JP2002508188A - 触媒性抗体によるアルドール縮合 - Google Patents

触媒性抗体によるアルドール縮合

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JP2002508188A
JP2002508188A JP2000539161A JP2000539161A JP2002508188A JP 2002508188 A JP2002508188 A JP 2002508188A JP 2000539161 A JP2000539161 A JP 2000539161A JP 2000539161 A JP2000539161 A JP 2000539161A JP 2002508188 A JP2002508188 A JP 2002508188A
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aldol
ketone
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カーロス エフ ザ サード バーバス
ロバート エイ ラーナー
グオフ ツォン
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes

Abstract

(57)【要約】 触媒性抗体（３８Ｃ２および３３Ｆ１２を含む）は、多様なケトン−ケトン、ケトン−アルデヒド、アルデヒド−ケトンおよびアルデヒド−アルデヒド分子間アルドール反応を触媒することができ、さらにいくつかの事例ではその後で脱水を触媒してアルドール縮合生成物を生成することができる。多数の分子内アルドール反応もまた特定された。調べた全ての分子内アルドール反応の触媒作用によって対応する縮合生成物が得られた。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、アルドラーゼ触媒性抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２の基質特異性、
合成範囲および有効性に関する。より具体的には、これらの抗体が、ケトン−ケ
トン、ケトン−アルデヒド、アルデヒド−ケトン、およびアルデヒド−アルデヒ
ド分子間アルドール付加反応を触媒することを示し、さらにいくつかの事例では
、その後に続く脱水反応を触媒してアルドール縮合生成物を生じることを示す。
分子間アルドール反応のための基質もまた特定される。
【０００２】
【従来技術】
アルドール反応は、合成的変換で用いられる最も重要なＣ−Ｃ結合生成反応の
１つであることは疑いのないことであろう。伝統的に、アルドール反応は不整合
成方法開発のための実験場であった。１９８０年代には、アルドール反応は、高
度に立体選択的アルドールを生じる多数の方法の開発についてルネッサンスを経
験した（アルドール反応の概論については以下を参照されたい：C.H. Heathcock
, in Asymmetric Synthesis, J.D. Morrison ed., Academic Press, New York,
Vol.3(1984); Evans et al. Topics in Stereochemistry 1982, 12, 1; Masamun
e et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1985, 24, 1; Heathcock et al. Aldri
chim. Acta 1990, 23, 99; C.H. Heathcock, Science 1981, 214, 395;D.A. Eva
ns, 同書, 1988, 240, 420; Masamune et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19
85, 24, 1; D.A. Evans, J.V. Nelson, T.R. Taber, Top Stereochem. 1982, 13
, 1; C.H. Heathcock et al. in Comprehensive Organic Synthesis, B.M. Tros
t Ed.(Pergamon, Oxford, 1991), Vol.2, pp.133-319; I. Peterson, Pure Appl
. Chem. 1992, 64, 1821) 。
【０００３】 一般に、これは化学量論的な数量のキラル補助物質をもちいることによって最
も効果的に達成された。ここ数年、アルドール反応の立体選択的触媒デザインが
興味の中心であった。これらのアプローチのうちで最も注意をひくものはカーレ
イラ（Carreira）アルドール反応で、この反応では、キラルＴｉ（ＩＶ）複合体
（２−１０ｍｏｌ％）は、アルデヒドへの２−メトキシプロペンの鏡像選択的付
加を６６−９８％ｅｅで触媒する（A. Yanagisawa, Y. Matsumoto, H. Nakashim
a, K. Asakawa, H. Yamamoto, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9319 およびその
中に引用されている文献; T. Bach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33, 4
17およびその中に引用されている文献; Y.M.A. Yamada, N. Yoshikawa, H. Sasa
i, M. Shibasaki, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 1871; (b)E.M. Car
reira, W. Lee, R.A. Singer, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3649)。
【０００４】 慣習的有機合成方法に対するチャレンジとして合成触媒として天然のアルドラ
ーゼ酵素を利用することによって、立体化学的に複雑な分子について多くの効率
のよい合成が特に炭水化物の合成領域でもたらされた。いずれの不斉触媒もそれ
ぞれの合成チャレンジを満足させるために必要な範囲の反応性を示さないので、
不斉触媒の開発を可能にする方法論が要求されている。これは、酵素系触媒と同
様に遷移金属系触媒でも言えることである。例えば、カーレイラＴｉ（ＩＶ）複
合体はエノラート同等物の２−メトキシプロペンの使用範囲を限定されているが
、フルクトース１，６−ジホスフェートアルドラーゼは、アルドール供与体基質
としてジヒドロキシアセトンホスフェートの使用を制限されている（H.J.M. Gij
sen, L. Qiao, W. Fitz, C.-H. Wong, Chem. Rev. 1996, 96, 443; (b)C.-H. Wo
ng, R.L. Halcomb, Y. Ichikawa, T. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34,
412-432; (b)I. Henderson, K.B. Sharpless, C.-H. Wong, J. Am. Chem. Soc.
1994, 116, 558; (c)C.-H. Wong, G.M. Whitesides, Enzymes in Synthetic Org
anic Chemistry(Pergamon, Oxford, 1994); M.D. Bednarski, in Comprehensive
Organic Synthesis, B.M. Trost Ed.(Pergamon, Oxford, 1991), vol.2, 455;H
.J.M. Gijsen, C.-H. Wong, 同書, 1995, 117, 2947;C.-H. Wong et al. 同書,
1995、 117、 3333; L. Chen, D.P. Dumas, C.-H. Wong, 同書, 1992, 114, 741
）。
【０００５】 アルドール反応の蛋白質触媒の新規生成の問題を考えるために、我々は最近２
つのアルドラーゼ触媒抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２の開発を報告した。これら
の抗体はβ−ジケトンのハプテン１に対して作製された（このハプテンは抗体の
活性部位でリジン依存Ｉ型アルドラーゼメカニズムを刻印する化学的トラップと
して作用する）。免疫時の抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２の選別過程について提
唱されたメカニズムは図６に示されている。リジン残基のε−アミノ基は１のβ
−ジケトン部分のカルボニル官能基と反応し、β−ケトヘミアミナルを生成し、
続いて脱水されてβ−ケトイミンを生じ、これは最終的に互変異性化により安定
なエナミノン２を生じる。したがって、このハプテンは今や共有結合によって結
合ポケット内で結合している。この化学量論的反応とＩ型アルドラーゼ酵素の認
容されているエナミンメカニズムとの間のメカニズム的類似性は別のところで詳
細に考察されている（J. Wagner, R.A. Lerner, C.F. Barbas III, Science 199
5, 270, 1797; (b)G. Zhong, T. Hoffmann, R.A. Lerner, S. Danishefsky, C.F
. Barbas III, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8131; (c)C.F. Barbas III, A.
Heine, G. Zhong, T. Hoffmann, S. Gramatikova, R. Bjｏrnestedt, B. List,
J. Anderson, E.A. Stura, E.A. Wilson, R.A. Lerner, Science 1997, 278, 20
85)。
【０００６】 エナミノンの生成はＵＶ分光法によってモニターし（ハプテン１：ｌｍａｘ＝
３１８ｎｍ、ε〜１５０００）、抗体がハプテン１または他のジケトン（例えば
２，４−ペンタンジオンまたは３−メチル２，４−ペンタンジオン）とともに保
温されたかどうかに応じて数秒から数分以内に完了する。抗体３８Ｃ２および３
３Ｆ１２は、分子内アルドール反応（この反応は、我々の最近のウィーランド−
ミーシャー（Wieland-Miescher）ケトンの抗体触媒合成を可能にする）と同様に
、いくつかの脂肪族ケトン供与体と２つの異なるアルデヒド受容体（これはβ位
に４−アセトアニリドをもつ）とのアルドール反応を触媒することが以前に示さ
れた(Zhong et al. 同書）。さらにまた、両抗体は、リジン残基のε−アミノ基
と基質のケト基との間でのシッフ塩基生成により芳香族β−ケト酸の脱カルボキ
シル反応を触媒することが認められた（R. Bjｏrnestedt, G. Zhong, R.A. Lern
er, C.F. Barbas III, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11720）。
【０００７】 必要とされるものは、多様な基質について多くのアルドール付加反応を触媒し
、所望の鏡像体を生成させることができ、さらにいくつかの事例ではその後でそ
れら鏡像体の脱水を触媒してアルドール縮合生成物を生じる抗体である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルドール縮合反応およびレトロアルドール反応を触媒するために
触媒性抗体を使用することに関する。 本発明の特徴の１つは、β−ヒドロキシケトンを生成するためにアルドール供
与基質とアルドール受容基質との間でアルドール縮合を触媒する方法に関する。
アルドール付加活性をもつ触媒性抗体の触媒的に有効な量、または触媒性抗体の
抗体結合部位部分を含む触媒として活性な分子の触媒的に有効な量を、反応媒体
中で十分な量のアルドール供与基質およびアルドール受容基質と混合して反応混
合物を生成する。アルドール供与基質は、反応性カルボニル基および当該カルボ
ニル基と隣接する非分枝炭素を含むタイプに属する。触媒性抗体または触媒とし
て活性な分子は、アルドール供与基質の反応性カルボニル基とともにシッフ塩基
中間体を形成するリジン残基を含むタイプに属する。続いて、触媒性抗体または
触媒として活性な分子が、アルドール供与基質とアルドール受容基質との間でア
ルドール縮合反応を触媒しβ−ヒドロキシケトンを生成するために十分な時間、
上記の反応混合物を維持する。アルドール供与基質は、ケトン供与基質またはア
ルデヒド供与基質のどちらかである。アルドール受容基質は、ケトン受容基質ま
たはアルデヒド受容基質のどちらかである。しかしながら以下の条件が適用され
る：アルドール供与基質がケトン供与基質であり、さらにアルドール受容基質が
アルデヒド受容基質である場合は、ケトン供与基質は、官能基をもたない開放鎖
脂肪族ケトンではない。本発明のこの特徴における好ましい態様では、アルドー
ル受容基質はアルデヒド受容基質で、アルドール供与基質は、脂肪族環式ケトン
、官能基を有する開放鎖脂肪族ケトンおよび官能基を有する環式ケトンから成る
群から選ばれるケトン供与基質である。アルドール縮合は分子間でも分子内でも
よい。それが分子内のものである場合は、アルドール供与基質およびアルドール
受容基質の両方が単一反応物分子を形成し、アルドール縮合はこの単一反応物分
子を環状化させ、環式β−ヒドロキシケトンを生成する。これらの基質は混成で
もよく（すなわち供与体および受容体は互いに異なっている）、または同種でも
よい（すなわち供与体および受容体は全く同じもので、単一ケトン反応物分子で
ある）。
【０００９】 場合によっては、上記の方法に付加工程を付け加えてもよい。この場合、上記
の反応混合物は、触媒性抗体または触媒として活性な分子の存在下でさらなる時
間維持され、脱離反応によってβ−ヒドロキシケトンがβ−不飽和ケトン生成物
に変換される。 また別には、異なる付加工程を上記の方法に加えることができる。この場合、
還元によってβ−ヒドロキシケトンはジヒドロキシ生成物に変換される。
【００１０】 本発明のまた別の態様では、アルドール供与基質は以下の構造によって表され
る：
【００１１】
【化７】
【００１２】 アルドール受容基質は以下の構造によって表される：
【００１３】
【化８】
【００１４】 β−ヒドロキシケトンは以下の構造によって表される：
【００１５】
【化９】
【００１６】 上記の構造で、Ｒ1は（ＦＧ）−アルキル、（ＦＧ）−アルケニルおよび（ＦＧ ）−アリールから成る群から選ばれるラジカルで；Ｒ1はＨ、ＯＨおよびＦから 成る群から選ばれるラジカルで；ＸはＮＣＨ3、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2およびＣ6Ｈ4から
成る群から選ばれるラジカルで；ＦＧはＯＨおよびＯＣＨ3から成る群から選ば れるラジカルである。
【００１７】 本発明の別の特徴は、アルドール供与基質とアルドール受容基質との間でアル
ドール縮合を触媒してβ−ヒドロキシケトンを生成するまた別の方法に関する。
アルドール供与基質は、ケトン供与基質またはアルデヒド供与基質のどちらかで
ある。アルドール受容基質は、ケトン受容基質またはアルデヒド受容基質のどち
らかである。アルドール付加活性をもつ触媒性抗体の触媒的に有効な量、または
触媒性抗体の抗体結合部位部分を含む触媒として活性な分子の触媒的に有効な量
を、反応媒体中で十分な量のアルドール供与基質およびアルドール受容基質と混
合して反応混合物を生成する。触媒性抗体または触媒として活性な分子は、アル
ドール供与基質とともにシッフ塩基中間体を形成するリジン残基を含むタイプに
属する。アルドール供与基質は結合を生成しないα位で分枝していない。、触媒
性抗体または触媒として活性な分子がアルドール供与基質とアルドール受容基質
との間でアルドール縮合反応を触媒してβ−ヒドロキシケトンを生成し、離脱反
応によってβヒドロキシケトンをβ−不飽和ケトン生成物に変換するために十分
な時間上記の反応混合物を維持する。
【００１８】 本発明のまた別の特徴は、レトロアルドール反応を触媒してβ−ヒドロキシケ
トンを一次または二次カルボニル生成物に変換する方法に関する。一次および二
次カルボニル生成物はそれぞれ別個にケトン生成物またはアルデヒド生成物のど
ちらかである。触媒として有効な量のアルドール付加活性をもつ触媒性抗体、ま
たは触媒として有効な量の触媒性抗体の抗体結合部位部分を含む触媒として活性
な分子を、反応媒体中でβ−ヒドロキシケトンと混合し反応混合物を生成する。
触媒性抗体または触媒として活性な分子は、第一のカルボニル生成物とともにシ
ッフ塩基中間体を形成するリジン残基を含むタイプに属する。この第一のカルボ
ニル生成物はα位で分枝していない。続いて、触媒性抗体または触媒として活性
な分子が、レトロアルドール反応を触媒してβ−ヒドロキシケトンを第一および
第二のカルボニル生成物に変換するために十分な時間上記の反応混合物を維持す
る。本発明のこの特徴のべつの態様では、第一および第二のカルボニル生成物の
各々はケトン生成物でもよい。本発明の別の態様では、第一および第二のカルボ
ニル生成物は各々アルデヒド生成物である。本発明のさらに別の態様では、第一
のカルボニル生成物はアルデヒド生成物で、第二のカルボニル生成物はケトン生
成物である。β−ヒドロキシケトンは環状で、したがってレトロアルドール反応
はβ−ヒドロキシケトンを開環して、単一生成分子として第一および第二の両カ
ルボニル生成物を含むただ１つの開放鎖生成物を形成する。本発明のこの特徴の
別の態様では、レトロアルドール反応は逆方向のアルドール自己縮合で、この場
合、第一および第二のカルボニル生成物は互いに同一である。本発明のこの特徴
の好ましい実施態様では、β−ヒドロキシケトンは下記の構造によって表される
：
【００１９】
【化１０】
【００２０】 第一のカルボニル生成物は以下の構造によって表される：
【００２１】
【化１１】
【００２２】 第二のカルボニル生成物は以下の構造によって表される：
【００２３】
【化１２】
【００２４】 上記の構造で，Ｒ1は（ＦＧ）−アルキル、（ＦＧ）−アルケニルおよび（ＦＧ ）−アリールから成る群から選ばれるラジカルで；Ｒ1はＨ、ＯＨおよびＦから 成る群から選ばれるラジカルで；ＸはＮＣＨ3、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2およびＣ6Ｈ4から
成る群から選ばれるラジカルで；さらにＦＧはＯＨおよびＯＣＨ3から成る群か ら選ばれるラジカルである。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アルドラーゼ触媒性抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２の基質特異性、
合成範囲および有効性に関する。これらの抗体は、天然のクラスＩアルドラーゼ
酵素に共通のエナミンメカニズムを利用する。これらの触媒のための基質、２３
種の供与体および１６種の受容体を特定した。検査した全てのアルデヒドは、ポ
リヒドロキシル化アルデヒドを除いてこれらの抗体にとって基質となったので、
アルドール受容体の特異性は、ここで規定したものよりもはるかに広いと予想さ
れる。３８Ｃ２および３３Ｆ１２は、分子間ケトン−ケトン、ケトン−アルデヒ
ド、アルデヒド−ケトンおよびアルデヒド−アルデヒドアルドール付加反応を触
媒し、いくつかの事例では、その後脱水してアルドール縮合生成物を生じること
が明らかとなった。分子内アルドール反応のための基質もまた特定した。アルド
ール供与基質としてアセトンを用いて、新しい立体中心が、ほとんどの事例で９
５％を越えるｅｅでアルデヒドのｓｉ−面上の攻撃によって形成される。供与基
質としてヒドロキシアセトンを用いたとき攻撃はｒｅ−面で発生し、α−ｓｙｎ
構造の２つの立体中心をもつα，β−ジヒドロキシケトンが７０から＞９８％の
ｅｅで生成される。フルオロアセトン供与体反応では、主要生成物は、ｓｙｎα
−フルオロ−β−ヒドロキシケトンでｅｅは９５％である。レトロアルドール反
応の研究によって、これらの抗体は、単純なアミン触媒反応と比較して１０８倍
強化された効率を提供することが示された。
【００２６】
【実施例】
実施例１．顕著な範囲をもつアルドラーゼ抗体 抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２について、我々は４つの問題点に注目した：ｉ
）分子内アルドールと同様に分子間交差アルドールおよび自己アルドールのため
の基質の範囲と制限、ｉｉ）それらの立体特異性、ｉｉｉ）結合ポケットの性質
を理解するためにこれらの反応に関する動態パラメーター、およびｉｖ）これら
の触媒に関する理解を深めるために付加機構の研究。
【００２７】 交差アルドール反応：交差アルドール反応に対する抗体触媒３８Ｃ２および３
３Ｆ１２の範囲を特定するために、供与体として種々の市販ケトンおよび受容体
として異なる６つのアルデヒドを含む１セット（４−アセトアミドベンズアルデ
ヒド、３；３−（４'−アセトアミドフェニル−）プロパノール、４；３−（４'
−アセトアミドフェニル）−２−メチルプロパナール、５；４−（４'−アセト アミドフェニル）ブタナール、６；４−ニトロベンズアルデヒド、７；および４
−ニトロシンナムアルデヒド、８：図１）を調べた。供与体活性をスクリーニン
グするために、アルデヒド４を標準受容体アルデヒドとして選択した。これは、
アルデヒド４がＣ３に４−アセトアミドフェニル基をもつためである。分子のこ
の部分はハプテン構造１と密接な関係を有し、おそらく抗体によって特異的に認
識されるであろう。
【００２８】 比較を容易にするために、以下の限定条件下でのこれらの反応の比速度を求め
た：供与体１Ｍ、アルデヒド４５００ｍＭおよび抗体０．４モル−％。図１３に
示すように、種々の異なるケトンがアルデヒド４とアルドール反応を起こした。
これは、別個に化学的に合成した以下の標準物質とともに高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いたときの生成物の保持時間の比較によって証明された
：脂肪族開放鎖（アセトン、ブタノン、２−ペンタノンおよび３−ペンタノン）
、脂肪族環式（シクロペンタノンおよびシクロヒキサノン）、官能基をもつ開放
鎖（ヒドロキシアセトンおよびフルオロアセトン）および官能基をもつ環式（２
−ヒドロキシシクロヘキサノン）ケトン。極めて多様な他のケトンもまたアルデ
ヒド４を用いて調べ、４の消費およびβ−ヒドロキシケトン生成物として試験的
に割り当てた新しいピークの出現をモニターした。全実験の基質ケトンは図１４
に要約した。抗体触媒アルドール反応は、等モル量のハプテン１または２，４−
ペンタンジオンの添加によって抑制された。さらに別のコントロール実験をリジ
ンまたは抗体の代わりにウシ血清アルブミンを用いて実施した。これらの事例で
は本明細書で解明しようとしているアルドール触媒反応は観察されなかった。多
数のケトン（例えばオクタノン）は水性媒体中では限定的な可溶性を示し、これ
はおそらくそれらの触媒としての利用可能性を妨げるであろう。混合溶媒系によ
る更なる実験によって、このような基質が触媒によって受容される条件の特定が
可能になるであろう。調べたケトンのうちで、供与体としてヒドロキシアセトン
を含む反応が最も効率的であった。
【００２９】 物理化学的に非常に異なるこれらのケトンに対する抗体３８Ｃ２の驚くほど高
い無差別性は、供与体の構造における小さな変化（もし存在するとして）に耐え
る天然のアルドラーゼとは極めて対照的である（H.J.M. Gijsen, L. Qiao, W. F
itz, C.-H. Wong, Chem. Rev. 1996, 96, 443;(b)C.-H. Wong, R.L. Halcomb, Y
. Ichikawa, T. Kajimoto, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 412-432;(
b)I. Hemderson, K.B. Sharpless, C.-H. Wong, J. Am. Chem. Soc. 1994,116.5
58;(c)C.-H. Wong, G.M. Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistr
y(Pergamon, Oxford, 1994); M.D. Bednarrski, in Comprehensive Organic Syn
thesis, B.M. Trost, Ed(Pergamaon, Oxford, 1991), Vol.2, 455; H.J.M. Gijs
en, C.-H. Wong, 同書, 1995, 117, 2947;C.-H. Wong et al. 同書, 1995, 117,
3333; L. Chen, D.P. Dumas, C.-H. Wong, 同書, 1992, 114, 741）。
【００３０】 次に、我々は、受容体アルデヒドに対する特異性の範囲を明らかにしようとし
た。図１３に挙げた多様なケトンから代表的な供給体としてアセトン、シクロペ
ンタノンおよびヒドロキシアセトンを選択し、アルデヒド３および５−８（図１
）とのアルドール反応でこれらを調べた。再度、同一の条件（上記に記載したと
おり）を対応する比速度の決定に用いた（図１５）。全ての基質の組み合わせで
予想した生成物が得られた。単純な脂肪族アルデヒド受容体は下記に記載した（
雑多なアルドール反応の項を参照のこと）。種々のポリヒドロキシル化受容体ア
ルデヒド、グリセルアルデヒド、グルコース、およびリボースも調べた。これら
の基質はこれらの抗体によって受容されず、これはおそらくその活性部位の疎水
性のためであろう。下記で述べる実験と合わせてこれらの実験は、疎水性アルデ
ヒドには制限はあるが、受容体の特異性は非常に広いことを示唆している。
【００３１】 この触媒系についてより詳細な情報を得るために、我々は報告された反応のい
くつかを選び、供与体または受容体のどちらかの基質濃度を変えながら、一方第
二の反応物の濃度を一定に保って初速を調べた。アルデヒド４−８との全ての反
応は、偽一次キネティクスにしたがってデータを処理することによって典型的な
ミハエリス−メンテンのキネティクスにしたがった。一般に、基質または生成物
抑制は認められなかった。４−アセトアミドベンズアルデヒド（３）をより高濃
度（２ｍＭおよびそれ以上）で用いたとき基質抑制が認められたが、これは、お
そらく活性部位とアルデヒド間の可逆性シッフ塩基形成のためであろう。供与体
のミハエリス定数Ｋmの典型的な値は１ｍＭから１Ｍの範囲で、極めて多様な種 々のケトンを受容する抗体の能力を反映している。受容体３−８のＫmの値は１ ０から５００ｍＭの範囲である。明らかに、これらの分子の芳香族部分は活性部
位による識別の強化に必要である。Ｋcatの特徴的な値は１０-3から１分-1で、 Ｋcat／Ｋuncatの比は１０５対１０７であることを示している（更なる動態学的
データについては下記参照）。全てのデータは抗体の１つの活性部位について報
告されている（抗体分子は２つの活性部位をもつ）。
【００３２】 自己アルドール反応：研究の過程で、我々はまた、抗体３８Ｃ２および３３Ｆ
１２は自己アルドール反応を触媒することができるかどうかという問題に注目し
た。自己アルドール化はプロピオンアルデヒド、アセトンおよびシクロペンタノ
ンで認められたが、化合物４−６では観察されなかった（図１６）。さらにまた
、比較を容易にするために、以下の限定条件を用いて比速度を求めた：ケトンま
たはアルデヒド０．１Ｍ、抗体０．００５モル−％。これらの基質により抗体は
、以下の２つの連続工程から成るアルドール縮合反応を触媒した：アルドール付
加およびその後に続く水の除去。基質としてプロピオンアルデヒドを用いたとき
、アルドール付加生成物である３−ヒドロキシ−２−メチルペンタナールは中間
体として検出されなかったが、もっぱらトランス−２−メチル−２−ペンタナー
ル（３３）が検出され、水の除去も触媒されたことを示唆した（下記参照）。単
一生成物として化合物３３が得られたが、第三のプロピオンアルデヒド分子との
連続アルドール付加反応のための基質ではない。興味深いことには、化合物３３ は、アセトンが供与体として用いられる場合は受容体として働く（雑多なアルド
ール反応の項参照）。交差アルドール反応のためのアルデヒド受容体（これは活
性部位に優先的に結合する）が存在しない場合は、アセトン自体およびシクロペ
ンタノンは自己縮合を受け、それぞれメシチルオキシド３４および化合物３５を
生じる。これらのケトン自己アルドール反応は実質的に緩慢で、上記のこれら供
与体を必要とする交差アルドール反応よりも典型的には５００倍以上も緩徐であ
る。供与体としてアセトンまたはシクロペンタノンを用いる上記の交差アルドー
ル反応では、アセトン−アセトンおよびシクロペンタノン−シクロペンタノン自
己縮合生成物は観察されなかった。したがって、交差アルドール反応における自
己アルドール化活性は交差アルドール生成物の単離を損なうことはない。上記で
述べた自己アルドール縮合反応の一般的なメカニズムを説明するために、我々は
基質としてシクロペンタノンを選択し、アルドール付加生成物３６およびその除
去生成物３５の出現をＨＰＬＣおよびガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって
モニターした。さらに、抗体３８Ｃ２を別個に合成した中間体３６と保温し、３ ５ の出現をＨＰＬＣによってモニターした。実際、両反応工程が触媒され、アル
ドール付加が除去工程よりも速く進行した。シクロペンタノンから３５への全体
的変換の動態実験によって、Ｋm＝８４５ｍＭ、Ｋcat＝２ｘ１０-4分-1であるこ
とが示された。３６から３５への除去反応もミハエリス−メンテンキネティクス
に従った（Ｋm＝７５０ｍＭ、Ｋcat＝９ｘ１０-4分-1およびＫcat／Ｋuncat＝２
２４０）。
【００３３】 これらの実験から、我々は図７に示したシクロペンタノンの自己アルドール縮
合反応のメカニズムを提唱する（経路１）。β−ヒドロキシイミニウム陽イオン
（第二のシクロペンタノン分子のカルボニルＣ原子でのシクロペンタノンのエナ
ミンの攻撃後に活性部位で形成される）は、一部分がβ−ヒドロキシエナミン中
に失われた後で互変異性化され、続いて水を失う。この過程は、エナミンの窒素
原子からの電子の供与によって補助される（D.J. Hupe, M.C.R. Kendall, T.A.
Spencer, J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 2271)。α，β−不飽和イミニウム陽イ
オンは最終的に加水分解され、アルドール縮合生成物３５が遊離され、一方、抗
体３８Ｃ２のリジン残基は再び触媒サイクルに入る。
【００３４】 除去工程が遊離３６を介してバックグラウンドで発生するまた別のメカニズム
も図７に示すが（経路２）、この可能性はもっと低いように思われる。なぜなら
ば除去は抗体３８Ｃ２によって触媒され、アセチルアセトンによって抑制された
からである。抗体が存在しない場合シクロペンタノンから３５への完全な変換に
対するバックグラウンド反応は、２箇月間という長期の保温の後で観察されなか
った。
【００３５】 分子内アルドール縮合：分子内アルドール反応を解明するために、３８Ｃ２を
３つの異なる脂肪族ジケトン（２，４−ヘキサンジオン（３７）、２，５−ヘプ
タンジオン（３９）および２，６−オクタンジオン（４１))（図８）とともに保
温した。３７から３−メチルシクロペント−２−エノン（３８）への反応経路で
は触媒作用は認められなかった。これは、おそらく基質３７のＣ２でのエナミン
の攻撃で中心的に関与するボルドウィン７不適性５（エノレンド−トリグ）（Ba
ldwin 7 disfavored 5(enolendo-trig))プロセスのためであろう。３−メチルシ
クロヘプト−２−エノン（４２）を生じる、４１の対応する閉環（水の除去がそ
の後に続く）はボルドウィン適性（７（エノレンド−トリグ）プロセス）である
が、この事例でもまた生成物の形成は観察されなかった。対照的に、２，５−ヘ
プタンジオン（３９）のボルドウィン適性閉環反応（６（エノレンド−トリグ）
プロセス）（これは続いて水が除去され、３−メチルシクロヘキス−２−エノン
（４０）を生じる）は抗体３８Ｃ２によって触媒された。
【００３６】 生成物４０（これはダグラス＝ファービートル８の性フェロモンである）の出
現をＨＰＬＣによってモニターした。この反応はミハエリス−メンテンキネティ
クスにしたがい（図１７）、卓越した加速を示した。さらにまた対応する中間体
、３−ヒドロキシ−３−メチルシクロ−ヘキサノンと抗体を保温した。シクロペ
ンタノンの自己アルドール縮合でみられるように、４０を生じる除去工程もまた
抗体３８Ｃ２によって触媒された。報告した実験、４ｂでは、我々は基質として
トリケトン４３および鏡像体として純粋なジケトン（Ｓ）−４５および（Ｒ）− ４５ （図９）を調べた。全ての事例で生成物の形成（それぞれウィーランド−ミ
ーシャーケトン（Ｓ）−４４並びにケトン（Ｓ）−４６および（Ｒ）−４６）が
３８Ｃ２によって触媒され、基質として単純なジケトン３９を用いたときに認め
られる速度に匹敵する速度で進行した。全ての反応がミハエリス−メンテンキネ
ティクスにしたがった。それらのパラメーターは図１７にまとめられている。我
々はまた、これらの抗体の潜在的基質として２−メチル−２−（３'オキソペン チル）−１，３−シクロヘキサンジオン、２−メチル−２−（３'オキソブチル ）−１，３−シクロペンタンジオン、および２−メチル−２−（４'オキソペン チル）−１，３−シクロヘキサンジオンを調べたが、これらの基質との反応は観
察されなかった。
【００３７】 雑多なアルドール反応：上記で述べたように、２分子の自己アルドール縮合は
縮合工程後に終了する。生成物、トランス−２−メチル−２−ペンテナール（３ ３ ）は、第三の分子、プロピオンアルデヒドのその後のアルドール付加（または
縮合）のための基質ではない。対照的に、アルデヒド３３は、アセトンが供与体
として存在する場合は基質となる（図１０）。驚くべきことに、生成物４７の水
の除去はこの抗体によって触媒されないが、しかし熱力学的に有利なα，β，γ
，δ−不飽和ケトンは生成されるであろう。結合ポケットもまた、２，４−ヘキ
サジエナール（４８）で示されるようにこの受容体構造で鎖の伸長を許容する。
生成物４７から分かるように、抗体はまた、アルドール付加生成物４９の水の除
去も触媒しない。我々はまた、プロピオンアルデヒドが他のアルデヒドのための
供与体となるか否かを調べた。プロピンアルデヒドは結合ポケットに優先的に結
合し、さらに生成物としてβ−ヒドロキシアルデヒド（水の除去後に）、または
α，β−不飽和アルデヒドを生成するであろう。自己アルドール付加を抑えるた
めに、低濃度の供与体および高濃度の受容体アルデヒドを用いた。興味深い状態
がアセトアルデヒドに関して観察された。それは受容体として単独で作用し、供
与体のプロピオンアルデヒドとともに２−メチル−２−ブテナール（５０）を生
成することが分かった。逆方向反応（供与体としてアセトアルデヒド、受容体と
してプロピオンアルデヒド）の交差アルドール縮合生成物である２−ヘキセナー
ルは検出されなかった。
【００３８】 図１８に示したように、この抗体は、単純な脂肪族アルデヒドが受容基質とし
て作用する交差アルドール反応を触媒する。生成物５３を生じるシクロペンタノ
ンとペンタナールとの間の交差アルドール反応は、非常に効率的であることが証
明され、動態実験によってＫcatは１．１分-1で、ペンタノールのＫmは３．９ｍ
Ｍであることが明らかになった。ペンタナールはまた、供与体としてヒドロキシ
アセトンと対にしたとき非常に効率的な受容体であった。ペンタナール誘導生成
物５５および５６を伴うレトロアルドール反応も触媒された。
【００３９】 アルドール生成物の立体特異性および絶対配置：アルドラーゼも抗体３８Ｃ２
および３３Ｆ１２も高度に立体選択的なアルドール反応を触媒する。一般的ルー
ルとして、アセトンはアルデヒドにｓｉ−面の選択性を付加し、一方、ヒドロキ
シアセトンに関しては鏡像面選択性の逆転がｒｅ−面への付加をもたらす。生成
物は＞９９％のｅｅで形成される（図１９）。ｅｅはキラルＨＰＬＣおよびキラ
ルＧＣで求めた。絶対配置を割り当てるために、生成物を２つの方法のどちらか
で合成した。アセトン生成物の場合は、Patersonら（Tetrahedron 1990, 46, 46
63）が開発した方法を用いた。この方法は、ジイソピノカンフェニルエノールボ
リエート（in situで（−）−Ｉｐｃ2ＢＯＴｆから調製）およびアセトンを用い
る。ヒドロキシアセトン生成物は、対応するα，β−不飽和ケトンからシャープ
レス（Sharpless)の不整ジヒドロキシル化（Kolb et al. Chem. Rev. 1994, 94,
2483; P.J. Walsh, K.B. Sharpless, Synlett 1993, 605）を介して調製された
。
【００４０】 最高の鏡像選択性が、共役アルデヒド（アリルアルデヒドまたはベンジルアル
デヒド）が受容体としてアセトンが供与体として働くアルドール反応で認められ
た。これらの事例では、観察された鏡像選択性はいずれの抗体触媒でも常に９８
％ｅｅを越えた。より低い鏡像選択性は、α位にｓｐ３中心を含むアルドール受
容体で観察されたが、ただし鏡像選択性は、化合物２１で提唱されたようにこの
炭素中心に立体的かさばりを付加することによって高めることができる。このク
ラスの受容体に関しては、２つの触媒がそれぞれ異なる程度の立体選択性を示し
た。もっとも低い鏡像選択性は、受容体として４−（４'−アセトアミドフェニ ル）ブチルアルデヒドおよび供与体としてアセトンを用いて得られ、化合物２４ が生成された。この事例でのｅｅは、触媒３８Ｃ２および３３Ｆ１２でそれぞれ
２０％および３％である。供与体、受容体および触媒は全てこの反応の鏡像選択
性に対する影響を示している。なぜならば、４−（４'−アセトアミドフェニル ）ブチルアルデヒドとの反応でアセトンの代わりにアルドール供与体としてヒド
ロキシアセトンを使用することによって、生成物５８が７７％のｅｅで生成され
るからである。ヒドロキシアセトンのどちらかのα位における結合形成に関する
この反応の局所部位選択性（regioselectivity）は完全である。ヒドロキシアセ
トンのαヒドロキシ保有部位での反応によって生じた生成物のみが検出された。
３８Ｃ２によって触媒されたアルデヒド４とのフルオロアセトンの反応実験でも
、フルオロアセトンのα置換炭素を指向する結合形成の局所部位選択性が示され
た。しかしながら７％の他のレジオ異性体６０も単離された（図１１）。ｓｙｎ
−１６は単離生成物の７２％を構成し９５％のｅｅで生成され、一方、ａｎｔｉ
−１６は単離生成物の２１％を構成し３４％のｅｅで生成された。これら生成物
の絶対立体化学はまだ定まっていない。これらの抗体によって触媒されるフルオ
ロアセトンのアルドール付加の局所部位選択性は、天然のアルドラーゼ（デオキ
シリボース−５−ホスフェート）で観察されたものと反対である。後者の場合、
フルオロアセトンの非置換部位への付加のみが観察された（C.F. Barbas III, Y
.-F. Wang, C. -H. Wong, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 2013)。
【００４１】 ｓｙｎ−１６のようなα−フルオロ−β−ヒドロキシケトンの不整合成のため
の触媒も一般的方法論も知られていない（J.T. Welch, K. Seper, S. Eswarakri
shnan, J. Samartino, J. Org. Chem. 1984, 49, 4720; H.O. House, W.F. Fisc
her, M. Gall, T.E. McLaughlin, N.P. Peet, J. Org. Chem. 1971, 36, 3429-3
437; C. Kowalski, X. Creary, A.J. Rollin, M.C. Burke, J. Org. Chem. 1978
, 43, 260)。α−脂肪族置換ケトン（例えばシクロペンタノン）の反応を巻き込
む立体選択はこの事例では詳細に検討されなかった。これは、水性緩衝溶媒中で
これら供与体とともに形成される生成物のα位における立体化学的な不安定性の
ためである（R. Iriye, K. Takai, M. Noguchi, Bioorg. Med. Chem. Ltrs. 199
7, 7,199; M.T. Konieczny, P.H. Toma, M. Cushman, J. Org. Chem. 1993, 58,
4619)。脂肪族ケトンとの反応で供与体としてシクロペンタノンを用いる反応の
ａｎｔｉ／ｓｙｎ選択性は、動力学的に制御した合成により得られた生成物分布
と比較しながら下記に示す（ＬＤＡ、−７８Ｃ）。受容体としてｎ−ペンタナー
ルを用いて５３は抗体触媒によって生成されるが、そのａｎｔｉ／ｓｙｎ比は、
動力学的に制御した合成によって得られるものとほぼ同一である。選択性の逆転
は、受容体としてヘプタナールを用いた場合に認められるが、この場合ｓｙｎ−
生成物が優勢である。
【００４２】 レトロアルドール化、触媒効率および提唱されるメカニズム：以前の両触媒の
生化学的研究および３３Ｆ１２の構造研究は、天然のクラスＩアルドラーゼ酵素
と共有されるエナミンメカニズムと一致する。このメカニズムの中心となるもの
は、高度に不安定なｐＫaをもつε−アミノ基を有する化学的に固有のリジン残 基で、これは、より多くの典型的アミンにプロトンを付加しこの反応で効果をも
たない条件下で効率のよいアミン系触媒を可能にする。アルドラーゼとしての抗
体３８Ｃ２の触媒効率は、レトロアルドール反応の研究によって単純なアミン触
媒を用いて最も容易に比較できる。なぜならば、アミン触媒反応の二次速度定数
は、抗体触媒反応のＫcat／Ｋmと正比例するからである。アミン触媒アルドール
反応の動力学的研究が報告されたが、速度はアミン触媒レトロアルドール反応よ
りほぼ１０２倍遅い（J.-L. Reymond & Y. Chen, J. Org. Chem. 1995, 60, 697
9)。
【００４３】 我々は、抗体およびアミン触媒による基質５９のレトロ−アルドール反応を調
べた。アミン触媒は緩衝水性および有機溶媒の両方で調べた（図１２）。抗体３
８Ｃ２は５９のレトロアルドール化を触媒し、これはミハエリス−メンテンキネ
ティクスにしたがった（Ｋcat＝１．４分-1、Ｋm＝２７０ｍＭ）。このレトロア
ルドール反応のバックグラウンド速度は８．３ｘ１０-8分-1であった（１００ｍ
ＭのＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７）。この反応について抗体によって得られるバック
グラウンドに対する相対速度の増加は１．７ｘ１０７（Ｋcat／Ｋuncat）で、特
異性定数（Ｋcat／Ｋm）は５．２ｘ１０３分-1Ｍ-1である。３８Ｃ２によって触
媒されるレトロアルドール反応のための最も効率的な基質は、今日までのところ
６−（４'−ジメチルアミノフェニル）−４−ヒドロキシ−５−ヘキセン−２− オンである。この基質の特異性定数は２．０ｘ１０５である。この反応に対する
抗体３８Ｃ２の特異性定数は、アミン補助因子依存抗体アルドラーゼについて以
前に報告されたものの１０６倍以上である（J.-L. Reymond, Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 1995, 34, 2285)。
【００４４】 以前の研究では、活性部位のリジン、ＬｙｓＨ９３（これはこれら触媒化学の
中心をなすものである）のεアミノ基のｐＫaは、リガンドと結合していない抗 体ではプロトン付加および電荷の成長に不利な疎水性の分子環境によって高度に
不安定であると言われていた。３８Ｃ２および３３Ｆ１２の活性部位リジンのｐ
Ｋaはそれぞれ６．０および５．５と概算された。溶液中で遊離しているリジン のε−アミノ基のｐＫaは１０．５である（J.A. Dean, in Lange's Handbook of
Chemistry(McGraw-Hill, San Francisco, CA 1992), pp.8.19-8.71）。これら の研究はまた、ｎ−オクタノールの疎水性に類似する活性部位の疎水性を示唆し
ている。したがって、５９のｎ−ブチルアミンおよびアミノアセトニトリル触媒
レトロアルドール化のための二次速度定数は、水性緩衝液およびｎ−オクタノー
ルで求めた。ｎ−ブチルアミンは、抗体触媒反応において重要なリジンの側鎖と
の構造的類似性のゆえに研究対象とし、アミノアセトニトリルは、そのｐＫａが
抗体の活性部位リジンのｐＫａと類似するので調べた。水の中でのｎ−ブチルア
ミンおよびアミノアセトニトリルのｐＫaは１０．６１および５．３４である（D
.J. Hupe, M.C.R. Kendall, T.A. Spencer, J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 1254
)。アミン触媒に対する３８Ｃ２の相対的有効性（Ｋcat／Ｋm）／ＫＮＨ２およ び３８Ｃ２の活性部位リジンの有効モル濃度（Ｋcat／ＫＮＨ２）は図２０に示 す。抗体３８Ｃ２は、水性媒体または有機媒体のどちらかでの非酵素的アミン触
媒反応と比較したとき、５９のレトロアルドール反応の効率を１０６−１０８倍
高めた。５９の単純アミン触媒レトロアルドール化に対する３８Ｃ２の相対効率
は、酵素アセトアセテートデカルボキシラーゼの有効性に十二分に匹敵する（後
者は同じ基質のアミノアセトニトリル触媒脱カルボキシル反応と比較され、（Ｋ cat ／Ｋm）／ＫＮＨ２は９．５ｘ１０６である）（F.H. Westheimer, Proceddin
g of the Robert A. Welch Foundation, Houston, 1971, 15, 7; F.H. Westheim
er, Tetrahedron, 1995, 51, 3; L.A. Highbarger, J.A. Gerlt, G.L. Kenyon,
Biochemistry, 1996, 35, 41）。アセトアセテートデカルボキシラーゼは、その
メカニズムがリジンの活性化ε−アミノ基周囲に集中する酵素のうちで最も研究
されたものである。３８Ｃ２の活性部位アミンの有効性もまた、用いられたアミ
ンおよび溶媒系にしたがって５６０から３５０００Ｍの間の有効モル濃度によっ
て示される。
【００４５】 図２０に示すように、ｎ−オクタノール中でのｎ−ブチルアミン触媒は、アミ
ンがｎ−オクタノール中では反応性非プロトン付加状態にあるために水溶液中で
の触媒と比較して６３倍増加する。アミノアセトニトリルは、その低いｐＫaの ために両溶媒で同様な有効性を示す。この反応のための活性化エネルギーは、こ
の反応は遷移状態で電荷分散を必要とするので、抗体の活性部位およびｎ−オク
タノールのような非極性溶媒中ではより低いはずである。極性媒体は、陽イオン
イミニウム中間体を活性化複合体よりもより強く安定化させると期待されるであ
ろう（C. Reichardt, in Solvents and Solvents Effects in Organic Chemistr
y, H.F. Ebel, E. Wentrup-Byne, Eds., New York, NY, 1990, 2nd eddition, p
p1-511; C.H. Stereoselective Aldol Condensations, in Comprehensive Carba
nion Chemistry, E. Buncel & T. Durst, Eds., Part B, p.177ff(特にp.198),
Elsevier, Amsterdam, 1984)。
【００４６】 リガンドをもたない３３Ｆ１２の結晶構造は、水分子（これもまたＴｙｒＬ４
１のヒドロキシル基に対して水素結合距離内に存在する）に対して水素結合距離
内にあるＬｙｓＨ９３を示している。抗体が結合に際して大きな構造的変化を受
けるであろうということに注意して、クラスＩアルドラーゼについて提唱された
メカニズムに類似するメカニズムを図２に示すが、これがもっとも可能性がある
であろう。この提唱メカニズムでは、ＴｙｒＬ４１は塩基として作用するであろ
う。受容体活性化は必須のようである。なぜならば、ストークのエナミン（Stor
k et al. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 20)またはミハエル反応（M.J. Lucero,
K.N. Houk, J.Am. Chem. Soc. 1997, 119, 826)にしたがって、４−ニトロフェ
ネチルブロミドのようなアルキル化基質またはメチルビニルケトンのようなα，
β−不飽和基質を添加してもエナミンを捕捉できなかったからである（先導的文
献として以下を参照されたい：M. Pfau, G. Revial, A. Guingant, J.J. d'Ange
lo, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 273; J. d'Angelo, D. Desmaёle, F. Duma
s, A. Guingant, Tetrahedron: Asymmetry 1992, 3, 459; I. Jabin, G. Revial
, A. Tomas, P. Lemoine, M. Pfau, Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 1795; C
. Cavｅ, D. Desmaёle, J. d'Angelo, J. Org. Chem. 1996, 61, 4361)。
【００４７】 しかしながら、受容体の活性化およびそれが生じる分子環境は、アルデヒドの
非反応性ジェム−ジオール型の形成を促進しないように釣合いがとれていなけれ
ばならない。エナミン形成および／またはＣ−Ｃ結合形成／破壊工程はこれらの
触媒に関して律速的である。エレクトロスプレー質量分析法による１８Ｏ標識水
での５９の３８Ｃ２触媒によるレトロ−アルドール化の研究では、抗体触媒によ
る迅速な１８Ｏの基質５９への取り込みが示された（図３）。６分以内に、１モ
ル％の３８Ｃ２触媒により５０％以上の基質５９分子への１８Ｏの取り込みが認
められた（抗体を含まないコントロール反応では取り込みはこの時点で認められ
なかった）。この結果は、β−ケト酸の３８Ｃ２触媒脱カルボキシル反応の同様
な実験で我々が観察したものと対照的である。後者の場合は、イミン形成は律速
的で、１８Ｏの基質への取り戻しは触媒されなかった。供与体としてヒドロキシ
アセトンを含む反応はアセトンを含む反応よりも速い。この観察はまた、エナミ
ン生成が少なくとも部分的に律速性であることを支持している。なぜならば、初
めの分子軌道からの計算によって、アセトンと比べてヒドロキシアセトンの場合
、イミンからエナミンへの変換のための活性化エネルギーは、ヒドロキシアセト
ンのヒドロキシ基の電子回収性（α−炭素のプロトン吸引を促進する）のために
低い（約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と予想されていたからである（J.-F. Lin, C.-C.
Wu, M.-H. Lien, J. Phys. Chem. 1995, 99, 16903)。このことは、ヒドロキシ
アセトンのヒドロキシ含有側で形成されたエナミンの相対的安定性の増加と合わ
せて、結合形成がヒドロキシ基をもつα部位でのみ検出されるというヒドロキシ
アセトンアルドールの局所部位化学（regiochemstry)の完璧な制御を説明する。
同様な考えによって、フルオロアセトン付加の局所部位選択性が観察されたこと
はまた、初めの分子軌道計算の報告と一致する。ヒドロキシアセトン付加の鏡像
面選択性における逆転はまだ完全には説明されていない。ヒドロキシアセトン由
来生成物５４および５８のα−ｓｙｎ立体化学は、ヒドロキシアセトンのＺ−エ
ナミンの優先的形成（これは分子内水素結合を介してＥ−配置よりも安定化され
ている）およびそれに続く受容体のｒｅ面上の攻撃によって合理的に説明するこ
とができる（図４に図示）。エナミンのα位の分枝は、活性化水分子またはこの
機能を果たす別のアミノ酸側鎖の再構成をもたらし、鏡像面の選択性を変化させ
ることができる。シクロペンタノンのアルデヒドへの付加におけるｓｙｎおよび
ａｎｔｉの両生成物（生成物５１−５３）の観察によって、受容体アルデヒドの
両方の面がこのエナミンによる攻撃（Ｅ−エナミンの生成に限定される）で利用
性を有することが支持される。ベンジル系またはアリル系受容体３、７および８ で認められた高い鏡像選択性に対して６のような基質の鏡像選択性の低下は、よ
り自由度の小さい受容体分子のより効率的な鏡像面選択性と合致する。これら触
媒の化学的メカニズムの更なる理解は、ハプテン１と結合した抗体３３Ｆ１２の
Ｘ線結晶構造解析によって得られるであろう。
【００４８】 抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２は、多様なケトンーケトン、ケトン−アルデヒ
ド、アルデヒド−ケトンおよびアルデヒド−アルデヒド分子間アルドール反応を
触媒し、さらにいくつかの事例では後続の脱水を触媒してアルドール縮合生成物
を生じることができる。多数の分子内アルドール反応もまた特定した。調べた全
ての分子内アルドール反応触媒によって対応する縮合生成物が得られた。調和供
与体と受容体基質は図５に示す。供与体特異性の主要な制限は、非結合形成α位
で分枝するケトンを触媒が受容する能力をもたないことであるようで、一方、受
容体は、ポリヒドロキシル化アルデヒドが基質としてまだ特定されていないので
、比較的疎水性のアルデヒドまたはケトンであるという程度の限定があるだけで
ある。これら抗体触媒の範囲は、天然の既知酵素アルドラーゼまたは遷移金属系
アルドール触媒のいずれで観察された範囲も越えている。ケトン−アルデヒド交
差アルドール反応でアセトンがアルドール供与基質である場合、新規な立体形成
中心がアルデヒドのｓｉ面の攻撃によって多くの事例で９５％を越えるｅｅで形
成される。供与基質としてヒドロキシアセトンを用いた場合、攻撃はアルデヒド
のｒｅ面で発生し、α−ｓｙｎ配置を有する２つの立体形成中心をもつα，β−
ジヒドロキシケトンを生成する（３Ｒ、４Ｓ）。これらの反応は７０から＞９９
％のｅｅで進行する。供与基質としてフルオロアセトンを用いる交差アルドール
反応の主要生成物はｓｙｎα−フルオロ−β−ヒドロキシケトンで、９５％のｅ
ｅで生成される。
【００４９】 この研究は、有効でしかも範囲の広い触媒を製造することができる反応性免疫
の能力を際立たせた。そのような抗体は、目的に応じて製造することができ、ハ
プテンと共有結合させるために免疫系によって最適化され、結合ポケットは免疫
原との非共有結合反応に関して必ずしも純化される必要はない。結果として、生
物触媒は、物理化学的特性が極めて異なる多様な基質を受容することができる。
抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２は、その極めて広い範囲、有効性および立体選択
性のゆえに不整合成触媒の項目に加えられる有用な触媒である。これは、１グラ
ムまでの規模で、異なる１０個のブレビコミンの高度に鏡像選択的な完全合成に
よって本明細書で示される（下記参照）。現今の遷移金属触媒と異なり、本明細
書で報告する抗体はアルドール反応およびレトロアルドール反応の両反応を触媒
し、鏡像選択性合成または動力学的分離のいずれかにより高い光学的純度をもつ
β−ヒドロキシケトンの両鏡像体の製造を可能にした（下記参照）。抗体触媒反
応における規模の問題は、現時点で利用可能な技術、特に植物および藻類におけ
る抗体の異種発現を用いて解決できる。後者の場合、何トンもの規模でこれらの
触媒の低コスト製造を達成でき、実質的には無制限規模でアルドールの" グリー
ン合成"を可能にする。抗体３８Ｃ２は現在はアルドリッチ＝ケミカル＝カンパ ニー社（Aldrich Chemical Company）から市販されている（A. Hiatt, Nature 1
990, 334, 469; A. Hiatt, J.K. Ma, Int. Rev. Immunol. 1993, 10, 139; J.K.
Ma, A. Hiatt, M. Hein, N.D. Vine, F. Wang, P. Stabila, C. van Dolleweer
d, K. Mostov, T. Lehner, Science 1995, 268, 716; E. Franken; U. Teuschel
, R. Hain, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8, 411)。
【００５０】 実施例２：天然酵素の反応速度加速をもつが範囲はより広い抗体アルドラーゼ
を誘導する免疫選別の能力 構造的および機能的研究によって、免疫系の選別基準が変化した場合に、天然
の酵素の有効性をもちながらより広範囲の基質を受容する抗体が誘導されること
が示された。この触媒性抗体は反応性免疫によって製造された。この反応は、免
疫系の選別基準を単純な結合から化学的反応性に変化させる過程である。この過
程は、解糖で用いられる天然の酵素の速度加速に類似するアルドラーゼ触媒性抗
体を製造するために用いられた。天然の酵素と異なり、抗体アルドラーゼは、多
様なアルドール反応および脱カルボキシル反応を触媒した。この研究は酵素の進
化の自然過程を暗示する。
【００５１】 蛋白質触媒を選択する場合の主要なジレンマは、多様性を増す代わりに天然の
酵素の速度加速を２倍にすることの懸念である。新規な酵素が化学反応で最も有
用であるためには、それらは多様な基質を受容することができると同時に効率的
でなければならない。効率についての要求は明らかであるが、一方、酵素が多様
な基質を用いるある部類の反応を触媒することができるときそれらはさらに有用
性を増すので、その範囲が問題となってくる。この問題を解決するために、我々
は抗体触媒を用いた。
【００５２】 このアプローチは、進化と免疫系が新規な蛋白質機能を発達させる過程を比較
することによって最も際立たせることができる（図２８）。第一に、免疫系は、
進化が利用している強力な遺伝的手段の各々に対する対応物をもつ（S. Lerner,
J. Benkovic & P.G. Scultz, Science 252:659(1991); P.G. Schultz & R.A. L
erner, Science 269:1835(1995))。この２つの過程の重要な違いは時間というパ
ラメーターと選別基準である。進化の間に、自然の選別が機能または適合性の改
善を基準に発生し、一方、免疫系では効率のよいクローンがより優れた結合を基
準に選別される。天然の酵素はおそらく、基質のターンオーバーに最も適合して
いる反応に集中することができる結合相互作用を有する、" 完璧"ないくつかの 酵素の触媒としての有効性のゆえに選別される。したがって、各々の系は新規な
機能を作りだすために相応な遺伝的手段をもつが、それらの系は選別基準および
時間の進行では異なっている。主要な問題は、その選別基準が単純な結合から機
能へと切り換えられたとき、免疫系は直ちに効率的な触媒を産生できるだろうか
ということである。この問題についてのこのような考え方は、新規な抗体触媒を
開発する最も強力な方法は、所望の化学的成果を達成するそれらの能力を基準に
それらを選別することである。しかしながら先ず得られたこの近似の結果に対し
て、範囲の問題は、選別基準にかかわらず、誘発された抗体は免疫反応の結果と
して与えられた基質に対して高度に限定されているためにそのまま残っている。
しかしながら、効率的でかつ広い範囲をもつ触媒の開発を可能にする、抗体誘発
時における機能的選別のまた別の特徴が存在する。非共有結合反応の通常的協力
よりもむしろ抗体との共有結合を形成する化学的相互反応を基に選別する抗体誘
発の過程を考えてみよう（図２４）。非共有結合の事例では、一連の体細胞変異
はハプテンとの相互反応の改善をもたらし、それと同時に誘発した分子に対する
結合特異性を高める。したがって、ある酵素がこの過程から生じる場合は、ほと
んどの天然酵素の限定的基質特異性をもつであろう。共有結合の事例では、体細
胞の通常の洗練過程は停止するであろう。なぜならば、クローン間で競合する優
れた非共有結合がたとえどんなに多く生成されたとしても、それらはただ１つの
共有結合事象によって達成される結合エネルギーと同等ではないので、抗原と共
有結合を形成した抗体をもつ全てのクローンが他のものから選別されるからであ
る。
【００５３】 共有結合が抗体の進化の過程の初期に出現する場合、この洗練過程の一切の選
別圧力は、結合ポケット内で化学反応を達成できる抗体の誘導を停止し、そうで
なければ高度に洗練されないであろう。したがって、反応性免疫によって選別さ
れるいくつかの抗体は効率的であろう。なぜならば、酵素のようにそれらは化学
反応を基準に選別され、しかも酵素と違って、結合ポケットの洗練のための通常
の要求が妨げられていたので、それらは広い範囲を有する。
【００５４】 我々の方法（反応性免疫と称する）は、上記に述べた特性を有する抗体の産生
を可能にする（Wagner et al. Science 270:1797(1995); Wirsching et al. Sci
ence 270:1775(1995))。この方法は、化学反応を達成することができる抗体触媒
の能力を基準にin vivoでそれら抗体触媒を選別する手段を提供する。この方法 は通常の免疫の態様から外れている。通常の免疫態様では、得られる抗体が天然
の状態の標的と反応することができるように、可能なかぎり化学反応を起こさな
い抗原を使用するために注意がはらわれる。反応性免疫の過程では、この反対を
行う。化学反応（例えば共有結合の形成）が免疫反応での抗体誘発中に抗体分子
の結合ポケットで発生することができるように、反応性抗原がデザインされる。
抗体誘発中の抗体で生じる化学反応は、対応する基質が用いられる場合は反応コ
ーディネートの不可欠な部分であるようにデザインされる。 我々はここで同じ化学的メカニズムを利用するアルドラーゼ（１つは自然に得
られたもの、他方は反応性免疫によって得られた触媒性抗体）を比較する。
【００５５】 反応性免疫プロセスおよび抗体アルドラーゼ： 我々が製造しようとした抗体触媒は、天然の酵素のエナミンメカニズムが抗体
結合部位内に刻印されたアルドラーゼであった。この抗体触媒は、適切な化学的
反応性ををもつ適切に配置されたリジン残基をもつ全ての抗体が、カルボニル基
の１つを攻撃してαカルビノールアミン（これは続いて壊れてシッフ塩基を形成
する）を生成するように、１，３−ジケトンハプテンで動物を免疫することによ
って製造された。シッフ塩基が互変異性化によってα位の第二のカルボニル官能
性のために安定なビニローグ系アミドであるエナミンを形成するとき、抗体との
安定な共有結合反応が形成される（図２３）。
【００５６】 ビニローグ系アミドは蛋白質の範囲外で（約３１６ｎｍ）強力にＵＶを吸収し
、したがって結合スクリーニングの代わりに我々は新規な吸収についてスクリー
ニングした。この吸収は、抗体が天然のアルドラーゼの中核的化学メカニズムを
発達させたことを示すものである。この方法で製造された抗体はアルドール反応
および脱カルボキシル反応を触媒することが示された。それらの全ては、天然の
クラスＩアルドラーゼによって利用される同じエナミンメカニズムによって生じ
る（G. Bjｏrnestedt, R.A. Zhong, Lerner & C.F. Barbas III, J. Am. Chem.
Soc. 118:11720(1996))。これからそれら抗体の範囲、相対効率および構造を述 べる。
【００５７】 酵素、フルクトース１，６−ジホスフェートアルドラーゼは蛋白質アルドラー
ゼのうちで最も研究されており、それは生物の３つの領域の各々で見出される。
この酵素は、グルコース代謝にとって主要なもので（解糖＝糖分割＝アルドラー
ゼ）、解糖または糖質新生でそれぞれ網目構造の切断または合成を触媒する。自
然界では、この酵素は、フルクトース１，６−ジホスフェートの切断を触媒して
燐酸ジヒドロキシアセトンおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートを生じ
る。クラスＩアルドラーゼ酵素は、エナミンメカニズムによって生じる（図２４
）。Ｃ−Ｃ結合形成工程での力学的対称性は、β−ジケトン選別が力学的に同一
な反応コーディネートをこの工程周辺に誘導することを可能にする（図２４）。
【００５８】 抗体触媒の範囲と効率： フルクトース１，６−ジホスフェート（特に供与体の活性化に関して範囲が非
常に狭い）と異なり、抗体アルドラーゼは範囲が非常に広く、極めて多様な基質
を受容する（図２２）。今日までに１００以上の異なるアルドール付加または縮
合またはその両方の反応がこのただ１つの触媒によって実施された。この触媒は
、アルデヒド−アルデヒド、ケトン−アルデヒド、およびケトン−ケトン反応を
加速することができる。交差アルドール反応の場合、種々のケトンが供与体とし
て受容される。例えば脂肪族開放鎖ケトン（例えばアセトンからペンタノンシリ
ーズ）、脂肪族環状ケトン（シクロペンタノンからシクロヘプタノン）、官能基
をもつ開放鎖ケトン（ヒドロキシアセトン、ジヒドロキシアセトン、フルオロア
セトン）および官能基をもつ環状ケトン（２−ヒドロキシシクロヘキサノン）で
ある。生物触媒の活性部位リジン残基は、これらのケトンを対応するエナミンに
変換できる。これらエナミンは、アルデヒドおよびケトンの両方を攻撃できる重
要な中間体である。供与体で分かったように、抗体はまた非常に異なるアルデヒ
ド基質を受容する。例えば、ペンタナール、４−アセトアミドベンズアルデヒド
、または２，４−ヘキサジエナールである。この研究中に、この抗体はまた、交
差反応のために受容体アルデヒドが存在しないことを条件にアセトンまたはシク
ロペンタノンの自己アルドール縮合を触媒することが分かった。特に、プロピオ
ンアルデヒドもまた自己アルドール縮合のための基質となる（ここでは同時に供
与体および受容体として作用する）。この反応は二量体工程で終了する。ただし
、生成物（トランス−２−メチル−２−ペンタナール）は反応性アルデヒド官能
性を含み、その後の付加工程にとってそれ自体が受容体であるかもしれない。そ
のような反応は、アセトンが供与体である場合にのみ抗体によって触媒されるこ
とが分かった。ここでは水の除去は行われなかった。ただしアルドール付加生成
物は脱水に対して不安定であった。
【００５９】 自己アルドール縮合反応の事例で水の除去もまた触媒されるか否かを決定する
ために、シクロペンタノンのアルドール付加生成物を化学的に合成し、それを抗
体とともに保温した。この基質で水の除去が触媒され、典型的なミハエリス−メ
ネテンキネティクスにしたがった。分子内自己アルドール縮合を調べた。基質と
して２，６−ヘプタンジオンを用いたとき抗体は１つの工程で３−メチル−２−
シクロヘキセノンの形成を触媒することが分かった。２，６−ジケトンの一部が
シクロヘキサノン系に取り込まれる場合は、このボルドウィン適性６（エノレン
ド−トリグ）−エキソ−トリグ過程も抗体によって触媒される。したがって、ス
テロイドのＡ−Ｂ環の部分構造の形成は、対応する前駆体から開始しながら触媒
される。非常に驚くべきことは、抗体はキラリティーのないトリケトンの環状化
を触媒し、＞９５％の鏡像異性過剰（ｅｅ）でウィーランドミーシャーケトンの
（Ｓ）−鏡像体を生成する例である。最初のハプテンの構造を考え、さらにその
構造と幾何学的に必要なものもつその後の構造とを比較すれば、反応性免疫の力
が説明されるであろう。なぜならば、この生物触媒は、最初そのような基質の幾
何学構造を求めてデザインされたのではなく、機能を求めてデザインされたから
である。
【００６０】 全ての抗体触媒アルドール反応は、ベンズアルデヒド誘導体を除いて典型的な
ミハエリス−メンテンキネティクスにしたがう。後者はより高い濃度（＞２ｍＭ
）でわずかに基質抑制を示す。交差アルドール反応での供与体のミハエリス定数
ＫMの典型的な値は１ｍＭから１Ｍの範囲で、多様な種々のケトンを受容するこ とができる抗体の能力を反映している。受容体アルデヒドのＫM値は２０μＭか ら５００μＭの範囲である。部分的にはこれらの分子の芳香族部分によって、活
性部位による認識増加がもたらされる。さらに、これらの化合物の疎水性は駆動
力として作用し、それらの活性部位への分配を促進する。自己アルドール反応お
よび分子内アルドール縮合反応では、ＫM値は１から５ｍＭの範囲である。レト ロアルドール反応のＫM値はより好ましい値で、典型的には１５から４００μＭ の範囲である。全ての反応におけるＫcatの特徴的な値は１０-3から５分-1の範 囲で、Ｋcat／Ｋuncatの比は１０5から１０7を示す。
【００６１】 各蛋白質がα−ヒドロキシケトンの切断を触媒しアルデヒドとケトンを生成す
ると仮定して、高度に類似するレトロアルドール反応の各々について効率のよい
事例を比較した（図２５）。ＦＤＰアルドラーゼの場合、好ましい反応はフルク
トース１，６−ジホスフェートを切断して燐酸ジヒドロキシアセトンとグリセル
アルデヒド３−ホスフェートを生じるもので、一方、抗体の事例では、６−（４
'−ジメチルアミノフェニル）−４−ヒドロキシ−５−ヘキセン−２−オンを切 断して、アセトンと４−ジメチルアミノ−シンナムアルデヒドを生じるのが好ま
しい。抗体は、天然の基質上に荷電をもつホスフェートの手掛かりを必要としな
い。抗体によって達成される触媒のターンオーバーは、この事例での天然の酵素
のターンオーバーの１０倍以内である。さらに、このターンオーバー効率は多様
な反応で維持される（図２６）。
【００６２】 最初の反応性の上に構築される多様な触媒機能の進化： アルドール反応の他に、この抗体は、電子の排水桶として機能するプロトン付
加シッフ塩基を有するβ−ケト酸の脱カルボキシル反応を触媒する。実際のとこ
ろ、いくつかの天然のアルドラーゼが、生物学的に関連する脱カルボキシル反応
を力学的に類似の態様で触媒することが示された（Vlahos & E.E. Decker, J. B
iol. Chem. 261:11049(1986)）。
【００６３】 メカニズムの多様化をもたらすまた別のルートは補助因子の利用を伴う。天然
の酵素では、補助因子は触媒できる反応のレパートリーを広げる。上記で述べた
抗体のような触媒が原始触媒のモデルと考えるならば、その範囲は、その後の更
なる進化による洗練を受けてピリドキサル燐酸のような補助因子の存在によって
拡張されるであろう。この比較的単純な作戦は、活性部位リジンをもつ酵素を多
くのアミノ酸依拠変換を触媒することができるピリドキサル依存酵素に変換する
であろう。これらの反応には、アミノ基転移反応、ラセミ化反応、脱カルボキシ
ル反応、アルドール反応、並びに除去および置換反応が含まれる（John, Biochi
mica et Biophysica Acta 1248:81(1995); H. Wada & E.E. Snell, J. Biol. Ch
em. 237(1):133(1962)）。これらの酵素では、補酵素は、活性部位リジンのε−
アミノ基と補酵素のカルボニル基との間の反応によって形成される可逆性イミニ
ウム連結で結合して、３６０から４２０ｎｍで特徴的な吸収を示すイミンを生成
する。これらの考えをテストするために、補助因子ピリドキサルをその活性部位
に閉じ込めることができる触媒抗体の能力を調べた。その結果、抗体３３Ｆ１２
は典型的な内部アルジミンの態様で補助因子と結合することが見出された。その
後の２，４−ペンタンジオンの付加によって、アルジミンがアルドール反応で用
いられるのと同じリジン残基により可逆的に形成されることが示された。同じ活
性が抗体３８Ｃ２を用いて観察された。天然の補助因子のこの単純な付加によっ
てアルドラーゼ抗体の範囲を広げることができ、多様な新しい種類の反応を可能
にする。このようにして、我々は、最初の反応から実験的に酵素の多様化を創造
するために自然が用いたプロセスを再現できるかもしれない。
【００６４】 化学的に反応性を有するリジン： ２つのアルドラーゼが類似している場合、我々は、クローン選別と自然の選別
がそれぞれ触媒事象における化学的問題をどのように解決するのかという点に興
味をもった。アルドール反応の第一の工程は、カルボニル基上のリジンのε−ア
ミノ基の求核攻撃である。ε−アミノ基が求核性であるために、それは電荷をも
たない状態でなければならない。しかしながら、水溶液中でのリジンのこのアミ
ノ基のｐＫaは１０．５である（Dean, in Lange's Handbook of Chemistry(McGr
aw-Hill, San Francisco, CA, 1992), pp.8.19-8.71）。天然のアルドラーゼお よび抗体アルドラーゼは、両方とも球核物質として非プロトン付加リジンに依存
しており、しかもリジンのε−アミノ基が通常はプロトン付加される中性ｐＨで
これらは最大活性を示して機能するので、この基のｐＫaは不安定であるにちが いない。
【００６５】 レトロアルドール反応のためのｐＨの関数としてのＫcat／ＫMおよび１／ＫM の依存性は酸性稼動ｐＫaが６．３−６．６であることを示した。これは、ＦＤ Ｐアルドラーゼの触媒のｐＨ依存性実験で観察されたものにほぼ近似する。ｐＨ
に対するＫcat／ＫMおよび１／ＫMの依存性は、理想的には自由触媒および自由 基質のイオン化状態にしたがうが、一方、ここに示すように種々の程度にプロト
ン付加されたいくつかの中間工程を有する複雑なメカニズムでは、動力学的に決
定されたｐＫaは真のイオン化定数を示していないかもしれない。なぜならば、 それはいくつかの速度定数の比で構成され、律速工程はｐＨとともに変化するか
らである。
【００６６】 レトロアルドール反応の複雑さのいくつかを避ける、主要リジンのｐＫaを決 定するもっと直接的なアプローチは、β−ジケトンとエナミンを形成する抗体の
能力を基にしている。アルドール抗体は、化学量論的にβ−ジケトン（例えば３
−メチル−２，４−ペンタンジオン）と反応して、安定なビニローグ系アミドを
生成し、完全にアルドラーゼ活性を抑制する。３−メチル−２，４−ペンタンジ
オンの反応は、抗体−エナミン複合体３の吸収を３３５ｎｍで追跡することによ
って分光光度計でモニターされた。この反応のｐＨ依存性は図２９に示され、抗
体３３Ｆ１２および３８Ｃ２についてそれぞれｐＫa５．５および６．０で単純 な定量曲線によって表されている（これらの動力学的論争はD.E. Schmidtらの古
典的研究から続いている（D.E. Schmidt, Jr. & F.H. Westheimer, Biochemistr
y 10:1249(1971))。２，４−ペンタンジオンによるエナミン生成速度のｐＨ依存
性の研究によって同じｐＫaが得られた。２，４−ペンタンジオンおよび３−メ チル−２，４−ペンタンジオンの３位のプロトンのｐＫaはそれぞれ８．８７お よび１０．６５である（P.Y. Bruice, J. Am. Chem. Soc. 112:7361(1990))。こ
れらの研究は、レトロアルドール活性のｐＨ依存性の研究と合わせて、これらの
蛋白質が摂動ｐＫaをもつ活性部位リジンを含むことを示している。
【００６７】 別のシッフ塩基形成酵素アセトアセテートデカルボキシラーゼに関するWesthe
imerと彼の共同研究者の仕事から、中性ｐＨでのシッフ塩基生成のための反応性
リジンの化学的同調は、少なくとも部分的には、アミンの求核物質のｐＫaを静 電気的に動揺させる直ぐ近くの別のプロトン付加リジン残基によって達成できる
ことが分かっている。アミンのｐＫaを動揺させる第二の選択されるメカニズム は、疎水性の分子環境を基にするものである（P.A. Frey, F.C. Kokesh & F.H.
Westheimer, J. Am. Chem. Soc. 93:7226(1971); F.C. Kokesh & F.H. Westheim
er, J. Am. Chem. Soc. 93:7270(1971); L.A. Highbarger, J.A. Gerlt & G.L.
Kenyon, Biochemistry 35:41(1996); J.K. Lee & K.N. Houk, Science 276:942(
1997); S. Dao-pin, D.E. Anderson, W.A. Baase, F.W. Dahlquist & B.W. Matt
hews, Biochemistry 30:11521(1991))。
【００６８】 構造的に特異なリジンを取り囲む混成疎水性ポケット： これらの抗体内のただ１つの反応性リジンの求核特性を構造的により理解し、
さらにそれらの範囲を説明する構造的特徴を知るために、それらの遺伝子をクロ
ーニングして配列を決定し、さらに３３Ｆ１２の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ
）の三次元Ｘ線結晶構造を求めた。３３Ｆ１２および３８Ｃ２の配列は、それぞ
れ２６および２５のＬｙｓ残基を明らかにした。抗体は、ただ１つのＶＤＪ再構
成を含む体細胞性変種であり、ＶLおよびＶHの各々で９アミノ酸が異なっていた
。
【００６９】 ３３Ｆ１２の構造は、２．１５オングストロームの解像で分子の置き換えによ
って求めた。天然のＦａｂの全体的な構造は他の既知のＦａｂの構造と類似して
いる（図３０）。エルボアングル（elbow angle)（これはＶL−ＶHおよびＣL− ＣＨ１の擬似二重軸を互いに結びつける）は１５１．４−で、Ｆａｂ分子の観察
範囲内に入っている（２３）。３３Ｆ１２の抗原結合部位の入口は狭くて長い裂
け目である（図３１）。結合ポケットの深さは１１オングストローム以上で、深
くなるにつれ拡張する。このポケットの深さは、他の小さなハプテン分子に対し
て生じた抗体ポケットに匹敵する。ポケットの底にはＬｙｓＨ９３が疎水性環境
内で見出される（図３０）。第二のＬｙｓＨ５２ｂはＣＤＲ−Ｈ2の上部に位置 し、その側鎖はこの分子の外側に向いている。抗体３８Ｃ２では、ＬｙｓＨ５２
ｂはＡｒｇに変異し、一方、ＬｙｓＨ９３は両者で共通である。ＣＤＲと他の既
知抗体分子との配列比較によって、抗体３３Ｆ１２のいくつかの興味深い通常で
ない特色が明らかになった。ほとんどの抗体では残基Ｈ９３はＡｌａである。既
知の構造を有する他のの２つの抗体（エステル分解性抗体１７Ｅ８および癌腫結
合抗体Ｂ７２．３のキメラＦａｂ）のみがこの位置にＬｙｓを含んでいる。さら
に、残基Ｈ９４（これは他の抗体では通常Ａｒｇである）は、３３Ｆ１２では疎
水性Ｉｌｅによって置換されている。Ｈ９４のＡｒｇは、しばしばＨ１０１のア
スパラギン酸と塩橋を形成する。両抗体によるＪＨ３生殖細胞系統の利用（ＪＨ
セグメントだけはこの位置でＡｓｐをコードしない）は、この相互反応を妨げる
。
【００７０】 Ｆａｂ｀３３Ｆ１２の結合部位の分析（図３２Ａ）では、ＬｙｓＨ９３はほと
んど疎水性の側鎖によって取り囲まれ、残基ＬｅｕＨ４、ＭｅｔＨ３４、Ｖａｌ
Ｈ３７、ＣｙｓＨ９２、ＩｌｅＨ９４、ＴｙｒＨ９５、ＳｅｒＨ１００、Ｔｙｒ
Ｈ１０２およびＴｒｐＨ１０３とファンデルワールス力により接触している。３
８Ｃ２ではＴｈｒであるＩｌｅＨ９４を除いて、ＬｙｓＨ９４とファンデルワー
ルス力で接触している残基は両方の抗体で保存されている。さらに、これらの接
触を形成しているＩｌｅ９４以外のＶおよびＪ遺伝子セグメントの全ての残基は
、これらの抗体によって用いられた生殖細胞系統遺伝子セグメントでコードされ
ている。Ｖ遺伝子によってコードされた、抗体間で異なる残基は結合ポケットの
洗練にほとんど寄与しないが、このことは、リジンＨ９３はこれら触媒の個体発
生の初期に出現し、さらに残存する変異は免疫学的選別時の自然の推進力の結果
であったことを提唱している。このポケット内部では、ただ１つの荷電残基がＬ
ｙｓＨ９３のＮｚの半径８オングストローム内に存在する。ＡｓｐＨ５０のカル
ボキシルは約７．４オングストロームに位置し、これはいずれの水素結合または
塩橋からも遠すぎる。さらに、ＬｙｓＨ９３は、いずれの主要鎖カルボニル酸素
とも水素結合を形成しない。Ｂ７２．３では、ＡｓｐＨ１０１は存在しないが、
ＬｙｓＨ９３は、ＴｙｒＨ９６の主要鎖カルボニル酸素と荷電を有する水素結合
を形成する（後者は通常でないＣＤＲ−Ｈ３ループの構成の要因となっていると
いわれている）。本発明者らもまた基質認識のための疎水性ポケットを報告した
が（Zhou, J. Guo, W. Huang, R.J. Fletterick, T.S.Scanlan, Science 265:10
59(1994)）、さらに荷電を有するＡｒｇＨ９４およびＡｓｐＨ１０１残基が存在
する。ここでＬｙｓＨ９３残基はＡｓｐＨ１０１と塩橋を形成し（ＬｙｓＨ９３
Ｎｚ−ＡｓｐＨ１０１Ｏｄ１ ３．２オングストローム）、その場合、陽性荷電
Ｌｙｓがオキシアニオン形成を安定化させると提唱されている。したがって、３
３Ｆ１２では塩橋は形成されず、さらにそれは疎水性環境内に出現するので、ｐ
Ｋaは揺れ動き、荷電をもたないＬｙｓＨ９３が強力な求核物質として機能する ことを可能にするであろう。
【００７１】 εアミノ基のｐＫaが揺れ動くメカニズムをさらに明らかにするために、我々 は、疎水性に関して一定の態様で異なる一連の関連するβ−ヒドロキシケトン基
質を合成した。ｎ−オクタノールへの基質の分配とＫcat／Ｋaとの間の直線的自
由エネルギーの関係、ハンシュ相関関係（Hansch correlation）についての研究
で、抗体３３Ｆ１２の活性部位はｎ−オクタノールよりも１．１倍疎水性である
ことが示された（図３３）。この抗体はＬｙｓＨ９３の近傍に陽性荷電アミノ酸
側鎖を欠いているという観察と合わせて、上記の分析は、ＬｙｓＨ９３のｐＫa は疎水性の分子環境によって揺れ動いている可能性を支持する（疎水性分子環境
は、リガンドをもたない抗体のそのεアミノ基上でのプロトン付加および荷電の
成長に不利である）。したがって、我々は、この触媒の効率性と雑多性に至る進
化の事象を写したものを持っている。リジン残基は、異なる態様で疎水性ポケッ
トを含む生殖細胞系統抗体の体細胞での洗練の初期に出現した。この疎水性分子
環境へのリジン残基の挿入は、選別が十分に可能なほど効率的な化学反応性をも
たらした。いったんこの共有結合過程が出現すると、この結合ポケットは高い特
異性に向かってさらに進化することはなかった。
【００７２】 酵素の進化に関する有利な立場： 蛋白質酵素は、部分的には遷移状態の安定化、株、酸−塩基触媒作用、および
位置の近さの結果としてその蛋白質酵素の効率性を達成する。各酵素の蛋白質の
足場は、これらの個々の作用が互いに協調して反応しその結果それらが一緒にな
って顕著な速度加速を提供することができるように進化してきた。自由な蛋白質
の足場によって促進されるこれらの協調作用の要件は、人工蛋白質は天然の酵素
の効率に匹敵することができるのかという疑問をもたらした（Jencks, in Catal
ysis in Chemistry and Enzymology. A. Meister(Ed.), Dover Publications, I
nc., Mineola, New York, 1975. 31. J.R. Knowles, Nature 350:121(1991)）。
【００７３】 結合ポケット一式を酵素のように多くの基質と相互作用するようにプログラム
することができるので、原則として蛋白質の触媒としての潜在能力は抗体によっ
て探索することができる。多くの触媒性抗体が製造され、優れた速度加速を有す
ることが示されたが、それらが天然の酵素と異なるメカニズムを利用するために
天然の酵素と比較することはできなかった。したがって、天然の酵素と同じよう
に効率のよい他の蛋白質が製造できるかについての答えは得られていなかった。
我々はここで、抗体および酵素は、各々が同様なメカニズムを利用する場合、互
いに比肩しえる触媒効率を有することを示す。
【００７４】 我々は、触媒性抗体が全ての酵素と同じように効率的であることが判明したと
主張しようとしているのではない。しかしながら触媒性抗体は、全ての生物でエ
ネルギー代謝の中心である高度に進化した天然の酵素のターンオーバー効率に類
似している。フルクトース１，６−ジホスフェートアルドラーゼは、ただ１つの
アミノ酸がそのような重要な役割を触媒メカニズムにおいて果たす特別な事例と
考えることができるであろう。しかしこの見かけの単純さは、このアミノ酸の化
学的性質はその局所環境によって調整されるという点で当てにならない。我々の
触媒性抗体の構造的および化学的研究によって、ＬｙｓＨ９３の中心εアミノ基
のｐＫaは、プロトン付加およびアミノ官能性の荷電の成長に不利な疎水性環境 によって低下することが示唆された。このことは、活性部位における特定の化学
反応を選別する反応性免疫の威力を示す。この事例では、抗体の選別には、カル
ボニル炭素を攻撃し、安定なビニロギー系アミドを形成するために十分に求核性
である活性部位リジンが要求される。水の原動力（この反応およびアルドールの
中心事項である）もまたこの選別でプログラムされていることも見のがされるべ
きではない。
【００７５】 抗体アルドラーゼは効率的な触媒で、しかも非常に範囲が広い。それらは、１
００を越えるアルデヒド−アルデヒド、アルデヒド−ケトンおよびケトン−ケト
ンアルドール付加および／または縮合反応を触媒する。これらの反応のいくつか
（例えばウィーランド＝ミーシャーケトンの構築）は、有機化学の理論と実際に
とって主要なものである。それらは、ステロイドおよびタキソールのように多様
な構造物の合成に役割を果たす。抗体アルドラーゼのこの広い基質特異性は、反
応性免疫によって製造された他の触媒性抗体と共有される特性で、さらに上記で
考察したように、おそらくそれは、免疫原（誘発中に結合ポケット内に共有結合
を形成する）によって誘発される抗体の固有の個体発生の結果であろう（図２８
）。これは、限定された範囲をもつ高度に相補的な結合ポケットを生じる遷移状
態類似体を基準にした免疫学的選別で観察されるものと対照的である（Wedemaye
r et al. Science 176:1665(1997))。我々のＸ線結晶学的および化学的研究によ
って、抗体はその基部にある疎水性環境内に位置するリジンを含む大きな結合ポ
ケットを含むという考え方が支持される。結合ポケットは、疎水性分配の結果と
してこのポケットに引き込まれる多様な基質を収容すると予想される。いったん
結合ポケット内に入ると、基質は高度に反応性のリジン求核物質に出会い、求核
性エナミンに分解する。同様に、アルドール受容体はこのポケットに入り、禁制
の立体的反応が存在しないかぎりアルドール付加に参画する。疑いなく、抗体ア
ルドラーゼが触媒する多数の異なる反応がこの案に適合するであろう。
【００７６】 最後に、アルドラーゼ触媒性抗体は、生命にとって一般に本質的である複雑な
酵素と多くの面で類似しているので、代謝性酵素の進化について我々は何かを学
ぶことができるかもしれない。複雑な触媒機能を達成することが如何に困難であ
るかについての疑問の答えは、生命の起源にについての我々の考えをさらに押し
進める上で重要である。本来、反応性免疫の過程は、多様化と選別の通常の進化
サイクルを、ほとんどの部分について選別が多様化に先行する進化サイクルにス
イッチを切り換える。我々の実験は、反応性物質の結合から複雑な触媒機能（選
別可能なように十分に効率的である）への移行は明らかに比較的単純であること
を暗示している。その機能を最適化させるためにいったん自然の選別が開始する
と、蛋白質は、関連する化学反応の遂行に関して洗練されるだけでなく、より複
雑な代謝体系（例えばグルコース代謝）にその活性を適応させるように洗練され
ていく。最終的には、適応の過程は触媒作用の範囲を狭い方向へ洗練させていく
であろう（この場合状況に固有の調節過程が作動するであろう）。しかしそのよ
うに狭い方向へと進む前に、広い特異性をもつ酵素が、関連する酵素類の進化の
出発点として機能することができるであろう。効率のよい化学的メカニズムの進
化が、酵素の進化および機能の多様化の出発点における主要な駆動力であるとい
う有利な立場によって、構造的に異なる蛋白質は、活性部位に適切に官能基を付
加するそれらの能力に基づいて効率のよい同一の化学的メカニズムに集中するか
もしれない（Hester et al. & K. Pointek, FEBS Lett. 292:237(1991)）。
【００７７】 いくつかの酵素の進化で初期に明らかになった事象は、反応性免疫原によるこ
れらの触媒性抗体の誘発と同様な過程での反応性物質（例えば毒素）との相互作
用であったかもしれない。原始の化学量論的蛋白質の化学反応性は、したがって
多様な触媒機能の迅速な進化のための鋳型として機能できるであろう。これは遺
伝子複製事象によって促進され、それぞれの酵素のコピーを自由に多様化させ、
特定の基質に対して特に最適化させるであろう。本明細書で述べた多くの反応に
ついて、その各々が遺伝子の複製事象の後で選択的に最適化される。
【００７８】 実施例３：アルドラーゼ抗体３８Ｃ２を用いたいくつかのブレビコミンの鏡像
選択的完全合成： 化学における１つの主要なゴールは鏡像選択的過程のための効率的な触媒の開
発である。レドックス反応のような官能基変換のための強力な触媒が過去２０年
間の間に数多く開発されたが、一般的に使用できる鏡像選択性Ｃ−Ｃ結合形成触
媒の例ははるかに少ない（(a)Noyori, Asymmetric Catalysis in Organic Synth
esis, Wiley-Interscience(1994);(b)I. Ojima(ed), Catalytic Asymmetric Syn
thesis, VCH(1993))。これに関しては、触媒性鏡像選択アルドール反応（これは
まぎれもなく最も重要なＣ−Ｃ結合形成反応である）は大きな挑戦を受けてきた
（触媒性鏡像選択アルドール反応の最近の例については以下を参照されたい：(a
)Y.M.A. Yamada, N. Yoshikawa, H. Sasai, M. Shibasaki, Angew. Chem. 109:1
942-1944(1997); Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36:1871-1873(1997);(b)E.M. C
arreira, W. Lee, R.A. Singer, J. Am. Chem. Soc. 117:3649-3650(1995）およ
びその中の参考文献))。
【００７９】 反応性免疫の過程を用いて、我々は、最近アルドラーゼ抗体３８Ｃ２を開発し
たが、これは天然に存在するクラスＩアルドラーゼのエナミンメカニズムを利用
する（Wagner, R.A. Lerner, C.F. Barbas III, Science 270:1797(1995)）。我
々は、この抗体アルドラーゼは、その酵素の天然の対応物とは対照的に（実際の
ところほとんどの触媒性抗体と対称的に）、この抗体アルドラーゼは極めて多様
な基質を受容することを示した（Barbas III et al. Science 278:2085-2092(19
97))。抗体３８Ｃ２は、ウィーランド＝ミーシャーケトンの製造スケールでの高
度に鏡像選択的な合成によって示したように、有機合成で有用であることが明ら
かにされた（Zhong et al. J. Am. Chem. Soc. 119:8131-8132(1997)）。以前に
（−）−α−マルチストリアチンの完全合成で抗体が用いられたが（Sinha, E.
Keinan, J. Am. Chem. Soc. 117:3653-3654(1995）、今日までに報告されたほと
んどの触媒性抗体は、一般的に有用な触媒の場合に要求される合成範囲を欠いて
いた。我々はここで、抗体触媒アルドール反応またはレトロアルドール反応を用
いて、高度に鏡像選択的な（−）−（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−エキソ−ブレビ
コミン（ｅｎｔ−６０００）および（−）−（１Ｓ）−１−ヒドロキシ−エキソ
−ブレビコミン（ｅｎｔ−５０００）の完全合成を、他の異なる８種のブレビコ
ミンの公式完全合成とともに報告する。
【００８０】 ６，８−ジオキサビシクロ〔３．２．１〕オクタンの誘導体（図３４）は、キ
クイムシの多様な種のフェロモンである（Silverstein, R.G. Brownlee, T.E. B
ellas, D.L. Wood, L.E. Browne, Science 159:889(1968)）。キクイムシの大発
生は、毎年数百万の樹木の破壊をもたらし、大きな環境破壊と経済的損失を生じ
る。（＋）−エキソ−ブレビコミン（７−エチル−５−メチル−６，８−ジオキ
サビシクロ〔３．２．１〕オクタン、（１０００))は、この種類のフェロモンの
特定第１号であった。いくつかの酸素付加エキソ−ブレビコミンが単離され、最
近合成された(Prestwich, Pure Appl. Chem. 61:551-554(1989);(b)W. Francke,
F. Schroeder, P. Philipp, H. Meyer, V. Shinnwell, G. Gries, Bioorg. Med
. Chem. 4:363-373(1996);(c)H. Takikawa, K.-i. Shimbo, K. Mori, Liebigs A
nn. 1997, 821-824;(d)Y. Yokoyama, K. Mori, Liebigs Ann. 1997, 845-849)。
エキソ−ブレビコミン１０００はアルドラーゼ酵素（ウサギ筋肉アルドラーゼ）
を用いて合成された。しかしながら、この天然のアルドラーゼは、供与体として
はジヒドロキシアセトンホスフェートに限定された。この制限は、その後の燐酸
基の酵素的除去を要求する（M. Schultz, H. Waldmann, W. Vogt, H. Kunz, Tet
rahedron Lett. 31:867-868(1990))。
【００８１】 （＋）−１−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミンおよび（＋）−２−ヒドロキ
シ−エキソ−ブレビコミンが、雄のマウンテンパインビートル（Dentroctonus b
revicomis)の揮発性物質で特定された。その１９８９年の発見と１９９６年の構
造解明以来、１−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミンは２回合成された。Franck
eらによる最初の合成は、シャープレスの不整エポキシ化による動力学的分解を 基にしていた。Moriらによる第二回目の合成は主要工程としてシャープレスの不
整ジヒドロキシル化を用いた。この方法を用いて、彼らはまた図３４に示したよ
うに（＋）−２−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミンの合成を報告した。
【００８２】 以前に我々は、供与体としてヒドロキシアセトンを用いた３８Ｃ２触媒アルド
ール反応は、α（２Ｒ，３Ｓ）−配置をもつα，β−ジヒドロキシケトンの高度
に局所部位選択的および立体選択的な生成をもたらすことを示した。さらに、今
日までに報告された遷移金属触媒のいずれとも異なり、これらの抗体はまた効率
的にレトロアルドール反応を触媒する。これらの触媒を用いた動力学的分解はα
（２Ｒ，３Ｓ）−アルドールの選択的破壊をもたらし、高い鏡像体過剰でβ（２
Ｒ，３Ｓ）−アルドールの回収を可能にする。アルドール付加およびレトロアル
ドール活性の両方を用いることによって、両アルドール鏡像体が同じ抗体触媒を
用いて製造できる（図３５に示す）。
【００８３】 結果と考察： 抗体３８Ｃ２は、製造スケールでアルデヒド７０００とヒドロキシアセトンと
の間でアルドール反応を触媒し、５５％の収量および９８％のｅｅでジオール８ ０００ をａｎｔｉ−ジアステレオマーとともに生じる（比４：１；アルデヒド７ ０００ は市販の５−オキソヘキサンニトリルから２つの工程で製造された）。分
析スケールではｅｅはさらに高かった（＞９９％）。ジヒドロキシケトン８００ ０ αは水素化ホウ素ナトリウムで還元され、ＨＰＬＣ分離後にトリオールｓｙｎ
−９０００およびａｎｔｉ−９０００を生じた。個々のトリオールの酸触媒脱保
護および環状化によって、本質的に鏡像体として純粋な形でヒドロキシブレビコ
ミンｅｎｔ−５０００およびｅｎｔ−６０００が得られる（図３６）。
【００８４】 ヒドロキシケトン８０００αのｅｅは、キラセルＡＤカラムを用いてキラルＨ
ＰＬＣ分析によって求めた。その絶対配置は合成参照サンプルとの比較によって
割り当てた。この合成参照サンプルは、ホーナー＝ワズワース＝エモンス反応、
その後ＡＤミックス−αまたはＡＤミックス−βを用いてシャープレスの不整ジ
ヒドロキシル化を行って７０００から製造した（図３７）（Mulzer et al. Tetr
ahedron Lett. 35:9021-9024(1994); Walsh, K.B. Sharpless, Synlett 1993, 6
05-606) 。
【００８５】 抗体３８Ｃ２はラセミ体８０００のレトロアルドール反応を触媒し、動力学的
分解を介してラセミ化合物の５２％変換の後、＞９９％のｅｅでジオール８００ ０ βを生じた。したがって、ヒドロキシブレビコミン５０００および６０００は
、図３８で述べた経路と類似の経路によって８０００βから得ることができる。
【００８６】 ２−ヒドロキシル化ブレビコミン３０００および４０００は、化合物５０００ および６０００について記載した方法と同様な方法を用いてジヒドロキシケトン １１０００ αから製造した。抗体３８Ｃ２は、アルデヒド１００００と１−ヒド
ロキシ−２−ブタノンとの間でアルドール反応を触媒し、１１０００αを＞９９
％ｅｅで生じた（アルデヒド１００００は市販のエチルレブリネートから２工程
で製造した）。また、鏡像体（ｅｎｔ−３０００およびｅｎｔ−４０００）はア
ルドールｒａｃ−ｓｙｎ−１１０００の動力学的分解により製造でき、５４％変
換後＞９９％ｅｅで１１０００βを生じた。２−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコ
ミン４０００は、以前に報告されたことがない新規な化合物である。我々は、そ
れは酸素付加によりエンド−ブレビコミン２０００に由来する天然の生成物であ
ろうと考える。これは、エキソ−ブレビコミン１０００はヒドロキシ−ブレビコ
ミン３０００の生合成の前駆体であるという事実によって支持される。３からエ
キソ−ブレビコミン１０００を合成することは既に報告されている（Taniguchi,
H. Ohnishi, K. Ogasawara, Chem. Commun. 1996, 1477-1478）。したがって、
エキソ−ブレビコミン１の両鏡像体は今や入手可能である（図３８）。 全ての抗体触媒反応の動力学的パラメーターは図３９に示されている。
【００８７】 要約すれば、我々は、ブレビコミンｅｎｔ−５０００およびｅｎｔ−６０００ の高度に鏡像選択的な完全合成および、８つの他のブレビコミン（５０００、６
０００、３０００、ｅｎｔ−３０００、４０００、ｅｎｔ−４０００、１０００
、ｅｎｔ−１０００）の公式完全合成を、ただ１つの抗体触媒を利用して実施し
てみせた。先ず最初に、触媒抗体は、合成工程の総数を減らすため、および天然
生成物合成の鏡像選択性を高めるために用いた。これらの結果は、効率的でもあ
り範囲も広い抗体触媒を生成する反応性免疫の威力を強調している。
【００８８】 実施例４：抗体触媒による１−デオキシ−Ｌ−キシルロースの短工程鏡像選択
的合成： １−デオキシ−Ｌ−キシルロース（１１１１）の新規な効率的合成を示す。主
要工程は、抗体触媒によるベンジルオキシアセトアルデヒドへのヒドロキシアセ
トンの高度に鏡像選択的アルドール付加によって達成される。本明細書で述べる
合成はアイソトープ標識誘導体を得る便利な経路を提供するはずである。
【００８９】 最近１−デオキシキシルロースに対する注目が文献で高まってきたことで、我
々はこの重要な炭水化物の合成結果の報告を促された。この炭水化物は最初スト
レプトミセス＝ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicuus)から１９７６
年に単離された（Slechta et al. J. Antibiot. 29:685(1976); H. Hoeksema, L
. Baczynskyj, J. Antibiot. 29:688(1976))。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
は、チアミン（ビタミンＢ１）およびピリドキサル（ビタミンＢ６）の生合成の
中間体であることが分かった。Ｌ−およびＤ−鏡像体が広範囲の微生物によって
ピルビン酸およびＬ−またはＤ−グリセルアルデヒドからそれぞれ合成される。
最近になって、この糖は、テルペノイド構築ブロックへのまた別の非メバロネー
ト系生合成前駆体であることが分かった。
【００９０】 今日まで１−デオキシキシルロースの両鏡像体のいくつかの合成が報告されて
きたが、これらにはアイソトープ標識を伴うものが含まれる。これらのうちのい
くつかは全体的収量が低い多段合成である。本明細書で我々は、市販のアルドラ
ーゼ抗体３８Ｃ２を用いる１−デオキシ−Ｌ−キシルロースの新規な高効率鏡像
選択性合成を報告する。この抗体は、２００を越える異なるアルドールおよびレ
トロアルドール反応を通常は優れた鏡像選択性で触媒する（J. Wagner, R.A. Le
rner, C.F. Barbas III, Science 270:1797(1995);(b)C.F. Barbas III, A. Hei
ne, G. Zhong, T. Hoffmann, S. Gramatikova, R. Bjｏrnestedt, B. List, J.
Anderson, E.A. Stura, E.A. Wilson, R.A. Lerner, Science 278:2085-2092(19
97); (c)T. Hoffmann, G. Zhong, B. List, D. Shabat, J. Anderson, S. Grama
tikova, R.A. Lerner, C.F. Barbas III, J. Am. Chem. Soc. 120:2768(1998);(
d)G.F. Zhong, D. Shabat, B. List, J. Anderson, S.C. Sinha, R.A. Lerner,
C.F. Barbas III, Angew. Chem. 37:2481-4(1998);(e)B. List, D. Shabat, C.F
. Barbas III, R.A. Lerner, Chem. Eur. J. 4:881-5(1998))。
【００９１】 ヒドロキシアセトンは、抗体３８Ｃ２のための最良のアルドール供与体の１つ
である。このことは、他の触媒（化学的または生物学的触媒）が、アルドール反
応の供与基質としてヒドロキシアセトンを用いることができない状況で明瞭であ
る。一般的原則として、我々は、ヒドロキシアセトンは種々のアルデヒドと高度
に局所部位選択的、偏左右異性選択的および鏡像選択的に反応し、対応するα（
２Ｒ，３Ｓ）−ジヒドロキシケトンを生じることを見出した。対応するβ−（２
Ｓ，３Ｒ）−異性体は、３８Ｃ２触媒鏡像選択性レトロアルドール反応によるラ
セミ混合物から得ることができる（図４０）。この方法は、多くのアルドールの
動力学的分解および１０種の異なるブレビコミンの完全合成で明示してみせるこ
とができた。
【００９２】 市販のベンジルオキシアセトアルデヒドへの抗体３８Ｃ２触媒アルドール付加
によって、α，β−ジヒドロキシケトン２１１１ａが３２％の単離収量で得られ
た。この反応は非常に低い触媒負荷（０．０４ｍｏｌ％）を用い、アルデヒドの
５６％の変換後に停止した。反応速度はこの時点で、おそらく２１１１ａがわず
かに酸化され対応する１，３−ジケトンを生成するために遅くなった。β−ジケ
トンは抗体の活性部位リジンに結合し、反応してエナミノン（これは強力に触媒
を抑制する）を形成する。以前の事例で観察されたように、いくらかのアンチジ
アステレオマーが生成された。この事例では、わずか７％の望まないアンチ生成
物が観察されたが、シリカゲルクロマトグラフィーによって純粋な生成物が得ら
れた。ケトン２１１１ａは、水素添加によって容易に１−デオキシ−Ｌ−キシル
ロース（１１１１）に変換された（図４１）。
【００９３】 ０．５ｍｌのアセトニトリル中のベンジルオキシアセトアルデヒド（８０ｍｇ
、０．５３mmol）をＰＢＳ（燐酸緩衝食塩水、１００ｍＭ）中の抗体３８Ｃ２溶
液９ｍｌ（３５ｍｇ、０．２３mmol）に加え、続いてヒドロキシアセトン（０．
５ｍｌ、６．３mmol）を添加した。室温で４８時間後、反応は５６％変換に達し
、混合物を凍結乾燥させた。残留物を塩化メチレンで抽出した。減圧下で溶媒を
除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキ
サン、１／１）で精製し、純粋な２１１１ａ（３９ｍｇ、０．１７mmol、３２％
）を９７％ｅｅで生じた。ベンジルエーテル２１１１ａ（３９ｍｇ、０．１７mm
ol）を１ｍｌのメタノールに溶解し、炭素上の触媒量の水酸化パラジウムで水素
添加した。２時間後、混合物をセリットでろ過し、溶媒を減圧下で除去して純粋
な１−デオキシ−Ｌ−キシルロース（１９ｍｇ、０．１４mmol、８１％）を生じ
た。
【００９４】 アルドール生成物の鏡像体純度を決定するために、我々は参考化合物を図４２
に示したように合成した。ベンジルオキシアセトアルデヒドとのジエチル−２−
オキソプロピル−ホスフェートのホーナー＝ワズワース＝エモンス反応によって
、既知のオレフィン３１１１を生成し、これをシャープレス（Sharpless)の方法
にしたがってジヒドロキシル化して参照化合物アルドール２１１１ａおよび２１ １１ｂ を高いｅｅで得た（P.J. Walsh, K.B. Sharpless, Synlett 1993, 605-61
0; J. Mulzer, B. List, Tetrahedron Lett. 35:9021-4(1994)）。シャープレス
ＡＤ反応は意図的にサブオプティマルな条件（反応は室温で実施）で実施した。
これは、このような条件下で形成される所望しない少量のフラクションをクロマ
トグラフィー標準物として使用するためである。
【００９５】 ジヒドロキシケトン２１１１ａの鏡像体過剰は、キラセルＡＤカラムを用いて
キラルＨＰＬＣ分析によって測定し、９７％ｅｅであることが分かった（図４３
）。絶対配置は、シャープレスのＡＤから得た真正サンプルと比較して割り当て
た。
【００９６】 要するに、我々は新規な１−デオキシ−Ｌ−キシルロースの合成を本明細書で
示した。この２工程合成は今日までに報告されたもので最も短い。主要工程は、
アルドール供与体としてヒドロキシアセトンを用いて、高度に偏左右異性体選択
的および鏡像選択的な抗体触媒アルドール反応を介して達成された。抗体３８Ｃ
２（アルドリッチ（Aldrich)から市販）は、非保護ヒドロキシアセトンのアルデ
ヒドへのアルドール付加を触媒することができる唯一の既知触媒である。アイソ
トープ標識１−デオキシキシルロースの調製（更なる生物学的研究のために必要
）は、我々の合成方法および標識ベンジルオキシアセトアルデヒドおよび／また
はヒドロキシアセトンを用いて容易に実施できる（Piel et al. Tetrahedron Le
tt. 38:6387(1997))。
【００９７】 アルドラーゼ活性をもつ触媒性抗体を製造する方法は、米国特許第５５７１６
８１号および米国特許第５７３３７５７号（これらの文献は参照により本明細書
に含まれる）に開示されている。 本発明の好ましい形態を図面で示して説明してきたが、好ましい形態の変形例
は当業者には明白であろうと思われるので、本発明は、ここに示した特定の形態
に限定されず、むしろ下記請求項の記載のように限定される。
【００９８】 合成プロトコル 原則：1ＨＮＭＲスペクトルは、ブルーカー（Bruker）ＡＭＸ−５００ＮＭＲ分 光計で記録した。質量スペクトルは、ＡＰＩ−ＩＩＩ−ＰＥサイエックス（Scie
x)トリプル四極子質量分光計で記録した。無水条件を要求する全ての反応はオー
ブン乾燥ガラス器具でＡｒまたはＮ2雰囲気下で実施した。化学薬品および溶媒 は、純度puriss p.A. または標準的技術で精製した。ＴＨＦはナトリウム−ベン
ゾフェノンから蒸留した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：シリカゲルプレ
ートメルク（Merck)６０Ｆ254、化合物はＵＶ光で可視化するか、および／また は２５ｇのホスホモリブデン酸、１０ｇのＣｅ（ＳＯ4）2・Ｈ2Ｏ、６０ｍｌの 濃硫酸および９４０ｍｌのＨ2Ｏの溶液で処理し、続いて加熱するか、および／ または６０ｍｌの濃硫酸中の２，４−ジニトロフェニルヒドラジン１２ｇ、８０
ｍｌのＨ2Ｏおよび２００ｍｌの９５％ＥｔＯＨの溶液で染色し、続いて加熱す るか、および／または沃素浴（ＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ（１：１）４００ｍｌ中の３０ ｇのＩ2、２ｇのＫＩ）に浸漬して加温することによって可視化。フラッシュク ロマトグラフィー（ＦＣ）：シリカゲルメルク６０（粒子サイズ０．０４０−０
．０６３ｍｍ）、溶離剤は括弧内に表示。1ＨＮＭＲ：ブルーカーＡＭＸ３００ 、ブルーカーＡＭＸ２５０。化学的シフトは、ＴＭＳに対するｄ相対値（ｄ＝０
ｐｐｍ）で示される。共役定数ＪはＨｚで示される。スペクトルは、別に記載が
なければ室温で溶媒としてＣＤＣｌ3中で記録した。ＨＲ−ＭＳ：液体二次イオ ン化（ＬＳＩ−ＭＳ）：３−ニトロベンジルアルコールマトリックスによるＶＧ
ＺＡＢ−ＺＳＥ。
【００９９】 抗体安定性：抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２は、種々の緩衝溶液（ｐＨ５．５
から８．５）に溶解して（純水でさえも）数週間室温で安定である。それらを凍
結乾燥させ、さらにセファデックスカラムを通したとき活性の損失は５％未満で
ある。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭ燐酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．４）中で−７８℃で抗体を１０から２０ｍｇ／ｍｌのストック溶液として
保存した場合、検出可能な損失は見出されなかった。
【０１００】 図１に示した４−（４'−アセトアミドフェニル）ブチルアルデヒド（６）の 調製：アルデヒド６は、市販の４−（４'−アミノフェニル）酪酸から出発し以 下のように４工程で調製した。 （ｉ）４−（４'−アセトアミドフェニル）酪酸。４−（４'−アミノフェニル
）酪酸（４．０ｇ、２２mmol）をアセトニトリルと水（９／１）の混合溶媒１５
０ｍｌに加えた。無水酢酸（７．４ｇ、５５mmol、２．５当量）を０℃で加え、
続いて反応混合物を室温で４時間攪拌した。この反応混合物をろ過し、その後１
２０℃で一晩乾燥させ、４．５３ｇの４−（４'−アセトアミドフェニル）酪酸 （９３％）を得た。ＨＲ−ＭＳ：２２２．１１４０；Ｃ１２Ｈ１６Ｏ３Ｎ＋（計
算値２２２．１１３０）；Ｃ１２Ｈ１５Ｏ３Ｎ（２２１．２６）。
【０１０１】 （ｉｉ）４−（４'−アセトアミドフェニル）酪酸メチルエステル。４−（４'
−アセトアミドフェニル）酪酸（４．５０ｇ、２０mmol）および炭酸カリウム（
２．９０ｇ、２１mmol）を２０ｍｌの乾燥ＤＭＦに加えた。反応混合物を室温で
１５分攪拌した。続いてヨウ化メチル（１４．２ｇ、０．１０ｍｏｌ）を窒素下
で加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒およびヨウ化メチルを蒸発さ
せた後、固形の混合物が得られ、その混合物から酢酸エチル（３ｘ７０ｍｌ）で
抽出してメチルエステルを４．７ｇ得た（＞９９％）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨ
ｚ，ＣＤＣｌ3）：７．４１（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．３４（ｓ，ｂｒ，１ Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），２．６１（ｔ
，Ｊ７．３，２Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ７．３，２Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ）
，１．９３（ｈｅｐｔ，Ｊ７．３，２Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２３６．１２９６；Ｃ
１３Ｈ１８Ｏ2Ｎ＋（計算値２３６．１２８７）；Ｃ１３Ｈ１７Ｏ３Ｎ（２３５ ．２８）。
【０１０２】 （ｉｉｉ）４−（４'−アセトアミドフェニル）ブタノール。４−（４'−アセ
トアミドフェニル）酪酸メチルエステル（４．７０ｇ、２０mmol）を乾燥ＴＨＦ
５０ｍｌに溶解し、塩化メチレン中のＤＩＢＡＬＨ（１．０Ｍ、４０ｍｌ）を−
３０℃で滴下して加えた。混合物をこの温度で３時間攪拌し続けた。飽和塩化ア
ンモニウム（２５ｍｌ）をゆっくりと加えた。酢酸エチル（３ｘ８０ｍｌ）で抽
出し、続いて溶媒を蒸発させて残留物を得て、これをＦＣ（ヘキサン／酢酸エチ
ル４：１）で精製して、２．７３ｇ（６６％）の４−（４'−アセトアミドフェ ニル）ブタノールを得た。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．４２
（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．２３（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ８．
４，２Ｈ），３．７１（ｔ，Ｊ７．２，２Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ７．２，２Ｈ
），２．１７（ｓ，３Ｈ），１．６５（ｍ，４Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２０８．１３
４２；Ｃ１２Ｈ１８Ｏ２Ｎ＋（計算値２０８．１３３８）；Ｃ１２Ｈ１７Ｏ２Ｎ
（２０７．２７）。
【０１０３】 （ｉｖ）４−（４'−アセトアミドフェニル）ブチルアルデヒド（６）。塩化 メチレン（２５ｍｌ）と塩化オキサリル（１．０ｍｌ、１１mmol）の混合物をフ
ラスコに入れた。塩化メチレン（５ｍｌ）で希釈したジメチルスルホキシド（１
．７ｍｌ、２２mmol）を−７８℃でこの攪拌溶液に加えた。反応混合物を２分間
攪拌し、塩化メチレン（１０ｍｌ）中の４−（４'−アセトアミドフェニル）ブ タノール（２．２ｇ、１０mmol）を５分以内に加えた。さらに１５分間攪拌を継
続した。トリエチルアミン（７．０ｍｌ。５０mmol）を加え、反応混合物を５分
間攪拌し、続いて室温に加温した。水（５０ｍｌ）を加え、水層を塩化メチレン
（５０ｍｌ）で再抽出した。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（１００
ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濃縮後、２．０７ｇの純粋な
４−（４'−アセトアミドフェニル）ブチルアルデヒド（６）をＦＣ（ヘキサン ／酢酸エチル３：１）によって得た。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3） ：９．７６（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．２３（
ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ７．２
，２Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ７．２，２Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），１．９４
（ｈｅｐｔ，Ｊ７．２，２Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２０６．１１８５；Ｃ１２Ｈ１６
Ｏ２Ｎ＋（計算値２０６．１１８１）；Ｃ１２Ｈ１５Ｏ２Ｎ（２０５．２６）。
【０１０４】 図１０、１１、１３、１５、１６および１８に示したアルドール生成物の化学
的調製のための一般的方法：対応するケトン（１．０mmol；図１４に開示する好
ましいアルデヒドのいくつかはアルドリッチ、シグマ（Sigma)、フルカ（Fluka)
などから購入するか、または本明細書に記載したように得た）を新しく調製した
ＴＨＦ２ｍｌ中のＬＤＡ溶液（１．０５mmol）に−７８℃で加えた。この温度で
３０分間攪拌した後、適切なアルデヒド（１．０mmol；図１および図１０、１１
、１３、１５、１６および１８に開示した好ましいアルデヒドのいくつかはアル
ドリッチ、シグマ、フルカなどから購入するか、または本明細書に記載したよう
に得た）（２ｍｌのＴＨＦに溶解）を１分かけて加えた。−７８℃で５−３０分
間攪拌した後で、飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液（１ｍｌ）を加え、反応混合物を室温に加 温した。生成物を酢酸エチル（３ｘ１０ｍｌ）で抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4 ）て蒸発させた。純粋なアルドール生成物をＦＣによって得た。アルデヒド３− ８ および４８を用いたアセトン付加生成物の分光光度計によるデータは実施例と
して以下に示す。
【０１０５】 ６−（４'−アセトアミドフェニル）−４−ヒドロキシ−２−ヘキサノン（９ ）：図に示されている、購入または本明細書の記載のようにして得た表示のアル
デヒドおよびケトンを用い上記の方法にしたがって合成した。ＦＣ（酢酸エチル
／ヘキサン７５：２５）により０．２１ｇ（８５％）の純粋なアルドール９が生
成された。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．１２（ｓ，ｂｒ，１
Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），４
．０１（ｍ，１Ｈ），３．４２（ｍ，１Ｈ），２．７１（ｍ，１Ｈ），２．６２
（ｍ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．７５（ｍ，
１Ｈ），１．６４（Ｍ，１Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２５０．１４５０；Ｃ１４Ｈ２０
Ｏ３Ｎ＋（計算値２５０．１４４３）；Ｃ１４Ｈ１９Ｏ３Ｎ（２４９．３１）。
【０１０６】 ４−（４'−アセトアミドフェニル）−４−ヒドロキシ−２−ブタノン（１８ ）：図に示されている、購入または本明細書の記載のようにして得た表示のアル
デヒドおよびケトンを用い上記の方法にしたがって合成いた。ＦＣ（酢酸エチル
／ヘキサン７０：３０）によって０．１８ｇ（８２％）の純粋なアルドール１８ が生成された。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．８８（ｓ，
１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ８．５，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ８．５，２Ｈ），
５．２８（ｄ，Ｊ４．４，１Ｈ），４．９１（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ
），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，１Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２４４．０９
５５；Ｃ１２Ｈ１５Ｏ３ＮＮａ+（計算値２４４．０９４９）；Ｃ１２Ｈ１５Ｏ ３Ｎ（２２１．２６）。
【０１０７】 ４−（４'−イソブチルアミドフェニル）−４−ヒドロキシ−２−ブタノン（ ５９ ）：図に示されている、購入または本明細書の記載のようにして得た表示の
アルデヒドおよびケトンを用い上記の方法にしたがって合成した。ＦＣ（酢酸エ
チル／ヘキサン４０：６０）によって０．２３ｇ（９１％）の純粋なアルドール ５９ が生成された。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．５０（ｄ， Ｊ８．５，２Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ８．５，２Ｈ），７．２７（ｓ，ｂｒ，１
Ｈ），５．１２（ｍ，１Ｈ），３．３６（ｓ，１Ｈ），２．８４（ｍ，２Ｈ）２
．５１（ｐｅｎｔ，Ｊ６．８，１Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），１．２５（ｄ，
Ｊ６．８，６Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２７２．１２６７；Ｃ１４Ｈ１９Ｏ３ＮＮａ+ （計算値２７２．１２６３）；Ｃ１４Ｈ１９Ｏ３Ｎ（２４９．３１）。
【０１０８】 ６−（４'−アセトアミドフェニル）−４−ヒドロキシ−５−メチル−２−ヘ キサノン（２１）：図に示されている、購入または本明細書の記載のようにして
得た表示のアルデヒドおよびケトンを用い上記の方法にしたがって合成した。Ｆ
Ｃ（酢酸エチル／ヘキサン７０：３０）によって０．２１ｇ（７９％）の純粋な
アルドール２１が生成された。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７． ８５（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ８．３，２Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ
８．３，２Ｈ），３．９５（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ
，１Ｈ）２．６６（ｍ，３Ｈ），２．５５（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ）
，２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），１．７６（ｍ，１Ｈ），０．
８５（ｄ，Ｊ６．６，３Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２６４．１６０８；Ｃ１５Ｈ２２Ｏ
３Ｎ＋（計算値２６４．１６００）；Ｃ１５Ｈ２１Ｏ３Ｎ（２６３．３４）。
【０１０９】 ７−（４'−アセトアミドフェニル）−４−ヒドロキシ−２−ヘプタノン（２ ４ ）：図に示されている、購入または本明細書の記載のようにして得た表示のア
ルデヒドおよびケトンを用い上記の方法にしたがって合成した。ＦＣ（酢酸エチ
ル／ヘキサン７０：３０）によって０．２３ｇ（８９％）の純粋なアルドール２ ４ が生成された。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．３９（ｄ，Ｊ ８．４，２Ｈ），７．２４（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ
），４．０５（ｍ，１Ｈ），３．０４（ｍ，１Ｈ），２．５７（ｍ，４Ｈ），２
．１７（ｓ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｍ，２Ｈ），１．４５
（ｍ，２Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２８６．１４１１；Ｃ１５Ｈ２１Ｏ３ＮＮａ+（計 算値２８６．１４１９）；Ｃ１５Ｈ２１Ｏ３Ｎ（２６３．３４）。
【０１１０】 ４−（４'−ニトロフェニル）−４−ヒドロキシ−２−ブタノン（２７）：図 に示されている、購入または本明細書の記載のようにして得た表示のアルデヒド
およびケトンを用い上記の方法にしたがって合成した。ＦＣ（酢酸エチル／ヘキ
サン５０：５０）によって０．１８ｇ（８６％）の純粋なアルドール２６が生成
された。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：８．２１（ｄ，Ｊ７．２， ２Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ７．２，２Ｈ），５．２５（ｍ，１Ｈ），３．５６（
ｄ，Ｊ３．２，１Ｈ），２．８３（ｍ，２Ｈ），２．２１（ｓ，１Ｈ）；ＨＲ−
ＭＳ：２３２．０５９１；Ｃ１０Ｈ１１Ｏ４ＮＮａ+（計算値２３２．０５８６ ）；Ｃ１０Ｈ１１Ｏ４Ｎ（２０９．２０）。
【０１１１】 ６−（４'−ニトロフェニル）−４−ヒドロキシ−５−ヘキセン−２−オン（ ３０ ）：図に示されている、購入または本明細書の記載のようにして得た表示の
アルデヒドおよびケトンを用い上記の方法にしたがって合成した。ＦＣ（酢酸エ
チル／ヘキサン５０：５０）によって０．２１ｇ（８９％）の純粋なアルドール ３０ が生成された。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：８．１５（ｄ， Ｊ７．３，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ７．３，２Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ１５．
９，１Ｈ），６．３５（ｄｄ，Ｊ１５．９，Ｊ５．３，１Ｈ），４．７８（ｍ，
１Ｈ），３．２８（ｄ，Ｊ３．７，１Ｈ），２．７３（ｍ，２Ｈ），２．２１（
ｓ，１Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：２５８．０７５１；Ｃ１２Ｈ１３Ｏ４ＮＮａ+（計算 値２５８．０７４２）；Ｃ１２Ｈ１３Ｏ４Ｎ（２３５．２４）。
【０１１２】 ４−ヒドロキシノナ−５，７−ジエン−２−オン（４９）：図に示されている
、購入または本明細書の記載のようにして得た表示のアルデヒドおよびケトンを
用い上記の方法にしたがって合成した。ＦＣ（酢酸エチル／ヘキサン１５：８５
）によって８８ｍｇ（５７％）の純粋なアルドール４９が生成された。１ＨＮＭ
Ｒ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：６．２１（ｍ，１Ｈ），６．０５（ｍ，１Ｈ ），５．７４（ｍ，１Ｈ），５．５４（ｍ，１Ｈ），４．５６（ｍ，１Ｈ），２
．９３（ｍ，１Ｈ），２．６２（ｄ，Ｊ６．２，２Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ）
，１．７５（ｄ，Ｊ６．５，３Ｈ）；ＨＲ−ＭＳ：１７７．０８９９；Ｃ９Ｈ１
４Ｏ２Ｎａ+（計算値１７７．０８９２）；Ｃ９Ｈ１４Ｏ2（１５４．２１）。
【０１１３】 抗体触媒： 一般的調製用抗体触媒反応： 図１５に示した（Ｓ）４−ヒドロキシ−６−（４−ニトロフェニル）−５−ヘ
キセン−２−オン（３０）の調製のための図１０、１１、１３、１５、１６およ
び１８に示した抗体触媒反応の代表例：１５ｍｌのＤＭＦおよび３１ｍｌのアセ
トン（また別に他のケトン供与体を図に示したが、市販ルートで購入するかまた
は本明細書の記載にしたがって得ることができる）中の４−ニトロシンナムアル
デヒド８（１１０ｍｇ、０．６１mmol；また別に他のアルデヒド受容体を図に示
したが、市販ルートで購入するかまたは本明細書の記載にしたがって得ることが
できる）の溶液に、ＰＢＳ緩衝液（５７１ｍｌ、脱気してアルゴン下で維持）を
ゆっくり添加して沈澱を避けた。抗体３８Ｃ２（１２０ｍＭ溶液８．０ｍｌ）を
添加した。４−ニトロシンナムアルデヒドおよび抗体３８Ｃ２の最終濃度は、５
％（ｖ／ｖ）のアセトンを含む総容積６２５ｍｌ中でそれぞれ１．０ｍＭおよび
１．９ｍＭであった。この反応混合物をアルゴン下で７日間暗所で室温で保持し
た。反応混合物を塩化ナトリウムで飽和させ、３ｘ１５０ｍｌの酢酸エチルで抽
出した。抽出物をＭｇＳＯ4上で乾燥させて蒸発させ、１４０ｍｇの粗生成物を 得た。ＦＣ（１：２、酢酸エチル／ヘキサン）による精製で９６ｍｇ（６７％）
の純粋なアルドール生成物（３０）を９１％のｅｅで生じた。
【０１１４】 実施例２：フッ素化アルドール鏡像体選択的調製のための図１１に示した抗体
触媒反応の代表例： ０．２ｍｌのＤＭＦ中の３−（４'−アセトアミドフェニル）プロパナール４ （１５ｍｇ、０．０７８mmol；また別に他のアルデヒド受容体を図に示したが、
市販ルートで購入するかまたは本明細書の記載にしたがって得ることができる）
の溶液、０．５ｍｌのフルオロアセトン（また別に他のケトン供与体を図に示し
たが、市販ルートで購入するかまたは本明細書の記載にしたがって得ることがで
きる）および８．０ｍｌのＰＢＳ緩衝液を抗体３８Ｃ２（１２０ｍＭ溶液１．５
ｍｌ）に加えた。３−（４'−アセトアミドフェニル）プロパナールおよび抗体 ３８Ｃ２の最終濃度は、５％（ｖ／ｖ）のフルオロアセトンを含む総容積１０．
２ｍｌ中でそれぞれ７．６ｍＭおよび１７．５ｍＭであった。この反応混合物を
２１日間室温で保持した。３つのアルドール生成物ｓｙｎ−１６（ｅｅ９５％）
、ａｎｔｉ−１６（ｅｅ３４％）および６０（ｅｅ９７％）（図１１）を準製造
用ＲＨ−ＨＰＬＣ（カラム：ＶＹＤＡＣ蛋白質＆ペプチドＣ１８、（＝２５４ｎ
ｍ、１２％ＣＨ３ＣＮ／８８％の水（０．１％のＴＦＡを含む）、４．０ｍｌ／
分、１．０ｍｌ反応混合物／注入）によって単離し、ｓｙｎ−１６（１２ｍｇ、
ｔＲ＝２０．８分、収量６１％）、ａｎｔｉ−１６（３．６ｍｇ、ｔＲ＝１８．
２分、収量２１％）および６０（１．２ｍｇ、ｔＲ＝１６．３分、収量７％）が
得られた。全体的な収量は８２％であった（１５％のアルデヒド４が回収された
）。
【０１１５】 ６−（４'アセトアミドフェニル）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−ヘ キサノンのｓｙｎ−異性体（ｓｙｎ−１６）：図に示されている、購入または本
明細書の記載のようにして得た表示のアルデヒドおよびケトンを用い上記の方法
にしたがって合成した。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．４１（ ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．２２（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ８．４
，２Ｈ），４．６２（ｄｄ，Ｊ４８．８，４．９，２Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ
），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．６７（ｍ，１Ｈ），２．３０（ｄ，Ｊ５．１，
３Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．８４（ｍ，２Ｈ）。
【０１１６】 ６−（４'アセトアミドフェニル）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−ヘ キサノンのａｎｔｉ−異性体（ａｎｔｉ−１６）：図に示されている、購入また
は本明細書の記載のようにして得た表示のアルデヒドおよびケトンを用い上記の
方法にしたがって合成した。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．４ ２（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．１７（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ８
．４，２Ｈ），４．６４（ｄｄ，Ｊ４８．９，２．４，１Ｈ），４．００（ｄｍ
，Ｊ２４．５，１Ｈ），２．７７（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｄ，Ｊ５．０，３Ｈ
），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ）。
【０１１７】 ６−（４'アセトアミドフェニル）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−ヘ キサノンのレジオ−異性体（６０）：１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3） ：図に示されている、購入または本明細書の記載のようにして得た表示のアルデ
ヒドおよびケトンを用い上記の方法にしたがって合成した。（７．４３（ｄ，Ｊ
８．４，２Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．１４（ｓ，ｂｒ，１Ｈ
），４．８３（ｄ，Ｊ４７．５，２Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ
，４Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．８１（ｍ，２Ｈ）。
【０１１８】 図１５で示した２−〔１'−（４"−イソブチルアミドフェニル），１'−ヒド ロキシ〕メチルシクロペンタノン（１９）の製造スケールでの合成のために図１
５で示した生成物の代表例：シクロペンタノン（１ｍｏｌ、８８ｍｌ；また別に
他のケトン供与体を図に示したが、市販ルートで購入するかまたは本明細書の記
載にしたがって得ることができる）をＭＯＰＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．
４）９１２ｍｌに溶解した。次に、抗体３８Ｃ２（１．３mmol、０．１ｇ）を加
え、アルデヒド、４−イソブチルアミドベンジアルデヒド（１．１mmol、２１３
ｍｇ；また別に他のアルデヒド受容体を図に示したが、市販ルートで購入するか
または本明細書の記載にしたがって得ることができる）の最初の添加を実施した
。反応物を２４時間攪拌し、続いて第二のアルデヒド添加を実施した。その後の
２４時間で２回のアルデヒドの添加が続き総量８５２ｍｇ、４．４mmolとなった
。反応の進行は、ライニン（Rainin）カラム(Microsorb-MV, C18）（３００オン
グストローム、５ｍｍ；２５０ｘ４．６ｍｍ）およびアセトニトリル／水混合物
（２０％ＣＨ３ＣＮ／８０％水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む))を用い流速
１．０ｍｌ／分でＨＰＬＣ（Hitachi HPLCシステム：ポンプＬ−７１００、ＵＶ
検出装置Ｌ−７４００およびインテグレータＤ−７５００）によってモニターし
た。反応混合物を暗所のアルゴン下で室温で２１日間保持した。反応混合物を続
いてＮａＣｌで飽和させた。この混合物を３ｘ５００ｍｌの酢酸エチルで抽出し
、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて１．４ｇの粗生成物を得た。ＦＣ（６０ ：４０、ＥｔＡｃ／Ｈｅｘ．）による精製で＞９５％のｄｅで０．９ｇ（７２％
）の純粋な生成物（１９）が得られた。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）
：（７．４９（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），７．３１（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．２７
（ｄ，Ｊ８．４，２Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），２．
６−１．６（ｍ，７Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ６．８，６Ｈ）。
【０１１９】 抗体アッセイ：全抗体触媒反応は、基質４３（模式図４、Ｈ2Ｏ、ｐＨ６．５ ）および基質ｎ−Ｃ4Ｈ9ＣＨＯ、ｎ−Ｃ5Ｈ11ＣＨＯ、ｎ−Ｃ6Ｈ13ＣＨＯ（表６
、（３−〔Ｎ−モルフォリノ〕プロパンスルホン酸）ナトリウム塩緩衝液（ＭＯ
ＰＳ緩衝液）、ｐＨ７．０）との反応を除いて燐酸緩衝食塩水（１０ｍＭ燐酸塩
、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で実施した。基質３−８、３３ ３７ ３９ ４１ ４３ ４５および４８を用いる全ての抗体触媒反応およびバックグ
ラウンド反応は、ライニン（Rainin）カラム（マイクロソーブ(Microsorb）−Ｍ
Ｖ、Ｃ１８、３００オングストローム、５ｍｍ；２５０ｘ４．６ｍｍ）および溶
離剤としてアセトニトリル／水混合物（０．１％トリフルオロ酢酸含有）（流速
１．５ｍｌ／分または１．０ｍｌ／分）を用いて、高圧液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ；Hitachi HPLCシステム（ポンプＬ−７１００、ＵＶ検出装置Ｌ−７
４００およびインテグレータＤ−７５００))によってモニターした。生成物５１ −５３の生成に続いてガスクロマトグラフィー（ＤＢ−５（J&W Scientific）、
長さ：３０ｍ。Ｉ．Ｄ．：０．３２ｎｍ、温度：６５℃（２分）、速度：１０℃
／分、ｔＲ：（５１−ａｎｔｉ）＝１３．８２分、（５１−ｓｙｎ）＝１４．０
５分、（５２−ａｎｔｉ）＝１２．５６分、（５２−ｓｙｎ）＝１２．８２分、
（５３−ａｎｔｉ）＝１１．２４分、（５３−ｓｙｎ）＝１１．５２分）を実施
した。
【０１２０】 交差アルドール反応の比速度：交差アルドール反応の比速度は、受容基質（５
００ｍＭ）、抗体（２ｍＭ）および供与基質（１．０Ｍ）の開始濃度を用いて１
０％の反応が完了する前に決定した。 自己アルドールおよび分子内アルドール反応の比速度：自己アルドールおよび
分子内アルドール反応の比速度は、基質、０．１０Ｍおよび抗体、５ｍＭの開始
濃度を用いて１０％の反応が完了する前に決定した。 ミハエリス−メンテンカイネティクス：抗体触媒反応混合物の生成物形成また
は百分率変換は、ＨＰＬＣまたはＧＣによってモニターした。実験データは、反
応のＫcatおよびＫMを得るためにグラフィット（GraFit）ソフトで非直線回帰分
析を用いて作図した。全てのデータは抗体の活性部位について示されている。Ｉ
ｇＧ抗体は約１５００００ｇ／ｍｏｌのＭＷにつき２つの活性部位を有する。
【０１２１】 生成物９、１８、５９、２１、２４、２７、３０および５４の鏡像体過剰の決
定：ＰＢＳ１６０ｍｌ中の６．２５Ｍアルデヒド溶液に、ＰＢＳ中の抗体溶液（
１３５ｍＭ）３０ｍｌおよびアセトン１０ｍｌを加えた。最終濃度は、アセトン
５％（ｖ／ｖ）を含む総容積２００ｍｌのＰＢＳ中でアルデヒド５ｍＭおよび抗
体２０ｍＭであった。１８時間後に１２ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を加え、有機層を乾燥
（ＭｇＳＯ4）させ、さらに蒸発させた。生成物９、１８、５９、２１、２４、 ２７ および３０の場合には、残留物は約１ｍｌのｉ−プロパノールに溶解し、ｅ
ｅは、鏡像体分離のために適切なダイセル（Daicel）カラムを使用して通常のフ
ェースＨＰＬＣによって決定した。生成物５４のｅｅは、キラル毛細管カラム（
サイクロデックス（Cyclodex）−Ｂ（J&W Scientific）、長さ：３０ｍ、Ｉ．Ｄ
．：０．２５ｍｍ、温度：１５０℃、ｔＲ：（ａ）＝１５．４８分、（ｂ）＝１
６．０１分）でＧＣを使用して決定した。
【０１２２】 １８Ｏ取り込み：５９への１８Ｏの取り込みをモニターするために用いる電子 スプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析は、ＡＰＩ−ＩＩＩパーキンエルマー（Pe
rkin Elmer）ＳＣＩＥＸトリプル四極子質量分析計で実施した。サンプルの調製
では、凍結乾燥抗体３８Ｃ２を１８Ｏ標識水（１８Ｏ、９５−９８％、Cambridg
e Isotope Laboratories, Andover, MA)に再懸濁させ、最終濃度７．５ｍＭにし
た。反応はアルドール生成物５９（１．５ｍＭ）を添加して開始させ、経過時間
にしたがって部分標本を１８Ｏ取り込みの分析のために採取した。分析直前に、
サンプルをメタノールで１０倍希釈した。
【０１２３】 結晶化、データ収集、構造解明および洗練（refinement）：アルドラーゼ抗体
３３Ｆ１２のＦａｂ｀を１８％ＰＥＧ４０００、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７
．４およびイソプロパノールから、以下の単位胞寸法（ａ＝５６．５オングスト
ローム、ｂ＝６５．３オングストローム、ｃ＝１３２．６オングストローム）を
もち１分子が非対称性ユニットである空間群ｐ２1２1２1で結晶化する。固有の データセットを、スタンフォードシンクロトロン放射研究所（Stanford Synchro
tron Radiation Laboratory)のビームライン７−１で、凍結保護剤として２５％
グリセロールを用い−１７６℃で２．１５オングストロームの分解能で収集した
。データはＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（１７）を用いて処理した。構
造は分子置換技術を用いて決定した。８６の初期サーチモデルから、抗体ＮＣ６
．８（１８）は、分解能範囲１０−４オングストロームで７．６ｓのＭＥＲＬＯ
Ｔ（１７）を用いて回転関数分解を提供した。プログラムＡＭＯＲＥ（１７）で
の１５−４オングストロームのデータを用いた回転サーチおよび移動サーチによ
って、相関係数４９．６をもつ４４．７％のＲ値が提供され、これは次のＲ＝５
５．６％および相関係数１９．４の不正確な解答と比較される。正確な数列の計
算による変化および多段モデル構築は製図プログラムＯを用いて実施した。剛体
を用いる最初のＸＰＬＯＲ（位置決定的および緩慢冷却洗練プロトコル）での最
初の洗練によって、Ｆ＞１ｓをもつ１０．０から２．１５オングストロームのデ
ータについてＲ＝２３．８％がもたらされた。さらに洗練をプログラムＳＨＥＬ
ＸＬ−９６を用いて継続した。各洗練工程について、個々のＢ値洗練をもつ少な
くとも１０サイクルの共役勾配最少化を、結合距離および結合角度に関して標準
的拘束力さらにＢ値については０．０８のＳＩＭＵ拘束力で実施した。最終ステ
ージでは、さらに別のパラメーターを用いることなく水素原始を計算した位置に
配置した。水分子は差異電子密度（difference electron density)に組み込まれ
、それらが合理的な水素結合相互反応を示す場合に洗練した。全体的なマップの
質は良好で、他の抗体でもしばしば観察される定常重鎖のＨ１２８−Ｈ１３６領
域を除いて、主要な鎖の断裂は示されなかった。これらの残基は、説明可能な密
度をもたなかったので、固定Ｂ値を用いオキュパンシーセットをゼロにして洗練
した。ラマチャンドラン（Ramachandran）作図によって、９０．２％の残基がも
っとも適性な領域に示され、ただ１つの部外残基はＶａｌＬ５１でこれは抗体Ｆ
ａｂフラグメント分子で共通に観察される。ＬｙｓＨ９３の密度は２ｓレベルで
非常にかさだかく、Ｃｅを越えて拡張しない。このことは、Ｌｙｓでしばしば観
察されるようにおそらく多数の側鎖配置を示唆している。この残基はわずかに異
なる方向に向いているが、常に同じ報告位置に洗練された。最終的な洗練パラメ
ーターは図１５に概略されている。
【０１２４】 クラスＩアルドラーゼ酵素は、共有結合シッフ塩基中間体の形成に活性部位Ｌ
ｙｓを利用する。この反応の第一の工程は、Ｌｙｓが荷電をもたないと仮定して
、このＬｙｓの求核性攻撃で基質とカルビノールアミンを生成することである。
トランスアルドラーゼＢ−中間体複合体のＸ線結晶構造では、対応するＬｙｓが
電荷を有するといわれているが、脱プロトン反応は近傍の水分子によって促進さ
れる。水溶液中でのＬｙｓのｐＫaは通常はおよそ１０．５である。上記の反応 を触媒するために要求される強力な求核物質として作用するためには、顕著に揺
れ動くｐＫaをもつ荷電をもたないアミノ基が必要である。Paetzelらは、Ｌｙｓ
のｐＫaの揺れ動きのための３つの基本的条件を概略している。すなわち、静電 気、極性、および疎水性分子環境である。Westheimerらは、アセト酢酸デカルボ
キシラーゼについて、反応性ＬｙｓのｐＫaは近傍の第二の陽性荷電Ｌｙｓ残基 の静電気的反発作用のために５．６にシフトすることを示した。他方、近傍に陰
性荷電が存在する場合は、陽性荷電Ｌｙｓが荷電の中和に有利なためにＬｙｓの
ｐＫaは増加する。オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼの触媒性Ｌ ｙｓのｐＫaは７に低下し、これは、Ｌｙｓは存在する周囲の非極性空洞によっ て説明されている。Ｔ４リゾチームの疎水性コア内の変異実験によって、疎水性
ポケットに埋め込まれているＬｙｓのｐＫaは６．５にシフトすることが示され た。
【０１２５】 抗体Ｆａｂ｀３３Ｆ１２の配列は２６Ｌｙｓ残基を含んでいる。それは、１，
３ジカルボニルハプテンによる反応性免疫によって生じたので、この選別された
抗体は結合ポケットにＬｙｓを位置させているはずである。このＬｙｓの求核特
性のための構造をより理解するために、我々は、三次元Ｘ線構造を２．１５オン
グストロームの分解能で分子置換によって決定した。本来のＦａｂの全体的構造
は他の既知のＦａｂの構造と類似している。エルボーアングル（これはＶL−ＶH およびＣＬ−ＣＨ１の擬似二重軸を互いに結びつける）は１５１．４−であり、
さらにＦａｂ分子のための観察された範囲内にある。３３Ｆ１２の抗原結合部位
は細長く伸びた裂け目で、これは結合ポケットの底で拡大する（図２８−３３）
。結合ポケットは深さが１１オングストロームで、これは小さなハプテン群に対
して作製された抗体について認められるものと同等である。ＬｙｓＨ９３は、こ
の抗原結合ポケットの底の疎水性環境内に存在する（図３０ｃ）。第二のＬｙｓ
Ｈ５２ｂはＣＤＲ−Ｈ2の上部に配置されていて、その側鎖を分子の外側に向け ている。同様な抗体３８Ｃ２（これは同等な速度加速で同じ反応を触媒する）で
は、ＬｙｓＨ５２ｂがＡｒｇに変異しているが、ＬｙｓＨ９３は保持されている
。このＣＤＲと他の既知の抗体分子との配列比較によって、抗体３３Ｆ１２のい
くつかの興味深く通常と異なる特性が明らかにされた。残基Ｈ９３はこの位置で
は非常にしばしばＡｌａである。既知の構造をもつ他の２つの抗体、エステル分
解抗体１７Ｅ８および癌腫結合抗体Ｂ７２．３のキメラＦａｂフラグメントのみ
がその位置にＬｙｓを含んでいる。さらにまた、残基Ｈ９４（これは通常はＡｒ
ｇである）は、３３Ｆ１２では疎水性Ｉｌｅによって置換されている。Ｈ９４位
のＡｒｇは、しばしばＨ１０１のアスパラギン酸と塩橋を形成する（しかしなが
ら３３Ｆ１２では短いＨ３ループのために欠落している）。
【０１２６】 Ｆａｂ｀３３Ｆ１２の結合部位（図３Ａ）の分析によって、ＬｙｓＨ９３はほ
ぼ疎水性側鎖によって取り囲まれ、残基ＬｅｕＨ４、ＭｅｔＨ３４、ＶａｌＨ３
７、ＣｙｓＨ９２、ＩｌｅＨ９４、ＴｙｒＨ９５、ＳｅｒＨ１００、ＴｙｒＨ１
０２、およびＴｒｐＨ１０３とファンデルワールス力で接触していることが示さ
れた。荷電をもつ１つの残基がＬｙｓＨ９３のＮｚの半径８オングストローム内
に存在するが、いずれの水素結合または塩橋からも遠すぎる。さらに、ＬｙｓＨ
９３はいずれの主要鎖のカルボニル酸素とも水素結合を全く形成しない。Ｂ７２
．３では、ＡｓｐＨ１０１は存在しないが、ＬｙｓＨ９３はＴｙｒＨ９６の主要
鎖カルボニル酸素と荷電をもつ水素結合を形成し、これは、通常と異なるＣＤＲ
−Ｈ３ループ構造の原因であると提唱されている。抗体１７Ｅ８の対応する環境
は図３２ｂに示されている。本著者らはまた基質認識のための疎水性ポケットに
ついて記載したが、さらに荷電をもつＡｒｇＨ９４およびＡｓｐＨ１０１残基が
存在する。ここで、ＬｙｓＨ９３残基はＡｓｐＨ１０１と塩橋を形成し（Ｌｙｓ
Ｈ９３Ｎｚ−ＡｓｐＨ１０１Ｏｄ１、３．２オングストローム）、この場合陽性
荷電Ｌｙｓがオキシアニオン形成を安定化させると提唱されている。したがって
、塩橋は３３Ｆ１２では形成されないので、ＬｙｓＨ９３のｅ−アミノ基でのプ
ロトン付加および電荷の成長は疎水性環境のために不利であるように思われる。
したがって、ｐＫaは揺れ動き、荷電をもたないＬｙｓＨ９３を強力な求核性に し、反応性免疫過程での選別のための優れた候補物としてそれを提供するであろ
う。
【０１２７】 図３６に示したアルデヒド７０００の合成：５−オキソヘキサンニトリル（１
．１４ｍｌ、１０mmol、１当量；販売源にはアルドリッチ（Aldrich)／シグマ（
Sigma)／フルカ（Fluka)が含まれる）、カテコール（５．５１ｇ、５０mmol，５
当量）および触媒量のｐ−ＴｓＯＨをベンゼン（１５ｍｌ）中で１２時間還流さ
せた。室温に冷却後、混合物をエーテル（５０ｍｌ）で希釈し、１ＮのＮａＯＨ
で４回、飽和塩化アンモニウムで１回洗浄した。混合物を乾燥させ（ＭｇＳＯ4 ）、ろ過して濃縮し、２ｇ（＞９９％）のアセタールがわずかに黄色の油として
得られた。これを塩化メチレン（１００ｍｌ）に取り、ヘキサン中の１ＮのＤＩ
ＢＡＨ１０．５ｍｌで−７８℃で処理した。−７８℃で２時間、０℃で１時間後
、飽和塩化アンモニウム３ｍｌおよびエーテル１００ｍｌを添加し、混合物を室
温に加温した。少量のアルミナおよび１０分後に硫酸マグネシウムを添加した。
混合物を２時間攪拌し、続いてろ過し濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー
（９％ＥｔＡｃ／ヘキサン）によって、１５４５ｍｇ（７５％）のアルデヒド７ ０００ が油として得られた。アセタールの分光計によるデータ：1ＨＮＭＲ（２ ５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．６３（ｓ，３Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），２ ．０７（ｍ，２Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），６．７７（ｍ，４Ｈ
）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７．０，１９．２，２４．５， ３７．７，１０８．４，１１７．８，１１９．２，１２１．２；Ｃ12Ｈ13ＮＯ2 として算出したＨＲＭＳ：２０３．０９４６、測定値２０３．０９５２。 アルデヒド７の分光計データ：1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．６
０（ｓ，３Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ），２．４８（ｄ
ｔ，Ｊ＝１．４および７．２，２Ｈ），６．７４（ｍ，４Ｈ），９．７４（ｔ，
Ｊ＝１．４，１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５．７，２４ ．３，３８．１，４３．３，１０８．２，１２１．０，１２１．２，２０１．８
；Ｃ12Ｈ14Ｏ3としての算出したＨＲＭＳ：２０６．０９４３、測定値２０６． ０９４８。
【０１２８】 図３６に示したジオール８０００αの抗体触媒合成：ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭ
、ｐＨ＝７．０）中の抗体３８Ｃ２（アドリッチケミカル社から入手可能）の３
８μＭ溶液１８ｍｌに１ｍｌのヒドロキシアセトンおよびアセトニトリル中のア
ルデヒド７の１００ｍＭ溶液１ｍｌ（２０．６ｍｇ、０．１mmol）を添加した。
最終濃度は、約３３μＭ（アルデヒドに対して０．６６％）の３８Ｃ２、０．６
８Ｍのヒドロキシアセトンおよび５ｍＭのアルデヒド７０００であった。３６時
間後、ＲＰ−ＨＰＬＣ（３５％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡを含む）、 ８０００ αの保持時間＝７．７５分ａｎｔｉ−異性体＝７．３４分、７０００＝
１５．７７分）によってモニターしたとき反応は６５％変換に達した。抗体は、
セントリコン（Centricon)−１０濃縮チューブ（Amicon）で遠心して反応物から
分離した。溶媒は減圧下で除去して粗生成物はＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、９８％
以上のｅｅで１０．２ｍｇ（０．０３６mmol、消費アルデヒドにしたがって５５
％）の純粋な８０００αが得られた。ｅｅは、キラセルＡＤカラムを用いてキラ
ルＨＰＬＣによって求めた（１２％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン、１ｍｌ／分、λ＝
２８４ｎｍ；分析スケールではｅｅは＞９９％であった）。1ＨＮＭＲ（２５０ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．４６−２．１０（ｍ'ｓ，７Ｈ），１．５９（ｓ，３
Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｂｒ，１Ｈ），３．９５（ｂｒ，１Ｈ
），４．０３（ｂｒ，１Ｈ），６．７３（ｍ，４Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ
，ＣＤＣｌ3）δ１９．４，２４．２，２５．１，３４．０，３８．７，７１． ５，７９．１，１０８．２，１１８．５，１２０．９，２０７．９；Ｃ15Ｈ20Ｏ 5 Ｎａとして算出されたＨＲＭＳ：３０３．１２０８、測定値３０３．１２１６ 。
【０１２９】 図３６に示したトリオール９０００の合成：１０ｍｌのメタノール中のジオー
ル８０００α（１０．２ｍｇ、０，０３６mmol、１当量）をナトリウムボラネー
ト（３ｍｇ、２当量）で処理し、５分間攪拌した。混合物を飽和塩化アンモニウ
ム溶液で抽出し、さらにエーテルで再抽出した。乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、真空 中で蒸発させた後、偏左右異性体トリオールをＲＰ−ＨＰＬＣで単離した。３．
９ｍｇ（０．０１４mmol、３８％）のａｎｔｉ−９０００および４．４ｍｇ（０
．０１６mmol、４３％）のｓｙｎ−９０００を固形物として得た。 ａｎｔｉ−９０００の分光計によるデータ：1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤ3Ｏ
Ｄ）δ１．０８（ｄ，Ｊ＝６．３，３Ｈ），１．４５（ｓ，３Ｈ），１．３０−
１，６０（ｍ，４Ｈ），１．８９（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｂｒ，１Ｈ），３．
６１（ｍ，２Ｈ），６．５９（ｍ，４Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤ3Ｏ Ｄ）δ１９．８，２０．６，２４．５，３４．６，４０．１，６９．７，７３．
０，７８．３，１０９．１，１２２．０，１４８．９；Ｃ15Ｈ22Ｏ5Ｎａとして 算出されたＨＲＭＳ：３０５．１３６５、測定値３０５．１３７５。ｓｙｎ−９ ０００ の分光計によるデータ：1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１．０
５（ｄ，Ｊ＝６．４，３Ｈ），１．４３（ｓ，３Ｈ），１．３０−１．６０（ｍ
，４Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），２．９９（ｂｒ，１Ｈ），３．４８（ｂｒ，
１Ｈ），３．６７（ｍ，１Ｈ）６．６０（ｍ，４Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ
，ＣＤ3ＯＤ）δ２０．１，２０．８，２４．５，３４．６，４０．１，６８． ７，７１．２，７８．３，１０９．１，１２０．０，１２２．０，１４８．９；
Ｃ15Ｈ22Ｏ5Ｎａとして算出されたＨＲＭＳ：３０５．１３６５、測定値３０５ ．１３７４。
【０１３０】 図３６に示した（１Ｓ，１'Ｓ，５'Ｓ，７'Ｓ）−１−（５'−メチル−６'， ８'−ジオキサビシクロ−〔３．２．１〕オクト−７'イル）エタノール（（−）
−（１Ｓ）−１−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミン（ｅｎｔ−５０００））の
合成：トリオールａｎｔｉ−９０００（４．４ｍｇ、０．０１６mmol）およびベ
ンゼン０．５ｍｌ中の触媒量のｐ−ＴｓＯＨを６０℃で４５分加熱した。冷却後
、２５％のトリメチルアミン水溶液を１滴および１００ｍｇのシリカゲルを加え
た。この物質を真空中で蒸発させ、続いてクロマトグラフィー（９％ＥｔＯＡｃ
／ヘキサン）を施して、１−ヒドロキシブレビコミンｅｎｔ−５０００の２．７
ｍｇ（０．０１５４mmol、９６％）を生じた。分光計によるデータは文献の値と
完全に一致した。ｅｅは９８％であった。
【０１３１】 図３６に示した（１Ｒ，１'Ｓ，５'Ｓ，７'Ｓ）−１−（５'−メチル−６'， ８'−ジオキサビシクロ−〔３．２．１〕オクト−７'イル）エタノール（（−）
−（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミン（ｅｎｔ−６０００））の
合成：トリオールｓｙｎ−９０００（３．９ｍｇ、０．０１４mmol）およびベン
ゼン０．５ｍｌ中の触媒量のｐ−ＴｓＯＨを６０℃で４５分加熱した。冷却後、
２５％のトリメチルアミン水溶液を１滴および１００ｍｇのシリカゲルを加えた
。この物質を真空中で蒸発させ、続いてクロマトグラフィー（９％ＥｔＯＡｃ／
ヘキサン）を施して、１−ヒドロキシブレビコミンｅｎｔ−６０００の２．３ｍ
ｇ（０．０１３mmol、９５％）を液体として得た。分光計によるデータは文献の
値と完全に一致した。ｅｅはキラルＧＣで測定し、９８％であった。
【０１３２】 ジオール８０００の抗体触媒動力学的分解：この反応は分析スケールで実施し
た。ラセミアルドール８（５００μＭ）およびＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の抗体３
８Ｃ２（３０μＭ）をラセミ混合物の５２％が消費されるまで（およそ１０時間
）保温した。再アミノ化アルドール８０００αを分析用ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで
単離した。ｅｅは上記のようにして決定し、＞９９％であった。
【０１３３】 ホーナー＝ワズワース＝エモンス反応およびシャープレス不整ジヒドロキシル
化による８０００αおよび８０００βの参照化学物質の合成：アルデヒド７００ ０ （３６０ｍｇ、１．７４８mmol、１当量）、ジエチル（２−オキソプロピル）
ホスホネート（４２４ｍｇ、２．１８４mmol、１．２５当量）および水酸化リチ
ウム一水塩（１０１ｍｇ、２．４１２mmol、１．３８当量）を５ｍｌの無水ＴＨ
Ｆ中で３時間攪拌した。混合物を５ｍｌのエーテルで希釈し、０．３ｍｌの飽和
塩化アンモニウム溶液を加えた。混合物を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過して濃 縮した。シリカゲル上でのろ過（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって、液体
としてα，β−不飽和メチルケトン４３０ｍｇ（＞９９％）が得られた。1ＨＮ ＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．６０（ｓ，３Ｈ），１．５８−１．７ ０（ｍ，２Ｈ），１．９０−２．００（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２
．２０−２．３０（ｍ，２Ｈ），６．０５（ｄ，Ｊ＝１５．９，１Ｈ），６．７
５（ｍ，５Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１９．２，２４．５ ，２６．８，３２．０，３７．６，１０８．２，１０８．３，１２０．９，１２
１．２，１３１．５，１４７．３，２０３．８；Ｃ15Ｈ18Ｏ3Ｎａとして算出さ れたＨＲＭＳ：２６９．１１５４、測定値２６９．１１６１。
【０１３４】 図３６に示したシャープレス−ＡＤによるジオール８０００αの合成：１２ｍ
ｌのｔ−ＢｕＯＨ／水（１：１）中のα，β−不飽和メチルケトン（３００ｍｇ
、１．２２mmol、１当量）をＡＤ−ミックス−α（１．７３ｇ）およびメタンス
ルホンアミド（１２０ｍｇ）と０℃で処理し、０℃で３時間攪拌し、さらに室温
で１６時間攪拌した。メタ重亜硫酸ナトリウム（２．４８ｇ）を注意して加え、
混合物を酢酸エチル（ｘ５）で抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）、真空中での蒸発 、クロマトグラフィー（３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）の後で、２９９ｍｇ（８
８％）の純粋なジオール８αが固体として得られた。ｅｅは上記のように決定し
、８９％であった。
【０１３５】 図３７に示したジオール８０００βの合成：１２ｍｌのｔ−ＢｕＯＨ／水（１
：１）中のα，β−不飽和メチルケトン（３００ｍｇ、１．２２mmol、１当量）
をＡＤ−ミックス−β（１．７３ｇ）およびメタンスルホンアミド（１２０ｍｇ
）と０℃でで処理し、０℃で３時間さらに室温で１６時間攪拌した。メタ重亜硫
酸ナトリウム（２．４８ｇ）を注意して加え、混合物を酢酸エチル（ｘ５）で抽
出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）、真空中での蒸発、クロマトグラフィー（３５％Ｅ ｔＯＡｃ／ヘキサン）の後で、２９０ｍｇ（８５％）の純粋なジオール８０００ βが固体として得られた。ｅｅは上記のように決定し、９１％であった。
【０１３６】 図３８で示したムルザーシーケンスおよびシャープレス不整ジヒドロキシル化
によるジオール１１０００αおよびジオール１１０００βの参照化学物質の合成
：エチルレブリネート（７．１ｍｌ、５０mmol、１当量）、カテコール（２７．
５３ｇ、２５０mmol、５当量）および触媒量のＴｓＯＨをベンゼン（２００ｍｌ
）中で１２時間還流させた。室温に冷却後、混合物をエーテル（２５０ｍｌ）で
希釈し、１ＮのＮａＯＨで４回、飽和塩化アンモニウムで１回洗浄した。混合物
を乾燥させて（ＭｇＳＯ4）ろ過し、濃縮してルブリネートアセタール１１．８ ｇ（＞９９％）をわずかに黄色の油として得た。この物質（２．３６ｇ、１０mm
ol）を塩化メチレン（１００ｍｌ）中に取り、ヘキサン中の１ＮのＤＩＢＡＨ１
０．５ｍｌで処理した。−７８℃で３０分後、３ｍｌの飽和塩化アンモニウムお
よび１００ｍｌのエーテルを加え、混合物を室温に加温した。少量のアルミナお
よび１０分後に硫酸マグネシウムを加えた。混合物を２時間攪拌し、続いてろ過
し濃縮した。この後の化学工程のためにこの物質は十分な純度を有していた。抗
体触媒工程用：フラッシュクロマトグラフィー（９％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）に
よって１．８３ｇ（９５％）のアルデヒド１００００が油として得られた。分光
計によるアセタールのデータ：1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．１
２（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ），１．５３（ｓ，３Ｈ），２．２０（ｍ，２Ｈ），
２．３８（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｑ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），６．６６（ｍ，４
Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．１，２４．６，２８．２ ，３４．２，６０．５３，１０８．４，１２１．１４，１４７．３，１７２．８
；分光計による１００００のデータ：1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ
１．６４（ｓ，３Ｈ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），２．６２（ｔ，７
．６，２Ｈ），６．７６（ｍ，４Ｈ），９．７６（ｓ，１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６
３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ２４．６，３１．４，３７．６，１０８．４，１２１ ．３，１４７．１，２００．８。
【０１３７】 図３８に示したα，β不飽和エチルケトンの合成：１５ｍｌの無水エタノール
中のメチルメタンホスホネート（１．９５ｍｌ、１８mmol、３．６当量）をｎ−
ＢｕＬｉの２．５Ｍ溶液（７．２ｍｌ、１８mmol、３．６当量）で−７８℃で処
理した。３０分後、７ｍｌの無水エーテル中のエステル（８８１ｍｇ、１０mmol
、２当量）をゆっくりと添加し、混合物を−７８℃で１時間、０℃で３０分攪拌
した。４０ｍｌのＴＨＦ中の水（３６０ｍｇ、２０mmol、４当量）、続いてアル
デヒド１００００（９６０ｍｇ、５mmol、１当量）を加えた。１時間後、混合物
を６５ｍｌのエーテルで希釈し、さらに３ｍｌの飽和塩化アンモニウム溶液を加
えた。混合物を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過して濃縮した。クロマトグラフィ ー（９％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって９６０ｍｇ（７８％）のα，β−不飽
和エチルケトンが液体として得られた。1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）
δ１．０６（ｔ，Ｊ＝７．３，３Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｍ，
２Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｑ，Ｊ＝７．３，３Ｈ），６．０４
（ｄｔ，Ｊ＝１．５および１５．８，１Ｈ），６．７５（ｍ，４Ｈ），６．８１
（ｄｔ，Ｊ＝６．８および１５．８，１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣ
ｌ3）δ８．０，２４．６，２６．１，３３．３，３７．５，１０８．３，１１ ７．９，１２１．１，１３０．７，１４５．２，１４７．２，２００．７；Ｃ15 Ｈ18Ｏ3として算出されたＨＲＭＳ：２４６．１２５６、測定値２４６．１２６ ２。
【０１３８】 図３８に示したジオール１１０００αの合成：１６ｍｌのｔ−ＢｕＯＨ／水（
１：１）中のα，β不飽和エチルケトン（４００ｍｇ、１．６２６mmol、１当量
）をＡＤ−ミックス−α（２．３ｇ）およびメタンスルホンアミド（１６０ｍｇ
）と０℃で処理し、０℃で３時間、さらに室温で３６時間攪拌した。メタ重亜硫
酸ナトリウム（３．３８ｇ）を注意して加え、混合物を酢酸エチル（５ｘ）で抽
出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）、真空中での蒸発およびクロマトグラフィー（グラ ジエント、３５％，５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）の後で、固体として３５５ｍ
ｇ（７８％）の純粋なジオール１１０００α（ｅｅ＝９１％、ＨＰＬＣ）、およ
び８５ｍｇ（２１％）の出発物質を得た。1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ１．１２（ｔ，Ｊ＝７．３，３Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ），１．８６（ｍ
，３Ｈ），２．１５（ｍ，２Ｈ），２．５２（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｂｒ，１
Ｈ），４．００（ｂｒ，１Ｈ），４．０５（ｂｒ，１Ｈ），６．７７（ｍ，４Ｈ
）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．４，２８．２，３１．０，３ ５．４，７１．６，７８．６，１０８．４，１１８．６，１２１．１，１４７．
７，２１０．６；Ｃ15Ｈ20Ｏ5Ｎａとして算出されたＨＲＭＳ：３０３．１２０ ８、測定値３０３．１１９８。
【０１３９】 図３８に示したジオール１１０００βの合成：１６ｍｌのｔ−ＢｕＯＨ／水（
１：１）中のα，β不飽和エチルケトン（４００ｍｇ、１．６２６mmol、１当量
）をＡＤ−ミックス−β（２．３ｇ）およびメチルスルホンアミド（１６０ｍｇ
）と０℃で処理し、０℃で３時間、さらに室温で３６時間攪拌した。メタ重亜硫
酸ナトリウム（３．３８ｇ）を注意して加え、混合物を酢酸エチル（５ｘ）で抽
出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）、真空中での蒸発およびクロマトグラフィー（グラ ジエント、３５％，５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）の後で、固体として３２２ｍ
ｇ（７１％）の純粋なジオール１１０００β（ｅｅ＝９２％、ＨＰＬＣ）、およ
び１１４ｍｇ（２８％）の出発物質を得た。1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣ ｌ3）δ１．１２（ｔ，Ｊ＝７．３，３Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ），１．８６ （ｍ，３Ｈ），２．１５（ｍ，２Ｈ），２．５２（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｂｒ
，１Ｈ），４．００（ｂｒ，１Ｈ），４．０５（ｂｒ，１Ｈ），６．７７（ｍ，
４Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．４，２８．２，３１．０ ，３５．４，７１．６，７８．６，１０８．４，１１８．６，１２１．１，１４
７．７，２１０．６。
【０１４０】 抗体触媒によるジオール１１０００αの合成：この反応は分析スケールで実施
した。アルデヒド１００００（５００μＭ）、１−ヒドロキシ−２−ブタノン（
５％ｖ／ｖ）および抗体３８Ｃ２（３０μＭ）を約５時間保温した。アルドール
生成物は分析用ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで分離し、ｅｅ（＞９９％）は８０００α
の製造で述べたように決定した。
【０１４１】 抗体触媒によるジオール１１０００の動力学的分解：この反応は分析スケール
で実施した。ラセミアルドール１１０００（５ｍＭ）およびＰＢＳ（ｐＨ７．４
）中の抗体３８Ｃ２（１０４μＭ）をラセミ混合物の５４％が消費されるまで保
温した（約１０時間）。残留アルドール１１０００βを分析用ＲＰ−ＨＰＬＣカ
ラムで単離し、ｅｅは上記のようにして決定し＞９９％であった。
【０１４２】 図３８で示した２−ヒドロキシブレビコミン３０００および４０００の合成：
５ｍｌのメタノール中のシャープレスＡＤ由来ジオール１１０００α、ｅｅ＝９
１％（１４０ｍｇ、０．５mmol、１当量）をナトリウムボラネート（３８ｍｇ、
２当量）で処理し５分間攪拌した。混合物を飽和塩化アンモニウム溶液で抽出し
、エーテルで再抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）および真空中での蒸発後に、１４ １ｍｇ（＞９９％）の純粋な偏左右異性体トリオール１２０００を単離した。分
析のためにこのトリオールをＲＰ−ＨＰＬＣで分離してもよい。分光計によるａ
ｎｔｉ−１２０００のデータ：1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ０．８
６（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ），１．２５（ｍ，１Ｈ），１．４９（ｓ，３Ｈ），
１．６０（ｍ，３Ｈ），１．８５（ｍ，１Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），３．０
０（ｂｒ，１Ｈ），３．４０（ｂｒ，１Ｈ），３．７２（ｂｒ，１Ｈ），６．６
０（ｍ，４Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１０．２，２４．６ ，２７．４，２８．５，３６．８，７１．５，７４．１，７６．７，１０９．１
，１２０．０，１２２．１，１４９．０；Ｃ15Ｈ22Ｏ5Ｎａとして算出されたＨ ＲＭＳ：３０５．１３６５、測定値３０５．１３５８。ｓｙｎ−１２０００：Ｃ 15 Ｈ22Ｏ5Ｎａとして算出されたＨＲＭＳ：３０５．１３６５、測定値３０５． １３７１。
【０１４３】 図３８に示した（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ，７Ｒ）−および（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ，７
Ｓ）−７−エチル−５−メチル−６，６−ジオキサビシクロ〔３．２．１〕オク
タン−２−オ−ル）（（＋）−（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミ
ンおよび（＋）−（２Ｓ）−２ヒドロキシ−エンド−ブレビコミン）（４０００ および３０００）：トリオール１２０００（１４１ｍｇ、０．５mmol）および１
０ｍｌのベンゼン中の触媒量のｐ−ＴｓＯＨを４５分間６０℃で加熱した。冷却
後、３０滴の２５％トリメチルアミン水溶液および５００ｍｇのシリカゲルを加
えた。この物質を真空中で蒸発させ、続いてクロマトグラフィー（グラジエント
、１２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を実施し、固体として４０ｍｇ（４６％）の４ ０００ および液体として４０ｍｇ（４６％）の３を得た。分光計によるデータは
文献の数値と完全に一致している。：1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，Ｃ6Ｄ6）δ０ ．９０（ｔ，Ｊ＝７．４，３Ｈ），１．１２（ｂｒ，１Ｈ），１．４３（ｓ，３
Ｈ），１．３０−１．７０（ｍ，６Ｈ），３．６２（ｍ，１Ｈ），３．８０（（
ｄ，Ｊ＝３．７，１Ｈ），４．１８（ｔ，Ｊ＝６．５，１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６
３ＭＨｚ，Ｃ6Ｄ6）δ１０．０，２４．３，２６．９，２８．８，３５．４，６
６．２，７７．３，８０．９，１０７．４。４０００の分光計データ：1ＨＮＭ Ｒ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．９６（ｔ，Ｊ＝７．４，３Ｈ），１．０ ２（ｂｒ，１Ｈ），１．４８（ｓ，３Ｈ），１．６７−２．１０（ｍ，６Ｈ），
３．３２（ｄｔ，Ｊ＝３．１および８．１，１Ｈ），３．５２（ｄｄ，Ｊ＝４．
１および９．０，１Ｈ），４．３０（ｍ，１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（６３ＭＨｚ，Ｃ
ＤＣｌ3）δ９．５，２３．５，２３．６，２５．４，３３．８，６８．１，７ ４．９，７８．０。
【０１４４】 図４１に示した化合物１１１１の合成：０．５ｍｌのアセトニトリル中のベン
ジルオキシアセトアルデヒド（８０ｍｇ、０．５３mmol）をＰＢＳ（燐酸緩衝食
塩水、１００ｍＭ）中の抗体３８Ｃ２溶液９ｍｌに加え、続いてヒドロキシアセ
トン（０．５ｍｌ、６．３mmol）を加えた。室温で４８時間後、反応は５６％変
換に達した。混合物を凍結乾燥させた。残留物を塩化メチルで抽出した。溶媒を
減圧下で除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチ
ル／ヘキサン、１：１）で精製して純粋な２１１１α（３９ｍｇ、０．１７mmol
、３２％）を９７％ｅｅで得た。ベンジルエーテル２１１１α（３９ｍｇ、０．
１７mmol）を１ｍｌのメタノールに溶解し炭素上の触媒量の水酸化パラジウムで
水素を添加した。２時間後に混合物をセリットでろ過し、溶媒を減圧下で除去し
て純粋な１−デオキシ−Ｌ−キシルロース１１１１（１９ｍｇ、０．１４mmol、
８１％）を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、抗体触媒交差アルドール反応での受容体としてのアルデヒド３−８を
示す。
【図２】 図２は、アルドール反応における抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２の提唱メカニ
ズムの詳細な説明図である。律速工程は、おそらく工程５のＣ−Ｃ結合生成であ
る。
【図３】 図３は、エレクトロスプレーＭＳで得られた質量スペクトルで、緩衝９８％１
８Ｏ標識水でのアルドール生成物５９の抗体触媒酸素交換を示している。２７２
のｍ／ｚは出発物質に該当し、一方、抗体触媒交換（おそらく共有結合中間体を
介して）によって１８Ｏが取り込まれ、２７４のｍ／ｚが生成された。極めて微
量の１８Ｏの５９への取り込みが、抗体３８Ｃ２は存在しないがそれ以外は同一
の条件で観察された。
【図４】 図４は、アセトンおよびヒドロキシアセトンがアルドール供与基質として作用
する場合の鏡像選択性の潜在的な力学的開始点を示す。
【図５】 図５は、抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２のケトン−アルデヒド交差アルドール
コンセンサス基質を示す。
【図６】 図６は、β−ジケトンハプテン１を用いて抗体結合部位のリジン残基の主要ｅ
−アミノ基の捕捉メカニズムを示す。
【図７】 図７は、シクロペンタノンの抗体触媒自己アルドール縮合のための提唱メカニ
ズム（経路１）を示す。両工程（付加および除去）は抗体によって触媒される。
水の除去が遊離３６を介して生じるより不利なメカニズム（経路２）も示す。
【図８】 図８は、抗体触媒分子内アルドール縮合で基質として調べたジケトン３７、３ ９ および４１を示す。３９から４０に至る６（エノール−エンド−トリグ）−エ
キソ−トリグ過程のみが触媒される。
【図９】 図９は、ステロイド部分構造（Ｓ）−４４（ウィーランド−ミーシャケトン）
、（Ｓ）−４６および（Ｒ）−４６の抗体触媒合成を示す。
【図１０】 図１０は、抗体触媒交差アルドール反応での受容体としてアルデヒド３３、４ ８ およびアセトアルデヒドを示す。
【図１１】 図１１は、抗体触媒アルドール反応によるフッ素付加アルドール（ｓｙｎ−１ ６ 、ａｎｔｉ−１６および６０）の製造を示す。
【図１２】 図１２は、基質５９の抗体またはアミン触媒レトロアルドール反応を示す。
【図１３】 図１３は供与体の雑多性を示す：多様なケトンの抗体触媒交差アルドール反応
のための比速度（ｍｍｏｌ生成物／ｄ／ｍｍｏｌ抗体）は以下の規定条件下でア
ルデヒド４を用いて決定：１Ｍの供与体、５００ｍＭの４および０．４ｍｏｌ−
％の抗体（２ｍＭ）。Ｒ＝４−アセトアミドフェニル。
【図１４】 図１４は抗体３８Ｃ２および３３Ｆ１２の供与基質を示す。
【図１５】 図１５は受容体の雑多性を示す：アセトン、シクロペンタノンおよびヒドロキ
シアセトンの抗体触媒交差アルドール反応のための比速度（ｍｍｏｌ生成物／ｄ
／ｍｍｏｌ抗体）は、以下の規定条件下でアルデヒド３および５−８を用いて決
定：１Ｍの供与体、５００ｍＭの４および０．４ｍｏｌ−％の抗体（２ｍＭ）。
Ｒ＝４−アセトアミドフェニル、Ｒ'＝４−ニトロフェニル。
【図１６】 図１６は、プロピオンアルデヒド、アセトン、シクロペンタノンの抗体触媒自
己アルドール反応のための比速度（ｍｍｏｌ生成物／ｄ／ｍｍｏｌ抗体）、およ
び３６から水を除去して３５を生成する比速度を示す。以下の規定条件を用いた
：０．１Ｍのケトンまたはアルデヒドおよび０．００５ｍｏｌ−％の抗体（５ｍ
Ｍ）。これらの反応は、交差アルドール反応をもたらすアルデヒド受容体の非存
在下でもっぱら生じる。
【図１７】 図１７は、基質３９、４３および４５の分子内アルドール縮合のための動力学
パラメーター（ミハエリス−メンテンキネティクス）を示す。
【図１８】 図１８は、以下の規定条件下で脂肪族アルデヒドを用いたシクロペンタノンお
よびヒドロキシケトンの抗体触媒交差アルドール反応のための比速度（ｍｍｏｌ
生成物／ｄ／ｍｍｏｌ抗体）を示す：１Ｍの供与体、５００ｍＭのアルデヒドお
よび０．４ｍｏｌ−％の抗体（２ｍＭ）。
【図１９】 図１９は、キラルフェースＨＰＬＣおよびＧＣにより測定したいくつかの生成
物の立体化学的純度を示す。
【図２０】 図２０は、水溶液および有機溶媒中での５９の抗体３８Ｃ２触媒レトロアルド
ール化とアミン触媒レトロアルドール化との比較を示す。
【図２１】 図２１は、進化と免疫系が新規な蛋白質機能を発達させる過程の比較を示す。
先ず第一に、免疫系は、進化が利用する強力な遺伝的手段の各々に対して複製を
もつ。２つの過程の重要な相違は時間のパラメーターにあり、選別基準は以下の
通りである：＊バックグラウンド反応は無し。数値は、アルデヒドへのアセトン
のアルドール付加についてはＫuncat＝２．２８．１０-7Ｍ-1分-1を用い、さら に除去工程のためにＫcat／Ｋuncatは２２５０と測定されたという事実によって
概算；＊＊Ｋuncat＝２．２８．１０-7Ｍ-1分-1（アルデヒドへのアセトンの付 加の場合）。 酵素進化のための戦術と抗体反応の進化で用いられた戦術との比較： 蛋白質の進化 免疫反応 エクソンの移動組換え ＶＤＪの再構成 遺伝子の複製 Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子成分の対合群 点変異の蓄積 体細胞ハイパー変異、遺伝子変換 生物との適合のための自然の選別 結合のためのクローン選別 時間的規模：１０２−１０９年 時間的規模：週単位
【図２２】 図２２は基質として用いられた種々のケトンまたはアルデヒドを示す。１００
例以上のアルデヒド−アルデヒド、アルデヒド−ケトンおよびケトン−ケトンア
ルドール付加または縮合反応が触媒された。Ｒ1＝４−アセトアミドベンジル、 Ｒ2＝４−ニトロベンジル、Ｒ3およびＲ4は供与体に左右される。
【図２３】 図２３は、シッフ塩基の互変異化によって、α位の第二のカルボニル官能性の
ために安定なビニロギー系アミドであるエナミンが生成される場合、抗体との安
定な共有結合反応が形成されること示す。
【図２４】 図２４は、クラスＩアルドラーゼ酵素はエナミンメカニズムによって作用が進
行することを示す。Ｃ−Ｃ結合形成工程における力学的対称性によって、β−ジ
ケトン選別はこの工程の周辺に力学的に同一の反応コーディネートを誘導するこ
とができる。
【図２５】 図２５は、ＦＤＰアルドラーゼクラスＩおよび抗体アルドラーゼによって触媒
される最適反応の比較を示す。Ｒ＝４−イソブチルアミドベンジルまたはｎ−ブ
チルである。
【図２６】 図２６は、抗体が天然の基質上に荷電をもつホスフェートの握りを必要としな
い多様な反応を示す。抗体によって達成される触媒のターンオーバーは、この事
例での天然の酵素のそれの１０倍以内である。さらに、ターンオーバー効率は表
示した多様な反応で維持される。抗体触媒アルドールおよびレトロアルドール反
応の選別のための動力学パラメーターは、幾何学的に明瞭に異なる基質を受容す
る生物触媒の能力を反映している。
【図２７】 図２７は、アルドール反応の他に、この抗体は、電子の排水桶として作用する
プロトン付加シッフを用いてβ−ケト酸の脱カルボキシル反応も触媒することを
示している。実際、いくつかの天然のアルドラーゼは、力学的に類似の態様で生
物学的に関連する脱カルボキシル反応を触媒することが示された。
【図２８】 図２８は、古典的免疫と反応性免疫の構造的帰結の比較を示す。
【図２９】 図２９はｐＨの関数としてエナミン形成速度を示す。抗体３３Ｆ１２と３−メ
チル−２，４−ペンタンジオンとの間のエナミン形成は、分光光度計によって３
３５ｎｍで１５℃で追跡した。保温混合物は、７．５μＭの抗体および２５０μ
Ｍの３−メチル−２，４−ペンタンジオンを４．２から８のｐＨ範囲のクエン酸
／燐酸緩衝液中に含んでいた。反応速度は、実験的に求めた吸光係数ε335＝９ ．１ｍＭ-1ｃｍ-1を用いて算出した。
【図３０】 図３０は、抗体３３Ｆ１２の可変領域の立体図を示す。（ａ）側面図は超可変
ループＨ３の底部のＬｙｓＨ９３の位置を示す。（ｂ）９０−の回転によって対
応するものの上面を示し、結合部位の中を見せる。（ｃ）Ｆａｂ｀３３Ｆ１２結
合部位の立体図で、ＬｙｓＨ９３の近傍４オングストロームまたはそれ未満の中
に存在する残基のための側鎖のみを示す。軽鎖は薄紫色で、重鎖は青色で着色さ
れている。薄紫の標識は軽鎖の残基を、青色の標識は重鎖の残基をそれぞれ示し
ている。
【図３１】 図３１は、Ｆａｂ｀３３Ｆ１２結合ポケットの立体図を示す。１．４オングス
トロームの球体半径で計算した分子の表面からの薄片が示されている。残基Ｌｙ
ｓＨ９３のＮｚの先端のみが分子の表面と接触し、抗原結合部位のほぼ底部に位
置している。軽鎖は薄紫色で、重鎖は青色で示されている。
【図３２】 図３２は抗体結合部位の比較で、（Ａ）抗体Ｆａｂ｀３３Ｆ１２および（Ｂ）
抗体１７Ｅ８（２７）（ｐｄｂ ｃｏｄｅ ｌｅａｐ）のＬｙｓＨ９３の異なる
疎水性環境を示している。ＬｙｓＨ９３のＮｚ周辺の８オングストロームの球体
の残基が示されている。ＣＰＫ表示では、疎水性原子は黄色で、極性窒素および
酸素は青色および桃色でそれぞれ示されている。荷電をもつ塩基性残基では、そ
れらの窒素原子は濃紺で、荷電をもつ酸素原子は赤色で着色されている。Ｌｙｓ
Ｈ９３のＮｚ原子は青色で着色されている。
【図３３】 図３３は、活性部位の相対的疎水性の測定のためのハンシュプロットを示す。
一連のアルドール、Ｒ1ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＲ2Ｃ（Ｏ）Ｒ3の抗体３３Ｆ１２触媒 レトロアルドール反応のための動力学定数（Ｋcat／Ｋm）を、対応するＲ置換基
の疎水性定数ρの関数として作図した。ρ値は記載したように計算した。
【図３４】 図３４は、いくつかのブレビコミンの構造を示す：（＋）−エキソ−ブレビコ
ミン（１０００）；（＋）−エンド−ブレビコミン（２０００）；（１Ｒ，２Ｓ
，５Ｓ，７Ｒ）−２−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミン（３０００）；（１Ｒ
，２Ｓ，５Ｓ，７Ｓ）−２−ヒドロキシ−エンド−ブレビコミン（４０００）；
（１Ｒ，１'Ｒ，５'Ｒ，７'Ｒ）−１−ヒドロキシ−エキソ−ブレビコミン（５ ０００ ）；（１Ｓ，１'Ｒ，５'Ｒ，７'Ｒ）−１−ヒドロキシ−エキソ−ブレビ コミン（６０００）。
【図３５】 図３５は、ヒドロキシアセトンを含む３８Ｃ２触媒アルドールおよびレトロア
ルドール反応の立体化学的経過を示す。
【図３６】 図３６は、以下の条件でｓｙｎ−９０００およびａｎｔｉ−９０００から５０ ００ および６０００を製造する過程を示す：ａ）抗体３９Ｃ２（０．６６ｍｏｌ
％）、ヒドロキシアセトン（５容積％）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．
４）；ｂ）ＮａＢＨ4、ＭｅＯＨ；ＨＰＬＣ分離；ｃ）ｐＴｓＯＨ、Ｃ6Ｈ6、６ ０℃。
【図３７】 図３７は、分析スケールでの反応で得たアルドール８０００αの絶対配置と鏡
像異性体純度の測定を示す。キラセルＡＤカラム（１２％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサ
ン、１ｍｌ／分、波長（λ）＝２８４ｎｍ）。
【図３８】 図３８は、以下の条件を用いた１００００から１０００の合成を示す：ａ）分
析スケールでの反応：抗体３８Ｃ２（０．６ｍｏｌ％）、１−ヒドロキシ−２−
ブタノン（５容積％）、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）；ｂ）ＮａＢＨ4、ＭｅＯＨ；ｃ ）ｐＴｓＯＨ、Ｃ6Ｈ6、６０℃、カラムクロマトグラフィー；ｄ）文献に報告さ
れた条件に正確にしたがった（Taniguchi, H. Ohnishi, K. Ogasawara, Chem. C
ommun. 1966, 1477-1478）。
【図３９】 図３９は、抗体触媒反応の動力学的パラメーターを示す表である。（ａ）３日
後、バックグラウンド反応の生成物の形成は観察されなかった。（ｂ）ラインウ
ィーバ＝バーク（Lineweaver-Burk)の作図から得られたＫcat。（ｃ）速度は単 一濃度で測定したが、化合物８０００αと８０００βについて得られた速度と相
関性を有している。
【図４０】 図４０は、ヒドロキシアセトンが種々のアルデヒドと高い局所部位選択性、偏
左右異性選択性、および鏡像選択性をもって反応して対応するα−（２Ｒ，３Ｓ
）−ジヒドロキシケトンを生成するのを示している。対応するβ−（２Ｓ，３Ｒ
）−異性体は、３８Ｃ２触媒鏡像選択的レトロアルドール反応を介してラセミ混
合物から得ることができる。この手法は、多くのアルドールの動力学的解析を用
い、異なる１０のブレビコミンの完全合成で示すことができた。
【図４１】 図４１は、水素付加によってケトン２１１１ａを容易に１−デオキシ−Ｌ−キ
シルロース（１１１１）に変換できることを示している。０．５ｍｌのアセトニ
トリル中のベンジルオキシアセトアルデヒド（８０ｍｇ、０．５３mmol）を、Ｐ
ＢＳ（リン酸緩衝食塩水、１００ｍＭ）中の抗体３８Ｃ２溶液（３５ｍｇ、０．
２３mmol）９ｍｌに加え、続いてヒドロキシアセトン（０．５ｍｌ、６．３mmol
）を添加した。室温で４８時間後に反応は５６％変換に達した。この混合物を凍
結乾燥させた。残留物を塩化メチレンで抽出した。減圧下で溶媒を除去し、粗生
成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン、１／１
）で精製し、純粋な２１１１ａ（３９ｍｇ、０．１７mmol、３２％）を９７％の
ｅｅで得た。ベンジルエーテル２１１１ａ（３９ｍｇ、０．１７mmol）を１ｍｌ
のメタノールに溶解し、炭素上の触媒量の水酸化パラジウムを用いて水素を付加
させた。２時間後、混合物をセリットでろ過して減圧下で溶媒を除去し、純粋な
１−デオキシ−Ｌ−キシルロース（１９ｍｇ、０．１４mmol、８１％）を得た。
【図４２】 図４２は、アルドール生成物の鏡像異性体純度を決定するために参考化合物を
合成したことを示している。ジエチル−２−オキソプロピル−ホスフェートとベ
ンジルオキシアセトアルデヒドとのホーナー＝ワズワース＝エモンス反応によっ
て、既知のオレフィン３１１１が生成された。これをシャープレスの方法を用い
てジヒドロキシル化して参考アルドール２１１１ａおよび２１１１ｂを高いｅｅ
で得た。
【図４３】 図４３は、抗体触媒反応から得たアルドール２１１１αの絶対配置および鏡像
異性体純度の測定を示している。キラセルＡＤカラム（１２％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘ
キサン、１ｍｌ／分、λ＝２５４ｎｍ）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ラーナー ロバート エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ イースト ローズラ ンド ドライヴ 7750 (72)発明者 ツォン グオフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ ノーベル ドラ イヴ 4085 ナンバー５ Ｆターム(参考） 4B064 AC32 AC34 AC36 BA02 BA03 BA04 BH04 BH07 CA21 CA50 DA16

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルドール供与基質とアルドール受容基質との間でアルドー
    ル縮合を触媒して、β−ヒドロキシケトンを生成する方法であって、前記アルド
    ール供与基質がケトン供与基質またはアルデヒド供与基質のどちらかで、前記ア
    ルドール受容基質がケトン受容基質またはアルデヒド受容基質のどちらかで、前
    記方法が以下の工程を含む、アルドール縮合を触媒する方法： 工程Ａ：触媒として有効な量のアルドール付加活性を有する触媒性抗体または
    前記触媒性抗体の抗体結合部位部分を含む触媒として活性な分子を、十分量の前
    記アルドール供与基質および前記アルドール受容基質と反応媒体中で混合して反
    応混合物をつくる工程であって、前記アルドール供与基質は反応性カルボニル基
    および前記カルボニル基に隣接する分枝していない炭素を含み、前記触媒性抗体
    または前記触媒として活性な分子は、前記アルドール供与基質の反応性カルボニ
    ル基とともにシッフ塩基中間体を形成するリジン残基を含むタイプに属するもの
    である工程；続いて 工程Ｂ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子が前記アルドール供
    与基質と前記アルドール受容基質との間でアルドール縮合を触媒して前記β−ヒ
    ドロキシケトンを生成するために十分な時間、前記工程Ａの反応混合物を維持す
    る工程であって、下記の条件が適用される工程： アルドール供与基質がケトン供与基質で、アルドール受容基質がアルデヒド受
    容基質である場合は、ケトン供与基質は官能基をもたない開放鎖脂肪族ケトンで
    はない。
  2. 【請求項２】 前記アルドール受容基質がアルデヒド受容基質で、前記アル
    ドール供与基質が、脂肪族環式ケトン、官能基をもつ開放鎖脂肪族ケトンおよび
    官能基をもつ環式ケトンから成る群から選ばれる前記ケトン供与基質である請求
    項１に記載のアルドール縮合を触媒する方法。
  3. 【請求項３】 工程Ｂの後に、以下の付加工程を含む請求項２に記載のアル
    ドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子の存在下で更なる時
    間工程Ｂの反応混合物を維持し、離脱反応によって前記β−ヒドロキシケトンを
    β−不飽和ケトン生成物に変換する。
  4. 【請求項４】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項２に記載のア
    ルドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：還元によって前記β−ヒドロキシケトンをジヒドロキシ生成物に変換
    する。
  5. 【請求項５】 前記アルドール供与基質がケトン供与基質で、前記アルドー
    ル受容基質がケトン受容基質である請求項１に記載のアルドール縮合を触媒する
    方法。
  6. 【請求項６】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項５のアルドー
    ル縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子の存在下で更なる時
    間工程Ｂの反応混合物を維持し、離脱反応によって前記β−ヒドロキシケトンを
    β−不飽和ケトン生成物に変換する。
  7. 【請求項７】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項５に記載のア
    ルドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：還元によって前記β−ヒドロキシケトンをジヒドロキシ生成物に変換
    する。
  8. 【請求項８】 前記アルドール供与基質がアルデヒド供与基質で、前記アル
    ドール受容基質がアルデヒド受容基質である請求項１に記載のアルドール縮合を
    触媒する方法。
  9. 【請求項９】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項８のアルドー
    ル縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子の存在下で更なる時
    間工程Ｂの反応混合物を維持し、離脱反応によって前記β−ヒドロキシケトンを
    β−不飽和ケトン生成物に変換する。
  10. 【請求項１０】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項８に記載の
    アルドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：還元によって前記β−ヒドロキシケトンをジヒドロキシ生成物に変換
    する。
  11. 【請求項１１】 前記アルドール供与基質がアルデヒド供与基質で、前記ア
    ルドール受容基質がケトン受容体である請求項１に記載のアルドール縮合を触媒
    する方法。
  12. 【請求項１２】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項１１のアル
    ドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子の存在下で更なる時
    間工程Ｂの反応混合物を維持し、離脱反応によって前記β−ヒドロキシケトンを
    β−不飽和ケトン生成物に変換する。
  13. 【請求項１３】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項１１に記載
    のアルドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：還元によって前記β−ヒドロキシケトンをジヒドロキシ生成物に変換
    する。
  14. 【請求項１４】 前記アルドール縮合が分子内で、前記アルドール供与基質
    およびアルドール受容基質の両方が単一反応分子で、前記アルドール縮合が前記
    単一反応分子を環状化させて環式β−ヒドロキシケトンを生成する請求項１に記
    載のアルドール縮合を触媒する方法。
  15. 【請求項１５】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項１４のアル
    ドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子の存在下で更なる時
    間工程Ｂの反応混合物を維持し、離脱反応によって前記環式β−ヒドロキシケト
    ンを環式β−不飽和ケトン生成物に変換する。
  16. 【請求項１６】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項１４に記載
    のアルドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：還元によって前記環式β−ヒドロキシケトンを環式ジヒドロキシ生成
    物に変換する。
  17. 【請求項１７】 前記アルドール縮合が自己アルドール縮合で、前記アルド
    ール供与基質およびアルドール受容基質の両方が単一ケトン反応分子である請求
    項１に記載のアルドール縮合を触媒する方法。
  18. 【請求項１８】 前記工程Ｂの後で以下の付加工程を含む請求項１７のアル
    ドール縮合を触媒する方法： 工程Ｃ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子の存在下で更なる時
    間工程Ｂの反応混合物を維持し、離脱反応によって前記β−ヒドロキシケトンを
    β−不飽和ケトン生成物に変換する。
  19. 【請求項１９】 前記アルドール供与基質が以下の構造によって表され： 【化１】 前記アルドール受容基質が以下の構造によって表され： 【化２】 前記β−ヒドロキシケトンが以下の構造によって表される請求項１に記載のアル
    ドール縮合を触媒する方法： 【化３】 式中、Ｒ1は（ＦＧ）−アルキル、（ＦＧ）−アルケニルおよび（ＦＧ）−アリ ールから成る群から選ばれるラジカルで；Ｒ1はＨ、ＯＨおよびＦから成る群か ら選ばれるラジカルで；ＸはＮＣＨ3、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2およびＣ6Ｈ4から成る群か
    ら選ばれるラジカルで；ＦＧはＯＨおよびＯＣＨ3から成る群から選ばれるラジ カルである。
  20. 【請求項２０】 アルドール供与基質とアルドール受容基質との間でアルド
    ール縮合を触媒して、β−ヒドロキシケトンを生成する方法であって、前記アル
    ドール供与基質がケトン供与基質またはアルデヒド供与基質のどちらかで、前記
    アルドール受容基質がケトン受容基質またはアルデヒド受容基質のどちらかで、
    前記方法が以下の工程を含むアルドール縮合を触媒する方法： 工程Ａ：触媒として有効な量のアルドール付加活性を有する触媒性抗体または
    前記触媒性抗体の抗体結合部位部分を含む触媒として活性な分子を、十分量の前
    記アルドール供与基質および前記アルドール受容基質と反応媒体中で混合して反
    応混合物をつくる工程であって、前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分
    子は、前記アルドール供与基質とともにシッフ塩基中間体を形成するリジン残基
    を含むタイプに属し、前記アルドール供与基質は結合を形成しないα位で分枝し
    ていない工程；続いて 工程Ｂ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子が前記アルドール供
    与基質と前記アルドール受容基質との間でアルドール縮合を触媒して前記β−ヒ
    ドロキシケトンを生成するために十分な時間、前記工程Ａの反応混合物を維持し
    て前記β−ヒドロキシケトンを生成し、離脱反応によって前記β−ヒドロキシケ
    トンをβ−不飽和ケトン生成物に変換する工程。
  21. 【請求項２１】 レトロアルドール反応を触媒してβ−ヒドロキシケトンを
    第一および第二のカルボニル生成物に変換する方法であって、前記第一および第
    二のカルボニル生成物がそれぞれ別個にケトン生成物またはアルデヒド生成物で
    ある、以下の工程を含むレトロアルドール反応を触媒する方法： 工程Ａ：触媒として有効な量のアルドール付加活性を有する触媒性抗体または
    前記触媒性抗体の抗体結合部位部分を含む触媒として活性な分子を、前記β−ヒ
    ドロキシケトンと反応媒体中で混合して反応混合物をつくる工程であって、前記
    触媒性抗体または前記触媒として活性な分子は、前記第一のカルボニル生成物と
    シッフ塩基中間体を形成するリジン残基を含むタイプに属し、前記第一のカルボ
    ニル生成物はα位で分枝していない工程；続いて 工程Ｂ：前記触媒性抗体または前記触媒として活性な分子が前記レトロアルド
    ール反応を触媒して前記β−ヒドロキシケトンを前記第一および第二のカルボニ
    ル生成物に変換するために十分な時間、前記工程Ａの反応混合物を維持する工程
    。
  22. 【請求項２２】 前記第一および第二のカルボニル生成物がおのおのケトン
    生成物である請求項２１に記載のレトロアルドール反応を触媒する方法。
  23. 【請求項２３】 前記第一および第二のカルボニル生成物がおのおのアルデ
    ヒド生成物である請求項２１に記載のレトロアルドール反応を触媒する方法。
  24. 【請求項２４】 前記第一のカルボニル生成物がアルデヒド生成物で、さら
    に第二のカルボニル生成物がケトン生成物である請求項２１に記載のレトロアル
    ドール反応を触媒する方法。
  25. 【請求項２５】 前記β−ヒドロキシケトンが環状で、前記レトロアルドー
    ル反応が前記環式β−ヒドロキシケトンを開環して、単一生成物分子として前記
    第一および第二のカルボニル生成物の両方を含む単一の開放鎖生成物を形成する
    請求項２１に記載のレトロアルドール反応を触媒する方法。
  26. 【請求項２６】 前記レトロアルドール反応が逆方向の自己アルドール縮合
    で、ここで前記第一および第二のカルボニル生成物が互いに同一である請求項２
    １に記載のレトロアルドール反応を触媒する方法。
  27. 【請求項２７】 前記β−ヒドロキシケトンが以下の構造によって表され： 【化４】 前記第一のカルボニル生成物が以下の構造によって表され： 【化５】 前記第二のカルボニル生成物が以下の構造によって表される請求項２１に記載の
    レトロアルドール反応を触媒する方法： 【化６】 式中、Ｒ1は（ＦＧ）−アルキル、（ＦＧ）−アルケニルおよび（ＦＧ）−アリ ールから成る群から選ばれるラジカルで；Ｒ1はＨ、ＯＨおよびＦから成る群か ら選ばれるラジカルで；ＸはＮＣＨ3、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2およびＣ6Ｈ4から成る群か
    ら選ばれるラジカルで；ＦＧはＯＨおよびＯＣＨ3から成る群から選ばれるラジ カルである。
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