JP2002516119A - 非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤抗レトロウイルス療法をモニターするための手段および方法 - Google Patents

非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤抗レトロウイルス療法をモニターするための手段および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染および後天的免疫不全症候群（AIDS）の治療のための有効な薬剤レジメの同定に使用される、抗ウイルス薬剤感受性および耐性試験に関する。更に、HIV感染および抗ウイルス療法、特に非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤療法に対するその応答の臨床的進行を、表現型感受性アッセイまたは遺伝子型アッセイを使用してモニターする手段および方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、１９９８年５月２６日登録米国特許連番第０９／０８５，１４８号
の部分的継続であり、１９９９年３月１２日登録の米国仮出願第６０／１２４，
０９０号の利益を請求するものである。ここに両出願の内容を引用することによ
って本申請書に含めることとする。
【０００２】 この出願を通じて、様々な文献が、括弧付きで引用される。これらの出版物の
開示は、本発明の関連する分野の状態をより完全に記載するため、引用すること
により本出願に含める。
【０００３】
【技術分野】
本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染および後天的免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）の治療に際し、効果的な薬剤処方を特定するために使用される抗レ
トロウィルス剤感受性・耐性テストに関する。本発明はさらに、表現型または遺
伝型感受性定量法を用いて、ＨＩＶ感染の臨床的進行、および、その抗レトロウ
ィルス療法に対する反応をモニターするための手段・方法に関わる。本発明はま
た、表現型感受性テストを実行するための、新規のベクター、宿主細胞、および
、組成物にも関わる。本発明はさらに、ある患者の感染が、ある特定の抗レトロ
ウィルス剤処方に対して耐性を持つようになった、そのような患者を特定するた
めの、各種遺伝型方法論の使用にも関わる。本発明はまた、抗レトロウィルス候
補薬について、ウィルス、選ばれたウィルス配列、および・または、ウィルス蛋
白に対する同薬剤の抑制能力に関するスクリーニングにも関わる。特に、本発明
は、表現型感受性テスト、および・または、遺伝型テストによる、非ヌクレオシ
ド系逆転写酵素阻害剤耐性の定量に関わる。
【０００４】
【発明の背景】
ＨＩＶ感染は、病気経過を通じて、ウィルスの高率な世代交番があり、これが
最終的にＣＤ４枯渇と病気進行をもたらすという特徴を持つ。Wei X, Ghosh SK,
Taylor ME et al. (1995) Nature 343, 117-122、および、Ho, DD, Naumann AU,
Perelson AS, et al. (1995) Nature 373, 123-126。抗レトロウィルス剤の目的
は、ウィルス複製の実質的・持続的抑制を実現することである。持続的ウィルス
防止を実現するには、一般に各療法が、３個以上の抗レトロウィルス剤の併用か
ら成る、連続療法の使用が必要とされるようである。従って、初回治療と後続治
療の選択は合理的な根拠に基づいてなされなければならないが、その決定を導く
ために不可欠なのは、耐性パターンおよび交差耐性パターンに関する知識である
。併用療法において先ず重要な原理は、ウィルス複製に対して単独の場合よりも
さらに大きな抑制を実現するために、活性が共働的または加算的になるようにす
ることに関わる。しかしながらやはり、薬剤処方の耐性が鍵となる。なぜなら、
治療は、長年月に渡って維持する必要があるからである。
【０００５】 治療されない患者では、１日当りほぼ１０１０個の、新しいウィルス粒子が生
産される。ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）が、エキソ核酸分解校正による転写エラー
修正を持たないことと相俟って、この高レベルのウィルス世代交番は、ＨＩＶゲ
ノムの各位置につき、１日当り１０４から１０５個の突然変異を招く。その結果
は、広範な遺伝型変異の急速な確立である。他よりも多くのエラーを生じる傾向
がある、鋳型位置または塩基対置換があると考えられているが（Mansky LM, Tem
in HM (1995) J. Virol 69, 5087-5094）（Schinazi RF, Lloyd RM, Ramanathan
CS, et al. (1994) Anitimicrob Agents Chemother 38, 268-274）、一方、数
学モデルからは、感染者では、全ての任意の単一地点において、１日当り最大10
,000回の変異が起きている可能性のあることが示唆されている。
【０００６】 抗レトロウィルス剤耐性が生ずるためには、標的酵素は、その阻害剤の存在下
においてその機能を保持しながら、修飾されなければならない。１個のアミノ酸
置換を生ずる点突然変異が、同酵素の活性部位の形、サイズ、または、電荷量、
あるいは、基質結合部位やその周辺領域に変更をもたらす可能性がある。抗レト
ロウィルス剤に対して耐性を持つ突然変異株は、治療開始前は、低レベルにおい
て検出される。（Mohri H, Singh MK, Ching WTW, et al. (1993) Proc Natl Ac
ad Sci USA 90, 25-29）（Najera I, Richman DD, Olivares I, et al. (1994)
AIDS Res Hum Retroviruses 10, 1479-1488）（Najera I, Holguin A, Quinones
-Mateu E, et al. (1955) J. Virol 69, 23-31）。しかしながら、これらの突然
変異株は、全ウィルス負荷の内のほんの一小部分であって、野生型に比べて、複
製上または競合上の欠点を持つ可能性がある。（Coffin JM (1995) Science 267
, 483-489）。抗レトロウィルス剤治療の選択圧は、これら薬剤耐性突然変異株
に対して、競合上の利点を与えることになり、従って、それらが、優勢偽似種を
代表することになり（Frost SDW, McLean AR (1994) AIDS 8, 323-332）（Kella
m P, Boucher CAB, Tijnagal JMGH (1994) JGen Virol 75, 341-351）、最終的
には、患者において、薬剤耐性の確立とウィルス学的失敗という結果に至る。
【０００７】 非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤 非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）は、インビトロにおいてＨ
ＩＶ−１ ＲＴの強力な阻害剤となる、様々な化学的化合物のグループである。
この化合物の中には、ピリジノン誘導体や、デラビルジンやアテビルジンのよう
なビス（ヘテロアリル）ピペラジン（ＢＨＡＰ）、ジピリドジアゼピノン・ネビ
ラピン、チミン誘導体グループのＴＳＡＯとＨＥＰＴ、αアニリノフェニルアセ
タミド（α−ＡＰＡ）化合物ロビリド、（ＨＢＹ−０９７）のようなキノキサリ
ン系阻害剤、ベンゾジアゼピン−オン、および、‐チオン（ＴＩＢＯ）化合物、
および、ピリジノン誘導体（Ｌ−６９７，６６１）が含まれる。これら薬剤の概
観に関しては、（DeClercq E. (1996) Rev Med Virol 6, 97-117）（Emini EA (
1996) Antiviral Drug Resistance（「抗ウィルス剤耐性」）、DD Richman編、J
ohn Wiley & Sons, Ltd）を参照されたい。個々の化合物に対する高レベルの耐
性は、急速に、しばしば、単一投与療法の開始数週間以内に出現するが、多くの
場合、単一点突然変異のみが関わっているが、また多くの場合、他のＮＮＲＴＩ
に対するかなりの交差耐性をも招くようである。報告されている突然変異の多く
は、ＲＴ酵素触媒部位近傍の、２個のβシートをコードする、コドングループ１
００−１０８と１８１−１９０とに起こっている。（Kohlstaedt LA, Wang J, F
riedman JM, et al. (1992) Science 256, 1783-90）。従来から報告されている
ところによれば、ＮＮＲＴＩ結合ポケットは、ＲＴの、疎水性の非基質結合領域
であって、そこにおいて、これらの薬剤は、ＲＴと直接的相互作用を持つ。同薬
剤は、「親指」サブドメインの可動性を阻害することによって、または、触媒活
性に必須の、保存されたアスパラギン酸側鎖の方向性を破壊することによって、
活性を抑制する。（D‘Aquilla RT, (1994) Clin Lab Med 14, 393-423)(Arnold
E, Ding J. Hughes SH, et al. (1995) Curr Opin Struct Biol 5, 27-38)。
【０００８】 ネビラピンに対する感受性低下を付与する突然変異は、コドン９８、１００、
１０３、１０６、１０８、１８１、１８８、および、１９０に出現することが記
載されている。（Richman DD, Havlir D, Corbeil J. (1994) J Virol 68, 1660
-1666）。ネビラピン単一投与治療の際に最も高頻度で選択される変異種は、Ｔ
ｙｒ１８１−Ｃｙｓ（Ｙ１８１Ｃ）突然変異であり、これは、同薬剤に対して、
１００倍の感受性低下をもたらし、かつ、ピリジノン誘導体Ｌ−６９６、２２９
およびＬ−６９７、６６１に対する感受性をも低下させる（Arnold、同上）。Ｔ
ＳＡＯも１８１突然変異存在下では、限定された活性しか持たないが、コドン１
００や１０３の突然変異の存在下では活性を維持し、インビトロにおいて、ＲＴ
と最も緊密な相互作用を持つ領域において、特徴的な突然変異種ＧＬＵ１３８−
Ｌｙｓ（Ｅ１３８Ｋ）を選択する。（Richman, DD、同上）。（Richman DD. Shi
h C-K, Lowy I. et al. (1991) Proc Natl. Acad Sic USA 88, 11241-11245）。
【０００９】 ロビリドに対する耐性は、単一投与治療で使用すると、多くの患者で、２４週
までに出現する。この耐性は、コドン１００−１１０、１８１−１９０の範囲、
最も一般的にはコドン１０３にマッピングされる（Staszewski S, Miller V, Ko
ber A, et al. (1996) Antiviral Ther 1, 42-50）。ロビリドと、ジドブヂン、
または、ジドブジン＋ラミブジンによる併用治療においては、コドン９８と１０
３における変異種が、２４週時に検出された、最も高頻度の突然変異であった（
Staszewski S, Miller V, Rehmet S, et al. (1996) AIDS 10, P1-7）。
【００１０】 １０１、１０３および１８１突然変異もＢＨＡＰ類に対する交差耐性を付与す
るけれども（Balzarini J. Karlsson A, Perez-Perez M-J, et al. (1992) Viro
logy 192, 246-253）、インビトロにおいてこれらの薬剤で選択される、特徴的
なＰ２３６Ｌ置換は、ＲＴに対して、他のいくつかのＮＮＲＴＩに対する感受性
を付与するようであって、ヌクレオシド類縁体に対する感受性には影響を及ぼす
ことなく、ネビラピンに対するＩＣ５０を７から１０倍低下させる（Staszewski
S、同上）。この、コドン２３６における突然変異は、アテビルヂン投与治療時
における臨床分離株の中には観察されていない。ただし、同剤単一投与の際には
コドン１０３と１８１に、同剤とジドブジンの併用治療の際にはコドン１０１、
１８８、２３３および２３８に、他の耐性付与突然変異が報告されている。
【００１１】 ＨＢＹ−０５７は、最初は、インビトロでコドン１９０の突然変異を選択する
が、さらに継代すると、ＲＴコドン７４と７５における突然変異を一貫して選択
し、その際、いくつかの突然変異ウイルスは、ジダノシンやスタブジンに対する
感受性は低下させるが、ジゾブジンに対する感受性には変化がなかった（Kleim
J-P, Roesner M, Winkler I, et al. (1995) J Acquir Immune Defic Sydr 10,
Suppl 3, 2）。
【００１２】 コドン１８１における突然変異は、典型的な４１・２１５コドン突然変異によ
るジドブジン耐性に対して拮抗作用を示すことが報告されている（Zhang D, Cal
iendo AM, Eron JJ, et al. (1994) Antimicrob Agents Chemother 38, 282-287
）。これは、いくつかのＮＮＲＴＩとジドブジンとの併用治療が実行可能である
ことを示唆している。ジドブジン、ジダノシン、および、ネビラピンに対する３
重耐性を持つＨＩＶ突然変異株がインビトロにおいて記載されているけれども（
Larder BA, Kellam P, Kemp SD (1993) Nature 365, 451-453）、これら三種の
併用治療は、ＣＤ４細胞カウントが＜３５０個／ｍｍ３の患者にて、４８週に渡
って観察したところ、ジトブジン＋ジダノシンのみの併用の場合よりも優れた免
疫学的・ウィルス学的反応を与えた。ジドブジンとプリジノン誘導体Ｌ−６９７
、６６１との併用治療は、このＮＮＲＴＩ剤単独治療の際には典型的に選択され
るコドン１８１突然変異の出現を抑え、それによって、この薬剤に対する高レベ
ルの耐性の出現を遅らせる。ジドブジン耐性の変化についてはこの研究では調べ
られていない（Staszewski S, Massari FE, Kober A, et al. (1995) J Infect
Dis 171, 1159-1165）。ネビラピン投与治療時において、ジドブジン同時投与、
または、継続投与は、耐性の出現を遅らせなかった（Richman DD、同上）、（Nu
nberg JH, Schleif WA, Boots EJ, et al. (1990) J Virol 65, 4887-4892）（D
eJong MD, Loewenthl M, Boucher CAB, et al. (1994) J Infect Dis 169, 1346
-1350）（Cheeseman SH, Havlir, D, McLaughlin MM, et al. (1995) J Acquir
Immune Defic Syndr 8, 141-151）。しかしながら、１８１突然変異体は、併用
時に観察されず、最も一般的に見られた変化はコドン１９０に起こった（Richma
n DD、同上）。このことから示唆されるのは、インビトロにおいてジドブジン耐
性に対して拮抗作用を示したコドン１８１突然変異は、インビボでは好まれない
、すなわち、他の突然変異を優先する選択に適合することができない。これが、
ジドブジン耐性と同時に、このＮＮＲＴＩに対する感受性の低下が見られる理由
である。
【００１３】 ＮＮＲＴＩに対する感受性低下が急速に発達するということは、これら薬剤の
有用性の限界、特に単一投与療法におけるこれら薬剤の有用性の限界を示唆する
ものであり、それがために、薬剤耐性ウイルスの出現を遅らせようという試みの
中で、これらの分子が修飾されるに至った。「第２世代」ＮＮＲＴＩ、すなわち
、ピリジノンン誘導体Ｌ−７０２、０１９においては、野生型とコドン１８１突
然変異株ＨＩＶ−１の間に、ＩＣ５０において僅か３倍の変化しか認められず、
さらに、高レベルの耐性が生ずるためには多数の突然変異が必要であった（Gold
man ME, O‘Brien JA, Ruffing TL, et al. (1993) Antimicrob Agents Chemoth
er 37, 947-949）。
【００１４】 本発明の一つの目的は、ある患者のあるウイルス集団が、ある任意の処方剤に
対して耐性を持つか否かを示すことのできる、薬剤感受性・耐性テストを供給す
ることである。本発明のもう一つの目的は、ある一クールの治療後、ある任意の
一つの薬剤、または、複数の薬剤に対して耐性を持つに至った患者に対し、医師
が、それに基づいて、治療処方において、１個以上の薬剤を置換することが可能
になる、そのようなテストを供給することである。本発明のさらにもう一つの目
的は、ＨＩＶ感染、および・または、ＡＩＤＳ治療用の有効な薬剤処方の選択を
可能にするテストを供給することである。本発明のさらにもう一つの目的は、患
者がそれに対して耐性を持つに至った薬剤を特定する、特に、非ヌクレオシド系
逆転写酵素阻害剤に対する耐性を特定するための手段を提供することである。本
発明のさらにもう一つの目的は、薬剤候補化合物であって、特に、非ヌクレオシ
ド系逆転写酵素阻害剤に関連するウイルス薬剤耐性に関して、特定のウイルス、
ウイルス遺伝子、および・または、ウイルス蛋白に作用する薬剤候補化合物の生
物学的有効度を評価するためのテストおよび方法を供給することである。ＨＩＶ
の抗レトロウィルス薬剤耐性・感受性を評価するための手段・組成物を提供する
のが、本発明のさらにもう一つの目的である。本発明の上記目的、および、その
他の目的は、本申請書全体から明らかとなろう。
【００１５】
【発明の概要】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス感染の臨床的進行、および、抗ウィルス治療
に対するウイルスの反応を、表現型・遺伝型方法を用いて、モニターする方法に
関わる。さらに、本発明の一部は、下記の発見に基づく。すなわち、抗レトロウ
ィルス治療に対する耐性を付与する、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）における遺伝的
変化は、表現型ないし遺伝型方法を用いて、患者血漿ＨＩＶ ＲＮＡにおいて直
接、手早く定量が可能であるという発見である。この方法は、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）に基づく定量法を利用する。別法として、増幅工程なしでウィル
ス蛋白のウィルス核酸を評価する方法があれば、それによって、本発明の教示を
利用して、抗レトロウィルス治療をモニター、および・または、修飾することが
可能となろう。本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（エファビ
レンツ）で治療された患者（単数または複数）において、ＨＩＶ逆転写酵素のコ
ドン２２５における突然変異単独、または、コドン１０３における突然変異との
併合に関する発見に基づく。すなわち、そのような患者においては、上記突然変
異の存在が、デラビルジン感受性の上昇とは相関するが、ネビラピン感受性とは
ほとんど、あるいは、全く相関しない。この突然変異は、治療開始のある期間後
、血漿ＨＩＶ ＲＮＡにおいて見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン１０３におけ
る突然変異に加えてさらにコドン２２５にも突然変異の出現することは、耐性の
発達、および、最終的に免疫学的衰退進行のインディケーターであることが判明
した。本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）で治
療された患者において、ＲＴのコドン２３６における突然変異に関する発見に基
づく。すなわち、そのような患者においては、上記突然変異の存在が、デラビル
ジンに対する感受性の低下とは相関するが、ネビラピン感受性の低下とは全く相
関しない。ＨＩＶ ＲＴのコドン１９０と１０３、および・または、１０１にお
ける突然変異の発生は、従来、ウイルス学的失敗と、その後の免疫学的衰退と関
連づけられてきた、表現型感受性・耐性変化進行のインディケーターとなること
が判明した。本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（エファビレ
ンツ）で治療された患者（単数または複数）において、ＨＩＶ逆転写酵素のコド
ン１９０における突然変異単独、または、コドン１０３、および・または、１０
１における突然変異との併合に関する発見に基づく。すなわち、そのような患者
においては、上記突然変異の存在は、デラビルジン感受性の上昇、および、ネビ
ラピン感受性の低下と相関する。これらの突然変異は、ＮＮＲＴＩ治療の開始あ
る期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン２３６と
１０３、および・または１８１における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、
および、その後の免疫学的衰退と関連する、表現型における感受性・耐性変化進
行のインディケーターとなることが判明した。
【００１６】 本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ネビラピン）で治療さ
れた患者（単数または複数）において、ＨＩＶ逆転写酵素の、コドン２３０にお
ける突然変異単独、または、コドン１８１における突然変異との併合に関する発
見に基づく。すなわち、そのような患者においては、上記突然変異の存在が、デ
ラビルジンおよびネビラピン感受性の有意な低下と相関する。これらの突然変異
は、ＮＮＲＴＩ治療開始ある期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン２３０と１８１における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗
、および、その後の免疫学的衰退と関連する、表現型における感受性・耐性変化
進行のインディケーターとなることが判明した。本発明の一部は、非ヌクレオシ
ド系逆転写酵素阻害剤（ネビラピン）で治療された患者（単数または複数）にお
いて、ＨＩＶ逆転写酵素のコドン１８１における突然変異に関する発見に基づく
。すなわち、そのような患者においては、上記突然変異の存在が、デラビルジン
感受性の中等度の低下、および、ネビラピン感受性の有意な低下と相関しており
、エファビレンツ感受性の変化とは相関しない。この突然変異は、ＮＮＲＴＩ治
療開始ある期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン
１８１における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、および、その後の免疫学
的衰退と関連する、表現型における感受性・耐性変化進行のインディケーターと
なることが判明した。本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（エ
ファビレンツ）で治療された患者（単数または複数）において、ＨＩＶ逆転写酵
素のコドン１８８における突然変異に関する発見に基づく。すなわち、そのよう
な患者においては、上記突然変異の存在が、デラビルジン感受性の僅かな低下、
および、ネビラピン感受性の実質的な低下と相関する。この突然変異は、ＮＮＲ
ＴＩ治療開始ある期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴの
コドン１８８における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、および、その後の
免疫学的衰退と関連する、表現型における感受性・耐性変化進行のインディケー
ターとなることが判明した。本発明の一部は、報告ではそれ以前に非ヌクレオシ
ド系逆転写酵素阻害剤に暴露されたことのない患者（単数または複数）における
、ＨＩＶ逆転写酵素のコドン１８８の突然変異に関する発見に基づく。すなわち
、そのような患者においては、上記突然変異の存在が、デラビルジン感受性の中
等度の低下、ネビラピン感受性の実質的な低下、および、エファビレンツ感受性
の中等度の低下と相関する。この突然変異は、抗レトロウィルス治療開始ある期
間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン１３８と１８
８における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、および、その後の免疫学的衰
退と関連する、表現型における感受性・耐性変化進行のインディケーターとなる
ことが判明した。本発明の一部は、報告ではそれ以前に非ヌクレオシド系逆転写
酵素阻害剤に暴露されたことのない患者（単数または複数）における、ＨＩＶ逆
転写酵素のコドン９８の突然変異に関する発見に基づく。すなわち、そのような
患者においては、上記突然変異の存在が、デラビルジン、ネビラピン、および、
エファビレンツ感受性の僅かな低下と相関する。この突然変異は、抗レトロウィ
ルス治療開始ある期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴの
コドン９８における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、および、その後の免
疫学的衰退と関連する、表現型における感受性・耐性変化進行のインディケータ
ーとなることが判明した。
【００１７】 本発明の一部は、その人々について抗レトロウイルス剤投与治療が未知である
患者（単数または複数）において、ＨＩＶ逆転写酵素の、コドン９８における突
然変異単独、または、コドン１９０における突然変異との併合に関する発見に基
づく。すなわち、そのような患者においては、上記突然変異の存在が、デラビル
ジン感受性の上昇、および、その後の、ネビラピンとエファビレンツ両方の感受
性の実質的低下と相関する。これらの突然変異は血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出され
た。ＨＩＶ ＲＴのコドン１９０における突然変異に加えて、さらにコドン９８
における突然変異の出現は、耐性および、最終的には、免疫学的衰退進行のイン
ディケーターとなることが判明した。本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写
酵素阻害剤（デラビルジン）投与治療を受けた患者（単数または複数）において
、ＨＩＶ逆転写酵素の、コドン１８１における突然変異単独、または、コドン９
８における突然変異との併合に関する発見に基づく。すなわち、そのような患者
においては、上記突然変異の存在が、デラビルジン感受性の有意な低下、および
、エファビレンズ感受性の実質的低下と相関する。これらの突然変異は、治療開
始ある期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン１８
１における突然変異に加えて、さらにコドン９８における突然変異の出現は、耐
性、および、最終的には、免疫学的衰退進行のインディケーターとなることが判
明した。本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（エファビレンツ
）投与治療を受けた患者（単数または複数）において、ＨＩＶ逆転写酵素の、コ
ドン１０１における突然変異単独、または、コドン１９０、例えば、コドン１９
０ｓにおける突然変異との併合に関する発見に基づく。すなわち、そのような患
者においては、上記突然変異の存在が、デラビルジン感受性の無変化、および、
ネビラピンとエファビレンツ感受性の実質的低下と相関する。これらの突然変異
は、治療開始ある期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴの
コドン１９０、例えば、１９０ｓにおける突然変異に加えて、さらにコドン１０
１における突然変異の出現は、耐性、および、最終的には、免疫学的衰退進行の
インディケーターとなることが判明した。本発明の一部は、報告ではそれ以前に
非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤に暴露されたことのない患者（単数または複
数）における、ＨＩＶ逆転写酵素のコドン１０８の突然変異に関する発見に基づ
く。すなわち、そのような患者においては、上記突然変異の存在が、デラビルジ
ン感受性の無変化、ネビラピン感受性の僅かな低下、および、エファビレンツ感
受性の無変化と相関する。この突然変異は、抗レトロウィルス剤投与治療開始あ
る期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン１０８に
おける突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、および、その後の免疫学的衰退と
関連する、表現型における感受性・耐性進行のインディケーターとなることが判
明した。
【００１８】 本発明の一部は、報告ではそれ以前に非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤に暴
露されたことのない患者（単数または複数）における、ＨＩＶ逆転写酵素のコド
ン１０１の突然変異単独、または、コドン１０３および・またはコドン１９０に
おける突然変異との併合に関する発見に基づく。すなわち、そのような患者にお
いては、上記突然変異の存在が、デラビルジン、ネビラピン、および、エファビ
レンツ感受性の変化と相関する。特に、１０１および１９０、特に１９０Ａにお
ける突然変異の存在は、デラビルジン感受性の無変化、ネビラピン感受性の実質
的な低下、および、エファビレンツ感受性の有意な低下と相関する。１０３およ
び１９０における突然変異の存在は、デラルビジン感受性の中等度の低下、ネビ
ラピン感受性の実質的な低下、および、エファビレンツ感受性の有意な低下と相
関する。この突然変異は、抗レトロウィルス剤投与治療開始ある期間後に、血漿
ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン１０１と１０３、および・
または、１９０における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、および、その後
の免疫学的衰退と関連する、表現型における感受性・耐性変化進行のインディケ
ーターとなることが判明した。本発明の一部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻
害剤（ネビラピン）投与治療を受けた患者（単数または複数）における、ＨＩＶ
逆転写酵素のコドン１０６の突然変異単独、または、コドン１８９および・また
は１８１および２２７における突然変異との併合に関する発見に基づく。すなわ
ち、そのような患者においては、上記突然変異の存在が、デラビルジン、ネビラ
ピン、および、エファビレンツ感受性の変化と相関する。特に、１０６と１８１
における突然変異の存在は、デラビルジン感受性の有意な低下、ネビラジン感受
性の実質的な低下、および、エファビレンツ感受性の僅かな低下と相関する。１
０６および１８９における突然変異の存在は、デラビルジン感受性の僅かな低下
、ネビラピン感受性の中等度の低下、および、エファビレンツ感受性の無変化と
相関する。１０６と２２７における突然変異の存在は、デラビルジン感受性の僅
かな低下、ネビラピン感受性の実質的な低下、および、エファビレンツ感受性の
僅かな低下と相関する。１８１および２２７における突然変異の存在は、デラビ
ルジン感受性の上昇、ネビラピン感受性の有意な低下、および、エファビレンツ
感受性の上昇と相関する。１０６、１８１および２２７における突然変異の存在
は、デラビルジン感受性の中等度の低下、ネビラピン感受性の実質的な低下、お
よび、エファビレンツ感受性の僅かな低下と相関する。この突然変異は、ＮＮＲ
ＴＩ治療開始ある期間後に、血漿ＨＩＶ ＲＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴの
コドン１０６と１８９および・または１８１と２２７における突然変異の出現は
、ウイルス学的失敗、および、その後の免疫学的衰退と関連する、表現型におけ
る感受性・耐性変化進行のインディケーターとなることが判明した。本発明の一
部は、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ネビラピン）投与治療を受けた患者
（単数または複数）における、ＨＩＶ逆転写酵素のコドン１０３の突然変異単独
、または、コドン１００および・またはコドン１８８における突然変異との併合
関する発見に基づく。すなわち、そのような患者においては、上記突然変異の存
在が、デラビルジン、ネビラピン、および、エファビレンツ感受性における変化
と相関する。特に、１０３と１８８における突然変異の存在は、デラビルジン感
受性の実質的な低下、ネビラピン感受性の実質的な低下、および、エファビレン
ツ感受性の実質的な低下と相関する。１００および１０３における突然変異の存
在は、デラビルジン感受性の実質的な低下、ネビラピン感受性の中等度の低下、
および、エファビレンツ感受性の実質的な低下と相関する。１０３、１００およ
び１８８における突然変異の存在は、デラビルジン感受性の実質的な低下、ネビ
ラピン感受性の実質的な低下、および、エファビレンツ感受性の実質的な低下と
相関する。この突然変異は、ＮＮＲＴＩ治療開始ある期間後に、血漿ＨＩＶ Ｒ
ＮＡに見出された。ＨＩＶ ＲＴのコドン１０３と１００、および・または、１
８８における突然変異の出現は、ウイルス学的失敗、および、その後の免疫学的
衰退と関連する、表現型における感受性・耐性変化進行のインディケーターとな
ることが判明した。
【００１９】 本発明のもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む、ＰＣ
Ｒ準拠定量法を用いて、ＨＩＶ ＲＴコドン２２５における突然変異を、コドン
１０３を含むその他のコドンにおける突然変異と併合させて検出することが可能
である。これらの突然変異は、抗レトロウィルス治療に対するある特定パターン
の耐性、および、その後の免疫学的衰退と相関する。本発明のさらにもう一つの
実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む、ＰＣＲ準拠定量法を用いて
、ＨＩＶ ＲＴのコドン２３６における突然変異単独、あるいは、コドン１０３
および・または１８１を含むその他のコドンにおける突然変異を併合させて検出
することが可能である。これらの突然変異は、抗レトロウィルス治療に対する耐
性および免疫学的衰退と相関する。本発明のさらにもう一つの実施態様において
は、表現型・遺伝型定量法を含む、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、ＨＩＶ ＲＴの
コドン１９０（Ｇ１９０Ｓ）における突然変異単独、あるいは、コドン１０１（
Ｋ１０１Ｅ）における突然変異を併合させて検出することが可能である。これら
の突然変異は、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学的衰退と相関す
る。
【００２０】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１９０（Ｇ１９０Ａ）における突然変
異単独、あるいは、コドン１０３（Ｋ１０３Ｎ）における突然変異と併合させて
検出することが可能である。
【００２１】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン２３０における突然変異単独、あるい
は、コドン１８１における突然変異と併合させて検出することが可能である。
【００２２】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１８１における突然変異を検出するこ
とが可能である。
【００２３】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１８８における突然変異を検出するこ
とが可能である。
【００２４】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１３８における突然変異単独、あるい
は、コドン１８８における突然変異と併合させて検出することが可能である。
【００２５】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン９８における突然変異を検出すること
が可能である。
【００２６】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン９８における突然変異単独、あるいは
、コドン１９０における突然変異と併合させて検出することが可能である。
【００２７】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１８１における突然変異単独、あるい
は、コドン９８における突然変異と併合させて検出することが可能である。
【００２８】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０１における突然変異単独、あるい
は、コドン１９０、例えば、１９０ｓにおける突然変異と併合させて検出するこ
とが可能である。
【００２９】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０８における突然変異を検出するこ
とが可能である。
【００３０】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０１における突然変異単独、あるい
は、コドン１０３および・または１９０における突然変異と併合させて検出する
ことが可能である。
【００３１】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０６における突然変異単独、あるい
は、コドン１８９、および・または、１８１と２２７における突然変異と併合さ
せて検出することが可能である。
【００３２】 本発明のさらにもう一つの実施態様においては、表現型・遺伝型定量法を含む
、ＰＣＲ準拠定量法を用いて、抗レトロウィルス治療に対する耐性および免疫学
的衰退と相関する、ＨＩＶ ＲＴのコドン１８８における突然変異単独、あるい
は、コドン１００、および・または、１０３における突然変異と併合させて検出
することが可能である。一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている患
者において、コドン２２５と１０３に突然変異が検出されたならば、治療処方の
変更を考慮しなければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治
療を受けている患者において、コドン２３６および・または１０３および・また
は１８１に突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮しなければなら
ない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている患者におい
て、コドン１９０および・または１０３、および・または１０１に突然変異が検
出されたならば、治療処方の変更を考慮しなければならない。同様に、一旦、Ｎ
ＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている患者において、コドン２３０および
・または１８１に突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮しなけれ
ばならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている患者
において、コドン１８１に突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮
しなければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けて
いる患者において、コドン１８８に突然変異が検出されたならば、治療処方の変
更を考慮しなければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療
を受けている患者において、コドン１３８および・または１８８に突然変異が検
出されたならば、治療処方の変更を考慮しなければならない。同様に、一旦、Ｎ
ＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている患者において、コドン９８に突然変
異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮しなければならない。同様に、一
旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている患者において、コドン９８お
よび・または１９０に突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮しな
ければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている
患者において、コドン１８１および・または９８に突然変異が検出されたならば
、治療処方の変更を考慮しなければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レト
ロウィルス治療を受けている患者において、コドン１０１および・または１９０
、例えば、１９０Ｓに突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮しな
ければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている
患者において、コドン１０８に突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を
考慮しなければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受
けている患者において、コドン１０１および・または１０３および・または１９
０、例えば、１９０Ａに突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮し
なければならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けてい
る患者において、コドン１０６および・または１８９および・または１８１およ
び・または２２７に突然変異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮しなけ
ればならない。同様に、一旦、ＮＮＲＴＩ抗レトロウィルス治療を受けている患
者において、コドン１８８および・または１００および・または１０３に突然変
異が検出されたならば、治療処方の変更を考慮しなければならない。ＰＣＲ準拠
定量法による抗レトロウィルス治療の評価の後で、治療処方の修正を実行すべき
タイミングは、患者のウィルス負荷、ＣＤ４カウント数、および、それまでの治
療経過を含むいくつかの因子に依存してもよい。
【００３３】 本発明のもう一つの局面においては、非ヌクレオシド系逆転写酵素性抗レトロ
ウィルス剤の有効性を評価するための方法が供給される。この方法は下記の工程
を含む、すなわち、（ａ） 患者由来の分節と、インディケーター遺伝子とを含
む耐性テストベクターを宿主細胞に導入する工程、（ｂ） 工程（ａ）で得られ
た宿主細胞を培養する工程、（ｃ） 標的宿主細胞におけるインディケーター遺
伝子の発現を測定する工程であって、ここに、同インディケーター遺伝子の発現
は、患者由来分節に依存することを特徴とする工程、および、（ｄ） 工程（ｃ
）由来のインディケーター遺伝子の発現を、工程（ａ） − （ｃ）をＮＮＲＴ
Ｉ抗ＨＩＶ剤不在下に実行した場合に測定されたインディケーター遺伝子の発現
と比較する工程、ここに、ＮＮＲＴＩ抗ＨＩＶ剤の試験濃度は、工程（ａ） −
（ｃ）、工程（ｂ） − （ｃ）、または、工程（ｃ）において示されること
を特徴とする工程、である。
【００３４】 本発明はさらに、患者における非ヌクレオシド系逆転写酵素性抗レトロウィル
ス剤の有効性を評価するための方法を供給する。この方法は下記の工程を含む、
すなわち、（ａ） あるＮＮＲＴＩ抗ＨＩＶ剤に対する薬剤耐性を表わす標準曲
線を描出する工程、（ｂ） 前記感受性試験を用いて、同患者におけるＮＮＲＴ
Ｉ抗ＨＩＶ薬剤感受性を定量する工程、および、（ｃ） 工程（ｂ）におけるＮ
ＮＲＴＩ抗ＨＩＶ薬剤感受性を、工程（ａ）で求めた標準曲線と比較する工程で
あって、ここに、ＮＮＲＴＩ抗ＨＩＶ感受性の低下は、同患者における抗ＨＩＶ
薬剤耐性の発達を示すことを特徴とする工程、である。
【００３５】 本発明はさらに、ＨＩＶ抗レトロウィルス候補剤の生物学的有効性を評価する
ための方法を供給する。この方法は下記の工程を含む、すなわち、（ａ） 患者
由来の分節と、インディケーター遺伝子とを含む耐性テストベクターを宿主細胞
に導入する工程、（ｂ） 工程（ａ）で得られた宿主細胞を培養する工程、（ｃ
） 標的宿主細胞におけるインディケーター遺伝子の発現を測定する工程であっ
て、ここに、同インディケーター遺伝子の発現は、患者由来分節に依存すること
を特徴とする工程、および、（ｄ） 工程（ｃ）由来のインディケーター遺伝子
の発現を、工程（ａ） − （ｃ）を抗ウィルス候補剤不在下に実行した場合に
測定されたインディケーター遺伝子の発現と比較する工程、ここに、抗ウィルス
候補剤化合物の試験濃度は、工程（ａ） − （ｃ）、工程（ｂ） − （ｃ）
、または、工程（ｃ）に存在することを特徴とする工程、である。
【００３６】 標的細胞における耐性テストベクターのインディケーター遺伝子の発現は、最
終的に、患者由来の分節配列の活性に依存する。このインディケーター遺伝子は
、機能的であってもよいし、非機能的であってもよい。
【００３７】 また別の局面においては、本発明は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対する、抗レトロウ
ィルス剤感受性・耐性テストに向けられる。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ用抗レトロウィル
ス剤感受性・耐性テストに使用される、本発明の、特異的耐性テストベクターが
特定される。
【００３８】 さらに別の局面においては、本発明は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療のための、抗レ
トロウィルス剤候補化合物の特定と、それらの生物学的有効性の評価を供給する
。また別の局面では、本発明は、さらにＲＴ遺伝子とインディケーター遺伝子に
おける１個以上の突然変異を含む、患者由来分節を備える、新規の耐性テストベ
クターに向けられる。
【００３９】
【発明の詳細な記述】
本発明は、抗レトロウイルス治療（特に、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤
による抗レトロウイルス治療）を受けている患者におけるＨＩＶ感染の臨床的進
行をモニターする方法に関する。
【００４０】 １つの実施形態において、本発明は、患者の抗レトロウイルス治療の有効性を
評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること
；および（ｉｉ）この生体サンプルが、ＲＴ内の１つまたは複数の位置における
変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明らかにすること
を含む方法を提供する。その変異（１つまたは複数）は、表現型感受性／耐性に
おける変化との正の相関を有する。
【００４１】 特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス治療
の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採
取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン２２５およびコドン１
０３における変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明ら
かにすることを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性アッセイを使
用して、コドン２２５における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆転写酵素のコ
ドン１０３における変異との組合せで、デラビルジン感受性の低下、ネビラピン
感受性の変化がほとんどないこと、およびエファビレンツ感受性の変化がほとん
どないことと相関していることが立証された。
【００４２】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン２３６およびコド
ン１０３および／またはコドン１８１における変異を有するＨＩＶのＲＴをコー
ドする核酸を含むかどうかを明らかにすることを含む方法を提供する。本発明に
より、表現型感受性アッセイを使用して、コドン２３６における変異は、単独で
、あるいはＨＩＶ逆転写酵素のコドン１０３および／またはコドン１８１におけ
る変異との組合せで、デラビルジン感受性の低下（増大した耐性）、およびネビ
ラピン感受性の無変化と相関していることが立証された。２３６位の変異は、単
独で、あるいはＹ１８１Ｃの背景のもとで、エファビレンツ感受性に対する作用
を有していないが、１０３Ｎの変異により引き起こされる感受性喪失のかなりの
部分を回復させる。
【００４３】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン２３０および／ま
たはコドン１８１における変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むか
どうかを明らかにすることを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性
アッセイを使用して、コドン２３０における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆
転写酵素のコドン１８１における変異との組合せで、デラビルジン感受性の著し
い低下（増大した耐性）、ネビラピン感受性の著しい低下と相関していることが
立証された。
【００４４】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン１８１における変
異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明らかにすることを
含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩＶ
逆転写酵素のコドン１８１における変異は、デラビルジン感受性の中程度の低下
（増大した耐性）、ネビラピン感受性の著しい低下、およびエファビレンツ感受
性の無変化と相関していることが立証された。
【００４５】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン１８８における変
異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明らかにすることを
含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩＶ
逆転写酵素のコドン１８８における変異は、デラビルジン感受性のわずかな低下
（増大した耐性）、ネビラピン感受性の実質的な低下、およびエファビレンツ感
受性の著しい低下と相関していることが立証された。
【００４６】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン１３８および／ま
たはコドン１８８における変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むか
どうかを明らかにすることを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性
アッセイを使用して、コドン１３８における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆
転写酵素のコドン１８８における変異との組合せで、デラビルジン感受性の中程
度の低下（増大した耐性）、ネビラピン感受性の実質的な低下、およびエファビ
レンツ感受性の中程度の低下と相関していることが立証された。
【００４７】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン９８における変異
を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明らかにすることを含
む方法を提供する。本発明により、表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩＶ逆
転写酵素のコドン９８における変異は、デラビルジン感受性のわずかな低下（増
大した耐性）、ネビラピン感受性のわずかな低下、およびエファビレンツ感受性
のわずかな低下と相関していることが立証された。
【００４８】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン９８および／また
はコドン１９０における変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかど
うかを明らかにすることを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性ア
ッセイを使用して、コドン９８における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆転写
酵素のコドン１９０における変異との組合せで、デラビルジン感受性の増大（低
下した耐性）、ネビラピン感受性の実質的な低下、およびエファビレンツ感受性
の実質的な低下と相関していることが立証された。他の特定の実施形態において
、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス治療の有効性を評価する方法で
あって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；および（ｉｉ
）この生体サンプルが、コドン１８１および／またはコドン９８における変異を
有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明らかにすることを含む
方法を提供する。本発明により、表現型感受性アッセイを使用して、コドン１８
１における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆転写酵素のコドン９８における変
異との組合せで、デラビルジン感受性の著しい低下（増大した耐性）、ネビラピ
ン感受性の実質的な低下、およびエファビレンツ感受性のわずかな低下と相関し
ていることが立証された。他の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮ
ＲＴＩ抗レトロウイルス治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感
染患者から生体サンプルを採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、
コドン１０１における変異および／またはコドン１９０における変異、例えば、
１９０Ｓを有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明らかにする
ことを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性アッセイを使用して、
コドン１０１における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆転写酵素のコドン１９
０における変異との組合せで、デラビルジン感受性の無変化（野生型）、ネビラ
ピン感受性の実質的な低下、およびエファビレンツ感受性の実質的な低下と相関
していることが立証された。他の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮ
ＮＲＴＩ抗レトロウイルス治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ
感染患者から生体サンプルを採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが
、コドン１０８における変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかど
うかを明らかにすることを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性ア
ッセイを使用して、ＨＩＶ逆転写酵素のコドン１０８における変異は、デラビル
ジン感受性の無変化（野生型）、ネビラピン感受性のわずかな低下、およびエフ
ァビレンツ感受性の無変化と相関していることが立証された。別の特定の実施形
態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス治療の有効性を評価
する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；お
よび（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン１０１およびコドン１０３および／ま
たはコドン１９０における変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むか
どうかを明らかにすることを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性
アッセイを使用して、コドン１０１における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆
転写酵素のコドン１０３および／またはコドン１９０における変異との組合せで
、デラビルジン感受性の無変化（１０１および１９０）または中程度の低下（１
０３および１９０、例えば、１９０Ａ）（増大した耐性）のいずれか、ネビラピ
ン感受性の実質的な低下、およびエファビレンツ感受性の著しい低下と相関して
いることが立証された。
【００４９】 別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス
治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプル
を採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン１０６および／ま
たはコドン１８９および／またはコドン１８１および／またはコドン２２７にお
ける変異を有するＨＩＶのＲＴをコードする核酸を含むかどうかを明らかにする
ことを含む方法を提供する。本発明により、表現型感受性アッセイを使用して、
コドン１０６における変異は、単独で、あるいはＨＩＶ逆転写酵素のコドン１８
９および／またはコドン１８１および／またはコドン２２７における変異との組
合せで、デラビルジン感受性、ネビラピン感受性およびエファビレンツ感受性の
低下と相関していることが立証された。詳細には、１０６位および１８１位にお
ける変異の存在は、デラビルジン感受性の著しい低下、ネビラピン感受性の実質
的な低下、およびエファビレンツ感受性のわずかな低下と相関している。１０６
位および１８９位における変異の存在は、デラビルジン感受性のわずかな低下、
ネビラピン感受性の中程度の低下、およびエファビレンツ感受性の無変化と相関
している。１０６位および２２７位における変異の存在は、デラビルジン感受性
のわずかな低下、ネビラピン感受性の実質的な低下、およびエファビレンツ感受
性のわずかな低下と相関している。１８１位および２２７位における変異の存在
は、デラビルジン感受性の増大、ネビラピン感受性の著しい低下、およびエファ
ビレンツ感受性の増大と相関している。１０６位および１８１位および２２７位
における変異の存在は、デラビルジン感受性の中程度の低下、ネビラピン感受性
の実質的な低下、およびエファビレンツ感受性のわずかな低下と相関している。
別の特定の実施形態において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス治
療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを
採取すること；および（ｉｉ）この生体サンプルが、コドン１８８およびコドン
１００および／またはコドン１０３における変異を有するＨＩＶのＲＴをコード
する核酸を含むかどうかを明らかにすることを含む方法を提供する。本発明によ
り、表現型感受性アッセイを使用して、コドン１８８における変異は、単独で、
あるいはＨＩＶ逆転写酵素のコドン１００および／またはコドン１０３における
変異との組合せで、デラビルジン感受性、ネビラピン感受性およびエファビレン
ツ感受性の変化と相関していることが立証された。詳細には、１０３位および１
８８位における変異の存在は、デラビルジン感受性の実質的な低下、ネビラピン
感受性の実質的な低下、およびエファビレンツ感受性の実質的な低下と相関して
いる。１００位および１０３位における変異の存在は、デラビルジン感受性の実
質的な低下、ネビラピン感受性の中程度の低下、およびエファビレンツ感受性の
実質的な低下と相関している。１０３位および１００位および１８８位における
変異の存在は、デラビルジン感受性の実質的な低下、ネビラピン感受性の実質的
な低下、およびエファビレンツ感受性の実質的な低下と相関している。前記の状
況のもとにおいて、患者に感染しているＨＩＶウイルスの表現型感受性／耐性プ
ロファイルおよび遺伝子型プロファイルは、抗レトロウイルス剤に対する応答の
何らかの変化を反映して変化している。ＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス治療の場合
、患者に感染しているＨＩＶウイルスは、本明細書中に記載されているＮＮＲＴ
Ｉの１つまたは複数に対して耐性であり得るが、別のＮＮＲＴＩに対しては耐性
でないことがある。従って、変異を検出した後、抗レトロウイルス剤の投与量を
増大させること、あるいは別の抗レトロウイルス剤に変えること、あるいは１つ
または複数のさらなる抗レトロウイルス剤を患者の治療計画に加えることのいず
れかが望ましいと考えられる。例えば、患者がエファビレンツ（ＤＭＰ−２６６
）で処置されている場合、２２５位における変異が生じたとき、患者の治療計画
は、望ましくは、（ｉ）デラビルジンまたはネビラピンなどの異なるＮＮＲＴＩ
抗レトロウイルス剤に変えて、エファビレンツ処置を止めること；あるいは（ｉ
ｉ）エファビレンツの投与量を増大させること；あるいは（ｉｉｉ）別の抗レト
ロウイルス剤を患者の治療計画に加えることのいずれかによって変更され得る。
治療における改変の有効性は、ＨＩＶのＲＮＡコピー数などによりウイルス量を
モニターすることによって評価することができる。ＨＩＶのＲＮＡコピー数の減
少は、処置計画の有効性との正の相関を有する。
【００５０】 本明細書中で使用されている語句「正の相関を有する」とは、特定の結果によ
って、特定の結論が他の結論よりも起こりやすくなることを示す。
【００５１】 本発明の別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者のＮＮＲ
ＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生体サン
プルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列を、Ｒ
Ｔ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅すること
によって生体サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ）野生
型または２２５位および１０３位における変異コドンを含むＰＣＲ産物をもたら
すプライマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して
、コドン２２５またはコドン１０３またはその両方における変異の存在または非
存在を明らかにすることを含む方法。本発明のさらに別の好ましい非限定的な特
定の実施形態を下記に示す：患者のＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であ
って、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡ
をｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらす
ＨＩＶプライマーを使用して増幅することによって血漿サンプル中のＨＩＶコー
ドＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ）野生型あるいはコドン１０３および／また
はコドン１８１およびコドン２３６における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプ
ライマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コ
ドン２３６およびコドン１０３および／またはコドン１８１における変異の存在
または非存在を明らかにすることを含む方法。
【００５２】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン１０１における変異およびコドン１９０における変異（
Ｇ１９０Ｓ）を含むＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使用してＰＣＲを行うこ
と；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン１９０における変異（Ｇ１９０
Ｓ）およびコドン１０１における変異の存在または非存在を明らかにすることを
含む方法。
【００５３】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン１０３における変異およびコドン１９０における変異（
Ｇ１９０Ａ）を含むＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使用してＰＣＲを行うこ
と；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン１９０における変異（Ｇ１９０
Ａ）およびコドン１０３における変異を存在または非存在を明らかにすることを
含む方法。本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す
：患者のＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患
者から血漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、Ｈ
ＩＶ配列を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用し
て増幅することによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；
（ｉｉｉ）野生型あるいはコドン２３０およびコドン１８１における変異を含む
ＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）
ＰＣＲ産物を介して、コドン２３０およびコドン１８１における変異を存在また
は非存在を明らかにすることを含む方法。
【００５４】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン１８１における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプライ
マーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン
１８１における変異の存在または非存在を明らかにすることを含む方法。本発明
のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者のＮＮＲＴ
Ｉ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血漿サンプ
ルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列を、ＲＴ
遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅することに
よって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ）野生型
あるいはコドン１８８における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使
用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン１８８に
おける変異の存在または非存在を明らかにすることを含む方法。本発明のさらに
別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者のＮＮＲＴＩ治療の
有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血漿サンプルを採取
すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列を、ＲＴ遺伝子を
含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅することによって血
漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ）野生型あるいは
コドン１３８およびコドン１８８における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプラ
イマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コド
ン１３８およびコドン１８８における変異の存在または非存在を明らかにするこ
とを含む方法。
【００５５】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン９８における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプライマ
ーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン９
８における変異の存在または非存在を明らかにすることを含む方法。本発明のさ
らに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者のＮＮＲＴＩ治
療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血漿サンプルを
採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列を、ＲＴ遺伝
子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅することによっ
て血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ）野生型ある
いはコドン９８およびコドン１９０における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプ
ライマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コ
ドン１９０およびコドン９８における変異の存在または非存在を明らかにするこ
とを含む方法。本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に
示す：患者のＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感
染患者から血漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して
、ＨＩＶ配列を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使
用して増幅することによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅するこ
と；（ｉｉｉ）野生型あるいはコドン９８およびコドン１８１における変異を含
むＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ
）ＰＣＲ産物を介して、コドン９８およびコドン１８１における変異の存在また
は非存在を明らかにすることを含む方法。
【００５６】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン１０１およびコドン１９０における変異を含むＰＣＲ産
物をもたらすプライマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産
物を介して、コドン１９０における変異、例えば、１９０Ｓおよびコドン１０１
における変異の存在または非存在を明らかにすることを含む方法。
【００５７】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン１０８における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプライ
マーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン
１０８における変異の存在または非存在を明らかにすることを含む方法。本発明
のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者のＮＮＲＴ
Ｉ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血漿サンプ
ルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列を、ＲＴ
遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅することに
よって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ）野生型
あるいはコドン１０１およびコドン１０３およびコドン１９０における変異を含
むＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使用してＰＣＲを行うこと；および（ｉｖ
）ＰＣＲ産物を介して、コドン１０８およびコドン１０３およびコドン１９０に
おける変異、例えば、１９０Ａの存在または非存在を明らかにすることを含む方
法。
【００５８】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン１０６およびコドン１８９およびコドン１８１およびコ
ドン２２７における変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使用してＰＣ
Ｒを行うこと；および（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン１０６およびコドン
１８９およびコドン１８１およびコドン２２７における変異の存在または非存在
を明らかにすることを含む方法。
【００５９】 本発明のさらに別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：患者の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から血
漿サンプルを採取すること；（ｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＨＩＶ配列
を、ＲＴ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらすＨＩＶプライマーを使用して増幅す
ることによって血漿サンプル中のＨＩＶコードＲＮＡを増幅すること；（ｉｉｉ
）野生型あるいはコドン１８８およびコドン１００およびコドン１０３における
変異を含むＰＣＲ産物をもたらすプライマーを使用してＰＣＲを行うこと；およ
び（ｉｖ）ＰＣＲ産物を介して、コドン１８８およびコドン１００およびコドン
１０３における変異の存在または非存在を明らかにすることを含む方法。ＨＩＶ
ＲＴのコドン２２５およびコドン１０３における変異の存在は、現在または将
来のＮＮＲＴＩ治療の有効性を変更する必要があり得ることを示している。なぜ
なら、本発明によって示されているように、コドン１０３における変異は感受性
を低下させ、その感受性はコドン２２５における変異により部分的に回復され得
るからである。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ治療における変化が示され
る。同様に、本発明の手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン２３６
およびコドン１０３および／またはコドン１８１における変異の存在は、現在ま
たは将来のＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している。同様に
、本発明の手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１９０における変
異（Ｇ１９０Ａ）およびコドン１０３における変異（Ｋ１０３Ｎ）の存在は、現
在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している。同
様に、本発明の手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１９０におけ
る変異（Ｇ１９０Ｓ）およびコドン１０１における変異（Ｋ１０１Ｅ）の存在は
、現在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している
。同様に、本発明の手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン２３０お
よびコドン１８１における変異の存在は、現在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有
効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の手段および方法を使
用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１８１における変異の存在は、現在または将来の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の
手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１８８における変異の存在は
、現在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している
。同様に、本発明の手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１３８お
よびコドン１８８における変異の存在は、現在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有
効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の手段および方法を使
用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン９８における変異の存在は、現在または将来のＮ
ＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の手
段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン９８およびコドン１９０におけ
る変異の存在は、現在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれているこ
とを示している。同様に、本発明の手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴの
コドン１８１および９８における変異の存在は、現在または将来のＮＮＲＴＩ治
療の有効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の手段および方
法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０１における変異およびコドン１９０に
おける変異、例えば、１９０Ｓの存在は、現在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有
効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の手段および方法を使
用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０８における変異の存在は、現在または将来の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の
手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０１およびコドン１０３お
よびコドン１９０における変異、例えば、１９０Ａの存在は、現在または将来の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の
手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０６およびコドン１８９お
よびコドン１８１およびコドン２２７における変異の存在は、現在または将来の
ＮＮＲＴＩ治療の有効性が損なわれていることを示している。同様に、本発明の
手段および方法を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１８８およびコドン１００お
よびコドン１０３における変異の存在は、現在または将来のＮＮＲＴＩ治療の有
効性が損なわれていることを示している。
【００６０】 本発明の別の好ましい非限定的な特定の実施形態を下記に示す：ＨＩＶ感染患
者の抗レトロウイルス治療の有効性を評価する方法であって、（ａ）ＨＩＶ感染
患者から生体サンプルを採取すること；および（ｂ）この生体サンプルが、コド
ン２３６およびコドン１０３および／またはコドン１８１における変異を有する
ＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを明らかにすることを含む方
法。表現型感受性アッセイを使用して、この３つの変異の存在はデラビルジン耐
性との正の相関を有することが認められた。表現型感受性アッセイを使用して、
この３つの変異の存在はネビラピン耐性との正の相関を有することが認められた
。別の実施形態において、ＨＩＶ ＲＴの変異したコドン２３６はロイシン（Ｌ
）をコードしている。さらなる実施形態において、逆転写酵素は、ＨＩＶ ＲＴ
のコドン２３６における変異に加えて、コドン１０３における変異、コドン１８
１における変異、またはその組合せを有する。なおさらなる実施形態において、
変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、１８１位の変異したコ
ドンはシステイン（Ｃ）をコードしている。
【００６１】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン２２５及び１０３に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン２２５単独の突然変異あるいはコドン１０３の突然変異と合わ
せてコドン２２５の突然変異が存在することは、ネビラピンの感受性には影響を
及ぼさないが、デラビルジン感受性の上昇を生じさせることが認められた。さら
にもう一つの実施形態では、突然変異コドン２２５はヒスチジンをコードし、コ
ドン２３０はロイシンをコードし、コドン１８１はシステインをコードする。
【００６２】 本発明は、ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であ
って：（ａ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生
体サンプルがコドン１８１に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核
酸を含むかどうかを調べることを含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを
使用して、コドン１８１に突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の中
等度の低下及びネビラピン感受性の著しい低下及びエファビレンツ感受性の変化
なしと正に相関することが認められた。ひとつの実施形態では、突然変異コドン
１８１はイソロイシンをコードする。
【００６３】 本発明は、ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であ
って：（ａ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生
体サンプルがコドン１８８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核
酸を含むかどうかを調べることを含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを
使用して、コドン１８８に突然変異が存在することは、デラビルジン感受性のわ
ずかな低下及びネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性の著
しい低下と正に相関することが認められた。ひとつの実施形態では、突然変異コ
ドン１８８はシステイン、ヒスチジン、あるいはロイシンをコードする。
【００６４】 本発明は、ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であ
って：（ａ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生
体サンプルがコドン１９０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核
酸を含むかどうかを調べることを含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを
使用して、コドン１９０に突然変異が存在することは、デラビルジン感受性のわ
ずかな低下及びネビラピン感受性の大きな低下と正に相関することが認められた
。ひとつの実施形態では、突然変異コドン１９０はアラニンあるいはセリンをコ
ードする。
【００６５】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン２３０及び１８１に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン２３０単独の突然変異あるいはコドン１８１の突然変異と合わ
せてコドン２３０の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の著しい低
下及びネビラピン感受性の著しい低下を生じさせることが認められた。
【００６６】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１３８及び１８８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１３８単独の突然変異あるいはコドン１８８の突然変異と合わ
せてコドン１３８の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の中等度の
低下及びネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性の中等度の
低下を生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異
コドン１３８はアラニンをコードし、コドン１８８はロイシンをコードする。
【００６７】 本発明は、ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であ
って：（ａ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生
体サンプルがコドン９８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸
を含むかどうかを調べることを含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを使
用して、コドン９８に突然変異が存在することは、デラビルジン感受性のわずか
な低下及びネビラピン感受性のわずかな低下及びエファビレンツ感受性のわずか
な低下と正に相関することが認められた。ひとつの実施形態では、突然変異コド
ン９８はグリシンをコードする。
【００６８】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン９８及び１９０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含
むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩＶ
ＲＴのコドン９８単独の突然変異あるいはコドン１９０の突然変異と合わせて
コドン９８の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の上昇及びネビラ
ピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性の実質的な低下を生じさせ
ることが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異コドン１９０は
セリンをコードし、コドン９８はグリシンをコードする。
【００６９】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１８１及び９８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含
むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩＶ
ＲＴのコドン１８１単独の突然変異あるいはコドン９８の突然変異と合わせて
コドン１８１の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の著しい低下及
びネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性のわずかな低下を
生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異コドン
９８はグリシンをコードし、コドン１８１はシステインをコードする。
【００７０】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０１及び１９０、例えば１９０Ｓに突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を
コードする核酸を含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイ
を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０１単独の突然変異あるいはコドン１９０
の突然変異と合わせてコドン１０１の突然変異が存在することは、デラビルジン
の感受性を変化させず、ネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感
受性の実質的な低下を生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態
では、突然変異コドン１９０はセリンをコードし、コドン１０１はグルタミン酸
をコードする。
【００７１】 本発明は、ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であ
って：（ａ）ＨＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生
体サンプルがコドン１０８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核
酸を含むかどうかを調べることえを含む方法を提供する。表現型感受性アッセイ
を使用して、コドン１０８に突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の
変化なし及びネビラピン感受性のわずかな低下及びエファビレンツ感受性の変化
なしと正に相関することが認められた。ひとつの実施形態では、突然変異コドン
１０８はイソロイシンをコードする。
【００７２】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０１及び１９０、例えば１９０Ａに突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を
コードする核酸を含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイ
を使用して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０１単独の突然変異あるいはコドン１９０
の突然変異と合わせてコドン１０１の突然変異が存在することは、デラビルジン
の感受性を変化させず、ネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感
受性の著しい低下を生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態で
は、突然変異コドン１９０はグリシンをコードし、コドン１０１はグルタミン酸
をコードする。
【００７３】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０３及び１９０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１０３単独の突然変異あるいはコドン１９０の突然変異と合わ
せてコドン１０３の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の中等度の
低下及びネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性の著しい低
下を生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異コ
ドン１９０はアラニンをコードし、コドン１０３はアスパラギンをコードする。
【００７４】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０６及び１８１に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１０６単独の突然変異あるいはコドン１８１の突然変異と合わ
せてコドン１０６の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の著しい低
下及びネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性の実質的な低
下を生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異コ
ドン１０６はアラニンをコードし、コドン１８１はシステインをコードする。
【００７５】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０６及び１８９に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１０６単独の突然変異あるいはコドン１８９の突然変異と合わ
せてコドン１０６の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性のわずかな
低下及びネビラピン感受性の中等度の低下を生じさせ、エファビレンツの感受性
を変化させないことが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異コ
ドン１８９はロイシンをコードし、コドン１０６はアラニンをコードする。
【００７６】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０６及び２２７に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１０６単独の突然変異あるいはコドン２２７の突然変異と合わ
せてコドン１０６の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性のわずかな
低下及びネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性のわずかな
低下を生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異
コドン２２７はロイシンをコードし、コドン１０６はアラニンをコードする。
【００７７】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１８１及び２２７に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１８１単独の突然変異あるいはコドン２２７の突然変異と合わ
せてコドン１８１の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の上昇及び
ネビラピン感受性の著しい低下及びエファビレンツ感受性の上昇を生じさせるこ
とが認められた。
【００７８】 さらにもう一つの実施形態では、突然変異コドン２２７はロイシンをコードし
、コドン１８１はシステインをコードする。
【００７９】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０６及び１８１及び２２７に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコード
する核酸を含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用
して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１０６単独の突然変異あるいはコドン１８１と２２
７の突然変異と合わせてコドン１０６の突然変異が存在することは、デラビルジ
ン感受性の中等度の低下及びエファビレンツ感受性のわずかな低下を生じさせる
ことが認められた。
【００８０】 さらにもう一つの実施形態では、突然変異コドン１０６はアラニンをコードし
、コドン１８１はシステインをコードし、コドン２２７はロイシンをコードする
。
【００８１】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１０３及び１８８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１０３単独の突然変異あるいはコドン１８８の突然変異と合わ
せてコドン１０３の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の実質的な
低下及びネビラピン感受性の実質的な低下及びエファビレンツ感受性の実質的な
低下を生じさせることが認められた。さらにもう一つの実施形態では、突然変異
コドン１８８はロイシンをコードし、コドン１０３はアスパラギンをコードする
。
【００８２】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１００及び１０３に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を
含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用して、ＨＩ
Ｖ ＲＴのコドン１００単独の突然変異あるいはコドン１０３の突然変異と合わ
せてコドン１００の突然変異が存在することは、デラビルジン感受性の実質的な
低下及びネビラピン感受性の中等度の低下及びエファビレンツ感受性の実質的な
低下を生じさせることが認められた。
【００８３】 さらにもう一つの実施形態では、突然変異コドン１００はイソロイシンをコー
ドし、コドン１０３はアスパラギンをコードする。
【００８４】 本発明のもう一つの好ましい非制限的な特定の実施形態は次の通りである：Ｈ
ＩＶ感染患者の抗レトロウイルス治療の効果を評価する方法であって：（ａ）Ｈ
ＩＶ感染患者から生体サンプルを採取すること；そして（ｂ）生体サンプルがコ
ドン１００及び１０３及び１８８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコード
する核酸を含むかどうかを調べることを含む方法。表現型感受性アッセイを使用
して、ＨＩＶ ＲＴのコドン１００単独の突然変異あるいはコドン１０３と１８
８の突然変異と合わせてコドン１００の突然変異が存在することは、デラビルジ
ン感受性の実質的な低下及びネビラピン感受性の中等度の低下及びエファビレン
ツ感受性の実質的な低下を生じさせることが認められた。
【００８５】 さらにもう一つの実施形態では、突然変異コドン１００はイソロイシンをコー
ドし、コドン１０３はアスパラギンをコードし、コドン１８８はロイシンをコー
ドする。
【００８６】 本発明はまた、薬物スクリーニングのためのＮＮＲＴＩ突然変異をさらに含む
、ＨＩＶ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用するための手段及び方法を提供す
る。より特定すると、本発明は、薬物スクリーニングのためのコドン２２５及び
１０３に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記述する
。本発明はまた、コドン２３６及び１０３および／あるいは１８１に突然変異を
有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記述する。本発明はまた、コ
ドン１９０（Ｇ１９０Ａ）及び１０３（Ｋ１０３Ｎ）に突然変異を有するＨＩＶ
逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記述する。本発明はまた、コドン１９０（
Ｇ１９０Ｓ）及び１０１（Ｋ１０１Ｅ）に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を
含む耐性試験ベクターを記述する。
【００８７】 本発明はまた、コドン２３０及び１８１に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素
を含む耐性試験ベクターを記述する。
【００８８】 本発明はまた、コドン１８１に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性
試験ベクターを記述する。
【００８９】 本発明はまた、コドン１８８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性
試験ベクターを記述する。
【００９０】 本発明はまた、コドン１３８及び１８８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素
を含む耐性試験ベクターを記述する。
【００９１】 本発明はまた、コドン９８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試
験ベクターを記述する。
【００９２】 本発明はまた、コドン９８及び１９０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を
含む耐性試験ベクターを記述する。
【００９３】 本発明はまた、コドン１８１及び９８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を
含む耐性試験ベクターを記述する。
【００９４】 本発明はまた、コドン１０１及び１９０、例えば１９０Ｓに突然変異を有する
ＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記述する。
【００９５】 本発明はまた、コドン１０８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性
試験ベクターを記述する。
【００９６】 本発明はまた、コドン１０１及び１０３および／あるいは１９０、例えば１９
０Ａに突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記述する。
【００９７】 本発明はまた、コドン１０６及び１８９および／あるいは１８１および／ある
いは２２７に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記述
する。
【００９８】 本発明はまた、コドン１８８及び１００および／あるいは１０３に突然変異を
有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記述する。
【００９９】 本発明はさらに、非ヌクレオシドＨＩＶ−１逆転写酵素阻害因子耐性突然変異
体の分離と同定のための新規ベクター、宿主細胞及び組成物、ならびに抗ウイル
ス薬物のスクリーニングを実施するためにそのようなベクター、宿主細胞及び組
成物を使用することに関する。本発明はまた、上記突然変異体を阻害する能力に
ついての候補薬物のスクリーニングに関する。
【０１００】 実施例１：耐性検査ベクターを使用した表現型薬物の感受性および耐性試験 表現型薬物の感受性および耐性試験は、参考により本明細書に組み込まれる、
１９９７年１月２９日に提出されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６
０９号に記載された手段と方法を用いて実施した。
【０１０１】 これらの実験では、ＨＩＶプロテアーゼおよび逆転写酵素コード領域に相当す
る患者由来のセグメントは、ＨＩＶ感染個体の血清に存在するウイルス性粒子か
ら単離した、ウイルス性ＲＮＡを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−
ＰＣＲ）によって増幅された患者由来セグメントか、耐性試験ベクターＤＮＡの
親クローンの部位指向変異原性によって生成された野生種ＨＩＶ−１の突然変異
体であった。ウイルスＲＮＡの単離は、標準的手順（例えば、RNAgents Total R
NA Isolation system, Promega, Madison WIまたはRNAzol, Tel-Test, Friendsw
ood, TX）を使用して行った。ＲＴ−ＰＣＲ手順は２段階に分けられた。レトロ
ウイルス逆転写酵素［例えばＭｏｌｏｎｅｙ ＭｕＬＶ逆転写酵素（Roche Mole
cular Systems, Inc., Branchburg, NJ）またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭ
Ｖ）逆転写酵素（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）］を使用して、ウ
イルスＲＮＡをｃＤＮＡ内にコピーした。そして「ロングＰＣＲ」の実施に関し
て述べられているように（Barnes, W.M., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci, USA
91,2216-2220）、ｃＤＮＡは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ［例えばＴａｑ（Ro
che Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ）、Ｔｔｈ（Roche Molecular S
ystems, Inc., Branchburg, NJ）、PrimeZyme（Thermus brockianusから単離、B
iometra, Gottingen, Germany）］または熱安定性ポリメラーゼの組合せ［例え
ば、Expand High Fidelity PCR System（Taq+Pwo），(Boehringer Mannheim. In
dianapolis, IN）またはGeneAmp XL PCR kit（Tth+Vent），（Roche Molecular
Systems,Inc.,Branchburg,NJ）］を用いて増幅した。
【０１０２】 「試験用」患者由来セグメントの増幅に使用するプライマーである、ＡｐａＩ
プライマー（ＰＤＳＡｐａ）とＡｇｅＩプライマー（ＰＤＳＡｇｅ）は、１９９
７年１月２９日に提出されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６０９号
に記載されているように、ＰＣＲ生成物の５‘末端および３’末端にそれぞれ導
入されるＡｐａＩおよびＡｇｅＩ認識部位を生じる配列を含んでいた。
【０１０３】 「試験用」患者由来セグメントを含む耐性試験ベクターは、１９９７年１月２
９日に提出されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６０９号に記載され
ているように、ウイルスＲＮＡをテンプレートとし、オリゴヌクレオチドＰＤＳ
ＡＰａ（１）およびＰＤＳＡｇｅ（２）をプライマーとして用いてＲＴ−ＰＣＲ
によって調製された１．５ｋＢの増幅ＤＮＡ生成物を使用して作成し、続いてＡ
ｐａＩおよびＡｇｅＩまたはイソシゾマーＰＩＮＡＩで消化を行った。生成した
耐性試験ベクターに相当するプラスミドＤＮＡに、所与の患者の血清内に存在す
るＨＩＶウイルス擬種の代表的サンプルが含まれるようにするために、所与の耐
性試験ベクターの構築で得られる、多数の独立Ｅ．Ｃｏｌｉ形質転換体をプール
して、プラスミドＤＮＡの調製に使用した。
【０１０４】 アンホトロピックＭｕＬＶ ４０７０Ａ ｅｎｖ遺伝子生成物をコード化する
パッケージング発現ベクターによって、耐性試験ベクターの宿主細胞内で、ヒト
標的細胞に効率的に感染可能な耐性試験ベクターウイルス粒子を生成できるよう
になる。ｅｎｖを除いたＨＩＶ遺伝子すべてをコード化する耐性試験ベクターは
、パッケージング宿主細胞のトランスフェクションに使用した（一旦トランスフ
ェクションした宿主細胞は、耐性試験ベクター宿主細胞と呼ぶ）。アンホトロピ
ックＭｕＬＶ ４０７０Ａ ｅｎｖ遺伝子生成物をコード化するパッケージング
発現ベクターは、耐性試験ベクターとともに、耐性試験ベクター宿主細胞内で伝
染性擬種耐性試験ベクターウイルス粒子を生成するのに使用する。
【０１０５】 耐性試験ベクターを用いる耐性試験は、ヒト胚腎細胞系２９３（Cell Culture
Facility,UC San Francisco,SF,CA）またはＪｕｒｋａｔ白血病Ｔ細胞系（Auth
ur Weiss,UC San Francisco,SF,CA)より成る、パッケージング宿主および標的宿
主細胞を用いて実施した。
【０１０６】 耐性試験は、２つの宿主細胞種を用いた耐性試験ベクターによって実施した。
耐性試験ベクターウイルス粒子は、パッケージング宿主細胞に耐性試験ベクター
とパッケージング発現ベクターをトランスフェクションして調製した第１宿主細
胞（耐性試験ベクター宿主細胞）によって生成された。そして、耐性試験ベクタ
ーウイルス粒子を使用して、第２宿主細胞（標的宿主細胞）に感染させ、指標細
胞の発現を測定する。
【０１０７】 機能性ルシフェラーゼ遺伝子カセットを含む耐性試験ベクターを構築し、宿主
細胞に耐性試験ベクターＤＮＡによってトランスフェクションした。耐性試験ベ
クターには、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤
およびプロ手アーザ阻害剤などの抗レトロウイルス剤に感染しやすい、あるいは
耐性のある、患者由来の逆転写酵素およびプロテアーゼ配列が含まれていた。耐
性試験ベクターＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクションすることによって生成
された耐性試験ベクターウイルス粒子は、ＮＲＴＩまたはＮＮＲＴＩなしで、あ
るいは薬物の濃度を増加させて成長させた標的宿主細胞に、プロテアーゼ阻害剤
の存在する状態、あるいは不在の状態で、感染させるために使用した。薬物の存
在下で感染させた標的宿主細胞中で生成されたルシフェラーゼ活性の量を、薬物
なしで感染させた標的宿主細胞中で生成されたルシフェラーゼの量と比較した。
薬物耐性は、薬物なしで検出されたルシフェラーゼ活性を５０％阻害するのに必
要な薬物の量として測定した（阻害濃度５０％、ＩＣ５０）。ＩＣ５０値は、薬
物阻害パーセントと薬物濃度のｌｏｇ１０をプロットして決定した。
【０１０８】 宿主細胞は、直径１０ｃｍの皿に播種し、プレーティングの数日後に耐性試験
ベクタープラスミドＤＮＡおよびエンベロープ発現ベクターによりトランスフェ
クションした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法を用いて実施
した。沈殿物を含むＤＮＡ細胞培養液は、トランスフェクション後１時間から２
４時間まで、新しい培養液と交換した。耐性試験ベクターウイルス粒子を含む細
胞培養液は、トランスフェクション後１日から４日まで収集され、０．４５ｍｍ
フィルターを通過させた後に−８０℃で保存した。収集した細胞培養液中のＨＩ
Ｖカプシドタンパク質（ｐ２４）レベルは、ＥＩＡ法で、メーカー（SIAC; Fred
erick, MD）の記載どおりに決定した。標的細胞（２９３および２９３／Ｔ）は
、感染させる前に細胞培養液中にプレーティングした。対照感染は、模擬トラン
スフェクション（ＤＮＡなし）またはエンベロープ発現プラスミドのない耐性試
験ベクタープラスミドＤＮＡを含むトランスフェクションによる細胞培養液を使
用して実施した。感染後１〜３日あるいはそれ以上後に培養液を取り除き、溶菌
緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。細胞溶菌液は、ルシフェラー
ゼ活性をアッセイした（図３）。薬物の阻害効果は、次の式を用いて決定した：
％ルシフェラーゼ阻害＝１−（ＲＬＵｌｕｃ［薬物］÷ＲＬＵｌｕｃ）×１００
ここで、ＲＬＵｌｕｃ［薬物］は、薬物存在下の感染細胞中のルシフェラーゼ活
性の相対光単位であり、ＲＬＵｌｕｃは、薬物不在時のルシフェラーゼ活性の相
対光単位である。ＩＣ５０値は、ルシフェラーゼ活性の阻害パーセントと薬物濃
度のｌｏｇ１０をプロットしてデータから得られたＳ字形曲線から求めた。
【０１０９】 薬物阻害曲線は（図３）に示す。
【０１１０】 実施例２ 相関する表現型感受性と遺伝子型分析 患者ＨＩＶサンプルの表現型感受性分析 耐性試験ベクトルは、実施例１に記載されているように作成する。耐性試験ベ
クター、すなわち耐性試験ベクタープール由来のクローンは、抗レトロウイルス
薬物のパネルに対する感受性のレベルを正確に定量的に決定するために、表現型
アッセイで試験を行う。この抗レトロウイルス薬物のパネルは、ヌクレオシド−
類似逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲ
ＴＩ）およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＲＩ）として知られるクラスのメンバーを
含んでいていもよい。新しい薬物または新しい薬物標的として利用できるように
なると、薬物のパネルを拡張できる。ＩＣ５０は、試験を行った薬物にそれぞれ
に対して、各耐性試験ベクタープールについて決定する。試験を行った薬物すべ
てに対する感受性のパターンを調査し、既知の感受性パターンと比較する。患者
のサンプルはさらに、確認された感受性パターンと相関する遺伝子型変化につい
て検査することができる。
【０１１１】 患者のＨＩＶサンプルの遺伝子型分析 プールまたはクローンの耐性試験ベクターＤＮＡは、実施例２に記載されてい
る遺伝子型法のいずれかで分析する。本発明のある実施形態において、患者のＨ
ＩＶサンプル配列は、ウイルスＲＮＡ精製、ＲＴ／ＰＣＲおよびＡＢＩ連鎖終止
自動配列決定を用いて決定する。決定される配列は、データベースに存在する対
照配列と比較するか、治療開始前に患者から得たサンプルがある場合はこれと比
較する。対照配列または予備処理配列と異なる配列の遺伝子型を検査し、確認さ
れた遺伝子型に関連付ける。
【０１１２】 部位指向突然変異体の表現型感受性分析 確認された遺伝子型変化は、薬物感受性の表現型パターンの変化と関連付け、
定義された野生種（薬物感受性）遺伝子バックグラウンドに対する特定の突然変
異を含む耐性試験ベクターの構築によって評価する。突然変異は単独で含まれる
か、ＨＩＶのある薬物またはあるクラスの薬物に対する感受性を調節すると考え
られる、他の既知の薬物耐性突然変異と組み合わされて含まれうる。突然変異は
、幅広く知られた部位指向突然変異誘発法のいずれによって耐性試験ベクターに
導入される。本発明のある実施形態において、部位指向突然変異誘発のメガプラ
イマーＰＣＲ法が使用されている。そして、特定の突然変異または突然変異のグ
ループを含む耐性試験ベクターは、上記の表現型感受性アッセイを用いて試験を
行い、感受性プロファイルは、特定の突然変異を持たない、遺伝子的に定義され
た野生種（薬物感受性）耐性試験ベクターの感受性プロファイルと比較する。試
験を行った抗レトロウイルス薬物に対する表現型感受性のパターンの確認された
変化は、耐性試験ベクターに導入された特定の突然変異に由来するものである。
【０１１３】 実施例３ 相関する表現型感受性と遺伝子型分析：Ｐ２２５Ｈ 患者９７−３０２の表現型分析 耐性試験ベクターは、９７−３０２と呼ばれる患者サンプルより、実施例１に
記載されているように構築した。この患者は約１０ヶ月間、ｄ４Ｔ、インディナ
ビルおよびＤＭＰ−２６６による治療を受けていた。ウイルスＲＮＡの単離とＲ
Ｔ／ＰＣＲを使用して、ＰＲのすべてとＲＴのａａ１−３１３をコード化するウ
イルス配列を含む患者由来のセグメントを生成させた。患者由来のセグメントは
、指標遺伝子ウイルスベクターに挿入して、ＲＴＶ−３０２と呼ばれる耐性試験
ベクターを生成させた。ＲＴＶ−３０２は、表現型感受性アッセイを使用して、
抗レトロウイルス薬物のパネルに対する感受性レベルを正確に定量的に決定する
ために試験を行った。抗レトロウイルス薬物のこのパネルには、ＮＲＴＩ（ＡＺ
Ｔ、３ＴＣ、ｄ４Ｔ、ｄｄＩおよびｄｄＣ）、ＮＮＲＴＩ（デラビルジンおよび
ネビラピン）とＰＲＩ（インディナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナ
ビル）として知られるクラスのメンバーを含んでいた。試験した薬物それぞれに
ついて、ＩＣ５０を決定した。患者ウイルスの各薬物に対する感受性を検査し、
既知の感受性パターンと比較した。患者サンプルＲＴＶ−３０２について、ＮＮ
ＲＴＩに対する感受性パターンを観測すると、ネビラピンに対する感受性が著し
く低下し（耐性が上昇）、デラビルジンに対する感受性が適度に低下した（図８
Ａを参照）。患者サンプル９７−３０２はさらに、確認された感受性パターンと
相関する遺伝子型変化について検査した。
【０１１４】 患者９７−３０２の遺伝子型の決定 ＲＴＶ−３０２ ＤＮＡは、ＡＢＩ連鎖終止自動配列決定によって分析した。
ヌクレオチド配列は、野生種クレードＢ ＨＩＶ−１のコンセンサス配列（HIV
Sequence Database Los Alamos, NM）と比較した。ヌクレオチド配列は、対照配
列と異なる配列について検査した。ＲＴ突然変異は、位置Ｋ１０３Ｎ，Ｉ１３５
Ｍ，Ｔ２００Ａ，Ｐ２２５Ｈで示された。Ｋ１０３Ｎは、ＮＮＲＴＩに対する耐
性に関連付けられ、表現型感受性アッセイを用いて、デラビルジンとネビラピン
の両方に対して同程度の感受性の低下に関係することが示された。Ｉ１３５Ｍお
よびＴ２００Ａでの突然変異は、ＨＩＶの野生種（薬物感受性）変異体における
既知の多形性である。突然変異Ｐ２２５Ｈは、アミノ酸２２５における変化をＮ
ＮＲＴＩ表現型感受性の変化と関連付ける部位指向突然変異誘発および表現型感
受性試験を用いて、特徴付けを行った。
【０１１５】 部位指向突然変異誘発 耐性試験ベクターは、Ｐ２２５Ｈ突然変異のみか、ＮＮＲＴＩに対するＨＩＶ
感受性を調節することが知られている他の既知の薬物耐性突然変異（Ｋ１０３Ｎ
，Ｙ１８１Ｃ）との組合せを含むものが構築された。突然変異は、部位指向突然
変異誘発のメガプライマーＰＣＲ法を用いて、耐性試験ベクターに導入した（Sa
kar G and Sommar SS(1994) Biotechniques 8(4),404-407）。Ｐ２２５Ｈ突然変
異（Ｐ２２５Ｈ−ＲＴＶ）を含む耐性試験ベクターは、上で述べた表現型感受性
アッセイを用いて試験を行い、結果は、位置２２５で野生種である、遺伝的に定
義された耐性試験ベクターと比較した。ＮＮＲＴＩ、Ｐ２２５Ｈ−ＲＴＶ中のデ
ラビルジンに対する表現型感受性のパターンは、野生種と比較すると変化した。
別の野生種のバックグラウンドにおいては、（すなわちＰ２２５Ｈ突然変異のみ
）、Ｐ２２５Ｈ−ＲＴＶは、野生種対照ＲＴＶよりもデラビルジンに対する感受
性が強かった。Ｐ２２５Ｈ−ＲＴＶでは、ネビラピンに対する感受性は著しく変
化しなかった。Ｐ２２５Ｈ突然変異も、Ｋ１０３Ｎ，Ｙ１８１Ｃまたはその両方
（Ｋ１０３Ｎ＋Ｙ１８１Ｃ）での付加突然変異を含むＲＴＶ内に導入された。す
べての場合において、Ｐ２２５Ｈ突然変異が存在するならば、デラビルジンによ
る阻害に対するＲＴＶの感受性は、Ｐ２２５Ｈ突然変異を含まない対応するＲＴ
Ｖに比較して大きくなった（図８Ｄ）。すべての場合において、Ｐ２２５Ｈ突然
変異によって、ネビラピンに対する感受性は著しく変化しなかった（図８Ｄ）。
【０１１６】 実施例４ 相関する表現型感受性および遺伝子型分析：Ｐ２３６Ｌ ＨＩＶ患者９７−２６８の表現型分析 耐性試験ベクターは、９７−２６８と呼ばれる患者サンプルから、実施例１に
記載されているように構築した。この患者は、ＡＺＴおよび３ＴＣ（ＮＲＴＩ）
、インディナビルおよびサキナビル（ＰＲＩ）、デラビルジン（ＮＮＲＴＩ）に
よって１ヶ月から２年の異なる期間、治療を受けていた。ウイルスＲＮＡの単離
とＲＴ／ＰＣＲを用いて、ＰＲすべてとＲＴのアミノ酸１−３１３をコード化す
るウイルス配列を含む患者由来のセグメントを生成させた。患者由来のセグメン
トは、指標遺伝子ウイルスベクターに挿入して、ＲＴＶ−２６８と呼ばれる耐性
試験ベクターを生成させた。そしてＲＴＶ−２６８は、表現型感受性アッセイを
使用して、抗レトロウイルス薬物のパネルに対する感受性レベルを正確に定量的
に決定するために試験を行った。抗レトロウイルス薬物のこのパネルには、ＮＲ
ＴＩ（ＡＺＴ、３ＴＣ、ｄ４Ｔ、ｄｄＩおよびｄｄＣ）、ＮＮＲＴＩ（デラビル
ジンおよびネビラピン）とＰＲＩ（インディナビル、ネルフィナビル、リトナビ
ル、サキナビル）として知られるクラスのメンバーを含んでいた。試験した薬物
それぞれについて、ＩＣ５０を決定した。各薬物に対する患者ウイルスの感受性
を検査し、基準ウイルスの感受性と比較した。ウイルスサンプルがデラビルジン
に対して耐性があることがわかっている患者サンプルＲＴＶ−２６８について、
ＮＮＲＴＩに対する感受性のパターンにデラビルジンに対する耐性がないことを
確認した。サンプルはさらに、感受性パターンと相関する遺伝子型変化について
検査した。
【０１１７】 ＨＩＶ患者９７−２６８の遺伝子型 ＲＴＶ−２６８ ＤＮＡは、ＡＢＩ連鎖終止自動配列決定によって分析した。
ヌクレオチド配列は、野生種クレードＢ ＨＩＶ−１のコンセンサス配列と比較
した。ヌクレオチド配列は、対照配列と異なる配列について評価した。ＲＴ突然
変異は対照配列と比較して、位置Ｍ４１Ｌ、Ｄ６７Ｎ、Ｍ１８４Ｖ、Ｔ２００Ａ
、Ｅ２０３Ｄ、Ｌ２１０Ｗ、Ｔ２１５Ｙ、Ｋ２１９ＱおよびＰ２３６Ｌで示され
た。Ｔ２００ＡおよびＥ２０３Ｄでの突然変異は、ＨＩＶの野生種（薬物感受性
）変異体における既知の多形性である。位置Ｍ４１Ｌ、Ｄ６７Ｎ、Ｌ２１０Ｗ、
Ｔ２１５ＹおよびＫ２１９Ｑでの突然変異は、ＡＺＴ耐性に関連付けられる。Ｍ
１８４Ｖでの突然変異は、３ＴＣ耐性に関連付けられる。Ｐ２３６Ｌはデラビル
ジンに対する耐性と関連付けられ、ネビラピンに対する耐性を上昇させた（Duew
ekeら., Ibid）。以前の報告とは大きく異なって、ＲＴＶ−２６８サンプルのネ
ビラピン感受性は、変化が見られなかった。突然変異Ｐ２３６Ｌは、アミノ酸２
３６における変化を表現型感受性の変化と関連付ける部位指向突然変異誘発と生
体外表現型感受性試験を用いて、特徴付けを行った。
【０１１８】 部位指向突然変異誘発 耐性試験ベクターは、Ｐ２３６Ｌ突然変異のみか、ＮＮＲＴＩに対するＨＩＶ
感受性を調節することが知られている他の既知の薬物耐性突然変異（Ｋ１０３Ｎ
，Ｙ１８１Ｃ）との組合せを含むものが作成された。突然変異は、部位指向突然
変異誘発のメガプライマーＰＣＲ法を用いて、耐性試験ベクターに導入した（Sa
kar G and Sommar, Ibid.）。Ｐ２３６Ｌ突然変異（Ｐ２３６Ｌ−ＲＴＶ）を含
む耐性試験ベクターは、上で述べた表現型感受性アッセイを用いて試験を行い、
結果は、位置２３６で野生種である、遺伝的に定義された耐性試験ベクターと比
較した。Ｐ２３６Ｌ−ＲＴＶは、ＮＮＲＴＩ表現型感受性において変化を示した
。別の野生種のバックグラウンドにおいては、（すなわちＰ２３６Ｌ突然変異の
み）、Ｐ２３６Ｌ−ＲＴＶは野生種対照ＲＴＶよりも、デラビルジンに対する感
受性が低い。Ｄｕｅｗｅｋｅらとは対照的に、Ｐ２３６Ｌ−ＲＴＶの場合、ネビ
ラピンに対する感受性では著しい変化は見られなかった。Ｐ２３６Ｈ突然変異も
、Ｋ１０３Ｎ、Ｙ１８１Ｃまたはその両方（Ｋ１０３Ｎ＋Ｙ１８１Ｃ）での付加
突然変異を含むＲＴＶ内に導入された。すべての場合で、ＲＴＶのデラビルジン
に対する感受性はＰ２３６Ｌ突然変異が存在すれば、Ｐ２３６Ｌ突然変異を含ま
ない対応するＲＴＶよりも低かった。すべての場合において、Ｐ２３６Ｌ突然変
異によって、ネビラピンに対する感受性は著しく変化しなかった。
【０１１９】 実施例５ 相関する表現型感受性および遺伝子型分析：Ｇ１９０Ｓ ＨＩＶ患者９７−６４４表現型分析 耐性試験ベクターは、９７−６４４と呼ばれる患者サンプルから、実施例１に
記載されているように構築した。この患者は、ｄ４Ｔ（ＮＲＴＩ）、インディナ
ビル（ＰＲＩ）、エファビレンツ（ＮＮＲＴＩ）によって５ヶ月から１７ヶ月の
異なる期間、治療を受けていた。ウイルスＲＮＡの単離とＲＴ／ＰＣＲを用いて
、ＰＲすべてとＲＴのアミノ酸１−３１３をコード化するウイルス配列を含む患
者由来のセグメントを生成させた。患者由来のセグメントは、指標遺伝子ウイル
スベクターに挿入して、ＲＴＶ−６４４と呼ばれる耐性試験ベクターを生成させ
た。そしてＲＴＶ−６４４は、表現型感受性アッセイを使用して、抗レトロウイ
ルス薬物のパネルに対する感受性レベルを正確に定量的に決定するために試験を
行った。抗レトロウイルス薬物のこのパネルには、ＮＲＴＩ（ＡＺＴ、３ＴＣ、
ｄ４Ｔ、ｄｄＩおよびｄｄＣ）、ＮＮＲＴＩ（デラビルジンおよびネビラピン）
とＰＲＩ（インディナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル）として
知られるクラスのメンバーを含んでいた。試験した薬物それぞれについて、ＩＣ
５０を決定した。各薬物に対する患者ウイルスの感受性を検査し、基準ウイルス
の感受性と比較した。ウイルスサンプルがネビラピンに対して耐性があることが
わかっている患者サンプルＲＴＶ−６４４について、ＮＮＲＴＩに対する感受性
のパターンにデラビルジンに対する耐性がほとんどまたは全くないことを確認し
た。サンプルはさらに、感受性パターンと相関する遺伝子型変化について検査し
た。
【０１２０】 ＨＩＶ患者９７−６４４の遺伝子型 ＲＴＶ−６４４ ＤＮＡは、ＡＢＩ連鎖終止自動配列決定によって分析した。
ヌクレオチド配列は、野生種クレードＢ ＨＩＶ−１のコンセンサス配列と比較
した。ヌクレオチド配列は、対照配列と異なる配列について評価した。ＲＴ突然
変異は対照配列と比較して、位置Ｋ１０１ＥおよびＧ１９０Ｓで示された。Ｔ２
００ＡおよびＥ２０３Ｄでの突然変異は、ＨＩＶの野生種（薬物感受性）変異体
における既知の多形性である。位置Ｋ１０１Ｅでの突然変異は、すべてのＮＮＲ
ＴＩではなく、一部のＮＮＲＴＩに対する耐性に関連付けられる。特にＧ１９０
Ｓというわけではないが、突然変異Ｇ１９０Ａは、ネビラピンとロビリド(lovir
ide)に対する耐性と関連付けられる。突然変異Ｇ１９０ＳおよびＧ１９０Ａは、
アミノ酸１９０における変化を表現型感受性の変化と関連付ける部位指向突然変
異誘発と生体外表現型感受性試験を用いて、特徴付けを行った。
【０１２１】 部位指向突然変異誘発 Ｇ１９０ＳおよびＧ１９０Ａ突然変異を含む耐性試験ベクターを構築した。突
然変異は、部位指向突然変異誘発のメガプライマーＰＣＲ法を用いて、耐性試験
ベクターに導入した（Sakar and Sommar, Ibid.）。Ｇ１９０ＳまたはＧ１９０
Ａ突然変異を含む耐性試験ベクター（Ｇ１９０Ｓ−ＲＴＶまたはＧ１９０Ａ−Ｒ
ＴＶ）は、上で述べた表現型感受性アッセイを用いて試験を行い、結果は、位置
Ｇ１９０で野生種である、遺伝的に定義された耐性試験ベクターと比較した。Ｇ
１９０Ｓ−ＲＴＶおよびＧ１９０Ａ−ＲＴＶは、ＮＮＲＴＩ表現型感受性におい
て変化を示した。別の野生種のバックグラウンドにおいては、これらのＲＴＶは
野生種基準ＲＴＶよりも、ネビラピンに対する感受性が著しく低く、デラビルジ
ンに対する感受性がやや高かった。
【０１２２】 実施例6 RIV-1逆転写酵素の同定によるアミノ酸変異非ヌクレオシド逆転転写酵素阻害
剤に対する応答の推定 HIV-1逆転写酵素のアミノ酸236における突然変異の表現型および遺伝子型の相関 本発明の１つの実施態様では、HIV-1の逆転写酵素タンパク質の236番のアミノ
酸における変異を以下の方法を用いて評価する：(i)HIV-1に感染した被験者から
生物学的サンプルを採取し、(ii)そのサンプルがコドン236に突然変異を有するH
IV-1逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価する。コドン236(P236L)
における突然変異の存在はデラビルジン感受性の低下と相関するが、ネビラピン
感受性はほとんどまたはまったく変化しない。
【０１２３】 この生物学的サンプルは全血、末梢単核細胞(PBMC)、血清、血漿をはじめとす
る血液成分（EDTA、クエン酸-デキストロース、ヘパリンなどの種々の抗凝固剤
を用いて調製される）、組織生検、脳脊髄液(CSF)、またはその他の細胞、組織
もしくは体液からなる。もう１つの実施態様では、HIV-1核酸（ゲノムRNA）また
は逆転写酵素タンパク質は、生物学的サンプルから直接、または生物学的サンプ
ルからウイルス粒子を精製した後に単離できる。HIV-1逆転写酵素の236番のアミ
ノ酸が変異しているかどうかの評価は、逆転写酵素をコードするウイルス核酸の
直接同定または逆転写酵素タンパク質自体の直接同定といった種々の方法を用い
て実施できる。逆転写酵素の236番のアミノ酸の決定は、従来のまたは新規なア
ミノ酸配列決定法による逆転写酵素タンパク質の直接同定、抗体またはその他の
特異的結合タンパク質もしくは化合物によるエピトープ認識により実施できる。
あるいは、HIV-1逆転写酵素タンパク質の236番のアミノ酸は、逆転写酵素タンパ
ク質をコードするHIV-1核酸の増幅コピーを同定することにより決定できる。HIV
-1核酸の増幅は、当業者に公知であろう逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)
、NASBA、SDA、PCR、または3SRをはじめとする種々の方法を用いて実施できる。
HIV逆転写酵素をコードする核酸がコドン236に突然変異を有するかどうかの評価
は、種々のプライマー伸長-チェーンターミネーション法(Sanger, ABI/PE and V
isible Genetcis)もしくは鎖切断(Maxam and Gilbert)法、またはより最近に開
発された、マトリックス補助レーザー脱離イオン化フライト時間(matrix assist
ed laser desorption-ionization time of flight)(MALDI-TOF)または質量分析
法(Sequenom, Gene Trace Systems)などの配列決定法を用いる直接的な核酸配列
決定により実施できる。あるいは、アミノ酸236番をコードする核酸配列は、遺
伝子チップハイブリダイゼーションシーケンシング(Affymwtrix)、ラインプロー
ブアッセイ(LiPA; Murex)およびディファレンシャルハイブリダイゼーション(Ch
iron)などのプローブハイブリダイゼーション法を用いて評価できる。
【０１２４】 本発明の好ましい実施態様では、HIV-1逆転写酵素のアミノ酸236番が野生型で
あるか変異型であるかの評価は生物学的サンプルから調製した耐性試験ベクター
DNAを用いる表現型感受性アッセイを用いて行った。１つの実施態様では、血漿
サンプルを採取してウイルスRNAを精製し、RT-PCR法を用いて患者由来のHIV-1プ
ロテアーゼおよび逆転写酵素領域をコードするセグメントを増幅した。次ぎに増
幅した患者由来のセグメントを、DNA連結および細菌形質転換によって指標遺伝
子ウイルスベクターに組み込み、それにより耐性試験ベクターを作出した。
【０１２５】 耐性試験ベクターDNAを細菌培養物から単離し、表現型感受性アッセイを実施
例1に記載のようにして行った。P236L変異を有する患者サンプルを用いた表現型
感受性アッセイの結果。患者由来のHIV-1プロテアーゼおよび患者サンプル268由
来の逆転写酵素領域の核酸(DNA)配列は、蛍光検出チェーンターミネーションサ
イクルシーケンシング法(ABI/PE)を用いて決定した。この方法を使用して被験者
のサンプルに存在するHIV-1変異体の混合物の配列の組合せを表す（疑似種を表
す）共通核酸配列を決定し、さらに個々の変異体の核酸配列を決定した。
【０１２６】 患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異体は、デラ
ビルジンおよびネビラピン感受性がHIV-1逆転写酵素の103、181または236番にRT
変異が存在しないことと相関していることを示した。患者サンプルの表現型感受
性プロファイルおよび位置指定突然変異体は、HIV-1逆転写酵素の236番における
アミノ酸ロイシン(L)をコードする核酸配列の突然変異ならびに103および181番
の変異の不在と相関して、デラビルジン感受性は著しく低下（耐性が増強）する
が、ネビラピン感受性はほとんどまたは全く低下しないことを示した。
【０１２７】 患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異体は、103
、181または103および181番にRT変異が存在する場合(K103N、Y181C、またはK103
N+Y181C)、236番におけるアミノ酸プロリンによってさらにデラビルジンまたは
ネビラピン感受性が低下する（耐性が増強する）ことはないことを示した。しか
しながら、患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異体
は、NNRTI耐性に関与しているRT変異(K103N、Y181C、またはK103N+Y181C)に加え
、236番におけるアミノ酸ロイシン(L)によってデラビルジン感受性はさらに低下
する（耐性が増強する）が、ネビラピン感受性はほとんどまたは全く低下しない
ことを示した。
【０１２８】 HIV-1逆転写酵素のアミノ酸225における突然変異の表現型および遺伝子型の相関 患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異体は、アミ
ノ酸プロリン(P)がNNRTI耐性(K103N、Y181C)に関与しているRT変異の不在下でHI
V-1逆転写酵素の225番に存在する場合、デラビルジンまたはネビラピン感受性は
変化しないことを示した。しかしながら、患者サンプルの表現型感受性プロファ
イルおよび位置指定突然変異体は、アミノ酸ヒスチジン(H)がNNRTI耐性に関与し
ているRT変異(K103N、Y181C)の不在下で225番に存在する場合には、デラビルジ
ン感受性は増強するが、ネビラピン感受性はほとんどまたは全く変化しないこと
を示した。
【０１２９】 患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異体は、NNRT
I耐性に関与しているRT変異(K103N、Y181C、またはK103N+Y181C)に加えて、225
番にアミノ酸プロリン(P)が存在する場合には、デラビルジン感受性またはネビ
ラピン感受性はさらに低下しないことを示した。これに対し、患者サンプルの表
現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異体は、NNRTI耐性に関与してい
るRT変異(K103N、Y181C、またはK103N+Y181C)の存在下、アミノ酸ヒスチジン(H)
が225番に存在する場合には、デラビルジン感受性は増強するが、ネビラピン感
受性はほとんどまたは全く変化しないことを示した。
【０１３０】 HIV-1逆転写酵素のアミノ酸190における突然変異の表現型および遺伝子型の相関 患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異体は、NNRT
I耐性に関与しているRT変異(K103N、Y181C)の不在下、190番にアミノ酸グリシン
(G)が存在する場合には、デラビルジンまたはネビラピン感受性は変化しないこ
とを示した。患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定突然変異
体は、NNRTI耐性に関与しているRT変異の不在下、190番にアミノ酸アラニン(A)
が存在する場合には、デラビルジン感受性は増強するが、ネビラピン感受性は低
下することを示した。患者サンプルの表現型感受性プロファイルおよび位置指定
突然変異体は、NNRTI耐性に関与しているRT変異の不在下、190番にアミノ酸セリ
ン(S)が存在する場合には、デラビルジン感受性は増強するが、ネビラピン感受
性は低下することを示した。
【０１３１】 実施例8 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与している遺伝子型と表現型の相関:Y181I 耐性試験ベクターの調製および患者98-964HIVサンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、98-964と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにddI、d4T、AZT、3TC、ddC、(NRTI)、
サキナビルおよびネルフィナビル(PRI)、ならびにネビラピン(NNRTI)およびHUで
処置されていた。ウイルスRNAを単離し、RT/PCRを用いて、PRのすべておよびRT
のアミノ酸1-313をコードするウイルス配列を含んでなる患者由来セグメントを
作製した。このPDSを指標遺伝子ウイルスベクターに挿入してRTV-964と呼ばれる
耐性試験ベクターを作製した。次ぎにRTV-964を表現型アッセイで試験して抗レ
トロウイルス薬パネルに対する感受性のレベルを正確かつ定量的に測定した。こ
の抗レトロウイルス薬パネルはNRTI(AZT、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デ
ラビルジンおよびネビラピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル
、リトナビルおよびサキナビル）として知られているクラスのメンバーを含んで
なるものであった。試験した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求
めた。試験した薬剤すべてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パター
ンと比較した。患者RTV-964についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、そ
こではデラビルジン感受性においてはある程度の低下（10倍）が、またネビラピ
ン感受性においては顕著な低下（750倍）が認められた。
【０１３２】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-964のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。突然変異は対照配列に対してM41L、K43E、D67N、K70R、L74I、V75S、Y1
81I、R211T、T215Y、D218EおよびK219Qの位置に見られた。M41L、D67N、K70R、L
74I、V75S、T215YおよびK219QはNRTI耐性に関与している。R211Tにおける変異は
種々のHIVの野生型（薬剤感受性）変異体間では公知の配列多形性を有する。Y18
1Iは高レベルのネビラピン耐性と関与していることがこれまでに示されている。
発明者らは位置指定突然変異誘発およびin vitro表現型感受性試験を用いて突然
変異Y181Iを調べ、認められた遺伝子型における変化と表現型とを相関させた。
【０１３３】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにY181I変異を導入した。次ぎにY181I変異を含む耐性
試験ベクター(Y181I-RTV)を先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果
を、181番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて求め
た結果と比較した。発明者らはY181I-RTVにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラ
ピンおよびエファビレンに対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバッ
クグラウンド（すなわち、Y181I変異単独）において、Y181I-RTVは野生型の対照
RTVに対してデラビルジン感受性のある程度の低下（20倍）とネビラピン感受性
の著しい低下（7400倍）を示した。Y181I-RTVはエファビレンに対しては野生型
の感受性（1.4倍）を示した。
【０１３４】 実施例9 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:Y181I 耐性試験ベクターの調製および患者97-300HIVサンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、97-300と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにd4Tおよび3TC(NRTI)、インジナビル(P
RI)、ならびにエファビレン(NNRTI)で処置されていた。ウイルスRNAを単離し、R
T/PCRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1-313をコードするウイルス配列
を含んでなる患者由来セグメントを作製した。このPDSを指標遺伝子ウイルスベ
クターに挿入してRTV-300と呼ばれる耐性試験ベクターを作製した。次ぎにRTV-3
00を表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス薬パネルに対する感受性のレベ
ルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウイルス薬パネルはNRTI(AZT、3T
C、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジン、エファビレンおよびネビラピン
）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびサキナビ
ル）として知られているクラスのメンバーを含んでなるものであった。試験した
各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求めた。試験した薬剤すべてに
対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した。患者RTV-300
についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、デラビルジン感受性において
はある程度の低下（25倍）が、またネビラピン感受性においては顕著な低下（80
0倍を超える）が認められた。
【０１３５】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-300のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。突然変異は対照配列に対してK32N、M184V、およびY188Lの位置に見られ
た。M184Vにおける突然変異は3TC耐性に関与している。Y181Lは高レベルのエフ
ァビレン耐性と関与していることがこれまでに示されている。Y188におけるその
他の突然変異(すなわちY188CおよびY188H)は、数種のNNRTI(E-ePseU、E-EPS、HE
PT、ネビラピン、BHAP、U-8720E、TIBO R82913、ロビライド)で処置することに
よるものから選択されたことが報告されている。発明者らは位置指定突然変異誘
発およびin vitro表現型感受性試験を用いて突然変異Y181Lを調べ、認められた
遺伝子型における変化と表現型とを相関させた。
【０１３６】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにY181L変異を導入した。次ぎにY181L変異を含む耐性
試験ベクター(Y181L-RTV)を先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果
を、181番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて求め
た結果と比較した。発明者らはY181L-RTVにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラ
ピンおよびエファビレンに対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバッ
クグラウンド（すなわち、Y181Ｌ変異単独）において、Y181L-RTVは野生型の対
照RTVに対してデラビルジン感受性の若干の低下（9倍）を、ネビラピン感受性の
実施的な低下（800倍を超える）を、またエファビレン感受性の顕著な低下(109
倍)を示した。エファビレン感受性のおよそ100倍の低下はこれまで報告されてい
るものほど高いものではなかった。
【０１３７】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにY181C変異を導入した。次ぎにY181C変異を含む耐性
試験ベクター(Y181C-RTV)を先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果
を、181番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて求め
た結果と比較した。発明者らはY181C-RTVにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラ
ピンおよびエファビレンに対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバッ
クグラウンド（すなわち、Y181C変異単独）において、Y181C-RTVは野生型の対照
RTVに対してデラビルジン感受性の若干の低下（3倍）を、ネビラピン感受性(30
倍)およびエファビレン感受性(30倍)のある程度の低下を示した。
【０１３８】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにY181H変異を導入した。次ぎにY181H変異を含む耐性
試験ベクター(Y181H-RTV)を先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果
を、181番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて求め
た結果と比較した。発明者らはY181H-RTVにおけるNNRTI、デラビルジン、および
ネビラピンに対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバックグラウンド
（すなわち、Y181H変異単独）において、Y181H-RTVは野生型の対照RTVに対して
ネビラピン感受性のある程度の低下（3.5倍）を示した。エファビレンに対するY
188H表現型感受性は測定しなかった。
【０１３９】 実施例10 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:E138およびY188 耐性試験ベクターの調製および患者97-209HIVサンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、97-209と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにAZT、ddT、d4Tおよび3TC(NRTI)、イン
ジナビル(PRI)、ならびにアデフォビルで処置されていた。ウイルスRNAを単離し
、RT/PCRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1-313をコードするウイルス
配列を含んでなる患者由来セグメントを作製した。このPDSを指標遺伝子ウイル
スベクターに挿入してRTV-209と呼ばれる耐性試験ベクターを作製した。次ぎにR
TV-209を表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス薬パネルに対する感受性の
レベルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウイルス薬パネルはNRTI(AZT
、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジン、エファビレンおよびネビラ
ピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびサキ
ナビル）として知られているクラスのメンバーを含んでなるものであった。試験
した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求めた。試験した薬剤すべ
てに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した。患者RTV-
209についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、デラビルジン感受性におい
てはある程度の低下（75倍）が、またネビラピン感受性においては実質的な低下
（800倍を超える）が認められた。
【０１４０】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-209のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。突然変異は対照配列に対してA62V、S68G、V76I、E77L、F116Y、E138A、
Q151M、M184V、Y188L、およびE291Dの位置に見られた。A62V、V75I、E77L、F116
Y、Q151MおよびM184Vにおける突然変異はNRTI耐性に関与している。E138Kにおけ
る突然変異は数種のNNRTI耐性と関与していることがこれまでに示され、Y188Lに
おける突然変異はエファビレン感受性の低下と関与していることがこれまでに示
されている。発明者らは位置指定突然変異誘発およびin vitro表現型感受性試験
を用いて突然変異Y181LおよびE138Aを調べ、認められた遺伝子型における変化と
表現型とを相関させた。
【０１４１】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにE138A変異単独、およびY188Lとの組合せを導入した
。次ぎにE138A変異を含む(E138A-RTV)、またはE138変異をY181L変異とともに含
む(Y181L-RTV)耐性試験ベクターを先に記載した表現型アッセイを用いて試験し
、結果を、181および138番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクタ
ーを用いて求めた結果と比較した。発明者らはE138-RTV、Y188L-RTVおよびE138-
Y188L-RTVにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンに対す
る表現型感受性パターンを求めた。野生型のバックグラウンド（すなわち、E138
A変異単独）において、E138A-RTVはデラビルジン（1.6倍）、ネビラピン（1.3倍
）およびエファビレン（1.4倍）に対して野生型の感受性を示した。Y188L-RTVは
ネビラピン感受性の若干の低下（800倍を超える）を、またエファビレン感受性
の顕著な低下(110倍)を示した。E138A-Y188L-RTVは野生型の対照RTVに対してデ
ラビルジン感受性（75倍）およびエファビレン感受性（88倍）のある程度の低下
を、ネビラピン感受性の実質的な低下（800倍を超える）を示した。突然変異の
組合せは、各突然変異単独について見られた作用に比べデラビルジン感受性にお
いて増強された作用を示す結果となった。
【０１４２】 実施例11 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:A98 耐性試験ベクターの調製および患者98-675HIVサンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、98-675と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにddI、AZT、および3TC(NRTI)、ならび
にサキナビルおよびネルフィナビル(PRI)で処置されていた。ウイルスRNAを単離
し、RT/PCRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1-313をコードするウイル
ス配列を含んでなる患者由来セグメントを作製した。このPDSを指標遺伝子ウイ
ルスベクターに挿入してRTV-675と呼ばれる耐性試験ベクターを作製した。次ぎ
にRTV-675を表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス薬パネルに対する感受
性のレベルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウイルス薬パネルはNRTI
(AZT、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジン、エファビレンおよびネ
ビラピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよび
サキナビル）として知られているクラスのメンバーを含んでなるものであった。
試験した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求めた。試験した薬剤
すべてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した。患者
RTV-675についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、デラビルジン感受性に
ついては野生型の感受性（2.1倍）が認められ、ネビラピン感受性においては若
干の低下（6倍）が認められた。
【０１４３】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-675のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。M41L、S48t、L74V、A98G、M184V、およびT215Yの位置の突然変異は、NR
TI耐性に関与していることが分かった。A98Gにおける突然変異はネビラピン耐性
と関与していることがこれまでに示されている。発明者らは位置指定突然変異誘
発およびin vitro表現型感受性試験を用いて突然変異A98Gを調べ、認められた遺
伝子型における変化と表現型とを相関させた。
【０１４４】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにA98G変異を導入した。次ぎにA98G変異を含む耐性試
験ベクター(A98G-RTV)を先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果を、
98番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて求めた結果
と比較した。発明者らはA98G-RTVにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラピンお
よびエファビレンに対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバックグラ
ウンド（すなわち、A98G変異単独）において、A98G-RTVは野生型の対照RTVに対
してデラビルジン感受性（3倍）、ネビラピン感受性（8倍）、およびエファビレ
ン感受性（3倍）の若干の低下を示した。
【０１４５】 実施例12 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:A98およびG190 耐性試験ベクターの調製および患者B HIVサンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、Bと呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のようにし
て構築した。この患者が受けた抗レトロウイルス処置は不明である。ウイルスRN
Aを単離し、RT/PCRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1-313をコードする
ウイルス配列を含んでなる患者由来セグメントを作製した。このPDSを指標遺伝
子ウイルスベクターに挿入してRTV-Bと呼ばれる耐性試験ベクターを作製した。R
TV-Bプールの個々のクローンを選択し、次ぎに表現型アッセイで試験して抗レト
ロウイルス薬パネルに対する感受性のレベルを正確かつ定量的に測定した。この
抗レトロウイルス薬パネルはNRTI(AZT、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラ
ビルジンおよびネビラピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル、
リトナビルおよびサキナビル）として知られているクラスのメンバーを含んでな
るものであった。試験した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求め
た。試験した薬剤すべてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パターン
と比較した。患者RTV-Bクローン1についてNNRTI感受性パターンを観察したとこ
ろ、デラビルジン感受性においては増強（0.55倍）が、ネビラピン感受性におい
ては実質的な低下（640倍）、またエファビレン感受性においては顕著な低下（2
50倍）が認められた。
【０１４６】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-Bクローン1のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより
解析した。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(
HIV配列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子
型を調べた。突然変異は対照配列に対してM41L、A98G、M184V、L210W、R211?、T
215Y、E297A、およびG190Sの位置に見られた。M41L、M184V、L210WおよびT215Y
はNRTI耐性に関与している。A98Gの突然変異はネビラピン耐性と関与しているこ
とがこれまでに示されている。G190Aの位置における突然変異はネビラピン感受
性の変化と関与していることがこれまでに示されている。190番におけるその他
の突然変異(すなわちE、QおよびT)もまた報告されている。発明者らは位置指定
突然変異誘発およびin vitro表現型感受性試験を用いて突然変異A98GおよびG190
Sを調べ、認められた遺伝子型における変化と表現型とを相関させた。
【０１４７】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにA98およびG190S変異を単独または組合せて導入した
。次ぎにA98G変異を含む(A98G-RTV)、G190S変異を含む(G190S-RTV)を含む、また
両変異を含む(A98G-G190S-RTV)耐性試験ベクターを先に記載した表現型アッセイ
を用いて試験し、結果を、98および190番が野生型である遺伝学的に定義された
耐性試験ベクターを用いて求めた結果と比較した。発明者らはこれらの3つのベ
クターにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンに対する
表現型感受性パターンを求めた。野生型のバックグラウンド（すなわち、A98G変
異単独）において、A98G-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性（3
倍）、ネビラピン感受性（8倍）、およびエファビレン感受性（3倍）の若干の低
下を示した。野生型のバックグラウンド（すなわち、G190S変異単独）において
、G190S-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性の増強（0.5倍）、
ネビラピン感受性のある程度の低下（75倍）、またエファビレン感受性の若干の
低下（8倍）を示した。A98G-G190S-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン
感受性の増強（0.8倍）を示したが、ネビラピン（800倍を超える）およびエファ
ビレン（250倍を超える）両感受性の実質的低下を示した。個々の突然変異に関
してはエファビレン感受性はわずかな低下しか認められなかったが、A98GとG190
Sの組合せはエファビレン感受性の実質的な低下を生じた。同様に、この組合せ
の突然変異は、2つの突然変異単独の総和よりもネビラピン感受性のより顕著な
低下を招いた。
【０１４８】 実施例13 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:Y181およびA98 耐性試験ベクターの調製および患者98-1057サンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、98-1057と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにddI、d4T、AZT、および3TC(NRTI)、サ
キナビルおよびインジナビル(PRI)、ならびにデラビルジン(NNRTI)で処置されて
いた。ウイルスRNAを単離し、RT/PCRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1
-313をコードするウイルス配列を含んでなる患者由来セグメントを作製した。こ
のPDSを指標遺伝子ウイルスベクターに挿入してRTV-1057と呼ばれる耐性試験ベ
クターを作製した。次ぎにRTV-1057を表現型アッセイで試験して抗レトロウイル
ス薬パネルに対する感受性のレベルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロ
ウイルス薬パネルはNRTI(AZT、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジン
、エファビレンおよびネビラピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナ
ビル、リトナビルおよびサキナビル）として知られているクラスのメンバーを含
んでなるものであった。試験した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50
を求めた。試験した薬剤すべてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パ
ターンと比較した。患者RTV-1057についてNNRTI感受性パターンを観察したとこ
ろ、デラビルジン感受性においてはある程度の低下（35倍）を、ネビラピン感受
性においては顕著な低下（610倍）を示した。
【０１４９】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-1057のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。突然変異は対照配列に対してT39A、M41L、A62V、D67E、T69SST、A98G、
I135T、Y191C、T100I、およびT215Yの位置に見られた。M41L、A62V、D67E、T69S
ST、およびT215YはNRTI耐性に関与している。I135TおよびT100Iの位置における
突然変異はHIVの種々の野生型（薬剤感受性）変異体間で公知の配列多形性を有
する。Y181CおよびA98Gはある種のNNRTIに対する耐性と関与していることがこれ
までに示されている。発明者らは位置指定突然変異誘発およびin vitro表現型感
受性試験を用いて突然変異Y181CおよびA98Gを調べ、認められた遺伝子型におけ
る変化と表現型とを相関させた。
【０１５０】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにY181CおよびA98G変異を単独または組合せて導入し
た。次ぎにT181C変異を含む(Y181C-RTV)、A98G変異を含む(A98G-RTV)を含む、ま
た両変異を含む(Y181C-A98G-RTV)耐性試験ベクターを先に記載した表現型アッセ
イを用いて試験し、結果を、181および98番が野生型である遺伝学的に定義され
た耐性試験ベクターを用いて求めた結果と比較した。発明者らはこれら3つのベ
クターにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンに対する
表現型感受性パターンを求めた。野生型のバックグラウンド（すなわち、Y181C
変異単独）において、Y181C-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性
のある程度の低下（35倍）、ネビラピン感受性の顕著な低下（161倍）、および
エファビレン感受性の若干の低下（3倍）を示した。A98G-RTVは野生型の対照RTV
に対してデラビルジン感受性（3倍）、ネビラピン感受性（8倍）、およびエファ
ビレン感受性（8倍）の若干の低下を示した。Y181C-A98G-RTVは野生型の対照RTV
に対してデラビルジン感受性の顕著な低下（240倍）、ネビラピン感受性の実質
的な低下（800倍を超える）、またエファビレン感受性の若干の低下（7倍）を示
した。これらのデータは2つの突然変異Y191CとA98Gの組合せが、これら2つの突
然変異個々に関して見られる作用の総和よりも、デラビルジンおよびネビラピン
両感受性のより顕著な低下を招くことを示した。
【０１５１】 実施例14 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:K101およびG190 耐性試験ベクターの調製および患者98-644および98-1060HIVサンプルの表現型解
析 耐性試験ベクターは、98-644と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにd4T(NNRTI)、インジナビル(PRI)、な
らびにエファビレン(NNRTI)で処置されていた。もう1つの耐性試験ベクターは、
98-1060と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のようにして構築した。この
患者はそれまでにd4T(NNRTI)、インジナビル(PRI)、ならびにエファビレン(NNRT
I)で処置されていた。ウイルスRNAを単離し、RT/PCRを用いて、PRのすべておよ
びRTのアミノ酸1-313をコードするウイルス配列を含んでなる患者由来セグメン
トを作製した。このPDSを指標遺伝子ウイルスベクターに挿入してRTV-644および
RTV-1060と呼ばれる耐性試験ベクターを作製した。次ぎにRTV-644およびRTV-106
0を表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス薬パネルに対する感受性のレベ
ルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウイルス薬パネルはNNRTI(AZT、3
TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジン、およびネビラピン）、ならび
にPRI（インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびサキナビル）として
知られているクラスのメンバーを含んでなるものであった。試験した各薬剤の耐
性試験ベクタープールについてIC50を求めた。試験した薬剤すべてに対する感受
性パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した。患者RTV-644についてNNR
TI感受性パターンを観察したところ、デラビルジン感受性においては極めてわず
かな低下（2.5倍）を、またネビラピン感受性においては顕著な低下（600倍）を
示した。試験した薬剤すべてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パタ
ーンと比較した。患者RTV-644についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、
デラビルジン感受性においては極めてわずかな低下（2.5倍）を、またネビラピ
ン感受性においては顕著な低下（600倍）を示した。試験した薬剤すべてに対す
る感受性パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した。患者RTV-1060につ
いてNNRTI感受性パターンを観察したところ、デラビルジンに対しては野生型の
感受性（1.5倍）が認められた。RTV-1060については、エファビレン感受性の顕
著な低下（900倍）およびネビラピン感受性の実質的な低下（800を超える）が認
められた。
【０１５２】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-644およびRTV-1060のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシン
グにより解析した。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と
比較した(HIV配列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関
して遺伝子型を調べた。突然変異はRTV-644については対照配列に対してK101Eお
よびG190Sの位置に見られ、RTV-1060については対照配列に対してK101E、G190S
、T200AおよびT215Yの位置に見られた。T215の位置における配列は野生型と変異
型の混合物であった。K101Eの位置における突然変異は高レベルのデラビルジン
耐性をはじめとする数種のNNRTI耐性と関与していることがこれまで示されてい
る。G190Aの位置における突然変異はネビラピン感受性の変化に関していること
がこれまでに知られている。190番におけるその他の変異（すなわちE、QおよびT
）もまた報告されている。発明者らは位置指定突然変異誘発およびin vitro表現
型感受性試験を用いて突然変異K101EおよびG190Sを調べ、認められた遺伝子型に
おける変化と表現型とを相関させた。
【０１５３】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにK101EおよびG190S 変異を単独または組合せて導入
した。次ぎにK101E変異(K101E-RTV)、またG190S(G190S-RTV)を含む耐性試験ベク
ターを先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果を、1011および190番
が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて求めた結果と比
較した。発明者らは3つすべてのベクターにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラ
ピンおよびエファビレンに対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバッ
クグラウンド（すなわち、K101E変異単独）において、K101E-RTVは野生型の対照
RTVに対してデラビルジン感受性（5倍）およびエフェビレン感受性（5倍）の若
干の低下、ならびにネビラピン感受性のある程度の低下（12倍）を示した。K101
E-G190S-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性の増強（0.5倍）、
ネビラピン感受性のある程度の低下（75倍）、およびエファビレン感受性の若干
の低下（7.6倍）を示した。K101E-G190S-RTVはデラビルジンに対しては野生型の
感受性（1.4倍）を、野生型の対照RTVに対してネビラピン（800倍を超える）お
よびエファビレン（250倍を超える）の実質的な低下を示した。
【０１５４】 この実施例では、突然変異G190SとK101Eの組合せは新たな表現型パターンを示
した。これらの組合せはG190S変異単独について認められたデラビルジン感受性
に対する作用を逆転させ、さらにネビラピンおよびエファビレン両者についての
感受性に対する相加作用よりも大きくなった。
【０１５５】 実施例15 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:V108I 耐性試験ベクターの調製および患者98-652HIVサンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、98-652と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者は抗レトロウイルス治療を受けていなかった。ウイ
ルスRNAを単離し、RT/PCRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1-313をコー
ドするウイルス配列を含んでなる患者由来セグメントを作製した。このPDSを指
標遺伝子ウイルスベクターに挿入してRTV-652と呼ばれる耐性試験ベクターを作
製した。次ぎにRTV-652を表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス薬パネル
に対する感受性のレベルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウイルス薬
パネルはNRTI(AZT、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジンおよびネビ
ラピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびサ
キナビル）として知られているクラスのメンバーを含んでなるものであった。試
験した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求めた。試験した薬剤す
べてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した。患者RT
V-652についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、デラビルジン感受性の増
強（0.97倍）が認められ、ネイビラピン感受性においては若干の低下（5倍）が
認められた。
【０１５６】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-652のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。突然変異は対照配列に対してM41L、V108I、I135T、L210W、R211K、およ
びT215Dの位置に見られた。M41L、L210WおよびT215DはNRTI耐性に関与している
。I135TおよびR211Kの位置における突然変異はHIVの種々の野生型（薬剤感受性
）変異体の間で公知の配列多形性を有する。V108Iは数種のNNRTIに対する耐性に
関与していることが知られている。発明者らは位置指定突然変異誘発およびin v
itro表現型感受性試験を用いて突然変異V108Iを調べ、認められた遺伝子型にお
ける変化と表現型とを相関させた。
【０１５７】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにV108I変異を導入した。次ぎにV108I変異を含む耐性
試験ベクター(V108I-RTV)を先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果
を、108番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて求め
た結果と比較した。発明者らはV108I-RTVにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラ
ピンおよびエファビレンに対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバッ
クグラウンド（すなわち、V108I変異単独）において、V108I-RTVはデラビルジン
（1.3倍）およびエファビレン（1.7倍）に対しては野生型の感受性を、また野生
型の対照RTVに対してネビラピン感受性の若干の低下（3倍）を示した。
【０１５８】 実施例16 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:K103、K101およびG190 耐性試験ベクターの調製および患者98-955サンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、98-955と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにネルフィナビル(PRI)で処置されてい
た。ウイルスRNAを単離し、RT/PCRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1-3
13をコードするウイルス配列を含んでなる患者由来セグメントを作製した。この
PDSを指標遺伝子ウイルスベクターに挿入してRTV-955と呼ばれる耐性試験ベクタ
ーを作製した。次ぎにRTV-955を表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス薬
パネルに対する感受性のレベルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウイ
ルス薬パネルはNRTI(AZT、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジン、エ
ファビレンおよびネビラピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル
、リトナビルおよびサキナビル）として知られているクラスのメンバーを含んで
なるものであった。試験した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求
めた。試験した薬剤すべてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パター
ンと比較した。患者RTV-955についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、デ
ラビルジン感受性においては若干の低下（4倍）を、またネビラピン感受性にお
いては顕著な低下（530倍）を示した。
【０１５９】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-955のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。突然変異は対照配列に対してK20R、V35I、A62V、D67N、T69D、V75I、F7
7L、K101E、K103N、Y115F、F116Y、Q151M、I167V、Y181C、M184V、G190A、I202V
、R211K、F214L、T215V、およびK219Qの位置に見られた。K101E、K103N、Y181C
、G190A、およびF214Lの位置における突然変異は野生型と変異型の混合物であっ
た。A62V、D67N、T69D、V75I、F77L、Y115F、Q151M、M184V、T215VおよびK219Q
はNRTI耐性に関与している。V53I、R211KおよびF214Lにおける突然変異はHIVの
種々の野生型（薬剤感受性）変異体間で公知の配列多形性を有する。K101Eにお
ける突然変異はNNRTI耐性と関与していることがこれまでに示されている。Y181I
における突然変異は高レベルのネビラピン耐性に関与してることがこれまでに知
られている。K103Nにおける突然変異は3種のNNRTI、デラビルジン、ネビラピン
およびエファビレン耐性に関与していることがこれまでに知られている。発明者
らは位置指定突然変異誘発およびin vitro表現型感受性試験を用いて突然変異K1
01E、K103NおよびG190Aを調べ、認められた遺伝子型における変化と表現型とを
相関させた。
【０１６０】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにK101E、K103NおよびG109A変異を単独または組合せ
て導入した。次ぎにK101E変異を含む(K101E-RTV)、K103N変異を含む(K103N-RTV)
を含む、G190変異を含む(G190A-RTV)、また2つの突然変異を含む(K101E-G190A-R
TVおよびK103N-G190A-RTV)耐性試験ベクターを先に記載した表現型アッセイを用
いて試験し、結果を、101、103および190番が野生型である遺伝学的に定義され
た耐性試験ベクターを用いて求めた結果と比較した。発明者らはこれら5つすべ
てのベクターにおけるNNRTI、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンに
対する表現型感受性パターンを求めた。野生型のバックグラウンド（すなわち、
K101E変異単独）において、K101E-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン
感受性（5倍）およびエファビレン感受性（5倍）の若干の低下を、またネビラピ
ン感受性のある程度の低下（30倍）を示した。野生型バックグラウンド（すなわ
ち、G190A変異単独）において、G190A-RTVは野生型の対照RTVに対してエファビ
レン感受性の増強（8倍）を示した。K101E-G190A-RTVはデラビルジンに対しては
野生型の感受性（2倍）を、野生型の対照RTVに対してネビラピン感受性の実質的
な低下（800倍を超える）、またエファビレン感受性の顕著な低下（120倍）を示
した。K103N-G190-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性のある程
度の低下（40倍）を、ネビラピン感受性の実質的な低下（800倍を超える）を、
またエファビレン感受性の顕著な低下（215倍）を示した。G190Aを含むベクター
へ第２の突然変異を導入したところ、G190A変異単独について認められたデラビ
ルジン感受性における作用が逆転された。G190A変異はデラビルジン感受性の増
強を示した。しかしながら、K101EまたはK103NのいずれかのG190A変異への付加
は、デラビルジン感受性の若干の低下をもたらした。さらに、G190AおよびK101E
の組合せはネビラピンおよびエファビレン感受性の低下における相加作用よりも
大きくなった。最後に、これらのデータは2つの突然変異G190AとK103Nの組合せ
が、これら2つの突然変異個々に関して見られる作用の総和よりも、ネビラピン
およびエファビレン両感受性のより顕著な低下を招くことを示した。
【０１６１】 実施例17 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:V106、V189、V181およびF227 耐性試験ベクターの調製および患者98-1033および98-757HIVサンプルの表現型解
析 耐性試験ベクターは、98-1033と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにAZT、DST、3TCおよびddI(NRTI)、サキ
ナビル、インジナビルおよびネルフィナビル(PRI)、ならびにネビラピン(NNRTI)
で処置されていた。もう１つの耐性試験ベクターは、98-757と呼ばれる、異なる
時点で同じ患者から得られたサンプルから実施例1に記載のようにして構築した
。この患者はさらに8週間のネビラピン(NNRTI)、d4T(NRTI)、ならびにサキナビ
ルおよびネルフィナビル(PRI)による処置を受けた。ウイルスRNAを単離し、RT/P
CRを用いて、PRのすべておよびRTのアミノ酸1-313をコードするウイルス配列を
含んでなる患者由来セグメントを作製した。このPDSを指標遺伝子ウイルスベク
ターに挿入してRTV-1033およびRTV-757と呼ばれる耐性試験ベクターを作製した
。次ぎにRTV-1033およびRTV-757を表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス
薬パネルに対する感受性のレベルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウ
イルス薬パネルはNRTI(AZT、3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジンお
よびネビラピン）、ならびにPRI（インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル
およびサキナビル）として知られているクラスのメンバーを含んでなるものであ
った。試験した各薬剤の耐性試験ベクタープールについてIC50を求めた。試験し
た薬剤すべてに対する感受性パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した
。患者RTV-1033についてNNRTI感受性パターンを観察したところ、デラビルジン
感受性においてはある程度の低下（30倍）を、ネビラピン感受性においては実質
的な低下（800倍を超える）を、またエファビレン感受性においては顕著な低下
（200倍）を示した。患者RTV-757についてNNRTI感受性パターンを観察したとこ
ろ、デラビルジン感受性においては若干の低下（10倍）を、またネビラピン感受
性においては実質的な低下（800倍を超える）を示した。
【０１６２】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-1033およびRTV-757のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシン
グにより解析した。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と
比較した(HIV配列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関
して遺伝子型を調べた。RTV-1033に関する突然変異は対照配列に対してV35I、D6
7N、T69D、K70R、V106A、V189L、T200A、I202T、R211K、T215F、D218E、K219Q、
H221Y、F227L、L228H、およびR284の位置に見られた。RTV-1033に関する突然変
異は対照配列に対してV35I、D67N、T69D、K70R、V106A、V108I、L109V、Y108C、
V189L、T200A、I202T、R211K、T215F、D218E、K219Q、H211Y、L228H、L283I、お
よびR284Kの位置に見られた。V106A、V108I、およびL109Vの位置は野生型と変異
型の混合物であった。D67N、T69D、K70R、T215F、およびK219QはNRTI耐性に関与
している。V35I、T200A、R211KおよびR284Kにおける突然変異はHIVの種々の野生
型（薬剤感受性）変異体間で公知の配列多形性を有する。V106Aにおける突然変
異はネビラピン耐性と関与していることがこれまでに示されている。V189Iにお
ける突然変異はNNRTI耐性と関与していることがこれまでに示されているが、こ
の位置でのLへの突然変がNNRTI耐性と関与しているという報告はこれまでにはな
かった。V108Iにおける突然変異はデラビルジンおよびネビラピン両耐性の増強
に関与していることがこれまでに示されている。Y181Cにおける突然変異もまた
、デラビルジンおよびネビラピン両耐性の増強に関与していることがこれまでに
示されてる。発明者らは位置指定突然変異誘発およびin vitro表現型感受性試験
を用いて突然変異V106A、V189L、V181CおよびF227Lを調べ、認められた遺伝子型
における変化と表現型とを相関させた。
【０１６３】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターにV106A、V189L、V181CおよびF227L変異を単独または
組合せて導入した。次ぎにV106A変異を含む(V106A-RTV)、V189変異を含む(V189L
-RTV)を含む、V181C変異を含む(V181C-RTV)、F227Lを含む(F227L-RTV)、2つの突
然変異を含む(V106A-Y181C-RTVおよびV106A-V189L-RTVおよびV106A-F227-RTVお
よびV181C-F227-RTV)、ならびに3つの突然変異(V106A-Y181C-F227L-RTV)耐性試
験ベクターを先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果を、106、189、
181および227番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用いて
求めた結果と比較した。発明者らはこれら9つすべてのベクターにおけるNNRTI、
デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンに対する表現型感受性パターンを
求めた。野生型のバックグラウンド（すなわち、V106A変異単独）において、V10
6A-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性の若干の低下（5倍）、ネ
ビラピン感受性のある程度の低下（60倍）を、またエファビレンに対しては野生
型の感受性（1.7倍）を示した。野生型バックグラウンド（すなわち、V189L変異
単独）において、V189-RTVは野生型の対照RTVに対して、デラビルジン（1.8倍）
、ネビラピン（1.3倍）およびエファビレン（1.3倍）について野生型の感受性を
示した。野生型バックグラウンド（すなわち、V189C変異単独）において、Y181C
-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性の顕著な低下（100倍）、ネ
ビラピン感受性の実質的な低下（800倍を超える）、およびエファビレン感受性
の若干の低下（4倍）を示した。野生型バックグラウンド（すなわち、F227L変異
単独）において、F227L-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン（0.03倍）
およびエファビレン感受性（0.48倍）の増強、およびネビラピン感受性の若干の
低下（3倍）を示した。V106A-Y181C-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジ
ン感受性の若干の低下（3倍） 、ネビラピン感受性のある程度の低下（50倍）を、またエファビレンに対しては
野生型の感受性（1倍）を示した。V106A-F227-RTVは野生型の対照RTVに対してデ
ラビルジン感受性の若干の低下（3倍）、ネビラピン感受性の実質的な低下（800
倍を超える）、およびエファビレン感受性の若干の低下（8倍）を示した。Y181C
-F227L-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン（0.89倍）およびエファビ
レン感受性（0.99倍）の増強、およびネビラピン感受性の顕著な低下（285倍）
を示した。V106A-V181C-F227L-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受
性のある程度の低下（50倍）、ネビラピン感受性の実質的な低下（800倍を超え
る）、およびエファビレン感受性の若干の低下（12倍）を示した。
【０１６４】 実施例18 耐性試験ベクターと位置指定突然変異体を用いた、HIVにおけるNNRTI薬剤感受性
および耐性に関与する遺伝子型と表現型の相関:Y188、L100およびK103 耐性試験ベクターの調製および患者98-1058HIVサンプルの表現型解析 耐性試験ベクターは、98-1058と呼ばれる患者サンプルから実施例1に記載のよ
うにして構築した。この患者はそれまでにddI、d4T、AZT、3TC、ddCおよびアバ
カビル(NRTI)、インジナビルおよびアンプレナビル(PRI)、ならびにネビラピン(
NNRTI)で処置されていた。ウイルスRNAを単離し、RT/PCRを用いて、PRのすべて
およびRTのアミノ酸1-313をコードするウイルス配列を含んでなる患者由来セグ
メントを作製した。このPDSを指標遺伝子ウイルスベクターに挿入してRTV-1058
と呼ばれる耐性試験ベクターを作製した。RTV-1058の個々のクローンを選択し、
次ぎに表現型アッセイで試験して抗レトロウイルス薬パネルに対する感受性のレ
ベルを正確かつ定量的に測定した。この抗レトロウイルス薬パネルはNRTI(AZT、
3TC、d4T、ddIおよびddC)、NNRTI（デラビルジンおよびネビラピン）、ならびに
PRI（インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびサキナビル）として知
られているクラスのメンバーを含んでなるものであった。試験した各薬剤の耐性
試験ベクタープールについてIC50を求めた。試験した薬剤すべてに対する感受性
パターンを調べ、既知の感受性パターンと比較した。患者RTV-1058由来のクロー
ン4、5および10についてNNRTI感受性パターンを観察した。クローン4はデラビル
ジン感受性の顕著な低下（85倍）およびネビラピン感受性のペプチド実質的な低
下（800倍を超える）を示した。クローン5はデラビルジン感受性実質的な低下（
250倍）およびネビラピン感受性の顕著な低下（120倍）を示した。クローン10は
デラビルジン（250倍を超える）およびネビラピン感受性（800倍を超える）の実
質的な低下を示した。
【０１６５】 患者のHIVサンプルの遺伝子型の決定 RTV-1058のDNAはABIチェーンターミネーター自動シーケンシングにより解析し
た。このヌクレオチド配列を野生型分岐群B HIV-1の共通配列と比較した(HIV配
列データベースLos Alamos, NM)。対照配列とは異なる配列に関して遺伝子型を
調べた。突然変異は対照配列に対してM41L、A62V、D67N、T69SST、L74V、L100I
、K103N、V118I、I135T、T200S、L210W、およびT215Yの位置に見られた。L74Vお
よびL100Iは野生型と変異型の混合物であった。クローン4はK103NおよびY188Lの
位置に突然変異を含んでいた。クローン5はL100IおよびK103Nの位置に突然変異
を含んでいた。クローン10はL100I、K103NおよびY188Lの位置に突然変異を含ん
でいた。M41L、A62V、D67N、T69SST、L74V、L210W、およびT215YはNRTI耐性に関
与している。I135T、T200SおよびR211Tの位置における突然変異はHIVの種々の野
生型（薬剤感受性）変異体間で公知の配列多形性を有する。L100Iにおける突然
変異はデラビルジンおよびネビラピン耐性と関与していることがこれまでに示さ
れている。K103Nにおける突然変異はデラビルジン、ネビラピンおよびエファビ
レン耐性と関与していることがこれまでに示されている。発明者らは位置指定突
然変異誘発およびin vitro表現型感受性試験を用いて突然変異Y188L、L100Iおよ
びK103Nを調べ、認められた遺伝子型における変化と表現型とを相関させた。
【０１６６】 位置指定突然変異誘発を用いたHIVにおける抗レトロウイルス薬表現型感受性に
おける特異的突然変異の役割の確認 位置指定突然変異誘発のためのメガプライマー法(SakarおよびSommar, Ibid)
を用い、耐性試験ベクターに突然変異Y188L、L100IおよびK103Nを単独または組
合せて導入した。次ぎにY188L変異を含む(Y188L-RTV)、L100I変異を含む(L100I-
RTV)を含む、K103N変異を含む(K103N-RTV)、2つの突然変異を含む(K103E-Y188L-
RTVおよびL100I-K103N-RTV)、ならびに3つの突然変異(L100I-K103N-Y188L-RTV)
耐性試験ベクターを先に記載した表現型アッセイを用いて試験し、結果を、188
、100および103番が野生型である遺伝学的に定義された耐性試験ベクターを用い
て求めた結果と比較した。発明者らはこれら6つすべてのベクターにおけるNNRTI
、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンに対する表現型感受性パターン
を求めた。野生型のバックグラウンド（すなわち、Y188L変異単独）において、Y
188L-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン感受性の若干の低下（9倍）、
ネビラピン感受性の実質的な低下（800倍を超える）、およびエファビレン感受
性のある程度の低下（110倍）を示した。野生型バックグラウンド（すなわち、L
100I変異単独）において、L100I-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン（
30倍）およびエファビレン感受性（10倍）のある程度の低下、ならびにネビラピ
ン感受性のある程度の低下（10倍）および若干の低下（3倍）を示した。野生型
バックグラウンド（すなわち、K103M変異単独）において、K103N-RTVは野生型の
対照RTVに対してデラビルジン（50倍）、ネビラピン（55倍）およびエファビレ
ン感受性（30倍）のある程度の低下を示した。K103N-Y188L-RTVは野生型の対照R
TVに対してデラビルジン（250倍を超える）、ネビラピン（800倍を超える）、お
よびエファビレン感受性（250倍を超える）の実質的低下を示した。L100I-K103N
-RTVは野生型の対照RTVに対してデラビルジン（250倍を超える）およびエファビ
レン感受性（250倍を超える）の実質的な低下、ならびにネビラピン感受性のあ
る程度の低下（70倍）を示した。L100I-K103N-Y188L-RTVは 野生型の対照RTVに対してデラビルジン（250倍を超える）、ネビラピン（800倍
を超える）、およびエファビレン感受性（250倍を超える）のある程度の低下を
示した。新規な組合せは各突然変異単独に対して認められるパターンとは異なる
予期しなかった耐性パターンをもたらした。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、耐性試験ベクターである。患者由来セグメントおよび指標遺伝子を含
む耐性試験ベクターの概略図である。
【図２】 図２は、２細胞アッセイを示す。アッセイの概略図である。耐性試験ベクター
は、患者由来セグメントを指標遺伝子ウイルスベクターにクローニングすること
によって得られる。次いで、耐性試験ベクターは、両種性のネズミ白血病ウイル
ス（ＭＬＶ）エンベロープタンパク質あるいは感染を可能にする他のウイルスタ
ンパク質または細胞タンパク質を産生する発現ベクターと同時トランスフェクシ
ョンされる。患者由来配列によりコードされるプロテアーゼ（ＰＲ）および逆転
写酵素（ＲＴ）の遺伝子産物を含有する偽タイプ化ウイルス粒子が産生される。
次いで、粒子を集め、新鮮な細胞に感染させるために使用する。不完全なＰＲ配
列およびＲＴ配列を使用して、ルシフェラーゼ活性が機能的なＰＲおよびＲＴに
依存していないことが示された。ＰＲ阻害剤がトランスフェクション後に細胞に
加えられ、従って粒子が成熟している時には存在している。一方、ＲＴ阻害剤は
、ウイルス粒子感染時またはその前に細胞に加えられる。アッセイは、薬物の非
存在下、および広範囲の濃度にわたる薬物の存在下で行われる。ルシフェラーゼ
の量を測定し、阻害率（％）を、試験した種々の薬物濃度において計算する。
【図３】 図３は、表現型薬物感受性プロファイルの例である。データを、ｌｏｇ１０濃
度（ｕＭ）に対してルシフェラーゼ活性の阻害率をプロットすることによって分
析する。このプロットを使用して、ウイルス複製を５０％阻害するために必要と
される薬物濃度（ＩＣ５０）または９５％阻害するために必要とされる薬物濃度
（ＩＣ９５）を計算する。阻害曲線がより大きな薬物濃度の方に移動することは
、薬物耐性の証拠として解釈される。ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＡＺＴ
）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（デラビルジン）およびプロテアーゼ阻
害剤（リトナビル）に対する３つの典型的な曲線が示されている。薬物感受性（
耐性）の低下は、基準（処置前）サンプルと比較したとき、あるいは基準サンプ
ルが得られない場合にはＰＮＬ４−３またはＨＸＢ−２などの薬物感受性ウイル
スの対照と比較したときに、薬物感受性曲線がより大きな薬物濃度の方（右側）
に移動することに反映される。
【図４】 図４は、患者４８７の表現型薬物感受性および耐性プロファイルである。ＰＣ
Ｒに基づく表現型感受性アッセイを行い、デラビルジンおよびネビラピンの両方
に対する増大した耐性を示す表現型薬物感受性および耐性プロファイルが得られ
た。これは、ＮＮＲＴＩ感受性／耐性の最初のパターンの例である。血漿から得
られたこのウイルスを評価することによって、３ＴＣ耐性に関連するコドン１８
４での変異（Ｍ１８４Ｖ）、およびデラビルジン耐性およびネビラピン耐性の両
方に関連するコドン１０３での変異（Ｋ１０３Ｎ）を有するＨＩＶ逆転写酵素が
示された。
【図５】 図５は、部位特異的な逆転写酵素変異体の表現型薬物感受性および耐性プロフ
ァイルである。ＰＣＲに基づく表現型感受性アッセイを行い、コドン１０３およ
びコドン１８１における変異（Ｋ１０３Ｎ；Ｙ１８１Ｃ）を有し、デラビルジン
およびネビラピンの両方に対する耐性を示す部位特異的な変異体の表現型薬物感
受性および耐性プロファイルが得られた。この二重変異体により、耐性のさらな
る増大をもたらす両変異の付加的な作用が明らかにされる。
【図６】 図６は、患者２６８の表現型薬物感受性および耐性プロファイルである。ＰＣ
Ｒに基づく表現型感受性アッセイを行い、ネビラピンではなく、デラビルジンに
対する表現型耐性を有するＨＩＶ逆転写酵素を有する血漿から得られたウイルス
の評価を示す表現型薬物感受性および耐性プロファイルが得られた。これは、Ｎ
ＮＲＴＩ感受性／耐性の２番目のパターンの例である。この患者のウイルスは、
試験したプロテアーゼ阻害剤のすべてに対して耐性であり、ＡＺＴおよび３ＴＣ
に対する著しい耐性をも有し、ｄｄＣ、ｄｄＩおよびｄ４Ｔに対する感受性のわ
ずかな移動を示す。ＰＣＲおよび配列決定に基づく遺伝子型アッセイを使用して
血漿から得られたこのウイルスを評価することによって、コドン１０３およびコ
ドン２３６における変異（Ｋ１０３Ｎ；Ｐ２３６Ｌ）を有するＨＩＶ逆転写酵素
が示された。Ｐ２３６Ｌの変異は、デラビルジン耐性およびネビラピン過敏性を
引き起こすと以前に報告されていた（Ｄｕｅｗｅｋｅ ＴＪら、（１９９３）Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０、４７１３〜４７１７）。
しかし、この患者サンプルにおいては、デラビルジン耐性であったが、ネビラピ
ン感受性は野生型と同じであった。
【図７】 図７は、部位特異的な逆転写酵素変異体（Ｐ２３６Ｌ）の表現型薬物感受性お
よび耐性プロファイルである。ＰＣＲに基づく表現型感受性アッセイを行い、Ｐ
２３６Ｌの部位特異的な変異生成変異体のデラビルジンおよびネビラピンに対す
る感受性を示す表現型薬物感受性および耐性プロファイルが得られた。この結果
は、図６に示される患者ウイルスサンプルで認められた結果と同一である。その
下の２つの図はＫ１０３Ｎの部位特異的な変異生成変異体を示し、下段の２つの
図は二重変異体Ｋ１０３Ｎ＋Ｐ２３６Ｌを示す。Ｐ２３６Ｌの変異は、デラビル
ジンに対する深刻な耐性を引き起こすＫ１０３Ｎに対して付加的であるが、Ｋ１
０３Ｎによるネビラピン耐性に対する作用を有しない。右側の図には、Ｐ２３６
Ｌの変異がＹ１８１−＞Ｃの変異に加えられたときの類似する結果が示されてい
る。
【図８Ａ】 図８Ａは、患者３０２の表現型薬物感受性および耐性プロファイルである。こ
れは、ＮＮＲＴＩ感受性／耐性の３番目のパターンの例である。患者ウイルスの
表現型分析により、デラビルジンおよびネビラピンの両方に対する低下した感受
性が明らかにされた。このパターンは、デラビルジン感受性の低下と比較された
とき、ネビラピン感受性のより大きな低下を特徴とする。患者ウイルスの遺伝子
型分析により、デラビルジン耐性およびネビラピン耐性に関連したＫ１０３Ｎ、
およびＰ２２５ＨのＲＴ変異の存在が明らかにされた。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、患者７８０の表現型薬物感受性および耐性プロファイルである。こ
れは、ＮＮＲＴＩ感受性／耐性の３番目のパターンの第二の例である。患者ウイ
ルスの表現型分析により、デラビルジンおよびネビラピンの両方に対する低下し
た感受性が明らかにされた。このパターンは、デラビルジン感受性の低下と比較
されたとき、ネビラピン感受性のより大きな低下を特徴とする。患者ウイルスの
遺伝子型分析により、ネビラピン耐性およびデラビルジン耐性に関連したＫ１０
３Ｎ、およびＰ２２５ＨのＲＴ変異の存在が明らかにされた。
【図８Ｃ】 図８Ｃは、患者３０２の個々のウイルスクローンの表現型薬物感受性および耐
性プロファイルである。患者３０２から得られた個々のウイルスクローンの遺伝
子型分析により、Ｐ２２５Ｈ変異を伴うことなくＫ１０３Ｎの変異を含有するウ
イルス（Ｋ１０３Ｎ、Ｉ１３５Ｍ、Ｒ２１１Ｋ）、およびＰ２２５Ｈの変異とと
もにＫ１０３Ｎの変異を含有するウイルス（Ｋ１０３Ｎ、Ｐ２２５Ｈ）が明らか
にされた。これらのウイルスクローンの表現型特徴付けにより、Ｐ２２５Ｈの変
異は、Ｋ１０３Ｎの変異に関連するデラビルジン耐性量を低下させる（下段を比
較のこと）が、Ｋ１０３Ｎの変異に関連するネビラピン耐性量を変化させない（
上段を比較のこと）ことが示される。
【図８Ｄ】 図８Ｄは、部位特異的な逆転写酵素変異体の表現型薬物感受性および耐性プロ
ファイルである。部位特異的なＲＴ変異のＰ２２５Ｈを含有するウイルスの表現
型特徴付けにより、この変異は、デラビルジンに対する感受性を増大させるが、
ネビラピンに対する感受性を増大させないことが示される（上段を比較のこと）
。部位特異的なＲＴ変異のＰ２２５Ｈ＋Ｋ０１３ＮまたはＰ２２５Ｈ＋Ｙ１８１
Ｃを含有するウイルスの表現型特徴付けにより、Ｐ２２５Ｈの変異は、Ｋ１０３
ＮまたはＹ１８１Ｃのいずれかに関連するデラビルジン耐性量を低下させるが、
Ｋ１０３ＮまたはＹ１８１Ｃに関連するネビラピン耐性量を低下させないことが
示される。デラビルジンに対してであるが、ネビラピンに対してではない（対応
する中段および下段を比較のこと）。
【図９Ａ】 図９Ａは、患者６４４の表現型薬物感受性および耐性プロファイルである。こ
れは、ＮＮＲＴＩ感受性および耐性の４番目のパターンの例である。患者ウイル
スの表現型分析により、デラビルジンではなく、ネビラピンに対する感受性の大
きな低下が明らかにされた。患者ウイルスの表現型分析により、アテビルジン、
ＤＭＰ２６６、Ｌ−６９７、６６１およびＵＣ−１０、３８、５７に対する感受
性の低下に関連するＫ１０１Ｅ変異（Ｓｃｈｉｎａｚｉ、Ｍｅｌｌｏｒｓ、Ｌａ
ｒｄｅｒ耐性表）だけでなく、ＲＴ変異Ｇ１９０Ｓの存在が明らかにされた。
【図９Ｂ】 図９Ｂは、部位特異的な逆転写酵素変異体の表現型薬物感受性および耐性プロ
ファイルである。部位特異的なＲＴ変異のＧ１９０ＡまたはＧ１９０Ｓのいずれ
かを含有するウイルスの表現型特徴付けにより、これらの変異は、ネビラピンに
対する感受性を大きく低下させ、デラビルジンに対する感受性をわずかに増大さ
せていることが示されている（上段を比較のこと）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ

Claims (72)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 HIV感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス
    療法をモニターする方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から血漿サンプルを採取することと； （ｂ）前記血漿サンプルが、コドン236に変異をもったHIV逆転写酵素をコード
    する核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジンに対する感受性の低下およびネビラピン感受
    性における僅かの変化または無変化と相関している方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記コドン236における変
    異はロイシンをコードする方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコドン10
    3、コドン181またはその両方に追加の変異を有する方法。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、コドン103における変異は
    アスパラギン（N）をコードし、コドン181における変異はシステイン（C）をコ
    ードする方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗レト
    ロウイルス剤で治療されている方法。
  6. 【請求項６】 HIV感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方
    法であって： （ａ）前記HIV感染患者から生物学的サンプルを採取することと； （ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン225に変異をもったHIV逆転写酵素をコ
    ードする核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジンに対する感受性の増加およびネビラピン感受
    性における僅かの変化または無変化と相関している方法。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、前記変異したコドン225は
    ヒスチジン（H）をコードする方法。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗レト
    ロウイルス剤で治療されている方法。
  9. 【請求項９】 請求項６に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコドン10
    3、コドン181またはその両方に追加の変異を有する方法。
  10. 【請求項１０】 HIV感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する
    方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から生物学的サンプルを採取することと； （ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン190に変異をもったHIV逆転写酵素をコ
    ードする核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジン感受性の増加およびネビラピン感受性の低下
    と相関している方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、前記コドン190におけ
    る変異はアラニンまたはセリンをコードする方法。
  12. 【請求項１２】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン236における変異およびコド
    ン103および／または181における変異ならびに指標物質の遺伝子を含む耐性試験
    ベクターをホスト細胞の中に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  13. 【請求項１３】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン225における変異およびコド
    ン103における変異ならびに指標物質を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中
    に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  14. 【請求項１４】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）コドン236に変異を有する逆転写酵素をコードする患者由来のセグメン
    トおよび指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入するこ
    とと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質遺伝子の発現を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質遺伝子の発現を、前記抗レトロウイ
    ルス薬剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測
    定された前記指標物質遺伝子の発現と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  15. 【請求項１５】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）コドン225に変異を有する逆転写酵素をコードする患者由来のセグメン
    トおよび指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入するこ
    とと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質遺伝子の発現を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質遺伝子の発現を、前記抗レトロウイ
    ルス薬剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測
    定された前記指標物質遺伝子の発現と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  16. 【請求項１６】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性
    を評価するための方法であって： （ａ）コドン190に変異を有する逆転写酵素をコードする患者由来のセグメン
    トおよび指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入するこ
    とと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質遺伝子の発現を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質遺伝子の発現を、前記抗レトロウイ
    ルス薬剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測
    定された前記指標物質遺伝子の発現と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  17. 【請求項１７】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン190に変異を有する
    逆転写酵素および指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物
    質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  18. 【請求項１８】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン225に変異を有する
    逆転写酵素および指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物
    質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  19. 【請求項１９】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン236に変異を有する
    逆転写酵素および指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物
    質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１７に記載の耐性試験ベクターであって、前記コド
    ン190に変異を有する患者由来のセグメントは、更に、コドン103に変異を含む耐
    性試験ベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項１８に記載の耐性試験ベクターであって、前記コド
    ン225に変異を有する患者由来のセグメントは、更に、コドン103に変異を含む耐
    性試験ベクター。
  22. 【請求項２２】 請求項１９に記載の耐性試験ベクターであって、前記コド
    ン236に変異を有する患者由来のセグメントは、更に、コドン103および／または
    181に変異を含む耐性試験ベクター。
  23. 【請求項２３】 HIV感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイル
    ス療法を評価する方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から血漿サンプルを採取することと； （ｂ）前記血漿サンプルが、コドン230に変異をもったHIV逆転写酵素をコード
    する核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジンおよびネビラピンに対する感受性の低下と相
    関している方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、前記コドン230におけ
    る変異はロイシン（L）をコードする方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２３に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコド
    ン181またはその両方に追加の変異を有する方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法であって、コドン281における変
    異はシステイン（C）をコードする方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２３に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗
    レトロウイルス剤で治療されている方法。
  28. 【請求項２８】 HIV感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイル
    ス療法を評価する方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から血漿サンプルを採取することと； （ｂ）前記血漿サンプルが、コドン181に変異をもったHIV逆転写酵素をコード
    する核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジンおよびネビラピンに対する感受性の低下、並
    びにエファビレンツ感受性における僅かの変化または無変化と相関している方法
    。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の方法であって、前記コドン181におけ
    る変異はシステイン（C）をコードする方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２８に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコド
    ン98、コドン106。コドン227またはその組合せに追加の変異を有する方法。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載の方法であって、コドン98における変異
    はグリシン（G）をコードし、コドン106における変異はアラニン（A）をコード
    し、コドン227における変異はロイシン（L）をコードする方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２８に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗
    レトロウイルス剤で治療されている方法。
  33. 【請求項３３】 HIV感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイル
    ス療法の有効性を評価する方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から生物学的サンプルを採取することと； （ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン188に変異をもったHIV逆転写酵素をコ
    ードする核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する
    感受性の減少と相関している方法。
  34. 【請求項３４】 請求項２３に記載の方法であって、前記コドン188におけ
    る変異はロイシン（L）、システイン（C）またはヒスチジン（H）をコードする
    方法。
  35. 【請求項３５】 請求項３３に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコド
    ン138、コドン103、コドン100またはその組合せに追加の変異を有する方法。
  36. 【請求項３６】 請求項３５に記載の方法であって、前記コドン138におけ
    る変異はアラニン（A）をコードし、コドン103における変異はアスパラギン（N
    ）をコードし、コドン100における変異はイソロイシン（I）をコードする方法。
  37. 【請求項３７】 請求項３３に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗
    レトロウイルス剤で治療されている方法。
  38. 【請求項３８】 HIV感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイル
    ス療法の有効性を評価する方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から生物学的サンプルを採取することと； （ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン190に変異をもったHIV逆転写酵素をコ
    ードする核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジン感受性の増加、並びにネビラピンおよびエフ
    ァビレンツに対する感受性の低下と相関している方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の方法であって、前記コドン190におけ
    る変異はアラニン（A）またはセリン（S）をコードする方法。
  40. 【請求項４０】 請求項３８に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコド
    ン98、コドン101もしくはコドン103またはその組合せに追加の変異を有する方法
    。
  41. 【請求項４１】 請求項４０に記載の方法であって、前記コドン98における
    変異はグリシン（G）をコードし、コドン101における変異はグルタミン酸（E）
    をコードし、コドン103における変異はアスパラギン（N）をコードする方法。
  42. 【請求項４２】 請求項３８に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗
    レトロウイルス剤で治療されている方法。
  43. 【請求項４３】 HIV感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイル
    ス療法の有効性を評価する方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から生物学的サンプルを採取することと； （ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン106に変異をもったHIV逆転写酵素をコ
    ードする核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジンおよびネビラピンに対する感受性の減少、並
    びにエファビレンツ感受性感受性における僅かの変化または無変化と相関してい
    る方法。
  44. 【請求項４４】 請求項４３に記載の方法であって、前記コドン106におけ
    る変異はアラニン（A）をコードする方法。
  45. 【請求項４５】 請求項４３に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコド
    ン227およびコドン189またはその組合せに追加の変異を有する方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載の方法であって、前記コドン227におけ
    る変異はロイシン（L）をコードし、コドン189における変異はロイシン（L）を
    コードする方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４３に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗
    レトロウイルス剤で治療されている方法。
  48. 【請求項４８】 HIV感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイル
    ス療法の有効性を評価する方法であって： （ａ）前記HIV感染患者から生物学的サンプルを採取することと； （ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン103に変異をもったHIV逆転写酵素をコ
    ードする核酸を含有するかどうかを評価することとを含み、 前記変異の存在は、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する
    感受性の低下と相関している方法。
  49. 【請求項４９】 請求項４８に記載の方法であって、前記コドン103におけ
    る変異はアスパラギン（N）をコードする方法。
  50. 【請求項５０】 請求項４８に記載の方法であって、前記逆転写酵素はコド
    ン100またはその組合せに追加の変異を有する方法。
  51. 【請求項５１】 請求項５０に記載の方法であって、前記コドン100におけ
    る変異はイソロイシン（I）をコードする方法。
  52. 【請求項５２】 請求項４８に記載の方法であって、前記HIV感染患者は抗
    レトロウイルス剤で治療されている方法。
  53. 【請求項５３】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン230における変異およびコド
    ン181における変異ならびに指標物質の遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト
    細胞の中に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  54. 【請求項５４】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン181における変異およびコド
    ン98および／または106および／または227における変異ならびに指標物質を含む
    耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  55. 【請求項５５】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン188における変異およびコド
    ン138および／または103および／または100における変異ならびに指標物質を含
    む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  56. 【請求項５６】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン190における変異およびコド
    ン98および／または101および／または103における変異ならびに指標物質を含む
    耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  57. 【請求項５７】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン106における変異およびコド
    ン227および／または189における変異ならびに指標物質を含む耐性試験ベクター
    をホスト細胞の中に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  58. 【請求項５８】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）患者由来のセグメントを含み、更にコドン103における変異およびコド
    ン100における変異ならびに指標物質を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中
    に導入することと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質の測定を、前記抗レトロウイルス薬
    剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定され
    た前記指標物質の測定と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  59. 【請求項５９】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）コドン230に変異を有する逆転写酵素をコードする患者由来のセグメン
    トおよび指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入するこ
    とと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質遺伝子の発現を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質遺伝子の発現を、前記抗レトロウイ
    ルス薬剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測
    定された前記指標物質遺伝子の発現と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  60. 【請求項６０】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）コドン227に変異を有する逆転写酵素をコードする患者由来のセグメン
    トおよび指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入するこ
    とと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質遺伝子の発現を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質遺伝子の発現を、前記抗レトロウイ
    ルス薬剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測
    定された前記指標物質遺伝子の発現と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  61. 【請求項６１】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）コドン188に変異を有する逆転写酵素をコードする患者由来のセグメン
    トおよび指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入するこ
    とと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質遺伝子の発現を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質遺伝子の発現を、前記抗レトロウイ
    ルス薬剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測
    定された前記指標物質遺伝子の発現と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  62. 【請求項６２】 HIV抗レトロウイルス薬剤化合物候補の生物学的有効性を
    評価するための方法であって： （ａ）コドン189に変異を有する逆転写酵素をコードする患者由来のセグメン
    トおよび指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターをホスト細胞の中に導入するこ
    とと； （ｂ）ステップ（ａ）で得たホスト細胞を培養することと； （ｃ）標的ホスト細胞における前記指標物質遺伝子の発現を測定することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た前記指標物質遺伝子の発現を、前記抗レトロウイ
    ルス薬剤化合物候補の不存在下で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測
    定された前記指標物質遺伝子の発現と比較することとを含み、 前記ステップ（ａ）〜（ｃ）；ステップ（ｂ）〜（ｃ）；または前記ステップ
    （ｃ）に、試験濃度の前記抗レトロウイルス薬剤化合物候補を存在せしめる方法
    。
  63. 【請求項６３】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン230に変異を有する
    逆転写酵素および指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物
    質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  64. 【請求項６４】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン227に変異を有する
    逆転写酵素および指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物
    質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  65. 【請求項６５】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン188に変異を有する
    逆転写酵素および指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物
    質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  66. 【請求項６６】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン189に変異を有する
    逆転写酵素および指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物
    質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  67. 【請求項６７】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン181、コドン98、コ
    ドン106およびコドン227またはこれらの組合せに変異を有する逆転写酵素ならび
    に指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物質遺伝子の発現
    は前記患者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  68. 【請求項６８】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン106、コドン227お
    よびコドン189またはこれらの組合せに変異を有する逆転写酵素ならびに指標物
    質遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記指標物質遺伝子の発現は前記患
    者由来のセグメントに依存する耐性試験ベクター。
  69. 【請求項６９】 HIV患者由来の切片を含み、更にコドン103およびコドン10
    1に変異を有する逆転写酵素ならびに指標物質遺伝子を含む耐性試験ベクターで
    あって、前記指標物質遺伝子の発現は前記患者由来のセグメントに依存する耐性
    試験ベクター。
  70. 【請求項７０】 請求項１７に記載の耐性試験ベクターであって、前記コド
    ン190に変異を有する患者由来のセグメントは、更に、コドン98およびコドン101
    またはこれらの組合せに変異を含む耐性試験ベクター。
  71. 【請求項７１】 請求項６３に記載の耐性試験ベクターであって、前記コド
    ン230に変異を有する患者由来のセグメントは、更に、コドン181に変異を含む耐
    性試験ベクター。
  72. 【請求項７２】 請求項６５に記載の耐性試験ベクターであって、前記コド
    ン188に変異を有する患者由来のセグメントは、更に、コドン138、コドン103お
    よびコドン190またはこれらの組合せに変異を含む耐性試験ベクター。
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