JP2002531124A - エプスタイン−バーウイルスの末端反復配列を有するベクター - Google Patents

エプスタイン−バーウイルスの末端反復配列を有するベクター

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Abstract

(57)【要約】 トランスフェクトした細胞に異種発現ベクターの組込み頻度を向上させるために、エプスタイン−バーウイルスに由来する独特な末端反復配列の使用を記載する。このベクターは高い生産細胞系を誘導する方法に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野）関連出願 ：MSB-7241（米国特許出願番号第09/209,920号）、「哺乳動物の遺伝子
発現のためのヒトハイブリッド宿主細胞（Human Hybrid Host Cell for Mammali
an Gene Expression)」と命名されたChoの出願、およびMSB-7255（米国特許出願
番号第09/209,916号）、「第VIII因子のための発現系（Expression System for
factorVIII）」と命名されたChoらの出願は、関連する主題を含む。両出願は199
8年12月10日に出願された。
【０００２】 発明の背景 分野 ：本発明は一般に、遺伝子操作の施された哺乳動物細胞系からの生物学的に
活性なタンパク質の生産に関する。具体的には本発明は、発現ベクターの宿主哺
乳動物細胞系のゲノムDNAへの組込みを増強させるエプスタイン-バーウイルス末
端反復配列を含有する新規な発現ベクターに関する。背景 ：部位特異的組込みによる発現ベクターのゲノムDNAへの安定な組込み効率
を増すために、多くの試みがなされてきた。
【０００３】 投入DNAの宿主細胞ゲノムへのランダムな非相同的な組込みは、目的とする相
同的組換えよりも100倍以上高い頻度で起こる（Thomas et al.,1987,Cell 51:50
3-512)。しかしホットスポット、例えば超可変ミニサセライトDNAを使用する相
同的組換えは哺乳動物細胞中で２つの欠損プラスミド間のランダム組換えよりも
頻繁に起こることが示された（Wahls et al.,1990,Cell 60:95-103)。
【０００４】 自己抗原の細胞性タンパク質がSun et al.により単離された(1994,Proc Natl
Acad Sci USA 91:8646-8650)。このタンパク質は末端反復結合タンパク質、すな
わちTRBPと同定された。末端反復結合タンパク質の２つの末端反復結合部位(TRB
S1およびTRBS2)もSun et al.により単離された。彼らはTRBPが反復細胞性DNA中
に存在する配列、例えば数可変縦列反復（variable-number tandem repeats:VNT
R)および免疫グロブリン重鎖クラススイッチ領域に結合することに気づいた。
【０００５】 末端反復結合タンパク質は、エプスタイン−バーウイルス末端反復（EBV-TR）
のＧ−リッチ領域に結合する。EBV-TRはプロセッシングおよびビリオンDNAのパ
ッケージングに関与する（Zimmermann et al.,1995,J Virol 69:3147-3155)。EB
V-TRは染色体DNAへの組込み(Matsuo et al.1984,Science 226:1322-1325)および
感染後のゲノムの環化現象（event）に関与している。このような配列はEBVビリ
オンDNAの開裂およびパッケージングに必須の要素である（Hammerschmidt et al
.,1989,Nature(London)340:393-397；Zimmermann et al.,J Virol, 69:3147-315
5)。このようなデータは組換え現象においてEBV-TR配列の重要な役割を示してい
る。したがって、我々はトランスフェクトした細胞から誘導されるクローンにお
けるEBV-TRの組込み現象を試験した。
【０００６】 発明の要約 我々は今、選択可能なマーカーおよびEBV-TR配列を含む発現ベクターでトラン
スフェクトした細胞が、同じ選択条件下でEBV-TR配列を含まない同じ発現ベクタ
ーでトランスフェクトした細胞に比べて、選択剤に耐性の細胞数において５〜10
倍の増加を示すことを見いだした。薬剤選択下でのより高い生存率は、EBV-TRを
含むベクターがベクターのゲノムDNAへの組込み頻度を強化できることを示して
いる。
【０００７】 本発明の発現ベクターは、EBV-TR配列およびジヒドロ葉酸シダクターゼ(dhfr)
のような選択可能なマーカーを含む。好適なEBV-TR配列は、不死化したリンパ芽
球細胞系6F11に由来するTRBP-結合領域のコア部分を含む402bp配列（図１に与え
る）である。好適な態様では哺乳動物遺伝子発現ベクターは、CMVエンハンサー
およびプロモーター、エプスタイン-バーウイルスに由来するイントロン配列（C
ho et al.への米国特許第5,854,021号明細書に記載されているようなMIS）、タ
ンパク質コード配列の挿入を可能にするための独自な制限酵素部位HpaI、および
ポリＡ領域に加えて薬剤選択マーカーおよび図１に示すEBV-TR配列をもつプラス
ミド骨格を含んで成る。このベクターをpSH131（図２を参照にされたい）と命名
する。このベクターは目的とするタンパク質の適切なDNAコード配列を哺乳動物
細胞に導入し、無血清培地でタンパク質発現の長期培養を安定化させるために使
用する。１つの好適な態様では、IL-4ムテイン(mutein)の配列をpSH131にクロー
ン化し、そして生成したベクターはpSH135である。このEBV-TR配列はpCIS25D（B
-ドメイン欠損rFVIIIを発現するためのベクター、BDD-FVIIIと命名）にも直接連
結し、そして生成したベクターはpCIS25DTRである。
【０００８】 好適な増幅可能なマーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr)であるが、グ
ルタミン シンテターゼ(gs)および多剤耐性遺伝子(mdr)のような他のマーカーに
置き換えることもできる。このような増幅可能なマーカー(dhfr、gsおよびmdr)
は選択可能なマーカーでもある。好適な選択可能なマーカーは、neo（ネオマイ
シ耐性に関するアミノグリコシド ホスフォトランスフェラーゼ）である：さら
にhph（ヒグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ）およびhisD（ヒスチジ
ノール デヒドロゲナーゼ）のような他の好適なマーカーに置き換えることがで
きる。
【０００９】 トランスフェクトする宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞であることができる。
選択遺伝子の細胞の染色体DNAへの組込みが受け入れられることが知られている
細胞系が最適であり；例えばヒト 胚性腎細胞（例えば293S細胞）、293SとＢ細
胞起源のヒトハイブリッド（例えばHKB11；ATCC寄託番号CRL 12568、MSB-7241、
「哺乳動物の遺伝子発現のためのヒト ハイブリッド宿主細胞(Human hybrid hos
t cell for mammalian gene expression)」と命名された本出願と同日に出願さ
れたChoへの米国特許出願を参照にされたい、この出願は引用により本明細書に
編入する）、チャイニーズハムスター卵母細胞（CHO）、ベビィ ハムスターの腎
臓(BHK-21) 、マウス骨髄腫およびヒトＢ-細胞である。
【００１０】 １つの役立つ例として、我々はdhfrおよびEBV-TR配列を含む発現ベクターでト
ランスフェクトしたCHO(dhfr-)細胞が、同じ選択条件下でEBV-TR配列を含まない
同じ発現ベクターでトランスフェクトした細胞に比べて、メトトレキセート(MTX
）耐性細胞の数において約５〜10倍の増加を表したことを示す。
【００１１】 本明細書で使用する場合、無血清条件とは血清を加えない培地で細胞の成長が
起こる条件を意味する。
【００１２】 具体的態様EBV-TRを含む発現ベクターの構築 B95/8 EBVシークエンシング データの170,476から170,856のDNA配列を包含す
る（P.J.Farrell、「エプスタイン−バーウイルスゲノム（Epstein-Barr Virus
Genome)」、進歩したウイルス腫瘍学（Advanced Viral Oncology)で：G.Klein編
集；ラベンス出版社（Ravens Press)、ニューヨーク 1989、第103〜132頁)、図
１に記載したEBV-TR配列の381bpフラグメントを、EBVにより不死化されたリンパ
芽球細胞である6F11細胞（ATCC CRL9652）から調製した鋳型DNAから、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により作成した。２つのプライマー(配列番号：１から誘導
したフラグメント5'-GGCAATGGAGCGTGACGAAG-3'および5'-CTCATCACGGTCACGCATGG-
3'）を作成して、6F11細胞DNA中のEBV-TR配列の381bpフラグメントを増幅した。
PCR産物をリン酸化し、そして制限エンドヌクレアーゼNaeIにより切り出した553
bpフラグメントを除去した後に発現ベクターpSM97に連結した。生成したベクタ
ーはpSH31（図２）であり、これをアメリカン タイプ カルチャー コレクション
、ATCC98879に寄託した。
【００１３】 pSH131(402bp)中のEVB-TR配列のDNAシークエンシングデータは、予想されたサ
イズ(381bp)よりも大きかった。この主な差異は９bp要素からの４bp（GTGTTGGCG ）および10bp要素からの７bp（GGTCATGGGG）から成る11-bpの反復(GGCGGGTCATG)
である。Zimmermann et al.（1996,J Virol 69:3147-3155)により記載されてい
るEBV-TR中のEBV DNA分子の両端は、９bp要素（GTGTTGGCG）および11bp要素（GG
GTCATGGGG）から成る（すべてのフラグメントは配列番号：１に由来する）。pSH
131中の11bp要素は、１bpが欠損していた；すなわち我々は10bpのみを観察した
。観察された11bp要素の反復の理由は、pSH131（402bp）中のEBV-TR配列がB95/8
DNAではなく6F11 DNAを使用して作成されたからかもしれない。6F11細胞をEBV
により不死化し、そしてEBV-DNAの鎖状化形を有するが（Cho and Tran,1993,Vir
ology 194:838-842）、B95/8EBVは感染ウイルスである。したがって、pSH131(40
2bp)のEBV-TR配列は、この鎖状化EVB-DNAから誘導した。
【００１４】 IL-4ダフル ムテイン(IL-4dm)をコードするDNA配列を、pSM97およびpSH131のH
paI部位に挿入した。生成したプラスミドはpSH134(pSM97中のIL-4dm)およびpSH1
35(pSH131中のIL-4dm)。使用したIL-4dmは、本質的にはSebaldへの欧州特許第06
13499号に記載されている（これは引用により本明細書に編入する)。このIL-4dm
は121位（アルギニン）および124位(チロシン)においてアスパラギン酸へ変化し
たアミノ酸を有する非修飾IL-4の誘導体である。
【００１５】 EBV-TR配列のPCR産物はpCIS25DのSalI部位にも挿入し、これはＢ-ドメインが
欠失した第VIII因子（BDD-FVIII）をコードする発現ベクターである。生成した
プラスミドはpCIS25DTRである。すべての４つの発現ベクター、pSH134およびpSH
135、pCIS25D、およびpCIS25DTRは同じ機能的dhfr遺伝子を有する。マップに関
しては図２を参照にされたい。
【００１６】
【実施例】
実施例１ 一過性のトランスフェクション アッセイにおいて レポーター遺伝子の発現に及ぼすEBV-TRの効果 ２百万個のCHO（dhfr-陰性）およびHKB（ヒト−ヒトハイブリッド細胞系：ATC
C CRL-12568）細胞を、提供されたプロトコールに従いカチオン性リポソーム DM
RIE-C試薬（ライフ テクノロジーズ(Life Technologies)、ロックビル、メリー
ランド州）を使用して６-ウェルプレート中の５μgのプラスミドDNA(pSH134およ
びpSH135)を用いて別々にトランスフェクトした。両発現ベクターでCHOおよびHK
B細胞をトランスフェクションした２または３日後に、上清をELISAによりIL-4dm
の発現について試験した。図３に示すように、繰り返した一過性のトランスフェ
クションアッセイにおける２つの異なるトランスフェクション体から、pSH134に
由来するIL-4dmの発現レベルはpSH135に由来するレべルに大変類似していた。こ
のような結果はEBV-TRがIL-4dmレポーター遺伝子の発現に効果を及ぼさないこと
を示している。このような結果はEBV-TRがベクター中の遺伝子発現、例えばdhfr
に及ぼす機能を強化しないかもしれないことを示している。これはEBV-TRの存在
が、dhfr遺伝子の発現の増加以外のメカニズムを通して生存率を上げ、すなわち
このメカニズムにはベクターの組み込みの上昇が関与しているかもしれないこと
を意味している。
【００１７】 実施例２ EBV-TRを含むベクターを用いてトランスフェクトした細胞の薬剤選択 CHO（dhfr-）細胞を、ライフ テクノロジー(Life Technology)により提供され
たプロトコールに従いカチオン性リポソーム DMRIE-C試薬を使用して、５μgのp
SH134および５μgのpSH135を用いて別々にトランスフェクトした。トランスフェ
クトされた細胞（96ウェルプレートあたり５×105細胞）を、r-インスリン、ト
ランスフェリンおよび50nM MTXを補充し、そしてヒポキサンチンおよびチミジン
を欠く無血清培地で選択した。成長−陽性ウェルは、50nM MTXを含む選択培地で
最初に選択してから２週間後に計数した。MTX−耐性クローンはmockトランスフ
ェクト細胞からは誘導されなかった。結果を表１に示す。実施例１（IL-4dm）は
、50nMのメトトレキセートを補充し、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く無血
清培地で行った。実施例２（IL-4dm）は、50nMのメトトレキセートを補充した血
清（５％）を含有する選択培地で行った。実施例３（BDD-FVIII）および実施例
４（BDD-FVIII）は、実施例１の無血清選択培地で行った。 表１．EBV-TRに連結した、およびしていないIL-4dmおよびBDD-FVIII発現ベクタ
ーを使用してトランスフェクトしたCHO（dhfr-）細胞からの薬剤−選択比 成長−陽性ウェル／全ウェル (1)ベクターw/oEBV-TR1 (2)EBV-TRを含むベクター2 (2)の％成長を(1) （成長+/全） （成長+/全） の％成長で割る3 実施例１ (IL-4dm) 28/960(2.9％) 238/960(24.8％)4 8.5 実施例２ (IL-4dm) 51/576(8.8％) 520/864(60.1％)4 6.8 実施例３ (BDD-FVIII) 48/1344(3.6％) 2227/3840(58％)4 16 実施例４(BDD-FVIII) 64/864(7.4％) 288/1056(27％)4 3.6 1 トランスフェクションにEBV-TRを欠く発現ベクターを使用した。2 トランスフェクションにEBV-TRを含む発現ベクターを使用した。3 この比はEBV-TRを欠く発現ベクターでトランスフェクトした細胞に対して、EBV
-TRを有するベクターでトランスフェクトした細胞の成長+比を示す。4 多数のコロニーが多くの成長−陽性ウェルで成長していたので、成長−陽性コ
ロニーの実際の数は各ウェルで計数された成長−陽性数よりも大変高い。
【００１８】 選択培地に細胞をまいてから２週間後、pSH135(EBV-TRを含む)でトランスフェ
クトした細胞は、pSH134(EBV-TRを含まない)でトランスフェクトした細胞よりも
約10倍高い選択比を示したが、EBV-TRはIL-4の発現に及ぼす機能に強化を示さな
かった（図３）。CHO（dhfr-)細胞も、DMRIE-C試薬を使用して５μgのpCIS25Dお
よび５μgのpCIS25DTRでトランスフェクトした。細胞は上記と同じ条件下で選択
した。pCIS25DTRでトランスフェクトした細胞は、pCIS25Dでトランスフェクトし
た細胞よりも約３倍から約16倍高い選択比を示した（表１）。このような結果は
発現ベクター中のEBV-TRの配列が、遺伝子治療のためにインビボでベクターの組
込みを増大させるために使用できることを示している。
【００１９】 実施例３無血清条件下での高い生産細胞系の選択 pSH135でトランスフェクトしたCHO（dhfr-陰性)細胞は、トランスフェリン、
組換えインスリンおよびメトトレキセート(50nM)を補充した無血清選択培地を使
用して、96-ウェルプレートにまいた（ウェルあたり５×105細胞）。選択培地は
ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く。増幅（50および100nMのMTX）から３カ月
後、1G9と名付けた最初の群の１つを震盪フラスコを使用して懸濁培養に適用し
た。高レベルのIL-4dm生産性（〜５pg/c/d）が無血清培地およびトランスフェリ
ンおよび組換えインスリンを補充したアルブミンを含まない培地で少なくとも約
10週間、続いて観察された。
【００２０】 実施例４安定な組込み 実施例２に記載したようにpCIS25DTRでトランスフェクトしたCHO細胞に由来す
る、BDD-FVIIIをスクリーニングするCHOクローンの1つを、選択薬剤（MTX）の不
在下でその生産安定性について試験した。このクローンはMTXを欠く培地中で６
カ月間の成長期間中、BDD-FVIIIを分泌し続けた。このクローンに由来するすべ
ての単一細胞クローンも選択陽性であった。このような結果はEBV-TR配列を含む
ベクターの組込みが安定な組込みであることを示している。
【００２１】 結論 高レベルのタンパク質を分泌する安定な細胞系の誘導化は大変単調で、しかも
労力を要する仕事である。これは少なくとも一部は目的とする遺伝子の安定な組
込みおよび増幅の機会の低さによる。高い分泌コロニーを得るためには、一般に
多数の薬剤耐性コロニーをスクリーニングする必要がある。したがって我々は本
明細書で、EBV-TR配列を有するベクターが増大された薬剤選択比をもたらすこと
を記載し、これはトランスフェクトされた遺伝子の高い組込み率を示している。
表１に示すように、トランスフェクトされた細胞は無血清条件下でも選択および
増幅することが可能であった。
【００２２】 上記実施例は本発明を具体的に説明することを意図しており、当業者には変更
も生じるだろうと思われる。従って本発明の範囲は、前記特許請求の範囲によっ
てのみ限定されるべきである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
【外１】
【図２】 選択比を比較するために使用する発現ベクターを示す。すべてのプラスミドは
pBR322骨格に基づき構築し、そしてdhfr発現単位を含む。目的タンパク質をコー
ドするすべての遺伝子は、CMVエンハンサー／プロモーター(CMVe/p)の制御下に
あり、５'-イントロン（MISまたはCIS）をこの遺伝子の５'-末端に配置した。
【図３】 CHOおよびHKB細胞を使用して４回繰り返した一過性のトランスフェクションア
ッセイにおいて、pSH134およびpSH135に由来するIL-4ムテインの発現に及ぼすEB
V-TRの効果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 DA02 EA04 GA11 4B065 AA90 AB04 BA02 CA44

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物細胞に発現ベクターを導入する方法において： ａ）細胞による発現ベクターの取り込みを可能とする条件下で、哺乳動物細胞を
    発現ベクターと接触させる工程であって、発現ベクターが異種タンパク質をコー
    ドする第１DNA配列、増幅可能なマーカーをコードする第２DNA配列、およびベク
    ターDNAのゲノムDNAへの組込み頻度を増強させる第３DNA配列を含んで成るもの
    である工程、 ｂ）工程ａ）から得た細胞を、耐性細胞の選択を可能とする条件下で選択培地中
    で成長させる工程；および ｃ）工程ｂ）から得た異種タンパク質を発現する細胞を回収する工程、 を含んで成る上記方法。
  2. 【請求項２】 ｄ）工程ｃ）で回収した細胞を、さらに選択を行うことを可
    能とする条件下で成長させる工程をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 第３DNA配列がEBV-TR配列である、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 第３配列が、図１（配列番号：１）に記載された配列を含ん
    で成る、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 第２DNA配列が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン シ
    ンテターゼおよび多剤耐性遺伝子から成る群から選択される増幅可能なマーカー
    をコードする、 請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 第１DNA配列が、第VIII因子、第VIII因子の誘導体、インタ
    ーロイキン−４およびIL-4の誘導体から成る群から選択される異種タンパク質を
    コードする、 請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 工程ｂ）およびｄ）の少なくとも１工程を無血清条件下で行
    う、請求項２に記載の方法。
  8. 【請求項８】 異種タンパク質をコードする第１DNA配列、増幅可能なマー
    カーをコードする第２DNA配列、およびEBV-TR配列を含んで成る第３DNA配列を含
    んで成る発現ベクター。
  9. 【請求項９】 第３配列が図１（配列番号：１）に記載されている、請求項
    ８に記載の発現ベクター。
  10. 【請求項１０】 増幅可能なマーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼである、
    請求項９に記載の発現ベクター。
  11. 【請求項１１】 EBV-TR配列を含んで成るベクターでトランスフェクトした
    CHO細胞から誘導されるIL-4dmを発現するCHOクローン。
  12. 【請求項１２】 1G9と命名された請求項１１に記載の細胞系。
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