JP2002511249A - 変異型ＧＰＩＩＩａを発現するトランスジェニック哺乳動物 - Google Patents

変異型ＧＰＩＩＩａを発現するトランスジェニック哺乳動物

Info

Publication number
JP2002511249A
JP2002511249A JP2000543580A JP2000543580A JP2002511249A JP 2002511249 A JP2002511249 A JP 2002511249A JP 2000543580 A JP2000543580 A JP 2000543580A JP 2000543580 A JP2000543580 A JP 2000543580A JP 2002511249 A JP2002511249 A JP 2002511249A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
human mammal
iiia
gene
mutant
tyrosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000543580A
Other languages
English (en)
Inventor
デボラ， アン ロー，
デイヴィッド， アール． フィリップス，
Original Assignee
シーオーアール セラピューティクス インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シーオーアール セラピューティクス インコーポレイテッド filed Critical シーオーアール セラピューティクス インコーポレイテッド
Publication of JP2002511249A publication Critical patent/JP2002511249A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、外来ＤＮＡが導入された、またはインテグリンβサブユニットに様々な改変または置換を施して作製した、トランスジェニックまたは遺伝子操作されたヒト以外の哺乳動物に関する。特に、本発明は、内因性ＧＰ IIIａ遺伝子が、そのリン酸化可能な細胞質チロシン残基のうちの１つまたは全てがフェニルアラニン等の非チロシン残基で置換された、改変または変異型ＧＰ IIIａ遺伝子で置換された、トランスジェニック哺乳動物を提供する。改変または変異型ＧＰ IIIａを発現する、得られたトランスジェニック哺乳動物の血液中の血小板は、野生型動物において生じる程度のチロシンリン酸化を経ることができないため、これらの遺伝子操作された動物は、血小板機能にとってのリン酸化反応の重要性を評価するための重要なツールを提供する。また本発明は、変異型ＧＰ IIIａインテグリンサブユニットが血小板の形成以外の生物学的プロセスに及ぼす影響を研究するのにも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） 本願は、１９９６年１０月１８日に出願された米国特許出願第０８／７３４，
６０７号、１９９６年１１月２１日に出願された米国仮出願第６０／０３１，６
６５号、１９９７年３月２８日に出願された米国仮出願第６０／０４２，０９３
号、および１９９７年１１月２１日に出願された米国特許出願第０８／９７５，
６５３号に関連するものであり、これらの内容は全て参考文献として本明細書に
援用する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、外来ＤＮＡが導入された、またはインテグリンをコードする遺伝子
の中のあるコドンを置換して作製した、トランスジェニック哺乳動物または遺伝
子操作した哺乳動物に関する。特に、本発明は、内因性ＧＰ IIIａ遺伝子（β３
としても知られる）の全体または一部が、その２つのリン酸化可能な細胞質チロ
シン残基のうちの一方または両方が例えばフェニルアラニン等の非チロシン残基
で置換された変異型ＧＰ IIIａ遺伝子で置換された、トランスジェニック哺乳動
物を提供する。改変されたＧＰ IIIａ遺伝子を発現する、得られたトランスジェ
ニック哺乳動物の血液に見られる細胞（特に血小板）の全てまたは一部は、その
野生型の相対物において生じるようなチロシンリン酸化を経ることができないた
め、これらの動物は、血小板機能にとってのこれらのチロシン残基のリン酸化反
応の重要性を評価するための有用なツールを提供する。また本発明は、変異型Ｇ
Ｐ IIIａインテグリンサブユニットが血小板の形成以外の生物学的プロセスに及
ぼす影響を研究するのにも有用である。
【０００３】
【従来の技術】
本明細書に記載される全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出
願が特定的にそして個別に参考文献として援用されると指摘されたのと同程度に
、本明細書中に参考文献として援用される。
【０００４】 Ａ．インテグリン インテグリンは、細胞外基質タンパク質および他の細胞への細胞の接着を媒介
するαβヘテロ二量体のファミリーである（Ｃｌａｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１
９９５）２６８：２３３−２３９）。また、インテグリンは、一連の中間体タン
パク質を介してアクチン細胞骨格に結合して、細胞外基質と細胞内細胞骨格との
間のつながり、およびそれに関連する運動機構を提供する。このような膜貫通連
絡は、細胞の移動に必要である。多くの生物学的応答は、少なくともある程度、
インテグリン媒介性接着および細胞移動（胚発生、血流遮断、血餅退縮、有糸分
裂、血管形成、炎症、免疫応答、白血球のホーミングおよび活性化、貪食作用、
骨吸収、腫瘍の成長および転移、アテローム性動脈硬化、再狭窄ならびに創傷の
治癒を含む）に依存する。
【０００５】 インテグリンファミリーのメンバーは、シグナル伝達にも関与している。これ
は、細胞活性化（インサイド・アウト・シグナル伝達と呼ばれる）に応答した細
胞表面インテグリンの接着親和力の変化により証明される。さらに、インテグリ
ン媒介性接着の後の細胞内シグナル経路に対する影響が観察され、これはアウト
サイド・イン・シグナル伝達と呼ばれる。
【０００６】 インテグリンファミリーは、１５個の関連する既知のαサブユニット（α１、
α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、αＥ、αＶ、αIIｂ、αＬ
、αＭ、およびαＸ）および８個の関連する既知のβサブユニット（β１、β２
、β３、β４、β５、β６、β７およびβ８）からなる。Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ
ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，８：９２９−９３８（１９９４）。インテグリンαおよ
びβサブユニットは、図１に示したような様々なペアリングで存在することが知
られている。インテグリンのリガンド特異性は、αおよびβサブユニットの特定
のペアリングにより決定されるが、幾つかのインテグリンは同じリガンドに結合
することが知られているので、ある程度の重剰性が存在する。
【０００７】 β３サブユニットの２つの既知のペアリングが観察された。つまり、αＶとの
ペアリングでαＶβ３、ビトロネクチン受容体が作製され、ＧＰ IIｂとのペア
リングではＧＰ IIｂ−IIIａ、フィブリノーゲン受容体が作製される。αＶβ３
は、広範囲に分布しており、インテグリンファミリーの最も不規則なメンバーで
あり、広いスペクトルの接着性タンパク質への細胞付着（大部分の場合、接着性
タンパク質上のＲ−Ｇ−Ｄ配列に付着する）を媒介する。αＶβ３により媒介さ
れる生物学的プロセスは多様であり、骨吸収、血管形成、腫瘍の転移および再狭
窄が含まれる。αＶβ３は、接着性タンパク質の連結の際にシグナルを出すこと
が知られている（Ｐ．Ｉ．Ｌｅａｖｅｓｌｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１
２１：１６３−１７０（１９９３））。例として、内皮細胞は連結から解放され
るとアポトーシスを起こす（Ｐ．Ｃ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｃｅｌｌ７９：１１５７−
１１６４（１９９４））。
【０００８】 Ｂ．既知の細胞骨格タンパク質とインテグリンの相互作用 インテグリンの未改変αおよびβサブユニット細胞質ドメインの、様々な細胞
骨格タンパク質およびシグナルタンパク質への結合が、報告されている。Ｓ．Ｄ
ｅｄｈａｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：６５７−６６９
（１９９６）。形態学的研究により、これらのタンパク質の多くは、インテグリ
ンがクラスタ化して細胞外基質および細胞骨格タンパク質の両方に結合している
フォーカルアドヒージョン（中心的接着位）に集積していることが示された。Ｉ
．Ｋｎｅｚｅｖｉｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２７）：１６４１６
−１６５２１（１９９６）。
【０００９】 例えば、２３５ｋＤビンキュリンおよびアクチン結合タンパク質であるタリン
は、固相結合アッセイにおいてαIIｂおよびβ３の細胞質ドメインに結合する。
Ｉ．Ｋｎｅｚｅｖｉｃら、同上。固相結合アッセイにおける、１００ｋＤビンキ
ュリン結合タンパク質およびアクチンの架橋タンパク質であるαアクチニンの、
β１およびβ３の細胞質ドメインへの結合も、観察されている。Ｃ．Ａ．Ｏｔｅ
ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２８）；２１１９３−２１１９７（１
９９３）；およびＣ．Ａ．Ｏｔｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：７２
１−７２９（１９９０）。結合研究により、ビンキュリンおよびアクチン結合タ
ンパク質を含む２１５ｋＤ ＳＨ２ドメインであるテンシン（ｔｅｎｓｉｎ）と
β１の細胞質ドメインとの間に相互作用があることが証明された。Ｓ．Ｌｉｎら
、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ７Ｓｕｐｐ．３８９ａＡｂｓｔｒａｃｔ２２５９
（１９９６）。
【００１０】 また、他の細胞骨格に関連するタンパク質も、インテグリンと相互作用する。
１９５ｋＤミオシンおよび中間径フィラメント結合タンパク質であるスケルミン
は、β１およびβ３の細胞骨格ドメインの膜近接領域に結合する。Ｋ．Ｂ．Ｒｅ
ｄｄｙら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ７Ｓｕｐｐ．３８５Ａ，Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ２２３７（１９９５）。これらの著者らは、スケルミンがミオシンおよび中間
径フィラメントをβインテグリンに結合させることができると唱えた。
【００１１】 また、ビンキュリン結合シグナルタンパク質であるパキシリンも、β１インテ
グリンの細胞質ドメインに結合する。Ｍ．Ｄ．Ｓｃｈａｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．１３０：１１８１−１１８７（１９９５）。β１−パキシリン会
合が直接的なものであるか間接的なものであるかはまだ分かっていないが、パキ
シリンは、チロシンキナーゼｐｐ１２５ＦＡＫの基質であり、ｐｐ１２５ＦＡＫ
によりチロシンがリン酸化されると仮定されていた。アクチン結合タンパク質フ
ィラミンは、インビトロではβ２インテグリンサブユニットの細胞質テイルに結
合し、そしてインビボではβ２インテグリンと共に共免疫沈降および同時局在化
されることが証明されている。Ｃ．Ｐ．Ｓｈａｒｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５４；３４６１−３４７０（１９９５）。
【００１２】 セリン／トレオニンキナーゼのミオシン軽鎖キナーゼファミリーに関連するも
のと同定された２０８ｋＤインテグリン結合タンパク質も、報告されている。Ｗ
ａｌｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ７Ｓｕｐｐ．３８４Ａ，Ａｂｓｔｒ
ａｃｔ２２３５（１９９５）。このキナーゼは、αアクチニンおよびミオシンを
含むタンパク質の複合体の一部であると言われていたが、このキナーゼがインテ
グリンの細胞質テイルに直接会合するのか、タンパク質の複合体を介するのかは
定かではなかった。
【００１３】 上記に挙げた細胞骨格タンパク質は、精製したタンパク質またはペプチドを有
するインテグリンサブユニットの細胞質ドメインと相互作用することが分かって
いるが、これらの相互作用が細胞内でどのように起こるのか、またこれらの相互
作用がどのように調節されるのかは分かっていない。さらに、上記インテグリン
／細胞骨格相互作用は、ホスホチロシンに依存して生じるものではない。
【００１４】 Ｃ．インテグリンβサブユニットの細胞質ドメインのチロシンリン酸化 多くのアゴニストにより誘導された血小板凝集により、β３細胞質テイルの中
のチロシン残基のリン酸化が起こる。Ｌａｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７１
：１０８１１−１０８１５（１９９６）。幾つかの点において、両方のチロシン
残基のリン酸化は、ある種のシグナルタンパク質への結合に必要であったが、他
のシグナルタンパク質は、モノリン酸化の後に結合した。さらに、αｖβ３でト
ランスフェクトした細胞によるビトロネクチンへの接着は、β３サブユニットの
強力なチロシンリン酸化を誘導する。Ｂｌｙｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７１：３１４５８−３１４６２（１９９６）。
【００１５】 研究により、β１、β２およびβ３のチロシンを含む細胞質ドメインの配列は
、通常のインテグリン／細胞骨格相互作用にとって重要であることが分かってい
る。例えば、ＣＨＯ細胞の中にトランスフェクトされたβ３の中の７４７位のチ
ロシンがアラニンにより置換されると、β３媒介性細胞伸展を破壊し、事前に確
立された接着プラークへのαIIｂβ３の漸増をブロックし、αIIｂβ３がフィブ
リノーゲン被覆粒子の細胞内取込みを媒介する能力を低減する。Ｊ．Ｙｌａｎｎ
ｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，９５５０−９５５７，（１９９５）
。
【００１６】 Ｙｌａｎｎｅら同上，により報告されたさらなる実験は、さらに、７５９位の
チロシンをアラニンで置換すると、細胞伸展およびαIIｂβ３の接着プラークへ
の漸増が低減するが、この配列を含むカルボキシ末端ペンタペプチドを除去する
と、インテグリンの機能に対してさらに際立った効果を与えることを示した。こ
れらの著者らは、インテグリン媒介性細胞伸展に絶対的に必要な因子は７５７位
の残基のところでトランケートされたβ３または７４７位のチロシンがアラニン
により置換されたβ３を有するインテグリンのどちらにも結合しないため、イン
テグリン媒介性細胞伸展が起こらないと結論付けた。
【００１７】 β１−を含むインテグリンとβ２を含むインテグリンの相同的なドメインにお
ける点突然変異もそれぞれ機能を調節する。というのは、これらの突然変異がフ
ォーカルアドヒージョン（Ａ．Ａ．Ｒｅｓｚｋａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１
１７：１３２１−１３３０（１９９２））およびインテグリンの活性化（Ｍ．Ｌ
．Ｈｉｂｂｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２２７−１２３８（１９９１
））を減少することによりインテグリン−細胞骨格相互作用に影響するからであ
る。チロシンキナーゼも同様に、αIIｂβ３の細胞骨格接着を調節する上で不可
欠であることが見出された。Ｓｃｈｏｅｎｗａｅｌｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６９（５１）：３２４７９−３２４８７（１９９４）。
【００１８】 全体的に、２つのチロシンとβ３細胞質ドメインの７４７〜７６２位の残基の
「細胞接着調節ドメイン（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｄｏｍａｉｎ）」すなわち「ＣＡＲＤ」が、インテグリンβ３の接着機能の調
節に不可欠であることが報告された。Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ９３：１１８１９−１
１８２４（１９９６）。ＣＡＲＤからの１６アミノ酸配列は、固定化フィブリノ
ーゲンへのＨＥＬおよびＥＣＶ３０４細胞の接着を、インテグリンβ３テイルの
「先端部に係合する」細胞内のタンパク質同士の相互作用と競合することにより
、阻害した。しかし、ＣＡＲＤと相互作用する細胞質タンパク質の同定はまだ成
されていないと言われていた。
【００１９】 Ｄ．ミオシン 血小板血漿膜は、膜骨格として知られる格子状構造により被われている。膜骨
格は、短いアクチンフィラメント、アクチン結合タンパク質、スペクトリン、ビ
ンキュリンおよび様々な他のたんぱく質からなるが、これら全てが同定されたわ
けではない。Ｆｏｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３４）：２５９７３
−２５９８４（１９９３）。細胞質側上で、この骨格は細胞質アクチンフィラメ
ントのネットワークに会合するようである。膜骨格は脂質二重層を被い、細胞外
糖タンパク質および細胞内細胞骨格要素の両方に会合する。Ｆｏｘらは、血小板
中におけるインテグリンに誘導された運動の調節における１つのステップとして
、ＧＰIIｂ−IIIａが膜骨格のコンポーネントおよび関連するシグナル分子の再
分布を誘導すると唱えた。
【００２０】 ミオシンは、アクチンと相互作用して収縮または運動をもたらす収縮性タンパ
ク質である。「ミオシン」という用語は、アクチンフィラメントを移動させるこ
とができる、または小疱もしくは固定されたアクチンフィラメント上の他の物質
を移動することができる、分子モーターの少なくとも１１個のクラスからなる多
様なスーパーファミリーを広く指す。全てのミオシンに共通する特徴の１つは、
アクチンに可逆的に結合することおよびＭｇＡＴＰを加水分解することができる
ことである。図５およびＪ．Ｒ．ＳｅｌｌｅｒｓおよびＨ．Ｖ．Ｇｏｏｄｓｏｎ
，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ２：１３２３−１３３９（１９９５）を参照
。
【００２１】 精製されたミオシンの全てのタイプは多量体であり、少なくとも３つの機能的
ドメイン、つまりヘッド、ネックおよびテイルを有すると思われる。ヘッドすな
わちモータードメインは、ヌクレオチドおよびアクチン結合部位を含み、ミオシ
ンスーパーファミリーの間で最も良く保存された領域である。ネックドメインは
、軽鎖サブユニットの結合により安定化される重鎖からの長いαへリックス単鎖
からなる。アクチンを移動させることができるようにミオシンを固定する働きを
するテイル領域は、全ての領域の中で最も多様な一次配列であり、細胞または細
胞小器官膜にある種のミオシンアイソフォームを固定する働きをすることができ
る。細胞内でのミオシンのクラスタリングは、膜上またはアクチンフィラメント
自体の上で起こり得ると唱えられていた。Ｔｉｔｕｓ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ７：１１９（１９９７）。しかし、ミオシンテイルと細
胞内構造との間の相互作用の正確な生化学的メカニズムについては、これまでに
記載されていなかった。
【００２２】 Ｅ．シグナル伝達 インテグリンシグナル伝達におけるＧＰ IIｂ−IIIａの細胞質ドメインの関与
は、突然変異誘発実験から推測される。ＧＰ IIｂの細胞質ドメインが欠失する
と、野生型複合体と同等の親和性を持ってフィブリノーゲンに結合する構成的に
活性な受容体になる。このことは、ＧＰ IIｂの細胞質テイルが調節的な役割を
持つことを示唆している（Ｔ．Ｅ．Ｏ'Ｔｏｏｌｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌ．
１：８８３−８９３，（１９９０））。ＧＰ IIｂ−IIIａの点突然変異、欠失お
よび他のトランケーションは、ＧＰ IIｂ−IIIａのリガンド結合活性およびその
シグナル応答に影響を及ぼす（Ｐ．Ｅ．Ｈｕｇｈｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：１２４１１−１２４１７，（１９９５）；Ｊ．Ｙｌａｎｎｅら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９５５０−９５５７，（１９９５））。
【００２３】 ＧＰ IIｂではなくＧＰ IIIａの細胞質ドメインを含むキメラ膜貫通タンパク
質は、ＧＰ IIｂ−IIIａの機能を阻害する（Ｙ．Ｐ．Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．２６９：１８３０７−１８３１０，（１９９４））。このことは、
遊離ＧＰ IIIａ細胞質ドメインが正常なＧＰ IIｂ−IIIａ機能に必要な細胞内の
タンパク質に結合することを示唆している。幾つかのタンパク質は、ＧＰ IIｂ
またはＧＰ IIIａの膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに結合する
ことが分かっている。
【００２４】 タンパク質のテトラスパニン・ファミリーのメンバーであるＣＤ−９（Ｆ．Ｌ
ａｎｚａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０６３８−１０６４５，１９
９１）は、凝集した血小板上のＧＰ IIｂ−IIIａと相互作用することが見出され
た。ＧＰ IIIａの細胞質ドメインを「バイト」として用いて２−ハイブリッドス
クリーニングを行って同定したタンパク質であるβ３−エンドネキシン（ｅｎｄ
ｏｎｅｘｉｎ）は、ＧＰ IIIａの細胞質テイルと直接且つ選択的に相互作用する
ことが見出された（Ｓ．Ｓｈａｔｔｉｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３１：
８０７−８１６，（１９９５））。β３−エンドネキシンは、血小板無力症Ｓ７
５２−Ｐ突然変異を含むＧＰ IIIａ細胞質ドメインにはあまり結合しない。これ
らのＧＰ IIIａ結合タンパク質のいずれかがシグナル伝達に関与するかどうかは
まだ分かっていない。
【００２５】 また、ＧＰ IIIａ細胞質ドメイン配列でインテグリンと相互作用し得る、αＶ
β３に結合する細胞質タンパク質も記載されている。Ｂａｒｔｆｅｌｄおよびそ
の共同研究者ら（Ｎ．Ｓ．Ｂａｒｔｆｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８：１７２７０−１７２７６，（１９９３））は、洗浄剤ライゼートからの免疫
沈降法を用いて分子量が１９０ｋＤａであるタンパク質がＰＤＧＦ刺激３Ｔ３細
胞から得たαＶβ３インテグリンに会合することを証明した。ＩＲＳ−１は、ヒ
トインスリン受容体をコードするＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＲａｔ
−１細胞のインスリン刺激後に、αＶβ３インテグリンに結合することが分かっ
た（Ｋ．ＶｕｏｒｉおよびＥ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｓｃｉ．２６６：１５７６
−１５７８，（１９９４））。Ｋｏｌａｎｕｓら（Ｃｅｌｌ８６：２３３−２４
２，（１９９６））は近年、シトヘシン（ｃｙｔｏｈｅｓｉｎ）−１を同定した
。シトヘシン−１は、インテグリンβ２鎖の細胞内部分に特異的に結合し、シト
ヘシン−１の過剰発現は、ＩＣＡＭ−１へのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞
のβ２インテグリン依存性結合を誘導する。新規なセリン／トレオニンキナーゼ
であるＩＬＫ−１は、β１細胞質ドメインと会合することが分かった（Ｈａｎｎ
ｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３７９：９１−９６，（１９９６））。ＩＬＫ−１の
過剰発現は、インテグリンリガンドであるフィブロネクチン、ラミニンおよびビ
トロネクチンへの接着を阻害する。
【００２６】 接着タンパク質に結合するインテグリンおよびインテグリンシグナル伝達は、
上記のように、様々な生理学的役割を担う。インテグリンを介するシグナリング
の増強は、細胞接着および細胞内シグナル分子の活性化を強化し、これにより、
細胞の運動性および増殖の増強、細胞応答性の増強、ならびに形態学的変化の調
節がもたらされる。細胞機能に関与するインテグリンについては既に記載し、シ
グナリングについてこれから説明するが、インテグリンがシグナルを伝達するメ
カニズムについてはまだ未解明である。β３インテグリンの細胞質テイルにより
媒介されるインサイド・アウトおよびアウトサイド・インのシグナル伝達の役割
の分子メカニズムを理解するためには、インテグリンの細胞内テイルと相互作用
する細胞内分子の同定が必要である。インビトロでαアクチニンがβ１テイルに
結合することが報告されたが（Ｏｔｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：
２１１９３−２１１９７，（１９９３））、これらの結合の機能的な関係ははっ
きりしていない。２−ハイブリッド酵母を用いて、ＩＬＫ−１がβ１相互作用タ
ンパク質として同定されたが、ＩＬＫ−１はβ３には結合しない（Ｈａｎｎｉｇ
ａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３７９：９１−９６（１９９６））。
【００２７】 Ｆ．相同性組換え 遺伝子は、相同性組換えを用いて部位特異的に導入することができる。これは
、トランスジェニック動物の作製において使用することができ、その際、動物を
突然変異させ、その変異の表現型を、薬剤スクリーニング、生理学的プロセスの
調査、新しい製品の開発等の目的で研究することができる。相同性組換えについ
て議論した文献は、Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら（１９９５）の米国特許第
５，４１３，９２３号に記載されている。
【００２８】 相同性組換えにより内因性遺伝子における部位特異的修飾が可能となり、従っ
て、遺伝性のまたは後天的な突然変異を修正し、および／または遺伝子操作によ
りそのゲノムに新しく改変を加えることができる。相同性組換えの遺伝子治療へ
の応用は、相同性組換えまたは遺伝子ターゲッティングを移植用の正常な体細胞
で行えることができるかどうかによる。
【００２９】 相同性組換え用の細胞を調製するために、胚幹細胞または幹細胞系を得ること
ができる。胚幹細胞以外の細胞を使用することができる（例えば、造血幹細胞な
ど）（例えば、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎら（１９９４）の米国特許第５，５８９
，３６９号を参照されたい）。細胞は、適当な胎児繊維芽細胞層上で増殖させた
り、または、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖させてから、使用するこ
とができる。予め得ておいた胚盤胞に胚幹細胞を注入し、キメラ動物を作製する
。胚幹細胞手法の主な利点は、雌の動物に人工受精する前に、「導入遺伝子」で
トランスフェクトした細胞を該導入遺伝子の組込みおよび影響について検査する
ことができることである。従来のマイクロインジェクション手法と対照的に、導
入遺伝子を用いた相同性組換えにより染色体から相同的な各内因性遺伝子を除去
することができる。続いて交配実験を行うことにより、両方の染色体上に該導入
遺伝子を持つ動物を育種することができる。正常な遺伝子産生の発現をブロック
する変異を導入遺伝子の中に組み込む場合、この手法により内因性遺伝子を除去
することができ、こうして機能の研究を行うことができる。
【００３０】 また、相同性組換えは染色体外で行うこともでき、これは、大きな遺伝子配列
（例えば５０ｋｂを超えるもの等）を扱うときに有利である。染色体外相同性組
換えを行う方法は、Ｒ．Ｍ．Ｋａｙら（１９９８）の米国特許第５，７２１，３
６７号に記載されている。
【００３１】 Ｇ．トランスジェニック動物の産生 トランスジェニック動物は、クローニングされた遺伝子材料を実験的に導入し
た遺伝子改変動物である。クローニングされた遺伝子材料は、しばしば導入遺伝
子とよばれる。導入遺伝子の核酸配列を、ゲノム上のその特定の核酸配列が通常
見られない遺伝子座に組み込む。この導入遺伝子は、目的の動物の種と同じ種ま
たは異なる種のゲノムから得た核酸配列からなるものであってよい。
【００３２】 トランスジェニック技術の発展により、研究者は、実質的にあらゆる遺伝子型
の哺乳動物を作製したり、形質転換動物の生理学的および形態学的特性に対する
特定の外来核酸配列の導入による影響を評価したりすることが可能となった。ト
ランスジェニック動物が利用できれば、多くの他の検査システムでは達成できな
かった体系的かつ特異的な方法で、細胞プロセスを操作し、調べることができる
。例えば、トランスジェニック動物の開発は、生物学者および医学者に、病気の
研究に有用なモデルを提供する。このような動物はまた、新しい薬学的に活性な
物質の試験および開発にも有用である。
【００３３】 トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション
、マイクロインジェクション、胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング、なら
びに組換えウイルスおよびレトロウイルス感染等の様々な異なる方法により作製
することができる（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、米国特許第５，
６０２，３０７号、Ｍｕｌｌｉｎｓら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２（４）
：６３０−６３３（１９９３）、Ｂｒｅｎｉｎら、Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６（
２）９９−１１０（１９９７）；Ｔｕａｎ（編）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇ
ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｎｏ．６２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ
（１９９７）を参照）。「ノックアウト」という用語は一般に、特定遺伝子の対
立遺伝子の欠如（ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ）を含む変異生物（通常はマウス）を
指す。「ノックイン」という用語は一般に、相同性組換えにより遺伝子を挿入し
た変異生物（これも通常はマウス）を指す。ノックイン遺伝子は、内因性野生型
遺伝子に代わる遺伝子の変異形態であってもよい。
【００３４】 多くの組換えネズミが作製されてきた。例えば、活性化された癌遺伝子配列を
発現するもの（米国特許第４，７３６，８６６号）、サルＳＶ４０Ｔ−抗原を発
現するもの（米国特許第５，７２８，９１５号）、インターフェロン調節因子１
（ＩＲＦ−１）の発現を欠くもの（米国特許第５，７３１，４９０号）、ドーパ
ミン作用機能不全を示すもの（米国特許第５，７２３，７１９号）、血圧制御に
関与する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第５，７３１，
４８９号）、自然に発生したアルツハイマー病において存在する症状に大きな類
似性を示すもの（米国特許第５，７２０，９３６号）、細胞接着を媒介する能力
の低下したもの（米国特許第５，６０２，３０７号）、ウシ成長ホルモン遺伝子
を保有するもの（Ｃｌｕｔｔｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４３（４）：１７５
３−１７６０（１９９６））、および完全なヒト抗体反応を生成することができ
るもの（ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３４９（９０４９）：４０
５（１９９７））等がある。
【００３５】 ネズミ（特にマウスおよびラット）はトランスジェニック実験に最も多く選ば
れている動物であるが、幾つかのケースでは、代替の動物種を使用することが好
ましく、また必要さえある場合がある。トランスジェニック手順は、ヒツジ、ヤ
ギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよび
モルモット等の、ネズミ以外の様々な動物において使用することに成功してきた
（例えば、Ｋｉｍら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（４（：５１５−５
２６（１９９７）；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３
５（６）：６０９−６１７（１９９５）；Ｐｅｔｔｅｒｓ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅ
ｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６（５）：６４３−６４５（１９９４）；Ｓｃｈｎｉｅｋｅ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４６）：２１３０−２１３３（１９９７）；
およびＡｍｏａｈ，Ｊ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７５（２）：５７８−
５８５（１９９７）を参照）。
【００３６】 組換えコンピテント哺乳動物細胞中への核酸断片の導入方法は、複数の核酸分
子の同時形質転換を補助する方法によるものであってもよい。トランスジェニッ
ク動物の作製手順の詳細については、当業者には簡単に入手可能であり、例えば
米国特許第５，４８９，７４３号および米国特許第５，６０２，３０７号中の引
用が挙げられる。
【００３７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、改変された、置換されたまたは変異型インテグリン細胞質βサブユ
ニット遺伝子（およびその発現産物）を含み、その発現産物の２つ（またはそれ
以上の）細胞質チロシン残基の少なくとも１つが、フェニルアラニンなどの非チ
ロシン残基で置換されている、ヒト以外の哺乳動物を提供する。本発明に包含さ
れる哺乳動物の例としては、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ、イヌ、ネコ、サル、
チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよびモルモットが挙げられ
る。
【００３８】 より詳細には、本発明は、変異型ＧＰ IIIａ遺伝子および発現産物を含み、リ
ン酸化可能な細胞質チロシン残基の一方または両方がフェニルアラニン等の非リ
ン酸化可能チロシン残基で置換された、ヒト以外の哺乳動物を提供する。
【００３９】 さらに詳細には、本発明は、７４７位および７５９位の２つの細胞質チロシン
残基が各々フェニルアラニンで置換された変異型ＧＰ IIIａ遺伝子を含むトラン
スジェニックマウスを提供する。
【００４０】 また本発明は、本発明のトランスジェニック、ヒト以外の哺乳動物の血漿から
単離した血小板をも提供する。
【００４１】 また本発明は、ＧＰ IIIａ遺伝子などの変異型インテグリン細胞質βサブユニ
ット遺伝子で形質転換されたヒト以外の哺乳動物を作製する方法であって、例え
ば内因性ＧＰ IIIａ遺伝子の２つのチロシン残基のうちの少なくとも１つが非チ
ロシン残基で置換された該変異型ＧＰ IIIａを調製するものであり、ａ）変異し
た、または改変されたＧＰ IIIａ遺伝子などの変異型インテグリン細胞質βサブ
ユニット遺伝子をコードする核酸分子を胚幹細胞中に導入するステップ；そして
、ｂ）ステップａ）で得られた細胞から形質転換されたヒト以外の哺乳動物を再
生するステップを含むことを特徴とする方法をも提供する。
【００４２】 さらに詳細には、本発明は、例えば変異型ＧＰ IIIａ遺伝子で形質転換したヒ
ト以外の哺乳動物を作製する方法であって、内因性ＧＰ IIIａ遺伝子の２つのチ
ロシン残基のうち少なくとも一方を非チロシン残基で置換して該変異型ＧＰ III
ａを調製するものであり、 ａ）胚幹細胞中に、該変異型ＧＰ IIIａ遺伝子をコードする核酸分子およびＦＲ
Ｔ部位によりフランキングされた選択マーカーを導入するステップ； ｂ）形質転換細胞を同定および選択するステップ； ｃ）ＦＬＰ組換え酵素を用いた一過性形質転換により、ステップｂ）で選択され
た形質転換細胞から選択マーカーを除去するステップ； ｄ）ステップｃ）で得た形質転換細胞を胚盤胞中に注入するステップ； ｅ）ステップｄ）の胚盤胞から形質転換された、ヒト以外の哺乳動物を再生し、
ここで該再生された形質転換ヒト以外の哺乳動物が前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子
に対してキメラであるステップ； ｆ）野生型ヒト以外の哺乳動物と前記キメラヒト以外の哺乳動物とを育種して、
野生型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してヘテロ接合性であるヒト以外の哺乳動物を作製
するステップと； ｇ）ステップｆ）で作製したヘテロ接合性ヒト以外の哺乳動物をステップｆ）で
作製した第２のヘテロ接合性ヒト以外の哺乳動物と交配させるステップ；そして
、 ｈ）得られた子孫から前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してホモ接合性であるヒ
ト以外の哺乳動物を選択するステップ、 を含むことを特徴とする方法をも提供する。
【００４３】 また、本発明は、同じ種または株の２つの哺乳動物間の特徴を比較する方法で
あって、一方の哺乳動物が例えば野生型ＧＰ IIIａ遺伝子を有し、他方の哺乳動
物は、該野生型ＧＰ IIIａ遺伝子の２つのチロシン残基のうちの少なくとも１つ
が変異型ＧＰ IIIａ遺伝子において非チロシン残基で置換された、改変されたま
たは変異されたＧＰ IIIａ遺伝子を有することを特徴とする、前記方法を提供す
る。より具体的には、本発明は、ＧＰ IIIａの細胞質チロシン残基の両方がフェ
ニルアラニン等どの非チロシン残基で置換されたトランスジェニック哺乳動物を
用いたこのような方法を含む。さらにより具体的には、本発明は、７４７位およ
び７５９位の細胞質チロシン残基が両方ともフェニルアラニン等の非チロシン残
基で置換されたトランスジェニック哺乳動物を用いるこのような方法を含む。
【００４４】 本発明のトランスジェニック哺乳動物に使用される、比較することができる特
徴の例には、様々な生理学的または生物学的機能および様々なインテグリン分子
の細胞質βサブユニット遺伝子により、全体または一部が媒介される反応の比較
が含まれる。例えば、このような機能の比較には、２つの哺乳動物型の間（すな
わち野生型動物と遺伝子操作された動物の間）の出血時間または凝固時間の観察
および比較；２つの哺乳動物型間のさまざまな血栓反応の比較；様々な血管形成
刺激に応答した２つの哺乳動物型の血管形成のレベル、程度および速度の比較；
２つの哺乳動物型間の腫瘍転移の速度および程度の比較；および２つの哺乳動物
型の炎症の範囲、速度および程度の比較が含まれる。
【００４５】 また本発明は、ＧＰ IIIａ遺伝子の発現に起因する改変された、または変異さ
れたインテグリンβサブユニット遺伝子を発現する遺伝子操作された哺乳動物の
選択された生物学的特徴に及ぼす様々な薬剤の影響を測定する方法であって、ａ
）前記薬剤をトランスジェニック哺乳動物に投与するステップ、ｂ）前記投与の
後、所望の時間のあいだ前記哺乳動物を維持するステップ、そしてｃ）前記変異
型ＧＰ IIIａ遺伝子の発現に起因する前記哺乳動物の特徴が、前記薬剤の投与に
より影響されたかどうかを測定するステップを含むことを特徴とする、前記方法
をも提供する。
【００４６】 本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載および実施例から明らかであ
ろう。例えば、実施例は変異型β３サブユニットを含むトランスジェニック動物
に関するものであるが、本発明は、その特定のインテグリンβサブユニット遺伝
子をコードする内因性遺伝子中に１以上のリン酸化可能なチロシンを有する他の
インテグリンβサブユニットを用いて実施することもできる。
【００４７】
【発明の実施の形態】 別途に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書
中に記載される方法および物質と同等なもしくは類似するあらゆる方法および物
質は、本発明の実施および試験で使用することができるが、好適な方法および物
質について記載する。
【００４８】 I．一般的な説明 以下の記載は、本発明の一般的な説明および本明細書中で使用される幾つかの
用語の定義を提供するものである。本願中に記載される発明の一部は、サンフラ
ンシスコで１９９８年４月１５日に開かれた米国心臓協会会議でＤａｖｉｄ Ｒ
．Ｐｈｉｌｌｉｐｓにより発表されたものである。そのプレゼンテーションの内
容およびこれに関連するあらゆる印刷物は全て、本明細書中に参考文献として援
用される。
【００４９】 本発明者らによる以前の研究により、血小板インテグリンＧＰ IIｂ−IIIａ（
αIIｂβ３としても知られる）のＧＰ IIIａサブユニットのチロシンリン酸化は
、このインテグリンによるシグナル伝達を調節することができることが示された
（例えば１９９７年１１月２１日に出願された米国特許出願第０８／９７５，６
５３号を参照。当該文献は、本明細書中に参考文献として援用される）。ＧＰ I
IIａチロシンリン酸化が血小板の凝集に依存すること、ならびにシグナルタンパ
ク質および細胞骨格タンパク質がリン酸化されたＧＰ IIIａに会合するようにな
ることは、ＧＰ IIIａリン酸化が血小板中のアウトサイド・インＧＰ IIｂ−III
ａシグナリングにおいて重要であることを我々に示唆するものであった。ＧＰ I
Iｂ−IIIａ媒介アウトサイド・イン・シグナリングが首尾良く行われることは、
安定な血小板凝集の形成などの血小板機能に必要であり、正常な止血のために重
要なプロセスであり、また異常な状態であると閉塞性血栓の形成につながり得る
ものである。従って、ＧＰ IIIａのチロシンリン酸化がアウトサイド・インＧＰ
IIｂ−IIIａシグナリングにおいて本当に重要なステップである場合、このよう
なリン酸化を阻害することができる化合物が抗血栓特性を有すると仮定すること
ができる。血小板機能におけるＧＰ IIIａのチロシンリン酸化反応の重要性に焦
点を当てるために、２つの細胞質チロシン残基がフェニルアラニンに変異したＧ
Ｐ IIIａ遺伝子によりその内因性ＧＰ IIIａ遺伝子が置換された、変異型マウス
を作製した（ＧＰ IIIａ（Ｙ７４７Ｆ，Ｙ７５９Ｆ））。このような動物から得
た血小板は、チロシンリン酸化を経ることができないＧＰ IIIａを発現し、従っ
て、血小板機能のためのリン酸化反応の重要性を評価するための重要なツールを
提供する。
【００５０】 トランスフェクトされた細胞系における（すなわちインビトロでの）ＧＰ III
ａ変異の影響を評価することは、ＧＰ IIIａ機能における様々な残基の役割を決
定するのに有用であるが、血小板機能におけるＧＰ IIIａ細胞質チロシン残基の
重要性は、インビボで決定するのが最もよい。従って、本発明者らは、内因性マ
ウスＧＰ IIIａ遺伝子を、その２つの細胞質チロシン残基のうちの一方に少なく
とも１つの非チロシン置換を有する変異型遺伝子で置換する、遺伝子置換計画を
着手した。より具体的には、内因性マウスＧＰ IIIａ遺伝子を、細胞質ドメイン
の７４７位および７５９位の２つのチロシンがそれぞれフェニルアラニンに置換
された変異型遺伝子で置換した。マウスＧＰ IIIａ遺伝子は配列決定されていな
いので、ヒトＧＰ IIIａ遺伝子の配列に基づくＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ
に基づく技法を用いて、マウスゲノムＧＰ IIIａを含むＰ１クローンを得た。目
的の領域に対応するＤＮＡ（すなわちＧＰ IIIａ細胞質ドメインをコードする２
つのエクソン）を、一般的な分子生物学的手法を用いてマッピングした。細胞質
ドメイン中の２つのチロシン（Ｙ７４７およびＹ７５９）をフェニルアラニンに
変異させ、この変異型ＧＰ IIIａゲノムＤＮＡおよびＦＲＴ部位（ＦＬＰ組換え
酵素の認識配列）によりフランキングされた選択薬剤マーカー（ネオマイシン耐
性）を含むターゲッティングベクターを構築した。このベクターを胚幹細胞中に
トランスフェクトし、サザンブロットおよび特定のプライマーを用いたＰＣＲに
より、相同性組換えを経た細胞を同定した。次に、１つの正常なＧＰ IIIａ対立
遺伝子、１つのＧＰ IIIａ（Ｙ７４７Ｆ、ＦＹ７５９Ｆ）変異型対立遺伝子、お
よびネオマイシン耐性ＤＮＡを含むこれらのＥＳ細胞を、ＦＬＰ組換え酵素で一
過性トランスフェクトにかけ、薬剤耐性ＤＮＡを除去した。再び、所望の過程を
経たＥＳ細胞を、サザンブロットおよびＰＣＲにより同定した。変異型マウスの
作製のための現在標準的なプロトコールを使用した。基本的に、胚盤胞中に所望
の変異型ＥＳ細胞を注入してキメラマウスを作製し、これを野生型マウスと育種
して、１つの正常なＧＰ IIIａ対立遺伝子および１つの変異型ＧＰ IIIａ対立遺
伝子を発現するヘテロ接合性動物を作製した（テイルゲノムＤＮＡのサザンブロ
ットおよびＰＣＲにより評価した）。次にこれらのヘテロ接合性動物を交配させ
て同腹子を作製した。これらの動物の約１／４は、変異型ＧＰ IIIａに対してホ
モ接合性であった（すなわち、これらのマウスにより発現されたＧＰ IIIａのみ
が２つのチロシンのフェニルアラニンへの変異を含んでいた）。
【００５１】 これらのトランスジェニックマウスは、血小板機能に対するＧＰ IIIａ細胞質
チロシン残基の重要性を評価するための重要なツールを提供する。従来の研究に
より、ＧＰ IIIａチロシン残基のリン酸化は、アウトサイド・インＧＰ IIｂ−I
IIａシグナリングにおいて重要であることが指摘されていた。変異型マウスから
得た血小板は、その中のＧＰ IIIａがチロシンリン酸化されることができないＧ
Ｐ IIｂ−IIIａを発現する。従って、これらのマウスから得た血小板は、血小板
機能に対するアウトサイド・インＧＰ IIｂ−IIIａシグナリングの役割を評価す
るための多くのアッセイにおいて使用することができる。例えば、変異型マウス
における出血時間は、ＧＰ IIIａのチロシンリン酸化が正常な止血に不可欠であ
るかどうかを評価する。また、ＧＰ IIIａチロシンリン酸化がアウトサイド・イ
ン・シグナリングの必須な部分である場合、変異型マウスは血栓応答（非常に大
きな血小板凝集の形成が必要である）において欠陥があることが予測されるであ
ろう。本発明者らは現在、これらの変異型マウスのマウス血栓症モデルを使用し
て、この問題を直接評価することができる。実際、この変異型マウスは、ＧＰ I
IIａチロシンリン酸化を直接干渉するか、またはこのリン酸化に依存する事象（
例えばホスホ−ＧＰ IIIａとアダプタータンパク質との相互作用など）を干渉す
るように設計された治療薬を生成することの有用性についての情報を提供する。
【００５２】 ＧＰ IIIａ（β3）インテグリンサブユニットの発現は、血小板に限定されな
い。内皮細胞において、このタンパク質はαvサブユニットと対になりαvβ3イ
ンテグリンを形成する。このインテグリンは、血管形成および腫瘍転移において
重要な役割を果たすと考えられる。好中球において、β3はＬＲＩ（白血球反応
性インテグリン）のサブユニットであり、炎症反応に関与すると考えられている
。変異型マウスにおいてβ3の全ては、細胞質ドメインにおけるチロシンのフェ
ニルアラニンへの変異を含むので、このマウスは、αvβ3およびＬＲＩ機能に対
するこれらの変異の影響を調べるために使用することができる。この場合も、こ
のような分析は、β3リン酸化の阻害が血管形成、腫瘍転移および／または炎症
に影響を及ぼすか否かについての情報を提供するものであり、従って、臨床的に
非常に重要である。
【００５３】 上記詳細な説明は、理解をより明瞭にするためにのみ提供されたものであって
、これにより何ら不必要、限定的な意味を成すものではなく、当業者にとっては
改変が自明である。
【００５４】 本発明は、特定の実施の形態に関して記載されたが、さらに変更を行うことが
可能であることが理解できよう。本願は、本発明が属する技術分野において公知
または一般に実施されているようなもの、これまでに記載した重要な特徴に当て
はまるようなもの、および特許請求の範囲に従っているもので本明細書の開示内
容から逸脱するものも含む、一般に本発明の原理に従った本発明のあらゆるバリ
エーション、使用法、または適用を包含するものとする。
【００５５】 II．具体的な実施の形態 β３の細胞質ドメイン内のホスホチロシン結合モチーフの存在は、このインテ
グリンテイルのチロシンリン酸化が、ホスホチロシン結合シグナルタンパク質Ｓ
ｈｃおよびＧｒｂ２の細胞膜への漸増を容易にすることを示している（Ｐｈｉｌ
ｉｐｓら（１９９６）を参照）。本発明者らは、β３インテグリンテイルのチロ
シンリン酸化および脱リン酸化が、同様に、細胞骨格へのインテグリンの会合を
調節することを発見した（例えば、１９９７年１１月２１日に出願された米国特
許出願第０８／９７５，６５３号（本明細書中に参考文献として援用される）を
参照）。図２は、様々なヒトインテグリンβサブユニットのアミノ酸配列を提供
し、チロシン残基の位置を示している。先に記載したように、他の研究により、
チロシンを含むβ１、β２およびβ３（ＧＰ IIIａ）の細胞質ドメインの配列が
、ＧＰIIｂ−IIIａおよび他のインテグリンが正常に機能するために重要である
ことが分かっている。従って、天然でリン酸化可能なチロシン残基を含むこれら
の、または他のインテグリンβサブユニットの改変された変異型細胞質ドメイン
を発現するトランスジェニック動物は、明らかに本発明の範囲内に包含される。
【００５６】 また、リン酸化可能なチロシン残基の保存的置換を含む改変、修飾または変異
されたインテグリンサブユニットも、明らかに企図される。本明細書中で使用さ
れる保存的アミノ酸置換とは、１以上の関連する細胞質チロシン残基の部位でリ
ン酸化を経ることができないこと以外は、シグナル活性に関与するインテグリン
の能力、または１以上の特定の結合相手（例えばミオシンなど）に結合するイン
テグリンの能力に悪影響を及ぼさない、そのアミノ酸配列における特定の残基（
具体的にはリン酸化可能なチロシン残基）の変更、または他のものの変更を指す
。置換、挿入または欠失は、変更した配列がペプチドのシグナル活性への関与、
またはその天然の結合相手（例えばミオシンなど）との会合を有意に阻害すると
き、対応する野生型インテグリンβサブユニットペプチドの正常な機能に悪影響
を及ぼすといわれている。例えば、βサブユニットペプチドの総電荷、構造また
は疎水性／親水性特性は、ペプチドの活性に悪影響を及ぼすことなく変更するこ
とができると考えられる。従って、βサブユニットペプチドのアミノ酸配列を変
更して、この変更によりその正常なシグナル活性に関与するもしくは例えばミオ
シンなどの正常な結合相手に会合するペプチドの能力に悪影響を及ぼさない程度
に、例えばそのペプチドをより疎水性または親水性とすることができると考えら
れる。このように、特に考えられるのは、変異型ＧＰIIIａサブユニットである
。
【００５７】 例えば、１つの用途では、リン酸化可能チロシン残基のどれか１つまたは全て
を修飾するために標準的なノックアウト手順を用いて改変βサブユニットペプチ
ドを調製することができる。これは、ターゲッティング組換え等の当分野で公知
の様々な手順を用いて達成することができる。調製したあと、遺伝子操作した動
物を用いて、以下のことができる。すなわち、１）βサブユニットペプチドによ
り媒介される生物学的および病理学的プロセスを同定すること、２）βサブユニ
ットペプチドと相互作用するタンパク質および他の遺伝子を同定すること、３）
βサブユニットペプチドのリン酸化の不在または減少を克服するために外から供
給することができる薬剤を同定すること、および４）改変βサブユニットペプチ
ドの活性を調節する（すなわち増強したり、減少させたり）薬剤を同定するのに
適したスクリーニングとして役立てることである。
【００５８】 本明細書中に記載したように、本発明は、内因性βサブユニット遺伝子の中で
リン酸化可能チロシン残基が通常存在する部位に非チロシン残基を含むトランス
ジェニック動物を提供する。非チロシン置換はこれらの残基がチロシンであると
きのようにはリン酸化されないため、および正常な血小板凝集はリン酸化の発生
に依存するため、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、正常時とは異なる血
小板凝集を示す。形質転換した動物と形質転換していない動物の生理学的および
形態学的特徴を比較することにより、当業者であれば、対応する動物に対するＧ
Ｐ IIIａ遺伝子における細胞質チロシンリン酸化の存在または不在の影響を決定
することができる。
【００５９】 さらに、本発明のトランスジェニック動物を用いて、血小板凝集を調節する（
すなわち促進かさらに阻害する）薬剤、またはインテグリンシグナル経路により
媒介される他の影響を同定することができる。このような薬剤の評価は、当業者
に公知の手法により、インビトロ、インサイチュー、またはインビボのいずれか
で行うことができる。開示されたトランスジェニック動物の細胞、血小板、組織
または全器官は、インテグリンが媒介する細胞骨格会合に関係するプロセスを減
少または促進する能力について様々な薬剤の効果を試験するのに有用である。試
験することができる薬剤には、様々な抗凝血剤、血栓溶解および抗血小板治療薬
および薬剤が含まれる。このような薬剤の例には、ヘパリン等のグリコサミオン
グリカン；ジクマロール、アニシンジオンおよびブロマドキオロン等の経口抗凝
血薬；組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ウロキナーゼ；アスピリン
、ジピリダモール；およびチクロピジンが含まれる。例えば、このような薬剤お
よびその薬理学のより完全なリストについては、Ｍａｊｅｒｕｓら、Ａｎｔｉｃ
ｏａｇｕｌａｎｔ，Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ，ａｎｄ Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌ
ｅｔ Ｄｒｕｇｓ，ｉｎ Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎ
ｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ５４（１９９６）を参照。
【００６０】 本発明のトランスジェニック動物の細胞および全ての器官は、獣医学および人
間医学におけるこれらの使用とは全く別に、動物における遺伝子の調節、発現お
よび組織化を調査するために使用することもできる。他の細胞、組織および生物
学的プロセスに対する、改変したまたは変異型インテグリンβサブユニット（例
えばＧＰ IIIａ遺伝子）の様々な影響を研究することにより、当業者は、正常な
代謝経路におけるチロシンリン酸化の役割をつきとめることができる。
【００６１】 トランスジェニック哺乳動物（特にトランスジェニックマウス）の診断用途、
および研究用途の他の例については、例えば米国特許第５，５６９，８２４号を
参照されたい。
【００６２】 さらなる記載を要するまでもなく、当業者であれば、これまでの説明および以
下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製および使用し、特許請求の
範囲に記載された方法を行うことができるものと信じる。従って、以下の実施例
は、本発明の好適な実施の形態について特に指摘しており、本願の開示の他の部
分をいかようにも限定するものと解釈されるべきではない。
【００６３】 他の一般的な構成は、当業者には自明であろう。
【００６４】 （実施例１） マウスゲノムＧＰ IIIａ ＤＮＡの取得 マウスゲノムＤＮＡの配列は公知ではなく、また公表されていないが、マウス
ＧＰ IIIａのアミノ酸配列の一部は入手可能であり（Ｃｉｅｔａｔら（１９９３
），Ｂｉｏｃｈｅｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．１９３：７７
１−７７８、およびＤｒ Ｊｅａｎ−Ｐｈｉｌｌｉｐｅ Ｒｏｓａ，Ｕｎｉｔｅ
ＩＮＳＥＲＭ３４８，Ｐａｒｉｓ）、ヒトＧＰ IIIａ配列に似ていることから
、ヒトおよびマウスから得たＧＰ IIIａはかなり類似しているものと思われる。
従って、マウスＧＰ IIIａ配列の、ヒトＧＰ IIIａの場合ではＧＰ IIIａの細胞
質ドメインをコードすることが知られている２つのエクソン（すなわちエクソン
ＭおよびＮ）にまたがる領域に対して幾つかのＰＣＲプライマーを作製した（Ｌ
ａｎｚａ，Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８０９８−
１８１０３）。次に、全マウスゲノムＤＮＡを用いてこれらのプライマーを試験
したところ、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）において１セットが約１．５ｋＢ
の特定のバンドを生成した。このバンドは、エクソンＭの３'側部分、エクソン
Ｎの５'側部分、およびこれら２つのエクソンの間のイントロンにまたがる推定
ヒト断片（約１．２ｋＢ）とサイズが似ていた。これらのプライマーは、１）５
'側プライマー（マウスＧＰ IIIａの１８３４〜１８５０番残基）および２）３'
側プライマー（マウスＧＰ IIIａの２０２６〜２０３９番残基）をコードするも
のであった。次にこれらの特異的プライマーを用いて、マウスゲノムＤＮＡの大
きな断片を含むＰ１クローンを得た。このクローンは、ＰＣＲにおいて鋳型とし
て使用したときに同じバンドを生じた。このように本発明者らは、マウスゲノム
ＧＰ IIIａを含み、ＧＰ IIIａの細胞質ドメインをコードする領域を特に含むＰ
１クローンを得た。次に、このＰ１クローンの約１０ｋＢを、制限酵素消化物の
混合物、サザンブロットおよびアミノ酸配列決定によりマッピングした。これは
マウスＧＰ IIIａであること、および、ヒトＧＰ IIIａと同様に、２つのエクソ
ン（ヒト命名法にちなんでＭおよびＮと呼ばれる）はマウスＧＰ IIIａ細胞質領
域をコードしていることが確認された。実際に、この細胞質ドメインのアミノ酸
残基は、ヒトおよびマウスの間では同一であると判明した。
【００６５】 （実施例２） ７４７位および７５９位のチロシン残基のフェニルアラニンへ の変異 エクソンＮを含む０．３ｋＢ ＰｓｔＩ／ＳａｃＩ断片（上記２つのチロシン
残基をコードする）をｐＢＳＫＳ II中にサブクローニングし、標準的な部位部
位特異的変異誘発手法を用いて２つのチロシン残基をフェニルアラニンに変異さ
せた。変異は配列決定により確認し、また、変異型ＤＮＡを後に同定するために
使用することができる２つの新しい酵素部位、すなわちＤｒａＩ部位（Ｙ７４７
Ｆ位）およびＴａｑＩ部位（Ｙ７５９Ｆ）を導入するように設計した。この変異
型断片を使用して、マウスゲノムＧＰ IIIａクローンにおける野生型ＰｓｔＩ／
ＳａｃＩ断片を置換した。
【００６６】 （実施例３） ターゲッティングベクターの構築 ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩアダプターを用いて、エクソンＭおよびゲノムのイ
ントロンＤＮＡを含む、マウスＧＰ IIIａの約２．５ｋＢ ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎ
ｄIII断片を、ネオマイシン耐性カセットを含むｐＢＳベクターのＥｃｏＲＩ部
位の中へサブクローニングした。ｎｅｏrＤＮＡは、ｎｅｏｒＤＮＡを後の段階
で切り出すのに使用することができる、Ｆｌｐ組換え酵素により認識される部位
であるＦＲＴ認識配列によりフランキングされていた（Ｄｙｍｅｃｋｉ Ｓ．Ｍ
．（１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：６１９１−６１９６）。チロシンがフェ
ニルアラニンに変異したエクソンＮを含むＧＰ IIIａの約４ｋＢ ＨｉｎｄIII
断片を、このベクターのＨｉｎｄIII部位中にサブクローニングし、エクソンＭ
とＮとの間のイントロンの中にｎｅｏrカセットを有する変異されたＧＰ IIIａ
から基本的に構成される構築物を得た。
【００６７】 （実施例４） ターゲッティングされた胚幹（ＥＳ）細胞の作製 上記ターゲッティング構築物をＥＳ細胞中にトランスフェクトし、次にＪｏｈ
ｎｓｏｎ，ＲおよびＫｉｌｌｅｎ，Ｎ．Ｐ（Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２
：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄｓ．Ｂ．Ｄ．Ｈａｎｅｓ
ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ
ｅｓｓ ｐ．３１３−３２７（１９９５））に記載されたように、薬剤Ｇ４１８
を用いて、このＥＳ細胞をｎｅｏｒについて選択した。首尾良く相同性組換えさ
れたＥＳ細胞をサザンブロットおよびＰＣＲ手法により同定した。現在、これら
の細胞は１つの野生型ＧＰ IIIａ対立遺伝子、およびｎｅｏｒカセットとチロシ
ンのフェニルアラニンへの変異を含む１つの対立遺伝子を持っていた。該薬剤カ
セットのサイズは１．９ｋＢであり、イントロンの中に存在していたが、本発明
者らは、その存在が彼らの実験に悪影響を及ぼさないようにするために、これを
除去しようとした。このため、ＦＲＴ部位を認識して該薬剤耐性をコードするＤ
ＮＡの切出しをもたらすＦｌｐ組換え酵素で、選択されたＥＳ細胞を一過性トラ
ンスフェクションにかけた。このように、イントロン中に存在する外来性ＤＮＡ
の１．９ｋＢ片の代わりに、３４ｂｐＦＲＴ認識部位（および新しいＸｂａＩ部
位）をコードする小さな片のみが残る（Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．Ｍ．，ＰＮＡＳ
９３：６１９１−６１９６（１９９６））。再び、サザンブロットおよびＰＣＲ
手法を用いて、首尾良く事を経たＥＳ細胞を選択した。
【００６８】 （実施例５） 変異型マウスの作製 変異型マウスを作製するために、変異型ＥＳ細胞クローン（１２９株マウスに
由来する）をＣ５７Ｂ１６マウスから得た胚盤胞中に注入し、これらの胚盤胞を
擬似妊娠代理母に移植した（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，Ｒ，Ｄａｖｉｓ，Ａ
．Ｃ．，およびＢｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ２２５ Ｅｄｓ．Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．Ｄｅ
Ｐａｎｐｈｉｌｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）の特にｐ８５
５−８７８に記載）。次に混合外皮カラー（Ｃ５７Ｂ１６胚盤胞からのものは黒
および１２９ＥＳ細胞からのものは野ねずみ色（ａｇｏｕｔｉ色））により識別
した雄のキメラ動物を、Ｃ５７Ｂ１６野生型雌と交尾させた。その子孫を、サザ
ンブロットにより野生型および変異型ＧＰ IIIａ対立遺伝子の存在について遺伝
子型に分けた（変異型ＧＰ IIIａＤＮＡのみに存在する新しいＸｂａＩ部位を利
用した）。これらの子孫には、野生型およびヘテロ接合性動物が混じっており、
ヘテロ接合性動物をさらに交配させて、野生型動物、ヘテロ接合性動物（すなわ
ち一方が野生型で他方が変異型ＧＰ IIIａ対立遺伝子）およびホモ接合性動物（
すなわち両方とも、チロシンのフェニルアラニンへの変異を含むＧＰ IIIａ対立
遺伝子）を含む同腹子を生ませた。
【００６９】 今までのところ、このような交配から得た子孫の遺伝子型は、（基本的なメン
デルの遺伝法則に従って）予測した比率で生じた。さらに、変異型動物は生存可
能であり、抗ＧＰ IIｂ−IIIａ抗体で血小板を染色してＦＡＣＳ（蛍光活性化細
胞選別）で調べたときに、非変異型ＧＰ IIIａを発現する正常な動物に見られる
のと同様のレベルでその血小板上にＧＰ IIｂ−IIIａを発現する。
【００７０】 上記実施例にそって本発明を詳細に記載してきたが、本発明の精神から逸脱す
ることなく様々な修正を行うことができることが理解できよう。従って、本発明
は、特許請求の範囲によってのみ限定される。本願中に引用された全ての特許、
特許出願および刊行物は、その全体が本明細書中に参考文献として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 αおよびβインテグリンサブユニットのペアリングを示す図である。
【図２】 様々なインテグリンサブユニットの細胞質ドメインを示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月１９日（２０００．６．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項６８】 前記哺乳動物がマウスであることを特徴とする、請求項６
７に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月１４日（２０００．１２．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） 本願は、１９９６年１０月１８日に出願された米国特許出願第０８／７３４，
６０７号、１９９６年１１月２１日に出願された米国仮出願第６０／０３１，６
６５号、１９９７年３月２８日に出願された米国仮出願第６０／０４２，０９３
号、および１９９７年１１月２１日に出願された米国特許出願第０８／９７５，
６５３号に関連するものであり、これらの内容は全て参考文献として本明細書に
援用する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】 本発明は、外来ＤＮＡが導入された、またはインテグリンをコードする遺伝子
の中のあるコドンを置換して作製した、トランスジェニック哺乳動物または遺伝
子操作した哺乳動物に関する。特に、本発明は、内因性ＧＰ IIIａ遺伝子（β３
としても知られる）の全体または一部が、その２つのリン酸化可能な細胞質チロ
シン残基のうちの一方または両方が例えばフェニルアラニン等の非チロシン残基
で置換された変異型ＧＰ IIIａ遺伝子で置換された、トランスジェニック哺乳動
物を提供する。改変されたＧＰ IIIａ遺伝子を発現する、得られたトランスジェ
ニック哺乳動物の血液に見られる細胞（特に血小板）の全てまたは一部は、その
野生型の相対物において生じるようなチロシンリン酸化を経ることができないた
め、これらの動物は、血小板機能にとってのこれらのチロシン残基のリン酸化反
応の重要性を評価するための有用なツールを提供する。また本発明は、変異型Ｇ
Ｐ IIIａインテグリンサブユニットが血小板の形成以外の生物学的プロセスに及
ぼす影響を研究するのにも有用である。
【０００３】
【従来の技術】 本明細書に記載される全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出
願が特定的にそして個別に参考文献として援用されると指摘されたのと同程度に
、本明細書中に参考文献として援用される。
【０００４】 Ａ．インテグリン インテグリンは、細胞外基質タンパク質および他の細胞への細胞の接着を媒介
するαβヘテロ二量体のファミリーである（Ｃｌａｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１
９９５）２６８：２３３−２３９）。また、インテグリンは、一連の中間体タン
パク質を介してアクチン細胞骨格に結合して、細胞外基質と細胞内細胞骨格との
間のつながり、およびそれに関連する運動機構を提供する。このような膜貫通連
絡は、細胞の移動に必要である。多くの生物学的応答は、少なくともある程度、
インテグリン媒介性接着および細胞移動（胚発生、血流遮断、血餅退縮、有糸分
裂、血管形成、炎症、免疫応答、白血球のホーミングおよび活性化、貪食作用、
骨吸収、腫瘍の成長および転移、アテローム性動脈硬化、再狭窄ならびに創傷の
治癒を含む）に依存する。
【０００５】 インテグリンファミリーのメンバーは、シグナル伝達にも関与している。これ
は、細胞活性化（インサイド・アウト・シグナル伝達と呼ばれる）に応答した細
胞表面インテグリンの接着親和力の変化により証明される。さらに、インテグリ
ン媒介性接着の後の細胞内シグナル経路に対する影響が観察され、これはアウト
サイド・イン・シグナル伝達と呼ばれる。
【０００６】 インテグリンファミリーは、１５個の関連する既知のαサブユニット（α１、
α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、αＥ、αＶ、αIIｂ、αＬ
、αＭ、およびαＸ）および８個の関連する既知のβサブユニット（β１、β２
、β３、β４、β５、β６、β７およびβ８）からなる。Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ
ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，８：９２９−９３８（１９９４）。インテグリンαおよ
びβサブユニットは、図１に示したような様々なペアリングで存在することが知
られている。インテグリンのリガンド特異性は、αおよびβサブユニットの特定
のペアリングにより決定されるが、幾つかのインテグリンは同じリガンドに結合
することが知られているので、ある程度の重剰性が存在する。
【０００７】 β３サブユニットの２つの既知のペアリングが観察された。つまり、αＶとの
ペアリングでαＶβ３、ビトロネクチン受容体が作製され、ＧＰ IIｂとのペア
リングではＧＰ IIｂ−IIIａ、フィブリノーゲン受容体が作製される。αＶβ３
は、広範囲に分布しており、インテグリンファミリーの最も不規則なメンバーで
あり、広いスペクトルの接着性タンパク質への細胞付着（大部分の場合、接着性
タンパク質上のＲ−Ｇ−Ｄ配列に付着する）を媒介する。αＶβ３により媒介さ
れる生物学的プロセスは多様であり、骨吸収、血管形成、腫瘍の転移および再狭
窄が含まれる。αＶβ３は、接着性タンパク質の連結の際にシグナルを出すこと
が知られている（Ｐ．Ｉ．Ｌｅａｖｅｓｌｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１
２１：１６３−１７０（１９９３））。例として、内皮細胞は連結から解放され
るとアポトーシスを起こす（Ｐ．Ｃ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｃｅｌｌ７９：１１５７−
１１６４（１９９４））。
【０００８】 Ｂ．既知の細胞骨格タンパク質とインテグリンの相互作用 インテグリンの未改変αおよびβサブユニット細胞質ドメインの、様々な細胞
骨格タンパク質およびシグナルタンパク質への結合が、報告されている。Ｓ．Ｄ
ｅｄｈａｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：６５７−６６９
（１９９６）。形態学的研究により、これらのタンパク質の多くは、インテグリ
ンがクラスタ化して細胞外基質および細胞骨格タンパク質の両方に結合している
フォーカルアドヒージョン（中心的接着位）に集積していることが示された。Ｉ
．Ｋｎｅｚｅｖｉｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２７）：１６４１６
−１６５２１（１９９６）。
【０００９】 例えば、２３５ｋＤビンキュリンおよびアクチン結合タンパク質であるタリン
は、固相結合アッセイにおいてαIIｂおよびβ３の細胞質ドメインに結合する。
Ｉ．Ｋｎｅｚｅｖｉｃら、同上。固相結合アッセイにおける、１００ｋＤビンキ
ュリン結合タンパク質およびアクチンの架橋タンパク質であるαアクチニンの、
β１およびβ３の細胞質ドメインへの結合も、観察されている。Ｃ．Ａ．Ｏｔｅ
ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２８）；２１１９３−２１１９７（１
９９３）；およびＣ．Ａ．Ｏｔｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：７２
１−７２９（１９９０）。結合研究により、ビンキュリンおよびアクチン結合タ
ンパク質を含む２１５ｋＤ ＳＨ２ドメインであるテンシン（ｔｅｎｓｉｎ）と
β１の細胞質ドメインとの間に相互作用があることが証明された。Ｓ．Ｌｉｎら
、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ７Ｓｕｐｐ．３８９ａＡｂｓｔｒａｃｔ２２５９
（１９９６）。
【００１０】 また、他の細胞骨格に関連するタンパク質も、インテグリンと相互作用する。
１９５ｋＤミオシンおよび中間径フィラメント結合タンパク質であるスケルミン
は、β１およびβ３の細胞骨格ドメインの膜近接領域に結合する。Ｋ．Ｂ．Ｒｅ
ｄｄｙら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ７Ｓｕｐｐ．３８５Ａ，Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ２２３７（１９９５）。これらの著者らは、スケルミンがミオシンおよび中間
径フィラメントをβインテグリンに結合させることができると唱えた。
【００１１】 また、ビンキュリン結合シグナルタンパク質であるパキシリンも、β１インテ
グリンの細胞質ドメインに結合する。Ｍ．Ｄ．Ｓｃｈａｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．１３０：１１８１−１１８７（１９９５）。β１−パキシリン会
合が直接的なものであるか間接的なものであるかはまだ分かっていないが、パキ
シリンは、チロシンキナーゼｐｐ１２５ＦＡＫの基質であり、ｐｐ１２５ＦＡＫ
によりチロシンがリン酸化されると仮定されていた。アクチン結合タンパク質フ
ィラミンは、インビトロではβ２インテグリンサブユニットの細胞質テイルに結
合し、そしてインビボではβ２インテグリンと共に共免疫沈降および同時局在化
されることが証明されている。Ｃ．Ｐ．Ｓｈａｒｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５４；３４６１−３４７０（１９９５）。
【００１２】 セリン／トレオニンキナーゼのミオシン軽鎖キナーゼファミリーに関連するも
のと同定された２０８ｋＤインテグリン結合タンパク質も、報告されている。Ｗ
ａｌｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ７Ｓｕｐｐ．３８４Ａ，Ａｂｓｔｒ
ａｃｔ２２３５（１９９５）。このキナーゼは、αアクチニンおよびミオシンを
含むタンパク質の複合体の一部であると言われていたが、このキナーゼがインテ
グリンの細胞質テイルに直接会合するのか、タンパク質の複合体を介するのかは
定かではなかった。
【００１３】 上記に挙げた細胞骨格タンパク質は、精製したタンパク質またはペプチドを有
するインテグリンサブユニットの細胞質ドメインと相互作用することが分かって
いるが、これらの相互作用が細胞内でどのように起こるのか、またこれらの相互
作用がどのように調節されるのかは分かっていない。さらに、上記インテグリン
／細胞骨格相互作用は、ホスホチロシンに依存して生じるものではない。
【００１４】 Ｃ．インテグリンβサブユニットの細胞質ドメインのチロシンリン酸化 多くのアゴニストにより誘導された血小板凝集により、β３細胞質テイルの中
のチロシン残基のリン酸化が起こる。Ｌａｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７１
：１０８１１−１０８１５（１９９６）。幾つかの点において、両方のチロシン
残基のリン酸化は、ある種のシグナルタンパク質への結合に必要であったが、他
のシグナルタンパク質は、モノリン酸化の後に結合した。さらに、αｖβ３でト
ランスフェクトした細胞によるビトロネクチンへの接着は、β３サブユニットの
強力なチロシンリン酸化を誘導する。Ｂｌｙｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７１：３１４５８−３１４６２（１９９６）。
【００１５】 研究により、β１、β２およびβ３のチロシンを含む細胞質ドメインの配列は
、通常のインテグリン／細胞骨格相互作用にとって重要であることが分かってい
る。例えば、ＣＨＯ細胞の中にトランスフェクトされたβ３の中の７４７位のチ
ロシンがアラニンにより置換されると、β３媒介性細胞伸展を破壊し、事前に確
立された接着プラークへのαIIｂβ３の漸増をブロックし、αIIｂβ３がフィブ
リノーゲン被覆粒子の細胞内取込みを媒介する能力を低減する。Ｊ．Ｙｌａｎｎ
ｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，９５５０−９５５７，（１９９５）
。
【００１６】 Ｙｌａｎｎｅら同上，により報告されたさらなる実験は、さらに、７５９位の
チロシンをアラニンで置換すると、細胞伸展およびαIIｂβ３の接着プラークへ
の漸増が低減するが、この配列を含むカルボキシ末端ペンタペプチドを除去する
と、インテグリンの機能に対してさらに際立った効果を与えることを示した。こ
れらの著者らは、インテグリン媒介性細胞伸展に絶対的に必要な因子は７５７位
の残基のところでトランケートされたβ３または７４７位のチロシンがアラニン
により置換されたβ３を有するインテグリンのどちらにも結合しないため、イン
テグリン媒介性細胞伸展が起こらないと結論付けた。
【００１７】 β１−を含むインテグリンとβ２を含むインテグリンの相同的なドメインにお
ける点突然変異もそれぞれ機能を調節する。というのは、これらの突然変異がフ
ォーカルアドヒージョン（Ａ．Ａ．Ｒｅｓｚｋａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１
１７：１３２１−１３３０（１９９２））およびインテグリンの活性化（Ｍ．Ｌ
．Ｈｉｂｂｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２２７−１２３８（１９９１
））を減少することによりインテグリン−細胞骨格相互作用に影響するからであ
る。チロシンキナーゼも同様に、αIIｂβ３の細胞骨格接着を調節する上で不可
欠であることが見出された。Ｓｃｈｏｅｎｗａｅｌｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６９（５１）：３２４７９−３２４８７（１９９４）。
【００１８】 全体的に、２つのチロシンとβ３細胞質ドメインの７４７〜７６２位の残基の
「細胞接着調節ドメイン（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｄｏｍａｉｎ）」すなわち「ＣＡＲＤ」が、インテグリンβ３の接着機能の調
節に不可欠であることが報告された。Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ９３：１１８１９−１
１８２４（１９９６）。ＣＡＲＤからの１６アミノ酸配列は、固定化フィブリノ
ーゲンへのＨＥＬおよびＥＣＶ３０４細胞の接着を、インテグリンβ３テイルの
「先端部に係合する」細胞内のタンパク質同士の相互作用と競合することにより
、阻害した。しかし、ＣＡＲＤと相互作用する細胞質タンパク質の同定はまだ成
されていないと言われていた。
【００１９】 Ｄ．ミオシン 血小板血漿膜は、膜骨格として知られる格子状構造により被われている。膜骨
格は、短いアクチンフィラメント、アクチン結合タンパク質、スペクトリン、ビ
ンキュリンおよび様々な他のたんぱく質からなるが、これら全てが同定されたわ
けではない。Ｆｏｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３４）：２５９７３
−２５９８４（１９９３）。細胞質側上で、この骨格は細胞質アクチンフィラメ
ントのネットワークに会合するようである。膜骨格は脂質二重層を被い、細胞外
糖タンパク質および細胞内細胞骨格要素の両方に会合する。Ｆｏｘらは、血小板
中におけるインテグリンに誘導された運動の調節における１つのステップとして
、ＧＰIIｂ−IIIａが膜骨格のコンポーネントおよび関連するシグナル分子の再
分布を誘導すると唱えた。
【００２０】 ミオシンは、アクチンと相互作用して収縮または運動をもたらす収縮性タンパ
ク質である。「ミオシン」という用語は、アクチンフィラメントを移動させるこ
とができる、または小疱もしくは固定されたアクチンフィラメント上の他の物質
を移動することができる、分子モーターの少なくとも１１個のクラスからなる多
様なスーパーファミリーを広く指す。全てのミオシンに共通する特徴の１つは、
アクチンに可逆的に結合することおよびＭｇＡＴＰを加水分解することができる
ことである。図５およびＪ．Ｒ．ＳｅｌｌｅｒｓおよびＨ．Ｖ．Ｇｏｏｄｓｏｎ
，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ２：１３２３−１３３９（１９９５）を参照
。
【００２１】 精製されたミオシンの全てのタイプは多量体であり、少なくとも３つの機能的
ドメイン、つまりヘッド、ネックおよびテイルを有すると思われる。ヘッドすな
わちモータードメインは、ヌクレオチドおよびアクチン結合部位を含み、ミオシ
ンスーパーファミリーの間で最も良く保存された領域である。ネックドメインは
、軽鎖サブユニットの結合により安定化される重鎖からの長いαへリックス単鎖
からなる。アクチンを移動させることができるようにミオシンを固定する働きを
するテイル領域は、全ての領域の中で最も多様な一次配列であり、細胞または細
胞小器官膜にある種のミオシンアイソフォームを固定する働きをすることができ
る。細胞内でのミオシンのクラスタリングは、膜上またはアクチンフィラメント
自体の上で起こり得ると唱えられていた。Ｔｉｔｕｓ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ７：１１９（１９９７）。しかし、ミオシンテイルと細
胞内構造との間の相互作用の正確な生化学的メカニズムについては、これまでに
記載されていなかった。
【００２２】 Ｅ．シグナル伝達 インテグリンシグナル伝達におけるＧＰ IIｂ−IIIａの細胞質ドメインの関与
は、突然変異誘発実験から推測される。ＧＰ IIｂの細胞質ドメインが欠失する
と、野生型複合体と同等の親和性を持ってフィブリノーゲンに結合する構成的に
活性な受容体になる。このことは、ＧＰ IIｂの細胞質テイルが調節的な役割を
持つことを示唆している（Ｔ．Ｅ．Ｏ'Ｔｏｏｌｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌ．
１：８８３−８９３，（１９９０））。ＧＰ IIｂ−IIIａの点突然変異、欠失お
よび他のトランケーションは、ＧＰ IIｂ−IIIａのリガンド結合活性およびその
シグナル応答に影響を及ぼす（Ｐ．Ｅ．Ｈｕｇｈｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：１２４１１−１２４１７，（１９９５）；Ｊ．Ｙｌａｎｎｅら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９５５０−９５５７，（１９９５））。
【００２３】 ＧＰ IIｂではなくＧＰ IIIａの細胞質ドメインを含むキメラ膜貫通タンパク
質は、ＧＰ IIｂ−IIIａの機能を阻害する（Ｙ．Ｐ．Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．２６９：１８３０７−１８３１０，（１９９４））。このことは、
遊離ＧＰ IIIａ細胞質ドメインが正常なＧＰ IIｂ−IIIａ機能に必要な細胞内の
タンパク質に結合することを示唆している。幾つかのタンパク質は、ＧＰ IIｂ
またはＧＰ IIIａの膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに結合する
ことが分かっている。
【００２４】 タンパク質のテトラスパニン・ファミリーのメンバーであるＣＤ−９（Ｆ．Ｌ
ａｎｚａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０６３８−１０６４５，１９
９１）は、凝集した血小板上のＧＰ IIｂ−IIIａと相互作用することが見出され
た。ＧＰ IIIａの細胞質ドメインを「バイト」として用いて２−ハイブリッドス
クリーニングを行って同定したタンパク質であるβ３−エンドネキシン（ｅｎｄ
ｏｎｅｘｉｎ）は、ＧＰ IIIａの細胞質テイルと直接且つ選択的に相互作用する
ことが見出された（Ｓ．Ｓｈａｔｔｉｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３１：
８０７−８１６，（１９９５））。β３−エンドネキシンは、血小板無力症Ｓ７
５２−Ｐ突然変異を含むＧＰ IIIａ細胞質ドメインにはあまり結合しない。これ
らのＧＰ IIIａ結合タンパク質のいずれかがシグナル伝達に関与するかどうかは
まだ分かっていない。
【００２５】 また、ＧＰ IIIａ細胞質ドメイン配列でインテグリンと相互作用し得る、αＶ
β３に結合する細胞質タンパク質も記載されている。Ｂａｒｔｆｅｌｄおよびそ
の共同研究者ら（Ｎ．Ｓ．Ｂａｒｔｆｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８：１７２７０−１７２７６，（１９９３））は、洗浄剤ライゼートからの免疫
沈降法を用いて分子量が１９０ｋＤａであるタンパク質がＰＤＧＦ刺激３Ｔ３細
胞から得たαＶβ３インテグリンに会合することを証明した。ＩＲＳ−１は、ヒ
トインスリン受容体をコードするＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＲａｔ
−１細胞のインスリン刺激後に、αＶβ３インテグリンに結合することが分かっ
た（Ｋ．ＶｕｏｒｉおよびＥ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｓｃｉ．２６６：１５７６
−１５７８，（１９９４））。Ｋｏｌａｎｕｓら（Ｃｅｌｌ８６：２３３−２４
２，（１９９６））は近年、シトヘシン（ｃｙｔｏｈｅｓｉｎ）−１を同定した
。シトヘシン−１は、インテグリンβ２鎖の細胞内部分に特異的に結合し、シト
ヘシン−１の過剰発現は、ＩＣＡＭ−１へのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞
のβ２インテグリン依存性結合を誘導する。新規なセリン／トレオニンキナーゼ
であるＩＬＫ−１は、β１細胞質ドメインと会合することが分かった（Ｈａｎｎ
ｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３７９：９１−９６，（１９９６））。ＩＬＫ−１の
過剰発現は、インテグリンリガンドであるフィブロネクチン、ラミニンおよびビ
トロネクチンへの接着を阻害する。
【００２６】 接着タンパク質に結合するインテグリンおよびインテグリンシグナル伝達は、
上記のように、様々な生理学的役割を担う。インテグリンを介するシグナリング
の増強は、細胞接着および細胞内シグナル分子の活性化を強化し、これにより、
細胞の運動性および増殖の増強、細胞応答性の増強、ならびに形態学的変化の調
節がもたらされる。細胞機能に関与するインテグリンについては既に記載し、シ
グナリングについてこれから説明するが、インテグリンがシグナルを伝達するメ
カニズムについてはまだ未解明である。β３インテグリンの細胞質テイルにより
媒介されるインサイド・アウトおよびアウトサイド・インのシグナル伝達の役割
の分子メカニズムを理解するためには、インテグリンの細胞内テイルと相互作用
する細胞内分子の同定が必要である。インビトロでαアクチニンがβ１テイルに
結合することが報告されたが（Ｏｔｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：
２１１９３−２１１９７，（１９９３））、これらの結合の機能的な関係ははっ
きりしていない。２−ハイブリッド酵母を用いて、ＩＬＫ−１がβ１相互作用タ
ンパク質として同定されたが、ＩＬＫ−１はβ３には結合しない（Ｈａｎｎｉｇ
ａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３７９：９１−９６（１９９６））。
【００２７】 Ｆ．相同性組換え 遺伝子は、相同性組換えを用いて部位特異的に導入することができる。これは
、トランスジェニック動物の作製において使用することができ、その際、動物を
突然変異させ、その変異の表現型を、薬剤スクリーニング、生理学的プロセスの
調査、新しい製品の開発等の目的で研究することができる。相同性組換えについ
て議論した文献は、Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら（１９９５）の米国特許第
５，４１３，９２３号に記載されている。
【００２８】 相同性組換えにより内因性遺伝子における部位特異的修飾が可能となり、従っ
て、遺伝性のまたは後天的な突然変異を修正し、および／または遺伝子操作によ
りそのゲノムに新しく改変を加えることができる。相同性組換えの遺伝子治療へ
の応用は、相同性組換えまたは遺伝子ターゲッティングを移植用の正常な体細胞
で行えることができるかどうかによる。
【００２９】 相同性組換え用の細胞を調製するために、胚幹細胞または幹細胞系を得ること
ができる。胚幹細胞以外の細胞を使用することができる（例えば、造血幹細胞な
ど）（例えば、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎら（１９９４）の米国特許第５，５８９
，３６９号を参照されたい）。細胞は、適当な胎児繊維芽細胞層上で増殖させた
り、または、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖させてから、使用するこ
とができる。予め得ておいた胚盤胞に胚幹細胞を注入し、キメラ動物を作製する
。胚幹細胞手法の主な利点は、雌の動物に人工受精する前に、「導入遺伝子」で
トランスフェクトした細胞を該導入遺伝子の組込みおよび影響について検査する
ことができることである。従来のマイクロインジェクション手法と対照的に、導
入遺伝子を用いた相同性組換えにより染色体から相同的な各内因性遺伝子を除去
することができる。続いて交配実験を行うことにより、両方の染色体上に該導入
遺伝子を持つ動物を育種することができる。正常な遺伝子産生の発現をブロック
する変異を導入遺伝子の中に組み込む場合、この手法により内因性遺伝子を除去
することができ、こうして機能の研究を行うことができる。
【００３０】 また、相同性組換えは染色体外で行うこともでき、これは、大きな遺伝子配列
（例えば５０ｋｂを超えるもの等）を扱うときに有利である。染色体外相同性組
換えを行う方法は、Ｒ．Ｍ．Ｋａｙら（１９９８）の米国特許第５，７２１，３
６７号に記載されている。
【００３１】 Ｇ．トランスジェニック動物の産生 トランスジェニック動物は、クローニングされた遺伝子材料を実験的に導入し
た遺伝子改変動物である。クローニングされた遺伝子材料は、しばしば導入遺伝
子とよばれる。導入遺伝子の核酸配列を、ゲノム上のその特定の核酸配列が通常
見られない遺伝子座に組み込む。この導入遺伝子は、目的の動物の種と同じ種ま
たは異なる種のゲノムから得た核酸配列からなるものであってよい。
【００３２】 トランスジェニック技術の発展により、研究者は、実質的にあらゆる遺伝子型
の哺乳動物を作製したり、形質転換動物の生理学的および形態学的特性に対する
特定の外来核酸配列の導入による影響を評価したりすることが可能となった。ト
ランスジェニック動物が利用できれば、多くの他の検査システムでは達成できな
かった体系的かつ特異的な方法で、細胞プロセスを操作し、調べることができる
。例えば、トランスジェニック動物の開発は、生物学者および医学者に、病気の
研究に有用なモデルを提供する。このような動物はまた、新しい薬学的に活性な
物質の試験および開発にも有用である。
【００３３】 トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション
、マイクロインジェクション、胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング、なら
びに組換えウイルスおよびレトロウイルス感染等の様々な異なる方法により作製
することができる（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、米国特許第５，
６０２，３０７号、Ｍｕｌｌｉｎｓら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２（４）
：６３０−６３３（１９９３）、Ｂｒｅｎｉｎら、Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６（
２）９９−１１０（１９９７）；Ｔｕａｎ（編）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇ
ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｎｏ．６２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ
（１９９７）を参照）。「ノックアウト」という用語は一般に、特定遺伝子の対
立遺伝子の欠如（ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ）を含む変異生物（通常はマウス）を
指す。「ノックイン」という用語は一般に、相同性組換えにより遺伝子を挿入し
た変異生物（これも通常はマウス）を指す。ノックイン遺伝子は、内因性野生型
遺伝子に代わる遺伝子の変異形態であってもよい。
【００３４】 多くの組換えネズミが作製されてきた。例えば、活性化された癌遺伝子配列を
発現するもの（米国特許第４，７３６，８６６号）、サルＳＶ４０Ｔ−抗原を発
現するもの（米国特許第５，７２８，９１５号）、インターフェロン調節因子１
（ＩＲＦ−１）の発現を欠くもの（米国特許第５，７３１，４９０号）、ドーパ
ミン作用機能不全を示すもの（米国特許第５，７２３，７１９号）、血圧制御に
関与する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第５，７３１，
４８９号）、自然に発生したアルツハイマー病において存在する症状に大きな類
似性を示すもの（米国特許第５，７２０，９３６号）、細胞接着を媒介する能力
の低下したもの（米国特許第５，６０２，３０７号）、ウシ成長ホルモン遺伝子
を保有するもの（Ｃｌｕｔｔｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４３（４）：１７５
３−１７６０（１９９６））、および完全なヒト抗体反応を生成することができ
るもの（ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３４９（９０４９）：４０
５（１９９７））等がある。
【００３５】 ネズミ（特にマウスおよびラット）はトランスジェニック実験に最も多く選ば
れている動物であるが、幾つかのケースでは、代替の動物種を使用することが好
ましく、また必要さえある場合がある。トランスジェニック手順は、ヒツジ、ヤ
ギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよび
モルモット等の、ネズミ以外の様々な動物において使用することに成功してきた
（例えば、Ｋｉｍら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（４（：５１５−５
２６（１９９７）；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３
５（６）：６０９−６１７（１９９５）；Ｐｅｔｔｅｒｓ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅ
ｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６（５）：６４３−６４５（１９９４）；Ｓｃｈｎｉｅｋｅ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４６）：２１３０−２１３３（１９９７）；
およびＡｍｏａｈ，Ｊ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７５（２）：５７８−
５８５（１９９７）を参照）。
【００３６】 組換えコンピテント哺乳動物細胞中への核酸断片の導入方法は、複数の核酸分
子の同時形質転換を補助する方法によるものであってもよい。トランスジェニッ
ク動物の作製手順の詳細については、当業者には簡単に入手可能であり、例えば
米国特許第５，４８９，７４３号および米国特許第５，６０２，３０７号中の引
用が挙げられる。
【００３７】
【課題を解決するための手段】 本発明は、改変された、置換されたまたは変異型インテグリン細胞質βサブユ
ニット遺伝子（およびその発現産物）を含み、その発現産物の２つ（またはそれ
以上の）細胞質チロシン残基の少なくとも１つが、フェニルアラニンなどの非チ
ロシン残基で置換されている、ヒト以外の哺乳動物を提供する。本発明に包含さ
れる哺乳動物の例としては、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ、イヌ、ネコ、サル、
チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよびモルモットが挙げられ
る。
【００３８】 より詳細には、本発明は、変異型ＧＰ IIIａ遺伝子および発現産物を含み、リ
ン酸化可能な細胞質チロシン残基の一方または両方がフェニルアラニン等の非リ
ン酸化可能チロシン残基で置換された、ヒト以外の哺乳動物を提供する。
【００３９】 さらに詳細には、本発明は、７４７位および７５９位の２つの細胞質チロシン
残基が各々フェニルアラニンで置換された変異型ＧＰ IIIａ遺伝子を含むトラン
スジェニックマウスを提供する。
【００４０】 また本発明は、本発明のトランスジェニック、ヒト以外の哺乳動物の血漿から
単離した血小板をも提供する。
【００４１】 また本発明は、ＧＰ IIIａ遺伝子などの変異型インテグリン細胞質βサブユニ
ット遺伝子で形質転換されたヒト以外の哺乳動物を作製する方法であって、例え
ば内因性ＧＰ IIIａ遺伝子の２つのチロシン残基のうちの少なくとも１つが非チ
ロシン残基で置換された該変異型ＧＰ IIIａを調製するものであり、ａ）変異し
た、または改変されたＧＰ IIIａ遺伝子などの変異型インテグリン細胞質βサブ
ユニット遺伝子をコードする核酸分子を胚幹細胞中に導入するステップ；そして
、ｂ）ステップａ）で得られた細胞から形質転換されたヒト以外の哺乳動物を再
生するステップを含むことを特徴とする方法をも提供する。
【００４２】 さらに詳細には、本発明は、例えば変異型ＧＰ IIIａ遺伝子で形質転換したヒ
ト以外の哺乳動物を作製する方法であって、内因性ＧＰ IIIａ遺伝子の２つのチ
ロシン残基のうち少なくとも一方を非チロシン残基で置換して該変異型ＧＰ III
ａを調製するものであり、 ａ）胚幹細胞中に、該変異型ＧＰ IIIａ遺伝子をコードする核酸分子およびＦＲ
Ｔ部位によりフランキングされた選択マーカーを導入するステップ； ｂ）形質転換細胞を同定および選択するステップ； ｃ）ＦＬＰ組換え酵素を用いた一過性形質転換により、ステップｂ）で選択され
た形質転換細胞から選択マーカーを除去するステップ； ｄ）ステップｃ）で得た形質転換細胞を胚盤胞中に注入するステップ； ｅ）ステップｄ）の胚盤胞から形質転換された、ヒト以外の哺乳動物を再生し、
ここで該再生された形質転換ヒト以外の哺乳動物が前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子
に対してキメラであるステップ； ｆ）野生型ヒト以外の哺乳動物と前記キメラヒト以外の哺乳動物とを育種して、
野生型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してヘテロ接合性であるヒト以外の哺乳動物を作製
するステップと； ｇ）ステップｆ）で作製したヘテロ接合性ヒト以外の哺乳動物をステップｆ）で
作製した第２のヘテロ接合性ヒト以外の哺乳動物と交配させるステップ；そして
、 ｈ）得られた子孫から前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してホモ接合性であるヒ
ト以外の哺乳動物を選択するステップ、 を含むことを特徴とする方法をも提供する。
【００４３】 また、本発明は、同じ種または株の２つの哺乳動物間の特徴を比較する方法で
あって、一方の哺乳動物が例えば野生型ＧＰ IIIａ遺伝子を有し、他方の哺乳動
物は、該野生型ＧＰ IIIａ遺伝子の２つのチロシン残基のうちの少なくとも１つ
が変異型ＧＰ IIIａ遺伝子において非チロシン残基で置換された、改変されたま
たは変異されたＧＰ IIIａ遺伝子を有することを特徴とする、前記方法を提供す
る。より具体的には、本発明は、ＧＰ IIIａの細胞質チロシン残基の両方がフェ
ニルアラニン等どの非チロシン残基で置換されたトランスジェニック哺乳動物を
用いたこのような方法を含む。さらにより具体的には、本発明は、７４７位およ
び７５９位の細胞質チロシン残基が両方ともフェニルアラニン等の非チロシン残
基で置換されたトランスジェニック哺乳動物を用いるこのような方法を含む。
【００４４】 本発明のトランスジェニック哺乳動物に使用される、比較することができる特
徴の例には、様々な生理学的または生物学的機能および様々なインテグリン分子
の細胞質βサブユニット遺伝子により、全体または一部が媒介される反応の比較
が含まれる。例えば、このような機能の比較には、２つの哺乳動物型の間（すな
わち野生型動物と遺伝子操作された動物の間）の出血時間または凝固時間の観察
および比較；２つの哺乳動物型間のさまざまな血栓反応の比較；様々な血管形成
刺激に応答した２つの哺乳動物型の血管形成のレベル、程度および速度の比較；
２つの哺乳動物型間の腫瘍転移の速度および程度の比較；および２つの哺乳動物
型の炎症の範囲、速度および程度の比較が含まれる。
【００４５】 また本発明は、ＧＰ IIIａ遺伝子の発現に起因する改変された、または変異さ
れたインテグリンβサブユニット遺伝子を発現する遺伝子操作された哺乳動物の
選択された生物学的特徴に及ぼす様々な薬剤の影響を測定する方法であって、ａ
）前記薬剤をトランスジェニック哺乳動物に投与するステップ、ｂ）前記投与の
後、所望の時間のあいだ前記哺乳動物を維持するステップ、そしてｃ）前記変異
型ＧＰ IIIａ遺伝子の発現に起因する前記哺乳動物の特徴が、前記薬剤の投与に
より影響されたかどうかを測定するステップを含むことを特徴とする、前記方法
をも提供する。
【００４６】 本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載および実施例から明らかであ
ろう。例えば、実施例は変異型β３サブユニットを含むトランスジェニック動物
に関するものであるが、本発明は、その特定のインテグリンβサブユニット遺伝
子をコードする内因性遺伝子中に１以上のリン酸化可能なチロシンを有する他の
インテグリンβサブユニットを用いて実施することもできる。
【００４７】
【発明の実施の形態】 別途に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書
中に記載される方法および物質と同等なもしくは類似するあらゆる方法および物
質は、本発明の実施および試験で使用することができるが、好適な方法および物
質について記載する。
【００４８】 I．一般的な説明 以下の記載は、本発明の一般的な説明および本明細書中で使用される幾つかの
用語の定義を提供するものである。本願中に記載される発明の一部は、サンフラ
ンシスコで１９９８年４月１５日に開かれた米国心臓協会会議でＤａｖｉｄ Ｒ
．Ｐｈｉｌｌｉｐｓにより発表されたものである。そのプレゼンテーションの内
容およびこれに関連するあらゆる印刷物は全て、本明細書中に参考文献として援
用される。
【００４９】 本発明者らによる以前の研究により、血小板インテグリンＧＰ IIｂ−IIIａ（
αIIｂβ３としても知られる）のＧＰ IIIａサブユニットのチロシンリン酸化は
、このインテグリンによるシグナル伝達を調節することができることが示された
（例えば１９９７年１１月２１日に出願された米国特許出願第０８／９７５，６
５３号を参照。当該文献は、本明細書中に参考文献として援用される）。ＧＰ I
IIａチロシンリン酸化が血小板の凝集に依存すること、ならびにシグナルタンパ
ク質および細胞骨格タンパク質がリン酸化されたＧＰ IIIａに会合するようにな
ることは、ＧＰ IIIａリン酸化が血小板中のアウトサイド・インＧＰ IIｂ−III
ａシグナリングにおいて重要であることを我々に示唆するものであった。ＧＰ I
Iｂ−IIIａ媒介アウトサイド・イン・シグナリングが首尾良く行われることは、
安定な血小板凝集の形成などの血小板機能に必要であり、正常な止血のために重
要なプロセスであり、また異常な状態であると閉塞性血栓の形成につながり得る
ものである。従って、ＧＰ IIIａのチロシンリン酸化がアウトサイド・インＧＰ
IIｂ−IIIａシグナリングにおいて本当に重要なステップである場合、このよう
なリン酸化を阻害することができる化合物が抗血栓特性を有すると仮定すること
ができる。血小板機能におけるＧＰ IIIａのチロシンリン酸化反応の重要性に焦
点を当てるために、２つの細胞質チロシン残基がフェニルアラニンに変異したＧ
Ｐ IIIａ遺伝子によりその内因性ＧＰ IIIａ遺伝子が置換された、変異型マウス
を作製した（ＧＰ IIIａ（Ｙ７４７Ｆ，Ｙ７５９Ｆ））。このような動物から得
た血小板は、チロシンリン酸化を経ることができないＧＰ IIIａを発現し、従っ
て、血小板機能のためのリン酸化反応の重要性を評価するための重要なツールを
提供する。
【００５０】 トランスフェクトされた細胞系における（すなわちインビトロでの）ＧＰ III
ａ変異の影響を評価することは、ＧＰ IIIａ機能における様々な残基の役割を決
定するのに有用であるが、血小板機能におけるＧＰ IIIａ細胞質チロシン残基の
重要性は、インビボで決定するのが最もよい。従って、本発明者らは、内因性マ
ウスＧＰ IIIａ遺伝子を、その２つの細胞質チロシン残基のうちの一方に少なく
とも１つの非チロシン置換を有する変異型遺伝子で置換する、遺伝子置換計画を
着手した。より具体的には、内因性マウスＧＰ IIIａ遺伝子を、細胞質ドメイン
の７４７位および７５９位の２つのチロシンがそれぞれフェニルアラニンに置換
された変異型遺伝子で置換した。マウスＧＰ IIIａ遺伝子は配列決定されていな
いので、ヒトＧＰ IIIａ遺伝子の配列に基づくＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ
に基づく技法を用いて、マウスゲノムＧＰ IIIａを含むＰ１クローンを得た。目
的の領域に対応するＤＮＡ（すなわちＧＰ IIIａ細胞質ドメインをコードする２
つのエクソン）を、一般的な分子生物学的手法を用いてマッピングした。細胞質
ドメイン中の２つのチロシン（Ｙ７４７およびＹ７５９）をフェニルアラニンに
変異させ、この変異型ＧＰ IIIａゲノムＤＮＡおよびＦＲＴ部位（ＦＬＰ組換え
酵素の認識配列）によりフランキングされた選択薬剤マーカー（ネオマイシン耐
性）を含むターゲッティングベクターを構築した。このベクターを胚幹細胞中に
トランスフェクトし、サザンブロットおよび特定のプライマーを用いたＰＣＲに
より、相同性組換えを経た細胞を同定した。次に、１つの正常なＧＰ IIIａ対立
遺伝子、１つのＧＰ IIIａ（Ｙ７４７Ｆ、ＦＹ７５９Ｆ）変異型対立遺伝子、お
よびネオマイシン耐性ＤＮＡを含むこれらのＥＳ細胞を、ＦＬＰ組換え酵素で一
過性トランスフェクトにかけ、薬剤耐性ＤＮＡを除去した。再び、所望の過程を
経たＥＳ細胞を、サザンブロットおよびＰＣＲにより同定した。変異型マウスの
作製のための現在標準的なプロトコールを使用した。基本的に、胚盤胞中に所望
の変異型ＥＳ細胞を注入してキメラマウスを作製し、これを野生型マウスと育種
して、１つの正常なＧＰ IIIａ対立遺伝子および１つの変異型ＧＰ IIIａ対立遺
伝子を発現するヘテロ接合性動物を作製した（テイルゲノムＤＮＡのサザンブロ
ットおよびＰＣＲにより評価した）。次にこれらのヘテロ接合性動物を交配させ
て同腹子を作製した。これらの動物の約１／４は、変異型ＧＰ IIIａに対してホ
モ接合性であった（すなわち、これらのマウスにより発現されたＧＰ IIIａのみ
が２つのチロシンのフェニルアラニンへの変異を含んでいた）。
【００５１】 これらのトランスジェニックマウスは、血小板機能に対するＧＰ IIIａ細胞質
チロシン残基の重要性を評価するための重要なツールを提供する。従来の研究に
より、ＧＰ IIIａチロシン残基のリン酸化は、アウトサイド・インＧＰ IIｂ−I
IIａシグナリングにおいて重要であることが指摘されていた。変異型マウスから
得た血小板は、その中のＧＰ IIIａがチロシンリン酸化されることができないＧ
Ｐ IIｂ−IIIａを発現する。従って、これらのマウスから得た血小板は、血小板
機能に対するアウトサイド・インＧＰ IIｂ−IIIａシグナリングの役割を評価す
るための多くのアッセイにおいて使用することができる。例えば、変異型マウス
における出血時間は、ＧＰ IIIａのチロシンリン酸化が正常な止血に不可欠であ
るかどうかを評価する。また、ＧＰ IIIａチロシンリン酸化がアウトサイド・イ
ン・シグナリングの必須な部分である場合、変異型マウスは血栓応答（非常に大
きな血小板凝集の形成が必要である）において欠陥があることが予測されるであ
ろう。本発明者らは現在、これらの変異型マウスのマウス血栓症モデルを使用し
て、この問題を直接評価することができる。実際、この変異型マウスは、ＧＰ I
IIａチロシンリン酸化を直接干渉するか、またはこのリン酸化に依存する事象（
例えばホスホ−ＧＰ IIIａとアダプタータンパク質との相互作用など）を干渉す
るように設計された治療薬を生成することの有用性についての情報を提供する。
【００５２】 ＧＰ IIIａ（β3）インテグリンサブユニットの発現は、血小板に限定されな
い。内皮細胞において、このタンパク質はαvサブユニットと対になりαvβ3イ
ンテグリンを形成する。このインテグリンは、血管形成および腫瘍転移において
重要な役割を果たすと考えられる。好中球において、β3はＬＲＩ（白血球反応
性インテグリン）のサブユニットであり、炎症反応に関与すると考えられている
。変異型マウスにおいてβ3の全ては、細胞質ドメインにおけるチロシンのフェ
ニルアラニンへの変異を含むので、このマウスは、αvβ3およびＬＲＩ機能に対
するこれらの変異の影響を調べるために使用することができる。この場合も、こ
のような分析は、β3リン酸化の阻害が血管形成、腫瘍転移および／または炎症
に影響を及ぼすか否かについての情報を提供するものであり、従って、臨床的に
非常に重要である。
【００５３】 上記詳細な説明は、理解をより明瞭にするためにのみ提供されたものであって
、これにより何ら不必要、限定的な意味を成すものではなく、当業者にとっては
改変が自明である。
【００５４】 本発明は、特定の実施の形態に関して記載されたが、さらに変更を行うことが
可能であることが理解できよう。本願は、本発明が属する技術分野において公知
または一般に実施されているようなもの、これまでに記載した重要な特徴に当て
はまるようなもの、および特許請求の範囲に従っているもので本明細書の開示内
容から逸脱するものも含む、一般に本発明の原理に従った本発明のあらゆるバリ
エーション、使用法、または適用を包含するものとする。
【００５５】 II．具体的な実施の形態 β３の細胞質ドメイン内のホスホチロシン結合モチーフの存在は、このインテ
グリンテイルのチロシンリン酸化が、ホスホチロシン結合シグナルタンパク質Ｓ
ｈｃおよびＧｒｂ２の細胞膜への漸増を容易にすることを示している（Ｐｈｉｌ
ｉｐｓら（１９９６）を参照）。本発明者らは、β３インテグリンテイルのチロ
シンリン酸化および脱リン酸化が、同様に、細胞骨格へのインテグリンの会合を
調節することを発見した（例えば、１９９７年１１月２１日に出願された米国特
許出願第０８／９７５，６５３号（本明細書中に参考文献として援用される）を
参照）。図２は、様々なヒトインテグリンβサブユニットのアミノ酸配列を提供
し、チロシン残基の位置を示している。先に記載したように、他の研究により、
チロシンを含むβ１、β２およびβ３（ＧＰ IIIａ）の細胞質ドメインの配列が
、ＧＰIIｂ−IIIａおよび他のインテグリンが正常に機能するために重要である
ことが分かっている。従って、天然でリン酸化可能なチロシン残基を含むこれら
の、または他のインテグリンβサブユニットの改変された変異型細胞質ドメイン
を発現するトランスジェニック動物は、明らかに本発明の範囲内に包含される。
【００５６】 また、リン酸化可能なチロシン残基の保存的置換を含む改変、修飾または変異
されたインテグリンサブユニットも、明らかに企図される。本明細書中で使用さ
れる保存的アミノ酸置換とは、１以上の関連する細胞質チロシン残基の部位でリ
ン酸化を経ることができないこと以外は、シグナル活性に関与するインテグリン
の能力、または１以上の特定の結合相手（例えばミオシンなど）に結合するイン
テグリンの能力に悪影響を及ぼさない、そのアミノ酸配列における特定の残基（
具体的にはリン酸化可能なチロシン残基）の変更、または他のものの変更を指す
。置換、挿入または欠失は、変更した配列がペプチドのシグナル活性への関与、
またはその天然の結合相手（例えばミオシンなど）との会合を有意に阻害すると
き、対応する野生型インテグリンβサブユニットペプチドの正常な機能に悪影響
を及ぼすといわれている。例えば、βサブユニットペプチドの総電荷、構造また
は疎水性／親水性特性は、ペプチドの活性に悪影響を及ぼすことなく変更するこ
とができると考えられる。従って、βサブユニットペプチドのアミノ酸配列を変
更して、この変更によりその正常なシグナル活性に関与するもしくは例えばミオ
シンなどの正常な結合相手に会合するペプチドの能力に悪影響を及ぼさない程度
に、例えばそのペプチドをより疎水性または親水性とすることができると考えら
れる。このように、特に考えられるのは、変異型ＧＰIIIａサブユニットである
。
【００５７】 例えば、１つの用途では、リン酸化可能チロシン残基のどれか１つまたは全て
を修飾するために標準的なノックアウト手順を用いて改変βサブユニットペプチ
ドを調製することができる。これは、ターゲッティング組換え等の当分野で公知
の様々な手順を用いて達成することができる。調製したあと、遺伝子操作した動
物を用いて、以下のことができる。すなわち、１）βサブユニットペプチドによ
り媒介される生物学的および病理学的プロセスを同定すること、２）βサブユニ
ットペプチドと相互作用するタンパク質および他の遺伝子を同定すること、３）
βサブユニットペプチドのリン酸化の不在または減少を克服するために外から供
給することができる薬剤を同定すること、および４）改変βサブユニットペプチ
ドの活性を調節する（すなわち増強したり、減少させたり）薬剤を同定するのに
適したスクリーニングとして役立てることである。
【００５８】 本明細書中に記載したように、本発明は、内因性βサブユニット遺伝子の中で
リン酸化可能チロシン残基が通常存在する部位に非チロシン残基を含むトランス
ジェニック動物を提供する。非チロシン置換はこれらの残基がチロシンであると
きのようにはリン酸化されないため、および正常な血小板凝集はリン酸化の発生
に依存するため、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、正常時とは異なる血
小板凝集を示す。形質転換した動物と形質転換していない動物の生理学的および
形態学的特徴を比較することにより、当業者であれば、対応する動物に対するＧ
Ｐ IIIａ遺伝子における細胞質チロシンリン酸化の存在または不在の影響を決定
することができる。
【００５９】 さらに、本発明のトランスジェニック動物を用いて、血小板凝集を調節する（
すなわち促進かさらに阻害する）薬剤、またはインテグリンシグナル経路により
媒介される他の影響を同定することができる。このような薬剤の評価は、当業者
に公知の手法により、インビトロ、インサイチュー、またはインビボのいずれか
で行うことができる。開示されたトランスジェニック動物の細胞、血小板、組織
または全器官は、インテグリンが媒介する細胞骨格会合に関係するプロセスを減
少または促進する能力について様々な薬剤の効果を試験するのに有用である。試
験することができる薬剤には、様々な抗凝血剤、血栓溶解および抗血小板治療薬
および薬剤が含まれる。このような薬剤の例には、ヘパリン等のグリコサミオン
グリカン；ジクマロール、アニシンジオンおよびブロマドキオロン等の経口抗凝
血薬；組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ウロキナーゼ；アスピリン
、ジピリダモール；およびチクロピジンが含まれる。例えば、このような薬剤お
よびその薬理学のより完全なリストについては、Ｍａｊｅｒｕｓら、Ａｎｔｉｃ
ｏａｇｕｌａｎｔ，Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ，ａｎｄ Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌ
ｅｔ Ｄｒｕｇｓ，ｉｎ Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎ
ｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ５４（１９９６）を参照。
【００６０】 本発明のトランスジェニック動物の細胞および全ての器官は、獣医学および人
間医学におけるこれらの使用とは全く別に、動物における遺伝子の調節、発現お
よび組織化を調査するために使用することもできる。他の細胞、組織および生物
学的プロセスに対する、改変したまたは変異型インテグリンβサブユニット（例
えばＧＰ IIIａ遺伝子）の様々な影響を研究することにより、当業者は、正常な
代謝経路におけるチロシンリン酸化の役割をつきとめることができる。
【００６１】 トランスジェニック哺乳動物（特にトランスジェニックマウス）の診断用途、
および研究用途の他の例については、例えば米国特許第５，５６９，８２４号を
参照されたい。
【００６２】 さらなる記載を要するまでもなく、当業者であれば、これまでの説明および以
下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製および使用し、特許請求の
範囲に記載された方法を行うことができるものと信じる。従って、以下の実施例
は、本発明の好適な実施の形態について特に指摘しており、本願の開示の他の部
分をいかようにも限定するものと解釈されるべきではない。
【００６３】 他の一般的な構成は、当業者には自明であろう。
【００６４】 （実施例１） マウスゲノムＧＰ IIIａ ＤＮＡの取得 マウスゲノムＤＮＡの配列は公知ではなく、また公表されていないが、マウス
ＧＰ IIIａのアミノ酸配列の一部は入手可能であり（Ｃｉｅｔａｔら（１９９３
），Ｂｉｏｃｈｅｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．１９３：７７
１−７７８、およびＤｒ Ｊｅａｎ−Ｐｈｉｌｌｉｐｅ Ｒｏｓａ，Ｕｎｉｔｅ
ＩＮＳＥＲＭ３４８，Ｐａｒｉｓ）、ヒトＧＰ IIIａ配列に似ていることから
、ヒトおよびマウスから得たＧＰ IIIａはかなり類似しているものと思われる。
従って、マウスＧＰ IIIａ配列の、ヒトＧＰ IIIａの場合ではＧＰ IIIａの細胞
質ドメインをコードすることが知られている２つのエクソン（すなわちエクソン
ＭおよびＮ）にまたがる領域に対して幾つかのＰＣＲプライマーを作製した（Ｌ
ａｎｚａ，Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８０９８−
１８１０３）。次に、全マウスゲノムＤＮＡを用いてこれらのプライマーを試験
したところ、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）において１セットが約１．５ｋＢ
の特定のバンドを生成した。このバンドは、エクソンＭの３'側部分、エクソン
Ｎの５'側部分、およびこれら２つのエクソンの間のイントロンにまたがる推定
ヒト断片（約１．２ｋＢ）とサイズが似ていた。これらのプライマーは、１）５
'側プライマー（マウスＧＰ IIIａの１８３４〜１８５０番残基）および２）３'
側プライマー（マウスＧＰ IIIａの２０２６〜２０３９番残基）をコードするも
のであった。次にこれらの特異的プライマーを用いて、マウスゲノムＤＮＡの大
きな断片を含むＰ１クローンを得た。このクローンは、ＰＣＲにおいて鋳型とし
て使用したときに同じバンドを生じた。このように本発明者らは、マウスゲノム
ＧＰ IIIａを含み、ＧＰ IIIａの細胞質ドメインをコードする領域を特に含むＰ
１クローンを得た。次に、このＰ１クローンの約１０ｋＢを、制限酵素消化物の
混合物、サザンブロットおよびアミノ酸配列決定によりマッピングした。これは
マウスＧＰ IIIａであること、および、ヒトＧＰ IIIａと同様に、２つのエクソ
ン（ヒト命名法にちなんでＭおよびＮと呼ばれる）はマウスＧＰ IIIａ細胞質領
域をコードしていることが確認された。実際に、この細胞質ドメインのアミノ酸
残基は、ヒトおよびマウスの間では同一であると判明した。
【００６５】 （実施例２） ７４７位および７５９位のチロシン残基のフェニルアラニンへ の変異 エクソンＮを含む０．３ｋＢ ＰｓｔＩ／ＳａｃＩ断片（上記２つのチロシン
残基をコードする）をｐＢＳＫＳ II中にサブクローニングし、標準的な部位部
位特異的変異誘発手法を用いて２つのチロシン残基をフェニルアラニンに変異さ
せた。変異は配列決定により確認し、また、変異型ＤＮＡを後に同定するために
使用することができる２つの新しい酵素部位、すなわちＤｒａＩ部位（Ｙ７４７
Ｆ位）およびＴａｑＩ部位（Ｙ７５９Ｆ）を導入するように設計した。この変異
型断片を使用して、マウスゲノムＧＰ IIIａクローンにおける野生型ＰｓｔＩ／
ＳａｃＩ断片を置換した。
【００６６】 （実施例３） ターゲッティングベクターの構築 ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩアダプターを用いて、エクソンＭおよびゲノムのイ
ントロンＤＮＡを含む、マウスＧＰ IIIａの約２．５ｋＢ ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎ
ｄIII断片を、ネオマイシン耐性カセットを含むｐＢＳベクターのＥｃｏＲＩ部
位の中へサブクローニングした。ｎｅｏrＤＮＡは、ｎｅｏrＤＮＡを後の段階
で切り出すのに使用することができる、Ｆｌｐ組換え酵素により認識される部位
であるＦＲＴ認識配列によりフランキングされていた（Ｄｙｍｅｃｋｉ Ｓ．Ｍ
．（１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：６１９１−６１９６）。チロシンがフェ
ニルアラニンに変異したエクソンＮを含むＧＰ IIIａの約４ｋＢ ＨｉｎｄIII
断片を、このベクターのＨｉｎｄIII部位中にサブクローニングし、エクソンＭ
とＮとの間のイントロンの中にｎｅｏrカセットを有する変異されたＧＰ IIIａ
から基本的に構成される構築物を得た。
【００６７】 （実施例４） ターゲッティングされた胚幹（ＥＳ）細胞の作製 上記ターゲッティング構築物をＥＳ細胞中にトランスフェクトし、次にＪｏｈ
ｎｓｏｎ，ＲおよびＫｉｌｌｅｎ，Ｎ．Ｐ（Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２
：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄｓ．Ｂ．Ｄ．Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ
ｅｓｓ ｐ．３１３−３２７（１９９５））に記載されたように、薬剤Ｇ４１８
を用いて、このＥＳ細胞をｎｅｏrについて選択した。首尾良く相同性組換えさ
れたＥＳ細胞をサザンブロットおよびＰＣＲ手法により同定した。現在、これら
の細胞は１つの野生型ＧＰ IIIａ対立遺伝子、およびｎｅｏrカセットとチロシ
ンのフェニルアラニンへの変異を含む１つの対立遺伝子を持っていた。該薬剤カ
セットのサイズは１．９ｋＢであり、イントロンの中に存在していたが、本発明
者らは、その存在が彼らの実験に悪影響を及ぼさないようにするために、これを
除去しようとした。このため、ＦＲＴ部位を認識して該薬剤耐性をコードするＤ
ＮＡの切出しをもたらすＦｌｐ組換え酵素で、選択されたＥＳ細胞を一過性トラ
ンスフェクションにかけた。このように、イントロン中に存在する外来性ＤＮＡ
の１．９ｋＢ片の代わりに、３４ｂｐＦＲＴ認識部位（および新しいＸｂａＩ部
位）をコードする小さな片のみが残る（Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．Ｍ．，ＰＮＡＳ ９３：６１９１−６１９６（１９９６））。再び、サザンブロットおよびＰＣＲ
手法を用いて、首尾良く事を経たＥＳ細胞を選択した。
【００６８】 （実施例５） 変異型マウスの作製 変異型マウスを作製するために、変異型ＥＳ細胞クローン（１２９株マウスに
由来する）をＣ５７Ｂ１６マウスから得た胚盤胞中に注入し、これらの胚盤胞を
擬似妊娠代理母に移植した（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，Ｒ，Ｄａｖｉｓ，Ａ
．Ｃ．，およびＢｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ２２５ Ｅｄｓ．Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．Ｄｅ
Ｐａｎｐｈｉｌｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）の特にｐ８５
５−８７８に記載）。次に混合外皮カラー（Ｃ５７Ｂ１６胚盤胞からのものは黒
および１２９ＥＳ細胞からのものは野ねずみ色（ａｇｏｕｔｉ色））により識別
した雄のキメラ動物を、Ｃ５７Ｂ１６野生型雌と交尾させた。その子孫を、サザ
ンブロットにより野生型および変異型ＧＰ IIIａ対立遺伝子の存在について遺伝
子型に分けた（変異型ＧＰ IIIａＤＮＡのみに存在する新しいＸｂａＩ部位を利
用した）。これらの子孫には、野生型およびヘテロ接合性動物が混じっており、
ヘテロ接合性動物をさらに交配させて、野生型動物、ヘテロ接合性動物（すなわ
ち一方が野生型で他方が変異型ＧＰ IIIａ対立遺伝子）およびホモ接合性動物（
すなわち両方とも、チロシンのフェニルアラニンへの変異を含むＧＰ IIIａ対立
遺伝子）を含む同腹子を生ませた。
【００６９】 今までのところ、このような交配から得た子孫の遺伝子型は、（基本的なメン
デルの遺伝法則に従って）予測した比率で生じた。さらに、変異型動物は生存可
能であり、抗ＧＰ IIｂ−IIIａ抗体で血小板を染色してＦＡＣＳ（蛍光活性化細
胞選別）で調べたときに、非変異型ＧＰ IIIａを発現する正常な動物に見られる
のと同様のレベルでその血小板上にＧＰ IIｂ−IIIａを発現する。
【００７０】 上記実施例にそって本発明を詳細に記載してきたが、本発明の精神から逸脱す
ることなく様々な修正を行うことができることが理解できよう。従って、本発明
は、特許請求の範囲によってのみ限定される。本願中に引用された全ての特許、
特許出願および刊行物は、その全体が本明細書中に参考文献として援用される。
【００７１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> COR Therapeutics, Inc. <120> Transgenic Mammals Expressing Mutant GPIIIa <130> JP00-5552-XY <140> PCT/US99/08285 <141> 1999-04-15 <150> US 60/115,516 <151> 1998-04-15 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 66 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Segment of GP IIIa beta-3 subunit <220> <223> Xaa at positions 41-48 and 56-66 may be present or missing and may be any variable. <400> 1 Lys Leu Leu Leu Thr Thr His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu 1 5 10 15 Glu Glu Arg Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr 20 25 30 Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa 65 <210> 2 <211> 66 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Segment of GP IIIa beta-6 subunit <220> <223> Xaa at positions 41-48 may be present or missing and may be any variable. <400> 2 Lys Leu Leu Val Ser Phe His Asp Arg Lys Glu Val Ala Lys Phe Glu 1 5 10 15 Ala Glu Arg Ser Lys Ala Lys Trp Gln Thr Gly Thr Asn Pro Leu Tyr 20 25 30 Arg Gly Ser Thr Ser Thr Phe Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asn Val Thr Tyr Lys His Arg Glu Lys Gln Lys Val Asp Leu Ser Thr 50 55 60 Asp Cys 65 <210> 3 <211> 66 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Segment of GP llla beta-1 subunit <220> <223> Xaa at positions 41-48 and 56-66 may be present or missing and may be any variable. <400> 3 Lys Leu Leu Met Leu Ile His Asp Arg Arg Glu Glu Ala Lys Glu Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Met Asn Ala Lys Trp Asp Thr Gly Glu Asn Pro Ile Tyr 20 25 30 Lys Ser Ala Val Thr Thr Val Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asn Pro Lys Tyr Glu Gly Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa 65 <210> 4 <211> 66 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Segment of GP IIIa beta-5 subunit <220> <223> Xaa at positions 58-66 may be present or missing and may be any variable. <400> 4 Lys Leu Leu Val Thr Ile His Asp Arg Arg Glu Phe Ala Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ser Glu Arg Ser Arg Ala Arg Tyr Glu Met Ala Ser Asn Pro Leu Tyr 20 25 30 Arg Lys Pro Ile Ser Thr His Thr Val Asp Phe Thr Phe Asn Lys Phe 35 40 45 Asn Lys Ser Tyr Asn Gly Thr Val Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa 65 <210> 5 <211> 66 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Segment of GP IIIa beta-2 subunit <220> <223> Xaa at positions 28, 41-48 and 56-66 may be present or missing and may be any variable. <400> 5 Lys Ala Leu Thr His Leu Ser Asp Leu Arg Glu Tyr Arg Arg Phe Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Leu Lys Ser Gln Trp Asn Asn Asp Xaa Asn Pro Leu Phe 20 25 30 Lys Ser Ala Thr Thr Thr Val Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asn Pro Lys Phe Ala Glu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa 65 <210> 6 <211> 66 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Segment of GP IIIa beta-7 subunit <220> <223> Xaa at positions 41-48 and 61-66 may be present or missing and may be any variable. <400> 6 Arg Leu Ser Val Glu Ile Tyr Asp Arg Arg Glu Tyr Ser Arg Phe Glu 1 5 10 15 Lys Glu Gln Gln Gln Leu Asn Trp Lys Gln Asp Ser Asn Pro Leu Tyr 20 25 30 Lys Ser Ala Ile Thr Thr Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asn Pro Arg Phe Gln Glu Ala Asp Ser Pro Thr Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa 65 <210> 7 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence for GP IIIa beta subunits <220> <221> VARIANT <222> (5)..(51) <223> Xaa at positions 5, 17, 19-21, 23, 25-28, 34, 36, 37, 39-48, 50, 51, 53-65 may be present or missing and may be any variable. <400> 7 Lys Leu Leu Val Xaa Ile His Asp Arg Arg Glu Phe Ala Lys Phe Glu 1 5 10 15 Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Pro Leu Tyr 20 25 30 Lys Xaa Ala Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asn Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa 65
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 フィリップス， デイヴィッド， アー ル． アメリカ合衆国， カリフォルニア州， サン マテオ， パロット ドライヴ 245 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA03 DA02 EA04 GA11 HA12 4C084 AA17 ZA362 ZA442 ZA532 ZB112 ZB262 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA50 FA74

Claims (68)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＧＰ IIIａ遺伝子の２つの細胞質チロシン残基のうち少なく
    とも１つが非チロシン残基で置換された変異型ＧＰ IIIａ遺伝子を含むヒト以外
    の哺乳動物。
  2. 【請求項２】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴と
    する、請求項１に記載のヒト以外の哺乳動物。
  3. 【請求項３】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロシ
    ン残基であることを特徴とする、請求項１に記載のヒト以外の哺乳動物。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のヒト以外の哺乳動物の血漿から単離した血
    小板。
  5. 【請求項５】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ、
    イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよびモ
    ルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のヒト以
    外の哺乳動物。
  6. 【請求項６】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする、
    請求項５に記載のヒト以外の哺乳動物。
  7. 【請求項７】 前記細胞質チロシン残基の両方が非チロシン残基で置換され
    ていることを特徴とする、請求項１に記載のヒト以外の哺乳動物。
  8. 【請求項８】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴と
    する、請求項７に記載のヒト以外の哺乳動物。
  9. 【請求項９】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロシ
    ン残基であることを特徴とする、請求項７に記載のヒト以外の哺乳動物。
  10. 【請求項１０】 請求項７に記載のヒト以外の哺乳動物の血漿から単離した
    血小板。
  11. 【請求項１１】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載のヒト
    以外の哺乳動物。
  12. 【請求項１２】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項１１に記載のヒト以外の哺乳動物。
  13. 【請求項１３】 そのＤＮＡの中に安定に導入された導入遺伝子を発現する
    ヒト以外の哺乳動物であって、該導入遺伝子が、２つの細胞質チロシン残基のう
    ち少なくとも１つが非チロシン残基で置換された変異型ＧＰ IIIａをコードする
    ＤＮＡを含むことを特徴とする、前記ヒト以外の哺乳動物。
  14. 【請求項１４】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴
    とする、請求項１３に記載のヒト以外の哺乳動物。
  15. 【請求項１５】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項１３に記載のヒト以外の哺乳動物。
  16. 【請求項１６】 請求項１３に記載のヒト以外の哺乳動物の血漿から単離し
    た血漿板。
  17. 【請求項１７】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３に記載のヒ
    ト以外の哺乳動物。
  18. 【請求項１８】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項１７に記載のヒト以外の哺乳動物。
  19. 【請求項１９】 前記細胞質チロシン残基の両方が非チロシン残基で置換さ
    れていることを特徴とする、請求項１３に記載のヒト以外の哺乳動物。
  20. 【請求項２０】 非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴とす
    る、請求項１９に記載のヒト以外の哺乳動物。
  21. 【請求項２１】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項１９に記載のヒト以外の哺乳動物。
  22. 【請求項２２】 請求項１９に記載のヒト以外の哺乳動物の血漿から単離し
    た血漿板。
  23. 【請求項２３】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１９に記載のヒ
    ト以外の哺乳動物。
  24. 【請求項２４】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項２３に記載のヒト以外の哺乳動物。
  25. 【請求項２５】 以下のステップを含み、内因性ＧＰ IIIａ遺伝子の２つの
    チロシン残基のうち少なくとも一方を非チロシン残基で置換して、変異型ＧＰ I
    IIａ遺伝子を調製することを特徴とする、変異型ＧＰ IIIａ遺伝子で形質転換し
    たヒト以外の哺乳動物の作製方法。 ａ）胚幹細胞中に前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子をコードする核酸分子を導入する
    ステップと； ｂ）ステップａ）で得られた細胞から形質転換されたヒト以外の哺乳動物を再生
    するステップ。
  26. 【請求項２６】 非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴とす
    る、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の方
    法。
  29. 【請求項２９】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 細胞質チロシン残基の両方が非チロシン残基で置換されて
    いることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴
    とする、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の方
    法。
  34. 【請求項３４】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記形質転換したヒト以外の哺乳動物を育種して、前記変
    異型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してホモ接合性であるヒト以外の哺乳動物を作製する
    ステップをさらに含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 以下のステップを含み、内因性ＧＰ IIIａ遺伝子の２つの
    チロシン残基のうち少なくとも一方を非チロシン残基で置換して、変異型ＧＰ I
    IIａ遺伝子を調製することを特徴とする、変異型ＧＰ IIIａ遺伝子で形質転換し
    たヒト以外の哺乳動物を作製する方法。 ａ）胚幹細胞中に、前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子をコードする核酸分子およびＦ
    ＲＴ部位によりフランキングされた選択マーカーを導入するステップ； ｂ）形質転換細胞を同定および選択するステップ； ｃ）ＦＬＰ組換え酵素を用いた一過性形質転換により、ステップｂ）で選択され
    た形質転換細胞から選択マーカーを除去するステップ； ｄ）ステップｃ）で得た形質転換細胞を胚盤胞中に注入するステップ；そして、
    ｅ）ステップｄ）の胚盤胞から形質転換されたヒト以外の哺乳動物を再生するス
    テップ、ここで該再生された形質転換ヒト以外の哺乳動物が変異型ＧＰ IIIａ遺
    伝子に対してキメラである。
  38. 【請求項３８】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴
    とする、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３７に記載の方
    法。
  41. 【請求項４１】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項３７に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 細胞質チロシン残基の両方が非チロシン残基で置換されて
    いることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴
    とする、請求項３７に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項４３に記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記形質転換したヒト以外の哺乳動物を育種して、前記変
    異型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してホモ接合性であるヒト以外の哺乳動物を作製する
    ステップをさらに含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    請求項４７に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 以下のステップをさらに含むことを特徴とする、請求項３
    ７に記載の方法。 ｆ）野生型ヒト以外の哺乳動物と前記キメラヒト以外の哺乳動物とを育種して、
    前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してヘテロ接合性であるヒト以外の哺乳動物を
    作製するステップ； ｇ）ステップｆ）で作製したヘテロ接合性ヒト以外の哺乳動物をステップｆ）で
    作製した第２のヘテロ接合性ヒト以外の哺乳動物と交配させるステップ；そして
    、 ｈ）得られた子孫から前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子に対してホモ接合性であるヒ
    ト以外の哺乳動物を選択するステップ。
  50. 【請求項５０】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 同じ種の２匹の哺乳動物の特徴を比較することからなる方
    法であって、一方の哺乳動物は野生型ＧＰ IIIａ遺伝子を有し、他方の哺乳動物
    は変異型ＧＰ IIIａ遺伝子を有し、該野生型ＧＰ IIIａ遺伝子の２つのチロシン
    残基の少なくとも一方が前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子の中では非チロシン残基で
    置換されていることを特徴とする、前記比較方法。
  52. 【請求項５２】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴
    とする、請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項５１に記載の方
    法。
  55. 【請求項５５】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 細胞質チロシン残基の両方が非チロシン残基で置換されて
    いることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記非チロシン残基がフェニルアラニンであることを特徴
    とする、請求項５６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記細胞質チロシン残基が７４７位および７５９位のチロ
    シン残基であることを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記ヒト以外の哺乳動物が、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタ
    、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、ウサギ、ウシおよび
    モルモットからなる群より選択されることを特徴とする、請求項５６に記載の方
    法。
  60. 【請求項６０】 前記ヒト以外の哺乳動物がマウスであることを特徴とする
    、請求項５９に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記２種類の哺乳動物間の出血時間を比較するステップを
    さらに含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記２種類の哺乳動物間の血栓反応を比較するステップを
    さらに含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記２種類の哺乳動物間の血管形成を比較するステップを
    さらに含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記２種類の哺乳動物間の腫瘍転移を比較するステップを
    さらに含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記２種類の哺乳動物間の炎症を比較するステップをさら
    に含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記哺乳動物がマウスであることを特徴とする、請求項５
    １に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 以下のステップを含むことを特徴とする、ＧＰ IIIａ遺伝
    子の発現に起因する哺乳動物の特徴に及ぼす薬剤の影響を決定する方法。 ａ）前記薬剤を請求項１に記載の哺乳動物に投与するステップ； ｂ）前記投与の後、所望の時間のあいだ前記哺乳動物を維持するステップ；そし
    て、 ｃ）前記変異型ＧＰ IIIａ遺伝子の発現に起因する前記哺乳動物の特徴が、前記
    薬剤の投与により影響されたかどうかを決定するステップ。
  68. 【請求項６８】 前記哺乳動物がマウスであることを特徴とする、請求項６
    ７に記載の方法。
JP2000543580A 1998-04-15 1999-04-15 変異型ＧＰＩＩＩａを発現するトランスジェニック哺乳動物 Pending JP2002511249A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11551698P 1998-04-15 1998-04-15
US60/115,516 1998-04-15
PCT/US1999/008285 WO1999053032A1 (en) 1998-04-15 1999-04-15 TRANSGENIC MAMMALS EXPRESSING MUTANT GP IIIa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002511249A true JP2002511249A (ja) 2002-04-16

Family

ID=22361909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000543580A Pending JP2002511249A (ja) 1998-04-15 1999-04-15 変異型ＧＰＩＩＩａを発現するトランスジェニック哺乳動物

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1071751A1 (ja)
JP (1) JP2002511249A (ja)
AU (1) AU3646299A (ja)
CA (1) CA2325817A1 (ja)
IL (1) IL138873A0 (ja)
WO (1) WO1999053032A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000008137A2 (en) * 1998-08-04 2000-02-17 Cor Therapeutics, Inc. Transgenic animals having a modified glycoprotein v gene
DE60037970T2 (de) * 1999-06-28 2008-08-21 Inter-K Pty. Ltd., Newcastle Verfahren zur modulierung von integrin-vermittelter zellaktivitaet und hierfuer geeignete reagenzien

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523209A (en) * 1994-03-14 1996-06-04 The Scripps Research Institute Methods for identifying inhibitors of integrin activation
CA2229622A1 (en) * 1995-08-31 1997-03-06 Le T. Duong Mouse integrin subunits

Also Published As

Publication number Publication date
EP1071751A1 (en) 2001-01-31
WO1999053032A1 (en) 1999-10-21
CA2325817A1 (en) 1999-10-21
AU3646299A (en) 1999-11-01
IL138873A0 (en) 2001-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200359610A1 (en) Humanized transgenic animal
Franz et al. Transgenic animal models: new avenues in cardiovascular physiology
Kapur et al. The presence of novel amino acids in the cytoplasmic domain of stem cell factor results in hematopoietic defects in Steel17H mice
US5750826A (en) Bradykinin B2 receptor modified transgenic non-human animals
US6639123B1 (en) Melanocortin-3 receptor deficient cells, non-human trangenic animals and methods of selecting compounds which regulate body weight
Hynes et al. Toward a genetic analysis of cell-matrix adhesion
JP2002511249A (ja) 変異型ＧＰＩＩＩａを発現するトランスジェニック哺乳動物
AU712016B2 (en) Ikaros transgenic cells and animals
US20230172170A1 (en) Non-human animals having a humanized cxcl13 gene
US6077990A (en) PAR2 modified transgenic mice
WO1999002724A2 (en) Methods for identifying genes expressed in selected lineages, and a novel genes identified using the methods
US7196170B2 (en) Aiolos, Helios, Daedalos and Ikaros: genes, polypeptides, regulatory elements and uses thereof
US6995298B1 (en) Transgenic mammals expressing mutant GP IIIa
US20030167487A1 (en) Transgenic animals having a modified glycoprotein V gene
AU732028B2 (en) Thrombin receptor modified transgenic animals
JP2003525596A (ja) メラノコルチン−４受容体欠損細胞、非ヒトトランスジェニック動物および体重調節化合物の選択方法
Bahou et al. Molecular characterization of proteolytically activated receptors: insights from the thrombin receptor and proteinase activated receptor-2 (PAR-2) genes
US20020104112A1 (en) Ikaros regulatory elements and uses thereof
WO1997040138A9 (en) Thrombin receptor modified transgenic animals
JPH1179A (ja) Ｇａｓ６遺伝子改変マウス
JPH08322426A (ja) アンギオテンシンｉｉ受容体タイプ１遺伝子欠損動物
JP2003116407A (ja) ラディキシンノックアウト動物