JP2002517198A - ジスルフィドコアポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ジスルフィドコアタンパク質（Ｚｄｓｃｌ）用のポリヌクレオチドおよびポリペプチド分子に関する。ポリペプチドおよびそれらを符号化するポリヌクレオチドはセリンプロテアーゼ阻害剤である。また、Ｚｄｓｃｌポリペプチドを符号化するポリヌクレオチド、Ｚｄｓｃｌポリペプチドと特異的に結合する抗体、およびＺｄｓｃｌポリペプチドと特異的に結合する抗体を中和する抗イディオタイプ抗体を含有する発現ベクターについて開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： タンパク質インヒビターは、ファミリーメンバー間の広範囲の配列相同性、及
び鎖内ジスルフィド架橋の保存に基づいて一連のファミリーに分類される。Lask
owski and Kato, Ann. Rev. Rev. Biochem. 49 : 593-626 (1980) を参照のこと
。セリンプロテイナーゼインヒビターの例は、急性膵炎、種々の状態のショック
症候群、線溶亢進性出血及び心筋梗塞の処理において治療的に使用されるセリン
プロテイナーゼインヒビターアプロチニンである。高用量でのアプロチニンの投
与は、心臓手術、例えば心肺バイパス手術に関して、血液の損失を有意に低める
。

【０００２】 しかしながら、インビボ投与される場合、アプロチニンは、比較的高い用量の
反復された注入の後、ラット、ウサギ及びイヌにおいて腎毒性効果を有すること
が見出された。アプロチニンに関し観察される腎毒性（すなわち、病変（lesion
）の形で出現する）は、細管の負に荷電された表面への結合を引き起こす、アプ
ロチニンの高い正の実効電荷の結果として腎臓の近位細管細胞におけるアプロチ
ニンの蓄積のせいである。この腎毒性は、特に多量のインヒビターの投与を必要
とするそれらの用途（例えば、心肺バイパス手術）における臨床目的のためにア
プロチニンを不適切にする。さらに、アプロチニンは、ヒトへの投与に基づいて
免疫応答を誘発するウシタンパク質である。

【０００３】 従って、急性膵炎、ショック症候群の種々の状態、線溶亢進性出血及び心筋梗
塞の処理のために毒性ではないセリンプロテイナーゼインヒビターに関する必要
性が存在する。

【０００４】 発明の要約： 本発明は、ジスルフィドコアプロテイナーゼインヒビターと呼ばれる新しいク
ラスのプロテイナーゼインヒビター（この後、Zdsc1 ポリペプチドとして言及さ
れる）を提供することによってこの必要性を満たす。ネズミZdsc1、すなわち配
列番号１及び２は、配列番号２の位置１でのメチオニンから位置２４でのアラニ
ンまで延長するシグナル配列を有する。成熟ネズミZdsc1ポリペプチドはまた配
列番号３によっても示される。配列番号４及び５は、成熟ヒトZdsc1ポリペプチ
ド、及びそれをコードするポリヌクレオチドの例である。一般的なZdsc1ポリペ
プチドは、配列番号６により例示される。

【０００５】 本発明の１つの観点においては、単離されたポリペプチドが提供される。前記
ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３又は配列番号５の配列を含むアミノ酸
の配列を有する。 発明のもう１つの観点においては、配列番号２、配列番号３又は配列番号５の
配列を含むアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌ
クレオチドが提供される。 本発明のさらなる観点においては、配列番号１もしくは配列番号４のいずれか
，又は配列番号１の相補的配列もしくは配列番号４の相補的配列に対して、緊縮
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列が提供される。

【０００６】 本発明のさらなる観点においては、配列番号３又は配列番号４のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％，９５％又は９９
％相同であるポリヌクレオチド配列が提供される。 本発明のもう１つの観点においては、（ａ）転写プロモーター；（ｂ）上記の
ようなアミノ酸配列を含む、Zdsc1ポリペプチドをコードするDNAセグメントを含
んで成る発現ベクターが提供される。 本発明のもう１つの観点においては、前記DNAセグメントによりコードされる
哺乳類Zdsc1ポリペプチドを発現する、上記に開示されるような発現ベクターを
導入されている培養された真核、細菌、菌類又は他の細胞が提供される。

【０００７】 本発明のもう１つの観点においては、第１部分及びペプチド結合のより連結さ
れる第２部分から実質的に成るキメラポリペプチドが提供される。前記キメラポ
リペプチドの第１部分は、上記のようなZdsc1ポリペプチドから実質的に成る。
本発明はまた、キメラポリペプチドをコードする発現ベクター、及びキメラポリ
ペプチドを生成するために形質転換された宿主細胞も提供される。

【０００８】 本発明のさらなる観点においては、上記に開示されるようなポリペプチドに対
して特異的に結合する抗体、及びZdsc1抗体に対して特異的に結合する抗体の抗
イディオタイプ抗体が提供される。 本発明のそれらの及び他の観点は、本発明の次の詳細な記載に基づいて明らか
になるであろう。 発明の特定の記載：

【０００９】 本明細書に引用されるすべての文献は、引用によりそれらのすべてを本明細書
に組み込まれる。 本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助ける
ことができる：

【００１０】 “親和性標識”（abfinity tag）とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提
供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第
2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書に
おいて使用される。原理的には、それに対して抗体又は他の特異的結合剤が利用
できるあらゆるペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。

【００１１】 親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,
EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991)
, グルタチオンＳ トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 19
88）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlag^TM ペプチド（Hoppなど., Biotec
hnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプトアビジン結合ペプチド、又は他の抗
原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein
Expression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識を
コードするDNAは、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Ea
stman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手で
きる。

【００１２】 用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の
遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対
立遺伝子変異は、突然変異を通して天然に生じ、そして集団内の表現型多型現象
をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされた
ポリペプチドにおける変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の
対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すためにも本明細書におい
て使用される。

【００１３】 用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端"とは、ポリペプチド内の位
置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それ
らの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は
一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末
端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置
するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではな
い。

【００１４】 用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される
安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又
はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の
典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプ
テン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同
様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その
相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０⁹Ｍ^-1の結合親和性を有する。

【００１５】 用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列
に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5' ATGCACG
GG 3' は、5' CCCGTGCAT 3'に対して相補的である。 用語“Contig”とは、もう１つのポリヌクレオチドに対して同一又は相補的な
配列の連続した範囲を有するポリヌクレオチドを示す。連続した配列は、ポリヌ
クレオチドのそれらの全範囲において又は部分的範囲に沿って、所定の範囲のポ
リヌクレオチド配列と“オーバーラップする”と言われる。

【００１６】 用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオ
チドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して）
を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし
同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれ
Aspをコードする）。

【００１７】 用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能
に連結された注目のポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は
環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモ
ーター及びターミネーター配列並びに１又は複数の複製起点、１又は複数の選択
マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、並びに同様のものを包含す
る。発現ベクターは一般的に、プラスミドもしくはウィルスDNAから誘導され、
又は両者の要素を含むことができる。

【００１８】 用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオ
チドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は不
所望のコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成系内で
の使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、
それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを含む分子
である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まない
が、しかし天然において存在する5'及び3' 非翻訳領域、例えばプロモーター及
びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らか
であろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を参照のこと)
。

【００１９】 “単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、
例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク
質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチ
ド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形
、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチド
を提供することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”
とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体
化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。

【００２０】 “作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグ
メントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロ
モーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進
行するよう配列されることを示す。 用語“オルト体（orthology）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタ
ンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパ
ク質を示す。オルト体間の配列の差異は、種分化（speciation）の結果である。

【００２１】 “パラ体（paralogs）”とは、生物によって生産される、異なっているが，し
かし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複（gene dupbica
tion ）を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及び
ミオグロビンは、お互いパラ体である。

【００２２】 “ポリヌクレオチド”は、5'末端から3'末端に読み取られるデオキシリボヌク
レオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌ
クレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで
合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオ
チドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド（“nt”）、又はキロ塩基
（“kb”）として表される。ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖で
あるポリヌクレオチドを記載する。

【００２３】 この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用
され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリ
ヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素
分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖
ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのよう
な対になっていない末端は、長さ20ntを超えない。

【００２４】 “ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもい
ずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約
１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ペプチド”として言及され
る。 用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロ
モーター配列は通常、遺伝子の5' 非コード領域に見出されるが、しかし必ずし
もそうとは限らない。

【００２５】 “タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。
タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭
水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加さ
れ、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主
鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特
定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。

【００２６】 用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細
胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、
細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに
関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ドメイン（Frank Grantは
、サブユニット結合及びシグナルトランスダクションが別々のサブユニットであ
り得る“多ペプチド”を提案している）構造により特徴づけられる。受容体への
リガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互
作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。

【００２７】 この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に
連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、AMP生成の上昇、
細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分
解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シ
トソール性又は核性であり；モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−
アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容
体、IL−３受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体
及びIL―6受容体)であり得る。

【００２８】 用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより
大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるポリペ
プチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポ
リペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常
分解される。

【００２９】 用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を
示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA
分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライ
シング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写される
いくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異
体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタ
ンパク質を示すために本明細書において使用される。

【００３０】 不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子
量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が
“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正
確には±１０％であることが理解されるであろう。

【００３１】 セリンプロテイナーゼインヒビターは、活性部位を占有し、そしてそれにより
、正常な基質による占有を妨げることによって標的プロテイナーゼのタンパク質
分解活性を調節する。セリンプロテイナーゼインヒビターはいくつかの無関係な
構造的種類に分類されるが、それらはすべて、結合ループを端に有する残基とタ
ンパク質コアとの間での分子間相互作用により安定化される暴露されたループ（
“インヒビターループ”、“反応性コア”、“反応部位”、“結合ループ”とも
称する）を有する。

【００３２】 Bode, W. and Huber, R. "Natural protein proteinase inhibitors and thei
r interactions with proteinases", Eur. J. Biochem., 204: 433-451 (1992)
を参照のこと。インヒビターと酵素との相互作用は、非常にゆっくりと解離する
安定した複合体を生成し、すなわち結合ループの分裂しやすい結合で分解される
新規又は修飾されたインヒビターのいずれかを生成する。

【００３３】 セリンプロテイナーゼインヒビターは、種々の構造ファミリー、例えばKunitz
ファミリー、Kazalファミリー及びHirudinファミリーに分類される。タンパク質
Zdsc1は、Chelonianinファミリーに密接に関連すると思われる新規サブファミリ
ーのメンバーである。Chelonianin ファミリーは、それぞれがループ領域により
連結される２種の逆平行（anti parallel ）β鎖から成る、２種の隣接するβ−
ヘアピンモチーフを含んで成る通常の構造モチーフにより特徴づけられる。この
モチーフの二次構造は、β−シートトポロジーKにより示される（Branden, C. a
nd Tooze, J. Introduction to Protein Structure, P. 28, Garland Publishin
g, Inc., 1991）。 β−鎖は、鎖間水素結合、及び４個のジスルフィド結合網により連結される。そ
れらのジスルフィド結合は、プロテイナーゼインヒビターの構造を安定化し、そ
してそれを分解に対して影響されにくくする。この構造特徴は、プロテイナーゼ
インヒビターの“４−ジスルフィドコア”ファミリーとして言及されるべきChel
onianin ファミリーを生じさせた。このファミリーは、ヒト抗ロイコプロテイナ
ーゼ、ヒトエラフィン、テンジクネズミカルトリン様（caltrin-like）タンパク
質、ヒトカルマン（kallman ）症候群タンパク質、カメChelonianin, 及びヒト
精巣上皮分泌タンパク質E4，並びにマスTOP−２，及びC.エレガンス（C. Elegan
s）CO8G9を包含する。それらのいくつかのファミリーメンバーは、この構造モチ
ーフのいくつかのコピーを含む。

【００３４】 生来のプロテイナーゼとプロテイナーゼインヒビターとの間の不均衡（ambala
nce ）は、ヒト抗ロイコプロテイナーゼインヒビターのレベルが遺伝的バックグ
ラウンド又は空気汚染により傷つけられている患者に見出される。それらの患者
においては、重度の肺損傷が、プロテイナーゼの軽減された活性のためにもたら
される。抗ロイコプロテイナーゼインヒビターのエラスターゼ阻害ドメインは、
Zdsc1の３−ジスルフィドコアファミリーに関連する４−ジスルフィドコアファ
ミリーに分類される。

【００３５】 もう１つの例として、ヒトエラフィン（または、４−ジスルフィドコアファミ
リーにおける）は、白血球エラスターゼ及び膵臓エラスターゼの特定インヒビタ
ーである。それらのプロテイナーゼは、結合組織タンパク質エラスチンを分解す
る能力を有し、そして従って、エラスチンは過剰のエラスターゼ介在性組織タン
パク質分解及び損傷を妨げることができる。

【００３６】 セリンプロテイナーゼインヒビター活性は、Norris など., Biol. Chem. Hopp
e-Seyler 371: 37-42 (1990)により実質的に記載される方法を用いて測定され得
る。手短に言及すれば、Kunitz-型インヒビターの種々の固定された濃度が、１
００mMのNaCl，５０mMのトリスHCl，0.01％のTWEEN80 (ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレエート)溶液（pH7.4）において、２５℃で、表１及び表２に列挙
される濃度でセリンプロテイナーゼの存在下でインキュベートされる。３０分間
のインキュベーションの後、残る酸素活性が、アッセイ緩衝液における表１及び
表２に列挙されるような適切な基質の溶液の分解により測定される。サンプルが
３０分間インキュベートされ、その後、個々のサンプルの吸光度が405nmで測定
される。酵素活性の阻害が、405nmでの吸光度の低下又は460nmでの蛍光Emの低下
として測定される。前記結果から、見掛け阻害定数Kiが計算される。

【００３７】

【表１】

【表２】

【００３８】 表１における略語：rec.は組換えを意味し、GLカリクレインは粒状カリクレイ
ンを意味し、そしてPLカリクレインは血漿カリクレインを意味する。 阻害アッセイが、１０mMのNaCl，50mMのトリス−HCl（pH7.6），0.01％のTWEE
N80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレ−ト）において、300μlの合計体
積でマイクロタイターウェルにおいて行われた。

【００３９】 個々の反応物には、１μMのサンプルインヒビター及び表１に列挙される濃度
でのプロテイナーゼの一つを含めた。反応物は２５℃で１０分間インキュベート
され、この後、適切な色原体基質が表１に列挙される最終濃度まで添加され、そ
してその最終反応物が２５℃で３０分間インキュベートされた。アミド分解活性
が405nmでの吸光度により、又は460nmでの蛍光Emにより測定された。％阻害率は
、１００％活性又は０％阻害を表すインヒビターの存在下で実施される反応に対
して決定された。

【００４０】 本発明のセリンプロテイナーゼインヒビターは、中でも、急性膵炎、ショック
症候群の種々の状態、線溶亢進性出血及び心筋梗塞の処理のための開示される方
法に使用され得る。本発明のアミロイドタンパク質前駆体相同体は、中でも、前
記前駆体の組織分布を示すことへの使用のために又はそのようなタンパク質の精
製への使用のための抗体を生成するために使用され得る。

【００４１】 ４−ジスルフィドコアファミリーのメンバーにおけるシステイン３〜８は、次
のモチーフに従って存在する： Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cy
s Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys (配列番号１７)。残基Xaaは、システインを除くい
ずれかのアミノ酸残基により置換され得る。

【００４２】 このファミリーにおけるシステイン１〜２間の及びシステイン２〜３間の空間
は可変性である。システイン１〜３は、次のモチーフの１つに従って存在するこ
とが観察されている： Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys (配列番
号１８) Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys (配
列番号１９)

【００４３】 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys
（配列番号２０） Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys (配列番号２１) Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys（配列番号２
２）。 ４−ジスルフィドコアにおける８個のシステインは、次のパターンに従って結
合される： １−６，２−７，３−５，４−８。

【００４４】 タンパク質Zdsc１は、“３−ジスルフィドコア”ファミリーとして言及される
であろう新規の関連サブファミリーのメンバーである。このファミリーは、シス
テイン１及び６の不在のために、４−ジスルフィドコアファミリーとは異なる。
残る６個のシステインは次のパターンに従って存在する： Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys (配列番号２３)。

【００４５】 Zdsc1は、マスTOP−２及びマウスWDMN1タンパク質に対して最高の類似性を有
する、４−ジスルフィドコアタンパク質のほとんどに対する配列相同性により関
連づけられる。Garczynski, M. and Goetz, F. Molecular characterization of
a RNA transcript that is highly up-regulated at the time of ovulation i
n the brook trout ovary, Biology of Reproduction, 57: 856-864 (1997) を
参照のこと。

【００４６】 ジスルフィド結合及び結合ループを包含する、Zdsc1の立体構造をさらに特徴
づけるために、本発明者は、ブタエラフィン、すなわちFLEについてのNMR構造に
基づいて相同性モデルを構成した。Francart, C. など., "Solution structure
of R-elafin, a specific inhibitor of elastase", J. Mol. Biol. 268: 666-6
77 (1997) を参照のこと。３種のタンパク質間の複数の一列配列が下記に与えら
れる。

【００４７】 エラフィンにおける既知の及び予測される構造／機能関係、及びキモトリプシ
ンにより複合体化された抗ロイコプロテイナーゼの結晶構造との類似性により、
Zdsc 1/2の一定の特徴が予測され得る。Grutter, M. など., "The 2.5A X-ray c
rystal structure of the acid-stable proteinase inhibitor from human muco
us secretions analyzed in its complex with bovine alpha-chymotrypsin", E
MBO J., 7: 345-351 (1988) を参照のこと。Zdsc1における６個のシステインは
、次のパターンに従って結合される： ２−７，３−５，４−８。

【００４８】 Zdsc1の反応性結合ループは、配列LQLLGT（配列番号９）を包含する。ヒトZds
cのそれらの活性結合ループは、配列DRLLGT（配列番号１０）を包含する。Zdsc1
においては、この結合ループの回りのフランキング残基は、標的プロテイナーゼ
と相互反応にすることが予測される。分裂しやすい結合が、２つのロイシン間の
反応性結合ループに存在する。P1位置（第２ロイシン）での置換は、この残基が
標的プロテイナーゼに対する特異性に影響を及ぼすことが予測されるので、許容
されない。Bode, W. and Huber, R. "Natural protein proteinase inhibitors
and their interactions with proteinases", Eur. J. Biochem., 240: 433-451
(1992)を参照のこと。いずれかのシステイン残基の置換は、これがその構造を
有意に不安定化することが予測されるので、許容されない。

【００４９】 Zdsc1における位置Gln30〜Cys60からの許容できる変動性を予測するために、
本発明者は、個々の位置での許容できる置換を列挙する一般化されたモチーフを
創造した。 MKLGAFLLLVSLITLSLEVQELQA (配列番号８) (Zdsc1についての予測されるシグナル配列)

【００５０】

【表３】

【００５１】 ブタエラフィンと、Zdsc1についての予測される成熟ペプチドとの間の複数の
一列配列。FLEのシステイン３−８が、前記一列配列の上部にラベルされている
。Zdsc1のシステイン１−６が、４−ジスルフィドコアタンパク質についての標
準の番号付けを用いて、前記一配列の底部にラベルされている。Zdsc1及びZdsc2
の分析に基づいて、次の一般的なタンパク質が、下記配列番号６に示されるよう
に推定された。

【００５２】

【表４】

【００５３】 ここで、 アミノ酸位置２のXaaが、Valであるか又は不在であり； アミノ酸位置３のXaaが、Arg又はAlaであり； アミノ酸位置４のXaaが、Pro又はGlyであり； アミノ酸位置５のXaaが、Leu又はAspであり； アミノ酸位置６のXaaが、Gln, Arg, Lys又はGluであり； アミノ酸位置１２のXaaが、Val, Ala, Ile, Leu, Met又はSerであり； アミノ酸位置１６のXaaが、Thr, Arg, Ala, Asn, Ser, Val, Gln, Glu, His,
又はLysであり； アミノ酸位置２２のXaaが、Asn, Gly, Asp, His, 又はSerであり；

【００５４】 アミノ酸位置２４のXaaが、Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Lys,
Pro, Ser又はThrであり； アミノ酸位置２５のXaaが、Asp又はGluであり； アミノ酸位置２６のXaaが、His, Gln, Tyr又はGluであり； アミノ酸位置３０のXaaが、Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile,
Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr又はValであり； アミノ酸位置３３のXaaが、Gly, Ser, Ala, Asn又はThrであり； アミノ酸位置３５のXaaが、Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile,
Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr又はValであり； アミノ酸位置３７のXaaが、Val又はThrであり； アミノ酸位置３８のXaaが、Ala又はThrであり；そして アミノ酸位置３９のXaaが、Asn又はGlyである。

【００５５】 配列番号８に基づいてのいずれかの得られるポリペプチドは、配列番号３、配
列番号５又は配列番号７に対して少なくとも８０％、好ましくは９０又は９５％
、及び最も好ましくは９９％同一であるべきである。

【００５６】 ポリヌクレオチド： 本発明はまた、本明細書に開示されるZdscポリペプチドをコードする、DNA及
びRNA分子を包含するポリヌクレオチド分子も提供する。当業者は遺伝子コード
の宿主の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能で
あることを容易に認識するであろう。本発明のポリヌクレオチド、一般的にはcD
NAは、本明細書に記載されるポルペプチドをコードする。本発明のポリペプチド
をコードするcDNA配列は一連のコドンから成り、前記ポリペプチドの個々のアミ
ノ酸残基はコドンによりコードされ、そして個々のコドンは３個のヌクレオチド
から成る。アミノ酸残基は、次の通りにそれらのそれぞれのコドンによりコード
される。

【００５７】 アラニン（Ala）は、GCA, GCC, GCG又はGCTによりコードされ； システイン（Cys）は、TGC又はTGTによりコードされ； アスパラギン酸（Asp）は、GAC又はGATによりコードされ； グルタミン酸（Glu）は、GAA又はGAGによりコードされ； フェニルアラニン（Phe）は、TTC又はTTTによりコードされ； グリシン（Gly）は、GGA, GGC, GGG又はGGTによりコードされ； ヒスチジン（His）は、CAC又はCATによりコードされ； イソロイシン（Ile）は、ATA, ATC又はATTによりコードされ； リシン（Lys）は、AAA又はAAGによりコードされ； ロイシン（Leu）は、TTA, TTG, CTA, CTC, CTG又はCTTによりコードされ； メチオニン（Met）は、ATGによりコードされ；

【００５８】 アスパラギン（Asn）は、AAC又はAATによりコードされ； プロリン（Pro）は、CCA, CCC, CCG又はCCTによりコードされ； グルタミン（Gln）は、CAA又はCAGによりコードされ； アルギニン（Arg）は、AGA, AGG, CGA, CGC, CGG又はCGTによりコードされ； セリン（Ser）は、AGC, AGT, TCA, TCC, TCG又はTCTによりコードされ； トレオニン（Thr）は、ACA, ACC, ACG又はACTによりコードされ； バリン（Val）は、GTA, GTC, GTG又はGTTによりコードされ； トリプトファン（Trp）は、TGGによりコードされ；そして チロシン（Tyr）は、TAC又はTATによりコードされる。

【００５９】 本発明によれば、ポリヌクレオチドが本明細書に記載のように請求される場合
、請求されることは、センス鎖、アンチセンス鎖及びそれらのそれぞれの水素結
合により一緒にアニールされるセンス及びアンチセンス両鎖を有する二本鎖とし
てのDNAであることが理解されることが認識されるべきである。また、本発明の
ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNA（mRNA）が請求され、そしてこのm
RNAは本明細書に記載されるcDNAによりコードされる。メッセンジャーRNA（mRNA
）は、本明細書に定義されるコドンと同じコドンを用いてポリペプチドをコード
し、但し個々のチミンヌクレオチド（T）がウラシルヌクレオチド（U）により置
換される。

【００６０】 当業者はまた、異なった種が、“選択的コドン使用法”を示すことができるこ
とを理解するであろう。一般的には、Granthamなど., Nuc. Acids Res. 8: 1893
-912 (1980); Haas, など. Curr. Biol. 6: 315-24 (1996);Wain-Hobson, など.
, Gene 13: 355-64 (1981); Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209 (1982); H
olm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87 (1986); Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573
-97 (982)を参照のこと。

【００６１】 本明細書において使用される場合、用語“選択的コドン使用法”又は“選択的
コドン”とは、一定の種の細胞において最も頻繁に使用されるタンパク質コドン
を言及する技術用語であり、従って、個々のアミノ酸をコードする可能コドンの
１つ又は少数の代表物を好む。例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）はACA, ACC,
ACG又はACTによりコードされ得るが、しかし哺乳類細胞において、ACCが最も通
常使用されるコドンであり；他の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌
においては、異なったThrコドンが選択的である。

【００６２】 特定種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法によ
り、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。選択コドン配列の組換えDNA
中への導入は、例えば、特定細胞型又は種内でのタンパク質翻訳を効果的にする
ことによって、タンパク質の生成を増強する。選択コドンを含む配列は、種々の
種における発現について試験され、そして最適化され得、そして本明細書に開示
されるように官能性について試験され得る。

【００６３】 本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号
１、配列番号４又はそれらに対して相補的な配列の類似するサイズの領域に対し
て、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義さ
れたイオン強度及びｐHで、特定の配列のための熱溶融点（Tｍ）よりも約５℃低
くあるよう選択される。Tmは、標的配列の 50％が完全に適合されたプローブに
対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐH下で）である。
典型的な緊縮条件は、塩濃度がｐH７で約0.03Mまでであり、そして温度が少なく
とも約60℃である条件である。

【００６４】 前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを
包含する。DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知られてい
る。一般的に，RNAは多量のZdsc１ RNAを生成する組織又は細胞から単離され得
る。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77: 5201, 1980）により同定され、そして肝臓におけるヒトZdsc1の高
い発現を包含する。

【００６５】 全RNAは、グアニジウム HCl抽出、続くCsClグラジエントにおける遠心分離に
よる単離により調製され得る（Chirgwinなど.,Biochemistry 18:52−94, 1979）
。ポリ（A）⁺ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 1408−
1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA(ｃDNA)は、既知
の方法を用いて、ポリ（A）⁺ RNAから調製される。他方では、ゲノムDNAが単離
され得る。Zdscポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばハイブリ
ダイゼーション又はPCRにより同定され、そして単離される。

【００６６】 Zdsc1ポリペプチドをコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニン
グ方法により得られる。相補的DNA（cDNA）クローンが好ましいが、但し、いく
つかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノ
ムクローンを使用するか又は少なくとも１つのゲノムイントロンを包含するよう
cDNAを修飾すことが好ましい。cDNA及びゲノムクローンを調製するための方法は
、よく知られており、そして当業者のレベル内であり、そしてライブラリーをプ
ロービングし又は感作するためには、本明細書に開示される配列、又はその一部
の使用を包含する。発現ライブラリーは、Zdscに対する抗体、受容体フラグメン
ト、又は他の特異的結合パートナーによりプローブされ得る。

【００６７】 本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子機械を用いて合成され得る。現在、
その選択される方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本
鎖DNAが、ある用途、例えば遺伝子、又は遺伝子フラグメントの合成のために必
要とされる場合、個々の相補的鎖は別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０
bp）の生成は、技術的に直接的であり、そして相補的鎖を合成し、そして次に、
それらをアニーリングすることによって達成され得る。しかしながら、より長い
遺伝子（＞300bp）の生成のためには、化学的DNA合成の間、個々のサイクルのカ
ップリング効率はめった100％ではないので、特定の手段が所望される。

【００６８】 この問題を克服するためには、合成遺伝子（二本鎖）が、２０〜100個の長さ
のヌクレオチドである一本鎖フラグメントから変性形でアセンブルされる。二本
鎖構造体は、完全な遺伝子配列を形成するために、連続して、お互い連結される
。化学的に合成された遺伝子はヌクレオチドの正しい配列を有することが絶対的
に必須であるので、個々の二本鎖フラグメント及び次に、完全な配列は、DNA配
列分析により特徴づけられる。Glick and Dasternak, Molecular Biotechnology
, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Wshington, D
.C. 1994); Itakura など., Annu. Rev. Biochem. 53: 323-56 (1984) 及びChim
ieなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 633-637 (1990) を参照のこと。

【００６９】 本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物ポリペプチド及びポリヌク
レオチドを提供する。それらの種は，哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、昆
虫及び他の脊椎動物並びに無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定
されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ
、犬、ネコ、馬及び他の霊長類ポリペプチドからのZdscポリペプチドである。ヒ
トZdscのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給さ
れる情報及び組成物を用いてクローン化され得る。

【００７０】 例えば、ｃDNAは、本明細書に開示されるようなZdscを発現する組織又は細胞
型から得られるｍRNAを用いてクローン化され得る。ｍRNAの適切な源は、本明細
書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン ブロットをプローブ
することによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系の
ｍRNAから調製される。次に、Zdsc−コードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な
又は部分的なヒトｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数組
みの変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。

【００７１】 ｃDNAはまた、本明細書に開示される代表的なヒトZdsc配列から企画されたプ
ライマーを用いて、PCR（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）によってもクロ
ーン化され得る。さらなる方法においては、ｃDNAライブラリーが宿主細胞を形
質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃDNAの
発現がZdsc1ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がま
た、ゲノム クローンの単離に適用され得る。

【００７２】 当業者は、配列番号１及び４に開示される配列がそれぞれネズミZdsc1及びヒ
トZdsc1の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライ
シングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝
子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラ
リーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号１に示されるDN
A配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及
び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２の対立
遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。

【００７３】 Zdsc1ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから
生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと
同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及
びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異な
った個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによっ
てクローン化され得る。

【００７４】 本発明はまた、配列番号２、３及び５のポリペプチド、及びそれらのオルト体
に対して実質的に同一である単離されたZdsc1ポリペプチドも提供する。用語“
実質的に同一である”とは、配列番号２に示される配列又はそれらのオルト体に
対して、５０％，好ましくは６０％、より好ましくは少なくとも８０％の配列同
一性を有するにポリペプチドを示すために本明細書において使用される。そのよ
うなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２又はそのオルト体に対して、
少なくとも９０％、及び最も好ましくは９５％又はそれ以上同一であろう。

【００７５】 ％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bul
l. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. A
cad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、２種
のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナル
ティー、及び表２（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示される
ようなHenikoff and Henikoff （前記）の“blosum 62”評点マトリックスを用
いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のよう
にして計算される：

【００７６】

【数１】

【００７７】

【表５】

【００７８】 当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズ
ムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査
アルゴリズムは、１つのアミノ酸配列及び推定上の変異体のアミノ酸配列により
供給される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。
前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載さ
れる。

【００７９】 手短には、FASTAがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミ
ノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ktup変数が１であ
る場合）又は対の同一性（ktup＝2である場合）のいずれかを有する試験配列に
より共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度
の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対
合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域
の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。

【００８０】 “カットオフ”値（配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算
される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられ
た初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結
合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配
列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch
アルゴリズム（Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers
, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974）の変法を用いて整列される。

【００８１】 FASTA 分析のための実例となるパラメーターは次のものである：ktup＝１、ギ
ャップ開始ペナルティー＝10、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリッ
クス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 (前
記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログ
ラム中に導入され得る。

【００８２】 FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性
を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は
、１〜６、好ましくは４〜６の範囲であり得る。 本発明は、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号５のアミノ酸配列と比較し
て、１又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分
子を包含する。

【００８３】 BLOSUM62の表は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された
領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来する
アミノ酸置換マトリックスである［Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad.
Sci. USA 89: 10915 (1992) ］。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミ
ノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。
本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１より
も大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、
その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性で
ある。

【００８４】 好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のBL
OSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくと
も２（例えば、２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられる。従って、本発明
は、配列番号３に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％及び最も好ましく
は９９％同一であり、そして哺乳類における抗体生成を刺激することができるそ
れらのポリペプチドを請求し、そして前記抗体は配列番号３の生来の配列に結合
することができる。

【００８５】 変異体Zdsc1ポリペプチド及び実質的に同一のZdsc1ポリペプチドは、１又は複
数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの
変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表３を参照のこと）及びタンパク質
及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；
小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又
はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２
５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である
。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、Zdscポリペプチドと親和性標
識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン
分解部位及び第Xa因子分解部位を含む。

【００８６】

【表６】

【００８７】 異なった種は、“選択的コドン使用法”を示すことができる。一般的には、Gr
anthamなど., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912 (1980); Haas, など. Curr. Biol.
6: 315-24 (1996);Wain-Hobson, など., Gene 13: 355-64 (1981); Grosjean a
nd Fiers, Gene 18: 199-209 (1982); Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87 (19
86); Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97 (982); Sharp and Matassi, Curr.
Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994) ; Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494 (
1995); 及びMakrides, Microbiol. Rev. 60: 512 (1996)を参照のこと。

【００８８】 本明細書において使用される場合、用語“選択的コドン使用法”又は“選択的
コドン”とは、一定の種の細胞において最も頻繁に使用されるタンパク質コドン
を言及する技術用語であり、従って、個々のアミノ酸をコードする可能コドンの
１つ又は少数の代表物を好む。例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）はACA, ACC,
ACG又はACTによりコードされ得るが、しかし哺乳類細胞において、ACCが最も通
常使用されるコドンであり；他の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌
においては、異なったThrコドンが選択的である。

【００８９】 特定種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法によ
り、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。選択コドン配列の組換えDNA
中への導入は、例えば、特定細胞型又は種内でのタンパク質翻訳を効果的にする
ことによって、タンパク質の生成を増強する。選択コドンを含む配列は、種々の
種における発現について試験され、そして最適化され得、そして本明細書に開示
されるように官能性について試験され得る。

【００９０】 本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物を表す変異体ポリペプチド
及び核酸分子を提供する。それらの種は，哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類
、昆虫及び他の脊椎動物並びに無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには
限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、
ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類ポリペプチドからのZdsc１ポリペプチドであ
る。

【００９１】 ヒトZdsc１のオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により
供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃDNAは、本
明細書に開示されるようなZdsc１を発現する組織又は細胞型から得られるｍRNA
を用いてクローン化され得る。ｍRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列
から企画されたプローブによりノザン ブロットをプローブすることによって同
定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製され
る。

【００９２】 次に、Zdsc１−コードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒト
ｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数組みの変性プローブ
により、プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開
示される代表的なヒトZdsc１配列から企画されたプライマーとのPCRを用いても
クローン化され得る。さらなる方法においては、ｃDNAライブラリーが宿主細胞
を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃDN
Aの発現がZdsc1ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法が
また、ゲノム クローンの単離に適用され得る。

【００９３】 当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトZdsc1の単一の対立遺伝子を表
し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測される
ことを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って
、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによって
クローン化され得る。配列番号１又は４に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝
子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミ
ノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２、３又は５の対立遺伝子
変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。

【００９４】 Zdsc1ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから
生成されたcDNA分子は、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチ
ドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異
体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、
異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることに
よってクローン化され得る。

【００９５】 一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のため
の熱溶融点（Tｍ）よりも約５℃低くあるよう選択される。Tmは、標的配列の５
０％が完全に適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義された
イオン強度及びｐH下で）である。

【００９６】 １対の核酸分子、例えばDNA-DNA, RNA-RNA及びDNA-RNAは、ヌクレオチド配列
がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハ
イブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハ
イブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリ
ッドのTmは、１〜1.5％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイ
ゼーション条件緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの
程度に対する制御を可能にする。

【００９７】 緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイ
ゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。緊縮ハイブリダ
イゼーション条件は、ハイブリッドのTmよりも約５〜２５℃低い温度、及び1Mま
でのNa⁺を有するハイブリダイセーション緩衝液を包含する。低い温度での高い
程度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドに対して約１℃、ハ
イブリッドのTmを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。一般的に、そ
のような緊縮条件は、２０〜７０℃の温度、及び６×SSC及び０〜５０％のホル
ムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。

【００９８】 より高い程度の緊縮性は、４×SSC及び０〜５０％のホルムアミドを有するハ
イブリダイゼーション緩衝液と共に、４０〜７０℃の温度で達成され得る。高い
緊縮条件は、典型的には、１×SSC及び０〜５０％のホルムアミドを有するハイ
ブリダイゼーション緩衝液と共に、４０〜７０℃の温度を包含する。異なった程
度の緊縮性は、標的配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイ
ゼーション及び洗浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーション
に続く洗浄が、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポ
リヌクレオチドプローブから除去するために、高い程度の緊縮性で行われる。

【００９９】 上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは、特定のポリ
ペプチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合する当業者の能力内
である。特定標的配列のためのTmは、標的配列の５０％が完全に適合されたプロ
ーブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下で）である。Tm
に影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対
含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、及びハイブリダイゼーショ
ン溶液における不安定化剤の存在を包含する。

【０１００】 Tmを計算するための多くの等式は、当業界において知られており、そしてDNA,
RNA及びDNA-RNAハイブリッド、及び種々の長さのポリヌクレオチドプローブに
対して特異的である（例えば、Sambrookなど., Molecular Cloing: A Lavorator
y Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel など.,
(eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, In
c. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Technique
s, (Academic Press, Inc. 1987); 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio
l. 26: 227 (1990) を参照のこと）。

【０１０１】 配列分析ソフトウェア、例えばOLIGO6.0 (LSR; Long Lake, MN) 及びPrimer P
remier 4.0 (Premier Biosoft Inter National; Palo Alto, CA), 並びにインタ
ーネット上のサイトが、所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に
基づいてTmを計算するための入手できる手段である。そのようなプログラムはま
た。定義された条件下で所定の配列を分析し、そして適切なプローブ配列を同定
することもできる。

【０１０２】 典型的には、５０個以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーションは、計算されたTmよりも約２０〜２５℃低い温度で行われる。より小
さなプローブに関しては、５０個以下の塩基対のハイブリダイゼーションは典型
的には、Tm又はそれよりも５〜１０℃低い温度で実施される。これは、DNA-DNA
及びDNA-RNAハイブリッドに関するハイブリダイゼーションの最大の速度を可能
にする。

【０１０３】 ポリヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を
及ぼす。５０個以下の塩基対の小さなプローブ配列は、急速に相補的配列との平
衡に達するが、しかし低い安定性のハイブリッドを形成する。いずれかの場所で
の数分〜数時間のインキュベーション時間が、ハイブリッド形成を達成するため
に使用され得る。長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化に達するが、しかし
低い温度でさえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩
又はそれよりも長いプロセッシングを可能にする。一般的に、インキュベーショ
ンは、計算されたCot時間×３に等しい間、実施される。Cot時間、すなわちポリ
ヌクレオチド配列が再結合するのにかかる時間は、当業界において知られている
方法により特定の配列について計算され得る。

【０１０４】 ポリヌクレオチド配列の塩基対組成は、ハイブリッド複合体の熱安定性に影響
を及ぼし、それによりハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼー
ション緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。A−Tは、塩化ナトリウムを含む水溶
液において、G―C対よりも低い安定性を有する。従って、G―C含有率が高いほど
、ハイブリッドはより安定する。配列内でのG及びC残基の分布さえまた、ハイブ
リッド安定性に明確に寄与する。さらに、塩基対組成は、所定の配列のTmを変更
するために操作され得る。例えば、５−メチルデオキシジチジンによりデオキシ
シチジンが置換され、そして５−ブロモデオキシウリジンによりチミジンが置換
され、Tmが高められ、そして７−デアザ−２'−デオキシグアノシンによりグア
ノシンを置換することにより、Tmに対する依存性を低めることができる。

【０１０５】 ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度もまた、ハイブリッドの安定性に
影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的に、ブロッキング剤、例
えばDenhardt's 溶液（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo）、変性されたサケ
精子DNA, tRNA, ミルク粉末（BLOTTO）、ヘパリン又はSDS、及びNa⁺源、例えばS
SC（１×SSC：0.15Mの塩化ナトリウム、15mMのクエン酸ナトリウム）又はSSPE (
1×SSPE:1.8MのNaCl、10mMのNaH₂PO₄, 1mMのEDTA，pH7.7)を含む。緩衝液のイオ
ン濃度を低めることによって、ハイブリッドの安定性が高められる。

【０１０６】 典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、10mM〜1MのNa⁺を含む。不安
定化剤又は変性剤、例えばホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グア
ニジニウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液
への添加は、ハイブリッドのTmを変更するであろう。典型的には、ホルムアミド
が、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために
、５０％までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、RNAプローブを用いる
場合、非特異的にはバックグラウンドを低めるためにも作用する。

【０１０７】 示されるように、変異体Zdsc1ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番
号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子により、５０％ホル
ムアミド、５×SSC（１×SSC：0.15Mの塩基ナトリウム及び15mMのクエン酸ナト
リウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×Denhardt's 溶液（100×Den
hardt's 溶液：２％（w/v）のFicoll 400, 2% (w/v)のポリビニルピロリドン及
び２％（w/v）のウシ血清アルブミン）、１０％の硫酸デキストラン及び２０μg
/mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んで成る溶液において、４２℃で一
晩ハイブリダイズされ得る。

【０１０８】 当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動性を考慮することがで
きる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液
において、高度で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混
合されたハイブリダイゼーション溶液が入手でき（例えば、CLONTECH Laborator
ies, Inc. からのEXPRESSHYB Hybridization Solution），そしてハイブリダイ
ゼーションは製造業者の説明書に従って行われ得る。

【０１０９】 ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮
条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る
。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.5×
〜２×SSC溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体Zdsc1
ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレ
オチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記
洗浄緊縮性は、５５〜６５℃での、0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液、例えば
５５℃での、0.1％SDSを含む0.5×SSC溶液、又は６５℃での0.1％SDSを含む２×
SSC溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるSSCをSSPEにより置換する
ことによって同等の条件を容易に製造することができる。

【０１１０】 典型的な高い緊縮洗浄条件は、５０〜６５℃での0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）を含む0.1×〜0.2×SSCの溶液による洗浄を包含する。換言すれば、変
異体Zdsc1ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列
番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズ
し、ここで前記洗浄緊縮性は、５0〜６５℃での、0.1％SDSを含む0.１×〜0．２
×SSC溶液、例えば５0℃での、0.1％SDSを含む0.1×SSC溶液、又は６５℃での0.
1％SDSを含む0.２×SSC溶液に等しい。

【０１１１】 本発明はまた、配列番号２のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質
的に類似する配列同一性を有する単離されたZdsc1 ポリペプチドも提供する。用
途“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号２で示される配列又はそれら
のオルト体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％以
上の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される
。本発明はまた、配列番号３のアミノ酸残基の配列に対して少なくとも７０％、
少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％以上の配列
同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドも包含する。本発明はさ
らに、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。％同一性を決
定するための方法が下記に記載される。

【０１１２】 本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得るZdsc1変異体核酸分子を
企画する：配列番号３のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似
性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなZdsc1変異体は、
（１）５５〜６５℃での0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液に等しい緊縮洗浄条
件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハ
イブリダイズし、そして（２）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７
０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％以上
の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。

【０１１３】 他方では、Zdsc1変異体は、（１）５０〜６５℃での0.1％SDSを含む0.1×〜0.
2×SSC溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（
又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２
のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０
％、少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコー
ドする核酸分子として特徴づけられ得る。

【０１１４】 本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体は［及び１又は複数のポリペ
プチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質］を提供する。例えば
、Zdsc ポリペプチドは、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567,584号に開示
されるようにして、ダイマータンパク質への融合体として調製され得る。これに
関する好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含
する。免疫グロブリン−Zdsc1ポリペプチド融合体は、遺伝子的に構築された細
胞において発現され得る［種々のマルチマーZdsc1類似体を生成するために］。

【０１１５】 補助ドメインは、Zdsc1ポリぺぷチドを、特定の細胞、組織又は高分子（例え
ば、コラーゲン）に標的化するためにそれらのポリペプチドに融合され得る。例
えば、Zdsc1ポリペプチド又はタンパク質は、標的細胞の表面上の受容体に特異
的に結合するリガンドにZdsc1ポリペプチドを融合することによって、予定され
た細胞型に標的化され得る。この場合、ポリペプチド及びタンパク質は治療又は
診断目的のために標的化され得る。Zdsc1ポリペプチドは、複数の成分、例えば
精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合
体はまた、特にドメイン間に１又は複数の切断部位を含むことができる。Tuanな
ど., Connective Tissue Research 34: 1〜9 (1996) を参照のこと。

【０１１６】 本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基も包含することが
できる。天然に存在しないアミノ酸は、次のものを包含するが、但しそれらだけ
には限定されない：トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、
シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−ヒドロキシプロリン、N−メチルグ
リシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシメチルシステイン、
ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコ
リン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロ
リン、３，３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェ
ニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４
−フルオロフェニルアラニン。

【０１１７】 タンパク質中に天然に存在しないアミノ酸残基を挿入するためのいくつかの方
法は、当業界において知られている。例えば、ナンセンス突然変異が化学的にア
ミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが
使用され得る。

【０１１８】 アミノ酸を合成し、そしてtRNAをアミノアシル化するための方法は、当業界に
おいて知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、
E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬を含んで成る細胞−フリーシステ
ムにおいて実施される。例えば、Robertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113: 272
2 (1991); Ellmanなど., Methods Enzymol. 202: 301 (1991); Chung など., Sc
ience 259: 806-809 (1993); 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
: 10145-10149 (1993) を参照のこと。

【０１１９】 第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノ
アシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツ
メガエル卵母細胞において行われる。Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 19
991-19998 (1996) を参照のこと。第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換
される天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の存在下で、及び所望の天
然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニ
ルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の
存在下で培養される。

【０１２０】 天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に組
み込まれる。Koide など., Biochem. 33: 7470-7476 (1994) を参照のこと。天
然に存在するアミノ酸残基は、インビトロでの化学的修飾により天然に存在しな
い種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに延長するために特定部
位の突然変異誘発と組み合わされ得る。Wynn and Richards, Protein Sci-2: 39
5-403 (1993) を参照のこと。

【０１２１】 限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ
酸、天然に存在しないアミノ酸、及び異常なアミノ酸は、Zdsc1アミノ酸残基に
より置換さえ得る。本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界にお
いて知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然
変異誘発に従って同定され得る。Cunningham and Wells, Science 244: 1081-10
85 (1989); Bass など、Proc. Natl. Acan. Sci. USA 88: 4498-4502 (1991) を
参照のこと。

【０１２２】 後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子におけるあらゆる残基
で導入され、そしてその得られる変異体分子が、その分子の活性に対して決定的
であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようにして、生物学的
活性について試験される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708
(1996) を参照のこと。リガンド−受容体又は他の生物学的相互作用の部位はま
た、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、クリスタログ
ラフィー、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるよう
に、構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Vos など., Scienc
e 255: 306-12 (1992); Smith など．，J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992); W
lodaverなど., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。

【０１２３】 タンパク質の生成： 完全な長さのポリペプチド、生物学的に活性な断片、および融合ポリペプチド
を含む本発明のZdscl ポリペプチドは、従来の手法により遺伝子工学で操作され
た宿主細胞中で産生することができる。好適な宿主細胞は、外因性DNA により形
質転換またはトランスフェクトされ、培養により増殖することができる型の細胞
であり、細菌、真菌細胞、および培養された、より高度な真核細胞が含まれる。
真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。

【０１２４】 クローン化されたDNA分子を取り扱う、また様々な宿主細胞中に外因性DNAを導
入する手法は、Sambrook 等の共著、Molecular Cloning : A Laboratory Manual
，第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 19
89）、およびAusubel等の編集、Current Protocols in Molecular Biology (Joh
n Wiley and Sons,Inc., NY,1987)に開示されている。

【０１２５】 一般に、Zdscl ポリペプチドをコードするDNA 配列は発現ベクター内において
、通常転写プロモーターおよびターミネーターを含むその発現に必要な他の遺伝
因子と操作可能に連結している。また、ある系内で選択マーカーが別々のベクタ
ー上に供給されることが可能性であり、外因性DNA の複製が宿主細胞のゲノム中
に組込むことにより提供されることが可能性であるということは当業技術者には
分かるはずだが、ベクターは一般に１または複数の選択マーカーおよび１または
複数の複製起点を含有する。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベ
クター、およびその他の因子の選択は、当業技術の通常レベル内の日常設計の事
柄である。多くのこのような因子は文献に記載されており、営利目的の供給業者
から入手可能である。

【０１２６】 Zdscl ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中に向けるために、分泌シグナル配
列（また、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列として知られる）が発
現ベクター中に提供される。分泌シグナル配列はZdscl の分泌シグナル配列であ
ってもよく、あるいは別の分泌されるタンパク質（例えばt-PA）から誘導されて
も、または初めから合成されてもよい。

【０１２７】 分泌シグナル配列は、ZdsclのDNA配列と操作可能に連結し、すなわち２つの配
列は適正な読み枠中で連結され、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分
泌経路中に向けるような位置に置かれる。或る分泌シグナル配列が注目のDNA 配
列中の他の位置にあってもよいが、分泌シグナル配列は注目のポリペプチドをコ
ードするDNA配列に対して通常５′に位置づけられる（例えば、Welch他の米国特
許第5,037,743号；Holland他の米国特許第5,143,830号を参照されたい）。

【０１２８】 別法では、本発明のポリペプチド中に含有された分泌シグナル配列は、他のポ
リペプチドを分泌経路に向けるために用いられる。本発明はそのような融合ポリ
ペプチドを提供する。本発明の融合ポリペプチドに含有された分泌シグナル配列
は追加のペプチドを分泌経路に向けるために、好ましくはアミノ末端で追加のペ
プチドと融合される。このような構造物は当業界で周知の多くの用途を有する。
例えば、これらの新しい分泌シグナル配列の融合構造物は、受容体などの常態で
は非分泌性のタンパク質の活性成分の分泌を目的とすることができる。このよう
な融合体はペプチドが分泌経路を通るようにインビボまたはインビトロで用いる
ことができる。

【０１２９】 培養した哺乳類細胞は本発明の範囲内の好適な宿主である。外因性DNA を哺乳
類細胞中に導入する方法は、リン酸カルシウムが仲介するトランスフェクション
についてはWigler等の論文、Cell 14:725（1978）； CorsaroおよびPearsonの論
文、Somatic Cell Genetics 7：603（1981）；GrahamおよびVan der Ebの論文、
Virology 52：456（1973）；電気穿孔法についてはNeumann等の論文、EMBO J. 1
：841〜845（1982）；DEAE−デキストランが仲介するトランスフェクションにつ
いてはAusubel 等の論文、同上誌；およびリポソームが仲介するトランスフェク
ションについてはHawley-Nelson等の論文、Focus 15：73，1993、およびCiccaro
ne等の論文、Focus 15：80（1993）；またウィルス性ベクターについてはMiller
およびRosmanの論文、Bio Techniques 7：980（1989）、ならびにWangおよびFin
erの論文、Nature Med．2：714（1996）がある。

【０１３０】 培養した哺乳類細胞中における組換えポリペプチドの産生については、例えば
Levinson他の米国特許第4,713,339号；Hagen他の米国特許第4,784,950号；Palmi
ter他の米国特許第4,579,821号；およびRingoldの米国特許第4,656,134号に開示
されている。好適な培養した哺乳類細胞にはCOS-1（ATCC No.CRL1650）、COS-7
（ATCC No.CRL1651）、BHK（ATCC No.CRL1632）、BHK570（ATCC No.CRL10314)、
293（ATCC No.CRL1573)；Graham等の論文、J.Gen.Virol.36：59-72（1977）、お
よびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO-K1；ATCC No.CCL61）の細胞系
がある。

【０１３１】 その他の好適な細胞系が当業界で知られており、American Type Culture Coll
ection，Rockville，Marylandなどの公共の供託機関から入手可能である。一般
に、SV-40またはサイトメガロウィルス由来のプロモーターなどの強力な転写プ
ロモーターが好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照されたい。別の
好適なプロモーターには、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第4,579,821号お
よび第4,601,978号）およびアデノウィルスの主要後期プロモーター由来のもの
がある。

【０１３２】 薬剤選択が、一般外来DNA が挿入された培養された哺乳類細胞を選択するため
に用いられる。そのような細胞は一般に「トランスフェクタント」と呼ばれる。
選択剤の存在下で培養され、注目の遺伝子を子孫に渡すことができる細胞は「安
定トランスフェクタント」と呼ばれる。好ましい選択マーカーは抗生物質ネオマ
イシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は G-418などのネオマイシ
ン型薬剤の存在下で行なわれる。選択系はまた注目の遺伝子の発現レベルを増加
させる「増幅」と呼ばれるプロセスに用いることができる。

【０１８０】 特定の抗体の選別および単離は当業界においてよく知られている。Paul編、Fu
ndamental Immunology（Raven Press，1993）；Getzoff等の論文、Adv.in Immun
ol．43：1〜98（1988）；Goding,J.W.編、Monoclonal Antibodies：Principles
and Practice（Academic Press Ltd.，1996）；Benjamin等の論文、Ann.Rev.Imm
unol．2：67〜101（1984）を参照されたい。

【０１８１】 Zdsclタンパク質またはポリペプチドと特異的に結合する抗体を検出するため
に当業者が周知の様々な検定法を利用することができる。典型的な検定法は、Ha
rlowおよびLane編、Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor La
boratory Press，1988）に詳細に記述されている。このような検定法の代表例に
は、併行（concurrent）免疫電気泳動法、放射線免疫検定法、放射線免疫沈降法
、酵素免疫吸着測定法（ELISA）、ドットブロットまたはウェスタンブロット検
定法、阻害または競合検定法、およびサンドウィッチ検定法がある。加えて、抗
体は、変異Zdsclタンパク質またはポリペプチドに対する野生型の結合について
選別することができる。

【０１８２】 Zdsclに対する抗体は、Zdsclを発現する細胞の標識用に；親和精製によるZdsc
lの単離用に；Zdsclポリペプチドの循環レベルを判定するための診断検定用に；
根底をなす病理学または疾病の遺伝標識としての可溶性ポリペプチドの検出また
は計量用に；FACSを使用する分析法において；抗イディオタイプ抗体の生成用に
；中和抗体として、またはインビトロおよびインビボでZdsclを妨害するための
拮抗体として用いることができる。

【０１８３】 好適な直接標識またはラベルには放射線核種、酵素、基質、コファクター、阻
害剤、蛍光遺伝標識、化学発光遺伝標識、磁気粒子などがあり、また間接標識ま
たはラベルはビオチン−アビジンまたは中間体としてのその他の補体／抗補体対
の使用を特徴とすることができる。また本明細書の抗体は直接または間接的に薬
剤、毒素、放射線核種などと接合してもよく、これらの接合体はインビボの診断
または治療の用途に用いることができる。さらに、Zdsclまたはその断片に付着
する抗体は、検定、例えばウェスタンブロットまたは当業界で周知のその他の検
定において変性したZdsclまたはその断片を検出するためにインビトロで用いる
ことができる。

【０１８４】 生化学的に活性な接合体： また、本明細書の抗体またはポリペプチドは直接または間接的に薬剤、毒素、
放射線核種などと接合してもよく、これらの接合体はインビボの診断または治療
の用途に用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドまたは抗体は、対
応する抗補体分子を発現させる組織または器官（例えば、それぞれ受容体または
抗原）を特定または治療するために用いることができる。より具体的にはZdscl
ポリペプチドまたは抗Zdscl抗体、あるいは生化学的に活性な断片またはそのタ
ンパク質は、検出可能な分子または細胞障害分子と結合し、抗補体分子を発現さ
せる細胞、組織、または器官を有する哺乳類に送達することができる。

【０１８５】 好適な検出可能な分子は、直接または間接的にポリペプチドまたは抗体に付着
することができ、放射線核種、酵素、基質、共同因子、阻害剤、蛍光遺伝標識、
化学発光遺伝標識、磁気粒子などが含まれる。好適な細胞障害分子は、直接また
は間接的にポリペプチドまたは抗体に付着することができ、細菌性または植物性
毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、リシン、アブ
リンなど）、ならびにヨウ素−131、レニウム−188、またはイットリウム−90な
どの治療用放射線核種が含まれる（例えば、ポリペプチドまたは抗体に直接付着
するか、またはキレート部分の手段を介して間接的に付着するかのいずれかであ
る）。

【０１８６】 また、ポリペプチドまたは抗体はアドリアマイシンなどの細胞障害薬と接合す
ることができる。検出可能な分子または細胞障害分子の間接的付着の場合、検出
可能な分子または細胞障害分子は相補体／抗相補体対のメンバーと接合すること
が可能で、そこでもう一方のメンバーはポリペプチドまたは抗体部分と結合する
。これらの目的では、ビオチン／ストレプトアビジンが典型的な相補体／抗相補
体対である。

【０１８７】 別の実施形態において、ポリペプチド−毒素融合タンパク質、または抗体−毒
素融合タンパク質を、標的細胞または組織の阻害または除去（abration）（例え
ば、がん細胞または組織の治療のため）に用いることができる。別法では、ポリ
ペプチドが多機能性ドメイン（例えば、活性化ドメインまたはリガンド結合ドメ
イン、プラス、ターゲティングドメイン）を有する場合、ターゲティングドメイ
ンのみを含む融合タンパク質が、検出可能な分子、細胞障害分子、または補体分
子を興味のある細胞または組織の種類に向けるのに好適であるかも知れない。

【０１８８】 ドメインのみの融合タンパク質が相補体分子を含む場合には、抗相補体分子は
検出可能な分子または細胞障害分子と接合することができる。したがって、この
ようなドメイン−相補体分子融合タンパク質は、一般的な抗相補体−検出可能／
細胞障害分子接合体の細胞／組織特異的送達のための一般的な標的用ビヒクルを
代表する。 本明細書に記載の生化学的に活性なポリペプチドまたは抗体の接合体は、静脈
内、動脈内、または導管内を通って送達することができ、あるいは処置すべき狙
いの部位に局部的に導入することができる。

【０１８９】 ポリヌクレオチド／ポリペプチドの使用法： 本発明の分子は、受容体を識別し、単離するために用いることができる。例え
ば、本発明のタンパク質およびペプチドをカラム上に固定することができ、膜調
製物がカラムを流れる（Hermanson等の編集、Immobilized Affinity Ligand Tec
hniques，pp．195〜202（Academic Press，San Diego，CA，1992））。また、タ
ンパク質およびペプチドは、放射能標識（M.Deutscher編、Methods in Enzymol
，「Guide to Protein Purification」，721〜37（Acad.Press,San Diego，1990
））、またはホトアフィニティーラベリング（Brunner等の論文、Ann.Rev.Bioch
em．62：483〜514（1993）、およびFedan等の論文、Biochem.Pharmacol．33：11
67〜80（1984））を施すことができ、特定の細胞表面のタンパク質を識別するこ
とができる。

【０１９０】 遺伝子治療： Zdsclポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドは、Zdscl活性を増大または
抑制することが望まれる遺伝子治療の用途において有用である。哺乳類が変異ま
たは欠落したＺｄｓｃｌ遺伝子を有する場合、哺乳類の細胞中にZdscl遺伝子を
導入することができる。一実施形態において、Zdsclポリペプチドを符号化する
遺伝子をインビボでウィルス性のベクター中に導入することができる。

【０１９１】 このようなベクターには、単純ヘルペスウィルス（HSV）、乳頭腫ウィルス、
エプスタイン・バールウィルス（EBV）、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス
（AAV）などの弱毒化したまたは欠損のあるDNAウィルスがあるが、これには限定
されない。完全またはほとんど完全にウィルス性遺伝子を欠く欠損のあるウィル
スが好ましい。欠損のあるウィルスは細胞中に導入した後、感染しない。欠損の
あるウィルスの使用は、ベクターが他の細胞に感染する恐れなしに特定の局在域
中の細胞への投与を可能にする。

【０１９２】 具体的なベクターの例には、欠損のある単純ヘルペスウィルス１（HSV1）(kap
litt等の論文、Molec.Cell.Neurosci．2：320〜30（1991））；Stratford-Perri
caudet等の論文、J.Clin.Invest．90：626〜30，1992に記載のベクターなどの弱
毒化したアデノウィルスベクター；および欠損のあるアデノ随伴ウィルスベクタ
ー（Samulski等の論文、J.Virol．61:3096〜101（1987）；Samulski等の論文、J
.Virol.63：3822〜3828（1989)）があるが、これには限定されない。

【０１９３】 別の実施形態において、Zdscl遺伝子はレトロウィルスのベクター中に導入す
ることができ、例えばAnderson他の米国特許第5,399,346号；Mann等の論文、Cel
l 33：153（1983）；Temin他の米国特許第4,650,764号；Temin他の米国特許第4,
980,289号；Markowitz等の論文、J.Virol.62：1120（1988）；Temin他の米国特
許第5,124,263号；Dougherty他の国際公開第WO95/07358号（公開日1995年３月16
日）；およびKuo等の論文、Blood 82：845（1993）に記載されている。別法では
、ベクターはリポソームを用いてインビボでリポフェクションにより導入するこ
とができる。

【０１９４】 合成のカチオン性脂質を、標識遺伝子を符号化する遺伝子のインビボ移入用リ
ポソームの調製に用いることができる（Felgner等の論文、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 84：7413〜7（1987）；Mackey等の論文、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027
〜31（1988））。外因性の遺伝子をインビボで特定の器官に導入するためにリポ
フェクションを用いることは幾つかの実用的な利点を有する。特定の細胞に対す
るリポソームの分子ターゲッティングは利益の一面を示す。

【０１９５】 より具体的には、移入を特定の細胞に向けることは利益の一面を示す。例えば
、移入を特定の細胞の種類に向けることは、膵臓、肝臓、腎臓、および脳などの
細胞異質性を有する組織においては特に好都合であろう。脂質をターゲッティン
グのために他の分子と化学的に結合させることができる。標的ペプチド（例えば
、ホルモンまたは神経伝達物質）、抗体などのタンパク質、あるいは非ペプチド
分子を化学的にリポソームと結合させることができる。

【０１９６】 体から標的細胞を除去すること、裸のDNAプラスミドとしてベクターを導入す
ること、次いで形質転換された細胞を体の中に再着床させることが可能である。
遺伝子治療用の裸のDNAベクターは、当業界で周知の方法、例えば移入、電気穿
孔法、微注入法、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈
降、遺伝子銃の使用またはDNAベクター輸送体の使用により所望の宿主細胞中に
導入することができる。例えば、Wu等の論文、J.Biol.Chem.267：963〜7（1992
）；Wu等の論文、J.Biol.Chem.263：14621〜14624（1988）を参照されたい。

【０１９７】 インビボの細胞増殖を抑制するためなど、Zdscl遺伝子の転写を抑制するため
にアンチセンスの方法体系を用いることができる。Zdsclを符号化するmRNAと結
合させて、このようなmRNAの翻訳を阻害するために、Zdsclを符号化するポリヌ
クレオチド（例えば、配列番号：１で示されるポリヌクレオチド）のセグメント
に対して相補的なポリヌクレオチドを設計する。このようなアンチセンスポリヌ
クレオチドは、細胞培養物中または被験者中のZdsclポリペプチド符号化遺伝子
の発現を抑制するために用いられる。

【０１９８】 本発明はまた診断用途に使用法が見出されるはずの試薬を提供する。例えば、
Zdscl遺伝子、ZdsclDNAまたはRNAを含むプローブ、あるいはその部分配列は、Zd
scl遺伝子が存在するかどうか、または変異が起こっているかどうかを決定する
ために用いることができる。Zdscl遺伝子坐における検出可能な染色体異常には
、異数性、遺伝子コピー番号の変化、挿入、欠失、制限部位の変化、および転位
があるが、これには限定されない。

【０１９９】 このような染色体異常は、制限断片長多型（RFLP）分析、PCRの手法を使用す
るショートタンデムリピート（STR）分析、および当業界でよく知られているそ
の他の遺伝子連鎖分析手法（Sambrook等の論文、同上誌；Ausubel等の論文、同
上誌；Marian等の論文、Chest 108：255〜65（1995））などの分子遺伝子の手法
を採用することにより本発明のポリヌクレオチドを用いて検出することができる
。

【０２００】 Zdscl遺伝子を発現させるために設計された形質転換マウスおよび「ノックア
ウトマウス」（Snouwaert等の論文、Science 257：1083（1992））と呼ばれるZd
scl遺伝子機能の完全な欠如を示すマウスもまた産出することができる（Lowell
等の論文、Nature 366：740〜42（1993））。これらのマウスは、Zdscl遺伝子お
よびそれによってインビボの系中に符号化されるタンパク質を研究するために使
用することができる。

【０２０１】 染色体上の局在化： 放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳類染色体の高解像度の連続した地図を
構築するために開発された体細胞遺伝子技術である（Cox等の論文、Science 250
：245〜250（1990））。遺伝子配列の部分または全体の知識は、染色体の放射線
ハイブリッドマッピングパネルとともに用いるのに適するPCRプライマーの設計
を可能にする。Stanford G3RH PanelおよびGeneBridge 4 RH Panel（Reseach Ge
netics,Inc.，Huntsville，AL）などの全ヒトゲノムをカバーする放射線ハイブ
リッドマッピングパネルが市販されている。これらのパネルは迅速なPCRベース
の染色体上の局在化と、遺伝子、配列に標識した部位（STS）、ならびに関心の
ある域内の他の非多型および多型標識遺伝子の順序づけとを可能にする。

【０２０２】 これには新たに発見された興味の対象の遺伝子と以前に位置決めした標識遺伝
子との間の正比例の物理的距離を確定することが含まれる。遺伝子の位置の正確
な知識は、１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかを決定すること
、およびYAC、BAC、またはcDNAクローンなどの様々な形態のその他の周囲の遺伝
子配列を得ること；２）同一染色体域との結合を示す、遺伝性疾患に対して可能
性のある候補遺伝子を提供すること；および３）特定の遺伝子がどのような機能
を有するかを決定する助けとなる可能性のあるマウスなどの相互参照モデル生物
；を含む幾つかの目的にとって有用である可能性がある。

【０２０３】 配列に標識した部位（STS）はまた染色体上の局在化のために単独で用いるこ
とができる。STSはヒトゲノムに独特なDNA配列であり、特定の染色体または染色
体域に対する基準点として用いることができる。STSは、全ての他のゲノム配列
の存在下でこの部位を特定して検出するために、重合酵素連鎖反応で用いる１対
のオリゴヌクレオチドプライマーにより規定される。STSはただ単にDNA配列を基
礎としているので電子データベース、例えばDatabase of Sequence Tagged Site
s（dbSTS）、GenBank（National Center for Biological Information，Nationa
l Institutes of Health，Bethesda，MD；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）の中
に完全に記述することができ、関心のある遺伝子配列でこれら短ゲノムの目印の
STS配列に含まれるマッピングデータを探査することができる。

【０２０４】 薬品に使用する場合、本発明のタンパク質は非経口的、具体的には静脈内また
は皮下への通常の方法による送達用に調合される。静脈内投与は１から数時間の
典型的な期間にわたる巨丸剤の注射または注入によることになる。一般に薬品の
調合には、生理的食塩水、緩衝用塩類液、水に溶かした５％デキストロースなど
の薬剤として許容されるビヒクルと組合せたZdsclタンパク質が含まれることに
なる。さらに調合物は１または複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、ガラ
スびん表面のタンパク質の損失を防止するためのアルブミンなどを含んでもよい
。

【０２０５】 調合方法は当業界でよく知られており、例えばGennaro編、Remington：The Sc
ience and Practice of Pharmacy（Mack Publishing Co., Easton, PA, 第19版
，1995）に開示されている。治療量は、通常１日当たり患者の体重の0.1から100
μｇ／kgの範囲、好ましくは１日当たり0.5から20μｇ／kgであるが、正確な用
量は治療すべき状態の性質と程度、患者の特徴などを考慮に入れて容認基準に従
って臨床医により決定されることになる。用量の決定は通常の当業技術レベルの
範囲にある。タンパク質は、急性治療に対しては１週間以内にわたって、多くの
場合１から３日の期間にわたって投与してもよく、あるいは慢性治療においては
数ヶ月または数年にわたって用いてもよい。 本発明を、さらに下記の非限定的実施例により例示する。

【０２０６】実施例１ ：マウスのZdscl遺伝子のクローニング 発現された配列標識（EST）、配列番号：１１を好酸性cDNAライブラリーのEST
データバンク中に見出した。ESTに対応するcDNAクローンを見出し、配列して配
列番号：１のDNA配列を得た。成熟タンパク質は配列番号：３の中に示される。

【０２０７】実施例２ ：ヒトのZdscl遺伝子のクローニング EST、配列番号：１２を老化したヒトの繊維芽細胞のcDNAライブラリーのESTデ
ータバンク中に見出した。ESTに対応するcDNAクローンを見出し、配列して配列
番号：４のDNA配列を得た。成熟タンパク質は配列番号：５の中に示される。

【０２０８】実施例３ ：Zdsclのノーザンブロット分析 ノーザンブロット分析を、Clontech（Palo Alto,CA）から入手したマウスの多
種組織ブロットおよびドットブロットと、Origene（Rockville,Maryland）から
入手したMouse Multiple Tissue Blotとを用いて、Zdscl遺伝子の全符号化域を
含む400bpDNAプローブにより行なった。プローブを、製造業者の仕様に従ってMU
LTIPRIME（商標）DNA標識システム（Amersham,United Kingdom）を用いて³²Ｐに
より放射性標識した。EXPRESSHYP（商標）溶液（Clontech）を予備雑種形成に、
またノーザン分析の雑種形成用溶液として用いた。

【０２０９】 ブロット上のプローブの雑種形成を６５℃で夜通し行ない、次いでブロットを
室温の２Ｘの標準クエン酸ナトリウム（SCC）および0.1％のドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）中で４回洗浄し、続いて５０℃の0.1ＸのSCCおよび0.1％のSDS中で
２回洗浄した。次いでブロットを露出させた。両方の多種組織ブロットに対して
肝臓中に１回のみの強い転写が見られた。ドットブロットは肝臓に対して強いド
ットを示した。また、脾臓および大腸菌DNAに対してもかすかなドットが見られ
た。

【０２１０】 本発明の特殊な実施形態を例示のために本明細書に記載したが、上記から様々
な変形形態を本発明の精神と範囲から逸脱することなく作ることができることが
理解されよう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲による場合を除いて
制限されない。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA19 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA56 EA23 FA74

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を有する単離され
   たポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号５のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド
   。
3. 【請求項３】 配列番号２、配列番号３及び配列番号５から成る群から選択
   されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し
   て少なくとも９０％相同である単離されたポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号２、配列番号３及び配列番号５から成る群から選択
   されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項３記載の単離され
   たポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２、配列番号３及び配列番号５から成る群から選択
   されたポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。
6. 【請求項６】 配列番号２、配列番号３及び配列番号５から成る群から選択
   されたポリペプチドに対して特異的に結合する抗体に結合し、そしてその抗体を
   中和する抗−イディオタイプ抗体。
7. 【請求項７】 配列番号２、配列番号３及び配列番号５から成る群から選択
   されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
8. 【請求項８】 アミノ酸位置１でのXaaが、Alaであるか又は不在であり； アミノ酸位置２のXaaが、Valであるか又は不在であり； アミノ酸位置３のXaaが、Arg又はAlaであり； アミノ酸位置４のXaaが、Pro又はGlyであり； アミノ酸位置５のXaaが、Leu又はAspであり； アミノ酸位置６のXaaが、Gln, Arg, Lys又はGluであり； アミノ酸位置１２のXaaが、Val, Ala, Ile, Leu, Met又はSerであり； アミノ酸位置１６のXaaが、Thr, Arg, Ala, Asn, Ser, Val, Gln, Glu, His,
   又はLysであり； アミノ酸位置２２のXaaが、Asn, Gly, Asp, His, 又はSerであり； アミノ酸位置２４のXaaが、Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Lys,
   Pro, Ser又はThrであり； アミノ酸位置２５のXaaが、Asp又はGluであり； アミノ酸位置２６のXaaが、His, Gln, Tyr又はGluであり； アミノ酸位置３０のXaaが、Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile,
   Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr又はValであり； アミノ酸位置３３のXaaが、Gly, Ser, Ala, Asn又はThrであり； アミノ酸位置３５のXaaが、Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile,
   Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr又はValであり； アミノ酸位置３７のXaaが、Val又はThrであり； アミノ酸位置３８のXaaが、Ala又はThrであり；そして アミノ酸位置３９のXaaが、Asn又はGlyである、配列番号６から成る単離され
   たポリヌクレオチド。