JP2002526033A - ディスインテグリン相同体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、zdint1、すなわちディスインテグリンプロテアーゼの新規メンバーのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド分子に関する。それらをコードするポリペプチド及びポリヌクレオチドは、細胞−細胞相互作用調節性であると思われ、そして出産及び治療のために使用され得る。本発明はまた、zdint1ポリペプチドに対する抗体も包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： ディスインテグリン（disintegrin）は、種々の細胞、例えば、血小板、線維
芽細胞、腫瘍、内皮、筋肉、ニューロン、骨及び精子細胞の表面上の細胞表面分
子、例えばインテグリン（integrin）を結合することが示されている。ディスイ
ンテグリンは、細胞−マトリックス及び細胞−細胞相互作用を調べるためのユニ
ーク且つ潜在的に有用な手段である。さらに、それらは、一定の腫瘍細胞のそれ
らの抗−付着性、抗−移動性及び抗脈管形成活性のために抗血栓及び抗転移剤の
開発において有用である。

【０００２】 ディスインテグリンドメインを有するタンパク質のファミリーは、ADAM（メタ
ロプロテアーゼ及びディスインテグリン）、MDC（メタロプロテアーゼ/ディスイ
ンテグリン/システインに富んでいる）及びSVMP（ヘビ毒メタロプロテアーゼ）
を包含する。

【０００３】 ADAMの総説については、Wolfsberg and White, Developmental Biology, 180:
389-401, 1996を参照のこと。ADAMは、ヘテロダイマー複合体において、独立し
た機能単位として、又はこのファミリーの他のメンバーと共に存在することが示
されている。そのファミリーのいくつかのメンバーは、選択のスプライシングに
起因する多重イソ形で存在する。ADAMタンパク質は、付着性及び抗−付着性機能
を有することが示されている。ADAMファミリーのいくつかのメンバーは、非常い
特異的な組織分布を有し、そして他は広く分布されている。このファミリーのす
べてのメンバーが、それらの遺伝子構造に共通するドメインにより表される可能
性ある機能のすべてを表すことができるとは限らない。

【０００４】 ADAMは、プロペプチドドメイン、メタロプロテアーゼ様ドメイン、ディスイン
テグリン−様ドメイン、システインに富むドメイン、EGF−様ドメイン及び細胞
質ドメインを有することによって特徴づけられる。 このファミリーのプロトタイプの例は、ADAM12であり、メルトリンαとしても
知られているADAM12は切断されたイソ形及び十分な長さのイソ形を有し、そして
筋肉細胞融合及び分化に包含される（Gilpinなど., J. Biol. Chem. 273: 157-1
66, 1998）。

【０００５】 このファミリーのもう１つのプロトタイプの例は、ADAM２とヘテロダイマーを
形成し、そして精子/卵融合に関与するADAM１である（Wolfsberg and White, 前
記）。

【０００６】 SVMPファミリーは、３種の種類（P−１，P−II及びP−III）により表される。
すべての３種の種類は、プロペプチド及びメタロプロテアーゼドメインを含む。
P−II及びP−III種類はまた、ディスインテグリンドメインを含み、そしてP−II
I種類はさらに、システインに富んでいるドメインを含む。それらのドメインは
、ADAMにおいて見出されるそれらのドメインに対して配列において類似する。SV
MPファミリーのいくつかのメンバーは、保存された“RGD”アミノ酸配列を有す
る。

【０００７】 このトリペプチドは、そのコンホメーションが活性化された血小板へのフィブ
リノーゲンの結合を破壊するヘアーピンループを形成することが示されている。
このRGD配列は、P−II SVMPにおけるRSE，MVD, MSE及びKGDにより、及びP−III
SVMPにおけるMSEC, RSEC, IDDC及びRDDC（カルボキシ末端システイン残基と共に
トリペプチド）により置換され得る。従って、それらの配列は、P−II及びP−II
I SVMPにおけるインテグリン結合を担当することができる。

【０００８】 SVMPのプロトタイプの例は、ディスインテグリンドメインを通して、続いてβ ₁ サブユニット（GPIIA）のタンパク質分解を通して血小板α₂サブユニット（GPI
a）に結合することによって血小板凝集を介在するジャラルハギン（jararhagin
）である（Huang and Liu, J. Toxicol-Toxin Reveiws 16: 135-161, 1997）。

【０００９】 メタロプロテアーゼ/ディスインテグリン/システインに富んでいるファミリー
のタンパク質は、受精及び筋肉融合における役割から、形質膜からのTNFα開放
、細胞内タンパク質分解及びニューロン発育における必須機能までの種々の仕事
に関与している（Blovel, Cell 90: 589-592, 1997）。このファミリーはまた、
上記のようなメタロプロテアーゼ、ディスインテグリン及びシステインに富んで
いるドメインによって特徴づけられる。 本発明は、新規ディスインテグリン相同体及び関連する組成物を提供し、それ
らの使用は、本明細書における教示から当業者に明らかであろう。

【００１０】 発明の要約： １つの観点において、本発明は、配列番号２の１４個のアミノ酸の連続配列を
含んで成る、単離されたポリペプチド分子を提供する。１つの態様においては、
ポリプチド分子は、配列番号２の残基437〜450を含んで成る。もう1つの態様に
おいては、ポリペプチド分子は、82〜232個の長さのアミノ酸である。さらなる
態様においては、ポリペプチド分子は、配列番号２の残基164〜382；配列番号２
の残基383〜464；及び/又は配列番号２の残基465〜696である。

【００１１】 もう１つの態様においては、本発明は、 （ａ）配列番号２の残基164〜382を含んで成るポリペプチド分子； （ｂ）配列番号２の残基383〜464を含んで成るポリペプチド分子； （ｃ）配列番号２の残基465〜696を含んで成るポリペプチド分子； （ｄ）配列番号２の残基438〜449を含んで成るポリペプチド分子； （ｅ）配列番号２の残基164〜464を含んで成るポリペプチド分子； （ｆ）配列番号２の残基164〜696を含んで成るポリペプチド分子； （ｇ）配列番号２の残基383〜696を含んで成るポリペプチド分子； （ｈ）配列番号２の残基164〜449を含んで成るポリペプチド分子； （ｉ）配列番号２の残基438〜696を含んで成るポリペプチド分子；及び （ｊ）配列番号２の残基１〜696を含んで成るポリペプチド分子； から成る群から選択された、単離されたポリペプチド分子を提供する。

【００１２】 もう1つの態様においては、配列番号２の１４個のアミノ酸の連続配列を含んで
成るポリペプチド分子をコードする単離されたポリヌクレオチド分子が提供され
る。1つの態様においては、前記ポリペプチド分子は、配列番号２の残基437〜45
0を含んでなる。もう1つの態様においては、前記ポリペプチド分子は、82〜232
個の長さのアミノ酸である。さらなる態様においては、前記ポリペプチド分子は
、配列番号２の残基146〜382；配列番号２の残基383〜464；及び／又は配列番号
２の残基465〜696である。

【００１３】 もう1つの態様においては、本発明は、 （ａ）配列番号２の残基164〜382を含んでなるポリペプチド分子； （ｂ）配列番号２の残基383〜464を含んでなるポリペプチド分子； （ｃ）配列番号２の残基465〜696を含んでなるポリペプチド分子； （ｄ）配列番号２の残基438〜449を含んでなるポリペプチド分子； （ｅ）配列番号２の残基164〜464を含んでなるポリペプチド分子； （ｆ）配列番号２の残基164〜696を含んでなるポリペプチド分子； （ｇ）配列番号２の残基383〜696を含んでなるポリペプチド分子； （ｈ）配列番号２の残基164〜449を含んでなるポリペプチド分子； （ｉ）配列番号２の残基438〜696を含んでなるポリペプチド分子；及び （ｊ）配列番号２の残基１〜696を含んでなるポリペプチド分子； から成る群から選択されたポリペプチド分子をコードする単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。

【００１４】 もう1つの態様においては、第１ゼグメント及び第２セグメントを有する融合
タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供されここで、前記第
１セグメントがプロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードする第１ポ
リペプチドを含んで成り、そして前記第２セグメントが配列番号２の残基383〜4
64の間のアミノ酸の連続配列を有するポリペプチドをコードする第２ポリヌクレ
オチドを含んで成り、そして前記第１セグメントが前記第２セグメントのアミノ
末端側に位置を定められている。1つの態様においては、プロテアーゼドメイン
は、ａ）多くのディスインテグリンプロテアーゼであるプロテアーゼドメイン；
及びｂ）配列番号２のアミノ酸残基164〜382に対して少なくとも80％同一である
プロテアーゼドメインから成る群から選択される。

【００１５】 もう1つの態様においては、本発明は、 ａ）配列番号２の残基383〜464に対して少なくとも80％同一であるポリペプチ
ド分子をコードするポリヌクレオチド分子；及び ｂ）上記ａ）に対して相補的であるポリヌクレオチド分子から成る群から選択
される。 1つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、 ａ）配列番号２の残基383〜696に対して少なくとも80％同一であるポリペプチ
ド分子をコードするポリヌクレオチド分子；及び ｂ）上記ａ）に対して相補的であるポリヌクレオチド分子から成る群から選択
される。 さらなる態様においては、ポリヌクレオチド分子は、 ａ）配列番号２の残基１〜696に対して少なくとも80％同一であるポリペプチ
ド分子をコードするポリヌクレオチド分子；及び ｂ）上記ａ）に対して相補的であるポリヌクレオチド分子； から成る群から選択される。

【００１６】 もう1つの態様においては、次の作用可能に連結された要素： ａ）転写プロモーター； ｂ）請求項１記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント；及び ｃ）転写ターミネーター； を含んで成る発現ベクターが提供される。 もう1つの態様においては、本発明は、発現ベクターを導入されている、DNAセ
グメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞を提供する
。

【００１７】 もう1つの態様においては、本発明は、ポリペプチドの製造方法を提供し、こ
こで前記方法は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細
胞を培養し；そして前記ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る。 もう1つの態様においては、１４個のアミノ酸の連続配列を含んでなるポリペ
プチドポリペプチドと、細胞とをインビボ及びインビトロで組合すことによって
、細胞−細胞相互作用を調節するための方法が提供される。1つの態様において
は、細胞は、ａ）心臓からの組織；ｂ）脳からの組織；ｃ）脊髄からの組織；及
びｄ）骨格筋からの組織から成る群から選択された組織に由来する。

【００１８】 1つの態様においては、本発明は、ａ）配列番号７；ｂ）配列番号８；ｃ）配
列番号９；ｄ）配列番号１０；及びｅ）配列番号１１、から成る群から選択され
るアミノ酸の連続配列を含んで成る単離されたポリペプチド分子を提供する。 もう1つの態様においては、ａ）配列番号７；ｂ）配列番号８；ｃ）配列番号
９；ｄ）配列番号１０；及びｅ）配列番号１１から成る群から選択されるアミノ
酸の連続配列を含んで成る単離されたポリペプチド分子をコードする単離された
ポリヌクレオチド分子が提供される。 本発明のそれらの及び他の観点は、次の発明の特定の記載及び添付図面から明
らかに成るであろう。

【００１９】 発明の特定の記載： 本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助ける
ことができる： “親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質へ
の第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに
結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される
。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタン
パク質が親和性標識として使用され得る。

【００２０】 親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,
EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991)
, グルタチオンＳ トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 19
88）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlag（商標）ペプチド（Hoppなど., B
iotechnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他
の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Prot
ein Expression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標
識をコードするDNAは、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ
; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入
手できる。

【００２１】 用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の
遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対
立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現
象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされ
たポリペプチドにおける変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子
の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書におい
て使用される。

【００２２】 用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位
置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それ
らの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は
一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末
端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置
するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではな
い。

【００２３】 用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される
安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又
はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の
典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプ
テン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同
様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その
相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０⁹Ｍ^-1の結合親和性を有する。

【００２４】 用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列
に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5’ ATGCAC
GGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。 用語“contig ”とは、他のポリヌクレオチドに対する一連の連続した同一の
又は相補的な配列を有するポリヌクレオチドを示す。連続した配列とは、ポリヌ
クレオチドの全体において、又はその一部に沿って、一定の長さのポリヌクレオ
チド配列を“オーバーラップ”すると言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列
5’-ATGGCTTAGCTT-3’ に対する代表的なcontig とは、5’-TAGCTTgagtct-3’及
び3’-gtcgacTACCGA-5’である。

【００２５】 用語“〜に対応する”とは、配列におけるアミノ酸残基の位置に適応される場
合、配列が最適に整列されている場合の多くの配列における対応する位置を意味
する。 用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオ
チドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示
す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じ
アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAsp
をコードする）。

【００２６】 用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能
に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又
は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロ
モーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選
択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含す
る。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は
両者の要素を含むことができる。

【００２７】 用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオ
チドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所
望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成シス
テム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された
分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを
含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を
含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロ
モーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業
者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を
参照のこと)。

【００２８】 “単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、
例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク
質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチ
ド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、
すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを
供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”と
は、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化
された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。

【００２９】 “作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグ
メントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロ
モーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進
行するよう配列されることを示す。 用語“オルト体（orthology）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタ
ンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパ
ク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。 “パラ体（paralogs）”とは、生物によって製造される、異なっているが，し
かし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じる
と思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互い
パラ体である。

【００３０】 “ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリ
ヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロ
で合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレ
オチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド（“nt”）、又はキロ塩
基（“kb”）として表される。

【００３１】 ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記
載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すため
に使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本
鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端
が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、
二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そ
のような対になっていない末端は、長さ20ntを超えない。

【００３２】 “ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもい
ずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約
１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及
される。 用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロ
モーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずし
もそうではない。

【００３３】 “タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。
タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭
水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加さ
れ、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主
鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特
定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。

【００３４】 用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細
胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、
細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに
関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ドメイン又は多ペプチド構
造により特徴づけられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェク
タードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメ
ーション変化をもたらす。

【００３５】 この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に
連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、AMP生成の上昇、
細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分
解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シ
トソール性又は核性であり；モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−
アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容
体、IL−３受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体
及びIL―6受容体)であり得る。

【００３６】 用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより
大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペ
プチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポ
リペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常
分解される。

【００３７】 用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を
示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA
分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライ
シング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写される
いくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異
体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタ
ンパク質を示すために本明細書において使用される。

【００３８】 不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子
量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が
“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確
には±１０％であることが理解されるであろう。 本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれ
る。

【００３９】 本発明は、新規cDNA配列（配列番号１）、及びディスインデグリン−様ファミ
リーメンバー（ADAM, SVMP及びMDC；ディスインテグリンプロテアーゼ又は“DPs
”として本明細書において言及される）に対する相同性を有する対応するポリペ
プチド（配列番号２）の発現に基づかれている。例えば、Blobel, Cell 90: 589
-592, 1997及びWolfsberg and White, Developmental Biology 180: 389-401, 1
996を参照のこと。ディスインテグリンは、例えば抗凝集、受精、筋肉融合、結
合組織障害、軟膏形成、関節炎、転移及び神経発生に関与している。

【００４０】 それらのポリペプチドの分泌シグナル（また、リーダー配列、プレプロ配列又
はプレ配列としても知られている）ドメインは、細胞の分泌路を通してポリペプ
チドを方向づけ、そこでそれは合成される。分泌シグナル及びプロペプチドドメ
インは、十分な長さの分子から分解され、zdint1ポリペプチドの成熟形がもたら
される。プロテアーゼドメインは、活性的であっても又は不活性的であっても良
い。ディスインテグリンファミリーのいくつかのメンバーは、システインに富ん
でいるドメインにおける“システイン−スイッチ”により調節され得る“活性”
亜鉛触媒部位を有する。

【００４１】 “活性”プロテアーゼドメインを有するファミリーメンバーに例は、それぞれ
、精子/卵融合及びミエリン鞘基本タンパク質の分解に包含されるADAM1及びADAM
10である。このファミリーの他のメンバーは、そのような触媒部位を有さず、そ
して“不活性”である。不活性プロテアーゼドメインを含むファミリーメンバー
の例は、腫瘍抑制に包含され得るADAM11である。不活性プロテアーゼドメインを
有することが知られている他のタンパク質ファミリーは、セリンプロテアーゼで
ある。

【００４２】 このタンパク質の付着性（ディスインテグリン）ドメインは、そのディスイン
テグリンの特異性に依存して、多くの細胞の表面上にインテグリンドメインを結
合する。このインテグリンドメイン内の予測される結合部位は、しばしば、約13
個のアミノ酸を含んで成るアミノ酸ループである。折りたたみに基づくこの配列
のコンホメーションは、その先端でアミノ酸配列を表すヘアーピンループをもた
らす。この配列はしばしば、“RGD”であるが、しかし種々の他のアミノ酸残基
により置換され得る（Wolfsberg and White, 前記；及びJia, J. Biol. Chem. 2
72: 13094-13102, 1997）。

【００４３】 それらの配列の多様性は、１）すべてのディスインテグリンドメインがインテ
グリンのためのリガンド（又は他の細胞表面受容体）として作用するとは限らず
；２）異なった配列を有するディスインテグリンドメインが異なったタイプの細
胞表面受容体に結合し；又は３）ディスインテグリン構造ループの重要な部分が
その構造であって、その配列ではなく、そして従って、ディスインテグリンドメ
インの特定種類のための受容体が多数のディスインテグリン結合ループ配列を認
識できることに影響を及ぼすことができる。ディスインテグリンドメインは、GP
IIb/IIIa（フィブロネクチン受容体）及び/又はGPIa/IIa（コラーゲン受容体）
を結合することによる血小板凝集の阻害を包含する細胞−細胞相互作用を担当で
きることが示されている。

【００４４】 多くのディスインテグリンファミリーメンバーは、融合ドメイン、すなわち約
23個のアミノ酸の比較的疎水性のドメインを有する。このドメインは、ADAMファ
ミリーメンバーのいくつか内に存在し、そして細胞−細胞融合、及び特に精子/
卵融合、及び筋肉融合に関与することが示されている。 システインに富んでいるドメインは、DPファミリーメンバーにおいて変化し、
そしてインテグリンにインテグリン−結合領域を構造的に提供することに関与し
ているように思われる。 多くのDPファミリーメンバーは、細胞膜にポリペプチドを結合するように作用
するトランスメンブランドメインを有する。

【００４５】 ディスインテグリンファミリーメンバーのシグナル化ドメインは、リン酸化の
ための長さ及び部位において保存される傾向がある。しかしながら、その他に、
それらはアミノ酸組成においてユニークである傾向がある。いくつかのディスイ
ングリンファミリーメンバーは、Abl, Src, 及び/又はSrc−関連SH3ドメイン中
のSH3ドメインに結合することによってシグナル化することができる。

【００４６】 本発明のzdint1ポリペプチドは、DPファミリーの新規メンバーである。トラン
スメンブランドメインを含んで成るzdint1のイソ形の存在は、zdint1がシグナル
化ドメインを含む選択的にスプライシングされた変異体を有するであろうことを
示す。 本発明の新規zdint1ポリペプチドコードのポリヌクレオチドが最初に、Blast
類似性調査を行うことによって同定された。配列番号１のヌクレオチド1097〜14
15に対応する、発現された配列標識が、幼児脳プラスミドライブラリーから単離
されたクローンを得るために使用された。

【００４７】 zdint1の推定されるアミノ酸配列（配列番号２）の試験は、次のドメインの同
定を可能にした：配列番号２の残基163で終結するプロペプチド配列；配列番号
２の残基164〜382のプロテアーゼ配列；配列番号２の残基383〜464のディスイン
テグリン配列及び配列番号２の残基465〜696のシステインに富んでいる配列。デ
ィスインテグリンドメイン内に、“ディスインテグリンループ”配列、すなわち
配列番号２の残基438〜449が存在する。配列番号２の残基443〜445に対応するア
ミノ酸配列、すなわちECDは、DPのいくつかの他のメンバーの“RGD結合ループ”
に類似する。

【００４８】 zdint1の組織分布の分析が、Human Multiple Tissue, Master ドット、及びヒ
ト血管ブロットを用いて、ノザンブロット技法により行われた。約3.0kb，4.4kb
及び7.5kbの３種の転写体サイズの強いシグナルが、Multiple Tissue ノザンブ
ロットに基づいて、心臓において観察された。同じ転写体サイズの弱いシグナル
が、脳及び脊髄において観察された。それらの３種の転写体サイズの弱いシグナ
ルが骨格筋において観察された。Master ドットは、脳、心臓、胎児脳及び胎児
心臓において強いシグナルを示した。ヒト血管ブロットは、ヒト大動脈内皮細胞
において３〜3.5kbで強いシグナル、及び大動脈平滑筋細胞及び正常ヒト肺線維
芽細胞において弱いシグナルを示した。

【００４９】 zdint1のプロテアーゼドメインは、ポリペプチドレベルで、最も近似するファ
ミリーのプロテアーゼドメイン、すなわちADAM11に対して49.5％の同一性、及び
ポリヌクレオチドレベルで58％の同一性を有する。zdint1の ディスインテグリ
ンドメインは、ポリペプチドレベルで、最も近似のファミリーのディスインテグ
リンドメイン、すなわちADAM11に対して66.7％の同一性、及びポリヌクレオチド
レベルで64.3％の同一性を示した。ADAM11の発現は、乳癌組織において低下する
ことが示され、そして従って、乳癌における腫瘍サプレッサーとして作用するこ
とが示される（Emiなど., Nature Gen. 5: 151-157, 1993）。ADAM11は、選択の
スプライシングの結果として複数のイソ形を有することが示された。

【００５０】 DPにおける選択のスプライシングの例であるもう１つのタンパク質は、ADAM12
、すなわちメルトリンαである。プロペプチド及びメタロプロテアーゼドメイン
を欠いている、この分子の切断された形は、インビボで、異所性筋肉形成に関与
しているが、しかしインビトロにおいてはそうではなく、このことは、この遺伝
子を発現する細胞が隣接する先祖細胞に対して作用する成長因子を生成すること
を示唆する。 他のADAMは、血管形成、急性冠状動脈症候群、ステント上の再狭窄の予防、及
び手術後の過剰の付着の予防、転移の予防、及び特定タンパク質、例えばアミロ
イド前駆体タンパク質の分解のために考慮されて来た。

【００５１】 ポリヌクレオチド： zdint1のディスインテグリンドメインにおける高く保存されたアミノ酸は、新
規ファミリーメンバーを同定するための手段として使用され得る。例えば、逆転
写−ポリメラーゼ鎖反応（RT−PCR）は、種々の組織源又は細胞系から得られたR
NAからの保存されたディスインテグリンドメインをコードする配列を増幅するた
めに使用され得る。特に、zdint1配列から企画された高い宿主のプライマーが２
の目的のために有用である。

【００５２】 本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるzdint1ポ
リペプチドをコードするDNA及びRNA分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの
縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であ
ることを容易に認識するであろう。配列番号３は、配列番号２のzdint1ポリペプ
チドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。当業者はまた、配
列番号３の変性配列がUとTとを置換することによって、配列番号2をコードする
すべてのRNA配列も供給することを理解するであろう。

【００５３】 従って、配列番号３のヌクレオチド１-2088を含んで成るzdint1ポリペプチド
−コードのポリヌクレオチド及びそれらのRNA相当物は、本発明により包含され
る。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３内に使用される1
文字コードを示す。“決定”は、コード文字により示されるヌクレオチドである
。“補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードY
はC又はTのいずれかを示し、そしてその補体RはA又はGを示し、AはTに対して相
補的であり、そしてGはCに対して相補的である。

【００５４】

【表１】

【００５５】 与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号3に使
用される縮重コドンが表２に示される。

【表２】

【００５６】 当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可
能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するで
あろう。例えば、セリン（WSN）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギ
ニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN）のための縮重コ
ドンは、ある環境下で、セリン（AGY）をコードすることができる。類似する関
係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って
、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配
列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列へ
の参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列
は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。

【００５７】 当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するで
あろう。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980;
Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 199６; Wain−Hobson、など.,Gene 1
3：355−64，1981；Grosjean and Fiera，Gene 18：199−209、1982；Holm,N
uc．Acids Res．14：3075−87、1986；Ikemura，Ｊ．Mol．Biol．158：573−97
，1982を参照のこと。

【００５８】 本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択
的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸
をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言
及する技術的用語である(表２を参照のこと)。例えば、アミノ酸トレオニン（Th
r）は、ACA、ACC、ACG、又はACTによりコードされるが、しかし哺乳類細胞にお
いては、ACCが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば
昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったThrコドンが好ましい
。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法に
より、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。

【００５９】 例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内
でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を
増強する。従って、配列番号３に開示される縮重コドン配列は、当業界において
通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種において
ポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む
配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される
官能性について試験され得る。

【００６０】 本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号
１の類似するサイズの領域又はそれに対して相補的な配列に対して、緊縮条件下
でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度
及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Tm）よりも約５℃低くあるよう選択さ
れる。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダ
イズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型的な緊縮条件は
、塩濃度がpH7で、約0.03Mまでであり、そして温度は少なくとも約60℃である。

【００６１】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。DNA及びRNA
を調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、RNA
は、多量のzdint1 RNAを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織
及び細胞は、ノザンブロット（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201,
1980）により同定され、そして心臓、脳、骨格筋、脊髄、胎児心臓及び胎児脳
を包含する。

【００６２】 全RNAは、グアニジウム Hcl抽出、続くCsclグラジエントにおける遠心分離に
よる単離により調製され得る（Chirgwinなど.,Biochemistry 18:52−94, 1979）
。ポリ（A）⁺ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 1408−
1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA(ｃDNA)は、既知
の方法を用いて、ポリ（A）⁺ RNAから調製される。他方では、ゲノムDNAが単離
され得る。次に、zdint1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えば
ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離さ
れる。

【００６３】 zdint1をコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により
得られる。相補的DNA（cDNA）クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途（
例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノムクローンを
使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようcDNAクローンを修飾
することが好ましい。cDNA及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知
られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプロ
ーブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包
含する。発現ライブラリーは、zdint1に対する抗体、受容体フラグメント、又は
他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。

【００６４】 本明細書に開示されるzdint1ポリヌクレオチド配列はまた、zdint1遺伝子の5
’非コード領域をクローン化するためのプローブ又はプライマーとしても使用さ
れ得る。ノザンブロットによりzdint1について観察される組織−特異的発現の観
点においては、この遺伝子領域は、心臓−、脳−、脊髄−及び骨格筋−特異的発
現を提供することが予測される。従ってzdint1遺伝子からのプロモーター要素は
、例えば遺伝子療法により処理されたトランスジェニック動物又は患者において
異種遺伝子の組織特異的発現を方向づけるために使用され得る。5’フランキン
グ配列のクローニングはまた、アメリカ特許第5,641,670号に開示されるように
、“遺伝子活性化”によりzdin1タンパク質の生成も促進する。

【００６５】 手短に言及すれば、細胞における内因性zdin1遺伝子の発現は、少なくとも１
つの標的配列、調節配列、エキソン及び対合されていないスプライスドナー部位
を含んで成るDNA構造体を、zdint1遺伝子座中に導入することによって変更され
る。標的化配列は、内因性zdint1遺伝子座と前記構造体との相同組換えを可能に
するzdint1 5’非コード配列であり、それにより、構造体内の配列が内因性zdin
t1コード配列と作用可能に結合されるようになる。この態様においては、内因性
zdint1プロモーターは、増強された組織特異的、又は他方では、調節された発現
を提供するために他の調節配列により置換され、又はそれらの配列により補充さ
れ得る。

【００６６】 本発明のポリヌクレオチドはまた、DNA合成機械を用いても合成され得る。現
在、選択の方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖DN
Aが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相
補的鎖が別々に製造される。短い遺伝子（60〜80bp）の生成は技術的に直接的で
あり、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され
得る。

【００６７】 しかしながら、より長い遺伝子（300bp以上）の生成に関しては、化学的にDNA
合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100％ではないので、
特定の方法が所望される。この問題を克服するためには、合成遺伝子（二本鎖）
が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でア
センブルされる。Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles
& Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994);
Itakura など., Annu.Rev. Biochem. 53: 323-56, 1984及びClimie など., Proc
. Natl. Acad. Sa. USA 87: 633-7, 1990を参照のこと。

【００６８】 本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオ
チドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及
び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ
、馬及び他の霊長類リガンドからのzdint1ポリペプチドである。ヒトzdint1ポリ
ペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給
される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。

【００６９】 例えば、ｃDNAは、zdint1を発現する組織又は細胞型から得られるｍRNAを用い
てクローン化され得る。そのような組織又は細胞形は、例えば心臓、脳、脊髄及
び骨格筋を包含する。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画さ
れたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。
次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製される。次に、zdi
nt1ポリペプチドコードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃ
DNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより
、プローブすることによって単離され得る。

【００７０】 ｃDNAはまた、本明細書に開示される代表的なヒトzdint1ポリヌクレオチド配
列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）（Mullis,
アメリカ特許第4,683,202号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法に
おいては、ｃDNAライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクト
するために使用され、そして興味あるｃDNAの発現がzdint1ポリペプチドに対す
る抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム クローンの単離に適
用され得る。

【００７１】 当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトzdint1の単一の対立遺伝子を表
し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測される
ことを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って
、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによって
クローン化され得る。配列番号１に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体、例え
ばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更を
もたらすそれらの変異体は、配列番号２の対立遺伝子変異体であるタンパク質と
同じように、本発明の範囲内である。

【００７２】 zdint1ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから
生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと
同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及
びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異な
った個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによっ
てクローン化され得る。

【００７３】 本発明はまた、配列番号２ポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実質
的に同一である単離されたzdint1ポリペプチドも提供する。用語“実質的に同一
である”とは、配列番号２に示される配列又はそれらのオルト体に対して、50％
，好ましくは60％、より好ましくは少なくとも70％及びさらにより好ましくは80
％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される
。そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２又はそのオルト体に
対して、少なくとも 90％、及び最も好ましくは95％又はそれ以上同一であろう
。％配列同一性は、従来の方法により決定される。

【００７４】 例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikof
f and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照の
こと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティ
ー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コード
により示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“blosum
62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される
。次に、％同一性が次のようにして計算される：

【００７５】

【数１】

【００７６】

【表３】

【００７７】 ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて
、類似する方法により決定される。 当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズ
ムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査
アルゴリズムは、１つのアミノ酸配列及び推定上の変異体のアミノ酸配列により
供給される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。
前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載
される。

【００７８】 手短には、FASTAがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミ
ノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ktup変数が１であ
る場合）又は対の同一性（ktup＝2である場合）のいずれかを有する試験配列に
より共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度
の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対
合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域
の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。

【００７９】 “カットオフ”値（配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算
される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられ
た初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結
合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配
列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch
アルゴリズム（Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers
, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974）の変法を用いて整列される。

【００８０】 FASTA 分析のための好ましいパラメーターは次のものである：ktup＝１、ギャ
ップ開始ペナルティー＝10、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリック
ス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 (前記)
に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログラ
ム中に導入され得る。

【００８１】 FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性
を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は
、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは３〜６
、最も好ましくは３であり得る。

【００８２】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ
酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。BLOSUM62表は、
関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパ
ク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリ
ックスである［Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 109
15 (1992) ］。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入さ
れ得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。

【００８３】 本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よ
りも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は
、その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性
である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１
（例えば、１，２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ま
しくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のBLOSUM62値により特
徴づけられる。

【００８４】 変異体zdint1ポリペプチド及び実質的に相同のzdint1ポリペプチドは、１又は
複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それら
の変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク
質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換
；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−
又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜
２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長であ
る。

【００８５】 従って、本発明は、配列番号２の対応する領域に対して少なくとも50％、好ま
しくは少なくとも60％、及びより好ましくは80％同一で配列を含んで成る約383
〜約464のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポ
リペプチドはさらに、zdint1ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解
部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Xa因子分解
部位を含む。

【００８６】

【表４】

【００８７】 本発明はさらに、種々のポリペプチド融合体、及び１又は複数のポリペプチド
融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えば、ディス
インテグリンポリペプチドドメインは、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567
,584号に開示されるように、ニ量体化するタンパク質への融合体として調製され
得る。これに関する好ましいニ量体化するタンパク質は、他のディスインテグリ
ンポリペプチドドメイン又はディスインテグリンポリペプチドドメインフラグメ
ントを包含する。

【００８８】 ディスインテグリンポリペプチドドメイン融合体又はディスインテグリンポリ
ペプチドドメインフラグメント融合体は、種々のマルチマーディスインテグリン
−様類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る
。補助ドメインポリペプチドは、特定細胞、組織又は高分子（例えば、心臓、脳
、脊髄、骨格筋、血小板）にそれらを標的化するために、ディスインテグリンド
メインポリペプチドに融合され得る。

【００８９】 例えば、プロテアーゼポリペプチドドメイン又はプロテアーゼポリペプチドフ
ラグメント又はタンパク質が、標的細胞の表面上のインテグリンポリペプチド又
はインテグリン−様ポリペプチドに特異的に結合する、ディスインテグリンポリ
ペプチドドメイン又はフラグメントにそれを融合することによって予定された細
胞型に標的化され得る。

【００９０】 この場合、ポリペプチド、ポリペプチドドメイン及びタンパク質は、治療又は
診断目的のために標的化され得る。そのようなディスインテグリン又はプロテア
ーゼポリペプチドドメイン又はフラグメントは、複数の成分、例えば精製のため
の親和性標識及び標的化−ディスインテグリンドメインに融合され得る。ポリペ
プチド融合体はまた、特にドメイン間に１又は複数の分解部位を含むことができ
る。Tuanなど., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996を参照のこと。

【００９１】 本発明のポリペプチド融合体は一般的に、約1,500よりも多くないアミノ酸残
基、好ましくは約1,200よりも多くない残基、より好ましくは約1,000よりも多く
ない残基を含み、そして多くの場合、それよりも相当に少ないであろう。例えば
、zdint1ポリペプチドの残基は、E.コリβガラクトシダーゼ（1,021個の残基；C
asadabanなど., J. Bacteriol. 143: 971-980, 1980を参照のこと）、10−残基
スペーサー及び４−残基第Xa因子切断部位に融合され得る。第２の例においては
、zdint1ポリペプチドの残基は、マルトース結合タンパク質（約370個の残基）
、４−残基切断部位及び６−残基ポリヒスチジン標識に融合され得る。

【００９２】 本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天
然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２,４−メタプロ
リン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N
−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシ
ステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミ
ン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−
メチルプロリン、３,３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２
−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニ
ン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。

【００９３】 天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方
法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノ
アシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用
され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔRNAをアミノアシル化するための方法は
、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及
び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリ
ーシステムにおいて実施される。

【００９４】 タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Rovertsonな
ど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman など., Meth. Enzymol. 202:
301,1991; Chung など., Science 259: 806−09, 1993; 及びChungなど., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を参照のこと。第２の方法におい
ては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノアミル化されたサプ
レッサ−ｔRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞
において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991−98, 1996 )。

【００９５】 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸
（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ
酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザ
フェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入
される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存在
するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換
され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変
異誘発と組み合わされ得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403, 19
93)。

【００９６】 限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ
酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、zdint1アミノ酸によ
り置換され得る。 本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている
方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同
定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassな
ど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991）。後者の技法におい
ては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得ら
れる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定す
るために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。

【００９７】 また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
ディスインテグリン−インテグリン又はプロテアーゼ相互作用の部位はまた、推
定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又
は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、de Vos など.
,Science 255: 306−312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899−904,
1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59−64, 1992を参照のこと。必須アミ
ノ酸の同一性は、関連するディスインテグリン−様分子との相同体の分析からも
推定され得る。

【００９８】 複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばRe
idhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer
（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を
用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペ
プチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリー
ンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異
誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。

【００９９】 使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 3
0 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WI
PO公開WO 92／06204号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire な
ど., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。

【０１００】 開示されたzdint1 DNA及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 3
70 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1
994及びWIPO公開WI97／20078により開示されるように、DNA シャフリングを通
して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNAが、ランダムに導入された点
突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリ
ーによるインビトロ相同組換えにより生成される。

【０１０１】 この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親DNAのファミリ
ー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。
所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさら
なる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異に
ついて選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。

【０１０２】 上記に開示されるような突然変異誘発方法は、クローン化された突然変異誘発
リガンドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と
組み合わされ得る。活性ポリペプチド(例えば、ディスインテグリン−細胞表面
結合又はプロテアーゼ活性)をコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細
胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方
法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定
を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。

【０１０３】 本明細書において論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号２の種々のポ
リペプチドフラグメント又は変異体、又は野生型zdint1タンパク質のディスイン
テグリン及び／又はプロテアーゼ活性を保持するそれらのものを同定し、そして
/又は調製することができる。そのようなポリペプチドは、例えば分泌シグナル
、プロペプチドドメイン、プロテアーゼドメイン、トランスメンブランの一部又
はすべて及び細胞ドメインからの追加のアミノ酸、例えば、細胞内シグナル化を
担当するアミノ酸；融合ドメイン；親親和性標識；及び同様のものを含むことが
できる。

【０１０４】 変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのzdint1ポリペプチドに関して
は、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードす
る十分な変性ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。

【０１０５】 タンパク質の生成： 本発明のzdint1ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、生物学的に
活性のフラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構
築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより
形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれら
の細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含す
る。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化された
DNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は
次の文献に開示される：Sambrool など., Molecular Cloning : A Laboratory M
anual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989, 及びAusubel など., eds., Current Protocol in Molecular Biolog
y, John Wiley and Sons, Ins., NY, 1987。

【０１０６】 一般的に本発明のzdint1ポリペプチドをコードするDNA配列は、その発現のた
めに必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プ
ロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常
、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、し
かし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され
得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得
ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベ
クター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くの
そのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手でき
る。

【０１０７】 zdint1ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグ
ナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列とし
ても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、もう
１つの分泌されたタンパク質（例えばt−PA ）に由来し、又は新たに合成され得
る。分泌シグナル配列は、zdint1 DNA配列に作用可能に連結され、すなわち２
つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中
に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。

【０１０８】 分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の5’
側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるDNA配列の他の場所
に位置することもできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Ho
llandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。本発明のポリペプチ
ド及びポリペプチドフラグメントは、生来のシグナル配列の不在下で生物学的に
活性的であると思われる。

【０１０９】 zdint1のプロテアーゼドメインは、異なったプロテアーゼドメインを提供する
異種配列により置換され得る。この場合、融合生成物が分泌され得、そしてzdin
t1のディスインテグリンドメインが上記特定組織にプロテアーゼドメインを向け
ることができる。この置換されたプロテアーゼドメインは、DPタンパク質ファミ
リーにより示されるプロテアーゼドメイン又は他の既知プロテアーゼからのドメ
イン選択され得る。

【０１１０】 培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性DNAを 、
哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランス
フェクション（Wiglerなど., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Som
atic Cell Genetics 7 :603, 1981; Graham など., Virology 52; 456, 1973）,
エレクトロポレーション( Neumann など., EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE
−デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel など., 前記）、及びリポ
ソーム−仲介トランスフェクション（Hawley −Nelson など., Focus 15: 73, 1
993; Ciccarone など.,Focus 15: 80, 1993 ）を包含する。

【０１１１】 培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばlevinson
など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など., アメリカ特許第4,784,950
号; Palmiter など., アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメリカ
特許第 4,656,134 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、COS−
1（ATCC No. CRL 165）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 16
32）、BHK 570 （ATCC No. CRL 10314 ）、293（ATCC No. CRL 1573 ; Graham
など., J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977 ）、及びチャイニーズ ハムスター卵
巣(例えば CHO−K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。

【０１１２】 追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例
えば American Type Culture Collection,Rockville, Marylandから入手できる
。一般的に、強い転写プロモーター、例えばSV−40 又はサイトメガロウィルス
からのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第4,956,288 号を参照の
こと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター
（アメリカ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号）、アデノウィルス主要後期
プロモーターを包含する。

【０１１３】 薬物選択は一般的に、外来性DNAが挿入されている、培養された哺乳類細胞を
選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”
として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある
遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として
言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコ
ードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様の
もの存在下で実施される。

【０１１４】 “増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現
レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトラ
ンスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベル
で生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジ
ヒドロ葉酸レダクターゼである。

【０１１５】 他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロ
マイシン アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。変更された表
現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパ
ク質、例えばCD4, CD8,クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分
類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない
細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。

【０１１６】 他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主とし
て使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのア
グロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes ）の使用は、Sinka
rなど.、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47−58, 1987 により再考されている。
昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Guarino
など.,アメリカ特許第5,162,222号；及びWIPO公開WO94／06463号により公開され
る。

【０１１７】 昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Autographa californica ）核
多角体病ウィルス（AcNPV）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染
され得る。King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Exprossion Syste
m: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O’Reilly, D. R. ., Bacul
ovirus Expression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford Universi
ty Press., 1994; 及びRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Prot
ocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参
照のこと。

【０１１８】 組換えzdint1バキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( Luc
kow, VA, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポ
ゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシス
テムは、Bac−to−Bac ( TM )キット（Life Technologies, Rockville, MD）
として市販されている。

【０１１９】 このシステムは、“bacmid”と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維
持されるバキュロウィルスゲノム中に、ZDINT1 ポリペプチドをコードするDNAを
移動せしめるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFast
BacI (TM ) (Life Technologies )を利用する。Hill−Perkins, M.S. and Posse
e, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. V
irol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and Rapoport, B., J. Bi
ol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。

【０１２０】 さらに、トランスファーベクターは、発現されたzdint1ポリペプチドのC−又
はN−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu エピトープ標識をコードするDNA
とのイン−フレーム融合体を含むことができる（Grussenmeyer, T. など., Peoc
. Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985）。当業界において知られている技法を
用いて、zdint1を含むトランスファーベクターにより、E.コリが形質転換され、
そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的lacZ遺伝子を含むbacmida に
ついてスクリーンされる。

【０１２１】 組換えバキュロウィルスゲノムを含むbacmida DNA が、通常の技法を用いて単
離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（ Spodoptera frugiperda ）細胞
、例えばSf9 細胞をトランスフェクトするために使用される。Zlipolを発現する
組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者に
おいて通常使用される方法により製造される。

【０１２２】 組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ
・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には
、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applicati
on of Recombinant DNA, ASM Prss, Washington, D.C., 1994を参照のこと。も
う１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）に由来するH
igh FiveO（商標）細胞系(Invitrogen)である（アメリカ特許第5,300,435号）。
市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。

【０１２３】 適切な培地は、Sf9細胞のためには、SF900II（商標）(Life Technologies),又
はEST 921（商標）(Expression Systems); 及びT. ni 細胞のためには、Ex−C
ellO405（商標）（JRH Biosciences, Lenza, KS）又はExpress FiveO（商標）(L
ife Technologies )である。細胞は、約２〜５×１０⁵個の細胞〜１〜２×１０⁶ 個の細胞の接種密度から増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、0.
1〜10,より典型的にはほぼ３の感染の多重度（MCI）で添加される。使用される
方法は一般的に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（King, L. A.
and Possee, R. D., 前記; O’Reilly, D. R. など., 前記；Richardson, C. D.
, 前記）。上清液からのzdint1ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載され
る方法を用いて達成され得る。

【０１２４】 菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、
特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）, ピチア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ(pich
ia methanolica) を包含する。外因性DNAによりS. セレビシアエ細胞を形質転
換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawa
saki, アメリカ特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373
号；Brake, アメリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,74
3号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。

【０１２５】 形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物
（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択
される。サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシス
テムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可
能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT
１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びター
ミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311
号；Kingsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第
4,977,092 号を参照のこと）及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子からのも
のを包含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,9
36 号；及び第4,661,454号を参照のこと。

【０１２６】 他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾ
サッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス
・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluy
veromyces fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア
・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolic
a）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マ
ルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知ら
れている。

【０１２７】 例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCr
egg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mckni
ght など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモ
ニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は
、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（N
eurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,53
3号により開示される。

【０１２８】 組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、
WIPO公開WO97／17450, WO97／17451、WO98／02536及びWO９８／02565に開示され
る。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、
好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。
P.メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモ
ーター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ アル
コール利用遺伝子（AUG１又はAUG２）のものであることが好ましい。他の有用な
プロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸デヒドロゲナ
ーゼ（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のものを包含する。

【０１２９】 宿主染色体中へのDNAの組み込みを促進するためには、宿主DNA配列を両端に有
するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア メタ
ノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主
細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシ
ラーゼ（AIRC; EC. 4.1.1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メ
タノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メ
タノール利用遺伝子（AUG１及びAUG２）が欠失されている宿主細胞を使用するこ
とが好ましい。

【０１３０】 分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP４及
びPRB１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、P.メ
タノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミド
の導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは約3.75kV/cmの
電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数を有する、指数的
に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.メタ
ノリカ細胞を形質転換することが好ましい。

【０１３１】 原核宿主細胞、例えば細菌E.コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明
において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクロ
ーン化される外来性DNA配列を発現するための技法は、当業界において良く知ら
れている（例えば、Sambrookなど., 前記を参照のこと）。細菌、例えばE.コリ
においてzdint1ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には
不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に
向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例
えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。

【０１３２】 次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元さ
れた及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶
液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。
後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊
し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収する
ことによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変
性及び再生のための必要性を回避することができる。

【０１３３】 形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の
増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の
方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培
地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須
アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子
又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加
されたDNAを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーによ
り補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における
薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。

【０１３４】 P.メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地に
おいて、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例
えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーショ
ンを提供される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD（２％D−グ
ルコース、２％のBacto（商標）ペプトン（Difco Laboratories, Detroit, MI）
, 1%のBacto（商標）酵母抽出物（Difco Laboratories）, 0.004%のアデニン及
び0.006％のL−ロイシン）である。

【０１３５】 タンパク質の単離： 本発明のポリペプチドを80％以上の純度、より好ましくは90％以上の純度、さ
らに好ましくは95％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子
、特に他のタンパク質及び核酸に対して、99.9％以上の純度であり、そして感染
性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精
製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチド
を実質的に有さない。

【０１３６】 発現された組換え体zdint1ポリペプチド（又はキメラzdint1ポリペプチド）は
、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニ
ウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用され
る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高
性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、
誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、
特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好まし
い。

【０１３７】 典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基によ
り誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl
ブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharrose (Pharm
acia)及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso H
aas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基
材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、
ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用され
る条件下で不溶性である同様のものを包含する。

【０１３８】 それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキ
シル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基よ
り変性され得る。カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロ
キシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラ
ジド活性化及びカルボジイミド カップリング化学物質のためのカルボキシル及
びアミノ誘導体を包含する。

【０１３９】 それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使
用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受
容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特
定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部
決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharma
cia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。

【０１４０】 本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サ
イズ排除、及び親和性クロマトグラフィー（但し、それらだけには限定されなう
）より単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラ
フィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含ん
でなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、
ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される( Sulkowsk
i, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。ヒスチジンに富んでいるタンパク質が
、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックス
に吸着され、そして競争溶出、ｐHの低下、又は強いキレート化剤の使用により
溶出されるであろう。

【０１４１】 他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Methods in
Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, (
ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529−39）。本発明のさらなる態様
においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合
タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成
され得る。

【０１４２】 フラグメント／融合タンパク質： 宿主細胞からのzdint1ポリペプチドの輸送を方向づけるために、zdint1 DNAは
分泌ペプチド、例えばｔ−PA分泌ベプチドをコードする第２DNAセグメントに連
結される。分泌された受容体ポリペプチドの精製を促進するために、C−末端延
長、例えばポリ−ヒスチジン標識、物質P、Flagペプチド（Hoppなど., Bio/Tech
nology 6: 1204-1210, 1988; Eastman Kodak Co., New Haven, CTから入手でき
る)、又は抗体又は他の特異的結合剤が利用できるもう１つのポリペプチそ又は
タンパク質が、zdint1ポリペプチドに融合され得る。

【０１４３】 さらに、当業者において記載される方法に従って、ポリペプチド融合又はハイ
ブリッドzdint1タンパク質は、他のディスインテグリン−様分子（例えば、ADAM
, MDC及びSVMP）、又は異種タンパク質のそれらの領域又はドメインと組合して
、本発明のzdint1の領域又はドメインを用いて構成される（Sambrook など., 前
記；Altschul など., 前記；Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511-5, 1994及び
それらにおける引例）。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きな
ドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッ
ドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリ
ペプチドの組織及び細胞局在せいを変更し、そして未知の構造のポリペプチドに
適用される。

【０１４４】 融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれら
を化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得
る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードす
るポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載さ
れる方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部
又はすべては、本発明のzdint1と、もう１つのファミリーメンバー、例えばADAM
、 MDC及びSVMPからの機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。

【０１４５】 そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されな
い：保存されたモチーフ、例えば分泌シグナル配列、プロテアーゼ、RGD、シス
テイン及びディスインテグリンドメイン。そのような融合タンパク質は、構成さ
れる融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他のディスインテグリン−様
ファミリータンパク質（例えば、ADAM, MDC及びSVMP）と同じか又は類似する生
物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タ
ンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。

【０１４６】 zdint1ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学的合成により調製され
得る。zdint1ポリペプチドはモノマー又はマルチマーであり；グリコシル化され
ても又はグリコシル化されなくても良く；ペギレート化されても又はペギレート
化されなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を包含しても又はしな
くても良い。

【０１４７】 ポリペプチドの化学的合成： zdint1 ポリペプチド、ペプチド、変異体及び/又はそれらのフラグメントはま
た、化学的合成を通して調製され得る。TMLポリペプチドは、モノマー又はマル
チマーであり；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペギ
レート化されても又はペギレート化されなくても良く；アミド化されても又はア
ミド化されなくても良く；硫酸化されても又は硫酸化されなくても良く；そして
初期メチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。例えば、TMLポ
リペプチドはまた、独占的固相合成、部分固相法、フラグメント縮合又は従来の
溶液合成により合成され得る。

【０１４８】 ポリペプチドは、好ましくは、例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21
49, 1963により記載されるように、固相ペプチド合成により調製される。その合
成は、α−アミノ末端で保護されているアミノ酸により実施される。不安定性側
鎖を有する三官能価アミノ酸はまた、ポリペプチドのアセンブリーの間に生じる
所望しない化学反応を妨げるために適切な基により保護される。α−アミノ保護
基は、アミノ末端での続く反応の発生を可能にするために、選択的に除去される
。α−アミノ保護基の除去のための条件は、側鎖保護基を除去しない。

【０１４９】 α−アミノ保護基は、段階的なポリペプチド合成の技術において有用であるこ
とが知られているそれらの基である。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリ
フルオロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳
香族ウレタン型保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換され
たベンジルオキシカルボニル、及び９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル
（Fmoc））、脂肪族ウレタン、保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（
tBoc）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル）、
及びアルカリ型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が包含される
。好ましい保護基は、tBoc及びFmocである。

【０１５０】 選択される側鎖保護基は、カップリングの間、損なわれないまま存続し、そし
てアミノ末端保護基の保護解除の間、又はカップリング状態の間、除去されるべ
きではない。側鎖保護基はまた、最終ポリペプチドを変更しないであろう反応条
件を用いて、合成の完結に基づいて除去できるべきである。TBoc化学においては
、三官能価アミノ酸のための側鎖保護基はほとんどベンジルに基づかれている。
Fmoc化学においては、それらはほとんどtert−ブチル又はトリチルに基づかれて
いる。

【０１５１】 tBoc化学においては、好ましい側鎖保護基は、アルギニンのためにはトシル、
アスパラギン酸のためにはシクロヘキシル、システインのためには４−メチルベ
ンジル（及びアセトアミドメチル）、グルタミン酸、セリン及びトレオニンのた
めにはベンジル、ヒスチジンのためにはベンジルオキシメチル（及びジニトロフ
ェニル）、リシンのためには２−C1−ベンジルオキシカルボニル、トリプトファ
ンのためにはホルミル、及びチロシンのためには２−ブロモベンジルである。

【０１５２】 Fmoc化学においては、好ましい側鎖保護基は、アルギニンのためには２，２，
５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Pmc）又は、２，２，４
，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Pbf）、アス
パラギン、システイン、グルタミン及びヒスチジンのためにはトリチル、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン及びチロシンのためにはtert−ブ
チル、リシン及びトリプトファンのためにはtBocである。

【０１５３】 リンペプチドの合成のためには、リン酸基の直接的又は後アセンブリー組み込
みが使用される。直接的な組み込み法においては、セリン、トレオニン又はチロ
シン上のリン酸基が、Fmoc化学においては、メチル、ベンジル又はtert−ブチル
により、又はtBoc化学においては、メチル、ブチル又はフェニルにより保護され
得る。リン酸保護を伴わないでのホスホトリシンの直接的な組み込みがまた、Fm
oc化学において使用され得る。後アセンブリー組み込み法においては、セリン、
トレオニン又はチロシンの保護されていないヒドロキシル基が、ジ−tert−ブチ
ル−、ジベンジル−又はジメチル−N, N’−ジイソプロピルホスホラミジットに
より固相上で誘導体化され、そして次に、tert−ブチルヒドロペルオキシドによ
り酸化される。

【０１５４】 固相合成は通常、適切な固体支持体にα−アミノ保護された（側鎖保護された
）アミノ酸をカップリングすることによって、カルボキシル末端から実施される
。エステル連鎖が、その結合がクロロメチル、クロルトリチル又はヒドロキシメ
チル樹脂に対して行われる場合に形成され、そしてその得られるポリペプチドは
C−末端で遊離カルボキシル基を有する。他方では、アミド樹脂、例えばベンズ
ヒドリルアミン又はP−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（tBoc化学に関しては
）及びRinkアミド又はPAL樹脂（Fmoc化学に関しては）が使用される場合、アミ
ド結合が形成され、そしてその得られるポリペプチドは、C−末端でカルボキサ
ミド基を有するであろう。

【０１５５】 それらの樹脂は、ポリスチレン又はポリアミドに基づかれても、又は取り扱い
又はリンカーを伴って又は伴わないで、又は結合される第１アミノ酸を伴って又
は伴わないで、ポリエチレングリコール−グラフトされても、商業的に入手でき
、そしてそれらの調製は、Stewartなど., “Solid Phase Peptide Synthesis”
(2^nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984)、及びBayer & Ra
pp Chem. Pept. Prot. 3: 3 (1986)；及びAthertonなど., Solid Phase Peptide
Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989により記載され
ている。

【０１５６】 必要なら、側鎖で及びα−アミノ基で保護されたC−末端アミノ酸が、種々の
活性化剤、例えばジシクロへキシルカルボンジイミド（DCC）、N，N’−ジイソ
プロピルカルボジイミド（DIPCDI）及びカルボニルジイミダゾール（CDI）を用
いて、ヒドロキシルメチル樹脂に結合される。それは、クロロメチル又はクロロ
トリチル樹脂に、そのセシウムテトラメチルアンモニウム塩形で、又はトリエチ
ルアミン（TEA）又はジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在下で、直接的
に結合され得る。アミド樹脂への第1のアミノ酸結合は、カップリング反応の間
のアミド結合形成と同じである。

【０１５７】 樹脂支持体への結合に続いて、αアミノ保護基は、保護化学（例えば、tBoc,
Fmoc）に依存して、種々の試薬を用いて除去される。Fmoc除去の程度は、300〜3
20nmで又は導電性細胞によりモニターされ得る。α−アミノ保護基の除去の後、
残る保護されたアミノ酸は、所望する配列を得るために、必要とされる程度、段
階的に結合される。

【０１５８】 次の種々の活性化剤がカップリング反応のために使用され得る：DCC, DIPCDI
，２−クロロ−１，３−ジメチルイミジウムフルオロホスフェート（CIP）、ベ
ンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニ
ウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）及びそのピロリジン類似体（PyBOP）、
ブロモ−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBroP）、O
−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニ
ウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）及びそのテトラフルオロボレート類似
体（TBTU）又はそのピロリジン類似体（HBPyU）、O−（７−アザベンゾトリアゾ
ール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロ
ホスフェート（HATU）及びそのテトラフルオロボレート類似体（TATU）又はその
ピロリジン類似体（HAPyU）。

【０１５９】 カップリング反応に使用される最も通常の触媒添加物は、４−ジメチルアミノ
ピリジン（DMAP）、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキシ−１，２，
３−ベンゾトリアジン（HODhbt）、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）
及び１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（HOAt）包含する。個々の保
護されたアミノ酸は、過剰（2.0当量以上）で使用され、そしてカップリング通
常、N−メチルピロリドン（NMP）、又はDMF, CH₂C₂又はそれらの混合物において
行われる。カップリング反応の完結の程度は、例えばKaiserなど., Aral. Bioch
em. 34: 595,1970により記載されるように、ニンヒドリン反応により、個々の段
階でモニターされ得る。

【０１６０】 所望するペプチドの完全なアセンブリーの後、ペプチド樹脂が適切なスキャベ
ンジャーを含む試薬により切断される。Fmocペプチドは通常、切断され、そして
スキャベンジャー（例えばH₂O、エタンジチオール、フェノール及びチオアニゾ
ール）を含むTFAにより保護される。TBocペプチドは通常、切断され、そして樹
脂からポリペプチドを分解し、側鎖保護基のほとんどを除去する液体HFにより、
−５〜0℃で１〜２時間保護解除される。スキャベンジャー、例えばアニゾール
、ジメチルスルフィド及びｐ−チオクレゾールが通常、ポリペプチドに存在する
アミノ酸残基のアルキル化及びアシル化から、分解の間に形成されるカチオンを
妨げるために液体HFと共に使用される。

【０１６１】 トリプトンファンのホルミル基、及びヒスチジンのジニトロフェニル基はそれ
ぞれ、HF分解の前、DMF中、ピペリジン及びチオフェニルにより除去される必要
がある。システインのアセトアミドメチル基は、酢酸水銀（II）により、及び他
方では、システインをシスチンに同時酸化するヨウ素、三フルオロ酢酸トリウム
（III）又は四フルオロ硼酸銀）により除去され得る。tbocペプチド分解及び保
護解除のために使用される他の強酸は、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA
）及びトリメチルシリルトリフルオロ酢酸（TMSOTf）を包含する。

【０１６２】 ディスインテグリンループ（配列番号２の残基438〜449）は、心臓、脳、脊髄
及び骨格筋の障害のアッセイ及び処理への使用のために特に興味あるものである
。それらの目的のためには、合成されるディスインテグリンループペプチドは、
末端システイン残基を含み、そして従って、配列番号２の残基437〜450であろう
。このペプチドは、線状ペプチド又はジスルフィド結合されたペプチドとして合
成され得る。残基438，444及び450間にジスルフィド結合を有するペプチドが特
に興味あるものである。ペプチド合成及びジスルフィド結合の追加の記載につい
ては、Jia, L.G., 前記を参照のこと。

【０１６３】 当業者は、モデルとしてzdint1のインテグリン結合ペプチドを用いて新規結合
ペプチドを企画し、そして合成することが有用であることを認識するであろう。
そのようなペプチドを合成するための方法は、P.L. Barkerなど., J. Med. Chem
. 35：2040−2048，1992, 及びL. Jiaなど., Biol. Chem. 272: 13094-13102, 1
997により記載される。インテグリン結合ペプチドの構造コンホメーションは決
定的であるので、いくつかのアミノ酸置換はペプチドのコンホメーションを変更
しないが、ペプチドの環化が好都合には、維持されることが認識される。合成ペ
プチドは、dint１のためのアゴニスト又はアンタゴニストとして有用であり、そ
してアッセイされ得る。

【０１６４】 アッセイ： zdint1ポリペプチドの活性は、例えば細胞−細胞相互作用、タンパク質分解細
胞外マトリックス形成又は改造性を測定する種々のアッセイを用いて測定され得
る。さらに、ディスインテグリンファミリーメンバー、又はインテグリン/ディ
スインテグリン相互作用、アポプトシス増殖又は分化に関する他の生物学的機能
がまた、測定され得る。血小板凝集における変化が特に興味あるものである。血
小板凝集を測定するアッセイは当業界において良く知られている。一般的に文献
に関しては、Dennis, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2471-2475, 1989を参照のこ
と。

【０１６５】 興味あるもう１つのアッセイは、筋肉細胞又は筋細胞の分化、成長及び/又は
電気的カップリングの変化を測定し、又は検出する。さらに、線維芽細胞、筋芽
細胞神経細胞、白血球細胞、内皮細胞及び腫瘍細胞の細胞−細胞相互作用に対す
るdint1ポリペプチドの効果が、測定するために興味あるものである。さらなる
もう1つのアッセイは、プロテアーゼ活性及びアポプトシスの変化を試験する。

【０１６６】 本発明の分子の活性は、例えば成人心臓における組織特異性に基づいて、心臓
細胞の新生又は過形成（すなわち、増殖）を測定する種々のアッセイを用いて測
定され得る。本発明のポリペプチドにたぶん関連する追加の活性は、内皮細胞、
心筋細胞、線維芽細胞、骨格筋細胞の他の成長因子を通しての直接的又は関節的
増殖；内皮細胞、線維芽細胞及び/又は食作用性細胞のための走化性因子として
の作用；および骨形成因としての作用；および間葉幹細胞及び前駆体手段を拡張
するための因子としての作用を包含する。

【０１６７】 増殖は、培養された心臓細胞を用いて、又は適切な動物モデルへの本発明の分
子をインビボ投与することによって測定され得る。一般的には、増殖効果は、細
胞数の上昇として観察され、そして従って、アポプトシスの阻害、及び有糸分裂
誘発を包含する。培養された細胞は、一次培養物からの心臓線維芽細胞、心筋細
胞、骨格筋細胞、ヒトへそ静脈内皮細胞を包含する。確立された細胞系は、NIH
3T3線維芽細胞（ATCC No. CRL−1658）、CHH−１サケ心臓細胞（ATCC No. CRL−
1680）、H9c2ラット心臓筋芽細胞（ATCC No. CRL−1446）、Shionogi乳癌細胞（
Tanakaなど.,）Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 8928-8932, 1992)及びLNCap. FGC
腺癌細胞（ATCC No. CRL-1740）を包含する。

【０１６８】 細胞増殖を測定するアッセイは、当業者において良く知られている。例えば、
増殖を測定するアッセイは、中性の色素に対する化学感受性としてのアッセイ（
Cavanaugh など., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990）、放射性ラ
ベルされたヌクレオチドの組み込み（Cookなど., Analytical Biochem. 179: 1-
7, 1989）、増殖細胞のDNAへの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（Brdu）の
組み込み（Porstmannなど., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985）、及び
テトラゾリウム塩の使用（Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Al
leyなど., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall など., Growht Reg. 5:
69-84, 1995; 及びScudieroなど., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988）を包含
する。

【０１６９】 分化は進行性で且つ動的な過程であり、多能性幹細胞で始まり、そして最終的
に分化された細胞で終結する。拘束なしに系統に再生することができる多能生幹
細胞は、細胞系統への拘束が行われる場合、失われる一組の分化マーカーを発現
する。前駆体細胞は、細胞が成熟に向かって細胞系統路を進行する場合に、発現
され続けることができても又はできなくても良い一組の分化マーカーを発現する
。成熟細胞により独占的に発現される分化マーカーは通常、機能的性質のもの、
例えば細胞生成物、細胞生成物を生成するための酵素及び受容体である。

【０１７０】 細胞集団の分化の段階は、細胞集団に存在するマーカーの固定によりモニター
される。筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、腺維芽細胞及び網様細胞は、通常の間葉
幹細胞に起因すると思われる（Owenなど., Ciba Fdn. Symp. 136: 42-46, 1988
）。間葉幹細胞のためのマーカーは間だ十分には同定されておらず（Owenなど.,
J. of Cell Sci. 87: 731-738, 1987）、その結果、同定は、前駆体及び成熟細
胞段階で行われる。初期段階心筋細胞前駆体細胞（しばしば、心筋細胞幹細胞と
して言及される）の存在が推定されるが、しかし成人心臓組織においては示され
ていない。本発明の新規ポリペプチドは、間葉幹細胞及び心筋細胞前駆体細胞を
、インビボ及びエクスビボの両者で単離するための研究のために有用である。

【０１７１】 最終分化又は脱分化の方の経路に特定細胞型を刺激する因子が、通常の前駆体
又は幹細胞に起因する全細胞集団に影響を及ぼすことを示唆する証拠が存在する
。従って、zdint1ポリペプチドは、筋細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、
軟骨細胞及び内皮細胞の阻害又は増殖を刺激することができる。本発明の分子は
、心筋細胞の増殖又は分化を刺激すると共に、脂肪細胞の増殖又は分化を、通常
の前駆体/幹細胞に対するそれらの効果により阻害することができる。従って、
本発明の分子は、軟骨肉腫、アテローム硬化症、再狭窄及び肥満症に使用される
。

【０１７２】 分化を測定するアッセイは例えば、組織、酵素活性、機能的活性又は形態学的
変化の段階−特異的発現に関連する細胞−表面マーカーを測定することに包含す
る（Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1
994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989;
すべては引用により本明細書に組み込まれる）。

【０１７３】 心臓性新生又は過形成を評価するためのインビボアッセイは、本発明の分子に
よる新生児及び成熟ラットの処理を包含する。動物の心臓機能は、心拍、血圧及
び左心室機能を決定するための心臓出力として測定される。心臓改良性を評価す
るために死後法は次のものを包含する：高められた心臓重量、核/細胞質体積、
増殖性細胞核抗原（PCNA）対細胞質アクチンレベルを決定するための心臓組織学
断片の染色（Quainiなど., Circulation Res. 75: 1050−1063，1994及びReiss
など., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8630-8635, 1996）。

【０１７４】 合成zdint1アゴニストのインビボ効果を測定するアッセイは、うっ血性心不全
及び慢性過負荷圧の後、再構造及び修復を測定するLeft Venticular Hypertroph
y モデル（A. M. Feldmanなど., Circ. Res. 73: 184-192, 1993）を包含する。 本発明のタンパク質、例えば他方では、スプライスされたペプチドは、腫瘍抑
制のために、及び脳、心臓、脊髄及び骨格筋細胞における単離において、又は他
の分子（成長因子、サイトカイン、等）に関連して作用する増殖及び分化のため
に有用である。zdint1の他のスプライシングは、細胞型特異的であり、そして特
異的組織に活性を付与することができる。

【０１７５】 本発明のタンパク質は、治療剤、例えばプロテアーゼ、放射性核種、化学治療
法剤、及び小分子（但し、それらだけには限定されない）の供給のために有用で
ある。それらの治療剤の効果は、培養された細胞を用いてインビトロで、又は適
切な動物モデルに本発明の分子を投与することによってインビボで測定され得る
。zdint1トランスフェクトされた発現宿主細胞は、例えば、zdint1トランスフェ
クトされた発現宿主細胞が、アルギン酸塩環境下で包埋され、そして受容体動物
中に注入（移植）され得る。

【０１７６】 アルギネート−ポリ−L−リシン微小封入、透過性膜封入及び拡散チャンバー
は、トランスフェクトされた哺乳類細胞又は一次哺乳類細胞を捕獲するための手
段として記載されている。それらのタイプの非免疫原性“封入”又は微小環境は
、微小環境への栄養物ノトランスファーを可能にしそして又は、捕獲された細胞
により分泌され又は開放されるタンパク質及び他の高分子の環境バリアーを通し
て受容体動物への拡散を可能にする。最も重要なことには、カプセル又は微小環
境は、受容体動物の免疫応答から外来性の包埋された細胞をマスクし、そして遮
断する。そのような微小環境は、注入される細胞の寿命を、数時間又は数日（裸
細胞）から数週間（包埋された細胞）まで拡張することができる。

【０１７７】 アルギン酸塩糸は、包埋された細胞を生成するための単純且つ迅速な手段を提
供する。アルギン酸塩糸を生成するために必要とされる材料は、容易に手に入れ
ることができそして比較的安価である。製造されると、そのアルギン酸塩糸は、
インビトロで、及びその糸を用いて得られるデータに基づいて、インビボで、比
較的強く且つ耐久性がある。そのアルギン酸塩糸は容易に操作でき、そしてその
方法論は多くの調製のために評価できる。典型的な方法においては、３％のアル
ギン酸塩が、無菌水において調製され、そして滅菌濾過される。アルギン酸塩糸
の調製の直前、アルギン酸塩溶液が再び濾過される。

【０１７８】 約５０％の細胞懸濁液（１ml当たり約５×１０⁵個〜約５×１０⁷個の細胞を含
む）が３％アルギン酸塩溶液と共に混合される。１mlのアルギン酸塩／細胞懸濁
液が、約１５分間にわたって、１００mMの滅菌濾過されたCacl₂ 溶液中に押し出
され、“糸（Thread）”が形成される。次に、押し出された糸は、５０mMのCacl ₂ の溶液に移され、そして次に２５mMのCacl₂の溶液に移される。

【０１７９】 次に、糸が、脱イオン水によりすすがれ、その後、ポリ−L−リシンの0.01％
溶液においてインキュベートすることによって糸を被覆する。最後に、糸は乳酸
塩化されたリンガー溶液によりすすがれ、そして注射器（針のない）中に溶液か
ら抜き取られる。次に大きな孔の針がその注射器につけられ、そして糸が最少量
の乳酸塩化されたリンガー溶液において受容体中の腹腔内注入される。

【０１８０】 本発明のタンパク質をアッセイするための別のインビボアプローチは、ウィル
ス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィ
ルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（AAV）
を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種拡散の
供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（T. C.
Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D
.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと）。

【０１８１】 アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ i ）アデノウ
ィルスは比較的大きなDNA挿入体を適応せしめることができ；（ ii ）高い力価
に増殖され得；（ iii ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ iv ）
異なったプロモーターを含む多数の利用できるベクターと共に使用され得る。ま
た、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射によ
り投与され得る。

【０１８２】 アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAのより大きな
挿入体（７kbまでの）が適応され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により
又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスDN
A中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須E1遺伝子がウィルス
ベクターから欠失され、そしてウィルスは、E１遺伝子が宿主細胞（ヒト293細胞
系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。損なわれてい
ない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。

【０１８３】 アデノウィルス供給システムがE１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主
細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝
臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう(そし
て、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する)。分泌されたタンパク質は高
く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が
決定され得る。

【０１８４】 アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使
用され得る。アデノウィルス感染された非−293細胞を、その細胞が急速に分裂
しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を
生成することができる。例えば、BHK細胞は、細胞工場において集密性まで増殖
され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクター
に暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の
数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。

【０１８５】 他方では、アデノウィルスベクター感染された293S細胞が、有意な量のタンパ
ク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、懸濁培養において増殖せしめら
れ得る（ Garnier など., Cytotechnol. 15: 145−55, 1994 を参照のこと）。
いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞
における発現されたタンパク質の素因に依存して、細胞培養物上清液から反復し
て単離され得る。感染された293S 細胞生成プロトコールにおいては、分泌され
ていないタンパク質が効果的に得られる。

【０１８６】 さらにもう１つの態様においては、配列番号１のポリヌクレオチドの少なくと
も14個の連続ヌクレオチド、又は配列番号１に対して相補的な配列を含んで成る
オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーが提供される。

【０１８７】 アゴニスト及びアンタゴニスト： zdint1発現に関して観察される３組織分布（心臓、脳、脊髄及び骨格筋の観点
においては、アゴニスト（生来のディスインテグリン及びプロテアーゼドメイン
を包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大
な可能性を有する。Zdint1アゴニスト及びアンタゴニストとして同定される化合
物は、細胞−細胞相互作用、筋発生、アポプトシス、神経発生、結合組織障害、
軟骨形成、関節炎、腫瘍増殖及び抑制、細胞外マトリックスタンパク質、虚血性
再灌流及び炎症の修復及び再造形をインビオロ及びインビボで研究するために有
用である。

【０１８８】 例えば、zdint1及びアゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の化合物と
して有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために
、単独で又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。従って、
アンタゴニストは、培養物における骨髄性系統の細胞の増殖及び/又は発育を特
異的に促進することにおいて有用である。さらに、zdint1ポリペプチド及びzdin
t1アゴニスト、例えば小分子は、研究試薬として、例えば心臓、脳、脊髄又は骨
格筋細胞の拡張、分化及び/又は細胞−細胞相互作用のために有用である。Zdint
1ポリペプチドは、それらの細胞型のための組織培養培地に添加される。

【０１８９】 アンタゴニスト： アンタゴニストはまた、相補的／抗−相補的相互作用の部位を特徴づけるため
の研究試薬として有用である。zdint1活性のインヒビター（zdint1アンタゴニス
ト）は、抗−zdint1抗体、及び可溶性zdint1受容体、並びに他のペプチド及び非
ペプチド剤（例えば、リボザイム）を包含する。

【０１９０】 zdint1はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するために
も使用され得る。試験化合物は、zdint1の活性を阻害する化合物を同定するため
に、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれら
のアッセイの他に、サンプルが、ディスインテグリン／インテグリン結合又はzd
int1−依存性細胞応答の刺激／阻害を測定するよう企画された種々のアッセイ内
のzdint1活性の阻害について試験され得る。例えばzdint1−応答性細胞系は、zd
int1−刺激された細胞経路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフ
ェクトされ得る。

【０１９１】 このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そし
て一般的に、アッセイできるタンパク質、例えばルシフェラーゼ又は代謝物をコ
ードする遺伝子に作用可能に連結されるDNA応答要素を含むであろう。DNA応答要
素は、サイクリックAMP応答要素（CRE）、ホルモン応答要素（HRE）、インスリ
ン応答要素（IRE）（Nasrin など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273−7,
1990）及び血清応答要素（SRE）（Shaw など., Cell 56: 563−72, 1989）を包
含するが、但しそれらだけには限定されない。

【０１９２】 サイクリックAMP応答要素は、Roestler など., J. Biol. Chem. 263 (19): 90
63−6, 1988及びHabener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087−94, 1990に再考さ
れる。ホルモン応答要素は、Beato, Cell 56: 335−44l, 1989に再考される。た
ぶんほとんどのレポーター遺伝子構造体は、インテグリンの結合に基づいて、例
えばSREレポーターを通して細胞内に表示するディスインテグリンを含むであろ
う。候補体化合物、溶液、混合物又は抽出物は、レポーター遺伝子発現のzdint1
刺激の低下により明らかなように、標的細胞に対するzdint1の活性を阻害する能
力について試験される。

【０１９３】 このタイプのアッセイは、細胞表面受容体すなわち、相補的／抗−相補的対の
インテグリン又は抗−相補的メンバーに結合するzdint1を直接的にブロックする
化合物、及び補体／抗−補体結合に続く細胞経路における工程をブロックする化
合物を検出するであろう。他方では、化合物又は他のサンプルが、検出できるラ
ベル（例えば¹²⁵I、 ビオチン、ホースラディシュペルオキシダーゼ、FITC、及
び同様のもの）により標識されるzdint1を用いて、インテグリンへのzdint1結合
の直接的なブロッキングについて試験され得る。

【０１９４】 このタイプのアッセイにおいては、インテグリンへのラベルされたzdint1の結
合を阻害する試験サンプルの能力は、二次アッセイを通して確かめられ得る阻害
活性の表示である。結合アッセイ内に使用されるインテグリンは、細胞インテグ
リン、又は単離され、固定されたインテグリンであり得る。

【０１９５】 “RGD”、すなわちインテグリン結合ループに類似する、zdin1の“ECD”イン
テグリン結合成分（配列番号２の残基443〜445）を含んで成るアミノ酸配列はま
た、インヒビターとしても使用され得る。そのようなインヒビターは、その天然
に存在するインテグリン以外のインテグリンを、その折りたたみ構造の性質によ
り結合するであろう。そのようなインヒビターにおける特に興味あることは、血
小板凝集を介在することである。結合及び阻害、並びに血小板凝集を測定するア
ッセイは、当業界において知られている。

【０１９６】 zdint1ポリペプチドは、免疫グロブリンH鎖不変領域、典型的には２つの不変
領域ドメインを含み、そして可変領域を欠いているFcフラグメントとの融合体と
して発現され得る。そのような融合体を調製するための方法は、アメリカ特許第
5,155,027号及び第5,567,584号に開示される。そのような融合体は典型的には、
マルチマー分子として分泌され、ここで前記分子においては、Fc部分はお互いに
ジスルフィド結合され、そして２つの非Igポリペプチドはお互いに接近して配列
されている。

【０１９７】 このタイプの融合体は、それ自体又は他のインテグリンファミリーメンバーと
のzdint1のニ量体化の効果及び可能性を評価するために使用され得る。そのよう
な融合はまた、zdint1が結合するその対応するインテグリンを単離するためにも
有用である。アッセイへの使用のためには、キメラは、Fc領域を通して支持体に
結合され、そしてELISA形に使用される。

【０１９８】 zdint1インテグリン−結合ポリペプチドはまた、インテグリンの精製のために
も使用される。zdint1ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋さ
れたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、
架橋されたポリアクリルアミド又は使用の条件下で安定している同様の材料のビ
ーズ上に固定される。固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業
界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアノゲン活性化、N−ヒド
ロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒ
ドラジド活性化を包含する。

【０１９９】 得られる媒体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてインテグリンを含
む流体が、インテグリン結合ループポリペプチドへのインテグリンの結合を可能
にするために、カラムに１又は複数回、通される。次に、インテグリンが、塩濃
度の変化、カオトロピック剤（グアニジンHcl）、又はインテグリン−受容体結
合を破壊するｐHを用いて溶出される。

【０２００】 リガンド−結合受容体(又は抗体、補体／抗補体対の１つのメンバー)、又はそ
の結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（BIAcore, Pharmacia Bio
sensor, Piscataway, NJ）を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され
得る。そのような受容体、抗体、補体／抗補体対のメンバー、又はフラグメント
は、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Karlsson, J. Imm
unol. Methods 145: 229−40, 1991 及びCunningham and Wells, J. Mol.Biol.
234: 554−63,1993により開示される。受容体、抗体、メンバー又はフラグメン
トは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合
されるデキストラン繊維に共有結合される。

【０２０１】 試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は相補的／抗−相補
的対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された
受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化
として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−
及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結
合の化学量の評価が可能にされる。

【０２０２】 zdint1ポリペプチド、ペプチド又は変異体により引き起こされる細胞−細胞相
互作用をアッセイするためのもう１つの方法は、受容体結合及び続く生理学的細
胞応答に関連する、細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を測定する、珪素ベース
のバイオセンサーのマイクロフィジオメーターによる。典型的な装置は、Molecu
lar Devices, Sunnyvale, CAにより製造されるCytosensor（商標）マイクロフィ
ジオメーターである。

【０２０３】 種々の細胞応答、例えば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、
調節及び受容体活性化及び同様のものが、この方法により測定され得る。例えば
、McConnell, H.M.など., Science 257：1906-1912, 1992; Pitchford, S. など
., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997: Arimilli, S. など., J. Immunol. Met
h. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. など., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95
, 1998を参照のこと。

【０２０４】 マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着性真核又は原核細胞をアッセ
イするために使用され得る。時間にわたって細胞培地における細胞外酸性化の変
化を測定することによって、マイクロフィジオメーターは、種々の刺激、例えば
zdint1ポリペプチド、ペプチド、変異体、アゴニスト又はアンタゴニストに対す
る細胞応答を直接的に測定する。好ましくは、マイクロフィジオメーターは、zd
int1ポリペプチドに対して応答しない対照の真核細胞に比較して、zdint1−応答
性真核細胞の応答を測定するために使用される。

【０２０５】 zdint1−応答性真核細胞は、zdint1ポリペプチド、ペプチド、又は変異体に対
して応答性である細胞である細胞を創造する、zdint1のための受容体がトランス
フェクトされている細胞；又はzdint1ポリペプチド、ペプチド、又は変異体に対
して天然において応答性の細胞、例えば腎臓又は小腸に由来する細胞を包含する
。zdint1ポリペプチド、ペプチド、又は変異体に暴露されていない対照に比較し
て、zdint1ポリペプチド、ペプチド、又は変異体に暴露された細胞の応答におけ
る変化、例えば細胞外酸性化の上昇又は低下により測定される差異が、zdint1−
調節された細胞応答の直接的に測定である。さらに、そのようなzdint1−調節さ
れた応答は、種々の刺激下でアッセイされ得る。

【０２０６】 マイクロフィジオメーターを用いれば、zdint1ポリペプチドに対して応答性の
細胞を供給し、前記細胞の第１部分を試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の
第２部分を試験化合物の存在下で培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して
、前記細胞の第２部分の細胞応答の上昇又は低下の変化を検出することを含んで
なる、zdint1ポリペプチドのアゴニストを同定するための方法が提供される。

【０２０７】 前記細胞応答の変化は、細胞外酸性化速度の測定できる変化として示される。
さらにzdint1ポリペプチドの存在及び試験化合物の不在下での細胞の第３部分が
、zdint1−応答細胞のための陽性対照として、及び試験化合物のアゴニスト活性
とzdint1ポリペプチドのその活性とを比較するための対照として使用され得る。

【０２０８】 さらに、マイクロフィジオメーターを用いれば、zdint1ポリペプチドに対して
応答性の細胞を供給し、前記細胞の第１部分をzdint1の存在及び試験化合物の不
在下で培養し、前記細胞の第２部分をzdint1の存在及び試験化合物の存在下で培
養し、そして前記細胞の第１部分に比較して、前記細胞の第２部分の細胞応答の
上昇又は低下の変化を検出することを含んでなる、zdint1ポリペプチドのアンタ
ゴニストを同定するための方法が提供される。細胞応答における変化は、細胞外
酸性化速度の測定できる変化として示される。zdint1ポリペプチドのためのアン
タゴニスト及びアゴニストは、この方法を用いて急速に同定され得る。

【０２０９】 さらに、zdint1のポリペプチド、ペプチド及び変異体は、zdint1により刺激さ
れた経路に対して応答する、細胞、組織又は細胞系を同定するために使用され得
る。上記マイクロフィジオメーターは、リガンド−応答細胞、例えば本発明のzd
int1ポリペプチド、ペプチド及び変異体に対する応答性の細胞を同定するために
使用され得る。細胞は、zdint1ポリペプチド、ペプチド及び変異体の存在又は不
在下で培養され得る。zdint1ポリペプチド、ペプチド及び変異体の存在下で細胞
外酸性化の測定できる変化を誘発するそれらの細胞は、zdint1に対して応答性で
ある。そのような細胞系は、上記のようなzdint1ポリペプチドのアンタゴニスト
及びアゴニストを同定するために使用され得る。

【０２１０】 インテグリンポリペプチド及びディスインテグリンポリペプチドを結合する他
の受容体ポリペプチド、並びにそれらの変異体はまた当業界において知られてい
る他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和
性の決定のためのスカチャード分析（Scatchard, Ann. NY. Acad. Sci. 51:660
−72, 1949）及び熱量測定アッセイ（Cunningham など., Science 253: 545−48
, 1991;Cunningham など., Science 245: 821−25, 1991）を包含する。

【０２１１】 “可溶性受容体”とは、細胞膜に結合されない受容体ポリペプチドである。可
溶性受容体は、最も通常には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いて
いるリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、追加のアミノ
酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合
のための部位、又は免疫グロブリン不変領域配列を提供する親和性標識を含んで
成る。

【０２１２】 多くの細胞−表面受容体は、タンパク質加水分解により、又は交互にスプライ
シングされたmRNAから翻訳される天然に存在する可溶性相対物を有する。受容体
ポリペプチドは、それがそれぞれ、膜固定化又はシグナルトランスダクションを
提供するために、それらのセグメントの十分な部分を欠いている場合、トランス
メンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないと言われる。

【０２１３】 zdint1ポリペプチドの可溶性形は、zdint1ポリペプチドに対してアンタゴニス
トとして作用することができ、そして脳、骨格筋及び脊髄におけるzdint1の効果
を調節するために有用である。さらに、可溶性zdint1ペプチド及びフラグメント
は、細胞外マトリックスへの細胞のインテグリン−介在性結合を破壊することが
できる。

【０２１４】 抗体： zdint1ポリペプチドはまた、zdint1エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに
特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。zdint1ポリペプチド又
はそのフラグメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するための剤(免
疫原)として作用する。適切な抗原は、６個又はそれ以上の連続した親水性アミ
ノ酸を表す、配列番号２によりコードされるzdint1ポリペプチドのフラグメント
を包含する。そのような抗原性領域は、例えばアミノ酸残基159〜164（配列番号
７）；アミノ酸残基158〜163（配列番号８）；アミノ酸残基518〜523（配列番号
９）；アミノ酸残基658〜663（配列番号10）；及びアミノ酸残基190〜195（配列
番号11）である。

【０２１５】 この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載のようにして、単離され
得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための
方法は、当業界において良く知られている。例えば、Current Protocols in Imm
unology, Cooligan, など., (eds.), National Institutes of Health, John Wi
ley and Sons, Inc., 1995; Sambrook など., Molecular Cloning: A Laborator
y Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G
.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications,
CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 を参照のこと。

【０２１６】 当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬
、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットから、zdint1ポリペプ
チド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得る。zdint1ポリ
ペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム
）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。

【０２１７】 免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプチド又
はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばzdint1又はその一
部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部
であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分
は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KLH
）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結
合され得る。

【０２１８】 本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性
精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント
、例えばF(ab’)₂及びFabタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的
に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフ
ラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリ
ペプチドもまた包含される。

【０２１９】 非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトCDRのみを移植することによ
って、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露
された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（cl
oaking）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒ
ト適合され得る。多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強す
るために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。
ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基
づく有害な免疫反応の可能性が低められる。

【０２２０】 本明細書において有用な抗体を生成し又は選択するための他の技法は、zdint1
タンパク質又はペプチドへのリンパ球インビトロ暴露、及びファージ又は類似す
るベクターにおける抗原表示ライブラリーの選択（例えば、固定された又はラベ
ルされたzdint1タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。可能性あ
るzdint1ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は
、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダム
ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。

【０２２１】 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばラン
ダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それら
のランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得
る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有
機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され
得る。

【０２２２】 そのようなランダム ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニ
ングするための技法は、当業界において知られており（Ladner など., アメリカ
特許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号；Ladner な
ど., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698
号）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリー
をスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto, CA), Invi
trogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 及
びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販されている。

【０２２３】 ランダムペプチド表示ライブラリーは、zdint1に結合するタンパク質を同定す
るために、本明細書に開示されるzdint1配列を用いてスクリーンされ得る。zdin
t1ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合タンパク質”は、細胞を標識する
ために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る；
それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に
接合され得る。それらの結合タンパク質はまた、分析方法に、例えば発現ライブ
ラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。

【０２２４】 結合タンパック質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本
的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出し又は定量化す
るために、診断アッセイにも使用され得る。それらの結合タンパク質はまた、zd
int1結合及びシグナル トランスダクションをインビボで阻止するために、zdin
t1 “アンタゴニス”として使用することができる。それらの抗−zdint結合タン
パク質は、例えば血小板凝集、アポプトシス、神経発生、筋発生、腫瘍形成及び
細胞−細胞相互作用を阻害するために有用である。

【０２２５】 抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関
連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合することが
決定された。第１に、本明細書に置ける抗体は、それらが10⁶M^-1又はそれ以上、
好ましくは10⁷M^-1又はそれ以上、より好ましくは10⁸M^-1又はそれ以上、及び最も
好ましくは10⁹M^-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を有するzdint1ポリペプチド
、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和
性は、例えばScatchard 分析（Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-67
2, 1949）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。

【０２２６】 第２に、抗体は、それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差−反応しな
い場合、有意に結合することが決定される。抗体は、それらが、標準のウェスタ
ーンブロット分析を用いて、zdint1を検出するが、しかし既知の関連するポリペ
プチドでない場合、関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない（Ausube
l など., 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、オルト体、タンパク質
ファミリーのメンバーである同じ種からのタンパク質、zdint1ポリペプチド及び
非−ヒトzdint1である。

【０２２７】 さらに、抗体は、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離
するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。例
えば、zdint1に対して生ぜしめられた抗体は、不溶性マトリックスに付着される
関連するポリペプチドに吸着され；zdint1に対して特異的な抗体は、適切な緩衝
液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。そのようなスクリーニン
グは、既知の密接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナ
ル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Antibodies: A Laboratory Man
ual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988;
Current Protocols in Immunology, Cooligan, など. (eds.), National Instit
utes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995）。

【０２２８】 特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知
られている。Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getz
offなど., Adv.in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Princip
les and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjam
in など., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984を参照のこと。

【０２２９】 当業者に知られている種々のアッセイが、zdint1タンパク質又はペプチドに特
異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Anti
bodies: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speing Harbor
Laboratory Press, 1988 に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表
的な例は次のものを包含する:同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジ
オイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ELISA）、ドットブロット又はウ
ェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセ
イ。さらに、野生型対変異体のzdint1タンパク質又はペプチドに結合する抗体が
スクリーンされ得る。

【０２３０】 zdint1に対する抗体及び結合タンパク質は、zdint1を発現する細胞を標識する
ために；アフィニティー精製によりzdint1を単離するために；zdint1ポリペプチ
ドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学のマー
カーとして可溶性zdint1を検出し又は定量化するために；FACS を使用する分析
方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗-インディオ
タイプ抗体を生成するために；及びインビトロでzdint1介在性活性を阻止するた
めの中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。

【０２３１】 適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビ
ター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間
接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗
−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた
、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合さ
れ得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る
。さらに、zdint1又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業
界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性
されたzdint1又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る
。

【０２３２】 本発明はまた、本明細書に記載されるzacrp2ポリペプチドのエピトープ−担持
の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのよ
うなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される
場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含ん
で成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得
る。（例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad Sci. USA81: 3988, 1983を参照
のこと）。

【０２３３】 対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合す
ることができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る
。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてその
ようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピト
ープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激
するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Sutcli
ffeなど., Science 219: 660, 1983を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エ
ピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプ
チドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。

【０２３４】 抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは、配列番号
２の少なくとも４〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜15個のアミノ酸、又は約15
〜約30個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペ
プチドは、本明細書に記載されるように、zacrp2ポリペプチドのフラグメント化
又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダム
ペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Lane and S
tephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, 及びCortese など., Curr. Opin
. Biotechnol. 7: 616, 1996を参照のこと）。

【０２３５】 エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体
を生成するための標準の方法は、例えばMole, “Epitope Mapping,” in Method
s in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Pages 105-16 (The Humana
Press, Inc., 1992), Price, “Production and Characterization of Syntheti
c Peptide-Derived Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, En
gineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), page 60-
84 (Cambridge University Press 1995), 及びColigan など. (eds.), Current
Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John
Wiley & Sons, 1997)により記載される。例えば配列番号７，８，９，10又は11
からのアミノ酸の配列を含んで成る本発明のポリペプチド又はそのフラグメント
は、エピトープ担持性である。

【０２３６】 生物活性接合体： 本明細書に記載される抗体又はポリペプチドはまた、薬物、トキシン、放射性
核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体
はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。例えば、本発明のポリペプ
チド又は抗体は、対応する抗−相補的分子（例えば、それぞれインテグリン又は
抗原）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。よ
り特定には、zdint1ポリペプチド又は抗−zdint1抗体、又はその生物活性フラグ
メント又は一部は、検出可能又は細胞毒性分子に結合され、そして抗−相補的分
子を発現する、細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。

【０２３７】 適切な検出可能分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合さ
れ得、そして放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、
化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子
は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は
植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリ
ン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばI−131、レニウム−188又
はイットニウム−90（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ
−ト成分により間接的に結合される）を包含する。

【０２３８】 ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合
され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は
細胞毒性分子は相補的/抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメ
ンバーはポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビ
オチン/ストレプタビジンが典型的な相補的/抗相補的対である。

【０２３９】 もう１つの態様においては、ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒
素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞
又は組織を処理するために）のために使用され得る。他方では、ポリペプチドが
複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及
び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク
質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型
に向けるために適切である。ドメインのみの融合タンパク質が相補的分子を含む
場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そ
のようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能
/細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。

【０２４０】 もう１つの態様においては、zdint1−サイトカイン融合タンパク質又は抗体−
サイトカイン融合タンパク質は、zdint1ポリペプチド又は抗−zdint1抗体が過剰
増殖性脳、心臓、脊髄又は骨格筋細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、脳
、心臓、脊髄及び骨格筋悪性）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（
一般的には、Hornickなど., Blood 89: 4437-4447, 1997を参照のこと）。

【０２４１】 記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化
を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。適切
なzdint1ポリペプチド又は抗−zdint1抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば
、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター
細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切
なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー
刺激因子（GM−CSM）を包含する。

【０２４２】 さらにもう１つの態様においては、zdint1ポチペプチド又は抗−zdint1抗体が
血管細胞又は組織を標的化する場合、そのようなポリペプチド又は抗体は、再狭
窄を低めるために、放射性核種、及び特にβ線発光放射性核種により接合され得
る。そのような治療アプローチは、放射性治療を管理する臨床医にほとんど危険
性を与えない。例えば、患者のステントを入れられた血管中に、必要とされる放
射線用量が供給されるまで、配置されるイリジウム−192含浸されたリボンは、
血管における低められた組織増殖、及びプラシーボリボンを受けた対照グループ
よりも大きな管腔を示した。

【０２４３】 さらに、血管再生及びステント血栓症は、処理グループにおいて有意に低かっ
た。類似する結果が、本明細書に記載されるように、放射性核種を含む生物活性
接合体の標的化により予測される。 本明細書に記載される生物活性ポリペプチド又は抗体接合体は、静脈内、動脈
内又は管内供給され得、又は作用の意図された部位に局部的に導入され得る。

【０２４４】 ポリヌクレオチド／ポリペプチドの使用： 本発明の分子は、細胞−細胞相互作用に関係する受容体及びインテグリンを同
定し、そして単離するために使用され得る。例えば、本発明のタンパク質及びペ
プチドがカラム上に固定され、そして膜調製物がそのカラム上に通される（Immo
bilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson など., eds., Academic Pres
s, San Diego, CA, 1992, pp.195-202）。次に、本発明のzdint1ポチペプチド、
ペプチド及び変異体に結合するポリペプチド及びペプチドが、溶出され、そして
当業界において知られている方法を用いて特徴付けられ得る。

【０２４５】 タンパク質及びペプチドはまた、放射性ラベルされ（Methods in Enzymol., v
ol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, ed., Acad. Pre
ss, San Diego, 1990, 721-737）、又は光親和性ラベルされ（Brunner など., A
nn. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993及びFedan など., Biochem. Pharnacol.
33: 1176-1180, 1984）、そして特定の細胞−表面タンパク質が同定され得る。

【０２４６】 本発明の分子は、虚血性現象の後、修復及び再造形において及び／又は血小板
凝集の阻害において有用であろう。本発明のポリペプチド、核酸及び/又は抗体
は、脳又は心臓組織における梗塞、及び／又は血小板凝集に関連する障害の処理
に使用され得る。本発明の分子は、タンパク質分解、アポプトシス、神経発生、
筋発生、結合組織障害、関節炎、軟骨形成、細胞付着、細胞融合及びシグナル化
を調節し、又は心臓、脳、脊髄及び骨格筋のような種々の組織における病理学的
状態の進行を妨げるために使用され得る。特に、一定の疾病が、そのような診断
、処理又は予防に敏感に反応できる。

【０２４７】 本発明の分子は、心臓、脳、脊髄及び骨格筋組織におけるニューロン及び筋細
胞の阻害及び増殖を調節するために使用され得る。zdint1ポリペプチドによる診
断、処理又は予防に敏感に反応できる障害は、例えばアルツハイマー病、腫瘍形
成、多発性硬化症、うっ血性心不全、虚血性再灌流又は梗塞、及び変形性疾患を
包含する。

【０２４８】 本発明のzdint1分子は、急性血管損傷のために内膜過形成又は再狭窄の処理に
おいて特に有用である。急性血管損傷は、生涯にわたって進行する慢性損傷（例
えば、アテローム硬化症）に比較して、急速に（すなわち、数日〜数ヶ月）生じ
るそれらの損傷である。急性血管損傷はしばしば、手術工程、例えば血管再構成
に起因し、ここでは、血管形成、動脈内膜切除、動脈切除、血管移植片配置又は
同様のことが使用される。過形成はまた、例えば移植片配置又は器官移植に応答
して、遅延された応答として生じることができる。再狭窄のための処理における
zdint1の用量は、個々の患者により変化するが、しかし一般には、上記で提供さ
れたそれらの範囲で存在するであろう。

【０２４９】 冠状血管疾病の処理は、冠動脈を通して適切な血流を再確立するために、攻撃
性プラーク材料を除去するか又は置換することへの機械的介入を包含する。複数
形の機械的介入、例えばバルーン血管形成、動脈切除、血管ステントの配置、レ
ーザー治療又はロトブレーターの使用にもかかわらず、それらの技法の有効性は
、処理語６ヶ月以内で約40％の再狭窄率に制限される。 再狭窄は、生物学的工程、例えば血小板沈着及び血管形成、走化性及びミトゲ
ン因子の開放、及び血管平滑筋細胞の拡張された動脈セグメントの内膜への移動
及び増殖の複雑な相互作用に起因すると思われる。

【０２５０】 機械的損傷の部位での血小板蓄積の阻害は、ヒト対象における再狭窄を制限す
ることができる。血小板GpIIb/IIIbへのモノクローナル抗体の治療的使用が、ヒ
ト対象における再狭窄のレベルを制限することができる（Califf など., N. Eng
l. J. Med., 330: 956-961 (1994)）。抗体は、血小板の表面上のGpIIb/IIIa受
容体に結合することができ、そしてそれにより、血小板蓄積を阻害する。このデ
ータは、ヒト冠動脈における機械的損傷の部位での血小板蓄積の阻害が、存在す
る究極的な治療応答のために有益であることを示唆する。

【０２５１】 遺伝子治療： zdint1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zdint1活性を高め、又
は阻害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異
誘発されたzdint1遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、zdint1遺伝子
が哺乳類の細胞中に導入され得る。1つの態様においては、zdint1ポリペプチド
をコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。

【０２５２】 そのようなベクターは、弱毒化された又は欠陥DNAウィルス、例えばヘルペス
単純ウィルス(HSV)、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス(EBV)、ア
デノウィルス、アデノ関連ウィルス(AAV)及び同様のものを包含するが、但しそ
れらだけには限定されない。ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いて
いる欠陥ウィルスが好ましい。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性で
はない。欠陥ウィルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを
心配しないで、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。

【０２５３】 特定のベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定され
ない：欠陥ヘルペスウィルス１(HSV1)ベクター（Kaplitt など., Molc. Cell. N
eurosci. 2: 320-30, 1991）、弱毒化されたアデノウィルス ベクター、例えば
Stratford-Perricaudat など. (J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992) により記
載されるベクター、及び欠陥アデノ−関連ウィルスベクター（Samulski など.,
J. Virol. 61: 3096-101, 1987; Samulski など., J. Virol. 63: 3822-28,1989
）。

【０２５４】 もう1つの態様においては、zdint1遺伝子は、次の文献に記載のようにして、
レトロウィルスベクターに導入され得る：Anderson など., アメリカ特許第5,39
9,346号；Mann など., Cell 33: 153, 1983; Temin など., アメリカ特許第4,65
0,764号；Temin など., アメリカ特許第4,980,289号；Markowitz など., J. Vir
ol. 62: 1120, 1988; Temin など., アメリカ特許第5,124,263 号；Dougherty
など., WIPO Publication WO95/07358 号；及びkuo など., Blood 82: 845-52,
1993。

【０２５５】 他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションによ
り導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボ
トランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felg
ner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey など
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。インビボで特定の器官
中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な
利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子標的化は、1つの領域の利点を表
す。

【０２５６】 特定細胞へのトランスフェクションの方向づけが1つの領域の利点を表すこと
は明白である。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性
を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは
明白である。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化され
たペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又
は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。

【０２５７】 身体から細胞を除去し、そして裸DNAプラスミドとしてベクターを導入し、そ
して次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子
治療のための裸DNAベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られ
ている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸
カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はDNAベクタートランスポーターの使用
により導入され得る（例えば、Wu など., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; W
u など., J. Biol. Chem. 263: 14621-24, 1988）。

【０２５８】 アンチセンス方法は、zdint1遺伝子転写を阻害するために、例えばインビボで
の細胞増殖を阻害するために使用され得る。Zdint1−コードのポリヌクレオチド
のセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１に示
されるようなポリヌクレオチド）は、zdint1−コードのmRNAに結合し、そしてそ
のようなmRNAの翻訳を阻害するよう企画される。そのようなアンチセンスポリヌ
クレオチドは、細胞培養物又は対象において、zdint1ポリペプチド−コードの遺
伝子の発現を阻害するために使用される。

【０２５９】 本発明はまた、診断に使用できるであろう試薬を提供する。例えば、zdint1 D
NA又はRNAを含んで成るプローブ、又はその副配列は、zdint1遺伝子が染色体2q3
3上に依存するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用
され得る。zdint1遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピ
ー数変化、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけに
は限定されない。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメ
ント長さ多型現象（RELP）分析、PCR技法を用いる短いタンデム反復体（STR）分
析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによ
って、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Sambrookなど., 前記
；Ausubel など., 前記；Marian, Chest 108: 255-65, 1995）。

【０２６０】 zdint1遺伝子又はそのフラグメントを発現するよう構築されたトランスジェニ
ックマウス、及び“ノックアウトマウス”（Snouwaert など., Science 257：10
83, 1992 ）として言及される、zdint1遺伝子機能の完全な不在を示すマウスは
また、当業者により生成され得る（Lowellなど., Nature 366: 740-42, 1993 ）
。それらのマウスは、zdint1 遺伝子フラグメント、及びそれによりコードされ
るタンパク質をインビボシステムにおいて研究するために使用される。

【０２６１】 染色体位置決定： 放射腺ハイブリッドマッピングは、哺乳類染色体の高い解像度の連続地図を構
成するために開発された体細胞遺伝子技法である（Coxなど., Science 250; 245
-50, 1990）。遺伝子配列の部分的又は完全な知識は、染色体放射線ハイブリッ
ドマッピングパネルによる使用のために適切なPCRプライマーの企画を可能にす
る。完全なヒトゲノムをカバーする放射線ハイブリッドマッピングパネル、例え
ばStanford G3 RHパネル及びGeneBridge 4 RHパネルは市販されている（Researc
h Genetics, Inc., Huntsville, AL）。

【０２６２】 それらのパネルは、遺伝子、配列−標識された部位（STS）、及び興味ある領
域内の他の非多型現象及び多型現象マーカーの急速な、PCRに基づく染色体位置
決定及び整列を可能にする。これは、興味ある新しく発見された遺伝子と前にマ
ッピングされたマーカーとの間を直接的に比例する物理的距離の確立を包含する
。遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）
配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばYA
C, BAC又はcDNAクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体
領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３
）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照
。

【０２６３】 配列標識された部位（STS）はまた、染色体位置決定のために独立的に使用さ
れる。STSは、ヒトゲノムにおいてユニークであるDNA配列であり、そして特定の
染色体又は染色体の領域のための参照点として使用され得る。STSは、すべての
他のゲノム配列の存在下でこの部位を特異的に検出するためにポリメラーゼ鎖反
応に使用される一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより定義される。STSは
、DNA配列に単独で基づかれているので、それらは電子データベース、例えばDat
abase of Sequence Tagged Sites (dbSTS)、GenBank (National Center for Bio
logical Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD,内に完
全に記載され得、そしてそれらの短いゲノムランドマークSTS配列内に含まれる
マッピングデータにより、興味ある遺伝子配列を調べられ得る。

【０２６４】 医薬使用のためには、本発明のタンパク質は経口、直腸、非経口、槽内、膣内
、腹腔内、局部内（粉末、軟膏、ドロップ、又は経皮用パッチ）、頬内、又は肺
又は鼻吸入により投与される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間、ボー
ラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤は、zdint1タン
パク質を、単独で又はニ量体パートナーと共に、及び医薬的に許容できるビーク
ル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものを含
むであろう。

【０２６５】 製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面
上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。配合方
法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Remington: The Scien
ce and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton,
PA, 19^th ed., 1995に開示される。治療用量は、一般的に、0.1〜100μg/kg患者
の体重/日、好ましくは0.5〜20mg/kg/日の範囲であり、そして正確な用量は処理
される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従
って、臨床医により決定される。

【０２６６】 用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、
１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与され得、又
は慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。一般的に、zdin
t1の治療的有効量は、脳、心臓、脊髄及び骨格筋における、細胞外マトリックス
再造形、瘢痕組織形成、腫瘍抑制、血小板凝集、アポプトシス、筋発生、神経発
生、電気的カップリング、血流及び/又は細胞増殖における臨床学的に有意な変
化を生成するのに十分な量である。

【０２６７】 本発明は、次の非制限的な例によりさらに例示される。 〔実施例〕 例１．EST配列の延長 本発明の新規zdint1ポリペプチドコードのポリヌクレオチドをまず、ESTデー
タベースに質問することによって同定した。この質問は、配列番号１のヌクレオ
チド1097〜1415に対する発現された配列標識（EST）を同定した。このESTに対応
するcDNAクローンを得、そして推定されるアミノ酸配列は不完全であることが決
定された。

【０２６８】 プライマーZC17,991 (配列番号４)及びZC17,992 (配列番号５)を用いて、整列
された胎児脳cDNAプラスミドライブラリーをスクリーンし、zdint1のクローンを
同定した。サーモサイクラー条件は次の通りであった：94℃で1.5分、１サイク
ル；続いて、94℃で10秒、64℃で20秒、72℃で30秒、30サイクル；続いて、72℃
で５分、１サイクル、続いて24℃で維持された。反応含有物のサンプルを４％ア
ガロースゲル上で電気泳動し、陽性プールを同定した。それらのプールを、ZC17
,992 (配列番号５)及びベクタープライマーZC13,006 (配列番号６)とのポリメラ
ーゼ鎖反応によりスクリーンした。

【０２６９】 サーモサイクラー条件は次に通りであった：94℃で1.5分、１サイクル；続い
て94℃で10秒、68℃で２分、５サイクル；続いて、94℃で10秒、62℃で20秒、72
℃で２分、25サイクル；続いて72℃で10分、１サイクル、続いて４℃で維持され
た。反応含有物のサンプルを、１％アガロースゲル上で電気泳動し、そして約1.
5kbのバンドを１％分離用ゲル上でさらに電気泳動し、そして得られるバンドを
、市販のゲル精製試薬及びプロトコール（QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiage
n, Inc., Santa Clarita, CA）を用いてゲル精製した。このフラグメントを配列
決定し、そして5’方向にzdint1のアミノ酸配列が延長したことを決定した。

【０２７０】 例２．組織分布 組織分布の分析を、Clontech (Palo Alto, CA)からのHuman Multiple Tissue
and Master Dot Blots 及び内部で調製されたヒト血管組織ブロットを用いての
ノザンブロット技法により行った。ヒト血管ブロットを次の細胞系から調製した
：ヒト臍静脈内皮細胞（Cascade Biologics, Inc., Portland, OR.）、ヒト肺動
脈内皮細胞（Cascade Biologics, Inc., Portland, OR.）、ヒト大動脈内皮細胞
（Cascade Biologics, Inc., Portland OR.）、大動脈平滑筋細胞（Clonetics,
San Diego, CA.）、ヒト腸平滑筋細胞（American Type Cultune Collection, Ma
nasas, Virginia）、正常ヒト肺線維芽細胞（Clonetics, San Diego, CA)及び平
常ヒト皮膚線維芽細胞−新生児（Clonetics, San Diego, CA.）。

【０２７１】 メッセンジャーRNAを抽出し、そしてブロットを当業界において知られている
方法により調製した。プローブを制限エンドヌクレアーゼPst1による元のcDNAク
ローンの制限消化物により得た。反応混合物を、分離用アガロースゲル上で電気
泳動し、そしてcDNAクローンからの239個の塩基対フラグメント及び223個の塩基
対フラグメントに対応する２種のバンドを、市販のゲル精製試薬及びQiagen，In
c．からのプロトコールを用いてゲル精製した。

【０２７２】 プローブを、両バンドからの精製されたDNAをプールすることによって製造し
、そして市販のキット（Rediprime DNA ラベリングシステム；AmershamCorp., A
rlington Heights, IL）を用いて、³²Pによりランダムプライムラベリングした
。次に、プローブを、NUCTRAP プッシュカラム（Stratagene Cloning Systems,
La Jolla, CA）を用いて精製した。EXPRESSHYB (Clontech)溶液を、プレハイブ
リダイゼーション及びハイブリダイゼーションのために使用した。

【０２７３】 ハイブリダイゼーション溶液は、８mlのEXPRESSHYB、80μlの剪断されたサケ
精子DNA（10mg/ml、５Prime−３Prime，Boulder，CO）、48μlのヒトCot−１ DN
A（1mg/ml、Gibco BRL）、及び57μlのラベルされたプローブ（2.3×10^-5CPM/μ
l）から成った。ハイブリダイゼーションは50℃で一晩行い、そして次に、ブロ
ットを、２×SSC及び0.1％のSDSにより周囲温度で、次に２×SSC及び0.1％のSDS
により60℃で、続いて0.1×SSC及び0.1％のSDSにより60℃で洗浄した。ブロット
を、一晩暴露し、そして展開した。

【０２７４】 約3.0kb、4.4kb及び7.5kbの３種の転写体サイズの強いシグナルを、複数組織
ノザンブロット上で心臓において観念した。同じ転写体サイズの弱いシグナルを
、脳及び脊髄において観察した。前記３種の転写体サイズのより弱いシグナルが
、骨格筋において観察された。マスタードットブロットは、脳、心臓、胎児脳及
び胎児心臓において強いシグナルを示した。ヒト血管ブロットに関しては、ヒト
大動脈内皮細胞において３〜3.5kbでの強いシグナル及び大動脈平滑筋細胞及び
正常ヒト肺線維芽細胞において弱いシグナルが観察された。

【０２７５】 例３．タンパク質精製 N−及びC−末端EE標識によるzdint1についての精製条件： E.コリ、ピチア（Pichia）、CHO及びBHK細胞を、Glu−Glu標識をコードするポ
リヌクレオチドに作用可能に結合される、配列番号１のDNA配列又はその一部を
含む発現ベクターによりトランスフェクトする。zdint1タンパク質を、E.コリ、
プチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、及び/又はチャイニーズハムスタ
ー卵巣（CHO）及び子供ハムスター肝臓（BHK）細胞のならし培地において発現す
る。E.コリ及びピチアにおいて発現されるzdint1に関しては、培地は、精製の前
、濃縮されていない。

【０２７６】 特にことわらない限り、すべての操作を、４℃で行う。BHK細胞からの合計25
ｌのならし培地を連続的に、４インチの0.2mM Millipore (Bedford, MA) OptiCa
p カプセルフィルター及び0.2mM Gelman (Ann Arbor, MI) Supercap50 を通して
濾過する。次に、材料を、3000kDa カットオフAmicon (Bed ford, MA) S10Y3膜
を備えたMillipore ProFlux A30 Tangental Flow Concentrator を用いて、約1.
3ｌに濃縮する。その濃縮された材料を再び、上記のようにして、Gelmanフィル
ターにより無菌−濾過する。

【０２７７】 プロテアーゼインヒビターの混合物を、濃縮されたならし培地に添加し、次の
最終濃度にする：2.5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA, Sigma Chemical Co.
St. Louis, MO）、0.001mMのロイペプチン（Boehringer-Mannheim, Indianapoli
s, IN）、0.001mMのペプスタチン（Boehringer-Mannheim）及び0.4mMのPefabloc
(Boehringer-Mannheim)。下記に記載のようにして調製された抗−EE Sepharose
のサンプル50.0mlを添加し、そしてその混合物を、Wheaton (Millville, NJ)
ローラー培養装置上で、４℃で18.0時間、軽く撹拌する。

【０２７８】 次に、混合物を、5.0×20.0cmのEcono-Column (Bio-Rad, Laboratories, Herc
ules, CA)中に注ぎ、そしてゲルを、30カラム体積のリン酸緩衝溶液（PBS）によ
り洗浄する。保持されなかった流れ出た画分を捨てる。280nMでの流出液の吸光
度が0.05以下に成ると、カラムを通しての流れをゼロに低め、そして抗−EE Sep
harose ゲルを、0.2mg/mlのEEペプチド（AnaSpec, San Jose, CA）を含むPBS2.0
カラム体積により洗浄する。使用されるペプチドは、配列GluTyrMetProValAspを
有する。

【０２７９】 ４℃で１時間後、流れが再開され、そして溶出されたタンパク質が集められる
。この画分を、ペプチド溶出液として言及する。次に、抗−EE Sepharose ゲル
を、2.0カラム体積の0.1Mグリシン（pH2.5）により洗浄し、そしてグリシン洗浄
物を別々に集める。グリシン−溶出された画分のpHを、少量の10×PBSの添加に
より7.0に調節し、必要なら、さらなる分析のために、４℃で貯蔵する。

【０２８０】 ペプチド溶出を、15,000分子量カットオフ膜濃縮機（Millipore, Bedford, MA
）を用いて、製造御者の説明書に従って、5.0mlに濃縮する。濃縮されたペプチ
ド溶出液を、BioCad Sprint HPLC (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA)
を用いて、1.0ml/分の流速でPBSにより平衡化された1.5×50cmのSephadex G-50
(Pharmacia, Piscataway, NJ) カラム上でのクロマトグラフィーにより、遊離ペ
プチドから分離する。

【０２８１】 ２mlの画分を集め、そして280nMでの吸光度をモニターする。280nMで吸収し、
そしてカラムの空隙率近くで溶出する材料の最初のピークを集める。この画分は
、純粋なzdint1 NEE又はzdint1 CEEである。この純粋な材料を上記のようにして
濃縮し、SDS−PAGE及び抗−EE抗体によるウェスターンブロットにより分析し、
アリコートし、そして標準の方法に従って、−80℃で貯蔵する。

【０２８２】 抗−EE Sepharose の調製： 100mlの層体積のプロテインG−Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) を、
Nalgeneの0.45ミクロンフィルター単位500mlを用いて、0.02％のアジ化ナトリウ
ムを含むPBS100mlにより３度、洗浄する。ゲルを、6.0体積の200mMのトリエタノ
ールアミン（pH8.2）（TEA, Sigma, St. Louis, MO）により洗浄し、そして900m
gの抗体を含む、同体積のEE抗体溶液を添加する。４℃での一晩のインキュベー
ションの後、結合されなかった抗体を、上記のように、５体積の200mMのTEAによ
り樹脂を洗浄することによって除去する。

【０２８３】 樹脂を２体積のTEAに再懸濁し、適切な容器に移し、そしてTEAに溶解されたジ
メチルピミルイミデート−2HCl (Pierce，Rockford, IL) を添加し、36mg/mlの
最終濃度のゲルを得る。ゲルを室温で45分間、揺り動かし、そして液体を、上記
のようにして、フィルター単位を用いて除去する。次に、ゲル上の非特異的部位
を、200mMのTEA中、20mMのエタノールアミン５体積と共に室温で10分間インキュ
ベートすることによってブロックする。次に、ゲルを、0.02％のアジ化ナトリウ
ムを含むPBS５体積により洗浄し、そしてこの溶液において４℃で貯蔵する。

【０２８４】 標識されなかったzdint1の精製： E.コリ、ピチア（Pichia）、CHO及びBHK細胞を、配列番号１のDNA配列又はそ
の一部を含む発現ベクターによりトランスフェクトする。下記方法を、E.コリ、
プチア・メタノリカ、及び/又はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）及び子供ハ
ムスター肝臓（BHK）細胞のならし培地において発現されるタンパク質のために
使用される。

【０２８５】 しかしながら、E.コリ及びピチアにおいて発現されるzdint1に関しては、培地
は、精製の前、濃縮されていない。特にことわらない限り、すべての操作を、４
℃で行う。BHK細胞からの合計25ｌのならし培地を連続的に、４インチの0.2mM M
illipore (Bedford, MA) OptiCap カプセルフィルター及び0.2mM Gelman (Ann A
rbor, MI) Supercap50 を通して濾過する。次に、材料を、3000kDa カットオフA
micon (Bed ford, MA) S10Y3膜を備えたMillipore ProFlux A30 Tangental Flow
Concentrator を用いて、約1.3ｌに濃縮する。

【０２８６】 その濃縮された材料を再び、上記のようにして、Gelmanフィルターにより無菌
−濾過する。プロテアーゼインヒビターの混合物を、濃縮されたならし培地に添
加し、次の最終濃度にする：2.5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA, Sigma Che
mical Co. St. Louis, MO）、0.001mMのロイペプチン（Boehringer-Mannheim, I
ndianapolis, IN）、0.001mMのペプスタチン（Boehringer-Mannheim）及び0.4mM
のPefabloc (Boehringer-Mannheim)。

【０２８７】 下記に概略される方法は、クロタラス・ピリダス（Crotalus v1iridus）及び
クロタラス・アトロクス（Crotalus atrox）毒物からメタロプロテアーゼ/ディ
スインテグリンを精製するために使用されるそれらの方法である（Liuなど., To
xicol. 33: 1289-1298, 1995; Shimokawa など., Arch Biochem Biophys 343: 3
5-43, 1997）。アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除及び
親和性クロマトグラフィーを包含する（但し、それらだけには限定されない）方
法の組み合わせが、標識されなかったzdint1を精製するために使用される。

【０２８８】 濃縮されたならし培地を、BioCad Sprint HPLC (PerSeptire BioSystems, Fra
mingham, MA) を用いて、10mMの硼酸緩衝液（pH9.0）、0.1MのNaCl及び2.0mMのC
aCl₂溶液により1/10に希釈する。材料を、5ml/分で、3.5×20cmのPros HQ (PerS
eptive BioSystems, Framingham, MA) カラム上に、ポンプにより送る。カラム
を、充填緩衝液により洗浄し、そして溶出液の吸光度が0.05以下である場合、カ
ラムを、0.1M〜1.0MのNaclの線状グラジエントにより展開する。zdint1 を含む
画分を、抗−zdint1ペプチド抗体を用いて、SDS−PAGE及びウェスターンブロッ
トにより同定する。

【０２８９】 zdint1−含有画分を一緒にプールし、そしてYM−10膜を備えたAmicon撹拌細胞
濃縮機を用いて濃縮する。次に、Poros HQプールを、10mMのリン酸ナトリウム（
pH7.0）により平衡化されたSephadex G-75カラム上でクロマトグラフィー処理す
る。zdint1を含む画分を、上記のようにして、同定し、そして一緒にプールし、
そしてBioCad Sprint HPLCを用いて、1.0ml/分で、1.0×５cmのPoros HAヒドロ
キシアパタイトカラムに適用する。カラムを、充填用緩衝液により洗浄し、そし
て10mM〜500mMのリン酸ナトリウムの線状グラジエントにより展開する。純粋なz
dint1を含む画分を、上記のようにして、SDS−PAGE及びウェスターンブロットに
より同定する。精製された材料をアリコートし、そして上記のようにして貯蔵す
る。

【０２９０】 例４．zdint1の染色体割り当て及び配置 zdint1を、“Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel”の市販バージョ
ンを用いて、染色体２に対してマッピングした。前記“Stanford G3 RH Panel”
は、完全なヒトゲノムの83の放射線ハイブリッドクローンの個々からのPCRable
DNA, 及び２つの対照DNA（RMドナー及びA3受容体）を含む。公的に利用できるWW
Wサーバー（http://shgc-www.stanford.edu）は、マーカーの染色体位置決定を
可能にする。

【０２９１】 “Stanford G3 RH Panel”によるzdint1のマッピングに関しては、20μlの反
応物を、PCRable 96−ウェルマイクロタイタープレート（Stratagene, La Jolla
, CA）において設定し、そして“RoboCycler Gradient 96”サーマルサイクラー
（Stratagene）に使用した。85のPCR反応物の個々は、次のものから成った：２
μlの10×Klentaq PCR反応緩衝液（CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto,
CA）、1.6μlのdNTPミックス（それぞれ2.5mM、PERKIN-ELMER, Foster City, CA
）、１μlのセンスプライマー、ZC20, 843 (配列番号12)、１μlのアンチセン
スプライマー、ZC20, 844 (配列番号13), ２μlの“RediLoad”（Research Gene
tics, Inc., Huntsville, AL）、0.4μlの50×Advantage Klentaq Polymerase M
ix (Clontech Laboratories, Inc.), 個々のハイブリッドクローン又は対照から
の25ngのDNA，及び20μlの合計体積のためへの蒸留水。

【０２９２】 反応物を、同量の鉱油により被覆し、そして密封した。RCRサイクラー条件は
次の通りであった：94℃で５分間の変性、１サイクル；94℃で45秒間の変性、66
℃で45秒間のアニーリング及び72℃で15秒間の延長、35サイクル；続いて72℃で
７分間の延長、最終１サイクル。反応物を、２％アガロースゲル上での電気泳動
により分離した（Life Technologies, Gaithersburg, MD）。

【０２９３】 結果は、12以上のLOD評点を有し、そしてマーカーからcR#10000の距離でフレ
ームワークマーカーSHGC−56733へのzdint1の連鎖を示した。周囲マーカーの使
用は、組み込まれたLDB染色体２地図上の２q33領域におけるzdint1を位置決定す
る（The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW serve
r:.Genetics.Soton.as.uk/public#Atml/）。

【０２９４】 例５．ペプチドの合成 配列番号２のアミノ酸残基437 (Cys)〜アミノ酸残基450（Cys）に対するペプ
チドを、モデル431Aペプチド合成機（Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foste
r Gity, CA）を用いて、固相ペプチド合成により合成する。Fmoc−グルタミン樹
脂（0.63mモル/g；Advanced Chemtech, Louisville, KY）を、初期支持体樹脂と
して使用する。１mモルのアミノ酸カートリッジ（Anaspec, Inc. San Jose, CA
）を、合成のために使用する。

【０２９５】 ２−（１−H−ベンゾトリアゾール−ｙ−イル−１，１，３，３−テトラメチ
ルヒルロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HBTU），1−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（HOBt），２m N，N−ジイソプロピルエチルアミン、N−メチルピロ
リドン、ジクロロメタン（すべては、Applied Biosystems/Perkin Elmerからで
ある）及びピペリジン（Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO）の混合物を、
合成試薬のために使用する。

【０２９６】 ペプチド比較ソフトウェア（Peptides International, Louisvillo, KY）を用
いて、zdint1ペプチドについての合成のための凝集可能性及び困難性レベルを推
定する合成を、単一カップリングプログラムを用いて、製造業者の規格に従って
行う。 ペプチドを、標準のTFA切断方法（Peptide Cleavage マニュアル、Applied Bi
osystem/Perkin Elmer に従って）に従って、固相から切断する。ペプチドの精
製を、C18, 10μmの半−分離用カラム（Vydac, Hesperial, CA）を用いて、RP−
HPLCにより行う。カラムからの溶出された画分を集め、そして電気スプレー質量
分光計により正しい質量及び純度について分析する。溶出された材料のプールを
集める。純粋なら、プールを組合し、凍結し、そして凍結乾燥する。

【０２９７】 例６．zdin1の抗凝集活性 凝固を阻害するzdint1タンパク質の能力を、対照として野生型zdint1を用いて
、１段階凝固アッセイにより測定する。組換えタンパク質を、５mg/mlのビタミ
ンKを含む培地において培養された細胞から、上記のようにして実質的に調製す
る。種々の量のzdin1又は組換え野生型zdint1を、50mMのトリス、pH7.5、0.1％
のBSAに希釈し、100mlにする。その混合物を、100mlのzdint1−欠失血漿及び200
mlのトロンボプラスチンC（Dade, Miami, FL; ウサギ脳トロンボプラスチン及び
11.8mMのCa²⁺を含む）と共にインキュベートする。

【０２９８】 凝固アッセイを、自動凝固タイマー（MLA Electra 800, Medical Laboratory
Automation Inc., Pleasantville, NY）により行い、そして凝固時間を、正常な
プールされたヒト血漿（1mlのzdint1活性当たり１単位を含むことが推定され；
健康ドナーからのクエン酸塩添加された血清をプールすることによって調製され
る）の１：５〜１：640希釈度により構成される標準曲線を用いて、zdint1活性
の単位に転換する。 zdint1活性は、対照サンプルに対する凝固時間の低下として見られる。

【０２９９】 例７．血小板蓄積のzdint1による阻害 zdint1を、非ヒト霊長類における機械的外傷のための動脈血栓症の部位での血
小板蓄積を阻害するその能力について分析する。大動脈内膜切断のモデルを、Lu
msdenなど. (Blood 81: 1762-1770 (1993)) により実質的に記載されるようにし
て、ヒヒに利用する。長さ１〜２cmのヒヒ大動脈断片を除去し、逆さにし、そし
て削り、大動脈の内膜及び培地の約50％を除去する。

【０３００】 動脈をその正しい配向に戻し、両端上にカニューレを挿入し、そしてヒヒにお
ける体外シャント中に配置し、それにより、そのシャントを通して、機械的に傷
つけられた動脈をヒヒの血液に暴露する。循環血液へのシャントの開始の直前、 ¹¹¹ In−ラベルされた自己由来の血小板を、動物中に静脈内注入する。傷つけら
れた動脈の部位での血小板蓄積のレベルを、同時ガンマ線カメラ映像により決定
する。

【０３０１】 血小板蓄積の阻害についてのzdin1の評価が、zdint1又は塩溶液対照のボーラ
ス注入を用いて行われ、そしてシャントの開始の直前に与えられる。傷つけられ
た動脈を、60分間、連続して測定する。 zdint1活性は、血小板蓄積の阻害として見出される。 前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために記載されてきたが、種々の
修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発明
は、請求項の範囲によってのみ制限される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、配列番号２に示されるzdint1タンパク質配列のHopp/Woods親水性プロ
フィールである。このプロフィールは、スライドする６−残基窓に基づかている
。隠されたG, S及びT残基並びに暴露されたH, Y及びW残基は無視された。それら
の残基は、小文字により図において示される。

【図２】 図２は、ADAM, MDC及びSVMPのメンバーのドメインレベル整列を示す。DISA−T
RIGAはSVMPである。MS2#HUMANはADAMである。HSUTSP1（TACE）はMDCである。HSU
52370#1はフェルチリン−β、すなわちADAM2である“sig”は、分泌シグナルペ
プチドを示し；“Propep”はプロペプチドドメインを示し；“メタル−プロテア
ーゼ”はメタロプロテアーゼドメインを示し；“disint”はディスインテグリン
ドメインを示し；“cys”はシステインに富んでいるドメインを示し；“RGD”は
トリペプチド、すなわちアルギニン−グリシン−アスパラギンを示し；そして“
TMD”はトランスメンブランドメインを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 19/04 19/02 19/08 19/04 25/28 19/08 35/00 25/28 35/04 35/00 41/00 35/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 41/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/64 Ｚ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/06 5/00 Ａ 5/10 Ｅ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ベインダー，ナンド アメリカ合衆国，ワシントン 98026，エ ドモンズ，フィフティセブンス プレース ウエスト 13919 (72)発明者 デイシャー，テレサ エー． アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，ノース イースト シックスティ ファースト ストリート 6317 (72)発明者 ビショップ，ポール ディー． アメリカ合衆国，ワシントン 98024，フ ォール シティ，サウス イースト エイ ス ストリート 28425 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD11 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 BA01 BA08 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 CA18 CA28 CA53 CA56 CA59 DA01 NA14 ZA15 ZA16 ZA36 ZA54 ZA96 ZB21 ZB26 ZC41 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA15 ZA16 ZA36 ZA54 ZA96 ZB21 ZC41

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２の１４個のアミノ酸の連続配列を含んでなる単離
   されたポリペプチド分子。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基437〜450を含ん
   でなる請求項１記載の単離されたポリペプチド分子。
3. 【請求項３】 前記ポリペプチド分子が、82〜232個の長さのアミノ酸であ
   る請求項１の単離されたポリペプチド分子。
4. 【請求項４】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基164〜382である
   請求項３記載の単離されたポリペプチド分子。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基383〜464である
   請求項３記載の単離されたポリペプチド分子。
6. 【請求項６】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基465〜696である
   請求項３記載の単離されたポリペプチド分子。
7. 【請求項７】 （ａ）配列番号２の残基164〜382を含んで成るポリペプチド
   分子； （ｂ）配列番号２の残基383〜464を含んで成るポリペプチド分子； （ｃ）配列番号２の残基465〜696を含んで成るポリペプチド分子； （ｄ）配列番号２の残基438〜449を含んで成るポリペプチド分子； （ｅ）配列番号２の残基164〜464を含んで成るポリペプチド分子； （ｆ）配列番号２の残基164〜696を含んで成るポリペプチド分子； （ｇ）配列番号２の残基383〜696を含んで成るポリペプチド分子； （ｈ）配列番号２の残基164〜449を含んで成るポリペプチド分子； （ｉ）配列番号２の残基438〜696を含んで成るポリペプチド分子；及び （ｊ）配列番号２の残基１〜696を含んで成るポリペプチド分子； から成る群から選択された、単離されたポリペプチド分子。
8. 【請求項８】 配列番号２の１４個のアミノ酸の連続配列を含んで成るポリ
   ペプチド分子をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
9. 【請求項９】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基437〜450を含ん
   でなる請求項８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
10. 【請求項１０】 前記ポリペプチド分子が、82〜232個の長さのアミノ酸で
    ある請求項８の単離されたポリヌクレオチド分子。
11. 【請求項１１】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基146〜382であ
    る請求項８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
12. 【請求項１２】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基383〜464であ
    る請求項８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
13. 【請求項１３】 前記ポリペプチド分子が、配列番号２の残基465〜696であ
    る請求項８記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
14. 【請求項１４】 （ａ）配列番号２の残基164〜382を含んでなるポリペプチ
    ド分子； （ｂ）配列番号２の残基383〜464を含んでなるポリペプチド分子； （ｃ）配列番号２の残基465〜696を含んでなるポリペプチド分子； （ｄ）配列番号２の残基438〜449を含んでなるポリペプチド分子； （ｅ）配列番号２の残基164〜464を含んでなるポリペプチド分子； （ｆ）配列番号２の残基164〜696を含んでなるポリペプチド分子； （ｇ）配列番号２の残基383〜696を含んでなるポリペプチド分子； （ｈ）配列番号２の残基164〜449を含んでなるポリペプチド分子； （ｉ）配列番号２の残基438〜696を含んでなるポリペプチド分子；及び （ｊ）配列番号２の残基１〜696を含んでなるポリペプチド分子； から成る群から選択されたポリペプチド分子をコードする単離されたポリヌクレ
    オチド分子。
15. 【請求項１５】 第１ゼグメント及び第２セグメントを有する融合タンパク
    質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記第１セグメントがプ
    ロテアーゼドメインを有するポリペプチドをコードする第１ポリペプチドを含ん
    で成り、そして前記第２セグメントが配列番号２の残基383〜464の間の14アミノ
    酸の連続配列を有するポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含んで
    成り、そして前記第１セグメントが前記第２セグメントに対してアミノ末端側に
    位置することを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 前記プロテアーゼドメインが、 ａ）ディスインテグリンプロテアーゼのメンバーであるプロテアーゼドメイン
    ；及び ｂ）配列番号２のアミノ酸残基164〜382に対して少なくとも80％同一であるプ
    ロテアーゼドメインから成る群から選択される請求項１５記載の単離されたポリ
    ヌクレオチド。
17. 【請求項１７】 ａ）配列番号２の残基383〜464に対して少なくとも80％同
    一であるポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド分子；及び ｂ）上記ａ）に対して相補的であるポリヌクレオチド分子； から成る群から選択される、ポリペプチド分子をコードする単離されたポリヌク
    レオチド分子。
18. 【請求項１８】 前記ポリヌクレオチド分子が、 ａ）配列番号２の残基383〜696に対して少なくとも80％同一であるポリペプチ
    ド分子をコードするポリヌクレオチド分子；及び ｂ）上記ａ）に対して相補的であるポリヌクレオチド分子； から成る群から選択されている請求項１７記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
19. 【請求項１９】 前記ポリヌクレオチド分子が、 ａ）配列番号２の残基１〜696に対して少なくとも80％同一であるポリペプチ
    ド分子をコードするポリヌクレオチド分子；及び ｂ）上記ａ）に対して相補的であるポリヌクレオチド分子； から成る群から選択されている請求項１７記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
20. 【請求項２０】 次の作用可能に連結された要素： ａ）転写プロモーター； ｂ）請求項１記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント；及び ｃ）転写ターミネーター； を含んで成る発現ベクター。
21. 【請求項２１】 前記DNAセグメントがさらに、親和性標識をコードする請
    求項２０記載の発現ベクター。
22. 【請求項２２】 請求項２１記載の発現ベクターが導入されており、DNAセ
    グメントによりコードされたポリペプチドを発現する、培養された細胞。
23. 【請求項２３】 ポリペプチドの製造方法であって、請求項２２記載の細胞
    を培養し、それにより、前記細胞がDNAセグメントによりコードされるポリペプ
    チドを発現し；そして前記ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る方法。
24. 【請求項２４】 請求項１記載のポリペプチドと、細胞とをインビボ及びイ
    ンビトロで組合すことによって、細胞−細胞相互作用を調節するための方法。
25. 【請求項２５】 前記細胞が、 ａ）心臓からの組織； ｂ）脳からの組織； ｃ）脊髄からの組織；及び ｄ）骨格筋からの組織； から成る群から選択された組織に由来する、細胞−細胞相互作用を調節するため
    の方法。
26. 【請求項２６】 ａ）配列番号７； ｂ）配列番号８； ｃ）配列番号９； ｄ）配列番号１０；及び ｅ）配列番号１１； から成る群から選択されるアミノ酸の連続配列を含んで成る単離されたポリペプ
    チド分子。
27. 【請求項２７】 請求項２６記載の単離されたポリペプチド分子をコードす
    る単離されたポリヌクレオチド分子。