JP2002505007A

JP2002505007A - ゲート・イオンチャネルを含む脂質膜から成るバイオセンサー

Info

Publication number: JP2002505007A
Application number: JP50395799A
Authority: JP
Inventors: ピーターソン・イアン・ロバート
Original assignee: コベントリーユニバーシティー
Priority date: 1997-06-14
Filing date: 1998-06-15
Publication date: 2002-02-12
Also published as: KR100550404B1; AU726398B2; AU7926698A; CN1161606C; HK1027623A1; EP0988533B1; WO1998058248A1; CN1301343A; EP0988533A1; DE69811886T2; DE69811886D1; ATE233897T1; CA2293284A1; ES2193535T3; GB9712386D0; US6177000B1; KR20010013583A; PT988533E; DK0988533T3; NZ501640A

Abstract

(57)【要約】バイオセンサーは、脂質膜（７）の最初の面に塗布されるサンプルの分析分子の存否を感知しうるゲート・イオンチャネルを含む脂質膜（７）を持つ。脂質膜（７）は、多孔質ゲル（４）の最初の層が脂質膜（７）の最初の面に塗布される一対の電極（１，２）の間に配置される。

Description

【発明の詳細な説明】ゲート・イオンチャネルを含む脂質膜から成るバイオセンサー本発明は、バイオセンサー、とりわけ脂質膜を通るイオンの輸送を検知もしくは測定することにより動作するタイプのバイオセンサーに関するものである。二重層膜に及ぶゲート・チャネル・タンパク質の使用に基づくバイオセンサーには、かなり関心がある。実際的な測定間隔中に個々の結合イベントは、このチャネルを通じて１０⁹イオンもの通過をもたらすことができる。また、異なるチャネルの動作は基本的に独立しており、またそれらを通る電流は直線的に結合する。これら二つのファクターは、卓越した感度と高いダイナミック・レンジを示す生体分子を感知するための一般原理の有望さを示唆する。高いダイナミック・レンジを達成するためには、ターゲット生体分子が存在すると開くチャネル・タンパク質を選ぶ必要がある。これは、多くの自然生成チャネル・タンパク質、一般的には神経細胞の神経伝達物質受容体の場合である。より一般的にあてはまるアプローチでは、頑強なゲートなしチャネルとりわけグラミシジンは、普通にはチャネルを妨害し、また抗原が結合するときにその妨害を解除するように、抗体分子に化学的に結合する。こうしたチャネル・タンパク質を通じて輸送される電荷は、物理的に溶媒和イオン（solvatedions）から成る。さらなる処理ができるようにするために、二重層の前後にある電極のワイヤを通じて、イオンを電子の流れと交換しなければならない。或る既知のアプローチでは、二重層は後ろの貴金属電極のすぐ近くにある。イオンがどこに流れるのか不明である。もしイオンが電極で放出されるなら、関連する化学変化が必然的に劣化に導くだろう。別の既知のアプローチでは、ゲルに含まれる二重層の後ろに電解質がある。二重層は、ゲルに隣接した開口部を通す標準技術で作られる。二重層が試験液の非常に強い撹拌に耐えることができるように、ゲルが二重層を物理的に少し支えている。しかし二重層は脱水できず、モニターする水性媒体で測定する直前に形成しなければならない。それは媒体に直接にさらされ、固体との接触に耐えることができない。既知の形態のそうしたバイオセンサーの欠点を克服もしくはかなり緩和する脂質膜を通るイオン輸送の測定に基づいて、新しい形態のバイオセンサーが考案された。本発明の第１の態様によれば、バイオセンサーは、脂質膜の最初の面に塗布されるサンプルの分析分子の存否を感知しうるゲート・イオンチャネルを含む脂質膜から成り、その脂質膜は一対の電極の間に配置され、そこでは多孔質ゲルの最初の層が脂質膜の最初の面に塗布される。本発明によるバイオセンサーは主として、脂質膜に塗布される多孔質ゲルの最初の層が膜を物理的接触で生じる物理的損傷と乾燥から守り、しかもサンプルに含まれる分子が脂質膜にアクセスできるようにするという点でメリットがある。バイオセンサーの乾燥によって膜がだいなしになることがないので、バイオセンサーを乾燥状態で包装して貯蔵し、使用直前に再水和させることができる。膜をより一層保護して隣接電極からの必要な分離をし、さらにその電極が必要とするイオンをたくわえておくために、脂質膜の二番目の面に二番目のゲル層を塗布することが望ましい。このゲルは、生体親和性のある多孔質ゲルが望ましく、最も望ましいのはヒドロゲルである。適切なゲル材料としては、アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、でんぷん、セルロース、もしくはカルボキシメチル誘導体等のこれらの誘導体、あるいはポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールなどの吸水膨張性有機ポリマーなどがある。特に望ましいゲル材料はアガロースである。とりわけ適切と考えられるその他のゲル材料には、ポリアクリルアミド・ゲルが含まれる。とりわけ最初のゲル層の厚みは、約１ｋＤの生体分子の拡散が比較的短時間、たとえば５分未満で生じる程度が望ましく、より望ましいのは２分未満である。最初のゲル層と二番目のゲル層の厚みは５mm未満が望ましく、できれば０．１〜２mm、最も望ましいのは約１mmである。脂質膜は、二重層の両親媒性分子が望ましく、最も望ましいのはホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンのような一以上のリン脂質である。この脂質は鎖の長さがＣ₁₂〜Ｃ₂₂の炭化水素の尾を持つことができ、最も望ましいのはＣ₁₂〜Ｃ₁₈である。特に望ましいリン脂質はジオレイルホスファチジルコリンである。その他の使用可能な膜形成分子には、親水基を持つ疎水性ポリマー・チェーンなどの両親媒性ポリマーが含まれる。そうしたポリマーの一例は、ホスファチジルコリン基を持つポリシロキサンである。たとえば膜結合タンパク質のような、ゲート・イオンチャネルを定義する適切な分子が、脂質膜に組み込まれる。脂質膜と二番目のゲル層の間に、不活性で不透過性材料の有孔シートをはさむことが望ましい。それに適した材料は、ポリテトラフルオロエチレンである。このシートの厚みは、たとえば約１００μm未満と薄い方が望ましく、より好ましい厚みは約１０μmである。このシートは、直径１０〜２００μmの穴が一以上あるものが望ましく、直径が５０〜１００μm程度であればより好ましい。この材料のシートにより、シートの穴の部分でのみ電極間に電流が流れる。脂質膜は、ゲート・イオンチャネルを定義する分子と膜形成脂質を溶媒で溶かし、そうして作られた溶液を二番目のゲル層（か二番目のゲル層に接する不活性材料の有孔シート）に塗布することによって作ることができる。水との実質的な不混和性を条件として、適切なあらゆる溶媒を使うことができる。水素結合を開始する能力のある極性溶媒が好ましい。というのは、それを使うことによって溶液の表面を完全にカバーするための強力な駆動力が得られるからである。特に好ましい溶媒はクロロホルムである。この溶液の濃度は、０．０１〜５％w/vが望ましく、たとえば約０．２％w/vのように１％w/ v未満がより望ましい。しかし、上記の脂質膜形成法は必ずしも妥当ではないかも知れない。たとえばいくつかの配位子ゲート・チャネル・タンパク質はクロロホルムで変性する可能性がある。そうした場合に妥当な脂質膜の別の形成法には、ゲート・イオンチャネルを定義する分子と膜形成脂質を含む転相ミセル溶液か乳剤を作ることが伴い、ミセル溶液や乳剤は炭化水素連続相を持つ。望ましい炭化水素はアルカンだが、ヘキサンが最も望ましい。すぐ上のパラグラフで述べた別の形成法があてはまる可能性のある一つの機能的配位子ゲート・チャネル・タンパク質は、ニコチン性アセチルコリン受容体（ nAChR−G.Puu等のBiosens,Bioelectron.10(1995),463を参照）である。わずかな変型が数多くあるこの神経受容体は神経系を持つほとんどの動物に見られ、非常に豊富な供給源は普通の大理石模様のエイTorpedo marmorataの電気器官にある。エイの電気器官を均質化し、膜結合留分を分離するためにＣ₅Ｃｌグラディエントで遠心分離することによって得られる生のエキスは、基本的に水様の連続相を持つ。水の割合を減らすことによって、乳剤を転相し、脂質膜を作るのに必要な特性を持つ炭化水素連続相の転相乳剤をそれから作ることが可能である。電極は、一般的に従来の形の貴金属電極が望ましい。最も好ましい電極は、雲母などの適切な基板のシート上に形成された銀／塩化銀の電極である。脂質膜の最初の面にある電極には、サンプル挿入ポートの役目をする開口部を作るのが望ましい。そのデバイスが上記のような有孔材料シートから成る場合には、開口部は穴と一直線になることが望ましい。本発明はさらに、サンプルの分析分子を定性的・定量的に測定する方法を提供し、この方法は、本発明の最初の側面に準拠したバイオセンサーで多孔質ゲルの最初の層にサンプルを塗布することから成る。本発明のバイオセンサーは、一層の多孔質ゲルを二つの平面電極のそれぞれに塗布し、脂質分子を含む溶液か乳剤を二番目のゲル層にかけ、次にゲル層が間に配置されるように一方の電極を他方の電極の上にのせることによって組み立てることが最も望ましい。一般にバイオセンサーは、脂質膜が自然に形成されるような条件下で組み立てられる。単一層の脂質は、溶液か乳剤とそれぞれのゲル層の間の界面で形成される。大部分の溶液か乳剤はゲル層の間から噴出するか蒸発するので、これら二つの単一層が一緒になって脂質膜二重層が形成される。本発明の望ましい具体的記述は、これから添付の図に関する例のみを使って詳細におこなう。図１は、本発明に準拠したバイオセンサー・セルの側面断面の概略図である。図２は、脂質二重層付きとなしの、図１で示したタイプのセルを使って測定したセル抵抗（対数抵抗目盛り）の柱状図を示す。図３は、グラミシジンに長期にわたってさらした後に図１のセルを使って測定したセル抵抗（対数目盛り）の、抵抗がその究極の値に達するのにかかる時間に対する散布図を示す。まず図１に関して、本発明に準拠したバイオセンサー・セルが、下記のように雲母基板１ａと２ａ上に形成された一対の平面の銀／塩化銀電極の間に形成される。上方の雲母基板１ａには、テスト・サンプルを差し込むことのできる直径３ mmの開口部３が１個ある。電極１と２の間の空間は、脂質二重層７が形成される上面上の厚さ１０μmのPTFEシートで分離される（下記の記述通りに調製される）アガロース・ゲルの一番目と二番目の層４と５で満たされる。シート６には、穴１０が一以上あけてある。銀のワイヤ８と９は、電極１と２に接続される。ゲル・シートの形成重量で１％のアガロース、重量で１０％のグリセロール、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍの塩化カリウム、０．０１Ｍの塩化カルシウム、および残りの超純水の混合物を沸点まで加熱した。まだ液体の間にその混合物をピペットで親水性のグラス・モールドか表面（一般に６ml）に移して、固まるまで放置した。ゲル・シート４と５は、最初にできたときには厚さ１mmだった。それらは、大気層流（公称２３℃、相対湿度５０％）の下で完全に乾燥するまで放置された。電解質（超純水中の０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍ塩化カルシウム）による再水和の後に、ゲルをその基板から取り除いた。電極の形成銀／塩化銀の電極１と２は以下のように作られた。新しく裂いた雲母片１ａと２ａに必要な穴をあけた(一般に数センチメートルのサイズの雲母片に直径３mm の穴)。それらを水洗いして、クロロホルムとメタノールで別々に音波破砕した。直径１２．５μmの銀線８と９を表面にのせて、次にそれに銀のコーティングをほどこし、放置して乾燥させ、銀線８と９を固定した。はじめに１０ｓの陰極として、次にさらに１０ｓの陽極として、ステンレススチールの対電極を使って９Ｖで１Ｍの塩化水素で電気分解して、表面を塩化物処理した。上記パラグラフで述べた再水和ゲル層４と５は、銀の面と接触させて置かれた。バイオセンサー・セルの組み立て厚さ１０μmのPTFEフィルム６をセンチメートル・サイズの切片にして、赤熱タングステンの先端で穴をあけた。その結果得られた穴は、一般的に直径５０〜１００μmだった。クロロホルム１リットル当たり２０gの濃度のＬ，α−ジオレイルホスファチジルコリンから、展布溶液が作られた。図１で示された構造物を、以下のように組み立てた。穴をあけたPTFE片６を、ゲル・コーティング５をほどこした下部電極２にのせた。展布溶液１０μlをPTF E６に散布し、ゲル・コーティング４をほどこした二番目の開口電極１を上にのせ、開口部３がPTFEシート６の穴と一直線になるようにした。測定測定のために、上記手順で作った電解二重層セルを電気絶縁箱に入れ、テスト溶液一滴を雲母開口部にかけた。セルの抵抗は、Keithleyモデル１７５デジタル・マルチメータで測定した。時間の関数としての電流変動を測定するために、１．０ＧΩのトランスインピーダンスのBio-Logic BLM-120二重層膜増幅器を使って、セル電流を電圧に変換した。出力電圧は、Cambridge Electronic Design 14 01 Plusマルチチャネル・アナライザでデジタル化し、CDRプログラムを動作させるコンピュータで運転記録をした。図２は、脂質膜なしでおこなった測定結果と比較した、上記のとおりに準備したセルの抵抗の６回の測定結果を示す。示されているとおり、脂質膜の効果は、測定抵抗をかなり増すことである。図３は、グラミシジン-Ｄの１g/l溶液に長い間さらした後に、上記のように準備したセルの測定抵抗値を示す。タンパク質の効果は、セル抵抗を減らすことである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月１日（１９９９．６．１）【補正内容】請求の範囲１．多孔質ゲルの最初の層が脂質膜の最初の面に塗布され、多孔質ゲルの二番目の層が脂質膜の二番目の面に塗布される、一対の電極の間に配置された脂質膜の最初の面に塗布されるサンプルの分析分子の存否を感知しうるゲート・イオンチャネルを含む脂質膜から成るバイオセンサー。２．ゲルがヒドロゲルである請求の範囲１に記載のバイオセンサー。３．ゲルの最初の層が、約１ｋＤの生体分子の拡散を５分未満で起こさせうるような、上記請求の範囲の何れか一つに記載のバイオセンサー。４．脂質膜の脂質がＣ_12-22の長鎖の炭化水素尾部を持つ、上記請求の範囲の何れか一つに記載のバイオセンサー。５．二つの平面電極のそれぞれに一層の多孔質ゲルを塗布し、脂質溶液を多孔質ゲル層の一つにかけ、次に一つの電極を他方の上にのせて、ゲル層がそれらの間に配置されて脂質膜で分離されるようにすることから成るバイオセンサー組み立て法。６．脂質膜形成の前に、ゲート・イオンチャネルを定義する膜形成脂質と分子を溶媒で溶かす、請求の範囲５に記載の方法。７．溶媒がクロロホルムである、請求の範囲６に記載の方法。８．脂質膜の形成の前に、ゲート・イオンチャネルを定義する膜形成脂質と分子が、アルカンに富む連続相の転相乳剤に組み込まれる、請求の範囲５に記載の方法。９．このアルカンがヘキサンである、請求の範囲８に記載の方法。１０．請求の範囲１〜４に記載の何れかのバイオセンサーで多孔質ゲルの最初の層にサンプルを塗布することから成る、サンプルの分析分子を定質的・定量的に測定する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．多孔質ゲルの最初の層が脂質膜の最初の面に塗布される、一対の電極の間に配置された脂質膜の最初の面に塗布されるサンプルの分析分子の存否を感知しうるゲート・イオンチャネルを含む脂質膜から成るバイオセンサー。２．ゲルの二番目の層が脂質膜の二番目の面に塗布される、請求の範囲１に記載のバイオセンサー。３．ゲルがヒドロゲルである、上記各請求の範囲の何れかに記載のバイオセンサー。４．ゲルの最初の層が、約１ｋＤの生体分子の拡散を５分未満で起こさせうるような、上記各請求の範囲の何れかに記載のバイオセンサー。５．脂質膜の脂質がＣ_12-22の鎖長さの炭化水素尾部を持つ、上記各請求の範囲の何れかに記載のバイオセンサー。６．二つの平面電極のそれぞれに一層の多孔質ゲルを塗布し、脂質溶液を二番目のゲル層にかけ、次に一つの電極を他方の上にのせて、ゲル層がそれらの間に配置されて脂質膜で分離されるようにすることから成るバイオセンサー組み立て法。７．脂質膜形成の前に、ゲート・イオンチャネルを定義する膜形成脂質と分子を溶媒で溶かす、請求の範囲６に記載の方法。８．溶媒がクロロホルムである、請求の範囲７に記載の方法。９．脂質膜の形成の前に、ゲート・イオンチャネルを定義する膜形成脂質と分子が、アルカンに富む連続相の転相乳剤に組み込まれる、請求の範囲６に記載の方法。１０．このアルカンがヘキサンである、請求の範囲９に記載の方法。１１．請求の範囲１〜５に記載の何れかのバイオセンサーで多孔質ゲルの最初の層にサンプルを塗布することから成る、サンプルの分析分子を定質的・定量的に測定する方法。