JP2002517409A - Preparation of antigen presenting cell compositions and methods for in vivo administration - Google Patents
Preparation of antigen presenting cell compositions and methods for in vivo administrationInfo
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Abstract
(57)【要約】 抗原提示細胞について濃縮された血球画分を獲得するための方法が、開示される。この方法は、幹細胞を動員させるために有効な因子を用いて患者を処置する工程、患者から血液サンプルを獲得する工程、血液サンプルを規定の密度を有する媒体にわたって密度遠心分離に供する工程、抗原提示細胞が濃縮された細胞画分を収集する工程、および樹状細胞の形態、表現型、および機能を有する細胞を誘導するために有効な条件下で上記収集された細胞を培養する工程、を包含する。インビトロ治療のためにこのような抗原提示細胞前駆体を使用する方法およびこのような抗原提示細胞を含む薬学的組成物もまた、開示される。 (57) [Summary] A method for obtaining an enriched blood cell fraction for antigen presenting cells is disclosed. The method comprises treating a patient with an agent effective to recruit stem cells, obtaining a blood sample from the patient, subjecting the blood sample to density centrifugation over a medium having a defined density, antigen presentation. Collecting the cell fraction enriched in cells, and culturing the collected cells under conditions effective to induce cells having dendritic cell morphology, phenotype, and function. I do. Also disclosed are methods of using such antigen presenting cell precursors for in vitro therapy and pharmaceutical compositions comprising such antigen presenting cells.
Description
【０００１】 本発明は、患者から抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびその前駆体を獲得する方法
、およびその患者における治療のためのそのような細胞の使用に関する。本発明
の方法は、ＡＰＣを用いるインビボ治療を包含する多工程治療アプローチ、およ
び特に、インビボ免疫療法に有用なＡＰＣを含む組成物およびそのようなＡＰＣ
を含む組成物を調製する方法を包含する。The present invention relates to a method for obtaining antigen presenting cells (APCs) and their precursors from a patient, and to the use of such cells for treatment in said patient. The methods of the invention are multi-step therapeutic approaches, including in vivo treatment with APCs, and in particular, compositions comprising APCs useful for in vivo immunotherapy and such APCs
And a method of preparing a composition comprising
【０００２】 （発明の背景） 多くの異なる治療レジメが、現在、癌治療に使用されている。このようなレジ
メは、以下に挙げる１つ以上を含み得る：手術、化学療法、Ｘ線照射、免疫療法
、幹細胞の単離および置換、ならびに幹細胞全体画分またはそれらに由来する部
分画分（ｓｕｂ−ｆｒａｃｔｉｏｎ）のインビトロ刺激、続いて刺激した細胞を
患者へ戻すこと（Ｖｌａｓｓｅｌａｅｒ、米国特許第５，４７４，６８７号、１
９９５年１２月１２日発行）。種々の型の治療プロトコルがあるのみならず、そ
のようなプロトコルの多くの改変型が、幹細胞を動員、同定、および単離するた
め、この幹細胞を分画するため、ならびにそれらをインビトロで培養するために
、存在する（Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、１８（１ 第
２部）３Ｓ〜８Ｓ頁、（１９９８））。最も関連的には、これは、幹細胞集団内
に見出される樹状細胞（ＤＣ）に関して当てはまる。この幹細胞集団は、抗原提
示細胞（ＡＰＣ）が特に有効になるように刺激され得る。このようなＡＰＣは、
任意のＴ細胞（被験体の抗原に遭遇していないＴ細胞（「未刺激のＴ細胞」）で
さえ）に対して抗原を提示し得る。BACKGROUND OF THE INVENTION Many different treatment regimes are currently used for treating cancer. Such a regime may include one or more of the following: surgery, chemotherapy, X-irradiation, immunotherapy, stem cell isolation and replacement, and whole stem cell fractions or subfractions derived therefrom (sub). -Fraction in vitro, followed by returning the stimulated cells to the patient (Vlasselaer, US Pat. No. 5,474,687, 1).
Published December 12, 995). Not only are there various types of therapeutic protocols, but many modified versions of such protocols mobilize, identify, and isolate stem cells, fractionate the stem cells, and culture them in vitro (Kennedy, Pharmacotherapy, 18 (1 part 2) pages 3S-8S, (1998)). Most relevantly, this is true for dendritic cells (DCs) found within the stem cell population. This stem cell population can be stimulated so that antigen presenting cells (APCs) are particularly effective. Such an APC is
The antigen can be presented to any T cell, even T cells that have not encountered the subject's antigen ("unstimulated T cells").
【０００３】 過去および現在の癌の処置レジメは、手術、Ｘ線照射、そして化学療法および
免疫療法の１つまたは両方を用いて幾分首尾良く行われている。化学療法／免疫
療法は、骨髄から末梢血への幹細胞の動員を生じることが示されている。サイト
カインのインビボ投与は、独立した処置としてかまたは他の癌治療と組合せる処
置の一部としてかのいずれかで広範に使用され、これは、幹細胞動員を刺激する
ことが実証されている（Ｈｅｉｎｚｉｎｇｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＥＮＧＬ
ＡＮＤ）、１２（３）３３３〜９頁、１９９８）。[0003] Past and present cancer treatment regimens have been somewhat successful using surgery, x-ray irradiation, and one or both of chemotherapy and immunotherapy. Chemotherapy / immunotherapy has been shown to result in the recruitment of stem cells from the bone marrow to peripheral blood. In vivo administration of cytokines is widely used, either as an independent treatment or as part of a treatment in combination with other cancer therapies, which has been demonstrated to stimulate stem cell recruitment (Heinzinger Et al., Leukemia (ENGL
AND), 12 (3) pp. 333-9, 1998).
【０００４】 より最近、癌の処置レジメは、幹細胞置換治療に続いて、特に、Ｘ線照射、化
学療法、およびサイトカインを用いる免疫療法の１つ以上を含んでいた。このよ
うな幹細胞置換治療は、一般に、患者細胞の収集、幹細胞の単離、および患者へ
幹細胞を戻すことを含む。[0004] More recently, cancer treatment regimes have included stem cell replacement therapy followed, inter alia, by one or more of x-ray irradiation, chemotherapy, and immunotherapy with cytokines. Such stem cell replacement therapy generally involves collecting patient cells, isolating the stem cells, and returning the stem cells to the patient.
【０００５】 上記に概要を述べたレジメの各々は、いくらかの成功を満たしている；しかし
、疾患の再発は、このような処置の後または疾患の再発後に、残存する腫瘍細胞
が存在したままであることのような多くの理由のために生じ得る。[0005] Each of the regimens outlined above has met with some success; however, recurrence of the disease is likely to occur after such treatment or after recurrence of the disease, with the remaining tumor cells remaining present. It can happen for many reasons, such as being.
【０００６】 種々の形態の細胞性免疫療法（これは、最近広範に承認を得ている）は、疾患
に対して患者をワクチン接種するための抗原のインビボ投与または特定の抗原に
よってインビトロで刺激され、そして引き続いて患者へ戻される細胞を用いる細
胞性治療を含む。[0006] Various forms of cellular immunotherapy, which has gained widespread approval recently, are stimulated in vitro by in vivo administration of antigens or specific antigens to vaccinate patients against disease. And subsequent cellular therapy with cells returned to the patient.
【０００７】 生存能力のある抗原でパルスした（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｅｄ）ＡＰＣを
用いるワクチン接種は、この臨床的な必要性に適応し得る。本明細書に記載され
る本発明は、癌患者からのＡＰＣの収集手段および免疫療法におけるそれらの使
用に関する。[0007] Vaccination with anti-pulsed APCs with viable antigens can adapt to this clinical need. The invention described herein relates to means for collecting APCs from cancer patients and their use in immunotherapy.
【０００８】 （発明の要旨） 従って、本発明の一般的な目的は、患者への抗原提示細胞の投与工程を包含す
る免疫療法および癌治療の方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION [0008] Accordingly, it is a general object of the present invention to provide a method of immunotherapy and cancer treatment that involves administering an antigen presenting cell to a patient.
【０００９】 本発明の別の目的は、このようなＡＰＣおよび免疫療法における使用のために
このような細胞を含む組成物を得るための方法を提供することである。[0009] Another object of the present invention is to provide a method for obtaining such APCs and compositions comprising such cells for use in immunotherapy.
【００１０】 本発明は、１つの局面において、ヒト患者から抗原提示細胞を得るための方法
を含む。この方法は、以下を包含する；（１）骨髄から末梢血へ幹細胞を動員さ
せるために有効な因子を用いて患者を処置する工程、（２）末梢血単核細胞にお
いて濃縮された血球画分をこの患者から獲得する工程、（３）この血球画分を密
度遠心分離に供する工程、（４）抗原提示細胞前駆体において濃縮された細胞画
分を獲得するために相間の細胞を収集する工程、および（５）樹状細胞の形態、
表現型、および機能を有する細胞を誘導するために有効な条件下で上記収集され
た細胞を培養する工程。密度遠心分離工程は、好ましくは、１．０６０５±０．
０００５ｇｒ／ｍｌの密度、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏの浸透圧重量モル濃
度、およびｐＨ７．４を有する分離媒体の上に（２）の産物を重層することによ
って実行される。[0010] The invention, in one aspect, includes a method for obtaining antigen presenting cells from a human patient. The method includes: (1) treating a patient with an agent effective to recruit stem cells from bone marrow to peripheral blood; (2) a blood cell fraction enriched in peripheral blood mononuclear cells. (3) subjecting the blood cell fraction to density centrifugation, and (4) collecting interphase cells to obtain a cell fraction enriched in antigen-presenting cell precursors. And (5) dendritic cell morphology,
Culturing the collected cells under conditions effective to induce cells having a phenotype and function. The density centrifugation step is preferably 1.0605 ± 0.
It is carried out by overlaying the product of (2) on a separation medium having a density of 0005 gr / ml, an osmolality of 280 mOsm / kg H 2 O, and a pH of 7.4.
【００１１】 本発明は、１．０６０５±０．０００５ｇｍ／ｍｌの密度、２８０ｍＯｓｍ／
ｋｇ Ｈ2Ｏの浸透圧重量モル濃度、およびｐＨ７．４を有するコロイド状シリ
カ溶液のような分離媒体は、アフェレーシスされた血液または骨髄バフィーコー
トが分離媒体上を覆っている場合に血球の大部分からＡＰＣまたはＣＤ３４+幹
細胞を効果的に分離し、およびこの細胞画分がＡＰＣにおいて特に濃縮されると
いう発見に一部基づく。The present invention has a density of 1.0605 ± 0.0005 gm / ml, 280 mOsm /
Separation media, such as a colloidal silica solution having an osmolality of kg H 2 O, and a pH of 7.4, will result in the majority of the blood cells when the apherized blood or bone marrow buffy coat is coated over the separation media. Based on the discovery that APC or CD34 + stem cells are effectively isolated from APCs and that this cell fraction is specifically enriched in APCs.
【００１２】 １つの局面において、骨髄から末梢血へ幹細胞を動員させるために有効な因子
は、１つ以上の化学療法剤またはＸ線照射である。さらなる局面において、この
動員は、１つ以上の化学療法剤を単独で、またはサイトカインと組み合わせて、
患者に投与することによって達成される。[0012] In one aspect, an agent effective for recruiting stem cells from the bone marrow to peripheral blood is one or more chemotherapeutic agents or X-ray irradiation. In a further aspect, the mobilization comprises one or more chemotherapeutic agents, alone or in combination with a cytokine,
It is achieved by administering to a patient.
【００１３】 本発明の免疫療法および癌治療方法は、以下の工程を包含する：（１）抗原提
示細胞前駆体において濃縮された細胞画分を獲得する工程（上記の工程（１）〜
（４）のように）、（２）培養工程の前に、抗原提示細胞前駆体において濃縮さ
れた細胞の画分の一部を患者に戻す工程か、または樹状細胞の形態、表現型、お
よび機能を有する細胞を誘導するために有効な条件下で抗原提示細胞前駆体にお
いて濃縮された細胞の画分全体を培養する工程のいずれか、次いで（３）曝露さ
れた細胞をこの患者に投与する工程。The immunotherapy and cancer treatment method of the present invention includes the following steps: (1) a step of obtaining a cell fraction enriched in an antigen-presenting cell precursor (the above steps (1) to (4))
(4)), (2) prior to the culturing step, returning a portion of the cell fraction enriched in the antigen-presenting cell precursor to the patient, or dendritic cell morphology, phenotype, And culturing the entire fraction of cells enriched in antigen presenting cell precursors under conditions effective to induce functional cells, and then (3) administering the exposed cells to the patient Process.
【００１４】 本発明の細胞は、収集された細胞を抗原前駆体（例えば、培養された細胞にお
いて誘導するために有効であるペプチド抗原もしくは他の抗原を含むポリペプチ
ド）に曝露することによってか、または免疫応答が所望される１つ以上のペプチ
ド抗原の細胞表面提示によって、樹状細胞の形態、表現型、および機能を有する
ように誘導され得る。The cells of the invention may be obtained by exposing the harvested cells to an antigen precursor (eg, a polypeptide comprising a peptide antigen or other antigen that is effective to induce in cultured cells) Alternatively, an immune response can be induced to have the morphology, phenotype, and function of dendritic cells by cell surface presentation of one or more peptide antigens desired.
【００１５】 １つの局面において、抗原前駆体は、ペプチド抗原または他の抗原を含むポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含み、そして曝露する工程は、このＤＮＡを、樹
状細胞の形態、表現型、および機能を有する細胞へ導入することを含む。[0015] In one aspect, the antigen precursor comprises DNA encoding a peptide antigen or a polypeptide comprising another antigen, and the exposing step converts the DNA to dendritic cell morphology, phenotype, and Introducing into a functional cell.
【００１６】 関連する局面において、本発明は、上記の型の樹状細胞の形態、表現型、およ
び機能を誘導するために有効な条件下で培養された幹細胞および抗原提示細胞前
駆体の混合物を含む、免疫療法における使用のための細胞組成物を含む。本発明
のＡＰＣの前駆体は、変化した細胞において免疫応答が所望される１つ以上のペ
プチド抗原の細胞表面提示を誘導するために有効な抗原前駆体にさらに曝露され
る。In a related aspect, the invention provides a mixture of stem cells and antigen presenting cell precursors cultured under conditions effective to induce the morphology, phenotype, and function of dendritic cells of the type described above. And cell compositions for use in immunotherapy. The precursor of the APC of the present invention is further exposed to an antigen precursor effective to induce cell surface presentation of one or more peptide antigens for which an immune response is desired in the altered cells.
【００１７】 本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、以下の本発明の詳細な説明が
、添付の図面と合わせて読まれる場合に、より十分に明確となる。[0017] These and other objects and features of the invention will become more fully apparent when the following detailed description of the invention is read in conjunction with the accompanying drawings.
【００１８】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 他に示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有する： 「樹状細胞前駆体」または「ＤＰＣ」は、適切な条件下において樹状細胞へと
成熟し得る末梢血球である。ＤＰＣは、代表的に、非樹状形態であり、そして抗
原提示細胞として一次免疫応答を誘発する能力を有さない。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION I. Definitions Unless otherwise indicated, the following terms have the following meanings: "Dendritic cell precursor" or "DPC" Peripheral blood cells that can mature into dendritic cells. DPCs are typically in a non-dendritic form and have no ability to elicit a primary immune response as antigen presenting cells.
【００１９】 「樹状細胞」または「ＤＣ」は、成熟したＤＰＣであり、これは、代表的に樹
状細胞形態を有する。すなわち、樹状細胞は、インビトロで培養される場合に樹
状突起を拡張する大きなベール細胞である。抗原またはペプチドをパルスされる
場合、このようなＤＣ細胞は、未刺激のＴ細胞に抗原を提示し得る。“Dendritic cells” or “DCs” are mature DPCs, which typically have a dendritic cell morphology. That is, dendritic cells are large bale cells that expand dendrites when cultured in vitro. When pulsed with an antigen or peptide, such DC cells can present antigen to unstimulated T cells.
【００２０】 「抗原提示細胞前駆体」は、抗原またはペプチドに曝露された場合に、ＡＰＣ
になり得、そしてＴ細胞に抗原を提示し得る細胞である。An “antigen-presenting cell precursor” is an APC that, when exposed to an antigen or peptide,
And can present antigen to T cells.
【００２１】 「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、抗原またはペプチドに曝露された細胞であり
、これは、免疫応答においてＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＣ
Ｄ４+ヘルパーＴリンパ球を活性化し得る。“Antigen-presenting cells” (APCs) are cells that have been exposed to an antigen or peptide, and that are responsible for the response of CD8 + cytotoxic T lymphocytes (CTLs) or C
D4 + helper T lymphocytes can be activated.
【００２２】 （ＩＩ．骨髄から末梢血への幹細胞の動員） 骨髄および末梢血の移植は、癌および造血障害の処置のために診療所で実施さ
れる。骨髄および末梢血の生成物が、患者において再注入される前に処理される
。II. Recruitment of Stem Cells from Bone Marrow to Peripheral Blood Transplantation of bone marrow and peripheral blood is performed in clinics for the treatment of cancer and hematopoietic disorders. Bone marrow and peripheral blood products are processed before being re-infused in the patient.
【００２３】 本発明の方法に従って、患者は、癌治療のための処置レジメの一部として、１
つ以上の化学療法剤を用いて、またはＸ線照射によって処置され得る。このよう
な処置レジメは、幹細胞の動員を生じることが実証されている（Ｈｅｉｎｚｉｎ
ｇｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＥＮＧＬＡＮＤ）１２（３）３３３〜９頁、（１
９９８））。このような動員はまた、１つ以上の化学療法剤を患者に投与する工
程（続いてサイトカインの投与をしてもよいし、しなくてもよい）を含むがこれ
に限定されない他の手段によっても達成され得る。他の処置レジメは、サイトカ
イン投与のみを含み得る。In accordance with the methods of the present invention, a patient may receive 1 as part of a treatment regimen for treating cancer.
It can be treated with one or more chemotherapeutic agents or by X-ray irradiation. Such treatment regimes have been demonstrated to result in recruitment of stem cells (Heinzin
ger et al., Leukemia (ENGLAND) 12 (3) pp. 333-9, (1
998)). Such mobilization may also be by other means, including, but not limited to, administering one or more chemotherapeutic agents to the patient, with or without the subsequent administration of cytokines. Can also be achieved. Other treatment regimes may involve only cytokine administration.
【００２４】 本発明の治療剤またはサイトカインの投与の方法としては、以下が挙げられ得
るがこれらに限定されない：中心静脈カテーテルを通じての静脈内（ＩＶ）注入
、皮下（ＳＣ）注入、経口、鼻内、経皮、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）、ま
たは肺内の投与。[0024] Methods of administration of the therapeutic agents or cytokines of the present invention may include, but are not limited to: intravenous (IV) infusion through a central venous catheter, subcutaneous (SC) infusion, oral, intranasal. Transdermal, intraperitoneal (IP), intramuscular (IM), or pulmonary administration.
【００２５】 動員のために好ましい化学療法剤としては、以下のうちの１つ以上が挙げられ
るがこれらに限定されない：シクロホスファミド、エトポシドまたはカルムスチ
ン。他の化学療法剤としては、関連分野において共通に使用される化学療法剤が
挙げられる（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（２
）３１１〜６、（１９９８））。Preferred chemotherapeutic agents for mobilization include, but are not limited to, one or more of the following: cyclophosphamide, etoposide, or carmustine. Other chemotherapeutic agents include chemotherapeutic agents commonly used in the relevant field (Moskowitz et al., Clin. Cancer Res. 4 (2
311-6, (1998)).
【００２６】 動員のために好ましいサイトカインとしては、以下のうちの１つ以上が挙げら
れるがこれらに限定されない：顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、胎
児肝臓キナーゼ−３タンパク質リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、インターロイキン−
３（ＩＬ−３）、およびトロンボポイエチン。サイトカインはまた、融合タンパ
ク質の形態で患者に投与され得る。Preferred cytokines for recruitment include, but are not limited to, one or more of the following: granulocyte colony stimulating factor (GCSF) or granulocyte macrophage colony stimulating factor (GMCSF), stem cell factor ( SCF), fetal liver kinase-3 protein ligand (FLT3-L), interleukin-
3 (IL-3), and thrombopoietin. The cytokine may also be administered to the patient in the form of a fusion protein.
【００２７】 本発明に従って、化学療法、Ｘ線照射およびサイトカインを用いる治療のうち
の１つ以上によって処置された患者から得られる幹細胞の画分は、以下で示され
るように、本発明の方法によって単離され得るＡＰＣ前駆体において濃縮される
。According to the present invention, the fraction of stem cells obtained from a patient treated by one or more of chemotherapy, X-irradiation and therapy with cytokines, as shown below, according to the method of the invention, Enriched in APC precursors that can be isolated.
【００２８】 （ＩＩＩ．ＡＰＣ前駆体の単離） （Ａ．密度勾配分離） 本発明の方法に従って、ＡＰＣにおいて濃縮された画分は、以下の工程によっ
て獲得され得る：（１）ヒト血液サンプルから、末梢血リンパ球および樹状細胞
前駆体を含む単球枯渇化細胞画分を獲得する工程、（２）密度遠心分離によって
収集した細胞において樹状細胞の一部を濃縮して、ＡＰＣにおいて濃縮された画
分を獲得する工程、（３）樹状細胞前駆体において、樹状細胞の形態および機能
を有する細胞への形態学的変化および生物学的変化を生成するために十分な時間
、無血清培地中で細胞画分を培養する工程、ならびに（４）上記培養する工程に
よって生成された非接着細胞を収集する工程。III. Isolation of APC Precursors A. Density Gradient Separation According to the method of the present invention, fractions enriched in APC can be obtained by the following steps: (1) from human blood samples Obtaining a monocyte-depleted cell fraction containing peripheral blood lymphocytes and dendritic cell precursors, (2) enriching a portion of dendritic cells in cells collected by density centrifugation and enriching in APCs Obtaining a fraction obtained, (3) sufficient time to produce morphological and biological changes in the dendritic cell precursors into cells having dendritic cell morphology and function, Culturing the cell fraction in a serum medium, and (4) collecting the non-adherent cells generated by the culturing step.
【００２９】 遠心分離における使用のために適切な任意のチューブが、本発明の実施のため
に使用され得る。例示される方法は、密度遠心分離によって工程（２）を達成す
るが、他のアプローチを使用して、以下で詳述されるように、このような単核細
胞枯渇化細胞画分を獲得し得ることが理解される。例えば、逆流溶出（ｃｏｕｎ
ｔｅｒｆｌｏｗ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）遠心分離（Ｋａｂｅｌ，Ｐ．Ｊ．ら
、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７９：３９５〜４１（１９８９））は、樹状
細胞について濃縮するために使用され得る。Any tube suitable for use in centrifugation can be used for practicing the present invention. The illustrated method accomplishes step (2) by density centrifugation, but other approaches are used to obtain such a mononuclear cell-depleted cell fraction, as detailed below. It will be appreciated that you get. For example, countercurrent elution (count
Terflow elution centrifugation (Kabel, PJ, et al., Immunobiology 179: 395-41 (1989)) can be used to enrich for dendritic cells.
【００３０】 例として、Ｇ−ＣＳＦを用いて以前に処置された癌患者由来のアフェレーシス
された血液は、例えば、くびれを超えるレベルまで満たされたコロイド状シリカ
溶液を含むセルトラップ（ｃｅｌｌ−ｔｒａｐ）遠心分離チューブへ直接的にロ
ードされる。この溶液は、１．０６０５±０．０００５ｇｒ／ｍｌの好ましい密
度、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏの好ましい浸透圧重量モル濃度、および好ま
しいｐＨ７．４に調整されている。勾配溶液の密度は、少なくとも少数第４位ま
でその精度を正確に規定するために濃度計で調整される。種々の勾配物質を使用
して前駆体細胞濃縮を達成し得、そしてこの勾配物質としては、「ＦＩＣＯＬＬ
」、「ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ」、塩化セシウム、「ＰＥＲＣＯＬＬ」お
よび等価なコロイド状シリカ溶液、アルブミンのような任意のタンパク質溶液な
らびにスクロースおよびデキストランのような任意の糖溶液が挙げられるが、こ
れらに限定されないことに注意すべきである。しかし、密度勾配溶液は、その使
用の前に、本明細書中で開示されることに従って、適切な密度、浸透圧重量モル
濃度およびｐＨに調製および調整されるべきである。勾配溶液は、遠心分離の間
、より高い密度を有する細胞全てがこの勾配を通過することを可能にするために
十分な容量中で遠心分離チューブに添加されるべきである。By way of example, apheresis blood from a cancer patient previously treated with G-CSF may be, for example, a cell-trap containing a colloidal silica solution filled to a level above the constriction. Loaded directly into a centrifuge tube. The solution is adjusted to a preferred density of 1.0605 ± 0.0005 gr / ml, a preferred osmolality of 280 mOsm / kg H 2 O, and a preferred pH of 7.4. The density of the gradient solution is adjusted with a densitometer to accurately define its accuracy, at least to the fourth decimal place. Precursor cell enrichment can be achieved using a variety of gradient materials, including "FICOLL"
, "FICOLL-HYPAQUE", cesium chloride, "PERCOLL" and equivalent colloidal silica solutions, any protein solution such as albumin, and any sugar solution such as sucrose and dextran. It should be noted that However, the density gradient solution should be prepared and adjusted to the appropriate density, osmolality and pH, as disclosed herein, prior to its use. The gradient solution should be added to the centrifuge tube in a volume sufficient to allow all cells with higher density to pass through this gradient during centrifugation.
【００３１】 遠心分離における使用に適切な任意のチューブが、本発明の実施のために使用
され得る。本発明の遠心分離工程において使用されるＣＤ３４+細胞の密度分離
のために、くびれまたはトラップ、および適切に調整された密度勾配物質をその
中に含むセルトラップチューブが、好ましい（Ｖａｎ Ｖｌａｓｓｅｌａｅｒ、
米国特許第５，４７４，６８７号）。[0031] Any tube suitable for use in centrifugation can be used for the practice of the present invention. For the density separation of CD34 + cells used in the centrifugation step of the present invention, a constriction or trap and a cell trap tube containing a suitably adjusted density gradient material therein are preferred (Van Vlaselaer,
U.S. Pat. No. 5,474,687).
【００３２】 本発明は、密度遠心分離後に相間に存在する画分が、ＤＣ、抗原提示細胞およ
びそれらの前駆体について濃縮されるという知見に基づく。従って、ＡＰＣの単
離は、使用される密度勾配の分離特徴に依存する。これは、次に、使用される勾
配物質の密度、浸透圧重量モル濃度およびｐＨのような物理的性質に依存する。
上記に示されるようなこれらの特徴の組合せを有する任意の分離媒体が、ＡＰＣ
およびその前駆体について濃縮される細胞画分を獲得するために有効であること
が、理解される。The present invention is based on the finding that the fraction present between the phases after density centrifugation is enriched for DCs, antigen presenting cells and their precursors. Thus, the isolation of APC depends on the separation characteristics of the density gradient used. This in turn depends on physical properties such as the density, osmolality and pH of the gradient material used.
Any separation media having a combination of these features, as set forth above, may be APC
And that it is effective to obtain a cell fraction that is enriched for its precursors.
【００３３】 この画分におけるＤＣの純度は、例えば、フローサイトメトリーセルソーティ
ング（ＦＡＣＳ）分析を機能的アッセイと共に使用して定量され得る。The purity of DC in this fraction can be quantified using, for example, flow cytometry cell sorting (FACS) analysis with a functional assay.
【００３４】 （Ｂ．抗体染色およびフローサイトメトリー） 例示的なアッセイにおいて、これらの細胞は、５％ウサギ血清の存在下におい
て氷上で３０分間、１０6個の細胞あたり１０Ｌの抗体およびＤＮＡ色素ＬＤＳ
７５１（Ｅｘｃｉｔｏｎ Ｉｎｃ．、Ｄａｙｔｏｎ ＯＨ）と共にインキュベー
トされる。ウサギ血清を使用して、細胞への非特異的結合を減少させる。細胞を
ＰＢＳで２回洗浄し、続いて１％パラホルムアミドで固定する。統計学的分析を
、ＬＹＳＹＳ ＩＩプログラムを備えるＦＡＣＳＳｃａｎフローサイトメトリー
システムを使用して１０4のフロー事象に対して実施した。当業者によって慣用
的に使用される多くの任意のイムノアッセイプロトコルを使用して、このような
分析を実行し得ることが、理解される。[0034] In (B. Antibody Staining and Flow Cytometry) exemplary assay, the cells on ice for 30 min in the presence of 5% rabbit serum, 10 6 cells per 10L antibodies and DNA dye LDS
751 (Exciton Inc., Dayton OH). Rabbit serum is used to reduce non-specific binding to cells. The cells are washed twice with PBS and subsequently fixed with 1% paraformamide. Statistical analysis was performed on 10 4 flow events using a FACSScan flow cytometry system with the LYSYS II program. It is understood that any of the many immunoassay protocols routinely used by those skilled in the art can be used to perform such an analysis.
【００３５】 （Ｃ．選択された細胞画分の培養） １つ以上の相間およびペレット由来の分離された細胞を収集し、洗浄し、そし
て適切な培養培地中に再懸濁し、組織培養容器に播種し、そして少なくとも２４
時間（好ましくは、約４０時間）、加湿インキュベーター中で培養する。培養す
る時間は、樹状細胞前駆体（ＤＰＣ）において樹状細胞（ＤＣ）の形態および機
能を有する細胞への形態学的および機能的変化を生成するために十分に長い。C. Cultivation of Selected Cell Fractions Separated cells from one or more interphases and pellets are collected, washed, and resuspended in a suitable culture medium and placed in a tissue culture vessel. Sow and at least 24
Incubate in a humidified incubator for a period of time (preferably about 40 hours). The time of culturing is long enough to produce morphological and functional changes in dendritic cell precursors (DPCs) to cells with dendritic cell (DC) morphology and function.
【００３６】 この形態学的変化は、例えば、顕微鏡写真を使用して検出され得る。ＤＣは、
大きなサイズのベール細胞であり、これは、インビトロで培養される場合、代表
的に、細胞質突起を細胞表面から拡げる。This morphological change can be detected, for example, using a micrograph. DC is
Large-sized veil cells, which, when cultured in vitro, typically spread cytoplasmic processes from the cell surface.
【００３７】 濃縮された細胞画分におけるＤＣは、代表的に、インビトロで培養される場合
に樹状形態を有する。The DCs in the enriched cell fraction typically have a dendritic morphology when cultured in vitro.
【００３８】 本発明の方法に従って、ＤＣの単離手順において、特に上段に記載される培養
工程において、使用される培養培地は、好ましくは、無血清である。According to the method of the present invention, the culture medium used in the DC isolation procedure, in particular in the culture steps described above, is preferably serum-free.
【００３９】 続いて収集されるＤＣ細胞の純度における改善をもたらした無血清培地は、Ｄ
ＭＥＭ／Ｆ−１２、濃縮された単球ＳＦＭ、ＡＩＭ−Ｖおよび濃縮されたＡＩＭ
−Ｖを含んだ。これらの全ては、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから使用可能である。他の無血
清培地もまた、本発明の実施において使用され得る。例としては、Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ
−Ｆｒｅｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｉｓｏｃｏｖ
ｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ；
Ｓｉｇｍａ）、およびＭＣＢＤ培地（Ｓｉｇｍａ）が挙げられる。The serum-free medium that resulted in an improvement in the purity of DC cells subsequently collected was D
MEM / F-12, enriched monocyte SFM, AIM-V and enriched AIM
-V. All of these are provided by Gibco / BRL Life Techno
logs, Gaithersburg, MD. Other serum-free media can also be used in the practice of the present invention. For example, Hybrid
oma Serum-Free Medium (Gibco), Protein
-Free Hybridoma Medium (Gibco), Isocov
e's Modified Dulbecco's Medium (IMDM;
Sigma), and MCBD medium (Sigma).
【００４０】 さらなる精製が所望される場合、ＤＣ、抗原提示細胞およびそれらの前駆体に
ついて濃縮された細胞画分は、さらなる精製工程に供され得る。例えば、ＤＣ上
で発現しない種々の抗原に対する抗体が、固体支持体上に固定化され、そして夾
雑する細胞を、除去または「負に枯渇」するために使用される。このようなさら
なる精製は、ＡＰＣをほとんど損失することなく、ＤＣ細胞のさらなる濃縮をも
たらし得る。If further purification is desired, the cell fraction enriched for DCs, antigen presenting cells and their precursors can be subjected to further purification steps. For example, antibodies to various antigens that are not expressed on DC are immobilized on a solid support and used to remove or "negatively deplete" contaminating cells. Such further purification may result in further enrichment of DC cells with little loss of APC.
【００４１】 （ＩＶ．ＡＰＣの生物学的活性） （Ａ．同種異系Ｔ細胞刺激に対する応答） この画分におけるＡＰＣは、上述のＤＣ細胞の特徴、ならびにＭＨＣクラスＩ
拘束ＣＴＬによって媒介される一次免疫応答を刺激する能力を有する。この機能
性能力は、トリチウムチミジン取り込みによって検出されるように設定して、同
種異系Ｔ細胞刺激における増殖応答を測定することによって評価される。IV. Biological Activity of APC A. Response to Allogeneic T Cell Stimulation APC in this fraction contains the characteristics of DC cells as described above, as well as MHC class I
Has the ability to stimulate a primary immune response mediated by restricted CTL. This functional capacity is assessed by measuring the proliferative response upon allogeneic T cell stimulation, set to be detected by tritiated thymidine incorporation.
【００４２】 ＡＰＣのさらなる特徴は、未刺激のＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
を、抗原でパルスされた後に、一次免疫応答において活性化する能力である。最
後の画分におけるＡＰＣの濃縮の程度は、例えば、ＣＴＬ活性化アッセイにおい
て限界希釈分析を使用して決定され得る。これは、同種異系細胞の連続希釈物を
選択された細胞画分と混合することによってなされ、例えば、実施例ＩＩに詳説
されるように、Ｔ細胞の増殖が評価される。その細胞が、ＭＨＣと会合し、そし
てＴ細胞を活性化し得る抗原を提示する相対的能力は、このような刺激に続く、
細胞増殖の相対的程度に基いて評価され得る。A further feature of APC is that unstimulated CD8 + cytotoxic T lymphocytes (CTL)
Is activated in the primary immune response after being pulsed with an antigen. The extent of APC enrichment in the last fraction can be determined, for example, using limiting dilution analysis in a CTL activation assay. This is done by mixing serial dilutions of allogeneic cells with the selected cell fraction, for example, and assessing T cell proliferation as detailed in Example II. The relative ability of the cell to present an antigen capable of associating with MHC and activating T cells is dependent on such stimulation.
It can be evaluated based on the relative degree of cell proliferation.
【００４３】 （Ｂ．キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）による刺激に対する応答
） 真の抗原提示細胞は、抗原でパルスされた後に、一次免疫応答において、未刺
激のＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化し得る。同種異系Ｔ細胞
に対する応答がリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答でないという確認として、ＫＬＨ
（このような細胞に通常は遭遇しない抗原）が当業者によって使用されて、ＡＰ
Ｃが未刺激のＴ細胞を活性化する能力が決定され得る。各細胞画分が、ＭＨＣと
会合し、そしてＴ細胞を活性化する抗原を提示するそれぞれの能力は、このよう
な刺激後の、細胞増殖の相対的程度に基いて評価され得る。B. Response to Stimulation by Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) True antigen-presenting cells, after being pulsed with antigen, undergo unstimulated CD8 + cytotoxic T lymphocytes (PKs) in the primary immune response. CTL) can be activated. To confirm that the response to allogeneic T cells was not a recall response, KLH
(Antigens not normally encountered in such cells) have been used by those skilled in the art to
The ability of C to activate unstimulated T cells can be determined. The respective ability of each cell fraction to associate with MHC and present antigens to activate T cells can be assessed based on the relative degree of cell proliferation following such stimulation.
【００４４】 例示的方法において、分画された細胞が、（１）４０時間培養されて、次いで
同種異系「刺激因子」または３０００ｒａｄの照射を受けたバフィーコート由来
の細胞と混合されるか、あるいは（２）キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）の存在下で４０時間培養され、次いで同種異系「刺激因子」または３００
０ｒａｄの照射を受けたバフィーコート由来の細胞と混合されるかのいずれかを
されて、それぞれ、その細胞が、同種異系応答を生成する能力または未刺激のＴ
細胞に対する抗原を提示する能力を評価される。In an exemplary method, the fractionated cells are (1) cultured for 40 hours and then mixed with allogeneic “stimulators” or cells from a buffy coat exposed to 3000 rad, Or (2) keyhole limpet hemocyanin (K
LH) for 40 hours and then allogeneic "stimulator" or 300
0 rad of irradiated buffy coat-derived cells, respectively, so that the cells are capable of producing an allogeneic response or unstimulated T cells, respectively.
The ability to present antigen to cells is assessed.
【００４５】 （Ｖ．ＡＰＣ前駆体のインビトロ刺激） （Ａ．ＡＰＣへの誘導） 本発明の細胞は、樹状細胞の形態、表現型、および機能を有するように誘導さ
れ得る。これは、収集された細胞が、抗原前駆体に曝露されることによってであ
り、この抗原前駆体は、例えば、培養された細胞において、免疫応答が所望され
る１つ以上のペプチド抗原の細胞表面提示を誘導するのに効果的なペプチド抗原
を含むポリペプチドである。V. In Vitro Stimulation of APC Precursors A. Induction to APC Cells of the present invention can be induced to have dendritic cell morphology, phenotype, and function. This is because the harvested cells are exposed to a progenitor that, for example, in cultured cells, has a cell surface of one or more peptide antigens for which an immune response is desired. A polypeptide containing a peptide antigen that is effective in inducing presentation.
【００４６】 いくつかの方法が使用されて、抗原でＡＰＣがパルスされ、ＡＰＣが、ＣＴＬ
の所望のサブセットを活性化するのに有効または適応性にされ得る。例えば、本
明細書中に詳説される実験は、細胞が抗原性ペプチドに曝露され得、そしてこれ
らのペプチドが、「内因性」クラスＩ経路によって処理され得、その結果、ＭＨ
ＣクラスＩ分子と会合し、結果的に、ＣＤ８+ＣＴＬを活性化し得るようになる
ことを示す。Several methods have been used to pulse APCs with antigen,
Can be effective or adaptive to activate a desired subset of For example, the experiments detailed herein show that cells can be exposed to antigenic peptides and these peptides can be processed by the "endogenous" class I pathway so that MH
Figure 4 shows that it associates with C class I molecules and consequently becomes able to activate CD8 + CTL.
【００４７】 ペプチドに加えて、特定のタンパク質がＡＰＣに導入され得て、その結果、そ
のタンパク質がＭＨＣクラスＩ経路（クラスＩＩとは異なって）を通じて処理さ
れるようになる（例えば、Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉらを参照のこと）。特に、
リポソームへの抗原の取り込みが使用されて、このような標的化が達成されてい
る［例えば、Ｎａｉｒ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：２３
７（１９９２）、Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５
（１９９２）、Ｚｈｏｕ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１５９９（１
９９２）］。In addition to peptides, certain proteins can be introduced into APCs, such that the proteins are processed through the MHC class I pathway (unlike class II) (eg, Mehta-Damani) See, et al.). In particular,
Incorporation of antigen into liposomes has been used to achieve such targeting [see, for example, Nair, S. et al. J. et al. Immunol. Meth. 152: 23
7 (1992), Reddy, R.A. J. et al. Immunol. 148: 1585
(1992), Zhou, F .; J. et al. Immunol. 149: 1599 (1
992)].
【００４８】 選択された抗原が、ＡＰＣに導入され得、これは、細胞が、このような抗原を
コードする遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトされることによる。Ｄ
ＮＡは、ペプチド抗原または他の抗原を含むポリペプチドをコードし、そして曝
露する工程は、そのＤＮＡを、形態学的に変化した細胞へ導入することを包含す
る。所望の抗原をコードする遺伝子でのＡＰＣのトランスフェクションは、クラ
スＩ ＭＨＣと会合する抗原を発現するのに有効な方法である。種々の公知の方
法［例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬ
Ｓ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎ
ｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ ＰＡ．、Ｍｕｌｌｉｇｅｎ，Ｒ．Ｃ．、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６（１９９３）］のいずれかが、このようなトラ
ンスフェクション（ＣａＰＯ4沈殿、リポフェクション、裸ＤＮＡ曝露、ならび
にウイルスベクターに基くアプローチ（例えば、レトロウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびワクシニアウイルスベクター）を
含む）に使用され得る。[0048] Selected antigens can be introduced into APCs by transfecting cells with an expression vector containing a gene encoding such an antigen. D
NA encodes a polypeptide, including peptide antigens or other antigens, and exposing involves introducing the DNA into morphologically altered cells. Transfection of APC with a gene encoding the desired antigen is an effective method for expressing an antigen that associates with class I MHC. Various known methods [eg, Ausubel, F .; M. Et al., CURRENT PROTOCOL
SIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley an
d Sons, Inc. , Media PA. Mulligen, R .; C. ,
Science 260: 926 (1993)] can be used for such transfection (CaPO 4 precipitation, lipofection, naked DNA exposure, and viral vector based approaches (eg, retroviral vectors, adenoviral vectors, AAV vectors, and Vaccinia virus vectors).
【００４９】 この抗原は、免疫応答をマウントすることが所望される任意の抗原（例えば、
癌特異的抗原またはウイルス抗原）であり得る。The antigen can be any antigen for which it is desired to mount an immune response (eg,
Cancer-specific antigens or viral antigens).
【００５０】 ＡＰＣ前駆体の単離において使用される密度勾配細胞分離方法／親和性細胞分
離方法が、簡単な、非観血式の、デバイスまたはキット中で使用され得る。ＡＰ
Ｃまたはその前駆体は、本発明の方法を使用して単離され、多くの適用において
使用され得る。The density gradient / affinity cell separation method used in the isolation of APC precursors can be used in a simple, non-invasive device or kit. AP
C or its precursor is isolated using the method of the present invention and can be used in many applications.
【００５１】 （Ｂ．抗原特異的Ｔリンパ球） 細胞画分中のＡＰＣの濃縮の程度は、例えば、ペプチド特異的ＣＴＬの生成に
よって評価されるような、機能性適応性を測定することによって決定され得る。
抗原提示細胞が濃縮された画分が、抗原でパルスされ、そしてパルスされた画分
の連続希釈物が作製される。次いで、これらの希釈物が使用されて、Ｔ細胞の増
殖が刺激される。ＭＨＣと会合し、そしてＴ細胞を活性化し得る抗原を発現する
ＡＰＣの相対数が、Ｔ細胞増殖を生じる最も希釈されたサンプルに基いて評価さ
れ得る。B. Antigen-Specific T Lymphocytes The extent of APC enrichment in the cell fraction is determined by measuring functional fitness, for example, as assessed by the production of peptide-specific CTL. Can be done.
The fraction enriched in antigen presenting cells is pulsed with antigen and serial dilutions of the pulsed fraction are made. These dilutions are then used to stimulate T cell proliferation. The relative number of APCs that associate with MHC and express an antigen capable of activating T cells can be assessed based on the most diluted sample that results in T cell proliferation.
【００５２】 抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球は、本質的にＭｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、
１９９４に記載のように誘発される。例として、３つのＨＬＡ−Ａ *０２０１
結合ペプチドが使用されて、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が誘発
され得る。例えば、第１のペプチドは、ヒトＴ細胞（ｔｒｏｐｈｉｃ）白血病ウ
イルスＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ；Ｅｌｏｖａａｒａ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
７７：１５６７〜１５７３（１９９３）；Ｋａｎｎａｇｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６６：２９２８〜２９３３（１９９２）；Ｚｗｅｅｒｉｎｋ，Ｈ．Ｊ．ら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１７６３〜１７７１（１９９３）］のＴａｘ遺
伝子産物のアミノ酸１１〜１９に対応し得；第２のペプチドは、黒色腫細胞上で
発現されるＭＡＲＴ−１抗原のアミノ酸２７〜３５に対応し得（Ｓｔｅｖｅｎｓ
ら）、そして第３のペプチドは、そのポリメラーゼ遺伝子におけるヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素のアミノ酸４６４〜４７２に対応し得る。全ての
ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃ
Ａ）によって合成され得る。[0052] Antigen-specific cytotoxic T lymphocytes are essentially derived from Mehta-Damani et al.
Induced as described in 1994. As an example, three HLA-A * 0201
Binding peptides can be used to induce antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL). For example, the first peptide is a human T-cell leukemia virus I (HTLV-I; Elovaara, I. et al., J. Exp. Med. 1).
77: 1567-1573 (1993); Kannagi, M .; J. et al. Vir
ol. 66: 2928-2933 (1992); Zweerlink, H .; J. J. et al. Immunol. 150: 1763-1771 (1993)]; the second peptide may correspond to amino acids 27-35 of the MART-1 antigen expressed on melanoma cells. (Stevens
And a third peptide may correspond to amino acids 464-472 of the human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase in its polymerase gene. All peptides were purchased from Bachem Laboratories (Torrance, C
A).
【００５３】 そのペプチドが、滅菌濾過されたＬＡＬ水（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ． Ｗ
ａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中１．０％の酢酸溶液に約１μｇ／ｍｌの濃度
で溶解されることによって、ストック溶液が調製される。単離されたＤＣが濃縮
された細胞画分が、１．０ｍＬ基礎ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁され、そして１
〜５μｇ／ｍＬのβ２−ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および１〜５μｇ／ｍＬのペプチドと
ともに３７℃で１〜２時間インキュベートされる。このインキュベーション後、
ペプチドでパルスされたＤＣが洗浄されて過剰のペプチドが除去され、そして自
己由来Ｔリンパ球（１４．５％メトリザマイドペレット細胞）と約１０：１の比
で混合され、４．０Ｕ／ｍＬのヒト組換えＩＬ−２を補充されたＡＢ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で１．０×１０6細胞／ｍＬの細胞濃度が得られる。培
養３日後、このＩＬ−２濃度は、２０．０Ｕ／ｍＬまで増加される。The peptide was purified from sterile filtered LAL water (BioWhittaker. W
Stock solutions are prepared by dissolving in a 1.0% acetic acid solution in Alkersville, MD) at a concentration of about 1 μg / ml. The isolated DC enriched cell fraction was resuspended in 1.0 mL basal RPMI-1640 and
５5 μg / mL β2-microglobulin (Sigma Chemical C
ompany, St. Louis, MO) and 1-5 μg / mL of peptide at 37 ° C. for 1-2 hours. After this incubation,
The peptide-pulsed DCs are washed to remove excess peptide and mixed with autologous T lymphocytes (14.5% metrizamide pellet cells) at a ratio of about 10: 1 and 4.0 U / mL AB Cult supplemented with human recombinant IL-2
ure Medium (Gibco Laboratories, Grand
A cell concentration of 1.0 × 10 6 cells / mL is obtained in (Island, NY). After 3 days of culture, the IL-2 concentration is increased to 20.0 U / mL.
【００５４】 このＴリンパ球は、ペプチドでパルスされた自己由来の単球を使用して、週１
回のスケジュールで１０：１の比で再刺激される。再刺激の間に、ＩＬ−２濃度
は、４．０Ｕ／ｍＬまで減少され、続いて、各再刺激後３日間の培養後に、２０
．０Ｕ／ｍＬまで増加された。ＣＴＬ培養は、代表的に、抗原特異的標的細胞溶
解の評価前の３〜４週間の間拡大される。[0054] The T lymphocytes were collected weekly using autologous monocytes pulsed with peptide.
Restimulation is performed at a 10: 1 ratio on a single schedule. During restimulation, IL-2 concentration was reduced to 4.0 U / mL, followed by 20 days of culture three days after each restimulation.
. Increased to 0 U / mL. CTL cultures are typically expanded for 3-4 weeks before assessment of antigen-specific target cell lysis.
【００５５】 （Ｃ．フローサイトメトリー） ＦＡＣＳ分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ−９０００コンピュ
ーター（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に連結
され、「ＬＹＳＩＳ ＩＩ」ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
）を実行するＦＡＣＳＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して行い得る。このような場合、
分析に使用されるモノクローナル抗体およびそれら各々のアイソタイプコントロ
ールは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入し得る。簡単に言えば、約
１００，０００個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェル中で、５０μｌのウ
サギ血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
、ＭＯ）とともに、最終容量１５０μＬで１５〜２０分間、室温でプレインキュ
ベートして、抗体結合に非特異的な部位をブロックする。次いで、１０μＬの所
望のＦＩＴＣモノクローナル抗体またはＰＥタグ化モノクローナル抗体をウェル
に添加し、そしてこの９６ウェルプレートを、暗中で４℃で３０分間インキュベ
ートする。C. Flow Cytometry FACS analysis was coupled to a Hewlett-Packard HP-9000 computer (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.) And “LYSIS II” software (Becton Dickinson).
) FACSScan flow cytometer (Becton Dick)
inson, San Jose, CA). In such a case,
The monoclonal antibodies and their respective isotype controls used in the analysis can be purchased from Becton Dickinson. Briefly, approximately 100,000 cells were plated in each well of a 96-well plate with 50 μl of rabbit serum (Sigma Chemical Company, St. Louis).
, MO) in a final volume of 150 μL for 15-20 minutes at room temperature to block non-specific sites for antibody binding. Then, 10 μL of the desired FITC or PE-tagged monoclonal antibody is added to the wells and the 96-well plate is incubated for 30 minutes at 4 ° C. in the dark.
【００５６】 次いで、プレートを遠心分離して細胞をペレット化し、そして上清を吸引して
結合していない抗体を取り除いた。ペレット化した細胞を、５％ヒトＡＢ血清を
補充した１００μＬのＤ−ＰＢＳに再懸濁し、固定化し、そして２．０μｇ／ｍ
ＬのＬＤＳ−７５１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ
）を補充した１００μＬの１．０％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加によって対比染
色した。ＬＤＳ−７５１は、近赤外スペクトル（ＦＡＣＳｃａｎのＦＬ３蛍光チ
ャンネルによって検出したＰｅｒＣＰ領域）において蛍光を発し、そして細胞を
対比染色して、核のない細胞（非染色）集団、核のある生存可能な細胞（弱く染
色される）集団および核のある生存可能でない細胞（非常に明るく染色される）
集団の間の区別を可能にする。The plate was then centrifuged to pellet the cells, and the supernatant was aspirated to remove unbound antibody. The pelleted cells were resuspended in 100 μL D-PBS supplemented with 5% human AB serum, immobilized, and 2.0 μg / m
LDS-751 (Molecular Probes, Eugene, OR)
) Supplemented with 100 μL of 1.0% paraformaldehyde (Sigma Che
medical Company, St. (Louis, MO). LDS-751 fluoresces in the near-infrared spectrum (PerCP region detected by FACScan's FL3 fluorescence channel) and counterstains the cells to a population of cells without nuclei (unstained), viable with nuclei Cell (weakly stained) population and non-viable cells with nuclei (very brightly stained)
Allows distinction between groups.
【００５７】 （Ｄ．混合したリンパ球培養物および天然のサプレッサー細胞活性） 例示的な方法において、２つの異なるバフィーコート由来の細胞を、平底９６
ウェルマルチウェルプレート中に各１０5個の細胞で混合する。１つのバフィー
コートを、３０００ｒａｄの放射で処理し、これを「刺激因子」と呼ぶ。他のバ
フィーコートは処理せず、これを「レスポンダー」と呼ぶ。２つの個体のＭＨＣ
遺伝子間の相違が存在する場合、その細胞は４〜７日間の期間にわたって増殖す
る。分画していないアフェレーシスした末梢血産物（ＡＰＢＬ）または異なる密
度の画分からの細胞を、ウェルあたり１０5個の細胞でこれらの同時培養に添加
する。「サプレッサー」と呼ばれるこれらの細胞を、ＭＬＲに添加する前に１５
００ｒａｄで処理する。この細胞を５日間培養し、次いで［3Ｈ］−チミジン（
１μＣｉ／ウェル）でパルスする。１８時間後、その細胞を収集し、そして取り
込まれたチミジンの量をシンチレーションカウンターで測定する。サプレッサー
細胞によって誘導された抑制パーセントは、以下の式によって決定される： 抑制パーセント＝１００×（コントロールｃｐｍ−実験ｃｐｍ）／実験ｃｐｍ （ＶＩ．ＡＰＣ前駆体を含む免疫療法および癌治療の方法） 本発明の方法によって単離されたＡＰＣの有用な特徴の１つは、Ｔ細胞のドナ
ーが以前に抗原に対して曝露された場合において、この方法が初期Ｔ細胞応答、
ＣＤ８+ＣＴＬ媒介応答ならびにＣＤ４+Ｔ細胞増殖応答の誘導のための抗原を提
示し得ることである。このように、ＡＰＣは、汎用性の有用な抗原提示細胞であ
り、そして一次免疫応答および二次免疫応答の生成を含む広い範囲の免疫療法、
免疫予防、および癌治療適用において利用され得る。D. Mixed Lymphocyte Culture and Natural Suppressor Cell Activity In an exemplary method, cells from two different buffy coats were plated on a flat bottom 96
Mix with 10 5 cells each in a well multi-well plate. One buffy coat was treated with 3000 rad radiation, which is referred to as "stimulator". The other buffy coats are not treated and are called "responders". MHC of two individuals
If there is a difference between the genes, the cells will grow over a period of 4-7 days. Cells from fraction apheresis peripheral blood products (APBL) or different densities unfractionated, added to these co-cultures at 10 5 cells per well. These cells, called "suppressors", are added to the MLR for 15 minutes prior to addition.
00rad. The cells are cultured for 5 days and then [ 3 H] -thymidine (
(1 μCi / well). After 18 hours, the cells are harvested and the amount of thymidine incorporated is measured in a scintillation counter. The percent inhibition induced by suppressor cells is determined by the following formula: Percent inhibition = 100 × (control cpm−experimental cpm) / experimental cpm (VI. Methods of Immunotherapy and Cancer Treatment Including APC Precursors) One of the useful features of APCs isolated by the method of the invention is that when a T cell donor has been previously exposed to an antigen, the method can provide an early T cell response,
The ability to present antigens for the induction of CD8 + CTL mediated responses as well as CD4 + T cell proliferative responses. Thus, APCs are versatile and useful antigen presenting cells, and a wide range of immunotherapies, including the generation of primary and secondary immune responses,
It can be utilized in immunoprevention and cancer therapeutic applications.
【００５８】 細胞または細胞膜は、例えば、直接的なインビボ投与、エキソビボ体細胞治療
、インビボ移植可能デバイス、およびエキソビボ体外デバイスにおいて使用され
得る。それらはまた、腫瘍特異的抗原およびウイルス特異的抗原由来のペプチド
エピトープの抗原性および免疫原性のスクリーニングにおいて利用され得る。適
切な抗原を用いて処置またはパルスされたＡＰＣは、強力なワクチン組成物、例
えば、病原性ウイルスまたは癌性腫瘍に対する組成物として使用され得る。Cells or cell membranes can be used, for example, in direct in vivo administration, ex vivo somatic cell therapy, in vivo implantable devices, and ex vivo extracorporeal devices. They can also be used in screening antigenicity and immunogenicity of peptide epitopes from tumor-specific and virus-specific antigens. APC treated or pulsed with the appropriate antigen can be used as a potent vaccine composition, for example, against pathogenic viruses or cancerous tumors.
【００５９】 特定の場合において、第２の個体（すなわち、「同種異系」細胞）における状
態を処置するために１つの個体から得られた細胞を使用することが有利であり得
る。例えば、ＡＩＤＳを有するＨＩＶ感染した個体は、しばしば、抗ウイルスＴ
細胞応答を高めることができない。このような場合において、ＣＴＬは、健常な
ＨＬＡ適合個体（例えば、同胞）から単離され得るか、刺激され得るか、または
インビトロで抗原をパルスしたＤＣを用いて感作され得るか、拡張され、または
ＨＩＶ感染個体に再び投与され得る。In certain cases, it may be advantageous to use cells obtained from one individual to treat a condition in a second individual (ie, “allogeneic” cells). For example, HIV-infected individuals with AIDS often have antiviral T
Inability to enhance cellular response. In such cases, CTL can be isolated, stimulated, or sensitized or expanded with antigen-pulsed DCs in vitro from healthy HLA-matched individuals (eg, siblings). Or may be administered again to an HIV-infected individual.
【００６０】 単離された細胞はまた、例えば、細胞のトランスフェクションのような遺伝子
治療適用において使用され得、その結果、それらは構成的に治療的適用のための
所望の抗原／遺伝子産物を発現する。工程は、以下の工程を包含する：抗原提示
細胞前駆体において濃縮された細胞画分を得る工程［上記の工程において記載さ
れるように］、および培養に先立って患者に濃縮された画分の一部を戻す工程、
または、樹状細胞の形態、表現型、および機能を有する細胞を誘導するために有
効な条件下で抗原提示細胞前駆体において濃縮された細胞の全画分を培養し、次
いで曝露された細胞を患者に投与する工程のいずれか。[0060] The isolated cells can also be used in gene therapy applications, such as, for example, transfection of cells, so that they constitutively express the desired antigen / gene product for therapeutic applications. I do. The steps include the following: obtaining a cell fraction enriched in antigen-presenting cell precursors [as described in the steps above], and the fraction enriched in the patient prior to culturing. Step of returning part,
Alternatively, culturing the entire fraction of cells enriched in antigen presenting cell precursors under conditions effective to induce cells having dendritic cell morphology, phenotype, and function, and then exposing the exposed cells Any of the steps of administering to a patient.
【００６１】 この状況において、アフェレーシスした血液サンプルを１つ以上のサイトカイ
ンで処置した患者から収集する。例として、患者は、サイトカインまたはその融
合タンパク質（例えば、１つ以上のＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３−
Ｌ、ＩＬ−３、およびトロンボポエチン）で処置される。In this situation, an apheresis blood sample is collected from a patient treated with one or more cytokines. By way of example, a patient may be treated with a cytokine or a fusion protein thereof (eg, one or more GCSF, GMCSF, SCF, FLT3-
L, IL-3, and thrombopoietin).
【００６２】 アフェレーシスしたサンプルを、各々が異なる密度の樹状細胞の形態、表現型
、および機能を有する密度勾配上の分画に供して、第１および第２の分離媒体間
の勾配相間で細胞層を形成させる。例えば、第１の分離媒体は、１．０６０５±
０．０００５ｇｒ／ｍｌの密度、２８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ Ｈ2Ｏの浸透圧重量モ
ル濃度、および７．４のｐＨを有し得、そして第２の分離媒体はより軽い密度を
有し得る。相間からの細胞を収集して、実施例Ｉに示されたような抗原提示細胞
前駆体が濃縮された幹細胞画分を得る。The apheresis sample is subjected to fractionation on a density gradient, each having a different density of dendritic cell morphology, phenotype, and function, to allow cells to be separated between the gradient phases between the first and second separation media. Form a layer. For example, the first separation medium is 1.0605 ±
Density of 0.0005gr / ml, osmolality of 280 mOsm / Kg H 2 O, and have a pH of 7.4 and a second separation medium, may have a lighter density. Cells from the interphase are collected to obtain a stem cell fraction enriched in antigen presenting cell precursors as shown in Example I.
【００６３】 収集した細胞の画分、「幹細胞」、ＡＰＣおよびその前駆体を、直ちに患者に
戻し得る。あるいは、収集したすべての細胞を、樹状細胞の形態、表現型、およ
び機能を有する細胞を誘導するために有効な条件下で培養する。誘導を、収集し
た細胞を抗原前駆体（例えば、ペプチド抗原または他の抗原を含むポリペプチド
）に曝露することによって達成する。これは、上記のように、免疫応答がそれに
対して所望されている培養細胞によって、１つ以上のペプチド抗原の細胞表面提
示を誘導するために有効である。The collected cell fraction, “stem cells”, APC and its precursors can be immediately returned to the patient. Alternatively, all harvested cells are cultured under conditions effective to induce cells having dendritic cell morphology, phenotype, and function. Induction is achieved by exposing the harvested cells to an antigen precursor (eg, a polypeptide comprising a peptide antigen or other antigen). This is effective to induce cell surface presentation of one or more peptide antigens by the cultured cells for which an immune response is desired, as described above.
【００６４】 抗原前駆体は、ペプチド抗原または他の抗原を含むポリペプチドをコードする
ＤＮＡであり得、そして曝露する工程は、そのＤＮＡを形態学的に変化した細胞
に導入することを包含し得る。The antigen precursor can be DNA encoding a polypeptide, including a peptide antigen or other antigen, and the exposing step can include introducing the DNA into a morphologically altered cell. .
【００６５】 樹状細胞画分のＡＰＣへのインビトロ導入後に、曝露された細胞を患者に投与
する。After in vitro introduction of the dendritic cell fraction into APC, the exposed cells are administered to a patient.
【００６６】 （ＶＩＩ．免疫療法における使用のためのＡＰＣ前駆体を含む組成物） 関連する局面において、本発明は、幹細胞および抗原提示細胞前駆体（上記の
ように、適切な抗原に曝露された）の混合物を含有する免疫療法における使用の
ための細胞組成物を含む。このような組成物の抗原提示細胞前駆体の成分は、上
記の型の樹状細胞の形態、表現型および機能を誘導するのに有効な条件下で培養
された細胞である。そしてこれは免疫応答が所望される１つ以上のペプチド抗原
の細胞表面提示を誘導するのに有効な抗原前駆体にさらに曝露される。(VII. Compositions Comprising APC Precursors for Use in Immunotherapy) In a related aspect, the invention relates to stem cells and antigen presenting cell precursors (as described above, exposed to appropriate antigens). A) for use in immunotherapy comprising the mixture of (a). The component of the antigen presenting cell precursor of such a composition is a cell that has been cultured under conditions effective to induce the morphology, phenotype and function of dendritic cells of the type described above. This is then further exposed to an antigen precursor effective to induce cell surface presentation of one or more peptide antigens for which an immune response is desired.
【００６７】 ある場合には、腫瘍、他の癌特異的抗原またはウイルス抗原から誘導された細
胞が、樹状細胞を誘導するために用いられる。他の場合には、腫瘍細胞またはウ
イルス感染した細胞に融合されたＡＰＣが、樹状細胞画分を誘導するために用い
られる。In some cases, cells derived from tumor, other cancer-specific or viral antigens are used to derive dendritic cells. In other cases, APCs fused to tumor cells or virus infected cells are used to derive a dendritic cell fraction.
【００６８】 例として、抗原前駆体は、目的のペプチド抗原または他の抗原を含む癌特異的
ポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよく、そして曝露する工程は、形態
学的に変化した細胞へのＤＮＡの導入を含み得る。By way of example, the antigen precursor may be DNA encoding a cancer-specific polypeptide, including the peptide antigen of interest or other antigens, and exposing the morphologically altered cells to the morphologically altered cells. May be introduced.
【００６９】 ＡＰＣへの樹状細胞画分のインビトロ誘導後、曝露された細胞は、患者に投与
され得る薬学的組成物を含む。After in vitro induction of the dendritic cell fraction into APCs, the exposed cells comprise a pharmaceutical composition that can be administered to a patient.
【００７０】 前述から、本発明は、ＡＰＣを濃縮するための迅速かつ高収量の手順を提供す
ることが理解される。最も重要なことには、濃縮されたＡＰＣ細胞集団は、真の
ＰＡＣの機能（すなわち未刺激のＴ細胞に対して抗原を提示する能力）を有する
ことで特徴づけられる。継続中の議論が、真のＡＰＣの表現型（細胞表面マーカ
ーおよびその発現レベルに関して）について当業者に存在する。しかし、真のＡ
ＰＣについての一様に受容される基準は、未刺激のＴ細胞に対して抗原を提示す
る機能的能力である。From the foregoing, it will be appreciated that the present invention provides a rapid and high yield procedure for enriching APCs. Most importantly, the enriched APC cell population is characterized by having a true PAC function (ie, the ability to present antigen to unstimulated T cells). There is ongoing debate in the art for the true APC phenotype (with respect to cell surface markers and their expression levels). But true A
A uniformly accepted criterion for PC is the ability to present antigen to unstimulated T cells.
【００７１】 本明細書において記載される方法は、さらに、大量の血液からのＡＰＣ濃縮の
ための手順を提供する。この方法は、インビトロ適用およびインビボ治療の両方
におけるこのような細胞の使用を強化する。さらに、この手順は迅速で、便利で
そして経済的である。完全なサンプルの処理は、特殊な装置を必要とせず、そし
てわずかな時間内で当業者により実行され得る。[0071] The methods described herein further provide a procedure for APC enrichment from large volumes of blood. This method enhances the use of such cells for both in vitro applications and in vivo treatments. Furthermore, this procedure is quick, convenient and economical. Complete sample processing does not require special equipment and can be performed by those skilled in the art in a fraction of the time.
【００７２】 （実施例Ｉ） （患者からの細胞の動員および収集） （Ａ．動員） 動員された患者由来のアフェレーシスされた末梢血サンプルを、密度勾配上に
直接供した。しかし、完全な血液および骨髄吸引物を、バフィーコートへと処理
し（赤血球の除去）得、その後、それを密度勾配上に適用する。Example I Mobilization and Collection of Cells from Patients A. Mobilization Apheresis peripheral blood samples from mobilized patients were directly provided on a density gradient. However, the complete blood and bone marrow aspirate can be processed into a buffy coat (removal of red blood cells), which is then applied over a density gradient.
【００７３】 患者に水分補給し、そしてＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇａｎ、Ａｍｇｅｎ，Ｔｈ
ｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）を用いて約１０μｇ／ｋｇ／日の用量で皮下（
ＳＣ）注射によって投与して処置（「動員」）した。アフェレーシスを１×１０ 9 ／Ｌ以上までの白血球（ＷＢＣ）数の回復の際に開始した。アフェレーシスを
２００分間、８０ｍｌ／分の速度でＣｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｅｌｌ Ｓｅ
ｐａｒａｔｏｒ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を用いて行った（総量
１６Ｌ）。The patient was hydrated and G-CSF (Neupogan, Amgen, Th.
oosand Oaks, CA) at a dose of about 10 μg / kg / day subcutaneously (
SC) was administered ("mobilized") by administration by injection. 1 × 10 apheresis 9 Started upon recovery of white blood cell (WBC) count to / L or higher. Apheresis
Cobe Spectra Cell Se at a rate of 80 ml / min for 200 minutes
(total amount) using a parameter (Lakewood, Colorado)
16L).
【００７４】 （Ｂ．アフェレーシスされた血液の分画） アフェレーシスされた血液産物を、さらに１．０６０５±０．０００５ｇｒ／
ｍｌ（「ＢＤＳ」）の密度に調整された、有機シラン化コロイド状シリカ密度勾
配材料（ｏｒｇａｎｏｓｉｌａｎｉｚｅｄ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｉｌｉｃａ
ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）（米国特許第４，９
２７，７５０号）（これは２８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ Ｈ2Ｏの浸透圧重量モル濃度
およびｐＨ７．４を有する）に供し、そしてこれを室温で８５０×ｇで３０分間
遠心することによって分画した。勾配の相間（すなわち、分離媒体（ＢＤＳ）の
最上部）で留まった細胞を、チューブの上部区画の全含量を別の５０ｍｌチュー
ブに移すことにより収集した。くびれの下の領域における細胞ペレットを、チュ
ーブが反転されたときに注ぎ出ることから防いだ。B. Fractionation of Apherated Blood The apherized blood product was further purified to 1.0605 ± 0.0005 gr /
ml ("BDS") density of organosilanized colloidal silica density gradient material ("BDS")
density gradient material (U.S. Pat.
No. 27,750) (which was subjected to have a 280mOsm / Kg H 2 O osmolality and pH 7.4), and this was fractionated by centrifugation for 30 minutes at 850 × g at room temperature. Cells that remained between the phases of the gradient (ie, at the top of the separation medium (BDS)) were collected by transferring the entire content of the upper section of the tube to another 50 ml tube. The cell pellet in the area below the constriction was prevented from pouring out when the tube was inverted.
【００７５】 （実施例ＩＩ） （ＡＰＣの機能の評価） （Ａ．同種異系Ｔ細胞抗原の提示） ＧＣＳＦの投与後、癌患者から得られたアフェレーシスされた血液をＢＤＳ（
１．０６０５±０．０００５ｇｒ／ｍｌの密度、２８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ Ｈ2Ｏ
の浸透圧重量モル濃度、そしてｐＨ７．４を有する）上に重層し、次いで、上記
のように遠心分離した。勾配の相間で留まった細胞およびペレット中の細胞を、
それぞれの抗原提示能力について評価した。Example II Evaluation of APC Function A. Presentation of Allogeneic T Cell Antigen After administration of GCSF, apherated blood obtained from a cancer patient was subjected to BDS (
1.0605 ± 0.0005 gr / ml density, 280 mOsm / Kg H 2 O
Osmolality, and pH 7.4) and then centrifuged as above. Cells that remained between the phases of the gradient and cells in the pellet
Each antigen presentation ability was evaluated.
【００７６】 勾配の相間およびペレット由来の細胞を４０時間別々に培養し、次いで、同種
異系の「刺激因子」または３０００ｒａｄの照射を受けたバフィーコート由来の
細胞と混合した。相間画分またはペレット画分のいずれか由来の１０5個の細胞
を、それぞれ平底９６ウェルマルチウェルプレート中に、１ウェルにつき種々の
数の刺激因子と３組で混合し、そして［3Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル）
でパルスした。１８時間後、この細胞を収集し、そして取り込まれたチミジンの
量をシンチレーションカウンターで測定した。Cells from the interphase of the gradient and from the pellet were cultured separately for 40 hours and then mixed with allogeneic “stimulators” or cells from buffy coats exposed to 3000 rad. 10 5 cells from either interphase fraction or pellet fraction, in flat-bottomed 96-well multiwell plates, respectively, were mixed per well with various numbers of stimulators and three sets, and [3 H] -Thymidine (1 μCi / well)
Pulsed. After 18 hours, the cells were harvested and the amount of thymidine incorporated was measured with a scintillation counter.
【００７７】 図１に示すように、両方の細胞集団とも抗原提示能を有するようであるが、相
間からの細胞は、ペレットから誘導されたものよりも強い異種（ａｌｌｏ）応答
を誘発する。これは、ＡＰＣおよびその前駆体がＢＤＳ密度勾配遠心分離手順後
も相間内に残っていることを示す。As shown in FIG. 1, both cell populations appear to have the ability to present antigen, but cells from between the phases elicit a stronger heterologous (allo) response than that derived from the pellet. This indicates that APC and its precursor remain in phase after the BDS density gradient centrifugation procedure.
【００７８】 （Ｂ．未刺激の抗原（ＫＬＨ）の提示） 細胞を、上記「Ａ」に記載のように調製した。この細胞を、１０μｇ／ｍｌの
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の存在下で４０時間培養し、次い
で同種異系「刺激因子」または３０００ｒａｄを受けた、バフィーコート由来の
細胞と混合した。相間画分またはペレット画分のいずれか由来の１０5個の細胞
を、それぞれ平底９６ウェルマルチウェルプレート中に、１ウェルにつき種々の
数の刺激因子と３組で混合した。１８時間後、この細胞を収集し、そして取り込
まれたチミジンの量をシンチレーションカウンターで測定した。B. Presentation of Unstimulated Antigen (KLH) Cells were prepared as described in “A” above. The cells were cultured for 40 hours in the presence of 10 μg / ml keyhole limpet hemocyanin (KLH) and then mixed with allogeneic “stimulators” or cells from buffy coat that received 3000 rad. 10 5 cells from either interphase fraction or pellet fraction, in flat-bottomed 96-well multiwell plates were each mixed per well with various numbers of stimulators and three sets. After 18 hours, the cells were harvested and the amount of thymidine incorporated was measured with a scintillation counter.
【００７９】 図２に示すように、相間由来の細胞のみが未刺激のＴ細胞に対する提示能を有
するようであり、結果として相間の細胞のみがＡＰＣの機能的特徴を有する。本
明細書において記載される本発明は、通常ＡＰＣの決定的な特徴として受容され
る、ＡＰＣの機能を有するＡＰＣ集団の濃縮の方法とともに、動員されたＡＰＣ
およびその前駆体の組み合わせを提供する新規な方法を提示する。As shown in FIG. 2, only cells from the interphase seem to have the ability to present to unstimulated T cells, and consequently only the interphase cells have the functional characteristics of APC. The present invention described herein provides a method for enriching an APC population having the function of APC, which is generally accepted as a critical feature of APC,
And a novel method of providing a combination of its precursors.
【図１】 図１は、動員した患者由来の末梢血単核細胞が濃縮された血球画分の、ペレッ
ト由来の樹状細胞に対する相間由来の樹状細胞の抗原提示能を示す。これは、１
．０６０５±０．０００５ｇｍ／ｍｌの密度、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏの
浸透圧重量モル濃度、およびｐＨ７．４を有する媒体に対する密度遠心分離後に
、樹状細胞の形態、表現型、および機能を有する細胞へと誘導するために十分な
時間、収集および培養する。相間画分およびペレット画分由来の細胞と同種異系
細胞とのインキュベーション後の３Ｈ−ＴｄＲの取り込みの結果が、提示される
。FIG. 1 shows the antigen-presenting ability of phase-derived dendritic cells to pellet-derived dendritic cells in a blood cell fraction enriched for peripheral blood mononuclear cells from mobilized patients. This is 1
. Cells with dendritic cell morphology, phenotype, and function after density centrifugation on media having a density of 0605 ± 0.0005 gm / ml, osmolality of 280 mOsm / kg H 2 O, and pH 7.4 Harvest and culture for a time sufficient to induce The results of 3H-TdR incorporation after incubation of cells from the interphase and pellet fractions with allogeneic cells are presented.
【図２】 図２は、動員した患者由来の末梢血単核細胞が濃縮された血球画分の、ペレッ
ト由来の樹状細胞に対する相間由来の樹状細胞の抗原提示能を示す。これは、１
．０６０５±０．０００５ｇｍ／ｍｌの密度、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏの
浸透圧重量モル濃度、およびｐＨ７．４を有する媒体に対する密度遠心分離後に
、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の存在下において樹状細胞の形
態、表現型、および機能を有する細胞へと誘導するために十分な時間、収集およ
び培養する。相間画分およびペレット画分由来の細胞と同種異系細胞とのインキ
ュベーション後の３Ｈ−ＴｄＲの取り込みの結果が、提示される。FIG. 2 shows the antigen-presenting ability of phase-derived dendritic cells to pellet-derived dendritic cells in a blood cell fraction enriched for peripheral blood mononuclear cells from mobilized patients. This is 1
. Dendrites in the presence of keyhole limpet hemocyanin (KLH) after density centrifugation on a medium having a density of 0605 ± 0.0005 gm / ml, osmolality of 280 mOsm / kg H 2 O, and pH 7.4 Harvest and culture for a time sufficient to induce cells with cell morphology, phenotype, and function. The results of 3H-TdR incorporation after incubation of cells from the interphase and pellet fractions with allogeneic cells are presented.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR , BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW
Claims (16)
あって、以下の工程： （ｉ）幹細胞動員因子を用いる処置後に、被験体から末梢血単核細胞を含む血
球画分を獲得する工程、 （ｉｉ）１．０６０５±０．０００５ｇ／ｍｌの密度を有する第１の分離媒体
と第２の分離媒体との間に界面を有する密度遠心分離に該血球画分を供する工程
、 （ｉｉｉ）該界面の細胞を収集して、抗原提示細胞前駆体が濃縮された細胞画
分を獲得する工程；および （ｉｖ）該細胞を樹状細胞の形態、表現型、および機能を有するように誘導す
るために有効な条件下で該収集した細胞を培養する工程、 によって調製される、治療組成物。1. A therapeutic composition comprising a mixture of stem cells and an antigen presenting cell precursor, comprising: (i) blood cells comprising peripheral blood mononuclear cells from a subject after treatment with a stem cell mobilization factor; Obtaining a fraction, (ii) subjecting the blood cell fraction to density centrifugation having an interface between a first separation medium and a second separation medium having a density of 1.0605 ± 0.0005 g / ml. (Iii) collecting the cells at the interface to obtain a cell fraction enriched in antigen-presenting cell precursors; and (iv) transforming the cells into dendritic cell morphology, phenotype, and function. Culturing the harvested cells under conditions effective to induce to have a therapeutic composition.
が所望される１つ以上のペプチド抗原またはタンパク質抗原の細胞表面提示を誘
導するために有効な抗原に前記収集された細胞を曝露する工程を包含する、請求
項１に記載の治療組成物。2. The method according to claim 1, wherein the step of culturing comprises collecting the collected cells with an antigen effective to induce cell surface presentation of one or more peptide or protein antigens for which an immune response is desired in the cultured cells. The therapeutic composition according to claim 1, comprising the step of exposing.
胞表面提示を誘導するために有効な抗原に前記収集された細胞を曝露する工程を
包含する、請求項１に記載の治療組成物。3. The method of claim 1, wherein the step of culturing comprises exposing the collected cells to an antigen effective to induce cell surface presentation of an autoantigen to unstimulated T cells. Therapeutic composition.
原の細胞表面提示を誘導するために有効な抗原に前記収集された細胞を曝露する
工程を包含する、請求項１に記載の治療組成物。4. The method of claim 2, wherein the step of culturing comprises exposing the harvested cells to an antigen effective to induce cell surface presentation of an allogeneic antigen to unstimulated T cells. A therapeutic composition according to claim 1.
の細胞表面提示を誘導するために有効な抗原に前記収集された細胞を曝露する工
程を包含する、請求項１に記載の治療組成物。5. The method of claim 1, wherein the step of culturing comprises exposing the collected cells to an antigen effective to induce cell surface presentation of exogenous antigen to unstimulated T cells. A therapeutic composition according to claim 1.
含むポリペプチドである、請求項２に記載の治療組成物。6. The therapeutic composition according to claim 2, wherein said antigen is a polypeptide comprising one or more peptide or protein antigens.
２に記載の治療組成物。7. The therapeutic composition according to claim 2, wherein said antigen is a tumor lysate or a virus lysate.
含む癌特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、請求項２に記載の治療組成
物。8. The therapeutic composition according to claim 2, wherein said antigen is a cancer-specific antigen or a virus-specific antigen comprising one or more peptide or protein antigens.
列またはＲＮＡ配列が１つ以上のペプチド抗原またはタンパク質抗原を含むポリ
ペプチドをコードし、そして前記曝露する工程が該ＤＮＡまたはＲＮＡを前記細
胞へ導入する工程を包含する、請求項２に記載の治療組成物。9. The method according to claim 9, wherein said antigen is a DNA or RNA sequence, said DNA or RNA sequence encodes a polypeptide comprising one or more peptide antigens or protein antigens, and wherein said exposing step comprises: 3. The therapeutic composition according to claim 2, comprising the step of introducing into the cell.
）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣ
Ｆ）、胎児肝臓キナーゼ−３タンパク質リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）およびトロン
ボポイエチンからなる群より選択されるサイトカイン、またはそれらの融合タン
パク質である、請求項１に記載の治療組成物。10. The method according to claim 10, wherein the stem cell recruiting factor is granulocyte colony stimulating factor (GCSF).
), Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GMCSF), stem cell factor (SC
The therapeutic composition according to claim 1, which is a cytokine selected from the group consisting of F), fetal liver kinase-3 protein ligand (FLT3-L) and thrombopoietin, or a fusion protein thereof.
の治療組成物。11. The therapeutic composition according to claim 1, wherein said stem cell mobilization factor is a chemotherapeutic agent.
）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）である、請求項
１０に記載の治療組成物。12. The method according to claim 12, wherein the stem cell recruiting factor is granulocyte colony stimulating factor (GCSF).
) Or granulocyte macrophage colony stimulating factor (GMCSF).
であって、被験体の免疫療法のために、前記培養され、誘導された細胞を該被験
体に投与する工程を包含する、使用。13. Use of a therapeutic composition according to any one of claims 1 to 12, wherein the cultured and induced cells are administered to a subject for immunotherapy of the subject. Use comprising the step of:
であって、被験体の免疫療法のために、前記培養する工程の前に収集された細胞
を該患者に投与する工程を包含する、使用。14. Use of a therapeutic composition according to any one of claims 1 to 12, wherein the cells collected before the culturing step are used for immunotherapy of the subject. Administration comprising administering to the subject.
使用のための、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の治療組成物。15. The therapeutic composition according to any one of claims 1 to 12, for use as a medicament in treating a tumor in a subject.
、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の治療組成物の使用。16. Use of a therapeutic composition according to any one of claims 1 to 12 for the manufacture of a medicament for treating a tumor in a subject.
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