JP2002532687A - ホスホリパーゼａ２の活性を増大させる化合物のアッセイ - Google Patents
ホスホリパーゼａ２の活性を増大させる化合物のアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
所定のホスホリピド基質に対してホスホリパーゼＡ２の活性を増大させる化合物を同定する方法。その際、前記方法は化合物の存在で所定の基質に対して、ホスホリパーゼＡ２の活性が同じ化合物が不在の場合のその活性と比較して増大されるかどうかを測定することを含む。細胞中のホスホリパーゼＡ２の生産または発現を増大させる化合物を同定する方法。その際、前記方法は化合物の存在で細胞中のホスホリパーゼＡ２の生産または発現が、同じ化合物が不在の場合のその生産または発現と比較して直接的にまたは間接的に増大されるかどうかを測定することを含む。
Description
【０００１】 本発明は、特にうつ病および関連する精神病（不安症および精神分裂病を含む
）の治療において有効な化合物のアッセイ、かつこのような治療におけるそれら
の使用に関する。さらに、本発明は、ドコサヘキサエン酸、およびドコサヘキサ
エン酸の作用を模倣する化合物の、例えばうつ病および関連する精神病を治療す
るための使用にも関する。
）の治療において有効な化合物のアッセイ、かつこのような治療におけるそれら
の使用に関する。さらに、本発明は、ドコサヘキサエン酸、およびドコサヘキサ
エン酸の作用を模倣する化合物の、例えばうつ病および関連する精神病を治療す
るための使用にも関する。
【０００２】 うつ病は、世界の工業国中で最も流行している精神病の状態である。米国およ
び英国では、流行の程度は１３〜２０％であると推定されている（Boyd and Wei
ssmanm 1981）。うつ病と自殺の間には強力なつながりがある。うつ病は、自殺
したい衝動にかられている患者の４０〜７０％、ついに自殺をする雰囲気にある
患者の１５％で診断されている（Schifano, 1994による評論雑誌参照）。致命的
ではない自殺状態は、患者の２０〜４０％では観察されている。さらに、死亡率
（例えば、自殺、集中力の欠陥による致命的事故および後遺症に違いない疾患に
よる死）、疾病率（例えば、自殺未遂、事故、疾患、雇用の見通しの低さおよび
物質乱用障害）、および社会的コスト（例えば、機能不全家族、アブセンティズ
ムおよび失業）の点から見てこの病気を取り扱うためには、非常に高いコストが
かかる。
び英国では、流行の程度は１３〜２０％であると推定されている（Boyd and Wei
ssmanm 1981）。うつ病と自殺の間には強力なつながりがある。うつ病は、自殺
したい衝動にかられている患者の４０〜７０％、ついに自殺をする雰囲気にある
患者の１５％で診断されている（Schifano, 1994による評論雑誌参照）。致命的
ではない自殺状態は、患者の２０〜４０％では観察されている。さらに、死亡率
（例えば、自殺、集中力の欠陥による致命的事故および後遺症に違いない疾患に
よる死）、疾病率（例えば、自殺未遂、事故、疾患、雇用の見通しの低さおよび
物質乱用障害）、および社会的コスト（例えば、機能不全家族、アブセンティズ
ムおよび失業）の点から見てこの病気を取り扱うためには、非常に高いコストが
かかる。
【０００３】 伝統的に、１９６０年代にうつ病がセロトニン（５−ＨＴ）および／またはノ
ルアドレナリン機能の欠損により生じているとの報告があったため（Schildkrau
t 1965; Lapin and Oxenkrug, 1969）、研究は脳のセロトニン作用系およびノル
アドレナリン作用系に注目されてきた。この仮説が適用され、かつ現代の薬物療
法がこれらの２つの系を調節することに方向付けされているにもかかわらず、う
つ病を治療する現存する薬剤は、以下の基本的な３つの理由で不満足である： １． 抗うつ剤が患者の約７０％にだけでしか有効でなく、残りの相当な割合（
〜３０％）が現存の治療に対して耐性である（US Department of Health and Hu
man Services, 1993）。薬剤治療に反応する患者のうち、多くの患者が完全にお
さまるわけではない（標準の精神医学的スケールで推定して少なくとも５０％の
症状の減少）。
ルアドレナリン機能の欠損により生じているとの報告があったため（Schildkrau
t 1965; Lapin and Oxenkrug, 1969）、研究は脳のセロトニン作用系およびノル
アドレナリン作用系に注目されてきた。この仮説が適用され、かつ現代の薬物療
法がこれらの２つの系を調節することに方向付けされているにもかかわらず、う
つ病を治療する現存する薬剤は、以下の基本的な３つの理由で不満足である： １． 抗うつ剤が患者の約７０％にだけでしか有効でなく、残りの相当な割合（
〜３０％）が現存の治療に対して耐性である（US Department of Health and Hu
man Services, 1993）。薬剤治療に反応する患者のうち、多くの患者が完全にお
さまるわけではない（標準の精神医学的スケールで推定して少なくとも５０％の
症状の減少）。
【０００４】 ２． 全ての現存の抗うつ剤は、比較的にゆっくりとしかその臨床上の作用を表
さず、４週間もしくはそれ以上長い投与を必要として最大効能を達成する（Fraz
er, 1994）。
さず、４週間もしくはそれ以上長い投与を必要として最大効能を達成する（Fraz
er, 1994）。
【０００５】 ３． 副作用の発生率および重さもまた問題であり、特に以前の三環薬剤を用い
た場合には、例えば、過量投与での毒性、鎮静剤、乾燥唇および視力障害が生じ
得るのに対して、二世代の抗うつ薬、例えば選択的セロトニンインヒビター（SS
RIs）は、めまい、吐気、胃腸障害、頭痛、睡眠障害および性的機能不全を生じ
得る（Frazer, 1994）。
た場合には、例えば、過量投与での毒性、鎮静剤、乾燥唇および視力障害が生じ
得るのに対して、二世代の抗うつ薬、例えば選択的セロトニンインヒビター（SS
RIs）は、めまい、吐気、胃腸障害、頭痛、睡眠障害および性的機能不全を生じ
得る（Frazer, 1994）。
【０００６】 電気痙攣療法（ECT）だけが、急な発症かつ治療抵抗患者の両方に効果的なう
つ病の治療である（Paykel and Hale, 1986; Segman et al, 1994）。しかし、
その使用は多くの理由から制限されている。第１に、これらは短期間の記憶障害
およびＥＣＴの使用と関連する強力な社会的不名誉による。さらに、病院内での
使用に規制されている（通常、精神病の研究部門を有する病院）、それというの
も、その痛ましい副作用を妨げるために筋弛緩薬（例えば、Segman et al, 1994
参照）を用いる知覚消失下に投与されるからであるが、しかし過去にはこれは神
経筋遮断薬または麻酔薬を用いずに投与されていた。ＥＣＴは、臨床的作用の急
な発症が決定的であり（例えば高い自殺の危険性）かつ患者が多くの抗うつ剤に
抗療性である場合に特に有効である。ＥＣＴの作用様式が分かりにくいままであ
るにもかかわらず、その有益な効果は、体内を通る電気の通過というよりは痙攣
発作と関連する神経活性によると考えられている。それといういも、同様の有益
な効果が化学的痙攣薬、例えばビククリン（Siesjoe et al, 1982）またはフル
オロスシル（Green, 1980）を用いて製造できるからである。
つ病の治療である（Paykel and Hale, 1986; Segman et al, 1994）。しかし、
その使用は多くの理由から制限されている。第１に、これらは短期間の記憶障害
およびＥＣＴの使用と関連する強力な社会的不名誉による。さらに、病院内での
使用に規制されている（通常、精神病の研究部門を有する病院）、それというの
も、その痛ましい副作用を妨げるために筋弛緩薬（例えば、Segman et al, 1994
参照）を用いる知覚消失下に投与されるからであるが、しかし過去にはこれは神
経筋遮断薬または麻酔薬を用いずに投与されていた。ＥＣＴは、臨床的作用の急
な発症が決定的であり（例えば高い自殺の危険性）かつ患者が多くの抗うつ剤に
抗療性である場合に特に有効である。ＥＣＴの作用様式が分かりにくいままであ
るにもかかわらず、その有益な効果は、体内を通る電気の通過というよりは痙攣
発作と関連する神経活性によると考えられている。それといういも、同様の有益
な効果が化学的痙攣薬、例えばビククリン（Siesjoe et al, 1982）またはフル
オロスシル（Green, 1980）を用いて製造できるからである。
【０００７】 ＥＣＴの治療作用の機構が解明されるのであれば、うつ病患者の治療において
強力なＥＣＴの効能を有する新規の抗うつ剤を見出すことができるであろう。こ
のような薬剤にとって、発作を誘発したり短期間の記憶障害を引き起こすことな
く、その効果を表すことが望ましい。はじめに記載されたこのような治療の利点
は、作用および効能の急速な発症である。
強力なＥＣＴの効能を有する新規の抗うつ剤を見出すことができるであろう。こ
のような薬剤にとって、発作を誘発したり短期間の記憶障害を引き起こすことな
く、その効果を表すことが望ましい。はじめに記載されたこのような治療の利点
は、作用および効能の急速な発症である。
【０００８】 大規模な研究にもかかわらず、ＥＣＴの作用の正確な機構は不明瞭である。し
かし、次に動物への電気痙攣ショック（ＥＣＳ）の投与を調査することができる
。ＥＣＳおよび抗うつ剤は、モノアミン合成において多くの共通の作用を有する
。例えば、両方のタイプの治療は、一般的にα２−アドレナリン作動性受容体、
β１−アドレナリン作動性受容体（Green et al, 1984）および５−HT１Ａ−受
容体（Marin et al, 1992）をダウンレギュレートする。しかし、ＥＣＳおよび
抗うつ剤によって反対の方法で作用する２つの受容体があり、これらは５−HT２ Ａ およびドーパミンＤ１受容体である。抗うつ剤は、一般的には５−HT２Ａ受容
体のダウンレギュレーションを引き起こすが（Peroutka and Snyder, 1980）、
しかしＥＣＳはこれらの受容体のアップレギュレーションを引き起こす（Green
et al, 1983; Martin et al, 1991）。同様に、Ｄ１受容体は抗うつ剤によって
作用されないが（Martin et al, 1988）、しかしＤ１ファンクションはＥＣＳに
よって高められる（Martin et al, 1990）。
かし、次に動物への電気痙攣ショック（ＥＣＳ）の投与を調査することができる
。ＥＣＳおよび抗うつ剤は、モノアミン合成において多くの共通の作用を有する
。例えば、両方のタイプの治療は、一般的にα２−アドレナリン作動性受容体、
β１−アドレナリン作動性受容体（Green et al, 1984）および５−HT１Ａ−受
容体（Marin et al, 1992）をダウンレギュレートする。しかし、ＥＣＳおよび
抗うつ剤によって反対の方法で作用する２つの受容体があり、これらは５−HT２ Ａ およびドーパミンＤ１受容体である。抗うつ剤は、一般的には５−HT２Ａ受容
体のダウンレギュレーションを引き起こすが（Peroutka and Snyder, 1980）、
しかしＥＣＳはこれらの受容体のアップレギュレーションを引き起こす（Green
et al, 1983; Martin et al, 1991）。同様に、Ｄ１受容体は抗うつ剤によって
作用されないが（Martin et al, 1988）、しかしＤ１ファンクションはＥＣＳに
よって高められる（Martin et al, 1990）。
【０００９】 これらの変化は細胞外のモノアミンレベルの変化によって誘導されているよう
ではない。それというのも、α２−アドレナリン作動性受容体におけるＥＣＳの
作用はセロトニン作用性またはノルアドレナリン作用性ニューロンが不在のとき
でも存続し（Heal et al, 1991）かつβ１−アドレナリン作動性受容体における
その作用は、ノルアドレナリン作用性ニューロンが不在のときでも存続するから
である（Dooley et al, 1987）。
ではない。それというのも、α２−アドレナリン作動性受容体におけるＥＣＳの
作用はセロトニン作用性またはノルアドレナリン作用性ニューロンが不在のとき
でも存続し（Heal et al, 1991）かつβ１−アドレナリン作動性受容体における
その作用は、ノルアドレナリン作用性ニューロンが不在のときでも存続するから
である（Dooley et al, 1987）。
【００１０】 Basan&Rakowski（1970）は、１回のＥＣＳが脳内の遊離脂肪酸（ＦＦＡｓ）の
急速で短時間持続の増大を誘発することを報告している。このことは、ＦＦＡｓ
が多くの細胞機能を調節していることの証拠である（Sumida et al, 1993; Meir
es, 1994）。
急速で短時間持続の増大を誘発することを報告している。このことは、ＦＦＡｓ
が多くの細胞機能を調節していることの証拠である（Sumida et al, 1993; Meir
es, 1994）。
【００１１】 ドコサヘキサエン酸（DHA [22:6 ω-3]）が、おそらくＥＣＴの抗うつ剤作用
の媒介物であろうということがわかった。脳膜ホスホリピドにおけるホスホリパ
ーゼＡ２の作用がＤＨＡの源のようである。
の媒介物であろうということがわかった。脳膜ホスホリピドにおけるホスホリパ
ーゼＡ２の作用がＤＨＡの源のようである。
【００１２】 酵素系としてのホスホリパーゼは、適度に良好に特徴付けられ、特に、ホスホ
リパーゼＡ２（PLA２）は、酵素のスーパーファミリーとして公知であり、この
うちいくつかはシグナルトランスダクションに関係している（例えば、Dennis,
1997参照）。同様に、シグナルトランスダクション中の脂肪酸の役割は、Sumida
et al, 1993a中に記載されている。
リパーゼＡ２（PLA２）は、酵素のスーパーファミリーとして公知であり、この
うちいくつかはシグナルトランスダクションに関係している（例えば、Dennis,
1997参照）。同様に、シグナルトランスダクション中の脂肪酸の役割は、Sumida
et al, 1993a中に記載されている。
【００１３】 Vallette et al, 1995は、アラキドン酸およびＤＨＡは、細胞内ステロイドホ
ルモン信号経路を調節してグルココルチコイド感受性プロモーターを共同調節（
co-regulate）する役割があることを示唆している。Sumida et al, 1993bは、Ｄ
ＨＡのような不飽和脂肪酸がラット肝臓のグルココルチコイド受容体と相互に作
用し、かつその作用部位がホルモン−結合ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメイン
のＣ−末端配列を有する受容体の断片上にあることを示唆している。
ルモン信号経路を調節してグルココルチコイド感受性プロモーターを共同調節（
co-regulate）する役割があることを示唆している。Sumida et al, 1993bは、Ｄ
ＨＡのような不飽和脂肪酸がラット肝臓のグルココルチコイド受容体と相互に作
用し、かつその作用部位がホルモン−結合ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメイン
のＣ−末端配列を有する受容体の断片上にあることを示唆している。
【００１４】 脂肪酸は、含脂肪細胞の脂肪酸結合タンパク質ａＰ２（Grimaldi et al, 1992
）の遺伝子を誘発しかつクロヒブル酸（clofibric acid）−活性化受容体および
グルココルチコイド受容体のキメラを活性化することが明らかである（Goerrlic
her et al, 1992）。
）の遺伝子を誘発しかつクロヒブル酸（clofibric acid）−活性化受容体および
グルココルチコイド受容体のキメラを活性化することが明らかである（Goerrlic
her et al, 1992）。
【００１５】 種々の形のＰＬＡ２の分子クローニングは、Sharp et al, 1991; Clark et al
, 1991; Larson et al, 1998; Ma et al, 1999, US 5,466, 596; US 5,328,842;
US 5,554,511（US 5,466,595の一部）; US 5,354,677; US 5,322,776; およびW
O 96/03512（US 5,466,595に関連している）に記載されている。インヒビターの
スクリーニングは、WO 93/03512に記載されており、このようなインヒビターが
アラキドン酸カスケードにより媒介される抗炎症活性を有していることを示唆し
ている。
, 1991; Larson et al, 1998; Ma et al, 1999, US 5,466, 596; US 5,328,842;
US 5,554,511（US 5,466,595の一部）; US 5,354,677; US 5,322,776; およびW
O 96/03512（US 5,466,595に関連している）に記載されている。インヒビターの
スクリーニングは、WO 93/03512に記載されており、このようなインヒビターが
アラキドン酸カスケードにより媒介される抗炎症活性を有していることを示唆し
ている。
【００１６】 さらに、ＰＬＡ２−コード化ポリヌクレオチドは、WO 95/02328に記載されて
おり、WO 95/05479は、酵素活性を測定するために有効であるサイトゾルＰＬＡ
２のための新規の基質に関している。
おり、WO 95/05479は、酵素活性を測定するために有効であるサイトゾルＰＬＡ
２のための新規の基質に関している。
【００１７】 WO 97/04127は、サイトゾルＰＬＡ２遺伝子中の対立遺伝子のバリエーション
を分析することによる精神分裂病の推定診断テストに関し、かつEP 0599576は、
γ−リノール酸、アラキドン酸およびＤＨＡの組合物を精神分裂病の治療に使用
することに関する。
を分析することによる精神分裂病の推定診断テストに関し、かつEP 0599576は、
γ−リノール酸、アラキドン酸およびＤＨＡの組合物を精神分裂病の治療に使用
することに関する。
【００１８】 本発明の課題は、不安症および精神分裂病を含む精神病または神経障害を治療
するために薬剤として有効な化合物のスクリーニングアッセイ、またはこのよう
な薬剤に発展させるための先導化合物として少なくとも有効な薬剤；およびうつ
病を含む精神病または神経障害を治療する方法を提供することであった。
するために薬剤として有効な化合物のスクリーニングアッセイ、またはこのよう
な薬剤に発展させるための先導化合物として少なくとも有効な薬剤；およびうつ
病を含む精神病または神経障害を治療する方法を提供することであった。
【００１９】 ドコサヘキサエン酸は、繰返されるＥＣＴ（repeated ECT）の抗ドーパミン作
用の媒介物のようなものであることが同定された。ＥＣＳは、５−ＨＴ２Ａ結合
（Martin et al, 1991）、発現（Butler et al, 1993）および機能（Green et a
l, 1983）をアップレギュレートするので、これをＥＣＳのような効果のマーカ
ーとして使用する。繰返されるＥＣＳは、ＤＨＡを含めて遊離脂肪酸の著しい放
出を引き起こす（図１）。繰返されるＥＣＳの投与（１０日にわたり５回）は、
前頭皮質中で１１〜１３％および海馬中で３０〜４６％の５−ＨＴ２受容体結合
Ｂｍａｘの増大を引き起こし（Martin et al, 1991）；この効果は、ＤＨＡに模
倣させることができ（200 pmol i.c.v.(脳室内経路)１０日にわたり５回）、ex
vivoで約４０％の５−ＨＴ２結合Ｂｍａｘの増大を引き起こす（図２）。ＤＨＡ
治療の大きな効果は、in vivoでの５−ＨＴ２−媒介機能に見られる：すなわち
１０日にわたり５回 i.c.v.へＤＨＡを２００ｐｍｏｌまたは４００ｐｍｏｌ投
与すると、C57 BL/6 マウス中で５−メトキシ−N,N−ジメチルトリプタミン（５
-MeO-DMT）−誘導の頭部痙攣の頻度をそれぞれコントロールの６５％および１０
０％だけ増大させ、比較的高いＤＨＡ投与量は、ＥＣＳから区別がつかない効果
を生じる（図３ａ）。他の脂肪酸およびアラキドン酸（ＡＡ; 20:4 ω-6）は効
果がなく、かつオレイン酸（ＯＡ; 18:1 ω-9）の効果は不一致である（図３ｂ
）。さらに、ＤＨＡ投与（400 pmol, i.c.v. １０日にわたり５回）は、ポアソ
ルト強制水泳試験（Porsolt forced-swim test）において著しい抗うつ剤作用を
有しており、同様のＥＣＳ治療摂生により引き起こされるものに匹敵する（図４
）。対照的に、それぞれＤＨＡ、ＡＡおよびＯＡを２００pmol含有する混合物の
i.c.v.投与は効果がない（図４）。
用の媒介物のようなものであることが同定された。ＥＣＳは、５−ＨＴ２Ａ結合
（Martin et al, 1991）、発現（Butler et al, 1993）および機能（Green et a
l, 1983）をアップレギュレートするので、これをＥＣＳのような効果のマーカ
ーとして使用する。繰返されるＥＣＳは、ＤＨＡを含めて遊離脂肪酸の著しい放
出を引き起こす（図１）。繰返されるＥＣＳの投与（１０日にわたり５回）は、
前頭皮質中で１１〜１３％および海馬中で３０〜４６％の５−ＨＴ２受容体結合
Ｂｍａｘの増大を引き起こし（Martin et al, 1991）；この効果は、ＤＨＡに模
倣させることができ（200 pmol i.c.v.(脳室内経路)１０日にわたり５回）、ex
vivoで約４０％の５−ＨＴ２結合Ｂｍａｘの増大を引き起こす（図２）。ＤＨＡ
治療の大きな効果は、in vivoでの５−ＨＴ２−媒介機能に見られる：すなわち
１０日にわたり５回 i.c.v.へＤＨＡを２００ｐｍｏｌまたは４００ｐｍｏｌ投
与すると、C57 BL/6 マウス中で５−メトキシ−N,N−ジメチルトリプタミン（５
-MeO-DMT）−誘導の頭部痙攣の頻度をそれぞれコントロールの６５％および１０
０％だけ増大させ、比較的高いＤＨＡ投与量は、ＥＣＳから区別がつかない効果
を生じる（図３ａ）。他の脂肪酸およびアラキドン酸（ＡＡ; 20:4 ω-6）は効
果がなく、かつオレイン酸（ＯＡ; 18:1 ω-9）の効果は不一致である（図３ｂ
）。さらに、ＤＨＡ投与（400 pmol, i.c.v. １０日にわたり５回）は、ポアソ
ルト強制水泳試験（Porsolt forced-swim test）において著しい抗うつ剤作用を
有しており、同様のＥＣＳ治療摂生により引き起こされるものに匹敵する（図４
）。対照的に、それぞれＤＨＡ、ＡＡおよびＯＡを２００pmol含有する混合物の
i.c.v.投与は効果がない（図４）。
【００２０】 その他の研究の土台は、ＤＨＡの必須脂肪酸前駆体であるα−リノレン酸のレ
ベルが、健康患者（コントロール）と比較して軽度または重度のうつ病を患う患
者の血清コレステロールエステルにおいて著しく低いという発見である（Maer e
t al, 1996）。
ベルが、健康患者（コントロール）と比較して軽度または重度のうつ病を患う患
者の血清コレステロールエステルにおいて著しく低いという発見である（Maer e
t al, 1996）。
【００２１】 結論として、これらのデータはＥＣＴの多くの有益な効果をＤＨＡを用いる治
療により模倣できることを示している。さらに、これらは、膜ホスホリピドから
ＤＨＡを放出する機構をまた示しており、従って脳中での遊離ＤＨＡのレベルを
高め、うつ病および他の精神病および神経系の疾患を治療するもう１つの手段を
提供する。これらの研究法は、ＥＣＴと同様の効能を有するであろう（すなわち
、急速な作用の発症および抗治療患者の有効性）。
療により模倣できることを示している。さらに、これらは、膜ホスホリピドから
ＤＨＡを放出する機構をまた示しており、従って脳中での遊離ＤＨＡのレベルを
高め、うつ病および他の精神病および神経系の疾患を治療するもう１つの手段を
提供する。これらの研究法は、ＥＣＴと同様の効能を有するであろう（すなわち
、急速な作用の発症および抗治療患者の有効性）。
【００２２】 本発明の第１の態様は、所定のホスホリピド基質に対してホスホリパーゼＡ２ の活性を増大させる化合物を同定する方法の提供であり、該方法は、化合物の存
在で、同じ化合物が不在の時のその活性と比べてホスホリパーゼＡ２の活性が所
定の基質に対して増大するかどうかを測定することを含む。
在で、同じ化合物が不在の時のその活性と比べてホスホリパーゼＡ２の活性が所
定の基質に対して増大するかどうかを測定することを含む。
【００２３】 本発明の第２の態様は、細胞中でホスホリパーゼＡ２の生産または発現を増大
させる化合物を同定する方法の提供であり、該方法は、細胞中でのホスホリパー
ゼＡ２の生産または発現が同じ化合物が不在の時と比べてその生産または発現が
化合物の存在で、増大するかどうかを直接または間接的に測定することを含む。
させる化合物を同定する方法の提供であり、該方法は、細胞中でのホスホリパー
ゼＡ２の生産または発現が同じ化合物が不在の時と比べてその生産または発現が
化合物の存在で、増大するかどうかを直接または間接的に測定することを含む。
【００２４】 我々の研究では、ＤＨＡがおそらくＥＣＴの有益な抗うつ剤作用の媒介物であ
り、かつホスホリパーゼ酵素の活性または該酵素の高められた生産または発現、
内因性ＤＨＡの放出を強化してこれらの有益な効果をもたらすと考えられている
。本発明に関する理論によっても制限されていないが、ＤＨＡの放出をもたらす
ホスホリパーゼ酵素の合理的な活性を以下に記載する。
り、かつホスホリパーゼ酵素の活性または該酵素の高められた生産または発現、
内因性ＤＨＡの放出を強化してこれらの有益な効果をもたらすと考えられている
。本発明に関する理論によっても制限されていないが、ＤＨＡの放出をもたらす
ホスホリパーゼ酵素の合理的な活性を以下に記載する。
【００２５】 膜脂質は、次の４つの大きなグループに分けられる：トリグリセリド、ホスホ
グリセリド、スフィンゴリピドおよびグリコリピド。ホスホグリセリドは、過半
数の脂質クラスを形成している。ホスホグリセリド（またはホスホリピド）は、
グリセロールの第１目（ｓｎ−１）および第２目（ｓｎ−２）の炭素原子に付着
した２つの脂肪酸基、４つの可能な先端部の極性基：セリン、エタノールアミン
、コリンまたはイノシトールのうち１と結合した３番目（ｓｎ−３）の炭素原子
に付着したホスフェート基から成る。よって、先端部の極性基に応じて、ホスホ
リピドはさらに次のクラスに細分される：ホスファチジルセリン（PS）、ホスフ
ァチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルコリン（PC）またはホスファ
チジルイノシトール（PI）。
グリセリド、スフィンゴリピドおよびグリコリピド。ホスホグリセリドは、過半
数の脂質クラスを形成している。ホスホグリセリド（またはホスホリピド）は、
グリセロールの第１目（ｓｎ−１）および第２目（ｓｎ−２）の炭素原子に付着
した２つの脂肪酸基、４つの可能な先端部の極性基：セリン、エタノールアミン
、コリンまたはイノシトールのうち１と結合した３番目（ｓｎ−３）の炭素原子
に付着したホスフェート基から成る。よって、先端部の極性基に応じて、ホスホ
リピドはさらに次のクラスに細分される：ホスファチジルセリン（PS）、ホスフ
ァチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルコリン（PC）またはホスファ
チジルイノシトール（PI）。
【００２６】 ホスホリピドのそれぞれのクラスは、ｓｎ−１位およびｓｎ−２位で組み込ま
れる脂肪酸に応じてさらに分けられる。しかし、いくつかの一般化を有する：飽
和脂肪酸（例えば、パルミチン酸 [16:0]またはステアリン酸 [18:0]）またはモ
ノ不飽和脂肪酸（例えば OA）は、一般的にｓｎ−１で組み込まれているのに対
して、比較的長いポリ不飽和酸はｓｎ−２で組み込まれている。さらに、特定の
ポリ不飽和脂肪酸は特定の先端部の極性基と結合する傾向がある。このように、
脳ホスホリピドプール中では、ＡＡが優性的にＰｌおよびＰＣ中に組み込まれる
の対して、ＤＨＡはＰＳおよびＰＥ中に組み込まれる（Salem et al, 1986）。
れる脂肪酸に応じてさらに分けられる。しかし、いくつかの一般化を有する：飽
和脂肪酸（例えば、パルミチン酸 [16:0]またはステアリン酸 [18:0]）またはモ
ノ不飽和脂肪酸（例えば OA）は、一般的にｓｎ−１で組み込まれているのに対
して、比較的長いポリ不飽和酸はｓｎ−２で組み込まれている。さらに、特定の
ポリ不飽和脂肪酸は特定の先端部の極性基と結合する傾向がある。このように、
脳ホスホリピドプール中では、ＡＡが優性的にＰｌおよびＰＣ中に組み込まれる
の対して、ＤＨＡはＰＳおよびＰＥ中に組み込まれる（Salem et al, 1986）。
【００２７】 ホスホリピド中に組み込まれ次第、脂肪酸はホスホリパーゼの加水分解活性に
より放出され得る。ホスホリパーゼは、これがホスホグリセリド分子を分解する
場所に応じて４つの大きなクラスに分類されている。ホスホリパーゼＡ１（ＰＬ
Ａ１）およびＡ２（ＰＬＡ２）は、それぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位で酸を除
き、直接に遊離脂肪酸およびリゾホスファチジルグリセロールを生じる。ホスホ
リパーゼＢ（ＰＬＢ）酵素は、ＰＬＡ１およびＰＬＡ２活性を併用している。ホ
スホリパーゼＣ（ＰＬＢ）は、ｓｎ−３位で分解し、１，２−ジアシルグリセロ
ール（ＤＡＧ）およびリン酸化された先端部の基を生じる。ＰｌおよびＰＣ基質
はこの酵素のグループに特異的であるため、一般的にホスホイノシトールまたは
ホスホコリンが放出される。遊離脂肪酸は、ジアシルグリセロールリパーゼによ
りＤＡＧから引き続き放出されなくてはならない。ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）
は、ｓｎ−３位でホスフェートから先端部の極性基を分解し、ホスファチジン酸
（ＰＡ；ジアシグリセロール−３−ホスフェート）および先端部の遊離基を生じ
る。一般的に、これは酵素に特異的なＰＣであるため遊離コリンである（Liscov
itch 1991; Want et al, 1991; Thompson et al, 1993）。ＰＡからの脂肪酸の
放出には、その後のホスファチジン酸脱ホスホリラーゼおよびジアシグリセロー
ルリパーゼの後発性の活性を必要とする。
より放出され得る。ホスホリパーゼは、これがホスホグリセリド分子を分解する
場所に応じて４つの大きなクラスに分類されている。ホスホリパーゼＡ１（ＰＬ
Ａ１）およびＡ２（ＰＬＡ２）は、それぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位で酸を除
き、直接に遊離脂肪酸およびリゾホスファチジルグリセロールを生じる。ホスホ
リパーゼＢ（ＰＬＢ）酵素は、ＰＬＡ１およびＰＬＡ２活性を併用している。ホ
スホリパーゼＣ（ＰＬＢ）は、ｓｎ−３位で分解し、１，２−ジアシルグリセロ
ール（ＤＡＧ）およびリン酸化された先端部の基を生じる。ＰｌおよびＰＣ基質
はこの酵素のグループに特異的であるため、一般的にホスホイノシトールまたは
ホスホコリンが放出される。遊離脂肪酸は、ジアシルグリセロールリパーゼによ
りＤＡＧから引き続き放出されなくてはならない。ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）
は、ｓｎ−３位でホスフェートから先端部の極性基を分解し、ホスファチジン酸
（ＰＡ；ジアシグリセロール−３−ホスフェート）および先端部の遊離基を生じ
る。一般的に、これは酵素に特異的なＰＣであるため遊離コリンである（Liscov
itch 1991; Want et al, 1991; Thompson et al, 1993）。ＰＡからの脂肪酸の
放出には、その後のホスファチジン酸脱ホスホリラーゼおよびジアシグリセロー
ルリパーゼの後発性の活性を必要とする。
【００２８】 このように、脳膜ホスホリピドから遊離酸を直接に放出するために、ＰＬＡ２ またはＰＬＢ酵素を活性化する必要がある。しかし、本発明の範囲では、遊離脂
肪酸の非特異的な放出は必ずしも有益であるとは限らない。ＡＡの放出は、炎症
性の媒介物の能力があるトロンボキサンおよびプロスタグランジンの発生を導く
。従って、ＡＡを放出するホスホリパーゼを活性化しないのが望ましい。その結
果として、：（ａ）ｓｎ−２位でのＤＨＡの選択性または（ｂ）ｓｎ−３位での
ホスホセリンまたはホスホエタノールアミンの選択性のどちらか１方を用いてホ
スホリパーゼを活性化して、ｓｎ−２位で適当に高いＤＨＡの割合を有する基質
を規定することにより脳ホスホリピドプールからＤＨＡの優先的な放出を引き起
こすことが望ましい。いずれにせよ分子遺伝学的研究を用いて、これらの特徴を
有するＰＬＡ２のイソ型は公知であり、さらにこれらの所望の特徴を有するＰＬ
Ａ２の他のイソ型を見出すこともできる。
肪酸の非特異的な放出は必ずしも有益であるとは限らない。ＡＡの放出は、炎症
性の媒介物の能力があるトロンボキサンおよびプロスタグランジンの発生を導く
。従って、ＡＡを放出するホスホリパーゼを活性化しないのが望ましい。その結
果として、：（ａ）ｓｎ−２位でのＤＨＡの選択性または（ｂ）ｓｎ−３位での
ホスホセリンまたはホスホエタノールアミンの選択性のどちらか１方を用いてホ
スホリパーゼを活性化して、ｓｎ−２位で適当に高いＤＨＡの割合を有する基質
を規定することにより脳ホスホリピドプールからＤＨＡの優先的な放出を引き起
こすことが望ましい。いずれにせよ分子遺伝学的研究を用いて、これらの特徴を
有するＰＬＡ２のイソ型は公知であり、さらにこれらの所望の特徴を有するＰＬ
Ａ２の他のイソ型を見出すこともできる。
【００２９】 ＰＬＡ２活性を有する酵素の生化学的キャラクタリゼーションおよび分子遺伝
学的分析は、次のような２つの大きなクラスに分類することができる多くのイソ
型を明らかにした：低分子量（１４ｋＤ）の分泌イソ型（ｃＰＬＡ２）および高
分子量（４０〜１１０ｋＤ）のサイトゾルイソ型（ｃＰＬＡ２）。これらの大き
な分類は、基質特異性、コファクターの必要性、および活性の機構に応じてさら
に細分される。タンパク質またはＤＮＡ配列データが入手可能な全てのＰＬＡ２ イソ型の総合的概要は、Dennis(1997)により得られる。これらの配列決定された
イソ型のうち、特に有利なイソ型は、必要とされる基質が特異的にＤＨＡを放出
する、８５ｋＤａ ＶＩ型カルシウム非依存性のｃＰＬＡ２である。３つのげっ
歯類のイソ型はクローニングされて相同であることが示されたが（hamster: Jon
es and Tang 1995, Tang et al, 1997; mouse: Balboa et al, 1997; rat: Ma e
t al, 1997）、４つめの生化学的にキャラクタリゼーションされたげっ歯類のマ
クロファージイソ型 (Ackerman et al, 1994)も相同であると考えられている（B
alboa et al, 1997）。このＶＩ型カルシウム非依存性のｃＰＬＡ２酵素のヒト
相同体は、配列決定されかつ２つのイソ型を有することが示されている（Larsso
n et al, 1998; Ma et al, 1999）。短いイソ型（８５ｋＤ）は、げっ歯類イソ
型（Ma et al, 1999）に対して高度に相同（約９５％の同一性）であるのに対し
て、長いイソ型（８８ｋＤ）は、げっ歯類のイソ型中には存在しない付加的なア
ミノ酸５４個を含んでおり（Larsson et al. 1998）、このことはアデノシン三
リン酸（ATP）による酵素活性を与える（Ma et al, 1999）。しかし、生化学的
のキャラクタリゼーションされた付加的なイソ型があるが、タンパク質またはＤ
ＮＡレベルではまだ配列決定されていない。これらのいくつかは、優先的にＤＨ
Ａを放出する必要な基質特異性を有している。これらは、アレチネズミから Ror
dorf et al, (1991)により単離されたＰＥ選択性および最適ｐＨ８．５を有する
１４ｋＤ可溶性サイトゾルＰＬＡ２イソ型；ウシ脳からHirashima et al (1992)
により単離されたＰＥ選択性を有する１１０ｋDaカルシウム非依存性ＰＬＡ２；
ラット腎臓からHara al (1995)により精製されたアルカリ性の最適ｐＨおよびＰ
Ｅ選択性を有する６０ｋDaカルシウム依存性サイトゾルＰＬＡ２；およびラット
肥満細胞から精製された中性／酸性最適ｐＨを有するＰＳ加水分解カルシウム依
存性サイトゾルＰＬＡ２を、後者の２つのイソ型が脳中にも存在するという条件
で含まれる。
学的分析は、次のような２つの大きなクラスに分類することができる多くのイソ
型を明らかにした：低分子量（１４ｋＤ）の分泌イソ型（ｃＰＬＡ２）および高
分子量（４０〜１１０ｋＤ）のサイトゾルイソ型（ｃＰＬＡ２）。これらの大き
な分類は、基質特異性、コファクターの必要性、および活性の機構に応じてさら
に細分される。タンパク質またはＤＮＡ配列データが入手可能な全てのＰＬＡ２ イソ型の総合的概要は、Dennis(1997)により得られる。これらの配列決定された
イソ型のうち、特に有利なイソ型は、必要とされる基質が特異的にＤＨＡを放出
する、８５ｋＤａ ＶＩ型カルシウム非依存性のｃＰＬＡ２である。３つのげっ
歯類のイソ型はクローニングされて相同であることが示されたが（hamster: Jon
es and Tang 1995, Tang et al, 1997; mouse: Balboa et al, 1997; rat: Ma e
t al, 1997）、４つめの生化学的にキャラクタリゼーションされたげっ歯類のマ
クロファージイソ型 (Ackerman et al, 1994)も相同であると考えられている（B
alboa et al, 1997）。このＶＩ型カルシウム非依存性のｃＰＬＡ２酵素のヒト
相同体は、配列決定されかつ２つのイソ型を有することが示されている（Larsso
n et al, 1998; Ma et al, 1999）。短いイソ型（８５ｋＤ）は、げっ歯類イソ
型（Ma et al, 1999）に対して高度に相同（約９５％の同一性）であるのに対し
て、長いイソ型（８８ｋＤ）は、げっ歯類のイソ型中には存在しない付加的なア
ミノ酸５４個を含んでおり（Larsson et al. 1998）、このことはアデノシン三
リン酸（ATP）による酵素活性を与える（Ma et al, 1999）。しかし、生化学的
のキャラクタリゼーションされた付加的なイソ型があるが、タンパク質またはＤ
ＮＡレベルではまだ配列決定されていない。これらのいくつかは、優先的にＤＨ
Ａを放出する必要な基質特異性を有している。これらは、アレチネズミから Ror
dorf et al, (1991)により単離されたＰＥ選択性および最適ｐＨ８．５を有する
１４ｋＤ可溶性サイトゾルＰＬＡ２イソ型；ウシ脳からHirashima et al (1992)
により単離されたＰＥ選択性を有する１１０ｋDaカルシウム非依存性ＰＬＡ２；
ラット腎臓からHara al (1995)により精製されたアルカリ性の最適ｐＨおよびＰ
Ｅ選択性を有する６０ｋDaカルシウム依存性サイトゾルＰＬＡ２；およびラット
肥満細胞から精製された中性／酸性最適ｐＨを有するＰＳ加水分解カルシウム依
存性サイトゾルＰＬＡ２を、後者の２つのイソ型が脳中にも存在するという条件
で含まれる。
【００３０】 これらの参考文献の全て、かつそのうちで特にＰＬＡ２の同定および獲得に関
連する手法の教示は、本明細書中に引用されている。
連する手法の教示は、本明細書中に引用されている。
【００３１】 従って、現在までに選択的にＤＨＡを放出する好適な基質特性を有する５つの
ＰＬＡ２のサイトゾルイソ型が同定された。
ＰＬＡ２のサイトゾルイソ型が同定された。
【００３２】 配列決定されたＰＬＡ２の種々のクラス、イソ型、および本発明の実施に関し
て特に関心のある生化学的にキャラクタリゼーションされたイソ型は、表１に示
されている。
て特に関心のある生化学的にキャラクタリゼーションされたイソ型は、表１に示
されている。
【００３３】
【表１】
【００３４】 表の説明 Dennis 1997の後に、タンパク質およびＤＮＡ配列相同性に基づくホスホリパ
ーゼＡ２イソ型の分類。分子量、組織の位置、機能、選択性および活性のための
カルシウム要求数量を同定した。さらに生化学的特徴により同定されているがま
だ配列決定されていない部分的に精製されたイソ型もまた記載されている（タイ
プは表記されていない）。哺乳類ではないイソ型は省略してある。
ーゼＡ２イソ型の分類。分子量、組織の位置、機能、選択性および活性のための
カルシウム要求数量を同定した。さらに生化学的特徴により同定されているがま
だ配列決定されていない部分的に精製されたイソ型もまた記載されている（タイ
プは表記されていない）。哺乳類ではないイソ型は省略してある。
【００３５】 ＰＡＦ：血小板活性因子；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＰＥ：ホスファチジル
エタノールアミン；Ｐｌ：ホスファチジルイノシトール；ＰＳ：ホスファチジル
セリン；18:2 ω−６：リノレン酸；20:4 ω−６：アラキドン酸。
エタノールアミン；Ｐｌ：ホスファチジルイノシトール；ＰＳ：ホスファチジル
セリン；18:2 ω−６：リノレン酸；20:4 ω−６：アラキドン酸。
【００３６】 ＤＮＡおよび／またはタンパク質の配列が公知であるスクリーニングに有利な
イソ型は、PEのｓｎ−２位から脂肪酸を分解するその能力に基づきヒトｃｉｃＰ
ＬＡ２である（Larsson et al, 1998; Ma et al, 1999）。さらに、ＤＮＡ／タ
ンパク質配列がまだ公知ではない有利なイソ型は、有利な順序で、１４ｋＤラッ
ト肥満細胞イソ型（Murakami et al, 1992）、１１０ｋＤウシ脳型（Hirashima
et al, 1992）、１４ｋＤアレチネズミ型（Rordorf et al, 1991）および６０ｋ
Ｄラット腎臓型（Hara et al. 1995）である。
イソ型は、PEのｓｎ−２位から脂肪酸を分解するその能力に基づきヒトｃｉｃＰ
ＬＡ２である（Larsson et al, 1998; Ma et al, 1999）。さらに、ＤＮＡ／タ
ンパク質配列がまだ公知ではない有利なイソ型は、有利な順序で、１４ｋＤラッ
ト肥満細胞イソ型（Murakami et al, 1992）、１１０ｋＤウシ脳型（Hirashima
et al, 1992）、１４ｋＤアレチネズミ型（Rordorf et al, 1991）および６０ｋ
Ｄラット腎臓型（Hara et al. 1995）である。
【００３７】 さらに、Larsson et al, (1998)およびMa et al, (1999)により同定され、改
善された基質選択性（すなわち、ＰＥまたはＰＳのｓｎ−２位からＤＨＡを分解
する）を有するヒトｃｉｃＰＬＡ２のその他のスプライス変異体および同族体も
またスクリーニングに有利である。
善された基質選択性（すなわち、ＰＥまたはＰＳのｓｎ−２位からＤＨＡを分解
する）を有するヒトｃｉｃＰＬＡ２のその他のスプライス変異体および同族体も
またスクリーニングに有利である。
【００３８】 本発明の第１の態様に関して、“所定のホスホリピド基質の対してホスホリパ
ーゼＡ２の活性を増大させる”ことは、試験化合物が不在のとき（その他は同一
条件下で）と比較して試験化合物の存在で活性が少なくとも１．２倍、より有利
には少なくとも２倍、特に有利には少なくとも５倍、殊に有利には少なくとも１
０倍増大することを意味する。
ーゼＡ２の活性を増大させる”ことは、試験化合物が不在のとき（その他は同一
条件下で）と比較して試験化合物の存在で活性が少なくとも１．２倍、より有利
には少なくとも２倍、特に有利には少なくとも５倍、殊に有利には少なくとも１
０倍増大することを意味する。
【００３９】 ホスホリパーゼＡ２の活性を測定するために、好適なアッセイを使用すること
ができる。好適なアッセイは、例えば、WO 96/03512に記載されているように当
業者に公知である（このアッセイはホスホリパーゼ活性を阻害する化合物を同定
するために使用されていたにもかかわらず）。好適なホスホリパーゼＡ２の形を
用いてアッセイを行うことができる。例えば、ホスホリパーゼＡ２は脳組織から
精製するかまたは細胞培養から精製することができる（すなわち、ホスホリパー
ゼＡ２を天然に発現する培養中の細胞から）。また、有利には本発明中で使用さ
れるホスホリパーゼＡ２は、例えば該酵素をコードしているｃＤＮＡを好適な宿
主細胞系中で発現させることにより組換えＤＮＡ技術により製造してもよい。
ができる。好適なアッセイは、例えば、WO 96/03512に記載されているように当
業者に公知である（このアッセイはホスホリパーゼ活性を阻害する化合物を同定
するために使用されていたにもかかわらず）。好適なホスホリパーゼＡ２の形を
用いてアッセイを行うことができる。例えば、ホスホリパーゼＡ２は脳組織から
精製するかまたは細胞培養から精製することができる（すなわち、ホスホリパー
ゼＡ２を天然に発現する培養中の細胞から）。また、有利には本発明中で使用さ
れるホスホリパーゼＡ２は、例えば該酵素をコードしているｃＤＮＡを好適な宿
主細胞系中で発現させることにより組換えＤＮＡ技術により製造してもよい。
【００４０】 本発明のアッセイ中で使用するためのＰＬＡ２は、必ずしも天然に生じるＰＬ
Ａ２と同一でなくてもよいことが認識されるであろう（このようなＰＬＡ２ｓが
有利であろうにもかかわらず）。例えば、ＰＬＡ２はＰＬＡ２と他のポリペプチ
ドとの間の融合タンパク質であってもよい。特に、ＰＬＡ２はＰＬＡ２と融合タ
ンパク質をより容易に精製可能にするポリペプチドとの間で融合していてもよい
。一般的に、融合タンパク質はＰＬＡ２活性を有するタンパク質（かつこれは本
質的に天然のＰＬＡ２分子と同一である）および親和性リガンドに結合できる部
分を含有するであろう。例えば、ＰＬＡ２とオリゴヒスチジンペプチドとの間の
融合は、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することがで
き；ＰＬＡ２とＭｙｃエピトープとの間の融合はアンチ−Ｍｙｃ抗体を用いて精
製することができ；ＰＬＡ２とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの間の
融合はグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。融合は、Ｎ−もしくはＣ−末端または両方であってもよいと認識される
であろう。アッセイで有効なＰＬＡ２は、天然のＰＬＡ２の切断型であってもよ
くまたはＰＬＡ２の変異体型であってもよいことが認識されるであろう。“変異
体”には、次のような変化により本質的に酵素のＰＬＡ２活性を変えない欠失、
挿入および保存または非保存的な置換が含まれる。
Ａ２と同一でなくてもよいことが認識されるであろう（このようなＰＬＡ２ｓが
有利であろうにもかかわらず）。例えば、ＰＬＡ２はＰＬＡ２と他のポリペプチ
ドとの間の融合タンパク質であってもよい。特に、ＰＬＡ２はＰＬＡ２と融合タ
ンパク質をより容易に精製可能にするポリペプチドとの間で融合していてもよい
。一般的に、融合タンパク質はＰＬＡ２活性を有するタンパク質（かつこれは本
質的に天然のＰＬＡ２分子と同一である）および親和性リガンドに結合できる部
分を含有するであろう。例えば、ＰＬＡ２とオリゴヒスチジンペプチドとの間の
融合は、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することがで
き；ＰＬＡ２とＭｙｃエピトープとの間の融合はアンチ−Ｍｙｃ抗体を用いて精
製することができ；ＰＬＡ２とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの間の
融合はグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。融合は、Ｎ−もしくはＣ−末端または両方であってもよいと認識される
であろう。アッセイで有効なＰＬＡ２は、天然のＰＬＡ２の切断型であってもよ
くまたはＰＬＡ２の変異体型であってもよいことが認識されるであろう。“変異
体”には、次のような変化により本質的に酵素のＰＬＡ２活性を変えない欠失、
挿入および保存または非保存的な置換が含まれる。
【００４１】 “保存的置換”とは、Gly、Ala；Val、Ile、Leu; Lys、His、Arg；および Phe
、Tyrのような組合せを意味する。このような変異体は、公知のタンパク質工学
および部位特異的突然変異の方法を用いて作ることができる。
、Tyrのような組合せを意味する。このような変異体は、公知のタンパク質工学
および部位特異的突然変異の方法を用いて作ることができる。
【００４２】 スクリーニングアッセイにおいて使用するために好適なＰＬＡ２を製造するた
めに、ＰＬＡ２またはその好適な変異体（場合により）をコードするＤＮＡまた
はＲＮＡを好適な宿主中で発現させてポリペプチドを製造する。従って、ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを公知の技術に従って、この中に含まれる教示を考慮
して適切に変えて、発現ベクターを構築することができ、次にこれを本発明のポ
リペプチドを発現および生産するために好適な宿主細胞を形質転換するために使
用する。このような技術は、米国特許第 4,440,859号明細書1984年４月３日 Rut
ter et al発行、同第4,530,901号明細書1985年7月23日 Weissman発行、同第4,58
2,800号明細書1986年4月15日 Crowl発行、同第4,677,063号明細書1987年６月30
日 Mark et al発行、同第4,678,751号明細書1987年7月7日 Goeddel発行、同第4,
704,362号明細書1987年11月3日 Itakura et al発行、同第4,710,463号明細書198
7年12月1日 Murry発行、同第4,757,006号明細書1988年7月12日Toole, Jr. et al
発行、同第4,766,075号明細書1988年8月23日Goeddel et al発行および同第4,810
,648号明細書1989年3月7日Stalker発行に開示されているもの、およびこの中に
加入されている全てのものを含む。
めに、ＰＬＡ２またはその好適な変異体（場合により）をコードするＤＮＡまた
はＲＮＡを好適な宿主中で発現させてポリペプチドを製造する。従って、ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを公知の技術に従って、この中に含まれる教示を考慮
して適切に変えて、発現ベクターを構築することができ、次にこれを本発明のポ
リペプチドを発現および生産するために好適な宿主細胞を形質転換するために使
用する。このような技術は、米国特許第 4,440,859号明細書1984年４月３日 Rut
ter et al発行、同第4,530,901号明細書1985年7月23日 Weissman発行、同第4,58
2,800号明細書1986年4月15日 Crowl発行、同第4,677,063号明細書1987年６月30
日 Mark et al発行、同第4,678,751号明細書1987年7月7日 Goeddel発行、同第4,
704,362号明細書1987年11月3日 Itakura et al発行、同第4,710,463号明細書198
7年12月1日 Murry発行、同第4,757,006号明細書1988年7月12日Toole, Jr. et al
発行、同第4,766,075号明細書1988年8月23日Goeddel et al発行および同第4,810
,648号明細書1989年3月7日Stalker発行に開示されているもの、およびこの中に
加入されている全てのものを含む。
【００４３】 ポリペプチドをコードするＤＮＡに、好適な宿主中に挿入するための幅広い種
々の他のＤＮＡ配列を含めることができる。随伴ＤＮＡ（companion DNA）は、
宿主の性質、ＤＮＡの宿主への挿入方法、かつエピソーム維持または組込みが望
ましいかどうかに応じる。
々の他のＤＮＡ配列を含めることができる。随伴ＤＮＡ（companion DNA）は、
宿主の性質、ＤＮＡの宿主への挿入方法、かつエピソーム維持または組込みが望
ましいかどうかに応じる。
【００４４】 一般的に、ＤＮＡは発現ベクター中、例えばプラスミドに発現のための固有の
方向性でかつ正確なリーディングフレームで挿入される。必要であれば、ＤＮＡ
を所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列
に結合させることができるが、このような制御は一般的には発現ベクター中で利
用できる。従って、ベクターを標準的な手法により宿主中に挿入することができ
る。一般的には、宿主の全てがベクターにより形質転換されるわけではない。従
って、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。１つの選択手法では、形
質転換された細胞中で選択可能な形質をコードする必須の制御因子、例えば抗生
物質耐性を有するＤＮＡ配列を発現ベクター中に組込むことを含む。また、この
ような選択可能な形質のための遺伝子は別のベクター上にあってもよく、これを
所望の宿主細胞を同時形質転換するために使用する。
方向性でかつ正確なリーディングフレームで挿入される。必要であれば、ＤＮＡ
を所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列
に結合させることができるが、このような制御は一般的には発現ベクター中で利
用できる。従って、ベクターを標準的な手法により宿主中に挿入することができ
る。一般的には、宿主の全てがベクターにより形質転換されるわけではない。従
って、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。１つの選択手法では、形
質転換された細胞中で選択可能な形質をコードする必須の制御因子、例えば抗生
物質耐性を有するＤＮＡ配列を発現ベクター中に組込むことを含む。また、この
ような選択可能な形質のための遺伝子は別のベクター上にあってもよく、これを
所望の宿主細胞を同時形質転換するために使用する。
【００４５】 組換えＤＮＡにより形質転換された宿主細胞は、ここに開示されている教示を
考慮して当業者に公知の十分な時間および適切な条件下で培養し、ポリペプチド
の発現が可能になり、次にこれを回収することができる。
考慮して当業者に公知の十分な時間および適切な条件下で培養し、ポリペプチド
の発現が可能になり、次にこれを回収することができる。
【００４６】 細菌（例えば、E. ColiおよびBacillus subtillus）、酵母（例えばSaccharom
yces cerevisiae）、糸状菌（例えばAspergillus）、植物細胞、動物細胞および
昆虫細胞を含めて多くの発現系が公知である。
yces cerevisiae）、糸状菌（例えばAspergillus）、植物細胞、動物細胞および
昆虫細胞を含めて多くの発現系が公知である。
【００４７】 ベクターは、たとえこのベクターが他の非原核細胞タイプ中で発現させるため
に使用されるとしても、原核細胞レプリコン、例えば原核生物中で増殖させるた
めのＣｏｌＥ１ oriを含む。ベクターは、その方法で形質転換された細菌の宿主
細胞、例えば大腸菌中で遺伝子の発現（転写および翻訳）を指示できる適切なプ
ロモーター、例えば原核生物のプロモーターを含む。
に使用されるとしても、原核細胞レプリコン、例えば原核生物中で増殖させるた
めのＣｏｌＥ１ oriを含む。ベクターは、その方法で形質転換された細菌の宿主
細胞、例えば大腸菌中で遺伝子の発現（転写および翻訳）を指示できる適切なプ
ロモーター、例えば原核生物のプロモーターを含む。
【００４８】 プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を生じさせることがで
きるＤＮＡ配列により形成される発現制御因子である。典型的な細菌の宿主細胞
と相溶性のプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントを挿入するために都
合のよい制限部位を有するプラスミドベクター中で一般的に提供される。
きるＤＮＡ配列により形成される発現制御因子である。典型的な細菌の宿主細胞
と相溶性のプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントを挿入するために都
合のよい制限部位を有するプラスミドベクター中で一般的に提供される。
【００４９】 一般的な原核生物のベクタープラスミドは、Biorad 研究所（Richmond, CA, U
SA）から入手可能な pUC18、pUC10、pUR322 および pBR329 および Pharmacia,
Piscatway, NJ, USAから入手可能な pTrc99A および pKK223-3である。
SA）から入手可能な pUC18、pUC10、pUR322 および pBR329 および Pharmacia,
Piscatway, NJ, USAから入手可能な pTrc99A および pKK223-3である。
【００５０】 一般的な動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia, Piscataway, NJ, USAか
ら入手可能な pSVLである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を作動さ
せるために SV40 後期プロモーターを使用し、発現の最大のレベルはＴ抗原産生
細胞、例えばＣＯＳ-１細胞中で見出されている。
ら入手可能な pSVLである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を作動さ
せるために SV40 後期プロモーターを使用し、発現の最大のレベルはＴ抗原産生
細胞、例えばＣＯＳ-１細胞中で見出されている。
【００５１】 誘導性の動物発現ベクターの例は、Pharmaciaから入手可能なｐＭＳＧである
。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を作動させるためにマウス乳腺癌ウ
イルス末端反復配列を使用する。
。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を作動させるためにマウス乳腺癌ウ
イルス末端反復配列を使用する。
【００５２】 有効な酵母プラスミドベクターは、pRS403-406およびpRS413-416であり、かつ
一般的にStratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから入手可能
である。プラスミドである pRS403、pRS404、pRS405 および pRS406は、酵母挿
入プラスミド（Ylps）でありかつ酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2 および UR
A3を組込む。プラスミドであるpRS413〜416は酵母動原体プラスミド（YCps）で
ある。
一般的にStratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから入手可能
である。プラスミドである pRS403、pRS404、pRS405 および pRS406は、酵母挿
入プラスミド（Ylps）でありかつ酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2 および UR
A3を組込む。プラスミドであるpRS413〜416は酵母動原体プラスミド（YCps）で
ある。
【００５３】 ＤＮＡを相補的な付着末端によりベクターに操作的に結合する種々の方法が開
発されてきた。例えば、相補的なホモポリマー系をＤＮＡセグメント中に添加し
てベクターＤＮＡに挿入することができる。次に、ベクターとＤＮＡセグメント
は相補的なホモポリマー末端との間の水素結合により結合して組換えＤＮＡ分子
を形成する。
発されてきた。例えば、相補的なホモポリマー系をＤＮＡセグメント中に添加し
てベクターＤＮＡに挿入することができる。次に、ベクターとＤＮＡセグメント
は相補的なホモポリマー末端との間の水素結合により結合して組換えＤＮＡ分子
を形成する。
【００５４】 １種以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクター
に結合するもう１つの方法を提供する。前に記載したようなエンドヌクレアーゼ
制限消化により生じるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポ
リメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理するか、またはその３’−
5’−エキソヌクレアーゼ活性を有する突出した３’−１本鎖末端を除去し、か
つその重合活性を有する凹んだ３’−末端を埋める酵素で処理する。
に結合するもう１つの方法を提供する。前に記載したようなエンドヌクレアーゼ
制限消化により生じるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポ
リメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理するか、またはその３’−
5’−エキソヌクレアーゼ活性を有する突出した３’−１本鎖末端を除去し、か
つその重合活性を有する凹んだ３’−末端を埋める酵素で処理する。
【００５５】 従って、これらの作用を組み合わせることで平滑末端ＤＮＡセグメントを生じ
る。次に平滑末端化されたセグメントは、平滑末端化されたＤＮＡ分子のライゲ
ーションを触媒することができる酵素、例えば、バクテリオファージＴ４ＤＮＡ
リガーゼの存在で、大モル過剰のリンカー分子を用いてインキュベートする。こ
のように、反応生成物は、それらの末端でポリマーのリンカー配列を有するＤＮ
Ａセグメントである。次にこれらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素を用いて
切り取られ、かつ該ＤＮＡセグメントのそれと相補性の末端を生産する酵素を用
いて、切り取られた発現ベクターにライゲーションされる。
る。次に平滑末端化されたセグメントは、平滑末端化されたＤＮＡ分子のライゲ
ーションを触媒することができる酵素、例えば、バクテリオファージＴ４ＤＮＡ
リガーゼの存在で、大モル過剰のリンカー分子を用いてインキュベートする。こ
のように、反応生成物は、それらの末端でポリマーのリンカー配列を有するＤＮ
Ａセグメントである。次にこれらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素を用いて
切り取られ、かつ該ＤＮＡセグメントのそれと相補性の末端を生産する酵素を用
いて、切り取られた発現ベクターにライゲーションされる。
【００５６】 種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する合成リンカーは、International
Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USAを含めて多くの製造元から市販され
ている。
Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USAを含めて多くの製造元から市販され
ている。
【００５７】 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Saiki
et al (1988)によりScience 239, 487〜491ページに開示されているようなポリ
メラーゼ連鎖反応を使用することである。
et al (1988)によりScience 239, 487〜491ページに開示されているようなポリ
メラーゼ連鎖反応を使用することである。
【００５８】 この方法で、酵素的に増幅すべきＤＮＡは、自体が増幅されたＤＮＡに組み込
まれることになる２つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーによりフランキ
ングされる。この特異的なプライマーは、当業者の公知の方法を用いて発現ベク
ター中にクローニングするために使用できる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
含むことができる。
まれることになる２つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーによりフランキ
ングされる。この特異的なプライマーは、当業者の公知の方法を用いて発現ベク
ター中にクローニングするために使用できる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
含むことができる。
【００５９】 その他の好適なＤＮＡ操作および発現手法は、Sambrook et al (1989)“Molec
ular Cloning, a laboratory manual”, cold Spring Hargbor Press, Cold Spr
ing Harbor, New York, USAに記載されている。
ular Cloning, a laboratory manual”, cold Spring Hargbor Press, Cold Spr
ing Harbor, New York, USAに記載されている。
【００６０】 本発明のアッセイ法は、単離されたホスホリパーゼＡ２を用いて行うのが望ま
しいのではあるが、特定のホスホリパーゼＡ２を有力なホスホリパーゼ活性とし
て発現する細胞を用いてアッセイを行うことも適切である。このような細胞は、
ホスホリパーゼＡ２を過剰発現する天然に生じる細胞かまたは培養中にこのよう
になる細胞であるか、または関心のあるホスホリパーゼＡ２を過剰発現する遺伝
子工学的の操作した細胞であってもよい。
しいのではあるが、特定のホスホリパーゼＡ２を有力なホスホリパーゼ活性とし
て発現する細胞を用いてアッセイを行うことも適切である。このような細胞は、
ホスホリパーゼＡ２を過剰発現する天然に生じる細胞かまたは培養中にこのよう
になる細胞であるか、または関心のあるホスホリパーゼＡ２を過剰発現する遺伝
子工学的の操作した細胞であってもよい。
【００６１】 ＰＬＡ２の“過度活性化（super-activation)”をスクリーニングすることが
できる。ＰＬＡ２アッセイは、加水分解率を測定するために使用できるため、Ｐ
ＬＡ２による基質の加水分解率が活性体化合物の不在の場合よりも、これが存在
する場合に早くなるのであれば、過度活性化を観察することができる。現存の先
例：カルシウム非依存性ＰＬＡ２活性を高めるために必要な活性体物質／コファ
クターは、例えばアデノシン三リン酸（ATP）（Ackerman et al, 1994; Ma et a
l 1999）および洗浄剤 Triton X-100(Hirashima et al, 1992; Ackerman et al,
1994)を含む。
できる。ＰＬＡ２アッセイは、加水分解率を測定するために使用できるため、Ｐ
ＬＡ２による基質の加水分解率が活性体化合物の不在の場合よりも、これが存在
する場合に早くなるのであれば、過度活性化を観察することができる。現存の先
例：カルシウム非依存性ＰＬＡ２活性を高めるために必要な活性体物質／コファ
クターは、例えばアデノシン三リン酸（ATP）（Ackerman et al, 1994; Ma et a
l 1999）および洗浄剤 Triton X-100(Hirashima et al, 1992; Ackerman et al,
1994)を含む。
【００６２】 また、阻害を克服する能力に関する試験により、このアッセイをＰＬＡ２の活
性を調査するために使用できる。この場合に、コントロール試料およびテスト試
料はＰＬＡ２の阻害物質を含み、かつ阻害を克服できる化合物が選択される。一
連の阻害物質をこのアッセイの態様で使用できる。これらのいくつかは、サイト
ゾルイソ型に特異的であるが、しかしイソ型、例えば、臭化ブロモフェナシルま
たはメチル−アラキドニル−フルオロホスホネート（MAFP）の間では区別がない
。その他は、カルシウム非依存性イソ型、例えばパルミトイルトリフルオロメチ
ルケトン（PACOCF３）、アラキドニルトリフルオロメチルケトン（AACOCF３）（
および他のトリフルオロメチルケトン誘導体）またはブロモエノールラクトン（
BEL）（Ackermann et al, 1994; Ma et al 1999）に特異的である。しかし、多
少ＰＬＡ２活性を減少するために阻害剤を使用する場合には、２つのアッセイ条
件がある：第１に、酵素の活性部位でインヒビター結合の効果を克服する化合物
は超活性効果を有する見込みがなく、第２に、不可逆的な‘自殺基質’タイプの
インヒビター、例えばＢＥＬを使用しないことが重要である。
性を調査するために使用できる。この場合に、コントロール試料およびテスト試
料はＰＬＡ２の阻害物質を含み、かつ阻害を克服できる化合物が選択される。一
連の阻害物質をこのアッセイの態様で使用できる。これらのいくつかは、サイト
ゾルイソ型に特異的であるが、しかしイソ型、例えば、臭化ブロモフェナシルま
たはメチル−アラキドニル−フルオロホスホネート（MAFP）の間では区別がない
。その他は、カルシウム非依存性イソ型、例えばパルミトイルトリフルオロメチ
ルケトン（PACOCF３）、アラキドニルトリフルオロメチルケトン（AACOCF３）（
および他のトリフルオロメチルケトン誘導体）またはブロモエノールラクトン（
BEL）（Ackermann et al, 1994; Ma et al 1999）に特異的である。しかし、多
少ＰＬＡ２活性を減少するために阻害剤を使用する場合には、２つのアッセイ条
件がある：第１に、酵素の活性部位でインヒビター結合の効果を克服する化合物
は超活性効果を有する見込みがなく、第２に、不可逆的な‘自殺基質’タイプの
インヒビター、例えばＢＥＬを使用しないことが重要である。
【００６３】 このアッセイの態様では、アロステリック部位で触媒活性を強化するように作
用する化合物を同定することにより、ＰＬＡ２を活性化する化合物が探求されて
いる。この研究により探求される化合物タイプは、触媒部位には結合しないよう
である。それというのも、これらは触媒活性を折衷する傾向があるようだからで
ある。それにもかかわらず、どのような機構によってでもＰＬＡ２活性を増大す
ることができる化合物がこの研究では有効である。
用する化合物を同定することにより、ＰＬＡ２を活性化する化合物が探求されて
いる。この研究により探求される化合物タイプは、触媒部位には結合しないよう
である。それというのも、これらは触媒活性を折衷する傾向があるようだからで
ある。それにもかかわらず、どのような機構によってでもＰＬＡ２活性を増大す
ることができる化合物がこの研究では有効である。
【００６４】 アッセイの様式、例えば高処理量スクリーニングアッセイは、ここで開示され
ている本発明の酵素および基質を用いずに当業者により行うこともできる。ホス
ホリパーゼＡ２に特に有利なホスホリピド基質は、ｓｎ−２位でＤＨＡを有する
ものであり、かつ有利には、該ホスホリピド基質のｓｎ−３位でホスホセリンま
たはホスホエタノールアミンを有するものである。
ている本発明の酵素および基質を用いずに当業者により行うこともできる。ホス
ホリパーゼＡ２に特に有利なホスホリピド基質は、ｓｎ−２位でＤＨＡを有する
ものであり、かつ有利には、該ホスホリピド基質のｓｎ−３位でホスホセリンま
たはホスホエタノールアミンを有するものである。
【００６５】 本発明の２番目の態様に関しては、ホスホリパーゼＡ２の生産または発現を好
適な方法を用いて細胞中で測定することができる。例えば、細胞中のタンパク質
またはｍＲＮＡの量を測定することにより測定できる（例えば、周知の免疫アッ
セイの方法、例えばタンパク質の量を検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELIS
A）を用いて、および例えば、ｍＲＮＡの量を測定する定量逆転写ポリメラーゼ
連鎖反応（RT-PCR）を用いて）。また、ここに開示されているホスホリパーゼＡ ２ 活性を検定することにより測定することもできる。
適な方法を用いて細胞中で測定することができる。例えば、細胞中のタンパク質
またはｍＲＮＡの量を測定することにより測定できる（例えば、周知の免疫アッ
セイの方法、例えばタンパク質の量を検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELIS
A）を用いて、および例えば、ｍＲＮＡの量を測定する定量逆転写ポリメラーゼ
連鎖反応（RT-PCR）を用いて）。また、ここに開示されているホスホリパーゼＡ ２ 活性を検定することにより測定することもできる。
【００６６】 ウェスタンブロット法（タンパク質転写の前にポリアクリルアミドゲルを分離
し、引き続きブロッティング、または直接にドット−ブロッティングする）をタ
ンパク質発現のレベルを測定するために使用することもできる。ノーザンブロッ
ト法（アガロースゲル分離の後に、または粗ｍＲＮＡ抽出物をノーザンスロット
／ドットブロッティングすることにより）をｍＲＮＡ発現を測定するために使用
することもできる。
し、引き続きブロッティング、または直接にドット−ブロッティングする）をタ
ンパク質発現のレベルを測定するために使用することもできる。ノーザンブロッ
ト法（アガロースゲル分離の後に、または粗ｍＲＮＡ抽出物をノーザンスロット
／ドットブロッティングすることにより）をｍＲＮＡ発現を測定するために使用
することもできる。
【００６７】 一般的には、本発明の第２の態様のアッセイ法で使用される細胞は、自然にホ
スホリパーゼＡを発現する細胞である。
スホリパーゼＡを発現する細胞である。
【００６８】 例としては、ラットまたはヒトの肥満細胞、ＣＨＯ細胞、グリア芽腫細胞、神
経芽腫細胞、ＨＥＫ２９３（腎臓）細胞、または適切なイソ型を発現し、かつ初
代培養において成長できる組織から得られるいずれかの細胞を含む。供給源は、
使用すべきイソ型に明らかに依存する。しかし、ホスホリパーゼＡ２を発現する
好適な遺伝子工学的に操作した細胞を使用してもよい（かつここで開示されてい
るような好適な方法を用いて製造してもよい）。さらに、記載された方法を用い
て、タンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルを実験動物から除去した後に適切な期
間 in vivoで試験化合物で処理した脳または他の組織中で試験することができる
。
経芽腫細胞、ＨＥＫ２９３（腎臓）細胞、または適切なイソ型を発現し、かつ初
代培養において成長できる組織から得られるいずれかの細胞を含む。供給源は、
使用すべきイソ型に明らかに依存する。しかし、ホスホリパーゼＡ２を発現する
好適な遺伝子工学的に操作した細胞を使用してもよい（かつここで開示されてい
るような好適な方法を用いて製造してもよい）。さらに、記載された方法を用い
て、タンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルを実験動物から除去した後に適切な期
間 in vivoで試験化合物で処理した脳または他の組織中で試験することができる
。
【００６９】 ホスホリパーゼＡ２の発現および生産の変化を直接に測定するもう１つの方法
として、間接的な方法を使用することができる。特別な態様において、ホスホリ
パーゼＡ２をコードする遺伝子のプロモーターは、レポーター遺伝子に操作的に
結合している。この場合には、レポーター遺伝子産物の発現または生産のレベル
の変化をホスホリパーゼＡ２の発現または生産のレベルの変化の代わりに調べる
。好適なレポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ（酵素の作用により有色生
成物に変換される無色の基質を使用して検出できる）、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（好適な放射性の基質を使用して検出できる）および
ルシフェラーゼ（これが適切な条件下で光を放射できることにより検出できる）
を含む。その他の好適なレポーター遺伝子は、当業者に周知の緑色蛍光タンパク
質、または組換え融合生成物（好適に光りの波長を励起された場合に固有の蛍光
である）；エクオリン（触媒的に蛍光生成物を生じる）；またはＧａｌ４転写因
子（他のレポーター遺伝子の発現を高めるために２段階法で使用できる）である
。プロモーター／レポーター遺伝子を構築するための宿主細胞は、プロモーター
が機能的である好適な宿主細胞であるが、しかし宿主細胞がホスホリパーゼＡ２ 酵素を自然に発現する細胞であるのが有利である。好適な細胞は、ラットまたは
ヒトの肥満細胞、ＣＨＯ細胞、グリア芽腫細胞、神経芽腫細胞およびＨＥＫ２９
３（腎臓）細胞を含む。
として、間接的な方法を使用することができる。特別な態様において、ホスホリ
パーゼＡ２をコードする遺伝子のプロモーターは、レポーター遺伝子に操作的に
結合している。この場合には、レポーター遺伝子産物の発現または生産のレベル
の変化をホスホリパーゼＡ２の発現または生産のレベルの変化の代わりに調べる
。好適なレポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ（酵素の作用により有色生
成物に変換される無色の基質を使用して検出できる）、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（好適な放射性の基質を使用して検出できる）および
ルシフェラーゼ（これが適切な条件下で光を放射できることにより検出できる）
を含む。その他の好適なレポーター遺伝子は、当業者に周知の緑色蛍光タンパク
質、または組換え融合生成物（好適に光りの波長を励起された場合に固有の蛍光
である）；エクオリン（触媒的に蛍光生成物を生じる）；またはＧａｌ４転写因
子（他のレポーター遺伝子の発現を高めるために２段階法で使用できる）である
。プロモーター／レポーター遺伝子を構築するための宿主細胞は、プロモーター
が機能的である好適な宿主細胞であるが、しかし宿主細胞がホスホリパーゼＡ２ 酵素を自然に発現する細胞であるのが有利である。好適な細胞は、ラットまたは
ヒトの肥満細胞、ＣＨＯ細胞、グリア芽腫細胞、神経芽腫細胞およびＨＥＫ２９
３（腎臓）細胞を含む。
【００７０】 “ホスホリパーゼＡ２の生産または発現の増大させる”とは、ホスホリパーゼ
Ａ２のレベルが少なくとも１．２倍、有利には少なくとも２倍、特に有利には少
なくとも５倍かつ殊に有利には１０倍増大することを意味する。
Ａ２のレベルが少なくとも１．２倍、有利には少なくとも２倍、特に有利には少
なくとも５倍かつ殊に有利には１０倍増大することを意味する。
【００７１】 本発明の方法が、望ましい特性を有する化合物をスクリーニングアッセイとし
て使用されることが認識されるであろう。試験すべき化合物は、いずれかの好適
な化合物である。特に、該化合物は５０００未満の分子量を有する有機分子であ
ってもよい。化合物は、有利には水または水性媒体中に可溶であり、それほど有
利ではないのは、生物学的に相溶性である有機溶剤、例えばエタノール、ジメチ
ルスルホキシドまたはジゴール（digol）に可溶であり、かつ少なくとも有利に
は生物学的に非相溶性であるが、やはりアッセイ法と相溶性である溶剤に可溶で
ある。
て使用されることが認識されるであろう。試験すべき化合物は、いずれかの好適
な化合物である。特に、該化合物は５０００未満の分子量を有する有機分子であ
ってもよい。化合物は、有利には水または水性媒体中に可溶であり、それほど有
利ではないのは、生物学的に相溶性である有機溶剤、例えばエタノール、ジメチ
ルスルホキシドまたはジゴール（digol）に可溶であり、かつ少なくとも有利に
は生物学的に非相溶性であるが、やはりアッセイ法と相溶性である溶剤に可溶で
ある。
【００７２】 アッセイ中に選択される化合物は、ホスホリパーゼＡ２の特定のイソ型に完全
に選択的である必要はないが、しかしこれらはＤＨＡを含有するホスホリピドに
作用するＰＬＡ２ｓに関して選択的であるのが望ましい。
に選択的である必要はないが、しかしこれらはＤＨＡを含有するホスホリピドに
作用するＰＬＡ２ｓに関して選択的であるのが望ましい。
【００７３】 本発明の方法中で使用されるホスホリパーゼＡ２は、ホスホリピド基質のｓｎ
−２位に選択性を有するのが有利であることが認識されるであろう。ホスホリパ
ーゼＡ２がホスホリピド基質のｓｎ−３位でホスホセリンまたはホスホエタノー
ルアミンに関して選択性を有する場合に特に有利である。有利には、本発明の方
法中で使用されるホスホリパーゼＡ２は、表１に記載されているようなホスホリ
パーゼであり、特にMurakami et al, 1992; Hara et al, 1995; Rordorf et al,
1991; Jones and Tang 1995; Ma et al, 1997, Tang et al; 1997; Balboa et
al, 1997; Larsson et al, 1998; Ma et al, 1999に記載されているものである
。一方で、好適な動物種から由来する好適なホスホリパーゼＡ２を使用すること
ができ、同定された化合物がヒトのホスホリパーゼＡ２を活性化できることが望
ましい。
−２位に選択性を有するのが有利であることが認識されるであろう。ホスホリパ
ーゼＡ２がホスホリピド基質のｓｎ−３位でホスホセリンまたはホスホエタノー
ルアミンに関して選択性を有する場合に特に有利である。有利には、本発明の方
法中で使用されるホスホリパーゼＡ２は、表１に記載されているようなホスホリ
パーゼであり、特にMurakami et al, 1992; Hara et al, 1995; Rordorf et al,
1991; Jones and Tang 1995; Ma et al, 1997, Tang et al; 1997; Balboa et
al, 1997; Larsson et al, 1998; Ma et al, 1999に記載されているものである
。一方で、好適な動物種から由来する好適なホスホリパーゼＡ２を使用すること
ができ、同定された化合物がヒトのホスホリパーゼＡ２を活性化できることが望
ましい。
【００７４】 本発明のさらなる態様は、精神病または神経障害、例えばうつ病に有効な薬剤
、または薬剤を製造するための先導化合物の選択方法の提供であり、この方法は
、本発明の第１の態様で記載したようにホスホリパーゼＡ２の活性を増大させる
かまたは本発明の第２の態様で記載したようにホスホリパーゼＡ２の生産または
発現を増大させる化合物を選択することを含む。本発明のスクリーニング法を使
用する薬剤は、うつ病、不安症および精神分裂病を含む精神病疾患の範囲内で、
または脳卒中、てんかんおよび他の神経変性疾患を含む神経性疾患の範囲内で有
効であると考えられている。このアッセイ法は、上記のように通常の抗うつ剤に
抵抗性である約３０％の患者を治療するために有効である薬剤または薬剤を製造
するための先導化合物を同定するために特に適することが認識されるであろう。
、または薬剤を製造するための先導化合物の選択方法の提供であり、この方法は
、本発明の第１の態様で記載したようにホスホリパーゼＡ２の活性を増大させる
かまたは本発明の第２の態様で記載したようにホスホリパーゼＡ２の生産または
発現を増大させる化合物を選択することを含む。本発明のスクリーニング法を使
用する薬剤は、うつ病、不安症および精神分裂病を含む精神病疾患の範囲内で、
または脳卒中、てんかんおよび他の神経変性疾患を含む神経性疾患の範囲内で有
効であると考えられている。このアッセイ法は、上記のように通常の抗うつ剤に
抵抗性である約３０％の患者を治療するために有効である薬剤または薬剤を製造
するための先導化合物を同定するために特に適することが認識されるであろう。
【００７５】 一方で、本発明の第１および第２の態様を用いて同定された化合物は、ホスホ
リパーゼＡ２を活性化するか、またはその生産または発現を細胞中で増大させる
点において有効であり、さらに、その他の望ましい特性をベースとした薬剤のよ
うな化合物（drug-like comound)または薬剤を製造するための先導化合物を選択
するのが望ましい。
リパーゼＡ２を活性化するか、またはその生産または発現を細胞中で増大させる
点において有効であり、さらに、その他の望ましい特性をベースとした薬剤のよ
うな化合物（drug-like comound)または薬剤を製造するための先導化合物を選択
するのが望ましい。
【００７６】 “薬剤”または“薬剤のような化合物”という用語は、当業者に周知であり、
かつ、例えば薬剤中の活性成分として医薬中で使用することに適するという特徴
を有する化合物の意味を含む。従って、例えば薬のような化合物は、有機化学の
手法により、またはそれほど有利でないが、分子生物学または化学の手法により
合成できる分子であってもよく、かつ５０００ダルトン未満の分子量であっても
よい低分子が有利である。これは水溶性であってもよい。薬のような化合物は、
さらに特定のタンパク質またはタンパク質と選択的な相互作用し、かつ生物学的
に利用可能であり、および／または脳、浸透する標的細胞膜に再び接近できると
いう特徴を有していてもよいが、しかしこれらの特徴は重要ではないことが認識
されるであろう。好適には、選択される化合物は、ほ乳類への投与において作用
部位である脳に到達できる化合物である。
かつ、例えば薬剤中の活性成分として医薬中で使用することに適するという特徴
を有する化合物の意味を含む。従って、例えば薬のような化合物は、有機化学の
手法により、またはそれほど有利でないが、分子生物学または化学の手法により
合成できる分子であってもよく、かつ５０００ダルトン未満の分子量であっても
よい低分子が有利である。これは水溶性であってもよい。薬のような化合物は、
さらに特定のタンパク質またはタンパク質と選択的な相互作用し、かつ生物学的
に利用可能であり、および／または脳、浸透する標的細胞膜に再び接近できると
いう特徴を有していてもよいが、しかしこれらの特徴は重要ではないことが認識
されるであろう。好適には、選択される化合物は、ほ乳類への投与において作用
部位である脳に到達できる化合物である。
【００７７】 このように、薬のような化合物または先導化合物は血脳関門を通過する必要が
ある場合に特に有利である。
ある場合に特に有利である。
【００７８】 “先導化合物”という用語は、同様に当業者に周知であり、かつ一方でより望
ましい特徴を有していてもよい他の化合物を設計するための出発点を提供する薬
剤として使用するためにそれ自体が好適ではない化合物（例えば、その意図する
標的に対して弱い能力しかなく、その作用において非選択的であり、不安定で、
溶解性に乏しく、合成し難いかまたは乏しい生物学的利用能しか有さないため）
という意味を含んでいてもよい。
ましい特徴を有していてもよい他の化合物を設計するための出発点を提供する薬
剤として使用するためにそれ自体が好適ではない化合物（例えば、その意図する
標的に対して弱い能力しかなく、その作用において非選択的であり、不安定で、
溶解性に乏しく、合成し難いかまたは乏しい生物学的利用能しか有さないため）
という意味を含んでいてもよい。
【００７９】 好適には、該薬剤または先導化合物は、さらなる望ましい特性に基づいて選択
される。
される。
【００８０】 該化合物は、ホスホリパーゼＡ２酵素および脳膜ホスホリピドを含有する脳ホ
モジェネート中でＤＨＡ放出を活性化することに基づいて選択される場合には特
に有利である。
モジェネート中でＤＨＡ放出を活性化することに基づいて選択される場合には特
に有利である。
【００８１】 該薬剤または先導化合物が、ホモジェネートがホスホリパーゼＡ２酵素および
脳膜ホスホリピドを含有するヒトの脳ホモジェネート中でＡＡ放出を活性化しな
いことに基づいてさらに選択される場合には特に有利である。ＡＡ放出は望まし
くない、それというのもこれは患者に望ましくない炎症および／または神経毒性
をもたらし得るからである。ＤＨＡ放出およびＡＡ放出は、同じアッセイにおい
て、例えばアイソトープ標識されたホスホリピドを使用することにより、かつＡ
ＡからＤＨＡを分離することにより測定できることが認識されるであろう。
脳膜ホスホリピドを含有するヒトの脳ホモジェネート中でＡＡ放出を活性化しな
いことに基づいてさらに選択される場合には特に有利である。ＡＡ放出は望まし
くない、それというのもこれは患者に望ましくない炎症および／または神経毒性
をもたらし得るからである。ＤＨＡ放出およびＡＡ放出は、同じアッセイにおい
て、例えばアイソトープ標識されたホスホリピドを使用することにより、かつＡ
ＡからＤＨＡを分離することにより測定できることが認識されるであろう。
【００８２】 該化合物が動物中でＥＣＳの作用を模倣することに基づいて化合物を選択する
場合には特に有利である。例えば、化合物が動物中で本質的にＥＣＳの時間経過
と類似している反応の時間過程を導き出すことに基づいて化合物を選択するのが
有利である。このような効果およびこの効果の時間過程は、頭部痙攣を誘導する
５−メトキシ−N,N−ジメチルトリプタミンの強化、またはポアソルト強制水泳
試験（Porsolt et al, 1977）、有利にはＣ５７ＢＬ／６マウスにおける水泳時
間の延長の強化により、続いて薬剤投与を１０日にわたり５回行うことにより認
知してもよい。しかし、うつ病または他の精神または神経疾患が認知された他の
動物モデルの効能、かつその他の治療様式を使用することもできる。有利には、
効能が７日以内に明確になるべきである。
場合には特に有利である。例えば、化合物が動物中で本質的にＥＣＳの時間経過
と類似している反応の時間過程を導き出すことに基づいて化合物を選択するのが
有利である。このような効果およびこの効果の時間過程は、頭部痙攣を誘導する
５−メトキシ−N,N−ジメチルトリプタミンの強化、またはポアソルト強制水泳
試験（Porsolt et al, 1977）、有利にはＣ５７ＢＬ／６マウスにおける水泳時
間の延長の強化により、続いて薬剤投与を１０日にわたり５回行うことにより認
知してもよい。しかし、うつ病または他の精神または神経疾患が認知された他の
動物モデルの効能、かつその他の治療様式を使用することもできる。有利には、
効能が７日以内に明確になるべきである。
【００８３】 該化合物が、動物への投与において痙攣性ではなくかつ短期間の記憶喪失を生
じないことに基づいて選択される場合にもまた特に有利である。発作／痙攣を構
成するものは、実験動物挙動に馴染みのある当業者に公知である。短期間の記憶
喪失は、有利には当業者に公知のMorris water maze(Morris, 1984)または受動
的回避試験を用いて評価される。
じないことに基づいて選択される場合にもまた特に有利である。発作／痙攣を構
成するものは、実験動物挙動に馴染みのある当業者に公知である。短期間の記憶
喪失は、有利には当業者に公知のMorris water maze(Morris, 1984)または受動
的回避試験を用いて評価される。
【００８４】 本発明のさらなる態様は、患者の精神病または神経疾患を治療する方法を提供
することであり、該方法は、脳膜ホスホリピドからのドコサヘキサエン酸の放出
を増大させる化合物の有効量を投与することを含む。
することであり、該方法は、脳膜ホスホリピドからのドコサヘキサエン酸の放出
を増大させる化合物の有効量を投与することを含む。
【００８５】 精神病または神経疾患には、うつ病、不安症、精神分裂症、脳卒中、てんかん
およびその他の神経変性疾患が含まれる。該方法がうつ病および／または不安症
に使用される場合には特に有利である。
およびその他の神経変性疾患が含まれる。該方法がうつ病および／または不安症
に使用される場合には特に有利である。
【００８６】 有利には、該化合物はホスホリパーゼＡ２を活性化するものである。
【００８７】 より有利には、該化合物は脳膜ホスホリピドからアラキドン酸の放出を本質的
に増大しないものである。適当には、該化合物は本発明のアッセイ法を用いて得
られるものである。
に増大しないものである。適当には、該化合物は本発明のアッセイ法を用いて得
られるものである。
【００８８】 一般的には、該化合物は薬剤配合物にする。
【００８９】 製剤は、単位服用量の形で好適に存在していてもよく、かつ薬剤学の当業者に
周知の方法により製造されてもよい。このような方法は、活性材料（本発明の方
法中で使用するための化合物）と１種以上の補助成分を構成する担体とを結合さ
せる工程を含む。一般的には、製剤は活性成分と液体担体または微粉砕した固体
担体もしくは両方と均一にかつ密接に結合させ、次に必要があればこの生成物を
成形することにより製造される。
周知の方法により製造されてもよい。このような方法は、活性材料（本発明の方
法中で使用するための化合物）と１種以上の補助成分を構成する担体とを結合さ
せる工程を含む。一般的には、製剤は活性成分と液体担体または微粉砕した固体
担体もしくは両方と均一にかつ密接に結合させ、次に必要があればこの生成物を
成形することにより製造される。
【００９０】 経口投与のために好適な本発明による製剤は、別個の単位、例えばカプセル剤
、カシェ剤または錠剤として存在していてもよく、それぞれ予め決められた量の
活性成分を；散剤または顆粒剤として；水溶液または非水性液体中の溶液または
エマルションとして；または水中油形液体液体エマルションまたは油中水形液体
エマルションとしてを含有している。活性成分は、巨丸剤、舐剤または糊剤とし
て存在していてもよい。
、カシェ剤または錠剤として存在していてもよく、それぞれ予め決められた量の
活性成分を；散剤または顆粒剤として；水溶液または非水性液体中の溶液または
エマルションとして；または水中油形液体液体エマルションまたは油中水形液体
エマルションとしてを含有している。活性成分は、巨丸剤、舐剤または糊剤とし
て存在していてもよい。
【００９１】 錠剤は、圧縮または成形によって、場合により１種以上の補助成分と一緒に製
造してもよい。圧縮錠剤は、好適な機械中で、活性成分を自由流れ型（free-flo
w form）で、例えば散剤または顆粒剤、場合により結合剤（例えば、ポビドン、
ゼラチン、ヒドロキシポリメチルセルロース）、滑剤、不活性な希釈剤、保存薬
、錠剤分解物質（例えば、でんぷんグリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架
橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、表面活性または分散剤と混合し
て圧縮により製造することができる。成形錠剤は、好適な機械中で、不活性な液
体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより製造することがで
きる。錠剤は、場合によりコーティングまたは切込み線を入れてもよく、かつ例
えば、種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、その中の活
性成分をゆっくりとまたは制御して放出するように配合し、所望の放出プロフィ
ールを提供してもよい。
造してもよい。圧縮錠剤は、好適な機械中で、活性成分を自由流れ型（free-flo
w form）で、例えば散剤または顆粒剤、場合により結合剤（例えば、ポビドン、
ゼラチン、ヒドロキシポリメチルセルロース）、滑剤、不活性な希釈剤、保存薬
、錠剤分解物質（例えば、でんぷんグリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架
橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、表面活性または分散剤と混合し
て圧縮により製造することができる。成形錠剤は、好適な機械中で、不活性な液
体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより製造することがで
きる。錠剤は、場合によりコーティングまたは切込み線を入れてもよく、かつ例
えば、種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、その中の活
性成分をゆっくりとまたは制御して放出するように配合し、所望の放出プロフィ
ールを提供してもよい。
【００９２】 口内での局所的な投与に好適な製剤は、活性成分を香味ベースの形、一般的に
はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントの形で含有しているロゼン
ジ；活性成分を不活性なベース、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスク
ロースおよびアラビアゴムの形で含有している香剤；および活性成分を好適な液
体キャリアーの形で含有している口内洗浄剤を含む。
はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントの形で含有しているロゼン
ジ；活性成分を不活性なベース、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスク
ロースおよびアラビアゴムの形で含有している香剤；および活性成分を好適な液
体キャリアーの形で含有している口内洗浄剤を含む。
【００９３】 非経口投与に好適な薬剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および製剤を意図する
受容者の血液と等張にする溶質を含有していてもよい無菌注射液；沈殿防止剤お
よび増粘剤を含有していてもよい水性および非水性無菌懸濁剤を含んでいてもよ
い。製剤は、単位服用量または複数回服用量コンテナ（multi-dose containers
）中、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に存在していてもよく、かつ
使用する直前に単に無菌の液体担体、例えば水または注射剤の添加を必要とする
だけの凍結乾燥（親液化）された状態で貯蔵されていてもよい。即座の注射溶液
および懸濁液は、上記の種類の無菌散剤、顆粒剤および錠剤から製造してもよい
。
受容者の血液と等張にする溶質を含有していてもよい無菌注射液；沈殿防止剤お
よび増粘剤を含有していてもよい水性および非水性無菌懸濁剤を含んでいてもよ
い。製剤は、単位服用量または複数回服用量コンテナ（multi-dose containers
）中、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に存在していてもよく、かつ
使用する直前に単に無菌の液体担体、例えば水または注射剤の添加を必要とする
だけの凍結乾燥（親液化）された状態で貯蔵されていてもよい。即座の注射溶液
および懸濁液は、上記の種類の無菌散剤、顆粒剤および錠剤から製造してもよい
。
【００９４】 有利な単位服用量製剤は、活性成分の日用量または単位服量量、日用亜服用量
またはその適切なフラクションを含有しているものである。
またはその適切なフラクションを含有しているものである。
【００９５】 特に上記した成分の他に、本発明の製剤は、本件の製剤のタイプにを有する当
業者に慣用の他の薬剤を含有していてもよく、例えば経口投与に好適なものは香
味剤を含有していてもよいことを理解すべきである。
業者に慣用の他の薬剤を含有していてもよく、例えば経口投与に好適なものは香
味剤を含有していてもよいことを理解すべきである。
【００９６】 経口、直腸、筋肉内、静脈内、腹腔内、局所的などを含めて、投与に好適な経
路を使用することができる。化合物が経口的に投与される場合が有利である。
路を使用することができる。化合物が経口的に投与される場合が有利である。
【００９７】 前記の化合物またはその製剤は、経口および非経口的（例えば、皮下または筋
肉）注射を含めて慣用の方法で投与することができる。治療は、一定期間にわた
る単一投与または複数投与から成っていてもよい。
肉）注射を含めて慣用の方法で投与することができる。治療は、一定期間にわた
る単一投与または複数投与から成っていてもよい。
【００９８】 一方で、本発明の治療法中で使用するための化合物は、単独で投与されてもよ
いが、これは製薬学的薬剤として、１種以上の認容性の担体と一緒に存在するの
が有利である。該担体は、本発明の化合物と矛盾せずに、かつその受容者によっ
て有害性であってならない意味で“認容性”であるべきである。一般的には、担
体は無菌でありかつ発熱性物質不含の水または食塩水である。
いが、これは製薬学的薬剤として、１種以上の認容性の担体と一緒に存在するの
が有利である。該担体は、本発明の化合物と矛盾せずに、かつその受容者によっ
て有害性であってならない意味で“認容性”であるべきである。一般的には、担
体は無菌でありかつ発熱性物質不含の水または食塩水である。
【００９９】 本発明のさらなる態様は、脳膜ホスホリピドからのドコサヘキサエン酸の放出
を増大させる化合物の、精神病または神経障害を治療するための医薬品の製造に
おける使用を提供する。有利には、該障害はうつ病および／または不安症である
。
を増大させる化合物の、精神病または神経障害を治療するための医薬品の製造に
おける使用を提供する。有利には、該障害はうつ病および／または不安症である
。
【０１００】 本発明のもう１つの態様は、患者の精神病または神経障害を治療する方法の提
供であり、該方法は、ドコサヘキサエン酸の有効量またはドコサヘキサエン酸の
抗うつ剤作用を模倣する化合物を投与することを含むが、但し、精神分裂病を治
療するための該方法をドコサヘキサエン酸をアラキドン酸との組合せで使用しな
いことを条件とする。有利には、該障害はうつ病および／または不安症である。
ＤＨＡの抗うつ剤作用を模倣する化合物が特に有効である。
供であり、該方法は、ドコサヘキサエン酸の有効量またはドコサヘキサエン酸の
抗うつ剤作用を模倣する化合物を投与することを含むが、但し、精神分裂病を治
療するための該方法をドコサヘキサエン酸をアラキドン酸との組合せで使用しな
いことを条件とする。有利には、該障害はうつ病および／または不安症である。
ＤＨＡの抗うつ剤作用を模倣する化合物が特に有効である。
【０１０１】 本発明のさらなる態様は、ドコサヘキサエン酸またはドコサヘキサエン酸の抗
精神病または神経障害作用を模倣した化合物の、精神病または神経障害を治療す
るための医薬品の製造における使用の提供であるが、但し、精神分裂病を治療す
るための該医薬をドコサヘキサエン酸をアラキドン酸との組合せで使用しないこ
とを条件とする。
精神病または神経障害作用を模倣した化合物の、精神病または神経障害を治療す
るための医薬品の製造における使用の提供であるが、但し、精神分裂病を治療す
るための該医薬をドコサヘキサエン酸をアラキドン酸との組合せで使用しないこ
とを条件とする。
【０１０２】 有利には該障害はうつ病である。ＤＨＡの抗うつ剤作用を模倣する化合物が特
に有効である。
に有効である。
【０１０３】 一方で、特定のＰＬＡ２イソ型を活性化してＤＨＡを放出するか、またはいく
つかのＥＣＴの有効な作用（例えば５−ＨＴ２結合および機能のアップレジュレ
ーション(up-regulations)）をもたらすことが有益であると予期されている。Ｄ
ＨＡ放出が遺伝子発現の変化を生じると予期されている。ＤＨＡが遺伝子発現の
変化を媒介し、特に、ＤＨＡにより媒介される遺伝子発現中のその変化は、グル
ココルチコイド受容体の活性化により媒介されると考えられている。
つかのＥＣＴの有効な作用（例えば５−ＨＴ２結合および機能のアップレジュレ
ーション(up-regulations)）をもたらすことが有益であると予期されている。Ｄ
ＨＡ放出が遺伝子発現の変化を生じると予期されている。ＤＨＡが遺伝子発現の
変化を媒介し、特に、ＤＨＡにより媒介される遺伝子発現中のその変化は、グル
ココルチコイド受容体の活性化により媒介されると考えられている。
【０１０４】 ＤＨＡの受容体が転写因子のステロイドホルモン核受容体ファミリーの仲間で
あるという見方を支持する多くの証拠がある。このように、ＤＨＡがアロステリ
ック的にデキサメタゾンがラット肝臓のサイトゾル抽出物中のグルココルチコイ
ド受容体に結合するのを抑制し（Sumida et al, 1993b）かつデキサメタゾン−
誘導ルシフェラーゼをレポーターとする発現を増大する（Valette et al, 1995
）。その他の脂肪酸は、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（peroxisome proli
ferator-activated receptor：PPAR）核受容体により遺伝子転写を活性化するこ
と（Goettlicher et al, 1992）および脂肪細胞中のａＰ２遺伝子は、脂肪酸が
ｈＮＵＣ−１核受容体の同族体に結合することにより活性化されることが報告さ
れている（Grimaldi et al, 1992）。
あるという見方を支持する多くの証拠がある。このように、ＤＨＡがアロステリ
ック的にデキサメタゾンがラット肝臓のサイトゾル抽出物中のグルココルチコイ
ド受容体に結合するのを抑制し（Sumida et al, 1993b）かつデキサメタゾン−
誘導ルシフェラーゼをレポーターとする発現を増大する（Valette et al, 1995
）。その他の脂肪酸は、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（peroxisome proli
ferator-activated receptor：PPAR）核受容体により遺伝子転写を活性化するこ
と（Goettlicher et al, 1992）および脂肪細胞中のａＰ２遺伝子は、脂肪酸が
ｈＮＵＣ−１核受容体の同族体に結合することにより活性化されることが報告さ
れている（Grimaldi et al, 1992）。
【０１０５】 ＦＦＡｓのこれらの効果がステロイドホルモン核受容体により媒介されている
ため、この受容体のスーパーファミリーのメンバーであるグルココルチコイド受
容体が５−ＨＴ２Ａ受容体発現の調節に関係があることに留意することが重要で
ある。例えば、ヒドロコルチゾンは５−ＨＴ２機能を増大させる（Buckett and
Luscombe 1984）およびデオキサメタゾンがラット皮質中で５−ＨＴ２結合を増
大させる（Kuroda et al, 1993）。さらに、５−ＨＴ２結合は、グルココルチコ
イド受容体発現がアンチセンスｍＲＮＡ構造により低減されている“うつ病の”
トランスジェニックマウス中で低減するのに対して（Pepin et alm 1992a）、三
環の抗うつ剤であるデシプラミンは、同じトランスジェニックマウス系で脳グル
ココルチコイド受容体ｍＲＮＡレベルを増大させる（Pepin et al, 1992b）。最
後に、簡潔な研究により、５−ＨＴ２プロモーター−ルシフェラーゼをレポータ
ーとする発現が神経２ａ細胞中のデキサメタゾンにより増大されることを示され
た（Garlow and Ciaranello, 1995）。
ため、この受容体のスーパーファミリーのメンバーであるグルココルチコイド受
容体が５−ＨＴ２Ａ受容体発現の調節に関係があることに留意することが重要で
ある。例えば、ヒドロコルチゾンは５−ＨＴ２機能を増大させる（Buckett and
Luscombe 1984）およびデオキサメタゾンがラット皮質中で５−ＨＴ２結合を増
大させる（Kuroda et al, 1993）。さらに、５−ＨＴ２結合は、グルココルチコ
イド受容体発現がアンチセンスｍＲＮＡ構造により低減されている“うつ病の”
トランスジェニックマウス中で低減するのに対して（Pepin et alm 1992a）、三
環の抗うつ剤であるデシプラミンは、同じトランスジェニックマウス系で脳グル
ココルチコイド受容体ｍＲＮＡレベルを増大させる（Pepin et al, 1992b）。最
後に、簡潔な研究により、５−ＨＴ２プロモーター−ルシフェラーゼをレポータ
ーとする発現が神経２ａ細胞中のデキサメタゾンにより増大されることを示され
た（Garlow and Ciaranello, 1995）。
【０１０６】 従って、ＤＨＡの抗うつ剤作用を模倣した化合物は、ＤＨＡと本質的に同じ効
果をグルココルチコイド受容体に有する化合物を含まれる。このような化合物に
は、グルココルチコイド受容体を結合でき、かつＤＨＡが結合した時にグルココ
ルチコイド受容体により活性化される同じ遺伝子の発現を調節するものが含まれ
る。グルココルチコイド受容体は、ＤＨＡに結合でき、遺伝子プロモーター中の
ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に関するグルココルチコイド応答配列の場所に依存
して遺伝子発現を活性化するかまたはこれを抑制する。特に、コルチコステロイ
ドは、海馬中で５−ＨＴ２Ａ受容体の発現をアップレギュレートできるのに対し
て、同時に５−ＨＴ１Ａ受容体の発現をダウンレギュレートする（ＥＣＴでも効
果が見られる）。一般的に、これらの遺伝子の活性は研究されている。
果をグルココルチコイド受容体に有する化合物を含まれる。このような化合物に
は、グルココルチコイド受容体を結合でき、かつＤＨＡが結合した時にグルココ
ルチコイド受容体により活性化される同じ遺伝子の発現を調節するものが含まれ
る。グルココルチコイド受容体は、ＤＨＡに結合でき、遺伝子プロモーター中の
ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に関するグルココルチコイド応答配列の場所に依存
して遺伝子発現を活性化するかまたはこれを抑制する。特に、コルチコステロイ
ドは、海馬中で５−ＨＴ２Ａ受容体の発現をアップレギュレートできるのに対し
て、同時に５−ＨＴ１Ａ受容体の発現をダウンレギュレートする（ＥＣＴでも効
果が見られる）。一般的に、これらの遺伝子の活性は研究されている。
【０１０７】 従って、本発明のさらなる態様は、グルココルチコイド受容体におけるドコサ
ヘキサエン酸の効果を模倣する化合物を同定する方法を含み、該方法はグルココ
ルチコイド受容体を化合物と接触させかつ該化合物の効果が本質的にドコサヘキ
サエン酸と同じであるかどうかを測定することから成る。
ヘキサエン酸の効果を模倣する化合物を同定する方法を含み、該方法はグルココ
ルチコイド受容体を化合物と接触させかつ該化合物の効果が本質的にドコサヘキ
サエン酸と同じであるかどうかを測定することから成る。
【０１０８】 この方法は、うつ病の治療に関して有効である薬または薬のような化合物また
は先導化合物を同定するために使用できることが認識されるであろう。ＤＨＡの
効果を模倣する薬剤もまた他のＣＮＳ障害、例えば精神病、発作（大脳虚血）、
頭部障害、および神経変性状態の治療の有効であることが認識される。
は先導化合物を同定するために使用できることが認識されるであろう。ＤＨＡの
効果を模倣する薬剤もまた他のＣＮＳ障害、例えば精神病、発作（大脳虚血）、
頭部障害、および神経変性状態の治療の有効であることが認識される。
【０１０９】 “グルココルチコイド受容体を化合物と接触させる”ことは、一般的にグルコ
コルチコイド受容体が細胞内で構成されかつ該化合物が細胞と接触するという間
接的な意味で、特にグルココルチコイド受容体と化合物の接触の可能性を含む。
有利には、化合物の効果は、遺伝子発現を調節するグルココルチコイド受容体能
力に関して、これがどのような効果を有するかを測定することにより計られる。
多くの遺伝子は、グルココルチコイド受容体が結合することにより調節できるプ
ロモーターを有している（それ自体が例えばアクチベーター、たとえばＤＨＡの
結合により活性化された場合）。従って、（グルココルチコイド受容体に応答す
る応答配列を有する遺伝子の）遺伝子発現の活性化を有する試験化合物の効果と
、同じ遺伝子の発現の活性化を有するＤＨＡの効果を比較するのが特に有効であ
る。
コルチコイド受容体が細胞内で構成されかつ該化合物が細胞と接触するという間
接的な意味で、特にグルココルチコイド受容体と化合物の接触の可能性を含む。
有利には、化合物の効果は、遺伝子発現を調節するグルココルチコイド受容体能
力に関して、これがどのような効果を有するかを測定することにより計られる。
多くの遺伝子は、グルココルチコイド受容体が結合することにより調節できるプ
ロモーターを有している（それ自体が例えばアクチベーター、たとえばＤＨＡの
結合により活性化された場合）。従って、（グルココルチコイド受容体に応答す
る応答配列を有する遺伝子の）遺伝子発現の活性化を有する試験化合物の効果と
、同じ遺伝子の発現の活性化を有するＤＨＡの効果を比較するのが特に有効であ
る。
【０１１０】 細胞は、グルココルチコイド受容体に応答する応答配列を含有する遺伝子が存
在する天然の遺伝子系を含んでいてもよく、かつ発現の活性化（ＤＨＡによるか
または試験化合物による）は遺伝子発現の測定により計られるにもかかわらず（
例えば、その生成物の発現を測定することによる）、受容体遺伝子に操作的に結
合しているプロモーターに応答配列が操作的に結合している場合に特に望ましい
。従って、アッセイ中で使用される細胞が、レポーター遺伝子に操作的に結合し
ているプロモーターに操作的に結合しているグルココルチコイド受容体配列を含
有する核酸を有することが有利である。レポーター遺伝子の発現は、場合により
試験化合物（またはＤＨＡ）によるグルココルチコイド受容体の活性化の測定か
ら得られる。本発明のはじめの態様に関して先に述べたように、レポーター遺伝
子、例えば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランス
フェラーゼおよびルシフェラーゼは当業者に公知である。ルシフェラーゼは、光
放出に関する感度のために特に有利なレポーター遺伝子である。
在する天然の遺伝子系を含んでいてもよく、かつ発現の活性化（ＤＨＡによるか
または試験化合物による）は遺伝子発現の測定により計られるにもかかわらず（
例えば、その生成物の発現を測定することによる）、受容体遺伝子に操作的に結
合しているプロモーターに応答配列が操作的に結合している場合に特に望ましい
。従って、アッセイ中で使用される細胞が、レポーター遺伝子に操作的に結合し
ているプロモーターに操作的に結合しているグルココルチコイド受容体配列を含
有する核酸を有することが有利である。レポーター遺伝子の発現は、場合により
試験化合物（またはＤＨＡ）によるグルココルチコイド受容体の活性化の測定か
ら得られる。本発明のはじめの態様に関して先に述べたように、レポーター遺伝
子、例えば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランス
フェラーゼおよびルシフェラーゼは当業者に公知である。ルシフェラーゼは、光
放出に関する感度のために特に有利なレポーター遺伝子である。
【０１１１】 アッセイ法においてレポーター遺伝子の発現に使用するために特に有利な応答
配列およびプロモーターは、５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子由来の応答配列およびプ
ロモーターである。ラットの５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子由来のこれらの配列は、
Garlow and Ciaranello(1995) Mol. Brain Res. 31, 201-209に記載されており
、本発明中に引用されており、かつ事実、応答配列およびプロモーターは、ルシ
フェラーゼレポーター遺伝子に操作的に結合した形で記載されている。
配列およびプロモーターは、５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子由来の応答配列およびプ
ロモーターである。ラットの５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子由来のこれらの配列は、
Garlow and Ciaranello(1995) Mol. Brain Res. 31, 201-209に記載されており
、本発明中に引用されており、かつ事実、応答配列およびプロモーターは、ルシ
フェラーゼレポーター遺伝子に操作的に結合した形で記載されている。
【０１１２】 ヒトの５−ＨＴ２Ａ遺伝子プロモーターは、Zhu et al, (1995)によりクロー
ニングされた。塩基：-1157、-1137、-1127および-496（塩基＋１＝ＡＴＧ翻訳
開始のＡ）で出発する４つの転写開始部位がヒト遺伝子中で同定された。-1157
、-1127および-496での転写開始部位は脳内で使用される。ＤＮアーゼ１フット
プリント試験は、塩基-1248〜01219（はじめの３つの開始部位の上流）、-1109
〜-891、および-810〜-795（はじめの３つの開始部位の下流であるが部位４の上
流）での転写因子結合部位を明らかにした。転写因子Ｓｐ１は、これらのはじめ
のフットプリント部位の３’末端に結合するが、しかしその５’末端は公知の転
写因子結合部位を有さず、従って殆どは新規の転写因子により保護されている。
ニングされた。塩基：-1157、-1137、-1127および-496（塩基＋１＝ＡＴＧ翻訳
開始のＡ）で出発する４つの転写開始部位がヒト遺伝子中で同定された。-1157
、-1127および-496での転写開始部位は脳内で使用される。ＤＮアーゼ１フット
プリント試験は、塩基-1248〜01219（はじめの３つの開始部位の上流）、-1109
〜-891、および-810〜-795（はじめの３つの開始部位の下流であるが部位４の上
流）での転写因子結合部位を明らかにした。転写因子Ｓｐ１は、これらのはじめ
のフットプリント部位の３’末端に結合するが、しかしその５’末端は公知の転
写因子結合部位を有さず、従って殆どは新規の転写因子により保護されている。
【０１１３】 ２番目のフットプリント部位は、公知の転写因子結合部位を含有せず、かつ同
様に知られていない転写因子により保護されているのに対して、３番目の部位は
、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子（Ｅ−ｂｏｘ）結合部位に
集中している。転写開始部位１〜３は、もっとも一般的に使用され、かつ部位４
からの転写を抑制する。しかし、上流のレプレッサーが不在の場合には、部位４
が最も有効なプロモーターである。公表されたこのプロモーター配列の実験は、
塩基−１２２〜−１０７に位置するグルココルチコイド受容体応答配列を明らか
にしている。しかし、この部位のフットプリント／ＤＮアーゼ１の保護は試験さ
れていなかった。
様に知られていない転写因子により保護されているのに対して、３番目の部位は
、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子（Ｅ−ｂｏｘ）結合部位に
集中している。転写開始部位１〜３は、もっとも一般的に使用され、かつ部位４
からの転写を抑制する。しかし、上流のレプレッサーが不在の場合には、部位４
が最も有効なプロモーターである。公表されたこのプロモーター配列の実験は、
塩基−１２２〜−１０７に位置するグルココルチコイド受容体応答配列を明らか
にしている。しかし、この部位のフットプリント／ＤＮアーゼ１の保護は試験さ
れていなかった。
【０１１４】 本発明の機構としての特定の理論に制限されることなく、図１に記載されてい
るように、ＤＨＡは５−ＨＴ２Ａ遺伝子発現を活性化すると考えられている。従
って、ＤＨＡのように本質的に同様に５−ＨＴ２Ａ遺伝子発現を活性化する化合
物は本発明のスクリーニングアッセイにより同定できかつ記載された方法で有効
であろう。
るように、ＤＨＡは５−ＨＴ２Ａ遺伝子発現を活性化すると考えられている。従
って、ＤＨＡのように本質的に同様に５−ＨＴ２Ａ遺伝子発現を活性化する化合
物は本発明のスクリーニングアッセイにより同定できかつ記載された方法で有効
であろう。
【０１１５】 ＤＨＡを模倣するものとして同定された化合物は薬剤のような化合物または先
導化合物の可能性を持っていることが認識され、これらは、先に記載されたよう
なうつ病または他の疾患にかかっている患者に投与するために好適な化合物とし
てさらに選択されるのが望ましい。特に、精神病または神経疾患に対して活性を
表示する他のパラメーターを試験した場合に、グルココルチコイド受容体におい
てＤＨＡの効果を模倣するのと同様にＤＨＡと同様の効果、例えば抗うつ剤活性
を有する化合物が選択されるのが有利である。さらに、上記のように、薬剤とし
て使用するために望ましい他の特性を有する化合物が選択されるのが有利である
。
導化合物の可能性を持っていることが認識され、これらは、先に記載されたよう
なうつ病または他の疾患にかかっている患者に投与するために好適な化合物とし
てさらに選択されるのが望ましい。特に、精神病または神経疾患に対して活性を
表示する他のパラメーターを試験した場合に、グルココルチコイド受容体におい
てＤＨＡの効果を模倣するのと同様にＤＨＡと同様の効果、例えば抗うつ剤活性
を有する化合物が選択されるのが有利である。さらに、上記のように、薬剤とし
て使用するために望ましい他の特性を有する化合物が選択されるのが有利である
。
【０１１６】 本発明のさらなる態様は、うつ病または精神病、発作、頭部障害を含む他のＣ
ＮＳ疾患、および神経変性疾患の治療に有効（または薬剤を製造するために有効
）である薬剤または薬剤のような化合物または先導化合物を同定する本発明のス
クリーニング法の使用を含む。
ＮＳ疾患、および神経変性疾患の治療に有効（または薬剤を製造するために有効
）である薬剤または薬剤のような化合物または先導化合物を同定する本発明のス
クリーニング法の使用を含む。
【０１１７】 本発明を以下の図および実施例を用いて詳説する。
【０１１８】 例１：ＰＬＡ２／ＰＬＢイソ型の単離および精製 全脳粗抽出物からの単離 ホスホリパーゼ酵素を１ｋｇまでの脳組織を均質化することにより全脳から抽
出し（例えばHirashima et al, 1992; Bonventre and Koroshetz, 1993）、続い
て遠心分離によりサイトゾル（100,000×g 上清）、シナプトソームおよびミク
ロソーム分画に分離した。サイトゾルおよび他の分画を初期ＤＥＡＥ toyopearl
カラムクロマトグラフィー工程により部分的に精製した。また、粗分画を４０
〜４５％硫酸アンモニウムで処理し、殆どのタンパク質を沈殿させ、次に１Ｍ塩
化カリウム中で抽出／再び融解し、Superose ゲル濾過クロマトグラフィー（Ror
dorf et al, 1991; Bonventre and Koroshetz, 1993）により部分的に精製した
。部分的に精製された酵素をさらに種々の大きさの圧排的アフィニティークロマ
トグラフィー法（例えばUltrogel AcA 54 column, Octyl-Sepharose column, Ph
enyl toyopearl column）を使用して更に精製した。本発明により記載されてい
る有利な基質特異性を有するＰＬＡ２酵素を単離するための有利なクロマトグラ
フィー法において、すなわちｓｎ−２位から優先的にＤＨＡを放出するホスファ
チジルセリンまたはエタノールアミン加水分解酵素は、基質アフィニティーカラ
ム（例えばsn-1アシル、sn-2 ドコサヘキサエノイルホスホセリン／エタノール
アミン、Affigel 10 columns (after Hirashima et al 1992)）に結合するかま
たはコファクターアフィニティーカラム（例えばアデノシン三リン酸−アガロー
スアフィニティーカラム(Ackerman et al 1994)）に結合するかまたはヘパリン
カラム（[Jones and Tang 1995]）に結合する。均質にする最後の精製はHRLC MA
7Q、ヒドロキシアパタイト、またはMono P 5/20カラムを用いて達成される。約
５％の収率で１０００〜１００００倍の精製が達成された。
出し（例えばHirashima et al, 1992; Bonventre and Koroshetz, 1993）、続い
て遠心分離によりサイトゾル（100,000×g 上清）、シナプトソームおよびミク
ロソーム分画に分離した。サイトゾルおよび他の分画を初期ＤＥＡＥ toyopearl
カラムクロマトグラフィー工程により部分的に精製した。また、粗分画を４０
〜４５％硫酸アンモニウムで処理し、殆どのタンパク質を沈殿させ、次に１Ｍ塩
化カリウム中で抽出／再び融解し、Superose ゲル濾過クロマトグラフィー（Ror
dorf et al, 1991; Bonventre and Koroshetz, 1993）により部分的に精製した
。部分的に精製された酵素をさらに種々の大きさの圧排的アフィニティークロマ
トグラフィー法（例えばUltrogel AcA 54 column, Octyl-Sepharose column, Ph
enyl toyopearl column）を使用して更に精製した。本発明により記載されてい
る有利な基質特異性を有するＰＬＡ２酵素を単離するための有利なクロマトグラ
フィー法において、すなわちｓｎ−２位から優先的にＤＨＡを放出するホスファ
チジルセリンまたはエタノールアミン加水分解酵素は、基質アフィニティーカラ
ム（例えばsn-1アシル、sn-2 ドコサヘキサエノイルホスホセリン／エタノール
アミン、Affigel 10 columns (after Hirashima et al 1992)）に結合するかま
たはコファクターアフィニティーカラム（例えばアデノシン三リン酸−アガロー
スアフィニティーカラム(Ackerman et al 1994)）に結合するかまたはヘパリン
カラム（[Jones and Tang 1995]）に結合する。均質にする最後の精製はHRLC MA
7Q、ヒドロキシアパタイト、またはMono P 5/20カラムを用いて達成される。約
５％の収率で１０００〜１００００倍の精製が達成された。
【０１１９】 単離に引き続く細胞系中の内因性発現 ヒト（例えば、MRC5、HEK 298、HeLa、Ntera2）または他の哺乳類種（例えば
、サルＣＯＳ、ハムスターＣＨＯまたはＢＨＫ、マウス３Ｔ３またはＮＢ４１Ａ
３神経芽細胞腫、ラットＣ６グリオームなど）から、あるいは神経／グリア由来
のキャラクタリゼーションされた細胞系において構造的に発現される天然酵素の
抽出は、全脳からのホスホリパーゼＡ２／Ｂの抽出に使用したものと同様のプロ
トコールにより達成されるが、但し、約１０１１〜１０１２細胞（細胞約１ｋｇ
、質量）が酵素を精製してミクロシークエンス法用に均質化するための十分な材
料を提供するために必要である。
、サルＣＯＳ、ハムスターＣＨＯまたはＢＨＫ、マウス３Ｔ３またはＮＢ４１Ａ
３神経芽細胞腫、ラットＣ６グリオームなど）から、あるいは神経／グリア由来
のキャラクタリゼーションされた細胞系において構造的に発現される天然酵素の
抽出は、全脳からのホスホリパーゼＡ２／Ｂの抽出に使用したものと同様のプロ
トコールにより達成されるが、但し、約１０１１〜１０１２細胞（細胞約１ｋｇ
、質量）が酵素を精製してミクロシークエンス法用に均質化するための十分な材
料を提供するために必要である。
【０１２０】 脊椎動物または他（例えば昆虫）に由来する遺伝子修飾された細胞からの酵素の
単離法 選択されたＤＨＡ放出ホスホリパーゼ酵素（殆どヒトのイソ型）は、非相同発
現に必要な調節ＤＮＡ配列に結合する酵素を選択するためのコード配列を有する
合成ＤＮＡ構築物を用いるトランスフェクションにより種々の細胞中で発現され
る。殆どの脊椎動物の細胞系がこの方法に好適であるが、しかし昆虫細胞系のバ
キュロウイルスを使用する発現も好適であることが判明した（Ma et al, 1999）
。使用される合成ＤＮＡ構築物は、染色体外（一過性トランスフェクション）で
あるかまたは染色体ＤＮＡに安定に組み込まれている。宿主細胞の要求条件は、
翻訳後の酵素グリコシル化および天然組織中でのレベルと同等の活性を得るため
にホスホリパーゼに必要とされるその他の修飾が可能であるべきことである。ホ
スホリパーゼ酵素は、内因性発現酵素を細胞系から抽出するために使用したのと
同様の手法を用いて、遺伝子修飾された細胞から精製した。
単離法 選択されたＤＨＡ放出ホスホリパーゼ酵素（殆どヒトのイソ型）は、非相同発
現に必要な調節ＤＮＡ配列に結合する酵素を選択するためのコード配列を有する
合成ＤＮＡ構築物を用いるトランスフェクションにより種々の細胞中で発現され
る。殆どの脊椎動物の細胞系がこの方法に好適であるが、しかし昆虫細胞系のバ
キュロウイルスを使用する発現も好適であることが判明した（Ma et al, 1999）
。使用される合成ＤＮＡ構築物は、染色体外（一過性トランスフェクション）で
あるかまたは染色体ＤＮＡに安定に組み込まれている。宿主細胞の要求条件は、
翻訳後の酵素グリコシル化および天然組織中でのレベルと同等の活性を得るため
にホスホリパーゼに必要とされるその他の修飾が可能であるべきことである。ホ
スホリパーゼ酵素は、内因性発現酵素を細胞系から抽出するために使用したのと
同様の手法を用いて、遺伝子修飾された細胞から精製した。
【０１２１】 組換えタンパク質の親和性単離法 非相同的にホスホリパーゼ酵素を発現する遺伝子修飾された細胞からのタンパ
ク質を抽出および精製するもう１つの方法として、“タギング”ポリ−ヒスチジ
ンまたは同様のリンカー配列をホスホリパーゼ酵素をコードする遺伝子構築物中
に組み込んで組換え酵素を製造する。これらの構築物は、酵素のグリコシル化お
よび他の翻訳後修飾を必要とする場合には、真核細胞中で発現させるべきである
が、しかし好適な原核細胞、例えば大腸菌中で発現させてもよい。一般的な抽出
法は、Witmer et al. (1995)に記載されており、その際、約６０ｇの細菌が音波
処理により溶解され、かつ４５％硫酸アンモニウムを用いて可溶性タンパク質が
抽出／沈殿されている。硫酸アンモニウムを除去するために透析を使用し、次に
ファルマシア（Pharmacia）社の HiLoad 26.10 Q セファロースカラムを用いる
初期イオン交換クロマトグラフィー精製工程を続ける。この後に、塩化亜鉛を予
備充填した金属キレート樹脂アフィニティーカラムにおいて、プール活性分画（
pooled actibe fracyions）の精製をする。このような条件下で、組換え酵素の
ポリヒスチジンタギング配列は、アフィニティーカラムに付着した二価のイオン
と相互作用し、１Ｍまで段階的に増大するイミダゾールを精製したタンパク質を
溶出するために使用する。さらなる精製工程は、CentriPrep ３０ユニットを用
いた濃縮およびファルマシアMono Q HR 5/5カラムからの溶出を含めて安定な酵
素ストックを提供するために使用する。
ク質を抽出および精製するもう１つの方法として、“タギング”ポリ−ヒスチジ
ンまたは同様のリンカー配列をホスホリパーゼ酵素をコードする遺伝子構築物中
に組み込んで組換え酵素を製造する。これらの構築物は、酵素のグリコシル化お
よび他の翻訳後修飾を必要とする場合には、真核細胞中で発現させるべきである
が、しかし好適な原核細胞、例えば大腸菌中で発現させてもよい。一般的な抽出
法は、Witmer et al. (1995)に記載されており、その際、約６０ｇの細菌が音波
処理により溶解され、かつ４５％硫酸アンモニウムを用いて可溶性タンパク質が
抽出／沈殿されている。硫酸アンモニウムを除去するために透析を使用し、次に
ファルマシア（Pharmacia）社の HiLoad 26.10 Q セファロースカラムを用いる
初期イオン交換クロマトグラフィー精製工程を続ける。この後に、塩化亜鉛を予
備充填した金属キレート樹脂アフィニティーカラムにおいて、プール活性分画（
pooled actibe fracyions）の精製をする。このような条件下で、組換え酵素の
ポリヒスチジンタギング配列は、アフィニティーカラムに付着した二価のイオン
と相互作用し、１Ｍまで段階的に増大するイミダゾールを精製したタンパク質を
溶出するために使用する。さらなる精製工程は、CentriPrep ３０ユニットを用
いた濃縮およびファルマシアMono Q HR 5/5カラムからの溶出を含めて安定な酵
素ストックを提供するために使用する。
【０１２２】 例２：ＤＨＡ−分離ホスホリパーゼ活性および製薬学的化合物によるその活性化 本発明によりホスホリパーゼ活性を測定するために使用されるアッセイの目的
は、通常の不活性な酵素によるホスホリピド基質の加水分解を活性化する化合物
を同定するため、または構成的な活性酵素の加水分解活性を高めることである。
アッセイの原則は、アクチベーター化合物を代表するｓｎ−２位でＤＨＡを含有
しかつｓｎ−３位で適切な塩基（エタノールアミンまたはセリン）を含有するホ
スホリピド基質、および活性化されたときに基質から選択的にＤＨＡを放出する
ことができるホスホリパーゼ酵素の混合物を形成することである。Reynolds et
al(1991)に記載されているようなホスホリピド加水分解がモニターされている種
々の方法論がある。２つの主な方法を以下に詳説する。
は、通常の不活性な酵素によるホスホリピド基質の加水分解を活性化する化合物
を同定するため、または構成的な活性酵素の加水分解活性を高めることである。
アッセイの原則は、アクチベーター化合物を代表するｓｎ−２位でＤＨＡを含有
しかつｓｎ−３位で適切な塩基（エタノールアミンまたはセリン）を含有するホ
スホリピド基質、および活性化されたときに基質から選択的にＤＨＡを放出する
ことができるホスホリパーゼ酵素の混合物を形成することである。Reynolds et
al(1991)に記載されているようなホスホリピド加水分解がモニターされている種
々の方法論がある。２つの主な方法を以下に詳説する。
【０１２３】 ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（DTNB）法 このアッセイ法は、チオール−感応性発色団（例えば、５，５'−ジチオビス
（２-ニトロ安息香酸）(DYNB)）の存在で基質のｓｎ−２位からチオ−エステル
−結合脂肪酸が加水分解するとホスホリパーゼ酵素活性により生じる遊離チオー
ルとして黄色い発色団（２−ニトロ−５−チオ安息香酸）が分光光度学的にモニ
ターされることを利用する（Yu and Dennis 1991）。
（２-ニトロ安息香酸）(DYNB)）の存在で基質のｓｎ−２位からチオ−エステル
−結合脂肪酸が加水分解するとホスホリパーゼ酵素活性により生じる遊離チオー
ルとして黄色い発色団（２−ニトロ−５−チオ安息香酸）が分光光度学的にモニ
ターされることを利用する（Yu and Dennis 1991）。
【０１２４】 適切なホスホリピド基質のミセル、例えばｓｎ−１−ステアロイル、ｓｎ−２
−チオドコサヘキサノイルホスファチジルエタノールアミン（この化合物は市販
されていないが、しかし好適な粗基質である）は、脳、精巣、特に網膜からのホ
スホリピドを抽出することにより得られるが、この全ては特に高濃度のＤＨＡ−
含有ホスホリピドを有する。事実、網膜棒体外節膜ホスホリピドの多くは、ジ−
（ｓｎ−１、ｓｎ−２）−ドコサヘキサエノイルホスホリピドから成る。基質は
、理想的ではないジカプリルチオホスファチジルコリンに制限されており、ｓｎ
−１−ステアロイル、ｓｎ−２−チオ−アラキドニル−ホスファチジルコリン、
またはその代わりのｓｎ−３置換ホスファチジルエタノールアミン（Cayman Che
mical Company, Ann Arbor, MI 48108, USAから入手可能）は、選択されたホス
ホリパーゼの最適ｐＨで、Tris−ベースの緩衝液中でＴｒｉｔｏｎＸ−１００お
よびウシ血清アルブミンと混合する。酵素活性化に必要であれば、該緩衝液に１
０ｍＭまでのＣａ＋＋を含有させてもよく、またはこの酵素がＣａ＋＋−依存性
である場合にはＣａ＋＋の全ての痕跡をキレートするために１０ｍＭまでのエチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）を含有させてもよい。さらに必要があれば補助因子
、例えばアデノシン三リン酸（ATP）を添加してもよい。これにＤＴＮＢ水溶液
を添加する。次に“アクチベーター”試験化合物を添加してもよく、かつ該溶液
を１．０ｍｌキュベット中に入れる。４０５ｎｍでの吸光度が観測されて安定な
基線が整えられた後に、ホスホリパーゼの試料を添加し、かつ吸光度の変化の速
度を測定し、このことから酵素による基質加水分解の速度を計算することができ
る。“アクチベーター化合物”の存在での基質加水分解の速度の増大は、酵素だ
けの存在での加水分解の速度と比較して活性化効果を示す。このアッセイは、体
積２２５μｌまで容易に減少させて９６ウェルプレートを使用するオートメーシ
ョンの程度で実施することができる。このアッセイは、以下に記載する放射性ア
ッセイほど感応性ではない。
−チオドコサヘキサノイルホスファチジルエタノールアミン（この化合物は市販
されていないが、しかし好適な粗基質である）は、脳、精巣、特に網膜からのホ
スホリピドを抽出することにより得られるが、この全ては特に高濃度のＤＨＡ−
含有ホスホリピドを有する。事実、網膜棒体外節膜ホスホリピドの多くは、ジ−
（ｓｎ−１、ｓｎ−２）−ドコサヘキサエノイルホスホリピドから成る。基質は
、理想的ではないジカプリルチオホスファチジルコリンに制限されており、ｓｎ
−１−ステアロイル、ｓｎ−２−チオ−アラキドニル−ホスファチジルコリン、
またはその代わりのｓｎ−３置換ホスファチジルエタノールアミン（Cayman Che
mical Company, Ann Arbor, MI 48108, USAから入手可能）は、選択されたホス
ホリパーゼの最適ｐＨで、Tris−ベースの緩衝液中でＴｒｉｔｏｎＸ−１００お
よびウシ血清アルブミンと混合する。酵素活性化に必要であれば、該緩衝液に１
０ｍＭまでのＣａ＋＋を含有させてもよく、またはこの酵素がＣａ＋＋−依存性
である場合にはＣａ＋＋の全ての痕跡をキレートするために１０ｍＭまでのエチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）を含有させてもよい。さらに必要があれば補助因子
、例えばアデノシン三リン酸（ATP）を添加してもよい。これにＤＴＮＢ水溶液
を添加する。次に“アクチベーター”試験化合物を添加してもよく、かつ該溶液
を１．０ｍｌキュベット中に入れる。４０５ｎｍでの吸光度が観測されて安定な
基線が整えられた後に、ホスホリパーゼの試料を添加し、かつ吸光度の変化の速
度を測定し、このことから酵素による基質加水分解の速度を計算することができ
る。“アクチベーター化合物”の存在での基質加水分解の速度の増大は、酵素だ
けの存在での加水分解の速度と比較して活性化効果を示す。このアッセイは、体
積２２５μｌまで容易に減少させて９６ウェルプレートを使用するオートメーシ
ョンの程度で実施することができる。このアッセイは、以下に記載する放射性ア
ッセイほど感応性ではない。
【０１２５】 アイソトープ標識された脂肪酸の加水分解 このアッセイは、ホスホリピド酵素によりホスホリピド基質から放出される１ ４ Ｃまたは３Ｈアイソトープ標識された脂肪酸を測定する。これは、最も一般的
に使用されかつ最も感応性のホスホリパーゼアッセイである。しかし、アイソト
ープ標識された脂肪酸最終生成物を反応進行度を計量化する前にアイソトープ標
識された基質から分離しなくてはならないという欠点を有する。
に使用されかつ最も感応性のホスホリパーゼアッセイである。しかし、アイソト
ープ標識された脂肪酸最終生成物を反応進行度を計量化する前にアイソトープ標
識された基質から分離しなくてはならないという欠点を有する。
【０１２６】 好適なホスホリパーゼ基質、例えばｓｎ−１−ステアロイル、ｓｎ−２−１４ Ｃ−ドコサヘキサエノイル−ホスファチジルエタノールアミンである。これは、
Amersham Life Sciences、またはNEN Life Sciencesによる慣用の合成により製
造されていてもよい。[３Ｈ]−標識された基質は、精製された標識されていない
ホスホリピドから[３Ｈ]による任意の水素の非特異的置換により比較的簡単に形
成される。しかし、該反応はＤＨＡ中の炭素二重結合を飽和させているようであ
る。脂肪酸の[１４Ｃ]−アイソトープ標識型は、例えば生物学的発酵系を用いて
合成されていてもよく、次にホスホリピド含有の[１４Ｃ]−ＤＨＡを単離し；ま
たｓｎ−１−ステアロイル、ｓｎ−２−１４Ｃ−アラキドニル−ホスファチジル
コリンまたはｓｎ−２−１４Ｃ−アラキドニル−ホスファチジルエタノールアミ
ン（すべてAmersham Life Sciences, UKから入手可能）を約４０〜６０mCi/mmol
（1.48〜2.22 GBq/mmol）で使用してもよく、好適なＴｒｉｓ−ベースの緩衝液
２０μｌ中、４５０pmolsで選択されたホスホリパーゼ酵素の最適ｐＨで製造し
てもよい。これに“アクチベーター化合物”含有の同じ緩衝液１８０μｌ、必要
に応じてＣａ＋＋、またはＥＤＴＡまたはＡＴＰを添加する（上記参照）。ホス
ホリパーゼの試料を添加することにより反応を開始させ、かつ３７℃で１時間イ
ンキュベートする。この反応を０．１％酢酸を含有するイソヘキサン１ｍｌの添
加により終了させ、遊離脂肪酸を抽出する。続いて遠心分離して有機相および水
相に分離し、有機相１００μｌを添加して十分にシンチレーションさせて、かつ
カウントする。“アクチベーター化合物”の存在で１４Ｃ−標識された遊離脂肪
酸の著しく高められた遊離は、ホスホリパーゼ酵素だけの存在での放出と比較し
て、“アクチベーター”効果を示していると解釈される。
Amersham Life Sciences、またはNEN Life Sciencesによる慣用の合成により製
造されていてもよい。[３Ｈ]−標識された基質は、精製された標識されていない
ホスホリピドから[３Ｈ]による任意の水素の非特異的置換により比較的簡単に形
成される。しかし、該反応はＤＨＡ中の炭素二重結合を飽和させているようであ
る。脂肪酸の[１４Ｃ]−アイソトープ標識型は、例えば生物学的発酵系を用いて
合成されていてもよく、次にホスホリピド含有の[１４Ｃ]−ＤＨＡを単離し；ま
たｓｎ−１−ステアロイル、ｓｎ−２−１４Ｃ−アラキドニル−ホスファチジル
コリンまたはｓｎ−２−１４Ｃ−アラキドニル−ホスファチジルエタノールアミ
ン（すべてAmersham Life Sciences, UKから入手可能）を約４０〜６０mCi/mmol
（1.48〜2.22 GBq/mmol）で使用してもよく、好適なＴｒｉｓ−ベースの緩衝液
２０μｌ中、４５０pmolsで選択されたホスホリパーゼ酵素の最適ｐＨで製造し
てもよい。これに“アクチベーター化合物”含有の同じ緩衝液１８０μｌ、必要
に応じてＣａ＋＋、またはＥＤＴＡまたはＡＴＰを添加する（上記参照）。ホス
ホリパーゼの試料を添加することにより反応を開始させ、かつ３７℃で１時間イ
ンキュベートする。この反応を０．１％酢酸を含有するイソヘキサン１ｍｌの添
加により終了させ、遊離脂肪酸を抽出する。続いて遠心分離して有機相および水
相に分離し、有機相１００μｌを添加して十分にシンチレーションさせて、かつ
カウントする。“アクチベーター化合物”の存在で１４Ｃ−標識された遊離脂肪
酸の著しく高められた遊離は、ホスホリパーゼ酵素だけの存在での放出と比較し
て、“アクチベーター”効果を示していると解釈される。
【０１２７】 例３：マウスにおいてＥＣＳ効果を模倣するＤＨＡ治療 図１に関しては、１０匹のグループのＣ５７／ＢＬ６マウスに、Hugo Basille E
CSユニットを用いて２００Ｖ、９９ｍA、２５０Ｈｚ、０．９ｍsecパルス幅１秒
で耳クリップ電極を介してＥＣＳを１回または繰返し（１０日にわたり５回）与
えた。コントロールグループにも耳クリップを装着したが、電流は流さなかった
（仮ＥＣＳ）。続いて脳を次のＥＣＳの増加時間で、ヘッド−フォーカスマイク
ロ波照射を使用して固定し、かつ解剖した。次にこれらを１Ｍ ＨＣｌ中で均質
化し、遊離脂肪酸を４０％ヘキサン／６０％イソプロパノール中で抽出し、Meth
oprep IIを用いて１晩メチル化し、次に内部標準Ｃ１７：０に対するガスクロマ
トグラフィーにより分析した。結果は、ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸
に関するそれぞれの時点での（それぞれＡおよびＢ）コントロールグループの全
脳遊離脂肪酸レベルからの百分率変化として表示した。
CSユニットを用いて２００Ｖ、９９ｍA、２５０Ｈｚ、０．９ｍsecパルス幅１秒
で耳クリップ電極を介してＥＣＳを１回または繰返し（１０日にわたり５回）与
えた。コントロールグループにも耳クリップを装着したが、電流は流さなかった
（仮ＥＣＳ）。続いて脳を次のＥＣＳの増加時間で、ヘッド−フォーカスマイク
ロ波照射を使用して固定し、かつ解剖した。次にこれらを１Ｍ ＨＣｌ中で均質
化し、遊離脂肪酸を４０％ヘキサン／６０％イソプロパノール中で抽出し、Meth
oprep IIを用いて１晩メチル化し、次に内部標準Ｃ１７：０に対するガスクロマ
トグラフィーにより分析した。結果は、ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸
に関するそれぞれの時点での（それぞれＡおよびＢ）コントロールグループの全
脳遊離脂肪酸レベルからの百分率変化として表示した。
【０１２８】 図２に関しては、１４匹のグループ中のＣ５７／ＢＬ６マウスをハロタン麻酔
し、次に食塩水賦形剤の形で０．５％ジゴール４ｍｌ中の２００pmol ＤＨＡを
５日にわたり３回（DHA×３）または１０日にわたり５回（DHA×５）i.c.v.に注
射した。コントロールグループには、i.c.v.に賦形剤だけを与え、２つの治療摂
生を使用した。次に脳を取り除き、皮質半球を解剖し、本質的にCheetham et al
, (1988)に記載されているように均質化しかつ膜を調製した。５−ＨＴ２Ａ受容
体結合は、[３Ｈ]−ketanserinを用いてキャラクタリゼーションし、５ｍＭメチ
セルギドを使用して非特異的結合を確定した。コントロールからの有意性を両側
試験ｔ−検定（2-tailed t-test）を使用して試験した；＊＝５×ＤＨＡ治療を
用いた５−ＨＴ２ＡＢmaxの著しい増大（Ｐ≦０．０５）。
し、次に食塩水賦形剤の形で０．５％ジゴール４ｍｌ中の２００pmol ＤＨＡを
５日にわたり３回（DHA×３）または１０日にわたり５回（DHA×５）i.c.v.に注
射した。コントロールグループには、i.c.v.に賦形剤だけを与え、２つの治療摂
生を使用した。次に脳を取り除き、皮質半球を解剖し、本質的にCheetham et al
, (1988)に記載されているように均質化しかつ膜を調製した。５−ＨＴ２Ａ受容
体結合は、[３Ｈ]−ketanserinを用いてキャラクタリゼーションし、５ｍＭメチ
セルギドを使用して非特異的結合を確定した。コントロールからの有意性を両側
試験ｔ−検定（2-tailed t-test）を使用して試験した；＊＝５×ＤＨＡ治療を
用いた５−ＨＴ２ＡＢmaxの著しい増大（Ｐ≦０．０５）。
【０１２９】 図３に関しては、１５匹までのグループのＣ５７／ＢＬ６マウスをハロタン麻
酔し、次に食塩水賦形剤の形で０．５％ジゴール中の脂肪酸を用いてi.c.v.に注
射するか、または２５匹までのグループに耳クリップ電極を介してＥＣＳを与え
た（図１に記載されているように）。コントロールには、食塩水賦形剤の形で０
．５％ジゴールだけを与えるかまたは仮ＥＣＳ治療をする（図１に記載されてい
るように）。治療は１回だけ（‘×１’と表示される治療）または１０日にわた
り５回（‘×５’と表示される）与えた。Ａ：ＥＣＳまたは変化させた投与量の
ドコサヘキサエン酸を横座標に表示されているように与えた。Ｂ：ＥＣＳまたは
２００pmol投与量のアラキドン酸（ＡＡ）、オレイン酸（ＯＡ）またはドコサヘ
キサエン酸（ＤＨＡ）を与えた。次に動物に５−メチオキシ−N,N−ジメチルト
リプタミン、２ｍｇ／ｋｇ s.c.を与え、１０分間放置し、次に頭部痙攣の数を
３０秒間隔で数えた。結果は、適切なコントロールグループと比較した頭部痙攣
の数における百分率差として表示した（ＥＣＳ vs 仮ＥＣＳ；脂肪酸 vs ジゴー
ル）。差をBonferroniの多重比較試験を使用して分析しかつ有意性が示された。
＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。
酔し、次に食塩水賦形剤の形で０．５％ジゴール中の脂肪酸を用いてi.c.v.に注
射するか、または２５匹までのグループに耳クリップ電極を介してＥＣＳを与え
た（図１に記載されているように）。コントロールには、食塩水賦形剤の形で０
．５％ジゴールだけを与えるかまたは仮ＥＣＳ治療をする（図１に記載されてい
るように）。治療は１回だけ（‘×１’と表示される治療）または１０日にわた
り５回（‘×５’と表示される）与えた。Ａ：ＥＣＳまたは変化させた投与量の
ドコサヘキサエン酸を横座標に表示されているように与えた。Ｂ：ＥＣＳまたは
２００pmol投与量のアラキドン酸（ＡＡ）、オレイン酸（ＯＡ）またはドコサヘ
キサエン酸（ＤＨＡ）を与えた。次に動物に５−メチオキシ−N,N−ジメチルト
リプタミン、２ｍｇ／ｋｇ s.c.を与え、１０分間放置し、次に頭部痙攣の数を
３０秒間隔で数えた。結果は、適切なコントロールグループと比較した頭部痙攣
の数における百分率差として表示した（ＥＣＳ vs 仮ＥＣＳ；脂肪酸 vs ジゴー
ル）。差をBonferroniの多重比較試験を使用して分析しかつ有意性が示された。
＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。
【０１３０】 図４に関しては、１０匹のグループのＣ５７／ＢＬ６マウスをブリエタール（
brietal）で麻酔し、かつＥＣＳを１０日にわたり５回与えるか、またはハロタ
ンで麻酔し、食塩水賦形剤の形で０．５％ジゴール４ｍｌ中、ドコサヘキサエン
酸（DHA）４００pmolを i.c.v.に１０日にわたり５回与えるか、またはハロタン
麻酔し、かつそれぞれ２００pmolのドコサヘキサエン酸（DHA）、アラキドン酸
（AA）およびオレイン酸（OA）の混合物をジゴール賦形剤１２ｍｌの形で、i.c.
v.に１０日にわたり５回与えた。コントロールには、ブリエタールおよび仮ＥＣ
Ｓ、ハロタンおよびジゴール賦形剤４ｍｌ、またはハロタンおよびジゴール賦形
剤１２ｍｌを与えた。最後の治療の２４時間後に、動物を個別に温水の円形タン
クに置き、かつ水面を移動しているドップラー効果を使用して動物の行動を１分
間の間隔で評価し、オーバーヘッドエミッターおよびセンサーを用いて測定する
（Buckett et al, 1982）。結果は、関連するコントロールグループと比較した
百分率差として表示した。著しい差は、two-way ANOVAにより治療を用いてかつ
ドップラーレコーダチャネルをファクターとして分析され、次にWilliam's test
（ＤＨＡからジゴール）または多重-検定（ＥＣＳから仮ＥＣＳおよびＤＨＡ／
Ａ／ＯＡから３×ジゴール）によって分析された。＊ｐ≦０．０５。ＥＣＳおよ
びＤＨＡ治療は、動物の行動において著しい増大を生じ、このことは抗うつ剤効
果を示していると解釈できる。
brietal）で麻酔し、かつＥＣＳを１０日にわたり５回与えるか、またはハロタ
ンで麻酔し、食塩水賦形剤の形で０．５％ジゴール４ｍｌ中、ドコサヘキサエン
酸（DHA）４００pmolを i.c.v.に１０日にわたり５回与えるか、またはハロタン
麻酔し、かつそれぞれ２００pmolのドコサヘキサエン酸（DHA）、アラキドン酸
（AA）およびオレイン酸（OA）の混合物をジゴール賦形剤１２ｍｌの形で、i.c.
v.に１０日にわたり５回与えた。コントロールには、ブリエタールおよび仮ＥＣ
Ｓ、ハロタンおよびジゴール賦形剤４ｍｌ、またはハロタンおよびジゴール賦形
剤１２ｍｌを与えた。最後の治療の２４時間後に、動物を個別に温水の円形タン
クに置き、かつ水面を移動しているドップラー効果を使用して動物の行動を１分
間の間隔で評価し、オーバーヘッドエミッターおよびセンサーを用いて測定する
（Buckett et al, 1982）。結果は、関連するコントロールグループと比較した
百分率差として表示した。著しい差は、two-way ANOVAにより治療を用いてかつ
ドップラーレコーダチャネルをファクターとして分析され、次にWilliam's test
（ＤＨＡからジゴール）または多重-検定（ＥＣＳから仮ＥＣＳおよびＤＨＡ／
Ａ／ＯＡから３×ジゴール）によって分析された。＊ｐ≦０．０５。ＥＣＳおよ
びＤＨＡ治療は、動物の行動において著しい増大を生じ、このことは抗うつ剤効
果を示していると解釈できる。
【０１３１】 結論として、これらのデータはＥＣＴの多くの有益な効果は、ＤＨＡを用いる
治療により模倣できることを示している。
治療により模倣できることを示している。
【０１３２】 ＤＨＡが５ＨＴ２Ａ遺伝子発現を活性化すると考える提案された機構は、図５
に示されている。全ての成分は分子レベルで同定され、かつこの系の中の脂肪酸
の相互作用は文献に記載されている。
に示されている。全ての成分は分子レベルで同定され、かつこの系の中の脂肪酸
の相互作用は文献に記載されている。
【０１３３】 １．細胞外ＤＨＡは（ＥＣＴまたはホスホリパーゼＡ２アクチベーターにより放
出される）、脂肪酸トランスポータによりサイトゾルに輸送される。また、細胞
内で放出されるＤＨＡは、サイトゾル中にとどまる。
出される）、脂肪酸トランスポータによりサイトゾルに輸送される。また、細胞
内で放出されるＤＨＡは、サイトゾル中にとどまる。
【０１３４】 ２．サイトゾル内では、脂肪酸結合タンパク質（FABP）は亜細胞のコンパートメ
ント（例えば、小胞体中のＰＳはミトコンドリアに輸送されてPEに変換される）
の間で脂肪酸を輸送する。このような脂肪酸結合タンパク質はＤＨＡを核に輸送
する。
ント（例えば、小胞体中のＰＳはミトコンドリアに輸送されてPEに変換される）
の間で脂肪酸を輸送する。このような脂肪酸結合タンパク質はＤＨＡを核に輸送
する。
【０１３５】 ３．核内では、ステロイドホルモン核受容体がＤＨＡに結合する。これはＤＨＡ
特異的受容体（例えば、オルファン核受容体）であるかまたはＩＩ型グルココル
チコイド受容体であってもよい。（グルココルチコイド受容体はサイトゾル中の
それらのリガンドに結合し、次に核へ場所をかえることもできる）。
特異的受容体（例えば、オルファン核受容体）であるかまたはＩＩ型グルココル
チコイド受容体であってもよい。（グルココルチコイド受容体はサイトゾル中の
それらのリガンドに結合し、次に核へ場所をかえることもできる）。
【０１３６】 ４．ＤＨＡ−結合、活性化された核受容体は、５−ＨＴ２Ａ遺伝子のプロモータ
ー領域中の特異的なＤＮＡ認識配列（応答配列）に結合する。
ー領域中の特異的なＤＮＡ認識配列（応答配列）に結合する。
【０１３７】 ５．プロモーターの近くの核受容体−ＤＮＡ結合は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮ
Ａ ｐｏｌｙ）がプロモータに結合させて遺伝子転写の増大を強化する（プロモ
ーターに近すぎる核受容体−ＤＮＡ結合はＲＮＡポリメラーゼ結合を遮断して遺
伝子転写を減少させることもできる、５−ＨＴ１Ａ遺伝子の場合）。
Ａ ｐｏｌｙ）がプロモータに結合させて遺伝子転写の増大を強化する（プロモ
ーターに近すぎる核受容体−ＤＮＡ結合はＲＮＡポリメラーゼ結合を遮断して遺
伝子転写を減少させることもできる、５−ＨＴ１Ａ遺伝子の場合）。
【０１３８】
【外１】
【０１３９】
【外２】
【０１４０】
【外３】
【図１】 図１は、（ａ）マウス全脳ＤＨＡレベルにおける１回のＥＣＳおよび５回のＥ
ＣＳの効果を表す図および（ｂ）マウス全脳ＡＡレベルにおける１回のＥＣＳお
よび５回のＥＣＳの効果を表す図である。
ＣＳの効果を表す図および（ｂ）マウス全脳ＡＡレベルにおける１回のＥＣＳお
よび５回のＥＣＳの効果を表す図である。
【図２】 図２は、ex vivoでのマウス表皮５−ＨＴ２受容体結合におけるＤＨＡ（200 p
mol i.c.v.）の効果を表す図である。
mol i.c.v.）の効果を表す図である。
【図３】 図３は、（ａ）in vivoでの５−ＨＴ２受容体機能におけるＤＨＡ i.c.v.の効
果を表す図および（ｂ）in vivoでの５−ＨＴ２受容体機能におけるＡＡおよび
ＯＡ（200 pmol ）の効果を表す図である。
果を表す図および（ｂ）in vivoでの５−ＨＴ２受容体機能におけるＡＡおよび
ＯＡ（200 pmol ）の効果を表す図である。
【図４】 図４は、ポアソルト強制水泳試験での回避挙動におけるＥＣＳ、ＤＨＡ（400
pmol i.c.v.）ならびにＤＨＡ、ＡＡおよびＯＡ（それぞれ200 pmol i.c.v.）
の組合せの効果を表す図である。
pmol i.c.v.）ならびにＤＨＡ、ＡＡおよびＯＡ（それぞれ200 pmol i.c.v.）
の組合せの効果を表す図である。
【図５】 図５は、ＤＨＡが５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子発現を活性化する機構を記載した
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/22 Ａ６１Ｐ 25/22 ４Ｃ２０６ 25/24 25/24 25/28 25/28 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/44 1/44 1/66 1/66 1/68 Ｚ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 9/16 // Ｃ１２Ｎ 9/16 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ケビン ステュアート ジョン トンプソ ン イギリス国 ノッティンガム ペニーフッ ト ストリート アール３ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 CB21 CB26 DA12 DA13 DA14 DA20 DA54 DA61 DA80 FA34 FB01 FB02 FB06 FB07 JA20 4B024 AA01 AA11 BA11 DA02 FA02 FA10 4B050 CC03 DD11 FF03E FF05E FF11E FF14E HH01 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ13 QQ22 QQ32 QQ73 QR45 QR48 QR51 QR57 QR77 QR80 QS05 QX02 4C084 AA17 NA14 ZA062 ZA122 ZA152 ZA182 ZC192 4C206 AA02 DB09 MA01 MA04 NA14 ZA06 ZA12 ZA15 ZA18 ZC19
Claims (26)
- 【請求項１】 所定のホスホリピド基質に対してホスホリパーゼＡ２の活性
を増大させる化合物を同定する方法において、前記方法は、化合物の存在で所定
の基質に対して、ホスホリパーゼＡ２の活性が同じ化合物が不在の場合のその活
性と比較して増大されるかどうかを測定することを含むことを特徴とする、所定
のホスホリピド基質に対してホスホリパーゼＡ２の活性を増大させる化合物を同
定する方法。 - 【請求項２】 細胞中のホスホリパーゼＡ２の生産または発現を増大させる
化合物を同定する方法において、前記方法は、化合物の存在で細胞中のホスホリ
パーゼＡ２の生産または発現が、同じ化合物が不在の場合のその生産または発現
と比較して直接的にまたは間接的に増大されるかどうかを測定することを含むこ
とを特徴とする、細胞中のホスホリパーゼＡ２の生産または発現を増大させる化
合物を同定する方法。 - 【請求項３】 ホスホリパーゼＡ２がヒト脳膜ホスホリピドからドコサヘキ
サエン酸を放出することができるホスホリパーゼＡ２である、請求項１または２
に記載の方法。 - 【請求項４】 ホスホリパーゼＡ２がホスホリピド基質のｓｎ−２位でドコ
サヘキサエン酸への選択性を有する、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 ホスホリパーゼＡ２がホスホリピド基質のｓｎ−３位でホス
ホセリンまたはホスホエタノールアミンへの選択性を有する、請求項１または２
に記載の方法。 - 【請求項６】 ホスホリパーゼＡ２がホスファチジルセリンまたはホスファ
チジルエタノールアミン選択性を有するカルシウム−非依存性（ＶＩ型）サイト
ゾルホスホリパーゼＡ２またはサイトゾルホスホリパーゼＡ２のいずれか１方で
ある、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項７】 ホスホリパーゼＡ２の発現をレポーター分子に操作的に結合
しているホスホリパーゼＡ２をコードする遺伝子からのプロモーターを用いて間
接的に測定する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】 請求項３から６までのいずれか１項に記載のホスホリパーゼ
である、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 精神病または神経疾患を治療するために有効な薬剤、または
薬剤を製造するための先導化合物を選択する方法において、前記方法は、請求項
１に記載のホスホリパーゼＡ２の活性を増大させるかまたは請求項２に記載のホ
スホリパーゼＡ２の生産または発現を増大させる化合物を選択することを含むこ
とを特徴とする、精神病または神経疾患を治療するために有効な薬剤、または薬
剤を製造するための先導化合物を選択する方法。 - 【請求項１０】 前記化合物が脳ホモジネート中でドコサヘキサエン酸放出
を活性化できるかどうかを測定し、その際、このホモジネートはホスホリパーゼ
Ａ２酵素および脳膜ホスホリピドを含有しており、かつドコサヘキサエン酸の放
出を本質的に活性化する化合物を選択する工程をさらに含む、請求項９に記載の
方法。 - 【請求項１１】 前記化合物が脳ホモジネート中でアラキドン酸放出を活性
化できるかどうかを測定し、その際、このホモジネートはホスホリパーゼＡ２酵
素および脳膜ホスホリピドを含有しており、かつアラキドン酸の放出を本質的に
活性化しない化合物を選択する工程をさらに含む、請求項９または１０に記載の
方法。 - 【請求項１２】 前記化合物が動物中で電気痙攣ショックの抗うつ剤効果を
模倣できるかどうかを測定する工程をさらに含む、請求項９から１１までのいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 脳膜ホスホリピドからドコサヘキサエン酸の放出を増大さ
せる化合物の、精神病または神経疾患を治療するための薬剤の製造における使用
。 - 【請求項１４】 前記化合物がホスホリパーゼＡ２を活性化する、請求項１
３に記載の使用。 - 【請求項１５】 前記化合物が脳膜ホスホリピドからのアラキドン酸の放出
を本質的に増大させない、請求項１３または１４に記載の使用。 - 【請求項１６】 前記化合物が請求項１から１２までのいずれか１項に記載
の方法により得られる、請求項１３から１５までのいずれか１項に記載の使用。 - 【請求項１７】 患者の精神病または神経疾患を治療する方法において、前
記方法は、脳膜ホスホリピドからのドコサヘキサエン酸の放出を増大させる化合
物の有効量を投与することを含むことを特徴とする、患者の精神病または神経疾
患を治療する方法。 - 【請求項１８】 患者の精神病または神経疾患を治療する方法において、前
記方法は、精神分裂病を治療する場合には、ドコサヘキサエン酸をアラキドン酸
と組合わせて使用しないことを条件として、ドコサヘキサエン酸またはドコサヘ
キサエン酸の抗精神病または神経疾患効果を模倣する化合物の有効量を投与する
ことを含むことを特徴とする、患者の精神病または神経疾患を治療する方法。 - 【請求項１９】 精神分裂病を治療するための薬剤の場合には、ドコサヘキ
サエン酸をアラキドン酸と組合わせて使用しないことを条件とする、ドコサヘキ
サエン酸またはドコサヘキサエン酸の抗精神病または神経疾患効果を模倣する化
合物の、精神病または神経疾患を治療するための薬剤の製造における使用。 - 【請求項２０】 グルココルチコイド受容体におけるドコサヘキサエン酸の
効果を模倣する化合物を同定する方法において、前記方法は、グルココルチコイ
ド受容体と化合物を接触させかつ前記化合物が本質的にドコサヘキサエン酸と同
様の効果をグルココルチコイド受容体において有するかどうかを測定することを
含むことを特徴とする、グルココルチコイド受容体におけるドコサヘキサエン酸
の効果を模倣する化合物を同定する方法。 - 【請求項２１】 グルココルチコイド受容体が細胞中で構成されかつ前記細
胞が化合物と接触する、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 細胞は、レポーター遺伝子に操作的に結合しているプロモ
ーターに操作的に結合しているグルココルチコイド応答配列を含有する核酸構築
物を含有している、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 グルココルチコイド応答配列およびプロモーターが５−Ｈ
Ｔ２Ａ受容体遺伝子由来である、請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項２２ま
たは２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 明細書に記載されている神経病または神経疾患での治療に
有効な化合物のための新規のスクリーニングアッセイ。 - 【請求項２６】 明細書に記載されている神経病または神経疾患を治療する
ための新規の方法。
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