JP2002538479A - 自己集成アレイ - Google Patents

自己集成アレイ

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JP2002538479A
JP2002538479A JP2000603795A JP2000603795A JP2002538479A JP 2002538479 A JP2002538479 A JP 2002538479A JP 2000603795 A JP2000603795 A JP 2000603795A JP 2000603795 A JP2000603795 A JP 2000603795A JP 2002538479 A JP2002538479 A JP 2002538479A
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molecules
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electrode
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ディー． モントゴメリー，ドナルド
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コンビマトリックス コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、自己集合アレイの製造方法にを特筆する。本方法は、（ａ）コード化アフィニティーを有する分子の１つ又はそれ以上の立体多重化アレイを調製し、そして（ｂ）アレイ上に固定される少なくとも１つの物質を含有する溶液にコード化アフィニティーアレイを曝露する過程を包含する。本発明は、立体多重化自己集合アレイも特筆する。

Description

【発明の詳細な説明】
発明の分野： 本発明は、生物学的及び化学的合成及び処理の分野に関する。本発明は、自己
集成マイクロアレイの生成方法に関する。 本出願は、１９９９年３月１１日に出願されたアメリカ特許出願第６０／１２
３，８９４号の優先権を主張する。 発明の背景： 生物学的及び化学的処理及び合成装置の分野は、絶え間なく進歩している。化
学的及び生物学的材料を合成するための急速な方法を提供する、多くの新規且つ
改良されたアレイ又は“遺伝子チップ”が開発されている。そのような技術の例
は、Ｐｉｒｒｕｎｇなど．，アメリカ特許第５，１４３，８５４号、Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ，ＷＯ９３／２２４８０号、Ｈｅｌｌｅｒ，ＷＯ９５／１２８０８号、ア
メリカ特許第５，８４９，４８６号、アメリカ特許第５，６３２，９５７号、ア
メリカ特許第５，６０５，６６２号、及びＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＷＯ９８／０
１２２１号に記載されるそれらのものを包含する。前記開示は、それらのすべて
を、引用により本明細書に組み込まれる。化学的及び生物学的材料の合成方法は
、例えば写真平板技法又は電気化学的技法を用いることができる。 多数の異なったリガンドの調製方法は、効果的な合理的又はランダムスクリー
ニングを可能にするのに十分な規模で使用される場合、非常に遅く且つ、極端に
高価であった。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄなど，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ Ｓｏ
ｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）により記載される方法が、固体支持
体上でペプチドを合成するために使用されて来た。この方法においては、アミノ
酸が不溶性ポリマーから製造される支持体に共有結合される。α保護された基を
有するもう１つのアミノ酸が、ジペプチドを形成するために、共有結合されたア
ミノ酸と反応せしめられる。洗浄の後、保護基が除去され、そしてα保護基を有
する第３のアミノ酸が前記ジペプチドに付加される。この工程は、所望する長さ
の及び配列のペプチドが得られるまで、続けられる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方
法を用いる場合、多量のペプチド配列の合成は、技術的に不可能であり、又は経
済的に実用的ではない。 多数のペプチド配列を合成するためには、ポリマー合成のための一連の反応容
器を使用することが提案されて来た。例えば、管状反応器システムが、試薬の自
動化された連続的添加により固相支持体上で洗浄ポリマーを合成するために使用
され得る。しかしながら、この方法はまた、効果的且つ経済的スクリーニングの
ための十分に多数のポリマー配列の合成を可能にしない。 多数のポリマー配列を調製するためのもう１つの方法は、容器の孔のサイズよ
り大きな、既知量の反応性粒子を包含する多孔成容器を用いる。前記容器におけ
る粒子は、所望する生成物分子の配列を合成するために、所望する材料と選択的
に反応することができる。しかしながら、当業界において知られている他の方法
に関しては、この方法は、効果的なスクリーニングのための十分な種類のポリペ
プチドの合成のためには実際的でない。 他の技法がまた、記載されており、そして試みられて来た。それらの方法のい
くつかは、標準のマイクロタイタープレートの形成に適合する９６のプラスチッ
クピン上でのペプチドの合成を包含する。不運なことには、それらの技法は幾分
有用ではあるが、実質的な問題が残存している。標準のマイクロタイタープレー
トを用いる方法は、合成され、そしてスクリーンされ得る配列の多様性において
制限され続けている。マイクロタイタープレートの使用は、個々のポリマーがマ
イクロタイタープレートの単離されたウェルにおいて合成されるので、実質的に
純粋なポリマーを生成することが認識されているが、所定の時間で生成され得る
ポリマーの数は、マイクロタイタープレートにおけるウェルの数、すなわち９６
により制限される。さらに、マイクロタイタープレートにおける合成のために必
要とされる装置は大きい。この制限のために、マイクロタイタープレートの使用
は、比較的少数のペプチドを生成するために多量の空間を必要とする。 電気化学的合成方法及びそれを行うために多孔性アレイは、アメリカ特許出願
第０９／００３，０７５号及び第０９／２１４，３４８号（それらの開示は、引
用により本明細書に組み込まれる）、及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１１
４６３号及びＰＣＴ／ＵＳ９９／００５９９号（それらの開示は、引用により本
明細書に組み込まれる）に記載される。そのようなマイクロアレイ及び合成方法
は、生物学的サンプルにおける興味ある分子を検出するよう企画されたアレイを
合成するために使用され得る。そのような検出のためのアレイを生成するための
方法を提供し、そして急速且つ特異的態様で、興味ある分子を検出するよう企画
されたアレイを製造することが、本発明の目的である。 発明の要約： 第１の観点においては、本発明は、自己集成アレイの製造方法を特徴とする。
この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも１つの分
子を含む溶液に暴露する段階を含んで成る。 第２野観点においては。本発明は、コードされた親和性アレイを用いて、空間
的に多重化された態様で材料を固定するための方法を特徴とする。この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも１つの分
子を含む溶液に暴露する段階を含んで成り、ここで前記アレイ上に固定される分
子がコードされた親和性を有する１又は複数の分子への実質的な結合親和性を有
するリガンドを含んで成る。 第３の観点においては、本発明は、本発明に従って調製される自己集成アレイ
を特徴とする。本発明の方法の生成物は、空間的に多重化される、固定された材
料のアレイである。そのようなアレイは、高い処理量態様で所望する性質のため
の材料をスクリーニングするために使用され得る。そのようなアレイはまた、サ
ンプルにおける１又は複数の分子の存在を検出するためにも使用され得る。そし
て従って、診断評価を提供する。 第４の観点においては、本発明は、空間的に多重化された態様で表示される、
コードされた親和性分子を含んで成るアレイと、生物学的サンプルとを接触せし
め手段を含んで成る、サンプルにおける標的分子の検出方法を特徴とする。この
方法は、生物学的サンプルとの接触を特徴とする。好ましくは、前記アレイは、
少なくとも約１０００のコードされた親和性分子を含んで成る。前記方法は好ま
しくは、標的分子のその対応するリガンド又は結合ドメインへの結合を可能にす
るために適切な条件下で行われる。好ましくは、前記検出は、上皮蛍光顕微鏡及
びＣＣＤカメラのような装置により検出され得る蛍光的にラベルされた標識を用
いて行われる。 発明の特定の記載： 第１の観点においては、本発明は、自己集成アレイの製造方法を特徴とする。
この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも１つの材
料を含む溶液に暴露する段階を含んで成る。 それらのアレイは、例えばガラスプレートの表面上に異なった分子を位置決定
し、前記分子を、電極アレイを用いて現場合成し、又は一連の写真平版マスクを
用いて前記分子を現場合成することによって調製され得る。コードされた分子の
空間的に多重化されたアレイを調製するための方法は、当業者に明らかであろう
。 種々の材料が、コードされた親和性アレイにおける種々の空間部位に対する特
定の親和性を有する種々の分子を用いて、化学的に標識され得る。前記材料は、
いずれかの所定の空間位置でコードされた親和性分子に対するそのような化学的
標識の親和性に基づいて種々の空間位置上に自己構成態様で固定され得る。コー
ドされた親和性を有する分子は好ましくは、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチ
ド、ビオチン及びストレプタビジンから成る群から選択される。 第２野観点においては、本発明は、コードされた親和性アレイを用いて、空間
的に多重化された態様で材料を固定するための方法を特徴とする。この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも１つの分
子を含む溶液に暴露する段階を含んで成り、ここで前記アレイ上に固定される分
子がコードされた親和性を有する１又は複数の分子への実質的な結合親和性を有
するリガンドを含んで成る。 第３の観点においては、本発明は、本発明に従って調製される自己集成アレイ
を特徴とする。本発明の方法の生成物は、空間的に多重化される、固定された材
料のアレイである。そのようなアレイは、高い処理量態様で所望する性質のため
の材料をスクリーニングするために使用され得る。そのようなアレイはまた、サ
ンプルにおける１又は複数の分子の存在を検出するためにも使用され得る。そし
て従って、診断評価を提供する。 好ましくは、アレイは、少なくとも１つの電極に最も接近して多孔性膜上で形
成される。好ましくは、電極の電流又は電位は、電極に最も接近して、又はそれ
から離れて、コンピューターによるインターフェイスにより調節され、そして操
作される。好ましい態様においては、アレイは、多孔性膜の最も近くに電極を有
する多孔性又は非固体の支持体上で形成される。特に好ましい態様においては、
少なくとも約１００の電極及びペプチドが、アレイ上に存在する。さらにより好
ましくは態様においては、少なくとも５００又は少なくとも１０００の電極又は
ペプチドがアレイ上に存在する。１又は１以上の親和性分子が個々の電極の最も
近くに存在できることが企画される。 第４の観点においては、本発明は、空間的に多重化された態様で表示される、
コードされた親和性分子を含んで成るアレイと、生物学的サンプルとを接触せし
め手段を含んで成る、サンプルにおける標的分子の検出方法を特徴とする。この
方法は、生物学的サンプルとの接触を特徴とする。好ましくは、前記アレイは、
少なくとも約１０００のコードされた親和性分子を含んで成る。前記方法は好ま
しくは、標的分子のその対応するリガンド又は結合ドメインへの結合を可能にす
るために適切な条件下で行われる。好ましくは、前記検出は、上皮蛍光顕微鏡及
びＣＣＤカメラのような装置により検出され得る蛍光的にラベルされた標識を用
いて行われる。 定義： 本明細書において使用される場合、次の用語は、次の一般的な意味を有するこ
とが理解される。 “空間的に多重化されたアレイ”とは、異なった空間位置で固定される異なっ
た材料を含んで成るアレイである。例としては、アレイは、グリッドの個々の要
素が２種の変数（ｘ，ｙ）によりラベルされる直線座標システムを使用すること
ができる。このタイプのグリッド上の個々の別々の空間位置は、ユニークな２種
の種々のラベルを有する。異なった材料が、そのようなグリッドを異なった空間
位置で固定することができる。個々の固定された材料は、グリッド上の特定の空
間位置に関連している。この定義によれば、それらの固定された材料は、そのよ
うなグリッドシステム上で“空間的に多重化される”。 用語“コードされた親和性”とは、線状、半線状又は、閉鎖−ループポリマー
鎖におけるモノマー単位の配列に依存する化学的親和性を言及する。例えば、ア
ミノ酸の所定の配列から形成される特定の短いペプチドに対して選択的である抗
体が生成され得る。親和性“コード”とは、ペプチドを形成するために使用され
るアミノ酸配列である。異なったコードされたペプチドに対して選択的に結合す
る異なった抗体が生成され得る。同様に、相補的ヌクレオチド配列に対して比較
的高いハイブリダイゼーション親和性を有するオリゴヌクレオチドが生成され得
る。 アレイ 本発明の好ましい実施態様は、空間的に多重化したアフィニティ・アンカー・
アレイを多孔膜上に電気化学的に固定するために電極アレイを利用することを特
徴としている。本発明の方法の好ましい実施態様では、アフィニティ・アンカー
分子をそのアレイに電位化学的に付着させ、アンカー分子だけがアクティブな電
極を被覆しているアレイに付着するようにする。しかし本発明は、いろいろな方
法がある中でもフォトリソグラフィーの技術またはインク・スポッティングによ
って分子を付着させる他のアレイにも適用することが可能である。 本発明の方法は、特に、アメリカ合衆国特許出願シリアル番号第９／００３，
０７５号と第０９／２１４，３４８号に記述されているアレイの表面に空間的に
多重化したアフィニティ・アレイを作るのに応用することができる。なお、これ
ら出願の内容は参考としてこの明細書に組み込まれている。こうしたアレイは、
ペプチドなどの化合物を個々に指定可能な特定の位置において合成できるように
設計されている。こうしたアレイは、コンタクトの製造者が既存の半導体製造設
備を利用して低コストで製作することができる。図４は、そうしたアレイを用い
てある分子パターンを合成できることを示している。まず最初に、アレイを、生
体適合性のある多孔膜でコーティングする。この多孔膜により、大量の溶媒と電
極の間を分子が自由に流れられる。次に、このアレイを、興味の対象である、電
気化学的に生成させる（ＥＣＧ）試薬の前躯体を含む溶液に浸す。次に、コンピ
ュータをアレイと接続して望む電極パターンにすると、前躯体が電気化学的反応
によってアクティブな種に変換される。電気化学的に生成させた（ＥＣＧ）試薬
は、今度は電極を覆っている膜に固定された分子と反応する。 これらの好ましいアレイの主な特徴は、ＥＣＧ試薬を、選択した微小電極のご
く近傍に限定できることである。その様子を図５に示す。この図では、フルオレ
セイン染料が、指定した個々の微小電極の位置に共有結合によって固定されてい
る。この染料によって確実に市松模様のパターンにすることができるため、アク
ティブな電極とアクティブでない電極の間の化学的な交信は実質的に存在してい
ない。ＥＣＧ試薬をこの程度に局在化することは、微小電極アレイを浸す溶液の
物理化学的反応を利用することによって実現できる。この溶液は、通常は、緩衝
液と、ＥＣＧ試薬と反応するスカベンジャーとを含んでいる。しかし、ＥＣＧ試
薬が生成する速度は、この溶液が微小電極のごく近傍の狭い領域でＥＣＧ試薬と
反応する能力を圧倒する可能性がある。その結果、ＥＣＧ試薬によって媒介され
る化学反応が、選択した微小電極の周囲で起こるが、化学的な交信はない。 いくつかの実施態様では、好ましいこれらアレイの表面にリンカー分子層を設
けることができる。リンカー分子があることによって、モノマーまたは未完成分
子を、基板または基板を覆っている層に間接的に付着させることができる。リン
カー分子は、例えば多孔度を制御したガラス（ＣＰＧ）を層材料として用い、珪
素炭素結合によって被覆層に付着させることが好ましい。リンカー分子があるこ
とによって、合成されたポリマーが容易にターゲットを認識できるようにもなる
。さらに、合成されたポリマーをある種の受容体に対して提示する状態を改善す
るためには、リンカー分子を親水特性／疎水特性に基づいて選択することが好ま
しい。例えば、親水性受容体の場合には、その受容体が合成されたポリマーに非
常によく近づくことができるようにするため親水性リンカー分子が好ましかろう
。 リンカー分子は、完成した基板上のポリマーが、その基板に暴露される結合部
全体と自由に相互作用するのに十分な長さであることが好ましい。リンカー分子
は、使用するときには、長さが１０ １０００分子であることが好ましい。特に
好ましい実施態様では、官能基が結合部全体に十分に暴露されるよう長さが約６
５０分子となっている。本発明で使用することが好ましいリンカー分子としては
、例えばアリールアセチレン、２ １０個のモノマー単位を含むエチレングリコ
ールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、およびこれらの組み合わせが
挙げられる。本発明の別の実施態様では、他のリンカー分子を使用することがで
きる。そうした他のリンカー分子は、当業者であればこの明細書の記載から理解
できよう。 別の好ましい実施態様では、リンカー分子の中間位置に切断基を設けることが
できる。この切断基は、電気化学的に生成させた試薬を用いて切断することがで
きる。この切断基は、保護基を除去するのに用いる試薬とは異なる試薬によって
切断されることが好ましい。こうすることによって、合成が完了した後のさまざ
まな合成ポリマーまたは核酸配列を除去することができる。リンカー分子として
は、例えば、無水酢酸、ｎ−アセチルイミジゾール、蟻酸イソプロペニル、フル
オレスカミン、３−ニトロフタル酸無水物、３−スルホプロポン酸無水物である
。これらの中では、無水酢酸、ｎ−アセチルイミジゾールが好ましい。 リンカー分子は、完成した基板上のペプチドなどのポリマーが、その基板に暴
露される結合部全体と自由に相互作用するのに十分な長さであることが好ましい
。リンカー分子は、使用するときには、官能基が結合部全体に十分に暴露される
よう長さが約６５０分子となっていることが非常に好ましい。本発明で使用する
ことが好ましいリンカー分子としては、例えばアリールアセチレン、２ １０個
のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、ア
ミノ酸、およびこれらの組み合わせが挙げられる。本発明の別の実施態様では、
他のリンカー分子を使用することができる。そうした他のリンカー分子は、当業
者であればこの明細書の記載から理解できよう。 別の好ましい実施態様では、リンカー分子の中間位置に切断基を設けることが
できる。この切断基は、電気化学的に生成させた試薬を用いて切断することがで
きる。この切断基は、保護基を除去するのに用いる試薬とは異なる試薬によって
切断されることが好ましい。そうすることによって、合成が完了した後のさまざ
まな合成ポリマーまたはペプチドを電気化学的に生成した試薬を用いて除去する
ことができる。本発明では、特に、環外にアクティブなエステルを有する酸不安
定性４，４’−ジメチオキシトリチル分子のいろいろな誘導体を用いることがで
きる。これらリンカー分子は、パーセプティブ・バイオシステムズ社、フラムガ
ム、マサチューセッツ州から入手することができる。ＤＮＡの合成中に使用する
切断用リンカー分子としては、Ｎ−スクシンイミジル−４−［ビス−（４−メト
キシフェニル）−クロロメチル］−ベンゾエートのほうが好ましい。この分子の
合成法と使用法は、ブライアンＤ．ギルディー、ジェイムズＭ．クール、ハバー
ト・ケスターによる「合成生分子を修飾するための多目的な酸不安定性リンカー
」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３１巻、第４９号、７０９５
７０９８ページ、１９９０年に記載されている。また、アレイ全体に対して同
時に、化学試薬、光、熱などの他の切断法も適用することができる。 切断用リンカー基を使用すると、合成された分子、例えばポリマーやアミノ酸
配列を、望む時期に電極アレイから解離または分離することができる。この解離
によって、例えば合成されたポリマーまたはアミノ酸配列を別の電極アレイまた
は第２の基板に移すことができる。明らかなことだが、当業者であれば、元の基
板上で合成された分子を第２の基板に移すのにいくつかの方法が思いつくであろ
う。 本発明で使用するのに好ましいアレイは、特定の形である必要はない。すなわ
ち電極は、正方形のマトリックス形である必要はない。電極アレイの形状として
考えられるのは、正方形；長方形；任意の多角形の境界を有する、直線で囲まれ
たグリッド・アレイや六角形のグリッド・アレイ；各電極が共通の中心に対して
同心円をなしていて、任意の多角形で囲まれたグリッド；各電極の直径が同じで
あったり異なっていたりする複数の電極を有するフラクタル・グリッド・アレイ
である。本発明では、点在形態の電極も使用することができる。しかし電極アレ
イは、少なくとも１０×１０のマトリックスの中に少なくとも１００個の電極を
備えていることが好ましい。さらに好ましいのは、電極アレイが、例えば少なく
とも２０×２０のマトリックスの中に少なくとも４００個の電極を備えているこ
とである。それ以上に好ましいのは、電極アレイが、例えば少なくとも６４×３
２のマトリックスの中に少なくとも１０２４個または２０４８個の電極を備えて
いることであり、より一層好ましいのは、例えば少なくとも６４０×３２０のマ
トリックスの中に少なくとも２０４，８００個の電極を備えていることである。
本発明で用いることのできる他のサイズのアレイは、当業者であればこの明細書
の記述から明らかであろう。 本発明では、直径がほぼ１ミクロン未満 １００ミクロン（０．１ミリメート
ル）の電極を有する電極アレイを用いることが好ましい。さらに、本発明では、
電極の直径とは関係なく、各電極の中心から中心までの距離が約１０ １０００
ミクロンの電極アレイを用いることが好ましい。さらに好ましいのは、隣接する
２つの電極の中心が５０１００ミクロン離れていることである。 電極は、基板の表面と高さを同じにすることができる。しかし、本発明の好ま
しい一実施態様では、電極は、平坦な円板というよりは半球形である。さらに詳
しく説明するならば、半球形の電極の輪郭は、半球のように見える逆正接関数で
表現される。当業者であれば、このような形の電極に馴染んでいるであろう。電
極が半球形であることによって、電位が電極の径方向で一定になることが保証さ
れる。すなわち、電極が半球形であることにより、電位が電極の端部近くで中央
部よりも大きくなることがなく、電気化学的反応による試薬の生成が電極のあら
ゆる部分で同じ速度で起こることが保証される。 本発明で用いることのできる電極は、貴金属、例えばイリジウムおよび／また
は白金、あるいは、他の金属、例えば、パラジウム、金、銀、銅、水銀、ニッケ
ル、亜鉛、チタン、タングステン、アルミニウム、さらには、さまざまな金属の
合金や、他の導電性材料、例えば炭素などで構成することができるが、これだけ
に限定されるわけではない。なお炭素の中には、ガラス状炭素、網状ガラス様炭
素、基底面グラファイト、端面グラファイト、グラファイトが含まれる。インジ
ウム・スズ酸化物などのドーピングされた酸化物、珪素酸化物やガリウム・ヒ素
などの半導体も考えることができる。さらに、電極は、導電性ポリマー、金属を
ドープしたポリマー、導電性セラミック、導電性粘土で構成することもできる。
貴金属の中では、白金とパラジウムが特に好ましい。というのも、これら貴金属
は、水素を吸収するという能力、すなわち本発明の方法において使用する前に水
素を“あらかじめ充填する”という能力と関係した好ましい特性を有するからで
ある。 これらアレイの他の好ましい実施態様では、１つまたはそれ以上の電極は、“
ゲッター”構造に近くなっている。この“ゲッター”構造は、第２の電極を有す
ることが好ましい。第２の電極は、形もサイズも任意でよい。しかし第２の電極
は、単独で、あるいはスカベンジャー溶液および／または緩衝溶液とともに、電
気化学的に生成した試薬を捕捉する機能を持つことができる。あるいは第２の電
極は、イオンが近くの電源の中、例えば半導体回路の中に拡散することを少なく
したりなくしたりする機能を持つことができる。このような第２の電極は、すで
に説明した選択した電極と同じ材料で製造することができる。 アレイに使用する電極は、公知の方法で電源に接続することができる。電極を
電源に接続する好ましい方法としては、ＣＭＯＳスイッチング回路、ラジオ波お
よびマイクロ波の周波数でアドレス可能なスイッチ、光でアドレス可能なスイッ
チ、電極から半導体チップの周辺にある接続パッドへの直接接続がある。上に説
明したようにして“ゲッター”構造の位置を決めると、半導体チップの寿命が延
びる。したがって、このような接続は特に好ましい。 ＣＭＯＳスイッチング回路には、各電極からＣＭＯＳトランジスタ・スイッチ
への接続が含まれる。このスイッチにアクセスするには、電子的アドレス信号を
、共通バスを通じ、各電極に付随したＳＲＡＭ（スタティック・ランダム・アク
セス・メモリ）回路に送る。スイッチが“オン”になると、電極は電源に接続さ
れる。これが好ましい１つの動作モードである。 ラジオ波およびマイクロ波の周波数でアドレス可能なスイッチには、ラジオ波
またはマイクロ波の信号でスイッチングされる電極が含まれる。こうすることに
より、スイッチング論理あり、および／または、スイッチング論理なしの両方の
場合にスイッチを入れることができる。スイッチは、特定の周波数または変調周
波数を受信するようにチューニングすることができ、スイッチング論理なしでス
イッチングがなされる。また、このスイッチでは両方の方法を使うこともできる
。 光でアドレス可能なスイッチは、光によってスイッチングがなされる。この方
法では、電極は、スイッチング論理あり、およびスイッチング論理なしでスイッ
チングすることもできる。光信号は、スイッチング論理なしでスイッチングがで
きるよう、空間的に局在させることができる。これは、例えば、レーザー・ビー
ムを電極アレイの上を走査させることによって実現する。この場合、電極は、レ
ーザーが電極を照射するごとにスイッチングされる。また、アレイ全体に光を十
分に照射し、光信号を時間変調させてコード化された信号を発生させることもで
きる。しかし、光を十分に照射する場合にはスイッチング論理が必要である。 間接的な方法によって光でアドレス可能な一種のスイッチングを実現すること
もできる。この方法では、電極は半導体材料で構成する。半導体電極には、閾値
電圧よりも低いバイアスをかける。バイアスが十分に低いと、電気化学的反応は
起こらない。というのも、電子がバンド・ギャップを超えるだけのエネルギーを
持っていないからである。“オン”になっている電極は、すでに他の方法でオン
にされたのであろう。電極に光を照射すると、電子が光からバンド・ギャップを
超えるのに十分なエネルギーを得るため、電気化学的反応が起こる。 したがって、電極アレイは、光を照射されたときはいつでも電気化学的反応を
起こす用意がある。この方法では、アレイ全体に光を十分に照射するか、あるい
は各電極に別々に光を照射することができる。この方法は、速いスイッチング・
エレクトロニクスを必要とせずに非常に速い電気化学的反応をパルス状に起こす
のに有効である。電極から半導体チップの周辺にある接続パッドへの直接接続が
別の方法としてある。もっともこの接続方法だと、アレイの密度が制限される可
能性がある。 望むタイプの化学種を電気化学的に生成させるには、各電極の電位が所定の最
小値になっている必要がある。これは、所定の最小電位が必要であることを意味
する。この最小電位は、電圧または電流を指定することによって実現することが
できる。例えば、各電極に必要な最小電位を実現するには２つの方法がある。す
なわち、必要な値の電圧を指定する方法と、電流を、必要な電圧を得るのに十分
な値に決める方法である。必要な最小電位の値は、生成させることにした化学試
薬のタイプによって決まることになる。当業者であれば、望む化学種が何である
かに基づき、必要な電圧および／または電流を容易に決定することができよう。
使用可能な電位の最大値は、やはり望む化学種が何であるかに基づいて決定され
る。電位が望む化学種に関連した最大値を超える場合には、望まない化学種が生
成される可能性がある。 合成方法 本発明は、その好ましい実施例において、コードされた親和性分子を電気化学
的にアレイに固定することを特徴とする。本発明の範囲に含まれる典型的なコー
ドされた親和性分子としては、ビオチン、ストレプトアビジン、オリゴヌクレオ
チド、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチドリガンドが結合した修飾ペプチド等
が挙げられる。アレイに配置されるべき分子に対して適切な結合親和性を有する
如何なる分子も使用できることは、当業者であれば容易に理解できる。 親和性のアンカーがペブチド、抗原、抗体、又はオリゴヌクレオチドである場
合には、その開示内容が本明細書に参考として含まれるアメリカ合衆国特許出願
シリアル番号０９／００３，０７５および０９／２１４，３４８に記載の方法に
より、親和性アンカーをアレイに固定することができる。図４は、本発明のアレ
イがどのように分子パターンの合成に用いられるかを示している。第１に、アレ
イを、多量の溶媒と電極間の分子の自由な流れを可能にする生体適合性多孔性膜
によりコートする。次いで、アレイを、電気化学的に生成される（ＥＣＧ）目的
試薬の不活性な前駆体を含む溶液に浸漬する。ペプチドの合成では、これがアミ
ノ保護基を取り除くためのＥＣＧ試薬となる。その後、コンピュータにより所望
の電極パターンにし、前駆体を電気化学的に活性種に変換する。その結果、ＥＣ
Ｇ試薬が、電極を被う膜に固定された分子と反応する。溶液を適切に緩衝するこ
とにより、活性電極の領域外へのＥＣＧ試薬の拡散を排除する。 本発明の方法では、好ましくは、その開示内容が本明細書に参考として含まれ
る特許出願シリアル番号０９／００３，０７５および０９／２１４，３４８、及
び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１１４６３およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０
０５９９に記載された、支持体の特定の場所での物質の電気化学的配置方法を利
用する。該方法は、電気化学的に生成される試薬と反応する少なくとも一つの分
子に近接する少なくとも一つの電極を、その表面に有する支持体を供する工程、
電極に、電極に近接する少なくとも一つの分子と反応しうる電気化学的試薬を生
成するのに十分な電圧をかける工程、及びこれによって化学反応をおこす工程か
らなる。このような方法により、オリゴヌクレオチド及びペプチドのようなコー
ドされた親和性分子よりなるアレイが製造できる。 他の好ましい実施例では、本発明は支持体における、別々に形成されたオリゴ
ヌクレオチド又はペプチドのアレイの電気化学的合成方法を利用する。該方法は
、バッファーまたはスカベンジャー溶液を、支持体表面に近接する電極アレイと
接触させる工程、ここで該表面は一つ以上の、少なくとも一つの保護された化学
官能基がついた分子に近接しており、少なくとも一つの分子上の少なくとも一つ
の保護された化学官能基を選択的に脱保護する工程、通常はヌクレオチドまたは
アミノ酸であり、少なくとも一つの保護された化学官能基を有する第１のモノマ
ーを、該分子上の一つ以上の脱保護された化学官能基に結合する工程、該結合さ
れた分子又は少なくとも一つの保護された化学官能基を有する他の分子上の化学
官能基を選択的に脱保護する工程、通常はヌクレオチドまたはアミノ酸であり、
少なくとも一つの保護された化学官能基を有する第２のモノマーを、該結合され
た分子又は他の脱保護された分子上の一つ以上の脱保護された化学官能基に結合
する工程、及び、結合された保護モノマーまたは結合された保護分子上の化学官
能基の選択的脱保護と、これに続く、通常はヌクレオチドまたアミノ酸である添
加されたモノマーの、該脱保護された化学官能基への結合を、所望の長さを有す
る少なくとも二つの分離した高分子、通常はオリゴヌクレオチドまたはペプチド
であるが、が支持体表面に形成されるまで反復する工程からなる。 更なる好ましい実施例においては、本発明は、支持体上における、別々に形成
された高分子からなるコードされた親和性分子のアレイの電気化学的合成方法を
利用する。該方法は、バッファーまたはスカベンジャー溶液を、支持体表面に近
接する電極アレイと接触させる工程、ここで該表面は一つ以上の、少なくとも一
つの保護された化学官能基を有する分子に近接し、少なくとも一つの分子上の少
なくとも一つの保護された化学官能基を選択的に脱保護する工程、少なくとも一
つの保護された化学官能基を有する第１のモノマーを、該分子上の一つ以上の脱
保護された化学官能基に結合する工程、該結合された分子、又は少なくとも一つ
の保護された化学官能基を有する他の分子上の化学官能基を選択的に脱保護する
工程、少なくとも一つの保護された化学官能基を有する第２のモノマーを、該結
合された分子又は他の脱保護された分子上の脱保護された化学官能基を結合させ
る工程、および、結合された保護モノマーまたは結合された保護分子上の化学官
能基の選択的脱保護と、これに続く、添加されたモノマーの脱保護された化学官
能基への結合を、所望の長さを有する少なくとも二つの分離した高分子が支持体
表面に形成されるまで反復する工程からなる。本発明によれば、該モノマー又は
分子は通常ヌクレオチドまたはアミノ酸であり、該高分子はオリゴヌクレオチド
またはペプチドである。 これらの電気化学的手法によれば、高分子合成用もしくは被修飾用のいずれを
も含むモノマー、及び予備形成分子を、支持体上の小さな、正確にわかっている
位置に配置することが可能である。従って、既知のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、又は既知の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを支持体上の選択された位
置で合成することが可能である。さらに、既知のアミノ酸配列を有するペプチド
、又は既知の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを、事前に選択され、正確な
位置とポリマーの座標がわかっているような支持体上の位置で合成することが可
能である。例えば、本願において開示された発明に従えば、アミノ酸を、支持体
上の選択した位置に配置して、ペプチドの形でアミノ酸の所望の配列を合成する
ことができる。 本明細書に記載の合成方法の好ましい実施例では、それぞれの電極と接触する
バッファー又はスカベンジャー溶液を使用する。この溶液は、電気化学的に生成
する試薬、特にプロトン及び／又はヒドロキシルイオンを緩衝するもので、電気
的に生成されたイオンがアレイ中の一つの電極から他の電極へ拡散することによ
る化学的クロストークを能動的に防ぐ。例えば、水性または部分的に水性の媒体
に接触している電極に十分な正（又は負）電圧をかけると、水の加水分解の産物
としてプロトン（又はヒドロキシルイオン）が生じる。例えば、プロトンは、ペ
プチドのようなコンビナトリアル合成で用いられるいくつかの分子から電気化学
的保護基を除去するのに有用である。 分離した純粋なペプチドを製造するためには、これらのプロトン（又はヒドロ
キシルイオン）を、選択した電極にごく近い領域に留めておくことにより、アレ
イ中で隣接する電極間の化学的クロストークを最小限にし、可能ならば排除する
ことが好ましい。選択された電極から動きだす試薬と反応し、かくしてこれらの
試薬が隣接する電極と反応するのを防ぐバッファー又はスカベンジャー溶液を用
いることにより、電気化学的に生成された試薬の移動の空間的な広がりを能動的
に調節することができる。 これら電気化学的に生成された試薬を、選択された電極にごく近い領域に留め
ておく別の手法は、「ゲッター」構造を選択された電極の近傍に、実質的に外環
境に接触するように配置するものである。そのような「ゲッター」構造は、スカ
ベンジャー溶液と共に、あるいは、その代わりに用いることができる。「ゲッタ
ー」構造は、当業者が容易に理解できるような、あらゆる適した材料を用いて設
計し、あらゆる適した形または大きさに成形できる。そのような「ゲッター」構
造の最も重要な特徴は、選択された電極から拡散していくような電気化学的に生
成された試薬を補足するように作用する点である。「ゲッター」構造は、電気化
学的に生成された試薬と化学的に反応することにより受動的に作用しうる。一方
で「ゲッター」構造は、能動的に作用して、電気化学的に生成された試薬を補足
しうる。これは、電気化学的補足を起こすのに十分な電圧を「ゲッター」構造に
印加することにより実現できる。 「ゲッター」構造の他の機能は、選択された電極に使用可能に接続されうるトラ
ンジスタ等の回路に向かっての、あるいは回路内へのイオンの拡散を防ぐことで
あろう。この機能に従い、「ゲッター」構造を、電気絶縁体と、選択された電極
に使用可能に接続された金属化層との間の境界面に配置することができる。 コードされた親和性分子がペプチド又はオリゴヌクレオチドである実施例にお
いては、本発明の支持体は少なくとも一つの電極に隣接している。即ち、電極は
、電気的に絶縁性の領域に実質的に囲まれた、支持体の導電性領域である。電極
は、支持体に近接しているという条件に従って、支持体に配置してもよく、即ち
、支持体中又は支持体上に埋め込むことができ、また、支持体の隣、下、あるい
は上に置いてもよいが、電極で電気化学的に生成された試薬による、モノマー及
び／又は分子上の化学官能基の脱保護が適切に行われるよう、支持体近くに十分
隣接している必要がある。 少なくとも１つの電極のすぐ近くにあることの他に、基質は、その表面に、電
気化学的に除去可能な保護基によって保護された少なくとも１つの化学的官能基
を有する少なくとも１つの分子、好ましくは幾つかの分子を有する。保護された
化学的官能基を有するこれらの分子はまた、電極のすぐ近くにある必要がある。
これに関して、基質の表面上の分子は、電極に十分近く接近している必要があり
、それによって、電極で生成される電気化学的試薬が、直ぐ近くの分子上の少な
くとも１つの保護された官能基から保護基を除去することができる。 基質の表面に付けられた保護された化学的官能基を有する分子は一般に、モノ
マー、リンカー分子および予備形成された（ｐｒｅ−ｆｏｒｍｅｄ）分子から選
択することができる。好ましくは、基質の表面に付いた分子は、モノマー、ヌク
レオチド、アミノ酸、ペプチドおよびリンカー分子を包含する。これらの分子の
すべてが通常、共有結合またはイオン性相互作用によって基質に結合する。ある
いは、これらの分子のすべてが、また共有結合またはイオン性相互作用によって
、基質の表面を覆う層、例えば透過性膜層に結合されることができ、この層は、
幾つかの異なる方法（共有結合、イオン性相互作用、分散性相互作用および親水
性または疎水性相互作用を含む）で、基質表面に付着けられることができる。な
お別の付着方法では、モノマーまたは予備形成された分子は、基質または基質を
覆う層に結合されたリンカー分子に結合されることができる。 本明細書において使用されるモノマー、リンカー分子および予備形成された分
子は、好ましくはアミノ酸またはヌクレオチドであり、好ましくは、電気化学的
に製造された試薬によって除去することができる保護基により保護されている化
学的官能基を備えている。電気化学的に製造された試薬によって脱保護されるこ
とができる化学的官能基が、基質表面上の分子に存在しないと、次のモノマーま
たは予備形成された分子の結合が、この分子で生じることができない。好ましく
は、保護基は、基質の反対側で、リンカー分子、モノマーまたは予備形成された
分子の遠位端もしくは末端にある。すなわち、リンカー分子は好ましくは、電気
化学的に除去可能な保護基を有する化学的官能基、例えばアミノもしくはカルボ
ン酸基で終結する。モノマー、リンカー分子および予備形成された分子において
見出される化学的官能基には、任意の化学的に反応性の官能性が包含される。通
常、化学的官能基は、対応する保護基と関連しており、合成される生成物に基づ
いて選択または使用される。本発明の分子は、共有結合またはイオン性相互作用
によって、脱保護された化学的官能基に結合する。 親和性アンカーとしての使用を企図される種々のコード化親和性ポリマー、特
にオリゴヌクレオチドおよびペプチドを合成するために本発明の方法に従い使用
されるモノマー、特にオリゴヌクレオチドおよびアミノ酸は、一緒に結合されて
ポリマーを形成することができる小さい分子の組のすべてのメンバーを包含する
。この組としては、限定されることはないが、普通のＬ−アミノ酸の組、Ｄ−ア
ミノ酸の組および合成アミノ酸の組が挙げられる。モノマーは、ポリマーの合成
のための基本組（ｂａｓｉｓ ｓｅｔ）の任意のメンバーを包含する。例えば、
Ｌ−アミノ酸の３量体は、ポリペプチドの合成のために約８０００のモノマーの
基本組を形成する。ポリマーの合成における連続工程において、異なる基本組の
モノマーを使用することができる。合成法に従い使用できるモノマーの数は広く
変化し得る。例えば、２〜数千個のモノマーが使用できるが、より好ましい実施
態様においては、モノマーの数は、約４〜約２００の範囲であり、より好ましく
はモノマーの数は４〜２０の範囲である。 さらに、本質的に任意の予備形成された分子が、コード化親和性分子として働
くことができ、基質、基質を覆う層、モノマーまたはリンカー分子に結合するこ
とができ、かつ、親和性アンカーとして働くことができる。予備形成された分子
としては、例えばタンパク質（特にレセプター、酵素、イオンチャネルおよび抗
体を含む）、核酸、抗原等が挙げられる。予備形成された分子は一般に、基質上
以外の部位に形成される。好ましい実施態様においては、予備形成された分子は
、分子、モノマー、または別の予備形成された分子上の脱保護された官能基に結
合される。これについては、すでに基質に付けられた予備形成された分子は追加
的に、化学的官能基の脱保護の後にモノマーまたは他の予備形成された分子が結
合することができる、少なくとも１つの保護された化学的官能基を有することが
できる。 保護基は、モノマー、リンカー分子または予備形成された分子に結合して、モ
ノマー、リンカー分子または予備形成された分子上の反応性の官能性を保護する
物質であり、活性化剤、例えば電気化学的に製造された試薬に選択的にさらすと
除去されることができる。本発明に従い使用することができる保護基は好ましく
は、すべての酸および塩基不安定な保護基を包含する。例えば、ペプチドアミン
基は好ましくは、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）またはベンジルオキシ
カルボニル（ＣＢＺ）（その両方が酸不安定である）によって、または９−フル
オレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）（塩基不安定である）によって保護さ
れる。その上、ホスホロアミダイト上のヒドロキシ基は、ジメトキシトリチル（
ＤＭＴ）（酸不安定である）により保護することができる。ヌクレオシド、特に
ホスホロアミダイト上の環外アミン基は好ましくは、アデノシンおよびグアノシ
ン塩基上のジメチルホルムアミジンならびに、シチジン塩基上のイソブチリルに
より保護され、これらは両方塩基不安定性保護基である。この保護法は、高速（
ｆａｓｔ）オリゴヌクレオチド脱保護（ＦＯＤ）として知られている。この方法
で保護されたホスホロアミダイトは、ＦＯＤホスホロアミダイトとして知られて
いる。 本発明に従い使用できるさらなる保護基は、アミノ部分を保護するための酸不
安定基：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニ
ル、アダマンチルオキシカルボニル、１−メチルシクロブチルオキシカルボニル
、２−（ｐ−ビフェニル）プロピル（２）オキシカルボニル、２−（ｐ−フェニ
ルアゾフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，
５−ジメチルオキシベンジルオキシ−カルボニル、２−フェニルプロピル（２）
オキシカルボニル、４−メチルオキシベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキ
シカルボニル、フルフリルオキシカルボニル、トリフェニルメチル（トリチル）
、ｐ−トルエンスルフェニルアミノカルボニル、ジメチルホスフィノチオイル、
ジフェニルホスフィノチオイル、２−ベンゾイル−１−メチルビニル、ｏ−ニト
ロフェニルスルフェニルおよび１−ナフチリデン；アミノ部分を保護するための
塩基不安定基として：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、メチルスルホ
ニルエチルオキシカルボニルおよび５−ベンズイソアゾリルメチレンオキシカル
ボニル、；還元されるときに不安定なアミノ部分を保護するための基として：ジ
チアスクシノイル、ｐ−トルエンスルホニルおよびピペリジノ−オキシカルボニ
ル；酸化されるときに不安定なアミノ部分を保護するための基として：（エチル
チオ）カルボニル；多種多様の試薬に不安定なアミノ部分を保護するための基と
して（適当な試薬は、基の後の括弧内に挙げられている）；フタロイル（ヒドラ
ジン）、トリフルオロアセチル（ピペリジン）およびクロロアセチル（２−アミ
ノチオフェノール）；カルボン酸を保護するための酸不安定基：ｔｅｒｔ−ブチ
ルエステル；ヒドロキシル基を保護するための酸不安定基：ジメチルトリチル；
ならびにホスホトリエステル基を保護するための塩基不安定基：シアノエチルを
包含する。 上記したように、任意の未反応の脱保護された化学的官能基が、合成反応中の
任意の時点でかぶせられて（ｃａｐｐｅｄ）、そのような分子でのさらなる結合
を避けるかまたは防ぐことができる。キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）基は、例
えば未反応のアミノ官能基と結合することによって脱保護された官能基を「キャ
ップ（ｃａｐ）」して、アミドを形成する。本発明において使用するのに適当な
キャッピング剤（ｃａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としては、無水酢酸、ｎ−アセ
チルイミジゾール、ギ酸イソプロペニル、フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ａｍｉｎｅ）、３−ニトロフタル酸無水物および３−スルホプロピオン酸無水物
が挙げられる。これらのうちで、無水酢酸およびｎ−アセチルイミジゾールが好
ましい。 本発明のコード化親和性分子、すなわちモノマー、リンカー分子および予備形
成された分子は、基質に直接付くことができるか、または基質を覆う別の物質の
層または膜に付くことができる。すなわち、本発明の親和性アンカーは、基質を
覆う別の物質の層または膜に付くことができる。分子を、電気化学的に製造され
た試薬による変性のためにそこに結合することができるように、基質を覆う層ま
たは膜を形成することができる物質としては、調節された多孔性のガラス（ｃｏ
ｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｏｓｉｔｙ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）；一般的ポリマ
ー、例えばテフロン（登録商標）、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスチレン 、ポリアシレート、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアミ ド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリシリコーン、ポリニトリル、多価電解質 、ヒドロゲル、エポキシポリマー、メラミン、ウレタンおよびコポリマーならび にこれらと他のポリマーとの混合物；生物学的に誘導されたポリマー、例えば多 糖、ポリヒアルロン酸およびキトン（ｃｈｉｔｏｎ）；セラミック、例えばアル ミナ、金属酸化物、クレーおよびゼオライト；界面活性剤；チオール；自己集合 単層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）；多孔性炭素；な らびにフレリン（ｆｕｌｌｅｒｉｎｅ）物質が挙げられる。膜は、スピンコーテ ィング、浸漬コーティングまたは手で施用することにより、または任意の他の当 分野で許容できるコーティングの形態によって、基質上にコーティングすること ができる。 電極にて電気化学的に生成される試薬は大きく２つの分類：酸化物及び還元物
に分けられる。発明によれば有用なその他種々雑多の精製が存在する。電気化学
的に生成できる酸化物には、ヨード、ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸、過酸化水素、次
亜塩素酸塩、メタバナデート、臭素酸塩、重クロム酸塩、セリウム（ＩＶ）及び
過マンガン酸塩が含まれる。電気化学的に生成できる還元物には、クロム（ＩＩ
）、フェロシアニド、チオール、チオスルフェート、チタン（ＩＩＩ）、ヒ素（
ＩＩＩ）及び鉄（ＩＩ）が含まれる。その他試薬には臭素、塩素、プロトン及び
ヒドロキシルイオンが含まれる。前記試薬中、プロトン、ヒドロキシルイオン、
ヨード、臭素、塩素及びチオールが好ましい。 本発明のコードされたアフィニティー分子を合成する方法の好適実施態様によ
れば、緩衝及び／又はスカベンジング液が各電極に接触している。その他電気化
学的に生成された、緩衝し及び／又はスカベンジできる試薬が考えられているが
、発明に従い使用できる緩衝及び／又はスカベンジング液はプロトン及び／又は
ヒドロキシルイオンの様なイオンを好ましく緩衝し、又はスカベンジングする。
緩衝液はあるアレー中の１電極から電気化学的に生成された試薬が別のアレーの
電極に核酸し化学的に交わることを防ぐが、一方スカベンジング液はそれに結合
し、又は反応することで電気化学的生成された試薬を中和／脱活性化することを
目的として機能する。即ち、緩衝液及び／又は素間弁じ液を利用することで、電
気化学的に生成された試薬の空間的な突出範囲を能動的にコントロールすること
ができる。発明によれば、緩衝液及びスカベンジング液は独立又は一緒に利用さ
れる。好ましくは、緩衝液の能力の方がスカベンジ液に比べ維持が容易であるこ
とから、緩衝液が利用される。 本発明に従い利用できる緩衝液は、水性又は部分的に水性である製剤に利用さ
れる全ての電解質を含む。本発明により好ましく利用される緩衝液には；ｐＨ５
付近を典型的に緩衝する酢酸緩衝液；典型的にはｐＨ８付近を緩衝するホウ酸緩
衝液；典型的にはｐＨ６付近を緩衝するクエン酸緩衝液；典型的にはｐＨ３付近
を緩衝するグリシン緩衝液；典型的にはｐＨ７付近を緩衝するＨＥＰＥＳ緩衝液
；典型的にはｐＨ７付近を緩衝するリン酸緩衝液；典型的にはｐＨ８付近を緩衝
するトリス緩衝液；及びＩ２＋Ｉ１＝Ｉ３の等式にてヨード濃度を緩衝する０．
１Ｍ ＫＩ緩衝液；この反応の平衡定数は１０−２、が含まれる。 プロトンスカベンジャーとして機能する３級アミンスあるいは非水性溶媒中に
てヒドロキシルイオンスカベンジャーとして機能するスルホン酸の様な分子種を
含むカベンジング液、又は緩衝液との組み合わせが利用されるだろう。試薬／種
がスカベンジされる速度は実際に生じる反応の固有速度とスカベンジャーの濃度
の両方に依存する。例えば、溶媒は高濃度に存在することが多いため、良好なス
カベンジャーを作る。しかし多くの分子スカベンジャーは非選択的な形で機能し
、スーパーオキサイドジスムターゼや西洋ワサビパーオキシダーゼの様な一部の
分子スカベンジャーだけが選択的にスカベンジする。 本発明の具体的利点は、例えば電極での水の加水分解により一般的に生じる、
ヒドロキシルラジカル、スーパーオキサイド、酸素ラジカル及び過酸化水素を含
む各種活性種をスカベンジすることができるスカベンジャー分子である。ヒドロ
キシルラジカルは最も反応性に富む分子の内の一つとして知られているが、その
反応速度は拡散的によりコントロールされており、従ってそれらはそれらが出会
った最初の反応物／分子種と反応する。そのため水はヒドロキシルラジカルの迅
速活効果的なスカベンジャーである。スーパーオキサイドもまた比較的反応性に
富んだ分子種であるが、非水性又は部分的に水性である溶媒中では安定している
。水性媒体中では、スーパーオキサイドはすぐに水を含む大部分の分子と反応す
る。多くの溶媒では、それらはスーパーオキサイドジアムターゼにより選択的に
スカベンジすることができる。 酸素ラジカルはフリーラジカルとして存在している酸素種のファミリーである
。それらは水又はアスコルビン酸の様な各種分子によりスカベンジできる。過酸
化水素は比較的穏和な反応種であり、特にコンビナトリアル合成に有用である。
過酸化水素は水及び多くのタイプの酸化剤及び還元剤によりスカベンジされる。
過酸化水素がスカベンジされる速度は、使用するスカベンジ分子の酸化還元電位
に依存している。過酸化水素は西洋ワサビペルオキシダーゼによっても選択的に
スカベンジするこができる。スカベンジ可能な電気化学的に生成される別の種は
ヨードである。ヨードは穏和な酸化剤であり、やはりコンビナトリアル合成に結
うようである。ヨードはヒドロキシルイオンと反応してスカベンジされ、ヨウ化
物と次亜ヨウ化物を形成する。ヨードがスカベンジされる速度はｐＨに依存して
いる；ｐＨが高いほどヨードは素早くスカベンジされる。上記の全てのスカベン
ジャーが本発明により使用することができるだろう。その他スカベンジャー分子
については、本開示を見れば当業者は容易に思い浮かべることができるだろう。 本発明のコードされた親和性分子を合成する方法によれば、緩衝液は少なくと
も０．０１ｍＭの濃度で好ましく使用される。より好ましくは緩衝液の濃度は１
ないし１００ｍＭの範囲であり、更に好ましくは緩衝液は１０ないし１００ｍＭ
の範囲の濃度にある。最適には、緩衝液濃度は約３０ｍＭである。約０．１モル
の濃度の緩衝液は、バルク値にｐＨを緩衝する前にプロトンイオン又はヒドロキ
シルイオンを約１００オングストローム動かすだろう。例えば０．０００１モル
の葉に緩衝液の濃度が低くなると、イオンの可動域は約数ミクロンになるが、こ
の距離はアレー中の電極間の距離によってはまだ許容される距離である。 本発明のコードされた親和性分子を合成する方法によれば、溶液中のスカベン
ジャー分子の濃度は、異なる修理のスカベンジャー分子は異なる速度で反応する
ため、使用する具体的なスカベンジャー分子に依存している。より反応性に富む
スカベンジャーでは必要なスカベンジング溶液濃度はより低くなり、その逆はま
た逆である。当業者はスカベンジング液の適切な濃度を選択した特異的スカベン
ジャーに基づき決定することができる。 発明の基質に近接した少なくとも１本の電極は好ましくは電極のアレーである
。数百万本の電極を含むアレーを含めいずれの寸法の電極アレーも利用できる。
好ましくは、電源よりアレー中にある複数の電極が同時にアドレスし制御できる
ことが好ましい。各電極がそれ自体の電源により個別にアドレスでき、またコン
トロールでき、それにより各種電圧を選択的に作用してアレー中の電極を選択で
きることがより好ましい。この場合、電極は“スイッチ可能”と表すことができ
る。 コード化親和性分子及び標的分子 本発明の範囲内にある例示のコード化親和性分子には、ビオチン、ストレプト
アビジン、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチドリガンド
のついた修飾ペプチド等が含まれる。当業者は、アレー上に配置された分子に対
する好適結合親和性を有する分子が使用できることを容易に理解する。本発明の
親和性アンカーがアレーに、好ましくは電気化学的に固定することで配置された
後、アレーはその上に来た所望分子と接触するだろう。 コード化親和性分子がペプチドの場合、分子はリガンド相互作用により固定結
合されるだろう。コード化親和性分子が抗体の場合には、固定化される分子は対
応する抗原であり、あるいは対応する抗原により標識されるだろう。コード化親
和性分子がオリゴヌクレオチドである場合、固定化される分子はハイブリダイゼ
ーション相互作用により結合する。コード化親和性分子がビオチン又はビオチン
標識分子の場合、固定化される分子はストレプトアビジンにより標識されるか、
又はその逆である。 固定化される分子は好適結合又はハイブリダイゼーション条件の下に親和性ア
ンカーと接触させられ、また当業者に良く知られている。固定化される分子がコ
ード化親和性分子に結合した後、過剰の未結合分子は当業者既知である好適洗浄
工程により取り除かれるだろう。 標識体 標識体は固定される分子に直接加えられるだろう。アミノ酸、ペプチド及び蛋
白質へ標識体を結合させる方法は当業者公知である。本発明での使用に適した検
出可能な標識体には、顕微鏡、光化学、生化学、免疫化学、電気的、光学的、レ
ーザー又は化学的手段により検出可能な成分を含んでいる。本発明に於いて有用
な標識体には、標識ストレプトアビジン標識体による染色に関してはビオチン、
そして磁性ビーズ（例えばＤｎｙａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えばフルオ
ロセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーンフルオレセント蛋白質等）、
放射線標識（例えば３Ｈ，２５１、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ等）、酵素（例えば
西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）及び金コロイド又は
色つきガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテッ
クス等）製ビーズが含まれる。これら標識体の利用については例えば米国特許第
３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第
３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号及び
第４，３６６，２４１号に提供されている。 これら標識体を検出する方法は当業者に良く知られている。放射線標識は写真
フィルム又はシンチレーションカウンターを利用して検出され、蛍光マーカーは
光検出装置を使い発光が検出されるだろう。酵素標識体は酵素に基質を提供し、
基質に対する酵素の作用により生じた反応産物を検出することで検出されるだろ
う。 標識体はコード化親和性分子に結合させる前、あるいは後に固定化される文意
に加えられるだろう。直接標識体は、コード化親和性分子に結合する前に、固定
化される分子に直接結合させられるか、又は取り込ませる検出可能な標識体であ
る。間接標識体は、固定化される分子がコード化親和性分子に結合した後に２量
体に結合するものである。幾つかの実施態様では、間接標識体は固定化される分
子に結合する結合成分に取り付けられる。即ち、例えば固定化される分子がハイ
ブリダイゼーションされる前にビオチン化されるだろう。ハイブリダイゼーショ
ン後、アビジン標識蛍光色素がビオチンを持ったハイブリッド二本鎖に結合し、
容易に検出できる標識体を提供する。 幾つかの実施態様では、固定化される分子それ自体は標識されていない。むし
ろコード化親和性分子が標識されているか、又は直接又は間接的にシグナル反応
性成分に結合されている。高密度マイクロアレーのコード化親和性分子に結合し
た、固定化される標識分子を検出する方法は当業者に既知である。発色標識体又
は放射火星標識プローブが利用されるだろう。 幾つかの実施態様では、固定化される分子は蛍光標識体により標識され、アレ
ー上の標識体の局在は蛍光顕微鏡を使い特定されるだろう。アレーは使用した蛍
光標識体の励起波長の抗原を使い励起され、生じた発光波長を持つ蛍光が検出さ
れる。具体的好適実施態様では、励起抗原は蛍光ラベルの励起に適したレーザー
である。共焦点顕微鏡はコンピューター制御ステージにより自動化され、アレー
を自動的にスキャンするだろう。同様に顕微鏡には自動的にデータを集めるフォ
トトラスダクターが取り付けられ、アレー上の各コード化親和性分子への結合に
おり生じた蛍光シグナルは自動的に記録されるだろう。この様な自動システムは
米国特許第５，１４３，８５４号に記載されている。 当業者は特定のコード化親和性分子及び提供されたコントロールの性質を利用
し、得られた結合の結果を評価するための方法を知るだろう。実施態様の一つで
は、各コード化親和性分子の強度は単純に定量化される。これは、アレー上の各
種コード化結合部位を表す各位置にあるコード化親和性分子のシグナル強度を測
定することで行われる。試験サンプルから固定化される分子に結合したアレーの
絶対強度をコントロールサンプルより生じた強度と比較することで、存在する分
子の相対量がわかる。 シグナルは親和度、固定される分子上の標識体の数及びサンプル内にある固定
化される分子の量によって変化する。一般には存在する分子が極めて低レベルで
ある場合、生じるシグナルも極めて低い。一部低レベル濃度ではシグナルはバッ
クグランドと区別できない。データを評価する場合閾値の強度値は、シグナルが
バックグランドから実質的に区別できない数として測定されないものより低く選
択される。低レベルの分子の検出を望む場合、より低い閾値が選ばれるだろう。
逆に、高分子濃度のみ評価する場合には、より高い閾値レベルが選択されるだろ
う。実施態様の一つでは、閾値は平均バックグランドシグナルより約１０％高い
。更に、適当なコントロールを利用することにより、条件の変動をコントロール
するより詳細な分析が可能になる。即ち、例えば好適実施態様では、空間的に多
様なコード化親和性アレーが標準化用のコントロールと共に提供される。結合条
件が不良な場合、標準化コントロールはより小さいシグナルを示し、結合条件が
良好な場合には、標準化コントロールはより高いシグナルを示す。従って、標準
化コントロールに対するアレー中のその他プローブに由来するシグナルを標準化
することで、結合条件内の変動をコントロールできる。一般には、標準化はアレ
ー中の他プローブに由来する測定シグナルを、標準化コントロールから得られた
平均シグナルで除することで求められる。標準化には、サンプル調整及び増幅に
起因する変動についての補正も含まれる。この様な標準化はサンプル調整／増幅
コントロールから得られた平均シグナルで測定シグナルを序することで行われる
。得られた値は、結果は、一定数が乗じられ結果のスケールが調整される。 次に具体的な分子の濃度は、標的分子に対し特異的に結合するコード化親和性
分子それぞれのシグナル強度を測定し、そして標準化コントロールに対し標準化
することで決定することができる。 本発明の方法はコンピューターを利用し好ましく実施される。コンピューター
は、基質より測定された結合強度を分析し、そして固定化される１またはそれ以
上の標的分子の濃度をモニタリングし／又は定量化することを目的として発明を
取り込んでいるコンピューターコードを含むソフトウエアープログラムを実行す
る。 好ましい実施態様の説明 以下で実施例により本発明を説明するが、これらは本発明の範囲を限定するも
のではない。 実施例１ 本発明の方法により、多数の異なる抗体の立体多重化アレイを作製し得る。電
極アレイを用いて、好ましくは長さ７〜１０アミノ酸の小ペプチドを合成する。
アレイの異なる電極で、異なる配列のアミノ酸を合成する。 特定の配列のアミノ酸を有するペプチドに対する特異的アフィニティーを有す
る一連の抗体を調製する。これらの抗体は、それらがコード化アフィニティーア
レイ上の特定の位置に結合アフィニティーを示す対応する配位子を固定し得る化
学タグとして役立つ。次に、これらのコード化アフィニティー抗体タグの各々を
、ある種の当該タンパク質に対するアフィニティーを有する別の抗体と結合させ
る。これらの非コード化抗体は、コード化アフィニティーアレイ中のペプチドに
対するアフィニティーを有さない。この方式で一組の抗体−抗体二量体を生成す
るが、これらは各々、コード化アフィニティーアレイ中の特定のペプチドに対す
るアフィニティー、ならびに１つ又はそれ以上のタンパク質に対するアフィニテ
ィーを有する。 すべての抗体−抗体二量体を、適切な溶媒系中で一緒に混合する。ペプチドの
立体多重化コード化アフィニティーアレイを伴う電極アレイを、抗体−抗体二量
体のこの混合物に曝露する。抗体−抗体二量体は各々、抗体タグの各々が特定の
ペプチドに対する特異的アフィニティーを有するために、コード化アフィニティ
ーアレイ上の異なる立体位置に結合する。これは、コード化アフィニティーアレ
イ中の異なる立体位置の異なる固定化抗体の自己集合を生じる。 結果的に生じたアレイは、立体的多重化方式で異なるタンパク質に対する多数
の抗体を表示する。このアレイを用いて、例えば多数の異なるタンパク質の存在
に関して細胞溶解物を検定し得る。タンパク質の同定は、非固定化抗体によりそ
れが捕獲される立体位置の座標からすぐに分かる。 実施例２ 本発明の方法により、小分子の立体多重化アレイを作製し得る。電極アレイを
用いて、長さ１５〜３０塩基対の小オリゴヌクレオチドを作製する。アレイ上の
異なる電極で、異なるオリゴヌクレオチドプローブを合成する。 組合せ化学に関する標準であるスプリットおよびプール法を用いて、一連の小
分子をビーズ上に作製する。ビーズ上に小分子が作製されるのと同時に、オリゴ
ヌクレオチドを同一ビーズ上で同時合成する。同時合成オリゴヌクレオチドの配
列は、それがビーズ上に小分子を作製するために用いられた合成工程の配列を表
すように、コードされる。このコード化オリゴヌクレオチドは、コード化アフィ
ニティーアレイ中のその相補的タグに対する特異的アフィニティーを有するタグ
を生成する。 すべてのオリゴヌクレオチドタグ化ビーズを、適切な溶媒系中で一緒に混合す
る。オリゴヌクレオチドの立体多重化コード化アフィニティーアレイを伴う電極
アレイをビーズのこの混合物に曝露する。ビーズは各々、オリゴヌクレオチドタ
グの各々がその相補的オリゴヌクレオチド配列に対する特異的アフィニティーを
有するために、コード化アフィニティーアレイ上の異なる立体位置に結合する。
これは、コード化アフィニティーアレイ中の異なる立体位置の異なる小分子を保
有する異なる固定化ビーズの自己集合を生じる。 結果的に生じたアレイは、立体的多重化方式で多数の小分子を表示する。この
アレイは、例えばアレイ中の各小分子に対する受容体の活性を検定するために用
い得る。活性化合物の同定は、その立体位置の座標から分かる。 目下の好ましい実施態様を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の精
神を逸脱しない限り種々の修正がなされ得ると理解されるべきである。したがっ
て、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、支持体上に空間的に多重化された態様で分配される小さなペプチドの
コードされた親和性アレイを示す。そのようなペプチドの空間的に多重化された
アレイは、ペプチドであるか、又はペプチドリガンドによりラベルされる標的分
子を捕獲するか又はそれに結合するために使用され得る。
【図２】 図２は、支持体上に空間的に多重化された態様で分配される小さなペプチドの
コードされた親和性アレイを示す。そのような小さなペプチドは、捕獲プローブ
として使用することができるか、又は興味あるタンパク質又はペプチドのための
捕獲プローブとして作用する第２抗体に結合することができるコード特異的抗体
のための親和性を有する。
【図３】 図３は、コードされた親和性抗体に暴露される場合、空間的に多重化された態
様で自己集成できる典型的な成分を示す。そのような例は、第１コード特異的抗
体に結合される抗体捕獲プローブ、オリゴヌクレオチドに結合される抗体捕獲プ
ローブ、ペプチドに結合される抗体捕獲プローブ、及びビーズ結合によりコード
特異的抗体に結合される有機分子を包含する。
【図４】 図４は、本発明の好ましいアレイが、あるパターンの分子を合成するためにい
かにして使用され得るかを記載する。第１に、アレイは、多量の溶媒と電極との
間での分子の自由な流れを可能にする生物適合性多孔性膜により被覆され得る。
次にアレイは、電気化学的に生成される（ＥＣＧ）興味ある試薬に、前駆体を含
む溶液において含侵され得る。次に、コンピューターが、所望する電極パターン
を表すためにアレイを調節することができ、そして前駆体が活性種に電気化学的
に転換され得る。電気化学的に生成される（ＥＣＧ）試薬は、電極をおおう膜に
固定される分子と反応する。
【図５】 図５は、選択された微小電極にすぐ隣接する領域にＥＣＧ試薬を制限する能力
を有する本発明の好ましいアレイの中心的特徴を示す。ここで、フルオレセイン
色素は、個々に調整された微小電極位置で共有固定されている。前記色素は、チ
ェッカー盤模様のパターンに強く制限され、そして活性及び不活性微小電極での
化学的クロストークを実質的に示さない。ＥＣＧ試薬の局在化のこのレベルは、
微小電極アレイが含侵される溶液の物理化学性質を利用することによって達成さ
れ得る。そのような溶液は通常、緩衝液、及びＥＣＧ試薬と反応するスキャベン
ジャーを含む。しかしながら、ＥＣＧ試薬が生成される速度は、微小電極のすぐ
近くにある小さな局所領域においてそれらの試薬と反応する溶液の能力を圧倒す
ることができる。結果として、ＥＣＧ試薬により介在される化学的性質は、選択
された微小電極近くで存在するが、しかし化学的クロストークは存在しない。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年９月２１日（２００１．９．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 自己集成アレイ
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野： 本発明は、生物学的及び化学的合成及び処理の分野に関する。本発明は、自己
集成マイクロアレイの生成方法に関する。 本出願は、1999年３月11日に出願されたアメリカ特許出願第60/123,894号の優
先権を主張する。
【０００２】 発明の背景： 生物学的及び化学的処理及び合成装置の分野は、絶え間なく進歩している。化
学的及び生物学的材料を合成するための急速な方法を提供する、多くの新規且つ
改良されたアレイ又は“遺伝子チップ”が開発されている。そのような技術の例
は、Pirrungなど., アメリカ特許第5,143,854号、Southern, WO93/22480号、Hel
ler, WO95/12808号、アメリカ特許第5,849,486号、アメリカ特許第5,632,957号
、アメリカ特許第5,605,662号、及びMontgomery, WO98/01221号に記載されるそ
れらのものを包含する。前記開示は、それらのすべてを、引用により本明細書に
組み込まれる。化学的及び生物学的材料の合成方法は、例えば写真平板技法又は
電気化学的技法を用いることができる。
【０００３】 多数の異なったリガンドの調製方法は、効果的な合理的又はランダムスクリー
ニングを可能にするのに十分な規模で使用される場合、非常に遅く且つ、極端に
高価であった。例えば、Merrifield など, J.AM. Chem Soc. 85: 2149-2154 (19
63)により記載される方法が、固体支持体上でペプチドを合成するために使用さ
れて来た。この方法においては、アミノ酸が不溶性ポリマーから製造される支持
体に共有結合される。
【０００４】 α保護された基を有するもう1つのアミノ酸が、ジペプチドを形成するために
、共有結合されたアミノ酸と反応せしめられる。洗浄の後、保護基が除去され、
そしてα保護基を有する第３のアミノ酸が前記ジペプチドに付加される。この工
程は、所望する長さの及び配列のペプチドが得られるまで、続けられる。Merrif
ieldの方法を用いる場合、多量のペプチド配列の合成は、技術的に不可能であり
、又は経済的に実用的ではない。
【０００５】 多数のペプチド配列を合成するためには、ポリマー合成のための一連の反応容
器を使用することが提案されて来た。例えば、管状反応器システムが、試薬の自
動化された連続的添加により固相支持体上で洗浄ポリマーを合成するために使用
され得る。しかしながら、この方法はまた、効果的且つ経済的スクリーニングの
ための十分に多数のポリマー配列の合成を可能にしない。
【０００６】 多数のポリマー配列を調製するためのもう１つの方法は、容器の孔のサイズよ
り大きな、既知量の反応性粒子を包含する多孔成容器を用いる。前記容器におけ
る粒子は、所望する生成物分子の配列を合成するために、所望する材料と選択的
に反応することができる。しかしながら、当業界において知られている他の方法
に関しては、この方法は、効果的なスクリーニングのための十分な種類のポリペ
プチドの合成のためには実際的でない。
【０００７】 他の技法がまた、記載されており、そして試みられて来た。それらの方法のい
くつかは、標準のマイクロタイタープレートの形成に適合する96のプラスチック
ピン上でのペプチドの合成を包含する。不運なことには、それらの技法は幾分有
用ではあるが、実質的な問題が残存している。標準のマイクロタイタープレート
を用いる方法は、合成され、そしてスクリーンされ得る配列の多様性において制
限され続けている。
【０００８】 マイクロタイタープレートの使用は、個々のポリマーがマイクロタイタープレ
ートの単離されたウェルにおいて合成されるので、実質的に純粋なポリマーを生
成することが認識されているが、所定の時間で生成され得るポリマーの数は、マ
イクロタイタープレートにおけるウェルの数、すなわち96により制限される。さ
らに、マイクロタイタープレートにおける合成のために必要とされる装置は大き
い。この制限のために、マイクロタイタープレートの使用は、比較的少数のペプ
チドを生成するために多量の空間を必要とする。
【０００９】 電気化学的合成方法及びそれを行うために多孔性アレイは、アメリカ特許出願
第09/003,075号及び第09/214,348号（それらの開示は、引用により本明細書に組
み込まれる）、及び国際特許出願PCT/US97/11463号及びPCT/US99/00599号（それ
らの開示は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載される。そのようなマ
イクロアレイ及び合成方法は、生物学的サンプルにおける興味ある分子を検出す
るよう企画されたアレイを合成するために使用され得る。そのような検出のため
のアレイを生成するための方法を提供し、そして急速且つ特異的態様で、興味あ
る分子を検出するよう企画されたアレイを製造することが、本発明の目的である
。
【００１０】 発明の要約： 第１の観点においては、本発明は、自己集成アレイの製造方法を特徴とする。
この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも1つの分
子を含む溶液に暴露する段階を含んで成る。
【００１１】 第２野観点においては、本発明は、コードされた親和性アレイを用いて、空間
的に多重化された態様で材料を固定するための方法を特徴とする。この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも1つの分
子を含む溶液に暴露する段階を含んで成り、ここで前記アレイ上に固定される分
子がコードされた親和性を有する１又は複数の分子への実質的な結合親和性を有
するリガンドを含んで成る。
【００１２】 第３の観点においては、本発明は、本発明に従って調製される自己集成アレイ
を特徴とする。本発明の方法の生成物は、空間的に多重化される、固定された材
料のアレイである。そのようなアレイは、高い処理量態様で所望する性質のため
の材料をスクリーニングするために使用され得る。そのようなアレイはまた、サ
ンプルにおける１又は複数の分子の存在を検出するためにも使用され得る。そし
て従って、診断評価を提供する。
【００１３】 第４の観点においては、本発明は、空間的に多重化された態様で表示される、
コードされた親和性分子を含んで成るアレイと、生物学的サンプルとを接触せし
め手段を含んで成る、サンプルにおける標的分子の検出方法を特徴とする。この
方法は、生物学的サンプルとの接触を特徴とする。好ましくは、前記アレイは、
少なくとも約1000のコードされた親和性分子を含んで成る。前記方法は好ましく
は、標的分子のその対応するリガンド又は結合ドメインへの結合を可能にするた
めに適切な条件下で行われる。好ましくは、前記検出は、上皮蛍光顕微鏡及びCC
Dカメラのような装置により検出され得る蛍光的にラベルされた標識を用いて行
われる。
【００１４】 発明の特定の記載： 第１の観点においては、本発明は、自己集成アレイの製造方法を特徴とする。
この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも1つの材
料を含む溶液に暴露する段階を含んで成る。 それらのアレイは、例えばガラスプレートの表面上に異なった分子を位置決定
し、前記分子を、電極アレイを用いて現場合成し、又は一連の写真平版マスクを
用いて前記分子を現場合成することによって調製され得る。コードされた分子の
空間的に多重化されたアレイを調製するための方法は、当業者に明らかであろう
。
【００１５】 種々の材料が、コードされた親和性アレイにおける種々の空間部位に対する特
定の親和性を有する種々の分子を用いて、化学的に標識され得る。前記材料は、
いずれかの所定の空間位置でコードされた親和性分子に対するそのような化学的
標識の親和性に基づいて種々の空間位置上に自己構成態様で固定され得る。コー
ドされた親和性を有する分子は好ましくは、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチ
ド、ビオチン及びストレプタビジンから成る群から選択される。
【００１６】 第２野観点においては、本発明は、コードされた親和性アレイを用いて、空間
的に多重化された態様で材料を固定するための方法を特徴とする。この方法は、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも1つの分
子を含む溶液に暴露する段階を含んで成り、ここで前記アレイ上に固定される分
子がコードされた親和性を有する１又は複数の分子への実質的な結合親和性を有
するリガンドを含んで成る。
【００１７】 第３の観点においては、本発明は、本発明に従って調製される自己集成アレイ
を特徴とする。本発明の方法の生成物は、空間的に多重化される、固定された材
料のアレイである。そのようなアレイは、高い処理量態様で所望する性質のため
の材料をスクリーニングするために使用され得る。そのようなアレイはまた、サ
ンプルにおける１又は複数の分子の存在を検出するためにも使用され得る。そし
て従って、診断評価を提供する。
【００１８】 好ましくは、アレイは、少なくとも1つの電極に最も接近して多孔性膜上で形
成される。好ましくは、電極の電流又は電位は、電極に最も接近して、又はそれ
から離れて、コンピューターによるインターフェイスにより調節され、そして操
作される。好ましい態様においては、アレイは、多孔性膜の最も近くに電極を有
する多孔性又は非固体の支持体上で形成される。特に好ましい態様においては、
少なくとも約100の電極及びペプチドが、アレイ上に存在する。さらにより好ま
しくは態様においては、少なくとも500又は少なくとも1000の電極又はペプチド
がアレイ上に存在する。１又は１以上の親和性分子が個々の電極の最も近くに存
在できることが企画される。
【００１９】 第４の観点においては、本発明は、空間的に多重化された態様で表示される、
コードされた親和性分子を含んで成るアレイと、生物学的サンプルとを接触せし
め手段を含んで成る、サンプルにおける標的分子の検出方法を特徴とする。この
方法は、生物学的サンプルとの接触を特徴とする。好ましくは、前記アレイは、
少なくとも約1000のコードされた親和性分子を含んで成る。前記方法は好ましく
は、標的分子のその対応するリガンド又は結合ドメインへの結合を可能にするた
めに適切な条件下で行われる。好ましくは、前記検出は、上皮蛍光顕微鏡及びCC
Dカメラのような装置により検出され得る蛍光的にラベルされた標識を用いて行
われる。
【００２０】 定義： 本明細書において使用される場合、次の用語は、次の一般的な意味を有するこ
とが理解される。 “空間的に多重化されたアレイ”とは、異なった空間位置で固定される異なっ
た材料を含んで成るアレイである。例としては、アレイは、グリッドの個々の要
素が２種の変数（x, y）によりラベルされる直線座標システムを使用することが
できる。このタイプのグリッド上の個々の別々の空間位置は、ユニークな２種の
種々のラベルを有する。異なった材料が、そのようなグリッドを異なった空間位
置で固定することができる。個々の固定された材料は、グリッド上の特定の空間
位置に関連している。この定義によれば、それらの固定された材料は、そのよう
なグリッドシステム上で“空間的に多重化される”。
【００２１】 用語“コードされた親和性”とは、線状、半線状又は、閉鎖−ループポリマー
鎖におけるモノマー単位の配列に依存する化学的親和性を言及する。例えば、ア
ミノ酸の所定の配列から形成される特定の短いペプチドに対して選択的である抗
体が生成され得る。親和性“コード”とは、ペプチドを形成するために使用され
るアミノ酸配列である。異なったコードされたペプチドに対して選択的に結合す
る異なった抗体が生成され得る。同様に、相補的ヌクレオチド配列に対して比較
的高いハイブリダイゼーション親和性を有するオリゴヌクレオチドが生成され得
る。
【００２２】アレイ 本発明の好ましい実施態様は、空間的に多重化したアフィニティ・アンカー・
アレイを多孔膜上に電気化学的に固定するために電極アレイを利用することを特
徴としている。本発明の方法の好ましい実施態様では、アフィニティ・アンカー
分子をそのアレイに電位化学的に付着させ、アンカー分子だけがアクティブな電
極を被覆しているアレイに付着するようにする。しかし本発明は、いろいろな方
法がある中でもフォトリソグラフィーの技術またはインク・スポッティングによ
って分子を付着させる他のアレイにも適用することが可能である。
【００２３】 本発明の方法は、特に、アメリカ合衆国特許出願シリアル番号第9/003,075号
と第09/214,348号に記述されているアレイの表面に空間的に多重化したアフィニ
ティ・アレイを作るのに応用することができる。なお、これら出願の内容は参考
としてこの明細書に組み込まれている。こうしたアレイは、ペプチドなどの化合
物を個々に指定可能な特定の位置において合成できるように設計されている。こ
うしたアレイは、コンタクトの製造者が既存の半導体製造設備を利用して低コス
トで製作することができる。
【００２４】 図4は、そうしたアレイを用いてある分子パターンを合成できることを示して
いる。まず最初に、アレイを、生体適合性のある多孔膜でコーティングする。こ
の多孔膜により、大量の溶媒と電極の間を分子が自由に流れられる。次に、この
アレイを、興味の対象である、電気化学的に生成させる(ECG)試薬の前躯体を含
む溶液に浸す。次に、コンピュータをアレイと接続して望む電極パターンにする
と、前躯体が電気化学的反応によってアクティブな種に変換される。電気化学的
に生成させた(ECG)試薬は、今度は電極を覆っている膜に固定された分子と反応
する。
【００２５】 これらの好ましいアレイの主な特徴は、ECG試薬を、選択した微小電極のごく
近傍に限定できることである。その様子を図5に示す。この図では、フルオレセ
イン染料が、指定した個々の微小電極の位置に共有結合によって固定されている
。この染料によって確実に市松模様のパターンにすることができるため、アクテ
ィブな電極とアクティブでない電極の間の化学的な交信は実質的に存在していな
い。
【００２６】 ECG試薬をこの程度に局在化することは、微小電極アレイを浸す溶液の物理化
学的反応を利用することによって実現できる。この溶液は、通常は、緩衝液と、
ECG試薬と反応するスカベンジャーとを含んでいる。しかし、ECG試薬が生成する
速度は、この溶液が微小電極のごく近傍の狭い領域でECG試薬と反応する能力を
圧倒する可能性がある。その結果、ECG試薬によって媒介される化学反応が、選
択した微小電極の周囲で起こるが、化学的な交信はない。
【００２７】 いくつかの実施態様では、好ましいこれらアレイの表面にリンカー分子層を設
けることができる。リンカー分子があることによって、モノマーまたは未完成分
子を、基板または基板を覆っている層に間接的に付着させることができる。リン
カー分子は、例えば多孔度を制御したガラス(CPG)を層材料として用い、珪素−
炭素結合によって被覆層に付着させることが好ましい。
【００２８】 リンカー分子があることによって、合成されたポリマーが容易にターゲットを
認識できるようにもなる。さらに、合成されたポリマーをある種の受容体に対し
て提示する状態を改善するためには、リンカー分子を親水特性/疎水特性に基づ
いて選択することが好ましい。例えば、親水性受容体の場合には、その受容体が
合成されたポリマーに非常によく近づくことができるようにするため親水性リン
カー分子が好ましかろう。
【００２９】 リンカー分子は、完成した基板上のポリマーが、その基板に暴露される結合部
全体と自由に相互作用するのに十分な長さであることが好ましい。リンカー分子
は、使用するときには、長さが10〜1000分子であることが好ましい。特に好まし
い実施態様では、官能基が結合部全体に十分に暴露されるよう長さが約650分子
となっている。本発明で使用することが好ましいリンカー分子としては、例えば
アリールアセチレン、2〜10個のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴ
マー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、およびこれらの組み合わせが挙げられる
。本発明の別の実施態様では、他のリンカー分子を使用することができる。そう
した他のリンカー分子は、当業者であればこの明細書の記載から理解できよう。
【００３０】 別の好ましい実施態様では、リンカー分子の中間位置に切断基を設けることが
できる。この切断基は、電気化学的に生成させた試薬を用いて切断することがで
きる。この切断基は、保護基を除去するのに用いる試薬とは異なる試薬によって
切断されることが好ましい。こうすることによって、合成が完了した後のさまざ
まな合成ポリマーまたは核酸配列を除去することができる。リンカー分子として
は、例えば、無水酢酸、n-アセチルイミジゾール、蟻酸イソプロペニル、フルオ
レスカミン、3-ニトロフタル酸無水物、3-スルホプロポン酸無水物である。これ
らの中では、無水酢酸、n-アセチルイミジゾールが好ましい。
【００３１】 リンカー分子は、完成した基板上のペプチドなどのポリマーが、その基板に暴
露される結合部全体と自由に相互作用するのに十分な長さであることが好ましい
。リンカー分子は、使用するときには、官能基が結合部全体に十分に暴露される
よう長さが約650分子となっていることが非常に好ましい。本発明で使用するこ
とが好ましいリンカー分子としては、例えばアリールアセチレン、2〜10個のモ
ノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ
酸、およびこれらの組み合わせが挙げられる。本発明の別の実施態様では、他の
リンカー分子を使用することができる。そうした他のリンカー分子は、当業者で
あればこの明細書の記載から理解できよう。
【００３２】 別の好ましい実施態様では、リンカー分子の中間位置に切断基を設けることが
できる。この切断基は、電気化学的に生成させた試薬を用いて切断することがで
きる。この切断基は、保護基を除去するのに用いる試薬とは異なる試薬によって
切断されることが好ましい。そうすることによって、合成が完了した後のさまざ
まな合成ポリマーまたはペプチドを電気化学的に生成した試薬を用いて除去する
ことができる。本発明では、特に、環外にアクティブなエステルを有する酸不安
定性4,4'-ジメチオキシトリチル分子のいろいろな誘導体を用いることができる
。
【００３３】 これらリンカー分子は、パーセプティブ・バイオシステムズ社、フラムガム、
マサチューセッツ州から入手することができる。DNAの合成中に使用する切断用
リンカー分子としては、N-スクシンイミジル-4-[ビス-(4-メトキシフェニル)-ク
ロロメチル]-ベンゾエートのほうが好ましい。この分子の合成法と使用法は、ブ
ライアン D. ギルディー、ジェイムズ M. クール、ハバート・ケスターによる「
合成生分子を修飾するための多目的な酸不安定性リンカー」、Tetrahedron Lett
ers、第31巻、第49号、7095−7098ページ、1990年に記載されている。また、ア
レイ全体に対して同時に、化学試薬、光、熱などの他の切断法も適用することが
できる。
【００３４】 切断用リンカー基を使用すると、合成された分子、例えばポリマーやアミノ酸
配列を、望む時期に電極アレイから解離または分離することができる。この解離
によって、例えば合成されたポリマーまたはアミノ酸配列を別の電極アレイまた
は第2の基板に移すことができる。明らかなことだが、当業者であれば、元の基
板上で合成された分子を第2の基板に移すのにいくつかの方法が思いつくであろ
う。
【００３５】 本発明で使用するのに好ましいアレイは、特定の形である必要はない。すなわ
ち電極は、正方形のマトリックス形である必要はない。電極アレイの形状として
考えられるのは、正方形;長方形;任意の多角形の境界を有する、直線で囲まれた
グリッド・アレイや六角形のグリッド・アレイ;各電極が共通の中心に対して同
心円をなしていて、任意の多角形で囲まれたグリッド;各電極の直径が同じであ
ったり異なっていたりする複数の電極を有するフラクタル・グリッド・アレイで
ある。本発明では、点在形態の電極も使用することができる。
【００３６】 しかし電極アレイは、少なくとも10×10のマトリックスの中に少なくとも100
個の電極を備えていることが好ましい。さらに好ましいのは、電極アレイが、例
えば少なくとも20×20のマトリックスの中に少なくとも400個の電極を備えてい
ることである。それ以上に好ましいのは、電極アレイが、例えば少なくとも64×
32のマトリックスの中に少なくとも1024個または2048個の電極を備えていること
であり、より一層好ましいのは、例えば少なくとも640×320のマトリックスの中
に少なくとも204,800個の電極を備えていることである。本発明で用いることの
できる他のサイズのアレイは、当業者であればこの明細書の記述から明らかであ
ろう。
【００３７】 本発明では、直径がほぼ1ミクロン未満〜100ミクロン(0.1ミリメートル)の電
極を有する電極アレイを用いることが好ましい。さらに、本発明では、電極の直
径とは関係なく、各電極の中心から中心までの距離が約10〜1000ミクロンの電極
アレイを用いることが好ましい。さらに好ましいのは、隣接する2つの電極の中
心が50〜100ミクロン離れていることである。
【００３８】 電極は、基板の表面と高さを同じにすることができる。しかし、本発明の好ま
しい一実施態様では、電極は、平坦な円板というよりは半球形である。さらに詳
しく説明するならば、半球形の電極の輪郭は、半球のように見える逆正接関数で
表現される。当業者であれば、このような形の電極に馴染んでいるであろう。電
極が半球形であることによって、電位が電極の径方向で一定になることが保証さ
れる。すなわち、電極が半球形であることにより、電位が電極の端部近くで中央
部よりも大きくなることがなく、電気化学的反応による試薬の生成が電極のあら
ゆる部分で同じ速度で起こることが保証される。
【００３９】 本発明で用いることのできる電極は、貴金属、例えばイリジウムおよび/また
は白金、あるいは、他の金属、例えば、パラジウム、金、銀、銅、水銀、ニッケ
ル、亜鉛、チタン、タングステン、アルミニウム、さらには、さまざまな金属の
合金や、他の導電性材料、例えば炭素などで構成することができるが、これだけ
に限定されるわけではない。なお炭素の中には、ガラス状炭素、網状ガラス様炭
素、基底面グラファイト、端面グラファイト、グラファイトが含まれる。
【００４０】 インジウム・スズ酸化物などのドーピングされた酸化物、珪素酸化物やガリウ
ム・ヒ素などの半導体も考えることができる。さらに、電極は、導電性ポリマー
、金属をドープしたポリマー、導電性セラミック、導電性粘土で構成することも
できる。貴金属の中では、白金とパラジウムが特に好ましい。というのも、これ
ら貴金属は、水素を吸収するという能力、すなわち本発明の方法において使用す
る前に水素を“あらかじめ充填する”という能力と関係した好ましい特性を有す
るからである。
【００４１】 これらアレイの他の好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の電極は、“
ゲッター”構造に近くなっている。この“ゲッター”構造は、第2の電極を有す
ることが好ましい。第2の電極は、形もサイズも任意でよい。しかし第2の電極は
、単独で、あるいはスカベンジャー溶液および/または緩衝溶液とともに、電気
化学的に生成した試薬を捕捉する機能を持つことができる。あるいは第2の電極
は、イオンが近くの電源の中、例えば半導体回路の中に拡散することを少なくし
たりなくしたりする機能を持つことができる。このような第2の電極は、すでに
説明した選択した電極と同じ材料で製造することができる。
【００４２】 アレイに使用する電極は、公知の方法で電源に接続することができる。電極を
電源に接続する好ましい方法としては、CMOSスイッチング回路、ラジオ波および
マイクロ波の周波数でアドレス可能なスイッチ、光でアドレス可能なスイッチ、
電極から半導体チップの周辺にある接続パッドへの直接接続がある。上に説明し
たようにして“ゲッター”構造の位置を決めると、半導体チップの寿命が延びる
。したがって、このような接続は特に好ましい。
【００４３】 CMOSスイッチング回路には、各電極からCMOSトランジスタ・スイッチへの接続
が含まれる。このスイッチにアクセスするには、電子的アドレス信号を、共通バ
スを通じ、各電極に付随したSRAM(スタティック・ランダム・アクセス・メモリ)
回路に送る。スイッチが“オン”になると、電極は電源に接続される。これが好
ましい１つの動作モードである。
【００４４】 ラジオ波およびマイクロ波の周波数でアドレス可能なスイッチには、ラジオ波
またはマイクロ波の信号でスイッチングされる電極が含まれる。こうすることに
より、スイッチング論理あり、および/または、スイッチング論理なしの両方の
場合にスイッチを入れることができる。スイッチは、特定の周波数または変調周
波数を受信するようにチューニングすることができ、スイッチング論理なしでス
イッチングがなされる。また、このスイッチでは両方の方法を使うこともできる
。
【００４５】 光でアドレス可能なスイッチは、光によってスイッチングがなされる。この方
法では、電極は、スイッチング論理あり、およびスイッチング論理なしでスイッ
チングすることもできる。光信号は、スイッチング論理なしでスイッチングがで
きるよう、空間的に局在させることができる。これは、例えば、レーザー・ビー
ムを電極アレイの上を走査させることによって実現する。この場合、電極は、レ
ーザーが電極を照射するごとにスイッチングされる。また、アレイ全体に光を十
分に照射し、光信号を時間変調させてコード化された信号を発生させることもで
きる。しかし、光を十分に照射する場合にはスイッチング論理が必要である。
【００４６】 間接的な方法によって光でアドレス可能な一種のスイッチングを実現すること
もできる。この方法では、電極は半導体材料で構成する。半導体電極には、閾値
電圧よりも低いバイアスをかける。バイアスが十分に低いと、電気化学的反応は
起こらない。というのも、電子がバンド・ギャップを超えるだけのエネルギーを
持っていないからである。“オン”になっている電極は、すでに他の方法でオン
にされたのであろう。電極に光を照射すると、電子が光からバンド・ギャップを
超えるのに十分なエネルギーを得るため、電気化学的反応が起こる。
【００４７】 したがって、電極アレイは、光を照射されたときはいつでも電気化学的反応を
起こす用意がある。この方法では、アレイ全体に光を十分に照射するか、あるい
は各電極に別々に光を照射することができる。この方法は、速いスイッチング・
エレクトロニクスを必要とせずに非常に速い電気化学的反応をパルス状に起こす
のに有効である。電極から半導体チップの周辺にある接続パッドへの直接接続が
別の方法としてある。もっともこの接続方法だと、アレイの密度が制限される可
能性がある。
【００４８】 望むタイプの化学種を電気化学的に生成させるには、各電極の電位が所定の最
小値になっている必要がある。これは、所定の最小電位が必要であることを意味
する。この最小電位は、電圧または電流を指定することによって実現することが
できる。例えば、各電極に必要な最小電位を実現するには2つの方法がある。す
なわち、必要な値の電圧を指定する方法と、電流を、必要な電圧を得るのに十分
な値に決める方法である。
【００４９】 必要な最小電位の値は、生成させることにした化学試薬のタイプによって決ま
ることになる。当業者であれば、望む化学種が何であるかに基づき、必要な電圧
および/または電流を容易に決定することができよう。使用可能な電位の最大値
は、やはり望む化学種が何であるかに基づいて決定される。電位が望む化学種に
関連した最大値を超える場合には、望まない化学種が生成される可能性がある。
【００５０】合成方法 本発明は、その好ましい実施例において、コードされた親和性分子を電気化学
的にアレイに固定することを特徴とする。本発明の範囲に含まれる典型的なコー
ドされた親和性分子としては、ビオチン、ストレプトアビジン、オリゴヌクレオ
チド、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチドリガンドが結合した修飾ペプチド等
が挙げられる。アレイに配置されるべき分子に対して適切な結合親和性を有する
如何なる分子も使用できることは、当業者であれば容易に理解できる。
【００５１】 親和性のアンカーがペプチド、抗原、抗体、又はオリゴヌクレオチドである場
合には、その開示内容が本明細書に参考として含まれるアメリカ合衆国特許出願
シリアル番号 09/003,075および09/214,348に記載の方法により、親和性アンカ
ーをアレイに固定することができる。図4は、本発明のアレイがどのように分子
パターンの合成に用いられるかを示している。第1に、アレイを、多量の溶媒と
電極間の分子の自由な流れを可能にする生体適合性多孔性膜によりコートする。
【００５２】 次いで、アレイを、電気化学的に生成される(ECG)目的試薬の不活性な前駆体
を含む溶液に浸漬する。ペプチドの合成では、これがアミノ保護基を取り除くた
めのECG試薬となる。その後、コンピュータにより所望の電極パターンにし、前
駆体を電気化学的に活性種に変換する。その結果、ECG試薬が、電極を被う膜に
固定された分子と反応する。溶液を適切に緩衝することにより、活性電極の領域
外へのECG試薬の拡散を排除する。
【００５３】 本発明の方法では、好ましくは、その開示内容が本明細書に参考として含まれ
る特許出願シリアル番号09/003,075および09/214,348、及び国際特許出願番号PC
T/US97/11463およびPCT/US99/00599に記載された、支持体の特定の場所での物質
の電気化学的配置方法を利用する。該方法は、電気化学的に生成される試薬と反
応する少なくとも一つの分子に近接する少なくとも一つの電極を、その表面に有
する支持体を供する工程、電極に、電極に近接する少なくとも一つの分子と反応
しうる電気化学的試薬を生成するのに十分な電圧をかける工程、及びこれによっ
て化学反応をおこす工程からなる。このような方法により、オリゴヌクレオチド
及びペプチドのようなコードされた親和性分子よりなるアレイが製造できる。
【００５４】 他の好ましい実施例では、本発明は支持体における、別々に形成されたオリゴ
ヌクレオチド又はペプチドのアレイの電気化学的合成方法を利用する。該方法は
、バッファーまたはスカベンジャー溶液を、支持体表面に近接する電極アレイと
接触させる工程、ここで該表面は一つ以上の、少なくとも一つの保護された化学
官能基がついた分子に近接しており、少なくとも一つの分子上の少なくとも一つ
の保護された化学官能基を選択的に脱保護する工程、通常はヌクレオチドまたは
アミノ酸であり、少なくとも一つの保護された化学官能基を有する第1のモノマ
ーを、該分子上の一つ以上の脱保護された化学官能基に結合する工程、該結合さ
れた分子又は少なくとも一つの保護された化学官能基を有する他の分子上の化学
官能基を選択的に脱保護する工程、通常はヌクレオチドまたはアミノ酸であり、
少なくとも一つの保護された化学官能基を有する第2のモノマーを、該結合され
た分子又は他の脱保護された分子上の一つ以上の脱保護された化学官能基に結合
する工程、及び、結合された保護モノマーまたは結合された保護分子上の化学官
能基の選択的脱保護と、これに続く、通常はヌクレオチドまたアミノ酸である添
加されたモノマーの、該脱保護された化学官能基への結合を、所望の長さを有す
る少なくとも二つの分離した高分子、通常はオリゴヌクレオチドまたはペプチド
であるが、が支持体表面に形成されるまで反復する工程からなる。
【００５５】 更なる好ましい実施例においては、本発明は、支持体上における、別々に形成
された高分子からなるコードされた親和性分子のアレイの電気化学的合成方法を
利用する。該方法は、バッファーまたはスカベンジャー溶液を、支持体表面に近
接する電極アレイと接触させる工程、ここで該表面は一つ以上の、少なくとも一
つの保護された化学官能基を有する分子に近接し、少なくとも一つの分子上の少
なくとも一つの保護された化学官能基を選択的に脱保護する工程、少なくとも一
つの保護された化学官能基を有する第1のモノマーを、該分子上の一つ以上の脱
保護された化学官能基に結合する工程、該結合された分子、又は少なくとも一つ
の保護された化学官能基を有する他の分子上の化学官能基を選択的に脱保護する
工程、少なくとも一つの保護された化学官能基を有する第2のモノマーを、該結
合された分子又は他の脱保護された分子上の脱保護された化学官能基を結合させ
る工程、および、結合された保護モノマーまたは結合された保護分子上の化学官
能基の選択的脱保護と、これに続く、添加されたモノマーの脱保護された化学官
能基への結合を、所望の長さを有する少なくとも二つの分離した高分子が支持体
表面に形成されるまで反復する工程からなる。本発明によれば、該モノマー又は
分子は通常ヌクレオチドまたはアミノ酸であり、該高分子はオリゴヌクレオチド
またはペプチドである。
【００５６】 これらの電気化学的手法によれば、高分子合成用もしくは被修飾用のいずれを
も含むモノマー、及び予備形成分子を、支持体上の小さな、正確にわかっている
位置に配置することが可能である。従って、既知のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、又は既知の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを支持体上の選択された位
置で合成することが可能である。さらに、既知のアミノ酸配列を有するペプチド
、又は既知の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを、事前に選択され、正確な
位置とポリマーの座標がわかっているような支持体上の位置で合成することが可
能である。例えば、本願において開示された発明に従えば、アミノ酸を、支持体
上の選択した位置に配置して、ペプチドの形でアミノ酸の所望の配列を合成する
ことができる。
【００５７】 本明細書に記載の合成方法の好ましい実施例では、それぞれの電極と接触する
バッファー又はスカベンジャー溶液を使用する。この溶液は、電気化学的に生成
する試薬、特にプロトン及び/又はヒドロキシルイオンを緩衝するもので、電気
的に生成されたイオンがアレイ中の一つの電極から他の電極へ拡散することによ
る化学的クロストークを能動的に防ぐ。例えば、水性または部分的に水性の媒体
に接触している電極に十分な正(又は負)電圧をかけると、水の加水分解の産物と
してプロトン(又はヒドロキシルイオン)が生じる。例えば、プロトンは、ペプチ
ドのようなコンビナトリアル合成で用いられるいくつかの分子から電気化学的保
護基を除去するのに有用である。
【００５８】 分離した純粋なペプチドを製造するためには、これらのプロトン(又はヒドロ
キシルイオン)を、選択した電極にごく近い領域に留めておくことにより、アレ
イ中で隣接する電極間の化学的クロストークを最小限にし、可能ならば排除する
ことが好ましい。選択された電極から動きだす試薬と反応し、かくしてこれらの
試薬が隣接する電極と反応するのを防ぐバッファー又はスカベンジャー溶液を用
いることにより、電気化学的に生成された試薬の移動の空間的な広がりを能動的
に調節することができる。
【００５９】 これら電気化学的に生成された試薬を、選択された電極にごく近い領域に留め
ておく別の手法は、「ゲッター」構造を選択された電極の近傍に、実質的に外環
境に接触するように配置するものである。そのような「ゲッター」構造は、スカ
ベンジャー溶液と共に、あるいは、その代わりに用いることができる。「ゲッタ
ー」構造は、当業者が容易に理解できるような、あらゆる適した材料を用いて設
計し、あらゆる適した形または大きさに成形できる。
【００６０】 そのような「ゲッター」構造の最も重要な特徴は、選択された電極から拡散し
ていくような電気化学的に生成された試薬を補足するように作用する点である。
「ゲッター」構造は、電気化学的に生成された試薬と化学的に反応することによ
り受動的に作用しうる。一方で「ゲッター」構造は、能動的に作用して、電気化
学的に生成された試薬を補足しうる。これは、電気化学的補足を起こすのに十分
な電圧を「ゲッター」構造に印加することにより実現できる。
【００６１】 「ゲッター」構造の他の機能は、選択された電極に使用可能に接続されうるト
ランジスタ等の回路に向かっての、あるいは回路内へのイオンの拡散を防ぐこと
であろう。この機能に従い、「ゲッター」構造を、電気絶縁体と、選択された電
極に使用可能に接続された金属化層との間の境界面に配置することができる。
【００６２】 コードされた親和性分子がペプチド又はオリゴヌクレオチドである実施例にお
いては、本発明の支持体は少なくとも一つの電極に隣接している。即ち、電極は
、電気的に絶縁性の領域に実質的に囲まれた、支持体の導電性領域である。電極
は、支持体に近接しているという条件に従って、支持体に配置してもよく、即ち
、支持体中又は支持体上に埋め込むことができ、また、支持体の隣、下、あるい
は上に置いてもよいが、電極で電気化学的に生成された試薬による、モノマー及
び/又は分子上の化学官能基の脱保護が適切に行われるよう、支持体近くに十分
隣接している必要がある。
【００６３】 少なくとも1つの電極のすぐ近くにあることの他に、基質は、その表面に、電
気化学的に除去可能な保護基によって保護された少なくとも1つの化学的官能基
を有する少なくとも1つの分子、好ましくは幾つかの分子を有する。保護された
化学的官能基を有するこれらの分子はまた、電極のすぐ近くにある必要がある。
これに関して、基質の表面上の分子は、電極に十分近く接近している必要があり
、それによって、電極で生成される電気化学的試薬が、直ぐ近くの分子上の少な
くとも1つの保護された官能基から保護基を除去することができる。
【００６４】 基質の表面に付けられた保護された化学的官能基を有する分子は一般に、モノ
マー、リンカー分子および予備形成された(pre-formed)分子から選択することが
できる。好ましくは、基質の表面に付いた分子は、モノマー、ヌクレオチド、ア
ミノ酸、ペプチドおよびリンカー分子を包含する。これらの分子のすべてが通常
、共有結合またはイオン性相互作用によって基質に結合する。
【００６５】 あるいは、これらの分子のすべてが、また共有結合またはイオン性相互作用に
よって、基質の表面を覆う層、例えば透過性膜層に結合されることができ、この
層は、幾つかの異なる方法(共有結合、イオン性相互作用、分散性相互作用およ
び親水性または疎水性相互作用を含む)で、基質表面に付着けられることができ
る。なお別の付着方法では、モノマーまたは予備形成された分子は、基質または
基質を覆う層に結合されたリンカー分子に結合されることができる。
【００６６】 本明細書において使用されるモノマー、リンカー分子および予備形成された分
子は、好ましくはアミノ酸またはヌクレオチドであり、好ましくは、電気化学的
に製造された試薬によって除去することができる保護基により保護されている化
学的官能基を備えている。電気化学的に製造された試薬によって脱保護されるこ
とができる化学的官能基が、基質表面上の分子に存在しないと、次のモノマーま
たは予備形成された分子の結合が、この分子で生じることができない。好ましく
は、保護基は、基質の反対側で、リンカー分子、モノマーまたは予備形成された
分子の遠位端もしくは末端にある。
【００６７】 すなわち、リンカー分子は好ましくは、電気化学的に除去可能な保護基を有す
る化学的官能基、例えばアミノもしくはカルボン酸基で終結する。モノマー、リ
ンカー分子および予備形成された分子において見出される化学的官能基には、任
意の化学的に反応性の官能性が包含される。通常、化学的官能基は、対応する保
護基と関連しており、合成される生成物に基づいて選択または使用される。本発
明の分子は、共有結合またはイオン性相互作用によって、脱保護された化学的官
能基に結合する。
【００６８】 親和性アンカーとしての使用を企図される種々のコード化親和性ポリマー、特
にオリゴヌクレオチドおよびペプチドを合成するために本発明の方法に従い使用
されるモノマー、特にオリゴヌクレオチドおよびアミノ酸は、一緒に結合されて
ポリマーを形成することができる小さい分子の組のすべてのメンバーを包含する
。この組としては、限定されることはないが、普通のL-アミノ酸の組、D-アミノ
酸の組および合成アミノ酸の組が挙げられる。
【００６９】 モノマーは、ポリマーの合成のための基本組(basis set)の任意のメンバーを
包含する。例えば、L-アミノ酸の3量体は、ポリペプチドの合成のために約8000
のモノマーの基本組を形成する。ポリマーの合成における連続工程において、異
なる基本組のモノマーを使用することができる。合成法に従い使用できるモノマ
ーの数は広く変化し得る。例えば、2〜数千個のモノマーが使用できるが、より
好ましい実施態様においては、モノマーの数は、約4〜約200の範囲であり、より
好ましくはモノマーの数は4〜20の範囲である。
【００７０】 さらに、本質的に任意の予備形成された分子が、コード化親和性分子として働
くことができ、基質、基質を覆う層、モノマーまたはリンカー分子に結合するこ
とができ、かつ、親和性アンカーとして働くことができる。予備形成された分子
としては、例えばタンパク質(特にレセプター、酵素、イオンチャネルおよび抗
体を含む)、核酸、抗原等が挙げられる。予備形成された分子は一般に、基質上
以外の部位に形成される。
【００７１】 好ましい実施態様においては、予備形成された分子は、分子、モノマー、また
は別の予備形成された分子上の脱保護された官能基に結合される。これについて
は、すでに基質に付けられた予備形成された分子は追加的に、化学的官能基の脱
保護の後にモノマーまたは他の予備形成された分子が結合することができる、少
なくとも1つの保護された化学的官能基を有することができる。
【００７２】 保護基は、モノマー、リンカー分子または予備形成された分子に結合して、モ
ノマー、リンカー分子または予備形成された分子上の反応性の官能性を保護する
物質であり、活性化剤、例えば電気化学的に製造された試薬に選択的にさらすと
除去されることができる。本発明に従い使用することができる保護基は好ましく
は、すべての酸および塩基不安定な保護基を包含する。例えば、ペプチドアミン
基は好ましくは、t-ブチルオキシカルボニル(BOC)またはベンジルオキシカルボ
ニル(CBZ)(その両方が酸不安定である)によって、または9-フルオレニルメトキ
シカルボニル(FMOC)(塩基不安定である)によって保護される。
【００７３】 その上、ホスホロアミダイト上のヒドロキシ基は、ジメトキシトリチル(DMT)(
酸不安定である)により保護することができる。ヌクレオシド、特にホスホロア
ミダイト上の環外アミン基は好ましくは、アデノシンおよびグアノシン塩基上の
ジメチルホルムアミジンならびに、シチジン塩基上のイソブチリルにより保護さ
れ、これらは両方塩基不安定性保護基である。この保護法は、高速(fast)オリゴ
ヌクレオチド脱保護(FOD)として知られている。この方法で保護されたホスホロ
アミダイトは、FODホスホロアミダイトとして知られている。
【００７４】 本発明に従い使用できるさらなる保護基は、アミノ部分を保護するための酸不
安定基:tert-ブチルオキシカルボニル、tert-アミルオキシカルボニル、アダマ
ンチルオキシカルボニル、1-メチルシクロブチルオキシカルボニル、2-(p-ビフ
ェニル)プロピル(2) オキシカルボニル、2-(p-フェニルアゾフェニリル)プロピ
ル(2) オキシカルボニル、α,α-ジメチル-3,5-ジメチルオキシベンジルオキシ-
カルボニル、2-フェニルプロピル(2) オキシカルボニル、4-メチルオキシベンジ
ルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、フルフリルオキシカルボニル
、トリフェニルメチル(トリチル)、p-トルエンスルフェニルアミノカルボニル、
ジメチルホスフィノチオイル、ジフェニルホスフィノチオイル、2-ベンゾイル-1
-メチルビニル、o-ニトロフェニルスルフェニルおよび1-ナフチリデン;
【００７５】 アミノ部分を保護するための塩基不安定基として:9-フルオレニルメチルオキ
シカルボニル、メチルスルホニルエチルオキシカルボニルおよび5-ベンズイソア
ゾリルメチレンオキシカルボニル、;還元されるときに不安定なアミノ部分を保
護するための基として:ジチアスクシノイル、p-トルエンスルホニルおよびピペ
リジノ-オキシカルボニル;酸化されるときに不安定なアミノ部分を保護するため
の基として:(エチルチオ)カルボニル;
【００７６】 多種多様の試薬に不安定なアミノ部分を保護するための基として(適当な試薬
は、基の後の括弧内に挙げられている):フタロイル(ヒドラジン)、トリフルオロ
アセチル(ピペリジン)およびクロロアセチル(2-アミノチオフェノール);カルボ
ン酸を保護するための酸不安定基:tert-ブチルエステル;ヒドロキシル基を保護
するための酸不安定基:ジメチルトリチル;ならびにホスホトリエステル基を保護
するための塩基不安定基:シアノエチルを包含する。
【００７７】 上記したように、任意の未反応の脱保護された化学的官能基が、合成反応中の
任意の時点でかぶせられて(capped)、そのような分子でのさらなる結合を避ける
かまたは防ぐことができる。キャッピング(capping)基は、例えば未反応のアミ
ノ官能基と結合することによって脱保護された官能基を「キャップ(cap)」して
、アミドを形成する。本発明において使用するのに適当なキャッピング剤(cappi
ng agent)としては、無水酢酸、n-アセチルイミジゾール、ギ酸イソプロペニル
、フルオレスカミン(fluorescamine)、3-ニトロフタル酸無水物および3-スルホ
プロピオン酸無水物が挙げられる。これらのうちで、無水酢酸およびn-アセチル
イミジゾールが好ましい。
【００７８】 本発明のコード化親和性分子、すなわちモノマー、リンカー分子および予備形
成された分子は、基質に直接付くことができるか、または基質を覆う別の物質の
層または膜に付くことができる。すなわち、本発明の親和性アンカーは、基質を
覆う別の物質の層または膜に付くことができる。分子を、電気化学的に製造され
た試薬による変性のためにそこに結合することができるように、基質を覆う層ま
たは膜を形成することができる物質としては、調節された多孔性のガラス(contr
olled porosity glass)(CPG);
【００７９】 一般的ポリマー、例えばテフロン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリアシレート、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリア
ミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリシリコーン、ポリニトリル、多価電解
質、ヒドロゲル、エポキシポリマー、メラミン、ウレタンおよびコポリマーなら
びにこれらと他のポリマーとの混合物;生物学的に誘導されたポリマー、例えば
多糖、ポリヒアルロン酸およびキトン(chiton);
【００８０】 セラミック、例えばアルミナ、金属酸化物、クレーおよびゼオライト;界面活
性剤;チオール;自己集合単層(self-assembled monolayer);多孔性炭素;ならびに
フレリン(fullerine)物質が挙げられる。膜は、スピンコーティング、浸漬コー
ティングまたは手で施用することにより、または任意の他の当分野で許容できる
コーティングの形態によって、基質上にコーティングすることができる。
【００８１】 電極にて電気化学的に生成される試薬は大きく2つの分類：酸化物及び還元物
に分けられる。発明によれば有用なその他種々雑多の精製が存在する。電気化学
的に生成できる酸化物には、ヨード、ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸、過酸化水素、次
亜塩素酸塩、メタバナデート、臭素酸塩、重クロム酸塩、セリウム(IV)及び過マ
ンガン酸塩が含まれる。電気化学的に生成できる還元物には、クロム(II)、フェ
ロシアニド、チオール、チオスルフェート、チタン(III)、ヒ素(III)及び鉄(II)
が含まれる。その他試薬には臭素、塩素、プロトン及びヒドロキシルイオンが含
まれる。前記試薬中、プロトン、ヒドロキシルイオン、ヨード、臭素、塩素及び
チオールが好ましい。
【００８２】 本発明のコードされたアフィニティー分子を合成する方法の好適実施態様によ
れば、緩衝及び/又はスカベンジング液が各電極に接触している。その他電気化
学的に生成された、緩衝し及び/又はスカベンジできる試薬が考えられているが
、発明に従い使用できる緩衝及び/又はスカベンジング液はプロトン及び/又はヒ
ドロキシルイオンの様なイオンを好ましく緩衝し、又はスカベンジングする。
【００８３】 緩衝液はあるアレー中の1電極から電気化学的に生成された試薬が別のアレー
の電極に核酸し化学的に交わることを防ぐが、一方スカベンジング液はそれに結
合し、又は反応することで電気化学的生成された試薬を中和/脱活性化すること
を目的として機能する。即ち、緩衝液及び/又は素間弁じ液を利用することで、
電気化学的に生成された試薬の空間的な突出範囲を能動的にコントロールするこ
とができる。発明によれば、緩衝液及びスカベンジング液は独立又は一緒に利用
される。好ましくは、緩衝液の能力の方がスカベンジ液に比べ維持が容易である
ことから、緩衝液が利用される。
【００８４】 本発明に従い利用できる緩衝液は、水性又は部分的に水性である製剤に利用さ
れる全ての電解質を含む。本発明により好ましく利用される緩衝液には;pH5付近
を典型的に緩衝する酢酸緩衝液;典型的にはpH8付近を緩衝するホウ酸緩衝液;典
型的にはpH6付近を緩衝するクエン酸緩衝液;典型的にはpH3付近を緩衝するグリ
シン緩衝液;典型的にはpH7付近を緩衝するHEPES緩衝液;典型的にはpH7付近を緩
衝するリン酸緩衝液;典型的にはpH8付近を緩衝するトリス緩衝液;及びI2+I1=I3
の等式にてヨード濃度を緩衝する0.1M KI緩衝液;この反応の平衡定数は10-2、が
含まれる。
【００８５】 プロトンスカベンジャーとして機能する3級アミンスあるいは非水性溶媒中に
てヒドロキシルイオンスカベンジャーとして機能するスルホン酸の様な分子種を
含むカベンジング液、又は緩衝液との組み合わせが利用されるだろう。試薬/種
がスカベンジされる速度は実際に生じる反応の固有速度とスカベンジャーの濃度
の両方に依存する。例えば、溶媒は高濃度に存在することが多いため、良好なス
カベンジャーを作る。しかし多くの分子スカベンジャーは非選択的な形で機能し
、スーパーオキサイドジスムターゼや西洋ワサビパーオキシダーゼの様な一部の
分子スカベンジャーだけが選択的にスカベンジする。
【００８６】 本発明の具体的利点は、例えば電極での水の加水分解により一般的に生じる、
ヒドロキシルラジカル、スーパーオキサイド、酸素ラジカル及び過酸化水素を含
む各種活性種をスカベンジすることができるスカベンジャー分子である。ヒドロ
キシルラジカルは最も反応性に富む分子の内の一つとして知られているが、その
反応速度は拡散的によりコントロールされており、従ってそれらはそれらが出会
った最初の反応物/分子種と反応する。
【００８７】 そのため水はヒドロキシルラジカルの迅速活効果的なスカベンジャーである。
スーパーオキサイドもまた比較的反応性に富んだ分子種であるが、非水性又は部
分的に水性である溶媒中では安定している。水性媒体中では、スーパーオキサイ
ドはすぐに水を含む大部分の分子と反応する。多くの溶媒では、それらはスーパ
ーオキサイドジアムターゼにより選択的にスカベンジすることができる。
【００８８】 酸素ラジカルはフリーラジカルとして存在している酸素種のファミリーである
。それらは水又はアスコルビン酸の様な各種分子によりスカベンジできる。過酸
化水素は比較的穏和な反応種であり、特にコンビナトリアル合成に有用である。
過酸化水素は水及び多くのタイプの酸化剤及び還元剤によりスカベンジされる。
過酸化水素がスカベンジされる速度は、使用するスカベンジ分子の酸化還元電位
に依存している。過酸化水素は西洋ワサビペルオキシダーゼによっても選択的に
スカベンジするこができる。
【００８９】 スカベンジ可能な電気化学的に生成される別の種はヨードである。ヨードは穏
和な酸化剤であり、やはりコンビナトリアル合成に結うようである。ヨードはヒ
ドロキシルイオンと反応してスカベンジされ、ヨウ化物と次亜ヨウ化物を形成す
る。ヨードがスカベンジされる速度はpHに依存している;pHが高いほどヨードは
素早くスカベンジされる。上記の全てのスカベンジャーが本発明により使用する
ことができるだろう。その他スカベンジャー分子については、本開示を見れば当
業者は容易に思い浮かべることができるだろう。
【００９０】 本発明のコードされた親和性分子を合成する方法によれば、緩衝液は少なくと
も0.01mMの濃度で好ましく使用される。より好ましくは緩衝液の濃度は1ないし1
00mMの範囲であり、更に好ましくは緩衝液は10ないし100mMの範囲の濃度にある
。最適には、緩衝液濃度は約30mMである。約0.1モルの濃度の緩衝液は、バルク
値にpHを緩衝する前にプロトンイオン又はヒドロキシルイオンを約100オングス
トローム動かすだろう。例えば0.0001モルの葉に緩衝液の濃度が低くなると、イ
オンの可動域は約数ミクロンになるが、この距離はアレー中の電極間の距離によ
ってはまだ許容される距離である。
【００９１】 本発明のコードされた親和性分子を合成する方法によれば、溶液中のスカベン
ジャー分子の濃度は、異なる修理のスカベンジャー分子は異なる速度で反応する
ため、使用する具体的なスカベンジャー分子に依存している。より反応性に富む
スカベンジャーでは必要なスカベンジング溶液濃度はより低くなり、その逆はま
た逆である。当業者はスカベンジング液の適切な濃度を選択した特異的スカベン
ジャーに基づき決定することができる。
【００９２】 発明の基質に近接した少なくとも1本の電極は好ましくは電極のアレーである
。数百万本の電極を含むアレーを含めいずれの寸法の電極アレーも利用できる。
好ましくは、電源よりアレー中にある複数の電極が同時にアドレスし制御できる
ことが好ましい。各電極がそれ自体の電源により個別にアドレスでき、またコン
トロールでき、それにより各種電圧を選択的に作用してアレー中の電極を選択で
きることがより好ましい。この場合、電極は“スイッチ可能”と表すことができ
る。
【００９３】 コード化親和性分子及び標的分子 本発明の範囲内にある例示のコード化親和性分子には、ビオチン、ストレプト
アビジン、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチドリガンド
のついた修飾ペプチド等が含まれる。当業者は、アレー上に配置された分子に対
する好適結合親和性を有する分子が使用できることを容易に理解する。本発明の
親和性アンカーがアレーに、好ましくは電気化学的に固定することで配置された
後、アレーはその上に来た所望分子と接触するだろう。
【００９４】 コード化親和性分子がペプチドの場合、分子はリガンド相互作用により固定結
合されるだろう。コード化親和性分子が抗体の場合には、固定化される分子は対
応する抗原であり、あるいは対応する抗原により標識されるだろう。コード化親
和性分子がオリゴヌクレオチドである場合、固定化される分子はハイブリダイゼ
ーション相互作用により結合する。コード化親和性分子がビオチン又はビオチン
標識分子の場合、固定化される分子はストレプトアビジンにより標識されるか、
又はその逆である。
【００９５】 固定化される分子は好適結合又はハイブリダイゼーション条件の下に親和性ア
ンカーと接触させられ、また当業者に良く知られている。固定化される分子がコ
ード化親和性分子に結合した後、過剰の未結合分子は当業者既知である好適洗浄
工程により取り除かれるだろう。
【００９６】 標識体 標識体は固定される分子に直接加えられるだろう。アミノ酸、ペプチド及び蛋
白質へ標識体を結合させる方法は当業者公知である。本発明での使用に適した検
出可能な標識体には、顕微鏡、光化学、生化学、免疫化学、電気的、光学的、レ
ーザー又は化学的手段により検出可能な成分を含んでいる。
【００９７】 本発明に於いて有用な標識体には、標識ストレプトアビジン標識体による染色
に関してはビオチン、そして磁性ビーズ(例えばDnyabeadsTM)、蛍光色素(例えば
フルオロセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーンフルオレセント蛋白質
等)、放射線標識(例えば3H,251、35S、14C、32P等)、酵素(例えば西洋ワサビパ
ーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等)及び金コロイド又は色つきガラス
又はプラスチック(例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等)製ビー
ズが含まれる。これら標識体の利用については例えば米国特許第3,817,837号;第
3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号及び
第4,366,241号に提供されている。
【００９８】 これら標識体を検出する方法は当業者に良く知られている。放射線標識は写真
フィルム又はシンチレーションカウンターを利用して検出され、蛍光マーカーは
光検出装置を使い発光が検出されるだろう。酵素標識体は酵素に基質を提供し、
基質に対する酵素の作用により生じた反応産物を検出することで検出されるだろ
う。
【００９９】 標識体はコード化親和性分子に結合させる前、あるいは後に固定化される文意
に加えられるだろう。直接標識体は、コード化親和性分子に結合する前に、固定
化される分子に直接結合させられるか、又は取り込ませる検出可能な標識体であ
る。間接標識体は、固定化される分子がコード化親和性分子に結合した後に2量
体に結合するものである。幾つかの実施態様では、間接標識体は固定化される分
子に結合する結合成分に取り付けられる。即ち、例えば固定化される分子がハイ
ブリダイゼーションされる前にビオチン化されるだろう。ハイブリダイゼーショ
ン後、アビジン標識蛍光色素がビオチンを持ったハイブリッド二本鎖に結合し、
容易に検出できる標識体を提供する。
【０１００】 幾つかの実施態様では、固定化される分子それ自体は標識されていない。むし
ろコード化親和性分子が標識されているか、又は直接又は間接的にシグナル反応
性成分に結合されている。高密度マイクロアレーのコード化親和性分子に結合し
た、固定化される標識分子を検出する方法は当業者に既知である。発色標識体又
は放射火星標識プローブが利用されるだろう。
【０１０１】 幾つかの実施態様では、固定化される分子は蛍光標識体により標識され、アレ
ー上の標識体の局在は蛍光顕微鏡を使い特定されるだろう。アレーは使用した蛍
光標識体の励起波長の抗原を使い励起され、生じた発光波長を持つ蛍光が検出さ
れる。具体的好適実施態様では、励起抗原は蛍光ラベルの励起に適したレーザー
である。共焦点顕微鏡はコンピューター制御ステージにより自動化され、アレー
を自動的にスキャンするだろう。同様に顕微鏡には自動的にデータを集めるフォ
トトラスダクターが取り付けられ、アレー上の各コード化親和性分子への結合に
おり生じた蛍光シグナルは自動的に記録されるだろう。この様な自動システムは
米国特許第5,143,854号に記載されている。
【０１０２】 当業者は特定のコード化親和性分子及び提供されたコントロールの性質を利用
し、得られた結合の結果を評価するための方法を知るだろう。実施態様の一つで
は、各コード化親和性分子の強度は単純に定量化される。これは、アレー上の各
種コード化結合部位を表す各位置にあるコード化親和性分子のシグナル強度を測
定することで行われる。試験サンプルから固定化される分子に結合したアレーの
絶対強度をコントロールサンプルより生じた強度と比較することで、存在する分
子の相対量がわかる。
【０１０３】 シグナルは親和度、固定される分子上の標識体の数及びサンプル内にある固定
化される分子の量によって変化する。一般には存在する分子が極めて低レベルで
ある場合、生じるシグナルも極めて低い。一部低レベル濃度ではシグナルはバッ
クグランドと区別できない。データを評価する場合閾値の強度値は、シグナルが
バックグランドから実質的に区別できない数として測定されないものより低く選
択される。低レベルの分子の検出を望む場合、より低い閾値が選ばれるだろう。
逆に、高分子濃度のみ評価する場合には、より高い閾値レベルが選択されるだろ
う。実施態様の一つでは、閾値は平均バックグランドシグナルより約10%高い。
更に、適当なコントロールを利用することにより、条件の変動をコントロールす
るより詳細な分析が可能になる。即ち、例えば好適実施態様では、空間的に多様
なコード化親和性アレーが標準化用のコントロールと共に提供される。
【０１０４】 結合条件が不良な場合、標準化コントロールはより小さいシグナルを示し、結
合条件が良好な場合には、標準化コントロールはより高いシグナルを示す。従っ
て、標準化コントロールに対するアレー中のその他プローブに由来するシグナル
を標準化することで、結合条件内の変動をコントロールできる。一般には、標準
化はアレー中の他プローブに由来する測定シグナルを、標準化コントロールから
得られた平均シグナルで除することで求められる。標準化には、サンプル調整及
び増幅に起因する変動についての補正も含まれる。この様な標準化はサンプル調
整/増幅コントロールから得られた平均シグナルで測定シグナルを序することで
行われる。得られた値は、結果は、一定数が乗じられ結果のスケールが調整され
る。
【０１０５】 次に具体的な分子の濃度は、標的分子に対し特異的に結合するコード化親和性
分子それぞれのシグナル強度を測定し、そして標準化コントロールに対し標準化
することで決定することができる。 本発明の方法はコンピューターを利用し好ましく実施される。コンピューター
は、基質より測定された結合強度を分析し、そして固定化される1またはそれ以
上の標的分子の濃度をモニタリングし/又は定量化することを目的として発明を
取り込んでいるコンピューターコードを含むソフトウエアープログラムを実行す
る。
【０１０６】 好ましい実施態様の説明 以下で実施例により本発明を説明するが、これらは本発明の範囲を限定するも
のではない。 実施例1. 本発明の方法により、多数の異なる抗体の立体多重化アレイを作製し得る。電
極アレイを用いて、好ましくは長さ7〜10アミノ酸の小ペプチドを合成する。ア
レイの異なる電極で、異なる配列のアミノ酸を合成する。
【０１０７】 特定の配列のアミノ酸を有するペプチドに対する特異的アフィニティーを有す
る一連の抗体を調製する。これらの抗体は、それらがコード化アフィニティーア
レイ上の特定の位置に結合アフィニティーを示す対応する配位子を固定し得る化
学タグとして役立つ。次に、これらのコード化アフィニティー抗体タグの各々を
、ある種の当該タンパク質に対するアフィニティーを有する別の抗体と結合させ
る。これらの非コード化抗体は、コード化アフィニティーアレイ中のペプチドに
対するアフィニティーを有さない。この方式で一組の抗体-抗体二量体を生成す
るが、これらは各々、コード化アフィニティーアレイ中の特定のペプチドに対す
るアフィニティー、ならびに1つ又はそれ以上のタンパク質に対するアフィニテ
ィーを有する。
【０１０８】 すべての抗体-抗体二量体を、適切な溶媒系中で一緒に混合する。ペプチドの
立体多重化コード化アフィニティーアレイを伴う電極アレイを、抗体-抗体二量
体のこの混合物に曝露する。抗体-抗体二量体は各々、抗体タグの各々が特定の
ペプチドに対する特異的アフィニティーを有するために、コード化アフィニティ
ーアレイ上の異なる立体位置に結合する。これは、コード化アフィニティーアレ
イ中の異なる立体位置の異なる固定化抗体の自己集合を生じる。
【０１０９】 結果的に生じたアレイは、立体的多重化方式で異なるタンパク質に対する多数
の抗体を表示する。このアレイを用いて、例えば多数の異なるタンパク質の存在
に関して細胞溶解物を検定し得る。タンパク質の同定は、非固定化抗体によりそ
れが捕獲される立体位置の座標からすぐに分かる。
【０１１０】 実施例2. 本発明の方法により、小分子の立体多重化アレイを作製し得る。電極アレイを
用いて、長さ15〜30塩基対の小オリゴヌクレオチドを作製する。アレイ上の異な
る電極で、異なるオリゴヌクレオチドプローブを合成する。
【０１１１】 組合せ化学に関する標準であるスプリットおよびプール法を用いて、一連の小
分子をビーズ上に作製する。ビーズ上に小分子が作製されるのと同時に、オリゴ
ヌクレオチドを同一ビーズ上で同時合成する。同時合成オリゴヌクレオチドの配
列は、それがビーズ上に小分子を作製するために用いられた合成工程の配列を表
すように、コードされる。このコード化オリゴヌクレオチドは、コード化アフィ
ニティーアレイ中のその相補的タグに対する特異的アフィニティーを有するタグ
を生成する。
【０１１２】 すべてのオリゴヌクレオチドタグ化ビーズを、適切な溶媒系中で一緒に混合す
る。オリゴヌクレオチドの立体多重化コード化アフィニティーアレイを伴う電極
アレイをビーズのこの混合物に曝露する。ビーズは各々、オリゴヌクレオチドタ
グの各々がその相補的オリゴヌクレオチド配列に対する特異的アフィニティーを
有するために、コード化アフィニティーアレイ上の異なる立体位置に結合する。
これは、コード化アフィニティーアレイ中の異なる立体位置の異なる小分子を保
有する異なる固定化ビーズの自己集合を生じる。
【０１１３】 結果的に生じたアレイは、立体的多重化方式で多数の小分子を表示する。この
アレイは、例えばアレイ中の各小分子に対する受容体の活性を検定するために用
い得る。活性化合物の同定は、その立体位置の座標から分かる。 目下の好ましい実施態様を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の精
神を逸脱しない限り種々の修正がなされ得ると理解されるべきである。したがっ
て、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、支持体上に空間的に多重化された態様で分配される小さなペプチドの
コードされた親和性アレイを示す。そのようなペプチドの空間的に多重化された
アレイは、ペプチドであるか、又はペプチドリガンドによりラベルされる標的分
子を捕獲するか又はそれに結合するために使用され得る。
【図２】 図２は、支持体上に空間的に多重化された態様で分配される小さなペプチドの
コードされた親和性アレイを示す。そのような小さなペプチドは、捕獲プローブ
として使用することができるか、又は興味あるタンパク質又はペプチドのための
捕獲プローブとして作用する第2抗体に結合することができるコード特異的抗体
のための親和性を有する。
【図３】 図３は、コードされた親和性抗体に暴露される場合、空間的に多重化された態
様で自己集成できる典型的な成分を示す。そのような例は、第1コード特異的抗
体に結合される抗体捕獲プローブ、オリゴヌクレオチドに結合される抗体捕獲プ
ローブ、ペプチドに結合される抗体捕獲プローブ、及びビーズ結合によりコード
特異的抗体に結合される有機分子を包含する。
【図４】 図４は、本発明の好ましいアレイが、あるパターンの分子を合成するためにい
かにして使用され得るかを記載する。第1に、アレイは、多量の溶媒と電極との
間での分子の自由な流れを可能にする生物適合性多孔性膜により被覆され得る。
次にアレイは、電気化学的に生成される(ECG)興味ある試薬に、前駆体を含む溶
液において含侵され得る。次に、コンピューターが、所望する電極パターンを表
すためにアレイを調節することができ、そして前駆体が活性種に電気化学的に転
換され得る。電気化学的に生成される(ECG)試薬は、電極をおおう膜に固定され
る分子と反応する。
【図５】 図５は、選択された微小電極にすぐ隣接する領域にECG試薬を制限する能力を
有する本発明の好ましいアレイの中心的特徴を示す。ここで、フルオレセイン色
素は、個々に調整された微小電極位置で共有固定されている。前記色素は、チェ
ッカー盤模様のパターンに強く制限され、そして活性及び不活性微小電極での化
学的クロストークを実質的に示さない。ECG試薬の局在化のこのレベルは、微小
電極アレイが含侵される溶液の物理化学性質を利用することによって達成され得
る。そのような溶液は通常、緩衝液、及びECG試薬と反応するスキャベンジャー
を含む。しかしながら、ECG試薬が生成される速度は、微小電極のすぐ近くにあ
る小さな局所領域においてそれらの試薬と反応する溶液の能力を圧倒することが
できる。結果として、ECG試薬により介在される化学的性質は、選択された微小
電極近くで存在するが、しかし化学的クロストークは存在しない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年２月２２日（２００２．２．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 33/543 ５９３ // Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ 33/543 ５９３ Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA12 4B029 AA07 AA21 AA23 BB15 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ41 QR31 QR38 QR55 QS34 4G075 AA22 AA39 AA65 CA20 CA36 EC21 FB02 FB03 FB06 FC11 FC13

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 自己集成アレイの製造方法であって、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
    アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも１つの分
    子を含む溶液に暴露する段階を含んで成る方法。
  2. 【請求項２】 前記アレイが、ガラスプレートの表面上で形成される請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記アレイが、電極上で又はその最も近くで形成される請求
    項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 １又は複数の空間的多重化されたアレイの調製が、一連の写
    真平版マスクを用いて、１又は複数の分子を合成することを含んで成る請求項１
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 １又は複数の空間的に多重化されたアレイの調製が、電気化
    学的手段を用いて、１又は複数の分子を合成することを含んで成る請求項１記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 コードされた親和性を有する前記分子が、ペプチド、抗体、
    オリゴヌクレオチド、ビオチン及びストレプタビジンから成る群から選択される
    請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記固定される分子が、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチ
    ド、ビオチン及びストレプタビジンから成る群から選択される請求項１記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 コードされた親和性アレイ上に空間的多重化された態様で分
    子を固定するための方法であって、 （ａ）コードされた親和性を有する分子の１又は複数の空間的に多重化された
    アレイを調製し；そして （ｂ）前記親和性アレイを前記アレイ上に固定されるべき少なくとも１つの分
    子を含む溶液に暴露する段階を含んで成り、ここで前記アレイ上に固定される分
    子がコードされた親和性を有する１又は複数の分子への実質的な結合親和性を有
    するリガンドを含んで成る方法。
  9. 【請求項９】 前記アレイが、ガラスプレートの表面上で形成される請求項
    ９記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記アレイが、電極上で又はその最も近くで形成される請
    求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 １又は複数の空間的多重化されたアレイの調製が、一連の
    写真平版マスクを用いて、１又は複数の分子を合成することを含んで成る請求項
    ９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 １又は複数の空間的に多重化されたアレイの調製が、電気
    化学的手段を用いて、１又は複数の分子を合成することを含んで成る請求項９記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 コードされた親和性を有する前記分子が、ペプチド、抗体
    、オリゴヌクレオチド、ビオチン及びストレプタビジンから成る群から選択され
    る請求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記固定される分子が、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオ
    チド、ビオチン及びストレプタビジンから成る群から選択される請求項９記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１記載の方法に従って製造される自己集成アレイ。
  16. 【請求項１６】 少なくとも１つの電極に最も近くの多孔性膜、及び少なく
    とも１つのコードされた親和性分子を含んで成る自己集成アレイ。
  17. 【請求項１７】 サンプルにおける標的分子の検出方法であって、空間的に
    多重化された態様で表示される、コードされた親和性分子を含んで成るアレイと
    、生物学的サンプルとを接触せしめ手段を含んで成る方法。
  18. 【請求項１８】 前記アレイが、少なくとも１０００のコードされた親和性
    分子を含んで成る請求項１７記載の方法。
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