JP2002518064A

JP2002518064A - Ｒｎａ転写産物の検出、分析およびマッピング方法

Info

Publication number: JP2002518064A
Application number: JP2000556062A
Authority: JP
Inventors: ジェフリー・ジェイ・ラーリー; ルース・タル−シンガー
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2002-06-25
Also published as: CA2330731A1; EP1090144A1; WO1999067422A1

Abstract

(57)【要約】「ファインアレイ転写物マッピング」または「ＦＡＴマッピング」と呼ばれる遺伝子分析方法を開示し、該方法は、ゲノムから転写されたＲＮＡ分子の検出および測定に有用である。該方法は、鋳型ゲノムの異なった発現を調べ、発現された転写産物の５’末端を正しくマッピングすることに適用される。さらに、特定の生物学的状況下での転写産物の存在または不存在ならびにその相対濃度により、遺伝子機能またはコーディング能を決定することもできる。かくして、該方法は、新規遺伝子および既知遺伝子をマッピングし同定すること、ならびに遺伝子機能および調節を調べることに関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新規遺伝学的方法、ゲノムから転写されるＲＮＡ分子の検出、測定
および特徴づけに有用な方法であるファインアレイ転写産物マッピング（fine a
rray transcript mapping）または「ＦＡＴマッピング」に関するものである。
該方法は、２つの試料間の異なるＲＮＡの発現を分別し、鋳型であるゲノム配列
に関してＲＮＡ分子の末端を正確に決定すること（マッピング）に特に有用であ
る。

【０００２】複雑なゲノムの転写調節の分析は実験的挑戦である。１の古典的なアプローチ
はフィルターハイブリダイゼーションまたはノーザンブロッティングを用いるも
のであり、ゲノムの１の小さい領域のみに由来する転写産物を１回ずつ分析する
ものであり、その部分はプローブにより表わされる。この方法による複雑なゲノ
ムの完全な転写の分析は、数百ないし数千の実験および膨大な量の時間と努力が
必要である。さらに、調べるべき各生物学的状況はさらなる個々のゲノムの分析
を必要とする。かくして、この伝統的アプローチは効率に関して重大な欠点を有
する。これらの欠点を克服するために、洗練され、感度の良いアプローチが開発され
るようになり、それらは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に依存
するものであり、異なる細胞集団中の特定遺伝子の発現を示すものである。分別
ディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）はこれらの新しいＰＣＲによる
方法の最初のもので、２つの集団からの全ｍＲＮＡのランダムプライムド増幅を
用いるものである。ＤＤＲＴ−ＰＣＲは、２つのＲＮＡ集団における変化した発
現を示すｍＲＮＡに対応したｃＤＮＡフラグメントの可視化およびその後の単離
を可能にする（７、８）。もう１つの方法は、レプレゼンテイショナル（repres
entational）分別分析（ＲＤＡ）と呼ばれ、ｃＤＮＡの増幅のカップリングした
２つの集団中に存在するフラグメントを、集団の１つに存在する異なって発現さ
れたｍＲＮＡから差し引く方法である（６、９）。第３の方法はサプレッション
引き算ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）であり、これはＲＴ−ＰＣＲを用いて
異なって発現された遺伝子由来のｍＲＮＡであり、これはＲＴ−ＰＣＲを用いて
異なって発現された遺伝子由来のｍＲＮＡを選択的に増幅し、その一方で豊富な
ｃＤＮＡの増幅を抑制するものである（２）。最近の研究において、本発明者は
、転写産物である３２種の異なってディスプレイされたマウスｃＤＮＡ（そのレ
ベルは、潜伏的にＨＳＶ−１に感染したネズミ三叉神経節の外植後の最初の４時
間以内に変化した）を単離するためにＤＤＲＴ−ＰＣＲを用いた。４つのｃＤＮ
ＡはネズミＴＩＳ７と同一であり、それらの配列はインターフェロン（ＩＦＮｓ
）に関連していることが示された。ＤＤＲＴ−ＰＣＲにより生成された異なって
発現された各フラグメントのアクリルアミドゲル精製、再増幅、確認、および配
列決定は非常に労力を要するプロセスであった。ｍＲＮＡ配列の一部がＤＤＲＴ−ＰＣＲ、ＲＤＡまたはＳＳＨにより同定され
たら、転写産物の真の末端がマッピングされた後にのみ蛋白をコードするＲＮＡ
の部分を決定することができる。１のバッチにおいて既知配列を共有する２〜３
のｍＲＮＡの末端をマッピングするための洗練された方法が開発されている。こ
れらのうち優れた方法は「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」（ＲＡＣＥ）または「ワン
−サイデッド増幅（one-sided amplification）」として知られており、３’末
端または５’末端に別個に適用される方法である（１８、１９、２０、２１）。
この方法は、発現されることが知られているｍＲＮＡ中の配列を含むオリゴヌク
レオチドプライマーならびにｍＲＮＡの末端の特徴を有する第２の一般的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いる。１の実験において、小さなＲＮＡのセット
（そのすべてが第１のオリゴヌクレオドプライマーにより表された配列を含むゲ
ノム領域に由来する）のみが検出または分析される。

【０００３】「ファインアレイ転写産物マッピング」または「ＦＡＴマッピング」と呼ばれ
る本発明は、この領域におけるさらなる発展方法である。ＦＡＴマッピングは、
数百または数千の重複ゲノムクローンまたはＤＮＡフラグメントのアレイ（arra
y）を含む試験グリッドを、試験集団由来のＲＮＡ転写産物を表す標識ｃＤＮＡ
からなるプローブ（１、１１、１２）を用いてプロービングすることを包含する
。好ましくは、高速ロボットを用いて、この潜在的に高処理量のシステムが、マ
イクログラム量の全細胞ｍＲＮＡに由来するプローブ混合物により稀な転写産物
の発現を定量的に測定できるようにし、さらに、１回のラン（run）でゲノム配
列中の数百の遺伝子の分析を可能にするようにする。最近、類似の方法を用い、
オリゴヌクレオチドアレイを用いて酵母の新規なオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）が同定された（１６）。多くのクローンがＦＡＴマッピング法に使用
されて２つの近接クローン末端間のギャップが短くなるので、標識プローブの末
端を高い精度で予想することができる。好ましくは、予想の精度はアレイ中のク
ローンの数および分布状態に比例する。コンピューターシュミレーションにより
精度を予想できる。かくして、ＦＡＴマッピングは、非常に迅速かつ労力を節約
する様式で、ＤＤＲＴ−ＰＣＲ，ＳＳＨ、ＲＤＡおよびＲＡＣＥの目的を達成し
うる方法である。ＦＡＴマッピング法を用いて、引き算的に発現された遺伝子配
列を同定し、転写産物をマッピングするための当該分野で認識された方法を用い
る研究を補完し、確認することもできる。さらにそのうえ、ＦＡＴマッピングは
、１回の実験において、誘導され、引き算的に発現された遺伝子のデータベース
を得ることができ、それらの発現遺伝子に共通した転写プロモーター中のこれま
で未知であった調節エレメントの同定を容易にするであろう。ＦＡＴマッピング法を用いれば、これまで同定されていなかった遺伝子が一定
のゲノム中配列中に存在しているかもしれない。ウイルス、特にヘルペスウイル
スのゲノムは、今回のＦＡＴマッピング法を有利に適用できるゲノム配列の一例
である。例えば、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）における遺伝子活性
および遺伝子の転写は、インビトロで培養された細胞の感染に間にカスケード的
に一時的に調節される。さらにヘルペスウイルスは、共通の３’末端を有するが
異なった５’末端を有する転写産物からの異なった蛋白を発現することが知られ
ている。例えば、以前の研究において、Bandaranら（１７）は、より古典的な方
法によりＵＬ９オープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡの５’末端を正確
に決定することによる、１型単純ヘルペスウイルスによりコードされる新たな蛋
白ＯＢＰＣの同定について記載している。該ＯＢＰＣ蛋白は、ＵＬ９転写産物が
コードするＯＢＰ蛋白とは異なる５’末端を有するが同じ３’末端を有する新規
転写産物（ＵＬ８．５）によりコードされていた。かくして、これらの結果から
、ＲＮＡ転写産物の末端のマッピングは新たな遺伝子を発見するための方法であ
るが、このようにして伝統的方法を用いて新たな遺伝子を発見することは非常に
労力を要するものである。ＦＡＴマッピングは、大きなゲノム領域中の転写産物
の末端の全体的なマッピングを一度に行うための新規かつ迅速な方法を提供し、
それゆえ、本発明の方法は、これまで未同定であった遺伝子の発見を可能にする
非常に有効な別法を提供する。

【０００４】発明の概要本発明は、ゲノム配列に由来する個々の転写産物の位置をマッピングする方法
であって、下記工程：ａ）ゲノム配列の重複サブフラグメントを得て、ここに各
ゲノムサブフラグメントのヌクレオチド配列の少なくとも一部分が決定されてお
り；ｂ）各重複ゲノムサブフラグメントを高密度グリッド上の別個の隊列となっ
た（知られた）位置に置き；ｃ）該ゲノム配列から転写された試験転写産物を含
む組成物を調製し；ｄ）該組成物中の試験転写産物を検出可能な様式で標識し；
ｅ）標識試験転写産物を含む組成物を、ゲノムフサブラグメントを含む高密度グ
リッドと接触させ、そのことにより標識試験転写産物がゲノムサブフラグメント
にハイブリダイゼーションするようにし；ｆ）ハイブリダイゼーションしていな
い試験転写産物を高密度グリッドの表面から除去し；ｇ）ハイブリダイゼーショ
ンした標識試験転写産物を含む高密度グリッド上の隊列位置を検出し、次いで、
ｈ）高密度グリッド上で標識試験転写産物がゲノムサブフラグメントにハイブリ
ダイゼーションしたパターンを分析することを含み、高密度グリッド上の標識試
験転写産物の位置を該グリッド上の重複ゲノムサブフラグメントの隊列位置と比
較することにより、ゲノム配列中における個々の試験転写産物の位置がマッピン
グされる方法を提供する。

【０００５】また本発明は、共通のゲノム配列を共有している２またはそれ以上の異なる組
織または細胞集団間の転写産物の異なった発現を測定する方法に関し、該方法は
、該共通配列に対して上記工程ａおよびｂを行い、異なった各細胞または組織集
団に対して別個に上記工程ｃからｈまでを行い、次いで、異なった各細胞または
組織集団からの試験転写産物が共通のゲノム配列に対してマッピングされるパタ
ーンを比較することを含む方法であり、異なった組織または細胞集団間の転写産
物の発現の相違が調べられる方法である。

【０００６】さらに本発明は、特定条件下においてゲノム配列中の知られた位置の特定のオ
ープンリーディングフレームが発現されるかどうかを調べる方法を提供し、該方
法は、ゲノム配列に対して上記工程ａおよびｂを行い、それにより該オープンリ
ーディングフレームに対応するゲノムサブフラクションの高密度グリッド上の隊
列位置を決定し、該ゲノム配列を含む細胞または組織の集団を特定条件に供し、
特定条件に供された該細胞または組織のゲノム配列に対して上記工程ｃからｈま
でを行い、次いで、該特定条件に供された該細胞または組織由来の試験転写産物
が該オープンリーディングフレームのゲノムサブフラグメントに対応する該高密
度グリッド上の隊列位置にハイブリダイゼーションしたかどうかを調べることを
含む方法であり、該ゲノム配列中の該オープンリーディングフレームが該特定条
件下で発現されたかどうかが調べられる方法である。

【０００７】発明の詳細な説明本発明ＦＡＴマッピングは、ゲノム配列から発現された個々の転写産物のゲノ
ム配列中の位置をマッピングするための便利な方法を提供する。一般的方法は、
まずゲノム配列の重複サブフラグメントを得ることを含み、各サブフラグメント
のヌクレオチド配列はすでに決定されているか既知のものである。当該方法のこ
の工程に関し、用語「配列決定」は、各ゲノムフラグメント全体にわたる全ヌク
レオチド配列の決定を必ずしも必要としない。詳細には、十分な配列のみ、例え
ば、サブフラグメントが由来するゲノム配列中の位置を決定できるフラグメント
の各末端（５’および３’末端）についてのみ知られていてば十分である。さら
に、いくつかの場合、サブフラグメントの重複の程度が非常に高い場合、各サブ
フラグメントの末端のいずれか一方（５’または３’末端）に由来する重要部分
のみ配列決定すれば十分であるかもしれない。本発明のこの工程に関し、すべて
またはいくつかのサブフラグメントの配列を決定する目的は、ゲノム配列の範囲
全体にわたるそれらのサブフラグメントの正しい順序を決定することにもなりう
る。当該分野においてそのいくつかがよく知られている慣用的方法論によりゲノム
サブフラグメントの配列決定を行ってもよい。また、この工程の特に好ましい具
体例において、配列決定前あるいは高密度グリッド上にサブフラグメントを置く
前に、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて個々のサブフラグメントを増幅す
る。

【０００８】既知配列のゲノムサブフラグメントが得られたならば、各サブフラグメントの
部分試料をそれぞれ、高密度グリッド上の隊列となった（既知の）位置に置く。
グリッド上の各フラグメント位置が知られているので、そして全ゲノム配列中の
各フラグメント配列の位置が知られているので、いずれのグリッド位置から得ら
れるデータであっても、サブフラグメントにより表されるゲノム配列の小さな領
域に帰属することができる。この方法の目的のために、用語「グリッド」、また
は「高密度グリッド」は、ゲノムサブフラグメントの隊列化したスポットまたは
部分試料を適用するに適した表面をいう。核酸グリッド材料は、例えば、ナイロ
ンフィルター膜、誘導体化ガラス、シリコンチップまたは他のポリマー固体支持
体を包含する。多くのかかるグリッドが市販されている。次いで、ゲノムサブフラグメントの部分試料を含むグリッドを、ゲノム配列を
含有する細胞または組織から転写された試験転写産物を含む組成物に曝露する。
試験転写産物を調製して、検出可能な様式で標識する。例えば、試験転写産物を
検出可能に標識する方法は、標識ヌクレオチド三リン酸存在下での逆転写および
ポリメラーゼ連鎖反応である。好ましい標識は、フルオレセイン、ローダミンお
よびピレンのごとき蛍光発生物質、ハプテン、Ｐ３２、Ｐ３３、テルビウム、ユ
ーロピウム、ならびに電気的に活性な基を包含する。

【０００９】ゲノムサブフラグメントを含む高密度グリッドと標識試験転写産物とを接触さ
せ、標識試験転写産物をゲノムサブフラグメントとハイブリダイゼーションさせ
る。好ましいハイブリダイゼーション条件は、０．０１ないし１Ｍの塩濃度、約
３５ないし７０℃の温度、約０．５ないし数時間の時間を包含する。好ましい条
件は当業者によって、例えば、アレイヌクレオチドの平均Ｇ＋Ｃ含量に基づいて
実験的に容易に決定され、異なるものである。当業者に知られた慣用的方法によ
り未ハイブリダイゼーション試験転写産物を高密度グリッド表面から除去する。
この分野で知られたアレイを調製するための一般的に有用な方法、標識プローブ
およびハイブリダイゼーション条件は、例えば文献１１および１２に示されてい
る。

【００１０】次いで、標識試験転写産物を有する高密度グリッドの各隊列位置を検出し、標
識試験転写産物が高密度グリッド上に出現するパターンを分析し、それにより高
密度グリッド上の標識転写産物の位置を、該グリッド上の重複ゲノムサブフラグ
メントの隊列位置と比較することにより、ゲノム配列中における個々の試験転写
産物の位置をマッピングする。よって、便利なことに本発明は、転写されたＲＮＡの５’末端の正確な位置、
さらに３’末端の正確な位置を提供できるものであり、かくして、ＯＲＦを含む
既知および未知の転写産物、または遺伝子をゲノム配列上にマッピングする手段
を提供するものである。この情報は、当該分野で知られた他のハイブリダイゼー
ションアレイ法よっては提供されないものである。発現されたＲＮＡは、これま
で実際の遺伝子中に存在するとは予想されなかったＯＦＲを含む可能性があり、
さらに本発明は、特定の条件または刺激に応答した発現とこれらのＯＲＦとを関
連づけることができ、かくして、新規遺伝子に関する情報も本発明によって提供
される。本発明により提供される、特定の条件または刺激に応答した既知ＯＲＦ
の発現に関する情報は、既知ＯＲＦに関する新たな機能または活性の情報を導く
。新たな遺伝子の情報は、配列および発現がこれまで特徴づけられていなかった
全く新しい遺伝子、ならびに転写開始が新たに認識された位置で起こる既知遺伝
子配列中の新たなＯＲＦを包含する。目的の鋳型ゲノム配列は、動物、微生物、
ウイルスまたは植物を包含する生きた生物に由来する１本鎖または２本鎖ＤＮＡ
であってもよく、あるいはいくつかの場合にはＲＮＡであってもよい。本発明方
法の好ましい具体例は、ゲノム配列が動物、詳細には哺乳動物、最も詳細にはヒ
ト動物に由来するものである。さらに好ましいゲノム配列はウイルスまたは最近
、最も詳細には１型および２型単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型
肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、７および８ならびにヒトサイトメガロ
ウイルスのごとき他の複雑なゲノムに由来するものである。さらなる好ましいゲ
ノム配列は、例えば、他の原核細胞もしくは真核細胞病原体または動物のゲノム
領域を含有するシュードモナス人工染色体（ＢＡＣｓ）、あるいはヒトを包含す
る哺乳動物に対して病原性のあるストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種
、ミコバクテリウム種および他の類似の生物の完全なゲノムに由来するものであ
る。

【００１１】一般的なＦＡＴマッピング法の他の好ましい具体例は、目的ＤＮＡを剪断また
は酵素消化し、十分にランダムなフラグメントをクローン化してすべての領域の
配列が複数のクローンにより表されるようにするショットガンクローニング法に
よって重複配列を得るＦＡＴマッピング方法を包含する。かくして、クローンの
全集団はゲノム領域についてのライブラリーとなる。上述のごとく、この態様に
おいて、高密度グリッド上に置く前にポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより
クローン化フラグメントを個々に増幅し、次いで、クローニングベクターから分
離してもよい。さらに、ＰＣＲを用いて一定の重複ＤＮＡフラグメントをｎ個の
ヌクレオチドからなるゲノム領域から得て、ＦＡＴマッピングに使用する場合、
好ましくは、少ない塩基、好ましくは１個の塩基だけずれるようにフラグメント
を調製する。かくして、例えば、フラグメントのシリーズは、塩基１〜２００、
２〜２０１、３〜２０２等．．．．．（ｎ−１９９）〜ｎの配列を有するポリヌ
クレオチドのフラグメントを含むであろう。ＦＡＴマッピングのためのＤＮＡフ
ラグメントを得るための最後の好ましい方法は、ｎ個の塩基からなるゲノムを表
す既知ゲノム配列に由来する長さ２０個またはそれ以上の塩基の一連の重複オリ
ゴヌクレオチドを完全に合成して、該一連のものが塩基１〜２０、２〜２１、３
〜２２、．．．．．（ｎ−１９）〜ｎを含むようにすることであってもよい。一般的なＦＡＴマッピング法のさらなる好ましい具体例は、ゲノムサブフラグ
メントの配列データに基づいてゲノム配列中のゲノムサブフラグメントの位置を
分析するためのコンピューターにより支援される方法を包含する。さらに、コン
ピューターにより支援される方法は、高密度グリッド上の標識試験転写産物のパ
ターンとを検出し、重複ゲノムサブフラグメントの隊列位置と比較すること、な
らびにかかる分析により示されるｍＲＮＡおよび遺伝子の特徴を予測することに
有用である。本発明方法を改良するために、本発明方法のいずれのポイントに自
動化された工程を用いてもよく、特に、例えば、サブフラグメントの配列決定、
サブフラグメントの増幅、サブフラグメントまたは標識試験転写産物の部分試料
を高密度グリッド上に置くこと、ならびにハイブリダイゼーションおよび洗浄工
程に用いてもよい。

【００１２】本発明のＦＡＴマッピングにより、共通のゲノム配列を共有する２またはそれ
以上の異なった組織、細胞集団またはウイルス感染細胞集団間の異なった発現お
よび相対濃度を測定する方法が、さらに提供される。上述のごとくこの方法は、
まず、共通のゲノム配列に由来する、配列決定され重複したサブフラグメントか
らなる高密度グリッドを調製することを含む。次いで、試験転写産物の組成物を
共通のゲノム配列から調製する。ここに各試験組成物は、異なる組織もしくは細
胞集団からの、あるいは異なった時点での同じ組織もしくは細胞集団からの、あ
るいは特定の刺激もしくは条件に曝露された同じ組織もしくは細胞集団からの共
通のゲノム配列の発現を示すものである。最後に、それぞれの場合において共通
のゲノム配列から発現された試験転写物のパターンを比較し、それにより、異な
る組織もしくは細胞集団間、あるいは異なった時点での同じ組織もしくは細胞集
団間、あるいは特定の刺激もしくは条件に曝露された同じ組織もしくは細胞集団
間における転写産物の発現の相違を調べる。該方法のこの態様における好ましい具体例は、共通のゲノム配列が哺乳動物、
最も詳細にはヒトに由来するものである方法である。細菌種、最も詳細にはスト
レプトコッカス、スタフィロコッカス、ミコバクテリウムのごときヒト病原体、
あるいは真菌、最も詳細にはクリプトコッカスのごときヒト病原体真菌タイプ；
あるいは寄生動物、詳細にはプラスモジウムのごとき真核ヒト病原体に由来する
ものである。ウイルス由来、最も詳細には１型単純ヘルペスまたは２型単純ヘル
ペス由来のゲノム配列が特に好ましい。

【００１３】異なった発現を分析することを目的としたＦＡＴマッピングのこの態様のさら
なる好ましい具体例は、転写産物組成物が同じ生物の異なる組織に由来するもの
であり、例えば、試料が１の動物個体、詳細には哺乳動物、特にヒトの異なる器
官または細胞タイプから取られる場合である。本発明のこの態様は、組織および
細胞に特異的な機能の調節を調べるための便利な機構を提供する。さらに本発明の一般的方法は、ゲノム発現の異なった時点における同じ組織タ
イプの発現を調べる方法を提供し、例えば、組織、細胞もしくはウイルスの発達
の異なった段階において、あるいは特定の刺激または条件に曝露された後の異な
った時点においてゲノム発現を測定することができる。異なった時点での分析の
例は、例えばヒトにおける高等動物の細胞の発達および分化の調査、加齢プロセ
スにおける胎児組織とその同じ組織との比較分析を包含する。さらなる特別に有
用な態様は、ウイルスゲノム発現の異なった段階におけるウイルス感染細胞中の
ウイルスゲノムの分析を包含し、例えば、潜伏期間中およびビルレンスサイクル
中の一定間隔においてウイルスゲノムをサンプリングする。したがって、細胞ゲ
ノムの分析を行って、ウイルス潜伏期および感染中に関連した種々の時点におい
てウイルスを有する組織における細胞因子の発現を調べることもできる。当該方法は、特定の刺激または条件に曝露された後の種々の組織および細胞タ
イプにおける経時的分析にも適用でき、それにより、細胞またはウイルス発現に
対する当該刺激または条件の影響を研究する。異なったゲノム試料に対する可能
な刺激の例は、例えば、温度、光、圧力、または他の物理的、環境的もしくは化
合物を包含する化学的刺激、最も好ましくは感染または疾病の状態におけるウイ
ルス、細胞もしくは組織のタイプに対して適用されうる潜在的な薬剤候補化合物
のごとき化学的刺激を包含するが、これらに限定されない。かくして、本発明は
、癌組織のごとき古典的非感染性疾患ならびにウイルス感染のごとき感染性疾患
を包含する疾病状態に対する潜在的薬剤候補化合物を調べる有用な分析方法を提
供する。

【００１４】さらにもう１つの態様において、ゲノム配列中の既知の位置にある特定のオー
プンリーディングフレームが特定の時点または条件下で発現されるかどうかを調
べる方法として、本発明ＦＡＴマッピングをさらに説明する。上記のごとく当該
一般的方法は、ゲノム配列の重複サブフラグメントを得ること、これらのサブフ
ラグメントを配列決定すること、次いで、該列決定した各サブフラグメントの部
分試料を高密度グリッド上に隊列として置くことを含む。次いで、このゲノム配
列を含有する細胞または組織の集団を特定条件に供するか、あるいは特定時点に
おいてサンプリングし、ウイルス、細胞または組織集団が特定条件または時点に
供される間に発現された試験転写産物を含む組成物を調製する。この組成物中の
試験転写物を検出可能に標識し、高密度グリッドと接触させ、そのことにより標
識試験転写産物がグリッド上のゲノムサブフラグメントにハイブリダイゼーショ
ンする。未ハイブリダイゼーション試験転写産物をグリッドから洗い去り、標識
試験転写産物を含むグリッド上の位置を同定する。試験転写産物がグリッド上の
ゲノムサブフラグメントにハイブリダイゼーションしたパターンを、好ましくは
コンピューターにより支援される方法により分析する。この分析により、試験転
写産物が転写されたゲノム配列上の位置がマッピングされ、既知オープンリーデ
ィングフレームに由来する特定の転写産物は発現されたかどうかが便利に決定さ
れる。特に好ましい態様は、組織または細胞集団を特定のストレスまたは潜在的薬剤
化合物に曝露し、ストレスまたは潜在的薬剤化合物への曝露が目的の特定オープ
ンリーディングフレームからの転写を刺激または抑制したかどうかを決定するこ
とを含む。

【００１５】実施例下記実施例は本願発明の種々の態様を説明する手段として提供され、本発明の
一般的なＦＡＴマッピングの適用可能性を限定するものと解してはならない。提
供される実施例は、Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 and 2,
John Wiley & Sons, 1989およびその後のアップデート版に記載されたような当
該分野でよく知られた慣用的なな分子生物学に関し、これを利用するものである
。一般的方法アレイ作成のための、ＨＳＶ−２クローン化ＤＮＡ標本の調製：ＨＳＶ−２ＳＢ５（ＡＴＣＣＶＲ２５４６）ゲノムライブラリーから単一
細菌コロニーを選択し、ユニークなプラスミドインサートを有することを確認し
た。マイクロタイター中で振盪せずに、アンピシリンを含有する１７５μｌのＬ
Ｂブロス中でコロニーを一晩増殖させた。Ｍ１３汎用プライマー（Gibco Life T
echnologies）およびAmpliTaq Gold PEを含む５０μｌの、３系のＰＣＲ増幅ウ
ェル中のそれぞれに１μｌの培養物を使用した。増幅を５５℃で４０サイクル行った。アガロース電気泳動により生成物を分析
し、ＡＧＴＣカラムを用いて精製した。ＤＮＡを定量し、Ｍ１３汎用プライマー
（ABI sequencer）を用いて配列決定し、グリッド作成用に沈殿させた。細菌培
養物を３系にして凍結した。下記のようにしてgenomicsＨＳＶ−２ＳＢ５ＤＮ
Ａから対照用の遺伝子特異的ＰＣＲ生成物を得た（プライマー感度）。ＨＳＶ−２クローン化ＤＮＡからのマイクロアレイの調製：上記工程からのＤＮＡ鋳型生成物を用いて、ハイブリダイゼーション用のＤＮ
Ａスポットのアレイを調製した。Molecular Dynamics Microarray スポッターを
用いてシラン処理ガラス（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）上にアレイを
スポットした。スポッティングおよびハイブリダイゼーションに使用するプロト
コルは、本質的には他に記載されたものである（A Systems Approach To Fabric
ating And Analyzing DNA Microarrays (1999). Jenifer Worley, Kate Bechtol
, Sharon Penn, David Roach, David Hancel, Mary Trounstine, and David Bak
er. DNA Microarrays: Biology and Technology. Biotechniques Books. Editor
Mark Schena）。下記のごとく調製したｃＤＮＡプローブのハイブリダイゼーシ
ョン後、Molecular Dynamicsマイクロアレイスキャナーを用いて得られたすべて
のマイクロアレイをスキャンした。Array Vision (Imaging Research, St. Cath
erine's Ontario, Canada)を用いて映像を分析した。遺伝子発現分析のための、ＨＳＶ−２感染細胞からのＲＮＡ抽出：ヒトＭＲＣ−５またはＮｅｔｒａ−２細胞（ＡＴＣＣ）をＨＳＶ−２ＳＢ５
（ＡＴＣＣＶＲ−２５４６）に感染の多重度５で感染させた。感染から１、２
、４、６、８および１７時間後に、製造者（Life Technologies-Gibco BRL, Gra
nd Island, NY）の説明に従ってTRIzol試薬を用いてＲＮＡを単離した。模擬感
染細胞をすべての実験において対照として使用した。ハイブリダイゼーションプローブ用の相補的ＤＮＡの調製：ＢＲＬキット１８０８９−０１１（Gibco BRL life Technologies）を用い、
２０μｇの全ＲＮＡを用いてＣｙ−３標識ｃＤＮＡプローブ（ｄＣＴＰ）を得た
。Qiagen Qiaquick PCRカラムを用いてプローブを精製した。洗浄前に付加的に
遠心分離を行う以外は製造者のプロトコルに従って行った。ＲＴ−ＰＣＲ実験のための、ＲＮＡからの相補的ＤＮＡの調製：ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅＩ（Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianap
olis, In）でＲＮＡを４５分消化し、次いで、７０℃で５分間インキュベーショ
ンして酵素を不活性化させた。すでに記載されているようにして（Tal-Singer R
., T. M. Lasner, W. Podrzucki, A. Skokotas, J. J. Leary, S. L. Berger, a
nd N. W. Fraser. 1997. Gene expression during reactivation of herpes sim
plex virus type 1 from latency in the peripheral nervous system is diffe
rent from that during lytic infection of tissue cultures. J. Virol. 71:5
268-5276）、Superscript Preamplification kit（Life-Technologies-Gibco BR
L, Grand Island, NY）を用い、オリゴｄＴでプライミングし、ランダムヘキサ
マーを用いて２〜３μｇの全ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（５０μｌ）を得た。半定量的分析のための、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅：適当量のｃＤＮＡを含む２５μｌの体積中で反応を行った。ＳＢ５転写産物を
検出するためのプラマーペアーを表１に示す。ＧＡＰＤＨ用プライマーをClonte
chから得た。ベータアクチンおよびシクロフィリン用プライマーはすでに記載さ
れたものであった（Tal-Singer R., T. M. Lasner, W. Podrzucki, A. Skokotas
, J. J. Leary, S. L. Berger, and N. W. Fraser. 1997. Gene expression dur
ing reactivation of herpes simplex virus type 1 from latency in the peri
pheral nervous system is different from that during lytic infection of t
issue cultures. J. Virol. 71:5268-5276、Tal-Singer R., W. Podrzucki, T.
M. Lasner, A. Skokotas, J. J. Leary, N. W. Fraser and S. L. Berger. 1998
. Use of differential display reverse transcription-PCR to reveal cellul
ar changes during Stimuli that result in herpes simplex virus type 1 rea
ctivation from latency: upregulation of immediate-early cellular respons
e genes TIS7, interferron, and interferron regulatory factor-1. J. Viol.
72:1252-1261）。サーマルサイクラー９７００（Perkin-Elmer, Norwalk, Conn
.）を用い、９６ウェルプレート中で、１μＭの各プライマー、１．２５ＵのAmp
liTaq Gold、２００μＭのｄＮＴＰ、および２５ｍＭＭｇＣｌ₂を含む１０Ｘバ
ッファーを用いてサイクリング反応を行った。９５℃で９分間変性の１サイクル
を行った後、下記サイクルを行った：（ｉ）９５℃で１分間変性、（ｉｉ）６０
℃で１分間アニーリング、次いで、（ｉｉｉ）７２℃で２分間伸長。最終サイク
ルは７２℃で７分間の伸長で終了した。３５ないし４５サイクルの増幅を行った
。逆転写を行わないＲＮＡ試料を各セットの実験に付してＤＮＡ混入に関する対
照とした（ＲＴ−）。すでに記載されたように（Tal-Singer et al. 1998）、ア
ガロースゲル電気泳動、Fluoimagerスキャンニング（Molecular Dynamics）およ
びバンド強度定量によりＰＣＲ生成物を分析した。ＰＣＲ生成物バンド強度と細
胞ハウスキーピング遺伝子（シクロフィリン、ベータアクチンまたはＧＡＤＰＨ
をコード）のバンド強度との割合として、多くの数のＰＣＲ生成物の相対量を調
べた（Bloom, D. C., G. B. Devi-Rao, J. M. Hill, J. G. Stevens, and E. K.
Wagner. 1994. Molecular analysis of herpes simplex virus type 1 during
epinephrine-induced reactivation of latency infected rabbits in vivo. J.
Virol. 68:1283-1292）。ＰＣＲ標準物質：感染ＭＲＣ−５細胞からのＨＳＶ−２（ＳＢ５）ウイルスＤＮＡを、ＤＮＡｚ
ｏｌ試薬（Life Technologies-Gibco BRL, Grand Island, NY）を用いることに
より脳から調製したマウスＤＮＡ中に系列希釈した。１μｌ中全部で１０ナノグ
ラムを、各プライマーセットを用いるＰＣＲに供して相対プライマー感度を評価
した。ＴａｑＭａｎによる定量的ＲＮＡ分析： 2X TaqMan Universal PCR Master mix（Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.）およ
び適当量のｃＤＮＡを含む体積５０μｌ中において反応を行った。反応系は２０
０ｎＭのＴａｑＭａｎプライマーおよび４００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブも含
んでいた。Primer Expressソフトウェア（Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.）を用
いて表２に記載したプライマーペアーおよびプローブを設計し、９６ウェルオプ
チカルプレートにおいて分析した。蛍光リポーター色素Famでプローブ５’末端
を、蛍光消光色素Tamra（Synthegen, Houston, Tx）でローブ３’末端を標識し
て、ＰＣＲ生成物の直接検出を可能にした。ＴａｑＭａｎプローブはＰＣＲ生成
物中の標的配列にハイブリダイゼーションし、開裂してリポーター色素および消
光色素を分離させる。これら２つの色素の分離によりリポーターの蛍光が増大す
る。得られた蛍光をABI 7700 Sequence detector（Perkin-Elmer, Norwalk, Con
n）を用いて測定した。上記ＰＣＲ標準物質を用いて得た標準曲線を用いて相対
コピー数を計算した。

【００１６】

【表１】

【００１７】

【表２】

【００１８】実施例１再活性化中に誘導されるウイルス遺伝子の同定ＨＳＶ−２ＳＢ５（ＡＴＣＣＶＲ−２５４６）に感染したＭＲＣ−５細胞か
らゲノムウイルスＤＮＡを調製する。噴射によりＤＮＡを剪断して平均１ないし
２ｋｂのサイズのフラグメントにし、フラグメントをｐＵＣ１９およびブルース
クリプト（Bluescript)ベクター中に組み込む。ランダムに選択したクローン化
フラグメントを２０００個以上の別々のクローンから配列決定し、シークエンサ
ー（Sequencer）およびＰＨＲＡＰソフトフェアを用いて、該配列をアセンブリ
ーしてＨＳＶ−２ゲノムを表す連続ＤＮＡ配列にする。各クローン中に組み込ま
れたＨＳＶ−２ＤＮＡインサートを、Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを用
いるＰＣＲにより増幅する。次いで、各ＰＣＲ生成物ＤＮＡのうち５ナノグラム
を、８列ｘ１２列のドットからなるブロック２５個の２系のアレイとして数百枚
のスライドグラス上のドットとしてプリントする。各ＰＣＲ生成物の別個の部分
試料を、各末端におけるＤＮＡ配列の１回のランに供して、ゲノムアセンブリー
に関してインサート生成物が直線状に存在することを確認する。対照ＤＮＡ配列
、例えば、ベータ−アクチン、シクロフィリンおよびＩＲＦ−１からの細胞遺伝
子クローンから得た対照ＤＮＡ試料を、アレイスライド中に含ませることができ
る。前もってＨＳＶで３０日間感染させたマウス（潜伏感染マウス）から、低体温
による再活性化の前後に組織を取る。収集した組織は脳および三叉神経節を含む
。文献１５に記載のとおりＲＮＡを組織から精製する。潜伏感染し、再活性化さ
れた組織から標識ｃＤＮＡを調製し、上記ＤＮＡフラグメントの個々のスライド
アレイにハイブリダイゼーションさせる。コンピューター支援映像分析を用いて
、アレイを潜伏感染動物由来のｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることに
より得られた標識ドットパターンを、再活性化動物からのｃＤＮＡを用いて得ら
れたパターンと比較する。コンピューター支援計算を用いて、得られたクローン
のパターンを再活性化組織由来のＲＮＡにハイブリダイゼーションするゲノムＨ
ＳＶ−２配列の直線状アレイに翻訳する。これらの直線状アレイは、再活性化プ
ロセスの間に発現されたＨＳＶ−２配列を表すものであり、連続した直線状アレ
イから推定される各ＲＮＡの最初の（またはいくつかの場合には第２の）ＡＴＧ
５’により遺伝子が定義される。この実施例において、再活性化中に発現される
が、潜伏感染中に発現されない重要遺伝子は、ＴＫ遺伝子ＵＬ２３およびＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子ＵＬ３０を包含する。明らかに、インビトロでの一次感染期
間中において、即時初期遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ４およびＩＣＰ２２はＵＬ２３
およびＵＬ３０遺伝子の発現前には発現されず、そのことは、低体温により誘導
された細胞機能が、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４およびＩＣＰ２２遺伝子によるＵＬ２３
およびＵＬ３０の転写調節に打ち勝つか、あるいはこれに置き換わることを示唆
する。かくして、ＩＣＰ０、４または２２を妨害する抗ウイルス剤は、ＵＬ２３
またはＵＬ３０の阻害剤と同様に潜伏を妨害するとは予想されない。

【００１９】実施例２一次インビトロ感染期間中のＨＳＶ−２における遺伝子発現の一時的
調節の確認インビトロでＨＳＶ−２ＳＢ５に感染してから０、２、６、１２および１８
時間後のＭＲＣ−５細胞由来のＲＮＡ試料を用いる実験において、ＨＳＶ−２中
の全遺伝子の発現の一時的カスケードのキネティクスを一度に調べる。内部リピ
ートＬから内部リピートＳ領域までのＲＮＡ転写産物の末端位置をより細かに調
べるために、１１６１００から１３２６００までの間の１０ヌクレオチドごとに
開始する長さ１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を得て、アレイに加えて実施例１にて
調製したランダムクローンを補足する。これらの新たな付加物は、実際の末端か
ら１０ヌクレオチド以内のところに転写産物の末端をマッピングする最小限の正
確さを保証する。ＨＳＶ−２に感染してから０、２、６、１２および１８時間後
に標識ｃＤＮＡプローブを調製する。全部で５つのｃＤＮＡ試料をスライドグラ
ス上のアレイグリッドにハイブリダイゼーションさせ、さらに、スポットに結合
している標識プローブのパターンを、ＨＳＶ−２ゲノム上のＲＮＡ分子鋳型配列
の直線状アレイ（またはマップ）に翻訳する。この実験において、ＲＮＡ転写産
物は０時間目には検出されない。ＩＣＰ０、ＩＣＰ４およびＩＣＰ２２を包含す
る即時初期遺伝子は２時間目に検出され、６時間目のハイブリダイゼーションに
おいてＵＬ２３およびＵＬ３０を包含する初期遺伝子も検出される。１８時間目
までには、糖蛋白および糖蛋白Ｂのごとき構造遺伝子が検出される。各キネティ
クのクラスにおいて検出される遺伝子のなかには、新規でありこれまで未同定で
あった転写産物ならびにそのＨＳＶ−１ホモログがそのＨＳＶ−２カウンターパ
ートとは異なったように一時的に調節される転写物が検出される。

【００２０】実施例３潜在的な抗ウイルス化合物が作用するＨＳＶ生活環における段階の同
定、ならびに抗ウイルス化合物の作用機構の明確化一時的に調節されるＨＳＶ−２からの遺伝子発現のカスケードを上記実施例２
のようにして特徴づけることができるので、感染細胞を化合物「Ｘ」で処理する
こと以外は同様に調製したｃＤＮＡプローブを用いるファインアレイ転写物マッ
ピングによって当該カスケードの破壊を調べることもできる。例えば、ＤＮＡ合
成阻害剤アフィジコジンの存在下または不存在下で感染してから１２時間ないし
１８時間たった培養物から得たｃＤＮＡプローブにアレイをハイブリダイゼーシ
ョンさせることにより、発現が完全にＨＳＶＤＮＡ複製に依存している遺伝子
が同定されるであろう。未処理の培養物から得たプローブによって、発現がＤＮ
Ａ合成に厳密に依存している遺伝子がマッピングされるであろうが、それは処理
された培養物から得たプローブを用いて検出されるマッピングされた転写産物を
含まないであろう。結果的に、未知化合物の存在下で感染してから１２ないし１
８時間後の細胞から得たｃＤＮＡプローブを用いて同じパターンのハイブリダイ
ゼーションしたドットが検出される場合には、未知活性を有する化合物はＨＳＶ
ＤＮＡ合成を阻害する可能性がある。同様に、未知化合物の存在下で感染して
から１２ないし１８時間後の細胞から得たｃＤＮＡを用いるマッピングにおいて
即時初期遺伝子のみが検出される場合には、当該化合物の作用機構は複製サイク
ルの初期段階に、例えば、ＩＣＰ４による遺伝子発現のトランス活性化に関与し
ているであろう。

【００２１】実施例４ＨＳＶゲノムによりコードされる新規遺伝子の同定ＨＳＶ−２からの遺伝子発現の一時的に調節されるカスケードを上記実施例２
のようにして特徴づけることができる。オープンリーディングフレームＵＬ８、
ＵＬ９およびＵＬ１０の周辺のＨＳＶゲノム領域からの転写産物であって、ＵＬ
８、ＵＬ８．５、ＵＬ９、ＵＬ９．５およびＵＬ１０（１７）をコードするもの
とは異なるサイズの転写産物が存在すること、ならびにＦＡＴマッピングがこれ
らのｍＲＮＡの末端位置を予測するものであることが知られているので、コード
される新規な蛋白を予測することができる。この予想は、別のＲＮＡの５’末端に由来する翻訳開始配列中に存在する最初
のＡＴＧコドンにより表されるオープンリーディングフレームに基づくであろう
。これらのＲＮＡのいくつかは感染後迅速に発現される可能性があり、他のもの
は感染期間の後期に発現される可能性があり、そのことはクローン化ＤＮＡスポ
ットに基づいて得られるシグナル多様化に関与する。推定される新規蛋白は既知
のＵＬ８、ＵＬ８．５、ＵＬ９、ＵＬ９．５およびＵＬ１０遺伝子のアミノ酸配
列を表す可能性があり（すなわち、それらのオープンリーディングフレームの小
部分を含む可能性があり）、あるいは別のリーディングフレーム中に存在するこ
とにより新規なアミノ酸配列を表す可能性もある。

【００２２】実施例５転写に対する新規化合物の影響による新規化合物の特徴づけならびに
それらの薬剤としての可能性ＦＡＴマッピングに供されたゲノム配列が動物遺伝子の一部、例えば、ケモカ
インをコードするヒト遺伝子の一部を表す場合には、実験化合物により処理され
た細胞または組織から調製されたプローブを用いて、目的のケモカインの発現に
影響する化合物を同定してもよい。かくして、ヒト末梢血リンパ球は、適当な刺
激により、前炎症性ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１ｂおよび他のケモカインのｍＲＮＡ
を転写する。インビトロまたはインビボにおいて試験化合物の存在下で刺激を行
った場合、それらのリンパ球から抽出されたｍＲＮＡから標識ｃＤＮＡプローブ
を調製し、ＦＡＴＭａｐアレイのブローブに使用することができる。ＲＡＮＴ
ＥＳまたはＭＩＰ１ｂｍＲＮＡの産生を特性または促進する化合物で処理され
た細胞から調製されたプローブを、ＦＡＴＭａｐシグナルの対応した減少また
は増加によって同定することができる。ＲＡＮＴＥＳの転写を抑制する化合物は
抗炎症剤として有用であろうし、ＲＡＮＴＥＳの産生を促進する化合物は潜在的
な前炎症性薬剤であろう。同様に、ＦＡＴマッピングを用いて、特定の疾病状態において、例えば、乾癬
の皮膚において異なって発現される一定の遺伝子領域に由来する遺伝子の群を特
徴づけてもよい。薬剤が知られているか、同一ではあるが逆方向（例えば、上流
方向ではなく下流方向）の遺伝子の発現に異なった影響を及ぼすことがＦＡＴマ
ッピングまたは別の転写分析により確認可能である場合には、ＦＡＴマッピング
によってそれらの既知薬剤の新たな疾病への適用が発見される可能性がある。

【００２３】実施例６実施例２のさらなる具体例ＦＡＴＭａｐ法を用いて、細胞培養物の一次感染期間中のＨＳＶ−２遺伝子発
現の一時的調節を確認した。マイクロアレイＦＡＴＭａｐの結果がｍＲＮＡレベ
ルを示すものであるかどうかを評価するために、さらに３つの方法、ａ）遺伝子
特異的生成物量をハウスキーピング遺伝子生成物量と比較する半定量的ＰＣＲ、
ｂ）ＴａｑＭａｎリアルタイム定量的ＰＣＲ分析、およびｃ）ＨＳＶ−２の特定
遺伝子に由来するＤＮＡの多数のスポットによって同じアレイ上に生じたハイブ
リダイゼーションシグナルで同じＲＮＡ試料を評価した。以下に、すべての方法
によるＨＳＶ−２遺伝子ＩＣＰ６（ＵＬ３９）およびｇＣ（ＵＬ４４）に関する
結果を示す。ＦＡＴＭａｐアレイハイブリダイゼーションは、模擬感染対照細胞と比較する
と、ＭＲＣ−５ＲＮＡを用いた場合には感染時間経過とともにＩＣＰ６（ＵＬ
３９）クローンに関するシグナルが除々に増加したことを示した。シグナル強度
のピークはＰＩ（感染後）６時間においてであり、ＰＩ１７時間までには減少
した。図３Ａにおいて、イメージシグナル強度をＹ軸にプロットし、そのシグナ
ルを示すクローンの左端位置をＸ座標に示す。図３Ｂ中の矢印は、ＨＳＶ−２
ＨＧ５２Genbenkエントリーにおいて定義されたＵＬ３９のオープンリーディン
グフレームを示す。ＦＡＴＭａｐのデータは、図４に示す同じグリッド上の遺伝子特異的ＰＣＲ生
成物からのアレイシグナルと矛盾しなかった。ＵＬ３９（ＩＣＰ６）に関する慣
用的な半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果は、発現のＦＡＴＭａｐアレイキネティクス
および特異的遺伝子マイクロアレイの結果の両方に矛盾せず、その結果は感染６
時間後まで発現が増加するというものである。類似のＨＳＶ−２に関する実験か
ら得られたＲＮＡによる慣用的ＲＴ−ＰＣＲに関するデータを図５Ａに示す。Ｔ
ａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ分析から得られたデータもまた、図５Ｂに示すように、
ＩＣＰ６（ＵＬ３９）の発現についてのキネティクスにおけるＦＡＴＭａｐアレ
イと一致する。ＵＬ４４オープンリーディングフレームの産物である糖蛋白Ｃ（ｇＣとしても
知られる）に関する遺伝子である他の１のＨＳＶ−２遺伝子をこの実験に使用し
てある。図６Ａおよび６Ｂに、ＵＬ４４ゲノム領域に関するＦＡＴＭａｐのデー
タおよびＨＳＶ−２ＨＧ５２Genbankエントリーからの遺伝子マップを示す。上
記ＦＡＴＭａｐクローンによる発現パターンは、図７に示すように、ｇＣオープ
ンリーディングフレーム（ＵＬ４４）に関する遺伝子特異的ＤＮＡスポットにつ
いて行ったマイクロアレイハイブリダイゼーションのパターンとも類似している
。以下に示すように、同じＵＬ４４ＤＮＡに関する８系の同じスポットの再現
性もそれぞれ良好であった。

【００２４】実施例７実施例４の具体例ＦＡＴＭａｐ法を用いてＨＳＶ−２遺伝子発現領域を同定した。該領域では、
ＨＳＶ−２ＨＧ５２Genbankエントリーにより同定された１のオープンリーディ
ングフレーム中で発現レベルが異なっていると思われる。これらは、おそらく別
のＲＮＡが存在し、それがリポートされる遺伝子と相関関係を有していない場合
であり、それゆえ、新たな遺伝子が示される可能性がある。図８において、ＵＬ
２９のコーディング領域の左半分を含むクローンは、ＵＬ２９の右半分について
のシグナルよりも大きいことがわかる。このことは、遺伝子の３’側半分を含む
、別個の、高度に発現されたＲＮＡを示唆するものであり、ＵＬ２９オープンリ
ーディングフレームの一部およびＵＬ２９オープンリーディングフレーム中の一
方の末端を用いる新規遺伝子の発現を示すものと考えられる。図８に、各クロー
ンの両末端の位置をプロットしてあり、黒シンボルによりクローン左端が示され
、白い同型シンボルによりクローンの右端が示されている。シンポルの各ペアー
の高さあるいはＹ軸上の座標は、ハイブリダイゼーション実験においてクローン
により示されたシグナル強度である。図１０に、ＵＬ９からＵＬ１３までの領域に由来するクローンが示されており
、ＦＡＴＭａｐによる転写物マッピングの概念は、ゲノムのこの領域からのクロ
ーンシグナルのパターンがＨＳＶ−２ＨＧ５２Genbankエントリーにより帰属さ
れた遺伝子のパターンと類似しているという事実により明確に支持される。その
データは、ＵＬ９は低レベルで発現されるが、ＵＬ１０および１１はより高いレ
ベルで発現され、ＵＬ１２は中間の発現レベルであることを示す。

【００２５】本明細書にて引用した文献：下記文献を参照により本願明細書に一体化させる： 1. Chalifur, L. E., R. Fahmy, E. L. Holder, E. W. Hutchinson, C. K. Ost
erland, H. M. Schipper, and E. Wang. 1994. A method for analysis of gene
expression patterns. Analytical Biochemistry. 216:299-304. 2. Diatchenko, L., Y.-F. C. Lau, A. P. Campbell, A. Chenchick, F. Moqad
am, B. Huang, S. Lukyanov, K. Lukyanov, N. Gurskaya, E. D. Sverdlov, and
P. D. Siebert. 1996. Suppression subtractive hybridization: a method fo
r generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and
libraries. PNAS. 93:6025-6030. 3. Fraser, N. W., J. G. Spivack, Z. Wroblewska, T. Block, S. L. Deshman
e, T. Valyi-Nagy, R. Natarajan, and R. Gesser. 1991. A review of the mol
ecular mechanism of HSV-1 latency. Curr. Eye Res. 10 (Suppl):1-14. 4. Fraser, N. W., and T. Valyi-Nagy. 1993. Viral, neuronal and immune f
actors which may influence herpes simplex virus (HSV) latency and reacti
vation. Microbial Pathogen. 15:83-91. ５．Ｈｉｌｌ，Ｔ．Ｊ．１９８５．Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ
ｖｉｒｕｓｌａｔｅｎｃｙ，ｐ．１７５−２４０．ＩｎＢ．Ｒｏ
ｉｚｍａｎ（ｅｄ．），ＴｈｅＨｅｒｐｅｓＶｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ
．４．ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ．，ＮｅｗＹｏ
ｒｋ．６．Ｈｕｂａｎｋ，Ｍ．，ａｎｄＤ．Ｇ．Ｓｃｈａｔｚ．１９
９４．ＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｍＲＮＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅ
ｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃＤＮＡ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ．２２：５６４０−５６４８．７．Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，Ｄ．Ｂａｕｅｒ，Ｌ．Ａｖｅｒｂｏｕｋ
ｈ，Ｐ．Ｗａｒｔｈｏｅ，Ｍ．Ｒｏｈｒｗｉｌｄ，Ｈ．Ｍｕｌｌｅ
ｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｕｓｓ，ａｎｄＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ．１９９
５．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｌｔｅｒｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ，ｐ．３０４−３
２１．ＩｎＰ．Ｋ．ＶｏｇｔａｎｄＩ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ（ｅ
ｄ．），ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．２５４．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ．８．Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ．１９９
２．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｂｙｍｅａｎｓｏｆｔｈｅｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５７：
９７６−９７１．９．Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，Ｎ．，Ｎ．Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，ａｎｄＭ
．Ｗｉｇｌｅｒ．１９９３．Ｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｃｏｍｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｓ．Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ．２５９：９４６−９５１．１０．Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ．１９９１．Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ
：ａｂｒｉｅｆｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐ．８４１−８４７．
ＩｎＢ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓａｎｄＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ（ｅｄ．
），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｖｉｒｏｌｏｇｙ．ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ
，Ｌｔｄ．，ＮｅｗＹｏｒｋ． 11. Schena, M., D. Shalon, R. W. Davis, and P. O. D. Brown. 1995. Quant
itative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA
microarray. Science. 270:467-470. 12. Shalon, D., S. J. Smith, and P. O. Brown. 1996. A DNA microarray sy
stem for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe
hybridization. Genome-Res. 6:639-45. 13. Sheng, M., and M. E. Greenberg. 1990. The regulation and function o
f c-fos and other immediate early genes in the nervous system. Neuron. 4
:477-485. 14. Stevens, J. G. 1989. Human herpes viruses: A consideration of the
latent state. Microbial Rev. 53:318-332. １５．Ｔａｌ−Ｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｗ．Ｐｏｄｒｚｕｃｋｉ，Ｔ
．Ｍ．Ｌａｓｎｅｒ，Ａ．Ｓｋｏｋｏｔａｓ，Ｊ．Ｊ．Ｌｅａｒ
ｙ，Ｎ．Ｗ．Ｆｒａｓｅｒ，ａｎｄＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ．１
９９８．ＵｓｅｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙ−ＲＴ−
ＰＣＲｔｏＲｅｖｅａｌＣｅｌｌｕｌａｒＣｈａｎｇｅｓＤｕｒｉｎ
ｇＳｔｉｍｕｌｉｔｈａｔＲｅｓｕｌｔｉｎＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐ
ｌｅｘＴｙｐｅ１ＲｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｆｒｏｍＬａｔｅｎｃｙ
：ＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩｍｍｅｄｉａｔｅ−ＥａｒｌｙＣｅ
ｌｌｕｌａｒＲｅｓｐｏｎｓｅＧｅｎｅｓＴＩＳ７，ＩＦＮａｎｄ
ＩＲＦ−１．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，７２：１２５２
−１２６１．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ，Ｅ．１９９７．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉ
ｃｓｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＡＳＭ
ｎｅｗｓ．６３：３１２−３１７．Ｂａｒａｄａｒａｎ，Ｋ．，Ｃ．Ｅ．Ｄａｂｒｏｗｓｋｉ，ａｎｄ
Ｐ．Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ．１９９４．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｈｅｒｐ
ｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１ｇｅｎｏｍｅｃｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇｔｈｅＵＬ８，ＵＬ９，ａｎｄＵＬ１０ｇｅｎｅｓａ
ｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｄｅｌａｙｅｄ
−ｅａｒｌｙｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ，ＯＢＰＣ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６８：４２５１−４２６１．Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ａ．，Ｋ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄＲ．
Ｔｊｉａｎ．１９８５．Ｔｗｏｄｉｓｔｉｎｃｔｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｂｉｎｄｔｏｔｈｅＨＳＶｔｈｙｍｉｄｉ
ｎｅｋｉｎａｓｅｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ．４
２：５５９−５７２．ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄＲ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ．１９
８２．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｓｉｇｎａｌｓ
ｏｆａｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１７：３１６−３２４．Ｌｏｈ，Ｅ．Ｙ．，Ｊ．Ｆ．Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．Ｃｗｉｒｌ
ａ，Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ，ａｎｄＭ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ．１９
89. Polymerase chain reaction with single-sided specificity: analysis of
T cell receptor delta chain. Science. 243:217-220. Ohara, O., R. L. Dorit, and W. Gilbert. 1989. One-sided polymerase chain
reaction: the amplification of cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86
:5673-5677. 本願明細書にて引用された特許および特許出願あるいは本願が優先権を主張し
ている特許出願（これらに限らない）を包含するすべての刊行物を、参照により
、個々の刊行物が明確に示されているかのごとく本明細書に一体化させる。

【００２６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、単一ゲノム、すなわち２型単純ヘルペス（ＨＳＶ−２）
のゲノムに適用されたファンアレイ転写産物マッピング、または「ＦＡＴマッピ
ング法」の説明である。ＨＳＶ−２ゲノムは、大型で転写が複雑なゲノム領域の
一例である。ＨＳＶ−２ＤＮＡゲノムの２０００以上のランダムな重複クロー
ンを得て、クローン化ＤＮＡフラグメントの各末端を配列決定した。各クローン
化フラグメントをグリッド形成媒体上、例えばナイロン膜またはスライドグラス
上アレイ中の個々のスポットに置く。平均して、ＨＳＶ−２中の各ヌクレオチド
はアレイ上の数個のクローン中に現れる。

【図２】図２は、慣用的方法によりマッピングされるＨＳＶ−１の内部リ
ピート領域に由来する転写産物の複雑性を示す。

【図３Ａ】図３Ａは、０、２、６および１７時間感染したＭＲＣ−５細胞
から調製されたｃＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションするＦＡＴＭａｐア
レイの結果を示す。ＨＳＶ−２ゲノムヌクレオチド８７０００と９１０００との
間のすべてのサブフラグメントの左端のゲノム位置をＸ軸として用い、Ｙ軸上の
各シンボルの高さはサブフラグメントが占領したグリッドスポットの光強度であ
る。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ＨＳＶ２ＨＧ５２についてGenbankエントリーから
推定され、Genbankエントリーの特徴のセクションに説明され、ソフトウェアパ
ッケージＭａｐＤｒａｗ（DNASTAR,Inc.）を用いて引き出された、ゲノムヌクレ
オチド８７０００と９１０００との間に存在するＨＳＶ−２ＯＲＦを示す。Ｕ
Ｌ３９（ＩＣＰ６）はこのゲノム領域中で知られた唯一のＯＲＦである。

【図４】図４は、ＨＳＶ−２に感染後０、２、６および１７時間たったＭ
ＲＣ−５細胞から調製されたｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション後、
ＵＬ３９のみの発現に関する試験で特異的に得られたＰＣＲ生成物のグリッドハ
イブリダイゼーション結果を示す。これは、ＦＡＴマッピングに対するマイクロ
アレイ分析のための慣用的アプローチを示す。生成物を各グリッド上の５つの別
個の位置にスポットし、スポット１〜５からデータを得た。

【図５Ａ】図５Ａは、ハウス−キーピング遺伝子β−アクチンのｍＲＮＡ
量との比較による、ＩＣＰ６ｍＲＮＡ量についての慣用的な半定量的ＲＴ−Ｐ
ＣＲ分析の結果を示す。ベータ−アクチンの量に対するＩＣＰ６遺伝子特異的Ｐ
ＣＲ生成物の量の割合を、ＨＳＶ−２に感染してから０、１、２、４および６時
間後のＭＲＣ−５細胞由来のＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ反応から計算した。

【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＳＶ−２に感染してから０、１、２、４および６
時間後のＭＲＣ−５細胞に由来するＲＮＡ試料中の、定量的ＴａｑＭａｎＰＣ
Ｒにより検出されたｍＲＮＡ分子の相対量（コピー数）を示す。ＨＳＶ−２遺伝
子ｇＣ（ＵＬ４４）、ＩＣＰ６（ＵＬ３９）およびＩＣＰ２７に関する転写産物
を測定し、棒グラフで示した。

【図６Ａ】図６Ａは感染後０、２、６および１７時間たったＭＲＣ−５細
胞から調製されたｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションするＦＡＴＭａｐ
アレイの結果を示す。ＨＳＶ−２ゲノムヌクレオチド９６０００と１０１０００
との間のすべてのサブフラグメントの左端のゲノム位置をＸ軸として用い、Ｙ軸
上の各シンボルの高さはサブフラグメントが同時に占領したグリッドスポットの
光強度である。９７０００と９８０００との間のＵＬ４４（ｇＣ）領域中のすべ
てのクローンのシグナル強度は感染後０ないし２時間、および２ないし６時間に
おいて増大し、次いで、感染後１７時間においてわずかに減少していた。

【図６Ｂ】図６Ｂは、ＨＳＶ２ＨＧ５２についてGenbankエントリーから
推定され、Genbankエントリーの特徴のセクションに説明され、ソフトウェアパ
ッケージＭａｐＤｒａｗ（DNASTAR,Inc.）とともに引き出された、ゲノムヌクレ
オチド９６０００と１０１０００との間に存在するＨＳＶ−２ＯＲＦを示す。
ＵＬ４４（ｇＣ）、ＵＬ４５およびＵＬ４３の部分ならびにＵＬ４６はこのゲノ
ム領域中の知られたＯＲＦである。

【図７】図７は、感染から０、２、６、および１７時間後のＭＲＣ−５細
胞から調製したｃＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションしたＵＬ４４オープ
ンリーディングフレームに関する慣用的なマイクロアレイ遺伝子特異的ＰＣＲ生
成物スポットの結果を示す。遺伝子特異的ＤＮＡをマイクロアレイ中の８系の同
じスポットに適用した。

【図８】図８は、感染から０、２、６および１７時間後のＭＲＣ−５細胞
から調製したｃＤＮＡプローブMapDrawを用いてＨＳＶ２ＨＧ５２Genebankエン
トリーから引き出された既知ＯＲＦとハイブリダイゼーションするＦＡＴＭａｐ
アレイの結果ならびにMapDrawを用いてＨＳＶ２ＨＧ５２Genebankエントリーか
ら引き出された既知ＯＲＦを示す。ＨＳＶ−２ゲノムヌクレオチド番号５８００
０と６４０００との間のＨＳＶ−２ゲノム由来のすべてのサブフラグメントの左
端（黒シンボル）および右端（白シンボル）のゲノム位置をＸ軸として用い、Ｙ
軸上の各シンボルの高さはサブフラグメントが占領したグリッドスポットの光強
度である。ＵＬ２９はゲノムヌクレオチド番号５８０００と６４０００との間の
ＨＳＶ２ＨＧ５２配列から推定される唯一の既知遺伝子である。

【図９】図９は、感染０、２、６および１７時間後のＭＲＣ−５細胞から
調製したｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションするＦＡＴＭａｐアレイの
結果ならびにMapDrawを用いてＨＳＶ２ＨＧ５２Genebankエントリーから引き出
された既知ＯＲＦを示す。ＨＳＶ−２ゲノムヌクレオチド番号２２０００と２８
０００との間のＨＳＶ−２ゲノム由来のすべてのサブフラグメントの左端（黒シ
ンボル）および右端（白シンボル）のゲノム位置をＸ軸として用い、Ｙ軸上の各
シンボルの高さはサブフラグメントが占領したグリッドスポットの光強度である
。このゲノム領域のシグナル強度は既知ＯＲＦによく対応し、例えば、ＵＬ９お
よびＵＬ１３が低レベルでのみ発現され、対照的にＵＬ１０および１１が図８に
示すＵＬ２９領域について見られるよりも高レベルで発現される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ルース・タル−シンガーアメリカ合衆国19063ペンシルベニア州メディア、ヘムロック・ロード723番Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 HA14 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ10 QQ53 QR32 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲノム配列に由来する個々の転写産物の位置をマピングする
方法であって、下記工程：ａ）ゲノム配列の重複サブフラグメントを得ること、ここに各ゲノムサブフラ
グメントのヌクレオチド配列の少なくとも一部分が決定されており；ｂ）各重複ゲノムサブフラグメントを高密度グリッド上の別個の隊列となった
（知られた）位置に置くこと；ｃ）該ゲノム配列から転写された試験転写産物を含む組成物を調製すること；ｄ）該組成物中の試験転写産物を検出可能な様式で標識すること；ｅ）標識試験転写産物を含む組成物を、ゲノムフサブラグメントを含む高密度
グリッドと接触させ、そのことにより標識試験転写産物がゲノムサブフラグメン
トにハイブリダイゼーションするようにすること；ｆ）ハイブリダイゼーションしていない試験転写産物を高密度グリッドの表面
から除去すること；ｇ）ハイブリダイゼーションした標識試験転写産物を含む高密度グリッド上の
隊列位置を検出すること；次いでｈ）高密度グリッド上で標識試験転写産物がゲノムサブフラグメントにハイブ
リダイゼーションしたパターンを分析することを含み、高密度グリッド上の標識試験転写産物の位置を該グリッド上の重複ゲノ
ムサブフラグメントの隊列位置と比較することにより、ゲノム配列中における個
々の試験転写産物の位置がマッピングされる方法。
【請求項２】工程ａにおいて、ショットガンクローニング法を用いて重複
サブフラグメントの取得が行われる請求項１の方法。
【請求項３】ゲノム配列が植物、動物、細菌およびウイルスからなる群よ
り選択されるものである請求項１の方法。
【請求項４】ゲノム配列がヒト動物配列である請求項３の方法。
【請求項５】ゲノム配列がヘルペスウイルス配列である請求項３の方法。
【請求項６】工程ｂの前にポリメラーゼ連鎖反応を用いて工程ａの重複サ
ブフラグメントが増幅される請求項１の方法。
【請求項７】高密度グリッド上の標識試験転写産物の位置と該グリッド上
の重複ゲノムサブフラグメントの隊列位置との比較が、コンピューターにより支
援される方法を用いて行われる請求項１の方法。
【請求項８】ゲノム配列からの個々の転写産物が、これまで未同定であっ
た遺伝子の転写を示すものである請求項１の方法。
【請求項９】共通のゲノム配列を共有している２またはそれ以上の異なる
組織または細胞集団間の転写産物の異なった発現を測定する方法であって、下記
工程：該共通配列に対して請求項１の方法の工程ａおよびｂを行うこと；異なった各細胞または組織集団に対して別個に請求項１の方法の工程ｃからｈ
までを行うこと；次いで異なった各細胞または組織集団からの試験転写産物が共通のゲノム配列に対し
てマッピングされるパターンを比較することを含み、異なったウイルス、組織または細胞集団間の転写産物の発現の相違が調
べるられる方法。
【請求項１０】同じ生物中の２種またはそれ以上の組織間の転写産物の異
なった発現が測定される請求項９の方法。
【請求項１１】１のウイルス、細胞または組織集団の異なった発現が異な
った時点において測定される請求項９の方法。
【請求項１２】外部刺激の不存在下または存在下において、あるいは疾病
状態の不存在下または存在下において、１の組織、ウイルスまたは細胞集団の異
なった発現が測定される請求項９の方法。
【請求項１３】外部刺激が化合物である請求項１２の方法。
【請求項１４】ウイルス、組織または細胞集団が細菌およびウイルスから
なる群より選択されるものである請求項１１の方法。
【請求項１５】ウイルス集団が２型ヘルペスウイルスである請求項１３ま
たは１４の方法。
【請求項１６】ウイルス集団が２型ヘルペスウイルスであり、時点がウイ
ルス感染期間中、潜伏中および再活性化中において種々の間隔を置いて取られる
ものである請求項１１および１４の方法。
【請求項１７】特定条件下においてゲノム配列中の知られた位置の特定の
オープンリーディングフレームが発現されるかどうかを調べる方法であって、下
記工程：ゲノム配列に対して請求項１の方法の工程ａおよびｂを行い、それにより該オ
ープンリーディングフレームに対応するゲノムサブフラクションの高密度グリッ
ド上の隊列位置を決定すること；該ゲノム配列を含む細胞または組織の集団を特定条件に供すこと；特定条件に供された該細胞または組織のゲノム配列に対して請求項１の方法の
工程ｃからｈまでを行うこと；次いで該特定条件に供された該細胞または組織由来の試験転写産物が該オープンリー
ディングフレームのゲノムサブフラグメントに対応する該高密度グリッド上の隊
列位置にハイブリダイゼーションしたかどうかを調べることを含み、該ゲノム配列中の該オープンリーディングフレームが該特定条件下で発
現されたかどうかが調べられる方法。
【請求項１８】特定の条件が、転写前あるいは転写中における化合物の導
入である請求項１７の方法。
【請求項１９】ゲノム配列がウイルス配列である請求項１７の方法。
【請求項２０】ゲノム配列が２型ヘルペス由来であり、特定の条件が潜在
的に抗ウイルス剤である化合物の導入である請求項１８および１９の方法。
【請求項２１】３’および５’末端部分のみにおいて配列決定されている
、請求項１の方法の工程ａの配列決定されている各ゲノムサブフラグメントのヌ
クレオチド配列。
【請求項２２】３’および５’末端部分のみにおいて配列決定されている
、請求項９の配列決定されている各ゲノムサブフラグメントのヌクレオチド配列
。
【請求項２３】３’および５’末端部分のみにおいて配列決定されている
、請求項１７の配列決定されている各ゲノムサブフラグメントのヌクレオチド配
列。