JP2002507622A - 殺精子活性および抗ウイルス活性を示すａｚｔ誘導体 - Google Patents
殺精子活性および抗ウイルス活性を示すａｚｔ誘導体Info
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Abstract
(57)【要約】
殺精子活性または精子を動けなくする活性を示すピリミジン系ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有する避妊用組成物によって避妊活性ならびに抗ウイルス保護を提供する。一実施形態によれば、活性成分は、５−ハロ、６−アルコキシ置換基を持つチミン環（例えば、ＡＺＴ）を含有する。特定のＡＺＴ誘導体の抗ＨＩＶ活性は、ＡＺＴのペントース環にアリールホスフェート置換基を付与することによってさらに改善される。
Description
【０００１】
本発明は、避妊効果、例えば、殺精子効果を提供する際のＡＺＴ誘導体および
その類似体の使用に関する。特別の一実施形態によれば、本発明は殺精子活性を
示し、かつ抗ＨＩＶウイルス活性を維持するという二重機能を持つ新規なＡＺＴ
誘導体に関する。
その類似体の使用に関する。特別の一実施形態によれば、本発明は殺精子活性を
示し、かつ抗ＨＩＶウイルス活性を維持するという二重機能を持つ新規なＡＺＴ
誘導体に関する。
【０００２】
公知の殺精子剤、ノノキシノール−９（Ｎ９）およびグラミシジンは、精子の
形質膜を傷つけ、その形態を崩し、その半透膜性を破壊し、それによって精子運
動性および卵子の受精機能を損なわせる洗剤様の能力によってその効果を示す（
ウィルボーンら、ファータイル ステリル（Wilborn, et al., Fertil Steril,
1983 ; 39:717-719 ；バウリンバイアーら、ライフサイエンス（Bourinbaiar, e
t al.,Life Sci ）１９９４；５４：ＰＬ５−９）。非特異的な膜破壊特性ゆえ 、そのような膣内殺精子剤は膣頚部の上皮細胞を傷つけ、また性行為により感染
する疾患を防ぐ程度を低下させる可能性があることがわかっている（ニルシサー
ドら、セックシュアリー トランスミッテド ディジーズ（Niruthsisard et al
., Sex Transm Dis ）１９９１；１８：１７６−１７９）。現在入手可能な膣内
避妊薬の洗剤タイプの作用を媒介とした非特異的膜毒性の働きをしない膣内避妊
薬が望ましい。
形質膜を傷つけ、その形態を崩し、その半透膜性を破壊し、それによって精子運
動性および卵子の受精機能を損なわせる洗剤様の能力によってその効果を示す（
ウィルボーンら、ファータイル ステリル（Wilborn, et al., Fertil Steril,
1983 ; 39:717-719 ；バウリンバイアーら、ライフサイエンス（Bourinbaiar, e
t al.,Life Sci ）１９９４；５４：ＰＬ５−９）。非特異的な膜破壊特性ゆえ 、そのような膣内殺精子剤は膣頚部の上皮細胞を傷つけ、また性行為により感染
する疾患を防ぐ程度を低下させる可能性があることがわかっている（ニルシサー
ドら、セックシュアリー トランスミッテド ディジーズ（Niruthsisard et al
., Sex Transm Dis ）１９９１；１８：１７６−１７９）。現在入手可能な膣内
避妊薬の洗剤タイプの作用を媒介とした非特異的膜毒性の働きをしない膣内避妊
薬が望ましい。
【０００３】 さらに、性行為により感染する疾患の危険性が広く認識されており、今日まで
に教育や予防策が行われているにもかかわらず、ＨＩＶなどの疾患の広がりは依
然として重大な健康の問題である。ＨＩＶなどの性行為により感染する疾患に対
する何らかの保護をする避妊薬、特に、異性間感染により、そのような疾患にか
かる危険性の高い女性の危険性を減少させるためにを提供することが望ましいだ
ろう。
に教育や予防策が行われているにもかかわらず、ＨＩＶなどの疾患の広がりは依
然として重大な健康の問題である。ＨＩＶなどの性行為により感染する疾患に対
する何らかの保護をする避妊薬、特に、異性間感染により、そのような疾患にか
かる危険性の高い女性の危険性を減少させるためにを提供することが望ましいだ
ろう。
【０００４】
ＨＩＶ感染に対する効果について、ＡＺＴが広範囲に研究されてきたが、ＡＺ
Ｔ自体が、避妊活性、例えば、殺精子活性および／または精子を動けなくする活
性を有するということは認識されていなかった。本発明は、避妊薬として有用な
ＡＺＴ誘導体、生成物およびそれらを使用するための方法を提供する。そのよう
な生成物の例としては、膣内フォーム、クリーム、ローションまたはゲル剤、ス
ポンジ、その他の膣内挿入物およびコンドーム潤滑性組成物が挙げられる。本発
明はまた、抗ＨＩＶ活性を維持しながら、避妊特性を示す特定のＡＺＴ誘導体に
関する。
Ｔ自体が、避妊活性、例えば、殺精子活性および／または精子を動けなくする活
性を有するということは認識されていなかった。本発明は、避妊薬として有用な
ＡＺＴ誘導体、生成物およびそれらを使用するための方法を提供する。そのよう
な生成物の例としては、膣内フォーム、クリーム、ローションまたはゲル剤、ス
ポンジ、その他の膣内挿入物およびコンドーム潤滑性組成物が挙げられる。本発
明はまた、抗ＨＩＶ活性を維持しながら、避妊特性を示す特定のＡＺＴ誘導体に
関する。
【０００５】 本発明の一局面によれば、ＡＺＴのチミン環上に５−ハロおよび６−アルコキ
シ置換基を含み、避妊特性を示すＡＺＴ誘導体に関する。
シ置換基を含み、避妊特性を示すＡＺＴ誘導体に関する。
【０００６】 本発明の非常に重要な局面によれば、ＡＺＴのチミン環上に５−ハロおよび６
−アルコキシ置換基およびＡＺＴのペントース環上に化合物を細胞へ入りやすく
する置換基を含む、殺精子活性および抗ＨＩＶウイルス活性の双方の活性を有す
る新規な二重機能ＡＺＴ誘導体を使用した避妊効果を提供することに関する。例
えば、とりわけ、ペントース環上の置換基はホスフェート基といっしょに存在す
ることができ、それはさらにアリール含有基と置換されてもよい。そしてアリー
ル基自身はさらに置換され得る。本発明の上記局面によれば、ＡＺＴのペントー
ス環上のアジド基は、ＮＨ2と置換されることができ、それは、任意に置換され ることができ、または前記アジド基はハロ、ＣＮまたはＣＯＯＨと置換されるこ
とができる。
−アルコキシ置換基およびＡＺＴのペントース環上に化合物を細胞へ入りやすく
する置換基を含む、殺精子活性および抗ＨＩＶウイルス活性の双方の活性を有す
る新規な二重機能ＡＺＴ誘導体を使用した避妊効果を提供することに関する。例
えば、とりわけ、ペントース環上の置換基はホスフェート基といっしょに存在す
ることができ、それはさらにアリール含有基と置換されてもよい。そしてアリー
ル基自身はさらに置換され得る。本発明の上記局面によれば、ＡＺＴのペントー
ス環上のアジド基は、ＮＨ2と置換されることができ、それは、任意に置換され ることができ、または前記アジド基はハロ、ＣＮまたはＣＯＯＨと置換されるこ
とができる。
【０００７】 本発明のさらに別の局面によれば、殺精子活性を有するＡＺＴ誘導体を活性物
質として使用する避妊用生成物、およびそのような避妊用生成物の製造に関する
。
質として使用する避妊用生成物、およびそのような避妊用生成物の製造に関する
。
【０００８】 本発明のさらに別の局面によれば、精子を殺精子ＡＺＴ誘導体、例えば、上記
のように本発明の避妊用生成物に接触させることを含む方法に関する。 （発明の詳細な説明） ＨＩＶ感染に対する活性の高められた活性物質を探求する中で、ＡＺＴ誘導体
が殺精子活性および／または精子を動けなくする活性を持ち、したがって避妊用
生成物および避妊方法に有用な活性物質であるという予期せぬ発見がなされた。
これらの誘導体は、性行為によって感染する疾患の流行を減少させることができ
、同様に避妊を行うことができる避妊用生成物を生成するのに特に有用である。
特に、避妊活性を有するＡＺＴ誘導体は、ＡＺＴ誘導体のチミン環を５位におい
てハロゲンで、６位においてアルコキシ、特にＣ１−３アルコキシで置換するこ
とによって提供される。本発明のこの局面による誘導体は、下記式（Ｉ）で表さ
れる化学構造を有する。
のように本発明の避妊用生成物に接触させることを含む方法に関する。 （発明の詳細な説明） ＨＩＶ感染に対する活性の高められた活性物質を探求する中で、ＡＺＴ誘導体
が殺精子活性および／または精子を動けなくする活性を持ち、したがって避妊用
生成物および避妊方法に有用な活性物質であるという予期せぬ発見がなされた。
これらの誘導体は、性行為によって感染する疾患の流行を減少させることができ
、同様に避妊を行うことができる避妊用生成物を生成するのに特に有用である。
特に、避妊活性を有するＡＺＴ誘導体は、ＡＺＴ誘導体のチミン環を５位におい
てハロゲンで、６位においてアルコキシ、特にＣ１−３アルコキシで置換するこ
とによって提供される。本発明のこの局面による誘導体は、下記式（Ｉ）で表さ
れる化学構造を有する。
【０００９】
【化６】
【００１０】 但し、Ｒ1はＨ、Ｎ3、ハロ、ＣＮ、ＣＯＯＨまたはＮＨ2であり、Ｒ2はハロ（特
にＣｌ、ＢｒまたはＩ、より特にＢｒ）であり、Ｒ3はアルコキシ（特にＣ１− ３アルコキシ、より特にメトキシ（−ＯＣＨ3））である。前記ＮＨ3基は、官能
基化され得、例えば、−ＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、−Ｐｈ、−ＣＯＰｈおよび−ＣＨ 2 Ｐｈと結合され得る。薬学的に許容できる塩もしくはそのエステル剤型として は、例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩を使用することもでき
る。
にＣｌ、ＢｒまたはＩ、より特にＢｒ）であり、Ｒ3はアルコキシ（特にＣ１− ３アルコキシ、より特にメトキシ（−ＯＣＨ3））である。前記ＮＨ3基は、官能
基化され得、例えば、−ＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、−Ｐｈ、−ＣＯＰｈおよび−ＣＨ 2 Ｐｈと結合され得る。薬学的に許容できる塩もしくはそのエステル剤型として は、例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩を使用することもでき
る。
【００１１】 本発明のさらに別の局面によれば、上記式（Ｉ）で表される誘導体は、ＡＺＴ
ペントース環部分の上に置換基を有する。本発明の別の誘導体は下記式（II）で
あらわされる化学構造を有する。
ペントース環部分の上に置換基を有する。本発明の別の誘導体は下記式（II）で
あらわされる化学構造を有する。
【００１２】
【化７】
【００１３】 但し、Ｒ1はＨ、Ｎ3、ハロ、ＣＮ、ＣＯＯＨまたはＮＨ2であり、Ｒ2はハロ（特
にＣｌ、ＢｒまたはＩ、より特にＢｒ）であり、Ｒ3はアルコキシ（特にＣ１− ３アルコキシ、より特にメトキシ（−ＯＣＨ3））であり、Ｒ’は化合物を細胞 へ通過しやすくする基である。式（Ｉ）に示されるように、ＮＨ2基は、例えば 、ＮＨＣＨ3、ＮＨＣＯＣＨ3、ＮＨＰｈ、ＮＨＣＯＰｈ、およびＮＨＣＨ2Ｐｈ に変換することが可能である。Ｒ’基は、例えばホスフェート、脂質または脂肪
酸基である。または、精子反応性抗体またはサイトカインをこれらの化合物（同
様に式（Ｉ）で表される化合物）を誘導体化するために、標的輸送のためのＲ’
またはＲ1位置において使用することができる。薬学的に許容できる塩もしくは そのエステル剤型としては、例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム
塩も使用することもできる。
にＣｌ、ＢｒまたはＩ、より特にＢｒ）であり、Ｒ3はアルコキシ（特にＣ１− ３アルコキシ、より特にメトキシ（−ＯＣＨ3））であり、Ｒ’は化合物を細胞 へ通過しやすくする基である。式（Ｉ）に示されるように、ＮＨ2基は、例えば 、ＮＨＣＨ3、ＮＨＣＯＣＨ3、ＮＨＰｈ、ＮＨＣＯＰｈ、およびＮＨＣＨ2Ｐｈ に変換することが可能である。Ｒ’基は、例えばホスフェート、脂質または脂肪
酸基である。または、精子反応性抗体またはサイトカインをこれらの化合物（同
様に式（Ｉ）で表される化合物）を誘導体化するために、標的輸送のためのＲ’
またはＲ1位置において使用することができる。薬学的に許容できる塩もしくは そのエステル剤型としては、例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム
塩も使用することもできる。
【００１４】 本発明のさらに別の局面によれば、Ｒ’基は、ホスフェート基を形成する。ホ
スフェートの−ＯＨ部分のＨは、Ｃ１−４アルキルまたはアリール置換基（例え
ば、フェニル−、ナフチル−、またはアントラシニル（anthracinyl）−置換基 ）と置換されることができ、それらは任意に置換され、ＳＨまたはＮＨ2基はホ スフェートのＯＨを置換することができる。そしてこれらの各場合において、Ｎ
Ｈ2またはＳＨのＨは、既に述べたＯＨ基のＨと同じ方法で置換されることがで きる。アリールホスフェート基は驚くほどすぐれた抗ＨＩＶ活性を効果的に維持
する。アリールホスフェートＯＲ’基の例としては下記（化８）が挙げられる。
スフェートの−ＯＨ部分のＨは、Ｃ１−４アルキルまたはアリール置換基（例え
ば、フェニル−、ナフチル−、またはアントラシニル（anthracinyl）−置換基 ）と置換されることができ、それらは任意に置換され、ＳＨまたはＮＨ2基はホ スフェートのＯＨを置換することができる。そしてこれらの各場合において、Ｎ
Ｈ2またはＳＨのＨは、既に述べたＯＨ基のＨと同じ方法で置換されることがで きる。アリールホスフェート基は驚くほどすぐれた抗ＨＩＶ活性を効果的に維持
する。アリールホスフェートＯＲ’基の例としては下記（化８）が挙げられる。
【００１５】
【化８】
【００１６】 但し、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、同一もしくは異なり、水素、メチル、エチル、フ ルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ジクロロ、ジブロモ、ジフルオロ、トリフル
オロメチル、ニトロ、シアノ、メトキシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシ
から選択され、特に水素、フルオロ、ブロモおよびメトキシであり、Ｒ”は、任
意に置換および／またはエステル化され得るアミノ酸残基、例えば、アラニニル
（alaninyl）基（−ＮＨＣＨ（Ｍｅ）ＣＯＯＭｅ）である。アラニニル基の場合
、ＣＨ基に付いたメチル基を、例えばフェニル基で置換することができ、メチル
エステル化は、他のＣ２またはＣ３エステル化で置換することができる。
オロメチル、ニトロ、シアノ、メトキシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシ
から選択され、特に水素、フルオロ、ブロモおよびメトキシであり、Ｒ”は、任
意に置換および／またはエステル化され得るアミノ酸残基、例えば、アラニニル
（alaninyl）基（−ＮＨＣＨ（Ｍｅ）ＣＯＯＭｅ）である。アラニニル基の場合
、ＣＨ基に付いたメチル基を、例えばフェニル基で置換することができ、メチル
エステル化は、他のＣ２またはＣ３エステル化で置換することができる。
【００１７】 上記式（Ｉ）、（II）で表される誘導体において、Ｒ1がＮＨ2である場合、Ｒ 1 がＮ3である場合に比べて殺精子（即ち、避妊）活性が高いことがわかる。しか
しながら、抗ＨＩＶ活性は、有用なレベルではあるものの減少する。Ｒ4置換基 の中で、ブロモ置換基が最も高い殺精子活性を有し、フルオロ、メトキシ、水素
の順に高かった。抗ＨＩＶ活性もブロモＲ4置換基が最も高く、水素、メトキシ 、フルオロの順に高かった。
しながら、抗ＨＩＶ活性は、有用なレベルではあるものの減少する。Ｒ4置換基 の中で、ブロモ置換基が最も高い殺精子活性を有し、フルオロ、メトキシ、水素
の順に高かった。抗ＨＩＶ活性もブロモＲ4置換基が最も高く、水素、メトキシ 、フルオロの順に高かった。
【００１８】 ここで述べた誘導体の全ては、精子細胞において有用な代謝産物を産出すると
考えられている。上記ＡＺＴ誘導体と同様の代謝産物を産出する他の構造、およ
び現構造に対するプレカーサとして機能する構造が開発され得ることが当業者に
とっては明白であろうことは容易にわかる。本発明は、これらの他の構造を包含
することを考えなければならない。同様の代謝産物を産出する他の構造の例とし
ては、下記式（ａ）〜（ｌ）が挙げられる。
考えられている。上記ＡＺＴ誘導体と同様の代謝産物を産出する他の構造、およ
び現構造に対するプレカーサとして機能する構造が開発され得ることが当業者に
とっては明白であろうことは容易にわかる。本発明は、これらの他の構造を包含
することを考えなければならない。同様の代謝産物を産出する他の構造の例とし
ては、下記式（ａ）〜（ｌ）が挙げられる。
【００１９】
【化９】
【００２０】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００２１】
【化１０】
【００２２】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００２３】
【化１１】
【００２４】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００２５】
【化１２】
【００２６】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００２７】
【化１３】
【００２８】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００２９】
【化１４】
【００３０】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００３１】
【化１５】
【００３２】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００３３】
【化１６】
【００３４】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００３５】
【化１７】
【００３６】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００３７】
【化１８】
【００３８】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００３９】
【化１９】
【００４０】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００４１】
【化２０】
【００４２】 但し、Ｒ2はＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒ3は、メトキシ、エトキシまたはイソ
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
プロポキシであり、Ｒ6はＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはＣＨ2Ｐ
ｈであり、Ｒ7はメチル、エチルまたはプロピルである。
【００４３】 本発明は、チミン含有ヌクレオシドＡＺＴおよびその誘導体について説明して
きたが、避妊効果をもつ５−ハロゲンおよび６−アルコキシ置換基は、ピリミジ
ン環系を基礎とした他のヌクレオシドおよびヌクレオチドにも効果的である。そ
の一例がチミンである。これらの他のヌクレオシドとしては、例えば、ウラシル
またはシトシン環などの環部分が挙げられる。これらは例えば、チミンと同様の
方法で置換するのに好適である。
きたが、避妊効果をもつ５−ハロゲンおよび６−アルコキシ置換基は、ピリミジ
ン環系を基礎とした他のヌクレオシドおよびヌクレオチドにも効果的である。そ
の一例がチミンである。これらの他のヌクレオシドとしては、例えば、ウラシル
またはシトシン環などの環部分が挙げられる。これらは例えば、チミンと同様の
方法で置換するのに好適である。
【００４４】 チミン環上に５−ブロモおよび６−メトキシ置換基を有するＡＺＴ誘導体は、
公知の方法で調製できる。例えば、クマールら、ジャーナルオフメディカルケミ
ストリー（Kumar et al. J. Med. Chem. ）３７，４２９７（１９９４）；エル ．ワングら（L. Wang et al. ）、ジャーナルオフメディカルケミストリー、３ ９，８２６（１９９６）を参照されたい。同様に、アリールホスフェート誘導体
も公知のホスホロクロリデート化学的技法（phosphorochloridate chemistry te
chniques）で調製できる。例えば、シー．マクギアンら（C.McGuigan et al. ）
、ジャーナルオフメディカルケミストリー、３６，１０４８（１９９３）；同３
９，１７４８（１９９６）；バイオロジカルメディカルケミストリー レター（
Biorg. Med. Chem. Lett. ）６，１１８３（１９９６）。アジド基、例えばＮＨ 2 基への変換は公知の技術で行うことができる。ジャーナルオフメディカルケミ ストリー２１，１０９（１９７８）を参照されたい。
公知の方法で調製できる。例えば、クマールら、ジャーナルオフメディカルケミ
ストリー（Kumar et al. J. Med. Chem. ）３７，４２９７（１９９４）；エル ．ワングら（L. Wang et al. ）、ジャーナルオフメディカルケミストリー、３ ９，８２６（１９９６）を参照されたい。同様に、アリールホスフェート誘導体
も公知のホスホロクロリデート化学的技法（phosphorochloridate chemistry te
chniques）で調製できる。例えば、シー．マクギアンら（C.McGuigan et al. ）
、ジャーナルオフメディカルケミストリー、３６，１０４８（１９９３）；同３
９，１７４８（１９９６）；バイオロジカルメディカルケミストリー レター（
Biorg. Med. Chem. Lett. ）６，１１８３（１９９６）。アジド基、例えばＮＨ 2 基への変換は公知の技術で行うことができる。ジャーナルオフメディカルケミ ストリー２１，１０９（１９７８）を参照されたい。
【００４５】 下記式（化２１）（合成スキームＩ）は合成スキームの一例である。
【００４６】
【化２１】
【００４７】 化合物３ａは公知の文献に記載の方法で調製した。化合物３ａをＢｒＯＭｅで
処理し、（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’
−アジドチミジン ５’−（ｐ−メトキシフェニル メトキシアラニニルホスフ
ェート）と（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン５’−（ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート）とのジアステレオマ性混合物（４ａ）（混合比２：１）を作製した。３ｂ
の調製は、市販のｐ−ブロモフェノールおよびエチルエーテル中リンオキシクロ
ライドで開始し、中間物１ｂを得た。中間物１ｂをアラニンと結合させ、中間物
２ｂを得た。さらに中間物２ｂを、Ｎ−メチルイミダゾールでの触媒でＡＺＴと
結合させ、化合物３ｂを得た。化合物３ｂをＢｒＯＭｅで処理して、望ましい生
成物４ｂを得た。中間物２ｂを化合物、すなわち、トランス−（５Ｒ、６Ｒ）５
−ブロモ−６−メトキシ−５，６ ジヒドロ−３’−アジド−３’−デオキシチ
ミジンと結合させることによって、（Ｒ，Ｒ）ジアステレオマを達成した。
処理し、（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’
−アジドチミジン ５’−（ｐ−メトキシフェニル メトキシアラニニルホスフ
ェート）と（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン５’−（ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート）とのジアステレオマ性混合物（４ａ）（混合比２：１）を作製した。３ｂ
の調製は、市販のｐ−ブロモフェノールおよびエチルエーテル中リンオキシクロ
ライドで開始し、中間物１ｂを得た。中間物１ｂをアラニンと結合させ、中間物
２ｂを得た。さらに中間物２ｂを、Ｎ−メチルイミダゾールでの触媒でＡＺＴと
結合させ、化合物３ｂを得た。化合物３ｂをＢｒＯＭｅで処理して、望ましい生
成物４ｂを得た。中間物２ｂを化合物、すなわち、トランス−（５Ｒ、６Ｒ）５
−ブロモ−６−メトキシ−５，６ ジヒドロ−３’−アジド−３’−デオキシチ
ミジンと結合させることによって、（Ｒ，Ｒ）ジアステレオマを達成した。
【００４８】 本発明で殺精子活性物質として使用されるヌクレオシドを避妊用組成物として
使用するために調製することができる。そのような組成物は、特に哺乳動物、す
なわち、乳腺から分泌される母乳によって幼若動物を栄養する高等脊椎動物の全
てのクラス、例えば、ヒト、ウサギ、サル等の使用を意図している。本発明は非
常に実用的な用途で、ヒトに使用されることが期待されている。
使用するために調製することができる。そのような組成物は、特に哺乳動物、す
なわち、乳腺から分泌される母乳によって幼若動物を栄養する高等脊椎動物の全
てのクラス、例えば、ヒト、ウサギ、サル等の使用を意図している。本発明は非
常に実用的な用途で、ヒトに使用されることが期待されている。
【００４９】 本発明の避妊用組成物は、１以上の殺精子ヌクレオシドを含有する。殺精子剤
の総量は通常、避妊用組成物の総重量の約０．０２５〜０．５重量％である。通
常使用される殺精子剤の量は、望ましい殺精子効果および抗ウイルス保護効果を
達成するために必要な量であろう。その量は、具体的な組成物の必要に応じて変
えることができる。殺精子ＡＺＴ誘導体の使用量は、避妊用組成物の総重量の約
０．０５〜０．５重量％であることが好ましく、約０．０５〜０．２５重量％で
あることがより好ましい。
の総量は通常、避妊用組成物の総重量の約０．０２５〜０．５重量％である。通
常使用される殺精子剤の量は、望ましい殺精子効果および抗ウイルス保護効果を
達成するために必要な量であろう。その量は、具体的な組成物の必要に応じて変
えることができる。殺精子ＡＺＴ誘導体の使用量は、避妊用組成物の総重量の約
０．０５〜０．５重量％であることが好ましく、約０．０５〜０．２５重量％で
あることがより好ましい。
【００５０】 本発明の避妊用組成物は、殺精子ヌクレオシドのみならず、必要に応じて、薬
学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤、すなわち、殺精子ヌクレオシドを
精子との接触部位に適切に輸送および／または維持し、望ましい殺精子活性およ
び抗ウイルス保護を達成するための物質を含有する。
学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤、すなわち、殺精子ヌクレオシドを
精子との接触部位に適切に輸送および／または維持し、望ましい殺精子活性およ
び抗ウイルス保護を達成するための物質を含有する。
【００５１】 殺精子剤の投与のための薬学的組成物の有利な成分の１つは、ＵＳＰ５，５９
５，９８０に記載の重合体輸送成分である。その特許をここに引用する。そのよ
うな重合体輸送成分は殺精子剤の効率性を高め、投与したときの膣への刺激を減
少させることがわかっている。
５，９８０に記載の重合体輸送成分である。その特許をここに引用する。そのよ
うな重合体輸送成分は殺精子剤の効率性を高め、投与したときの膣への刺激を減
少させることがわかっている。
【００５２】 重合体成分の他に、避妊用組成物のバランスは、一般的に約０．１〜９９．８
％、しばしば約５０〜９９．８重量％であるが、それは、任意に１以上のコスメ
ティック成分（cosmetic ingredient）を含んでもよい。そのようなコスメティ ック成分は、当該技術分野の当業者に公知であり、しばしば希釈液、溶媒および
補助剤の技術において言及される。一般的にはコスメティック成分としては、例
えば、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、グリセリン、グリセロ
ールプロピレングリコール、ソルビトールおよびその他の高分子量アルコール類
が挙げられる。さらに、避妊用組成物は、少量例えば、避妊用組成物の重量を基
準として約０．１〜５重量％の他の添加剤、例えば、安定剤、界面活性剤、メタ
ノール、ユーカリ油、その他の精油、フレグランス等を含有してもよい。その組
成物に使用される安定剤としては、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウ
レートが好ましい。コスメティック成分、その他の添加物の選択および量、なら
びに混合方法の選択は当該技術分野の当業者に公知の技術にしたがって行うこと
ができる。
％、しばしば約５０〜９９．８重量％であるが、それは、任意に１以上のコスメ
ティック成分（cosmetic ingredient）を含んでもよい。そのようなコスメティ ック成分は、当該技術分野の当業者に公知であり、しばしば希釈液、溶媒および
補助剤の技術において言及される。一般的にはコスメティック成分としては、例
えば、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、グリセリン、グリセロ
ールプロピレングリコール、ソルビトールおよびその他の高分子量アルコール類
が挙げられる。さらに、避妊用組成物は、少量例えば、避妊用組成物の重量を基
準として約０．１〜５重量％の他の添加剤、例えば、安定剤、界面活性剤、メタ
ノール、ユーカリ油、その他の精油、フレグランス等を含有してもよい。その組
成物に使用される安定剤としては、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウ
レートが好ましい。コスメティック成分、その他の添加物の選択および量、なら
びに混合方法の選択は当該技術分野の当業者に公知の技術にしたがって行うこと
ができる。
【００５３】 本発明の殺精子活性成分およびそれを含有する避妊用組成物は、当該技術分野
の当業者に公知の方法によって哺乳動物の膣に適用することができる。前記組成
物の典型的な剤型としては、例えば、クリーム、ローション、ゲル剤、フォーム
や、スポンジ、坐薬およびフィルムの膣内デバイスが挙げられる。さらに、本発
明の避妊用化合物および組成物は、例えば、コンドームルーブリカント等のパー
ソナルケア製品として使用してもよい。そのようなルーブリカントとしては、通
常公知の成分、例えば、潤滑剤、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニト
ール、グリコール、およびグリコールエーテル；緩衝剤、例えば、グルコノ−ｄ
−ラクトン；殺菌剤または殺細菌剤、例えば、クロルヘキシジングルコネート；
防腐剤、例えば、メチルパラベン；増粘剤、例えば、ヒドロキシエチルセルロー
ス等；その他の補助剤、例えば、着色剤やフレグランスを本発明の組成物に加え
て含むことができる。当該分野の当業者は、そのような剤型の物性、例えば粘度
を広範に変え得ることを認識しているだろう。例えば、本発明の組成物のゲル剤
型の粘度は、例えば１５０，０００センチポアズであるが、本発明の組成物のロ
ーション剤型の粘度は、例えば１００センチポアズより実質的に高い。そのよう
な輸送形態の材料、成分、比率および処置についての更なる詳細は、当該技術分
野の当業者に公知である。
の当業者に公知の方法によって哺乳動物の膣に適用することができる。前記組成
物の典型的な剤型としては、例えば、クリーム、ローション、ゲル剤、フォーム
や、スポンジ、坐薬およびフィルムの膣内デバイスが挙げられる。さらに、本発
明の避妊用化合物および組成物は、例えば、コンドームルーブリカント等のパー
ソナルケア製品として使用してもよい。そのようなルーブリカントとしては、通
常公知の成分、例えば、潤滑剤、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニト
ール、グリコール、およびグリコールエーテル；緩衝剤、例えば、グルコノ−ｄ
−ラクトン；殺菌剤または殺細菌剤、例えば、クロルヘキシジングルコネート；
防腐剤、例えば、メチルパラベン；増粘剤、例えば、ヒドロキシエチルセルロー
ス等；その他の補助剤、例えば、着色剤やフレグランスを本発明の組成物に加え
て含むことができる。当該分野の当業者は、そのような剤型の物性、例えば粘度
を広範に変え得ることを認識しているだろう。例えば、本発明の組成物のゲル剤
型の粘度は、例えば１５０，０００センチポアズであるが、本発明の組成物のロ
ーション剤型の粘度は、例えば１００センチポアズより実質的に高い。そのよう
な輸送形態の材料、成分、比率および処置についての更なる詳細は、当該技術分
野の当業者に公知である。
【００５４】 本発明の避妊用組成物は、膣内に存在する精子を動けなくする、および／また
はそれらの子宮頚管粘液内への侵入を阻止するのに効果的な用量で哺乳動物に膣
内投与することが好ましい。典型的な用量は前記哺乳動物の体重１ｋｇあたり、
約０．０００１〜０．００１グラムの範囲である。
はそれらの子宮頚管粘液内への侵入を阻止するのに効果的な用量で哺乳動物に膣
内投与することが好ましい。典型的な用量は前記哺乳動物の体重１ｋｇあたり、
約０．０００１〜０．００１グラムの範囲である。
【００５５】 米国特許第５，０６９，９０６号明細書に記載の殺精子活性成分または避妊用
組成物の投与を助けるために膣内デバイスを使用してもよい。その開示をここに
引例として取り入れる。
組成物の投与を助けるために膣内デバイスを使用してもよい。その開示をここに
引例として取り入れる。
【００５６】 上記組成物の形状での殺精子活性成分の投与においては、前記組成物を薬物が
急速に放出されるように製剤してもよいし、また、徐放されるように製剤しても
よい。急速および徐速の放出をもたらす剤型は、米国特許第４，７０７，３６２
号明細書に記載されており、その特許もここに引用する。
急速に放出されるように製剤してもよいし、また、徐放されるように製剤しても
よい。急速および徐速の放出をもたらす剤型は、米国特許第４，７０７，３６２
号明細書に記載されており、その特許もここに引用する。
【００５７】 本発明を以下の実施例によって更に明確に述べる。それは、本発明を限定する
ものではない。
ものではない。
【００５８】
本発明のＡＺＴ誘導体の効果を評価した。いくつかのＡＺＴ誘導体を上記の合
成方法によって調製した。具体的な誘導体を下記表１および２に示す。合成例 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−デオキシ
チミジン 新鮮に調製したメチル次亜臭素酸塩溶液（無水メタノール中ブロミン）を無水
メタノール（５ｍＬ）中３’−アミノ−３’−デオキシチミジン溶液（０．１０
ｇ，０．４１ｍｍｏｌ）に滴下し、反応混合物の淡黄色が持続するまで攪拌した
。その反応を２０分続けた。空泡中の溶媒を除去して、５−ブロモ−６−メトキ
シ−５，６−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−デオキシチミジン（０．２ｇ，１
００％）および黄色の泡固体を得た；m.pt. 188-190℃(d)，UV(MeOH):λmax 2
02,235nm. IR(KBr):3440, 2979, 2358, 2107, 1699, 1469, 1249および1085 Cm -1。 1H NMR (DMSO) テ゛ルタ 8.25 (s, 1H, NHC=O), 6.20 (dd, J = 8.0, 5.9 Hz, 1H, H-1'), 5.08 (s, 1H, H-6), 3.99 (m, 1H, H-3'), 3.69 (br s, 2H, NH2),
3.40 (s, 2H, H-5'), 3.21 (s, 3H, CH3O), 2.49-2.15 (m, 2H, CH2-2'), 1.83
(s, 3H, CH3).MS (CI, m/e) 353.9(M+1, 23), 351.6 (21), 339.8(4), 338 (5),
321.8 ( 10), 319.8( 13), 304.8 (1), 230(1)。 （５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’
−アジド−３’−デオキシチミジン 新鮮に調製した重水素メチル次亜臭素酸塩溶液（重水素メタノール中ブロミン
）を、重水素メタノール（５ｍＬ）中ＡＺＴ溶液（０．５０ｇ，１．８７ｍｍｏ
ｌ）に滴下し、反応混合物の淡黄色が持続するまで攪拌した。その反応を２０分
続けた。空泡中の溶媒を除去して、残滓を分離薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬ
Ｃ）に塗布して、（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）メトキシ−５，６
−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−デオキシチミジン（０．７９１ｇ，４４％）
および（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）メトキシ−５，６−ジヒドロ
−３’−アミノ−３’−デオキシチミジン（０．５２７ｇ，２８％）の双方を白
い泡固体として得た； UV (MeOH): λmax , 237, 305 nm. IR (ニート液体、KBr テ゛ィスク ):3396, 3097, 2942, 2836, 2096, 1712, 1459, 1380, 1247, 1080 Cm-1 1H N
MR (CDCl3) (5R, 6R) テ゛ルタ 1.95 (s, CH3), 2.2 (m), 2.85 (q), 3.7-3.78 (dd)
, 4.2-4.44 (m), 4.90 (s), 5.90 (t), 8.6 (bs, NH); 13C NMR (CDCl3) :テ゛ルタ
22.82 (CH3), 36.98 (C-2'), 53.15 (C-5), 57.53 (OCH3), 60.02 (C-3'), 61.9
7 (C-5'), 83.94 (C-4'),86.36 (C-1'), 89.10 (C-6), 150.65 (C-2,CO), 167.3
3 (C-4,CO) . GC/MS: M + NH3, 398 (100.0), M + 2, 383, (62.0), M + 1, 38
2 (9.9), M+, 381 (65.5), 365 (8.0), 363 (8.0), 348 (61.0), 346 (62.0), 2
87 (4.9), 285 (10.5), 268 (23.6), 211 (6.8), 159 (6.8), 127 (7.8), 116 (
8.7), 114 (17.8), 99 (26.7), 89.1 (12.6), 86.1 (9.6), 35 (4.5)。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン−５’−
（ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェート）： 新鮮に調製したメチル次亜臭素酸塩溶液（無水メタノール中ブロミン）を無水
メタノール（５ｍＬ）中３’−アジドチミジン５’−（ｐ−メトキシフェニルメ
トキシアラニニルホスフェート）溶液（０．１１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）に滴下し
、反応混合物の淡黄色が持続するまで攪拌した。その反応を２０分続けた。空泡
中の溶媒を除去し、この物質をシリカゲルコラムの上部に塗布し、続いてクロロ
ホルムメタノール（９５：５，ｖ／ｖ）で溶出して、５−ブロモ−６−メトキシ
−５，６−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−アジドチミジン５’−（ｐ−メトキ
シフェニルメトキシアラニニルホスフェート）（０．０８５ｇ，０．１３ｍｍｏ
ｌ，６４％）を黄色の粘性オイルとして得た； UV (MeOH) λmax 329, 280, 241
nm. IR (ニート、KBrテ゛ィスク): 3282, 2954, 2838, 2358, 2103, 1739, 1635, 1506, 1 456, 1378, 1209, 1103 Cm-1. 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.66 (s, 1H, NHC=O), 7.2
6-7.10 (m, 2H, o-H), 6.87-6.76 (m, 2H, m-H), 6.04 (d, J = 6.2, 2.3 Hz, 1
H, H-1'), 4.88 (s, 1H, H-6), 4.33-4.22 (m, 1H, H-3'), 4.07-3.98 (m, 3H,
H-4', 5'), 3.77 (s, 3H, CH3OPh), 3.72 (s, 3H, CH3OC=O), 3.48 (s, 3H, CH3 O-6), 3.44 (d, J = 3.5 Hz, 1H, NH), 2.46-2.31 (m, 2H, CH2-2'), 1.96 (s,
3H, CH3-5), 1.36 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CH3-Ala).13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.7
(COOMe), 167.30 (C2), 156.6 (Ph ハ゜ラ), 150.7 (C4), 149.0(Ph イフ゜ソ), 121.6
(Ph オルト), 114.6(Ph メタ), 87.4(C6), 84.7 (C1'), 81.44 (C4'), 61.3 (C5'),
60.1(C3'), 57.9(OMe), 55.6 (Ph OMe), 52.5 (C5), 52.4 (COOMe) , 50.5 (Ala
CH), 36.61 (C2'), 22.74 (Me), 20.93 (Ala Me)。追加的ヒ゜ークが下記のアイソマーで 観察された: 150.2, 120.8, 114.44), 93.3, 89.82, 65.3, 65.6, 65.9, 56.9,
55.58, 50.37, 35.2 等。31 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 3.51 および 3.38 ppm,標準0 ppmとしてのリン酸との比較。 MS/電子スフ゜レー: 651, 649 (M+1). GC/mass : 645 (0.2), 643 (2.3), 572 (0.8), 559 (20.4), 558 (100), 501 (2.3), 446 (4.6), 435(3.5), 416 (1.4), 409 (
7.9), 328 (2.7), 272(6.1), 245 (1.6), 244 (8.8), 204 (3.2), 200 (0.1), 1
39 (6.1), 138 (4.7), 126 (10.1), 124 (29.0), 123 (3.3), 109 (14.01), 91
(11.5), 81 (11.9), 77 (13.1), 60 (13.6), 55 (9.0), 44 (26.2), 43 (54.9)。 ｐ−ブロモフェニルホスホロジクロリデート 無水ジエチルエーテル中ｐ−ブロモフェノールおよびトリエチルアミンの溶液
をジエチルエーテル中塩化ホスホリル溶液に滴下し、０oＣで強く攪拌した。そ の混合物を１５時間攪拌しながら、室温まで暖め、そのご２時間還流しながら加
熱した。その混合物を濾過し、析出物をジエチルエーテルで洗浄した。濾液と洗
浄液の混合物を減圧下で蒸発させて乾燥させ、色の着いたオイルを得た。そのオ
イルを真空蒸留し、無色のオイルの生成物を得た；Ｂ．Ｐｔ９７oＣ／０．１ｍ ｍ，収率９０％， UV (MeOH) λmax 271, 242nm, IR (KBr disc) 3878, 3095,
2358, 1888, 1712, 1483, 1189, 831 Cm-1, 1H NMR(CDCl3) テ゛ルタ 7.50 (d, 2H, アリール H, J = 9.0 Hz), 7.15 (d, 2H, アリール H, J = 9.0 Hz , 13 C NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ : 148.5, 133.30, 122.38, 120.48.. 31 P NMR (CDCl3.) テ゛ルタ 3.12。 ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデート 無水ジクロロメタン中トリエチルアミン溶液をジクロロメタン中Ｌ−アラニン
メチルエステルヒドロクロリドおよびｐ−ブロモフェニルホスホロジクロリデー
トの溶液に滴下し、−７０oＣで強く攪拌した。その反応混合物を６時間攪拌し ながらゆっくり室温まで暖め、空泡中の溶媒を除去した。その残滓をジエチルエ
ーテルで処理し、その混合物を濾過し、濾液を凝縮し、無色の粘性オイル生成物
を得た；収率８０％、UV (MeOH) :λmax 272, 231, 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.70 (s, br, 1H, Ala-NH), 7.16 (d, 2H, aryl H, J = 9.0 Hz), 7.48 (d, 2H, ary
l H, J = 9.0 Hz), 3.793 (s, 1H, -OCH3), 3.77 (s, 1H, -OCH3), 1.51 (d, 3H
, Ala-CH3), 1.40 (d, 3H, Ala-CH3); 13C NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ: 172.78および17 2.54, 148.46および148.50, 132.61および132.49, 122.14および 122.05, 52.70
および52.60, 50.31 および 50.51, 20.20 および 20.11 (2つのアイソマー). 31 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 8.48および 8.35. IR (ニート): 3212 (s, br), 2989 および 2952 (w-m), 1747 (s), 1483 (s), 1270, 1209 および 1147 (s), 1010 および
927 (s), 831 (m), 757 (m) cm-1; MS (CI, m/e): 357.9 (M+ + 2), 355.9 (
M+), 322.0 (M+ + 2 -Cl), 320 (M+ - Cl), 295.9 (M+ -COOCH3), 186.0(M+ + 2
-Br-Ph-O), 184.0 (M+ - Br-Ph-O)。 ３’−アジドチミジン５’−（ｐ−ブロモフェニル メトキシアラニニルホスフ
ェート） ＡＺＴをＴＨＦ中に溶解し、ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスホロ
クロリデートおよびＮ−メチルイミダゾールの溶液に添加し、強く攪拌した。１
２時間後、室温で、その溶媒を真空下で除去した。その残滓をクロロホルムに溶
解し、１Ｍ塩酸、飽和重炭酸ナトリウム溶液、続いて水で洗浄した。その有機相
を乾燥させ、真空下で蒸発させ、その残滓をシリカゲル上のクロマトグラフィー
によって、クロロホルム中５％メタノールを用いて溶出して浄化した。生成物を
望ましい濃度とした；収率８３％． 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.69 (s, br, 1H, 3 -NH), 7.45 (d, 2H, aryl H, J = 9.0 Hz), 7.33 (s, 1H, ヒ゛ニルH at C6), 7.11
(d, 2H, アリールH, J = 9.0 Hz), 6.18 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H at C1) 6.13 (t, 1
H, J = 6.6 Hz, H at C1), 4.44-3.77 (m, 6H, H's at C3', 4', 5', Ala-NH お よび Ala-CH), 3.73 (s, 3H, -COOCH3), 3.72 (s, 3H, -COOCH3), 2.18 (s, 3H,
-CH3 at C5), 1.90 (s, br, 3H, Ala-CH3).13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 173.6 (COO Me, 弱), 163.2, 160.7 (C2, 弱)、149.9 (C4),144.1,144.3(d, Ph イフ゜ソ, J =6Hz ), 135.4(C6), 121.79,121.72 (m,Ph オルト),119 (Ph メタ), 111.36 (C5), 85.41,8
5.05 (C1'), 82.20(C4'), 65.73 (C5'), 60.31, 60.17 (C3'), 52.75 (Ala OMe)
, 50.37, 50.22 (Ala CH), 37.28 (C2'), 21.07 (Ala Me) , 12.54 (C5- Me ).
IR (KBr): 3205 (m, br), 3066 (w), 2954 9w), 2109 (s), 1475 (s), 1691 (
vs), 1484 (m), 1270および1216 (m), 1153 (w-m), 1010および926 (m), 833お よび757 (w) cm-1. MS (CI, m/e): 589.1 (M+ + 2), 587.1 (M+), 418.0 (M+
+ 2-Br-Ph-O), 416.0 (M+ - Br-Ph-O), 340.0 [M+ + 2-(AZT-O)], 338.0 [M+-(A
ZT-O)], 250.1 [(AZT-O)+], 81 (Br)。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン−５’−
（ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート） メチル次亜臭素酸塩溶液（無水メタノール中ブロミン）の新鮮に調製した溶液
を無水メタノール（５ｍＬ）中３’−アジドチミジン５’−（ｐ−ブロモフェニ
ルメトキシアラニニルホスフェート）の溶液に滴下し、反応混合物の淡黄色が持
続するまで攪拌した。その反応を２０分続けた。空泡中の溶媒を除去し、この物
質をシリカゲルコラムの上部に塗布し、続いてクロロホルム−メタノール（９５
：５，ｖ／ｖ）で溶出して、５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン５’−（ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェー
ト）を黄色の粘性オイルとして得た；収率７３％．IR (ニート、KBr テ゛ィスク):3218, 3 093, 2925, 2850, 2105.9, 1712, 1484, 1456, 1378, 1241, 1153, 1010, 929 C
m-1. 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.70 (br s, 1H, 3-NH ), 7.43 ( 2H, d, Aryl H, J
= 9.0 Hz ), 6.01 ( 1H, t, C-1'の-CH ), 4.87 ( 1H, s, C-6の-CH), 4.35-3. 96 (6H, m, C-3'の-CH, 4', 5' および Ala-NH, a -CH ), 3.74 ( 3H, s, -COOC
H3 ), 3.44 ( 3H, s, C-6の-OCH3), 2.56-2.47 および 2.41-2.30 ( 1H および
1H, m および m, C-2'の-CH), 1.93 ( 3H, s, C-5の-CH3), 1.39 および 1.37 (
3H, d, a Alaの-CH3); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 173.6(COOMe), 166.7 (C2), 15 0.1 (C4), 148.9 (d,Ph イフ゜ソ),132.7および132.5 (C6), 121.9 (Ph, オルト), 121. 7 (Ph, メタ), 85.14 (C1'), 81.46 および 81.57および81.7(m,C4'), 65.48およ び65.60 (m,C5'), 60.0(C3'), 57.9および57.8(C5), 52.77 (al Ome),50.25およ
び50.37 (Ala CH), 36.96 および 36.91 (C2'), 22.87 および22.77 (Me), 21.1
3 および21.19 (d, Ala Me) (アイソマーが複数のためタ゛フ゛ルヒ゜ークが現れる) 31P NMR ( CDCl3, 内部の標準値としてリン酸 0 ppm) テ゛ルタ: 2.854, 2.754 (1:1) および 2. 7 および 2.46 (3:1)、系内に 4つのアイソマーが存在するため。MS (CI, m/e): 700.5 ( M++4 ), 698.5 (M++2 ), 696.5 ( M+ ), 588.8 ( M++2-Br-OCH3), 586.8 ( M+ -Br-OCH3 ).MALDI-TOF 721.8 (M+ + Na)。 その他の合成化合物の物性データ （５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）−メトキシ−５，６−ジヒドロ−
３’−アジドチミジン1 H NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ 8.00 (br s, 1H), 5.28-5.20 (t, 1H), 4.58 (s, 1H), 4 .52-4.48 (m, 2H), 3.75-3.70 (dd, 1H), 2.90 (q, 1H), 2.20 (m, 2H), 2.00 (
s, 3H); GC/mass: 383 (M+2, 97.0), 382 (M+1, 13.0), 381 (M+, 100), 377 (5
.0), 365 (6.0), 363 (6.0), 351 (4.0), 349 (3.0), 348 (45.0), 347 (5.0),
346 (41.0), 310 (22.0), 309 (2.0), 308 (21.0), 268 (23.0), 267 (9.0), 18
6 (4.0), 159 (4.0), 127 (10.0), 116 (5.0), 115 (1.0), 114 (7.0), 102 (7.
0), 99 (4.0), 89 (15.0), 81 (6.0); UV (MeOH): λmax 237 および 305 nm; I R (ニート): 3396, 3097, 2942, 2836, 2096, 1712 cm-1。 トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン ５’−［ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート］（ＷＨＩ−０７ａ） 青白い黄色の粘性オイル；収率（７３％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.75 (br s ,1H), 7.44 (d, 2H), 7.14 (d, 2H), 6.03 (t, 1H), 4.87 (s, 1H), 4.22-4.3
7, 3.93-4.08, 3.62-3.78 (m, 6H), 3.74 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 2.31-2.58 (
m, 2H), 1.93 (s, 3H), 1.38 (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 174.0, 167.1, 1
50.6, 133.2, 122.2, 122.1, 88.2, 85.6, 81.9, 65.9, 60.4, 58.3, 54.1, 53.
2, 50.7, 37.3, 23.3, 21.6; MS (MALDI-TOF) m/z 721.5 (M + Na); HPLC滞留時 間 14.4分; UV (MeOH): λmax 217, 226 および 270 nm; IR (ニート): 3218, 3093 , 2850, 2106, 1712 cm-1。 トランス−（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン−５’−［ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート］（ＷＨＩ−０７ｂ） 無色の粘性オイル；収率（４２％）； 1H NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ 8.37 (br, 1H), 7.44 (dd, 2H), 7.13 (d, 2H), 5.34 (t, 1H, ), 5.01 (s, 1H), 3.92-4.54 (m
, 6H ), 3.73 (s, 3H), 3.43 (s, 3H), 2.77-2.90 (m, 1H),, 2.25-2.37 (m, 1H
), 1.93 (s, 3H), 1.38 (dd, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 176.0, 166.7, 149.6
, 132.5, 122.9, 94.2, 82.38, 66.2, 61.4, 57.1, 53.3, 52.6, 50.2, 35.4 ,
29.8, 22.8, 21.1; UV: (MeOH): λmax 217, 226および270 nm; IR (ニート): 321 8, 3093, 2850, 2106, 1712 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３(−アジドチミジン− ５(−
［ｐ−フルオロフェニルメトキシアラニニルホスフェート］（ＷＨＩ−０６） 粘性液体；収率（７１％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.41, 8.21 (br s, 1H), 7.19 (dd, 2H), 7.03 (dd, 2H), 6.13 (t, 0.7H, 5R, 6R アイソマー), 5.38 (m, 0.
3H, 5S, 6S アイソマー), 4.88 および 4.61 (dおよびd, 0.7H および 0.3H), 4.46 -3.80 (m, 6H), 3.73 および 3.71 (s, 3H), 3.49 および 3.44 (s, 3H), 2.83-
2.22 (m, 2H), 1.95 (s, 3H), 1.36 (dd, 3H); MS (MALDI-TOF) m/z 660.1 (M +
Na); IR (ニート): 3230, 3081, 2107, 1736, 1712, 1504, cm-1. トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−エトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン５’−［ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート］ 粘性オイル；収率（４０％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.20 (br s, 1H), 7.15- 7.11 (d, 2H), 6.86-6.82 (d, 2H), 6.10 (t, 3H), 4.94 (s, 1H), 4.33-4.00 (
m, 6H), 4.03-4.02 (m, 2H), 3.80 (m, 3H), 3.70 (m, 3H), 2.50-2.40 (m, 1H)
, 2.40-2.20 (m, 1H), 1.92( s, 3H), 1.39-1.38 (d, 3H), 1.36 (t, 3H); 13C
NMR (CDCl3) テ゛ルタ 180.1, 166.9, 150.3, 148.1, 121.1, 121.0, 120.8, 114.6,
114.5, 114.5, 86.3, 84.9, 81.7, 81.5, 66.3, 66.2, 65.5, 65.3, 60.1, 55.
9, 52.6, 52.4, 50.4, 50.2, 36.9, 22.93, 22.9, 21.2, 15.2; MS (MALDI-TOF)
m/z 687.9 (M + Na); HPLC滞留時間1.74分および1.82分; UV (MeOH): λmax 20
8, 221, 278 nm; IR (ニート): 3242, 2852, 2106, 1732, 1506 cm-1. トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−エトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン 収率 （６０％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.70 (s, 1H), 5.82 (t, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.40-4.30 (m, 1H), 4.00-3.72 (m, 4H), 3.60-3.50 (m, 1H), 2.77-
2.68 (q, 1H), 2.37-2.29 (dd, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.17 (t, 3H); MS (MALDI-
TOF) m/z 415.7 (M + Na); UV (MeOH): λmax 210 および 214 nm; IR (ニート): 3 485, 3217, 3093, 2104, 1685 cm-1。 トランス−（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−エトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン 粘性オイル； 収率（２４％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.40 (s, 1H), 5.22 ( t, 1H), 4.60 (s, 1H), 4.02-3.68 (m, 4H) 3.60-3.50 (m, 1H), 2.98 (q, 1H),
2.22 (dd, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.25-1.22 (t, 3H); MS (MALDI-TOF) m/z 415.
7 (M+Na); UV (MeOH): λmax 210および214 nm; IR (ニート): 3485, 3217, 3093, 2929, 2104, 1685 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−デオキシチミジン５’−
［ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェート］ 粘性オイル； 収率（８６％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.24 (br s, 1H), 7.3 6-7.26 (m, 2H), 6.94-6.92 (m, 2H), 6.03-5.99 (m, 1H), 5.1-5.0 (s, 1H), 4
.40-4.0 (m, 5H), 3.87-3.86 (s, 3H), 3.80-3.79 (s, 3H), 3.55-3.54 (m, 3H)
, 2.34-2.03 (m, 7H), 1.46-1.43 (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.7, 167.
9, 156.3, 150.3*, 143.7*, 120.7*, 114.3*, 86.7, 86.2*, 78.4*, 67.6*, 57.
8*, 55.6, 52.4*, 50.1*, 31.8*, 25.7*, 22.8, 21.1; 31P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 3
.11, 3.22 (1:1); MS (MALDI-TOF) m/z 631.8 (M + Na); HPLC 滞留時間14.54分
、15.18分; UV (MeOH): λmax 226 および 279 nm; IR (ニート): 3419, 2850, 1645 , 1506 cm-1。 トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン ５’−［ｏ，ｏ−ジメトキシフェニルメトキシアラニニル
ホスフェート］ 無色の粘性液体； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.44 (s, 1H), 7.05 (t, 1H), 6.59 (d, 1H), 6.12* (t, 1H), 5.90* (t, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.5-4.3 (m, 1H), 4.
20-4.05 (m, 1H), 3.88* (s, 3H), 3.86* (s, 3H), 3.90-3.84 (m, 2H), 3.74*
(s, 3H), 3.73* (s, 3H), 3.73 (q, 1H), 3.48 (s, 6H), 2.70-2.30 (m, 2H), 1
.97 (s, 3H), 1.43* (d, 3H), 1.38* (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 151.9 ,
137.5, 129.1, 125.3, 124.9, 124.7, 88.2, 87.1, 85.8, 84.4*, 84.3*, 84.1,
81.8*, 81.7*, 61.7, 60.1, 56.1, 49.8, 37.0*, 36.8*, 22.9, 21.3, 21.2; 3 1 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 5.70, 5.27; MS (MALDI-TOF) m/z 702.4 (M + Na); IR (ニ
ート): 3340 (br), 2096, 1741, 1710 cm-1。 （５Ｓ，６Ｓ ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロチミジン 白色泡； 収率 （２０％）； 1H NMR (DMSO-d6) テ゛ルタ 10.87 (s, 1H), 5.76 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 5.18 (s, 1H), 5.17 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 4.24 (m,
1H), 3.72 (m, 1H,), 3.52 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.2 (m, 1H), 2.0 (m, 1H
), 1.84 (s, 3H); 13C NMR (DMSO-d6) テ゛ルタ 167.9, 150.4, 88.9, 86.9, 86.7,
71.1, 62.2, 57.3, 53.8, 37.7, 22.7; MS (MALDI-TOF) m/z 375.3 (M + Na), 3
77.3 (M + 2 + Na); IR (ニート): 3371 (br), 3214 (ショルタ゛ー), 1706 cm-1。 （５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロチミジン 白色泡； 収率 （８０％）； 1H NMR (DMSO-d6 ) テ゛ルタ 10.84 (br s, 1H), 6.04 (dd, 1H, J = 8.4, 5.4 Hz), 5.18 (s, 1H), 5.13 (s, 1H), 4.89 (s, 1H)
, 4.18 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 3.53 (m, 1H), 3.42 (s, 3H), 2.20 (m, 1H),
1.80 (m, 1H), 1.84 (s, 3H); 13C NMR (DMSO-d6) テ゛ルタ 167.9, 150.9, 86.7, 8 6.2, 83.4, 70.5, 61.8, 57.9, 54.5, 38.2, 22.6; MS (MALDI-TOF) m/z 375.8
(M + Na) および 377.4 (M +2 + Na); IR (ニート): 3366 (br), 3214 (ショルタ゛ー), 1 701 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−デオキシチミジン５’−
［ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート］ （ＷＨＩ−１１） 粘性オイル； 収率 （８６％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.74 (br s, 1H), 7.46-7.44 (m, 2H), 7.16-7.10 (m, 2H), 5.91 (t, 1H), 5.1-5.0 (s, 1H), 4.4
0-4.0 (m, 5H), 3.79* (s, 3H), 3.54* (s, 3H), 2.29-1.93 (m, 7H), 1.39-1.3
7 (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.5, 167.1, 150.5,148.5* 132.5*, 121.9
*, 117.7, 86.8, 86.2*, 78.3*, 67.6* , 57.8*, 53.8*, 50.1*, 31.6*, 25.7*
, 22.8*, および 20.9*; 31P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 2.65 および 2.74 (1:1), MS ( MALDI-TOF) m/z 679.1 (M -1 + Na); HPLC retention time 23.87, 24.49 minut
es; UV (MeOH): λmax 226 および 274 nm; IR (ニート): 3417, 1705, 1614 cm-1. ３’−アミノ−３’−デオキシチミジン５’−［ｐ−メトキシフェニルメトキシ
アラニニルホスフェート］ 無色の液体； 収率（７０％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.44 (br d, 1H), 7. 15-7.11 (d, 2H), 6.82-6.80 (d, 2H), 6.28-6.20 (t, 1H), 4.42-3.80 (m, 6H
), 3.75 (s, 3H), 3.71 (s, 3H,), 2.40-2.28 (m, 2H), 1.88 (br s, 3H), 1.39
および1.35 (dd, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.8, 163.8, 156.4, 150.3, 1 35.2, 121.0, 120.8, 114.4, 113.8, 110.8, 84.9, 84.2, 66.0, 58.0, 55.5, 5
5.3, 51.1, 34.2, 21.1, 20.8, 20.1; MS (MALDI-TOF) m/z 535.5 (M + Na); H
PLC 滞留時間10.48分、10.49分; UV (MeOH): λmax 218, 225 および 273 nm; IR ( ニート): 3261, 2839, 2096, 1741, 1693, 1506 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン５’−
［フェニルメトキシアラニニルホスフェート］（ＷＨＩ−０４） 粘性オイル； 収率 （９２％）；1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.90 (br s, 1H), 7. 37-7.15 (m, 5H), 6.06-6.02 (t, 1H), 4.87* (s, 1H), 4.40-4.0 (m, 5H), 3.7
2 (s, 3H) , 3.44* (s, 3H), 2.29-1.93 (m, 6H), 1.39-1.37 (dおよびd, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.5, 167.1, 152.1*,150.5, 129.8*, 125.2*, 120.1* , 87.3, 84.7,81.5, 60.0, 57.9*, 52.6*, 50.1*, 36.7,35.2, 22.7, 21.0; 31 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 2.32, 2.51 (小さなヒ゜ーク) および 2.58, 2.71 (大きなヒ゜ーク ) (1:1); MS (MALDI-TOF) m/z 679.1 (M -1 + Na); HPLC 滞留時間17.60分、20.9 0分; UV (MeOH): λmax 218 および 262 nm; IR (ニート): 3265, 2852, 2104, 171 3, 1591 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−デオキシチミジン５’−
［フェニルメトキシアラニニルホスフェート］（ＷＨＩ−１２） 粘性オイル； 収率 （８６％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.94 (br s, 1H), 7.46-7.10 (m, 5H), 5.93-5.90 (t, 1H), 5.02* (s, 1H), 4.40-4.0 (m, 5H), 3
.70* (s, 3H), 3.45* (s, 3H), 2.29-1.93 (m, 7H), 1.39-1.37 (dおよびd, 3H) ; 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.5, 167.2, 150.5*, 129.8, 129.5*, 125.0, 120.0 , 86.7*, 78.4*, 67.6*, 57.9*, 53.7, 52.6, 50.1*, 31.7*, 25.6, 22.8, 21.
0; 31P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 2.51, 2.58 (小さなヒ゜ーク) および 2.65, 2.74 (大き なヒ゜ーク) (1:1); MS (MALDI-TOF) m/z 642.1(M + Na); HPLC滞留時間6.97分、7.41 分; UV (MeOH): λmax: 230 および 241 nm; IR (ニート): 3226, 2850, 1728, 159 1 cm-1。実施例１ 方法 ＡＺＴおよび様々な誘導体の抗ＨＩＶ−１活性を評価するために、正常末梢血
単核細胞を、加熱不活化した２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３％インターロイ
キン−２、２ｍＭのグルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ 3 、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび４μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニ ンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ジブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ））中で７２時間培養し、感染多重度０．１、吸収周期１時間で、ＨＩＶ−
１に曝露した。続いて細胞を９６ウェルマイクロタイタプレート（１００μｌ／
ウェル；２×１０6細胞／ｍｌ、３つの同じウェル）中で、様々な濃度（０．０ ０１μＭ〜１００μＭ）の薬剤の存在下または不存在下で７日間培養した。感染
７日目に培養液の上澄みの一部を除去し、ウイルス複製を示すｐ２４抗原エンザ
イムアッセイを行った。エリスら、アンチミクロバイアル エージェント アン
ド ケモセラピー（Erice et al. Antimicrob. Agents and Chemother. ） 37,
835 （１９９３）；ジェー．エム．ザーリングら、ネイチャー（J. M. Zarling
et al. Nature ）３４７，９２（１９９０）、エフ．エム．ウックンら（F. M.
Uckun et al. ）、アンチミクロバイアル エージェント アンド ケモセラピ ー４２，３８３（１９９８）。ウイルス複製の阻害率は、試験薬物で処理した感
染細胞のｐ２４抗原値と、未処理の感染細胞のｐ２４抗原値とを比較することに
よって計算した。試験化合物の抗ＨＩＶ活性をＩＣ50（ＨＩＶ−１の複製を５０
％減少させる培養培地中化合物の最終濃度）で表した。細胞の生存能力は、比色
ＭＴＡアッセイによって定量した。エフ．エム．ウックンら、アンチミクロバイ
アル エージェント アンド ケモセラピー４２，３８３（１９９８）。
成方法によって調製した。具体的な誘導体を下記表１および２に示す。合成例 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−デオキシ
チミジン 新鮮に調製したメチル次亜臭素酸塩溶液（無水メタノール中ブロミン）を無水
メタノール（５ｍＬ）中３’−アミノ−３’−デオキシチミジン溶液（０．１０
ｇ，０．４１ｍｍｏｌ）に滴下し、反応混合物の淡黄色が持続するまで攪拌した
。その反応を２０分続けた。空泡中の溶媒を除去して、５−ブロモ−６−メトキ
シ−５，６−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−デオキシチミジン（０．２ｇ，１
００％）および黄色の泡固体を得た；m.pt. 188-190℃(d)，UV(MeOH):λmax 2
02,235nm. IR(KBr):3440, 2979, 2358, 2107, 1699, 1469, 1249および1085 Cm -1。 1H NMR (DMSO) テ゛ルタ 8.25 (s, 1H, NHC=O), 6.20 (dd, J = 8.0, 5.9 Hz, 1H, H-1'), 5.08 (s, 1H, H-6), 3.99 (m, 1H, H-3'), 3.69 (br s, 2H, NH2),
3.40 (s, 2H, H-5'), 3.21 (s, 3H, CH3O), 2.49-2.15 (m, 2H, CH2-2'), 1.83
(s, 3H, CH3).MS (CI, m/e) 353.9(M+1, 23), 351.6 (21), 339.8(4), 338 (5),
321.8 ( 10), 319.8( 13), 304.8 (1), 230(1)。 （５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’
−アジド−３’−デオキシチミジン 新鮮に調製した重水素メチル次亜臭素酸塩溶液（重水素メタノール中ブロミン
）を、重水素メタノール（５ｍＬ）中ＡＺＴ溶液（０．５０ｇ，１．８７ｍｍｏ
ｌ）に滴下し、反応混合物の淡黄色が持続するまで攪拌した。その反応を２０分
続けた。空泡中の溶媒を除去して、残滓を分離薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬ
Ｃ）に塗布して、（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）メトキシ−５，６
−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−デオキシチミジン（０．７９１ｇ，４４％）
および（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）メトキシ−５，６−ジヒドロ
−３’−アミノ−３’−デオキシチミジン（０．５２７ｇ，２８％）の双方を白
い泡固体として得た； UV (MeOH): λmax , 237, 305 nm. IR (ニート液体、KBr テ゛ィスク ):3396, 3097, 2942, 2836, 2096, 1712, 1459, 1380, 1247, 1080 Cm-1 1H N
MR (CDCl3) (5R, 6R) テ゛ルタ 1.95 (s, CH3), 2.2 (m), 2.85 (q), 3.7-3.78 (dd)
, 4.2-4.44 (m), 4.90 (s), 5.90 (t), 8.6 (bs, NH); 13C NMR (CDCl3) :テ゛ルタ
22.82 (CH3), 36.98 (C-2'), 53.15 (C-5), 57.53 (OCH3), 60.02 (C-3'), 61.9
7 (C-5'), 83.94 (C-4'),86.36 (C-1'), 89.10 (C-6), 150.65 (C-2,CO), 167.3
3 (C-4,CO) . GC/MS: M + NH3, 398 (100.0), M + 2, 383, (62.0), M + 1, 38
2 (9.9), M+, 381 (65.5), 365 (8.0), 363 (8.0), 348 (61.0), 346 (62.0), 2
87 (4.9), 285 (10.5), 268 (23.6), 211 (6.8), 159 (6.8), 127 (7.8), 116 (
8.7), 114 (17.8), 99 (26.7), 89.1 (12.6), 86.1 (9.6), 35 (4.5)。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン−５’−
（ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェート）： 新鮮に調製したメチル次亜臭素酸塩溶液（無水メタノール中ブロミン）を無水
メタノール（５ｍＬ）中３’−アジドチミジン５’−（ｐ−メトキシフェニルメ
トキシアラニニルホスフェート）溶液（０．１１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）に滴下し
、反応混合物の淡黄色が持続するまで攪拌した。その反応を２０分続けた。空泡
中の溶媒を除去し、この物質をシリカゲルコラムの上部に塗布し、続いてクロロ
ホルムメタノール（９５：５，ｖ／ｖ）で溶出して、５−ブロモ−６−メトキシ
−５，６−ジヒドロ−３’−アミノ−３’−アジドチミジン５’−（ｐ−メトキ
シフェニルメトキシアラニニルホスフェート）（０．０８５ｇ，０．１３ｍｍｏ
ｌ，６４％）を黄色の粘性オイルとして得た； UV (MeOH) λmax 329, 280, 241
nm. IR (ニート、KBrテ゛ィスク): 3282, 2954, 2838, 2358, 2103, 1739, 1635, 1506, 1 456, 1378, 1209, 1103 Cm-1. 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.66 (s, 1H, NHC=O), 7.2
6-7.10 (m, 2H, o-H), 6.87-6.76 (m, 2H, m-H), 6.04 (d, J = 6.2, 2.3 Hz, 1
H, H-1'), 4.88 (s, 1H, H-6), 4.33-4.22 (m, 1H, H-3'), 4.07-3.98 (m, 3H,
H-4', 5'), 3.77 (s, 3H, CH3OPh), 3.72 (s, 3H, CH3OC=O), 3.48 (s, 3H, CH3 O-6), 3.44 (d, J = 3.5 Hz, 1H, NH), 2.46-2.31 (m, 2H, CH2-2'), 1.96 (s,
3H, CH3-5), 1.36 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CH3-Ala).13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.7
(COOMe), 167.30 (C2), 156.6 (Ph ハ゜ラ), 150.7 (C4), 149.0(Ph イフ゜ソ), 121.6
(Ph オルト), 114.6(Ph メタ), 87.4(C6), 84.7 (C1'), 81.44 (C4'), 61.3 (C5'),
60.1(C3'), 57.9(OMe), 55.6 (Ph OMe), 52.5 (C5), 52.4 (COOMe) , 50.5 (Ala
CH), 36.61 (C2'), 22.74 (Me), 20.93 (Ala Me)。追加的ヒ゜ークが下記のアイソマーで 観察された: 150.2, 120.8, 114.44), 93.3, 89.82, 65.3, 65.6, 65.9, 56.9,
55.58, 50.37, 35.2 等。31 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 3.51 および 3.38 ppm,標準0 ppmとしてのリン酸との比較。 MS/電子スフ゜レー: 651, 649 (M+1). GC/mass : 645 (0.2), 643 (2.3), 572 (0.8), 559 (20.4), 558 (100), 501 (2.3), 446 (4.6), 435(3.5), 416 (1.4), 409 (
7.9), 328 (2.7), 272(6.1), 245 (1.6), 244 (8.8), 204 (3.2), 200 (0.1), 1
39 (6.1), 138 (4.7), 126 (10.1), 124 (29.0), 123 (3.3), 109 (14.01), 91
(11.5), 81 (11.9), 77 (13.1), 60 (13.6), 55 (9.0), 44 (26.2), 43 (54.9)。 ｐ−ブロモフェニルホスホロジクロリデート 無水ジエチルエーテル中ｐ−ブロモフェノールおよびトリエチルアミンの溶液
をジエチルエーテル中塩化ホスホリル溶液に滴下し、０oＣで強く攪拌した。そ の混合物を１５時間攪拌しながら、室温まで暖め、そのご２時間還流しながら加
熱した。その混合物を濾過し、析出物をジエチルエーテルで洗浄した。濾液と洗
浄液の混合物を減圧下で蒸発させて乾燥させ、色の着いたオイルを得た。そのオ
イルを真空蒸留し、無色のオイルの生成物を得た；Ｂ．Ｐｔ９７oＣ／０．１ｍ ｍ，収率９０％， UV (MeOH) λmax 271, 242nm, IR (KBr disc) 3878, 3095,
2358, 1888, 1712, 1483, 1189, 831 Cm-1, 1H NMR(CDCl3) テ゛ルタ 7.50 (d, 2H, アリール H, J = 9.0 Hz), 7.15 (d, 2H, アリール H, J = 9.0 Hz , 13 C NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ : 148.5, 133.30, 122.38, 120.48.. 31 P NMR (CDCl3.) テ゛ルタ 3.12。 ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデート 無水ジクロロメタン中トリエチルアミン溶液をジクロロメタン中Ｌ−アラニン
メチルエステルヒドロクロリドおよびｐ−ブロモフェニルホスホロジクロリデー
トの溶液に滴下し、−７０oＣで強く攪拌した。その反応混合物を６時間攪拌し ながらゆっくり室温まで暖め、空泡中の溶媒を除去した。その残滓をジエチルエ
ーテルで処理し、その混合物を濾過し、濾液を凝縮し、無色の粘性オイル生成物
を得た；収率８０％、UV (MeOH) :λmax 272, 231, 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.70 (s, br, 1H, Ala-NH), 7.16 (d, 2H, aryl H, J = 9.0 Hz), 7.48 (d, 2H, ary
l H, J = 9.0 Hz), 3.793 (s, 1H, -OCH3), 3.77 (s, 1H, -OCH3), 1.51 (d, 3H
, Ala-CH3), 1.40 (d, 3H, Ala-CH3); 13C NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ: 172.78および17 2.54, 148.46および148.50, 132.61および132.49, 122.14および 122.05, 52.70
および52.60, 50.31 および 50.51, 20.20 および 20.11 (2つのアイソマー). 31 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 8.48および 8.35. IR (ニート): 3212 (s, br), 2989 および 2952 (w-m), 1747 (s), 1483 (s), 1270, 1209 および 1147 (s), 1010 および
927 (s), 831 (m), 757 (m) cm-1; MS (CI, m/e): 357.9 (M+ + 2), 355.9 (
M+), 322.0 (M+ + 2 -Cl), 320 (M+ - Cl), 295.9 (M+ -COOCH3), 186.0(M+ + 2
-Br-Ph-O), 184.0 (M+ - Br-Ph-O)。 ３’−アジドチミジン５’−（ｐ−ブロモフェニル メトキシアラニニルホスフ
ェート） ＡＺＴをＴＨＦ中に溶解し、ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスホロ
クロリデートおよびＮ−メチルイミダゾールの溶液に添加し、強く攪拌した。１
２時間後、室温で、その溶媒を真空下で除去した。その残滓をクロロホルムに溶
解し、１Ｍ塩酸、飽和重炭酸ナトリウム溶液、続いて水で洗浄した。その有機相
を乾燥させ、真空下で蒸発させ、その残滓をシリカゲル上のクロマトグラフィー
によって、クロロホルム中５％メタノールを用いて溶出して浄化した。生成物を
望ましい濃度とした；収率８３％． 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.69 (s, br, 1H, 3 -NH), 7.45 (d, 2H, aryl H, J = 9.0 Hz), 7.33 (s, 1H, ヒ゛ニルH at C6), 7.11
(d, 2H, アリールH, J = 9.0 Hz), 6.18 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H at C1) 6.13 (t, 1
H, J = 6.6 Hz, H at C1), 4.44-3.77 (m, 6H, H's at C3', 4', 5', Ala-NH お よび Ala-CH), 3.73 (s, 3H, -COOCH3), 3.72 (s, 3H, -COOCH3), 2.18 (s, 3H,
-CH3 at C5), 1.90 (s, br, 3H, Ala-CH3).13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 173.6 (COO Me, 弱), 163.2, 160.7 (C2, 弱)、149.9 (C4),144.1,144.3(d, Ph イフ゜ソ, J =6Hz ), 135.4(C6), 121.79,121.72 (m,Ph オルト),119 (Ph メタ), 111.36 (C5), 85.41,8
5.05 (C1'), 82.20(C4'), 65.73 (C5'), 60.31, 60.17 (C3'), 52.75 (Ala OMe)
, 50.37, 50.22 (Ala CH), 37.28 (C2'), 21.07 (Ala Me) , 12.54 (C5- Me ).
IR (KBr): 3205 (m, br), 3066 (w), 2954 9w), 2109 (s), 1475 (s), 1691 (
vs), 1484 (m), 1270および1216 (m), 1153 (w-m), 1010および926 (m), 833お よび757 (w) cm-1. MS (CI, m/e): 589.1 (M+ + 2), 587.1 (M+), 418.0 (M+
+ 2-Br-Ph-O), 416.0 (M+ - Br-Ph-O), 340.0 [M+ + 2-(AZT-O)], 338.0 [M+-(A
ZT-O)], 250.1 [(AZT-O)+], 81 (Br)。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン−５’−
（ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート） メチル次亜臭素酸塩溶液（無水メタノール中ブロミン）の新鮮に調製した溶液
を無水メタノール（５ｍＬ）中３’−アジドチミジン５’−（ｐ−ブロモフェニ
ルメトキシアラニニルホスフェート）の溶液に滴下し、反応混合物の淡黄色が持
続するまで攪拌した。その反応を２０分続けた。空泡中の溶媒を除去し、この物
質をシリカゲルコラムの上部に塗布し、続いてクロロホルム−メタノール（９５
：５，ｖ／ｖ）で溶出して、５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン５’−（ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェー
ト）を黄色の粘性オイルとして得た；収率７３％．IR (ニート、KBr テ゛ィスク):3218, 3 093, 2925, 2850, 2105.9, 1712, 1484, 1456, 1378, 1241, 1153, 1010, 929 C
m-1. 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.70 (br s, 1H, 3-NH ), 7.43 ( 2H, d, Aryl H, J
= 9.0 Hz ), 6.01 ( 1H, t, C-1'の-CH ), 4.87 ( 1H, s, C-6の-CH), 4.35-3. 96 (6H, m, C-3'の-CH, 4', 5' および Ala-NH, a -CH ), 3.74 ( 3H, s, -COOC
H3 ), 3.44 ( 3H, s, C-6の-OCH3), 2.56-2.47 および 2.41-2.30 ( 1H および
1H, m および m, C-2'の-CH), 1.93 ( 3H, s, C-5の-CH3), 1.39 および 1.37 (
3H, d, a Alaの-CH3); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ: 173.6(COOMe), 166.7 (C2), 15 0.1 (C4), 148.9 (d,Ph イフ゜ソ),132.7および132.5 (C6), 121.9 (Ph, オルト), 121. 7 (Ph, メタ), 85.14 (C1'), 81.46 および 81.57および81.7(m,C4'), 65.48およ び65.60 (m,C5'), 60.0(C3'), 57.9および57.8(C5), 52.77 (al Ome),50.25およ
び50.37 (Ala CH), 36.96 および 36.91 (C2'), 22.87 および22.77 (Me), 21.1
3 および21.19 (d, Ala Me) (アイソマーが複数のためタ゛フ゛ルヒ゜ークが現れる) 31P NMR ( CDCl3, 内部の標準値としてリン酸 0 ppm) テ゛ルタ: 2.854, 2.754 (1:1) および 2. 7 および 2.46 (3:1)、系内に 4つのアイソマーが存在するため。MS (CI, m/e): 700.5 ( M++4 ), 698.5 (M++2 ), 696.5 ( M+ ), 588.8 ( M++2-Br-OCH3), 586.8 ( M+ -Br-OCH3 ).MALDI-TOF 721.8 (M+ + Na)。 その他の合成化合物の物性データ （５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−（ｄ３）−メトキシ−５，６−ジヒドロ−
３’−アジドチミジン1 H NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ 8.00 (br s, 1H), 5.28-5.20 (t, 1H), 4.58 (s, 1H), 4 .52-4.48 (m, 2H), 3.75-3.70 (dd, 1H), 2.90 (q, 1H), 2.20 (m, 2H), 2.00 (
s, 3H); GC/mass: 383 (M+2, 97.0), 382 (M+1, 13.0), 381 (M+, 100), 377 (5
.0), 365 (6.0), 363 (6.0), 351 (4.0), 349 (3.0), 348 (45.0), 347 (5.0),
346 (41.0), 310 (22.0), 309 (2.0), 308 (21.0), 268 (23.0), 267 (9.0), 18
6 (4.0), 159 (4.0), 127 (10.0), 116 (5.0), 115 (1.0), 114 (7.0), 102 (7.
0), 99 (4.0), 89 (15.0), 81 (6.0); UV (MeOH): λmax 237 および 305 nm; I R (ニート): 3396, 3097, 2942, 2836, 2096, 1712 cm-1。 トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン ５’−［ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート］（ＷＨＩ−０７ａ） 青白い黄色の粘性オイル；収率（７３％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.75 (br s ,1H), 7.44 (d, 2H), 7.14 (d, 2H), 6.03 (t, 1H), 4.87 (s, 1H), 4.22-4.3
7, 3.93-4.08, 3.62-3.78 (m, 6H), 3.74 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 2.31-2.58 (
m, 2H), 1.93 (s, 3H), 1.38 (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 174.0, 167.1, 1
50.6, 133.2, 122.2, 122.1, 88.2, 85.6, 81.9, 65.9, 60.4, 58.3, 54.1, 53.
2, 50.7, 37.3, 23.3, 21.6; MS (MALDI-TOF) m/z 721.5 (M + Na); HPLC滞留時 間 14.4分; UV (MeOH): λmax 217, 226 および 270 nm; IR (ニート): 3218, 3093 , 2850, 2106, 1712 cm-1。 トランス−（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン−５’−［ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート］（ＷＨＩ−０７ｂ） 無色の粘性オイル；収率（４２％）； 1H NMR (CDCl3 ) テ゛ルタ 8.37 (br, 1H), 7.44 (dd, 2H), 7.13 (d, 2H), 5.34 (t, 1H, ), 5.01 (s, 1H), 3.92-4.54 (m
, 6H ), 3.73 (s, 3H), 3.43 (s, 3H), 2.77-2.90 (m, 1H),, 2.25-2.37 (m, 1H
), 1.93 (s, 3H), 1.38 (dd, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 176.0, 166.7, 149.6
, 132.5, 122.9, 94.2, 82.38, 66.2, 61.4, 57.1, 53.3, 52.6, 50.2, 35.4 ,
29.8, 22.8, 21.1; UV: (MeOH): λmax 217, 226および270 nm; IR (ニート): 321 8, 3093, 2850, 2106, 1712 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３(−アジドチミジン− ５(−
［ｐ−フルオロフェニルメトキシアラニニルホスフェート］（ＷＨＩ−０６） 粘性液体；収率（７１％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.41, 8.21 (br s, 1H), 7.19 (dd, 2H), 7.03 (dd, 2H), 6.13 (t, 0.7H, 5R, 6R アイソマー), 5.38 (m, 0.
3H, 5S, 6S アイソマー), 4.88 および 4.61 (dおよびd, 0.7H および 0.3H), 4.46 -3.80 (m, 6H), 3.73 および 3.71 (s, 3H), 3.49 および 3.44 (s, 3H), 2.83-
2.22 (m, 2H), 1.95 (s, 3H), 1.36 (dd, 3H); MS (MALDI-TOF) m/z 660.1 (M +
Na); IR (ニート): 3230, 3081, 2107, 1736, 1712, 1504, cm-1. トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−エトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン５’−［ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェ
ート］ 粘性オイル；収率（４０％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.20 (br s, 1H), 7.15- 7.11 (d, 2H), 6.86-6.82 (d, 2H), 6.10 (t, 3H), 4.94 (s, 1H), 4.33-4.00 (
m, 6H), 4.03-4.02 (m, 2H), 3.80 (m, 3H), 3.70 (m, 3H), 2.50-2.40 (m, 1H)
, 2.40-2.20 (m, 1H), 1.92( s, 3H), 1.39-1.38 (d, 3H), 1.36 (t, 3H); 13C
NMR (CDCl3) テ゛ルタ 180.1, 166.9, 150.3, 148.1, 121.1, 121.0, 120.8, 114.6,
114.5, 114.5, 86.3, 84.9, 81.7, 81.5, 66.3, 66.2, 65.5, 65.3, 60.1, 55.
9, 52.6, 52.4, 50.4, 50.2, 36.9, 22.93, 22.9, 21.2, 15.2; MS (MALDI-TOF)
m/z 687.9 (M + Na); HPLC滞留時間1.74分および1.82分; UV (MeOH): λmax 20
8, 221, 278 nm; IR (ニート): 3242, 2852, 2106, 1732, 1506 cm-1. トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−エトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン 収率 （６０％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.70 (s, 1H), 5.82 (t, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.40-4.30 (m, 1H), 4.00-3.72 (m, 4H), 3.60-3.50 (m, 1H), 2.77-
2.68 (q, 1H), 2.37-2.29 (dd, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.17 (t, 3H); MS (MALDI-
TOF) m/z 415.7 (M + Na); UV (MeOH): λmax 210 および 214 nm; IR (ニート): 3 485, 3217, 3093, 2104, 1685 cm-1。 トランス−（５Ｓ，６Ｓ）−５−ブロモ−６−エトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン 粘性オイル； 収率（２４％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.40 (s, 1H), 5.22 ( t, 1H), 4.60 (s, 1H), 4.02-3.68 (m, 4H) 3.60-3.50 (m, 1H), 2.98 (q, 1H),
2.22 (dd, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.25-1.22 (t, 3H); MS (MALDI-TOF) m/z 415.
7 (M+Na); UV (MeOH): λmax 210および214 nm; IR (ニート): 3485, 3217, 3093, 2929, 2104, 1685 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−デオキシチミジン５’−
［ｐ−メトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェート］ 粘性オイル； 収率（８６％）； 1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.24 (br s, 1H), 7.3 6-7.26 (m, 2H), 6.94-6.92 (m, 2H), 6.03-5.99 (m, 1H), 5.1-5.0 (s, 1H), 4
.40-4.0 (m, 5H), 3.87-3.86 (s, 3H), 3.80-3.79 (s, 3H), 3.55-3.54 (m, 3H)
, 2.34-2.03 (m, 7H), 1.46-1.43 (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.7, 167.
9, 156.3, 150.3*, 143.7*, 120.7*, 114.3*, 86.7, 86.2*, 78.4*, 67.6*, 57.
8*, 55.6, 52.4*, 50.1*, 31.8*, 25.7*, 22.8, 21.1; 31P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 3
.11, 3.22 (1:1); MS (MALDI-TOF) m/z 631.8 (M + Na); HPLC 滞留時間14.54分
、15.18分; UV (MeOH): λmax 226 および 279 nm; IR (ニート): 3419, 2850, 1645 , 1506 cm-1。 トランス−（５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３
’−アジドチミジン ５’−［ｏ，ｏ−ジメトキシフェニルメトキシアラニニル
ホスフェート］ 無色の粘性液体； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.44 (s, 1H), 7.05 (t, 1H), 6.59 (d, 1H), 6.12* (t, 1H), 5.90* (t, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.5-4.3 (m, 1H), 4.
20-4.05 (m, 1H), 3.88* (s, 3H), 3.86* (s, 3H), 3.90-3.84 (m, 2H), 3.74*
(s, 3H), 3.73* (s, 3H), 3.73 (q, 1H), 3.48 (s, 6H), 2.70-2.30 (m, 2H), 1
.97 (s, 3H), 1.43* (d, 3H), 1.38* (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 151.9 ,
137.5, 129.1, 125.3, 124.9, 124.7, 88.2, 87.1, 85.8, 84.4*, 84.3*, 84.1,
81.8*, 81.7*, 61.7, 60.1, 56.1, 49.8, 37.0*, 36.8*, 22.9, 21.3, 21.2; 3 1 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 5.70, 5.27; MS (MALDI-TOF) m/z 702.4 (M + Na); IR (ニ
ート): 3340 (br), 2096, 1741, 1710 cm-1。 （５Ｓ，６Ｓ ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロチミジン 白色泡； 収率 （２０％）； 1H NMR (DMSO-d6) テ゛ルタ 10.87 (s, 1H), 5.76 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 5.18 (s, 1H), 5.17 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 4.24 (m,
1H), 3.72 (m, 1H,), 3.52 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.2 (m, 1H), 2.0 (m, 1H
), 1.84 (s, 3H); 13C NMR (DMSO-d6) テ゛ルタ 167.9, 150.4, 88.9, 86.9, 86.7,
71.1, 62.2, 57.3, 53.8, 37.7, 22.7; MS (MALDI-TOF) m/z 375.3 (M + Na), 3
77.3 (M + 2 + Na); IR (ニート): 3371 (br), 3214 (ショルタ゛ー), 1706 cm-1。 （５Ｒ，６Ｒ）−５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロチミジン 白色泡； 収率 （８０％）； 1H NMR (DMSO-d6 ) テ゛ルタ 10.84 (br s, 1H), 6.04 (dd, 1H, J = 8.4, 5.4 Hz), 5.18 (s, 1H), 5.13 (s, 1H), 4.89 (s, 1H)
, 4.18 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 3.53 (m, 1H), 3.42 (s, 3H), 2.20 (m, 1H),
1.80 (m, 1H), 1.84 (s, 3H); 13C NMR (DMSO-d6) テ゛ルタ 167.9, 150.9, 86.7, 8 6.2, 83.4, 70.5, 61.8, 57.9, 54.5, 38.2, 22.6; MS (MALDI-TOF) m/z 375.8
(M + Na) および 377.4 (M +2 + Na); IR (ニート): 3366 (br), 3214 (ショルタ゛ー), 1 701 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−デオキシチミジン５’−
［ｐ−ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート］ （ＷＨＩ−１１） 粘性オイル； 収率 （８６％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 8.74 (br s, 1H), 7.46-7.44 (m, 2H), 7.16-7.10 (m, 2H), 5.91 (t, 1H), 5.1-5.0 (s, 1H), 4.4
0-4.0 (m, 5H), 3.79* (s, 3H), 3.54* (s, 3H), 2.29-1.93 (m, 7H), 1.39-1.3
7 (d, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.5, 167.1, 150.5,148.5* 132.5*, 121.9
*, 117.7, 86.8, 86.2*, 78.3*, 67.6* , 57.8*, 53.8*, 50.1*, 31.6*, 25.7*
, 22.8*, および 20.9*; 31P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 2.65 および 2.74 (1:1), MS ( MALDI-TOF) m/z 679.1 (M -1 + Na); HPLC retention time 23.87, 24.49 minut
es; UV (MeOH): λmax 226 および 274 nm; IR (ニート): 3417, 1705, 1614 cm-1. ３’−アミノ−３’−デオキシチミジン５’−［ｐ−メトキシフェニルメトキシ
アラニニルホスフェート］ 無色の液体； 収率（７０％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.44 (br d, 1H), 7. 15-7.11 (d, 2H), 6.82-6.80 (d, 2H), 6.28-6.20 (t, 1H), 4.42-3.80 (m, 6H
), 3.75 (s, 3H), 3.71 (s, 3H,), 2.40-2.28 (m, 2H), 1.88 (br s, 3H), 1.39
および1.35 (dd, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.8, 163.8, 156.4, 150.3, 1 35.2, 121.0, 120.8, 114.4, 113.8, 110.8, 84.9, 84.2, 66.0, 58.0, 55.5, 5
5.3, 51.1, 34.2, 21.1, 20.8, 20.1; MS (MALDI-TOF) m/z 535.5 (M + Na); H
PLC 滞留時間10.48分、10.49分; UV (MeOH): λmax 218, 225 および 273 nm; IR ( ニート): 3261, 2839, 2096, 1741, 1693, 1506 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン５’−
［フェニルメトキシアラニニルホスフェート］（ＷＨＩ−０４） 粘性オイル； 収率 （９２％）；1HNMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.90 (br s, 1H), 7. 37-7.15 (m, 5H), 6.06-6.02 (t, 1H), 4.87* (s, 1H), 4.40-4.0 (m, 5H), 3.7
2 (s, 3H) , 3.44* (s, 3H), 2.29-1.93 (m, 6H), 1.39-1.37 (dおよびd, 3H); 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.5, 167.1, 152.1*,150.5, 129.8*, 125.2*, 120.1* , 87.3, 84.7,81.5, 60.0, 57.9*, 52.6*, 50.1*, 36.7,35.2, 22.7, 21.0; 31 P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 2.32, 2.51 (小さなヒ゜ーク) および 2.58, 2.71 (大きなヒ゜ーク ) (1:1); MS (MALDI-TOF) m/z 679.1 (M -1 + Na); HPLC 滞留時間17.60分、20.9 0分; UV (MeOH): λmax 218 および 262 nm; IR (ニート): 3265, 2852, 2104, 171 3, 1591 cm-1。 ５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−デオキシチミジン５’−
［フェニルメトキシアラニニルホスフェート］（ＷＨＩ−１２） 粘性オイル； 収率 （８６％）； 1H NMR (CDCl3) テ゛ルタ 7.94 (br s, 1H), 7.46-7.10 (m, 5H), 5.93-5.90 (t, 1H), 5.02* (s, 1H), 4.40-4.0 (m, 5H), 3
.70* (s, 3H), 3.45* (s, 3H), 2.29-1.93 (m, 7H), 1.39-1.37 (dおよびd, 3H) ; 13C NMR (CDCl3) テ゛ルタ 173.5, 167.2, 150.5*, 129.8, 129.5*, 125.0, 120.0 , 86.7*, 78.4*, 67.6*, 57.9*, 53.7, 52.6, 50.1*, 31.7*, 25.6, 22.8, 21.
0; 31P NMR (CDCl3) テ゛ルタ 2.51, 2.58 (小さなヒ゜ーク) および 2.65, 2.74 (大き なヒ゜ーク) (1:1); MS (MALDI-TOF) m/z 642.1(M + Na); HPLC滞留時間6.97分、7.41 分; UV (MeOH): λmax: 230 および 241 nm; IR (ニート): 3226, 2850, 1728, 159 1 cm-1。実施例１ 方法 ＡＺＴおよび様々な誘導体の抗ＨＩＶ−１活性を評価するために、正常末梢血
単核細胞を、加熱不活化した２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３％インターロイ
キン−２、２ｍＭのグルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ 3 、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび４μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニ ンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ジブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ））中で７２時間培養し、感染多重度０．１、吸収周期１時間で、ＨＩＶ−
１に曝露した。続いて細胞を９６ウェルマイクロタイタプレート（１００μｌ／
ウェル；２×１０6細胞／ｍｌ、３つの同じウェル）中で、様々な濃度（０．０ ０１μＭ〜１００μＭ）の薬剤の存在下または不存在下で７日間培養した。感染
７日目に培養液の上澄みの一部を除去し、ウイルス複製を示すｐ２４抗原エンザ
イムアッセイを行った。エリスら、アンチミクロバイアル エージェント アン
ド ケモセラピー（Erice et al. Antimicrob. Agents and Chemother. ） 37,
835 （１９９３）；ジェー．エム．ザーリングら、ネイチャー（J. M. Zarling
et al. Nature ）３４７，９２（１９９０）、エフ．エム．ウックンら（F. M.
Uckun et al. ）、アンチミクロバイアル エージェント アンド ケモセラピ ー４２，３８３（１９９８）。ウイルス複製の阻害率は、試験薬物で処理した感
染細胞のｐ２４抗原値と、未処理の感染細胞のｐ２４抗原値とを比較することに
よって計算した。試験化合物の抗ＨＩＶ活性をＩＣ50（ＨＩＶ−１の複製を５０
％減少させる培養培地中化合物の最終濃度）で表した。細胞の生存能力は、比色
ＭＴＡアッセイによって定量した。エフ．エム．ウックンら、アンチミクロバイ
アル エージェント アンド ケモセラピー４２，３８３（１９９８）。
【００５９】 ＡＺＴおよび様々な誘導体の強力な毒性が精子運動性に及ぼす効果を評価し、
洗剤様殺精子剤ノノキシノール−９（Ｎ−９、アイゲパールＣＯ−６３０；フォ
ーン−ポーレン社製、クランベリー、ニュージャージー（IGEPAL CO-630 ; Phon
e-Poulene, Cranbury, NJ ）と比較するために、プールされたドナー精子（ｎ＝
１０）の運動性の高い画分を不連続（９０〜４５％）パーコール勾配（コンセプ
ションテクノロジー（Conception Technologies ）、サンディエゴ、カリフォル
ニア）遠心分離およびオー．ジェー．ドクルツおよびジー．ジー．ハースジュニ
ア、バイオロジーリプロダクション（O. J. D’Cruz and G. G. Haas Jr., Biol
. Reprod. ）５３，１１１８（１９９５））に記載の「泳動（ｓｗｉｍ−ｕｐ）
」法によって調製した。全てのドナー検体は、インフォームドコンセントの後、
ウェイン ヒュース インスチチュートの倫理委員会（Institutional Review B
oard of The Wayne Hughes Institute ）のガイドラインを遵守して提供を受け た。運動性精子（１０×１０6／ｍｌ以上）を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（アーヴィ ン サイエンティフィック社、サンタアナ、カリフォルニア（Irvine Scientifi
c Co.,Santa Ana, CA ））および０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フラク
ションＶ、シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ（Fraction V,Sigma Che
mical Co., St. Louis, MO ））を含有するビッガーズ、ホウィットン、ホウィ ッテンガム培地（Biggers, Whitten, and Whittingam’s medium ）（ＢＷＷ） 中に、１％ＤＭＳＯ中試験物質（３００μＭ〜４．６μＭ）の連続２倍希釈液（
serial two fold dilution ）の存在下および不存在下で懸濁させた。合成ＷＨ Ｉ化合物の保存液をＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ）中で調製し、ＤＭＳＯ中に希釈
し、望ましい濃度とした。対応する体積のＤＭＳＯ（１％）を対照試験管に添加
した。Ｎ−９をＢＷＷ０．３％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）中で希釈し、望ましい濃度
とした（４．６〜３００μＭ）。３７℃で３時間インキュベーションした後、エ
ル、ジェー、ブルックマン、ファータイル ステリル（L. J. Burkman, Fertil.
Steril. ）５５，３６３（１９９１），オー．ジェー．ドクルツら、バイオロ ジーリプロダクション（１９９８）に記載のように運動性精子の割合をコンピュ
ータ補助精子分析器（ＣＡＳＡ）（computer assisted sperm analyzer）で分析
して評価した。運動性割合を、模擬処理した運動性精子の対照懸濁液と比較した
。試験化合物の殺精子活性をＥＣ50（運動性精子の割合を５０％減少させる培地
中化合物の最終濃度）で表した。非線形回帰分析を行い、ＥＣ50値をグラフパッ
ドプリズム（Graph Pad PRISM）ソフトウェア（サンディエゴ、カリフォルニア ）を用いた濃度効果曲線から測定した。
洗剤様殺精子剤ノノキシノール−９（Ｎ−９、アイゲパールＣＯ−６３０；フォ
ーン−ポーレン社製、クランベリー、ニュージャージー（IGEPAL CO-630 ; Phon
e-Poulene, Cranbury, NJ ）と比較するために、プールされたドナー精子（ｎ＝
１０）の運動性の高い画分を不連続（９０〜４５％）パーコール勾配（コンセプ
ションテクノロジー（Conception Technologies ）、サンディエゴ、カリフォル
ニア）遠心分離およびオー．ジェー．ドクルツおよびジー．ジー．ハースジュニ
ア、バイオロジーリプロダクション（O. J. D’Cruz and G. G. Haas Jr., Biol
. Reprod. ）５３，１１１８（１９９５））に記載の「泳動（ｓｗｉｍ−ｕｐ）
」法によって調製した。全てのドナー検体は、インフォームドコンセントの後、
ウェイン ヒュース インスチチュートの倫理委員会（Institutional Review B
oard of The Wayne Hughes Institute ）のガイドラインを遵守して提供を受け た。運動性精子（１０×１０6／ｍｌ以上）を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（アーヴィ ン サイエンティフィック社、サンタアナ、カリフォルニア（Irvine Scientifi
c Co.,Santa Ana, CA ））および０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フラク
ションＶ、シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ（Fraction V,Sigma Che
mical Co., St. Louis, MO ））を含有するビッガーズ、ホウィットン、ホウィ ッテンガム培地（Biggers, Whitten, and Whittingam’s medium ）（ＢＷＷ） 中に、１％ＤＭＳＯ中試験物質（３００μＭ〜４．６μＭ）の連続２倍希釈液（
serial two fold dilution ）の存在下および不存在下で懸濁させた。合成ＷＨ Ｉ化合物の保存液をＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ）中で調製し、ＤＭＳＯ中に希釈
し、望ましい濃度とした。対応する体積のＤＭＳＯ（１％）を対照試験管に添加
した。Ｎ−９をＢＷＷ０．３％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）中で希釈し、望ましい濃度
とした（４．６〜３００μＭ）。３７℃で３時間インキュベーションした後、エ
ル、ジェー、ブルックマン、ファータイル ステリル（L. J. Burkman, Fertil.
Steril. ）５５，３６３（１９９１），オー．ジェー．ドクルツら、バイオロ ジーリプロダクション（１９９８）に記載のように運動性精子の割合をコンピュ
ータ補助精子分析器（ＣＡＳＡ）（computer assisted sperm analyzer）で分析
して評価した。運動性割合を、模擬処理した運動性精子の対照懸濁液と比較した
。試験化合物の殺精子活性をＥＣ50（運動性精子の割合を５０％減少させる培地
中化合物の最終濃度）で表した。非線形回帰分析を行い、ＥＣ50値をグラフパッ
ドプリズム（Graph Pad PRISM）ソフトウェア（サンディエゴ、カリフォルニア ）を用いた濃度効果曲線から測定した。
【００６０】 ＣＡＳＡを用いた精子運動キネティクスを評価するため、３７℃で、４μｌず
つの精子懸濁液を、計測チャンバ上に配置された２つの２０μｍマイクロセルチ
ャンバ（コンセプションテクノロジー）上に置いた。各チャンバに、少なくとも
５〜８フィールドをハミルトンソーンインテグレーテッドビジュアルオプティカ
ルシステム（Hamilton Thorne Integrated Visual Optical System）（ＩＶＯＳ
）、バージョン１０インストルメント（ハミルトンソーン リサーチ インスチ
チュートインク、デンバー、マサチューセッツ（Hamilton Thorne Research Inc
.,Danvers,MA））を用いて走査分析した。各フィールドにつき３０秒記録した。
ハミルトンソーンコンピュータキャリブレーションをフレーム速度３０／ｓで３
０フレームに設定した。載物台の温度を載物台ウォーマーを用いて３７℃に維持
し、最低コントラスト、８；最小サイズ、６；低サイズゲート、１．０；高サイ
ズゲート２．９；低強度ゲート０．６；高強度ゲート、１．４；相コントラスト
輝度；低パス速度（path velocity ）１０μｍ／ｓ、および閾値直線度８０％；
ＨＴＭ倍率、１．９５に維持した。分析器の性能は、再生機能を用いて周期的に
検査した。精子のカイネティクスパラメータとしては、運動性（ＭＯＴ）および
前進運動性（ＰＲＧ）精子の数；曲線速度（ＶＣＬ：区切られた経過時間ごとに
得た、所与の精子が動いた距離の総合値）；平均パス速度（ＶＡＰ；精子頭部の
ぐらつきを除外した空間的平均パス）、直線速度（ＶＳＬ；時間毎の軌跡の始点
から終点までの直線距離）、ビートクロス回数（beat cross frequency ）（Ｂ ＣＦ；精子頭部が精子平均パスを横切る回数）、横向き頭部ずれの幅（amplitud
e of lateral head displacement ）（ＡＬＨ；精子頭部のぐらつきの幅の平均 ）および誘導体、直線性（ＳＴＲ＝１００×ＶＡＰ／ＶＣＬ）；線性（ＬＩＮ＝
１００×ＶＳＬ／ＶＣＬ；精子トラックの直線からの離間）があげられる。個別
のそれぞれの細胞トラックのデータを記録し、分析した。採取した各標本につき
、少なくとも２００の精子を分析した。 結果 生理学的受精は、射精された精子が泳ぎ、卵細胞の透明帯と結合し、卵子に侵
入する能力に依存する。これらのプロセスは、主に精子の運動性に依存する。ヒ
ト精子の運動性の高い画分をＡＺＴに曝露したところ、ヒト末梢血単核細胞にお
けるＨＩＶ−１複製を生体外において、ＩＣ50値０．００６μＭまで阻害したが
、３００μＭの高濃度でも、精子運動性に影響を及ぼさなかった（図１Ａ）。さ
らに、コンピュータ補助精子分析器（ＣＡＳＡ）を用いた精子運動性キネマティ
クスによって、精子運動性パラメータ、例えば、前進運動性、トラック速度、パ
ス速度および直線速度、泳動パターンの直線性、精子トラックの線性、ビートク
ロス回数、および横向き精子頭ずれを確認した。驚くべきことに、［５−ブロモ
−６−メトキシ］置換基をＡＺＴのチミン系環に導入して得た５−ブロモ−６−
メトキシ−５，６−ジヒドロ−ＡＺＴ（化合物ＷＨＩ−０１）は、抗ＨＩＶ活性
を有意に減少させることなく、殺精子機能を有意に増加させた（ＥＣ50 ＝１０ ４μＭ）（図１Ａ、図２Ａ）。ＮＨ2基を持つペントース環にアジド基を置くと （化合物ＷＨＩ−０３）、殺精子活性は向上した（ＥＣ50＝１２μＭ）が、抗Ｈ
ＩＶ活性は実質的に減少した。
つの精子懸濁液を、計測チャンバ上に配置された２つの２０μｍマイクロセルチ
ャンバ（コンセプションテクノロジー）上に置いた。各チャンバに、少なくとも
５〜８フィールドをハミルトンソーンインテグレーテッドビジュアルオプティカ
ルシステム（Hamilton Thorne Integrated Visual Optical System）（ＩＶＯＳ
）、バージョン１０インストルメント（ハミルトンソーン リサーチ インスチ
チュートインク、デンバー、マサチューセッツ（Hamilton Thorne Research Inc
.,Danvers,MA））を用いて走査分析した。各フィールドにつき３０秒記録した。
ハミルトンソーンコンピュータキャリブレーションをフレーム速度３０／ｓで３
０フレームに設定した。載物台の温度を載物台ウォーマーを用いて３７℃に維持
し、最低コントラスト、８；最小サイズ、６；低サイズゲート、１．０；高サイ
ズゲート２．９；低強度ゲート０．６；高強度ゲート、１．４；相コントラスト
輝度；低パス速度（path velocity ）１０μｍ／ｓ、および閾値直線度８０％；
ＨＴＭ倍率、１．９５に維持した。分析器の性能は、再生機能を用いて周期的に
検査した。精子のカイネティクスパラメータとしては、運動性（ＭＯＴ）および
前進運動性（ＰＲＧ）精子の数；曲線速度（ＶＣＬ：区切られた経過時間ごとに
得た、所与の精子が動いた距離の総合値）；平均パス速度（ＶＡＰ；精子頭部の
ぐらつきを除外した空間的平均パス）、直線速度（ＶＳＬ；時間毎の軌跡の始点
から終点までの直線距離）、ビートクロス回数（beat cross frequency ）（Ｂ ＣＦ；精子頭部が精子平均パスを横切る回数）、横向き頭部ずれの幅（amplitud
e of lateral head displacement ）（ＡＬＨ；精子頭部のぐらつきの幅の平均 ）および誘導体、直線性（ＳＴＲ＝１００×ＶＡＰ／ＶＣＬ）；線性（ＬＩＮ＝
１００×ＶＳＬ／ＶＣＬ；精子トラックの直線からの離間）があげられる。個別
のそれぞれの細胞トラックのデータを記録し、分析した。採取した各標本につき
、少なくとも２００の精子を分析した。 結果 生理学的受精は、射精された精子が泳ぎ、卵細胞の透明帯と結合し、卵子に侵
入する能力に依存する。これらのプロセスは、主に精子の運動性に依存する。ヒ
ト精子の運動性の高い画分をＡＺＴに曝露したところ、ヒト末梢血単核細胞にお
けるＨＩＶ−１複製を生体外において、ＩＣ50値０．００６μＭまで阻害したが
、３００μＭの高濃度でも、精子運動性に影響を及ぼさなかった（図１Ａ）。さ
らに、コンピュータ補助精子分析器（ＣＡＳＡ）を用いた精子運動性キネマティ
クスによって、精子運動性パラメータ、例えば、前進運動性、トラック速度、パ
ス速度および直線速度、泳動パターンの直線性、精子トラックの線性、ビートク
ロス回数、および横向き精子頭ずれを確認した。驚くべきことに、［５−ブロモ
−６−メトキシ］置換基をＡＺＴのチミン系環に導入して得た５−ブロモ−６−
メトキシ−５，６−ジヒドロ−ＡＺＴ（化合物ＷＨＩ−０１）は、抗ＨＩＶ活性
を有意に減少させることなく、殺精子機能を有意に増加させた（ＥＣ50 ＝１０ ４μＭ）（図１Ａ、図２Ａ）。ＮＨ2基を持つペントース環にアジド基を置くと （化合物ＷＨＩ−０３）、殺精子活性は向上した（ＥＣ50＝１２μＭ）が、抗Ｈ
ＩＶ活性は実質的に減少した。
【００６１】 アリールホスフェート置換誘導体の殺精子活性をＣＡＳＡによって評価した（
図１Ｂ）。非置換アリール部分を持つ化合物ＷＨＩ−０４は、ＷＨＩ−０１より
高い殺精子活性を示した。ｐ−メトキシ（化合物ＷＨＩ−０５、ＥＣ50＝２９μ
Ｍ），ｐ−フルオロ（化合物ＷＨＩ−０６、ＥＣ50＝１５μＭ）またはｐ−ブロ
モ（化合物ＷＨＩ−０７、ＥＣ50＝６μＭ）置換基をアリール部分に導入すると
、殺精子活性は更に増加した。力価はｐ−ブロモ＞ｐ−フルオロ＞ｐ−メトキシ
の順であった。アリール部分のｐ−ブロモ置換基はまた、予期に反して、抗ＨＩ
Ｖ機能の有意な増加を示した。ｐ−メトキシ置換されたアリールホスフェート誘
導体ＷＨＩ−０５（５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジ
ドチミジン−５’−（ｐ−メトキシフェニル）メトキシアラニニルホスフェート
）は、精子運動性アッセイにおいてＥＣ50値２９μＭ、ＨＩＶ複製アッセイにお
いて、ＩＣ50値０．０５μＭを示した。ｐ−ブロモ置換基（５−ブロモ−６−メ
トキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン−５’−（ｐ−ブロモフェニ
ル）−メトキシアラニニルホスフェート）をもつ化合物ＷＨＩ−０７は、精子運
動性アッセイにおいてＥＣ50値６μＭを示した（図１Ｂ、図２Ａ）。それは、洗
剤様殺精子剤Ｎ−９（ＥＣ50＝８１μＭ）より、１ログ高い力価となっている。
ＷＨＩ−０７はＨＩＶ複製アッセイにおいてＩＣ50値０．００５μＭの強力な抗
ＨＩＶ活性を示した。それは、実際ＡＺＴ（ＩＣ50 ＝０．００６μＭ）と一致 し、また、Ｎ−９（ＩＣ50＝２．１９５μＭ）の４３９倍強力であった（図２Ｂ
）。
図１Ｂ）。非置換アリール部分を持つ化合物ＷＨＩ−０４は、ＷＨＩ−０１より
高い殺精子活性を示した。ｐ−メトキシ（化合物ＷＨＩ−０５、ＥＣ50＝２９μ
Ｍ），ｐ−フルオロ（化合物ＷＨＩ−０６、ＥＣ50＝１５μＭ）またはｐ−ブロ
モ（化合物ＷＨＩ−０７、ＥＣ50＝６μＭ）置換基をアリール部分に導入すると
、殺精子活性は更に増加した。力価はｐ−ブロモ＞ｐ−フルオロ＞ｐ−メトキシ
の順であった。アリール部分のｐ−ブロモ置換基はまた、予期に反して、抗ＨＩ
Ｖ機能の有意な増加を示した。ｐ−メトキシ置換されたアリールホスフェート誘
導体ＷＨＩ−０５（５−ブロモ−６−メトキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジ
ドチミジン−５’−（ｐ−メトキシフェニル）メトキシアラニニルホスフェート
）は、精子運動性アッセイにおいてＥＣ50値２９μＭ、ＨＩＶ複製アッセイにお
いて、ＩＣ50値０．０５μＭを示した。ｐ−ブロモ置換基（５−ブロモ−６−メ
トキシ−５，６−ジヒドロ−３’−アジドチミジン−５’−（ｐ−ブロモフェニ
ル）−メトキシアラニニルホスフェート）をもつ化合物ＷＨＩ−０７は、精子運
動性アッセイにおいてＥＣ50値６μＭを示した（図１Ｂ、図２Ａ）。それは、洗
剤様殺精子剤Ｎ−９（ＥＣ50＝８１μＭ）より、１ログ高い力価となっている。
ＷＨＩ−０７はＨＩＶ複製アッセイにおいてＩＣ50値０．００５μＭの強力な抗
ＨＩＶ活性を示した。それは、実際ＡＺＴ（ＩＣ50 ＝０．００６μＭ）と一致 し、また、Ｎ−９（ＩＣ50＝２．１９５μＭ）の４３９倍強力であった（図２Ｂ
）。
【００６２】 ペントース環のアジド基（ＷＨＩ−１１およびＷＨＩ−１２）を除去すること
によって抗ＨＩＶ活性は減少したが、ＡＺＴ誘導体の殺精子活性は改善した（図
１Ｂ）。実施例２ 方法 本発明のＡＺＴ誘導体（ＷＨＩ化合物０１、０３、０５および０７、図１Ａお
よび図１Ｂ）の存在下で、インキュベーションの持続性が精子を動けなくする活
性に及ぼす効果を試験するために、精子の運動性画分（１０7／ｍｌ）を２００ μＭ ＷＨＩ−０１、またはそれぞれ１００μＭのＷＨＩ−０３、ＷＨＩ−０５
およびＷＨＩ−０７もしくは１％ＤＭＳＯ（０．１％）のみを存在させた０．５
ｍｌのＢＷＷ−０．３％ＢＳＡ中で、３７℃でインキュベーションした。一定間
隔毎に、２つの同じアリコート（４μｌ）を２つの２０μｍマイクロセルチャン
バに移し、ＣＡＳＡによって精子運動性を評価した。ＣＡＳＡは、ＷＨＩ−０１
については２０分毎に１８０分間、ＷＨＩ−０３およびＷＨＩ−０７については
５分毎に４０分間行った。 結果 精子を動けなくするカイネティクスは、本発明のＡＺＴにおいて速かった（図
１Ｂ）。ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７（濃度１００μＭ）に曝露された精子
の前進運動性を失うのに要する時間はそれぞれ１７分（９５％ＣＩ：１２〜２６
分）、６分（９５％ＣＩ：４〜１１分）であった。ＷＨＩ−０５に曝露６０分後
、ＷＨＩ−０７に曝露３０分後に、精子は完全に動けなくなった。比較例によれ
ば、１８０分のモニターの間は、対照サンプル中の精子の運動性は依然として安
定していた（基準値との比較で９６±２．５％）。実施例３ 方法 精漿がＷＨＩ化合物のＳＩＡに及ぼす可能な効果をアッセイ培地中の１０％無
細胞精漿の存在下で、またはＷＨＩ−０３、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７を
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中液化ドナー精液（ｎ＝３）の希釈液（１：２〜１
：６）に直接添加（２００μＭ）して調べ、３７℃でインキュベーションした。
３時間のインキュベーション後、２つの同じアリコート（４μｌ）を使用してＣ
ＡＳＡを行った。
によって抗ＨＩＶ活性は減少したが、ＡＺＴ誘導体の殺精子活性は改善した（図
１Ｂ）。実施例２ 方法 本発明のＡＺＴ誘導体（ＷＨＩ化合物０１、０３、０５および０７、図１Ａお
よび図１Ｂ）の存在下で、インキュベーションの持続性が精子を動けなくする活
性に及ぼす効果を試験するために、精子の運動性画分（１０7／ｍｌ）を２００ μＭ ＷＨＩ−０１、またはそれぞれ１００μＭのＷＨＩ−０３、ＷＨＩ−０５
およびＷＨＩ−０７もしくは１％ＤＭＳＯ（０．１％）のみを存在させた０．５
ｍｌのＢＷＷ−０．３％ＢＳＡ中で、３７℃でインキュベーションした。一定間
隔毎に、２つの同じアリコート（４μｌ）を２つの２０μｍマイクロセルチャン
バに移し、ＣＡＳＡによって精子運動性を評価した。ＣＡＳＡは、ＷＨＩ−０１
については２０分毎に１８０分間、ＷＨＩ−０３およびＷＨＩ−０７については
５分毎に４０分間行った。 結果 精子を動けなくするカイネティクスは、本発明のＡＺＴにおいて速かった（図
１Ｂ）。ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７（濃度１００μＭ）に曝露された精子
の前進運動性を失うのに要する時間はそれぞれ１７分（９５％ＣＩ：１２〜２６
分）、６分（９５％ＣＩ：４〜１１分）であった。ＷＨＩ−０５に曝露６０分後
、ＷＨＩ−０７に曝露３０分後に、精子は完全に動けなくなった。比較例によれ
ば、１８０分のモニターの間は、対照サンプル中の精子の運動性は依然として安
定していた（基準値との比較で９６±２．５％）。実施例３ 方法 精漿がＷＨＩ化合物のＳＩＡに及ぼす可能な効果をアッセイ培地中の１０％無
細胞精漿の存在下で、またはＷＨＩ−０３、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７を
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中液化ドナー精液（ｎ＝３）の希釈液（１：２〜１
：６）に直接添加（２００μＭ）して調べ、３７℃でインキュベーションした。
３時間のインキュベーション後、２つの同じアリコート（４μｌ）を使用してＣ
ＡＳＡを行った。
【００６３】 ＷＨＩ化合物の除去後、ＳＩＡの粘度を評価するために、１％ＤＭＳＯ中ＷＨ
Ｉ−０１、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７の存在下（１００μＭ）または不存
在下でプールされた運動性精子（５×１０6）を０．５ｍｌのアッセイ培地に添 加した。３７℃で３０分、６０分のインキュベーション後、２つの同じアリコー
トを使用して、ＣＡＳＡを用いた精子運動性評価を行った。残りの精子について
は、新鮮なアッセイ培地を添加し、遠心分離（５００ｘｇで５分間）を行うこと
によって洗浄した。この上澄みを捨て、ペレットを新鮮な培地（ＷＨＩ化合物を
含まない）中で再び懸濁させ、もとの体積にし、再びインキュベーションした。
３７℃で３０分後、２つの同じアリコートについて、ＣＡＳＡによって精子の運
動性パラメータを再び評価した。その結果を２つの評価の手段として表し、ＤＭ
ＳＯのみを含有する対照培地に懸濁させた運動性精子の同様に処理した上澄みの
精子運動性パラメータと比較した。 結果 ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７をリン酸緩衝食塩水中に希釈された精液に直
接添加したところ、ＣＡＳＡにより評価される精子運動性は完全に喪失していた
。したがって、殺精子活性は精漿の存在による影響を受けなかった。ＷＨＩ−０
５またはＷＨＩ−０７のＳＩＡがが可逆的であるかどうかを調べるために、精子
をいずれかの化合物１００μＭに３０分間曝露し、洗浄し、新鮮な精子運動性ア
ッセイ培地中に再び懸濁させ、精子の運動性をＣＡＳＡによって再び評価した。
精子運動性の回復は認められなかった。これは、薬物誘導性の精子を動けなくす
る性質は不可逆的であることを示すものである。ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０
７によって誘発された用量依存性、および時間依存性の精子運動性の喪失を生残
精子の運動性の有意な変化、例えばトラック速度、パス速度、および直線速度の
著明な減少と関連していた。実施例４ 方法 大多数の殺精子化合物は、洗剤様の活性を精子形質膜に及ぼした結果、精子を
動けなくすると考えられているので、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７が精漿の
膜透過性に及ぼす効果を、よう化プロピジウムで染色した精子のフローサイトメ
トリック分析によって調べ、精子先体膜の完全性に及ぼす効果を、ＦＩＴＣ−レ
クチン、ＴＯＴＯ３ヨウ化物およびナイルレッドで染色した精子について共焦レ
ーザ走査顕微鏡検査によって調べた。
Ｉ−０１、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７の存在下（１００μＭ）または不存
在下でプールされた運動性精子（５×１０6）を０．５ｍｌのアッセイ培地に添 加した。３７℃で３０分、６０分のインキュベーション後、２つの同じアリコー
トを使用して、ＣＡＳＡを用いた精子運動性評価を行った。残りの精子について
は、新鮮なアッセイ培地を添加し、遠心分離（５００ｘｇで５分間）を行うこと
によって洗浄した。この上澄みを捨て、ペレットを新鮮な培地（ＷＨＩ化合物を
含まない）中で再び懸濁させ、もとの体積にし、再びインキュベーションした。
３７℃で３０分後、２つの同じアリコートについて、ＣＡＳＡによって精子の運
動性パラメータを再び評価した。その結果を２つの評価の手段として表し、ＤＭ
ＳＯのみを含有する対照培地に懸濁させた運動性精子の同様に処理した上澄みの
精子運動性パラメータと比較した。 結果 ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７をリン酸緩衝食塩水中に希釈された精液に直
接添加したところ、ＣＡＳＡにより評価される精子運動性は完全に喪失していた
。したがって、殺精子活性は精漿の存在による影響を受けなかった。ＷＨＩ−０
５またはＷＨＩ−０７のＳＩＡがが可逆的であるかどうかを調べるために、精子
をいずれかの化合物１００μＭに３０分間曝露し、洗浄し、新鮮な精子運動性ア
ッセイ培地中に再び懸濁させ、精子の運動性をＣＡＳＡによって再び評価した。
精子運動性の回復は認められなかった。これは、薬物誘導性の精子を動けなくす
る性質は不可逆的であることを示すものである。ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０
７によって誘発された用量依存性、および時間依存性の精子運動性の喪失を生残
精子の運動性の有意な変化、例えばトラック速度、パス速度、および直線速度の
著明な減少と関連していた。実施例４ 方法 大多数の殺精子化合物は、洗剤様の活性を精子形質膜に及ぼした結果、精子を
動けなくすると考えられているので、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７が精漿の
膜透過性に及ぼす効果を、よう化プロピジウムで染色した精子のフローサイトメ
トリック分析によって調べ、精子先体膜の完全性に及ぼす効果を、ＦＩＴＣ−レ
クチン、ＴＯＴＯ３ヨウ化物およびナイルレッドで染色した精子について共焦レ
ーザ走査顕微鏡検査によって調べた。
【００６４】 固定化、精子ペレットのエタノール透過性、続くフルオレスセイン（ＦＩＴＣ
）−結合エンドウレクチン（シグマ社）を用いた染色の後に、蛍光顕微鏡（オリ
ンパスＢＸ−６０）によって、無傷の先体を持つ精子の割合を測定した。陽性対
照精子において、精子懸濁液を１０μＭカルシウムイオノフォア（ＣａＩ）Ａ２
３１８７（シグマ社）でインキュベーション（３７℃で３時間）することによっ
て先体反応を誘発した。各１００μＭのＷＨＩ−０１、ＷＨＩ−０３、ＷＨＩ−
０５、ＷＨＩ−０７またはＮ−９の存在下または不存在下で運動性精子（５×１
０6／ｍｌ）を３７℃で４時間インキュベーションし、続いてＰＩ（１０μｇ／ ｍｌ）を添加し、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＩに陽性の精子の
割合をＦＡＣＳバンテージ（FACS Vantage ）フローサイトメータ（ベクトンデ ィキンソンアンドカンパニー、マウンテンビュー（Becton Dickinson and Co.,M
ountain View ）カリフォルニア）を用いたフローサイトメトリーによって測定 した。泳動画分中の精子を特徴的前進および９０°光散乱特性（オー．ジェー．
ドクルツ、ジー．ジー．ハースジュニア、ファータイル、ステリル、５８、６３
３（１９９２）によって確認した。全ての分析は、ＰＩ発光において６３５ｎｍ
のバンドパスフィルタを有するクリプトン／アルゴンレーザからの４８８ｎｍ励
起を用いて行った。ＰＩ染色に陽性の精子の割合を、膜無傷の精子に対するカッ
トオフシグナルを用いて測定した。
）−結合エンドウレクチン（シグマ社）を用いた染色の後に、蛍光顕微鏡（オリ
ンパスＢＸ−６０）によって、無傷の先体を持つ精子の割合を測定した。陽性対
照精子において、精子懸濁液を１０μＭカルシウムイオノフォア（ＣａＩ）Ａ２
３１８７（シグマ社）でインキュベーション（３７℃で３時間）することによっ
て先体反応を誘発した。各１００μＭのＷＨＩ−０１、ＷＨＩ−０３、ＷＨＩ−
０５、ＷＨＩ−０７またはＮ−９の存在下または不存在下で運動性精子（５×１
０6／ｍｌ）を３７℃で４時間インキュベーションし、続いてＰＩ（１０μｇ／ ｍｌ）を添加し、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＩに陽性の精子の
割合をＦＡＣＳバンテージ（FACS Vantage ）フローサイトメータ（ベクトンデ ィキンソンアンドカンパニー、マウンテンビュー（Becton Dickinson and Co.,M
ountain View ）カリフォルニア）を用いたフローサイトメトリーによって測定 した。泳動画分中の精子を特徴的前進および９０°光散乱特性（オー．ジェー．
ドクルツ、ジー．ジー．ハースジュニア、ファータイル、ステリル、５８、６３
３（１９９２）によって確認した。全ての分析は、ＰＩ発光において６３５ｎｍ
のバンドパスフィルタを有するクリプトン／アルゴンレーザからの４８８ｎｍ励
起を用いて行った。ＰＩ染色に陽性の精子の割合を、膜無傷の精子に対するカッ
トオフシグナルを用いて測定した。
【００６５】 エタノール透過性の、空気乾燥された精子の塗抹標本を、それぞれ異なる標的
をマークするＦＩＴＣエンドウ、ＴＯＴＯ−３ヨウ化物およびナイルレッド（そ
れぞれ、透過した精子の先体、核、形質膜をそれぞれ標的とする）を用いて順次
染色した。クリプトン／アルゴン混合ガスレーザー（励起直線、４８８、５６８
および６４７ｎｍ）を備え、ニコンエクリプス（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ）
Ｅ８００シリーズアップライト顕微鏡に搭載したバイオラッド（Ｂｉｏ Ｒａｄ
）ＭＲＣ−１０２４レーザー走査共焦顕微鏡（バイオラッド社、ヘラクレス、カ
リフォルニア（BioRad Laboratories, Hercules, CA ））で、サンプルを調べた
。５９８／４０ｎｍ、５２２ＤＦ３２および６８０ＤＦ３２発光／フィルタをそ
れぞれ用いて、エタノール透過後の精子の先体領域、核、および形質膜からのフ
ルオレスセイン、ＴＯＴＯ−３ヨウ化物、ナイルレッドの蛍光発光を同時に検出
した。ニコン６０×（ＮＡ１．３５）対物レンズおよびカルマン（Ｋａｌｍａｎ
）集光フィルターを用いて共焦画像を得た。デジタル画像をアドーブフォトショ
ップ（Adove Photoshop ）ソフトウェア（アドーブシステム、マウンテンヴュー
、カリフォルニア（Adove Systems,Moutain View,CA ））を用いて処理した。最
終的な画像は、フジックス ピクトログラフィ（Fujix Pictography ）３０００
（富士写真フィルム株式会社、東京、日本）カラープリンタを用いて印刷した。
をマークするＦＩＴＣエンドウ、ＴＯＴＯ−３ヨウ化物およびナイルレッド（そ
れぞれ、透過した精子の先体、核、形質膜をそれぞれ標的とする）を用いて順次
染色した。クリプトン／アルゴン混合ガスレーザー（励起直線、４８８、５６８
および６４７ｎｍ）を備え、ニコンエクリプス（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ）
Ｅ８００シリーズアップライト顕微鏡に搭載したバイオラッド（Ｂｉｏ Ｒａｄ
）ＭＲＣ−１０２４レーザー走査共焦顕微鏡（バイオラッド社、ヘラクレス、カ
リフォルニア（BioRad Laboratories, Hercules, CA ））で、サンプルを調べた
。５９８／４０ｎｍ、５２２ＤＦ３２および６８０ＤＦ３２発光／フィルタをそ
れぞれ用いて、エタノール透過後の精子の先体領域、核、および形質膜からのフ
ルオレスセイン、ＴＯＴＯ−３ヨウ化物、ナイルレッドの蛍光発光を同時に検出
した。ニコン６０×（ＮＡ１．３５）対物レンズおよびカルマン（Ｋａｌｍａｎ
）集光フィルターを用いて共焦画像を得た。デジタル画像をアドーブフォトショ
ップ（Adove Photoshop ）ソフトウェア（アドーブシステム、マウンテンヴュー
、カリフォルニア（Adove Systems,Moutain View,CA ））を用いて処理した。最
終的な画像は、フジックス ピクトログラフィ（Fujix Pictography ）３０００
（富士写真フィルム株式会社、東京、日本）カラープリンタを用いて印刷した。
【００６６】 高解像度低電圧走査電子顕微鏡検査を用いて精子頭部上の異なる膜ドメインの
地形学的な画像化を、エム．エイチ．ストフェッルら、モレキュラー リプロダ
クション デベロプメント（Stoffel et al., Molecular Reprod Develop ）、 ３４：１７５（１９９３）；およびエス．エル．エルランドセンら、スキャニン
グ（S.L.Erlandesen et al., Scanning ）、１１：１６９（１９８９））に記載
の方法で行った。運動性精子のアリコート（２０×１０6）をＤＭＳＯ（１％） のみ、またはＤＭＳＯ中ＷＨＩ−０５、ＷＨＩ−０７各１００μＭ、またはＤＭ
ＳＯ中１０μＭ ＣａＩを用いて、３７℃で３時間インキュベーションした。洗
浄した精子懸濁液を０．１％ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたガラスチップ
上におき、６０分かけて氷上でインキュベーションし、ガラスに接着させた。上
澄み液を別の容器に移し、３時間、付着細胞を０．１４Ｍナトリウムカコジレー
ト緩衝液中１％パラホルムアルデヒドおよび１％グルタールアルデヒド内で固定
した。形質膜の完全性を保存するため、精子を、０．１４Ｍカコジレート緩衝液
中に０．１％のルテニウムレッドを含有する１％オスミウムテトロキシド（Ｏｓ
Ｏ4）中に４℃で１時間、後固定した。全てのサンプルをエタノールの級数を上 げながら脱水した、臨界点乾燥し、約２ｎｍの白金をアルゴンを用いたイオンビ
ームスパッタ法によって塗布した（１０ｋｅＶで４ｍＭ；イオンテック リミテ
ッド、ミドルセックス、英国（Ion Tech Ltd., Middlesex, England ））。全て
のサンプルを日立製作所製（Hitachi ）Ｓ−９００ ＳＥＭを用いて加速電圧２
ｋｅＶで試験した。低倍率（×２，０００−５０００）で精子を観察し、中間倍
率（×１８，０００−２５，０００）で典型的な精子を写真撮影した。評価した
各検体では、少なくとも２００の精子を走査し、先体領域の無傷性を調べた。
地形学的な画像化を、エム．エイチ．ストフェッルら、モレキュラー リプロダ
クション デベロプメント（Stoffel et al., Molecular Reprod Develop ）、 ３４：１７５（１９９３）；およびエス．エル．エルランドセンら、スキャニン
グ（S.L.Erlandesen et al., Scanning ）、１１：１６９（１９８９））に記載
の方法で行った。運動性精子のアリコート（２０×１０6）をＤＭＳＯ（１％） のみ、またはＤＭＳＯ中ＷＨＩ−０５、ＷＨＩ−０７各１００μＭ、またはＤＭ
ＳＯ中１０μＭ ＣａＩを用いて、３７℃で３時間インキュベーションした。洗
浄した精子懸濁液を０．１％ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたガラスチップ
上におき、６０分かけて氷上でインキュベーションし、ガラスに接着させた。上
澄み液を別の容器に移し、３時間、付着細胞を０．１４Ｍナトリウムカコジレー
ト緩衝液中１％パラホルムアルデヒドおよび１％グルタールアルデヒド内で固定
した。形質膜の完全性を保存するため、精子を、０．１４Ｍカコジレート緩衝液
中に０．１％のルテニウムレッドを含有する１％オスミウムテトロキシド（Ｏｓ
Ｏ4）中に４℃で１時間、後固定した。全てのサンプルをエタノールの級数を上 げながら脱水した、臨界点乾燥し、約２ｎｍの白金をアルゴンを用いたイオンビ
ームスパッタ法によって塗布した（１０ｋｅＶで４ｍＭ；イオンテック リミテ
ッド、ミドルセックス、英国（Ion Tech Ltd., Middlesex, England ））。全て
のサンプルを日立製作所製（Hitachi ）Ｓ−９００ ＳＥＭを用いて加速電圧２
ｋｅＶで試験した。低倍率（×２，０００−５０００）で精子を観察し、中間倍
率（×１８，０００−２５，０００）で典型的な精子を写真撮影した。評価した
各検体では、少なくとも２００の精子を走査し、先体領域の無傷性を調べた。
【００６７】 透過性電子顕微鏡では、０．２Ｍカコジレート緩衝液中５％スクロース中の３
％グルタールアルデヒド内で室温で固定した。そのサンプルを４℃で２時間、１
％ＯｓＯ4、５％スクロースおよび０．１％ルテニウムレッド内で後固定（post-
fixed ）した。エタノールの級数を上げながら前記サンプルを脱水し、シュプー
ルエポキシ（Spurr’s epoxy ）中に包埋した。レイチェルトユングウルトラカ ットイー（Reichert-Jung Ultracut E ）上に薄い切片（９０ｎｍ）を調製し、 酢酸ウラニルおよび鉛クエン酸塩で染色した。ＪＥＯＬ−１２００ＥＸ ＩＩ電
子顕微鏡（ＪＥＯＬ、パリ）を用いて、６０ｋＶで加圧しながらグリッドを調べ
た。精子を低倍率（×２５．０００）および高倍率（×１００，０００）で観察
した。典型的な精子を写真撮影した。精子の各評価では、１００〜２００の精子
についての精子頭部膜の無傷性を評価した。 結果 ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７の存在下では、精子は完全に動けなくなった
にもかかわらず、これらの化合物を用いた４時間のインキュベーション後ＰＩに
透過性を示したのは精子の３％未満であった。先体の完全性の研究では、濃度１
００μＭでの３時間のインキュベーション後、運動性は完全に喪失したにも関わ
らず、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７処理された精子（模擬処理された精子と
同様）の先体は無傷のままであった（それぞれ９７．０(２．０および９３．０(
５．６）。ＦＩＴＣ−レクチン、ＴＯＴＯ−３、およびナイルレッドで染色した
精子についての共焦顕微鏡検査によれば、強力な先体がＦＩＴＣ−レクチンで染
色され（緑）、核がＴＯＴＯ−３で染色され（青）、膜がナイルレッド（赤）で
それぞれ染色されていることがわかった（図３Ａ〜図３Ｄ）。非先体反応精子に
おいて、精子頭部の先体領域は、賦形剤（すなわち、１％ＤＭＳＯ）のみ（図３
Ａ）、１００ μＭ ＷＨＩ−０５ （図３Ｂ）および１００μＭ ＷＨＩ−０
７（図３Ｃ）に３時間曝露した精子において、均一な明るい緑の蛍光塗料を示し
た。比較例において、１００μＭのＮ−９に３時間、同じ条件で曝露した精子は
、膜の完全性が破壊されているため先体反応精子だけであることがわかった（図
３Ｄ）、これは先の観察と一致する。ダブリュー．エイチ．ウィルボーン、ディ
ー．ダブリュー．ハーン、ジェー．ジェーマクガイア（W. H. Wilborn, D. W. H
ahn, J. J. McGuire ）、ファータイルステリル）３９，７１７（１９８３）） ；エイ．エス．バウリンバイアー、エス．リーハング、コントラセプション（A.
S. Bourinbaiar, S. Lee-Huang, Contraception ）、４９，１３１（１９９４ ）。二重機能のＡＺＴ類似体の殺精子活性は、膜の無傷性の喪失を伴わなかった
。
％グルタールアルデヒド内で室温で固定した。そのサンプルを４℃で２時間、１
％ＯｓＯ4、５％スクロースおよび０．１％ルテニウムレッド内で後固定（post-
fixed ）した。エタノールの級数を上げながら前記サンプルを脱水し、シュプー
ルエポキシ（Spurr’s epoxy ）中に包埋した。レイチェルトユングウルトラカ ットイー（Reichert-Jung Ultracut E ）上に薄い切片（９０ｎｍ）を調製し、 酢酸ウラニルおよび鉛クエン酸塩で染色した。ＪＥＯＬ−１２００ＥＸ ＩＩ電
子顕微鏡（ＪＥＯＬ、パリ）を用いて、６０ｋＶで加圧しながらグリッドを調べ
た。精子を低倍率（×２５．０００）および高倍率（×１００，０００）で観察
した。典型的な精子を写真撮影した。精子の各評価では、１００〜２００の精子
についての精子頭部膜の無傷性を評価した。 結果 ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７の存在下では、精子は完全に動けなくなった
にもかかわらず、これらの化合物を用いた４時間のインキュベーション後ＰＩに
透過性を示したのは精子の３％未満であった。先体の完全性の研究では、濃度１
００μＭでの３時間のインキュベーション後、運動性は完全に喪失したにも関わ
らず、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７処理された精子（模擬処理された精子と
同様）の先体は無傷のままであった（それぞれ９７．０(２．０および９３．０(
５．６）。ＦＩＴＣ−レクチン、ＴＯＴＯ−３、およびナイルレッドで染色した
精子についての共焦顕微鏡検査によれば、強力な先体がＦＩＴＣ−レクチンで染
色され（緑）、核がＴＯＴＯ−３で染色され（青）、膜がナイルレッド（赤）で
それぞれ染色されていることがわかった（図３Ａ〜図３Ｄ）。非先体反応精子に
おいて、精子頭部の先体領域は、賦形剤（すなわち、１％ＤＭＳＯ）のみ（図３
Ａ）、１００ μＭ ＷＨＩ−０５ （図３Ｂ）および１００μＭ ＷＨＩ−０
７（図３Ｃ）に３時間曝露した精子において、均一な明るい緑の蛍光塗料を示し
た。比較例において、１００μＭのＮ−９に３時間、同じ条件で曝露した精子は
、膜の完全性が破壊されているため先体反応精子だけであることがわかった（図
３Ｄ）、これは先の観察と一致する。ダブリュー．エイチ．ウィルボーン、ディ
ー．ダブリュー．ハーン、ジェー．ジェーマクガイア（W. H. Wilborn, D. W. H
ahn, J. J. McGuire ）、ファータイルステリル）３９，７１７（１９８３）） ；エイ．エス．バウリンバイアー、エス．リーハング、コントラセプション（A.
S. Bourinbaiar, S. Lee-Huang, Contraception ）、４９，１３１（１９９４ ）。二重機能のＡＺＴ類似体の殺精子活性は、膜の無傷性の喪失を伴わなかった
。
【００６８】 高解像度低電圧走査電子顕微鏡検査によって薬物処理した精子頭部の地形学的
な画像化を行ったところ、精子中に平滑な連続面をもつ無傷の先体が（図３Ａ’
〜３Ｄ’）が賦形剤（図３Ａ’）または１００μＭのＷＨＩ−０５（図３Ｂ’）
に曝露されていることがわかった。しかしＷＨＩ−０７で処理された精子（図３
Ｃ’）は膜に穏やかな波うちの徴候があった。比較例においては、１０μＭのＣ
ａＩ Ａ２３１８７に曝露された精子は、特徴的な小胞形成または小嚢形成、窓
形成および血漿および先体膜の喪失の特徴が観察された（図３Ｄ’）。精子頭部
の接線断面の透過性電子顕微鏡検査によれば、精子の血漿膜、外部および内部先
体膜が賦形剤（図３Ａ”）、ＷＨＩ−０５（図３Ｂ”）およびＷＨＩ−０７（図
３Ｃ”）に曝露されているが、ＣａＩ Ａ２３１８７（図３Ｄ”）には３時間曝
露されなかった（図３下のパネル）。これらの結果から、ＷＨＩ−０５またはＷ
ＨＩ−０７の殺精子効果が、精子頭部の先体領域の精子形質膜の破壊を誘発する
洗剤タイプの活性によっては引き起こされないことが明らかになった。ＡＺＴの
ブロモメトキシ置換アリールホスフェート誘導体のこれらの特徴は、最も広く使
用されている典型的な洗剤型殺精子剤であるＮ−９の特徴とは異なる。実施例５ 方法 ヒト精子−透明帯（ｚｏｎａ）の認識および結合アッセイは、生体外および生
体内での受精の成果を予測するようである。したがって次に、ＷＨＩ−０５およ
びＷＨＩ−０７が精子−卵子相互作用に及ぼす阻害作用を均一な精子−透明帯結
合アッセイにおいて、無傷のヒト透明帯および細胞透過性ＤＮＡ特異的染料、Ｓ
ＹＢＲ１４（緑）およびＳＹＴＯ１７（青）でそれぞれ標識された２色の精子を
用いたレーザ走査共焦顕微鏡検査によって評価した。ヒト卵子と結合する精子の
数にばらつきがあるために、精子−透明帯結合比を用いて精子−透明帯結合能を
評価した。
な画像化を行ったところ、精子中に平滑な連続面をもつ無傷の先体が（図３Ａ’
〜３Ｄ’）が賦形剤（図３Ａ’）または１００μＭのＷＨＩ−０５（図３Ｂ’）
に曝露されていることがわかった。しかしＷＨＩ−０７で処理された精子（図３
Ｃ’）は膜に穏やかな波うちの徴候があった。比較例においては、１０μＭのＣ
ａＩ Ａ２３１８７に曝露された精子は、特徴的な小胞形成または小嚢形成、窓
形成および血漿および先体膜の喪失の特徴が観察された（図３Ｄ’）。精子頭部
の接線断面の透過性電子顕微鏡検査によれば、精子の血漿膜、外部および内部先
体膜が賦形剤（図３Ａ”）、ＷＨＩ−０５（図３Ｂ”）およびＷＨＩ−０７（図
３Ｃ”）に曝露されているが、ＣａＩ Ａ２３１８７（図３Ｄ”）には３時間曝
露されなかった（図３下のパネル）。これらの結果から、ＷＨＩ−０５またはＷ
ＨＩ−０７の殺精子効果が、精子頭部の先体領域の精子形質膜の破壊を誘発する
洗剤タイプの活性によっては引き起こされないことが明らかになった。ＡＺＴの
ブロモメトキシ置換アリールホスフェート誘導体のこれらの特徴は、最も広く使
用されている典型的な洗剤型殺精子剤であるＮ−９の特徴とは異なる。実施例５ 方法 ヒト精子−透明帯（ｚｏｎａ）の認識および結合アッセイは、生体外および生
体内での受精の成果を予測するようである。したがって次に、ＷＨＩ−０５およ
びＷＨＩ−０７が精子−卵子相互作用に及ぼす阻害作用を均一な精子−透明帯結
合アッセイにおいて、無傷のヒト透明帯および細胞透過性ＤＮＡ特異的染料、Ｓ
ＹＢＲ１４（緑）およびＳＹＴＯ１７（青）でそれぞれ標識された２色の精子を
用いたレーザ走査共焦顕微鏡検査によって評価した。ヒト卵子と結合する精子の
数にばらつきがあるために、精子−透明帯結合比を用いて精子−透明帯結合能を
評価した。
【００６９】 具体的には、生体外で受精しなかったヒト卵子を等しい数のＳＹＢＲ１４（緑
）およびＳＹＴＯ１７（青）標識された対照精子、または等しい数のＳＹＢＲ１
４（緑）およびＳＹＴＯ１７（青）標識精子を含有する試験精子の混合物と個別
に受精させた。後者は、３種の濃度（２５，５０および１００μＭ） の試験化
合物で予め処理しておいた。共インキュベーション後、しっかり結合した緑（Ｓ
ＹＢＲ１４）および青（ＳＹＴＯ１７）精子についてレーザ走査共焦顕微鏡検査
を行った。凍結ヒト卵子（ｎ＝４６）を解凍し、精子懸濁液を添加する前に、３
回 ＢＷＷ−０．３％ＢＳＡ中およびＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ中ですすいだ。卵
子の回復、凍結、解凍および生体外増殖の過程では、いつも積雲のない（ｃｕｍ
ｕｌｕｓ−ｆｒｅｅ）、非生存卵子となった。ヒト精子−透明帯結合上のＷＨＩ
−０５およびＷＨＩ−０７がヒト精子と透明帯との結合に及ぼす影響を調べるた
めに、生殖能力のある運動性画分を１０7／ｍｌずつの２つに分け、２つの細胞 透過性ＤＮＡ特異的染料（ＳＹＢＲ１４およびＳＹＴＯ１７）で標識した。第一
の部分は２．５μＭ ＳＹＢＲ１４（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いてインキュベーションし、第二の部分は５μＭ
ＳＹＴＯ１７を用いてインキュベーションした。インキュベーション３０分後、
精子の運動性をＣＡＳＡによって評価した。強く染色された緑または青の核を持
つ運動性精子をＢＷＷ中で２回洗浄し、ＳＹＢＲ１４（緑）およびＳＹＴＯ１７
（青）で染色された１００万の運動性精子をヒト透明帯（ｎ＝２）を含む皿にミ
ネラルオイルの下で添加し、４時間共インキュベーションした。卵子を広い範囲
で洗浄した後、精子と緩く結合した全ての卵子をスライドガラスの上に載せ、上
記バイオラッドＭＲＣ−１０２４レーザ走査共焦顕微鏡によって実験した。蛍光
画像を用いて、精子頭部に局在する蛍光発光ＳＹＢＲ−１４およびＳＹＴＯ−１
７を５９８／４０ｎｍおよび６８０ＤＦ３２発光／フィルターでそれぞれ記録し
た。ニコン２０×（ＮＡ１．４）対物レンズおよびカルマン（Ｋａｌｍａｎ）集
光フィルターを用いて、Ｚセクションの共焦画像を得た。デジタル画像をアドー
ブフォトショップ（Adobe Photoshop ）ソフトウェアで画像処理し、最終画像は
フジックスピクトログラフィー（Fujix Pictography ）３０００カラープリンタ
を用いて印刷した。各ヒト卵子にしっかり結合した緑および青色精子核を、全て
の焦点面上のそれぞれの卵子蛍光画像のＺセクションから計測し、結合比として
表した。 結果 対照と試験物質において、ヒト卵子に結合した緑と青の精子の数の比率は、著
明な違いが見られた。ＳＹＢＲ１４およびＳＹＴＯ１７標識対照精子と共インキ
ュベーションした対照卵子の平均精子−透明帯結合比率は１．０７であった。一
方、対照（ＳＹＢＲ１４）および２５、５０、１００μＭのＷＨＩ−０７で処理
した精子（ＳＹＴＯ１７）と共インキュベーションした卵子の精子−透明帯結合
平均比率はそれぞれ０．０８８、０．０３９、０．００９であった。２５、５０
、１００μＭのＷＨＩ−０５で処理した対応平均比率はそれぞれ０．１８、０．
０７、０．１０であった。図４Ａは、緑と青の精子と対照卵子（Ａ．１）および
試験卵子との代表的な精子−卵子結合パターンを示す。試験卵子においては青の
精子が１００μＭのＷＨＩ−０５（Ａ．２）または、緑で標識された精子と共イ
ンキュベーションする前に、２５μＭのＷＨＩ−０７（Ａ．３）のいずれかで予
め処理されている。個別の透明帯と結合する様々な数の精子にもかかわらず、対
照卵子と比較して、試験卵子と結合した青色精子は明らかに減少していた。実施例６ 方法 異種の透明帯のないハムスター卵子侵入アッセイは、ヒト精子の生体内受精能
ならびにヒト精子が無傷のヒト卵子に生体内で受精する能力と関連しているよう
である。したがって、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７が精子−卵子相互作用に
及ぼす阻害効果を透明帯のないハムスター卵子侵入アッセイによって更に調べた
。
）およびＳＹＴＯ１７（青）標識された対照精子、または等しい数のＳＹＢＲ１
４（緑）およびＳＹＴＯ１７（青）標識精子を含有する試験精子の混合物と個別
に受精させた。後者は、３種の濃度（２５，５０および１００μＭ） の試験化
合物で予め処理しておいた。共インキュベーション後、しっかり結合した緑（Ｓ
ＹＢＲ１４）および青（ＳＹＴＯ１７）精子についてレーザ走査共焦顕微鏡検査
を行った。凍結ヒト卵子（ｎ＝４６）を解凍し、精子懸濁液を添加する前に、３
回 ＢＷＷ−０．３％ＢＳＡ中およびＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ中ですすいだ。卵
子の回復、凍結、解凍および生体外増殖の過程では、いつも積雲のない（ｃｕｍ
ｕｌｕｓ−ｆｒｅｅ）、非生存卵子となった。ヒト精子−透明帯結合上のＷＨＩ
−０５およびＷＨＩ−０７がヒト精子と透明帯との結合に及ぼす影響を調べるた
めに、生殖能力のある運動性画分を１０7／ｍｌずつの２つに分け、２つの細胞 透過性ＤＮＡ特異的染料（ＳＹＢＲ１４およびＳＹＴＯ１７）で標識した。第一
の部分は２．５μＭ ＳＹＢＲ１４（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いてインキュベーションし、第二の部分は５μＭ
ＳＹＴＯ１７を用いてインキュベーションした。インキュベーション３０分後、
精子の運動性をＣＡＳＡによって評価した。強く染色された緑または青の核を持
つ運動性精子をＢＷＷ中で２回洗浄し、ＳＹＢＲ１４（緑）およびＳＹＴＯ１７
（青）で染色された１００万の運動性精子をヒト透明帯（ｎ＝２）を含む皿にミ
ネラルオイルの下で添加し、４時間共インキュベーションした。卵子を広い範囲
で洗浄した後、精子と緩く結合した全ての卵子をスライドガラスの上に載せ、上
記バイオラッドＭＲＣ−１０２４レーザ走査共焦顕微鏡によって実験した。蛍光
画像を用いて、精子頭部に局在する蛍光発光ＳＹＢＲ−１４およびＳＹＴＯ−１
７を５９８／４０ｎｍおよび６８０ＤＦ３２発光／フィルターでそれぞれ記録し
た。ニコン２０×（ＮＡ１．４）対物レンズおよびカルマン（Ｋａｌｍａｎ）集
光フィルターを用いて、Ｚセクションの共焦画像を得た。デジタル画像をアドー
ブフォトショップ（Adobe Photoshop ）ソフトウェアで画像処理し、最終画像は
フジックスピクトログラフィー（Fujix Pictography ）３０００カラープリンタ
を用いて印刷した。各ヒト卵子にしっかり結合した緑および青色精子核を、全て
の焦点面上のそれぞれの卵子蛍光画像のＺセクションから計測し、結合比として
表した。 結果 対照と試験物質において、ヒト卵子に結合した緑と青の精子の数の比率は、著
明な違いが見られた。ＳＹＢＲ１４およびＳＹＴＯ１７標識対照精子と共インキ
ュベーションした対照卵子の平均精子−透明帯結合比率は１．０７であった。一
方、対照（ＳＹＢＲ１４）および２５、５０、１００μＭのＷＨＩ−０７で処理
した精子（ＳＹＴＯ１７）と共インキュベーションした卵子の精子−透明帯結合
平均比率はそれぞれ０．０８８、０．０３９、０．００９であった。２５、５０
、１００μＭのＷＨＩ−０５で処理した対応平均比率はそれぞれ０．１８、０．
０７、０．１０であった。図４Ａは、緑と青の精子と対照卵子（Ａ．１）および
試験卵子との代表的な精子−卵子結合パターンを示す。試験卵子においては青の
精子が１００μＭのＷＨＩ−０５（Ａ．２）または、緑で標識された精子と共イ
ンキュベーションする前に、２５μＭのＷＨＩ−０７（Ａ．３）のいずれかで予
め処理されている。個別の透明帯と結合する様々な数の精子にもかかわらず、対
照卵子と比較して、試験卵子と結合した青色精子は明らかに減少していた。実施例６ 方法 異種の透明帯のないハムスター卵子侵入アッセイは、ヒト精子の生体内受精能
ならびにヒト精子が無傷のヒト卵子に生体内で受精する能力と関連しているよう
である。したがって、ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７が精子−卵子相互作用に
及ぼす阻害効果を透明帯のないハムスター卵子侵入アッセイによって更に調べた
。
【００７０】 ＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７に曝露されたヒト精子の受精能を透明帯のな
いハムスター卵子侵入アッセイによって評価した（ヤナギマチら、（Yanagimach
i et al. ）バイオロジーリプロダクション１５，４７１（１９７６））。９０ −４５％パーコール勾配遠心分離および洗浄によって得た精子の運動性画分（ｎ
＝４）をＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地（ｐＨ７．４）中で再び懸濁し、２０(１ ０6精子／ｍｌずつに分け、２４時間受精できるようにした。その後、３７(Ｃで
３時間、２５μＭまたは１００μＭの濃度のＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７（
０．５％ＤＭＳＯ中）を用いて、受精可能条件のもとで精子を処理した。薬物へ
の曝露後、ＷＨＩ処理した精子懸濁液をＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地中で洗浄し
た。受精およびＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地中での洗浄後の精子運動性をＣＡＳ
Ａによって評価した。
いハムスター卵子侵入アッセイによって評価した（ヤナギマチら、（Yanagimach
i et al. ）バイオロジーリプロダクション１５，４７１（１９７６））。９０ −４５％パーコール勾配遠心分離および洗浄によって得た精子の運動性画分（ｎ
＝４）をＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地（ｐＨ７．４）中で再び懸濁し、２０(１ ０6精子／ｍｌずつに分け、２４時間受精できるようにした。その後、３７(Ｃで
３時間、２５μＭまたは１００μＭの濃度のＷＨＩ−０５およびＷＨＩ−０７（
０．５％ＤＭＳＯ中）を用いて、受精可能条件のもとで精子を処理した。薬物へ
の曝露後、ＷＨＩ処理した精子懸濁液をＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地中で洗浄し
た。受精およびＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地中での洗浄後の精子運動性をＣＡＳ
Ａによって評価した。
【００７１】 凍結ハムスター卵子（チャールズリバーラボラトリー、ウインブルトンマサチ
ューセッツ（Charles River Laboratories, Wilmington, MA ））を、解凍し、 ＢＷＷ培地中、３５ｍｍのガラス底マイクロウェル（マットテックコーポレーシ
ョン、アシュランド、マサチューセッツ（Mat Tek Corporation, Ashland, MA ））に移した。透明帯を除去するため、洗浄した卵子を、ＢＷＷ培地中０．０５
％トリプシン（アーヴィン サイエンティフィック）で２０分処理し、その後、
ＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地に移し、３回洗浄した。１試験につき、１５〜４５
の透明帯のない卵子を、ミネラルオイルの下で１００μｌのＢＷＷ−３．５％Ｂ
ＳＡ培地に移した。＜１００μｌのＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地中、対照および
試験精子懸濁液（２(１０6）を添加し、その生殖細胞を４時間、３７(Ｃで５％ ＣＯ2を含む空気中で共インキュベーションした。インキュベーション後、卵子 をＢＷＷ培地で３回洗浄し、緩く結合した精子を除去した。イーアイ−ダナスー
リら、（EI-Danasouri et al. ）ファータイルステリル．５９，４７０（１９９
３）に記載の方法で卵子を固定し、染色した。結合し、脱凝縮した、蛍光発光し
ている精子を、励起フィルタＢＰ３６０−３７０およびＤＭ４００バリアフィル
タＢＡ４２０を備えたオリンパス ビーエックス６０（Olympus BX60 ）エピフ ルオレスセント（epifluorescent ）顕微鏡で観察した。卵子ごとに結合した精 子の数、卵子ごとに膨潤した精子頭部の数、および侵入を受けた卵子の割合を対
照精子および試験精子について測定した。少なくとも１つの膨潤した精子頭部を
原形質中に持つとき、その卵子は精子の侵入があったものとする。 結果 受精可能な精子を、いずれかの化合物とともに予備インキュベーションしたと
ころ、透明帯のない卵子と結合する精子の有意な阻害（Ｐ＜０．００１）が認め
られた（図４Ｂ）。同様に、ＷＨＩ−０５またはＷＨＩ−０７の用量を増加させ
て曝露した後のヒト精子の透明帯のないハムスター卵子への侵入率は、著明に阻
害されていた（対照と比較で４１％〜１００％阻害）。したがって、ＡＺＴの殺
精子アリールホスフェート誘導体を有するヒト精子の侵入は、透明帯のないハム
スター卵子と結合および侵入する能力を用量依存的に喪失していた。実施例７ 方法 生体内での受精は、精子の女性生殖器官への輸送の成功に依存するので、次に
、精子を生体内でＷＨＩ−０７を曝露することがその後の受精率に影響するかど
うかを測定した。ホルモンで活性化された成体雌スイスマウス（ＣＤ−１）を副
睾丸運動性精子を用いて、ＷＨＩ−０７をクリーム基剤で経膣投与を行い／行わ
ずに子宮頸部を介して人工受精を行った。８日後、雌マウスの子宮内に胚が存在
するか否かを調べた。
ューセッツ（Charles River Laboratories, Wilmington, MA ））を、解凍し、 ＢＷＷ培地中、３５ｍｍのガラス底マイクロウェル（マットテックコーポレーシ
ョン、アシュランド、マサチューセッツ（Mat Tek Corporation, Ashland, MA ））に移した。透明帯を除去するため、洗浄した卵子を、ＢＷＷ培地中０．０５
％トリプシン（アーヴィン サイエンティフィック）で２０分処理し、その後、
ＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地に移し、３回洗浄した。１試験につき、１５〜４５
の透明帯のない卵子を、ミネラルオイルの下で１００μｌのＢＷＷ−３．５％Ｂ
ＳＡ培地に移した。＜１００μｌのＢＷＷ−３．５％ＢＳＡ培地中、対照および
試験精子懸濁液（２(１０6）を添加し、その生殖細胞を４時間、３７(Ｃで５％ ＣＯ2を含む空気中で共インキュベーションした。インキュベーション後、卵子 をＢＷＷ培地で３回洗浄し、緩く結合した精子を除去した。イーアイ−ダナスー
リら、（EI-Danasouri et al. ）ファータイルステリル．５９，４７０（１９９
３）に記載の方法で卵子を固定し、染色した。結合し、脱凝縮した、蛍光発光し
ている精子を、励起フィルタＢＰ３６０−３７０およびＤＭ４００バリアフィル
タＢＡ４２０を備えたオリンパス ビーエックス６０（Olympus BX60 ）エピフ ルオレスセント（epifluorescent ）顕微鏡で観察した。卵子ごとに結合した精 子の数、卵子ごとに膨潤した精子頭部の数、および侵入を受けた卵子の割合を対
照精子および試験精子について測定した。少なくとも１つの膨潤した精子頭部を
原形質中に持つとき、その卵子は精子の侵入があったものとする。 結果 受精可能な精子を、いずれかの化合物とともに予備インキュベーションしたと
ころ、透明帯のない卵子と結合する精子の有意な阻害（Ｐ＜０．００１）が認め
られた（図４Ｂ）。同様に、ＷＨＩ−０５またはＷＨＩ−０７の用量を増加させ
て曝露した後のヒト精子の透明帯のないハムスター卵子への侵入率は、著明に阻
害されていた（対照と比較で４１％〜１００％阻害）。したがって、ＡＺＴの殺
精子アリールホスフェート誘導体を有するヒト精子の侵入は、透明帯のないハム
スター卵子と結合および侵入する能力を用量依存的に喪失していた。実施例７ 方法 生体内での受精は、精子の女性生殖器官への輸送の成功に依存するので、次に
、精子を生体内でＷＨＩ−０７を曝露することがその後の受精率に影響するかど
うかを測定した。ホルモンで活性化された成体雌スイスマウス（ＣＤ−１）を副
睾丸運動性精子を用いて、ＷＨＩ−０７をクリーム基剤で経膣投与を行い／行わ
ずに子宮頸部を介して人工受精を行った。８日後、雌マウスの子宮内に胚が存在
するか否かを調べた。
【００７２】 より特に、５ＩＵの妊馬血清ゴナドトロピンを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）するこ
とによって、続いて５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピンを４６〜４８時間後にを
腹腔内注射（ｉ．ｐ．）することによって、成体（月齢５〜６ヶ月）雌ＣＤ−１
マウスを過剰排卵させた。マウスを処置群（２７もしくは２４匹／群）すなわち
、賦形剤対照群（１％のＤＭＳＯを含むクリーム基剤（タロファーマスーティカ
ルス、ホーソーン、ニュージャージー（Taro Pharmaceuticals, Hawthorne, NJ
））または、試験群（１％ＤＭＳＯ中１％ＷＨＩ−０７を含むクリーム基剤）の
２群に無作為に割り付け、人工受精する前に経膣投与（５０μｌ）を行った。精
巣上体尾部をブリーダであることが証明されている成体ＣＤ−１雄ラット（月齢
５〜６ヶ月）から得た（ビー．ホーガン、アール．ベッディングトン、エフ．コ
スタンチーニ、イー．レーシー（編）、マウス胚の操作（コールドスプリングハ
ーバーラボラトリープレス、プレインビュー、ニューヨーク、１９９４（B. Hog
an, R. Beddington, F. Costantini, E. Lacy, Eds., Manipulating the Mouse
Embryo （Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1994 ）。そ
して改質されたクレブスリンガーバイカーボネート培地（Ｍ２；ジブコ−ビーア
ールエル）に懸濁させ、ピルベート、ラクテートおよびグルコースを添加した。
Ｍ２培地−５％ＢＳＡ中で精子を使用前１時間で受精可能とした。各実験のため
に精巣上体尾部を２５匹のマウスからプールし、１−２(１０6運動性精子／５０
μｌを受精させるために調整して使用した。鋭い１８ゲージ針を備えた１ｍｌシ
リンジから、５０μｌ体積／マウスで出した。調製物を分析し、精子濃度、運動
性、精子運動性パラメータを楕円形の精子頭部形態学（ハミルトンソーン）を用
いてＣＡＳＡによって調べた。８日目に、対照群および試験群を代表するそれぞ
れの雌を屠殺し、子宮に胚が存在するかどうかを調べた。合計で３つの受精実験
を行った。 結果 ３つの受精実験の結果を表１に示す。人口受精前にＷＨＩ−０７を経膣投与さ
れたマウスにおいては、受精率は対照群と比較して劇的に少なかった（７．６％
対３８．４％；Ｐ＜０．００１）。これは、ＷＨＩ−０７−曝露された精子が受
精部位に到達することができないことを示している。 （表１） ＷＨＩ−０７の経膣投与を行って／行わずに子宮頸部を介して人工受精を行っ
た場合の人口受精後の雌マウスにおける受精能 実験 各群の受精した 対照マウスの ＷＨＩ−０７− マウスの数* 受胎数†（％） 処理したマウスの 受精能 （％） １ ２７ １０ （３７．０） ２ （７．４） ２ ２７ １１ （４０．７） １ （３．７） ３ ２４ ９ （３７．５） ３ （１２．５） 合計 ７８ ３０ （３８．４） ６ （７．６）‡ * 動物は、妊娠８日目に屠殺した。 †子宮内に胚が存在するかどうかを調べることによって受精能を測定した ‡対照群との有意差 （ｐ＜０．００１）．実施例８ 方法 現在市販されている膣内避妊薬の洗剤様活性により誘発される非特異的膜毒性
を考慮に入れて膣内避妊薬を改質しなければならない。これは、膣組織を傷つけ
、ＨＩＶ等の性交渉によって感染する疾患にかかりやすくする。したがって、Ｎ
−９とＷＨＩ−０７をマウスにおいて反復経膣投与して局部組織の変化および炎
症反応を比較した。各群１５匹ずつの成体雌スイス（ＣＤ−１）マウスを５日間
（Ａ群）または２０日間（Ｂ群）連続して、５％Ｎ−９か５％ＷＨＩ−０７のい
ずれか、また、対照群はクリーム基剤で処置した。そして頚膣組織切片を調べ、
組織病理学的変化および炎症細胞の広がりを調べた（図５）。頚膣領域は、血管
粘膜下組織上に横たわる層状扁平上皮からなる。上皮組織の厚さは、発情周期の
４つの段階によって変わる。
とによって、続いて５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピンを４６〜４８時間後にを
腹腔内注射（ｉ．ｐ．）することによって、成体（月齢５〜６ヶ月）雌ＣＤ−１
マウスを過剰排卵させた。マウスを処置群（２７もしくは２４匹／群）すなわち
、賦形剤対照群（１％のＤＭＳＯを含むクリーム基剤（タロファーマスーティカ
ルス、ホーソーン、ニュージャージー（Taro Pharmaceuticals, Hawthorne, NJ
））または、試験群（１％ＤＭＳＯ中１％ＷＨＩ−０７を含むクリーム基剤）の
２群に無作為に割り付け、人工受精する前に経膣投与（５０μｌ）を行った。精
巣上体尾部をブリーダであることが証明されている成体ＣＤ−１雄ラット（月齢
５〜６ヶ月）から得た（ビー．ホーガン、アール．ベッディングトン、エフ．コ
スタンチーニ、イー．レーシー（編）、マウス胚の操作（コールドスプリングハ
ーバーラボラトリープレス、プレインビュー、ニューヨーク、１９９４（B. Hog
an, R. Beddington, F. Costantini, E. Lacy, Eds., Manipulating the Mouse
Embryo （Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1994 ）。そ
して改質されたクレブスリンガーバイカーボネート培地（Ｍ２；ジブコ−ビーア
ールエル）に懸濁させ、ピルベート、ラクテートおよびグルコースを添加した。
Ｍ２培地−５％ＢＳＡ中で精子を使用前１時間で受精可能とした。各実験のため
に精巣上体尾部を２５匹のマウスからプールし、１−２(１０6運動性精子／５０
μｌを受精させるために調整して使用した。鋭い１８ゲージ針を備えた１ｍｌシ
リンジから、５０μｌ体積／マウスで出した。調製物を分析し、精子濃度、運動
性、精子運動性パラメータを楕円形の精子頭部形態学（ハミルトンソーン）を用
いてＣＡＳＡによって調べた。８日目に、対照群および試験群を代表するそれぞ
れの雌を屠殺し、子宮に胚が存在するかどうかを調べた。合計で３つの受精実験
を行った。 結果 ３つの受精実験の結果を表１に示す。人口受精前にＷＨＩ−０７を経膣投与さ
れたマウスにおいては、受精率は対照群と比較して劇的に少なかった（７．６％
対３８．４％；Ｐ＜０．００１）。これは、ＷＨＩ−０７−曝露された精子が受
精部位に到達することができないことを示している。 （表１） ＷＨＩ−０７の経膣投与を行って／行わずに子宮頸部を介して人工受精を行っ
た場合の人口受精後の雌マウスにおける受精能 実験 各群の受精した 対照マウスの ＷＨＩ−０７− マウスの数* 受胎数†（％） 処理したマウスの 受精能 （％） １ ２７ １０ （３７．０） ２ （７．４） ２ ２７ １１ （４０．７） １ （３．７） ３ ２４ ９ （３７．５） ３ （１２．５） 合計 ７８ ３０ （３８．４） ６ （７．６）‡ * 動物は、妊娠８日目に屠殺した。 †子宮内に胚が存在するかどうかを調べることによって受精能を測定した ‡対照群との有意差 （ｐ＜０．００１）．実施例８ 方法 現在市販されている膣内避妊薬の洗剤様活性により誘発される非特異的膜毒性
を考慮に入れて膣内避妊薬を改質しなければならない。これは、膣組織を傷つけ
、ＨＩＶ等の性交渉によって感染する疾患にかかりやすくする。したがって、Ｎ
−９とＷＨＩ−０７をマウスにおいて反復経膣投与して局部組織の変化および炎
症反応を比較した。各群１５匹ずつの成体雌スイス（ＣＤ−１）マウスを５日間
（Ａ群）または２０日間（Ｂ群）連続して、５％Ｎ−９か５％ＷＨＩ−０７のい
ずれか、また、対照群はクリーム基剤で処置した。そして頚膣組織切片を調べ、
組織病理学的変化および炎症細胞の広がりを調べた（図５）。頚膣領域は、血管
粘膜下組織上に横たわる層状扁平上皮からなる。上皮組織の厚さは、発情周期の
４つの段階によって変わる。
【００７３】 特に、３０匹の雌ＣＤ−１マウス（月齢６ヶ月）を無作為に２群（Ａ群および
Ｂ群）に割り付けた。各群をさらに３つのマウス５匹ずつのサブグループに分け
た。Ａ群のマウスは５日間、Ｂ群のマウスは２０日間毎日、１％ＤＭＳＯのみ（
対照）、１％ＤＭＳＯ中５％ＷＨＩ−０７または５％Ｎ−９を添加したクリーム
基剤（タロファーマスーティカルス）を経膣投与した。それぞれ５日後、および
２０日後に、マウスを頸部脱臼により屠殺し、生殖器官の組織を１０％ホルマリ
ン緩衝液中に固定した。炎症の程度および膜のうろこ状上皮組織の無傷性を測定
するために、従来のパラフィン包埋切片（６−μｍ）を調製し、ヘマトキシリン
およびエオジンで染色し、画像分析システム（スキオン（Ｓｃｉｏｎ））と接触
したライカ（Ｌｅｉｃａ）社製顕微鏡を用いて倍率３００×で観察し、画像をア
ドーブフォトショップ（Adobe Photoshop ）ソフトウェアで印刷した。発情周期
の４つの段階を組織生理学的に調べた。
Ｂ群）に割り付けた。各群をさらに３つのマウス５匹ずつのサブグループに分け
た。Ａ群のマウスは５日間、Ｂ群のマウスは２０日間毎日、１％ＤＭＳＯのみ（
対照）、１％ＤＭＳＯ中５％ＷＨＩ−０７または５％Ｎ−９を添加したクリーム
基剤（タロファーマスーティカルス）を経膣投与した。それぞれ５日後、および
２０日後に、マウスを頸部脱臼により屠殺し、生殖器官の組織を１０％ホルマリ
ン緩衝液中に固定した。炎症の程度および膜のうろこ状上皮組織の無傷性を測定
するために、従来のパラフィン包埋切片（６−μｍ）を調製し、ヘマトキシリン
およびエオジンで染色し、画像分析システム（スキオン（Ｓｃｉｏｎ））と接触
したライカ（Ｌｅｉｃａ）社製顕微鏡を用いて倍率３００×で観察し、画像をア
ドーブフォトショップ（Adobe Photoshop ）ソフトウェアで印刷した。発情周期
の４つの段階を組織生理学的に調べた。
【００７４】 間接的免疫蛍光アッセイおよび共焦顕微鏡検査で、対照マウス、ＷＨＩ−０７
処置マウスおよびＮ−９処置マウスの頸膣切片のうろこ状上皮組織への好中球の
侵入を調べた。頸膣部組織切片を脱パラフィン化し、級別エタノール（graded e
thanol ）を通して脱水し、ラットｍＡｂ（セダーレーンラボラトリーリミテッ ド、ウエストベリー、ニューヨーク（Cederlane Laboratories Ltd., Westbury,
NY ））を用いてマウス好中球（クローン５１２０−２６．１−１１０）を免疫
染色した。加熱（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．０中で９３℃で
１０分）によって抗原回復後、切片をＰＢＳ中正常１０％ヤギ血清を用いて予備
的にインキュベーションし、ｍＡｂの最適希釈剤（５μｇ／ｍｌ）で処理し、続
いてＦＩＴＣ−結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（ピアスケミカル社、ロックフォード、
イリノイ（Pierce Chemical Co., Rockford, IL ））で処理した。各インキュベ
ーション工程を６０分続け、工程間に５分ずつＰＢＳ洗浄を行った。スライドを
ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を用いて対比染色し、脱イオン水で洗浄し、フェージング
防止（バイオラッド社）に載せ、上記レーザ共焦顕微鏡検査によって視覚化した
。第一のｍＡｂをＰＢＳで置換することによって、または対照としてＩｇＧ２を
使用することによって陰性対照を行った。 結果 １０匹の賦形剤のみで処理した対照マウスと同様、ＷＨＩ−０７で５日もしく
は２０日間処置した１０匹のマウスのいずれも、うろこ状上皮組織に有意な炎症
反応または膜破壊を示したものはなかった（図５ＡおよびＥ）。対照的に、Ｎ−
９を頸膣投与したマウスでは、上皮性裏打ちの破壊および頸膣クリプトの偏平状
上皮組織における好中球の流入との炎症性反応が１０匹中９匹で認められた（図
５Ｂ およびＥ）、これは既に報告されているラットでの観察と矛盾しない。ト
リホナス、ブッター、トキシコロジーレター（Tryphonas and Buttar, Toxicol.
Lett., ）２０，２８９（１９８４）。マウス好中球に特異的なモノクローナル
抗体を用いてＷＨＩ−０７およびＮ−９処理した頸膣上皮組織の切片の２色レー
ザ走査共焦蛍光画像によれば、ＷＨＩ−０７処理した検体の層状うろこ状上皮ク
リプトにおいて好中球が存在しないこと（図５Ｃ）、およびＮ−９処理した組織
切片のうろこ状上皮組織において強い陽性染色（緑）が明らかになった（図５Ｄ
）。これらの研究から、Ｎ−９処理とは違い、ＷＨＩ−０７をクリーム基剤で頸
膣投与することによっていかなる膜破壊または頸膣部の上皮組織のクリプトにお
いて急性の炎症反応を引き起こさなかった。
処置マウスおよびＮ−９処置マウスの頸膣切片のうろこ状上皮組織への好中球の
侵入を調べた。頸膣部組織切片を脱パラフィン化し、級別エタノール（graded e
thanol ）を通して脱水し、ラットｍＡｂ（セダーレーンラボラトリーリミテッ ド、ウエストベリー、ニューヨーク（Cederlane Laboratories Ltd., Westbury,
NY ））を用いてマウス好中球（クローン５１２０−２６．１−１１０）を免疫
染色した。加熱（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．０中で９３℃で
１０分）によって抗原回復後、切片をＰＢＳ中正常１０％ヤギ血清を用いて予備
的にインキュベーションし、ｍＡｂの最適希釈剤（５μｇ／ｍｌ）で処理し、続
いてＦＩＴＣ−結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（ピアスケミカル社、ロックフォード、
イリノイ（Pierce Chemical Co., Rockford, IL ））で処理した。各インキュベ
ーション工程を６０分続け、工程間に５分ずつＰＢＳ洗浄を行った。スライドを
ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を用いて対比染色し、脱イオン水で洗浄し、フェージング
防止（バイオラッド社）に載せ、上記レーザ共焦顕微鏡検査によって視覚化した
。第一のｍＡｂをＰＢＳで置換することによって、または対照としてＩｇＧ２を
使用することによって陰性対照を行った。 結果 １０匹の賦形剤のみで処理した対照マウスと同様、ＷＨＩ−０７で５日もしく
は２０日間処置した１０匹のマウスのいずれも、うろこ状上皮組織に有意な炎症
反応または膜破壊を示したものはなかった（図５ＡおよびＥ）。対照的に、Ｎ−
９を頸膣投与したマウスでは、上皮性裏打ちの破壊および頸膣クリプトの偏平状
上皮組織における好中球の流入との炎症性反応が１０匹中９匹で認められた（図
５Ｂ およびＥ）、これは既に報告されているラットでの観察と矛盾しない。ト
リホナス、ブッター、トキシコロジーレター（Tryphonas and Buttar, Toxicol.
Lett., ）２０，２８９（１９８４）。マウス好中球に特異的なモノクローナル
抗体を用いてＷＨＩ−０７およびＮ−９処理した頸膣上皮組織の切片の２色レー
ザ走査共焦蛍光画像によれば、ＷＨＩ−０７処理した検体の層状うろこ状上皮ク
リプトにおいて好中球が存在しないこと（図５Ｃ）、およびＮ−９処理した組織
切片のうろこ状上皮組織において強い陽性染色（緑）が明らかになった（図５Ｄ
）。これらの研究から、Ｎ−９処理とは違い、ＷＨＩ−０７をクリーム基剤で頸
膣投与することによっていかなる膜破壊または頸膣部の上皮組織のクリプトにお
いて急性の炎症反応を引き起こさなかった。
【００７５】 本発明の置換されたピリミジン誘導体は、予期に反して強力な殺精子活性およ
び抗ＨＩＶ活性特性を示す。その結果、それらは、特に膣内避妊薬として、性行
為により感染するＨＩＶを予防するのに有用である。それゆえに本発明のＡＺＴ
誘導体は、異性間性交渉によってＨＩＶに罹患する危険性の高いＨＩＶ女性の受
精コントロールに有用であろう。
び抗ＨＩＶ活性特性を示す。その結果、それらは、特に膣内避妊薬として、性行
為により感染するＨＩＶを予防するのに有用である。それゆえに本発明のＡＺＴ
誘導体は、異性間性交渉によってＨＩＶに罹患する危険性の高いＨＩＶ女性の受
精コントロールに有用であろう。
【００７６】 本発明の詳細を上に記載したが、本発明はこれに限定されるものでない。ここ
に記載した本発明は、別の実施形態を含む修正をしてもよい。そのような自明な
選択は全て、以下のクレームに述べる本発明の精神および範囲にある。
に記載した本発明は、別の実施形態を含む修正をしてもよい。そのような自明な
選択は全て、以下のクレームに述べる本発明の精神および範囲にある。
【図１】 図１Ａおよび図１Ｂは、ＡＺＴの化学構造および本発明の特定のＡＺＴ誘導体
の例および誘導体の比較例を示す。
の例および誘導体の比較例を示す。
【図２】 図２Ａおよび図２Ｂは、ＡＺＴおよび様々なＡＺＴ誘導体が精子の運動性に及
ぼす影響を示すグラフである。
ぼす影響を示すグラフである。
【図３】 図３は、様々なＡＺＴ誘導体が精子の形質膜および精子先体膜の完全性に及ぼ
す影響を示す。
す影響を示す。
【図４】 図４は、本発明の様々なＡＺＴ誘導体で処理した対照精子の精子−透明帯結合
の走査レーザ共焦顕微鏡検査画像を示す。
の走査レーザ共焦顕微鏡検査画像を示す。
【図５】 図５Ａ〜Ｄは、本発明のＡＺＴ誘導体によって頚膣部の炎症がＮ−９より減少
したことを示す。
したことを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１１月１４日（２０００．１１．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 但し、Ｒ1はＨ、Ｎ3、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2または官能基化ＮＨ2で あり、Ｒ2はハロゲンであり、Ｒ3はＣ１−３アルコキシであり、およびＲ’はＨ
または化合物を細胞へ通過しやすくする基である。
または化合物を細胞へ通過しやすくする基である。
【化２】 但し、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、同一もしくは異なり、水素、メチル、エチル、フ ルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、メト
キシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から選択され；Ｒ”は、
置換またはエステル化され得るアミノ酸残基である。
キシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から選択され；Ｒ”は、
置換またはエステル化され得るアミノ酸残基である。
【化３】 但し、Ｒ1はＨ、Ｎ3、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2または官能基化ＮＨ2で あり、Ｒ2はハロゲンであり、Ｒ3はＣ１−３アルコキシであり、およびＲ’はＨ
または化合物を細胞へ通過しやすくする基である。
または化合物を細胞へ通過しやすくする基である。
【化４】 但し、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、同一もしくは異なり、水素、メチル、エチル、フ ルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、メト
キシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から選択され；Ｒ”は、
置換またはエステル化され得るアミノ酸残基である。
キシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から選択され；Ｒ”は、
置換またはエステル化され得るアミノ酸残基である。
【化５】 但し、Ｒ1はＮ3、ＮＨ2または官能基化ＮＨ2であり、Ｒ2はハロゲン、Ｒ3はＣ１ −３アルコキシ、Ｒ4は水素、ハロゲンまたはＣ１−３アルコキシ、Ｒ5およびＲ 6 は水素である。
【化６】
但し、前記式（III）において、Ｒ1は水素、Ｎ3、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、
ＮＨ2、ＮＨ−ＣＨ3、ＮＨ−ＣＯＣＨ3、ＮＨ−Ｐｈ、ＮＨ−ＣＯＰｈおよびＮ
Ｈ−ＣＨ2−Ｐｈからなる群から選択された少なくとも一つの基であり、Ｒ2はハ
ロゲンであり、Ｒ3は炭素数１〜３（Ｃ１−３）のアルコキシであり、および、
Ｒ’は水素またはこの化合物を細胞内へ通過し易くする基である。
【化７】
但し、前記式（IV）において、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、同一または異なる基であ
って、水素、メチル、エチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオ
ロメチル、ニトロ、シアノ、メトキシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシか
らなる群から選択された少なくとも一つの基であり、Ｒ’’は、置換またはエス
テル化され得るアミノ酸残基である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 31/18 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ヴェンカタチャラム、タラカード アメリカ合衆国、55418 ミネソタ州、セ ント．アンソニー、ケンズィー テラス 2600、アパートメント ＃209 Ｆターム(参考） 4C057 BB02 BB05 CC03 CC04 LL12 LL14 LL19 LL23 4C076 AA06 BB30 CC35 CC50 FF67 4C086 AA01 AA02 AA03 EA17 MA01 NA14 ZA86 ZB33
Claims (34)
- 【請求項１】 哺乳動物の精子を、殺精子活性または精子を動けなくする活
性を示すＡＺＴ誘導体に接触させることを含む哺乳動物における避妊方法。 - 【請求項２】 前記ＡＺＴ誘導体のチミン環は、５位がハロゲンで置換され
、６位がアルコキシで置換されている請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記アルコキシがＣ１−３アルコキシである請求項２に記載
の方法。 - 【請求項４】 前記ＡＺＴ誘導体が下記式（化１）で表される化合物または
薬学的に許容されるその塩もしくはエステルである請求項３に記載の方法。 【化１】 但し、Ｒ1はＨ、Ｎ3、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2または官能基化ＮＨ2で
あり、Ｒ2はハロゲンであり、Ｒ3はＣ１−３アルコキシであり、およびＲ’はＨ
または化合物を細胞へ通過しやすくする基である。 - 【請求項５】 Ｒ2がブロモであり、Ｒ3がメトキシである請求項４に記載の
方法。 - 【請求項６】 Ｒ1がＮ3である請求項４に記載の方法。
- 【請求項７】 Ｒ1がＮＨ2または官能基化ＮＨ2である請求項４に記載の方 法。
- 【請求項８】 Ｒ’が脂質、脂肪酸またはホスフェート基の残基である請求
項４に記載の方法。 - 【請求項９】 Ｒ’がホスフェート基の残基である請求項８に記載の方法。
- 【請求項１０】 ＯＲ’が下記式（化２）で表される基である請求項９に記
載の方法。 【化２】 但し、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、同一もしくは異なり、水素、メチル、エチル、フ ルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、メト
キシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から選択され；Ｒ”は、
置換またはエステル化され得るアミノ酸残基である。 - 【請求項１１】 Ｒ4およびＲ5は、同一もしくは異なり、水素、フルオロ、
ブロモおよびメトキシからなる群から選択される請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 哺乳動物の精子を、殺精子活性または精子を動けなくする
活性を有するピリミジン系ヌクレオシドまたはヌクレオチドである活性物質に接
触させることを含む哺乳動物における避妊方法。 - 【請求項１３】 前記活性物質がチミン、ウラシルまたはシトシン環を含む
請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記チミン、ウラシルまたはシトシン環は、５位がハロゲ
ンで置換され、６位がアルコキシで置換されている請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 避妊効果用量の、殺精子活性または精子を動けなくする活
性を有するＡＺＴ誘導体、および避妊のために好適に使用される担体、希釈剤ま
たは賦形剤を含む避妊用組成物。 - 【請求項１６】 ＡＺＴ誘導体の前記チミン環部分は、５位がハロゲンで置
換され、６位がアルコキシで置換されている請求項１５に記載の組成物。 - 【請求項１７】 前記アルコキシがＣ１−３アルコキシである請求項１６に
記載の組成物。 - 【請求項１８】 前記ＡＺＴ誘導体が下記式（化３）で表される化合物また
は薬学的に許容できるその塩もしくはエステルである請求項１７に記載の組成物
。 【化３】 但し、Ｒ1はＨ、Ｎ3、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2または官能基化ＮＨ2で
あり、Ｒ2はハロゲンであり、Ｒ3はＣ１−３アルコキシであり、およびＲ’はＨ
または化合物を細胞へ通過しやすくする基である。 - 【請求項１９】 Ｒ2はブロモであり、Ｒ3はメトキシである請求項１８に記
載の組成物。 - 【請求項２０】 Ｒ1がＮ3である請求項１８に記載の組成物。
- 【請求項２１】 Ｒ1がＮＨ2または官能基化ＮＨ2である請求項１８に記載 の組成物。
- 【請求項２２】 Ｒ’が脂質、脂肪酸またはホスフェート基の残基である請
求項１８に記載の組成物。 - 【請求項２３】 Ｒ’がホスフェート基の残基である請求項２２に記載の組
成物。 - 【請求項２４】 ＯＲ’が下記式（化４）で表される基である請求項２３に
記載の組成物。 【化４】 但し、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、同一もしくは異なり、水素、メチル、エチル、フ ルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、メト
キシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から選択され；Ｒ”は、
置換またはエステル化され得るアミノ酸残基である。 - 【請求項２５】 Ｒ4およびＲ5は、同一もしくは異なり、水素、フルオロ、
ブロモおよびメトキシからなる群から選択される請求項２４に記載の組成物。 - 【請求項２６】 殺精子活性または精子を動けなくする活性を示すピリミジ
ン系ヌクレオシドまたはヌクレオチドである活性物質を避妊に効果的な用量で含
む避妊用組成物。 - 【請求項２７】 前記活性物質がチミン、ウラシルまたはシトシン環を含む
請求項２６に記載の組成物。 - 【請求項２８】 前記チミン、ウラシルまたはシトシン環は、５位がハロゲ
ンで置換され、６位がアルコキシで置換されている請求項２７に記載の組成物。 - 【請求項２９】 下記式（化５）で表される化合物。 【化５】 但し、Ｒ1はＮ3、ＮＨ2または官能基化ＮＨ2であり、Ｒ2はハロゲン、Ｒ3はＣ１
−３アルコキシ、Ｒ4は水素、ハロゲンまたはＣ１−３アルコキシ、Ｒ5およびＲ 6 は水素である。 - 【請求項３０】 Ｒ1がＮ3である請求項２９に記載の化合物。
- 【請求項３１】 Ｒ1が官能基化または非官能基化ＮＨ2である請求項２９に
記載の化合物。 - 【請求項３２】 Ｒ4が水素である請求項２９に記載の化合物。
- 【請求項３３】 Ｒ4がフルオロである請求項２９に記載の化合物。
- 【請求項３４】 Ｒ4がブロモである請求項２９に記載の化合物。
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