JP2002514411A - サイズ拡大型繊維素溶解酵素、及び繊維素溶解酵素のサイズ変更方法 - Google Patents
サイズ拡大型繊維素溶解酵素、及び繊維素溶解酵素のサイズ変更方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、線維素溶解性酵素であるフィブロラーゼのα２−マクログロブリンとの相互作用を小さくするようにすることによって、より少ない投与用量で、該繊維素溶解酵素による血栓溶解をより迅速かつ効果的にすることを課題とするものである。
【解決手段】 少なくとも１つの大きな有機分子をフィブロラーゼに共有結合させることによって修飾されたサイズ拡大型繊維素溶解酵素を解決手段とし、この大きな有機分子としてはポリエチレングリコールを用いる。
Description
【０００１】
本発明は、一般には生化学の分野に関し、詳細には繊維素溶解酵素のサイズ修
飾に関する。
飾に関する。
【０００２】
本出願は米国仮特許出願第６０／０８４８３３号（１９９８年５月８日出願）
の利益を主張するものである。 フィブロラーゼは、ミナミアメリカマムシ（Agkistrodon contortrix contort
rix）の毒液から単離されたメタロプロテイナーゼである。フィブロラーゼは、
約２３ｋＤａの小さな毒液メタロプロテイナーゼの代表的なものである。この酵
素は、フィブリンおよびフィブリノーゲンのα鎖およびβ鎖を切断するタンパク
質分解活性を有する。フィブリンは閉塞性血栓の主成分であるため、フィブロラ
ーゼの分解作用によって、血栓は溶解され、除去される。フィブロラーゼの繊維
素溶解活性は試験管および動物モデルの両方で調べられている。この酵素は、フ
ィブリン凝塊を効果的に溶解することがインビトロ［Guan, A. L. 他、Arch. Bi
ochem. Biophys. ２８９：１９７〜２０７（１９９１）］で明らかにされ、そし
てインビボ［Markland, F. S. 他、Circulation、９０：２４４８〜２４５６（
１９９４）；Markland, F. S. 他、Natural Toxins II（Singh, B. R. およびTu
, A. T. 編）、４２７頁〜４３８頁、Plenum Press, New York（１９９６）］で
明らかにされている。フィブロラーゼは十分に発達した血栓を分解できるが、こ
の構造体の形成に対する作用は有していない。
の利益を主張するものである。 フィブロラーゼは、ミナミアメリカマムシ（Agkistrodon contortrix contort
rix）の毒液から単離されたメタロプロテイナーゼである。フィブロラーゼは、
約２３ｋＤａの小さな毒液メタロプロテイナーゼの代表的なものである。この酵
素は、フィブリンおよびフィブリノーゲンのα鎖およびβ鎖を切断するタンパク
質分解活性を有する。フィブリンは閉塞性血栓の主成分であるため、フィブロラ
ーゼの分解作用によって、血栓は溶解され、除去される。フィブロラーゼの繊維
素溶解活性は試験管および動物モデルの両方で調べられている。この酵素は、フ
ィブリン凝塊を効果的に溶解することがインビトロ［Guan, A. L. 他、Arch. Bi
ochem. Biophys. ２８９：１９７〜２０７（１９９１）］で明らかにされ、そし
てインビボ［Markland, F. S. 他、Circulation、９０：２４４８〜２４５６（
１９９４）；Markland, F. S. 他、Natural Toxins II（Singh, B. R. およびTu
, A. T. 編）、４２７頁〜４３８頁、Plenum Press, New York（１９９６）］で
明らかにされている。フィブロラーゼは十分に発達した血栓を分解できるが、こ
の構造体の形成に対する作用は有していない。
【０００３】 フィブロラーゼは試験管内でフィブリン（フィブリノーゲン）を分解するが、
循環中では、この酵素はα２−マクログロブリン（α２Ｍ）によって効率的に不
活性化されている。インビボでの完全な血栓溶解を可能にするためには、フィブ
ロラーゼは、α２Ｍによってその迅速な不活性化が阻止されなければならない。
α２Ｍは、かなり高い濃度（約３μＭ）で循環系に存在する一般的なプロテアー
ゼ阻害剤である。この阻害剤は小さなプロテアーゼに結合して、これを封鎖し、
プロテイナーゼと非常に大きな７２０ｋＤａの四量体阻害剤分子との共有結合を
形成することによって循環からプロテアーゼを除くことができる。
循環中では、この酵素はα２−マクログロブリン（α２Ｍ）によって効率的に不
活性化されている。インビボでの完全な血栓溶解を可能にするためには、フィブ
ロラーゼは、α２Ｍによってその迅速な不活性化が阻止されなければならない。
α２Ｍは、かなり高い濃度（約３μＭ）で循環系に存在する一般的なプロテアー
ゼ阻害剤である。この阻害剤は小さなプロテアーゼに結合して、これを封鎖し、
プロテイナーゼと非常に大きな７２０ｋＤａの四量体阻害剤分子との共有結合を
形成することによって循環からプロテアーゼを除くことができる。
【０００４】 プロテイナーゼとα２Ｍとの相互作用は立体的な影響を受け、プロテイナーゼ
のサイズと直接関連しているようである［Werb, Z. 他、Biochemical Journal、
１３９：３５９〜３６８（１９７４）］。ガラガラヘビ（Crotalus atrox）から
得られる６８ｋＤａの出血性メタロプロテイナーゼはα２Ｍで阻害されないが、
別の非常に関連する、より小さな２３ｋＤａのメタロプロテイナーゼは、α２Ｍ
により迅速かつ効果的に結合して阻害される［Baramova, E. N. 他、Biochemist
ry、２９：１０６９〜１０７４（１９９０）］。プロテイナーゼがα２Ｍに一旦
結合すると、プロテイナーゼは、本質的に、循環から除かれ、標的分子（フィブ
ロラーゼの場合、血栓）に作用することができない。
のサイズと直接関連しているようである［Werb, Z. 他、Biochemical Journal、
１３９：３５９〜３６８（１９７４）］。ガラガラヘビ（Crotalus atrox）から
得られる６８ｋＤａの出血性メタロプロテイナーゼはα２Ｍで阻害されないが、
別の非常に関連する、より小さな２３ｋＤａのメタロプロテイナーゼは、α２Ｍ
により迅速かつ効果的に結合して阻害される［Baramova, E. N. 他、Biochemist
ry、２９：１０６９〜１０７４（１９９０）］。プロテイナーゼがα２Ｍに一旦
結合すると、プロテイナーゼは、本質的に、循環から除かれ、標的分子（フィブ
ロラーゼの場合、血栓）に作用することができない。
【０００５】
本発明によれば、線維素溶解酵素であるフィブロラーゼは、その血栓溶解活性
の効果を変えないで、フィブロラーゼのサイズを変える水溶性の大きい有機分子
との共有結合によって修飾される。その立体サイズおよび回転サイズが増大した
ことによりサイズ修飾されたフィブロラーゼは、より小さな速度論でα２Ｍと相
互作用することができ、従って、より長い活性の循環半減期を有することができ
る。フィブロラーゼのα２Ｍとの相互作用が小さくなることによって、より少な
い投与用量における繊維素溶解酵素による血栓溶解は、より迅速かつ効果的にな
る。
の効果を変えないで、フィブロラーゼのサイズを変える水溶性の大きい有機分子
との共有結合によって修飾される。その立体サイズおよび回転サイズが増大した
ことによりサイズ修飾されたフィブロラーゼは、より小さな速度論でα２Ｍと相
互作用することができ、従って、より長い活性の循環半減期を有することができ
る。フィブロラーゼのα２Ｍとの相互作用が小さくなることによって、より少な
い投与用量における繊維素溶解酵素による血栓溶解は、より迅速かつ効果的にな
る。
【０００６】 繊維素溶解酵素（フィブロラーゼ、あるいはガラガラヘビ（Crotalus）種また
はマムシ（Agkistridon）種の類似した小さな繊維素溶解酵素（例えば、A. pisc
ovirus conantiの繊維素溶解酵素［Retzios, A. D. 他、Protein Expressing Pu
rification、１（１）：３３〜３９（１９９０）］またはC. basiliscus basili
scusの繊維素溶解酵素［Retzios, A. D. 他、Protein Expressing Purification
、１（１）：３３〜３９（１９９０）；Retzios, A. D. 他、Biochemistry、３
１：４５４７〜４５５７（１９９２）］）、あるいは他の生物から単離された酵
素を含むが、これらに限定されない）のサイズ修飾は多数の種々の方法で行うこ
とができる。
はマムシ（Agkistridon）種の類似した小さな繊維素溶解酵素（例えば、A. pisc
ovirus conantiの繊維素溶解酵素［Retzios, A. D. 他、Protein Expressing Pu
rification、１（１）：３３〜３９（１９９０）］またはC. basiliscus basili
scusの繊維素溶解酵素［Retzios, A. D. 他、Protein Expressing Purification
、１（１）：３３〜３９（１９９０）；Retzios, A. D. 他、Biochemistry、３
１：４５４７〜４５５７（１９９２）］）、あるいは他の生物から単離された酵
素を含むが、これらに限定されない）のサイズ修飾は多数の種々の方法で行うこ
とができる。
【０００７】 付加される基は、任意の化学的に不活性な大きな水溶性の非荷電有機分子であ
って、約５，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａの分子量を有し、酵素に対する付
加に必要な成分を含有する有機分子であり得る。ポリエチレングリコールによっ
て例示される炭素原子が２個〜５個のポリアルキレングリコールは、酵素に対す
る付加に好適な分子である。他の好適な大きな有機分子には、ポリアラニン、ポ
リグリシンおよびポリリシンなどの単一アミノ酸のポリマーが含まれる。あるい
は、ポリエチレンおよびポリビニルなどの大きな有機ポリマーを使用することが
できる。さらに、抗体に由来するＦａｂフラグメントなどの天然のヒトタンパク
質は、好適な大きな有機分子であり得る。
って、約５，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａの分子量を有し、酵素に対する付
加に必要な成分を含有する有機分子であり得る。ポリエチレングリコールによっ
て例示される炭素原子が２個〜５個のポリアルキレングリコールは、酵素に対す
る付加に好適な分子である。他の好適な大きな有機分子には、ポリアラニン、ポ
リグリシンおよびポリリシンなどの単一アミノ酸のポリマーが含まれる。あるい
は、ポリエチレンおよびポリビニルなどの大きな有機ポリマーを使用することが
できる。さらに、抗体に由来するＦａｂフラグメントなどの天然のヒトタンパク
質は、好適な大きな有機分子であり得る。
【０００８】 付加された大きな有機分子はそれぞれ、何らかの反応し得る成分を加えないで
も、酵素の回転サイズを大きく増大させる。大きな有機分子を繊維素溶解酵素に
付加させる１つの方法は、修飾するための大きな有機分子に含まれるＮＨＳエス
テルによる共有結合によって例示される。ＮＨＳエステルは、フィブロラーゼま
たは任意の他の毒素繊維素溶解酵素の表面リシン残基のε−アミノ基と反応して
、共有結合したアミド結合を生成する。
も、酵素の回転サイズを大きく増大させる。大きな有機分子を繊維素溶解酵素に
付加させる１つの方法は、修飾するための大きな有機分子に含まれるＮＨＳエス
テルによる共有結合によって例示される。ＮＨＳエステルは、フィブロラーゼま
たは任意の他の毒素繊維素溶解酵素の表面リシン残基のε−アミノ基と反応して
、共有結合したアミド結合を生成する。
【０００９】 サイズ修飾された繊維素溶解酵素の１つのタイプを作製する方法を下記に詳し
く記載する。繊維素溶解酵素の活性保持に対するサイズ修飾剤付加の程度を決定
するために本発明者らが行った特異的なアッセイに関する細部もまた含まれる。
く記載する。繊維素溶解酵素の活性保持に対するサイズ修飾剤付加の程度を決定
するために本発明者らが行った特異的なアッセイに関する細部もまた含まれる。
【００１０】
＜修飾された繊維素溶解酵素の作製方法および活性測定方法＞ Ａ．天然型フィブロラーゼの精製：Agkistridon contortrix contortrix（ミナ
ミアメリカマムシ）の粗毒液は、それぞれが異なる活性を有する多数の種々のタ
ンパク質からなる。フィブロラーゼは、毒液の主要なタンパク質の１つである。
フィブロラーゼの精製に関する方法論は、Marklandの実験室によって発表されて
いる［Loayza, S. L. 他、J. Chromatog. B. ６６２：２２７〜２４３（１９９
４）］。これは、異なるタイプの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を各
段階で用いるかなり簡便な３段階のクロマトグラフィー精製である。最初の段階
は、フィブロラーゼが負荷サンプル中のそれ以外のタンパク質の大部分から分離
される疎水性相互作用ＨＰＬＣである。ヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）ＨＰ
ＬＣによって、ほぼ最終的な精製が可能になる。ＨＡＰカラムから得られた繊維
素溶解活性を含有するサンプルは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した場合、分子量が２３ｋＤａの単
一バンドのみを含む。ポリＣＡＴ−Ａカチオン交換ＨＰＬＣカラムでの最終精製
によって、フィブロラーゼの２つの異なるイソ型が分離される。イソ型はともに
、インビトロで試験されたときに同一の血栓溶解活性を有する。この２つのイソ
型の差は、グルタミン残基が２つのイソ型の一方のアミノ末端から切断されてい
ることである。
ミアメリカマムシ）の粗毒液は、それぞれが異なる活性を有する多数の種々のタ
ンパク質からなる。フィブロラーゼは、毒液の主要なタンパク質の１つである。
フィブロラーゼの精製に関する方法論は、Marklandの実験室によって発表されて
いる［Loayza, S. L. 他、J. Chromatog. B. ６６２：２２７〜２４３（１９９
４）］。これは、異なるタイプの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を各
段階で用いるかなり簡便な３段階のクロマトグラフィー精製である。最初の段階
は、フィブロラーゼが負荷サンプル中のそれ以外のタンパク質の大部分から分離
される疎水性相互作用ＨＰＬＣである。ヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）ＨＰ
ＬＣによって、ほぼ最終的な精製が可能になる。ＨＡＰカラムから得られた繊維
素溶解活性を含有するサンプルは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した場合、分子量が２３ｋＤａの単
一バンドのみを含む。ポリＣＡＴ−Ａカチオン交換ＨＰＬＣカラムでの最終精製
によって、フィブロラーゼの２つの異なるイソ型が分離される。イソ型はともに
、インビトロで試験されたときに同一の血栓溶解活性を有する。この２つのイソ
型の差は、グルタミン残基が２つのイソ型の一方のアミノ末端から切断されてい
ることである。
【００１１】 Ｂ．水溶性のＮＨＳ含有の大きな有機分子を結合させるフィブロラーゼのサイ
ズ変更方法：一級アミンに付加し得るＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）
エステルを含有する活性化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が市販され
ている。図１を参照［Clark, R. 他、Journal of Biological Chemistry、２７
１（３６）：２１９６９〜２１９７７（１９９６）］。タンパク質のα−アミノ
基は必ずしも付加に利用されないため、修飾には、リシンのε−アミノ基が一般
に使用される。ＮＨＳエステルの付加がフィブロラーゼを修飾するために使用さ
れ、良好な結果が得られている。これにより、分子量が約５，０００Ｄａ〜約５
０，０００Ｄａ（好ましくは、約１０，０００Ｄａ〜約３０，０００Ｄａ）のポ
リエチレングリコールが表面のリシン残基（１つまたは複数）に結合する。ＰＥ
Ｇ化されたフィブロラーゼは、所望するＰＥＧ化度に依存する種々の化学量論で
、所望する分子量のＰＥＧをフィブロラーゼと反応することによって得られる。
ズ変更方法：一級アミンに付加し得るＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）
エステルを含有する活性化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が市販され
ている。図１を参照［Clark, R. 他、Journal of Biological Chemistry、２７
１（３６）：２１９６９〜２１９７７（１９９６）］。タンパク質のα−アミノ
基は必ずしも付加に利用されないため、修飾には、リシンのε−アミノ基が一般
に使用される。ＮＨＳエステルの付加がフィブロラーゼを修飾するために使用さ
れ、良好な結果が得られている。これにより、分子量が約５，０００Ｄａ〜約５
０，０００Ｄａ（好ましくは、約１０，０００Ｄａ〜約３０，０００Ｄａ）のポ
リエチレングリコールが表面のリシン残基（１つまたは複数）に結合する。ＰＥ
Ｇ化されたフィブロラーゼは、所望するＰＥＧ化度に依存する種々の化学量論で
、所望する分子量のＰＥＧをフィブロラーゼと反応することによって得られる。
【００１２】 本発明者らは、反応時間およびＰＥＧ対フィブロラーゼのモル比を変更するこ
とによって、ＰＥＧ（分子量２０，０００）対フィブロラーゼが１０：１のモル
比での室温で１０分間の反応により、フィブロラーゼの多数の異なるＰＥＧ化体
が得られることを見出した。このようなＰＥＧ化フィブロラーゼには、マトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）で測定される４
３，３３１Ｄａの分子量を有する主要型が含まれる。この分子量は、１分子のフ
ィブロラーゼに対して１分子のＰＥＧが付加したことに対応する。これは図２に
示される。この場合、反応条件、緩衝液および温度は図１に示され、反応物比は
１０：１（ＳＰＡ−ＰＥＧ対天然型フィブロラーゼ）である。
とによって、ＰＥＧ（分子量２０，０００）対フィブロラーゼが１０：１のモル
比での室温で１０分間の反応により、フィブロラーゼの多数の異なるＰＥＧ化体
が得られることを見出した。このようなＰＥＧ化フィブロラーゼには、マトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）で測定される４
３，３３１Ｄａの分子量を有する主要型が含まれる。この分子量は、１分子のフ
ィブロラーゼに対して１分子のＰＥＧが付加したことに対応する。これは図２に
示される。この場合、反応条件、緩衝液および温度は図１に示され、反応物比は
１０：１（ＳＰＡ−ＰＥＧ対天然型フィブロラーゼ）である。
【００１３】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合、ＰＥＧ化反応の生成物である修飾型フィブ
ロラーゼは、球状タンパク質について予想されることから、異常なほどに移動し
たが、単一の主バンドとして存在する。修飾型タンパク質の主要な４３ｋＤａ形
態を、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａのタンパク質がサイズにより分離されるＨＰＬ
Ｃ（ＳＷ３０００−ＸＬカラム）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーで精
製する。図３を参照。このカラムに２回通すことによって、ＭＷ４３ｋＤａ（Ｍ
ＡＬＤＩ−ＭＳによる測定）のＰＥＧ化フィブロラーゼの均一溶液が得られた。
２．５ｘ６０ｃｍのカラムに対する操作条件には、２ｍｌ／分の流速での、５０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１４７ｍＭのＮａＣｌを用いたアイソクラチ
ック溶出が含まれる。サイズ分画カラムに最初通したとき、ＰＥＧ化された繊維
素溶解酵素の主要型のほぼ均一な調製物が得られる。最終精製は、同じ操作条件
で使用する同じサイズ分画カラムを通す２回目の操作によって行われた。
ロラーゼは、球状タンパク質について予想されることから、異常なほどに移動し
たが、単一の主バンドとして存在する。修飾型タンパク質の主要な４３ｋＤａ形
態を、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａのタンパク質がサイズにより分離されるＨＰＬ
Ｃ（ＳＷ３０００−ＸＬカラム）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーで精
製する。図３を参照。このカラムに２回通すことによって、ＭＷ４３ｋＤａ（Ｍ
ＡＬＤＩ−ＭＳによる測定）のＰＥＧ化フィブロラーゼの均一溶液が得られた。
２．５ｘ６０ｃｍのカラムに対する操作条件には、２ｍｌ／分の流速での、５０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１４７ｍＭのＮａＣｌを用いたアイソクラチ
ック溶出が含まれる。サイズ分画カラムに最初通したとき、ＰＥＧ化された繊維
素溶解酵素の主要型のほぼ均一な調製物が得られる。最終精製は、同じ操作条件
で使用する同じサイズ分画カラムを通す２回目の操作によって行われた。
【００１４】 Ｃ．ＰＥＧ結合の化学量論および位置の決定：フィブロラーゼの構造を、その
ｘ線構造が知られているアダマリシン亜科（adamalysin sub-family）サブファ
ミリー［Stocker, W. 他、Protein Sci. ４（５）：８２３〜４０（１９９５）
］の他のタンパク質との大きな相同性に基づいてモデル化した。図４を参照。Ｓ
ＰＡ−ＰＥＧの結合点である表面のリシン残基がマゼンタ色で示され、活性部位
のヒスチジン残基が黄色で強調されている。フィブロラーゼの予想される活性部
位は、３個のヒスチジン残基、ならびに１個の亜鉛原子および１個のメチオニン
ターンを含有する。これは、このクラスの酵素の特徴的なモチーフである。ＰＥ
Ｇまたは他の大きな有機分子鎖の付加が活性部位の構造および立体化学にどのよ
うに影響するかを理解することは、ＮＨＳを含有する大きな有機分子の付加によ
る分子量の変化が酵素活性にどのように影響するかを明らかにする助けになる。
ｘ線構造が知られているアダマリシン亜科（adamalysin sub-family）サブファ
ミリー［Stocker, W. 他、Protein Sci. ４（５）：８２３〜４０（１９９５）
］の他のタンパク質との大きな相同性に基づいてモデル化した。図４を参照。Ｓ
ＰＡ−ＰＥＧの結合点である表面のリシン残基がマゼンタ色で示され、活性部位
のヒスチジン残基が黄色で強調されている。フィブロラーゼの予想される活性部
位は、３個のヒスチジン残基、ならびに１個の亜鉛原子および１個のメチオニン
ターンを含有する。これは、このクラスの酵素の特徴的なモチーフである。ＰＥ
Ｇまたは他の大きな有機分子鎖の付加が活性部位の構造および立体化学にどのよ
うに影響するかを理解することは、ＮＨＳを含有する大きな有機分子の付加によ
る分子量の変化が酵素活性にどのように影響するかを明らかにする助けになる。
【００１５】 フィブロラーゼの一次構造には７個のリシン残基が存在する。本発明者らのフ
ィブロラーゼモデルから、これらのリシン残基はそれぞれ、活性部位の十分外側
に位置しているので、これらの残基の修飾は明らかに酵素の活性に影響していな
い［Bolger他、準備中］。ＰＥＧ付加物を含有する精製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析して、ＰＥＧ化調製物の均一性を明らかにしたが、修飾型フィブロラーゼの
真の質量を質量分析法で決定した。付加体の正確な質量を測定することによって
、フィブロラーゼの各化学種に結合したＰＥＧ分子の数を計算することができる
。フィブロラーゼにおける付加位置は、修飾されたタンパク質の部位特異的な酵
素的切断、その後、得られたペプチドフラグメントのアミノ酸分析およびペプチ
ド配列決定により決定することができる。
ィブロラーゼモデルから、これらのリシン残基はそれぞれ、活性部位の十分外側
に位置しているので、これらの残基の修飾は明らかに酵素の活性に影響していな
い［Bolger他、準備中］。ＰＥＧ付加物を含有する精製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分析して、ＰＥＧ化調製物の均一性を明らかにしたが、修飾型フィブロラーゼの
真の質量を質量分析法で決定した。付加体の正確な質量を測定することによって
、フィブロラーゼの各化学種に結合したＰＥＧ分子の数を計算することができる
。フィブロラーゼにおける付加位置は、修飾されたタンパク質の部位特異的な酵
素的切断、その後、得られたペプチドフラグメントのアミノ酸分析およびペプチ
ド配列決定により決定することができる。
【００１６】 簡単に記載すると、ＰＥＧまたは他の大きな分子量の有機分子が付加した位置
を決定するために、上記のようにして分子篩ＨＰＬＣ精製の後で得られた天然型
フィブロラーゼおよび修飾物の両方を、標準的な手順を使用して還元し、アルキ
ル化する［Guan, A. L. 他、Arch. Biochemm. Biophys. 、２８９：１９７〜２
０７（１９９１）］。次いで、ＰＥＧ化酵素および天然型酵素を別々にＴＰＣＫ
処理トリプシンで消化する。消化生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセ
トニトリルの上昇グラジエントとともにＣ１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣで
分離する。ＰＥＧ化タンパク質および天然型タンパク質の消化物において異なる
ペプチドをアミノ酸含有量についてアッセイし、必要な場合には配列決定して、
フィブロラーゼの既知の一次構造における付加の位置を同定する。このプロセス
は、ＮＨＳ―ＰＥＧの結合部位がリシン残基のみであり得るという本発明者らの
知識により助けられる。消化ペプチドはまた質量分析法で分析される。質量分析
法によって、アミノ酸分析を伴うトリプシン消化と同じ情報が得られるが、さら
に、付加型ＰＥＧペプチドの正確な分子量を測定することができる。最も望まし
いフィブロラーゼ誘導体は、天然の繊維素溶解活性の１００％に近い活性を有し
、その一方で、α２Ｍとの相互作用、および循環系からのクリアランス速度を低
下させる任意の他の血液産生プロテイナーゼ阻害剤との相互作用が弱められた誘
導体である。付加物の数および位置に関する情報は、活性および阻害に関するデ
ータとともに、最も少ない治療用量を必要とする最も有用な血栓溶解剤である修
飾型酵素の選択を可能する。
を決定するために、上記のようにして分子篩ＨＰＬＣ精製の後で得られた天然型
フィブロラーゼおよび修飾物の両方を、標準的な手順を使用して還元し、アルキ
ル化する［Guan, A. L. 他、Arch. Biochemm. Biophys. 、２８９：１９７〜２
０７（１９９１）］。次いで、ＰＥＧ化酵素および天然型酵素を別々にＴＰＣＫ
処理トリプシンで消化する。消化生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセ
トニトリルの上昇グラジエントとともにＣ１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣで
分離する。ＰＥＧ化タンパク質および天然型タンパク質の消化物において異なる
ペプチドをアミノ酸含有量についてアッセイし、必要な場合には配列決定して、
フィブロラーゼの既知の一次構造における付加の位置を同定する。このプロセス
は、ＮＨＳ―ＰＥＧの結合部位がリシン残基のみであり得るという本発明者らの
知識により助けられる。消化ペプチドはまた質量分析法で分析される。質量分析
法によって、アミノ酸分析を伴うトリプシン消化と同じ情報が得られるが、さら
に、付加型ＰＥＧペプチドの正確な分子量を測定することができる。最も望まし
いフィブロラーゼ誘導体は、天然の繊維素溶解活性の１００％に近い活性を有し
、その一方で、α２Ｍとの相互作用、および循環系からのクリアランス速度を低
下させる任意の他の血液産生プロテイナーゼ阻害剤との相互作用が弱められた誘
導体である。付加物の数および位置に関する情報は、活性および阻害に関するデ
ータとともに、最も少ない治療用量を必要とする最も有用な血栓溶解剤である修
飾型酵素の選択を可能する。
【００１７】 Ｄ．インビトロでの繊維素溶解活性に関する試験：大きな有機分子−タンパク
質の付加度が決定されると、修飾型フィブロラーゼによる酵素活性の保持がイン
ビトロアッセイで測定され、ＰＥＧ化フィブロラーゼおよび天然型フィブロラー
ゼの両方の繊維素溶解効力が、単独で、そしてα２Ｍの存在下で比較された。
質の付加度が決定されると、修飾型フィブロラーゼによる酵素活性の保持がイン
ビトロアッセイで測定され、ＰＥＧ化フィブロラーゼおよび天然型フィブロラー
ゼの両方の繊維素溶解効力が、単独で、そしてα２Ｍの存在下で比較された。
【００１８】 大きな有機分子で修飾された酵素のサイズ排除ＨＰＬＣから得られる溶出ピー
クのタンパク質を、非特異的なタンパク質分解に対するアッセイ（比色法による
アゾカゼインアッセイ）およびBajwa他により記載されるフィブリン特異的なフ
ィブリンプレート法［Bajwa, S. S. 他、Toxicon、１８：２８５〜２９０（１９
８０）］の両方を用いて繊維素溶解活性についてアッセイした。
クのタンパク質を、非特異的なタンパク質分解に対するアッセイ（比色法による
アゾカゼインアッセイ）およびBajwa他により記載されるフィブリン特異的なフ
ィブリンプレート法［Bajwa, S. S. 他、Toxicon、１８：２８５〜２９０（１９
８０）］の両方を用いて繊維素溶解活性についてアッセイした。
【００１９】
【表１】
【００２０】 繊維素溶解活性を測定する２つの方法のうち、後者はフィブリンの分解に特異
的である。フィブリンプレート法における比活性の定量化は、フィブリンプレー
トにおけるタンパク質分解の面積を単位重量のタンパク質について計算すること
によって行われる。大きな有機分子で修飾されたフィブロラーゼおよび未修飾型
フィブロラーゼを比較すると、ＰＥＧをＮＨＳ架橋法でフィブロラーゼに結合さ
せたときにタンパク質溶解活性が喪失していないことが明らかである。
的である。フィブリンプレート法における比活性の定量化は、フィブリンプレー
トにおけるタンパク質分解の面積を単位重量のタンパク質について計算すること
によって行われる。大きな有機分子で修飾されたフィブロラーゼおよび未修飾型
フィブロラーゼを比較すると、ＰＥＧをＮＨＳ架橋法でフィブロラーゼに結合さ
せたときにタンパク質溶解活性が喪失していないことが明らかである。
【００２１】 繊維素溶解活性がＰＥＧ化フィブロラーゼによって保持されていることは明ら
かであるが、酵素の反応速度論に対するＰＥＧ化の作用が注目される。フィブロ
ラーゼ（ＰＥＧ化型または未修飾型）と、フィブリンのα鎖内におけるフィブロ
ラーゼにより切断される切れやすい結合を含有する合成された蛍光消光型オクタ
ペプチド基質との相互作用の速度論は、反応時間における蛍光の変化をモニター
することによって決定される。図５を参照。ＬｙｓとＬｅｕとの間のフィブロラ
ーゼにより切断されやすい結合が切断されると、ペプチドは二分される。切断に
より、今度は、蛍光性Ａｂｚと４−Ｎｂａ（蛍光シグナルを増大させる消光基）
との距離が増大する。シグナルの増大速度はペプチドの切断速度に比例する。
かであるが、酵素の反応速度論に対するＰＥＧ化の作用が注目される。フィブロ
ラーゼ（ＰＥＧ化型または未修飾型）と、フィブリンのα鎖内におけるフィブロ
ラーゼにより切断される切れやすい結合を含有する合成された蛍光消光型オクタ
ペプチド基質との相互作用の速度論は、反応時間における蛍光の変化をモニター
することによって決定される。図５を参照。ＬｙｓとＬｅｕとの間のフィブロラ
ーゼにより切断されやすい結合が切断されると、ペプチドは二分される。切断に
より、今度は、蛍光性Ａｂｚと４−Ｎｂａ（蛍光シグナルを増大させる消光基）
との距離が増大する。シグナルの増大速度はペプチドの切断速度に比例する。
【００２２】 所定の波長の光で励起されたとき、蛍光基は特徴的な蛍光シグナルを生成する
が、消光基を伴う所定の幾何構造の場合にはシグナルを発しない。本発明者らの
合成ペプチドの場合、消光基は、蛍光基および消光基の両方がペプチドに結合さ
れているときには蛍光基からのシグナルに必要なエネルギーを完全に吸収する。
ペプチドが切断された場合、蛍光基と消光基との距離が非常に大きくなり、その
エネルギーは吸収されず、蛍光シグナルとして放出される。蛍光シグナルの増大
速度は、試験されている酵素による合成ペプチドの切断速度に比例する。
が、消光基を伴う所定の幾何構造の場合にはシグナルを発しない。本発明者らの
合成ペプチドの場合、消光基は、蛍光基および消光基の両方がペプチドに結合さ
れているときには蛍光基からのシグナルに必要なエネルギーを完全に吸収する。
ペプチドが切断された場合、蛍光基と消光基との距離が非常に大きくなり、その
エネルギーは吸収されず、蛍光シグナルとして放出される。蛍光シグナルの増大
速度は、試験されている酵素による合成ペプチドの切断速度に比例する。
【００２３】 ＰＥＧ化フィブロラーゼおよび天然型フィブロラーゼによる切断速度を比較す
ることによって、修飾型タンパク質のタンパク質分解活性が天然型物質の活性か
ら著しく変化しているかどうかが明らかにされる。いくつかのデータは、合成ペ
プチドのフィブロラーゼ切断が非常に迅速であることを示している。図６を参照
。蛍光基および消光基（それぞれ、２−アミノベンゼンおよび４−ニトロベンジ
ルアミド）を含有する合成ペプチドは、フィブロラーゼにより切断されやすい結
合が切断されたときに、より大きな蛍光シグナル発する。蛍光シグナルの増大速
度はペプチドの切断速度に比例する。この実験では、等モル量のフィブロラーゼ
およびペプチドがストップフロー蛍光計内で混合された。切断速度はシグナルの
変化速度により明らかにされる。サンプルの添加に伴うシグナルの急激な低下お
よび回復は系の人為的なものである。
ることによって、修飾型タンパク質のタンパク質分解活性が天然型物質の活性か
ら著しく変化しているかどうかが明らかにされる。いくつかのデータは、合成ペ
プチドのフィブロラーゼ切断が非常に迅速であることを示している。図６を参照
。蛍光基および消光基（それぞれ、２−アミノベンゼンおよび４−ニトロベンジ
ルアミド）を含有する合成ペプチドは、フィブロラーゼにより切断されやすい結
合が切断されたときに、より大きな蛍光シグナル発する。蛍光シグナルの増大速
度はペプチドの切断速度に比例する。この実験では、等モル量のフィブロラーゼ
およびペプチドがストップフロー蛍光計内で混合された。切断速度はシグナルの
変化速度により明らかにされる。サンプルの添加に伴うシグナルの急激な低下お
よび回復は系の人為的なものである。
【００２４】 Ｅ．α２Ｍとの相互作用による繊維素溶解活性の喪失：繊維素溶解活性に対す
る付加の作用が明らかにされると、付加型フィブロラーゼとα２Ｍとの相互作用
速度が決定され、天然型フィブロラーゼとの相互作用と比較された。既に述べた
ように、循環系からのフィブロラーゼクリアランスの主な手段はα２Ｍである。
α２Ｍおよびフィブロラーゼの相互作用は、フィブロラーゼによってα２Ｍの親
和性領域内のペプチド結合が切断されることにより媒介される。この切断は、親
和性領域を切断した薬剤を不可逆的に捕捉するα２Ｍの立体配座を変化させる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、α２Ｍの立体配座の変化を生じさせる切断は、モノ
マー（１８０ｋＤａ）のα２Ｍが、それぞれが約９０ｋＤａの２つの部分に分解
されることによって可視化することができる［Baramova, E. N. 、Biochemistry
、２９：１０６９〜１０７４（１９９０）］。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、フィブロラ
ーゼのα２Ｍに対する結合の速度論を観測するために使用することができるが、
天然型フィブロラーゼの場合、フィブロラーゼとα２Ｍとのインビトロでの相互
作用は非常に早いので、速度論パラメーターを測定することができない（未発表
データ）。
る付加の作用が明らかにされると、付加型フィブロラーゼとα２Ｍとの相互作用
速度が決定され、天然型フィブロラーゼとの相互作用と比較された。既に述べた
ように、循環系からのフィブロラーゼクリアランスの主な手段はα２Ｍである。
α２Ｍおよびフィブロラーゼの相互作用は、フィブロラーゼによってα２Ｍの親
和性領域内のペプチド結合が切断されることにより媒介される。この切断は、親
和性領域を切断した薬剤を不可逆的に捕捉するα２Ｍの立体配座を変化させる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、α２Ｍの立体配座の変化を生じさせる切断は、モノ
マー（１８０ｋＤａ）のα２Ｍが、それぞれが約９０ｋＤａの２つの部分に分解
されることによって可視化することができる［Baramova, E. N. 、Biochemistry
、２９：１０６９〜１０７４（１９９０）］。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、フィブロラ
ーゼのα２Ｍに対する結合の速度論を観測するために使用することができるが、
天然型フィブロラーゼの場合、フィブロラーゼとα２Ｍとのインビトロでの相互
作用は非常に早いので、速度論パラメーターを測定することができない（未発表
データ）。
【００２５】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、修飾型フィブロラーゼまたは天然型フィブロラーゼのα
２Ｍに対する結合を観測する重要な道具であるが、蛍光性化合物の２−（ｐ−ト
ルイジニル）ナフタレン−６−スルホン酸（ＴＮＳ）との立体配座が変化したα
２Ｍとの相互作用を使用して、相互作用の速度論を明らかにすることができる。
ＴＮＳは、非常に低い親和性で天然型α２Ｍに結合するが、その親和性は、α２
Ｍの立体配座が親和性領域内での切断によって変化したときに劇的に増大する［
Strickland, D. K. 他、Biochemistry、３０：２７９７〜２８０３（１９９１）
］。この切断の速度論は、ＴＮＳの蛍光シグナルの変化を記録することによって
モニターすることができる。α２Ｍが切断されると、シグナルが増大する［Bjor
k, I. 他、Biochemistry、２８（４）：１５６８〜１５７３（１９８９）］。α
２Ｍの修飾型フィブロラーゼおよび未修飾型フィブロラーゼとの会合速度を比較
して、この相互作用の速度論を得ることができる。図７を参照。
２Ｍに対する結合を観測する重要な道具であるが、蛍光性化合物の２−（ｐ−ト
ルイジニル）ナフタレン−６−スルホン酸（ＴＮＳ）との立体配座が変化したα
２Ｍとの相互作用を使用して、相互作用の速度論を明らかにすることができる。
ＴＮＳは、非常に低い親和性で天然型α２Ｍに結合するが、その親和性は、α２
Ｍの立体配座が親和性領域内での切断によって変化したときに劇的に増大する［
Strickland, D. K. 他、Biochemistry、３０：２７９７〜２８０３（１９９１）
］。この切断の速度論は、ＴＮＳの蛍光シグナルの変化を記録することによって
モニターすることができる。α２Ｍが切断されると、シグナルが増大する［Bjor
k, I. 他、Biochemistry、２８（４）：１５６８〜１５７３（１９８９）］。α
２Ｍの修飾型フィブロラーゼおよび未修飾型フィブロラーゼとの会合速度を比較
して、この相互作用の速度論を得ることができる。図７を参照。
【００２６】 未修飾型フィブロラーゼは、α２Ｍにより迅速かつ効率的に不活性化される。
アッセイを、ＰＥＧ化フィブロラーゼおよび天然型フィブロラーゼのα２Ｍによ
る阻害の違いを明らかにするために行った。既知濃度のフィブロラーゼの両形態
を、精製された状態または血漿中のいずれかで既知量のα２Ｍとインキュベーシ
ョンした（α２Ｍの血漿中の濃度は文献値の２．９μＭであると仮定した）。混
合物を３７℃で４５秒間インキュベーションし、次いでフィブリンプレートに直
接置いた。表２により明らかであるように、天然型フィブロラーゼは、α２Ｍの
精製形態または血漿形態のいずれによっても効果的に不活性化されている。ＰＥ
Ｇ化フィブロラーゼは、α２Ｍのいずれかの形態の存在下で活性の喪失を示して
いない。
アッセイを、ＰＥＧ化フィブロラーゼおよび天然型フィブロラーゼのα２Ｍによ
る阻害の違いを明らかにするために行った。既知濃度のフィブロラーゼの両形態
を、精製された状態または血漿中のいずれかで既知量のα２Ｍとインキュベーシ
ョンした（α２Ｍの血漿中の濃度は文献値の２．９μＭであると仮定した）。混
合物を３７℃で４５秒間インキュベーションし、次いでフィブリンプレートに直
接置いた。表２により明らかであるように、天然型フィブロラーゼは、α２Ｍの
精製形態または血漿形態のいずれによっても効果的に不活性化されている。ＰＥ
Ｇ化フィブロラーゼは、α２Ｍのいずれかの形態の存在下で活性の喪失を示して
いない。
【００２７】
【表２】
【００２８】
【実施例】実施例１ 方法： フィブロラーゼを３段階のＨＰＬＣ手順でAgkistridon contortrix contortri
xの粗毒液から単離した［Loyaza他、（１９９４）］。精製された酵素を、次い
で、スクシンイミドエステル官能基を含有する２０ｋＤａのＰＥＧと反応させた
。このエステルは、７個存在するフィブロラーゼの表面リシン残基のε−アミノ
基と容易に反応した。反応後、ＰＥＧ化フィブロラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分子サイズの変化について分析した。異なる分子量形態のＰＥＧ化酵素を分子
篩クロマトグラフィーで分離した。ＰＥＧ化フィブロラーゼをフィブリンプレー
トアッセイで繊維素溶解活性について調べ、α２Ｍとの相互作用の速度論を蛍光
アッセイにより測定した。相互作用の程度を、フィブロラーゼにより誘導される
α２Ｍの切断をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することによってモニターした。
xの粗毒液から単離した［Loyaza他、（１９９４）］。精製された酵素を、次い
で、スクシンイミドエステル官能基を含有する２０ｋＤａのＰＥＧと反応させた
。このエステルは、７個存在するフィブロラーゼの表面リシン残基のε−アミノ
基と容易に反応した。反応後、ＰＥＧ化フィブロラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分子サイズの変化について分析した。異なる分子量形態のＰＥＧ化酵素を分子
篩クロマトグラフィーで分離した。ＰＥＧ化フィブロラーゼをフィブリンプレー
トアッセイで繊維素溶解活性について調べ、α２Ｍとの相互作用の速度論を蛍光
アッセイにより測定した。相互作用の程度を、フィブロラーゼにより誘導される
α２Ｍの切断をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することによってモニターした。
【００２９】 結果： ＰＥＧ化反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、それぞれが２０ｋＤａの整数
値で異なるおよそ７種の異なるフィブロラーゼのＰＥＧ化体が存在することが明
らかにされた。天然型フィブロラーゼはすべて、この反応で消費された。反応時
間を変えることによって、これらの化学種のそれぞれが種々の量で得られた。Ｐ
ＥＧ化物は、１００％に近い天然の繊維素溶解活性を保持し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で検出されるように、α２Ｍとの大きく低下した相互作用を有していた。
値で異なるおよそ７種の異なるフィブロラーゼのＰＥＧ化体が存在することが明
らかにされた。天然型フィブロラーゼはすべて、この反応で消費された。反応時
間を変えることによって、これらの化学種のそれぞれが種々の量で得られた。Ｐ
ＥＧ化物は、１００％に近い天然の繊維素溶解活性を保持し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で検出されるように、α２Ｍとの大きく低下した相互作用を有していた。
【００３０】実施例２ 方法： フィブロラーゼを、実施例Ｉに記載されている３段階のＨＰＬＣ手順でAgkist
ridon contortrix contortrixの粗毒液から単離した。精製された酵素を、次い
で、スクシンイミドエステル官能基を含有する２０ｋＤａのＰＥＧと反応させた
。このエステルは、フィブロラーゼの７個の表面リシン残基のε−アミノ基と容
易に反応した。ＮＨＳ−ＰＥＧ対フィブロラーゼの１０：１の化学量論を含有す
る反応を１０分間行い、その後、過剰のメチルアミンを加えて停止させた。反応
が完了した後、ＰＥＧ化フィブロラーゼの１つの化学種を２段階の分子篩ＨＰＬ
Ｃ手順で精製した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して、このＰＥＧ化フィブロラーゼ
の分子量を測定した。α２Ｍの繊維素溶解活性の阻害に対するＰＥＧ化の作用を
、生理食塩水（コントロール）、ヒトα２Ｍまたは異なる種の血漿と軽くインキ
ュベーションした後、フィブリンプレートアッセイを使用して測定した。
ridon contortrix contortrixの粗毒液から単離した。精製された酵素を、次い
で、スクシンイミドエステル官能基を含有する２０ｋＤａのＰＥＧと反応させた
。このエステルは、フィブロラーゼの７個の表面リシン残基のε−アミノ基と容
易に反応した。ＮＨＳ−ＰＥＧ対フィブロラーゼの１０：１の化学量論を含有す
る反応を１０分間行い、その後、過剰のメチルアミンを加えて停止させた。反応
が完了した後、ＰＥＧ化フィブロラーゼの１つの化学種を２段階の分子篩ＨＰＬ
Ｃ手順で精製した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して、このＰＥＧ化フィブロラーゼ
の分子量を測定した。α２Ｍの繊維素溶解活性の阻害に対するＰＥＧ化の作用を
、生理食塩水（コントロール）、ヒトα２Ｍまたは異なる種の血漿と軽くインキ
ュベーションした後、フィブリンプレートアッセイを使用して測定した。
【００３１】 結果： 分子篩ＨＰＬＣの後、精製されたＰＥＧ化フィブロラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による分析によって、６３ｋＤａの見かけの分子量を有する単一の主バンドが見
出された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳに供した場合、このバンドは、１個のＰＥＧ２０，
０００Ｄａ分子がフィブロラーゼに付加したことに対応する４３ｋＤａのＭＷを
有することが明らかにされた。ＰＥＧ化物は、１００％に近い天然の繊維素溶解
活性を有していた。α２Ｍ（精製型または血漿中のいずれか）の存在下、天然の
タンパク質における繊維素溶解活性は、４５秒間のインキュベーションの後で完
全に阻害されたが、ＰＥＧ化フィブロラーゼは、同じ条件下で、１００％に近い
その活性を保持していた。
による分析によって、６３ｋＤａの見かけの分子量を有する単一の主バンドが見
出された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳに供した場合、このバンドは、１個のＰＥＧ２０，
０００Ｄａ分子がフィブロラーゼに付加したことに対応する４３ｋＤａのＭＷを
有することが明らかにされた。ＰＥＧ化物は、１００％に近い天然の繊維素溶解
活性を有していた。α２Ｍ（精製型または血漿中のいずれか）の存在下、天然の
タンパク質における繊維素溶解活性は、４５秒間のインキュベーションの後で完
全に阻害されたが、ＰＥＧ化フィブロラーゼは、同じ条件下で、１００％に近い
その活性を保持していた。
【００３２】 実施例３〜１３ 実施例２の手順を、下記の大きな有機分子を２０ｋＤａのＰＥＧの代わりに使
用することにより行うことができる： 実施例３〜１３…代用体 実施例３…５ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例４…５０ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例５…１０ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例６…３０ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例７…４０ｋＤａのポリプロピルグリコール 実施例８…１２ｋＤａのポリブチルグリコール 実施例９…１８ｋＤａのポリペンチルグリコール 実施例１０…２４ｋＤａのポリアラニングリコール 実施例１１…３０ｋＤａのポリグリシングリコール 実施例１２…４０ｋＤａのポリリシングリコール 実施例１３…３０ｋＤａのポリビニルグリコール
用することにより行うことができる： 実施例３〜１３…代用体 実施例３…５ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例４…５０ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例５…１０ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例６…３０ｋＤａのポリエチレングリコール 実施例７…４０ｋＤａのポリプロピルグリコール 実施例８…１２ｋＤａのポリブチルグリコール 実施例９…１８ｋＤａのポリペンチルグリコール 実施例１０…２４ｋＤａのポリアラニングリコール 実施例１１…３０ｋＤａのポリグリシングリコール 実施例１２…４０ｋＤａのポリリシングリコール 実施例１３…３０ｋＤａのポリビニルグリコール
【図１】 図１は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを含有するポリエチレングリコールの
繊維素溶解酵素に対する共有結合付加である。
繊維素溶解酵素に対する共有結合付加である。
【図２】 図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析されたフィブロラーゼに対するＮＨＳ−ＰＥ
Ｇによる付加の時間変化である。レーンＡ：０分反応（コントロール）。レーン
Ｂ〜Ｆ：２分、４分、６分、８分および１０分の反応時間に対応する。レーンＭ
：ＭＷは標準品である。
Ｇによる付加の時間変化である。レーンＡ：０分反応（コントロール）。レーン
Ｂ〜Ｆ：２分、４分、６分、８分および１０分の反応時間に対応する。レーンＭ
：ＭＷは標準品である。
【図３】 図３は、２ｍｌ／分でアイソクラチック溶出される分子篩カラム（ＴＳＫゲル
ＳＷ３０００−ＸＬ、２．５ｘ６０ｃｍカラム）でのモノＰＥＧ化フィブロラー
ゼ誘導体の分離を示す。
ＳＷ３０００−ＸＬ、２．５ｘ６０ｃｍカラム）でのモノＰＥＧ化フィブロラー
ゼ誘導体の分離を示す。
【図４】 図４は、メチンシンファミリーの２つの非常に関連するメンバーのｘ線構造に
基づくフィブロラーゼの三次元モデルである。
基づくフィブロラーゼの三次元モデルである。
【図５】 図５は、フィブロラーゼのために合成された蛍光消光型オクタペプチド基質を
示す。
示す。
【図６】 図６は、フィブロラーゼによる蛍光生成性オクタペプチドの切断を示す。
【図７】 図７は、ＴＮＳの蛍光放出によって測定されるフィブロラーゼとα２Ｍとの相
互作用速度を示す：ａ）フィブロラーゼ−α２Ｍ複合体と相互作用するＴＮＳの
飽和レベルを示す曲線；およびｂ）ＴＮＳと複合体との迅速な相互作用を示す。
互作用速度を示す：ａ）フィブロラーゼ−α２Ｍ複合体と相互作用するＴＮＳの
飽和レベルを示す曲線；およびｂ）ＴＮＳと複合体との迅速な相互作用を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月５日（２０００．６．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スゥエンソン，スティーブン，Ｄ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91007 アルカディア ウエスト シエラ ドライブ 116 Ｆターム(参考） 4B050 CC02 DD11 GG01 GG02 GG03 GG05 GG06
Claims (14)
- 【請求項１】 少なくとも１つの大きな有機分子を酵素に共有結合させること
によって修飾されたサイズ拡大型繊維素溶解酵素。 - 【請求項２】 前記酵素がフィブロラーゼである請求項１記載のサイズ拡大型
繊維素溶解酵素。 - 【請求項３】 前記大きな有機分子が水溶性である請求項１記載のサイズ拡大
型繊維素溶解酵素。 - 【請求項４】 前記大きな有機分子がポリマー分子である請求項１に記載のサ
イズ拡大型繊維素溶解酵素。 - 【請求項５】 前記ポリマー分子がポリエチレングリコールである請求項４記
載のサイズ拡大型繊維素溶解酵素。 - 【請求項６】 約１個〜約７個のポリマー分子が前記酵素に結合している請求
項２記載のサイズ拡大型繊維素溶解酵素。 - 【請求項７】 繊維素溶解酵素のサイズを変更するための方法であって、 （ａ）前記繊維素溶解酵素を、付加成分を含有する大きな有機分子と組み合わせ
る工程；および （ｂ）少なくとも１個の大きな有機分子を前記酵素に結合させる工程 を含む方法。 - 【請求項８】 前記大きな有機分子がポリマー分子である請求項７記載の方法
。 - 【請求項９】 前記付加成分がスクシンイミドエステルである請求項７記載の
方法。 - 【請求項１０】 前記繊維素溶解酵素がフィブロラーゼである請求項７記載の
方法。 - 【請求項１１】 前記大きな有機分子が水溶性である請求項８記載の方法。
- 【請求項１２】 前記ポリマー分子がポリエチレングリコールである請求項１
１記載の方法。 - 【請求項１３】 約１個〜約７個のポリマー分子が前記酵素に結合している請
求項１０記載の方法。 - 【請求項１４】 モル過剰量の前記ポリマーを前記酵素と組み合わせる請求項
１０記載の方法。
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