JP2002536956A - Recombinant potyvirus constructs and uses thereof - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、組換えポチウイルス感染性核酸に関し、好ましくは、植物の干渉作用に有用な構成物、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであって、ＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子保存ＦＲＮＫボックス配列が、置換、好ましくはＡｒｇの置換を含むことを特徴とする全長クローンを含む構成物に関する。前記構成物はさらに、アブラムシの伝染を効率的に止める置換を含有することが好ましい。さらに本発明は、前記構成物を用いて、ポチウイルスの弱い株を保護する方法および、前記構成物を用いて植物をウイルス感染から保護し、植物中の外来核酸（遺伝子）を一過性発現させる方法に関する。好ましくは、本発明はウリ科植物をＺＹＭＶ感染から干渉作用によって保護する方法に関する。本発明はまた、植物を機械的接種または衝撃によって接種することによって、組換えポチウイルス感染性構成物を用いて植物のウイルス感染を保護する方法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a recombinant potyvirus infectious nucleic acid, preferably a construct, cDNA or RNA useful for plant interference, wherein the HC-Pro gene-conserved FRNK box sequence is substituted, preferably Arg substituted. Or a construct comprising a full-length clone. Preferably, the composition further comprises a substitution that effectively stops aphid transmission. Further, the present invention provides a method for protecting a weak strain of a potyvirus using the above-mentioned composition, and a method for protecting a plant from virus infection using the above-mentioned composition and transiently expressing a foreign nucleic acid (gene) in the plant. How to make it. Preferably, the invention relates to a method for protecting Cucurbitaceae plants from ZYMV infection by interference. The present invention also relates to a method of protecting a plant from viral infection with a recombinant potyvirus infectious construct by inoculating the plant by mechanical inoculation or bombardment.
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は一般的に、植物におけるウイルス感染に対する保護のために有用な組
換えポチウイルス感染性核酸構成物、および前記構成物を有する組換えウイルス
に関する。特に本発明は、保存ＦＲＮＫボックスをコードする配列が置換を含有
するＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子を含む組換えポチウイルス感染性構成物に関する。アル
ギニン（Ａｒｇ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）で置換されていることが好ましい。FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates generally to recombinant potyvirus infectious nucleic acid constructs useful for protection against viral infection in plants, and to recombinant viruses having such constructs. In particular, the invention relates to a recombinant potyvirus infectious construct comprising a HC-Pro gene in which the sequence encoding the conserved FRNK box contains a substitution. Preferably, arginine (Arg) is substituted with isoleucine (Ile).
【０００２】 さらに本発明は、上記構成物を利用したポチウイルスの弱い株の生成方法、お
よびウイルス感染から植物を保護するための方法および前記構成物を用いて植物
中の外来核酸（遺伝子）を一過性発現させる方法に関する。本発明は、ＺＹＭＶ
感染に対するウリ科植物の干渉作用の方法に関する。Further, the present invention provides a method for producing a weak strain of potyvirus using the above-described composition, a method for protecting plants from virus infection, and the use of the above-mentioned composition to convert a foreign nucleic acid (gene) in a plant. The present invention relates to a method for transient expression. The present invention relates to ZYMV
The present invention relates to a method of interference action of cucurbits against infection.
【０００３】 （発明の背景） ウリ科植物は、例えば、キュウリ、カボチャ、カンタロープ、ズッキーニ、パ
ンプキン、メロン、スイカ等のように、世界中で栽培されている、いくつか経済
的に重要な種を含む植物の広い科である。世界中のウリ科植物の生産は、アブラ
ムシが運ぶいくつかのウイルスにより、損害を被っている。最も蔓延しているウ
イルスは、２つのポチウイルス ＺＹＭＶ(ズッキーニイエローモザイクウイル
ス)、ＷＭＶ−２（スイカモザイクウイルス２）、そしてＣＭＶ（キュウリモザ
イクウイルス)である。ＺＹＭＶ感染した植物は、例えば、葉脈透化（vein clea
ning）等の症状が表れ、次に、感染した葉全体に黄色のモザイクが表れる。また
、萎縮や歪みを示すこともある。感染が軽い場合は、生産高の質と量が影響を受
け、感染が重い場合は、生産全体が損失し、重大な経済的損害が生じる。BACKGROUND OF THE INVENTION Cucurbitaceous plants are some economically important species that are cultivated worldwide, such as, for example, cucumber, pumpkin, cantaloupe, zucchini, pumpkin, melon, watermelon, and the like. It is a broad family of plants including. Production of cucurbits around the world has been damaged by several viruses carried by aphids. The most prevalent viruses are the two potyviruses ZYMV (Zucchini Yellow Mosaic Virus), WMV-2 (Watermelon Mosaic Virus 2), and CMV (Cucumber Mosaic Virus). Plants infected with ZYMV are, for example, vein clea
ning), followed by a yellow mosaic throughout the infected leaves. It may also show atrophy and distortion. If the infection is light, the quality and quantity of the production will be affected; if the infection is heavy, the whole production will be lost and serious economic damage will occur.
【０００４】 制御方法としては、フィトサニテーション（phytosanitation）、アブラムシ
が持つウイルスをひきつけ、植物の周りにオイルスプレーのような疎水性バリア
を形成する着色されたプラスチック性の根覆いの使用が含まれる。これらは、多
大な感染に対して一時的で限定された保護を提供するものである。[0004] Control methods include phytosanitation, the use of colored plastic mulch to attract the aphid virus and form a hydrophobic barrier, such as an oil spray, around the plant. . These provide temporary and limited protection against massive infections.
【０００５】 古典的な品種改良、または、ウイルス由来の核酸配列を植物ゲノムに導入した
植物遺伝子工学の技術によるウイルス耐性品種の開発が、ウイルス感染から植物
を保護することに用いられている。ＺＹＭＶに耐性を示すカボチャハイブリッド
組換え近交系ラインが生成された(トリコリ ディー エム（Tricoli D.M.）、 カ
ーニー ケー ジェー（Carney K.J.）、ラッセル マックマスター ピー エフ（ R
ussell McMaster P.F.）、グロフ ディー ダブリュー（Groff D.W.）、ハーデン
ケー シー（Hadden K.C.）、ヒンメル ピー ティー（Himmel P.T.）、ハバード
ジェー ピー（Hubbard J. P.）、ボーショー エム エル（Boeshore M.L.）およ
びキーメード エイチ ディー（Quemada H.D.） (1995) バイオテクノロジー（Bi
otechnology ）13;1458)。しかし、これらは１品種だけに限定されている。[0005] Classical breeding or development of virus-resistant varieties by plant genetic engineering techniques in which a nucleic acid sequence derived from a virus has been introduced into a plant genome has been used to protect plants from virus infection. Pumpkin hybrid recombinant inbred lines resistant to ZYMV have been generated (Tricoli DM, Carney KJ, Russell Macmaster PF (R
ussell McMaster PF), Groff DW, Harden KC, Himmel PT, Himmel PT, Hubbard JP, Boeshore ML and Quemada HD) (1995) Biotechnology (Bi
otechnology) 13; 1458). However, they are limited to only one variety.
【０００６】 干渉作用の現象は、ウイルス病を制御するための良好な方法である。それは、
同じウイルスの強い株に感染することによる損傷に対し、保護するためにウイル
スの弱い株を使用するものである。[0006] The phenomenon of interference is a good way to control viral diseases. that is,
The use of a weak strain of the virus to protect against damage from infecting a strong strain of the same virus.
【０００７】 ウリ科植物において、特にＺＹＭＶに対する干渉作用は、魅力的な選択肢であ
る。干渉作用は、重篤な疾患の圧力のもとで特に効果的である。ウリ科植物のＺ
ＹＭＶ感染病の強さ、および比較的短い収穫サイクル（８〜１６週）の後半にお
いて、干渉作用は制御方法として好ましい選択肢となる。[0007] In Cucurbitaceae plants, interference with ZYMV in particular is an attractive option. Interference is particularly effective under severe disease pressure. Cucurbitaceae Z
In the latter half of the YMV infectious disease intensity and relatively short harvest cycle (8-16 weeks), interference is the preferred option as a control method.
【０００８】 今日使用されているウリ科植物の干渉作用のためのＺＹＭＶの弱い株は、レコ
ック（Lecoq）により得られた(レコックエイチ（Lecoq H.）、レメアジェーエム
（Lemaire JM.）、ウィプフ‐シュケーブルシー（Wipf-Scheible C.）(1991) プ
ラントディジーズ（Plant Dis.） 75:208-211)。この株は、指定ＺＹＭＶ-WKで
あり、アブラムシによって運ばれることが少ない。そのため、ウリ科植物におい
て、葉に弱い斑点が生じるだけで、果実の形成異常がおこることはない。植物に
早い段階で、通常は機械的接種によって、弱い株（ＺＹＭＶ−ＷＫ）を接種する
。[0008] Weak strains of ZYMV for interference with Cucurbitaceae plants used today have been obtained by Lecoq (Lecoq H., Lemaire JM., Wipf-Schcable) Sea (Wipf-Scheible C.) (1991) Plant Dis. 75: 208-211). This strain is designated ZYMV-WK and is less likely to be carried by aphids. For this reason, in the cucurbitaceous plant, only the formation of a weak spot on the leaf does not cause abnormal formation of fruit. Plants are inoculated early with a weak strain (ZYMV-WK), usually by mechanical inoculation.
【０００９】 この弱いウイルスの全長感染クローンは存在しない。[0009] There is no full-length infected clone of this weak virus.
【００１０】 ポチウイルスは、 共有結合した５’−末端ウイルス性タンパク質（Ｖｐｇ）
および３’末端ポリ（Ａ）テイルを有する陽性センス(positive sense)一本鎖Ｒ
ＮＡからなるゲノムを有する。ウイルス性ＲＮＡは単一ポリプロテインとして発
現され、続いて３つのウイルスコード化プロテアーゼによって処理され、ポチウ
イルスゲノム全体の保存領域である８〜１０の遺伝子が生成する。前記ポチウイ
ルスは、植物から植物へ、アブラムシによって非断続的に運ばれる。そしてこの
プロセスは、２つのウイルスコード化タンパク質、外殼タンパク質（ＣＰ）およ
びヘルパー成分プロテイナーゼ（ＨＣ−Ｐｒｏ）の存在に依存する。ＨＣ−Ｐｒ
ｏは、アブラムシ伝達、ポリプロテインプロセシング、ウイルス複製、症状の発
生、ならびに植物におけるウイルスの動きに関与する多機能タンパク質である(
メイア アイジー（Maia I. G.）、ヘニー エー（Haenni A.）およびベルナルデ
ィー エフ（Bernardi F.）(1996) ジャーナル オフ ジェネラルウィロロジー（J
ournal of General Virology） 77:1335-1341)。[0010] Potyviruses are covalently linked 5'-terminal viral proteins (Vpg).
And a positive sense single stranded R with a 3 'terminal poly (A) tail
It has a genome consisting of NA. Viral RNA is expressed as a single polyprotein and subsequently processed by three virally encoded proteases to produce 8-10 genes, conserved regions of the entire potyvirus genome. The potyvirus is carried non-intermittently by aphids from plant to plant. This process then relies on the presence of two virus-encoded proteins, a coat protein (CP) and a helper component proteinase (HC-Pro). HC-Pr
o is a multifunctional protein involved in aphid transmission, polyprotein processing, viral replication, pathogenesis, and viral movement in plants (
Maia IG, Haenni A. and Bernardi F. (1996) Journal off General Willology (J
ournal of General Virology) 77: 1335-1341).
【００１１】 ズッキーニイエローモザイクウイルス(ＺＹＭＶ)は、ポチウイルスグループに
属し、世界中の商業用ウリ科植物の壊滅的な流行病の原因となっている。感染性
転写物が生成されるＺＹＭＶの全長クローンが構成されている(ガル オン エー
（Gal On A.）、アンチギュナス ワイ(Antignus Y.）、ロスナー エー（Rosner
A.）およびラッチャ ビー（Raccah B. ）(1991) ジャーナル オフ ジェネラル
ウィロロジー、72:2639-2643)。Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) belongs to the potyvirus group and is responsible for catastrophic epidemics of commercial cucurbits worldwide. Full-length ZYMV clones that produce infectious transcripts have been constructed (Gal On A., Antignus Y., Rosner A.
A.) and Raccah B. (1991) Journal Off General
Willology, 72: 2639-2643).
【００１２】 ＣＰのＮ末端領域において保存ＤＡＧトリプレット（アスパラギン酸−アラニ
ン−グリシン；Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）の１０位においてアラニン（Ａｌａ）
残基をトレオニン（Ｔｈｒ）で置換することによって、アブラムシによるＺＹＭ
Ｖの伝達が効率的に止まることがわかった（ガル オン エー、アンチギュナス
ワイ、ロスナー エーおよびラッチャ ビー（１９９２）ジャーナルオフジェ
ネラルウィロロジー、72:2183-2187)。また、ＺＹＭＶの感染性クローンのＨＣ
−Ｐｒｏ遺伝子の３０９位においてＡｌａによりＴｈｒを置換することによって
も、ウイルス蓄積と症状の発生を変化させずにアブラムシの伝達に影響を及ぼし
た(ヒューエット エイチ（Huet H.）、ガル オン エー、メイリ イー（Meiri E.
）、レコック エイチおよびラッチャ ビー (1994)ジャーナル オフ ジェネラル
ウィロロジー、75:1407-1414)。しかし、ＺＹＭＶのＣＰのＤＡＧトリプレット
の置換に比べ、効果は少ない。Alanine (Ala) at position 10 of the conserved DAG triplet (aspartic acid-alanine-glycine; Asp-Ala-Gly) in the N-terminal region of CP
By substituting the residue with threonine (Thr), the aphid ZYM
V transmission was found to stop efficiently (Gal-on-A, Antigunas-W, Rosner-A, and Ratchahbee (1992) Journal Off-General Wirology, 72: 2183-2187). In addition, HC of the infectious clone of ZYMV
-Replacing Thr with Ala at position 309 of the Pro gene also affected aphid transmission without altering virus accumulation and symptom onset (Huet H., Galleon A., Meili) E (Meiri E.
), Lecoq H. and Ratchah Be (1994) Journal Off General
Willology, 75: 1407-1414). However, it is less effective than the replacement of ZYMV CP with DAG triplet.
【００１３】 驚くべきことに、ポチウイルスのＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子の保存ＦＲＮＫボックス
における置換が、感染性ポチウイルス構成物を構成できることがわかった。それ
は、植物に導入したとき、症状発生を少ししか誘発しないか、または全く誘発せ
ず、また、植物中にウイルス蓄積を起こさない。したがって、この感染性構成物
は新規なポチウイルス構成物であり、植物の干渉作用および植物中における外来
核酸の一過性発現に極めて優れている。それは、ＺＹＭＶの強い株による感染に
対し、存在するどんな保護方法よりも改良された保護であり、自然発生性のウイ
ルスより有意に安全で環境にやさしく、ウリ科植物において多様な症状を発生さ
せることなく、かつ安定している（植物の数代を経て、耐性ウイルスは見つかっ
ていない）。[0013] Surprisingly, it has been found that replacement of the HC-Pro gene of a potyvirus in the conserved FRNK box can constitute an infectious potyvirus construct. It induces little or no symptom development when introduced into plants and does not cause viral accumulation in plants. Therefore, this infectious component is a novel potyvirus component and is extremely excellent in plant interference and transient expression of foreign nucleic acids in plants. It is an improved protection against infection by strong strains of ZYMV over any existing protection methods, is significantly safer and more environmentally friendly than naturally occurring viruses, and produces a variety of symptoms in cucurbits Absent and stable (no resistance virus found after several generations of plant).
【００１４】 （発明の要約） 本発明は、植物の干渉作用に有用な構成物である組換えポチウイルス感染性核
酸、好ましくはｃＤＮＡまたはＲＮＡに関する。それは、そのＨＣ−Ｐｒｏ遺伝
子保存ＦＲＮＫボックス配列が置換、好ましくはＡｒｇ置換を持つことを特徴と
する全長クローンを含む。SUMMARY OF THE INVENTION [0014] The present invention relates to recombinant potyvirus infectious nucleic acids, preferably cDNA or RNA, that are components useful for plant interference. It includes a full-length clone characterized in that its HC-Pro gene-conserved FRNK box sequence has a substitution, preferably an Arg substitution.
【００１５】 前記構成物は、さらにアブラムシの伝達を効率的に止める置換、例えば、ＣＰ
のＮ末端領域の保存ＤＡＧトリプレットの１０位におけるＡｌａ残基の置換、ま
たはＺＹＭＶのＨＣ−ｐｒｏ中の３０９位におけるＴｈｒ残基の置換を含むこと
が好ましい。[0015] The construct may further comprise a substitution that effectively stops aphid transmission, eg, CP
It is preferred to include a substitution of an Ala residue at position 10 of the conserved DAG triplet of the N-terminal region of, or a substitution of a Thr residue at position 309 in the HC-pro of ZYMV.
【００１６】 本発明の組換え構成物は、植物干渉作用（特に強いＺＹＭＶ株に対して）にと
って、および全長クローンが、全ての位置においてそこに挿入されたＤＮＡまた
はＲＮＡの配列をもつか、または、全てのウイルス遺伝子が全長クローン（欠損
ＲＮＡ）から除去されている、植物中の外来核酸の一過性発現にとって有用かも
しれない。前記全長クローンはいかなるポチウイルスでもよいが、ＺＹＭＶであ
ることが好ましい。The recombinant constructs of the present invention are useful for plant interference (especially against strong ZYMV strains), and where the full-length clone has a DNA or RNA sequence inserted therein at all positions, or Alternatively, it may be useful for transient expression of foreign nucleic acids in plants, where all viral genes have been removed from the full-length clone (defective RNA). The full-length clone may be any potyvirus, but is preferably ZYMV.
【００１７】 本発明は、また、植物をウイルス感染から保護する方法であって、組換えポチ
ウイルス感染性構成物を、植物に、機械的接種によって、または衝撃によって接
種することを含む方法に関する。The present invention also relates to a method of protecting a plant from viral infection, comprising inoculating the plant with a recombinant potyvirus infectious component by mechanical inoculation or by impact.
【００１８】 本発明はまた、植物に全長クローンを感染させることによって、または、植物
に全長クローンを共感染させることによって、全長クローンまたは全長クローン
をもつウイルスと共に、全てのウイルス性遺伝子を除去する外来核酸を植物に導
入する方法に関する。The present invention also relates to a foreign gene which removes all viral genes together with a full-length clone or a virus having the full-length clone by infecting a plant with a full-length clone or co-infecting a plant with a full-length clone. The present invention relates to a method for introducing a nucleic acid into a plant.
【００１９】 本発明はまた、植物に、前記請求項のいずれかに記載の組換えポチウイルス感
染性構成物を接種し、得られた継代を採集することを含む、弱いポチウイルス株
を生成する方法およびその方法で生成されたウイルスに関する。The present invention also provides for producing a weak potyvirus strain, comprising inoculating a plant with a recombinant potyvirus infectious construct according to any of the preceding claims and collecting the resulting passages. And viruses produced by the method.
【００２０】 さらに本発明は、植物接種のための、または植物中の外来核酸を一過性発現さ
せるための組成物であって、活性物質として前記組換え構成物または組換え構成
物を含有するウイルスを含む組成物に関する。Furthermore, the present invention relates to a composition for inoculating a plant or for transiently expressing a foreign nucleic acid in a plant, comprising the recombinant construct or the recombinant construct as an active substance. A composition comprising a virus.
【００２１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、植物の干渉作用および植物における外来核酸の一過性発現に有用な
組換えポチウイルス感染性核酸構成物に関する。さらに本発明は、植物の接種ま
たは外来核酸の一過性発現のための、活性物質として組換え構成物または組換え
構成物を含有するウイルスを含む組成物に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to recombinant potyvirus infectious nucleic acid constructs useful for plant interference and transient expression of foreign nucleic acids in plants. The invention further relates to a composition comprising a recombinant construct or a virus containing the recombinant construct as active substance for inoculation of plants or transient expression of foreign nucleic acids.
【００２２】 本発明の構成物は、ＨＣ−ｐｒｏ遺伝子中の保存ＦＲＮＫボックス配列中に置
換を含有する全長ポチウイルスクローンを含み、好ましくはＡｒｇ（ＦＲＮＫボ
ックス中）が、大きな側鎖を有するアミノ酸もしくはＩｌｅ等の疎水基のアミノ
酸で置換されている。ＦＲＮＫボックスにおける、この置換は、植物におけるウ
イルス蓄積に影響を及ぼすことなく、症状発生の強さに劇的な影響を及ぼす。本
発明の構成物はまた、アブラムシによる伝達を効率的に止める置換、例えば、Ｃ
ＰのＮ末端領域の保存ＤＡＧ（Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）トリプレットの１０位
におけるＡｌａ残基のＴｈｒへの置換、ＺＹＭＶのＨＣ−ｐｒｏ中の３０９位に
おけるＡｌａによるＴｈｒの置換を含む。The constructs of the present invention include a full-length potyvirus clone containing a substitution in the conserved FRNK box sequence in the HC-pro gene, wherein preferably Arg (in the FRNK box) contains an amino acid with a large side chain or It is substituted with a hydrophobic amino acid such as Ile. This substitution in the FRNK box has a dramatic effect on the severity of symptoms without affecting virus accumulation in the plant. The compositions of the present invention also provide a substitution that effectively stops transmission by aphids, eg, C
Includes Thr substitution of the Ala residue at position 10 of the conserved DAG (Asp-Ala-Gly) triplet of the N-terminal region of P, and Thr substitution with Ala at position 309 in the HC-pro of ZYMV.
【００２３】 ＺＹＭＶの強い株の全長感染性クローンを構成し、ファージプロモーターのコ
ントロール下においた。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター(ガル オ
ン エー、アンチギュナス ワイ、ロスナー エーおよびラッチャ ビー(1991) ジ
ャーナル オフ ジェネラル ウィロロジー、72:2639-2643)、バクテリアプロモー
ター、もしくはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター
のようなインプランタ（in planta）に効果的なプロモーターが挙げられる(ガル
オン エー、メイリ エー、ヒュート エイチ（Huet H.）、ヒューア ダブリュー
．ジェー（Hua W.J.）、ラッチャビーおよびガバ ブイ（Gaba V.）(1995)、ジャ
ーナルオフジェネラルウィロロジー76:3223-3227)。A full length infectious clone of a strong strain of ZYMV was constructed and placed under control of a phage promoter. For example, a T7 RNA polymerase promoter (Gal-on-A, Antigunas-Y, Rosner-A, and Ratchah-Bee (1991) Journal of General Willology, 72: 2639-2643), a bacterial promoter, or an implanter such as the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. (In planta) include effective promoters (Gal-on-A, Meilier, Huet H., Hua WJ, Latchabbie and Gaba V. (1995), Journal Off General Willology 76: 3223-3227).
【００２４】 ここに挙げた文献には、まず、驚くべきことに植物においてウイルス蓄積を起
こさずに、症状を発生させる重要なものとして、ＦＲＮＫボックスを含んでいる
。ポチウイルスのＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子内のＦＲＮＫボックスの配列に高度に保存
されるために、ポチウイルスのＦＲＮＫボックスにおける置換は、ＺＹＭＶの１
８０位におけるＡｒｇのＩｌｅでの置換だけでなく、症状の発生に影響するだろ
うことがここに記載の文献に示されている。The documents cited here include, first of all, the FRNK box, as a surprising factor, without causing virus accumulation in plants. Due to the high degree of conservation in the sequence of the FRNK box in the HCV-Pro gene of the potyvirus, the substitution in the FRNK box of the potyvirus is only 1
It is shown in the literature described here that it would affect the occurrence of symptoms as well as the replacement of Arg at position 80 with Ile.
【００２５】 ポチウイルスの高度に保存されたゲノム、組織および遺伝子機能に基いて、Ｈ
Ｃ−Ｐｒｏ遺伝子中の保存ＦＲＮＫボックスは、全てのポチウイルスにおいて同
じ機能（恐らく受容体としての機能）を持つと結論づけられるだろう。したがっ
て、全てのポチウイルスにおけるＦＲＮＫボックスの置換は、類似の効果を症状
発生に対して及ぼすであろう。経済的に重要なポチウイルスとしては、例えば、
ＢＣＭＶ（ビーン コモン モザイクウイルス）、ＢＹＭＶ（ビーン イエロー
モザイクウイルス）、ＢｔＭＶ（ビート モザイク）、ＭＷＭＶ（モロッコ
スイカ モザイク）、ＯＹＤＶ（オニオンイエロー矮小化植物）、ＰＲＳＶ（パ
パイア リングスポット)、ＰＳｔＶ（ピーナッツ ストライプ）、ＰｅｐＭｏ
Ｖ(ペッパー斑紋(Ppper mottle))、ＰＶＭＶ(ペッパー血管斑点(Pepper venial
mottle))、ＣＧＶＢＶ（ササゲグリーン葉脈バンディング(Cowpea green veing
banding))、ＧＥＶ(グランド アイスポット(ground eyespot))、ＩＳＭＶ(アイ
リス強力モザイク(Iris severe mosaic))、ＪＧＭＶ(ジョンソングラスモザイク
)、ＬＹＳＶ（リーク イエロー ストライプ）、ＬＭＶ（レタスモザイク）、
ＭＤＭＶ（トウモロコシ矮小化モザイク）、ＰＰＶ（プラムボックス）、ＰＶＡ
（ポテトＡ）、ＰＶＶ（ポテトＶ）、ＰＶＹ（ポテトＹ）、ＳｂＭＶ（ダイズモ
ザイク）、ＳＣＭＶ（サトウキビモザイク）、ＳＰＦＭＶ（サツマイモ羽毛状斑
点(Sweet potato feathery mottle))、ＴＥＶ（タバコエッチ）、ＴＶＭＶ(タバ
コ ベイン モトリング(tobacco vein mottling))、ＴＢＶ（チューリップ ブ
レイキング）、ＴｕＭＶ（チューリップモザイク）、ＷＭＶ−２（スイカモザイ
クウイルス２）およびＹＭＶ（ヤマイモ モザイク）、ＺＹＦＶ（ズッキーニ
イエロー斑点（Zucchini yellow fleck）)がある。Based on the highly conserved genome, tissue and gene function of the potyvirus,
It will be concluded that the conserved FRNK box in the C-Pro gene has the same function (possibly as a receptor) in all potyviruses. Thus, replacement of the FRNK box in all potyviruses would have a similar effect on symptom development. As an economically important potyvirus, for example,
BCMV (bean common mosaic virus), BYMV (bean yellow mosaic virus), BtMV (beat mosaic), MWMV (Morocco)
Watermelon mosaic, OYDV (Onion yellow dwarf plant), PRSV (Papaya ring spot), PStV (Peanut stripe), PepMo
V (Ppper mottle), PVMV (Pepper venial
mottle)), CGVBV (Cowpea green veing
banding), GEV (ground eyespot), ISMV (Iris severe mosaic), JGMV (Johnson glass mosaic)
), LYSV (leak yellow stripe), LMV (lettuce mosaic),
MDMV (corn dwarf mosaic), PPV (plum box), PVA
(Potato A), PVV (Potato V), PVY (Potato Y), SbMV (Soy mosaic), SCMV (Sugar cane mosaic), SPFMV (Sweet potato feathery mottle), TEV (Tobacco etch), TVMV (Tobacco vein mottling), TBV (tulip breaking), TuMV (tulip mosaic), WMV-2 (watermelon mosaic virus 2) and YMV (yama mosaic), ZYFV (zucchini)
There are yellow spots (Zucchini yellow fleck).
【００２６】 感染性クローンは、ＲＮＡ転写物またはｃＤＮＡ構成物でもよいが、感染性転
写物の使用は、生体外での方法において効率性が低い。Although infectious clones may be RNA transcripts or cDNA constructs, the use of infectious transcripts is less efficient in in vitro methods.
【００２７】 本発明における植物のウイルス感染を保護する方法は、植物に組換えポチウイ
ルス感染性構成物を、例えば、機械的接種または衝撃によって接種することを含
む。The method for protecting a plant from viral infection according to the invention comprises inoculating a plant with a recombinant potyvirus infectious constituent, for example by mechanical inoculation or by bombardment.
【００２８】 活性物質として本発明の構成物を含有する組成物は、特にＺＹＭＶの強い株に
よる感染に対する、優れた植物の干渉作用のため、また、植物において外来核酸
を一過性発現させるために、使用してもよい。構成物を植物に導入するために、
衝撃によって感染させるために使用される組成物は、水溶性組成物であって、前
記構成物、硝酸カルシウムのような塩、およびタングステン、金等の粒子を略等
量で含む。植物に前記構成物を機械的接種によって導入するために使用される組
成物は、感染した植物組織を含む。The compositions containing the compositions according to the invention as active substances can be used for excellent plant interference, in particular against infection by strong strains of ZYMV, and for the transient expression of foreign nucleic acids in plants. , May be used. In order to introduce the composition into the plant,
The composition used to infect by impact is a water-soluble composition, which comprises the composition, a salt such as calcium nitrate, and particles such as tungsten, gold and the like in approximately equal amounts. The composition used to introduce said composition into plants by mechanical inoculation comprises infected plant tissue.
【００２９】 さらに本発明の構成物は、植物中の外来核酸、すなわち遺伝子の一過性発現の
ための賦形剤として使用してもよい。本発明の構成物は、高度に感染性であり、
感染された植物に症状を誘発せず、またアブラムシによって感染しない。Furthermore, the compositions of the present invention may be used as excipients for the transient expression of foreign nucleic acids, ie genes, in plants. The composition of the invention is highly infectious,
It does not induce symptoms in infected plants and is not infected by aphids.
【００３０】 活性物質を含む組成物を使用することによって、このクローンは、効率的で安
全で環境にやさしい方法で、外来核酸を感染した植物に一過性発現させる。した
がって、この構成物のさらに別の用途は、ポチウイルスの欠損ＲＮＡ分子内の外
来配列もしくは遺伝子の発現であってもよい。欠損ＲＮＡは、ウイルス性遺伝子
の何かが欠けているウイルス性ＲＮＡゲノムであって、完全なヘルパー遺伝子（
全長親遺伝子）と共同し、それらが含む配列の発現を容易にすることができる。
欠損ＲＮＡは、ヘルパー遺伝子ウイルスゲノムに由来するが、植物細胞において
複製するための完全なヘルパーウイルスの存在が必要である。本発明の構成物は
、全長クローンから除去したウイルス遺伝子をもっていてもよく、また後に、外
来遺伝子ポチウイルス欠損ＲＮＡを介して、全長クローンを植物に共感染するこ
とにより、全長クローンもしくは全長クローンを持つウイルスと一緒に全てのウ
イルス遺伝子を除去して、外来遺伝子の発現をサポートする機能を果たすことも
ある。By using a composition comprising the active substance, this clone allows the exogenous nucleic acid to be transiently expressed in infected plants in an efficient, safe and environmentally friendly manner. Thus, yet another use of this construct may be the expression of foreign sequences or genes within a defective RNA molecule of a potyvirus. Defective RNA is a viral RNA genome that lacks any of the viral genes, including the complete helper gene (
(Full-length parent gene) to facilitate expression of the sequences they contain.
Defective RNA is derived from the helper gene virus genome, but requires the presence of a complete helper virus to replicate in plant cells. The construct of the present invention may have the viral gene removed from the full-length clone, or later, by co-infecting the plant with the full-length clone via the foreign gene potyvirus-deficient RNA, to have the full-length clone or full-length clone. It may also remove all viral genes along with the virus and serve to support the expression of foreign genes.
【００３１】 本発明による外来核酸を植物に導入する方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの全ての
配列が挿入されている全長クローンを植物に感染すること、または植物に全長ク
ローンを感染することを含み、それによって、全長クローンまたは全長クローン
を持つウイルスと一緒に、全てのウイルス遺伝子を除去する。The method for introducing a foreign nucleic acid into a plant according to the present invention comprises infecting a plant with a full-length clone into which all sequences of DNA or RNA have been inserted, or infecting a plant with a full-length clone. Removes all viral genes, along with full-length clones or viruses with full-length clones.
【００３２】 本発明のポチウイルスのマイルド株の製造方法は、植物に組換えポチウイルス
感染性構成物を接種し、得られたその継代を集めることを含む。The method of producing a mild strain of potyvirus of the present invention comprises inoculating a plant with a recombinant potyvirus infectious construct and collecting the resulting passages.
【００３３】 以下、実施例および図面を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施
例および図は発明の範囲を限定するものでなく、明確にするものである。Hereinafter, the present invention will be further described with reference to examples and drawings. These examples and figures do not limit the scope of the invention but clarify it.
【００３４】 （図面の詳細な説明） 図１は、ＺＹＭＶ感染性ｃＤＮＡの４つの構成物（ａ−ｄ）の模式図を示す。
開いたバーおよび斜線の入ったバーは、ＦＬＣ内のＺＹＭＶ−ＮＡＴ配列および
ＺＹＭＶ−ＷＫ配列をそれぞれ示す。関連する制限酵素およびアミノ酸変化が存
在する。右側に、カボチャにおける症状の強さを、非常に強い(+++++)から弱い(
+)までで示している。突然変異発生に使用されるプライマーの配列を示している
。 実施例１：ＺＹＭＶの全長クローン（ＦＬＣ） ＺＹＭＶの全長クローン（ＦＬＣ）中の突然変異体の構成 ＺＹＭＶ−ＷＫ株のＨＣ−Ｐｒｏ配列 (ヒューエット エイチ、ガル オン エ
ー、メイリ イー、レコック エイチおよびラッチャ ビー(1994) ジャーナル オ
フ ジェネラル ウィロロジー、75:1407〜1414)を表す構成物を感染性ＦＬＣ中の
Ｔ７ＲＮＡプロモーター下においた。それらの構成物による感染率を高めるため
に、３５ＳＺＹＭＶＮＯＳ ｃＤＮＡのＦＬＣ由来のフラグメントＢｓｔＸＩ／
ＡｇｅＩ(ガル オン エー、アンチギュナス ワイ、ロスナー エーおよびラッチ
ャ ビー(1991) ジャーナル オフ ジェネラル ウィロロジー、72:2639〜2643およ
び、ガル オン エー、メイリ エー、ヒュート エイチ、ヒューア ダブリュー．
ジェー、ラッチャビーおよびガバ ブイ (1995)、ジャーナル オフ ジェネラル
ウィロロジー76:3223〜3227)を、ｐＺＹＨＣ（−）クローン (ヒュート エイチ
、ガル オン エー、メイリ エー、レコック エイチおよびラッチャビー(1994)
ジャーナル オフ ジェネラル ウィロロジー、75:1407〜1414)由来の適切なフラ
グメントで置換した。プライマー５’ＡＴＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＧＣＴ
ＣＴＡＧ３’（アミノ酸Ｉｌｅに下線を引き、Ｅｃｏ４７IIの特異的な制限部位
を太字で示した）を用いて、位置指定突然変異誘発が行われる部位を、サブクロ
ーンｐｋｓＭ１６ＢのｓｓＤＮＡテンプレートに上に導入した(ガル オン エー
、アンチギュナス ワイ、ロスナー エーおよびラッチャ ビー (1991)ジャーナル
オフ ジェネラル ウィロロジー、72:2639-2643)。変異を持つクローンｐｋｓＭ
１６ＢをＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩによってダブルダイジェッションし、得られ
たフラグメント（１．４ｋｂ）を３５ＳＺＹＭＶＮＯＳ ｃＤＮＡ中の同じ部位
に導入した(ガル オン エー、メイリ エー、ヒュー ト エイチ、ヒューア ダブ
リュー．ジェー、ラッチャビーおよびガバ ブイ (1995)、ジャーナルオフジェネ
ラルウィロロジー76:3223-3227)。FIG. 1 shows a schematic diagram of the four components (ad) of the ZYMV infectious cDNA.
Open and shaded bars indicate ZYMV-NAT and ZYMV-WK sequences in FLC, respectively. There are associated restriction enzymes and amino acid changes. On the right, the intensity of the symptoms in the pumpkin, from very strong (+++++) to weak (
+). The sequences of the primers used for mutagenesis are shown. Example 1 Construction of Mutants in ZYMV Full-length Clones (FLC) Construction of Mutants in ZYMV Full-length Clones (FLC) HC-Pro Sequence of ZYMV-WK Strain (Hueett H., Gul A. A. (1994) The construct representing the journal of general virology, 75: 1407-1414) was placed under the T7 RNA promoter in infectious FLC. To increase the infection rate with these constructs, the FLC-derived fragment BstXI / 35SZYMVNOS cDNA
AgeI (Gal-on-A, Antigunas-Y, Rosner-A, and Ratchah-Bee (1991) Journal of General Willology, 72: 2639-2643; and Gal-on-A, Meilier, Hute-H, Hua-W.
Jay, Ratchabbie and Gabba Buoy (1995), Journal Off General
Virology 76: 3223-3227) with pZYHC (-) clones (Hute H, Gal On A, Meili A, Lecock H and Ratchabee (1994)
Replaced with the appropriate fragment from Journal of General Willology, 75: 1407-1414). Primer 5'ATGTTC ATA AATAAGCGCT
Using CTAG3 '(amino acid Ile is underlined and the specific restriction site for Eco47II is shown in bold), the site for site-directed mutagenesis was introduced above into the ssDNA template of subclone pksM16B ( Gull-on-A, Antigunas-Y, Rosner-A and Ratchahbee (1991) Journal Off General Willology, 72: 2639-2643). Clone pksM with mutation
16B was double-digested with BamHI / BstEII, and the resulting fragment (1.4 kb) was introduced into the same site in the 35SZYMVNOS cDNA (Gal-on-A, Meilier, Hute-H, HW-J, Latchabbie and Gaba buoy (1995), Journal off General Willology 76: 3223-3227).
【００３５】 植物、機械的または衝撃による接種およびＺＹＭＶＡＧ１の症状の発現 温室栽培されたズッキーニ、カボチャ(カボチャ属ウリ状果エル．シーブイ
メイヤン（Curcurbita pepo. L. cv Ma'ayan）)、キュウリ(キューキュミス サ
チヴァス エル シーブイ ベットアルファ（Cucumis sativus L. cv. Bet Alpha
）; シムション（Shimshon）; デリラ（Delila）)、メロン(キューキュミス メ
ロ エル シーブイ アラバ（Cucumis melo L. cv. Arava）)およびスイカ(シトル
ラス ラナタス スカッド シーブイ マラリ（Citrullus lanatus Schad cv. Mal
ali）)の植物を子葉段階で使用した。接種された植物を成長チャンバ内で２５℃
で、連続的に光を当てて維持した。その植物について毎日、目に見える症状（sy
mtom）の進展を調べた。 Plant, mechanical or impact inoculation and development of symptoms of ZYMVAG1 Greenhouse-grown zucchini, pumpkin
Mayyan (Curcurbita pepo. L. cv Ma'ayan), cucumber (Cucumis sativus L. cv. Bet Alpha)
Shimshon; Delila), melon (Cucumis melo L. cv. Arava) and watermelon (Citrullus lanatus Schad cv. Malava)
ali)) plants were used at the cotyledon stage. Inoculated plants at 25 ° C. in growth chamber
And maintained continuously under light. Daily visible symptoms (sy
mtom).
【００３６】 衝撃接種は、前記ガル-オンら (1995)に記載の方法で行った。組換えウイルス
に感染させた植物の機械的接種は、汁液接種（１００ｍｇ／ｍｌ）によって行い
、汁液接種は、衝撃によって粉末で覆われた前記子葉に適用した。The impact inoculation was performed by the method described in Gal-On et al. (1995). Mechanical inoculation of plants infected with the recombinant virus was performed by sap inoculation (100 mg / ml), which was applied to the cotyledons covered with powder by impact.
【００３７】 干渉作用実験 ＺＹＭＶ−ＡＧ１株による干渉作用を前記レコックら（１９９１）による記載
の方法によって行った。完全に子葉が開いた段階のカボチャ実生苗を０．１μｇ
／μｌで３５Ｓ−ＡＧ１を用いて衝撃した。１週間後、それらを温室内で、１植
物につき５〜７のアブラムシ (ミザスペルシカ（Myzus persicae）)によりアン
チギュナス ワイ、ラッチャ ビー、ガル オン エーおよびコーヘン エス（Cohen
S.）(1989)サイトパラシティカ Phytoparasitica 17:287-289)による記載の方
法で感染させた。 Interference effect experiment The interference effect by the ZYMV-AG1 strain was carried out according to the method described by Lecock et al. (1991). 0.1 μg of pumpkin seedlings at the stage when cotyledons are completely opened
Bombardment with 35S-AG1 at / μl. One week later, they were planted in a greenhouse with 5-7 aphids per plant (Myzus persicae), anti-Gynus Wye, Ratchahbee, Gal-on-A and Cohen-S.
S.) (1989) Cytoparasitica Phytoparasitica 17: 287-289).
【００３８】 継代ウイルスビリオンにおける突然変異の測定 ウイルス性ＲＮＡ中に突然変異が見られるかどうかを確かめるために、感染し
た葉組織から全てのｍＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲの合成はヒューエット
エイチ(1994)による記載の方法で行った。 Determination of Mutations in Passaged Virus Virions All mRNA was extracted from infected leaf tissues to determine if mutations were found in the viral RNA. Hewett for RT-PCR synthesis
The procedure was as described by H. (1994).
【００３９】 ＺＹＭＶタイターを評価するためのＥＬＩＳＡ ＺＹＭＶ感染した植物、カボチャとキュウリの葉盤を７〜１０ｄ．ｐ．ｉ．取
り出し、均質化した組織に対して、アンチギュナスら(1989)による記載の方法で
ＥＬＩＳＡを行った。 ELISA to evaluate ZYMV titers ZYMV infected plants, pumpkin and cucumber leaf discs were 7-10 d. p. i. The removed and homogenized tissue was subjected to ELISA by the method described by Antigunas et al. (1989).
【００４０】 先に配列を比較していたところによれば、強いフィールドの株（field strain
）(ＺＹＭＶ−ＪＶ）と弱いフィールドの株ＺＹＭＫ−ＷＫの間で、ＨＣ−ｐｒ
ｏ遺伝子の４５５アミノ酸配列中の４つのアミノ酸が変化していた。２つの置換
基アスパラギン酸（Ａｓｐ）１４８およびＡｒｇ１８０（ＢｓｔＸＩ／ＢｓｔＥ
IIフラグメント）を含有するＺＹＭＶ−ＷＫのＨＣ−Ｐｒｏのフラグメントを置
換することによって、カボチャ植物において、ウイルスが蓄積することなく、ウ
イルスの症状発現が減少した。Ａｓｐ１４８またはＡｒｇ１８０の２つの置換を
確認するために、症状発現を起こし、位置指定突然変異誘発によって、ＦＲＮＫ
ボックス内（図１、クローンｄ）でＡｒｇ１８０をＩｌｅで置換した。According to the comparison of the sequences, a strong field strain (field strain) was used.
) (ZYMV-JV) and the weak field strain ZYMK-WK, HC-pr
Four amino acids in the 455 amino acid sequence of the o gene were changed. The two substituents aspartic acid (Asp) 148 and Arg180 (BstXI / BstE)
Substitution of the ZYMV-WK HC-Pro fragment containing the (II fragment) reduced the virus manifestation in pumpkin plants without virus accumulation. To confirm the two substitutions for Asp148 or Arg180, the symptom was raised and site-directed mutagenesis resulted in FRNK.
Arg180 was replaced with Ile in the box (FIG. 1, clone d).
【００４１】 Ｉｌｅで置換されたＡｒｇ１８０を含有する工学的ウイルスを、ＺＹＭＶ−Ａ
Ｇ１と指定した。この新しい株は、キュウリ（３つの異なる種類）、メロンおよ
びスイカにおいて症状発現を引き起こした。前記ウイルスは、野生型ＺＹＭＶ−
ＪＶと同レベルの蓄積があった。したがって、第二のアミノ酸の差（１４８位の
Ａｓｐ）が、弱いものから強いものまで症状が変化する際に重要でないことを示
していた。The engineered virus containing Arg180 replaced with Ile was identified as ZYMV-A
Designated as G1. This new strain caused symptoms in cucumber (three different varieties), melons and watermelons. The virus is wild-type ZYMV-
There was the same level of accumulation as JV. Thus, the difference in the second amino acid (Asp at position 148) was shown to be insignificant in changing symptoms from weak to strong.
【００４２】 弱いウイルスＺＹＭＶ−ＡＧ１内のアミノ酸変化の存在を確認し、アブラムシ
による伝達を阻害するために、Ｅｃｏ４７IIIの新しい制限酵素部位を５５０ｎ
ｔ位（ＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子の５’から）に導入し、ＣＰ中のＤＡＧモチーフをＤ
ＴＧでそれぞれ置換した（図１）。To confirm the presence of amino acid changes in the weak virus ZYMV-AG1 and to inhibit transmission by aphids, a new restriction site for Eco47III was added at 550n.
At position t (from the 5 ′ of the HC-Pro gene), the DAG motif in the CP
Each was replaced with TG (FIG. 1).
【００４３】 前記新たな工学的ウイルス（ＡＧ１）と野生型の強い株（ＪＶ）は、異なる
ウリ科植物種の全体にわたり感染された葉と、類似のレベルに蓄積された（表１
）。したがって、アミノ酸Ａｒｇ１８０をＩｌｅに変化させる点変異は、植物中
の動きおよびＺＹＭＶウイルスの発育に影響を与えずに、症状発現に劇的に影響
を及ぼす結果となるかもしれない。ポチウイルスＦＲＮＫボックス中の点変異に
よって得られた劇的な結果は、この文献の冒頭において実証されているところに
よれば、アミノ酸が強いフィールド株と弱いフィールド株の間で変化を示すとい
う、単なる公知の配列比較からはわからなかった。The new engineered virus (AG1) and the wild-type strong strain (JV) are different
Accumulated to a similar level with infected leaves throughout Cucurbit species (Table 1)
). Thus, a point mutation that changes amino acid Arg180 to Ile may result in a dramatic effect on symptom onset without affecting movement in plants and development of ZYMV virus. The dramatic results obtained by point mutations in the potyvirus FRNK box are, as demonstrated at the beginning of this document, merely a mere description that amino acids show a change between strong and weak field strains. No known sequence comparison revealed it.
【００４４】 ＺＹＭＶ−ＡＧ１におけるＡｒｇ１８０からＩｌｅへのアミノ酸置換の安定性
を、数百のカボチャ植物および数ダースのキュウリ植物を感染させることによっ
て試験した（表２）。ＨＣ−Ｐｒｏ中のＩｌｅ１８０突然変異の存在を、シーケ
ンシングによって確認した（データは示していない）。ＺＹＭＶ−ＡＧ１株を機
械的もしくは粒子衝撃によって接種されたウリ科植物は、植物成長期間を通じて
弱い症状が見られた（表２）。ビリオンゲノム内のＩｌｅ１８０突然変異の存在
を、シーケンシングによって、または、ＲＴ−ＰＣＲ増幅フラグメントの制限酵
素Ｅｃｏ４７IIIを用いて消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって、間接的に調べ
た（図１）。The stability of the amino acid substitution from Arg180 to Ile in ZYMV-AG1 was tested by infecting hundreds of pumpkin plants and dozens of cucumber plants (Table 2). The presence of the Ile180 mutation in HC-Pro was confirmed by sequencing (data not shown). Cucurbitaceae plants inoculated with the ZYMV-AG1 strain mechanically or by particle bombardment showed weak symptoms throughout the plant growth period (Table 2). The presence of the Ile180 mutation in the virion genome was examined indirectly by sequencing or by digestion of the RT-PCR amplified fragment with the restriction enzyme Eco47III (FIG. 1).
【００４５】 工学的ＺＹＭＶ−ＡＧ１株の複製および動きは、ウイルスの累積レベルからみ
て依然として高かった（野生型ＺＹＭＶと比較）。これらの結果は、選択的圧力
がウイルス突然変異ゲノムに逆転を示さなかったことを示唆する。The replication and movement of the engineered ZYMV-AG1 strain was still high in comparison to the cumulative levels of virus (compared to wild-type ZYMV). These results suggest that selective pressure did not show reversal in the viral mutant genome.
【００４６】 新たに生成された弱い株（ＺＹＭＶ−ＡＧ１）がＺＹＭＶ（ＪＶ）の強い株の
攻撃接種から保護する能力を、干渉作用実験において調べた。保護された植物の
大半は、強い株の攻撃後、弱い症状を示していた（９６％保護）。４７植物中２
植物において、ＺＹＭＶ−ＡＧ１株により感染させ、１ヶ月後、ＪＶ株により攻
撃した。接種後約１ヶ月で、強い症状を示した（表３）。The ability of the newly generated weak strain (ZYMV-AG1) to protect against challenge of a strong strain of ZYMV (JV) was examined in interference experiments. Most of the protected plants showed weak symptoms (96% protection) after challenge with strong strains. 2 out of 47 plants
Plants were infected with the ZYMV-AG1 strain and challenged one month later with the JV strain. Approximately one month after the inoculation, severe symptoms were exhibited (Table 3).
【００４７】 保護された植物をフィールド接種に曝露する小さなフィールド実験において、
保護を調べた。対照の非保護植物は、約４０％が感染していたが、保護されてい
た植物で重篤な症状を示したものはなかった。したがって、果実の損傷は保護植
物において認められなかった（表３）。従前の実験によれば、典型的な干渉作用
の現象においては、保護および攻撃ウイルス株の双方は、非常に密接に関連して
いた(パーリング ティーエム（Perring T.M.）、ファーラー シー エー（Farrar
C. A.）、ブルア エム ジェー（Blua M. J.）、ワング エイチ エル（Wang H.L
.）およびゴンザルブス ディー（Gonsalves D.）(1995) クロッププロテクショ
ン（Crop Protection ）14、7、601〜606)。これは、外殻タンパク質配列をはじ
めとした同じ配列を有し、非構造的タンパク質（ＨＣ−Ｐｒｏ）内の単一のアミ
ノ酸のみが異なる株間で、干渉作用が行われることを報告した最初のものである
。In a small field experiment that exposed protected plants to field inoculation,
Checked for protection. About 40% of the control unprotected plants were infected, but none of the protected plants showed severe symptoms. Therefore, no fruit damage was observed in the protected plants (Table 3). According to previous experiments, in a typical phenomenon of interference, both the protective and the aggressive virus strains were very closely related (Perring ™, Farrar CA).
CA), Blua MJ, Wang HL
.) And Gonsalves D. (1995) Crop Protection 14, 7, 601-606). This is the first to report that interference occurs between strains having the same sequence, including the coat protein sequence, and differing only by a single amino acid in the nonstructural protein (HC-Pro). It is.
【００４８】 ２）メロンにおける干渉作用 メロン(キューキュミス メロ エル シーブイ オフィア（Cucumis melo L.cv
. Ofir）)実生苗を植え、ＺＹＭＶ−ＷＫおよび組換えウイルスＺＹＭＶ-AG1で
感染させた。前記ウイルスは植樹前にメロン実生苗に塗布した。その後、実生苗
を非処理（対照）実生苗と一緒に植えた。2) Interference action on melon Melon (Cucumis melo L.cv.
.Ofir)) Seedlings were planted and infected with ZYMV-WK and the recombinant virus ZYMV-AG1. The virus was applied to melon seedlings before planting. The seedlings were then planted together with untreated (control) seedlings.
【００４９】 植物の半数を３週目に、野生型ウイルス(ＺＹＭＶ−ＪＶ）によって機械的に
攻撃し、半数を自然感染させるため攻撃しなかった。Half of the plants were mechanically challenged with the wild-type virus (ZYMV-JV) at 3 weeks and half were not challenged due to natural infection.
【００５０】 実験開始３０日目に、植物サイズ、野生型ウイルス感染の範囲等のパラメータ
を調べた。弱められたウイルス（ＷＫ）によって処理していないＺＹＭＶ−ＪＶ
で感染させた植物は、小さく、また、明らかな感染症状を示していた。組換えウ
イルス（ＺＹＭＶ−ＡＧ１）で処理した植物は感染の症状を示さなかった。On the 30th day from the start of the experiment, parameters such as plant size and range of wild-type virus infection were examined. ZYMV-JV not treated by attenuated virus (WK)
Were small and showed obvious infection symptoms. Plants treated with the recombinant virus (ZYMV-AG1) showed no symptoms of infection.
【００５１】 ３）植物中のＺＹＭＶ−ＡＧ１クローンからの外来遺伝子の発現 感染植物中の外来遺伝子の発現を調べるために、ＰｓｔＩ部位をＮＩｂ遺伝子
とＣＰ遺伝子の間でＺＹＭＶ−ＡＧ１に導入した。いかなる非選択的除草剤ビア
ラホス（商品名ＢＡＳＴＡ）にも耐性を持たないＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）
レポーター遺伝子およびＢａｒ遺伝子を、ＰｓｔＩ制限部位を含有するプライマ
ーを用いてＰＣＲ増幅し、ＰｓｔＩ部位に導入した。3) Expression of foreign gene from ZYMV-AG1 clone in plant In order to examine the expression of the foreign gene in infected plants, a PstI site was introduced into ZYMV-AG1 between the NIb gene and the CP gene. GFP (green fluorescent protein) that is not resistant to any non-selective herbicide bialaphos (brand name BASTA)
The reporter gene and the Bar gene were PCR amplified using primers containing a PstI restriction site and introduced into the PstI site.
【００５２】 植物にＧＥＰレポーター遺伝子もしくはＢａｒ遺伝子をもつＺＹＭＶ−ＡＧ１
を衝撃によって接種した。ZYMV-AG1 Having GEP Reporter Gene or Bar Gene in Plant
Were inoculated by shock.
【００５３】 生化学分析によれば、ＧＦＰおよびＢａｒ遺伝子は高度に安定して発現した。
数代を経て、弱い組換えウイルスの復帰突然変異体が見られたものはなかった。
またレポーター遺伝子およびバー遺伝子発現は依然として高く、安定していた。
ＧＦＰを発現する植物は発光し、バー遺伝子を発現させる植物は、除草剤ビアラ
ホスに耐性であることがわかった。According to biochemical analysis, the GFP and Bar genes were highly stably expressed.
Over the course of several generations, none of the weak recombinant virus revertants were found.
The reporter gene and bar gene expression were still high and stable.
Plants expressing GFP glowed and plants expressing the bar gene were found to be resistant to the herbicide bialaphos.
【００５４】[0054]
【表１】 [Table 1]
【００５５】[0055]
【表２】 [Table 2]
【００５６】[0056]
【表３】 [Table 3]
【００５７】[0057]
【図１】 図１は、ＺＹＭＶ感染性ｃＤＮＡ（ａ−ｄ）の４つの構成物の模式図を示す。FIG. 1 shows a schematic diagram of the four components of the ZYMV infectious cDNA (ad).
SEQUENCE LISTING <110> STATE OF ISRAEL/MINISTRY OF AGRICULTURE <120> RECOMBINANT POTYVIRUS CONSTRUCT AND USE THEREOF <130> R4646 <140> PCT/IL99/00184 <141> 1999-03-30 <150> IL123994 <151> 1998-04-07 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <220> <221> mutation <222> (7)..(9) <400> 1 atgttcataa ataagcgctc tag 23 SEQUENCE LISTING <110> STATE OF ISRAEL / MINISTRY OF AGRICULTURE <120> RECOMBINANT POTYVIRUS CONSTRUCT AND USE THEREOF <130> R4646 <140> PCT / IL99 / 00184 <141> 1999-03-30 <150> IL123994 <151> 1998- 04-07 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <220> <221> mutation <222> (7) .. (9) <400> 1 atgttcataa ataagcgctc tag 23
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成１２年６月１日（２０００．６．１）[Submission date] June 1, 2000 (2006.1)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【特許請求の範囲】[Claims]
【請求項２０】 植物への接種または植物における外来核酸の一過性発現のた
めの組成物であって、活性成分として請求項１〜１２に記載の組換え構成物また
は請求項１７に記載の組換え構成物を含有するウイルスを含む組成物。20. A composition for inoculating a plant or for transient expression of a foreign nucleic acid in a plant, wherein the composition is a recombinant construct according to claim 1 or 12 as an active ingredient. A composition comprising a virus containing the recombinant construct.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１４年１月２２日（２００２．１．２２）[Submission date] January 22, 2002 (2002.2.12)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００５７[Correction target item name] 0057
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【００５７】[0057]
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図面の簡単な説明[Correction target item name] Brief description of drawings
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】 図１は、ＺＹＭＶ感染性ｃＤＮＡ（ａ−ｄ）の４つの構成物の模式図を示す。FIG. 1 shows a schematic diagram of the four components of the ZYMV infectious cDNA (ad).
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR , BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW
Claims (20)
であって、ＨＣ-Ｐｒｏ遺伝子保存ＦＲＮＫボックス配列が置換を含むことを特
徴とする全長クローンを含有する組換え構成物。Claims: 1. A recombinant construct comprising a full-length clone, comprising a recombinant potyvirus infectious nucleic acid construct useful for plant interference, wherein the HC-Pro gene-conserved FRNK box sequence comprises a substitution. object.
の組換え構成物。2. The recombinant construct according to claim 1, wherein said nucleic acid is a cDNA or RNA transcript.
置換である請求項１に記載の組換え構成物。3. The recombinant construct according to claim 1, wherein the substitution in the conserved FRNK box is an arginine (Arg) substitution.
、または大きな側鎖を有している請求項３に記載の組換え構成物。4. The recombinant construct according to claim 3, wherein arginine (Arg) is substituted with a hydrophobic amino acid or has a large side chain.
いる請求項４に記載の組換え構成物。5. The recombinant construct according to claim 4, wherein arginine (Arg) is replaced by isoleucine (Ile).
に記載の組換え構成物。6. The method according to claim 1, further comprising a substitution for efficiently stopping aphid transmission.
3. The recombinant construct according to item 1.
組換えポチウイルス感染性核酸構成物。7. The recombinant potyvirus infectious nucleic acid construct according to claim 5, wherein the potyvirus is ZYMV.
質（ＣＰ）のＮ末端領域の保存ＤＡＧトリプレットの１０位のアラニン（Ａｌａ
）残基の置換、またはＺＹＭＶのヘルパー成分プロテイナーゼ（ＨＣ−ｐｒｏ）
の３０９位のトレオニン（Ｔｈｒ）の置換である請求項６および７に記載の組換
え構成物。8. The substitution, which effectively arrests aphid transmission, comprises the alanine (Ala) at position 10 of a conserved DAG triplet in the N-terminal region of the coat protein (CP).
) Substitution of residues or helper component proteinase of ZYMV (HC-pro)
8. The recombinant construct according to claims 6 and 7, which is a substitution of threonine (Thr) at position 309.
構成物。9. The recombinant construct according to claim 8, wherein said construct is ZYMV-AG1.
強い株に対するものである請求項９に記載の組換え構成物。10. The recombinant construct according to claim 9, which is useful for plant interference, wherein the interference is against a strong strain of ZYMV.
されたＤＮＡまたはＲＮＡ配列を持つか、または全てのウイルス性遺伝子が前記
全長クローンから除去されている、植物中の外来核酸の一過性発現(transient e
xpression)にさらに有用な請求項１〜１０に記載の組換え構成物。11. A full-length clone of a foreign nucleic acid in a plant wherein all positions have a DNA or RNA sequence inserted into the full-length clone or all viral genes have been removed from said full-length clone. Transient expression (transient e
A recombinant construct according to claims 1 to 10 which is further useful for xpression).
ＭＶ、ＯＹＤＶ、ＰＲＳＶ、ＰＳｔＶ、ＰｅｐＭｏＶ、ＰＶＭＶ、ＣＧＶＢＶ、
ＧＥＶ、ＩＳＭＶ、ＪＧＭＶ、ＬＹＳＶ、ＬＭＶ、ＭＤＭＶ、ＰＰＶ、ＰＶＡ、
ＰＶＶ、ＰＶＹ、ＳＣＭＶ、ＳＰＦＭＶ、ＴＥＶ、ＴＶＭＶ、ＴＢＶ、ＴｕＭＶ
、ＷＭＶ−２、ＹＭＶおよびＺＹＦＶから選択される請求項１〜６および請求項
１１に記載の組換えポチウイルス感染性核酸。12. The potyvirus may be BCMV, BYMV, BtMV, MW.
MV, OYDV, PRSV, PStV, PepMoV, PVMV, CGVBV,
GEV, ISMV, JGMV, LYSV, LMV, MDMV, PPV, PVA,
PVV, PVY, SCMV, SPFMV, TEV, TVMV, TBV, TuMV
12. The recombinant potyvirus infectious nucleic acid according to claims 1 to 6, and 11 selected from WMV-2, YMV and ZYFV.
成物を植物に接種することを含む、植物におけるウイルス感染を保護する方法。13. A method for protecting a plant from viral infection, comprising inoculating a plant with a recombinant potyvirus infectious construct according to any of the preceding claims.
って行う請求項１３に記載の方法。14. The method according to claim 13, wherein the inoculation of the plant is performed by mechanical inoculation or bombardment.
に記載の全長クローンを植物に感染させるか、または請求項１に記載の全長クロ
ーンを植物に共感染(co-infecting)させ、それによってウイルス性遺伝子を、全
長クローンもしくは全長クローンをもつウイルスと一緒に除去することを含む方
法。15. A method for introducing a foreign nucleic acid into a plant, the method comprising introducing the plant into a plant.
Or infecting a plant with the full-length clone according to claim 1, whereby the viral gene is co-infected with the full-length clone or the virus having the full-length clone. A method comprising removing
成物を植物に接種し、得られた継代を集めることを含む、ポチウイルスの弱い株
を生成する方法。16. A method of producing a weak strain of a potyvirus, comprising inoculating a plant with a recombinant potyvirus infectious construct according to any of the preceding claims and collecting the resulting passages.
た組換え構成物を含有するウイルス。17. A virus comprising the recombinant construct according to claim 1 and produced by the method according to claim 16.
法で接種した生成物。18. A product inoculated with a recombinant construct according to claim 12 according to the method of claim 12.
載の生成物。19. The product according to claim 18, wherein the product is a curcurbit.
めの組成物であって、活性成分として請求項１〜１２に記載の組換え構成物また
は請求項１７に記載の組換え構成物を含有するウイルスを含む組成物。20. A composition for inoculating a plant or for transient expression of a foreign nucleic acid in a plant, wherein the composition is a recombinant construct according to claim 1 or 12 as an active ingredient. A composition comprising a virus containing the recombinant construct.
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