JP2002518314A - 小分子塩化物輸送 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）は、リン酸化および細胞内ヌクレオチドによって制御される塩化物（Ｃｌ^-）チャンネルである。ＣＦＴＲは、気道上皮細胞における主要Ｃｌ^-輸送経路である。ＣＦに起因する上皮貫通Ｃｌ^-輸送の異常およびそれに続く液輸送欠損は、ＣＦＴＲタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子突然変異の結果である。本発明は、Ｃｌ^-および液輸送を治療するためにＣＦ上皮中に人工Ｃｌ^-輸送経路としてのイオノフォアの新規な使用を目指している。イオノフォア、および特に、小分子イオノフォアは、ＣＦを治療する強力な新規手段を表す。本発明は、また、哺乳類にイオノフォアを投与することによる気道上皮細胞および他の上皮細胞の完全な単層での塩化物分泌を発生させるイオノフォア使用を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９８年６月１９日出願の米国仮出願Ｎｏ．６０／０８９，８８
０の利益を主張するものである。

【０００２】 本発明は、嚢胞性繊維症の新規治療法に関する。更に詳しくは、本発明は、嚢
胞性繊維症の治療剤としての人工塩化物（クロリド）チャンネルまたは輸送体の
使用に関する。本発明は、また、細胞膜ハロゲン化物透過性を増加する方法に関
する。

【０００３】 細胞脂質二重層は、高度に荷電分子に非透過性である。しかしながら、イオノ
フォアは、特定の無機イオンに対し、細胞膜の透過性を増加することができる。
例えば、抗生物質バリノマイシンはカリウムイオン（Ｋ⁺）と複合体を形成し、
細胞膜を容易に通過する。脂質二重層に溶解している小疎水性分子である、イオ
ノフォアは、特定のイオンと脂質可溶性複合体を形成するので、細胞二重層を超
えてイオンを輸送することができる。

【０００４】 イオノフォアの２つのクラス、即ち、移動性イオン輸送体およびチャンネル形
成体、は輸送されるイオンの電荷を遮蔽することによって、荷電分子を細胞壁の
疎水性内部に透過することができる。バリノマイシンは移動性イオン輸送体であ
り、膜の１つの側でＫ⁺を拾いあげ、二重層を通過して拡散し、そして他の側に
Ｋ⁺を放出する。グラミシジンＡはチャンネル形成イオノフォアであり、チャン
ネルを通って二重層を通過し、イオンを選択的に流動させる膜貫通チャンネルを
形成し、二重層を通過する。

【０００５】 多くのイオノフォアは、抗生物質として有用である、なぜなら、輸送イオンに
加え、イオノフォアは、細胞膜を破壊し、生命力のある細胞内容を漏出させ、そ
して細胞破壊を導くからである。近年、新規抗生物質の探索において、イオノフ
ォアおよびその他の膜破壊化合物の設計および合成に大きな関心が寄せられてき
た。よく研究された例としては、アンフォテリシンＢ（ＡｍｐＢ）（Ｎａｇａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，113，ｐｐ．７２３７−７
２４０（１９９１）がある。ＡｍｐＢは、膜貫通性孔を生成するイオノフォアで
ある。これらの孔は、生命力のある細胞成分の漏出をおこし、細胞破壊の引き金
を引き、ＡｍｐＢを有用な抗生物質にしている。次いで、ＡｍｐＢの構造要素は
、類似した機能特性を有する化合物を設計するための出発点となっている。これ
ら化合物の多くは、例えば、５−アンドロステン−３Ｂ，１７Ｂ−ビス［（オキ
シカルボニル）ヘキサエチレングリコール］は、興味あるイオン移動性性質を有
している［Ｓｔａｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１
６，ｐｐ．６６７７−６６８２（１９９４）］。

【０００６】 抗生物質スクアラミンは、サメ、Ｓｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓの組織
から最近単離された新規ステロール−スペルミジン複合体である［Ｍｏｏｒｅ
ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，ｐｐ．１
３５４−１３５８（１９９３）］。このステロイドは、スペルミジンと陰イオン
性胆汁塩中間体の付加化合物であるが、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対す
る強力な抗細菌活性が明らかにされた。残念なことに、スクアラミンは、自然に
極少量見出されるのみである。

【０００７】 ＡｍｐＢに機能的に同等な化合物の探索において、スクアラミンのいくつかの
模倣体が合成された［Ｓａｄｏｗｎｉｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，１１７，ｐｐ．６１３８−６１３９（１９９５）］。造られたステロー
ル−スペルミン複合体は、スクアラミンに構造的にも類似しており、異常な程に
抗生物質の性質を示している。微生物の広範なスペクトルに対する強力な活性を
示す化合物の能力は、特に興味がある。ヨーロッパ特許出願ＷＯ第９６３８４６
４号、ＷＯ第９６３２４０４号、およびＷＯ第９００４４０１号は、抗生物質と
してのこのクラスの化合物の有用性を記載しており、それらの開示は、ここに参
照することにより取り入れられている。

【０００８】 それらの広範な抗生物質活性に加えて、スクアラミンの合成模倣体は、細胞膜
および輸送陰イオン選択性の独特なイオノフォア活性を有している［Ｄｅｎｇ，
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，ｐｐ．８９７５−８９７
６（１９９６）］。陰性に荷電した二重層を通過するイオンの輸送は、中性のも
のが通過する輸送より好ましい；そしてＮａ⁺輸送活性は観察されないが、効果
的なＣｌ^-輸送活性は観察される。

【０００９】 嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、上皮細胞内張りと共に多くの臓器に影響する複雑な
疾病である。致死的遺伝障害は、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ
）として知られているタンパク質をコードする遺伝子における突然変異の存在に
起因し、Ｃｌ^-イオンに対する上皮細胞内張りの透過性に影響する［Ｗｅｌｓｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，８，８２１−８２９（１９９２）］。ＣＦＴＲ
は、上皮細胞の細胞膜を通してＣｌ^-イオンの通過を制御する［Ｗｕｉｎｔｏｎ
，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，４，２７０９−２７１７（１９９０）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ
ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，４２４−４２７（１９９３）；Ｓｍｉｔｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，１５９０−１５９７（
１９９４）］。上皮細胞の細胞膜を通過するイオンの制御を通して、ＣＦＴＲは
液の流動を制御している。ＣＦにおいては、ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異は、欠損
上皮透過Ｃｌ^-輸送を引き起こし、そしてそれゆえに欠損液輸送となる。

【００１０】 イオン輸送異常をおこす遺伝的突然変異は、異常粘液分泌、炎症、感染および
組織損傷に至る。ＣＦＴＲは、汗腺、膵臓、生殖管、および気道を含む種々の上
皮細胞における活性イオン輸送−介在液輸送を制御している。例えば、気道上皮
において、電解質および液輸送の欠損は、気道浄化の障害、および塩感受性デフ
ェンシンの殺菌活性欠損の原因となり、次いでＣＦ患者の再感染および肺破壊を
もたらすと信じられている。［Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
６２，４２４−４２７（１９９３）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８
５，２２９−２３６］１９９６］；Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，
８８，５５３−５６０（１９９７）］。ＣＦにかかった患者は、肺感染の再発お
よび気道遮断、小腸閉塞、膵臓傷害、胆道閉塞による肝硬変、男性不妊、および
遂には死に至りがちである。

【００１１】 いくつかの治療方法が、ＣＦの治療と同時に開発されつつある。それらは、１
）抗菌活性および気道の粘液内張りの粘性を改善する薬剤の使用［Ｓｍｉｔｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５、２２９−２３６（１９９６）；Ｇｏｌｄｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８８，５５３−５６０（１９９７）］、２）ＣＦＴ
ＲのＣｌ^-チャンネル欠損を補償する、代りのＣｌ^-チャンネルを活性化する薬剤
の使用、３）タンパク質および遺伝子増加療法。（Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ，７３，１２５１−１１２５４，１９９３）、および４）突然変異表現
型を逆転させる薬剤の使用を含む。現在は、本病態の効果的な治療法はない。

【００１２】 従って、本発明は、Ｃｌ^-および液輸送を治療するための、ＣＦ上皮中におけ
る人工Ｃｌ^-輸送経路としてのイオノフォアの新規な使用を目指している。イオ
ノフォアおよび特に非ペプチドイオノフォア、そして特に、小分子イオノフォア
は、ＣＦを治療する強力な新規手段を代表する。好適な小分子イオノフォアは、
分子量が２０００以下、または好ましくは、１７５０以下、またはより好ましく
は、１５００以下、または更により好ましくは、１０００以下である。これらお
よびその他の利点を達成するために、および、本発明の目的によれば、具体化さ
れそして広範に記載されているように、本発明は、患者にイオノフォアの有効量
を投与することによってＣＦを治療する。

【００１３】 別の観点によれば、本発明は、また、哺乳類にイオノフォアを投与することに
よる気道上皮細胞および他の上皮細胞の完全な単層での塩素イオン分泌を発生さ
せるイオノフォア使用を包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで気
道上皮におけるＣｌ^-分泌の欠損を直すことができる。

【００１４】 更に別の観点において、本発明は、哺乳類にイオノフォアを投与することによ
って、上皮細胞の細胞上皮ハロゲン化物および陰イオン透過性を増加するために
、イオノフォアを使用することを包含する。

【００１５】 本発明は、また、人工Ｃｌ^-輸送経路として有用である；上皮細胞の完全な単
層で塩化物分泌を発生する；および細胞膜ハロゲン化物透過性を増加させる、新
規なイオノフォアに関する。

【００１６】 本発明は、また、遊離化合物としての、またはそれらの医薬として許容される
塩としての、イオノフォアの医薬組成物を提供する。更に、本発明のイオノフォ
アは、担体、賦形剤、増量剤、分散剤、クリーム、ゲル、溶液およびその他の医
薬処方において、共通の添加剤を包含する医薬組成物における有効成分である。

【００１７】 更なる観点において、本発明は、静脈内、経口、点滴、吸入、局所、腹腔内、
皮下、または筋肉内経路によって、本発明のイオノフォアおよび医薬組成物を投
与する方法を提供する。イオノフォアおよび医薬組成物は、例えば、カプセル、
粉末、錠剤、液体、溶液、およびエアゾル化溶液の形態で投与される。また、本
発明の実施内にあるのは、細胞膜を通る陰イオン輸送に欠損を与える、哺乳類に
おける疾病またはその他の状態を治療する方法である。

【００１８】 本発明の、更なる特徴および利点は、以下の記載に示され、および部分的には
記載から明らかであり、あるいは本発明の実施によって学習し得るであろう。本
発明の目的およびその他の利点は、記載および請求の範囲および付記する図面に
おいて、特に指摘される方法によって実現され達成されるであろう。

【００１９】 本発明は、患者にイオノフォアの有効量を投与することによってＣＦを治療す
る方法を目指している。本方法は、嚢胞性繊維症患者における塩化物アンバラン
スを補正するのに有用である。本発明の実施は、理論にのみ限定されるべきでは
ない。

【００２０】 本発明の実施において、イオノフォア、好ましくは小分子イオノフォアは、脂
質二重層を通して陰イオンを選択的に輸送する。有利には、イオノフォアは、細
胞膜ハロゲン化物透過性を増加する人工Ｃｌ^-チャンネルを形成する。スクアラ
ミンの模倣、例えばＧＬ−１７２（図１参照）、は陰性に荷電した脂質二重層を
通してイオンの輸送を助け、そして二重層を通したＮａ⁺のような陽イオンの輸
送には効果がないことが知られている。Ｄｅｎｇ，ＪＡＣＳ，１１８，８９７５
−８９７６（１９９６）を参照。しかしながら、Ｄｅｎｇの研究に基づくと、ス
クアラミンまたは他のイオノフォアの模倣体は嚢胞性繊維症患者の塩化物アンバ
ランスを補正するのに効果的であることを予測する合理的な根拠はない。

【００２１】 ＣＦＴＲは、気道上皮細胞における主要なＣｌ^-輸送経路である。ＣＦに起因
する異常上皮貫通Ｃｌ^-輸送およびそれに続く液輸送の欠損は、ＣＦＴＲタンパ
ク質をコードする遺伝子の遺伝的突然変異の結果である。気道上皮において、イ
オンおよび液輸送の欠損は、気道粘膜線毛浄化の障害、および塩感受性デフェン
シンの殺菌活性欠損に至り、次いでＣＦ患者の再感染および肺破壊をもたらすと
信じられている。本発明の実施によれば、ＣＦ上皮にイオノフォアを投与すると
、上皮細胞に人工Ｃｌ^-輸送経路を形成する。人工Ｃｌ^-輸送経路の導入は、異常
液輸送を治療する。

【００２２】 ＧＬ−１７２の構造は公知である。（Ｄｅｎｇ，ＪＡＣＳ １９９６，１１８
，８９７５−８９７６）。ＧＬ−１７２を、他の代表的な小分子イオノフォアと
共に、図１に示す。本発明において有用な小分子イオノフォアは、以下の構造を
有する：

【００２３】

【００２４】 式中、 （Ｒ₁）は、ＨまたはＯＨ； （Ｒ₂）は、ＨまたはＯＨ、ここで（Ｒ₁）および（Ｒ₂）は、同じかまたは異な
り； （Ｒ₃）は、分岐および非分岐である飽和および不飽和のアルキル鎖であり、好
ましい実施態様は、（Ｒ₃）は（ＣＨ_x）_m群であり、式中ｘ＝０、１、または２
、および、ｍ＝０から１０； （Ｘ）は、ＳＯ₄ ^-、ＰＯ₄ ^2-、ＨＯＰＯ₃ ^-、またはＣＯ₂ ^-； （Ｙ）は、結合基または不存在；および （Ｒ₄）は、アミン、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンである。

【００２５】 結合基（Ｙ）は、アミン（Ｒ₄）をコレステロール誘導体につながっている。
（Ｙ）基の例は、＞Ｃ＝Ｏ；−ＣＨ₂−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−
；−ＣＨ₂−ＮＨ−；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−；および-ＮＨ（＝Ｏ）−Ｏ−を包含
する。結合基の配座は重要ではない。本発明の実施において有用な更なる結合基
は、３または４原子以下を含み、（Ｒ₄）とコレステロール誘導体の間の共有結
合の架橋を形成する基である。例としては、−（ＣＨ₂）₂−；−（ＣＨ₂）₃−；
−（ＣＨ₂）−（Ｃ＝Ｏ）−；−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、式中、ｎは
好ましくは４またはそれ以下；またはグリシニル、アラニル、β−アラニル、セ
リニル、その他のような小アミノ酸、を包含する。

【００２６】 （Ｒ₄）は、窒素原子の数および各窒素を分離している炭素原子の数の両者で
変化しうるアミン構造（第一級、第二級および第三級アミンを包含する）を示す
。これらの構造は、アミン、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンとして
公知である。アミン、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンは、アルキルア
ミンまたはポリアルキルアミン鎖中のどのような炭素または窒素原子においても
、結合基（Ｙ）（または、もし結合基がない場合は、ステロイドに直接）につな
がっている。

【００２７】 ここで定義されるアルキルアミンまたはポリアルキルアミン基は、１つないし
それ以上の炭素−炭素二重結合を含み、そのようなアルキルアミンの使用は、そ
れゆえ、本発明の実施内である。アルキルアミンまたはポリアルキルアミン基は
、飽和または不飽和であるので、用語「アルキルアミン」は、本発明の記載にお
いてアルケニルアミンを包含する。アルキルアミンまたはポリアルキルアミンは
、分岐または非分岐でもよい。分岐アルキルアミンまたはポリアルキルアミンは
、第一級アルキルアミンまたはポリアルキルアミン鎖のどのような炭素または窒
素原子に連結しているアルキル、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンを
も含む。第一級アルキルアミンまたはポリアルキルアミン鎖は、結合基（Ｙ）に
（もし、結合基がなければ、直接ステロイドに）連結している。

【００２８】 本発明の好ましい実施態様において、（Ｒ₄）はスペルミンまたはスペルミジ
ンである。スペルミンまたはスペルミジンは、スペルミンまたはスペルミジン基
のいかなる炭素または窒素原子によっても結合基（Ｙ）に（または、もし、結合
基が存在しない場合、ステロイドに直接）連結している。

【００２９】 代表的なアルキルアミンは、以下を包含する： （ａ）ＮＨ₂−（ＣＨ₂）_z−； （ｂ）ＮＨ₃ ⁺−（ＣＨ₂）_z−； （ｃ）ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_z−Ｎ［−ＣＨ₂−ＣＨ₃］−（Ｎ原子により（Ｙ）に
連結） （ｄ）［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_y］ＮＨ−（ＣＨ₂）_z−；および （ｅ）［［ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_x］［ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_y］］−Ｎ−（ＣＨ₂）_z
−； 式中、ｘ、ｙおよびｚは１から10である。

【００３０】 代表的なポリアルキルアミンは、以下を包含する： （ａ）−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_x］_m−ＮＨ₃ ⁺； （ｂ）Ｈ−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_y］_p−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_z］_q−； （ｃ）Ｈ−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_x］_n −Ｎ−ＣＨ₂−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_y］_p−
［ＮＨ−（ＣＨ₂）_z］_q−ＮＨ₃ ⁺、［鎖の中央部でＮ原子によって（Ｙ）に連結
］； （ｄ）Ｈ−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_w］_m−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_x］_n −［ＮＨ−（Ｃ
Ｈ₂）_y］_p−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_z］_q− （ｅ）Ｈ−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_w］_m−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_x］_n −Ｎ−［［ＣＨ ₃ （ＣＨ₂）_y］Ｎ］−（ＣＨ₂）_z−ＮＨ₃ ⁺；および （ｆ）ＮＨ₃ ⁺−［ＣＨ［（ＣＨ₂）_x−ＮＨ₃ ⁺］−ＣＨ₂］−ＣＨ−［ＮＨ−（
ＣＨ₂）_w］_m−ＮＨ₃ ⁺、（鎖の中央部で炭素原子によって（Ｙ）に連結）； 式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは１から１０である。

【００３１】 交互のアミンおよびアルキル部分のいかなる組合せも、本発明の範囲内の（Ｒ ₄ ）構造を創造する。更に、アミンおよびアルキル部分のこの交互の組合せは、
（Ｒ₄）基中のいかなる炭素または窒素原子によっても結合基（Ｙ）または直接
ステロイドに連結し得る。

【００３２】 本発明の実施に従った小分子イオノフォアは、また以下のステロイド基の種々
の構造を包含する。

【００３３】

【００３４】 上に示したように、好ましい実施態様において、ステロイド基は、ステロイド
骨格の環の１７位から、または多くのステロイドにおける１７位から通常延長す
る腕（例えば、２０位および２２位）から、あるいは該腕（Ｒ₃）の、いかなる
伸長された、短縮された、分岐または非分岐形からも（Ｙ）（または、もし（Ｙ
）がない場合は、直接（Ｒ₄））に結合している。この実施態様においては、ス
テロイド基は、ステロイド骨格の第３位の（Ｘ）に連結されている。ステロイド
基の配座は、即ち、どのようにステロイドが（結合基（Ｙ）と共にまたは無しに
）（Ｘ）および（Ｒ₄）基に連結しているかは、非常に変化し得る。ステロイド
のどのような環の位置または置換基も、一般的にとりつけの点として使うことが
できる。例えば、別の好ましい実施態様においては、ステロイド基は、ステロイ
ド骨格の環の３位から、（Ｙ）［または、もし（Ｙ）がない場合は、直接（Ｒ₄
）］に結合し、そしてステロイド基は、１７位において、又は１７位から通常延
長している腕から（例えば、２０位および２２位）、或いは該腕のどのような伸
長された、短縮された、分岐したまたは非分岐の形（Ｒ₃）からも、以下のよう
に、（Ｘ）に連結する。

【００３５】

【００３６】 本発明の更なる実施態様において、ステロイドは、種々の程度の不飽和を包含
する。即ち、二重結合がステロイド骨格内の多くの位置に存在し得る。例えば、
二重結合は、５位と６位、または７位と８位の間、あるいは５位と６位、および
７位と８位の間に、以下のように存在し得る：

【００３７】

【００３８】 本発明の実施において有用なイオノフォアの更なる群は以下の構造を有する：

【００３９】

【００４０】 式中、 （Ｒ₁）は、ＨまたはＯＨ； （Ｒ₂）は、ＨまたはＯＨ、ここで（Ｒ₁）および（Ｒ₂）は、同じかまたは異な
り； （Ｒ_3a）および（Ｒ_3b）は、分岐および非分岐である飽和および不飽和のアルキ
ル鎖であり、（Ｒ_3a）および（Ｒ_3b）の好ましい実施態様は、（Ｒ₃）は（ＣＨ_x ）_m基、式中ｘ＝０、１、または２およびｍ＝０から１０である。（Ｒ_3a）およ
び（Ｒ_3b）は、同じかまたは異なる； （Ｙ₁）および（Ｙ₂）は結合基、または不存在（全部存在するか、または、いず
れかが或いは全てが不存在である）；そして （Ｒ₅）は、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンである。

【００４１】 結合基（Ｙ₁）および（Ｙ₂）は、アミン（Ｒ₅）をコレステロール誘導体に連
結している。（Ｙ₁）および（Ｙ₂）、および本発明の実施において有用である、
追加の（Ｙ₁）および（Ｙ₂）基の例は、結合基（Ｙ）について前に記載したもの
と同じである。（Ｙ₁）および（Ｙ₂）は、同じかまたは異なる。さらに、一方が
不存在で他方が存在する、どちらも不存在ではない、または両者が不存在であり
得る。

【００４２】 （Ｒ₅）は、窒素原子の数および各窒素を分離している炭素原子の数の両者が
変化し得る、アミン構造（第一級および第二級および第三級アミンを包含する）
を示す。（Ｒ₅）は、ステロイド基に結合する２つの点の存在のゆえに、前に記
載したアルキルアミンおよびポリアルキルアミンとは異なっている。アルキルア
ミンまたはポリアルキルアミンは、ステロイド骨格の２つの異なった位置で（結
合基の存在または非存在で）ステロイドに連結している。アルキルアミンまたは
ポリアルキルアミンは、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン鎖中のいずれ
もの炭素または窒素原子における結合基リンカーにも（あるいは、もし結合基が
ない場合はステロイドに直接）結合し得る。さらに、ステロイドのいかなる環の
位置または置換基も、一般的に、ステロイド骨格に結合する点として使用するこ
とができる。

【００４３】 個々に定義するアルキルアミンまたはポリアルキルアミン基は、１つまたはそ
れ以上の炭素−炭素二重結合を包含することができ、そしてそのようなアルケニ
ルアミンの使用は、それゆえに、本発明の実施の範囲内である。アルキルアミン
またはポリアルキルアミン基は、飽和または不飽和であり得るので、用語「アル
キルアミン」は、本発明の記載におけるアルケニルアミンを包含する。アルキル
アミンおよびポリアルキルアミンは、また、分岐または非分岐であり得る。分岐
アルキルアミンまたはポリアルキルアミンは、第一級アルキルアミンまたはポリ
アルキルアミン鎖の、いかなる炭素または窒素原子につながったアルキル、アル
キルアミン、またはポリアルキルアミン鎖をも含む。第一級アルキルアミンまた
はポリアルキルアミン鎖は、それで、結合基（Ｙ₁およびＹ₂）（または、もし結
合基のいずれかがない場合はステロイドに直接）つながっている。

【００４４】 本発明の好適な実施態様において、（Ｒ₅）はスペルミンまたはスペルミジン
である。スペルミンまたはスペルミジンは、スペルミンまたはスペルミジン基の
各末端の近傍の炭素または窒素原子によって結合基に（または、もし、結合基が
存在しない場合、ステロイドに直接）連結している。代表的なアルキルアミンお
よびポリアルキルアミンは、（Ｒ₄）の記載の中に存在する。（Ｒ₅）の部分を使
用するために、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンにおける２つの異なっ
た炭素または窒素原子の（Ｒ₄）のアミン部分をつなぐことは、当業者にとって
簡単な仕事である。

【００４５】 アミンおよびアルキル部分の交互の組合せは、本発明の範囲内の（Ｒ₅）を創
造する。さらに、アミンおよびアルキル部分のこの交互の組合せを、（Ｒ₅）基
における２つの炭素または窒素原子によって、結合基（Ｙ₁およびＹ₂）または、
ステロイドに直接連結することができる。アミン部分の最小および最大長は、も
ちろん、アミン部分とステロイド骨格の間の２つの接続点によって制限される。

【００４６】 本発明の実施によれば、この実施態様は、ステロイド基としての種々の構造を
包含する。上記したように、好適な実施態様において、ステロイド基は、ステロ
イド骨格の環の１７位から、または多くのステロイドの１７位から正常に延長さ
れた腕から（例えば、２０位および２２位）、または該腕の伸張された、短縮さ
れた、分岐した、あるいは非分岐の形から、およびステロイド骨格の環の３位か
ら、（Ｙ₁）および（Ｙ₂）（または、もし（Ｙ）のいずれかまたは両者がない場
合は、（Ｒ₅）に直接）結合する。ステロイド基の配座は、即ち、どのようにス
テロイドが（結合基（Ｙ₁およびＹ₂）と共にまたは無しに）（Ｒ₅）基の２つの
位置に連結しているかは、非常に変化し得る。ステロイドのどのような環の位置
または置換基も、一般的に結合の点として使うことができる。

【００４７】 本発明の、更なる実施態様において、ステロイドは種々の程度の不飽和を包含
する。即ち、二重結合が、以前の実施態様に記載したように、ステロイド骨格内
の多数の位置に存在し得る。

【００４８】 さらに、本発明の実施において有用なイオノフォアの第３の群は、膜をつなぐ
構造として記載される。理論に限定されずに、膜をつなぐ構造は、膜をつなぐイ
オンチャンネルを形成すると信じられている。二重層を通って形成された膜貫通
チャンネルは、チャンネルを通過し、そして二重層を横切って、選択的にイオン
を流動させる。

【００４９】 本発明の、好適な実施態様において、膜をつなぐ構造は、ジ−ステロイド構造
のそれである。本発明の実施において有用なジ−ステロイド化合物は、以下を包
含する：

【００５０】

【００５１】 および

【００５２】

【００５３】 式中、 （Ｘ）は、ＳＯ₄ ^-、ＰＯ₄ ^2-、ＨＯＰＯ₃ ^-、またはＣＯ₂ ^-； （Ｒ₁）は、ＨまたはＯＨ； （Ｒ₂）は、ＨまたはＯＨ、ここで（Ｒ₁）および（Ｒ₂）は、同じかまたは異な
り； （Ｒ₃）（ａ、ｂ、およびｃ）は、分岐または非分岐である飽和または不飽和の
アルキル鎖である。（Ｒ_3a）および（Ｒ_3b）の好ましい実施態様は、（ＣＨ_x）_m 基、式中ｘ＝０、１、または２、およびｍ＝０から１０である。（Ｒ_3c）は２つ
のステロイド基を（もし存在すれば、結合基（Ｙ₁）および（Ｙ₂）を通じて）１
つまたは２つのアミン基、（Ｒ₄）または（Ｒ_4a）および（Ｒ_4b）（もし存在す
れば、結合基（Ｙ₃）および（Ｙ₄）を通じて）に連結している。 （Ｒ₃）の好ましい実施態様は、以下を包含する：

【００５４】

【００５５】 （Ｙ₁）、（Ｙ₂）、（Ｙ₃）および（Ｙ₄）は、結合基であるか、または不存在
（全部存在するか或いは全てが不存在である）；そして （Ｒ₄）は、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンである。

【００５６】 結合基（Ｙ₁）、（Ｙ₂）、（Ｙ₃）および（Ｙ₄）は、アミン（Ｒ₄）または（
Ｒ_4a）および（Ｒ_4b）を、ジ−コレステロール誘導体化合物につないでいる。（
Ｙ₁）、（Ｙ₂）、（Ｙ₃）および（Ｙ₄）、および本発明の実施において有用な付
加的（Ｙ₁）、（Ｙ₂）、（Ｙ₃）および（Ｙ₄）基の例は、結合基（Ｙ）について
前に記載されたものと同じである。（Ｙ₁）、（Ｙ₂）、（Ｙ₃）および（Ｙ₄）は
、同じか、または異なる。さらに、これらは、いずれかが不存在であり、全て存
在し、或いは全て不存在である。

【００５７】 （Ｒ₄）または（Ｒ_4a）および（Ｒ_4b）は、窒素原子の数および各窒素原子を
分離している炭素原子の数の両者において変化し得るアミン構造（第一級および
第二級および第三級アミンを包含する）を示す。Ｒ₄（（Ｒ_4a）および（Ｒ_4b）
を含む）の好ましいアミン、アルキルアミン、およびポリアルキルアミン構造は
、上記に開示されている。

【００５８】 本発明の実施によると、この実施態様は、ステロイド基として種々の構造を包
含している。好ましい実施態様において、上記に示したように、ステロイド基は
、ステロイド骨格の環の１７位から、あるいは多くのステロイドにおける１７位
から通常延長された腕（例えば、２０位および２２位）から、あるいは該腕（も
し存在するなら、上記したように、（Ｙ）および（Ｒ）基を通して）伸張した、
短縮した、分岐のまたは非分岐の形態から、互いに連結されている。ステロイド
基は、上記した類似の部分を使ってステロイド骨格の環の３位からつながること
もできる。ステロイド基の配座は、即ち、どのようにステロイドが［（Ｙの）お
よび（Ｒ₃の）存在または不存在で］互いに、（Ｒ₅）基または基等に、および（
Ｘ）に、連結しているかは、非常に変化し得る。ステロイドのどのような環の位
置または置換基も、一般的に結合の点として使うことができる。

【００５９】 本発明の、更なる実施態様において、ステロイドは種々の程度の不飽和を包含
し得る。即ち、二重結合が、以前の実施態様に記載したように、ステロイド骨格
内の多数の位置に存在し得る。

【００６０】 ジ−ステロイド型構造の、なお更なる実施態様は、以下に示す、（Ｘ）基がス
テロイド部分につながった化合物の一群である：

【００６１】

【００６２】 式中、置換基は、他のジ−ステロイドで上記に定義した通りである。

【００６３】 ジ−ステロイド化合物の、（Ｘ）の更なる好適な実施態様は

【００６４】

【００６５】 式中、（Ａ）は−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−で、ｍ＝２ないし１０、または（Ａ）は不
存在である。

【００６６】 本発明は、また、遊離化合物としての、またはそれらの医薬として許容される
塩としての、イオノフォアの医薬組成物を提供する。更に、本発明のイオノフォ
アは、担体、賦形剤、増量剤、分散剤、クリーム、ゲル、溶液およびその他の医
薬処方において、共通の添加剤を包含する医薬組成物における有効成分を包含す
る。

【００６７】 更なる観点において、本発明は、静脈内、経口、点滴、吸入、局所、腹腔内、
皮下、経粘膜または筋肉内経路によって、本発明のイオノフォアおよび医薬組成
物を投与する方法を提供する。イオノフォアおよび医薬組成物は、例えば、カプ
セル、粉末、錠剤、液体、溶液、およびエアゾル化溶液の形態で投与される。更
に、噴霧装置、粉末吸入器、患者の体腔への注射、徐放性製剤、付加的ミセルを
使用したデリバリー、ゲル、またはリポソーム、および静脈注射は、投与の代表
的方法である。

【００６８】 好適な実施態様において、イオノフォアは、ＣＦによって影響されるＣｌ^-お
よび液輸送を治療するために、気道上皮に直接経口投与することができる。

【００６９】 本発明の他の重要な実施態様は、人工Ｃｌ^-チャンネルの導入と組合せて、抗
生物質活性の使用である。気道上皮における液輸送の欠損は、ＣＦ患者の肺に再
細菌感染をもたらす。スクアラミン模倣体の公知の抗生物質活性は、感染の治療
に使用することができ、人工塩化物チャンネルを提供し、塩化物分泌を改善する
。

【００７０】 化合物の投与量は、イオノフォアの半減期、イオノフォアまたはその分解産物
の可能性のある副作用、投与経路、患者の状態、その他のような因子によって代
り得る。そのような因子は、当業者によって決定することができる。もちろん、
日量を基本にした正確な投与量水準は、至適治療反応を与えるために医師によっ
て適合されることを意味している。

【００７１】 （実施例）実施例１ イオノフォアの合成 ＧＬ−１７２ ＧＬ−１７２の合成図式を、図２に示す。５−コレイン酸−２２，２３−ビス
ノル−３６−オール（４８７ｍｇ、１．４１ｍＭ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）ｍＬ）
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１７８ｍｇ、１．５５Ｍ）に懸濁し、そし
てＤＣＣ（４３７ｍｇ、２．１２ｍＭ）を加えた。反応は、５０℃オイルバス中
で３時間攪拌した。反応混合物をろ過し、塩基（重炭酸ナトリウム）後処理を行
った。得られた粗製物（１．０９ｇ）を、シリカゲルカラム（９５ｇ）上に乾燥
充填し（１０ｇシリカ）、５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出した。所望の物質
を単離し、¹ＨＮＭＲにより、ヒドロキシビスノルコレイン酸-ＮＨＳエステル（
５７１ｍｇ、９２％）と確認した。

【００７２】 ヒドロキシビスノルコレイン酸-ＮＨＳエステル（４６０ｍｇ、１．０４ｍＭ
）をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、三酸化硫黄ピリジン複合体（４９９ｍ
ｇ、３．１４ｍＭ）を加えた。反応は、４時間攪拌し、水性後処理を行った。粗
製物（５７０ｍｇ）を精製せずに使用した。

【００７３】 スルフォン酸塩（５０ｍｇ、０．５３８ｍＭ）のＤＭＦ懸濁液をスペルミン（
１８９ｍｇ、０．９３４ｍＭ）のＤＭＦ（１７．５ｍＬ）溶液中に加え、反応は
１．５時間攪拌して行った。溶媒を除去し、得られた粗製物を、フラッシュカラ
ムクロマトグラフィ（５０ｇ、シリカゲル）で、４０：２５：２、４０：２５：
５、および４０：２５：１０の勾配で溶出することによって精製した。所望の物
質を単離し、¹ＨＮＭＲにより、ヒドロキシビスノルコレイン−スペルミン−ス
ルフォン酸エステル、Ｌｉｐｉｄ１７２（１４０ｍｇ、３８％）と確認した。

【００７４】 ＧＬ-１７２の類縁体 ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｓｎｏｒｃｈｏｌｅｎｉｃメチルエステル−イミダゾールギ
酸塩の合成 ヒドロキシビスノルコレイン酸（４９８ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を１：１ク
ロロホルム／メタノール（１００ｍｌ）および濃硫酸（５．０ｍｌ）に懸濁した
。反応は、６時間還流し水性後処理を行った。得られた粗製物を、５０％酢酸エ
チル／ヘキサンで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィ（５０ｇ、シリカ
ゲル）によって精製した。所望の物質を単離し、¹ＨＮＭＲにより、ヒドロキシ
ビスノルコレイン酸−メチルエステル（３０７ｍｇ、５９％）と確認した。

【００７５】 ヒドロキシビスノルコレイン酸−メチルエステル（３１５ｍｇ、０．８７９ｍ
ｍｏｌ）を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、Ｈｕｎｉｇ塩基（０．１５ｍｌ
、０．８７９ｍｍｏｌ）を加え、次いでホスゲン（トルエン中１．９３Ｍ，２．
２８ｍｌ、４．３９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一夜攪拌した後、イミ
ダゾール（６５８ｍｇ、９．６７ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（５０ｍｌ）溶液を
加えた。反応混合物を、再び、一夜攪拌し、水性後処理を行った。粗製物３０％
酢酸エチル／ヘキサンで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィ（４０ｇ、
シリカゲル）によって精製した。所望の物質を単離し、¹ＨＮＭＲにより、ビス
ノルコレイン酸−メチルエステル−イミダゾールギ酸塩（３３６ｍｇ、９２％）
と確認した。

【００７６】 メチルエステル-イミダゾールギ酸塩（３３０ｍｇ、０．７２９ｍｍｏｌ）の
塩化メチレン溶液をスペルミン（３６９ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡ
Ｐ（１５ｍｇ）の塩化メチレン（２５ｍＬ）溶液中に加え、反応混合物を２日間
攪拌した。水性後処理を行い、得られた粗製物を、フラッシュカラムクロマトグ
ラフィ（３５ｇ、シリカゲル）で、４：２５：２、４０：２５：５、および４０
：２５：１０、クロロホルム／メタノール／水酸化アンモニア、の勾配で溶出す
ることによって精製した。所望の物質を単離し、¹ＨＮＭＲにより、ビスノルコ
レイン酸−メチルエステル−スペルミンカルバメート（１７０ｍｇ、４０％）、
Ｌｉｐｉｄ１８２、と確認した。

【００７７】実施例２ ＳＰＱによって評価した細胞膜塩化物透過性 ＣＦ（ΔＦ５０８）患者から生じた気管支の表面上皮細胞系（ＣＦＴ１）を、
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、Ｃｈａｐｅｌ
Ｈｉｌｌ、のＤｒ．Ｙａｎｋａｓｋａｓらによって確認した。細胞は、前に記載
した方法で培養された。（Ｙａｎｋａｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，ＡｍＪ．Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．，２６４，Ｃ１２１９−１２３０（１９９３））。簡潔には、ＣＦＴ
１細胞を５０，０００細胞／ｃｍ²の密度で１２ウエル細胞培養プレートに播種
し、２％ウシ胎仔血清、５μｇ／ｍｌインスリン、３．７μｇ／ｍｌ上皮細胞増
殖補助品、２５ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子、３０ｎＭトリヨードチロニン、１μＭ
ヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、および１０ｎｇ／ｍｌコレ
ラトキシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＨａｍ’ｓＦ１２培地で培養した。

【００７８】 Ｃｌ^-チャンネル活性は、以前に報告されたようにして、ハロゲン化物感受性
フルオロフォア、６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）−キノリニウム（
ＳＰＱ）で評価した［Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．（１９９４）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，
２７５（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４）：Ｃ，（１９９８）］。ＳＰＱ蛍光
は、最初、以下の組成（ｍＭ）を有するＮａｌバッファー中で３０分まで細胞を
インキュベートすることによって消光された：１３５ＮａＩ、２．４Ｋ₂ＨＰＯ₄ 、０．６ＫＨ₂ＰＯ₄、１ＭｇＳＯ₄、１ＣａＳＯ₄、および１０Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォン酸、ｐＨ＝７．４。２分間の
、ベースライン蛍光（Ｆｏ）を測定した後、ＮａＩ溶液を、ＮａＩをＮａＮＯ₃
に置換した溶液で置き換えた。５分後、フォルスコリン（２０μＭ）およびＩＢ
ＭＸ（１００μＭ）の混合物を加えて、ＣＦＴＲＣｌ^-チャンネル活性を促進し
た。

【００７９】 ハロゲン化物透過性の増加は、ＳＰＱ蛍光のより急速な増加によって反映され
る。それは、むしろ信号の絶対変化よりも相対変化速度であり、陰イオン透過性
を評価するのに重要な変化である。絶対レベルの相異は、ＳＰＱ負荷、細胞の大
きさ、あるいは試験している細胞の数におけるグループ間の定量的相異を反映し
ている。データは、時間ｔ（Ｆｔ）における蛍光からベースライン蛍光（Ｆｏ、
イオン置換前２分間のＩ^-の存在下で測定された平均蛍光）を引いた値の、平均
±標準誤差で示され、各条件下において得られた結果の代表である。各実験につ
いて、５０から１００の間の細胞が、与えられた日に試験され、各条件下の試験
は、少なくとも、２日間繰り返した。各実験について、反応は、対照と非処理細
胞で得られたものと、比較された。細胞は、もし、対照細胞で得られた信号より
大きな蛍光の変化速度を示したなら、陽性として採点した。上記に特定した条件
下で、対照細胞は、加えられたｃＡＭＰアゴニストに非応答性であった。応答細
胞で観察されたＳＰＱ蛍光の変化速度には、広いスペクトルが見られた。通常、
我々は、ＳＰＱ蛍光の増加速度を表す応答曲線の傾斜が、ｃＡＭＰアゴニストで
の刺激に続いて≧０．３６４であったなら、細胞を応答性として採点した。応答
は、不均一であるので、各実験において最大の応答を示す細胞の１０％について
、データを示した。全分野について評価したが、提示の明確さのために、応答し
たものの上位１０％のみを図示した。

【００８０】 ＣＦＴ１細胞は、初代ヒトＣＦ気道上皮細胞の生体電気の性質を保持している
が、しかしながら、ＣＦＴＲＣｌ^-チャンネル活性は、欠損している。フォルス
コリン（１０μＭ）およびＩＢＭＸ（１００μＭ）は、ＣＦＴ１細胞の１％より
少ないＳＰＱ蛍光の小さな増加をもたらしたのみである。本研究において、ＤＭ
ＳＯ（０．５％、ｖ／ｖ）、ＧＬ−１７２の溶媒、はＳＰＱ蛍光の増加をもたら
さなかった。対照的に、ＣＦＴ１細胞の１０％以上において、ＧＬ−１７２（１
００μＭ、ＤＭＳＯに溶解）は、ＳＰＱ蛍光の有意な増加を誘導し（図２）、陰
イオン透過性の増加を示した。

【００８１】 ＣＦ気道上皮（ＣＦＴ１）細胞をＳＰＱに負荷した。ＮＯ₃ ^-を、０分時におい
て、浴液中でＩ^-に置換した。ＧＬ−１７２（１００μＭ、ＤＭＳＯに溶解、四
角）または等容量のＤＭＳＯ（０．５％、ｖ／ｖ；円）を、イオン置換（矢印）
後６分に浴液に加えた。データは図２に示すが、時間（Ｆ₁）における蛍光から
ベースライン蛍光（Ｆ₀、イオン置換前２分間に測定された平均蛍光）を引いた
値の、平均±標準誤差で示されている。

【００８２】実施例３ Ｉ_sc測定により評価したＣｌ^-透過性 初代ヒト気管気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＮＨＢＥ細胞は、
一度継代接種し、約５×１０⁵細胞／ｃｍ²の密度で、コラーゲン被覆半透性イン
サート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＰＣＦ、０．４ｍｍ孔径、０．６ｃｍ²増殖領域
）に、直接接種し、気−液境界面で増殖させた［Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２６２，４２４−４２７（１９９３）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．
，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：（Ｊｕｌｙ２０）（１９９８）
］。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ
）およびＢＥＧＭ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ）として供給された増殖因子および抗菌性物質を補充したＢｒｏｎｃｈ
ｉａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＥＢＭ）の混
合物（１：１）を一日おきに加えた。上皮透過性抵抗（Ｒ₁）を一日おきに、第
３日（ｄａｙ３）から、オームメーターを使用してモニターした。フィッシャー
ラット甲状腺上皮（ＦＲＴ）細胞［Ｚｕｒｚｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．，１２１：１０３１−１０３９（１９９３）］を、培地が５％ウ
シ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭである点を除いて、ＮＨＢＥ細胞
として培養した。

【００８３】 分極気道上皮細胞を、電極でインターフェースを接触させ、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉ
ｎｇｅｒｓ液（１３５ｍＭ・ＮａＣｌ、２．４ｍＭ・Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．６ｍＭ・
ＫＨ₂ＰＯ₄、１．２ｍＭ・ＣａＣｌ₂、１．２ｍＭ・ＭｇＣｌ₂、２５ｍＭ・Ｎａ
ＨＣＯ₃、および１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）、９５％Ｏ₂および５％ＣＯ ₂ で通気した、改変Ｕｓｓｉｎｇチェンバーに装着した［Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ
．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１８９９７−１９００７
（１９９４）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，
Ｌ５２７−５３７（１９９６）］。粘膜側には、ＮａＣｌを１３５ｍＭグルコン
酸ナトリウムと置換し、上皮透過性Ｃｌ^-濃度勾配を作成した。上皮透過電圧は
、０ｍＶにクランプされ、決められた短絡電流（Ｉ_sc）を通電した後、５分間測
定した。安定化したベースラインが達成された後、細胞を、連続的に、１００μ
Ｍアミロライド（アミロライド感受性Ｎａ⁺チャンネルを推定するため）、１０
μＭフォルスコリンおよび１００μＭ・３−イソブチル−１−メチル−キサンチ
ン（ＩＢＭＸ）を含有する混合物（ＣＦＴＲ・Ｃｌ^-チャンネルを通して上皮透
過性Ｃｌ^-電流を促進するため）および１０ないし１００μＭ・５−ニトロ−２
（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（ＮＰＰＢ、ＣＦＴＲ・Ｃｌ^-チャン
ネルを阻害するＣｌ^-チャンネルブロッカー）で処置した。［Ｈａｓｅｇａｗａ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８，１４７７−１４７９（１９９２）］。
アミロライドおよびＮＰＰＢは粘膜溶液に加えたが、フォルスコリンおよびＩＢ
ＭＸ混合物は粘膜下組織溶液に加えた。

【００８４】 Ｉ_sc測定により評価したＣｌ^-透過性に対するＧＬ−１７２の効果 Ｒ₁が≧１０００Ω．ｃｍ²をおこす分極ＮＨＢＥ細胞を、Ｉ_sc測定用改変Ｕｓ
ｓｉｎｇチェンバーの１／２ずつ２つの間に装着した。図３ａは、アミロライド
（１００μＭ）を、Ｉ_SC減少を起こす頂点側に添加し、アミロライド感受性Ｎａ ⁺ 伝導度の存在を示す。連続してアミロライドが存在すると、フォルスコリン（
１０μＭ）およびＩＢＭＸ（１００μＭ）の混合物は、有意なＩ_scの増加を誘導
する。このＩ_scの増加は、フォルスコリンおよびＩＢＭＸの混合物は、細胞内ｃ
ＡＭＰの最大増加を促進するので、これらの実験条件下でｃＡＭＰ媒介チャンネ
ルを通しての最大Ｃｌ^-伝導度を表す。６つの独立した実験からのデータは、Ｉ_{s c} の平均増加、１１．３±１．６μＡ／ｃｍ²（平均±ＳＥＭ）が、混合物によっ
て発生したことを示した。Ｉ_scの増加はｃＡＭＰ媒介Ｃｌチャンネルにより媒介
されていることを確かめるために、ＮＰＰＢ（１００μＭ）を反応を阻害するの
に使った。

【００８５】 ＧＬ−１７２に対応したＩ_scの増加は、図３Ｂに示す。ＧＬ−１７２を、ＤＭ
ＳＯに溶解し、累積的に頂点側に加えた。アミロライド（１００μＭ）の存在下
で、ＧＬ−１７２は、Ｉ_scの投与依存的増加を促進した。反応は迅速で持続的で
、フォルスコリンおよびＩＢＭＸによる促進と類似していた。ＤＭＳＯは、ＧＬ
−１７２の溶媒として容量／容量濃度の２倍まで、Ｉ_scの有意な増加をもたらさ
なかった。５つの独立した実験からのデータは、図４に要約してある。統計的解
析は、有意（ｐ＜０．０１）であることを示唆している。ＧＬ−１７２によって
誘導された、１０および１００μＭの濃度でのＩ_scの増加は、フォルスコリンお
よびＩＢＭＸの混合物によって促進された最大応答の約２０％および３５％であ
った。

【００８６】 実験を、また、ｃＡＭＰ媒介応答を有しないＦＲＴ細胞で行った。ＧＬ−１７
２は、ＦＲＴ細胞において類似の応答をもたらした。これらの結果は、ＮＨＢＥ
細胞においてＧＬ−１７２によって誘導されたＩ_scの増加は、ＣＦＴＲＣｌ^-チ
ャンネルまたはその他のｃＡＭＰ媒介Ｃｌ^-チャンネルとは独立していることを
示唆している。

【００８７】実施例４ トランスジェニックＣＦマウスの鼻上皮に対するイオノフォアの効果
トランスジェニックＣＦマウスにおける鼻の電位差（ＰＤ）測定 ＦＡＢＰ−ＣＦＴＲ二トランスジェニック（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２６６，１７０５−１７０８（１９９５））マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。これら研究に使用した動物のいくつかは、
Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで飼育された。ＣＦマウスの鼻上皮を
通過するＰＤは、以前に記載されたようにして測定した［Ｇｒｕｂｂ ｅｔ ａ
ｌ．Ｎａｔｕｒｅ３７１，８０２−８０６（１９９４）；Ｚｅｉｈｅｒ ｅｔ
ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６，２０５１−２０６４（１９９５）；
Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８：６７１
−６８０（１９９７）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ９：（Ｊｕｌｙ２０）（１９９８）］。簡潔には、リンゲル溶液（１
３５ｍＭ・ＮａＣｌ、２．４ｍＭ・Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．６ｍＭ・ＫＨ₂ＰＯ₄、１．
２ｍＭ・ＣａＣｌ₂、１．２ｍＭ・ＭｇＣｌ₂、および１０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ、ｐ
Ｈ７．４）を満たした２３ゲージ皮下針を、リファレンス電極として使用した。
探索電極は（ＰＥ−２０チューブから引き出し、リンゲル溶液で満たす）、鼻腔
内に約５ｍｍ挿入した。電極は、寒天ブリッジによって電気的に組合され（３％
寒天、１Ｍ・ＫＣｌ）、流動ブリッジの液流に挿入され、甘こう電極によってデ
ジタル電圧計（Ｉｓｏ−ミリボルトメーター；Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続された。信号は、ストリップチャートレコー
ダー（Ｓｅｒｖｏｃｏｄｅｒ ｍｏｄｅｌ６２２１）を使用して記録した。

【００８８】 電極の配置に続いて、鼻通過をリンゲル溶液で、マイクロポンプ（ｍｏｄｅｌ
５５−３２０６；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して５−２０μ
ｌ／分で３ないし５分間、別のカテーテルを通して灌流した。一度、ベースライ
ンに達すると、灌流液を、１００μＭアミロライド含有リンゲル溶液に転換し、
新しい定常状態に達するまで、灌流を続ける。そして灌流溶液を、アミロライド
の存在下、ＧＬ−１７２またはＤＭＳＯを含有する低Ｃｌ^-リンゲル溶液（Ｎａ
Ｃｌをグルコン酸Ｎａによって置換された）で置換した。

【００８９】 データは、平均±標準誤差として表した。試験した動物の数または実施した個
々の実験は、「ｎ」で表示した。統計解析は、ＡＮＯＶＡを使用し、次いでＳｔ
ｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓテストを用いて行った。２つの群のみを
含む実験においては、不対Ｓｔｕｄｅｎｔテストを平均を比較するのに使用した
。０．０５より小さいｐ値は、統計的に有意とみなされた。

【００９０】 トランスジェニックＣＦマウスの鼻上皮におけるＧＬ−１７２の効果 これら動物における上皮Ｎａ⁺およびＣｌ^-輸送の欠損を回復するアデノウイル
スおよび陽イオン性脂質／ＤＮＡ遺伝子供与ベクターの能力を前もって評価する
ために、トランスジェニックＣＦマウスの鼻粘膜を使用した。［Ｇｒｕｂｂ ｅ
ｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３７１，８０２−８０６（１９９４）；Ｚｅｉｈｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６，２０５１−２０６４（１９９
５）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８：
６７１−６８０（１９９７）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，９：（Ｊｕｌｙ２０）（１９９８）］。ＣＦヌル（−／−）
マウスの有用性は、腸内合併症によって限定され得るので［Ｓｎｏｗａｅｒｔ
ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，１０８３−１０８８（１９９２）］、我々
は、ＦＡＢＰ−ＣＦＴＲ（−／−）二トランスジェニックマウスを用いた［Ｚｈ
ｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，１７０５−１７０８（１９９４）
］。ＦＡＢＰ−ＣＦＴＲ（−／−）二トランスジェニックマウスの鼻上皮は、Ｃ
Ｆヌル（−／−）マウスおよびＣＦに罹患したヒトで観察される電気生理学的異
常を表している。

【００９１】 図５は、野生型（図５Ａ）およびＣＦ（図５Ｂ）マウスにおける、基礎電位差
、アミロライドによって誘導されるＰＤ変化、およびアミロライド存在下におけ
るＮａＣｌをグルコン酸ナトリウムに続いて置換したのに応じたＰＤ変化、の代
表的な追跡を示す。ＮａＣｌのグルコン酸ナトリウムとの置換は、ＣＦ二トラン
スジェニック動物において小さな脱分極を起こすが、正常マウスにおいては著し
い超分極を生ずる。低Ｃｌ^-リンゲル溶液にＧＬ−１７２を添加すると、ＣＦマ
ウスで超分極を誘導した（図５Ｃ）。４頭のマウス中３頭において、ＧＬ−１７
２（１００μＭ）は、超分極を起こした（それぞれ、２．５、３、および６．５
ｍＶ）。低濃度（２０ｍＭ）では、超分極（４．２ｍＶ）は、試験した３頭の動
物中１頭のみに観察された。統計解析（図６）は、ＧＬ−１７２（１００μＭ）
によって誘導される超分極応答は、有意である（ｐ＜０．０５）であることを示
している。

【００９２】実施例５ ＧＬ−１７２処理ＩＢＥ−１細胞のホールセルパッチクランプ解析 ホールセルパッチクランプレコーディング ホールセルパッチクランプレコーディングを、以前記載されたと本質的に同じ
方法で実施した。Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２
７５（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４）：Ｃ（１９９８）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ
ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：（Ｊｕｌｙ２０），（１
９９８）。簡潔には、カバーグラス上の細胞を、ニコンｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微
鏡に装着したチェンバー内においた。パッチピペットは、２−４ＭΩの抵抗を有
する。ホールセル立体配置は、ギガシールを破裂させるための付加的パルス吸引
で達成した。ペプチド溶液（細胞内）は、ｐＨ７．４で、以下を含む：１３０ｍ
Ｍ・ＣｓＣｌ、２０ｍＭ・ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ｍＭ・２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭエチレングリ
コール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（Ｅ
ＧＴＡ）、１０ｍＭ・Ｍｇ−ＡＴＰ、および０．１ｍＭ・ＬｉＧＴＰ、ｐＨ７．
４。浴用溶液（細胞外）は、また、ｐＨ７．４で以下を含む：１４０ｍＭ−メチ
ル−Ｄ−グルタミン（ＮＭＤＧ）、２ｍＭ・ＣａＣｌ₂、１ｍＭ・ＭｇＣｌ₂、０
．１ｍＭ・ＣｄＣｌ₂、１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ・ＣｓＣｌ、および１０
ｍＭグルコース。細胞内および細胞外溶液は、Ｃｌ^-は溶液中で唯一の顕著な浸
透性イオンであるので、Ｃｌ^-電流のみ試験するために設計された。

【００９３】 アスパラギン酸が、細胞外Ｃｌ^-濃度を変化する実験において、置換陰イオン
として使用された。ＧＬ−１７２（１、１０および１００μＭ、ＤＭＳＯに溶解
）、またはＤＭＳＯの等濃度（０．５％および１％ｖ／ｖ）を示したように、浴
溶液に加えた。電流記録は、同一細胞について、ＧＬ−１７２またはＤＭＳＯの
異なった濃度を含有する溶液に暴露前、間、および後に行った。全ての実験は、
室温（２２℃）で行った。電流は２ＫＨｚでろ過された。データ取得および解析
は、ｐＣＬＡＭＰ５．５．１ソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。

【００９４】 ＧＬ−１７２で処理したＩＢＥ細胞のホールセルパッチクランプ解析 観察された信号がＣｌ^-電流であることを確認するために、ホールセルパッチ
クランプ実験をＣＦＴ１細胞で行った。図８（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）は、そ
のような実験の１つから追跡した代表的な電流を示す。これらの研究で、保持電
位は、０ｍＶ（電位依存性Ｎａ⁺およびＣａ²⁺チャンネルを不活化する）であり
、そして電圧は、−１００ｍＶから＋８０ｍＶまで、２０ｍＶ増分で段階的に、
ホールセル電流を活性化するように、増加させた。カルシウムおよびカリウムか
らの電流は、細胞内および外溶液の両者からＫ⁺を取り除くことによって、そし
て細胞外溶液中には１００μＭ・Ｃｄ²⁺および細胞内溶液中には２０ｍＭ・ＴＥ
Ａおよび１０ｍＭＥＧＴＡを含ませることによって、最小化させた。これらの条
件下で、ＧＬ−１７２で未処置の細胞において小電流が見出された（図８Ａ）。
さらに、溶媒濃度（１％ｖ／ｖ）の２倍までのＤＭＳＯは、ホールセル電流を活
性化することはできなかった（図８Ｂ）。

【００９５】 １または１０μＭの濃度でＧＬ−１７２は、試験したどんな細胞においてもホ
ールセル電流を増加させなかった。しかしながら、ＧＬ−１７２は、高濃度（３
０μＭ）において、試験した細胞の３０％でホールセル電流の有意な増加を誘導
した。さらに、１００μＭの濃度において、ＧＬ−１７２は、試験した細胞の全
てで、ホールセル電流の大きな増加をもたらした（図８Ｃ）。電流は、４０分間
維持され（試験した最大時間）、そして対照バッファーでウオッシュアウトした
後も持続された。

【００９６】 最後に、ＧＬ−１７２の存在および不存在での電流／電圧の関係を図８Ｄに要
約する。ＧＬ−１７２で処理した細胞におけるホールセル電流は、直線的電流−
電圧関係を示し、そして時間依存性であった。これらの性質は、野生型ＣＦＴＲ
で観察されたものと定性的に類似していた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９１）。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、代表的な小分子イオノフォアを示す。

【図２】 図２は、小分子イオノフォアの合成経路を示す。

【図３】 図３は、ＳＰＱ解析によって求めた、陰イオン透過性のＧＬ−１２７誘導増加
を示す。

【図４】 図４は、ヒト気管気管支の上皮（ＮＨＢＥ）細胞における、ＧＬ−１７２誘導
（ΔＩ_sc）の代表的な追跡を示す。１０μＭアミロリド添加後、１０μＭフォル
スコリンおよび１００μＭＩＢＭＸ（Ａ）またはＧＬ−１７２の混合物を、異な
った累積濃度で分極化上皮の頂端部に加えた。

【図５】 気道上皮細胞での短絡電流（ΔＩ_sc）におけるＧＬ−１７２誘導変化の要約。

【図６】 ＣＦマウスにおけるＧＬ−１７２誘導過分極。鼻上皮を通した電位差を、アミ
ロリド投与後、およびアミロリド存在下でのＣｌ^-置換（低Ｃｌ^-）の基礎条件下
で、（Ａ）野生型（＋／＋）マウスおよび（Ｂ）ホモ接合ＦＡＢＰ−ＣＦＴＲ二
トランスジェニック（−／−）ＣＦマウスにおいて測定した。（Ｃ）は、ＧＬ−
１７２（１００μＭ）を含有する低Ｃｌ^-溶液の灌流に応答する過分極を示すホ
モ接合（−／−）ＣＦマウスからの追跡である。

【図７】 野生型およびＣＦマウスにおけるＧＬ−１７２誘導過分極の要約。ＧＬ−１７
２存在または不存在の低Ｃｌ^-溶液に応じた鼻上皮の電位差（ΔＰＤ）の変化を
アミロリド添加（それぞれ、２０および１００μＭ）の存在下で測定した。デー
タは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧４）で表す。^*は、ＣＦ（−／−）と比較したｐ＜０
．０５を示す。

【図８】 ＣＦＴ−１細胞の全細胞パッチクランプ解析の要約。示した電流は、２０ｍＶ
増加の段階での、０ｍＶの固定電位から−１００ＭＶと＋８０ｍＶの間の電圧ス
テップに応じている。ＣＦＴ１細胞（Ａ）、およびＤＭＳＯ（１％ｖ／ｖ）処理
ＩＢＥ−１細胞（Ｂ）からの基礎（未処理）条件下での代表的な全細胞電流を示
す。（Ｃ）は、ＧＬ−１７２（１００μＭ、ＤＭＳＯに溶解）でＣＦＴ１細胞を
処理した後（Ａ）におけるように同じＣＦＴ１細胞を用いて記録したものである
。（Ｄ）において、基礎条件下（四角）、１０μＭ・ＧＬ−１７２（三角）を加
えた後、および次いで４８ないし７２時間１００μＭ・ＤＳＧ（１０μｇ／ｍｌ
）で処理（円）、で得られた電流−電圧関係を要約したものである。電流は、直
線的電流電圧行動を示し、そして時間依存性を示さなかった。データは、平均＋
／−ＳＥＭとして表す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年９月８日（２０００．９．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー、エドワード、アール アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ナテ ィック、 ベイコン ストリート 56 (72)発明者 チェン、セン、エイチ アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ウェ ルスリイ、 ウォール ストリート 50 (72)発明者 レーン、マチュー アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ケン ブリッジ、 チャウンシイ ストリート 24、アパートメント 10 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 NA14 ZA592 ZA662 ZC542 4C086 AA01 AA02 DA11 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA66 ZC54 4C091 AA01 BB01 CC01 DD01 EE03 FF01 GG01 HH01 JJ03 KK01 LL01 MM03 NN01 PA02 PA05 PB03 QQ01

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非ペプチド性イオノフォアの有効量を投与する工程を含む、
   上皮細胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる方法。
2. 【請求項２】 該非ペプチド性イオノフォアは、式、 および 式中、二重結合は、５位と６位の間または７位と８位の間に存在してもよいか
   、または５位と６位および７位と８位の間に同時に存在してもよく； （Ｒ₁）は、ＨおよびＯＨから選択され； （Ｒ₂）は、ＨおよびＯＨから選択され； （Ｒ₃）は、飽和および不飽和、分岐および非分岐、のアルキル鎖から選択され
   ； （Ｘ）は、ＳＯ₄ ^-、ＰＯ₄ ^2-、ＨＯＰＯ₃ ^-、およびＣＯ₂ ^-から選択され； （Ｙ）は、結合基または不存在であり；そして （Ｒ₄）は、アミン、アルキルアミン、およびポリアルキルアミンから選択され
   る； を含む群から選択されたものである、請求項１記載の上皮細胞の完全な単層にお
   いて塩化物分泌を発生させる方法。
3. 【請求項３】 該（Ｒ₃）が、（ＣＨ_x）_m、式中、該ｘは０、１および２か
   ら選択され、そして該ｍは１ないし１０から選択される、請求項２記載の上皮細
   胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる方法。
4. 【請求項４】 該非ペプチド性イオノフォアが、 式中、二重結合は、５位と６位の間または７位と８位の間に存在してもよいか
   、または５位と６位および７位と８位の間に同時に存在してもよく； （Ｒ₁）は、ＨおよびＯＨから選択され； （Ｒ₂）は、ＨおよびＯＨから選択され； （Ｒ_3a）および（Ｒ_3b）は、飽和および不飽和、分岐および非分岐、のアルキル
   鎖から選択され； （Ｙ₁）および（Ｙ₂）は、結合基または不存在であり；そして （Ｒ₅）は、アルキルアミン、およびポリアルキルアミンから選択される； を含む群から選択されたものである、請求項１記載の上皮細胞の完全な単層にお
   いて塩化物分泌を発生させる方法。
5. 【請求項５】 該（Ｒ_3a）および（Ｒ_3b）が、（ＣＨ_x）_m、式中、該ｘは０
   、１および２から選択され、そして該ｍは１ないし１０から選択される、請求項
   ４記載の上皮細胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる方法。
6. 【請求項６】 該非ペプチド性イオノフォアが、式、 および 式中、二重結合は、５位と６位の間または７位と８位の間に存在してもよいか
   、または５位と６位および７位と８位の間に同時に存在してもよく； （Ｘ）は、ＳＯ₄ ^-、ＰＯ₄ ^2-、ＨＯＰＯ₃ ^-、ＣＯ₂ ^-、および から選択され； （Ｒ₁）は、ＨおよびＯＨから選択され； （Ｒ₂）は、ＨおよびＯＨから選択され； （Ｒ_3a）、（Ｒ_3b）および（Ｒ_3c）は、飽和および不飽和、分岐および非分岐、
   のアルキル鎖から選択され；そして （Ｒ₄）は、アルキルアミン、およびポリアルキルアミンから選択される； を含む群から選択されたものである、請求項１記載の上皮細胞の完全な単層にお
   いて塩化物分泌を発生させる方法。
7. 【請求項７】 該（Ｒ_3a）および（Ｒ_3b）が、（ＣＨ_x）_m、式中、該ｘは０
   、１および２から選択され、そして該ｍは１ないし１０から選択される、請求項
   ６記載の上皮細胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる方法。
8. 【請求項８】 該（Ｒ_3c）が、 から選択されたものである、請求項６記載の上皮細胞の完全な単層において塩化
   物分泌を発生させる方法。
9. 【請求項９】 該（Ｘ）が、 である、請求項６記載の上皮細胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる
   方法。
10. 【請求項１０】 該小分子イオノフォアが、 である、請求項２記載の上皮細胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる
    方法。
11. 【請求項１１】 該小分子イオノフォアが、 である、請求項４記載の上皮細胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる
    方法。
12. 【請求項１２】 該小分子イオノフォアが、 である、請求項６記載の上皮細胞の完全な単層において塩化物分泌を発生させる
    方法。
13. 【請求項１３】 非ペプチド性イオノフォアの有効量を投与する工程を含む
    、上皮細胞の細胞膜ハロゲン化物透過性を増加させる方法。
14. 【請求項１４】 非ペプチド性イオノフォアの有効量を、患者に投与する工
    程を含む、嚢胞性繊維症患者における塩化物アンバランスを補正する方法。