JP2002502237A

JP2002502237A - Methods for generation and purification of nucleic acid molecules

Info

Publication number: JP2002502237A
Application number: JP54938098A
Authority: JP
Inventors: イー．グルーバー，クリスチャン; エイ．ジェシー，ジョエル
Original assignee: ライフテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2002-01-22
Also published as: EP0981535A4; WO1998051699A1; EP0981535A1; CA2287525A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸分子の生成および単離のための方法に関する。特に、本発明は、mRNA分子の単離、ならびに１本鎖および２本鎖であり得る核酸分子（例えば、cDNA分子またはライブラリー）の生成および単離に関する。さらに、本発明は、分子の集団を含み得るサンプルからの、目的の特定の核酸分子の選択および単離に関する。詳細には、本発明は、アフィニティー標識されたプライマー−アダプター分子に関し、これはこのような核酸分子の改善された単離および生成を可能にし、産物回収および単離のスピードの両方を増加する。 (57) [Summary] The present invention relates to a method for the production and isolation of a nucleic acid molecule. In particular, the invention relates to the isolation of mRNA molecules, and the generation and isolation of nucleic acid molecules (eg, cDNA molecules or libraries) that can be single- and double-stranded. Further, the invention relates to the selection and isolation of a particular nucleic acid molecule of interest from a sample that may contain a population of molecules. In particular, the present invention relates to affinity-labeled primer-adapter molecules, which allow for improved isolation and production of such nucleic acid molecules, increasing both the speed of product recovery and isolation.

Description

【発明の詳細な説明】核酸分子の生成および精製のための方法発明の分野本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野にある。本発明は特に、核酸分子の生成および単離にために有用な方法に関する。特に、本発明は、mRNA分子の単離、ならびにcDNAライブラリー（１本鎖および２本鎖）の生成および単離に関する。さらに、本発明は、分子の集団を含み得るサンプルからの、目的の特定の核酸分子の選択および単離に関する。具体的には、本発明は、このような核酸分子の改善された単離および生成を可能にする、アフィニティー標識されたプライマーアダプター分子の使用に関し、産物回収および単離のスピードの両方を増加させる。発明の背景 cDNAおよびcDNAライブラリー生物体、組織、または細胞の構造および生理学を試験することにおいて、その遺伝子成分を決定することが、しばしば所望される。生物体の遺伝子のフレームワークは、生物体の体細胞および生殖細胞において含まれるデオキシリボ核酸（ DNA）中のヌクレオチド塩基の２本鎖配列においてコードされる。DNAの特定のセグメントの遺伝子の成分、あるいは遺伝子は、遺伝子がコードするタンパク質生成の際に、明らかにされるのみである。タンパク質を生成するために、DNA二重らせんの一方の鎖の相補的なコピー（「コード」鎖）は、ポリメラーゼ酵素によって生成され、リボ核酸（RNA）の特定の配列を生じる。この特定のタイプのRNA は、タンパク質の生成のためのDNAからの遺伝子メッセージを含むので、メッセンジャーRNA（mRNA）と呼ばれる。所定の細胞、組織、または生物体内に、無数のmRNA種が存在し、それぞれは、別個のおよび特定のタンパク質をコードする。この事実は、組織または細胞における遺伝子発現を研究することに興味がある研究者に、強力な道具を提供する-- mRNA分子は、種々の分子生物学的技術によって、単離され得、そしてさらに操作され得、それによって、細胞、組織、または生物体の完全に機能的な遺伝子成分の解明を可能にする。遺伝子発現の研究に対する１つの共通のアプローチは、相補性DNA（cDNA）クローンの生成である。この技術において、生物体からのmRNA分子は、生物体の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離は、しばしば、固体クロマトグラフィーマトリクス（例えば、セルロースまたはセファロース）を用い、これに対してチミジン（T）のオリゴマーが複合体化されている。全ての真核生物mRNA 分子における３'末端は、アデノシン（A）塩基の列を含み、そしてAはTに結合するので、mRNA分子は、組織または細胞抽出物中の他の分子および物質から迅速に精製され得る。これらの精製されたmRNA分子から、cDNAコピーが、逆転写酵素（ RT）活性を有する酵素を使用して作製され得、mRNA鋳型の全てまたは一部に相補的な１本鎖cDNA分子の生成を生じる。適切な条件下で１本鎖cDNAをインキュベートすることは、２本鎖DNAの合成を可能にし、これは次いで、プラスミドまたはベクターに挿入され得る。この全体のプロセス、mRNAの単離から、プラスミドまたはベクターにcDNAを挿入して、単離された遺伝子を含有する宿主細胞集団の増殖までは、「cDNAクローニング」と呼ばれる。cDNAが多くの異なるmRNAから調製される場合、得られるcD NAのセットは、「cDNAライブラリー」と呼ばれ、供給源の細胞、組織、または生物体に存在する機能的な遺伝情報（遺伝子）の異なる集団を示すので、適切な用語である。これらのcDNAライブラリーの遺伝子型解析は、それらが由来する生物体の構造および機能に対する多くの情報を得ることができる。伝統的な生成法において、cDNA分子は、サイズ分画されなくてはならず、そして複数のフェノール／クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿が行われなくてはならない。これらの要件のそれぞれは、複数の抽出／沈殿に起因するサンプル欠損およびcDNA収量における制限のような固有の不利益を有する（Lambert，K.N .およびWilliamson，V.M.、Nucl.Acids Res．21（3）：775-776（1993））。これらの不利益は、文献において、部分的に取り組まれてきた。例えば、幾人かの研究者らは、オリゴ（dT）と結合されたラテックスまたは常磁性ビーズにmR NAを結合することによる、細胞および組識サンプルからのポリA+ mRNAの単離のための方法を報告し；次いで、１本鎖cDNA分子は、これらの固定されたRNA分子の逆転写によって生成され得る（Lambert，K.N.およびWilliamson，V.M.、Nucl ．Acids Res．21（3）：775-776（1993）；Kuribayashi-Ohta，K.ら、Biochim． Biophys．Acta 1156：204-212（1993）；Sasaki，Y.F.ら、Nucl.Acids Res．22 （3）:413-419（1996）；Fellman，F.ら、BioTechniques 21（5）:766−770（19 96））。このような固相合成法は、伝統的な方法の抽出／沈殿工程から生じる収量制限をほとんど受けない。しかし、これらの方法はなお、いくつかの重要な制限を有する。例えば、これらの方法のそれぞれは、cDNA分子のクローニングの前のPCR増幅に依存し、しばしば、偏りのあるcDNAライブラリーを生じる（すなわち、高度に発現される配列は、より低い量で発現される配列よりも優勢である）。さらに、これらの方法は、しばしば、鋳型に対するプライマー−アダプターの溶液ハイブリダイゼーションを使用する従来のcDNA合成よりも効率的でない（すなわち、ハイブリダイゼーション比率の増加のために回転拡散が必要とされる；Schmitz，K.S.およびSchur r，J.M.、J．Phys．Chem．76:534-545（1972）；Ness，J.V.およびHahn，W.E.、 Nucl.Acids Res．10（24）:8061-8077（1982））。最後に、上記の技術は、さらなるプロセシングのために、固相から新生のcDNA分子を遊離させるために熱変性または化学的な変性を使用し、これは、産物の欠損および／または損傷を生じ得る。従って、少量のRNA（全RNAまたはポリA+ mRNA）からの核酸分子の迅速で、高収量の合成、単離、および操作を提供する方法についての必要性が、当該分野において存在する。本発明は、このような方法を提供する。発明の要旨本発明は、少量の投入量核酸分子からの、核酸分子（１本鎖および２本鎖）の生成および単離のために有用な方法に関する。より詳細には、本発明は、リガンドが結合されたプライマー−アダプター分子を使用することによる、RNA鋳型（例えば、１本鎖mRNAまたはポリA+ RNA）からの、cDNA分子（１本鎖および２本鎖）の生成のための方法を提供する。このようなプライマー−アダプター分子はまた、RNA含有サンプルからmRNAまたはポリA+ RNA分子を単離するために、本発明に従って使用され得る。具体的には、本発明は、核酸分子を生成するための方法に関し、核酸鋳型、好ましくはmRNAまたはポリA+ RNA分子と、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチドならびにプライマーアダプター核酸分子とを、混合する工程を包含し、ここでプライマー−アダプター核酸分子は、１つ以上のリガンド分子および１つ以上の切断部位（好ましくは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位またはエンドヌクレアーゼ切断部位）を含有する。このプライマー−アダプターは、鋳型の任意の部分にハイブリダイズするように設計され得る。適切な条件下でのインキュベーションの際に、鋳型の全てまたは一部に相補的な第１の核酸分子（例えば、１本鎖cDNA）が、作製される。この第１の核酸分子は、第１の核酸分子および／または第１の核酸分子にハイブリダイズされる任意の核酸分子の単離を容易にするプライマー−アダプターを含む（好ましくは、その末端で、またはその末端近くで）。従って、第１の核酸分子（例えば、１本鎖cDNA）が、第２の核酸分子を作製するための鋳型として作用する場合（例えば、２本鎖cDNAのような２本鎖分子を形成する）、２本鎖分子は、分子中に含まれるプライマー− アダプター分子を使用して単離され得る。同様に、第１の核酸分子の合成の間に形成された鋳型−第１の核酸のハイブリッドが、単離され得る。所望される場合、プライマー−アダプターは、核酸合成の間の任意の工程または複数の工程で含まれ得る。例えば、プライマー−アダプター分子は、第１、第２、第３、第４などの合成工程の間に添加され得るか（第１の合成工程は、鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を作製する）、または複数のもしくは全ての合成工程において添加され得る。プライマー−アダプター分子を用いる複数の合成は、１つよりも多いプライマー−アダプターを有する合成された核酸分子を生じ得る。 RNAを含有するサンプルから、mRNAまたはポリA+ RNAを単離するために、１つ以上のmRNAまたはポリA+ RNA特異的プライマー−アダプターが使用される。このようなプライマー−アダプターは、mRNAおよび／またはポリA+ RNAにハイブリダイズして、プライマー−アダプター／ポリA+ RNAのハイブリッドを形成する。次いで、プライマー−アダプターは、サンプルからのmRNAおよび／またはポリA+ R NAの単離を容易にし得る。本発明のこの局面は、プライマー−アダプターが、目的の分子にハイブリダイズし、そして変性によって除去され得るので、プライマー−アダプターにおける切断部位は必要とされない。本発明のプライマー−アダプター分子はまた、特異的な核酸配列を単離するために使用され得る。目的の１つ以上の配列にハイブリダイズし得る１つ以上の標的特異的プライマー−アダプターを使用することによって、本発明は、核酸分子の集団からの特異的な核酸分子（例えば、遺伝子またはその部分）の選択および単離を可能にする。本発明によれば、２つ以上のこのような標的特異的プライマー−アダプター（それぞれ、異なる配列に指向される）の使用は、目的の１つよりも多い異なる配列の選択を可能にする。あるいは、目的の配列の異なる部分に指向される２つよりも多い標的特異的プライマー−アダプターは、バックグラウンド混入を減少することによって、このような配列の選択を容易にする。本発明のこの局面において、標的特異的プライマー−アダプターは、所望の分子にハイブリダイズし、そして変性によって除去され得るので、標的特異的プライマー− アダプターにおける切断部位は、必要とされない。本発明によれば、プライマー−アダプター分子は、プライマー−アダプターのリガンド部分に依存することによって、このようなプライマー−アダプターを含有する分子の単離を容易にする。プライマー−アダプターが、核酸分子に結合される（ハイブリダイズされるまたは合成の間に取込まれる）後、プライマー−アダプターのリガンド部分は、プライマー−アダプターを含有する分子の選択的な単離を可能にする。このような単離は、リガンド−ハプテン相互作用によって達成され得、ここでは、ハプテンは、例えば、固体支持体に結合される。いったん固体支持体に結合されると、目的の分子（プライマー−アダプターを含有する核酸分子）は、混入する核酸およびタンパク質から、溶液、好ましくは、緩衝液または水で支持体マトリクスを洗浄することによって、分離され得る。次いで、プライマー−アダプター内の１つ以上の切断部位の切断は、固体支持体からの目的の核酸分子の回収を、リガンドが固体支持体のハプテンに結合されたままで可能にする。あるいは、プライマー−アダプターが、目的の核酸分子にハイブリダイズされる場合、単離は、所望の分子からのプライマー−アダプターの変性によって、および／またはプライマー−アダプター分子内の切断部位の切断によって、達成され得る。本発明における使用のために好ましい固体支持体としては、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、またはマイクロタイタープレート、および最も好ましくは、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズが挙げられ、これらはリガンド分子を特異的に認識および結合する１つ以上のハプテン分子を含むが、これらに制限されない。本発明のこの局面に従う特に好ましいハプテン分子としては：（ｉ）アビジンおよびストレプトアビジン；（ii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；（iii）酵素特異的基質：（iv）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和化タンパク質（ENP）；（ｖ）Fe⁺⁺⁺；（vi）トランスフェリンレセプター；（vii）インスリンレセプター；（viii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）レセプター；（ix）CD4；（x）スペクトリンまたはホドリン；（xi）ICAM-IまたはICAM-2 ；（xii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xiii）アンキリン；（x iv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、α₆β₁、α₇β₁、およびα₆β₅；（ xv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xvi）インテグリンα₃β₁、α₄β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆ ；（xvii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xviii）ビトロネクチン；（xix ）フィブロネクチン；（xx）コラーゲン；（xxi）ラミニン；（xxii）グリコホリン；（xxiii）Mac-1；（xxiv）LFA-1；（xxv）βアクチン；（xxvi）gp120；（xxvii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）：（xxviii）インスリン；（xxix）フェロトランスフェリン；（xxx）アポトランスフェリン；（xxxi）リポ多糖；（xxxii）酵素；（xxxiii）抗体；ならびに（xxxiv）ビオチンが挙げられるが、これらに制限されない。上記のハプテン分子に順に対応する、本発明に従う使用のために特に好ましいリガンド分子としては：（ｉ）ビオチン；（ii）抗体；（iii）酵素；（iv）リポ多糖；（ｖ）アポトランスフェリン；（vi）フェロトランスフェリン；（vii ）インスリン；（viii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（ix）gp120；（ｘ）β-アクチン；（xi）LFA-1；（xii）Ma c-1；（xiii）グリコホリン；（xiv）ラミニン；（xv）コラーゲン；（xvi）フィブロネクチン；（xvii）ビトロネクチン；（xviii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xix）インテグリンα₃β₁、α₄β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_I _Ib β₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xx）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xxi）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、α₆β₁、α₇β₁ 、およびα₆β₅；（xxii）アンキリン；（xxiii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xxiv）ICAM-1またはICAM-2；（xxv）スペクリンまたはホドリン；（xxvi）CD4；（xxvii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）のレセプター；（xxviii）インスリンレセプター；（xxix）トランスフェリンレセプター；（xxx）Fe⁺⁺⁺；（xxxi）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和化タンパク質（ENP）；（xxxii）酵素特異的基質；（xxxiii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；ならびに（xxxiv）アビジンおよびストレプトアビジンが挙げられるが、これらに制限されない。従って、本発明は、核酸分子を作製するための方法に関し、以下（ａ）ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチドと、核酸鋳型ならびに本発明のプライマー−アダプターとを、混合する工程；ならびに（ｂ）プライマー−アダプターを含有する（好ましくは、その５'もしくは３' 末端で、またはその末端近くで）、ならびに鋳型の全ておよび一部に相補的である第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程を包含する。DNAポリメラーゼが、本発明に従って使用される場合、プライマー−アダプターは、３'末端で、または３'末端近くに位置され得、一方、逆転写酵素が使用される場合、プライマー−アダプターは、合成される核酸分子の５ '末端で、または５'末端近くに位置され得る。本発明によれば、第１の核酸分子は、第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第２の核酸分子を作製するために、鋳型として使用され得る。この合成において、プライマー−アダプターが使用される場合、各末端で、またはその末端近くで、プライマー−アダプターを含む２本鎖核酸分子が生成されるが、分子の異なる鎖においてである。しかし、プライマー−アダプターは、この第２の合成から除外され得、それによって、一方の末端でプライマー−アダプターを有する２本鎖核酸分子が提供される。所望される場合、本発明のプライマー−アダプターは、核酸分子を増幅するための方法において使用され得る。このような方法は、以下（ａ）ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチドと、核酸鋳型ならびに２っ以上のプライマー−アダプターとを、接触させる工程；ならびに（ｂ）鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程を包含する。このような増幅方法は、具体的に、以下（ａ）増幅される２本鎖核酸分子と、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有するポリペプチド、２本鎖分子の第１の鎖の部分に相補的な第１のプライマー−アダプター、ならびに２本鎖分子の第２の鎖の部分に相補的な第２のプライマー−アダプターとを、接触させる工程；（ｂ）第１のプライマーアダプターを含有し、および第１の鎖の全てまたは一部に相補的である第３の鎖の核酸分子、ならびに第２のプライマー−アダプターを含有し、および第２の鎖の全てまたは一部に相補的である第４の鎖の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程；（ｃ）第２の鎖と第４の鎖とを、および第１の鎖と第３の鎖とを変性させて、１本鎖核酸分子を形成する工程；ならびに（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の工程を、１回以上反復する工程、を包含する。本発明のこの局面において、第１のプライマー−アダプターまたは第２のプライマーアダプターは、核酸分子の合成を開始するための任意のオリゴヌクレオチドプライマーで置きかえられ得る。本発明の好ましい実施態様において、RNA（例えば、mRNAまたはポリA+ RNA）は、DNA合成のための鋳型として使用される。この好ましい方法は、RNA鋳型と、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、およびプライマーとを、混合する工程、ならびにRNA鋳型の全てまたは一部に相補的なDNA（例えば、cDNA）分子を作製するために十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程、を包含する。次いで、合成されたDNA分子は、さらなるDNA合成またはDNA増幅のための鋳型として、使用され得る。本発明のこの局面によれば、cDNAライブラリーは、 RNA分子（例えば、細胞または組織から単離されたRNA）の集団を使用する場合、生成され得る。本発明に従ってmRNAまたはポリA+ RNAを単離するために、方法は、具体的に、以下：（ａ）mRNAおよび/またはポリA+ RNAを含有する（または含有すると思われる）サンプルを得る工程；（ｂ）サンプルと、mRNAおよび/またはポリA+ RNAに選択的に結合し得る１つ以上のプライマーアダプターとを、接触させる工程；ならびに（ｃ）サンプルからmRNAおよび/またはポリA+ RNAを単離する工程、を包含し得る。特定のまたは所望の核酸分子を単離するために、本発明は、具体的に、以下：（ａ）１つ以上の所望の核酸分子を含有する（または含有すると思われる）サンプルを得る工程；（ｂ）サンプルと、１つ以上の所望の核酸分子に選択的に結合し得る１つ以上のプライマー−アダプターとを接触させる工程；および（ｃ）サンプルから所望の核酸分子を単離する工程、を包含する。好ましい局面において、所望の分子を含有するサンプルは、２本鎖または１本鎖cDNA分子の集団である。従って、本発明は、１つ以上の所望の核酸分子を単離する方法であって、以下：（ａ）１つ以上の所望のcDNA分子を含有する（または含有すると思われる）cD NA分子の集団を含有するサンプルを得る工程；（ｂ）サンプルと、１つ以上の所望のcDNA分子に特異的に結合し得る、１つ以上の標的特異的プライマー−アダプターとを、接触させる工程；および（ｃ）サンプルから所望のcDNA分子を単離する工程、を包含する方法に関する。本発明によれば、標的特異的プライマー−アダプターは、cDNA分子がRNA鋳型から合成される後の、特定のcDNA分子の選択において使用され得る（RNA/cDNA２本鎖分子に結合するか、またはRNA鎖の除去後に、１本鎖cDNA分子に結合する）。あるいは、標的特異的プライマー−アダプターは、２本鎖cDNA分子を結合するために使用され得る。このような標的特異的プライマー−アダプターはまた、増幅される核酸分子の集団から、１つ以上の所望の分子を選択するために、本発明に従って使用され得る。本発明はまた、本発明に従って生成されるcDNA分子または核酸分子を含有するベクター（発現ベクターを含む）、およびこれらのcDNA分子、核酸分子、またはベクターを含有する宿主細胞に関する。本発明はまた、組換えポリペプチドの発現に有利な条件下でこれらの宿主細胞を培養する工程、およびポリペプチドを単離する工程を包含する、組換えポリペプチドを生成するための方法を提供し、ならびにこれらの方法に従って生成される組換えポリペプチドを提供する。他の好ましい局面において、本発明は、１つ以上の容器（例えば、チューブ、バイアル、ボトル、アンプルなど）をそこに密接な制限で受けるように区画された運搬手段（例えば、ボックス、カートンなど）を備える、核酸分子またはcDNA 分子の生成のためのキットに関し、ここで第１の容器は、１つ以上のリガンド分子（好ましくは、ビオチン）を含有するプライマー−アダプター分子を含み、このプライマー−アダプター分子は、１つ以上の切断部位、好ましくは１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する。本発明はまた、逆転写酵素活性および／またはポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含み得るさらなる容器を備える、このようなキットに関する。本発明によれば、１つよりも多いポリペプチドが、同じまたは異なる容器において含まれ得る。本発明はまた、本発明のプライマー−アダプターのリガンドを特異的に結合し得る１つ以上のハプテンを有する固体支持体を含み得る、さらなる容器を備えるキットに関する。本発明はまた、本発明のプライマー−アダプターにおける切断部位を認識および切断する１つ以上のエンドヌクレアーゼを含み得るさらなる容器を備えるキットに関する。本発明の他の好ましい実施態様は、以下の図面および発明の説明、ならびに請求の範囲を考慮して、当業者に明らかである。図面の簡単な説明図１は、本発明の方法に従う、２本鎖cDNA分子の生成および単離、ならびにプラスミドベクター（pCMVSP0RT）へのそのライゲーションの説明である。「Ｂ」は、ビオチン分子（従って、cDNA分子のビオチン化の部位）を示し、そして「RE 」は、単離後の固相支持体からのcDNAの回収を容易にするために使用される、制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置を示す。発明の詳細な説明本発明は、高い処理量（high−througout）の様式における、小量のポリA+ RN AまたはmRNAからのcDNAライブラリーの迅速的な生成および単離について特に適する。本発明の好ましい局面において、１本鎖ポリA+ RNAまたはmRNAの集団は、リガンド結合化プライマーアダプター（非特異的または遺伝子特異的）と、溶液中でハイブリダイズされる。本明細書中で使用されるように、用語「プライマー −アダプター」は、鋳型核酸分子（例えば、mRNAまたはポリA+ RNA分子）に特異的に結合（例えば、ハイブリダイズ）し得る核酸分子をいう。本発明の特に好ましい実施態様において、プライマー−アダプターは、鋳型核酸分子の全てまたは部分に相補的な核酸分子の転写、逆転写、重合化、または伸長の開始を可能にする。本発明により、第１鎖および第２鎖のcDNA反応は、好ましくは１つのチューブにおいて行われ、生成される２本鎖cDNAの３'末端、または３'末端近くに、リガンドを導入する。次いで、リガンド結合されたcDNAは、リガンドハプテン相互作用を介してcDNAが結合するハプテンと結合された固体支持体に結合し、それによってcDNAの濃縮、ならびに有機抽出および沈殿を伴わない緩衝液の交換を可能にすることによって単離され得る。続いて、結合されたcDNAは、制限酵素消化によって、固相支持体から解離される。次いで、この非対称性のcDNAは、適切な末端（一方の末端は、cDNAを解離するために使用される制限部位に適合し、および他方の末端は、平滑末端である）を含むベクターに、直接的にクローン化される。ベクターへのクローニングに続いて、またはその前に、特定のcDNA配列（例えば、遺伝子または遺伝子フラグメント）は、本発明の標的特異的プライマー−アダプターを使用して選択的に単離され得る。複数の時間のかかる抽出および沈殿の排除に加えて、本発明の方法は、DNAアダプターについて必要なものおよびcDNA 分画（過剰の連結されないアダプターを除去するために、通常必要な工程）についての必要性を排除する。従って、本発明は、PCR増幅に必要性を伴うことなく、ナノグラム量のポリA+ RNAまたはmRNAから、より多くの量のcDNAの迅速的な生成および単離ならびにcDNAライブラリーの構築を容易にする。本発明はまた、構築されたcDNAライブラリーからの、所望の遺伝子または遺伝子フラグメントの単離を可能にする、単回の選択技術を提供する。核酸鋳型分子の供給源本発明の方法を使用して、核酸分子、および、特に、cDNA分子が、種々の核酸鋳型分子から調製され得る。本発明における使用のために好ましい核酸分子としては、１本鎖または２本鎖のRNAが挙げられる。より好ましい核酸分子としては、ポリアデニル化RNA（ポリA+ RNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、およびリボソームRNA（rRNA）分子が挙げられ、ならびに最も好ましいのは、mRNAおよびポリA+ RNA分子である。本発明の方法による核酸分子またはcDNA分子を調製するために使用される核酸鋳型分子は、当業者に周知の標準的な有機化学合成法に従って、合成的に調製され得る。より好ましくは、核酸鋳型分子は、天然の供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官、または生物体）から得られ得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原核生物（細菌細胞、これには、Escherichia属、Bachillus属、 Serratia属、Salmonella属、Staphylococcus属、Streptococcus属、Clostridium 属、Chlamydia属、Neisseria属、Treponema属、Mycoplasma属、Bprrelia属、Leg ionella属、Pseudomonas属、Mucobacterium属、Heilicobacter属、Erwinia属、A grobacterium属、Rhizobium属、およびStreptomyzes属の種の細胞を含む）、または真核生物（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物、および他の寄生虫、ならびに動物（昆虫（特に、Drosophilla spp.細胞）、線虫（特に、Caenorhabditis ele gans細胞）、および哺乳動物（特に、ヒト細胞）を含む）であり得る。核酸の供給源として使用され得る哺乳動物体細胞としては、血球（網赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系由来）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋からの筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、および骨芽細胞を含む）、ならびに他の間質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）が挙げられる。哺乳動物生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）はまた、上述の体細胞および生殖細胞を生じる前駆体（progenitor）、先駆体（precursor）、および幹細胞であり得るので、本発明における使用のための核酸の供給源として使用され得る。核酸の供給源として使用するために適切なものはまた、哺乳動物の組織または器官である（例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環系、リンパ系、胃腸、および結合組織の供給源由来の組織または器官、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎児に由来する供給源に由来する組織または器官）。任意の上述の原核生物または真核生物の細胞、組織、および器官は、正常であり得るか、罹患され得るか、形質転換され得るか、樹立され得るか、前駆体であり得るか、先駆体であり得るか、胎性であり得るか、または胚であり得る。罹患された細胞は、例えば、感染性疾患（細菌、真菌、もしくは酵母、ウイルス（AI DSを含む）、もしくは寄生虫によって引き起こされる）に関与するか、遺伝的もしくは生化学的病理学（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、もしくは多発性硬化症）に関与するか、またはガン性プロセスに関与する細胞を含み得る。形質転換または樹立された動物細胞株としては、例えば、COS細胞、CHO細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、K562細胞、F9細胞などが挙げられ得る。本発明における使用のための核酸の供給源として適切な他の細胞、細胞株、組織、器官、および生物体は、当業者に明らかである。一旦、開始する細胞、組織、器官、または他のサンプルが得られると、核酸分子（例えば、mRNA）は、当該分野において周知である方法によって、そこから単離され得る（例えば、Maniatis，T.らCell 15:687-701（1978）；Okayama，H．およびBerg，P.、Mol．Cell．Biol．2:161-170（1982）；Gubler，U.およびHoff man，B.J.、Gene 25:263-269（1983）を参照のこと）。考察されるように、本発明は、サンプルからmRNAおよび/またはポリA+ RNAを単離することおける改善を提供する。ポリA+ RNAまたはmRNAを特異的に認識し、そして結合する、本発明のプライマー−アダプターの使用は、このような選択を可能にする。好ましくは、プライマー−アダプターは、mRNAまたはポリA+ RNAのポリAテイルを認識し、そしてこれにハイブリダイズする。このような、プライマー−アダプターとしては、オリゴ（dT）を含有するプライマー−アダプターが挙げられ得る。いったん結合すると、プライマー−アダプターのリガンド部分の使用は、所望のRNA分子の単離を可能にする。次いで、このように単離されるポリA+ RNAまたはmRNA分子は、本発明の方法を使用して、cDNA分子およびcDNAライブラリーを調製するために使用され得る。核酸分子の合成本発明の実施において、１つ以上のリガンド分子を含有する核酸分子、および、特に、cDNA分子またはcDNAライブラリーは、上記のように得られる核酸鋳型（これは、好ましくは、mRNA分子またはポリA+ RNA分子である）と、ポリメラーゼ活性および／または逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドと、本発明の１つ以上のプライマー−アダプターとを混合することによって生成される。投入核酸分子の逆転写および／または重合化に有利な条件下で、鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子の合成が、達成される。本発明において使用される逆転転写酵素および／またはポリメラーゼ活性を有する好ましいポリペプチド（例えば、酵素）としては、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（RSV）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（RAV）逆転写酵素、骨髄芽球症随伴ウイルス（MAV）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Thermus thermophilus（Tth）DNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus（Taq）DNAポリメラーゼ、Thermotoga neopolit ana（Tne）DNAポリメラーゼ、Thermotoga maritima（Tma）DNAポリメラーゼ、Th er mococcus litoralis（TliまたはVENT^TM）DNAポリメラーゼ、Pyrococcus furiosu s（PfuまたはDEEPVENT^TM）DNAポリメラーゼ、Pyrococcus woosii（Pwo）DNAポリメラーゼ、Bacillus sterothermophilus（Bst）DNAポリメラーゼ、Sulfolobus a cidocaldarius（Sac）DNAポリメラーゼ、Thermoplasma acidophilum（Tac）DNA ポリメラーゼ、Thermus flavus（Tfl/Tub）DNAポリメラーゼ、Thermus ruber（T ru）DNAポリメラーゼ、Thermus brockianus（DYNAZYME^TM）DNAポリメラーゼ、Me thanobacterium thermoautotrophicum（Mth）DNAポリメラーゼ、ならびにその変異体、改変体、および誘導体が挙げられるが、これらに制限されない。本発明における使用のために特に好ましいのは、RNase H活性が実質的に減少されるこれらの酵素の改変体である。「RNase H活性が実質的に減少された」酵素によって、野生型のRNase H活性または「RNaseH゛」酵素（例えば、野生型M-MLVまたはAM V逆転写酵素）活性の約20%未満、より好ましくは、約15%、10%、もしくは５%未満、そして最も好ましくは、約２%未満の活性を有する酵素が意味される。任意の酵素のRNase H活性は、例えば、米国特許第5,244,797号において、Kotewicz， M.L.ら、Nucl.Acids Res．16:265（1988）において、およびGerard，G.F.ら、FO CUS14(5):91（1992）（これらの全ての開示は、本明細書中に参考として十分に援用される）において記載されるアッセイのような種々のアッセイによって決定され得る。ハプテン分子が結合する任意のリガンドは、本発明の方法において使用されるリガンド結合プライマー−アダプター分子を形成するために使用され得る。この目的のために適切なリガンドとしては：（ｉ）ビオチン；（ii）抗体；（iii）酵素；（iv）リポ多糖；（ｖ）アポトランスフェリン；（vi）フェロトランスフェリン；（vii）インスリン；（viii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（ix）gp120；（ｘ）β-アクチン；（xi）LF A-1；（xii）Mac-1；（xiii）グリコホリン（glycophorin）；（xiv）ラミニン；（xv）コラーゲン；（xvi）フィブロネクチン；（xvii）ビトロネクチン；（x viii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃；（xix）インテグリンα₃β₁、α₄β₁ 、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xx）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xxi）インテグリンα₁β₁、α₂ β₁、α₃β₁、 α₆β₁、α₇β₁、およびα₆β₅；（xxii）アンキリン；（xxiii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xxiv）ICAM-1またはICAM-2；（xxv）スペクリンまたはホドリン；（xxvi）CD4；（xxvii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）レセプター；（xxviii）インスリンレセプター；（xxix）トランスフェリンレセプター；（xxx）Fe⁺⁺⁺；（xxxi）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和タンパク質（ENP）；（xxxxii）酵素特異的基質；（xxxiii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；ならびに（xxxiv）アビジンおよびストレプトアビジンが挙げられるが、これらに制限されない。本発明の方法における使用のために最も好ましいのは、ビオチンである。リガンド結合プライマー−アダプター核酸分子は、１つ以上のリガンド分子がプライマー−アダプター分子の１つ以上のヌクレオチドに付着され（好ましくは、共有結合的に）（例えば、図１を参照のこと）、当業者に周知の従来の有機合成法を使用して、生成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、最初に５'アミノ（NH₂）基を生成し、次いでCab-NHSエステルを付加することによって、５'末端でビオチン化され得る（Langer，P.R.ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 78:6633（1981））。本発明の特に好ましい局面において、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、または４つ以上のリガンド分子、最も好ましくはビオチン分子を含有するプライマー−アダプター分子が、調製される。リガンド分子に加えて、プライマー−アダプター分子はまた、好ましくは、１つ以上のエンドヌクレアーゼ切断部位、好ましくは制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。これらの部位は、ハプテン結合化固体支持体からの、プライマー− アダプターを含有する新規に合成される核酸分子の解離を容易にする。本発明に従って使用され得るエンドヌクレアーゼの例としては、GeneIIが挙げられるが、これに制限されない。本発明に従って使用され得る制限エンドヌクレアーゼの例としては、AluI、Eco47III、EcoRV、FspI、HpaI、MscI、NruI、PvuII、RsaI、Sc aI、SmaI、SspI、StuI、ThaI、AvaI、BamHI、BanII、BglII、ClaI、EcoRI、Hind III、HpaII、KpnI、MseI、NcoI、NdeI、NotI、PstI、PvuI、SacI/SstI、SalI、X baI、XhoI、およびI-CeuIが挙げられるが、これらに制限されない。プライマー−アダプター分子中に操作される制限エンドヌクレアーゼ部位は、好ましくは、平滑末端または突出末端のいずれかを生じるように選択される。その認識部位が本発明のプライマー−アダプター分子中に操作され得る、平滑末端制限酵素の例としては、AluI、Eco47III、EcoRV、FspI、HpaI、MscI、NruI、Pvu II、RsaI、ScaI、SmaI、SspI、StuI、およびThaIが挙げられるが、これらに制限されない。その認識部位が本発明のプライマー−アダプター分子中に操作され得る、突出末端酵素の例としては、AvaI、BamHI、BanII、BglII、ClaI、EcoRI、HindIII、H paII、KpnI、MseI、NcoI、NdeI、NotI、PstI、PvuI、SacI/SstI、Sall，Xba、Xh oI、およびI-CeuIが挙げられるが、これらに制限されない。本発明の特に好ましい局面において、プライマーアダプター分子は、まれな切断制限エンドヌクレアーゼ（例えば、８個以上の塩基を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、８塩基対カッターなど））によって認識される部位を含むように操作される。このような制限部位としては、NotI制限部位、I-CeuI制限部位、PI -PspI制限部位、およびI-PpoI制限部位、PI-TliI制限部位、およびPI-FceI制限部位が挙げられ得る。上記の制限酵素、および本発明の方法において等しく使用され得る他の制限酵素は、例えば、Life Technologies，Inc．（Rockville、MD ）から市販されている。制限酵素およびそれらの切断部位の他の例について、Ro berts，R.J.、Nucl.Acids Res.17（補遺）:r347-r387（1989）もまた参照のこと。一旦、リガンド結合化プライマー−アダプター分子が得られると、これは、多数の任意の周知の技術を使用して、投入した核酸から核酸分子を生成するために使用される。このような合成技術としては、核酸鋳型へのプライマー−アダプターのハイブリダイゼーション、および鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を作製するためのプライマー−アダプターの伸長が挙げられる。このような合成は、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTP）、またはそれらの誘導体）、ならびにポリメラーゼおよび／または逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドの存在下で、達成される。本発明のプライマー−アダプターは、周知の技術を使用して、任意の核酸合成反応（cDNA合成を含む）、核酸増幅、および核酸配列決定において使用され得る。cDNAの合成のために、本発明のプライマー−アダプター分子は、cDNA分子もしくはcDNAライブラリーを生成するために、以下の実施例１に記載されるようなcDNA合成の方法、または当該分野において周知の他の方法（例えば、Gubler，U.およびHoffman，B.J.、Gene 25:263-269（1983）；Krug， M.S.およびBerger，S.L.、Meth．Enzymol．152:316-325（1987）；Sambrook，J. ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor、N Y：Cold Spring Harbor Laboratory Press、8.60〜8.63頁（1987））と組合わせて使用され得る。あるいは、本発明のプライマー−アダプター分子は、本発明に従う、cDNAの単一チューブ合成において使用され得る。このアプローチにおいて、投入核酸分子（好ましくは、mRNAまたはポリA+ RNA分子）は、本発明のプライマー−アダプター分子と、溶液中でハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた複合体は、cDNA 合成に必要なdNTPおよび補因子の存在下、逆転写酵素活性を有するポリペプチド（例えば、酵素）（これは、好ましくは、上記の任意のポリペプチドである）と接触される。第１の鎖の合成後、次いで、第２のcDNA鎖が、改変されたGulber-H offman反応（D'Alessio，J.M.ら、Focus 9:1（1987））によって、同じ反応容器中で合成され得る。本発明の方法が有利に使用され得るcDNA合成の他の技術は、当業者に容易に明らかである。核酸分子の単離本発明の方法に従って、１つ以上のプライマー−アダプターを含有する１本鎖および２本鎖の核酸分子（例えば、cDNA分子またはcDNAライブラリー）が、生成される。次いで、このような核酸分子またはライブラリーは、リガンドを結合する１つ以上のハプテン分子を含有する固体支持体に、核酸分子を結合することによって、溶液から迅速的に単離され得る。本発明の実施において、リガンド特異的ハプテン分子が結合され得る任意の固体支持体が使用され得る。好ましいこのような固相支持体としては、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ビーズ、およびマイクロタイタープレートが挙げられるが、これらに制限されない。好ましいものは、ガラス、ラテックス、または磁性材料から作製されるビーズであり、そして特に好ましいものは、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズである。固体支持体へのハプテン分子の結合は、当業者に周知の共有結合、疎水性結合、またはイオン結合のようなハプテン結合の任意の方法（コーティングを含む）によって達成され得る。本発明により、プライマー−アダプター分子に結合される（それゆえ、本発明の方法によって生成される核酸分子中に含まれる）リガンド分子を結合する能力を有する任意のハプテン分子が、使用され得る。本発明における使用のために特に好ましいハプテン分子（これは、上述で列挙されるリガンド分子に順に対応する）としては、：（ｉ）アビジンおよびストレプトアビジン；（ii）プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Fcレセプター、または抗体特異的抗原；（iii）酵素特異的基質；（iv）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和タンパク質（EN P）；（ｖ）Fe⁺⁺⁺；（vi）トランスフェリンレセプター；（vii）インスリンレセプター；（viii）サイトカイン（例えば、増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）のレセプター；（ix）CD4；（x）スペクトリンまたはホドリン；（xi）ICAM-IまたはICAM-2；（xii）C3bi、フィブリノーゲン、または第Ｘ因子；（xiii）アンキリン；（xiv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、 α₆β₁、α₇β₁、およびα₆β₅；（xv）インテグリンα₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、およびα_Vβ₃；（xvi）インテグリンα₃β₁、α₄β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_Vβ₁ 、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、およびα_Vβ₆；（xvii）インテグリンα_Vβ₁およびα_Vβ₃ ；（xviii）ビトロネクチン；（xix）フィブロネクチン；（xx）コラーゲン；（ xxi）ラミニン；（xxii）グリコホリン；（xxiii）Mac-1；（xxiv）LFA-1；（xx v）β-アクチン；（xxvi）gp120；（xxvii）サイトカイン（増殖因子、インターロイキン、またはコロニー刺激因子）；（xxviii）インスリン；（xxix）フェロトランスフェリン；（xxx）アポトランスフェリン；（xxxi）リポ多糖；（xxxii ）酵素；（xxxiii）抗体；ならびに（xxxiv）ビオチンが挙げられるが、これらに制限されない。例えば、プライマー−アダプター分子および新規に合成された核酸分子が、ビオチンを含む、本発明の好ましい局面において、ビオチンを結合するハプテン（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）は、固体支持体に連結され得る。特に好ましいこのような局面において、使用される固体支持体は、アビジンもしくはストレプトアビジンが結合された磁性ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズであり、これらは、例えば、Dynal A.S.（Oslo、Norway）またはSigm a（St．Louis、Missouri）から市販されている。もちろん、ハプテンの選択は、プライマー−アダプター分子の生成において使用されるリガンドの選択に依存し；従って、本発明の方法における使用のために適切なハプテンは、当業者に周知である。本発明の方法によって生成される核酸分子を単離するために、本発明のプライマー−アダプターを含有する核酸分子を含む溶液は、ハプテンによるリガンドの結合に有利な条件下で、ハプテン結合化固体支持体と接触される。代表的には、これらの条件は、緩衝化塩溶液、好ましくは、TRIS-、リン酸-、HEPES-、または炭酸塩-緩衝化塩化ナトリウム溶液、より好ましくは、TRIS-緩衝化塩化ナトリウム溶液、なおより好ましくは、約10〜100mM TRIS-HClと約300〜2000mM NaClとを含有する溶液、および最も好ましくは、約10mM TRIS-HClと約１M NaClとを、約６〜９のpH、より好ましくは、約７〜８のpH、なおより好ましくは、約7.2〜7.6 のpH、そして最も好ましくは、約7.5のpHで含有する溶液中でのインキュベーションを包含する。インキュベーションは、好ましくは、０℃〜約25℃で、そして最も好ましくは約25℃で、約30〜120分間、好ましくは、約45〜90分間、そして最も好ましくは、約60分間、行われ、ハプテン結合化固体支持体へのリガンド結合化核酸分子の結合を可能にした。いったん核酸が、固相支持体に結合されると、所望されない物質または混入物質（例えば、第１および第２の鎖の合成反応からの緩衝液および酵素、転写されない投入RNA分子など）は、上清中のそれらを単に除去することによって、排除され得る。例えば、ビオチン化cDNA分子が、アビジンまたはストレプトアビジン結合化固相に結合される好ましい局面において、混入物は、穏やかに吸引し、そして上清を捨てることによって、除去され得る。アビジンもしくはストレプトアビジンが結合された磁性、常磁性、または超常磁性のビーズが固体支持体として使用される特に好ましいこのような局面において、核酸（例えば、cDNA）を含有するビーズは、磁石（例えば、Manga-Sep Magnetic Particle Separator；Life Technologies，Inc.）を使用して上清から分離され、そして上清は、ピペットを使用して取り除かれる。固体支持体からのそれらの解離の前に、固定化された核酸分子は、好ましくは、所望されない物質をより十分に除去するために、例えば、上記の緩衝化塩溶液の１つで、１回以上洗浄される。一旦、混入物が十分に除去されると、核酸（例えば、cDNA）分子は、認識配列の切断に有利な条件下で、支持体を、上記のようなプライマー−アダプター分子中に操作された配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼ（これは、制限エンドヌクレアーゼであり得る）と接触させることによって、固体支持体から解離され得る。NotIおよび／またはI-CeuI認識配列が、プライマー−アダプター分子中に操作される（従って、これは、新規に合成された核酸（例えば、cDNA）分子中に含まれる）本発明の特に好ましいこのような局面において、固体支持体は、No tIおよび／またはI-CeuIを含有する溶液と接触される。もちろん、固体支持体から核酸分子を解離するために使用される制限酵素の選択は、プライマー−アダプター分子中に操作された特異的な認識部位およびその認識部位が核酸分子中に存在する可能性に依存する。固体支持体からの核酸分子（例えば、cDNAまたはcDNA ライブラリー）の解離のための好ましい条件は、約20℃〜約40℃、好ましくは、約25℃〜約39℃、より好ましくは、約30℃〜約37℃、そして最も好ましくは、約 37℃で、約30〜180分間、好ましくは、約60〜150分間、そして最も好ましくは約 120分間のインキュベーションを包含する。固体支持体からのそれらの解離後、核酸分子（例えば、cDNA分子またはcDNAライブラリー）は、本発明に従って、または文献において周知である技術（例えば、Gubler，U.およびHoffman，B.J．Ge ne 25:263-269（1983）；Krug，M.S.およびBerger，S.L.、Meth．Enzymol．152: 316−325（1987）；Sambrook，J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、第２版、Cold Spring Harbor、NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press、8. 60〜8.63頁（1987））、および当業者に周知の技術によって、加工およびさらに精製され得る。キット本発明はまた、核酸分子（例えば、cDNA分子またはライブラリー）の生成および単離における使用のためのキットを提供する。本発明のこの局面に従うキットは、１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなど）をその中の密接な（close）仕切りの中に有するキャリア手段（例えば、ボックス、カートン、チューブなど）を含み、ここで第１の容器は、１つ以上のプライマー−アダプター核酸分子を含み、このプライマー−アダプター分子は、好ましくは、ビオチン化されたプライマー−アダプター核酸分子である。他の局面において、本発明のキットはさらに、ハプテンが結合された固体支持体を含有する１つ以上のさらなる容器を含み、この固体支持体は、任意の上記の固体支持体であり得、および最も好ましくは、アビジンもしくはストレプトアビジンが結合された磁性、常磁性、または超常磁性のビーズである。さらなる局面において、本発明のキットはさらに、例えば、１つ以上のヌクレオチド（例えば、dNTP、ddNTP、もしくはその誘導体）、または逆転写酵素活性および／またはポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（例えば、酵素）、好ましくは上記のそれらの酵素のいずれかを含む、１つ以上のさらなる容器を含み得る。このようなヌクレオチドまたはその誘導体としては、dUTP、dATP、dTTP、dCTP、cGTP、dITP、7-デアザ-dGTP、α-チオ-dATP、α-チオ-dTTP、α-チオ-dGTP、α-チオ-dCTP、ddUTP 、ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddITP、7-デアザ（deaza）-ddGTP、α-チオ-dd ATP、α-チオ-ddTTP、α-チオ-ddGTP、α-チオ-ddCTP、またはそれらの誘導体（これらの全ては、Life Technologies，Inc.（Rockville、Maryland）、New Engl and BioLabs（Beverly，Massachusetts）、およびSigma Chemical Company（Sai nt Louis，Missouri）を含む供給源から市販されている）が挙げれ得るが、これらに制限されない。本発明に従うさらなるキットは、固体支持体からの、核酸分子（例えば、cDNA分子またはcDNAライブラリー）の解離のために使用される、１つ以上のエンドヌクレアーゼまたは制限酵素を含有する１つ以上のさらなる容器を含み得る。本発明のこの局面により包含されるキットはさらに、核酸逆転写および／または重合化プロトコルを行うために必要な、さらなる試薬（例えば、適切な緩衝液）および化合物を含み得る。使用本発明は、核酸分子の迅速的な生成および単離を必要とする種々の適用において使用され得る。本発明は、mRNAまたはポリA+ RNA分子の単離に、核酸分子の集団からの所望の核酸分子の単離に、および核酸分子（特に、小量のmRNAからの完全長のcDNA分子）の生成に、特に適する。本発明はまた、核酸分子の増幅のための方法に、およびこれらの方法によって増幅された核酸分子に関する。本発明のこの局面により、核酸分子は、当該分野で公知の任意の増幅方法に従って、本発明の核酸分子（例えば、cDNA分子）を増幅することによって、増幅され得る（すなわち、核酸分子のさらなるコピーが調製される）。本発明のこの局面に従う特に好ましい増幅方法としては、PCR（米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号）、Strand Displacement Amplific ation（SDA；米国特許第5,455,166号;EP 0 684 315）、およびNucielc Acid Seq uence-Based Ampllfication（NASBA；米国特許第5,409,818号；EP 0 329 822）が挙げられる。最も好ましいものは、１つ以上のPCR増幅を含むそれらの方法である。本発明はまた、本発明の核酸分子、または増幅された核酸分子を含む組換えベクターを調製するために使用され得る方法、これらの組換えベクターを含む宿主細胞、これらのベクターおよび宿主細胞を使用して組換えポリペプチドを生成するための方法、ならびにこれらの方法を使用して生成される組換えポリペプチドに関する。組換えベクターは、当該分野において周知である方法を使用して、本発明に従って調製された１つ以上の核酸分子または増幅された核酸分子を、ベクターに挿入することによる、本発明のこの局面に従って生成され得る（図１を参照のこと）。本発明のこの局面において使用されるベクターは、例えば、ファージまたはプラスミドであり得、および好ましくはプラスミドである。好ましいのは、目的のポリペプチドをコードする核酸配列に対するシス作用性の制御領域を含有するベクターである。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、補足（complementing）ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自身によって供給され得る。この点に関する特定の好ましい実施態様において、ベクターは、本発明のcDNA 分子または核酸分子の特異的な発現を提供する発現ベクターであり、このベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る。このようなベクターの中で特に好ましいのは、温度および栄養素添加物のような、操作することが容易である環境因子による誘導性のベクターである。本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体-、エピソーム-、およびウイルス-由来のベクター（例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター）、およびそれらの組み合わせに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられ、そして好ましくは、少なくとも１つの選択マーカー（例えば、細菌宿主細胞中での培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子）が挙げられる。このような発現ベクターへの挿入の前に、本発明の核酸分子（例えば、cDNA分子）または増幅される核酸分子は、適切なプロモーター（例えば、ファージλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーターおよびtacプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。本発明における使用のために特に好ましいベクターとしては、pQE70、pQE60、およびpQE-9（Qiagenから入手可能）；pBSベクター、Phagescriptベクター、Blu eScriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）；pcDNA3（Invitorogenから入手可能）;pGEX、pTrxfus、pTrc99a、pET-5、pET-9 、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）；ならびにpS PORT1、pSP0RT2、およびpSV・SPORT1（Life Technologies，Inc.から入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。本発明に従って使用され得る代表的な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに制限されない。好ましい細菌宿主細胞としては、Escherichia ssp.細胞（特に、E.coli細胞および最も特には、E.coliのDH10BおよびStb12株）、Bacillus spp.細胞（特に、B.subtilis およびB.megaterium細胞）、Streptomyces spp.細胞、Erwinia ssp.細胞、Klebs iella spp.細胞、ならびにSalmonella spp.細胞（特に、S．typhimurium細胞）が挙げられるが、これらに制限されない。好ましい動物宿主細胞株としては、昆虫細胞（最も特には、Spodoptera frugiperda Sf9およびSf21細胞、ならびにTrich oplusa High-Five細胞）、ならびに哺乳動物細胞（最も特には、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、およびヒト細胞）が挙げられる。これらのおよび他の適切な宿主細胞は、例えば、Life Technologies，Inc.、アメリカンタイプカルチャーコレクション、およびInvitrogenから市販されている。さらに、本発明は、組換えポリペプチドを生成するための方法、およびこれらの方法によって生成されるポリペプチドを提供する。本発明のこの局面により、組換えポリペプチドは、任意の上述の組換え宿主細胞を、そこからのポリペプチドの生成、およびポリペプチドの単離を有利にする条件下で、培養することによって、生成され得る。組換え宿主細胞を培養するための方法、ならびにそこからのポリペプチドの生成および単離のための方法は、当業者に周知である。他の適用において、本発明の方法は、ポリA+ RNAの複雑な集団から遺伝子特異的cDNAライブラリーを作製するために使用され得る。本発明の方法はまた、AFLP のような多型解析法と組合わせて、異なる２つのDNA集団間の転写の差異の、迅速的なおよび直接的な同定を容易にする。さらに、本発明において使用されるプライマー−アダプターは、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の調節領域）を含むように設計され得る。１つのこのような局面において、T7またはSP6 RNAポリメラーゼについてのプロモーターが、プライマー−アダプター中に操作され得、それによって増幅またはサブトラクションにおける使用のための元のmRNAのさらなるコピーの生成を可能にする。さらに、本発明の方法は、細胞、組織、器官、もしくは生物体からのような、全RNAからポリA+ RNAを単離するために、または全RNAからcDNAライブラリーを直接的に作製するために、使用され得る。後者の適用において、本発明は、目的のmRNAが全RNAのうちのごく微少な画分を示す場合に特に有用であり；本発明によって、この低レベルの mRNAは、全RNAのバックグラウンドから迅速的かつ効率的に単離され得、次いで、種々の目的（例えば、クローニングおよび／または増幅）のために、１本鎖または２本鎖のcDNA分子に、迅速的かつ効率的に逆転写され得る。本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適応は、明白であること、および本発明の範囲またはその任意の実施態様から逸脱することなくなされ得ることが、当業者には容易に明らかである。ここで本発明を、詳細に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照することによってより明らかに理解され、この実施例は、例示の目的のためのみに本明細書中に含まれ、本発明を制限することは意図されない。実施例１：cDNA分子の生成および単離第１鎖および第２鎖のcDNA合成反応を、50〜5000ngのmRNAを、10⁶個を超えるクローンのライブラリーを生成するための開始材料として使用した以外は、SUPE RSCRIPT Plasmid System（Life Technologies，Inc.，Rockville，Maryland）についての指導マニュアルにおいて記載されるように行った。cDNA合成において使用されるプライマー−アダプターは、４つのビオチン（Ｂ）残基を含んだ：B-GA CT（-B）AGT（-B）T（-B）CTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T₁₅)（配列番号１）。簡潔には、１μgのビオチン化されたプライマー−アダプターを使用して、第１鎖の合成を、60分間、50mM TRIS-HCl（pH8.3）、75mM KCl、３mM MgCl₂、10mM DTT、それぞれ500μMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、50μM/ml Bio-p-A、ならびに10,000〜50,000ユニット/ml SuperScript II逆転写酵素（Life Technolog ies，Inc.）を含有する溶液中で、開始した。第２鎖の合成を、以前に記載された方法（Okayama，H.およびBerg，P.、Mol．Cell．Biol．2:161（1982）；Guble r，U.およびHoffman，B.J.、Gene 25:263（1983）；D'Alessio，J.M．ら、FOCUS 9:1（1987））を用いて、25mM TRIS-HCl（pH7.5）、100mM KCl、５mM MgCl₂、10 mM(NH₄)₂SO₄、0.15mM B-NAD+、それぞれ250μMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP 、1.2mM DTT、65ユニット/ml DNAリガーゼ、250ユニット/ml DNAポリメラーゼI 、ならびに13ユニット/ml RNase Hを含有する溶液中で、２時間、16℃にて行った。２時間の第２鎖のcDNA合成反応のうちの最後の30分間の間、ストレプトアビジン常磁性ビーズを調製した。簡潔には、常磁性ビーズ（Life Technologies，Inc .）を再懸濁し、そして150μlのビーズ懸濁液を、各反応についてマイクロ遠心分離チューブ中においた。チューブを、Magna-Sep-Magnetic particle Separato r（磁石）に、２分間置き、そして上清を吸引によって除去した。次いで、ビーズを100μlのTE緩衝液（10mM TRIS-HCl（pH7.5）、１mM EDTA）を各チューブに添加することによって洗浄し、ビーズを再懸濁し、そして上記のように２分後に上清を除去した。洗浄後、ビーズを、160μlの結合緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7 .5）、１mM EDTA、１M NaCl）中に再懸濁し、そしてcDNAを単離することにおける使用まで、25℃で保持した。第２鎖のcDNA合成反応混合物を、T4 DNAポリメラーゼとともにインキュベーションした後、チューブを氷上に置き、そして反応を、10μlの0.5M EDTAの、各チューブへの添加によって終わらせた。次いで、その溶液を、ストレプトアビジンを結合した常磁性ビーズと接触させることによって、ビオチン化cDNA分子を単離した。簡潔には、上記のように調製された160μlのビーズを、cDNA反応混合物チューブに添加し、そしてチューブを穏やかに混合し、そして室温で、60分間、インキュベートした。次いで、チューブを２分間、磁石中に挿入し、その後、上清を除去し、そして捨てた。次いで、ビーズを、100μlの洗浄緩衝液（10mM TRIS- HCl（pH7.5）、１mM EDTA、500mM NaCl）で、穏やかに再懸濁し、続いて磁石中に再挿入することによって洗浄した。２分後、上清を除去し、および捨て、そして洗浄工程を反復した。第２の洗浄後、ビーズを100μlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、新しいチューブに移し、そして上述のように２回洗浄した（磁石への５分間の曝露を伴った）。第２の５分間の洗浄後、上清を除去し、および捨て、そしてcDNA分子を、NotI とのインキュベーションによってビーズから取り出した。簡潔には、50μlのNot I溶液（41μlのオートクレーブした蒸留水、５μlのREact3緩衝液（500mM TRIS- HCl（pH8.0）、100mM MgCl₂、１M NaCl）、および４μlのNotI）を各反応チューブに添加し、そしてチューブを穏やかなピペッティングによって混合した。チューブを、２時間、37℃でインキュベートし、次いで、磁石中に２分間挿入した。 cDNA分子を含有する上清を、新しいチューブに回収し、そしてビーズを、20μl のTE緩衝液中で穏やかに再懸濁し、磁石中に２分間、再挿入し、そしてこの洗浄からの上清を、上述からのcDNA分子を含有する上清と組合わせた。プールした上清を含有する各チューブに対して、70μlのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）を添加し、そしてチューブを、徹底的にボルテックスし、そして室温で、５分間、14,000×gにて遠心分離した。遠心分離後、65μl の上部の水層を各チューブから取り出し、そして新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、そして32μlの7.5M酢酸アンモニウム、１μl（20μg）のグリコーゲン、および250μlの冷（-20℃）無水エタノールを、各チューブに添加した。次いで、チューブを混合し、そしてドライアイス上に、または-70℃で15分間、保存し、次いで、30分間、14,000×gで、４℃にて、遠心分離した。上清を除去し、そして捨て、100μlの70％エタノールを、ペレットに添加し、そしてチューブを、２分間、14,000×gで、室温にて、遠心分離した。上清を除去し、および捨て、そしてペレットを、speed-vac中で乾燥し、次いで、TE緩衝液（50〜200ngの投入mRNAについて10μl、または200〜5000ngの投入mRNAについて100μl）中に溶解した。最終的なcDNA収量を、チェレンコフ計数によって決定した。実施例２：cDNAのベクターライゲーションおよび宿主細胞への導入 10〜50ngのcDNAをベクター（例えば、pCMVSPORT）にライゲーションし、そしてこのライゲーションを、クローニングベクターをNotIおよびSmaIで予め消化したことを除いて、SUPERSCRIPT Plasmid System manual（Life Technologies，In c.）において記載されるように形質転換することによって、E.collに導入した。１つのこのようなライゲーションにおいて、50ngのベクターを、４μlの5×T4 D NAリガーゼ緩衝液（250mM TRIS-HCl（pH7.6）、50mM MgCl₂、５mM ATP、５mM DT T、25%（w/v）PEG-8000）、および１μlのT4リガーゼ（１ユニット）を含有する 1.5mlマイクロ遠心チューブ中で、４℃にて、16時間、cDNAにライゲーションした。実施例３：cDNA収量比較本発明の方法によるcDNA合成の効率および収量を調べるために、cDNAを上記のように生成し、そして生成された量を、代替の市販の系（SUPERSCRIPT Plasmid System：Life Technologies，Inc.、Rockville、Maryland）を使用して得られた量と比較した。簡潔には、pCMV・SPORT-cDNAライゲーションを、MAX EFFICIENCY を含有するプレートに播き、形質転換効率を決定した。各実験について、48個のランダムに選択したコロニーに対して、SP6およびT7プロモータープライマー、ならびに40サイクルのPCRを使用することによって、cDNAインサートをサイズ分離した。表１は、SuperScript Plasmid Systemを使用して得られるcDNA収量に対する、本発明の方法によって得られるcDNA収量の比較を示す。表１．SUPERSCRIPT Plasmid Systemに対する、本発明の比較これらの結果は、本発明が、SUPERSCRIPT Plasmid Systemよりも約３〜４倍優れたcDNAの収量を生成することを実証する。さらに、本発明は、SUPERSCRIPT Pl asmid Systemで得られる形質転換効率および平均インサートサイズに、ほぼ等価な形質転換効率および平均インサートサイズを実証した。従って、本発明は、時間がかかり、そして収量を減少させる、cDNAのサイズ分画工程の使用を伴わない、完全長のcDNA分子の迅速的かつ効率的な生成のための方法を提供する。実施例４：種々の量の投入mRNAを使用する、cDNAの生成および単離本発明の方法が、cDNAを迅速的かつ効率的に生成することが実証されたので、種々の量の投入mRNAからのcDNAを生成することにおける本発明の効果を調べた。これらの研究において、投入mRNAの量を、５ng〜１μgまで変化させ、そしてcDN A収量、形質転換効率、および平均のインサートサイズを、上述のように決定した。結果を、表２に示す。表２．異なる量の投入mRNAを使用した場合のcDNAの収量これらの結果は、本発明が、5ngほど小量の投入mRNAから、大きなcDNAライブラリー（すなわち、10⁵個のクローンを超える）を生成し得ることを実証する。以前は、PCR（cDNAライブラリーを偏らせる(bias)プロセス）が、この小量のRNA からのcDNAライブラリーの生成を可能にした唯一の方法であった。上述の結果を合わせると、これらの結果は、本発明は、種々の量の投入mRNA（低レベルの発現を示し、従って、ポリA+または全RNAプールの小画分のみを示すmRNAを含む）から高品質の、完全長のcDNA分子を、迅速的かつ効率的に生成し得ることを示す。ここで、理解の明瞭さの目的のために、説明および実施例によって、本発明をいくらか詳細に十分に記載したが、本発明の範囲またはその任意の特定の実施態様に影響することなく、条件、処方、および他のパラメーターの広範なおよび等価な範囲内で、本発明を改変または変化することによって、本発明が行われ得ること、ならびにこのような改変または変化は、添付の請求の範囲内に包含されることが意図されることが当業者には明白である。本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術のレベルを示し、ならびに各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参考として援用されることが詳細におよび個々に示されるよのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Methods for generation and purification of nucleic acid molecules Field of the invention The present invention is in the fields of molecular biology and cell biology. The invention particularly relates to nucleic acid components. Methods useful for the production and isolation of offspring. In particular, the present invention relates to mRNA molecules. Isolation and generation and isolation of cDNA libraries (single and double stranded) I do. In addition, the present invention provides a method of identifying a particular target of interest from a sample that may include a population of molecules. It relates to the selection and isolation of nucleic acid molecules. Specifically, the present invention relates to such nucleic acid components. Affinity-labeled plies that allow for improved isolation and production of offspring Increased speed of product recovery and isolation for use of mer adapter molecules Let it. Background of the Invention cDNA and cDNA libraries In examining the structure and physiology of an organism, tissue, or cell, It is often desirable to determine the genetic composition. Biological frame of organism The work is composed of deoxyribonucleic acid contained in somatic cells and germ cells of the organism ( DNA) encoded by a double-stranded sequence of nucleotide bases. A specific section of DNA The components of the gene of the fragment, or the gene, is the protein produced by the gene. It will only be revealed during construction. DNA double to produce protein A complementary copy of one strand of the helix (the “coding” strand) is made by the polymerase enzyme. To produce a specific sequence of ribonucleic acid (RNA). This particular type of RNA Contains the genetic message from DNA for protein production, It is called a changer RNA (mRNA). In a given cell, tissue, or organism, there are countless mRNA species, each of which Encodes distinct and specific proteins. This fact can affect tissues or cells. Provides a powerful tool for researchers interested in studying gene expression in mRNA molecules can be isolated and manipulated by a variety of molecular biological techniques. A fully functional genetic component of a cell, tissue, or organism Enables the elucidation of One common approach to studying gene expression is to use complementary DNA (cDNA) cDNA. Generation of a loan. In this technique, mRNA molecules from an organism are Isolated from vesicle or tissue extracts. This isolation often involves solid chromatography. Use a rough matrix (eg, cellulose or sepharose) On the other hand, an oligomer of thymidine (T) is complexed. All eukaryotic mRNAs The 3 'end of the molecule contains a string of adenosine (A) bases, and A binds to T Therefore, mRNA molecules can be rapidly separated from other molecules and substances in tissue or cell extracts. It can be purified. From these purified mRNA molecules, a cDNA copy is obtained from reverse transcriptase ( RT) can be generated using an active enzyme and complement all or part of the mRNA template This results in the production of a single-stranded cDNA molecule. Incubate single-stranded cDNA under appropriate conditions. To allow the synthesis of double-stranded DNA, which in turn It can be inserted into a vector. From this overall process, mRNA isolation, insert the cDNA into a plasmid or vector. Until the expansion of the host cell population containing the isolated gene, Called "ning". If cDNA is prepared from many different mRNAs, the resulting cD The set of NAs is called a “cDNA library” and is the source cell, tissue, or source. It indicates different populations of functional genetic information (genes) present in the object, Is a word. Genotyping of these cDNA libraries is based on the organism from which they are derived. A great deal of information on body structure and function can be obtained. In traditional production methods, cDNA molecules must be size-fractionated and No phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation Not be. Each of these requirements is for samples resulting from multiple extractions / precipitations. It has inherent disadvantages such as deletions and limitations in cDNA yield (Lambert, K.N. And Williamson, V.M., Nucl. Acids Res. 21 (3): 775-776 (1993)). These disadvantages have been partially addressed in the literature. For example, how many The researchers added mR to latex or paramagnetic beads conjugated to oligo (dT). Isolation of poly A + mRNA from cell and tissue samples by binding NA A single-stranded cDNA molecule is then used to identify these immobilized RNA molecules. (Lambert, K.N. and Williamson, V.M., Nucl. . Acids Res. 21 (3): 775-776 (1993); Kuribayashi-Ohta, K. et al., Biochim. Biophys. Acta 1156: 204-212 (1993); Sasaki, Y.F. et al., Nucl. Acids Res. twenty two (3): 413-419 (1996); Fellman, F. et al., BioTechniques 21 (5): 766-770 (19). 96)). Such solid-phase synthesis methods involve yields resulting from traditional extraction / precipitation steps. Almost no volume limit. However, these methods still have some important limitations. For example, this Each of these methods relies on PCR amplification prior to cloning of the cDNA molecule, and is often Often, a biased cDNA library results (ie, highly expressed sequences). Are dominant over sequences expressed in lower amounts). In addition, these methods , Often primer-adapter solution hybridization to the template Is less efficient than traditional cDNA synthesis using hybridization (i.e., hybridization Rotational diffusion is required to increase the fraction of the fraction; Schmitz, K.S. and Schur r, J.M., J.M. Phys. Chem. 76: 534-545 (1972); Ness, J.V. and Hahn, W.E., Nucl.Acids Res. 10 (24): 8061-8077 (1982)). Finally, the above techniques Heat denaturation to release nascent cDNA molecules from the solid phase for further processing Or using chemical denaturation, which may result in loss of product and / or damage You. Therefore, rapid, high-throughput nucleic acid molecules from small amounts of RNA (total RNA or poly A + mRNA) There is a need in the art for methods of providing yield synthesis, isolation, and manipulation. Exists. The present invention provides such a method. Summary of the Invention The present invention relates to the isolation of nucleic acid molecules (single- and double-stranded) from small input nucleic acid molecules. It relates to methods useful for production and isolation. More specifically, the present invention relates to RNA template (by using a primer-adaptor molecule to which the For example, cDNA molecules (single and double stranded) from single stranded mRNA or poly A + RNA) And a method for the production of (chain). Such a primer-adapter molecule is In addition, the present invention has been used to isolate mRNA or poly A + RNA molecules from RNA-containing samples. Can be used as described. Specifically, the present invention relates to methods for producing nucleic acid molecules, including nucleic acid templates, Preferably mRNA or poly A + RNA molecules and polymerase and / or reverse transcriptase Mixing the active polypeptide and the primer adapter nucleic acid molecule Wherein the primer-adaptor nucleic acid molecule comprises one or more ligands. Molecule and one or more cleavage sites (preferably a restriction endonuclease cleavage site) Position or endonuclease cleavage site). This primer-adapter The key can be designed to hybridize to any part of the template. Appropriate conditions A first nucleic acid complementary to all or a portion of the template upon incubation below A molecule (eg, a single-stranded cDNA) is produced. The first nucleic acid molecule comprises a first nucleus. Acid molecule and / or any nucleic acid molecule that hybridizes to the first nucleic acid molecule. Contains a primer-adapter to facilitate isolation (preferably at its end, Or near its end). Thus, the first nucleic acid molecule (eg, a single-stranded cDNA) When acting as a template for producing two nucleic acid molecules (for example, a double-stranded cDNA To form a double-stranded molecule). It can be isolated using an adapter molecule. Similarly, during the synthesis of the first nucleic acid molecule The formed template-first nucleic acid hybrid can be isolated. If desired The primer-adapter may be included at any step or steps during nucleic acid synthesis. Can be rare. For example, a primer-adapter molecule can be a first, second, third, fourth, Which synthesis steps can be added (the first synthesis step is all or part of the template To produce nucleic acid molecules complementary to), or in several or all synthetic steps Can be added. Multiple syntheses using primer-adapter molecules are more than one Synthetic nucleic acid molecules with as many primer-adapters can result. One to isolate mRNA or poly A + RNA from a sample containing RNA The above mRNA or poly A + RNA specific primer-adapter is used. this Such primer-adapters can hybridize to mRNA and / or poly A + RNA. To form a primer-adaptor / polyA + RNA hybrid. Next Alternatively, the primer-adapter can be used for mRNA and / or polyA + R from the sample. It may facilitate the isolation of NA. This aspect of the invention provides that the primer-adapter is Primers because they hybridize to the target molecule and can be removed by denaturation. --- No cleavage site in the adapter is required. The primer-adapter molecules of the present invention can also be used to isolate specific nucleic acid sequences. Can be used for One or more markers capable of hybridizing to one or more sequences of interest The present invention provides a nucleic acid molecule by using a specific-specific primer-adaptor. Selection of specific nucleic acid molecules (eg, genes or portions thereof) from a population of Allows isolation. According to the present invention, two or more such target-specific primers -The use of adapters (each directed to a different sequence) is one of the goals Allows the selection of many different sequences. Alternatively, use different parts of the target sequence More than two target-specific primer-adapters to be directed are Reducing such contamination facilitates selection of such sequences. The present invention In this aspect of the invention, the target-specific primer-adapter is hybridized to the desired molecule. Target-specific primers because they can be hybridized and removed by denaturation No cleavage site in the adapter is required. According to the present invention, the primer-adapter molecule is Depending on the ligand moiety, such primer-adapters are included. Facilitates the isolation of molecules having A primer-adapter is attached to the nucleic acid molecule. Primers (hybridized or incorporated during synthesis) The ligand portion of the adapter selectively binds the molecule containing the primer-adaptor. Allows isolation. Such isolation is achieved by ligand-hapten interaction. Where the hapten is bound, for example, to a solid support. Once When bound to a solid support, the molecule of interest (nucleus containing primer-adapter) Acid molecules) from contaminating nucleic acids and proteins to solutions, preferably buffers. Alternatively, it can be separated by washing the support matrix with water. Then, Cleavage of one or more cleavage sites within the Limer-adaptor may be performed from a solid support. Nucleic acid molecules can be recovered while the ligand remains bound to the hapten on the solid support To Alternatively, the primer-adapter hybridizes to the nucleic acid molecule of interest. If used, isolation is by denaturing the primer-adapter from the desired molecule. And / or by cleavage of a cleavage site within the primer-adaptor molecule, Can be achieved. Preferred solid supports for use in the present invention include nitrocellulose , Diazocellulose, glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene , Polyethylene, dextran, sepharose, agar, starch, nylon, la Tex beads, magnetic beads, paramagnetic beads, superparamagnetic beads, or micro A titer plate, and most preferably, magnetic beads, paramagnetic beads, or Superparamagnetic beads, which specifically recognize and bind ligand molecules Including, but not limited to, one or more hapten molecules. Particularly preferred hapten molecules according to this aspect of the invention include: (i) avidin And streptavidin; (ii) protein A, protein G, cell surface Fc Sceptor or antibody specific antigen; (iii) enzyme specific substrate: (iv) polymixi B or endotoxin neutralizing protein (ENP); (v) Fe⁺⁺⁺; (Vi) tiger (Vii) insulin receptor; (viii) cytochemistry Receptors (eg, growth factors, interleukins, or colony stimulating factors) -; (Ix) CD4; (x) spectrin or fodrin; (xi) ICAM-I or ICAM-2 (Xii) C3bi, fibrinogen, or factor X; (xiii) ankyrin; (x iv) Integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, Α₆β₁, Α₇β₁, And α₆β_Five; ( xv) Integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, And α_Vβ_Three; (Xvi) Integri Α_Threeβ₁, Α_Fourβ₁, Α_Fourβ₇, Α_Fiveβ₁, Α_Vβ₁, Α_IIbβ_Three, Α_Vβ_Three, And α_Vβ₆ ; (Xvii) integrin α_Vβ₁And α_Vβ_Three(Xviii) vitronectin; (xix ) Fibronectin; (xx) collagen; (xxi) laminin; (xxii) glycopho (Xxiii) Mac-1; (xxiv) LFA-1; (xxv) β-actin; (xxvi) gp120; (Xxvii) cytokines (growth factors, interleukins, or colony stimulants (Child): (xxviii) insulin; (xxix) ferrotransferrin; (xxx) apo Transferrin; (xxxi) lipopolysaccharide; (xxxii) enzyme; (xxxiii) antibody; (Xxxiv) biotin, but not limited thereto. Particularly preferred for use according to the invention, which in turn corresponds to the hapten molecules described above The ligand molecules include: (i) biotin; (ii) antibody; (iii) enzyme; (Vi) apotransferrin; (vi) ferrotransferrin; (vii ) Insulin; (viii) cytokines (growth factors, interleukins, or (Ix) gp120; (x) β-actin; (xi) LFA-1; (xii) Ma c-1; (xiii) glycophorin; (xiv) laminin; (xv) collagen; (Xvii) vitronectin; (xviii) integrin α_Vβ₁And And α_Vβ_Three; (Xix) integrin α_Threeβ₁, Α_Fourβ₁, Α_Fourβ₇, Α_Fiveβ₁, Α_Vβ₁, Α_I _Ib β_Three, Α_Vβ_Three, And α_Vβ₆; (Xx) integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, And α_Vβ_Three; (Xxi) integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, Α₆β₁, Α₇β₁ , And α₆β_Five(Xxii) ankyrin; (xxiii) C3bi, fibrinogen, or Or (XXiv) ICAM-1 or ICAM-2; (xxv) specklin or hodori (Xxvi) CD4; (xxvii) cytokines (eg, growth factors, interleukins) (Xxviii) insulin receptor ; (Xxix) transferrin receptor; (xxx) Fe⁺⁺⁺; (Xxxi) polymyxin B or endotoxin neutralizing protein (ENP); (xxxii) enzyme-specific substrate; (Xxxiii) Protein A, protein G, cell surface Fc receptor, or antibody Different antigens; and (xxxiv) avidin and streptavidin But not limited to these. Accordingly, the present invention relates to a method for making a nucleic acid molecule, comprising: (A) a polypeptide having polymerase and / or reverse transcriptase activity; Mixing the nucleic acid template and the primer-adapter of the present invention; and To (B) It contains a primer-adaptor (preferably at its 5 ′ or 3 ′ At or near the end), and complementary to all and a portion of the template. Incubating the mixture under conditions sufficient to produce a first nucleic acid molecule Process. When a DNA polymerase is used in accordance with the present invention, The mer-adapter can be located at or near the 3 'end, while inverting. If a transcriptase is used, the primer-adapter will It can be located at or near the 5 'end. According to the present invention, the first nucleic acid component The offspring produce a second nucleic acid molecule that is complementary to all or a portion of the first nucleic acid molecule. To be used as a template. In this synthesis, the primer-adapter is If used, a primer-adaptor at or near each end A double-stranded nucleic acid molecule is produced, but on a different strand of the molecule. But, The primer-adapter can be omitted from this second synthesis, thereby A double-stranded nucleic acid molecule having a primer-adapter at one end is provided. If desired, the primer-adapter of the present invention may be used to amplify nucleic acid molecules. Can be used in the method described above. Such a method is as follows (A) a polypeptide having polymerase and / or reverse transcriptase activity; Contacting the nucleic acid template with two or more primer-adapters; Love (B) conditions sufficient to amplify nucleic acid molecules complementary to all or part of the template And incubating the mixture. Such amplification methods are specifically described below. (A) Double-stranded nucleic acid molecule to be amplified, polymerase and / or reverse transcriptase An active polypeptide, a first plasmid complementary to a portion of the first chain of the double-stranded molecule. Immer-adapter, and a second probe complementary to a portion of the second strand of the double-stranded molecule. Contacting with a Rimer-Adapter; (B) containing a first primer adapter and all or one of the first strands; A third strand nucleic acid molecule complementary to the portion, and a second primer-adapter And a fourth strand nucleic acid molecule that is complementary to all or part of the second strand Incubating the mixture under conditions sufficient to produce (C) denaturing the second and fourth strands and the first and third strands, Forming a single-stranded nucleic acid molecule; (D) a step of repeating the steps (a) to (c) one or more times. The present invention In this aspect of the invention, the first primer-adaptor or the second primer The adapter can be any oligonucleotide primer to initiate the synthesis of a nucleic acid molecule. Can be replaced with a marker. In a preferred embodiment of the invention, RNA (eg, mRNA or poly A + RNA) Is used as a template for DNA synthesis. This preferred method involves the use of an RNA template, Mixing one or more polypeptides having reverse transcriptase activity and a primer And the amount of DNA (eg, cDNA) complementary to all or part of the RNA template Incubating the mixture under conditions sufficient to produce offspring. I do. The synthesized DNA molecule is then used for further DNA synthesis or amplification. It can be used as a template. According to this aspect of the invention, the cDNA library comprises: When using a population of RNA molecules (eg, RNA isolated from cells or tissues), Can be generated. To isolate mRNA or poly A + RNA according to the present invention, the method specifically comprises: Less than: (A) contains (or appears to contain) mRNA and / or poly A + RNA A) obtaining a sample; (B) one that can selectively bind to the sample and mRNA and / or poly A + RNA Contacting the above primer adapter; (C) isolating mRNA and / or poly A + RNA from the sample. obtain. In order to isolate a particular or desired nucleic acid molecule, the present invention specifically provides: (A) a sample containing (or suspected of containing) one or more desired nucleic acid molecules; Obtaining a sample; (B) one or more that can selectively bind the sample and one or more desired nucleic acid molecules Contacting with a primer-adaptor of (C) isolating a desired nucleic acid molecule from the sample. In a preferred aspect, the sample containing the desired molecule is double-stranded or single-stranded. A collection of strand cDNA molecules. Accordingly, the present invention provides for isolating one or more desired nucleic acid molecules. The way to do this is: (A) a cDNA containing (or likely to contain) one or more desired cDNA molecules Obtaining a sample containing the population of NA molecules; (B) one or more samples that can specifically bind to one or more desired cDNA molecules; Contacting the above target-specific primer-adapter; and (C) isolating a desired cDNA molecule from a sample. . According to the present invention, the target-specific primer-adapter is a Can be used in the selection of a particular cDNA molecule (RNA / cDNA2 Binds to single-stranded cDNA molecules or binds to single-stranded cDNA molecules after removal of RNA strands) . Alternatively, the target-specific primer-adapter binds the double-stranded cDNA molecule Can be used for Such target-specific primer-adapters also provide increased The present invention provides a method for selecting one or more desired molecules from a population of nucleic acid molecules to be spanned. Can be used in accordance with The present invention also includes cDNA or nucleic acid molecules produced according to the present invention. Vectors (including expression vectors) and their cDNA molecules, nucleic acid molecules, or A host cell containing the vector. The present invention also provides for the production of recombinant polypeptides. Culturing these host cells under currently advantageous conditions, and simply isolating the polypeptide. Providing a method for producing a recombinant polypeptide, the method comprising: Also provided are recombinant polypeptides produced according to these methods. In other preferred aspects, the invention provides one or more containers (eg, tubes, Vials, bottles, ampules, etc.) Nucleic acid molecule or cDNA with a separate vehicle (eg, box, carton, etc.) A kit for the production of a molecule, wherein the first container comprises one or more ligand components. A primer-adaptor molecule containing a probe (preferably biotin). Of one or more cleavage sites, preferably one or more Contains a restriction endonuclease cleavage site. The invention also relates to reverse transcriptase activity and And / or may comprise one or more polypeptides having polymerase activity. Such a kit comprising a container comprising: According to the invention, more than one Polypeptides can be contained in the same or different containers. The present invention also provides One or more primers capable of specifically binding the ligand of the primer-adapter of the present invention. A kit comprising an additional container, which may include a solid support having a platen. The present invention also recognizes cleavage sites in the primer-adapter of the present invention and Kit comprising an additional container that may contain one or more endonucleases to cleave About. Other preferred embodiments of the present invention are described in the following drawings and description of the invention, and in It will be clear to the skilled person in view of the scope of the requirements. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the production and isolation of a double-stranded cDNA molecule and the process according to the method of the invention. Illustrates its ligation to the rasmid vector (pCMVSP0RT). "B" Indicates the biotin molecule (and thus the site of biotinylation of the cDNA molecule), and "RE '' Is a control used to facilitate the recovery of cDNA from a solid support after isolation. Indicates the location of the restriction endonuclease cleavage site. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method for reducing the amount of poly A + RN in a high-throughput manner. Particularly suitable for rapid generation and isolation of cDNA libraries from A or mRNA I do. In a preferred aspect of the invention, the population of single-stranded poly A + RNA or mRNA comprises: Ligand-bound primer adapter (non-specific or gene-specific) and solution Hybridized inside. As used herein, the term "primer “Adapter” is specific for a template nucleic acid molecule (eg, mRNA or poly A + RNA molecule) Refers to a nucleic acid molecule capable of binding (eg, hybridizing). Particularly preferred of the present invention In a preferred embodiment, the primer-adapter comprises all or a portion of the template nucleic acid molecule. Allows the initiation of transcription, reverse transcription, polymerization, or extension of a nucleic acid molecule complementary to the moiety. You. According to the present invention, the first strand and second strand cDNA reactions are preferably performed in one tube. At or near the 3 'end of the resulting double-stranded cDNA. Introduce the command. The ligand-bound cDNA is then used for ligand hapten interaction. The cDNA binds to a solid support bound to the hapten to which it binds, thereby Enables cDNA enrichment and buffer exchange without organic extraction and precipitation Can be isolated by Subsequently, the ligated cDNA is digested with restriction enzymes. Thus, it is dissociated from the solid support. This asymmetric cDNA is then (One end matches the restriction site used to dissociate the cDNA, and the other (The other end is blunt-ended). Following or prior to cloning into a vector, certain cDNA sequences (eg, , A gene or a gene fragment) according to the present invention. It can be selectively isolated using a putter. For multiple time-consuming extractions and precipitations In addition to exclusion, the method of the invention requires Fractionation (a step usually required to remove excess unligated adapter). To eliminate the need for Thus, the present invention provides a method without the need for PCR amplification. Rapid production of larger quantities of cDNA from nanogram quantities of poly A + RNA or mRNA Facilitates synthesis and isolation and construction of cDNA libraries. The present invention also relates to From the constructed cDNA library, simply select the desired gene or gene fragment. Provides a single selection technique that allows for separation. Source of nucleic acid template molecules Using the methods of the invention, nucleic acid molecules, and in particular, cDNA molecules, It can be prepared from a template molecule. Preferred nucleic acid molecules for use in the present invention And single-stranded or double-stranded RNA. More preferred nucleic acid molecules include , Polyadenylation RNA (poly A + RNA), messenger RNA (mRNA), transfection RNA (tRNA) and ribosomal RNA (rRNA) molecules, and most Preferred are mRNA and poly A + RNA molecules. Nucleic acids used to prepare nucleic acid molecules or cDNA molecules according to the methods of the invention The template molecule is prepared synthetically according to standard organic chemical synthesis methods well known to those skilled in the art. Can be More preferably, the nucleic acid template molecule is derived from a natural source (eg, a variety of cells). , Tissue, organ, or organism). Used as a source of nucleic acid molecules Cells that can be obtained include prokaryotes (bacterial cells, including Escherichia, Bachillus, Serratia, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium Genus, Chlamydia, Neisseria, Treponema, Mycoplasma, Bprrelia, Leg genus ionella, genus Pseudomonas, genus Mucobacterium, genus Heilicobacter, genus Erwinia, A grobacterium, Rhizobium, and Streptomyzes species) Or eukaryotes (fungi (especially yeast), plants, protozoa, and other parasites, Animals (insects (especially Drosophilla spp. Cells), nematodes (especially Caenorhabditis ele gans cells), and mammals (especially human cells). Mammalian somatic cells that can be used as a source of nucleic acids include blood cells (reticulocytes and And leukocytes), endothelial cells, epithelial cells, neurons (from the central nervous system or peripheral nervous system) ), Muscle cells (including muscle cells and myoblasts from skeletal, smooth, or cardiac muscle). ), Connective tissue cells (fibroblasts, adipocytes, chondrocytes, chondroblasts, osteocytes, And osteoblasts), and other stromal cells (eg, macrophages, Dendritic cells, Schwann cells). Mammalian germ cells (spermatocytes and oocytes) Cells) are also the precursors that give rise to the somatic and germ cells described above, For use in the present invention as it can be a precursor, and a stem cell Can be used as a source of nucleic acids. Suitable for use as a source of nucleic acid Also are mammalian tissues or organs (eg, brain, kidney, liver, pancreas). Blood, bone marrow, muscle, nerve, skin, urogenital, circulatory, lymphatic, gastrointestinal, and Tissue or organ from a source of connective tissue, as well as mammalian (including human) embryos Or tissues or organs from fetal sources). Any of the aforementioned prokaryotic or eukaryotic cells, tissues and organs are normal. Can be obtained, diseased, transformed, established, or a precursor. Can be, precursor, fetal, or embryo. Suffering The isolated cells may be, for example, infectious diseases (bacteria, fungi, or yeast, viruses (AI DS), or caused by parasites) or genetically Or biochemical pathology (eg, cystic fibrosis, hemophilia, Alzheimer's disease, muscle Dystrophy, or multiple sclerosis) or a cancerous process May be involved. Examples of transformed or established animal cell lines include For example, COS cells, CHO cells, VERO cells, BHK cells, HeLa cells, HepG2 cells, K562 cells , F9 cells and the like. As a source of nucleic acids for use in the present invention Other suitable cells, cell lines, tissues, organs, and organisms will be apparent to those of skill in the art. . Once a starting cell, tissue, organ, or other sample is obtained, the nucleic acid The child (eg, mRNA) is simply isolated therefrom by methods well known in the art. (Eg, Maniatis, T. et al. Cell 15: 687-701 (1978); Okayama, H .; And Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982); Gubler, U. and Hoff man, B.J., Gene 25: 263-269 (1983)). As discussed, Ming has improved the isolation of mRNA and / or poly A + RNA from samples. provide. The present invention specifically recognizes and binds poly A + RNA or mRNA. The use of primer-adapters allows for such a selection. Preferably, The primer-adapter recognizes the polyA tail of mRNA or polyA + RNA and And hybridize to this. As such a primer-adapter, , Oligo- (dT) -containing primer-adapters. Once When used, the use of the ligand portion of the primer-adaptor will Allows isolation. The poly A + RNA or mRNA molecule thus isolated is then To prepare cDNA molecules and cDNA libraries using the methods of the present invention. Can be used. Synthesis of nucleic acid molecules In the practice of the present invention, a nucleic acid molecule containing one or more ligand molecules, and In particular, a cDNA molecule or a cDNA library can be prepared using the nucleic acid template ( This is preferably an mRNA or poly A + RNA molecule) and a polymerase One or more polypeptides having activity and / or reverse transcriptase activity By mixing with one or more primer-adapters. Throw Under conditions that favor reverse transcription and / or polymerization of the incoming nucleic acid molecule, all or none of the template Synthesis of a partially complementary nucleic acid molecule is achieved. Inversion used in the present invention Preferred polypeptides having transcriptase and / or polymerase activity (eg, Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase, Uss sarcoma virus (RSV) reverse transcriptase, avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase Element, Rous-associated virus (RAV) reverse transcriptase, myeloblastosis-associated virus (MAV) reverse Transcriptase, human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase, retrovirus reverse transcriptase Element, retrotransposon reverse transcriptase, hepatitis B reverse transcriptase, cauliflower mosaic Ikuvirus reverse transcriptase, bacterial reverse transcriptase, Thermus thermophilus (Tth) DNA Remerase, Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase, Thermotoga neopolit ana (Tne) DNA polymerase, Thermotoga maritima (Tma) DNA polymerase, Th er mococcus litoralis (Tli or VENT^TM) DNA polymerase, Pyrococcus furiosu s (Pfu or DEEPVENT^TM) DNA polymerase, Pyrococcus woosii (Pwo) DNA poly Merase, Bacillus sterothermophilus (Bst) DNA polymerase, Sulfolobus a cidocaldarius (Sac) DNA polymerase, Thermoplasma acidophilum (Tac) DNA Polymerase, Thermus flavus (Tfl / Tub) DNA polymerase, Thermus ruber (T ru) DNA polymerase, Thermus brockianus (DYNAZYME^TM) DNA polymerase, Me thanobacterium thermoautotrophicum (Mth) DNA polymerase and its variants Variants, variants, and derivatives include, but are not limited to. In the present invention Particularly preferred for use in this context are those in which RNase H activity is substantially reduced. Variants of these enzymes. By an enzyme that “substantially reduced RNase H activity” , Wild-type RNase H activity or “RNaseH ゛” enzyme (eg, wild-type M-MLV or AM V reverse transcriptase) less than about 20% of activity, more preferably less than about 15%, 10%, or 5% An enzyme having full, and most preferably, less than about 2% activity is meant. Any The RNase H activity of the enzyme is described, for example, in US Pat. No. 5,244,797 by Kotewicz, M.L. et al., Nucl. Acids Res. 16: 265 (1988), and Gerard, G.F. et al., FO CUS 14 (5): 91 (1992) (all of these disclosures are fully incorporated herein by reference. Determined by various assays, such as the assays described in Can be done. Any ligand to which the hapten molecule binds is used in the method of the invention Can be used to form a ligand binding primer-adaptor molecule. this Suitable ligands for the purpose include: (i) biotin; (ii) antibodies; (iii) (Iv) lipopolysaccharide; (v) apotransferrin; (vi) ferrotransfase (Vii) insulin; (viii) cytokines (growth factors, interleukins) (Ix) gp120; (x) β-actin; (xi) LF A-1; (xii) Mac-1; (xiii) glycophorin; (xiv) laminin (Xv) collagen; (xvi) fibronectin; (xvii) vitronectin; (x viii) Integrin α_Vβ₁And α_Vβ_Three; (Xix) integrin α_Threeβ₁, Α_Fourβ₁ , Α_Fourβ₇, Α_Fiveβ₁, Α_Vβ₁, Α_IIbβ_Three, Α_Vβ_Three, And α_Vβ₆; (Xx) Integra Phosphorus α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, And α_Vβ_Three; (Xxi) integrin α₁β₁, Α_Two β₁, Α_Threeβ₁, α₆β₁, Α₇β₁, And α₆β_Five(Xxii) ankyrin; (xxiii) C3bi, fib (Xxiv) ICAM-1 or ICAM-2; (xxv) specrin (Xxvi) CD4; (xxvii) cytokines (eg, growth factors, (Xxle) interleukin or colony stimulating factor) receptor; (Xxix) transferrin receptor; (xxx) Fe⁺⁺⁺; (Xxxi) Polymyxin B or endotoxin neutralizing protein (ENP); (xxxxii) enzyme (Xxxiii) protein A, protein G, cell surface Fc receptor, Or an antibody-specific antigen; and (xxxiv) avidin and streptavidin But not limited thereto. Best for use in the method of the present invention. Also preferred is biotin. Ligand binding primer-adapter nucleic acid The offspring are one or more ligand molecules that are associated with one or more nucleotides of the primer-adapter molecule. Attached (preferably covalently) to leotide (see, eg, FIG. 1) ), Can be produced using conventional organic synthesis methods well known to those skilled in the art. For example, Gonucleotides are initially 5 'amino (NH_Two) Group and then Cab-NHS ester Can be biotinylated at the 5 'end (Langer, PR et al. roc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633 (1981)). In a particularly preferred aspect of the present invention Wherein one or more, two or more, three or more, or four or more ligand molecules , Most preferably a primer-adaptor molecule containing a biotin molecule is prepared. Is done. In addition to the ligand molecule, the primer-adaptor molecule also preferably One or more endonuclease cleavage sites, preferably restriction endonuclease sites It contains. These sites were used to generate primers from the hapten-bound solid support. Facilitates dissociation of newly synthesized nucleic acid molecules containing the adapter. In the present invention Thus, examples of endonucleases that can be used include Gene II, You are not limited to this. Examples of restriction endonucleases that can be used according to the present invention As, AluI, Eco47III, EcoRV, FspI, HpaI, MscI, NruI, PvuII, RsaI, Sc aI, SmaI, SspI, StuI, ThaI, AvaI, BamHI, BanII, BglII, ClaI, EcoRI, Hind III, HpaII, KpnI, MseI, NcoI, NdeI, NotI, PstI, PvuI, SacI / SstI, SalI, X baI, XhoI, and I-CeuI include, but are not limited to. The restriction endonuclease sites engineered into the primer-adapter molecule are: Preferably, it is selected to give rise to either blunt or overhanging ends. So A blunt end whose recognition site can be engineered into the primer-adaptor molecule of the invention. Examples of restriction enzymes include AluI, Eco47III, EcoRV, FspI, HpaI, MscI, NruI, Pvu II, RsaI, ScaI, SmaI, SspI, StuI, and ThaI, but not limited to Not done. A protrusion whose recognition site can be engineered into the primer-adaptor molecule of the invention. Examples of terminal enzymes include AvaI, BamHI, BanII, BglII, ClaI, EcoRI, HindIII, H paII, KpnI, MseI, NcoI, NdeI, NotI, PstI, PvuI, SacI / SstI, Sall, Xba, Xh oI, and I-CeuI, but are not limited thereto. In a particularly preferred aspect of the invention, the primer adapter molecule is a rare fragment. Restriction endonucleases (eg, endonucleases that recognize eight or more bases) To include a site that is recognized by the enzyme (eg, an 8 base pair cutter). Operated. Such restriction sites include NotI restriction sites, I-CeuI restriction sites, PI -PspI restriction site, and I-PpoI restriction site, PI-TliI restriction site, and PI-FceI restriction site Sites may be mentioned. Restriction enzymes described above, and equally used in the method of the invention Other restriction enzymes that can be used are described, for example, in Life Technologies, Inc. (Rockville, MD ) Is commercially available. For other examples of restriction enzymes and their cleavage sites, see Ro See also berts, R.J., Nucl. Acids Res. 17 (supplement): r347-r387 (1989). . Once the ligand-bound primer-adapter molecule is obtained, To generate nucleic acid molecules from the input nucleic acid using any of a number of well-known techniques. used. Such synthesis techniques include primer-adapter to nucleic acid template Hybridization and nucleic acid molecules complementary to all or part of the template Extension of the primer-adaptor to produce Such synthesis Is a nucleotide (eg, deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP), dide Oxyribonucleoside triphosphate (ddNTP) or derivatives thereof), and At least one polypeptide having polymerase and / or reverse transcriptase activity Is achieved in the presence of The primer-adapter of the present invention uses a known technique. Use any nucleic acid synthesis reaction (including cDNA synthesis), nucleic acid amplification, and nucleic acid sequencing Can be used in certain situations. Primer-Adapter of the Invention for cDNA Synthesis -Molecules are used in the following examples to generate cDNA molecules or cDNA libraries. A method for cDNA synthesis as described in 1 or other methods well known in the art (E.g., Gubler, U. and Hoffman, B.J., Gene 25: 263-269 (1983); Krug, M.S. and Berger, S.L., Meth. Enzymol. 152: 316-325 (1987); Sambrook, J. Et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, N Y: Combined with Cold Spring Harbor Laboratory Press, 8.60-8.63 (1987)) Can be used. Alternatively, the primer-adapter molecule of the present invention may comprise a single cDNA of a cDNA according to the present invention. Can be used in one-tube synthesis. In this approach, the input nucleic acid molecule (Preferably, mRNA or poly A + RNA molecule) is a primer-adaptor of the present invention. -Hybridized in solution with the molecule, the hybridized complex A polypeptide having reverse transcriptase activity in the presence of dNTPs and cofactors required for synthesis (Eg, an enzyme), which is preferably any of the polypeptides described above. Contacted. After synthesis of the first strand, the second cDNA strand is then replaced with the modified Gulber-H In the same reaction vessel by the offman reaction (D'Alessio, J.M. et al., Focus 9: 1 (1987)) Can be synthesized in Other techniques for cDNA synthesis in which the methods of the present invention may be advantageously used include: It will be readily apparent to one skilled in the art. Isolation of nucleic acid molecules Single strand containing one or more primer-adapters according to the method of the invention And double-stranded nucleic acid molecules (eg, cDNA molecules or cDNA libraries) Is done. Such a nucleic acid molecule or library then binds the ligand. Binding a nucleic acid molecule to a solid support containing one or more hapten molecules Thus, it can be rapidly isolated from the solution. In the practice of the present invention, any solid to which a ligand-specific hapten molecule can be bound A body support may be used. Preferred such solid supports include Nitrocell Loose, diazocellulose, glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene Pyrene, polyethylene, dextran, sepharose, agar, starch, niro , Beads, and microtiter plates, but are not limited to Not. Preferred are made from glass, latex, or magnetic materials Beads, and particularly preferred are magnetic beads, paramagnetic beads, or Superparamagnetic beads. The binding of the hapten molecule to the solid support is well known to those skilled in the art. Any method of hapten binding, such as covalent, hydrophobic, or ionic bonding ( Including coatings). According to the present invention, it is attached to a primer-adaptor molecule (therefore, the present invention Ability to bind ligand molecules (contained in nucleic acid molecules produced by the method) Any hapten molecule having the formula can be used. Specially for use in the present invention Preferred hapten molecules (which in turn correspond to the ligand molecules listed above) (I) avidin and streptavidin; (ii) protein A, protein G, cell surface Fc receptor, or antibody-specific antigen; (iii) enzyme Element-specific substrate; (iv) polymyxin B or endotoxin neutralizing protein (EN P); (v) Fe⁺⁺⁺(Vi) transferrin receptor; (vii) insulin receptor Sceptors; (viii) cytokines (eg, growth factors, interleukins, Is a receptor for colony stimulating factor); (ix) CD4; (x) spectrin or hod Phosphorus; (xi) ICAM-I or ICAM-2; (xii) C3bi, fibrinogen or Factor X; (xiii) ankyrin; (xiv) integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, α₆β₁, Α₇β₁, And α₆β_Five; (Xv) integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, And α_Vβ_Three; (Xvi) integrin α_Threeβ₁, Α_Fourβ₁, Α_Fourβ₇, Α_Fiveβ₁, Α_Vβ₁ , Α_IIbβ_Three, Α_Vβ_Three, And α_Vβ₆; (Xvii) integrin α_Vβ₁And α_Vβ_Three (Xviii) vitronectin; (xix) fibronectin; (xx) collagen; (xxxi) laminin; (xxii) glycophorin; (xxiii) Mac-1; (xxiv) LFA-1; (xx v) β-actin; (xxvi) gp120; (xxvii) cytokines (growth factor, (Xxviii) insulin; (xxix) ferro (Xxx) apotransferrin; (xxxi) lipopolysaccharide; (xxxii ) Enzymes; (xxxiii) antibodies; and (xxxiv) biotin. Not limited to For example, primer-adapter molecules and newly synthesized nucleic acid molecules In a preferred aspect of the present invention comprising otin, a hapten that binds biotin (Eg, avidin or streptavidin) can be linked to a solid support. . In particularly preferred such aspects, the solid support used is avidin. Or streptavidin-bound magnetic beads, paramagnetic beads, or paranormal Magnetic beads, such as Dynal A.S. (Oslo, Norway) or Sigm a (St. Louis, Missouri). Of course, the choice of hapten Depending on the choice of ligand used in the generation of the primer-adapter molecule Thus, haptens suitable for use in the method of the invention are well known to those skilled in the art. It is. To isolate a nucleic acid molecule produced by the method of the present invention, a ply of the present invention is used. The solution containing the nucleic acid molecule containing the mer-adaptor is the The hapten-bound solid support is contacted under conditions that favor binding. Typically, These conditions are buffered salt solutions, preferably TRIS-, phosphate-, HEPES-, or Carbonate-buffered sodium chloride solution, more preferably TRIS-buffered sodium chloride Solution, even more preferably, about 10-100 mM TRIS-HCl and about 300-2000 mM NaCl. Containing solution, and most preferably about 10 mM TRIS-HCl and about 1 M NaCl, A pH of 6-9, more preferably a pH of about 7-8, even more preferably about 7.2-7.6. PH, and most preferably, incubation in a solution containing at a pH of about 7.5. Options. The incubation is preferably at 0 ° C. to about 25 ° C., and Most preferably at about 25 ° C. for about 30-120 minutes, preferably for about 45-90 minutes, and Most preferably, for about 60 minutes, the ligand binding to the hapten-bound solid support is performed. The binding of the combined nucleic acid molecule was enabled. Once the nucleic acid is bound to the solid support, undesired substances or contaminants Quality (eg, buffers and enzymes from the first and second strand synthesis reactions, No input RNA molecules, etc.) are eliminated by simply removing them in the supernatant Can be done. For example, if the biotinylated cDNA molecule is avidin or streptavidin In a preferred aspect where it is bound to the bound solid phase, contaminants are gently aspirated and And discarding the supernatant. Avidin or streptoa Magnetic, paramagnetic, or superparamagnetic beads with vidin attached as solid support In particularly preferred such aspects used, nucleic acids (eg, cDNA) The beads to be used are magnets (for example, Manga-Sep Magnetic Particle Separator; Life Technologies, Inc.), and the supernatant is pipetted. Removed using. Prior to their dissociation from the solid support, the immobilized nuclei Acid molecules are preferably used to more fully remove unwanted substances, for example Wash one or more times with one of the above buffered salt solutions. Once contaminants have been sufficiently removed, the nucleic acid (eg, cDNA) molecule will have a recognition sequence Under conditions that favor cleavage of the primer, the support is treated with a primer-adaptor molecule as described above. An endonuclease that specifically recognizes the engineered sequence (this is a restriction enzyme) Dissociated from the solid support by contacting Can be NotI and / or I-CeuI recognition sequences are included in the primer-adapter molecule. (Thus, this is because in newly synthesized nucleic acid (eg, cDNA) molecules) In such particularly preferred aspects of the present invention (included in It is contacted with a solution containing tI and / or I-CeuI. Of course, solid support The choice of restriction enzymes used to dissociate nucleic acid molecules from primers Specific recognition site engineered in the target molecule and the recognition site It depends on the possibilities. Nucleic acid molecules (eg, cDNA or cDNA) from a solid support Preferred conditions for dissociation of the library) are from about 20 ° C to about 40 ° C, preferably About 25 ° C. to about 39 ° C., more preferably about 30 ° C. to about 37 ° C., and most preferably about At 37 ° C. for about 30-180 minutes, preferably about 60-150 minutes, and most preferably about Includes a 120 minute incubation. After their dissociation from the solid support, A nucleic acid molecule (eg, a cDNA molecule or a cDNA library) can be used in accordance with the present invention. Or techniques well known in the literature (eg, Gubler, U. and Hoffman, B.J. Ge. ne 25: 263-269 (1983); Krug, M.S. and Berger, S.L., Meth. Enzymol. 152: 316-325 (1987); Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 8. 60-8.63 (1987)) and by techniques well known to those skilled in the art. It can be purified. kit The invention also relates to the generation and generation of nucleic acid molecules (eg, cDNA molecules or libraries). And kits for use in isolation and isolation. Kit according to this aspect of the invention Contains one or more containers (eg, vials, tubes, ampules, bottles, etc.) Carrier means (e.g. a box) having a close partition therein , Carton, tube, etc.), wherein the first container comprises one or more primers -An adapter nucleic acid molecule, wherein the primer-adaptor molecule is preferably Is a biotinylated primer-adapter nucleic acid molecule. In other aspects In addition, the kit of the present invention further comprises a solid support to which a hapten is bound. Comprising a further container as described above, wherein the solid support is any of the solid supports described above. And, most preferably, avidin or streptavidin bound Magnetic, paramagnetic, or superparamagnetic beads. In a further aspect, the present invention Kits further include, for example, one or more nucleotides (eg, dNTPs, ddNTPs, Or a derivative thereof), or reverse transcriptase activity and / or polymerase activity One or more polypeptides (eg, enzymes) having, preferably, those described above. It may include one or more additional containers containing any of the enzymes. Such a nucleus Otides or derivatives thereof include dUTP, dATP, dTTP, dCTP, cGTP, dITP, 7-de Aza-dGTP, α-thio-dATP, α-thio-dTTP, α-thio-dGTP, α-thio-dCTP, ddUTP , DdATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddITP, 7-deaza-ddGTP, α-thio-dd ATP, α-thio-ddTTP, α-thio-ddGTP, α-thio-ddCTP, or a derivative thereof ( All of these are available from Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland), New Engl and BioLabs (Beverly, Massachusetts) and Sigma Chemical Company (Sai nt Louis, Missouri). Are not restricted. A further kit according to the invention provides nucleic acid separation from a solid support. Used for dissociation of a child (eg, a cDNA molecule or cDNA library) One or more additional containers containing one or more endonucleases or restriction enzymes May be included. The kit encompassed by this aspect of the invention further comprises nucleic acid reverse transcription and And / or additional reagents (eg, suitable Buffer) and compounds. use The present invention finds use in a variety of applications that require rapid generation and isolation of nucleic acid molecules. Can be used. The present invention relates to the collection of nucleic acid molecules for the isolation of mRNA or poly A + RNA molecules. For isolation of the desired nucleic acid molecule from a nucleic acid molecule, and particularly for nucleic acid molecules (particularly from small amounts of mRNA). Particularly suitable for the production of full-length cDNA molecules). The invention also relates to methods for the amplification of nucleic acid molecules and by these methods Related to the amplified nucleic acid molecule. According to this aspect of the invention, the nucleic acid molecule The nucleic acid molecule of the present invention (eg, a cDNA molecule) is amplified according to any amplification method known in By amplification, it can be amplified (ie, additional copies of the nucleic acid molecule can be prepared). Manufactured). Particularly preferred amplification methods according to this aspect of the invention include PCR (US Patents 4,683,195 and 4,683,202), Strand Displacement Amplific ation (SDA; U.S. Patent No. 5,455,166; EP 0 684 315), and Nuclielc Acid Seq uence-Based Ampllfication (NASBA; US Patent No. 5,409,818; EP 0 329 822) Is mentioned. Most preferred are those methods that involve one or more PCR amplifications. is there. The present invention also provides a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule of the present invention or an amplified nucleic acid molecule. That can be used to prepare the vectors, hosts containing these recombinant vectors Cells, these vectors and host cells to produce recombinant polypeptides. And recombinant polypeptides produced using these methods About. Recombinant vectors are prepared according to the invention using methods well known in the art. One or more nucleic acid molecules or amplified nucleic acid molecules prepared in Can be generated according to this aspect of the present invention (see FIG. 1). ). Vectors used in this aspect of the invention include, for example, phage or It may be a plasmid, and is preferably a plasmid. Preferred is the purpose Contains a cis-acting regulatory region for a nucleic acid sequence encoding a polypeptide Vector. A suitable trans-acting factor can be supplied by the host, Can be supplied by a complementing vector or introduced into a host At the same time, can be supplied by the vector itself. In certain preferred embodiments in this regard, the vector comprises a cDNA of the invention. An expression vector that provides for the specific expression of a molecule or nucleic acid molecule. Can be inducible and / or cell type specific. In such a vector Particularly preferred in are easy to operate, such as temperature and nutrient additives. A vector that is inducible by certain environmental factors. Expression vectors useful in the present invention include chromosomes-, episomes, and Virus-derived vectors (eg, bacterial plasmids or bacteriophage And vectors derived from combinations thereof (e.g., , Cosmids and phagemids) and preferably at least one Two selectable markers (eg, tetracycline for culture in bacterial host cells) Or an ampicillin resistance gene). Insertion into such an expression vector Prior to entry, the nucleic acid molecule of the invention (eg, a cDNA molecule) or the nucleic acid molecule to be amplified is A suitable promoter (eg, the phage λPL promoter, E. coli lac promoter). Operably linked to the promoter, trp promoter and tac promoter) It is. Other suitable promoters are known to those skilled in the art. Particularly preferred vectors for use in the present invention include pQE70, pQE60, And pQE-9 (available from Qiagen); pBS vector, Phasescript vector, Blu eScript vector, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (available from Stratagene) PcDNA3 (available from Invitorogen); pGEX, pTrxfus, pTrc99a, pET-5, pET-9 PKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (available from Pharmacia); and pS PORT1, pSP0RT2, and pSV SPORT1 (available from Life Technologies, Inc.) Is mentioned. Other suitable vectors will be readily apparent to one of skill in the art. Representative host cells that can be used in accordance with the present invention include bacterial cells, yeast cells , Plant cells, and animal cells, but are not limited thereto. preferable As bacterial host cells, Escherichia ssp. Cells (especially E. coli cells and most Include E. coli strains DH10B and Stb12), Bacillus spp. Cells (especially B. subtilis And B. megaterium cells), Streptomyces spp. Cells, Erwinia ssp. Cells, Klebs iella spp. cells and Salmonella spp. cells (especially S. typhimurium cells) But not limited thereto. Preferred animal host cell lines include kelp insect Cells (most particularly Spodoptera frugiperda Sf9 and Sf21 cells, and Trich oplusa High-Five cells) and mammalian cells (most particularly CHO cells, COS cells). Vesicles, VERO cells, BHK cells, and human cells). These and other Suitable host cells include, for example, Life Technologies, Inc., American Type Cal. It is commercially available from Char Collection and Invitrogen. Further, the present invention provides methods for producing recombinant polypeptides, and methods for producing these polypeptides. Provided by the method of (1). According to this aspect of the invention, Recombinant polypeptides can be used to transfer any of the above-described recombinant host cells to polypeptides therefrom. Culture under conditions that favor production of the polypeptide and isolation of the polypeptide. Thus, it can be generated. Methods for culturing recombinant host cells, and from there Methods for the production and isolation of polypeptides are well known to those skilled in the art. In other applications, the methods of the present invention provide gene-specific methods from complex populations of poly A + RNA. Can be used to generate a specific cDNA library. The method of the present invention also provides AFLP In combination with polymorphism analysis methods such as Facilitates quick and direct identification. In addition, the process used in the present invention Primers-adapters contain regulatory sequences (eg, promoters, enhancers, or Or other regulatory regions). In one such situation The promoter for T7 or SP6 RNA polymerase is Can be manipulated in a putter, thereby using in amplification or subtraction For the production of additional copies of the original mRNA. Further, the method of the present invention Converts poly A + RNA from total RNA, such as from cells, tissues, organs, or organisms For isolation or to generate a cDNA library directly from total RNA , Can be used. In the latter application, the present invention provides a method wherein the target mRNA comprises It is particularly useful when showing very small fractions; mRNA can be rapidly and efficiently isolated from a background of total RNA, and then Single-stranded for various purposes (eg, cloning and / or amplification). Alternatively, it can be quickly and efficiently reverse transcribed into a double-stranded cDNA molecule. Other suitable modifications and adaptations to the methods and applications described herein are Deviates from the scope of the invention or any embodiments thereof This It will be readily apparent to those skilled in the art that this can be done. The present invention will now be described in detail. Although described in detail, the present invention will become more apparent by reference to the following examples. It is understood that this example is included herein for illustrative purposes only, and Is not intended to be restricted. Example 1: Generation and isolation of cDNA molecules The first- and second-strand cDNA synthesis reactions were performed using 50 to 5000 ng of mRNA for 10⁶More than SUPE except used as starting material to generate library of clones RSCRIPT Plasmid System (Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland) Was performed as described in the training manual. Used in cDNA synthesis The primer-adapter used contained four biotin (B) residues: B-GA CT (-B) AGT (-B) T (-B) CTAGATCGCGAGCGGCCGCCC (T₁₅) (SEQ ID NO: 1). Briefly, 1 μg of biotinylated primer-adapter was used to Single-chain synthesis was performed for 60 minutes using 50 mM TRIS-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl_Two, 10mM DTT, 500 μM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 50 μM / ml Bio-p-A, etc. Labini 10,000-50,000 units / ml SuperScript II reverse transcriptase (Life Technolog ies, Inc.). The synthesis of the second strand was described previously. (Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2: 161 (1982); r, U. and Hoffman, B.J., Gene 25: 263 (1983); D'Alessio, J.M. FOCUS 9: 1 (1987)), using 25 mM TRIS-HCl (pH 7.5), 100 mM KCl, 5 mM MgCl_Two,Ten mM (NH_Four)_TwoSO_Four, 0.15 mM B-NAD +, 250 μM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP , 1.2 mM DTT, 65 units / ml DNA ligase, 250 units / ml DNA polymerase I And 2 hours at 16 ° C in a solution containing 13 units / ml RNase H. Was. Streptavidin during the last 30 minutes of the 2 hour second strand cDNA synthesis reaction. Paramagnetic beads were prepared. Briefly, paramagnetic beads (Life Technologies, Inc. .) And resuspend 150 μl of bead suspension in microcentrifuge for each reaction Placed in a separation tube. Tube into Magna-Sep-Magnetic particle Separato r (magnet) for 2 minutes and the supernatant was removed by aspiration. Then bee 100 μl of TE buffer (10 mM TRIS-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA) to each tube. Wash by adding, resuspend beads and after 2 minutes as described above The supernatant was removed. After washing, the beads were washed with 160 μl of binding buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7 .5) in resuspending in 1 mM EDTA, 1 M NaCl) and isolating the cDNA. It was kept at 25 ° C until use. The second strand cDNA synthesis reaction mixture is incubated with T4 DNA polymerase. After incubation, the tubes were placed on ice and the reaction was quenched with 10 μl of 0.5 M EDTA The addition was terminated by addition to a tube. The solution is then added to streptavidin. Biotinylated cDNA molecules by contacting them with paramagnetic beads did. Briefly, 160 μl of the beads prepared as described above were added to the cDNA reaction mixture primer. Add to the tube and mix the tubes gently and incubate at room temperature for 60 minutes. Incubated. The tube is then inserted into the magnet for 2 minutes, after which the supernatant Was removed and discarded. The beads were then added to 100 μl of wash buffer (10 mM TRIS- HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 500 mM NaCl), gently resuspended, then Washed by reinserting. After 2 minutes, the supernatant is removed and discarded, and And the washing step was repeated. After the second wash, resuspend the beads in 100 μl wash buffer And transferred to a new tube and washed twice as above (5 min to magnet) Exposure). After a second 5 minute wash, the supernatant was removed and discarded and the cDNA molecule was replaced with NotI. The beads were removed by incubation with. Briefly, 50 μl Not I solution (41 μl of autoclaved distilled water, 5 μl of REact3 buffer (500 mM TRIS- HCl (pH8.0), 100mM MgCl_Two1M NaCl) and 4 μl NotI) were added to each reaction tube. Was added to the tubes and the tubes were mixed by gentle pipetting. Ju The tubes were incubated for 2 hours at 37 ° C. and then inserted into the magnet for 2 minutes. The supernatant containing the cDNA molecules is collected in a new tube and the beads are Gently resuspend in TE buffer, reinsert in magnet for 2 minutes and wash this The supernatant from was combined with the supernatant containing the cDNA molecules from above. On the pool For each tube containing lysate, add 70 μl phenol: chloroform: isoa Add mill alcohol (25: 24: 1) and vortex the tube thoroughly And centrifuged at 14,000 xg for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, 65 μl Remove the upper aqueous layer from each tube and add a new microcentrifuge tube. And 32 μl of 7.5 M ammonium acetate, 1 μl (20 μg) of glycogen And 250 μl of cold (−20 ° C.) absolute ethanol was added to each tube. Next Mix tubes and store on dry ice or at -70 ° C for 15 minutes. And then centrifuged at 14,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. Remove the supernatant Add and discard, add 100 μl 70% ethanol to the pellet, and tube Was centrifuged at 14,000 xg for 2 minutes at room temperature. Remove and discard the supernatant And dry the pellet in a speed-vac, then TE buffer (50-200 ng) 10 μl for input mRNA or 100 μl for 200-5000 ng of input mRNA) I understand. Final cDNA yield was determined by Cerenkov counting. Example 2: Vector ligation of cDNA and introduction into host cells Ligation of 10 to 50 ng of cDNA into a vector (eg, pCMVSPORT) Leverage the ligation by pre-digesting the cloning vector with NotI and SmaI. SUPERSCRIPT Plasmid System manual (Life Technologies, In E.coll was introduced by transformation as described in c.). In one such ligation, 50 ng of vector was added to 4 μl of 5 × T4 D NA ligase buffer (250 mM TRIS-HCl (pH7.6), 50 mM MgCl_Two, 5mM ATP, 5mM DT T, 25% (w / v) PEG-8000), and 1 μl T4 ligase (1 unit) Ligation of the cDNA in a 1.5 ml microcentrifuge tube at 4 ° C for 16 hours Was. Example 3: Comparison of cDNA yield To examine the efficiency and yield of cDNA synthesis by the method of the present invention, And the amount produced is converted to an alternative commercially available system (SUPERSCRIPT Plasmid). System: Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland) Compared to the amount. Briefly, pCMV / SPORT-cDNA ligation was performed using MAX EFFICIENCY And the transformation efficiency was determined. For each experiment, 48 For randomly selected colonies, SP6 and T7 promoter primers, Size of the cDNA insert by using 40 cycles of PCR. Released. Table 1 shows the percentage of cDNA yield obtained using the SuperScript Plasmid System. 3 shows a comparison of cDNA yields obtained by the method of the present invention. Table 1. Comparison of the present invention with the SUPERSCRIPT Plasmid System These results indicate that the present invention is about 3-4 times better than the SUPERSCRIPT Plasmid System. Demonstrates that it produces a reduced cDNA yield. Further, the present invention relates to a SUPERSCRIPT Pl Almost equivalent to the transformation efficiency and average insert size obtained with the asmid System Excellent transformation efficiency and average insert size were demonstrated. Therefore, the present invention Does not involve the use of a cDNA size fractionation step, which is time consuming and reduces yield , A method for the rapid and efficient production of full-length cDNA molecules. Example 4: cDNA generation and isolation using different amounts of input mRNA Since the method of the present invention has been demonstrated to produce cDNA quickly and efficiently, The effect of the present invention in generating cDNA from various amounts of input mRNA was investigated. In these studies, the amount of input mRNA was varied from 5 ng to 1 μg and cDN A Determine yield, transformation efficiency, and average insert size as described above. Was. Table 2 shows the results. Table 2. CDNA yield using different amounts of input mRNA These results indicate that the present invention shows that a large cDNA Rally (ie 10^FiveMore than one clone). In the past, PCR (the process of biasing a cDNA library) has been used to This was the only method that allowed the generation of a cDNA library from E. coli. The above results Taken together, these results indicate that the present invention provides various amounts of input mRNA (low levels of expression And therefore, mRNA containing only poly A + or a small fraction of the total RNA pool) Show that high-quality, full-length cDNA molecules can be generated quickly and efficiently. The present invention will now be described, by way of illustration and example, for purposes of clarity of understanding. Although described in some detail in detail, the scope of the invention or any particular embodiment thereof is Extensive and etc. of conditions, formulations, and other parameters without affecting the The present invention can be carried out by modifying or changing the present invention within a reasonable range. And such modifications or changes are encompassed within the scope of the appended claims. It is clear to a person skilled in the art that this is intended. All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are subject to the present invention. Indicates the level of skill of those skilled in the art to which this belongs, as well as each individual publication, patent, Or that the patent application is specifically and individually indicated to be incorporated by reference. To the same extent as is incorporated herein by reference.

Claims

[Claims] 1. A method for producing a nucleic acid molecule, comprising: (A) a nucleic acid template, and (i) a polymerase activity and / or a reverse transcriptase activity. One or more polypeptides, and (ii) primer-adapter nucleic acid components Mixing with the child; and (B) sufficient to produce a first nucleic acid molecule complementary to all or a portion of the template; Incubating the mixture under suitable conditions, The primer-adapter nucleic acid molecule comprises one or more ligands and one or more A method comprising the step of containing a cleavage site. 2. Wherein the first nucleic acid molecule comprises the primer-adaptor nucleic acid molecule; The method of claim 1. 3. The method according to claim 1, wherein the template is RNA or DNA. 4. 4. The method of claim 3, wherein said RNA is an mRNA or a poly A + RNA molecule. 5. 2. The method according to claim 1, wherein said first nucleic acid molecule is RNA or DNA. 6. 2. The method of claim 1, wherein the polypeptide is Moloney leukemia virus. Rus (M-MLV) reverse transcriptase, Rous sarcoma virus (RSV) reverse transcriptase, avian myeloblast Cocculovirus (AMV) reverse transcriptase, Tne DNA polymerase, Tma DNA polymerase , Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Tli or VENT^TMDNA polymerer Ze, Pfu or DEEPVENT^TMDNA polymerase, Pwo DNA polymerase, Bst DNA poly Merase, Sac DNA polymerase, Tac DNA polymerase, Tfl / Tub DNA polymerase Ase, Tru DNA polymerase, DYNAZYME^TMDNA polymerase, Mth DNA polymerase Ze, Rous-associated virus (RAV) reverse transcriptase, myeloblastosis-associated virus (MAV) reverse Transcriptase, human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase, retroviral reverse transcription Enzyme, retrotransposon reverse transcriptase, hepatitis B virus reverse transcriptase, caliph Lawr mosaic virus reverse transcriptase, bacterial reverse transcriptase, and mutants, modified A method selected from the group consisting of variants and derivatives. 7. 5. The method according to claim 4, wherein said first nucleic acid molecule is a cDNA molecule. 8. Wherein said cleavage site is from said primer-adaptor nucleic acid molecule; The method of claim 1, wherein the method allows removal of at least one of the codes. 9. The cleavage site is at least one of the ligands from the first nucleic acid molecule; 3. The method according to claim 2, which allows for the removal of 10. 2. The method of claim 1, wherein the ligand molecule is: (i) biotin; (Ii) antibody; (iii) enzyme; (iv) lipopolysaccharide; (v) apotransferrin; (vi) insulin; (viii) cytokines (proliferation) Factor, interleukin, or colony stimulating factor); (ix) gp120; (x) β- (Xi) LFA-1; (xii) Mac-1; (xiii) glycophorin; (xiv) lamini (Xv) collagen; (xvi) fibronectin; (xvii) vitronectin; (Xviii) Integrin α_Vβ₁And α_Vβ_Three; (Xix) integrin α_Threeβ₁, Α_Four β₁, Α_Fourβ₇, Α_Fiveβ₁, Α_Vβ₁, Α_IIbβ_Three, Α_Vβ_Three, And α_Vβ₆; (Xx) Inn Tegulin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, And α_Vβ_Three; (Xxi) integrin α₁β₁ , Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, Α₆β₁, Α₇β₁, And α₆β_Five(Xxii) ankyrin; (xx iii) C3bi, fibrinogen, or factor X; (xxiv) ICAM-1 or ICAM-2 (Xxv) spectrin or hodrin; (xxvi) CD4; (xxvii) cytokine (Eg, growth factor, interleukin, or colony stimulating factor) (Xxviii) insulin receptor; (xxix) transferrin receptor; ( xxx) Fe⁺⁺⁺; (Xxxi) polymyxin B or endotoxin neutralizing protein ( ENP); (xxxii) enzyme-specific substrate; (xxxiii) protein A, protein G, Vesicle surface Fc receptor or antibody-specific antigen; and (xxxiv) avidin and And streptavidin A method selected from the group consisting of: 11. The cleavage site is a restriction endonuclease cleavage site or an endonuclease. 2. The method of claim 1, wherein the site is a protease cleavage site. 12. 3. The method according to claim 2, wherein the method further comprises: Under conditions sufficient to produce a second nucleic acid molecule that is wholly or partially complementary to the second nucleic acid molecule, A method comprising incubating one nucleic acid molecule. 13. 13. The method of claim 12, wherein said second nucleic acid molecule is an RNA or DNA molecule. Law. 14． The first and second nucleic acid molecules form a double-stranded nucleic acid molecule. 3. The method according to 2. 15. The method according to claim 14, wherein the double-stranded nucleic acid molecule is a double-stranded cDNA molecule. . 16. The step of incubating comprises: the first nucleic acid molecule and a DNA polymerase. Mixing the ze, one or more nucleotides, and one or more primers 13. The method of claim 12, comprising. 17． The primer contains one or more ligands and one or more cleavage sites 17. The method of claim 16, which is a primer-adapter. 18. 3. The method of claim 2, wherein said method further comprises one or more of said ligands. Binds to one or more haptens, thereby producing a nucleic acid-ligand-hapten complex. A method comprising forming a coalescence. 19. 13. The method of claim 12, wherein the method further comprises one or more of the rigs. Binds to one or more haptens, thereby providing a nucleic acid-ligand-hapten A method comprising forming a complex. 20. 20. The method according to claim 18 or claim 19, wherein the method further comprises the cutting. Isolating the nucleic acid molecule from the complex by cleavage of one or more sites. Including, methods. 21. 21. The method according to claim 20, wherein the nucleic acid molecule is a double-stranded or single-stranded nucleic acid molecule. The method described. 22. 19. The method of claim 18, wherein the one or more haptens are bound to a solid support. 20. The method according to 19. 23. 23. The method according to claim 22, wherein the solid support is nitrocellulose. , Diazocellulose, glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene , Polyethylene, dextran, sepharose, agar, starch, nylon, la Tex beads, magnetic beads, paramagnetic beads, superparamagnetic beads, and micro A method selected from the group consisting of titer plates. 24. 20. The method according to claim 18 or claim 19, wherein the one or more haptens are : (I) avidin and streptavidin; (ii) protein A, protein G, a cell surface Fc receptor, or an antibody-specific antigen; (iii) an enzyme-specific substrate; (Iv) polymyxin B or endotoxin neutralizing protein (ENP); (v) F e⁺⁺⁺(Vi) transferrin receptor; (vii) insulin receptor; (v iii) cytokines (eg, growth factors, interleukins, or colony stings) (Ix) CD4; (x) spectrin or fodrin; (xi) IC (Xiii) C3bi, fibrinogen, or factor X; (Xiii) AM-I or ICAM-2; ) Ankyrin; (xiv) integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, Α₆β₁, Α₇β₁ , And α₆β_Five: (Xv) integrin α₁β₁, Α_Twoβ₁, Α_Threeβ₁, And α_Vβ_Three ; (Xvi) integrin α_Threeβ₁, Α_Fourβ₁, Α_Fourβ₇, Α_Fiveβ₁, Α_Vβ₁, Α_IIbβ_Three, α_Vβ_Three, And α_Vβ₆; (Xvii) integrin α_Vβ₁And α_Vβ_Three; (Xviii) Vitronectin; (xix) fibronectin; (xx) collagen; (xxi) lamini (Xxii) glycophorin; (xxiii) Mac-1; (xxiv) LFA-1; (xxv) β-activator (Xxvi) gp120; (xxvii) cytokines (growth factors, interleukins, Or (xxviii) insulin; (xxix) ferrotransf (Xxx) apotransferrin; (xxxi) lipopolysaccharide; (xxxii) enzyme; xxxiii) a method selected from the group consisting of: antibodies; and (xxxiv) biotin. 25. 3. The method of claim 2, wherein the method further comprises the step of: A method comprising the step of amplifying. 26. The amplification converts the first nucleic acid molecule to a DNA polymerase, one or more nucleic acids. Incubate with leotide and one or more primers 26. The method of claim 25, wherein the method is accomplished by: 27. 27. The method of claim 26, wherein the primer is a primer-adapter. Method. 28. 13. The method of claim 12, wherein the method further comprises the first and second methods. A method of amplifying the nucleic acid molecule of the above. 29. 29. The method of claim 28, wherein the amplification comprises: (A) a first primer-adapter that is complementary to a portion of the first nucleic acid molecule The first nucleic acid molecule and the second nucleic acid molecule are complementary to a portion of the second nucleic acid molecule. A second nucleic acid molecule having a second primer-adaptor, a polymerase and Contacting with a polypeptide having reverse transcriptase activity. (B) a third nucleic acid molecule that is complementary to all or part of the first nucleic acid molecule; and Forming a fourth nucleic acid molecule that is complementary to all or a portion of the second nucleic acid molecule. Incubating the mixture under conditions sufficient for: (C) combining the first nucleic acid molecule with a third nucleic acid molecule and the second nucleic acid molecule with a third nucleic acid molecule; Denaturing 4 nucleic acid molecules; and (D) repeating the steps (a) to (c) one or more times; A method achieved by a method comprising: 30. The first primer-adaptor or the second primer adapter 30. The method of claim 29, wherein-is replaced with an oligonucleotide primer. . 31. 30. The method of claim 29, wherein the method further comprises one of the ligands. The above binds to one or more haptens, thereby retaining said amplified nucleic acid. Forming a nucleic acid-ligand-hapten complex. 32. 32. The method of claim 31, wherein the method further comprises one of the cleavage sites. A step of isolating the nucleic acid from the complex by cutting the above. How. 33. A nucleic acid molecule comprising one or more primer-adapter molecules, An immer-adapter molecule comprises one or more ligands and one or more cleavage sites. A nucleic acid molecule. 34. The one or more cleavage sites are for the one or more ligands from the nucleic acid molecule. 34. The nucleic acid molecule of claim 33, which allows for removal. 35. 34. The method of claim 33, wherein the ligand is bound to one or more haptens. Nucleic acid molecule. 36. 36. The one or more haptens of claim 35, wherein the one or more haptens are bound to a solid support. Nucleic acid molecule. 37. The cleavage site is a restriction endonuclease site or an endonuclease 34. The nucleic acid molecule of claim 33, which is a cleavage site. 38. The nucleic acid component according to claim 33, wherein the nucleic acid molecule is double-stranded or single-stranded. Child. 39. The nucleic acid molecule is a DNA molecule, an RNA molecule, or a DNA / RNA hybrid molecule. 39. The nucleic acid molecule of claim 38. 40. A nucleic acid molecule produced by the method of claim 1 or claim 12. 41. A kit for the production of a nucleic acid molecule comprising one or more containers, comprising: Containers contain primers containing one or more ligands and one or more cleavage sites. A kit containing an adapter molecule. 42. One or more polypeps having polymerase and / or reverse transcriptase activity 42. The key of claim 41, further comprising one or more additional containers containing a tide. To 43. One or more haptens capable of specifically recognizing and binding the ligand 42. The system of claim 41, further comprising one or more additional containers comprising a solid support containing the same. The kit according to 1. 44. A method for producing a cDNA molecule, comprising: (A) mRNA template, polypeptide and primer having reverse transcriptase activity Mixing the adapter nucleic acid molecule with the primer-adaptor molecule. Comprises one or more ligands and one or more cleavage sites; (B) sufficient to produce a first DNA molecule complementary to all or a portion of the template The mixture is incubated under mild conditions, thereby allowing the DNA-primer- The process of forming adapter molecules (C) The DNA-primer-adaptor molecule is used for ligand-hapten interaction. Binding to a solid support via (D) cleaving the one or more cleavage sites to remove the second Isolating one DNA molecule, A method comprising: 45. 45. The method of claim 44, wherein the method further comprises the first DNA molecule. Producing a second DNA molecule that is complementary to all or a portion of the method. 46. The second DNA molecule is produced before or after isolation of the first DNA molecule. 46. The method of claim 45, wherein 47. The second DNA molecule comprises a primer-adaptor molecule. 46. The method according to 46. 48. 45. The method of claim 44, wherein the method comprises the steps of: A method used to prepare a library. 49. A method for producing a cDNA molecule, the method comprising: (A) an mRNA template, one or more polypeptides having reverse transcriptase activity, Is used to create a first DNA molecule that is complementary to all or a portion of the template. Incubating under sufficient conditions; (B) combining the first DNA molecule and a primer-adaptor molecule with a primer- Under conditions sufficient to form a double-stranded DNA molecule containing the adapter molecule, Cuvating, wherein the primer-adaptor molecule comprises one or more Containing the above ligand and one or more cleavage sites; (C) supporting the double-stranded DNA molecule on a solid support via ligand-hapten interaction Binding to the body; and (D) cleaving the one or more cleavage sites to remove the 2 Isolating a single-stranded DNA molecule, A method comprising: 50. 50. The method of claim 49, wherein the method comprises the steps of: A method used to prepare a library. 51. A method for isolating an mRNA molecule, the method comprising: (A) RNA sample and primer-adapter that hybridizes to mRNA Mixing the mRNA with the primers, thereby forming an mRNA-primer-adaptor molecule. Wherein the primer-adaptor molecule comprises one or more ligands and A step containing one or more cleavage sites; (b) the mRNA-primer-adaptor Binding the molecule to the solid support via a ligand-hapten interaction; Love (C) cutting the mR from the solid support by cleaving the one or more cleavage sites. Isolating the NA molecule, A method comprising: 52. 52. The primer-adaptor molecule comprises an oligo (dT). The method described in. 53. A method for isolating one or more desired nucleic acid molecules from a population of nucleic acid molecules And the following (A) the population of nucleic acid molecules and one or more target-specific primer-adapter components Mixing with the offspring; (B) sufficient to bind the primer-adaptor molecule to the desired nucleic acid molecule; Incubating the mixture under simple conditions; (C) isolating one or more of the desired nucleic acid molecules; A method comprising: