853; Ptashne等, Nature (1990) 346:329-331）を使用
して作成することができる。プレイ融合タンパク質は、ＧＡＬ４、ＶＰ-１６等
々のような任意の好適な活性化ドメインを使用して作成することができる。プレ
イは、コードされたタンパク質の単離を容易にするために、核局在化シグナル（
Ylikomi等, EMBO J. (1992) 11:3681-3694; Dingwall及びLaskey, Trends Bioch
em. Sci. Trends Biochem. Sci. (1991)16:479-481）又はエピトープタグ（Alle
n等, Trends Biochem. Sci. Trends Biochem. Sci. (1995) 20:511-516）のよう
な有用な部分を含んでいてもよい。適切な培地上での成長によりそれらを発現す
る細胞を選択できるようにするレポーター遺伝子のような検出可能なフェノタイ
プを有する任意のレポーター遺伝子を使用することができる（例えば、Chien等,
PNAS (1991)88:9572-9582により記載されているLEU2、HIS3；及びGyuris等, Ce
ll (1993) 75:791-803）。他のレポーター遺伝子、例えばLacZ及びGFPはそれら
を発現する細胞を可視的にスクリーニングできるようにする（上掲のChien等）
。 ツーハイブリッドスクリーニングのために好適な宿主は酵母菌であるが、レポ
ーター遺伝子の転写と相互作用アッセイが生じる宿主細胞は任意の細胞、例えば
哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、ヒト、ウシ）、ニワトリ、細菌、又
は昆虫細胞でありうる。酵母菌中での二つの融合タンパク質集団の発現のための
様々なベクターと宿主株が使用できる（米国特許第５４６８６１４；Bartel等,
Cellular Interactions in Development (1993) Hartley編, Practical Approac
h Series xviii, IRL Press at Oxford University Press, New York, NY, pp.1
53-179;及びFields及びSternglanz, Trends In Genetics (1994) 10:286-292）
。哺乳動物系の例として、ＧＡＬ４推進ベイトとの活性化タギングＶＰ１６誘導
体の相互作用が、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ、又はＣＤ細胞表面抗原の合成を指示する
レポーターの発現を推進する（Fearon等,PNAS (1992) 89:7958-7962）。他の例
として、ＧＡＬ４-誘導ベイトとのＶＰ１６タギング誘導体の相互作用はＳＶ４
０Ｔ抗原の合成を推進し、それが次にプレイプラスミドの複製を促進し、それが
ＳＶ４０起点を有している（Vasavada等, PNAS (1991)88:10686-10690）。
【００５４】 典型的には、ベイトｐ５３遺伝子とキメラ遺伝子のプレイライブラリーがおよ
そ６−８時間かけて固体又は液体培地上での二つの酵母菌株の交配により組み合
わされる。得られた複相は両方の種類のキメラ遺伝子、すなわちＤＮＡ結合ドメ
イン融合体と活性化ドメイン融合体を含む。レポーター遺伝子の転写はＳＶ４０
Ｔ抗原の場合には結合複製アッセイによって（上掲のVasavada等）、あるいはイ
ッムノアッセイ法を使用して（Alam及びCook, Anal. Biochem. (1990)188:245-2
54）検出できる。ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＹＳ２又はＬＥＵ２のような他のレポ
ーター遺伝子の活性化により、それぞれウラシル、ヒスチジン、リジン又はロイ
シンの不存在下で細胞が成長し、よって選択マーカーとなる。例えば、ＧＦＰ及
びｌａｃＺはそれぞれ蛍光性で色素生産性である遺伝子産物を有している。 相互作用タンパク質が同定された後に、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列
が単離できる。一方法では、活性化ドメイン配列又はＤＮＡ結合ドメイン配列（
使用するプレイハイブリッドに依存する）が例えば、ＤＮＡ結合ドメイン又は活
性化ドメインのコード領域に特異的なオリグヌクレオチドプライマーついを使用
してＰＣＲにより増幅される。シャトル（大腸菌への酵母菌）ベクターが融合タ
ンパク質を発現させるために使用される場合は、タンパク質をコードするＤＮＡ
配列は酵母菌ＤＮＡを使用する大腸菌の形質転換と大腸菌からのプラスミドの回
収により単離できる。あるいは、酵母ベクターを単離し、融合タンパク質をコー
ドする挿入物を、大腸菌中でのプラスミドの成長のために、細菌発現ベクター中
にサブクローニングできる。
【００５５】 抗体とイッムノアッセイ 配列番号：２、４、６、８又は１０及びその誘導体と断片、例えば上で検討し
たものの何れかによりコードされるｐ５３タンパク質はモノクローナル又はポリ
クローナル抗体及び抗体断片又は誘導体（例えば、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片）
を産生するための免疫源として使用できる。例えば、５３タンパク質の断片、好
ましくは親水性として同定されたものは、当該分野で既知の方法、例えばハイブ
リドーマ法；無菌動物中でのモノクローナル抗体生産（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２
５４５）；ヒトハイブリドーマの使用（Cole等, PNAS (1983) 80:2026-2030; Co
le等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985) Alan R. Liss, pp.7
7-96）；及びヒト化抗体の生産（Jones等, Nature (1986) 321:522-525;米国特
許第５５３０１０１号）を使用する抗体生産のための免疫源として使用される。
特定の実施態様では、ｐ５３ポリペプチド断片は、特に担体タンパク質に結合さ
れたときに特異的抗原及び／又は免疫源をもたらす。例えば、ペプチドはキーホ
ールリンペット抗原（ＫＬＨ）に共有結合的に結合され、コンジュゲートがフロ
イント完全アジュバントに乳化される。実験用ウサギが一般的なプロトコルに従
って免疫化され、採血される。特異的抗体の存在は固定化された対応のポリペプ
チドを使用する固相免疫吸着アッセイによりアッセイされる。得られた抗体の特
異的活性又は機能は簡便なインビトロ、細胞ベース、又はインビボアッセイ、例
えばインビトロ結合アッセイ等々によって決定できる。結合親和性は抗原抗体会
合の平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０ ８ Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）の決定によりアッセイで
きる。以下の実施例１１は更に抗ＤＭｐ５３抗体の産生を記述する。 イムノアッセイはｐ５３タンパク質と相互作用するかそれに結合するタンパク
質を同定するために使用できる。野生型ｐ５３タンパク質に結合し、あるいはそ
れへの結合について競合するタンパク質の能力、又は抗ｐ５３タンパク質抗体に
結合するタンパク質の能力を試験するために様々なアッセイが利用できる。好適
なアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、免
疫放射線測定法、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散測定法、インサイツイムノアッ
セイ（例えばコロイド状金、酵素又は放射性同位元素標識を使用）、ウエスタン
ブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセ
イ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、疫電気泳
動アッセイ等々を含む。
【００５６】 潜在的な薬物標的の同定 新規なｐ５３遺伝子又はｐ５３相互作用遺伝子が同定されたら、それらはショ
ウジョウバエ又は他の昆虫のような動物モデルを使用するか、あるいは内因性ｐ
５３を発現するかｐ５３を発現するように操作された細胞を使用して、潜在的な
薬物又は殺虫剤の標的として評価できる。 昆虫への化合物のアッセイ 潜在的な殺虫性化合物は、経口的（合成食餌への添加、植物又は試験生物によ
り消費される餌食への適用を含む）、局所適用（スプレー、動物への化合物の直
接の塗布、動物の処置表面への接触を含む）又は注射によるものを含む様々な形
で昆虫に投与することができる。殺虫剤は典型的には非常に疎水性の分子であり
、通常は、メタノール又はアセトンの場合は蒸発する有機溶媒に溶解されなけれ
ばならず、あるいは低濃度で摂取を容易にするように含められる（エタノール、
ジメチルスルホキシド）。 昆虫アッセイにおける最初の工程は、通常は、化合物への長期の暴露後の昆虫
の最小致死量（ＭＬＤ）の決定である。化合物は通常ＤＭＳＯに希釈され０−４
８時齢の胚及び幼生を受けている食物表面に適用する。ＭＬＤに加えて、この工
程により、孵化する卵の割合、幼生の行動、例えば未処置の幼生と比較してそれ
らがどのように動き／餌を食べるか、生存して蛹化する割合、及び孵化する割合
（蛹殻からの成体昆虫の出現）の決定が可能になる。これらの結果に基づいて、
より短い暴露時間での更に詳細なアッセイが設計され、幼生は明らかな形態学的
欠陥を調べるために解剖されるかもしれない。ＭＬＤが決定されれば、より特定
の急性及び慢性アッセイを設計することができる。 典型的な急性アッセイでは、化合物が胚、幼生又は成体の食物表面に塗布し、
２時間及び終夜のインキュベーション後に動物を観察する。胚への塗布では、発
意機の欠陥及び生存して成体になるパーセントが決定される。幼生に対しては、
行動、移動運動、及び脱皮の欠陥が観察されうる。成体への塗布では、行動及び
神経学的欠陥が観察され、繁殖性についての影響に着目される。昆虫の生存、脱
皮及び繁殖性への有害な効果は何れも化合物が防除に有用性を有していることを
示す。 慢性的な暴露アッセイに対しては、成体を化合物を含むバイアル上に４８時間
置き、ついで清浄な容器に移し、繁殖性、神経学的欠陥及び死を観察する。
【００５７】 細胞培養物を用いる化合物のアッセイ ｐ５３活性を変調（例えば阻止又は亢進）する化合物は、内因性の正常な又は
突然変異ｐ５３を発現する細胞、及び／又はｐ５３、又はｐ５３の誘導体もしく
は断片を発現するベクターが形質移入された細胞によって試験できる。化合物は
様々な濃度で添加され、ｐ５３遺伝子を変調するその能力が、上述したガン抑制
遺伝子のアッセイの何れかを使用して（例えば、転写活性、アポトーシス、増殖
／細胞分裂周期、及び／又は形質転換を測定することにより）決定される。ｐ５
３を選択的に変調する化合物はｐ５３特異性を有する潜在的な薬物候補として同
定される。 大きな化学ライブラリーからの潜在的な製薬化合物としての小分子及び化合物
の同定には高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法が必要となる（Bolger,
Drug Discovery Today (1999) 4:251-253）。ここに述べるアッセイの幾つかは
それ自身がそのようなスクリーニング法に役立つ。例えば、野生型又は突然変異
ｐ５３タンパク質又はその断片を発現する細胞又は細胞株及びレポーター遺伝子
を対象の化合物に当て、レポーター遺伝子に応じて、相互作用を様々な方法、例
えば色検出、蛍光検出（例えばＧＦＰ）、オートラジオグラフィー、シンチレー
ション分析等々を使用して測定することができる。
【００５８】 昆虫ｐ５３配列の農業上の用途 昆虫ｐ５３遺伝子は農業上重要な害虫種を管理するのに使用できる。例えば、
ここに開示したタンパク質、遺伝子及びＲＮＡｓ、又はその断片は、農作物に損
害を与える昆虫、又は農場の動物又は他の動物の害虫の成長、給餌及び／又は繁
殖を変調させる活性を有しうる。一般に、効果的な殺虫剤は、例えば致死性、繁
殖不能性、麻痺、発育阻害、又は給餌中止のように、標的害虫に無力化する活性
を作用させる。そのような害虫は、ハエ、カ、ノミ、蛾、カブトムシ、セミ、バ
ッタ、アブラムシ及びコオロギの卵、幼生、幼虫及び成体形態を含む。ここに記
載された昆虫ｐ５３遺伝子の機能解析により、アポトーシス、ＤＮＡ損傷剤への
反応、及び生殖系列の細胞の保護の制御におけるこれらの遺伝子及びタンパク質
の役割が明らかになった。ＤＭｐ５３の過剰発現がショウジョウバエにおいてア
ポトーシスを誘発するので、活性化形態の昆虫ｐ５３遺伝子とタンパク質は、例
えば腸、神経系又は生殖腺のような特定の標的組織に送達されるか発現された場
合に害虫を制御する用途を持つ「細胞死」遺伝子として応用される。あるいは、
ＤＭｐ５３はＸ線のようなＤＮＡ損傷剤に応答してある役割を果たすので、昆虫
におけるｐ５３機能との干渉は、繁殖不能化のためにＤＮＡ損傷剤に昆虫を感作
させる用途を有している。例えば、照射した昆虫を環境中に放出することによっ
て害虫群を制御する現在の方法（Knipling, J Econ Ent (1995) 48:459-462; Kn
ipling (1979) U.S. Dept. Agric. Handbook No. 512）は、ｐ５３遺伝子、タン
パク質又はＲＮＡｓのドミナントネガティブな形態を昆虫、最も好ましくは昆虫
の生殖系列組織に発現させることにより、あるいはｐ５３機能を阻止する化学物
質に昆虫を暴露することにより、改善することができる。
【００５９】 昆虫ｐ５３タンパク質の突然変異解析はまた農業上重要な害虫の制御に関連し
て使用できる。この点について、昆虫ｐ５３遺伝子の突然変異解析は、無脊椎動
物におけるこのクラスのタンパク質の正確な生物学的機能を決定するための合理
的なアプローチ法を提供する。更に、大規模な系統的遺伝子変更因子スクリーニ
ングと併用する突然変異解析は、ｐ５３シグナル伝達経路の構成要素かもしれな
い他の潜在的な殺虫剤標的を同定し確認する手段を提供する。殺虫剤の活性の試
験は当該分野で知られている任意の方法とできる。昆虫ｐ５３タンパク質の核酸
を含んでなる殺虫剤は植物又は動物への送達に好適なベクターにて調製できる。
そのようなベクターは、トランスジェニック植物の産生のためのアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｔｉプラスミドベース
ベクター（Horsch等, Proc Natl Acad Sci USA. (1986) 83(8):2571-2572;Frale
y等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:4803）又は植物細胞又は植物の播
種のための組換えカリフラワーモザイクウイルス（米国特許第４４０７９５６号
）；脊椎動物中への遺伝子の導入のためのオロウイルスベースベクター（Burns
等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA (1993) 90:8033-37）；及び既に上述したベク
ターと方法を使用する無脊椎動物へ導入するための転移因子ベースのベクターを
含む。例えば、トランスジェニック昆虫は、昆虫の生活環の適切な時にガン抑制
因子タンパク質の発現を指示するために、例えばｔＴＡ応答性プロモーターのよ
うな適切な誘導プロモーターに作用可能に融合したｐ５３遺伝子を含む導入遺伝
子を使用して産生することができる。このようにして、例えば生活環の幼生段階
において（例えば給餌が作物に最も大きなダメージを与えるとき）殺虫剤として
の効能を試験することができる。 野生型又は突然変異型の組換え又は合成ｐ５３タンパク質、ＲＮＡｓ又はその
断片は、昆虫幼生の血リンパ中へのｐ５３タンパク質又はＲＮＡｓの溶液の注入
により殺虫剤活性についてアッセイすることができる（Blackburn等, Appl. Env
iron. Microbiol. (1998) 64(8):3036-41;Bowen及びEnsign, Appl. Environ. Mi
crobiol. (1998) 64(8):3029-35）。更に、ｐ５３タンパク質又はＲＮＡｓ又は
その断片を発現するトランスジェニック植物は害虫に対する活性について試験す
ることができる（Estruch等, Nat. Biotechnol. (1997) 15(2):137-41）。
【００６０】 昆虫ｐ５３遺伝子は標的害虫においてガン抑制遺伝子の発現を指示する組換え
ウイルスの形態の昆虫制御剤剤として使用できる。感染昆虫細胞におけるタンパ
ク質の発現のために様々の好適な組換えウイルス系が当該分野においてよく知ら
れている。好適な系は組換えバキュロウイルスを使用する。昆虫における毒性タ
ンパク質の発現を操作する手段として、及び昆虫制御剤としての組換えバキュロ
ウイルスの使用は、宿主特異性、環境安全性、ベクター系の利用性、及びガン抑
制因子タンパク質の精製又は製剤の必要のない殺虫剤として直接的な組換えウイ
ルスの潜在的使用を含む多くの特定の利点を有している（Cory及びBishop, Mol.
Biotechnol. (1997) 7(3):303-13;及び米国特許第５４７０７３５号；同第５３
５２４５１号；同第５７７０１９２号；同第５７５９８０９号；同第５６６５３
４９号；及び同第５５５４５９２号）。よって、昆虫ｐ５３遺伝子の発現を指示
する組換えバキュロウイルスは制御された実験室条件下でガン抑制因子タンパク
質の殺虫活性を試験するためと農場での昆虫制御剤としての双方に使用すること
ができる。昆虫制御剤としての野生型バキュロウイルスの一つの不具合は、ウイ
ルスの適用と標的昆虫の死の間の時間量が典型的には１から２週であることであ
る。この期間の間に昆虫の幼生は作物を食べ損害をもたらし続ける。従って、感
染した標的昆虫の摂食を迅速に停止させる改善されたバキュロウイルス誘導昆虫
制御剤を開発する必要がある。脊椎動物におけるｐ５３の細胞分裂周期及びアポ
トーシス調節の役割は、感染した昆虫の組換えバキュロウイルスからのガン抑制
因子タンパク質の発現が害虫の代謝を制御し、摂食を制限するのに所望の効果を
持ちうるという可能性を生じる。 昆虫ｐ５３遺伝子、ＲＮＡｓ、タンパク質又は断片は、農業用の使用に適した
任意の担体、例えば水、有機溶媒及び／又は無機溶媒を用いて製剤化されうる。
殺虫剤組成物は固体又は液体組成物の形態を取りえ、溶解、根号、粉砕、造粒、
及び分散のような基本的な製剤プロセスによって調製されうる。組成物は、昆虫
ｐ５３タンパク質又は遺伝子を、農業的に許容可能な賦形剤、例えばビヒクル、
担体、バインダー、ＵＶブロッカー、接着剤、ヘメカント（hemecants）、増粘
剤、分散剤、防腐剤及び昆虫誘引剤と混合されて含みうる。よって、本発明の組
成物は、例えば活性剤と細かく粉砕された固体担体を含有する固体として製剤化
されうる。あるいは、活性剤は、その分散液、エマルション及び懸濁液を含む液
体組成物に含まれうる。例えば、顆粒、粉末、餌ペレット（活性剤と昆虫誘引剤
又は食物物質を含む固体組成物）、マイクロカプセル、水分散性顆粒、エマルシ
ョン及び乳化濃縮物を含む、任意の好適な最終製剤を使用することができる。本
発明における使用に適したアジュバント又は担体の例は、水、有機溶媒、無機溶
媒、タルク、葉蝋石、合成微粒シリカ、アタピュガス（attapugus）クレー、珪
藻土チョーク、珪藻土、炭酸カルシウム、ボントナイト（bontonite）、フラー
土、綿実殻、小麦粉、大豆粉、軽石、トリポリ石、木粉、クルミ殻粉、アメリカ
スギ粉、及びリグニンを含む。組成物はまた一般的な殺虫剤を含んでいてもよく
、及び／又は一般的な殺虫剤と組み合わせて適用されてもよい。
【００６１】 （実施例） 次の実施例は配列番号：１、３、５、７、９及び１８の核酸配列の単離及びク
ローニングを記述し、これらの配列、その誘導体及び断片、及び遺伝子産物がｐ
５３経路の機構を明らかにする遺伝子研究に如何に使用できるか、並びにその経
路と相互作用する潜在的な製薬薬剤の発見を記述する。 これらの実施例は単に本発明の様々な側面を例示するために提供されるもので
決して発明を限定するものとみなされるべきではない。
【００６２】 実施例１：ショウジョウバエｃＤＮＡライブラリーの調製 ショウジョウバエで発現された配列タグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡライブラリーを以
下のようにして調製した。混合期（mixed stage）の幼虫（０−２０時間）の組
織，成虫原基及び成体ハエ頭部が集められ、全ＲＮＡが調製された。ミトコンド
リアｒＲＮＡは、ビオチン化ｒＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドを伴うハイブリ
ッド形成によって取り除かれ、その残存ＲＮＡからポリアデニル化ｍＲＮＡが選
択された。そして、その生成物は、ランダムプライマー化ライブラリーを構築す
るために使用された。最初のｃＤＮＡ鎖の合成は、６ヌクレオチドランダムプラ
イマーを使用によってプライムされた。そして、最初のｃＤＮＡ鎖は、およそ１
５ｄＧＴＰ分子を付加するためにターミナルトランスフェラーゼによって尾が付
けられた。２番目の鎖は、１３ヌクレオチドＣ尾が続くＮｏｔ１部位を含むプラ
イマーを使用して、Ｇ-尾部化された最初のｃＤＮＡ鎖へハイブリッド形成する
ためにプライム化された。二重鎖ｃＤＮＡは、ＢｓｔＸ１アダプターによって連
結され、Ｎｏｔ１によって消化された。そして，ｃＤＮＡは、大きさによってア
ガロースゲル上での電気永動によって分画され、７００ｂｐより大きなｃＤＮＡ
は精製された。ｃＤＮＡは、Ｎｏｔ１、ＢｓｔＸ１消化ｐＣＤＮＡ-ｓｋ＋ベク
ター（pBluescriptの誘導体、ストラタジーン）と連結され、大腸菌（ＸＬ１ｂ
ｌｕｅ）の形質転換に用いられた。ライブラリーの最終コンプレクシティは，６
Ｘ１０６ 独立性クローンであった。 ｃＤＮＡライブラリーは、Ｂｏｎａｌｄｏらによって記載された方法の改良法
を使用して標準化された（Genome Research (1996) 6:791-806）。ビオチン化
ドライバーは、挿入物のＰＣＲ増幅によってｃＤＮＡから調製され、同じライブ
ラリーの一本鎖プラスミドとハイブリッド形成された。生成二重鎖プラスミドは
、ストレパヴィデンマグネチックビーズ（strepavidin magnetic beads）を使用
して取り除かれ、残存一本鎖プラスミドは、シークエナーゼ（Sequenase）（Ame
rsham,Arlington Hills, IL）を用いて二重鎖分子へ変換され、そしてプラスミ
ドＤＮＡは、形質転換の前に−２０℃に 保管された。標準化プラスミドライブ
ラリーの等分量は、中程度の密度にプレートされた大腸菌（ＸＬ１ｂｌｕｅ又は
ＤＨ１０Ｂ）を形質転換するために使用され、コロニーはキュウボットロボット
（Qbot robot）（Genetix, Christchurch, UK）を使用した細菌成長培地を含む
３８４-ウェルマスタープレートへ摘み取り入れられた。クローンは、２４時間
、３７℃で生育され、そしてマスタープレートは−８０℃で 保存のために凍結
された。標準化ライブラリーよりシーケンシングのために精選されたコロニーの
総数は、２４００００であった。マスタープレートは、シーケンシング反応のテ
ンプレートとして使用するＤＮＡの生育と調製の為に、培地を接種するのに使用
された。反応は、最初に、ｃＤＮＡ挿入部の５'末端から開始するプライマーに
よって実行される。しかし、数パーセントのクローンは、やはり３' 末端からシ
ーケンスされる。クローンは、さらなる生物学的興味又は以下に論じる連続配列
（「contigs」）の集合を伸張できるクローンの選択、のいずれかに基づく３'末
端のために選択された。ＤＮＡシーケンシングは、ＡＢＩ３７７自動化シーケン
サーを使用して実行され、そしてＡＢＩＦＳ、ジローダミン（dirhodamine）又
はBigDyeケミストリー（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）のいず
れかを使用した。
【００６３】 配列の分析は，次のようになされた：自動化配列によって生じた形跡は、プロ
グラム「Ｐｈｒｅｄ」（Gordon, Genome Res. (1998)8:195-202）を使用した塩
基着呼であり、さらに質的価値を各塩基へ割り当てた。生成配列は、割り当てら
れたスコアの見地から、質のために切り取られた。ベクター配列も同じく取り除
かれた。各配列は、１００％近い同一性の領域を同定するためのＢＬＡＳＴプロ
グラム及びフィルターを使用して、全ての他のＥＳＴ配列と比較された。重なり
の可能性のある配列は、プログラム「Ｐｈｒａｐ」、「Ｐｈｒｅｄ」及び「Ｃｏ
ｎｓｅｄ」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington; h
ttp://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html）を使用して連続配
列（contigs）へ組み立てられた。この生成組み立て物は、そして既存の公的デ
ーターベースと比較され、次に既知のタンパク質との相同性は、コンセンサス配
列の翻訳を方向づけるために使用された。ＢＬＡＳＴによる相同性が得られない
場合は、コドンとヘキサヌクレオチド優先度に基づく統計的に最も可能性のある
翻訳が使用された。タンパク質ドメインのＰｆａｍ（Bateman等, Nucleic Acids
Res. (1999) 27:260-262）及びＰｒｏｓｉｔｅ（Hofmann等, Nucleic Acids Re
s. (1999) 27(1):215-219）の収集物は、翻訳産物のモチーフの同定に使用され
た。連続配列は、Ｏｒａｃｌｅ-ベースリレーショナルデーターベース（FlyTag(
商標), Exelixis Pharmaceuticals, Inc., South San Francisco, CA）に保存さ
れた。
【００６４】 実施例２：他のｃＤＮＡライブラリー レプチノターサ（Leptinotarsa）（コロラドポテトカブト虫）ライブラリーは
、ストラタジーン（Stratagene）のLambda ZAPcDNAクローニングキット（Strata
gene, La Jolla, CA, カタログ番号２００４５０）を使用し、製品手順書に従っ
て調製された。ライブラリーの構築のための最初のｃＤＮＡは、混合期（mixed
stage）の幼生レプチノターサ（Leptinotarsa）のｍＲＮＡを使用してオリゴ-ｄ
ｔプライム化された。 トリボリウム（Tribolium）ライブラリーは、pSPORT cDNAライブラリー構築シ
ステム（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を使用し、製品手順書に従っ
て作製された。ライブラリーの構築のために使用した最初のｃＤＮＡは、成体ト
リボリウム（Tribolium）ｍＲＮＡを使用してオリゴ-ｄｔプライム化された。
【００６５】 実施例３：ショウジョウバエ(ＤＭｐ５３）のｐ５３核酸のクローニング ＴＢＬＡＳＴＩＮプログラム（Altschulら，上掲）が、Fly Tag（商標）デー
ターベースへヤリイカｐ５３タンパク質配列（GenBank gi:1244762）の真偽を問
うために使用され、イカｐ５３タンパク質は、以前、無脊椎動物から同定された
ｐ５３ファミリーのたった二つのメンバーのうちの一つだから選ばれた。結果は
、単一配列コンティグを明らかにし、それは９６０ｂｐの長さ及びイカｐ５３（
スコア＝１９２、Ｐ＝５．１ｘ１０−１２ ）に対してかなり顕著な相同性を示
した。さらなるＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列に対するＢＬＡＳＴＸプログラム
を用いたこの配列の分析は、このコンディグは、脊椎動物のｐ５３-様配列の全
ての既知のファミリーに対して顕著な相同性を示し、基本的に全てのＤＮＡ結合
ドメインを包含するｐ５３ファミリーに対するコード化配列相同体を含み、それ
はｐ５３タンパク質ファミリーの最も保存された領域である。このコンディグの
検査は、それが、ｍＲＮＡの３'非翻訳領域はもとより推定上のＤＮＡ結合ドメ
インに対してＣ-末端のコード化領域を欠いている、不完全なｃＤＮＡであるこ
とを示した。 全長ｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡ末端のラピッドアンプリフィケーションに
よって作製された（RACE; Frohman等, PNAS (1988) 85:8998-9002）。ＲＡＣＥ-
レディーライブラリーは、クローンテックマラソンcDNA増幅キット（Cat＃K1802
）を使用し、製品の手順書に従って、クローンテック（Palo Alto, CA）ショウ
ジョウバエ幼虫ポリＡ＋ＲＮＡ（Ca＃694-1）から作製された。以下のプライマ
ーを、全長クローンを回収するためにライブラリーにおいて使用された： 3'373 CCATGCTGAAGCAATAACCACCGATG 配列番号：１１ 3'510 GGAACACACGCAAATTAAGTGGTTGGATGG 配列番号：１２ 3'566 TGATTTTGACAGCGGACCACGGG 配列番号：１３ 3'799 GGAAGTTTCTTTTCGCCCGATACACGAG 配列番号：１４ 5'164 GGCACAAAGAAAGCACTGATTCCGAGG 配列番号：１５ 5'300 GGAATCTGATGCAGTTCAGCCAGCAATC 配列番号：１６ 5'932 GGATCGCATCCAAGACGAACGCC 配列番号：１７
【００６６】 ショウジョウバエのｐ５３ｃＤＮＡの付加的５'及び３'配列を得るためのＲＡ
ＣＥ反応は，以下のように行われた。各ＲＡＣＥ反応は、４０μｌのＨ２Ｏ、５
μｌの１０ＸAdvantage PCR buffer（クローンテック）、１μｌの１０μＭ 特
異的ｐ５３ＲＡＣＥプライマー, 1μlの１０μＭ ＡＰ１プライマー（クローン
テックマラソンキット）、１μｌのｃＤＮＡ、１μｌの５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μ
ｌのAdvantage ＤＮＡポリメラーゼ（クローンテック）を含んだ。５'のＲＡＣ
Ｅのために、反応は、３'３７３，３'５１０，３'５６６，又は３'７９９プライ
マーの何れかを含んだ。３'のＲＡＣＥのために、反応は、５'１６４，又は５'
３００プライマーの何れかを含んだ。反応混合物は、以下のタッチダウンＰＣＲ
のサーモサイクリングプログラム段階にさらされた：（１）９４℃を１分、（２
）９４℃を０．５分、（３）７２℃を４分、（４）段階２-３を４回繰り返す、
（５）９４℃を０．５分、（６）７０℃を４分、（７）段階５-６を４回繰り返
す、（８）９４℃を０．３３分、（９）６８℃を４分、（１０）段階８-９を２
４回繰り返す、（１１）６８℃を４分、（１２）４℃に止まる。 ＲＡＣＥ反応の産物は、ゲル電気泳動によって分析された。以下のサイズの個
々のＤＮＡ種が、以下の各プライマーによって作製されたＲＡＣＥ産物の中に見
出された：３'３７３、およそ４００ｂｐ；３'５１０、およそ５５０ｂｐ、３'
５６６、およそ６００ｂｐ；３'７９９、およそ８５０ｂｐ；５'１６４、およそ
１４００ｂｐ、５'３００およそ１３００ｂｐ。ＲＡＣＥ ＤＮＡ産物はＴＯＰＯ
ＴＡクローニングキットを使用し（Invtrogen Corp., Carlsbad, California）
、製品手順書に従って直接にベクターｐＣＲ２．１へクローンされた。形質転換
された大腸菌のコロニーは、各作製物、及びＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ ２０ ｋｉｔ
（QIAGEN, Valencia, California）を使用して調製されたプラスミドＤＮＡのた
めに選び出された。各クローン内のＲＡＣＥｃＤＮＡ挿入部の配列は、ＢｉｇＤ
ｙｅシーケンシング試薬（Applied Biosystems, Inc. Foster City, California
）の標準手順書、及びＭ１３リバース又はフランギングベクター配列からのプラ
イミングのためのＢｉｇＴ７プライマーの何れか、或いはショウジョウバエのｐ
５３ｃＤＮＡ配列からの内部からのプライミングの為の５'９３２又は３'３７３
プライマー（上記に記載）、を使用して決定される。産物は、ＡＢＩ３７７ＤＮ
Ａシーケンサーを使用して分析された。配列は、Sequencherプログラム（Gene C
odes Corporation）を使用してコンディグへと組み立てられ、３８５個のアミノ
酸の予測タンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、
このタンパク質は、好意的に３６３から３９６個のアミノ酸の長さが知られた脊
椎動物ｐ５３タンパク質と比較された（Soussi等, Oncogene (1990) 5:945-952
）。予測ショウジョウバエのｐ５３タンパク質のＢＬＡＳＴＰ相同性検索プログ
ラム及びGenBank databaseを使用した分析は、全ての既知のｐ５３関連タンパク
質ファミリーと顕著な相同性を示すが、他のタンパク質ファミリーと顕著な相同
性を示さないことから、このタンパク質がｐ５３ファミリーのメンバーであるこ
とを確かにした。
【００６７】 実施例４：他の昆虫からのｐ５３核酸配列のクローニング ｐ５３核酸配列のクローニングに用いたＰＣＲ条件は９４℃、５分；続いての
９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分の３５サイクル；そして７２℃１０分の最
後の延長の変性工程であった。全てのＤＮＡ配列化反応はBigDye配列化試薬（Ap
plied Biosystems, Inc.）の標準的なプロトコルを使用して実施し、生成物をＡ
ＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーを使用して分析した。ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケ
ンサーから得たトレースデータを分析しPhred-Phrapプログラムを用いてコンテ
ィグを構築した。 ＤＭｐ５３ＤＮＡ及びタンパク質配列を、BLASTコンピュータプログラムを使
用してTribolium、Leptinotarsa、及びHeliothisｃＤＮＡライブラリから配列を
クエリーするのに使用し、その結果、ｐ５３関連配列をコードしているかもしれ
ない幾つかの候補ｃＤＮＡクローンが明らかになった。各候補ｐ５３ｃＤＮＡク
ローンに対して、よく分離された単一のコロニーをプレートに画線し、末端配列
決定をしてクローンを確認した。単一のコロニーを取り上げ、Qiagen REAL Prep
s (Qiagen, Inc., Valencia, CA)を使用して精製した。ついで、試料を適当な酵
素で消化させて、ベクターから挿入物を切除し、サイズを決定した。例えば、ベ
クターpOT2（www.fruitfly.org/EST/pOT2vector.html）はXho1/EcoRIで切除する
ことができ；又はpBluescript（Stratagene）はBssH IIで切除することができる
。ついで、プライマー歩行及びインビトロトランスポゾンタッギング法の組み合
わせを使用して配列決定した。
【００６８】 プライマー歩行にはPrimer-３ソフトウェア（Steve Rozen, Helen J. Skalets
ky (1998) Primer3. Codeで、http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/
other/primer3.htmlで入手可能）を用いてクローン中の既知のＤＮＡ配列に対し
てプライマーを設計した。ついで、これらのプライマーを配列化反応において使
用して、挿入物の全配列が決まるまで配列を伸展させた。 ＧＰＳ-１ Genome Priming Systemインビトロトランスポゾンキット（New Eng
land Biolabs, Inc., Beverly, MA）を、製造者のプロトコルに従って、トラン
スポゾンベース配列化のために使用した。簡単に言えば、無作為に散らばったプ
ライマー結合部位を持つ複数のＤＮＡ鋳型を作成した。これらのクローンは、２
４コロニー／クローンをQiagen REAL Prep中に取り込んでＤＮＡを精製すること
により調製し、供給されたプライマーを使用して配列決定して、トランスポゾン
挿入の両末端から双方向的に配列化を実施した。 ついで、配列をPhred／Phrapを使用して構築し、Consedを使用して解析した。
配列中の多義性は幾つかのクローンを再配列化することにより解決した。この努
力の結果、幾つかの近接ヌクレオチド配列を得た。Leptinotarsaに対しては、コ
ンティグは２６０１の塩基長から構築され、３５３のアミノ酸の予想タンパク質
をコードしている１０５９のヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）を包含していた。ＯＲＦは配列番号：３の塩基１２１−１１８０まで伸び
る。Triboliumでは、コンティグは１２９２の塩基長から構築され、配列番号：
５の塩基９５−１１４５まで伸び、３５０のアミノ酸の予想タンパク質をコード
している１０５０のヌクレオチドのＯＲＦを包含していた。他の候補Tribolium
ｐ５３クローンの解析もまた５０９塩基長の第２のコンティグを作成し、５０９
のヌクレオチドの部分ＯＲＦを包含し（配列番号：７）、１７０のアミノ酸の部
分タンパク質をコードしている。Heliothisでは、コンティグは４３４の塩基長
から構築され、４３４のヌクレオチドの部分ＯＲＦを包含し（配列番号：９）、
１４５のアミノ酸の部分タンパク質をコードしている。
【００６９】 実施例５：ＤＭｐ５３のノーザンブロット分析 標準的な方法を使用するノーザンブロット分析を、３つの異なったポリ(A)＋
ｍＲＮＡ調製物、０−１２ｈ胚、１２−２４ｈ胚及び成体を用いて実施し、それ
をサイズ標準に沿ってアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜にブロットした。
全ショウジョウバエｐ５３コード領域を含むＤＮＡ断片をHincII消化により切除
し、アガロースゲルでの電気泳動により分離し、ゲルから抽出し、Rediprime標
識システム（Amersham, Piscataway, NJ）を使用するランダムプライミングによ
って３２Ｐ標識した。ｍＲＮＡブロットへの標識プローブのハイブリダイゼーシ
ョンを終夜実施した。高緊縮性（0.2x SSC/0.1% SDS, 65℃）にて洗浄し、プロ
ーブに特異的にハイブリダイズしたｍＲＮＡ種をＸ線フィルムを使用するオート
ラジオグラフィーにより検出した。結果は、３種全てのｍＲＮＡ源においておよ
そ１．６キロベースの単一のクロスハイブリダイズｍＲＮＡ種を示した。このデ
ータは上述の５'及び３'ＲＡＣＥ産物の観察されたサイズと一致していた。
【００７０】 実施例６：ＤＭｐ５３遺伝子の細胞遺伝学的マッピング 任意の実存するショウジョウバエ突然変異がＤＭｐ５３遺伝子の突然変異に相
当するかどうかを決定するために、並びにこの遺伝子内での新しい突然変異を走
査するために、ＤＭｐ５３遺伝子のマップ位置を特定することは興味深い。ＤＭ
ｐ５３遺伝子の細胞遺伝学的位置は以下に概説するプロトコル（工程Ａ-Ｃ）に
従って、多糸染色体へのインサイツハイブリダイゼーション（Pardue, Meth Cel
l Biol (1994) 44:333-351）により決定した。 （Ａ）多糸染色体押しつぶし標本の調製：切除した唾液腺を４５％の酢酸の液
滴中に入れた。唾液腺を乳酸：水：酢酸の１：２：３混合物の液滴に移した。つ
いで、唾液腺をカバーガラスとスライドの間に押しつぶし、４℃で終夜インキュ
ベートした。押しつぶし試料を液体Ｎ２中で凍らして、カバーガラスを取り除い
た。ついで、スライドを７０％のエタノール中に１０分間直ぐに浸漬し、ついで
空気乾燥させた。ついでスライドを２ｘＳＳＣバッファー中にて３０分間６８℃
で熱処理した。ついで、押しつぶし試料を７０％エタノールで１０分間、続いて
９５％エタノールで５分間処理して脱水した。 （Ｂ）ビオチン化ハイブリダイゼーションプローブの調製：溶液を、５０μｌ
の１Ｍトシス-ＨＣｌ ｐＨ７．５、６．３５μｌの１ＭのＭｇＣｌ２、０．８５
μｌのβ-メルカプトエタノール、０．６２５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ、０
．６２５μｌの１００ｍＭのｄＣＴＰ、０．６２５μｌの１００ｍＭのｄＧＴＰ
、１２５μｌの２ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ６．６、及び７５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ
のｐｄ(Ｎ)６（Pharmacia, Kalamazoo, MI）を混合することにより調製した。１
０μｌのこの溶液をついで２μｌの１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、急速な
煮沸により変性させた（０．５μｇ）ＤＭｐ５３ｃＤＮＡ断片を含む３３μｌ、
５μｌの１ｍＭビオチン-１６-ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN）、及び１μｌのクレノーＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ）（Boehringer Mannhe
im）と混合した。混合物を室温で終夜インキュベートし、ついで次の成分を添加
した：１μｌの１ｍｇ／ｍｌの超音波処理変性サケ精液ＤＮＡ、５．５μｌの３
Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２及び１５０μｌのエタノール（１００％）。混合後
に溶液を１−２時間−７０℃で保存した。ＤＮＡ沈殿物をマイクロ遠心分離機で
の遠心分離により収集し、ペレットを７０％エタノール中で一度洗浄し、真空乾
燥させ、５０μｌのＴＥバッファーに溶解し、−２０℃で貯蔵した。
【００７１】 （Ｃ）ハイブリダイゼーションと染色は次のようにして実施した：ハイブリダ
イゼーション液（１１２．５μｌのホルムアミド；２５μｌの２０ｘＳＳＣ、ｐ
Ｈ７．０；５０μｌの５０％デキストラン流酸；６２．５μｌの蒸留Ｈ２Ｏ）に
添加した２０μｌのプローブを押しつぶし試料上に置いた。カバーガラス（２２
ｍｍ２）を押しつぶし試料上に配して、ゴム接着剤で密封し、４２℃で終夜気密
の湿室に配した。ゴム接着剤を剥がして除去し、３７℃にて２ｘＳＳＣバッファ
ー中でカバーガラスを除去した。スライドをそれぞれ２ｘＳＳＣバッファー中で
３７℃にて１５分で２回洗浄した。ついでスライドをそれぞれＰＢＳバッファー
中で室温にて１５分で２回洗浄した。次の「エリート(Elite)」溶液の混合物を
、１ｍｌのＰＢＴバッファー（０．１％Tween２０を含むＰＢＳバッファー）、
１０μｌのベクタステインＡ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）及び１
０μｌのベクタステインＢ（Vector Laboratories）を混合して調製した。つい
で混合物を３０分インキュベートした。５０μｌのエリート溶液をスライドに加
え、ついで水分を切った。７５μｌのエリート溶液をスライドに添加し、カバー
ガラスをスライドに配した。スライドを湿室において１．５−２時間３７℃にて
インキュベートした。ついでカバーガラスをＰＢＳバッファー中に取り除き、ス
ライドをそれぞれＰＢＳバッファー中で１０分間で２回洗浄した。 ＰＢＴバッファーにＤＡＢ（ジアミノベンジジン）を入れた新鮮な溶液を、１
μｌの０．３％過酸化水素を４０μｌの０．５ｍｇ／ｍｌＤＡＢ溶液と混合する
ことにより調製した。ついで、４０μｌのＤＡＢ／過酸化物溶液を画スライドに
配した。カバーガラスをスライドに配し、２分インキュベートした。ついで、ス
ライドを位相差顕微鏡で調べ、シグナルが十分であると決定されたときに、ＰＢ
Ｓバッファー中で反応を停止させた。ついで、スライドを１０分間流れるＨ２Ｏ
で洗浄し、空気乾燥させた。最後に、スライドを複合顕微鏡によって検査し、ハ
イブリダイゼーションシグナルに染色体位置をあてがった。ハイブリダイゼーシ
ョンの一つの明確な領域が、細胞遺伝帯域９４Ｄ２−６に割り当てられた多糸染
色体押しつぶし試料上に観察された。
【００７２】 実施例７：ＤＭｐ５３遺伝子のゲノムクローンの単離と配列解析 ＰＣＲを用いてＤＭｐ５３遺伝子を含むゲノムクローンの同定のためのＤＮＡ
プローブを生成した。各反応（全容量５０μｌ）は１００ｎｇのショウジョウバ
エゲノムＤＮＡ、それぞれ２．５μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２
μＭの各プライマー、及び１μｌのTAKARAexTaq DNAポリメラーゼ（Pan Vera Co
rp., Madison, WI）を含んでいた。反応はプライマー対５'１６４及び３'５１０
（上述）で始められ、使用された熱サイクル条件は次の通りであった（ここで、
０：００は分：秒で時間を示す）：９４℃の初期変性、２：００；次に９４℃、
０：３０、５８℃、０：３０、６８℃、４：００の１０サイクル；次に９４℃、
０：３０、５５℃、０：３０、６８℃、４：００＋サイクルあたり０：２０の２
０サイクル。ついで、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、ニッ
クトランスレーションにより３２Ｐ標識し、Berkeley Drosophila Genome Proje
ct (University of California, Berkeley, 及びGenome Systems, Inc., St.Lo
ius, MOより購入)からの高密度配列Ｐ１クローンを含むナイロン膜にハイブリダ
イズさせた。４つの陽性のＰ１クローン：ＤＳ０１２０１、ＤＳ０２９４２、Ｄ
Ｓ０５１０及びＤＳ０６２５４を同定し、各クローンを上述のプライマー対での
ＰＣＲアッセイを使用して確認した。配列決定のためのＤＮＡを調製するために
、各Ｐ１クローンを含む大腸菌を２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天プ
レート上で単一コロニーに画線し、３７℃で終夜成長させた。各Ｐ１クローンに
対してよく分離したコロニーを取り上げ、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む
２５０ｍｌのＬＢ培地に播種するのに使用し、培養物を振りながら３７℃で１６
時間成長させた。遠心分離により細菌細胞を収集し、Qiagen Maxi-Prep System
キット（QIAGEN, Inc., Valencia, Califormia）でＤＮＡを精製した。Ｐ１クロ
ーンＤＮＡｓから誘導した小挿入プラスミドＤＮＡライブラリーのショットガン
及び定方向配列決定を組み合わせた方策を使用してＰ１クローンからゲノムＤＮ
Ａ配列を得た（Ruddy等, Genome Research (1997) 7:441-456）。全てのＤＮＡ
配列決定と解析は上述した用にして実施し、Ｐ１配列コンティグを、ＤＭｐ５３
遺伝子又は他のコード領域を含むものを同定するためのBLAST配列相同性サーチ
プログラムを使用して解析した。この解析により、ＤＭｐ５３遺伝子が８のエキ
ソンと７のイントロンに分割されていることが証明された。また、BLAST解析に
より、ＤＭｐ５３遺伝子に隣接する二つの更なる遺伝子の存在が示された；一つ
は腎障害シスチン蓄積症に関連するヒト遺伝子と相同性を示し（標識されたＣＴ
ＮＳ様遺伝子）、第２の遺伝子はオキシドレダクターゼの大きなファミリーと相
同性を示した。よって、我々は、推定ＣＴＮＳ様及びオキシドレダクターゼ様遺
伝子の間に存在するＤＮＡ領域に対応して、８８０５ｂｐとＤＭｐ５３遺伝子の
限界を操作的に定義する。
【００７３】 実施例８：ｐ５３核酸配列の解析 クローニングの完了時にPfam及びPrositeプログラムを使用し、他のｐ５３配
列との比較と目での分析により配列を解析した。配列番号：１−６の様々なドメ
インをコードしているｃＤＮＡの領域は上記の表Ｉに示している。また、Pfamは
、ヌクレオチド３５４−４９５（配列番号：７）によりコードされたアミノ酸残
基１１８−１６５（配列番号：８）に部分的ＴＲＩＢ-Ｂｐ５３に対して、ヌク
レオチド３１５−４１４（配列番号：９）によりコードされたアミノ酸残基１０
５−１３８（配列番号：１０）に部分的HELIOｐ５３に対してｐ５３類似性領域
を予想した。 ｐ５３核酸配列の各々とそのコード化タンパク質に対してヌクレオチド及びア
ミノ酸配列を、BLAST（上掲のAltschul等）を使用して、公的データベースの全
ての入手可能なヌクレオチドとアミノ酸配列に対してサーチした。以下の表２−
６はその結果をまとめたものである。５つの最も類似した配列が各ｐ５３遺伝子
に対して列挙されている。
【００７４】 発表された配列に対して新規の最も短い近接アミノ酸としてアミノ酸残基の数
を見いだすためのｐ５３アミノ酸配列の各々を使用したBLAST解析は、次のもの
を示している：ＤＭｐ５３及びＴＲＩＢ-Ａｐ５３に対する７つのアミノ酸残基
、ＣＰＢｐ５３に対する６つのアミノ酸残基、及びＴＲＩＢ-Ｂｐ５３及びＨＥ
ＬＩＯｐ５３に対する５つのアミノ酸残基。 公的データベース内に１００％配列類似性を共有する配列が含まれていない最
も短い伸展の近接アミノ酸としてアミノ酸残基の数を見いだすためのｐ５３アミ
ノ酸配列の各々に対するBLASTの結果は、次のものを示している：ＤＭｐ５３、
ＣＰＢｐ５３、ＴＲＩＢ-Ａｐ５３及びＴＲＩＢ-Ｂｐ５３に対する９つのアミノ
酸残基と、ＨＥＬＩＯｐ５３に対する６つのアミノ酸残基。
【００７５】 実施例９：ショウジョウバエ遺伝学 ハエの培養と交雑を２２−２５℃にて標準的な手順に従って実施した（上掲の
Ashburner）。Ｇ１-ＤＭｐ５３過剰発現作成物を最小熱ショックプロモーターの
上流にglass多重レピートを含むBcIIをクローニングすることにより作成した。p
ExPressベクターは、タンパク質の安定化の増加のためのαチューブリン３'ＵＴ
Ｒと変更された多重クローニング部位を含むＰＧＭＲベクターの適応化形態であ
る（Hay等, Development (1994) 120:2121-2129）。標準的なＰ因子媒介生殖系
列形質転換を使用して、これらの作成物を含むトランスジェニック株を産生した
（上掲のRubin及びSpradling）。Ｘ線照射事件では、バイアル中の３齢の幼虫を
FaxitronＸ線キャビネットシステム（Wheeling, IL）を使用して４０００ラドの
Ｘ線に暴露した。
【００７６】 実施例１０：ホールマウントＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション、ＴＵＮ
ＥＬ及び免疫細胞化学 インサイツハイブリダイゼーションを標準的な方法を使用して実施した（Taut
z及びPfeifle, Chromosoma (1989)98:81-85）。ＤＭｐ５３アンチセンスＲＮＡ
プローブをEcoR1でＤＭｐ５３ｃＤＮＡを消化させ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで
転写することにより産生した。免疫細胞化学に対しては、３齢の幼虫の目と羽デ
ィスクをＰＢＳ中で切除し、２％のホルムアルデヒドに室温で３０分固定し、Ｐ
ＢＳ＋０．５％トリトン中で透過化し、ＰＢＳ＋５％ヤギ血清で阻止し、一次抗
体と共に室温で２時間又は４℃で終夜インキュベートした。抗ホスホ-ヒストン
染色には１：５００の希釈で抗ホスホ-ヒストンＨ３Mitosis Marker（Upstate B
iotechnology, Lake Placid, NY）を用いた。抗ＤＭｐ５３モノクローナル抗体
染色には１：２に希釈したハイブリドーマ上清を使用した。ＦＩＴＣ又はテキサ
スレッドに結合させたヤギ抗マウス又は抗ウサギ二次抗体（Jackson Immunorese
arch, West Grove, PA）が１：２００の希釈で使用された。抗体はＰＢＳ＋５％
ヤギ血清中に希釈した。ＴＵＮＥＬアッセイは、０．５％トリトン／ＰＢＳ透過
化工程と共に製造者のプロトコルに従ってApotag Directキット（Oncor, Gaithe
rsburg, MD）を使用して実施した。ディスクは抗フェード(fade)試薬（Molecula
r Probes, Eugene, OR）に取り付け、ライカ共焦点顕微鏡でイメージを得た。Ｂ
ｒＤＵ染色を記載されているようにして（de Nooij等, Cell. (1996)87(7):1237
-1247）実施して、Axioplan顕微鏡（Zeiss, Thornwood, NY）でイメージを得た
。
【００７７】 実施例１１：抗ＤＭｐ５３抗体の産生 抗ＤＭｐ５３ウサギポリクローナル（Josman Labs, Napa, CA）及びマウスモ
ノクローナル抗体（Antibody Solutions Inc., Palo Alto, CA）を、抗原として
グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼに融合した全長ＤＭｐ５３タンパク質（Ｇ
ＳＴ-ＤＭｐ５３）を使用して標準的な方法によって産生した。ＧＳＴ-ＤＭｐ５
３の封入体をＢ-ＰＥＲバッファー（Pierce, Rockford, IL）を使用して遠心分
離により精製し、免疫化のためにウサギとマウスに皮下注射した。マウスモノク
ローナル抗体の生産のための最終の追加免疫には、６ＭのＧｕＨＣｌへのＧＳＴ
-ＤＭｐ５３の可溶化と１ＭのＮａＣｌを含むリン酸バッファー中への透析によ
り得られた可溶性ＧＳＴ-ＤＭｐ５３の静脈内注射を用いた。ハイブルドーマ上
清を、Ｎｉ-ＮＴＡコートプレートに結合した可溶性６ＸＨＩＳ-タギングＤＭｐ
５３タンパク質（Qiagen, Valencia, CA）と抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片特異的二
次抗体を用いてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【００７８】 実施例１２：機能分析 この一連の実験の目標は昆虫ｐ５３の機能をヒトｐ５３のものと比較し対照す
ることであった。ＤＭｐ５３をこの一連の実験を実施するために選択したが、他
の昆虫ｐ５３の何れもまた用いることができる。 細胞死経路へのｐ５３の関与 ＤＭｐ５３がヒトｐ５３とインビボで同じく脳を呈することができるかどうか
を決定するために、ＤＭｐ５３を、glass応答性エンハンサー因子を使用してシ
ョウジョウバエの幼虫の目のディスクに異所的に発現させた。glass-ＤＭｐ５３
（gl-ＤＭｐ５３）導入遺伝子は形態形成溝の後ろの全ての細胞にＤＭｐ５３を
発現する。目の発達の間、形態形成溝は目のディスクの後ろから前まで通過する
。よって、gl-ＤＭｐ５３幼虫は幼虫の発育の間に目のディスクの後ろから前に
広がる細胞のフィールドにＤＭｐ５３を発現する。 gl-ＤＭｐ５３導入遺伝子を有する成虫ハエは生存可能であったが、融合した
個眼（複眼の多くの要素の何れか）を持つ小さく粗い目を持っていた。gl-ＤＭ
ｐ５３眼ディスクのＴＵＮＥＬ染色は、このフェノタイプが少なくとも部分的に
はＤＭｐ５３を発現する細胞の広範なアポトーシスによるものであったことを示
している。結果は、アクリジンオレンジとナイルブルーでのアポトーシス細胞の
検出により確認された。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は溝の１５−２５細胞直径内に現れ
た。溝が１時間におよそ１０細胞直径移動するとすると、これは、ＤＭｐ５３が
発現された後２−３時間でアポトーシスになることを示している。驚いたことに
、バキュロウイルス細胞死阻害剤ｐ３５の同時発現はＤＭｐ５３により誘発され
る細胞死を阻止しなかった（Miller, J Cell Physiol (1997) 173(2):178-182;O
htsubo等, Nippon Rinsho (1996)54(7):1907-1911）。しかし、gl-ＤＭｐ５３ハ
エにおけるＤＭｐ５３誘発アポトーシスと粗い眼のフェノタイプはヒトサイクリ
ン依存性キナーゼインヒビターｐ２１の同時発現により抑制される。ｐ２１の過
剰発現は細胞分裂周期のＧ１相の細胞を阻止するので、この知見は細胞周期の通
過が細胞をＤＭｐ５３誘発アポトーシスに感作させることを示唆している。ヒト
ｐ５３誘発アポトーシスに対するｐ２１箇条発現の同様の効果が記載されている
。
【００７９】 細胞分裂周期へのｐ５３の関与 細胞死経路に影響を及ぼすその能力に加えて、哺乳動物のｐ５３はＧ１及びＧ
２／Ｍチェックポイントで細胞分裂周期の停止を誘発可能である。ショウジョウ
バエの眼のディスクでは、分裂波は形態形成溝の後の細胞分割の同期した最終波
である。この発達の独特の側面は細胞に対するＤＭｐ５３の同様の効果に対する
アッセイ手段を提供する。Ｇ１からＳ相への細胞の移行はＢｒｄＵ取り込みによ
り検出することができる。野生型３齢幼虫から切除した眼のディスクは第二の分
裂波の細胞におけるＤＮＡ複製に対応するＢｒｄＵ染色細胞の密な帯域を示して
いた。Ｇ１からＳ相へのこの移行はgl-ＤＭｐ５３導入遺伝子からのＤＭｐ５３
の過剰発現により影響を受けなかった。対照的に、ヒトｐ２１又はショウジョウ
バエ騒動対decapo（de Nooij等, Cell (1996)87(7):1237-1247;Lane等, Cell (1
996) 87(7):1225-1235）の発現は、glass応答性エンハンサー因子の制御下にお
いて第２の分裂波におけるＤＮＡ複製を完全に阻止した。哺乳動物細胞では、ｐ
５３は２１遺伝子の転写活性化を通じてＧ１における細胞周期の阻止を誘発する
。これらの結果は、この機能がＤＭｐ５３において保存されていないことを示唆
している。 野生型の眼のディスクでは、第２の分裂波が典型的には抗ホスホ-ヒストン抗
体での染色する細胞の明確な帯域を形成する。gl-ＤＭｐ５３幼虫の眼のディス
クでは、この細胞の帯域は顕著に広く、より拡散しており、ＤＭｐ５３がＭ相へ
の入り及び／又は期間を変更することが示唆される。
【００８０】 ＤＮＡ損傷に対するｐ５３の応答 次の実験は、ＤＮＡ損傷に応答してＤＭｐ５３機能の喪失がアポトーシス又は
細胞周期停止に影響を与えたかどうかを決定するために実施した。 ＤＭｐ５３機能を欠く組織のフェノタイプを調べるために、ＤＭｐ５３のドミ
ナントネガティブな対立遺伝子を作成した。これらの突然変異はヒトｐ５３にお
けるＲ１７５Ｈ（ＤＭｐ５３のＲ１５５Ｈ）及びＨ１７９Ｎ（ＤＭｐ５３のＨ１
５９Ｎ）突然変異に類似している。ヒトｐ５３におけるこれらの突然変異は、お
そらくはそれらがＤＮＡに結合できないが機能的な四量体化ドメインを保持して
いるのでドミナントネガティブな対立遺伝子として作用する。野生型ＤＭｐ５３
と一緒のＤＭｐ５３Ｒ１５５Ｈの同時発現は野生型ＤＭｐ５３過剰発現から通常
生じる粗い眼のフェノタイプを抑制しており、これはこの突然変異体がインビボ
においてドミナントネガティブな対立遺伝子として作用することを確認している
。野生型ＤＭｐ５３とは異なり、glassエンハンサーを用いるＤＭｐ５３ Ｒ１５
５Ｈ又はＨ１５９Ｎの過剰発現は、走査型電子顕微鏡により眼の剛毛の微妙な変
化が明らかにされたけれども、目に見えるフェノタイプを作り出さなかった。 哺乳動物系では、ｐ５３誘発アポトーシスが損傷を受けたＤＮＡの伝播を防止
するのに重要な役割を担っている。ＤＮＡ損傷はまたショウジョウバエにおいて
アポトーシスに導く。この応答がＤＭｐ５３の作用を必要とするかどうかを決定
するために、羽のディスクの後の区画にドミナントネガティブなＤＭｐ５３を発
現させた。Ｘ線照射に続いて、羽のディスクを切除した。ＴＵＮＥＬ染色により
アポトーシス細胞が明らかになり、抗ＤＭｐ５３抗体によりドミナントネガティ
ブなＤＭｐ５３の発現パターンが明らかになった。Ｘ線照射後４時間で、野生型
の３齢幼虫の羽ディスクは広範なアポトーシスを示した。羽のディスクの後の区
画にドミナントネガティブなＤＭｐ５３を発現させられたとき、アポトーシスは
ＤＭｐ５３を発現する細胞では阻止された。よって、Ｘ線照射に続くアポトーシ
スの誘発にはＤＭｐ５３の機能を必要とする。このＤＭｐ５３のアポトーシス促
進の役割は、眼と他の組織において発生的にプログラムされた細胞死はドミナン
トネガティブなＤＭｐ５３対立遺伝子の何れかの発現によっても影響を受けない
ので、細胞性損傷に対する特異的な応答に限られているようである。Ｘ線照射に
対するアポトーシス応答におけるＤＭｐ５３に対する要求は、ＤＭｐ５３がＤＮ
Ａ損傷により活性化されうることを示唆している。哺乳動物では、ｐ５３は主に
ｐ５３タンパク質の安定化により活性化される。
【００８１】 ＤＭｐ５３機能はＸ線誘発アポトーシスには必要とされるが、同じ量の照射に
よって誘発される細胞分裂周期の停止には必要であるとは思われない。照射のな
い場合には、分裂の無作為パターンがショウジョウバエの３齢の羽ディスクで観
察された。照射時に、細胞周期阻止が、抗ホスホ-ヒストン染色の有意な減少に
よって証明されるように野生型ディスク内で生じた。細胞分裂周期阻止は羽のデ
ィスクの後におけるドミナントネガティブなＤＭｐ５３の発現によっては影響を
受けなかった。Ｘ戦照射後の幾つかの時点を調べたが、全てが同様な結果を与え
、Ｘ線誘発細胞分裂周期停止の開始と維持がＤＭｐ５３に依存しないことを示唆
している。 正常な発達におけるｐ５３ マウス中のｐ５３と同様に、ショウジョウバエにおけるドミナントネガティブ
なＤＭｐ５３の広範な発現が外観、生存性、又は繁殖性に有意な影響を持たない
ので、ＤＭｐ５３は発達に必要とされないように思われる。興味深いことに、発
達中の胚のインサイツハイブリダイゼーションは、後の胚性段階で始原的な生殖
系列に限られるようになった広範な早期の胚性発現を明らかにした。この発現パ
ターンは、催奇形因子に対する保護における哺乳動物のｐ５３の提案された役割
と同様に、生殖系列を保護するＤＭｐ５３の重要な役割を示している。
【００８２】 実施例１３：細胞培養物中でのｐ５３ＲＮＡｉ実験 誘導性メタロチオネンプロモーターの下でベクターコントロール又はヘムアグ
ルチニンエピトープ（ＨＡ）タギングｐ５３を発現する安定なショウジョウバエ
Ｓ２細胞株を、ｐＭＴ／Ｖ５-His（Invtrogen, Carlsbad, CA）を使用する形質
移入によって作成した。培地への銅の添加によるＤＭｐ５３発現の誘発はアポト
ーシスを経由しての細胞死の結果となった。アポトーシスを３つの異なった方法
：細胞増殖アッセイ；死亡細胞が収縮核により検出される細胞集団のＦＡＣＳ分
析；及びＤＮＡラダーアッセイによって測定した。Ｓ２細胞株においてＲＮＡｉ
を使用する能力により、この誘導性細胞ベースｐ５３発現系を使用してｐ５３の
忠節と機能を探求することが可能になった。 ｄｓＲＮＡ鋳型の調製：上流のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と顆粒のＤ
Ｍｐ５３遺伝子配列を含むＰＣＲプライマーを、ＤＭｐ５３ｃＤＮＡ配列（配列
番号：１）のヌクレオチド１２８から１１３８まで伸びる配列がＤＭｐ５３誘導
ｄｓＲＮＡの産生を可能にするように増幅されるように設計した。ＰＣＲ反応は
EXPAND High Fidelity（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を使用して
実施され、ついで生成物が精製された。 ＤＭｐ５３ＲＮＡを、Promega Large Scale RNA Production System (Madison
, WI)を使用して製造者のプロトコルに従ってＰＣＲ鋳型から作成した。ＲＮＡ
のエタノール沈降を実施し、ＲＮＡを、６８℃１０分の第一のインキュベーショ
ンと、続いての３７℃３０分の第二のインキュベーションによってアニールした
。得られたｄｓＲＮＡを−８０℃で貯蔵した。
【００８３】 組織培養物中でのＲＮＡｉ実験：ＲＮＡｉを本質的に過去に記載されているよ
うにして実施した（http://dixonlab.biochem.med.umich.edu/protocols/RNAiEx
periments.html）。一日目に、ｐＭＴ-ＨＡ-ＤＭｐ５３発現プラスミドを発現し
たショウジョウバエＳ２細胞の培養物を得て、１５μｇのＤＭｐ５３ｄｓＲＮＡ
を培地に添加するかＲＮＡを添加しなかった。二日目に、ＣｕＳＯ４を０、７、
７０又は７００μＭの最終濃度になるまで全ての培養物に添加した。四日目に、
アラマーブルー（Alamar Biosciences Inc., Sacramento, CA）染色アッセイを
実施して、５９０ｎｍでの蛍光を測定することにより、各培養物中の生細胞の数
を測定した。 ７μＭのＣｕＳＯ４では、ＲＮＡｉ処理又は未処理細胞に対して、０μＭのＣ
ｕＳＯ４の場合と細胞数に変化はなかった。７０μＭのＣｕＳＯ４では、ＲＮＡ
ｉ処理カテゴリーに対して、０μＭのＣｕＳＯ４の場合と細胞数に変化はなかっ
た。しかし、ＲＮＡｉで処理されなかった細胞の数は３０％低下した。７００μ
ＭのＣｕＳＯ４では、ＲＮＡｉで処理されなかった細胞の数は３０％低下する一
方（０μＭのＣｕＳＯ４の場合と比較）、ＲＮＡｉで処理されなかった細胞の数
は７０％低下した。 これらの実験は、ある程度の細胞の喪失は銅の毒性のためであるかもしれない
ので、ｐ５３ｄｓＲＮＡがｐ５３誘導性カテゴリーの細胞の少なくとも７０％を
救出したことを示している。これらの実験の結果は、ＤＭｐ５３ｄｓＲＮＡがＤ
Ｍｐ５３過剰発現を誘発することにより引き起こされたアポトーシスから細胞を
救出することを証明している。よって、この実験細胞ベース系はｐ５３機能の機
構と調節を研究するための明確で独自の方法を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ−１Ｂは、ヒト、アフリカツメガエル及びヤリイカにおい
て過去に同定されたｐ５３配列との、ショウジョウバエ、Leptinotarsa、Tribol
ium及びHeliothisから同定された昆虫ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列のCLUSTA
LWアラインメントを示している。アラインメント内の同一アミノ酸残基は実線内
にグループ分けされ、類似のアミノ酸残基は破線内にグループ分けされている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 1/68 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/566 33/50 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 オルマン，マイケル，マーチン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025， メンロ パーク，アシュル アヴェニュー 1805 (72)発明者 ヤング，リン，マリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94401， サン マテオ，ボールドウィン アヴェニ ュー 250 ４号室 (72)発明者 デンスキー，マデリン，ロビン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94109， サンフランシスコ，パイン ストリート， 1770 3203号室 (72)発明者 キーガン，ケビン，パトリック アメリカ合衆国 カルフォルニア 94580， サン ロレンゾ，ビア エステレラ 17311 (72)発明者 フリードマン，ロリ アメリカ合衆国 カルフォルニア 94107， サンフランシスコ，ワン ベイサイド ヴ ィッレジ プレイス，ユニット212 (72)発明者 コプツィンスキー，ケーシー アメリカ合衆国 カルフォルニア 94002， ベルモント，ジェームス ロード 2769 (72)発明者 ラーソン，ジェフリー，エス． アメリカ合衆国 カルフォルニア 94010， バーリンゲーム，エル カミノ リアル 1220 305号室 (72)発明者 ロバートソン，ステファニー，エー． アメリカ合衆国 カルフォルニア 94127， サンフランシスコ，ファウラー アヴェニ ュー 255 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB10 BB20 CB17 FA16 FB02 FB03 4B024 AA07 AA11 BA80 CA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ05 QQ13 QQ20 QQ43 QR32 QR48 QR74 QR80 QS24 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA13 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 BA10 CA51 EA50 FA72 FA73 FA74

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：４、６、８及び１０の何れか一つの少なく
    とも７の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列； （ｂ）配列番号：２の少なくとも７の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドを
    コードする核酸配列であって、単離された核酸分子が全長１５ｋｂ未満のもの； （ｃ）配列番号：４、６、８及び１０の何れか一つの９の連続アミノ酸と１００
    ％の配列類似性を共有する少なくとも９の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチ
    ドをコードする核酸配列； （ｄ）配列番号：２の９の連続アミノ酸と１００％の配列類似性を共有する少な
    くとも９の連続アミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列であっ
    て、単離された核酸分子が全長１５ｋｂ未満のもの； （ｅ）配列番号：１のヌクレオチド１−１１１、配列番号：３のヌクレオチド１
    −１２０、配列番号：５のヌクレオチド１−９３及び配列番号：１８のヌクレオ
    チド１−１２２５の何れかの少なくとも２０の連続ヌクレオチド； （ｆ）配列番号：２０及び配列番号２２からなる群から選択される配列と少なく
    とも８０％の配列類似性を有するアミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードす
    る核酸配列；及び （ｇ）（ａ）−（ｆ）の核酸の相補鎖； からなる群から選択される核酸配列を含んでなる単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 ＲＮＡである請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 核酸配列が、配列番号：１、３、５、７、９、１８、１９及
    び２１の何れかからなる群から選択される配列と少なくとも５０％の配列同一性
    を有する請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 核酸配列が、ＲＩＣＳＣＰＫＲＤ、ＫＩＣＳＣＰＫＲＤ、Ｒ
    ＶＣＳＣＰＫＲＤ、ＫＶＣＳＣＰＫＲＤ、ＲＩＣＴＣＰＫＲＤ、ＫＩＣＴＣＰＫ
    ＲＤ、ＲＶＣＴＣＰＫＲＤ、ＫＶＣＴＣＰＫＲＤ、ＦＸＣＫＮＳＣ及びＦＸＣＱ
    ＮＳＣ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸）からなる群から選択されるアミノ酸配列
    を含んでなるポリペプチドをコードする請求項１に記載された単離された核酸分
    子。
  5. 【請求項５】 核酸配列が、配列番号：２、４、６、８及び１０の何れかの
    少なくとも１７の連続アミノ酸をコードする請求項１に記載の単離された核酸分
    子。
  6. 【請求項６】 核酸配列が、配列番号：２、４、６、８及び１０の何れかの
    １９のアミノ酸と１００％の配列類似性を共有する少なくとも１９のアミノ酸を
    含んでなるポリペプチドをコードする請求項１に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 核酸配列が、配列番号：２、４、６、８及び１０の何れかと
    少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする請求項１に記
    載の単離された核酸分子。
  8. 【請求項８】 核酸配列が、活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、リンカ
    ードメイン、オリゴマー形成ドメイン、及び塩基性調節ドメインからなる群から
    選択される少なくとも一つのｐ５３ドメインをコードする請求項１に記載の単離
    された核酸分子。
  9. 【請求項９】 核酸配列が活性なｐ５３を構成的にコードする請求項１に記
    載の単離された核酸分子。
  10. 【請求項１０】 核酸配列が、ドミナントネガティブｐ５３をコードする請
    求項１に記載の単離された核酸分子。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 ｐ５３ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項８に記
    載の宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを回収することを含んでなるｐ５３ポリ
    ペプチドの製造方法。
  14. 【請求項１４】 ａ）配列番号：２、４、６、８及び１０の何れか一つの少
    なくとも７の連続アミノ酸； ｂ）配列番号：２、４、６、８及び１０の何れか一つの少なくとも９の連続アミ
    ノ酸と１００％の配列類似性を共有する少なくとも９の連続アミノ酸； ｃ）配列番号：２０及び配列番号：２２からなる群から選択される配列の少なく
    とも１０の連続アミノ酸； からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなる精製されたポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 アミノ酸配列が、ＲＩＣＳＣＰＫＲＤ、ＫＩＣＳＣＰＫＲ
    Ｄ、ＲＶＣＳＣＰＫＲＤ、ＫＶＣＳＣＰＫＲＤ、ＲＩＣＴＣＰＫＲＤ、ＫＩＣＴ
    ＣＰＫＲＤ、ＲＶＣＴＣＰＫＲＤ、ＫＶＣＴＣＰＫＲＤ、ＦＸＣＫＮＳＣ及びＦ
    ＸＣＱＮＳＣ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸）からなる群から選択される請求項
    １４に記載の精製されたポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群から選択さ
    れる配列と少なくとも５０％の配列類似性を有する請求項１４に記載の精製され
    たポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 ｐ５３活性を変調する候補化合物又は分子を検出する方法
    であって、ｐ５３ポリペプチド又はｐ５３ポリペプチドをコードする核酸を一又
    は複数の候補化合物又は分子に接触させ、候補化合物又は分子とｐ５３ポリペプ
    チド又は核酸との間の相互作用を検出することを含んでなり、ｐ５３ポリペプチ
    ドが、 ａ）配列番号：２、４、６、８及び１０の何れか一つの少なくとも７の連続アミ
    ノ酸と、 ｂ）配列番号：２、４、６、８及び１０の何れか一つの少なくとも９の連続アミ
    ノ酸と１００％の配列類似性を共有する少なくとも９の連続アミノ酸と、 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法。
  18. 【請求項１８】 候補化合物又は分子が推定される製薬用薬剤である請求項
    １７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 接触工程が、ｐ５３タンパク質を発現するように遺伝子操
    作された培養宿主細胞に候補化合物又は分子を投与することを含んでなる請求項
    １７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 接触工程が、ｐ５３タンパク質を発現するように遺伝子操
    作された昆虫に候補化合物又は分子を投与することを含んでなる請求項１７に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 候補化合物が推定殺虫剤である請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ｐ５３タンパク質を発現又は誤発現するように遺伝的に改
    変された初代昆虫又はｐ５３タンパク質発現又は誤発現を受け継いだ昆虫の子孫
    であって、ｐ５３タンパク質が、 ａ）配列番号：２、４、６、８及び１０の何れか一つの少なくとも７の連続アミ
    ノ酸と、 ｂ）配列番号：２、４、６、８及び１０の何れか一つの少なくとも９の連続アミ
    ノ酸と１００％の配列類似性を共有する少なくとも９の連続アミノ酸と、 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる昆虫。
  23. 【請求項２３】 上記昆虫が、Ｒ１５５Ｈ、Ｈ１５９Ｎ及びＲ２６６Ｔから
    なる群から選択される突然変異を持つドミナントネガティブｐ５３を発現するよ
    うに遺伝子改変がなされたショウジョウバエである請求項２２に記載の昆虫。
  24. 【請求項２４】 請求項２２に記載の初代昆虫におけるｐ５３タンパク質の
    発現又は誤発現により生じるフェノタイプを検出することを含んでなるｐ５３活
    性の実験方法。
  25. 【請求項２５】 ｐ５３タンパク質の発現又は誤発現を生じる初代昆虫と同
    じ遺伝子改変を有する第２世代昆虫を観察し、第２世代動物が対象遺伝子の突然
    変異を更に含み、存在する場合には初代動物のフェノタイプと第２世代動物のフ
    ェノタイプの間の差異が、ｐ５３タンパク質をコードする遺伝子の機能を変調可
    能なものとして対象遺伝子を特定する請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 一又は複数の候補化合物又は分子を昆虫又はその子孫に投
    与し、昆虫又はその子孫にｐ５３活性の変化を観察することを更に含んでなる請
    求項２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１に記載の単離された核酸分子に昆虫細胞を接触さ
    せることを含み、単離された核酸分子が配列番号：１、３、５、７及び９からな
    る群から選択される核酸配列のコード下領域から由来するｄｓＲＮＡである、ｐ
    ５３活性を変調する方法。
  28. 【請求項２８】 培養された昆虫細胞をｄｓＲＮＡに接触させ、培養された
    細胞のアポトーシスをアッセイする請求項２７に記載の方法。
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