JP2002508972A

JP2002508972A - テトラサイクリン−制御可能なエレメントを用いる可能な抗微生物標的としての微生物遺伝子を確認するための自律制御系

Info

Publication number: JP2002508972A
Application number: JP2000540255A
Authority: JP
Inventors: シェリル・エル・クウィン; チャールズ・ダブリュー・フォード
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1998-01-16
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2002-03-26
Also published as: AU2312699A; WO1999036554A1; EP1049789A1

Abstract

(57)【要約】特異的な遺伝子の発現をイン・ビトロ（in vitro)でかつ宿主感染の間に調節して、感染を維持するために必須である細菌遺伝子の同定が促進できるように、遺伝子的に設計した微生物病原体にスクリーニングを設計した。詳細には、テトラサイクリンの存在または不存在に応答する遺伝子調節エレメントを用いて、内因性細菌遺伝子の発現を調節する。通常、テトラサイクリンは動物中に存在しないため、感染動物の食餌にテトラサイクリンを添加するかまたはそこから取り除くことによって、テトラサイクリン−調節微生物遺伝子をイン・ビボ（in vivo)で制御することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野いずれの微生物遺伝子が抗生物質による阻害につき標的であるかを同定するた
めの方法である。詳細には、細菌のごとき組換え微生物、および細菌のごとき微
生物に感染した動物における自律調節性で、誘導可能な遺伝子発現を供するテト
ラサイクリン−調節系を記載する。

【０００２】発明の背景微生物病原体における広まった抗生物質耐性の発達は、新たな抗微生物剤に対
する緊急の医学的要望を創出している。存在する抗微生物剤の誘導体に依存する
代わりに、医薬産業は、新たなクラスの化合物を創薬する試行において標的化す
る新規な微生物プロセスを探索している（Knowles，D. J. C.，Trends in Micro
biol.，1997，5：379−383）。

【０００３】動物において感染を維持するために必須の遺伝子、またはイン・ビトロ（in v
itro)での病原体の増殖に必須の遺伝子は、抗生物質開発につき良好な標的である。典型的に、“必須の遺伝子”が、良好な抗微生物標的として優先されている
。必須の遺伝子とは、イン・ビトロ（in vitro）で微生物細胞の増殖に必要なも
のであり、ＤＮＡジャイレース、リボソーム・サブユニットおよび細胞壁生合成
酵素をコードするもののごとき遺伝子が含まれる。多種のこれらのタンパク質お
よび細胞コンポーネントが必須の遺伝子によってコードされているものとして同
定されている。なぜならば、これらの遺伝子の産物を阻害することを示す古典的
な抗微生物剤が存在するためである（各々、キノロン、テトラサイクリン、およ
び“ベータ”−ラクタム）。条件致死突然変異体の特徴付けから同定された必須
の遺伝子もある。

【０００４】全体の微生物ゲノム配列の入手可能に伴い、現在、必須であると判明し得る、
以前は知られておらず、特徴付けされていなかった多くの遺伝子が存在する。遺
伝子が必須であるかを試験する慣用的なアプローチは、試験遺伝子が欠失してい
るか、または不活性化されている生物の構築を試みることである。欠失または不
活性化した遺伝子を有して生物が生存できる場合には、該遺伝子は必須であると
考えられない（例えば、Stranden，A. M.，Ehlert，K.，Labischinski，H.およびBerger−Bachi，B.，1997，J. Bacteriol. 179：9−16を参照されたし）。しかしながら、不活性化または欠失した遺伝子を有する突然変異生物を創製できな
いことが、該遺伝子が必須であることを常に意味するとは限らない（例えば、Ok
ada，K.，Minehira，M., Zhu，X.， Suzaki， K., Nakagawa，T., Matsuda，H. およびKawamukai，M.による1997，J. Bacteriol. 179：3058−3060）。この結論
の消極的な証拠は、常に確かなものとは限らない。遺伝子欠失または遺伝子不活
性化をなぜ作製することができないかには他の理由が存在し得る。

【０００５】最近、病原性に必要な病原性因子および遺伝子が、抗微生物剤の新規な標的と
して示唆されている。２の広範に読まれ、参照されている技術、シグナチュア・
タグド・ミュータジェネシス（signature tagged mutagenesis）(STM; Hensel,
M.， Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M.D., Dalton, E.およびHolden, D.,
1995, Science 269:400-403)およびイン・ビボ（in vivo）発現技術（in vivo e
xpression technology）（IVET; Mahan, M. J., Tobias, J. W., Slauch, J. M.
, Hanna, P. C., Collier, R. J.およびMekalanos, J. J., 1995, PNAS 92:669-
673）により、病原性に必要であるかまたは宿主感染の間に誘導される膨大な数の細菌遺伝子を科学者が迅速に同定することができる。これらの遺伝子はワクチ
ン用の弱毒株を開発するための良好な標的を示すが、それが抗微生物剤による阻
害に有効な標的を示すか否かは明らかでない。潜在的な遺伝子標的のこの評価に
おける重要な差異は、抗微生物剤を用いて、感染が確立した後に、微生物病原体
を阻害することである。病原因子または病原性因子が感染を成立するためのみに
必要であれば、成立した感染症におけるこれらの阻害は感染症を解消しないであ
ろう。特異的な遺伝子の合成を停止させた後に成立した感染が解消される場合は
、この特異的な遺伝子は感染を維持するために必須である。したがって、それが
増殖に必須であるかを試験する、内因性遺伝子を停止させる方法を開発すること
が有利であろう。かかる方法は、新たなクラスの抗微生物化合物の開発の速度を
速める抗微生物標的の同定を促進するであろう。

【０００６】かかる系に関する多くのアイデアが開示されている（ＰＣＴ出願PCT／US96／0
7937号、1996年12月19日（19.12.96）に公開された国際公開番号WO 96／40979号
の定義、理論および説明を参照されたし。PCT／US96／07937号は出典明示して本
明細書の一部とみなすが；PCT／US96／07937号に開示されている組換え配列およ
び例は本明細書に取り込まれない）。

【０００７】また、米国特許第5,464,758号はテトラサイクリン−応答性プロモーターの多くの機構を開示している（1995年11月7日に公開された米国特許第5,464,758号は
一部出典明示して本明細書の一部とみなされ、一般的定義、理論、原理、概念、
テトラサイクリン・オペレーター（tetＯ）配列に関する一般情報は出典明示して本明細書の一部とみなすが、米国特許第5,464,758号に開示されている配列は出典明示して本明細書の一部とみなさない）。ここに、出願人は作動する系を説
明する。

【０００８】発明の概要本発明は、微生物遺伝子または遺伝子群の特徴付けを許容するプロセスを提供
し、ここに該遺伝子は遺伝子産物をコードし；該遺伝子産物は遺伝子標的であり
；該遺伝子標的は哺乳動物に感染するかまたは哺乳動物において感染を持続する
微生物の能力に重要であり、ここに微生物は：当該遺伝子的に改変された微生物
によって産生される遺伝子産物の量がテトラサイクリン−制御可能なエレメント
（Tetracycline−Controllable Element）またはＴＣＥによって調節または制御
されるように、遺伝子的に改変されて遺伝子改変微生物となり；ＴＣＥはテトラ
サイクリンに対する微生物の暴露に応答して遺伝子の機能をモデュレート（modu
late）するその能力を介して、標的遺伝子または遺伝子産物の発現を制御する遺
伝子調節系であって；ＴＣＥはテトラサイクリン−制御可能な転写プロモーター
・ポリヌクレオチド配列からなり；ここに、微生物タンパク質またはより一般的
には微生物遺伝子産物をコードするいずれの遺伝子ともし得る該遺伝子は、遺伝
子的に改変した微生物がテトラサイクリンに暴露されるか否かに依存して、より
多いかまたはより少ない量の遺伝子産物を当該遺伝子が産生するようにＴＣＥに
よって調節され；該哺乳動物は少なくとも２またはそれを超える複数の哺乳動物
であり、ここに該哺乳動物を最初にテトラサイクリンに暴露し、ついで遺伝子的
に改変した微生物に感染させ；つづいて：１の群の哺乳動物のうちの少なくとも
１匹または数匹の哺乳動物をテトラサイクリンに暴露し、他の１または群の哺乳
動物をテトラサイクリンに暴露せず；つづいて：テトラサイクリンに暴露した哺
乳動物の感染、微生物レベル、または生理学的症状の程度を、テトラサイクリン
に暴露しなかった哺乳動物の感染、微生物レベル、または生理学的症状のレベル
と比較し；つづいて：哺乳動物に感染するかまたは哺乳動物において感染を持続
する微生物の能力に重要な遺伝子を同定し、ここに、テトラサイクリンに暴露し
なかった哺乳動物と比較してテトラサイクリンに暴露した哺乳動物の比較が２群
の動物の間で、またはこれらの動物の感染レベルの間で意味のある差を示すこと
を特徴とする方法を提供する。

【０００９】本発明の関連する態様において、ＴＣＥはテトラサイクリンに対する微生物の
暴露に応答して遺伝子の機能をモデュレートするその能力を介して、標的遺伝子
または遺伝子産物の発現を制御する遺伝子調節系であり、ここにＴＣＥは、レポ
ーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したテトラサ
イクリン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列からなり、該テ
トラサイクリン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列はレポー
ター遺伝子（ＲＧ）および標的遺伝子（ＴＧ）をコードするポリヌクレオチド配
列に作動可能に結合し得る原核生物転写プロモーターである。該レポーター遺伝
子はβ−ラクタマーゼとすることができる。微生物は、テトラサイクリン耐性（
または保護）およびリプレッサーＤＮＡカセット（ＴＲＲＤＣ）を含むさらなる
遺伝子改変を有することができる。ＴＣＥ、ＴＲＲＤＣ、ＲＧおよびＴＧはすべ
て同一のＤＮＡカセット上に存在させることができ、これは調節ＤＮＡカセット
またはＲＤＣということができるが、ＴＣＥを超える他のコンポーネントはＲＤ
Ｃ上に存在する必要はない。ＴＲＲＤＣは構造遺伝子ｔｅｔＭ、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子、構造遺伝子ｔｅｔＲ、テトラサイクリン・リプレッサー遺伝子を
含むことができ、それはＴＣＥに作動可能に結合したプロモーターを有すること
ができる。

【００１０】試験する２群の動物間の意味のある差異とは、生存率または微生物のレベル、
または哺乳動物に存在する感染のレベルにおける数学的有意差である。２群の動
物間の意味のある差異は、群の動物の生存率にける数学的有意差である。群の動
物の生存率における有意差は、テトラサイクリンに暴露した動物がテトラサイク
リンに暴露しなかった動物よりも、より低い健康状態、より高い感染率、より低
い生存またはより高いレベルの微生物を有することを示す。該動物は、哺乳動物
とすることができ、好ましくはマウスまたは他のげっ歯類とすることができる。

【００１１】ＴＲＲＤＣのテトラサイクリン耐性遺伝子は、スタフィロコッカス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子からの配列からなるとすることができる。ＴＲＲＤＣのテトラサイクリン・リプレッサー遺伝子はＴｎ１０トラ
ンスポゾン由来のものとすることができる。微生物は組換え細菌とすることができる。それは、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）のごときスタフィロコッカス種、あるいはウイルス、下等真核生物、または酵母さえとすることができる。

【００１２】本発明は、さらに、原核生物染色体中の所定の位置に外因性ポリヌクレオチド
配列を組み込んで、内因性原核生物遺伝子を作動可能に制御するための単離ＤＮ
Ａ分子を含み、該ＤＮＡ分子は組換えエレメント（ＲＥ）およびテトラサイクリ
ン−制御可能なエレメント（ＴＣＥ）を含み、ここに該ＴＣＥはＲＥによってそ
の５'末端で挟まれたテトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列を含み、該ＲＥは単離ＤＮＡ分子と原核生物染色体との
間の相同性組換えに十分な長さのさらなるポリヌクレオチド配列を含む。

【００１３】この単離ＤＮＡ分子は、ＴＣＥに作動可能に結合されたレポーター遺伝子をコ
ードするポリヌクレオチド配列を有することができる。該レポーター遺伝子はベ
ータ−ラクタマーゼとすることができる。ある種の場合においては、少なくとも
１つの原核生物転写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列を、ＲＥとＴＣＥと
の間に位置させる。該ＤＮＡは、ＲＥとＴＣＥとの間に位置する原核生物転写プ
ロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合された原核生物テトラサイ
クリン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有することもできる
。該テトラサイクリン耐性タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（St
aphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものとすることができる。該ＤＮＡは、ＲＥとＴＣＥとの間に位置するテトラサイクリン−制御可能な原核生物
転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合した原核生物テトラ
サイクリン・リプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有す
ることができる。該テトラサイクリン・リプレッサーはＴｎ１０トランスポゾン
とすることができ、Ｔｅｔリプレッサー由来のものとすることができる。Ｔｎ１
０トランスポゾンの配列を本明細書中に開示する。関連するベクターおよび細胞
、特に原核生物宿主細胞を記載する。該ＤＮＡは、種々の組換えエレメントおよ
びテトラサイクリン−制御可能なエレメント、ベータ−ラクタマーゼのようなレ
ポーター遺伝子を有し、それらの配列は配列表から選択することができる。

【００１４】本明細書におけるＤＮＡ分子は、ベータ−ラクタマーゼ（β−ラクタマーゼ）
、特に含まれる配列表からのベータ−ラクタマーゼのごときレポーター遺伝子に
作動可能に結合することができ、該レポーター遺伝子はテトラサイクリン−制御
可能なエレメントに作動可能に結合することができる。テトラサイクリン耐性タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Stap
hylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものとすることができ、あるいは記載する種々の配列由来のものとすることができる。テトラサイクリン・リプレ
ッサーは、Ｔｎ１０トランスポゾン由来のｔｅｔＲ遺伝子としてもよく、幾つか
の配列を記載する。少なくとも１つの原核生物転写ターミネーター配列をテトラ
サイクリン−制御可能なエレメントと１またはそれを超える組換えエレメントと
の間に位置させることができる。原核生物テトラサイクリン耐性タンパク質は、
転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合することができる。
テトラサイクリン・リプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
は、転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合することができ
る。本明細書中に記載するＤＮＡは、宿主細胞の形質転換に好適な形態に作製す
ることができる。

【００１５】さらに、本発明は、原核生物中の所定の位置に外因性ポリヌクレオチド配列を
組み込むためのもう１つの異なるタイプの単離ＤＮＡ分子を含む。この他のタイ
プのＤＮＡは：標的ＤＮＡ分子中の所定の位置にテトラサイクリン−制御可能な
エレメント（ＴＣＥ）を含むポリヌクレオチド配列を組み込むための単離ＤＮＡ
分子として記載することができ、該単離ＤＮＡ分子は、順次融合した以下のＤＮ
Ａエレメント：ａ）第１の原核生物転写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列
；ｂ）第２の原核生物転写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列；ｃ）原核生
物テトラサイクリン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；ｄ）原
核生物リプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；ｅ）第１の
テトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーター・ポリヌクレオチド配
列；ｆ）第２のテトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーター・ポリ
ヌクレオチド配列；およびｇ）レポータータンパク質をコードするポリヌクレオ
チド配列、を含み；該単離ＤＮＡ分子は、所定の位置における当該単離ＤＮＡ分
子と標的ＤＮＡ分子との間の相同性組換えに十分な長さのさらなるポリヌクレオ
チド配列によって、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の
反対の末端で挟まれたＴＣＥを含むポリヌクレオチド配列を含む。前記のすべて
の修飾は、このパラグラフに記載したＤＮＡ分子にあてはめることができる。こ
のＤＮＡ分子は、ＲＤＣと呼ぶこともできるＤＮＡカセットとして記載すること
もできる。ＲＤＣは必ずしも単一のカセットでなくてもよく、ＲＤＣのエレメン
トは多くの異なる方法で作製することができることは注記しておく。ＲＤＣのエ
レメントは微生物自体から取ることさえできる。

【００１６】最後に、この系は細菌を用いて詳細に説明しているが、他のタイプの生物にも
適用することができる。当該系をウイルス、真核生物または酵母と共に用いる場
合には、転写プロモーターおよび構造遺伝子は、その生物において該プロモータ
ーおよび遺伝子を活性とするであろうことが当業者に明らかな方法で修飾される
であろう。

【００１７】発明の詳細な説明定義．本明細書全体を通して、当業者に知られているべきである語句を用いる
。当該分野における経験を有する博士号科学者であれば、本明細書に何が記載さ
れているかがわかるであろう。出典明示して本明細書の一部とみなす文献も多く
の用語を定義している。この明細書に独特である特別な語、句または略語を用い
ている場合もある。これらの特別または独特の語、句または略語は、文脈からそ
れらを読取り、および／またはそれらが直後に記載されており、いずれかの方法
で知ることができる。

【００１８】Ｃが数字に続いている場合は、摂氏にける温度をいう。該Ｃはスラッシュ“／
”および数字に続いてもよく、あるいはＣは上付き文字“^O”および数字、例えばＣ／３７またはＣ°３７であってもよい。ベータ−ラクタマーゼまたはβ−ラクタマーゼは、レポーター遺伝子またはタ
ンパク質であり、さらに後記する。遺伝子産物は、その配列が標題の遺伝子によってコードされているか、または
そのタンパク質から直接生じるいずれのタンパク質、酵素、核酸、リボソームコ
ンポーネント、化合物、糖でさえも意味する。

【００１９】ＲＤＣとは、さらに後記する安定な調節ＤＮＡカセット（Regulatory DNA Cas
sette）を意味する。ＲＥとは、さらに後記する組換えエレメント（Recombining Element）を意味する。ＴＣＥとは、さらに後記するテトラサイクリン−制御可能なエレメント（Tetr
acycline−Controllable Element）を意味する。ＴＲＲＤＣとは、さらに後記するテトラサイクリン耐性（または保護）および
リプレッサーＤＮＡカセット（Tetracycline Resistance （or protection）and
Repressor DNA Cassette（TRRDC））を意味する。ＲＧとは、レポーター遺伝子を意味し、マーカー遺伝子または酵素と呼ぶこと
もできる。文脈において読み取る場合には、レポーター遺伝子はレポータータン
パク質をいうであろう。

【００２０】ｔｅｔＯとは、さらに後記するテトラサイクリン・オペレーター配列を意味す
る。ミクロンは、記号“ｕ”または“μ”と省略し得る。Ｔｎ１０とは、さらに後記するイー・コリ（E. coli)および他の腸内細菌にテ
トラサイクリン耐性を付与し得る細菌トランスポゾンを意味する。ここに、本発明者らは、いずれの微生物遺伝子が感染を維持するのに必須であ
るかを同定する方法を記載する。本発明者らは、特異的な遺伝子がイン・ビトロ
（in vitro)でかつ宿主感染の間に調節され得るように、微生物病原体を遺伝子的に設計するように設計されたスクリーニングを開示する。これを完成するため
に、外因性ＤＮＡ配列を細菌の染色体に挿入して、標的化遺伝子の野生型発現を
破壊する。ついで、標的化遺伝子の発現を調節カセットが制御するように調節カ
セットを染色体に挿入することによって、標的化遺伝子の発現を調節する。別法
として、該標的化遺伝子をクローン化し、染色体中のどこかほかの場所または染
色体外ＤＮＡフラグメント上の調節カセットの制御下に置くこともできる。この
理論は、遺伝子が調節エレメントによって調節および制御されている、および該
調節エレメントが外来の作用に応答するいずれの遺伝子調節系にも適用し得る。
調節エレメントの存在する例は、例えばベータ−ラクタマーゼ、ベータ−ガラク
トシドならびに砂糖（グルコースほか）、アミノ酸（トリプトファンほか）、お
よび化学元素（鉄ほか）のごとき栄養因子のごときによって制御または影響され
る。

【００２１】出願人は、ＰＣＴ出願PCT/US 96/07937号、1996年12月19日（19．12．96）に公開された国際公開番号WO 96/40979号の定義、理論および記載を、一部、出典明示して本明細書の一部とみなす。PCT/US 96/07937号に開示されている組換え配列および例は本明細書の一部とみなさない。 1995年11月7日に公開された米国特許第5,464，758号は本明細書の一部とみなし、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に関する一般的な定義、理論、原理、
概念、一般情報は出典明示して本明細書の一部とみなすが、米国特許第5,464,75
8号に開示されている配列は本明細書の一部とみなさない。

【００２２】ここに、本発明者らは、テトラサイクリンの存在または不存在に応答する遺伝
子調節エレメントを詳細に記載する。したがって、テトラサイクリンを使用して
、標的化遺伝子の発現を調節する。通常、テトラサイクリンは動物には存在しな
いため、感染動物の食餌にテトラサイクリンを添加するか、またはそれから取り
除くことによってテトラサイクリン−調節微生物遺伝子をイン・ビボ（in vivo)
で制御することができる。

【００２３】本発明は、抗微生物剤に対する標的として微生物遺伝子産物を評価する方法を
記載する。抗生物質は、感染宿主における微生物の生存に必須の微生物プロセス
を標的化することによって作用する。微生物が哺乳動物に感染している間に遺伝
子を遮断することができるように微生物を遺伝子的に設計することによって、遺
伝子産物が関与するプロセスを阻害する化合物の効果を模倣することができる。
宿主における生存のために微生物により遺伝子産物が要求される場合には、該遺
伝子を止めることは、該遺伝子が関与するいずれかのプロセスを標的化する抗生
物質を投与することによって感染症を治療することに匹敵する。このようにして
、本発明者らは、最初に特異的な化学阻害剤をスクリーニングすることなく、こ
れらの工程を阻害する効果を試験することができる。

【００２４】 Microcide Pharmaceuticals，Inc.社に譲渡されたＰＣＴ国際公開WO 96/40979
号は、感染の間に微生物の遺伝子を調節することを可能とし得ることを示唆して
いるが、該文献はいかにしてこのことを行い得るかを何ら記載していない。ここ
に本明細書に供する説明は、微生物中の目的の特異的な遺伝子を当該微生物が哺
乳動物に感染している間に調節することができるように、微生物を遺伝子的に設
計する方法を記載する。目的の遺伝子を調節するこの遺伝子的に設計された系は
、テトラサイクリンの存在または不存在によって制御される。本発明においては
、哺乳動物にテトラサイクリンを摂食させる間に、遺伝子的に設計した微生物を
該哺乳動物に感染させることができる。該系は、テトラサイクリンの存在下で遺
伝子が発現するように設計されている。感染が成立したら、食餌からテトラサイ
クリンを取り除き、遺伝子の発現を停止させる。標的が感染に必要な遺伝子また
は遺伝子産物であれば、テトラサイクリンを取り除き、遺伝子を停止させると哺
乳動物から感染症が解消されるであろう。

【００２５】微生物の遺伝子的設計には、ＴＣＥを微生物に取り込ませる必要がある。ＴＣ
Ｅとは、テトラサイクリン−制御可能なエレメントを意味し、それはより十分に
後記する。ＴＣＥは、約５または６の異なるエレメントを含み得る決まったＤＮＡユニッ
トまたはＤＮＡカセットの部分に作製することができる。これらのエレメントを
図１の一部としてすべて示す。これらのエレメントには：ａ）１ないし数個の転
写ターミネーター；ｂ）構造遺伝子ｔｅｔＭ；ｃ）構造遺伝子ｔｅｔＲ；ｄ）１
ないし数個のプロモーター；ｅ）ＢｌａＺについての構造遺伝子によって本明細
書中に例示するレポーターエレメントまたはレポーター遺伝子が含まれ得る。ｆ
）これらの種々のエレメントは、和合性末端を許容する制限サイトを有し、これ
により種々のエレメントのＤＮＡカセットへの連結が許容される。図１に示す全
体のＤＮＡカセットを、調節ＤＮＡカセットまたはＲＤＣと呼ぶ。

【００２６】構造遺伝子ｔｅｔＭおよび構造遺伝子ｔｅｔＲが前記のＲＤＣの一部分である
必要はなく、むしろそれは異なるプラスミド上に存在させることができ、さもな
くば微生物によってそれが発現されるが、ＲＤＣ中のプロモーターによってそれ
が制御される必要はないように該微生物に挿入することができることは注記して
おく。構造遺伝子ｔｅｔＭ、構造遺伝子ｔｅｔＲおよびプロモーター配列を、本
明細書中ではテトラサイクリン耐性（または保護）およびリプレッサーＤＮＡカ
セット（ＴＲＲＤＣ）という。本明細書中で用いるごとく、テトラサイクリン・
リプレッサー遺伝子を構造遺伝子ｔｅｔＲといい、その関連タンパク質、テトラ
サイクリン・リプレッサータンパク質を構造タンパク質ＴｅｔＲという。本明細
書中で用いるごとく、テトラサイクリン耐性遺伝子を構造遺伝子ｔｅｔＭといい
、その関連タンパク質、テトラサイクリン耐性タンパク質を構造タンパク質Ｔｅ
ｔＭという。ｔｅｔＲおよびｔｅｔＭ遺伝子の機能、目的および設計ならびに遺
伝子産物は、より十分に後記する。ＴＲＲＤＣのコンポーネントを図１に示す。
３つのエレメント、ＴＲＲＤＣ、ＴＣＥおよびレポーター遺伝子（ＲＧ）をすべ
て図１に示す。

【００２７】転写ターミネーターもＴＲＲＤＣ中に存在させる必要ないが、それは図１に示
すごとく、ＴＲＲＤＣ中に存在させ得る。レポーター遺伝子ＲＧは、定量的にア
ッセイし得る遺伝子産物を発現するいずれの遺伝子とすることもできる。ここに
、本発明者らは、ＢｌａＺ遺伝子が好ましいレポーター遺伝子となることを見出
した。したがって、図１は、本発明の特定の態様であるとして示す。図１は、単
一のＤＮＡエレメントまたはカセット中の２つの転写プロモーター系を示し、そ
こにおいては、実際に、それらはこのように結合している必要はない。必要なこ
とは、標的遺伝子およびレポーター遺伝子が双方とも同一のプロモーター系によ
って制御されており、この系がテトラサイクリンによって調節されることである
。構造遺伝子ｔｅｔＭおよび構造遺伝子ｔｅｔＲの構造遺伝子は、独立したプラ
スミドのごとき、微生物において機能するいずれの起原からのプロモーターまた
はプロモーター群によって制御され得る。

【００２８】ＲＤＣの鍵となるコンポーネントは、標的遺伝子の発現または遺伝子産物の発
現を制御する遺伝子調節系であるＴＣＥ（テトラサイクリン−制御可能なエレメ
ント）である。抗微生物処理について標的として評価する標的または遺伝子産物
は転写プロモーターによって制御され、これはついでｔｅｔＲによってコードさ
れるテトラサイクリン・リプレッサータンパク質によって調節される。テトラサ
イクリンの不存在下においては、ｔｅｔＲコードタンパク質は転写プロモーター
の周囲のテトラサイクリン・オペレーター配列（ｔｅｔＯ）に結合し、プロモー
ターからの転写を低下させるかまたは妨害する。テトラサイクリン存在下におい
ては、ｔｅｔＲコードタンパク質はテトラサイクリンに結合し、ｔｅｔＯ配列へ
の結合を妨害し、プロモーターからの転写を許容する。（ＴＣＥ）は標的遺伝子
の転写を許容するプロモーター配列を有し、ｔｅｔＯ配列を含む。この例におい
ては、本発明者らはｔｅｔＲ遺伝子をＲＤＣ中に含めているが、それを染色体挿
入またはプラスミドベクター上のいずれかとして、独立コンポーネントとして微
生物に取り込ませることができる。

【００２９】ここに示す例におけるテトラサイクリン−制御可能なエレメント（ＴＣＥ）系
は、テトラサイクリン耐性オペロンの調節エレメントをベースとする。Ｔｎ１０
は、テトラサイクリン調節系を有するトランスポゾンである。Ｔｎ１０は、出典
明示して本明細書の一部とみなすHillenおよびWissmann，“Topics in Molecula
r and Structural Biology”in Protein-Nucleic Acid Interaction，SaegerおよびHeinemann編，Macmillan社，London，1989年，Vol.10，pp.143-162に記載さ
れている。Ｔｎ１０内の耐性−媒介遺伝子の転写は、テトラサイクリン・リプレ
ッサー（ＴｅｔＲ）によって負に調節される。テトラサイクリンまたはテトラサ
イクリン・アナログの存在下では、ＴｅｔＲはオペロンのプロモーター領域内に
位置するそのオペレーターに結合せずに、転写が許容される。テトラサイクリン
・オペレーター（ｔｅｔＯ）配列に作動可能に融合したプロモーターは、Ｔｅｔ
Ｒおよび低濃度のテトラサイクリンの存在下で実質的にサイレントである。

【００３０】ＴｅｔＲのそのオペレーター配列に対する特異性（HillenおよびWissmann，“
Topics in Molecular and Structural Biology” in Protein-Nucleic Acid Int
eraction, SeagerおよびHeinemann編, Macmillan社, London, 1989, Vol. 10, p
p. 143-162）ならびにＴｅｔＲに対するテトラサイクリンの高親和性（Takahash
iら，J. Mol. Biol. 187:341-348 (1986)）およびテトラサイクリンのよく研究された化学的および生理学的特性は、原核生物細胞における誘導可能な発現系に
対して基礎をなす。

【００３１】本発明は、タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子にも関し、該
ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に
作動可能に結合した極小プロモーターに作動可能に結合されている。ｔｅｔＯ配
列は、例えば（出典明示して本明細書の一部とみなす）HillenおよびWissmann，
“Topics in Molecular and Structural Biology” in Protein-Nucleic Acid I
nteration, SangerおよびHeinemann編, Macmillan社, London, 1989, Vol.10, p
p.143-162に従って得ることができる。本発明の実施において用いることができる他のｔｅｔＯは以下に記載する参考文献から得ることができる：Watersら，Nu
cl. Acids Res. 11：6089−6105（1983）；Postleら，Nucl. Acids Res. 12：48
49−4863（1984）；Ungerら，Gene 31：103−108（1984）；Ungerら，Nucl. Aci
ds Res. 12：7693−7703（1984）；Tovarら，Mol. Gen. Genet. 215：76−80（1
988）；比較および概観についてはProtein−Nucleic Acid Interaction，Seager
およびHeinemann編，Macmillan社，London，1989，Vol. 10，pp.143−162におけ
るHillenおよびWissmannを参照し、記載した系を発現させるためにも用いること
ができる。このパラグラフにおけるすべての参考文献は出典明示して本明細書の
一部とみなす。

【００３２】系を調節するために用いるテトラサイクリンによって微生物が死滅することを
防ぐために、テトラサイクリン耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子も
構築物に付加する。テトラサイクリンは、タンパク質合成に必要な伸長因子を妨
害することによって抗生物質として機能する。テトラサイクリン耐性を付与する
幾つかの遺伝子は、細胞のテトラサイクリンを汲出すことによってか、またはテ
トラサイクリンを化学的に変化させることによって、細胞におけるテトラサイク
リンのレベルに作用するであろう遺伝子産物を発現する。テトラサイクリンはＴ
ＣＥを調節するために必要であるため、微生物におけるテトラサイクリンのレベ
ルを変化させないテトラサイクリン耐性遺伝子を用いることは重要である。詳細
には、テトラサイクリン耐性遺伝子であるｔｅｔＭ遺伝子を選択して、テトラサ
イクリン保護を微生物に付与する。ｔｅｔＭ遺伝子は、テトラサイクリン存在下
で機能し得るもう１つのリボソーム伸長因子であると考えられるタンパク質をコ
ードしている。ここに本発明者らは、ｔｅｔＭ遺伝子を付加してＲＤＣを作製す
ることを記載するが、それは、染色体またはプラスミドベクターに挿入すること
によって、微生物に別々に付加することもできる。

【００３３】加えて、レポーター遺伝子を構築物に付加して、ＲＤＣの制御下で遺伝子から
発現されたタンパク質の量を測定する簡便な方法を許容する。別法として、該レ
ポーター遺伝子は微生物中に存在させることもできる。本発明者らの場合におい
ては、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ＢｌａＺをレポーター遺伝子として
用いる。この遺伝子は、β−ラクタムに対する耐性をそれが付与することにおい
て発現の選抜を許容する。すなわち、この遺伝子を発現する生物は、β−ラクタ
ムの存在下におけるその生存性によって選抜することができる。そのうえ、β−
ラクタマーゼのレベルは、単純な比色アッセイによって定量的にアッセイするこ
ともできる。テトラサイクリンの存在または不存在下におけるβ−ラクタマーゼ
活性のレベルを追跡することによって、本発明者らは、これを用いてＴＣＥの感
度を測定して、最適化されたＴＣＥ配列を選択することができる。

【００３４】ついで、ＴＣＥを微生物中の標的遺伝子に結合しなければならない。これは、
幾つかの方法でなし得る。本明細書においては、２つの卓越した（promenent）方法をオプションＩおよびオプションＩＩとして論ずる。他のオプションは、当
業者であれば明らかであろう。オプションＩ．ＴＣＥ単独；ｔｅｔＲ、ｔｅｔＭおよびＢｌａＺに結合したＴ
ＣＥ；または全体ＲＤＣを染色体に挿入することができる。挿入ＤＮＡを挟む組
換えエレメント（ＲＥ）は、宿主染色体ＤＮＡと十分な配列同一性を有して、染
色体への相同性組換えを許容するように設計されるであろう。ＲＥ配列は、カセ
ットが標的遺伝子とその内因性転写プロモーター配列との間に存在するように、
標的挿入に設計する。このようにして、天然制御配列を標的遺伝子から除去し、
標的遺伝子の発現を、挿入されたＴＣＥまたはＲＤＣの一部分としてのＴＣＥに
よって制御する。

【００３５】オプションＩＩ．標的遺伝子をＴＣＥに結合させるもう１つの方法には、微生
物中のプラスミドベクター上のＴＣＥ（単独か；またはｔｅｔＲ、ｔｅｔＭおよ
びＢｌａＺに連結するか；またはＲＤＣの一部分としてかのいずれか）とレポー
ター遺伝子との間またはレポーター遺伝子の直後への導入が含まれる。このオプ
ションＩＩの方法においては、不活性化した染色体からの野生型標的遺伝子を有
する微生物を用いる。ついで、該標的遺伝子をＴＣＥ含有ＤＮＡフラグメントに
連結し、微生物を安定に形質転換するのに好適なプラスミドベクターに挿入する
。

【００３６】ついで、遺伝子的に設計した微生物を用いて、マウスのごとき哺乳動物の試料
に感染させる。例えば、２群のマウス（Ａ群マウスおよびＢ群マウスという）を
、微生物に感染させている間に、（おそらくは、その飲料水にテトラサイクリン
を添加することによって）すべてテトラサイクリンで処理する。双方の群のマウ
スにおいて、微生物が当該動物に摂食させたテトラサイクリンに暴露されている
ため、感染微生物中の遺伝子は作動し（on）、機能産物を産生するであろう。つ
いで、Ｂ群マウスの飲料水からテトラサイクリンを取り除く。ついで、Ａ群マウ
スおよびＢ群マウスを時間にわたって比較する。Ａ群マウスはいまだテトラサイ
クリンに暴露されているため、微生物中の標的遺伝子は作動し、Ａ群の感染症に
機能するであろう。しかし、Ｂ群マウスにおいては、感染微生物における標的遺
伝子の発現は、テトラサイクリンが取り除かれれば低下するか、または停止さえ
してしまうであろう。機能する遺伝子を有する微生物を有するマウスであるＡ群
マウスが感染症の徴候を示し続け、病気になり続けおそらくは死にさえする一方
で、同時に遺伝子が停止しており、したがってより少ない遺伝子産物しか産生し
ていない微生物に感染したＢ群マウスが感染症から回復し得るかまたは改善の徴
候を示し得るか、あるいは少なくとも死なない場合には、制御された遺伝子また
は遺伝子産物が感染症を持続するために微生物に重要であり、抗微生物標的とし
て選択されるであろうことがわかる。このタイプの相異は有意差と考えられよう
。いずれの有意差も２つの群の動物間の意味のある差と考えられよう。有意性は
、よく知られた統計検定を用いて定量化することもできる。意味のある差は、微
生物感染症を評価している当業者によって判定することができよう。

【００３７】Ｂ群マウスの食餌からテトラサイクリンを取り除いた後に、Ａ群およびＢ群の
双方のマウスが病気に罹りつづけるかまたは微生物感染症を患いつづける場合に
は、タンパク質または遺伝子産物を阻害することがおそらくは哺乳動物における
感染症をいかなる場合においても治療しないであろうため、おそらくは該遺伝子
がさらなる抗微生物研究の良好な標的でないことを示している。これは、当該系をどのように使用するかの１つの例にすぎず、前記の明らかな
変形は当業者に明らかであろう。発明を前記してきたが、著者はここに幾つかの
発明の好ましい具体例を供したい。

【００３８】好ましい具体例本発明の好ましい具体例は、微生物染色体の所定の位置に外因性のポリヌクレ
オチド配列を組み込んで内因性の原核生物遺伝子を作動可能に制御するためか、
または標的化遺伝子の機能性コピーをそれが作動可能に制御するようにクローン
化した染色体外エレメントとしての単離ＤＮＡ分子またはＤＮＡカセットに関し
、当該ＤＮＡ分子はテトラサイクリン−制御可能なエレメント（ＴＣＥ）を含み
、ここにＴＣＥはテトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーターを含
む。微生物染色体に組み込むために、ＴＣＥポリヌクレオチド配列は組換えエレ
メント（ＲＥ）によってその５'末端で挟まれ、かつ所望により３'末端で挟まれ
てもよく、ここにおいてＲＥは、単離ＤＮＡ分子と微生物染色体との間における
相同性組換えに十分な長さのさらなるポリヌクレオチド配列を含む。

【００３９】好ましい具体例において、前記にいう単離ＤＮＡ分子は、ＴＣＥに作動可能に
結合されたレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。
該レポーター遺伝子は、蛍光マーカー、またはベータ−ガラクトシダーゼもしく
はプロテアーゼのごとき酵素とすることができるが、本明細書において好ましい
レポーター遺伝子はベータ−ラクタマーゼである。

【００４０】もう１つの好ましい具体例において、前記にいう単離ＤＮＡ分子は、ＲＥとＴ
ＣＥとの間に位置する少なくとも１つの転写ターミネーター・ポリヌクレオチド
配列をさらに含む。なおもう１つの好ましい具体例において、前記にいう単離ＤＮＡ分子は、ＲＥ
とＴＣＥとの間に位置する転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動可能
に結合した、原核生物テトラサイクリン耐性タンパク質をコードするポリヌクレ
オチド配列をさらに含む。好ましくは、該テトラサイクリン耐性タンパク質はス
タフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものである。

【００４１】もう１つの好ましい具体例において、前記にいう単離ＤＮＡ分子は、ＲＥとＴ
ＣＥとの間に位置するテトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーター
・ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合した原核生物テトラサイクリン・リプ
レッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。好ましく
は、該テトラサイクリン・リプレッサーはトランスポゾンＴｎ１０由来のもので
ある（出典明示して本明細書の一部とみなすPostle，K.，Nguyen，T. T.およびB
ertrans，K. P.，1984，Nucleic Acids Research 12：4849−4863を参照されたし）。

【００４２】もう１つの好ましい具体例において、前記にいう単離ＤＮＡ分子は、宿主細胞
の形質転換に好適な形態の組換えベクターである。もう１つの好ましい具体例は
、この組換えベクターで形質転換した宿主細胞を含む。もう１つの好ましい具体例は、前記にいうＤＮＡ分子を含む微生物宿主細胞を
含み、ここに該ＤＮＡ分子は宿主細胞染色体中の所定の位置に組み込まれる。本発明のもう１つの好ましい具体例は、標的ＤＮＡ分子の所定の位置にテトラ
サイクリン−制御可能なエレメント（ＴＣＥ）を含むポリヌクレオチド配列を組
み込むための単離ＤＮＡ分子に関し、該単離ＤＮＡ分子は順次融合した以下のＤ
ＮＡエレメント：第１の転写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列；第２の転
写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列；原核生物テトラサイクリン耐性タン
パク質をコードするポリヌクレオチド配列；原核生物リプレッサータンパク質を
コードするポリヌクレオチド配列；第１のテトラサイクリン−制御可能な転写プ
ロモーター・ポリヌクレオチド配列；第２のテトラサイクリン−制御可能な転写
プロモーター・ポリヌクレオチド配列；およびレポータータンパク質をコードす
るポリヌクレオチド配列を含み；該単離ＤＮＡ分子は、所定の位置における単離
ＤＮＡ分子と標的ＤＮＡ分子との間の相同性組換えに十分な長さのさらなるポリ
ヌクレオチド配列によって、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド配列の反対側の末端で挟まれたＴＣＥを含むポリヌクレオチド配列を含む。好
ましい具体例において、この単離ＤＮＡ分子を含む組換えベクターは、宿主細胞
の形質転換に好適な形態で存在する。さらなる好ましい具体例において、この単
離ＤＮＡ分子は、微生物宿主細胞染色体中の所定の位置に組み込まれる。

【００４３】もう１つの好ましい具体例において、ＤＮＡは以下の部材：順次以下のもの：
第２のテトラサイクリン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列
；標的化遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ分子；およ
びレポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する：原核生物
テトラサイクリン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；原核生物
リプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；第１のテトラサイ
クリン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列、を含有する微生
物病原体の形質転換に好適な組換えベクターに関する。

【００４４】好ましい具体例は、図１に示し、図１のコンポーネントとして本明細書中に記
載するＤＮＡカセットである。前記の記載は本発明を完全に説明しているであろうが、合成例および作動モデ
ルの双方の以下の例は説明目的のものであって、本発明の前記の記載に限定され
るものではない。

【００４５】実施例材料および方法テトラサイクリン−応答性ＤＮＡ調節カセットの構築：ＤＮＡカセットは、キャンベルタイプの組換えによる特異的サイトでエス・ア
ウレウス（S. aureus）の染色体に相同性組換えによって（出典明示して本明細書の一部とみなすCampbell，A.，1962，Advan. Genet. 11，45−101を参照されたし）か、自己複製プラスミドのいずれかによってエス・アウレウス（S. aureu
s）に導入するために構築する。染色体組み込み用に、このＤＮＡは、エス・アウレウス(S. aureus)の染色体ＤＮＡの領域に相同な領域を１または双方の末端に含む。構築物の残部は、図１に図示する組換えＤＮＡカセットを含む。自律調
節化プラスミド上においては、図１中の組換えＤＮＡカセットはエス・アウレウ
ス（S. aureus）遺伝子をコードするＤＮＡを含むであろう。

【００４６】このカセットの第１のエレメントは、染色体ＤＮＡからこのインサートへの転
写リード−スルーならびにカセットから染色体への転写リード−スルーを防ぐよ
うに設計された２つの転写ターミネーターを含む。これらは、テトラサイクリン
に対する耐性を付与するエス・アウレウス（S. aureus）遺伝子、ｔｅｔＭにつづく。耐性のメカニズムが細胞中のテトラサイクリンの構造または濃度を変化さ
せようではなく、むしろ翻訳においてテトラサイクリンに耐性である別の伸長因
子を供するようであったのでこの遺伝子を選択した（出典明示して本明細書の一
部とみなすNesin，M.，Svec，P.，Lupski，J.R.，Godson，G.N.，Kreisworth，B
.，Kornblum，J.およびProjan，S. J.，Antimicrob. Agents Chemother.，1990
，34：2273−2276を参照されたし）。この遺伝子は、図１に示すごとく左から右
に転写される。別法として、ｔｅｔＭはエス・アウレウス（S. aureus）の染色体のどこか他の場所に組み入れて、多数の標的化遺伝子試験に有用なバックグラ
ウンド株を提供することができる。イー・コリ（E. coli)のｔｅｔリプレッサー
をコードする遺伝子、ｔｅｔＲ（出典明示して本明細書の一部とみなすPostle，
K.，Nguyen，T. T.およびBertrand，K. P.，Nuc. Acids. Res.，1984，12：4849
−4863を参照されたし）は、２つの分岐プロモーター（P_tetおよびP_xyl）および
２つのテトラサイクリン・オペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含む領域上の近接プ
ロモーターからのｔｅｔＭとともにオペロンとして転写される。ｔｅｔリプレッ
サータンパク質は、テトラサイクリン不存在下でｔｅｔＯ配列に結合して、P_xyl からの転写を妨害する。テトラサイクリン存在下においては、ｔｅｔリプレッサ
ーはテトラサイクリンに結合するがｔｅｔＯ配列には結合せず、P_xylからの転写
が許容される。強力なビイ・ズブチリス（B. subtilis）のプロモーター、P_xyl は図１に示すごとく右への転写の開始を合図して、アンピシリンに対する耐性を
付与するアッセイ可能なマーカー遺伝子であるベータ-ラクタマーゼをコードするエス・アウレウス（S. aureus）のＢｌａＺの転写を許容する（出典明示して本明細書の一部とみなすWang，P. Z.およびNovick，R. P.，1987，J. Bacteriol
.，169：1763-1766を参照されたし）。このＤＮＡを染色体に挿入した場合、標的として試験すべき遺伝子はＢｌａＺとのオペロンで転写され、同様な転写調節
を有するであろう。ＤＮＡが自律調節化プラスミドに含まれる場合、該標的遺伝
子をコードするＤＮＡは、標的遺伝子およびＢｌａＺが単一のオペロンでかつ同
様な調節を有して転写されるようにＢｌａＺについで挿入されるであろう。

【００４７】以下のパラグラフでは、各ＤＮＡカセットエレメントをどのように作製するか
を説明する。全体的な合成エレメント（１および４）について、ＤＮＡオリゴヌ
クレオチドは制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって粘着末端に類似する
双方の末端にオーバーハングするヌクレオチドを残すように設計されている。Ｐ
ＣＲによって増幅させたエレメントについて、オリゴヌクレオチドは双方の末端
に制限エンドヌクレアーゼ用のユニークな認識サイトを取り込むように設計され
る。これらの制限サイトは、互いのおよび制限酵素消化プラスミドとの連結を単
純化する。オリゴヌクレオチドは、Genosys Biotechnologies，Inc.社，The Woo
dlands，TXによって合成された。

【００４８】ＤＮＡの連結は、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim Biochemicals
社製，Indianapolis，IN）を含むＴ４-ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのジチオスライトール、５０μｇ／ｍｌの牛血清アルブミン）中、１４／Ｃにて一晩行う。一般的に、
ＰＣＲ反応はＴａｑポリメラーゼおよびPerkin-Elmer社（Roche Molecular Syst
ems，Inc.社製，Branchburg，NJ）からの反応緩衝液を用いる５０μｌ反応容量で行う。ＰＣＲ反応物には、４０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび
ｄＴＴＰ；２００ｎＭの各プライマー；ならびに１-１００ｎｇの染色体ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡが含ませた。ＰＣＲ反応物を９５／Ｃにて５分間加熱し
てテンプレートを変性させ、つづいて９５／Ｃにて１分間の加熱、５０／Ｃにて
１分間のプライマー・アニーリングおよび７２／Ｃにて１分間の伸長の３０サイ
クルを行った。

【００４９】エレメント１：ターミネーターの構築双方向性ターミネーター用の配列は、ｓａｒＡについて（Bayerら，J. Bacter
iol.，1996，178：4563-4570）およびｐｃｒＢについて（Iordenescu，S.，Mol.
Gen. Genet.，1993，241：185-192）公開されたエス・アウレウス（S. aureus ）の転写ターミネーター由来のものである。このエレメントは、表Ｉに掲載する
４種のオリゴヌクレオチドからＣＬＱ４５９、ＣＬＱ４６０、ＣＬＱ４６１およ
びＣＬＱ４６２として構築した。アニーリングさせる前に、５ピコモルのＣＬＱ
４６０およびＣＬＱ４６１を、２ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７.６、２００ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ中のＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs社製，Beverly，MA）で３７Ｔ／Ｃにて
３０分間処理した。８５／Ｃに２０分間加熱することによって反応を停止させた
。ついで、９０／Ｃに５分間加熱する前に、キナーゼ処理した（kinased）ＣＬＱ４６０およびＣＬＱ４６１を等モル量のＣＬＱ４６２およびＣＬＱ４６３と各
々混合し、つづいて３０分間にわたって室温まで冷却した。２対のアリーリング
したプライマーを等モル量で混合し、５０／Ｃに５分間加熱し、ついで３０分間
にわたって室温まで冷却させた。このカセットは、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｍ
ａＩですでに消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する前に前記したごとく連結
した。図２は、このＤＮＡフラグメントのポリヌクレオチド配列を示す。

【００５０】エレメント２：テトラサイクリン耐性の構築エス・アウレウス（S. aureus）のｔｅｔＭ（Genbank受入れ番号M21136）の構
造遺伝子は、表１に掲載するプライマーＣＬＱ４６３およびＣＬＱ４６４を用い
て、前記したＰＣＲによって増幅させた。これらのプライマーは、各々制限酵素
ＢａｍＨＩおよびＸｍａＩに対するユニークな認識サイトを付加する。増幅用の
テンプレートは、Serban Iordenescu社（Public Health Research Institute，N
Y）によって供され、プラスミドｐＲＮ６８８０はNesin，M.，Svec，P.，Lupski
，J. R.，Godson，G. N.，Kreisworth，B.，Kornblum，J.およびProjan, S. J. ，Antimicrob. Agents Chemother.，1990，34：2273-2276によって公開されたプ
ラスミド由来のものである。図３は、このＤＮＡフラグメントのポリヌクレオチ
ド配列を示す。

【００５１】エレメント３：テトラサイクリン・リプレッサーの構築イー・コリ（E. coli)のｔｅｔＲ（Genbank受入れ番号J1830）は、Ｔｎ１０を
運搬しているイー・コリ（E. coli)株からプライマーＣＬＱ４６５およびＣＬＱ
４６７またはＣＬＱ４６６およびＣＬＱ４６７を用いるＰＣＲによって増幅させ
た（Hillen，W.およびSchollmeier，K.，Nucl. Acids Res.，1983，11：525-539
）。プライマーＣＬＱ４６５およびＣＬＱ４６７は、各々、制限エンドヌクレア
ーゼＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩに対するユニークな認識サイトを取り入れ、この
遺伝子に対する野生型プロモーター配列を含む。プライマーＣＬＱ４６６がＣＬ
Ｑ４６７と対をなす場合には、それは、遺伝子の開始コドンの近くに見出される
ＸｂａＩ制限酵素認識サイトの近くから開始するｔｅｔＲのより短い領域を増幅
させる。このより短い構築物により、この遺伝子を制御するための非-野生型のリーダーおよびプロモーター配列のクローニングが許容される。ＰＣＲ反応は、
反応混合物を９５／Ｃに５分間加熱し、９５／Ｃにて１分間、４５／Ｃにて１分
間および７２／Ｃにて１分間の３の連続する工程を通して３５回サイクルさせて
行った後に、全細胞を用いて行った。ＰＣＲ産物は製造業者の指示書に従って、
ｐＴ７-Ｂｌｕｅ-Ｔベクターキット（Novagen社製，Madison，WI）を用いてクロ
ーン化した。図４Ａおよび４Ｂは、これらのＤＮＡフラグメントのポリヌクレオ
チド配列を示す。

【００５２】エレメント４：転写プロモーターの構築合成プロモーター領域には、２つの分岐転写開始シグナルが含まれ、これはGe
issendorferおよびHillen（Appl. Microbiol. Biotechnol.，1990，33：657-663
）によって記載されたもの由来のものである。それは、ＣＬＱ４６８、ＣＬＱ４
６９、ＣＬＱ４７０、ＣＬＱ４７１、ＣＬＱ４７２およびＣＬＱ４８０として表
１に示すオリゴヌクレオチドから構築した。これらのプライマーをキナーゼ処理
し、アニーリングさせおよび連結する条件は、エレメント１の構築について記載
したのと同様とした。オリゴヌクレオチドＣＬＱ４６９、ＣＬＱ４７０、ＣＬＱ
４７１およびＣＬＱ４７２は、ＣＬＱ４６９とＣＬＱ４６８、ＣＬＱ４７０とＣ
ＬＱ４７１およびＣＬＱ４７２とＣＬＱ４８０をアニーリングさせる前にキナー
ゼ処理した。このアニーリングの後に、等モル量の各プライマーを互いに連結す
る前に他の２つの対とアニーリングさせ、ついで制限酵素ＸｂａＩおよびＰｓｔ
Ｉで消化したｐＵＣ１８とアニーリングさせた。すべての６種のオリゴヌクレオ
チドを用いてプロモーターカセットを構築した場合には、プライマーＣＬＱ４６
６およびＣＬＱ４６７を用いて増幅させたｔｅｔＲ遺伝子をそれに連結し、ｔｅ
ｔＲは非野生型リーダーおよびプロモーター配列から転写されるであろう。別法
として、（増幅用のＰＣＲプライマーＣＬＱ４６５およびＣＬＱ４６７を用いて
）ｔｅｔＲ遺伝子からの野生型プロモーターおよびリーダー配列をＰＣＲフラグ
メントに含める場合には、オリゴヌクレオチドＣＬＱ４７０、ＣＬＱ４７１、Ｃ
ＬＱ４７２およびＣＬＱ４７３のみで構築した合成プロモーター・エレメントを
それに連結した。図５は、このＤＮＡフラグメントのポリヌクレオチド配列を示
す。

【００５３】エレメント５：レポーター遺伝子の構築ベータ−ラクタマーゼをコードするエス・アウレウス（S. aureus）のＢｌａＺ遺伝子（Genbank受入れ番号M15526）は、表１からのオリゴヌクレオチドＣＬＱ４８６およびＣＬＱ４７５（エレメント５ａ）またはＣＬＱ４８６およびＣＬ
Ｑ５００（エレメント５ｂ）を用いてプラスミドｐＳＡ３８００（Novick，R.ら
，Cell，1989，59，395-404）からＰＣＲ増幅させた。ＣＬＱ４８６は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩに対するユニークな制限配列を取り込む。ＣＬＱ４７
５は制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩに対するユニークな認識
サイトを含む。ＣＬＱ５００は、制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩに対するユニ
ークな認識サイトを含む。ＰＣＲ産物は、ｐＴ７-Ｂｌｕｅ-Ｔベクターキット（
Novagen社製，Madison，WI）を用いてクローン化した。図６Ａおよび６Ｂは、こ
れらのＤＮＡフラグメントのポリヌクレオチド配列を示す。

【００５４】すべてのＰＣＲおよび合成ＤＮＡエレメントを単一のカセットにアセンブルさ
せた後に、該ＤＮＡカセットをエス・アウレウス（S. aureus）のプラスミドに連結する。染色体に組み込むように設計されたこれらの構築物について、該カセ
ットは相同染色体ＤＮＡからなる挿入−方向付け配列（insertion−directing s
equence）にも連結する。該プラスミドはエス・アウレウス（S. aureus）ＲＮ４
２２０、制限マイナス、修飾陽性株を通して継代される（出典明示して本明細書
の一部とみなすPeng，H.−L.，Novick，R. P.，Kreiswirth，B.，Kornblum，J. およびSchlievert，P.，1988，J. Bacteriol.，170，4365−4372を参照されたし
）。ＲＮ４２２０から精製したプラスミドＤＮＡは、天然エス・アウレウス（S.
aureus）のＤＮＡ修飾酵素によって修飾し、野生型ＤＮＡ制限系を有する病原性エス・アウレウス(S. aureus)株により容易に形質転換する（出典明示して本明細書の一部とみなすIordenescu，S.およびSurdeanu，M．1976，J. Gen. Micro
biol. 96，277−281を参照されたし）。ＥｃｏＲＩ制限酵素消化によって放出さ
れたインサートＤＮＡを精製し、環状化させる。このＤＮＡを病原性エス・アウ
レウス(S. aureus)株に形質転換し、テトラサイクリン耐性につき選抜する。インサートＤＮＡは複製起点を有していないため、それは自律プラスミドとして維
持されず、カセットが染色体に挿入された組換体についてのテトラサイクリン選
抜上で増殖する。サザンブロットまたはＰＣＲ分析を用いて、目的の組換え事象
が起こったことを確認する。

【００５５】自律複製プラスミド上の標的遺伝子の調節について、好適なプラスミドベクタ
ーに連結したＤＮＡカセットを修飾用のエス・アウレウス（S. aureus）ＲＮ４２２０を通して継代させ、ついで無処理でもう１つのエス・アウレウス（S. aur
eus）株に直接形質転換する。この株は、病原性株由来のものとし得るが、標的遺伝子の内因性コピーの発現が病原性親株から変化するように遺伝子的に設計し
得る。別法として、テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子およびプロモーター配
列を有するテトラサイクリン・リプレッサーは、エス・アウレウス（S. aureus ）染色体のもう１つの領域に別々に組換えることもできる。これらの遺伝子は、
調節カセットの他のＤＮＡエレメントに近接している必要はない。転写ターミネ
ーター、テトラサイクリン調節プロモーターおよびβ−ラクタマーゼ・レポータ
ー遺伝子を含むＤＮＡエレメントは、なお、それが野生型−染色体上の標的遺伝
子とその転写調節エレメントとの間で組換えられるように構築することができる
。

【００５６】ベータ−ラクタマーゼ・レポーター遺伝子は、異なるテトラサイクリン濃度に
おける転写リードスルーの測定を許容する。テトラサイクリン調節がこの系にお
いて予想どおりに作動する場合には、細胞はより低いテトラサイクリン濃度でよ
り少ないベータ−ラクタマーゼおよび試験遺伝子を産生するであろう。理想的に
は、テトラサイクリン不存在下では、検出可能なレベルのβ−ラクタマーゼまた
は試験遺伝子は全く見出されないであろう。試験遺伝子の転写をこのように停止
することができ、試験すべき遺伝子が必須の遺伝子である場合には、細胞はテト
ラサイクリン不存在下で生存しないであろう。遺伝子が必須でなく、この系にお
いてはテトラサイクリンによって調節されるような場合には、抗微生物標的とし
てのその潜在性を動物感染症モデルで試験するであろう。動物感染症は、テトラ
サイクリンを当該動物に摂食させている間に、この遺伝子的に設計した細菌を用
いて成立させる。本発明者らは、テトラサイクリンを感染動物の食餌から取り除
いた場合に感染症の消失を探す。

【００５７】実施例１第１の例において、外因性トリプトファン：ｔｒｐＤを欠く最小培地上におけ
るエス・アウレウス（S. aureus）増殖に必須である遺伝子、トリプトファン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の調節を制御することによってこのアプロー
チの妥当性を試験する。エス・アウレウス（S. aureus）の染色体ＤＮＡからのｔｒｐＤの構造遺伝子を、ＰｓｔＩエンドヌクレアーゼによる認識用のポリヌク
レオチド配列を各末端に付加する特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。
このＰＣＲ構築物は、それが図１に図示するように左から右に転写されるように
、プロモーター（エレメント４ａおよび４ｂ）とＢｌａＺ構造遺伝子（エレメン
ト５ｂ）との間に連結する。細胞をこの構築物で形質転換した場合、ｔｒｐＤ遺
伝子はP_xylプロモーターから転写され、形質転換体をテトラサイクリン上の増殖
によって選抜することができる。この例は、調節系に対する正の制御として作用
する。調節エレメントが予想どおりに機能する場合には、テトラサイクリンの存
在によって、ベータ−ラクタマーゼのマーカー遺伝子ならびにｔｒｐＤの転写が
許容され、細胞はアンピシリンを含むまたは含まない培地およびトリプトファン
を含むまたは含まない培地上で増殖するであろう。テトラサイクリンの不存在下
では、ｔｅｔリプレッサーはプロモーターに結合し、ベータ−ラクタマーゼおよ
びｔｒｐＤの転写を低下させるであろう。この場合においては、細胞はアンピシ
リンまたはトリプトファンの不存在下で生存するように予想されないであろう。
それが生存する場合には、これらの細胞によって産生されるベータ−ラクタマー
ゼのレベルを異なるテトラサイクリン濃度で測定して、ｔｅｔリプレッサーで達
成されるリプレッションのレベルを判定することができる。幾分かのリプレッシ
ョンが存在する限り、テトラサイクリンの存在下でこれらの細胞によって成立さ
れた感染症がテトラサイクリンの不存在下でも持続し得るかを調べるためにこの
制御を動物感染症で試験することができる。これは、どのくらいの感受性で当該
系が試験している標的遺伝子に存在するであろうかのインジケーターである。

【００５８】実施例２第２の例において、カセットを染色体に組み込むことの妥当性を、エス・アウ
レウス（S. aureus）増殖に必須であると予想される遺伝子：伸長因子Ｔｕをコードする遺伝子（ＥＦ−Ｔｕ）、の調節を制御することによって試験する。ＥＦ
−Ｔｕはタンパク質翻訳に必要であり、抗生物質に対する証明されている標的で
ある（出典明示して本明細書の一部とみなすSelva，E.，Montanini，N.，Stella
，S.，Soffietini，A.，Gastaksi，L.およびDenaro，M.，1997, J．Antibiot, T
okyo 50，22−26）。表１からのプライマーＣＬＱ４５５およびＣＬＱ４５６を用いて、ＥＦ−Ｔｕ構造遺伝子からすぐ上流のＤＮＡの領域に対応し、伸長因子
Ｇの構造遺伝子の３'末端を含むエス・アウレウス(S. aureus)の染色体ＤＮＡか
らの１つの３２０塩基対フラグメントを増幅した（図７Ａ）。表１からのプライ
マーＣＬＱ５０５およびＣＬＱ５０６を用いてＰＣＲ増幅した第２のフラグメン
トは、ＥＦ−Ｔｕ構造遺伝子の５'末端に重複する領域に対応する（図７Ｂ）。挿入ＤＮＡカセットは、これらのフラグメントを各々エレメント１およびエレメ
ント５ａに連結することによって構築した。このＤＮＡフラグメントを用いてエ
ス・アウレウス(S. aureus)細胞を形質転換する場合、該フラグメントは、エス・アウレウス(S. aureus)の染色体中のＥＦ−Ｔｕ遺伝子についての推定リボソーム結合サイトの約２０ｂｐ前の染色体へのインサートの組換えを指示する。染
色体中のＤＮＡフラグメントの挿入は、テトラサイクリンおよびアンピシリン上
の増殖によって選抜する。目的サイトへの組換えは、染色体ＤＮＡのサザンブロ
ットまたはＰＣＲ分析によって確認することができる。この例は、調節系に対し
ての正の制御として作用する。調節エレメントが予想どおりに機能する場合には
、テトラサイクリンの存在はベータ−ラクタマーゼ・マーカー遺伝子ならびにＥ
Ｆ−Ｔｕの転写を許容し、細胞はアンピシリンを含むかまたは含まない培地上で
増殖するであろう。テトラサイクリンの不存在下においては、ｔｅｔリプレッサ
ーがプロモーターに結合し、ベータ−ラクタマーゼおよびＥＦ−Ｔｕの転写を妨
害するであろう。この場合においては、細胞はアンピシリンの存在または不存在
下で生存することは予想されないであろう。なぜならば、ＥＦ−Ｔｕは必須であ
ると予想されるからである。それが実際に生存する場合には、この細胞によって
産生されるベータ−ラクタマーゼのレベルを異なるテトラサイクリン濃度で測定
して、ｔｅｔリプレッサーで達成されるリプレッションのレベルを決定すること
ができる。幾分かのリプレッションが存在する限り、この制御を動物感染症にお
いて試験して、テトラサイクリンの存在下でこの細胞によって成立された感染症
がテトラサイクリン不存在下でも持続され得るかを調べることができる。これは
、どのくらいの感受性で当該系が試験している標的遺伝子において存在するであ
ろうかのインジケーターである。

【００５９】実施例３第３の例においては、ＤＮＡカセットを構築して、エス・アウレウス(S. aure
us)のｆｅｍＡ遺伝子（Genbank受入れ番号M23918）を試験することを許容する。
エレメント１、２、３、４および５は実施例２におけるエレメントと同一である
。これらのエレメントを、ｆｅｍＡ構造遺伝子周辺のエス・アウレウス（S. aur
eus）の染色体ＤＮＡに対応する２片のＤＮＡに融合した。この遺伝子は、病原性因子として同定されている：遺伝子の挿入不活性化がエス・アウレウス(S. au
reus)病原体の病原性を低下させた（Mei−JM；Nourbakhsh−F；Ford−CW；Holde
n−DW，Mol−Microbiol. 1997年10月;26(2)：399−407）。表１からのプライマーＣＬＱ４５１およびＣＬＱ４５２を用いて、ｆｅｍＡ構造遺伝子のすぐ上流に
存在し、ｔｒｐＡの３'末端を含むエス・アウレウス(S. aureus)の染色体ＤＮＡ
の１つの３６９塩基対のフラグメントを増幅させた（図８Ａ）。プライマーＣＬ
Ｑ５０１およびＣＬＱ５０２を用いて、ｆｅｍＡ構造遺伝子の５'末端に重複するエス・アウレウス(S. aureus)の染色体ＤＮＡの第２のフラグメントを増幅させた（図８Ｂ）。挿入ＤＮＡカセット中のエレメント１に第１のフラグメントを
、エレメント５ａに第２のフラグメントを連結すると、細胞をこの構築物で形質
転換した場合に、エス・アウレウス（S. aureus）の染色体中のｆｅｍＡの推定リボソーム結合サイトの約２５ｂｐ前の染色体へのインサートの組換えが指示さ
れる。再度、染色体中のＤＮＡフラグメントの挿入は、テトラサイクリンおよび
アンピシリン上の増殖によって選抜する。目的サイトへの組換えは、組換え細胞
から単離したゲノミックＤＮＡのサザンブロットまたはＰＣＲ分析によって確認
する。テトラサイクリンの存在下または不存在下におけるベータ−ラクタマーゼ
発現のリプレッションにおける変動は、実施例２において示されたものに類似す
ると予想される。しかしながら、伝えるところによれば、ｆｅｍＡはイン・ビト
ロ（in vitro)における細胞の増殖に必須の遺伝子ではなく（Strander，A. M.，
Ehlert，K.，Labischinski，H.およびBerger−Bachi，B.，1997，J. Bacteriol.
179：9−16）、したがって、これらの組換え細胞は、テトラサイクリンの不存在下でＢｌａＺ末端ｆｅｍＡの転写が完全にリプレッションされる場合でさえ増
殖することが予想されるであろう。ｆｅｍＡが感染の成立に必須であり、テトラ
サイクリンの不存在がｆｅｍＡの転写を妨害する場合には、動物がその中にテト
ラサイクリンを有していなければ、これらの細胞は感染を成立できないであろう
。ｆｅｍＡが抗微生物剤の良好な標的である場合には、テトラサイクリンの存在
下で成立したこれらの細胞での感染症は、つづくテトラサイクリンの除去で解消
されるであろう。

【００６０】実施例４第４の例においては、染色体へ挿入するためにＤＮＡカセットを構築して、エ
ス・アウレウス（S. aureus）におけるｌｇｔ遺伝子（Genbank受入れ番号U35773
）の試験を許容する。リポタンパク質生合成における翻訳後修飾用の第１の酵素
をコードするｌｇｔは、イー・コリ（E.coli)において（出典明示して本明細書の一部とみなすGan，K.，Sankaran, K．，Williams，M. G.，Aldea, M.，Rudd,
K．E.，Kushner, S．R.およびWu，H. C.，1995，J. Bacteriol. 177：1879−188
2）およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）において（出典明示して本明細書の一部とみなすGan, K, Gupta, S. D., Sankaran, K., Sc
hmid, M. B.およびWu, H. C., 1993, J. Biol. Chem. 268:16544-16550）、必須
遺伝子であることが示されている。しかしながら、必須の性質はこれらの細菌中
のｌｇｔの不存在下における未修飾プロ−リポタンパク質蓄積の毒性効果による
ものと考えられ、ｌｇｔがエス・アウレウス(S. aureus)において必須遺伝子であるかまたはそれが感染に必要な遺伝子であるかは未だわかっていない。表１か
らのプライマーＣＬＱ４５３およびＣＬＱ４５４を用いて、ｌｇｔ構造遺伝子に
対する推定リボソーム結合サイトから１５ｂｐ上流で終了するＤＮＡの領域に対
応するエス・アウレウス（S. aureus）の染色体ＤＮＡからの４５０塩基対フラグメントをＰＣＲ増幅させた（図９Ａ）。表１からのプライマーＣＬＱ５０３お
よびＣＬＱ５０４を用いて、ｌｇｔの５'末端に重複するエス・アウレウス（S.
aureus）の染色体のもう１つのフラグメントをＰＣＲ増幅させた（図９Ｂ）。こ
の第１のフラグメントをエレメント１に、第２のフラグメントをエレメント５ａ
に挿入ＤＮＡカセット中で連結させると、この構築物で細胞を形質転換した場合
に、エス・アウレウス（S. aureus)の染色体中のｌｇｔの推定リボソーム結合サ
イトの約２５ｂｐ前の染色体への該インサートの組換えが指示される。再度、染
色体中のＤＮＡフラグメントの挿入は、テトラサイクリンおよびアンピシリン上
の増殖によって選抜する。目的のサイトへの組換えは、染色体ＤＮＡのサザンブ
ロットまたはＰＣＲ分析によって確認する。テトラサイクリンの存在下または不
存在下におけるβ-ラクタマーゼ発現のリプレッションにおける変動は、実施例２において示されたものと同様であると予想される。ＢｌａＺの転写がこの構築
物中のテトラサイクリンの不存在によってリプレッションされる場合には、ｌｇ
ｔもリプレッションされ、ｌｇｔが必須の遺伝子でない場合にのみ細胞は増殖す
るであろう。それが必須の遺伝子でない場合には、それを動物感染症モデルで試
験して、ｌｇｔ転写の停止が感染症を解消するかを判定することができる。

【００６１】

【表１】

【００６２】

【表２】

【００６３】本発明が前記の説明および例に特に記載した以外にも別の方法で実施できるこ
とは明らかであろう。本発明の膨大な修飾および変形が前記教示の見地から可能であり、したがって
、これらも本発明の範囲に入る。本明細書で引用したすべての刊行物の全体的な開示は、出典明示して本明細書
の一部とみなす。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の好ましい具体例の模式図である。図１は３つの結合したＤＮＡ
カセットまたはエレメントを示している。示した３つのコンポーネントは、作動
可能に結合させてもさせなくてもよいが、ＴＲＲＤＣ（テトラサイクリン耐性（
または保護）およびリプレッサーＤＮＡカセット（Tetracycline Resistance（o
r protection）and Repressor DNA Cassette））；ＴＣＥ（テトラサイクリン−
制御可能なエレメント（Tetracycline-Controllable Element））；およびＲＧ（レポーター遺伝子(Reporter Gene))であり、結合させなくてもよいコンポーネ
ントと一緒にしてＲＤＣ（調節ＤＮＡカセット（Regulatory DNA Cassette））と呼ぶ。矢印は転写開始部位および転写の向きを表す。２つの八角形は転写ター
ミネーターを表す。ボックスは遺伝子のコード領域を表し、矢印はこれらの遺伝
子の転写の向きを示す。白丸はｔｅｔＯ配列を表し、そこにテトラサイクリン−
リプレッサータンパク質がテトラサイクリンの不存在下で結合する。垂直バーは
制限エンドヌクレアーゼ切断部位を表す。ｔｅｔＲコード領域とＢｌａＺコード
領域との間の切断部位の間の領域がＴＣＥ領域である。ｔｅｔＭ、ｔｅｔＲ、Ｔ
ＣＥおよびＢｌａＺを図面中に記載する。図１は、それが３つの転写プロモータ
ー系、ＴＣＥ、ＴＲＲＤＣおよびＲＧが単一のＤＮＡエレメントで結合している
ことを示しているため本発明の特定の具体例を示しているが、実際には、そこに
おいてはＴＲＲＤＣもＲＧもＴＣＥと同一のＤＮＡ構築物中に存在する必要はな
い。

【図２】図２、配列番号：３３は、２つの転写ターミネーター配列を含む調節カセット
の合成ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列である。太字のヌクレオチドはイ
タリックで上方に示す制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含む。破線矢
印は、転写の間にＴのストリングによって推定ステム−ループを形成するρ独立
ターミネーター配列の二回対象の領域を示す。

【図３】図３、配列番号：３４は、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｔｅｔＭをコードす
る調節カセットのエレメントについての増幅ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド
配列である。太字のヌクレオチドはイタリックで上方に示す制限エンドヌクレア
ーゼに対する認識配列を含む。該ＤＮＡは、この図に示す上部から下部に転写お
よび翻訳が起こる、該遺伝子に対するコード鎖を表している。

【図４Ａ】図４Ａ、配列番号：３５は、エレメントに対する増幅ＤＮＡ配列のヌクレオチ
ド配列である。太字のヌクレオチドは、イタリックで上方に示す制限エンドヌク
レアーゼに対する認識配列を含む。該ＤＮＡは、この図に示す上部から下部に転
写および翻訳が起こる、該遺伝子に対するコード鎖を表している。

【図４Ｂ】図４Ｂ、配列番号：３６は、ｔｅｔＲ遺伝子の５'非翻訳領域からのさらなる配列を有する図４Ａのヌクレオチド配列である。太字のヌクレオチドは、イタリ
ックで上方に示す制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含む。該ＤＮＡは
、この図に示す上部から下部に転写および翻訳が起こる、該遺伝子に対するコー
ド鎖を表している。

【図５】図５、配列番号：３７は、ｔｅｔＯ配列と２の分岐転写プロモーターを含む調
節カセットの合成ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列である。太字のヌクレ
オチドは、イタリックで上方に示す制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を
含む。双方のＤＮＡ鎖の太字のヌクレオチドはｔｅｔＯ配列、テトラサイクリン
不存在下におけるｔｅｔリプレッサータンパク質に対する推定結合部位を表す。
ｔｅｔプロモーター（Ｐ_tet）よびｘｙｌプロモーター（Ｐ_xyl）の−３５および
−１０領域には、各々、下線および上線が引かれている。下部鎖の太字のＡＴＧ
は、ｔｅｔＲのオープンリーディングフレームの出発コドンを示す。

【図６ＡおよびＢ】図６Ａ（配列番号：３８）および図６Ｂ（配列番号：３９）は、レポーター遺
伝子ＢｌａＺをコードする調節カセット用の別の増幅ＤＮＡエレメントのヌクレ
オチド配列である。太字のヌクレオチドは、イタリックで上方に示す制限エンド
ヌクレアーゼに対する認識配列を含む。該ＤＮＡは、この図の上部から下部に転
写および翻訳が起こる、該ＤＮＡの非コード鎖を表している。図６Ａ（配列番号
：３８）は、カセットを染色体に組み込む構築に用いる配列を表す。図６Ｂ（配
列番号：３９）は、レポーター遺伝子を標的遺伝子の下流にクローン化する構築
に用いる配列を表す。

【図７ＡおよびＢ】図７Ａ、配列番号：４０は、伸長因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）の内因性構造遺伝子
に対して上流のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の染色体ＤＮＡに相同の増幅ＤＮＡのヌクレオチド配列である。図７Ｂ、配列番号
：４１は、ＥＦ−Ｔｕの構造遺伝子の５'末端に重複するスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の染色体ＤＮＡに相同の増幅ＤＮＡのヌクレオチド配列である。太字のヌクレオチドは、イタリックで上方に示す制限エ
ンドヌクレアーゼに対する認識配列を含む。

【図８ＡおよびＢ】図８Ａ、配列番号：４２は、ｆｅｍＡの内因性構造遺伝子に対して上流のスタ
フィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の染色体ＤＮＡに相同な増幅ＤＮＡのヌクレオチド配列である。図８Ｂ、配列番号：４３は、ｆｅｍＡ
の構造遺伝子の５'末端に重複するスタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloc
occus aureus）の染色体ＤＮＡに相同な増幅ＤＮＡのヌクレオチド配列である。
太字のヌクレオチドは、イタリックで上方に示す制限エンドヌクレアーゼに対す
る認識配列を含む。

【図９ＡおよびＢ】図９Ａ、配列番号：４４は、ｌｇｔの内因性構造遺伝子に対して上流のスタフ
ィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の染色体ＤＮＡに相同な増幅ＤＮＡのヌクレオチド配列である。図９Ｂ、配列番号：４５は、ｌｇｔの構
造遺伝子の５'末端に重複するスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcu
s aureus）の染色体ＤＮＡに相同な増幅ＤＮＡのヌクレオチド配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:445） 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:445） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 DA05 EA04 FA02 FA07 GA11 GA19 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ30 QQ98 QR32 QR39 QR60 QR69 QR75 QR80 QS05 QS24 QS28 QS38 4B065 AA53X AA53Y AB01 AC10 AC14 BA02 BA25 BB12 BB28 BB37 CA24 CA31 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物の遺伝子または遺伝子群を特徴付けできる方法であっ
て、ここに該遺伝子が遺伝子産物をコードし；ここに該遺伝子産物が遺伝子標的であり；ここに該遺伝子標的が哺乳動物に感染するかまたはそこに感染を持続させる微
生物の能力に重要であり、ここに該微生物が：遺伝子的に改変されて、該遺伝子的に改変された微生物によって産生された該
遺伝子産物の量がテトラサイクリン−制御可能なエレメントまたはＴＣＥによっ
て調節され制御されるように、遺伝子改変微生物になり；ここに該ＴＣＥが、テトラサイクリンに対する該微生物の暴露に応答して該遺
伝子の機能をモデュレート（modulate）するその能力を介して、標的遺伝子また
は遺伝子産物の発現を制御する遺伝子調節系であり、該ＴＣＥがテトラサイクリ
ン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列からなり；微生物タンパク質またはより一般的には微生物遺伝子産物をコードするいずれ
の遺伝子であってもよい該遺伝子が、該遺伝子改変微生物をテトラサイクリンに
暴露するか否かに応じてより多いか少ないかのいずれかの量の遺伝子産物を当該
遺伝子が産生するように該ＴＣＥによって調節され；該哺乳動物が、最初にテトラサイクリンに暴露され、該遺伝子改変微生物に感
染した複数の少なくとも２以上の哺乳動物であり；つづいて：テトラサイクリンに暴露した少なくとも１または１群の哺乳動物およびテトラ
サイクリンに暴露していない別の１または１群の哺乳動物が存在するように、該
哺乳動物の一部分に暴露したテトラサイクリンを取り除き；つづいて：テトラサイクリンに暴露されていない哺乳動物の感染症、微生物のレベル、ま
たは生理学的症状の程度と比較した、テトラサイクリンに暴露された哺乳動物の
感染症、微生物のレベル、または生理学的症状の程度を比較し；つづいて：哺乳動物に感染するかまたはそこにおいて感染症を持続する微生物の能力に重
要な該遺伝子を同定し、ここにテトラサイクリンに暴露されていない哺乳動部と
比較したテトラサイクリンに暴露された哺乳動物の比較が２群の動物の間に意味
のある差を示すことを特徴とする該方法。
【請求項２】該ＴＣＥがテトラサイクリンに対する該微生物の暴露に応答
して該遺伝子の機能をモデュレートするその能力を介して、標的遺伝子または遺
伝子産物の発現を制御する遺伝子調節系であって、該ＴＣＥがレポーター遺伝子
をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に結合した、テトラサイクリン−
制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列からなることを特徴とする
請求項１記載の方法。
【請求項３】該テトラサイクリン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌ
クレオチド配列が、原核生物転写プロモーターであることを特徴とする請求項２
記載の方法。
【請求項４】該ＴＣＥがテトラサイクリンに対する該微生物の暴露に応答
して該遺伝子の機能をモデュレートするその能力を介して、標的遺伝子または遺
伝子産物の発現を制御する遺伝子調節系であって、該ＴＣＥがレポーター遺伝子
（ＲＧ）および標的遺伝子（ＴＧ）をコードするポリヌクレオチド配列に作動可
能に結合した、テトラサイクリン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオ
チド配列からなることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】該レポーター遺伝子がβ−ラクタマーゼであることを特徴と
する請求項４記載の方法。
【請求項６】該微生物が、請求項１に記載の遺伝子改変に加えて、テトラ
サイクリン耐性（または保護）およびリプレッサーＤＮＡカセット（ＴＲＲＤＣ
）を含むさらなる遺伝子改変を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】該ＴＣＥがテトラサイクリンに対する該微生物の暴露に応答
して該遺伝子の機能をモデュレートするその能力を介して、標的遺伝子または遺
伝子産物の発現を制御する遺伝子調節系であって、該ＴＣＥがレポーター遺伝子
および標的遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に結合した、テ
トラサイクリン−制御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列からなり
、ここにＴＣＥ、ＴＲＲＤＣ、ＲＧおよびＴＧがすべて、調節ＤＮＡカセットま
たはＲＤＣということもできる、同一のＤＮＡカセット上に存在することを特徴
とする請求項６記載の方法。
【請求項８】ＴＲＲＤＣが構造遺伝子ｔｅｔＭ、構造遺伝子ｔｅｔＲを含
み、プロモーターがＴＣＥに作動可能に結合されていることを特徴とする請求項
６記載の方法。
【請求項９】該２群の動物間の意味のある差が、哺乳動物に存在する生存
率または微生物のレベルもしくは感染症のレベルにおける数学的有意差であるこ
とを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】該２群の動物間の意味のある差異が、群の動物の生存率に
おける数学的有意差であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】群の動物の生存率における有意差が、テトラサイクリンに
暴露された動物がテトラサイクリンに暴露されていない動物よりもより低い健康
状態、より高い感染率、より低い生存性またはより高いレベルの微生物を有する
ことを示すことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】該ＴＲＲＤＣのテトラサイクリン耐性遺伝子が、スタフィ
ロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子からの配列からなることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１３】該ＴＲＲＤＣの該テトラサイクリン・リプレッサー遺伝子
が、Ｔｎ１０トランスポゾン由来のものであることを特徴とする請求項１２記載
の方法。
【請求項１４】該Ｔｎ１０トランスポゾンが、配列番号：３５および３６
の配列から選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】該哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１記載
の方法。
【請求項１６】該組換え細菌がスタフィロコッカス（Staphylococcus）種
であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】該スタフィロコッカス種がスタフィロコッカス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】該微生物がウイルスであることを特徴とする請求項１記載
の方法。
【請求項１９】該微生物が下等真核生物であることを特徴とする請求項１
記載の方法。
【請求項２０】該微生物が酵母であることを特徴とする請求項１記載の方
法。
【請求項２１】組換えエレメント（ＲＥ）およびテトラサイクリン−制御
可能なエレメント（ＴＣＥ）を含み、原核生物染色体の所定の位置に外因性ポリ
ヌクレオチド配列を組み込んで内因性原核生物遺伝子を作動可能に制御するため
の単離ＤＮＡ分子であって、ここに該ＴＣＥがその５'末端において該ＲＥによって挟まれたテトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーター・ポリヌ
クレオチド配列を含み、該ＲＥが当該単離ＤＮＡ分子と原核生物染色体との間の
相同性組換えに十分な長さのさらなるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する該単離ＤＮＡ分子。
【請求項２２】さらに、該ＴＣＥに作動可能に結合したレポーター遺伝子
をコードするポリヌクレオチド配列を含む請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項２３】該レポーター遺伝子がベータ−ラクタマーゼであることを
特徴とする請求項２２記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項２４】さらに、ＲＥとＴＣＥとの間に位置する少なくとも１つの
原核生物転写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列を含む請求項２１記載の単
離ＤＮＡ分子。
【請求項２５】さらに、ＲＥとＴＣＥとの間に位置する原核生物転写プロ
モーター・ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合した原核生物テトラサイクリ
ン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請
求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項２６】該テトラサイクリン耐性タンパク質がスタフィロコッカス
・アウレウス（Staphylococcus auresu）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものであることを特徴とする請求項２５記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項２７】さらに、ＲＥとＴＣＥとの間に位置するテトラサイクリン
−制御可能な原核生物転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動可能に結
合した原核生物テトラサイクリン・リプレッサータンパク質をコードするポリヌ
クレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項２８】該テトラサイクリン・リプレッサーがＴｎ１０トランスポ
ゾン由来のｔｅｔＲ遺伝子であることを特徴とする請求項２７記載の単離ＤＮＡ
分子。
【請求項２９】宿主細胞の形質転換に好適な形態で請求項２１記載の単離
ＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
【請求項３０】請求項２９記載の組換えベクターを含む宿主。
【請求項３１】ＤＮＡ分子が宿主細胞染色体の所定の位置に組み込まれる
請求項２１記載のＤＮＡ分子を含む原核生物宿主細胞。
【請求項３２】該組換えエレメントが配列番号：４０、４１、４２および
４３から選択されるポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項２１記載
の単離ＤＮＡ分子。
【請求項３３】該組換えエレメントが配列番号：４４および４５から選択
されるポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ
分子。
【請求項３４】該テトラサイクリン−制御可能なエレメントがポリヌクレ
オチド配列番号：３７からなることを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分
子。
【請求項３５】さらに、該テトラサイクリン−制御可能なエレメントに作
動可能に結合したレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項３６】該テトラサイクリン−制御可能なエレメントがポリヌクレ
オチド配列番号：３７からなることを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分
子。
【請求項３７】該レポーター遺伝子がベータ−ラクタマーゼであることを
特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項３８】該レポーター遺伝子が配列番号：３８および３９から選択
されるベータ−ラクタマーゼであることを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮ
Ａ分子。
【請求項３９】テトラサイクリン耐性タンパク質がスタフィロコッカス・
アウレウス（Staphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものであることを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項４０】テトラサイクリン耐性タンパク質が、配列番号：３４から
選択されるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものであることを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子
。
【請求項４１】テトラサイクリン・リプレッサーが、Ｔｎ１０トランスポ
ゾン由来のｔｅｔＭ遺伝子であって、配列番号：３５および３６から選択される
ことを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項４２】さらに、テトラサイクリン−制御可能なエレメントと１つ
の組換えエレメントとの間に位置する少なくとも１つの原核生物転写ターミネー
ター配列（配列番号：３３）を含むポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とす
る請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項４３】さらに、転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動
可能に結合した原核生物テトラサイクリン耐性タンパク質をコードするポリヌク
レオチド配列を含むことを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項４４】さらに、転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動
可能に結合したテトラサイクリン・リプレッサータンパク質をコードするポリヌ
クレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項４５】宿主細胞の形質転換に好適な形態で請求項２１記載の単離
ＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
【請求項４６】順次融合した以下のＤＮＡエレメント：ａ）第１の原核生物転写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列；ｂ）第２の原核生物転写ターミネーター・ポリヌクレオチド配列；ｃ）原核生物テトラサイクリン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド
配列；ｄ）原核生物リプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；ｅ）第１のテトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーター・ポリヌ
クレオチド配列；ｆ）第２のテトラサイクリン−制御可能な原核生物転写プロモーター・ポリヌ
クレオチド配列；およびｇ）レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、標的ＤＮＡ分子の所定の位置にテトラサイクリン−制御可能なエレメン
ト（ＴＣＥ）を含むポリヌクレオチド配列を組み込むための単離ＤＮＡ分子であ
って；当該単離ＤＮＡ分子が、所定の位置における単離ＤＮＡ分子と標的ＤＮＡ
分子との間の相同性組換えに十分な長さのさらなるポリヌクレオチド配列によっ
て該レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の反対側の末端で
挟まれたＴＣＥを含むポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離ＤＮＡ
分子。
【請求項４７】宿主細胞の形質転換に好適な形態で請求項４６記載の単離
ＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
【請求項４８】ＤＮＡ分子が宿主細胞染色体の所定の位置に組み込まれて
いる請求項４６記載のＤＮＡ分子を含む原核生物宿主細胞。
【請求項４９】該組換えエレメントが、配列番号：４０、４１、４２およ
び４３から選択されるポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項４６記
載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５０】該組換えエレメントが、配列番号：４４および４５から選
択されるポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮ
Ａ分子。
【請求項５１】該テトラサイクリン−制御可能なエレメントがポリヌクレ
オチド配列番号：３７からなることを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮＡ分
子。
【請求項５２】さらに、該テトラサイクリン−制御可能なエレメントに作
動可能に結合したレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５３】該テトラサイクリン−制御可能なエレメントがポリヌクレ
オチド配列番号：３７からなることを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮＡ分
子。
【請求項５４】該レポーター遺伝子がベータ−ラクタマーゼであることを
特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５５】該レポーター遺伝子が配列番号：３８および３９から選択
されるベータ−ラクタマーゼであることを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮ
Ａ分子。
【請求項５６】該テトラサイクリン・リプレッサータンパク質がスタフィ
ロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものであることを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５７】該テトラサイクリン・リプレッサータンパク質が、配列番
号：３４から選択されるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）のｔｅｔＭ由来のものであることを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５８】該テトラサイクリン・リプレッサーがＴｎ１０トランスポ
ゾン由来のｔｅｔＲ遺伝子であって、配列番号：３５および３６から選択される
ことを特徴とする請求項４６記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５９】微生物遺伝子に作動可能に結合したテトラサイクリン−制
御可能な転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項６０】該テトラサイクリン−制御可能なエレメントがポリヌクレ
オチド配列番号：３７からなることを特徴とする請求項５９記載の単離ＤＮＡ分
子。
【請求項６１】さらに、該テトラサイクリン−制御可能なエレメントに作
動可能に結合したレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする請求項６０記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６２】該レポーター遺伝子がベータ−ラクタマーゼであることを
特徴とする請求項６１記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６３】該レポーター遺伝子が配列番号：３８および３９から選択
されるベータ−ラクタマーゼであることを特徴とする請求項６２記載の単離ＤＮ
Ａ分子。
【請求項６４】さらに、転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動
可能に結合したテトラサイクリン耐性（または保護）およびリプレッサーＤＮＡ
カセット（ＴＲＲＤＣ）をコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する請求項５９記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６５】さらに、転写プロモーター・ポリヌクレオチド配列に作動
可能に結合した、原核生物テトラサイクリン耐性（または保護）およびリプレッ
サーＤＮＡカセット（ＴＲＲＤＣ）をコードするポリヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする請求項６４記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６６】該テトラサイクリン耐性（または保護）およびリプレッサ
ーＤＮＡカセット（ＴＲＲＤＣ）がスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylo
coccus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものであることを特徴とする請求項６５記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６７】該テトラサイクリン耐性（または保護）およびリプレッサ
ーＤＮＡカセット（ＴＲＲＤＣ）が配列番号：３４からなるスタフィロコッカス
・アウレウス（Staphylococcus aureus）のｔｅｔＭ遺伝子由来のものであることを特徴とする請求項６６記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６８】該テトラサイクリン耐性（または保護）およびリプレッサ
ーＤＮＡカセット（ＴＲＲＤＣ）がＴｎ１０由来のテトラサイクリン・リプレッ
サーであることを特徴とする請求項６７記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６９】該テトラサイクリン耐性（または保護）およびリプレッサ
ーＤＮＡカセット（ＴＲＲＤＣ）が配列番号：３５および３６のポリヌクレオチ
ドから選択されるＴｎ１０由来のテトラサイクリン・リプレッサーであることを
特徴とする請求項６８記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項７０】宿主細胞の形質転換に好適な形態で請求項２１記載の単離
ＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
【請求項７１】請求項７０記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項７２】宿主細胞の形質転換に好適な形態で請求項４６記載の単離
ＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
【請求項７３】請求項７２記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項７４】宿主細胞の形質転換に好適な形態で請求項５９記載の単離
ＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
【請求項７５】請求項７４記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項７６】制御された量のテトラサイクリンまたはテトラサイクリン
・アナログを含む培地中で原核生物細胞を培養することを含む内因性原核生物遺
伝子の発現を調節するための方法。
【請求項７７】制御された量のテトラサイクリンまたはテトラサイクリン
・アナログを含む哺乳動物細胞で原核生物細胞を培養することを含む内因性原核
生物遺伝子の発現を調節するための方法。