JP2002501082A

JP2002501082A - β１インテグリンサブユニット依存性細胞接着調節活性を有するペプチド

Info

Publication number: JP2002501082A
Application number: JP2000528590A
Authority: JP
Inventors: ビー．マッカーシー，ジェームズ; ティー．ファークト，レオ; ブリエンゾ，アンジェラ
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1999-01-21
Publication date: 2002-01-15
Also published as: CA2319207A1; EP1049710A1; WO1999037669A1

Abstract

(57)【要約】Ｃ末端の芳香族アミノ酸残基及び２番目のＣ末端の残基として親油性アルキル側鎖を有するアミノ酸残基を含むβ１インテグリンサブユニット依存性細胞接着を調節することができるペプチドを供する。これらの“ＬｉｐＡｒ”Ｃ末端ペプチドは、典型的にはＲａｍｏｓ細胞のような細胞のβ１インテグリンサブユニット依存性接着を調節することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景細胞外マトリックス（“ＥＣＭ”）タンパク質の及び他の細胞の細胞認識は、
複数の別個の細胞表面レセプターに関する複合分子基質を有する。インテグリン
はＥＣＭタンパク質への細胞接着を媒介するために根本的に重要であるレセプタ
ーのファミリーである。腫瘍細胞は、侵入し転移する時に他の細胞上の種々のＥ
ＣＭタンパク質及び分子に接着する。これらの腫細胞の相互作用はそれらの表現
型に顕著な効果を有する。その正確な役割は複雑であり完全に理解されていない
が、α４β１インテグリンは腫瘍細胞抑制（ａｒｒｅｓｔ）及び／又は管外遊出
に関係しており、腫瘍細胞侵入及び転移に関係している。このインテグリンは多
くの造血細胞悪性腫瘍で及び黒色腫のような腫瘍でも発現される。α４β１イン
テグリンはＥＣＭ成分（例えばフィブロネクチン）並びに活性化された内皮細胞
及び他の細胞型上で発現されるＩｇスーパーファミリー接着レセプター（例えば
ＶＣＡＭ−１）の両方に結合する点でインテグリンの中でも特有である。α４β
１インテグリンはそれ自体にも結合して同型細胞接着を促進する。α４β１イン
テグリンのための役割は腫瘍細胞生物学の種々の点を調節することにおいて確立
されているが、α４β１インテグリンの機能が調節されるメカニズムは複数であ
り、十分に理解されていない。このような相互作用の性質を理解することはイン
テグリンでしばしば観察されるＥＣＭタンパク質での細胞型特異的挙動を説明す
る助けとなり得る。従って、このインテグリンに関連する複雑な相互作用の理解
を進める手段としてα４β１依存性細胞接着を調節することができるペプチドを
同定することの継え間ない必要性がある。

【０００２】発明の概要本発明は、β１インテグリンサブユニット依存性細胞接着を調節することがで
きるペプチドに関する。そのペプチドは、芳香族基を含む側鎖を有するＣ末端ア
ミノ酸残基（“−Ａｒ−”）及び２番目のＣ末端残基として親油性アルキル側鎖
基を有するアミノ酸残基（“−Ｌｉｐ−”）を含む。このＣ末端ジペプチド配列
は“ＬｉｐＡｒモチーフ”として本明細書に言及される。例えば、本発明の適切
なペプチドは、Ｃ末端チロシン残基及び２番目のＣ末端残基としてイソロイシン
を含み、即ちＣ末端“ＩＹモチーフ”（Ile-Tyr ）を含む。本ペプチドは比較的
多数のアミノ酸残基、例えば約１００アミノ酸残基まで又はそれ超を含んでよい
が、本明細書に開示されるように、ＬｉｐＡｒモチーフを含む極めて小さなペプ
チド、例えばジペプチドIle-Tyr 及びトリペプチドArg-Ile-Tyr もβ１依存性接
着を調節することができる。本ペプチドは、典型的には、約５０以下、好ましく
は約２５以下のアミノ酸残基を有する。ＬｉｐＡｒＣ末端ペプチドは、好まし
くは、細胞のβ１インテグリンサブユニット依存性接着、例えばＲａｍｏｓ細胞
のα４β１インテグリン依存性接着及び赤白血病細胞（例えば赤白血病細胞系Ｋ
５６２）のα５β１インテグリン依存性接着を阻害することができる。

【０００３】発明の詳細な記載本発明は、β１インテグリンサブユニット依存性細胞接着を調節することがで
きるペプチドに関する。これらのペプチドはＣ末端ＬｉｐＡｒモチーフを含み、
典型的には、β１インテグリンサブユニット依存性細胞接着、特にα４β１イン
テグリン依存性細胞接着を阻害することができる。本ペプチドは典型的には、α
２β１，α３β１及び／又はα５β１インテグリン依存性細胞接着を阻害するこ
ともできる。本明細書に用いる場合、用語“ＬｉｐＡｒモチーフ”は、Ｃ末端の
“Ａｒ”残基が芳香族基を含む側鎖を有するジペプチド配列をいう。芳香族基を
有する適切なアミノ酸残基の例には、チロシン（“Ｔｙｒ”）、フェニルアラニ
ン（“Ｐｈｅ”）、ヒスチジン（“Ｈｉｓ”）、及びトリプトファン（“Ｔｒｐ
”）がある。２番目のＣ末端“Ｌｉｐ”残基は、親油性アルキル側鎖基を含むア
ミノ酸である。本ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のα−カルボキシル基は、典型
的にはカルボン酸（−ＣＯ₂Ｈ）の形態である。本発明の好ましい実施形態にお
いて“Ｌｉｐ”及び“Ａｒ”残基はＬ−アミノ酸残基である。

【０００４】親油性アルキル側鎖基を有するアミノ酸残基の例にはロイシン（“Ｌｅｕ”）
、イソロイシン（“Ｉｌｅ”）、及びバリン (“Ｖａｌ”）がある。典型的には
、親油性側鎖基は、少くとも約３．０、好ましくは少くとも約４．０のＳＣＤＣ
（−ＲＴｌｎＫＤとして計算され、kcal／mol で表されるシクロヘキサン−水側
鎖分布係数）を有する。この適用の目的のため、ＳＣＤＣはRadzickaら、Bioche mistry, 27, 1664 (1988) に従って定義される。特定のアルキル側鎖基のＳＣＤ
Ｃが知られていない場合、ＳＣＤＣ値は、湿潤シクロヘキサンと水との間の分布
係数の測定により又はParkerら（Biochemistry, 25，5425 (1986))の方法に従っ
てＨＰＬＣ保持から得られる疎水性スケールを用いる同じアルキル側鎖基を含む
化合物の他の同様の化合物との比較により決定することができる。ロイシン、イ
ソロイシン、及びバリンのような親油性アルキル側鎖に対する類似性にかかわら
ず、最後から２番目の位置におけるメチオニンの挿入 (即ち“ＭＹ”Ｃ末端モチ
ーフ）は不活性なアナログを生じた。

【０００５】フィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメインの異なるフラグメントに対応す
る配列を有する４つのＣ末端チロシンでタグされたペプチドは、末梢血液単核細
胞及び脾臓細胞のフィブロネクチン及び内皮細胞単層への結合を阻害すると報告
されている（例えばWahlら、J.Clin.Invest., 94, 655-662 (1994)を参照のこと
）。これらのペプチドの２つ、ＦＮ−Ｃ／ＨＩ＋Ｙ及びＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ
はＣ末端ＬｉｐＡｒモチーフを含む。ＦＮ−Ｃ／ＨＩ＋Ｙのアミノ酸配列はYE
KPGSPPREV-VPRPRPGVY （配列番号：３８）である。ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのアミ
ノ酸配列はＷＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：１）である。他の２つのＴｙｒでタ
グしたフィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメイン関連ペプチドはＣ末端Ｌｉ
ｐＡｒモチーフを含まない（両ペプチドとも端は“ＴＹ”（Ｔｈｒ−Ｔｙｒ））
。これらの他の２つのフィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメインフラグメン
トのアミノ酸配列はKNNQKSEPLIGR-KKTY （ＦＮ−Ｃ／Ｈ II＋Ｙ；（配列番号：
３９））、及びＳＰＰＲＲＡＲＶＴＹ（ＦＮ−Ｃ／Ｈ IV＋Ｙ；（配列番号：４
０））である。全部で４つのＹでタグしたフラグメントは試験管内でフィブロネ
クチンへの白血球接着を阻害し、それら４つのうちの３つだけ、ＦＮ−Ｃ／Ｈ
Ｉ＋Ｙ，ＦＮ−Ｃ／Ｈ II＋Ｙ及びＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙが生体内ラットモデル
において抗炎症特性を示すと報告されている。それら４つのうちの１つ、ＦＮ−
Ｃ／ＨＶ＋Ｙは別の細胞外マトリックスタンパク質であるＶＣＡＭへの接着を
阻害しなければならないとも報告されている。その報告された結果は、Ｙでタグ
したフィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメインフラグメントの生物活性がそ
れらペプチドの各々の特定の配列の関数であることを示唆する。

【０００６】 β１インテグリン依存性細胞接着の阻害がインヒビターのキラリティーにより
行われるのか否かを検査するためにいくつかのアナログを調製した。ＦＮ−Ｃ／
ＨＶ＋Ｙ（配列番号：１）の全てのＤ型及びretro inverso ＦＮ−Ｃ／ＨＶ
＋Ｙの全てのＬ型（配列番号：４０；ＹＩＲＡＲＰＰＱＷの全てのＬ型、ＦＮ−
Ｃ／ＨＶ＋Ｙの逆プライマー配列）を調製し、８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞接
着アッセイで検査した。これら２つの化合物のいずれもＲａｍｏｓ細胞結合を阻
害せず、このことは、本ペプチドは、好ましくはＬ−エナンチオマーアミノ酸残
基の形態のＣ末端モチーフを含むことを示唆する。

【０００７】しかしながら、Ｃ末端ＬｉｐＡｒモチーフを保存する（即ちＣ末端Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒジペプチド配列を保持する）ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのアラニンノックアウト
アナログがβ１インテグリン依存性細胞接着を阻害することができることが驚く
ことに発見された。本明細書に用いる場合、用語“アラニンノックアウトアナロ
グ”は、１つの残基がアラニンに置換されているペプチドのアナログをいう。Ｆ
Ｎ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのアラニンノックアウトアナログのうち２つは、以前に刺激
化接着域形成に関連することが証明されている（例えばWoods ら、Mdec.Biol.Ce
ll, 4, 605-613 (1993))ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ内の“ＰＲＡＲＩ”モチーフ（Pr
o-Arg-Ala-Arg-Ile （配列番号：４１））内のアルギニン残基の一方のかわりに
置換されたアラニン残基を有する。これらのアラニンノックアウトアナログは、
アミノ酸配列ＷＱＰＰＲＡＡＩＹ（配列番号：８）及びＷＱＰＰＡＡＲＩＹ（配
列番号：１７）を有する。他のアラニンノックアウトアナログのうちの２つ、Ａ
ＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：３）、ＷＡＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：４）も、
非保存性アミノ酸置換によりＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙと異なる（各々Ｔｒｐのかわ
りにＡｌａ及びＧｌｎのかわりにＡｌａ）。

【０００８】本明細書に記載される例として、非保存性アミノ酸置換によりＦＮ−Ｃ／Ｈ
Ｖ＋Ｙと異なるがＣ末端ＬｉｐＡｒモチーフを保持するペプチドは、そのペプチ
ドの全体の物性特性がＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙと実質的に異なる場合でさえβ１イ
ンテグリンサブユニット依存性細胞接着を調節することができる。例えば、２つ
のアルギニン残基がアスパラギン酸残基により置換されているＦＮ−Ｃ／ＨＶ
＋ＹはＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙと少くとも同じくらい強力にＲａｍｏｓ細胞の８Ａ
２刺激化接着を阻害する。アナログ、ＷＱＰＰＤＡＤＩＹ（配列番号：３８）は
、それが、（ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙの＋２の実効電荷と対照的に）−２の全体の
実効電荷を有する場合でさえこの活性を示す。

【０００９】ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙの非保存性置換変異体がβ１インテグリンサブユニット
依存性細胞接着を阻害する能力を保持するという事実より驚くことは、ＦＮ−Ｃ
／ＨＶ＋Ｙに対してほとんど又は全く配列相同性がない他の短いＬｉｐＡｒ
Ｃ末端ペプチドもこの型の生物活性を有するという事実である。本明細書に開示
される結果は、ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ又はＦＮ−Ｃ／ＨＩ＋Ｙの対応するＣ末
端部分と５０％未満の相同性を有するペプチドでさえ、β１インテグリンサブユ
ニット依存性接着を阻害する能力を示すことを確立する。このようなペプチドの
例には、ＡＲＩＴＧＹIIＹ（配列番号：１４）、ＲＡＲＩＴＧＹＩＹ（配列番号
：１３）、ＰＲＱＡＷＲＰＩＹ（配列番号：１８）及びＲＰＡＰＱＲＷＩＹ（配
列番号：２０）がある。

【００１０】本明細書に用いる場合、用語“相同性（％）”は、もとのペプチド配列のもの
と同一であるか又は保存性アミノ酸置換の結果としてのみもとのペプチド配列か
ら異なるペプチドのアミノ酸残基のパーセンテージをいう。例えば、ペプチドＰ
ＡＩＦＤＲＳＣＧＳはペプチド配列ＰＫＶＭＥＲＴＣＤＳに対して４０％の同一
性及び８０％の相同性である。

【００１１】本発明の目的のため、保存性アミノ酸置換は、次の残基のクラス：クラスＩ：
Ala, Gly, Ser, Thr、及びPro (小さな脂肪族側鎖及びヒドロキシル基側鎖を示
す）；クラスII：Cys, Ser, Thr 及びTyr （−ＯＨ又は−ＳＨ基を含む側鎖を示
す) ；クラスIII ：Glu, Asp, Asn 及びGln （カルボキシル基含有側鎖）；クラ
スIV：His, Arg及びLys （塩基性側鎖を示す) ；クラスＶ：Ile, Val, Leu, Phe
及びMet (疎水性側鎖を示す) ；及びクラスVI：Phe, Trp, Tyr 及びHis (芳香
族側鎖を示す) のうちの１つの中からのアミノ酸残基の交換から生ずると定義さ
れる。それらクラスは、関連するアミノ酸、例えばクラスＩ内の３Ｈｙｐ及び４
Ｈｙｐ、クラスII内のホモシステイン；クラスIII 内の２−アミノアジピン酸、
２−アミノピメリン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、β−カルボキシアスパラ
ギン酸、及び対応するアミノ酸アミド；クラスIV内のオルニチン、ホモアルギニ
ン、Ｎ−メチルリシン、ジメチルリシン、トリメチルリシン、２，３−ジアミノ
プロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、ホモアルギニン、サルコシン及びヒドロ
キシリシン；クラスＶ内の置換化フェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン
、２−アミノオクタン酸、２−アミノヘプタン酸、スタチン及びβ−バリン；並
びにクラスVI内のナフチルアラニン、置換化フェニルアラニン、テトラヒドロイ
ソキノリン−３−カルボン酸、及びハロゲン化チロシンも含む。

【００１２】本発明の別の実施形態において、ペプチドは、１０以下のアミノ酸残基を含み
、ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのアミノ酸配列に実質的に対応しない配列を有する。本
明細書に用いる場合、特定のペプチドの配列は、その特定のペプチドが引用配列
と約８０％未満の同一性、好ましくは約５０％未満の相同性を有するなら、その
引用アミノ酸配列に実質的に対応しない。

【００１３】本発明の特に適したペプチドの１つのグループは、Ｃ末端“ＩＩＴ”モチーフ
を含むもの、即ち最もＣ末端の３つのアミノ酸残基の配列がIle-Ile-Tyr である
ものである。１つのこのようなペプチドは９アミノ酸残基を含み、配列：ＡＲＩ
ＴＧＹＩＩＹ（配列番号：１４）を有する。コスト、製造の容易さ及び全体の効率を含む種々の観点から、本ペプチドのよ
り小さな型が多くの明確な利点を供し得る。これにより、本発明の特に有利なペ
プチドの１つのグループは、Ｃ末端ＩＹモチーフを含み、１０以下、好ましくは
６以下のアミノ酸残基を含む。ジペプチドIle-Tyr に加えて、このグループの適
切な例には、ＰＲＡＲＩＹ（配列番号：２４）、ＲＡＲＩＹ（配列番号：２５）
、ＡＲＩＹ（配列番号：２６）及びＲＩＹがある。

【００１４】ペプチドの合成本発明のペプチドは、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）又は９−フルオ
レニルメトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）保護基のいずれかに基づいて標準的方
法を用いて固相法により合成することができる。この方法は、その開示が引用に
より本明細書に組み込まれるG.B.Fieldsら（Synthetic Peptides: A User's Gui de , W.M.Freeman & Company, New York, NY, pp.77-183 (1992) により記載され
る。ペプチド構造及び純度は、ＨＰＬＣ、並びにアミノ酸分析及び配列決定によ
って分析することができる。

【００１５】本ペプチドは、当業者に公知である組換え技術により合成することもできる。
例えば、その開示が引用により本明細書に組み込まれる米国特許５，５９５，８
８７は、結合性タンパク質及び要求される標的ペプチドの１又は複数のコピーを
含む融合タンパク質をコードする組換え遺伝子構成物の発現を介して種々の比較
的小さなぺプチドを形成する方法を記述する。発現後に、融合タンパク質は、要
求される標的ペプチドを生産するために化学的及び／又は酵素的方法を用いて単
離され、開裂される。

【００１６】本明細書の例に記述されるペプチドは、固相法によって合成することができる
。表Ｉ及びIIは、本明細書で報告される実験に記載されるペプチドのアミノ酸配
列を示す。以下の標準的一文字コード略語は、ペプチド内のアミノ酸残基を指す
ために用いる：Ａ−アラニン、Ｃ−システイン、Ｄ−アスパラテート、Ｅ−グル
タメート、Ｆ−フェニルアラニン、Ｇ−グリシン、Ｈ−ヒスチジン、Ｉ−イソロ
イシン、Ｋ−リシン、Ｌ−ロイシン、Ｍ−メチオニン、Ｎ−アスパラギン、Ｐ−
プロリン、Ｑ−グルタミン、Ｒ−アルギニン、Ｓ−セリン、Ｔ−トレオニン、Ｖ
−バリン、Ｗ−トリプトファン、Ｙ−チロシン。

【００１７】ペプチド担体コンジュゲート本発明のペプチドは、一価状態（即ち遊離ペプチド又は担体分子に結合した単
一ペプチドフラグメント）で用いることができる。そのペプチドは、単一担体分
子に結合した１を超える (同じ又は異なる) ペプチドフラグメントを有するコン
ジュゲートとして用いることもできる。担体は、生物担体分子 (例えばグリコサ
ミノグリカン、プロテオグリカン、アルブミン等) 又は合成ポリマー (例えばポ
リアルキレングリコール又は合成クロマトグラフィー支持体）であってもよい。
典型的には、オブアルブミン、ヒト血清アルブミン、他のタンパク質、ポリエチ
レングリコール等を担体として用いることができる。このような改良は見掛け上
のアフィニティーを増加させ、及び／又はペプチドの安定性を変化させることが
できる。各々の担体に会合する又は結合するペプチドフラグメントの数は、種々
であるが、担体分子当り約４〜８のペプチドフラグメントが標準的カップリング
条件下で典型的に得られる。

【００１８】例えば、ペプチド／担体分子コンジュゲートは、ペプチド及び担体分子の混合
物をカップリング剤、例えばカルボジイミドで処理することにより調製すること
ができる。カップリング剤は、カルボキシル基が他のペプチド／担体分子のメン
バー上の求核基（例えばアミノ又はヒドロキシル基）と反応してペプチド及び担
体分子の共有結合を形成することができるように、ペプチド又は担体分子のいず
れか上のカルボキシル基を活性化することができる。好ましくは、そのコンジュ
ゲートは、ＬｉｐＡｒ末端のフラグメントのＣ末端芳香族アミノ酸のα−カルボ
キシル基とアミド結合を介して担体分子に連結しない少くとも１つのペプチドフ
ラグメントを含む。

【００１９】例えば、オブアルブミンに結合したペプチドのコンジュゲートは、等量の凍結
乾燥したペプチド及びオブアルブミンを少量の水に溶かすことによって調製する
ことができる。第２のチューブにおいて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノ−プロピル）−カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ；ペプチドの量の１
０倍）を少量の水に溶かす。そのＥＤＣ溶液をペプチド／オブアルブミン混合物
に加え、数時間、反応させた。次にその混合物を（例えばリン酸緩衝塩類溶液に
）透析してペプチド／オブアルブミンコンジュゲートの精製溶液を得ることがで
きる。この方法で調製されたペプチド／担体コンジュゲートは、典型的には、オ
ブアルブミン分子当り約４〜５のペプチドフラグメントを含む。

【００２０】本発明は、以下の詳細な例を引用することにより更に記述されよう。それらの
例は、詳述のために供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでな
い。

【００２１】実施例 α４β１依存性細胞接着の阻害についてのアッセイ以下に記載のアッセイを、特定のペプチドがβ１インテグリンサブユニットが
調節する細胞接着を阻害し、特にα４β１リガンドであるIII ＣＳ−ＧＳＴへの
α４β１依存性Ｒａｍｏｓ細胞接着を阻害することができるか否かを決定するた
めに行った。III ＣＳ−ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（“Ｇ
ＳＴ”）に融合した血漿フィブロネクチンのIII 型ＣＳ領域（“III ＣＳ”）か
らのフラグメントを含む組換え生産された融合タンパク質である。フィブロネク
チンフラグメントはフィブロネクチンアミノ酸残基１９６１〜２０３９に相当し
(米国特許４，８３９，４６４に示されるフィブロネクチンについての配列ナン
バリング）、DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST （配列番号：２９）アミノ酸配列（“
ＣＳＩ”；フィブロネクチン残基１９６１〜１９８５）を含む。ＣＳＩ配列を有
する合成で調製されたペプチドはヒトリンパ球上α４β１インテグリンと相互作
用して細胞接着を促進するがヘパリンに結合しないことが示されている。アッセ
イにおいて、９６ウェルプレートを基質III ＣＳ−ＧＳＴでコートした。β１活
性化モノクローナル抗体８Ａ２( “Ａｂ８Ａ２”）で刺激したＲａｍｏｓ細胞を
それらのIII ＣＳ−ＧＳＴに接着する能力について評価すべきペプチドの１つと
予めインキュベートした。

【００２２】その融合タンパク質は、血漿フィブロネクチンの残基１９６１−２０３９につ
いてのコーディング配列を増幅するためにＰＣＲプライマーを最初に用いること
により作製することができる。そのＰＣＲ産物はＧＳＴのための遺伝子と共に適
切な細菌発現ベクターに導入することができる。生じたベクターは、適切な宿主
細胞、例えば大腸菌に形質転換し、発現させて融合タンパク質を生産することが
できる。必要に応じて、融合タンパク質はグルタチオンカラムを用いて精製する
ことができる。ＧＳＴのみを９６ウェルプレートにコートする対照実験において
、８Ａ２活性化Ｒａｍｏｓ細胞の接着は観察されなかった。

【００２３】９６ウェルプレートを、１mM ＣａＣｌ₂，ＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳ（“ＰＢ
Ｓ／カチオン”）中で３〜５μｇ／mlに希釈した５０μｌ／ウェルのIII ＣＳ−
ＧＳＴで３回重複してコートし、３７℃で一晩、インキュベートした。III ＣＳ
−ＧＳＴ溶液を除去して、ウェルを３７℃で 1〜２時間、０．３％ＢＳＡを含
む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／カチオンでブロックした。アッセイの間、各々
のウェルはペプチドあり又はなしで１００μｌのＲａｍｏｓ細胞（１０，０００
細胞／ウェル）を含んだ。Ｒａｍｏｓ細胞を接着媒体（２０mMのＨＥＰＥＳ及び
３mg／mlのＢＳＡを含むフェノール・レッドを含まないＤＭＥＭ）で３回、洗浄
した。細胞を計数して２００，０００細胞／mlで再度懸濁した。濃縮したＲａｍ
ｏｓ細胞を２０分、３７℃で５０μｇの蛍光ラベルＢＣＥＣＦで標識し、３０μ
ｌのジメチルスルホキシド（“ＤＭＳＯ”）中に再度懸濁した。その標識した細
胞を遠心し、２００，０００細胞／mlの濃度で接着媒体に再度懸濁した。その細
胞を、２μｇ／mlの濃度の精製ＩｇＧ又は１：１０００培養上清で活性化Ａｂ８
Ａ２で活性化した。

【００２４】細胞を標識している時に、阻害性ペプチド希釈物を調製した。凍結乾燥したペ
プチドを計量し最大阻害濃度の２倍の保存濃度で接着媒体に再度懸濁した。ペプ
チドを溶液にするのが困難であった場合、それは最初に３０μｌのＤＭＳＯに再
度懸濁した。ペプチドがＤＭＳＯに懸濁することが必要である場合、 (対照を含
む) 特定の実験におけるペプチドの全てを３０μｌのＤＭＳＯに懸濁した。本明
細書に記載する例において研究したペプチドのうち、ジペプチド“Ile-Tyr ”の
みがこの技術の使用を要求した。ペプチドの投与量依存希釈物を接着媒体を用い
て保存ペプチドを希釈して調製した。標識された細胞を１００，０００細胞／ml
の最終濃度及び適切な最終ペプチド濃度で３７℃で５分、ペプチド希釈物と混合
した。

【００２５】９６ウェルプレートからブロッキング溶液を除去し、その細胞／ペプチド混合
物を１００μｌ／ウェル（１０，００００細胞／ウェル）で加え、３７℃で３０
分、インキュベートした。標準細胞／ペプチドのアリコート（１０００μｌ）を
、接着を定量するために３７℃においた。吸引を用いて、プレートから非接着細
胞を除去した。標準細胞を遠心して１０００μｌの接着媒体中で再度懸濁した。
その標準細胞を空のウェルに１００，８０，６０，４０，２０及び０μｌ／ウェ
ルで加えて各々１００％，８０％，６０％，４０％，２０％及び０％接着を供し
た。プレート蛍光を励起４８５及び放射５３０で読んだ。細胞接着を、接着した
ままの入力細胞の割合 (％) として表し、標準細胞で得られた蛍光の標準曲線に
より決定した。実験の蛍光の読みは、接着割合（％）を得るために標準曲線から
補外した。

【００２６】実施例１−ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋ＹのアラニンノックアウトアナログＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙのα４β１依存性細胞接着阻害活性のためにアミノ酸残
基が要求されるか否かを決定するために、アラニンにより置換された単一の個々
の残基を有する一連のアナログを検査した。結果を図１及び２に示す。接着を阻
害する能力を喪失させた唯一のアラニン置換はＣ末端から２番目の位置における
イソロイシン残基のアラニンでの置換であった、他のアラニンノックアウトペプ
チド全てがＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙのものに匹敵する細胞接着阻害を示した。対照
として、Ｃ末端チロシンを有するＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ配列のスクランブル型も
検査した（ＲＰＱＩＰＷＡＲＹ（配列番号：２））。Ｃ末端ＬｉｐＡｒモチーフ
を欠如するスクランブル配列は細胞接着を阻害しなかった。

【００２７】実施例２−Ｃ末端チロシンタグ化フィブロネクチンフラグメントいくつかの他のＣ末端をチロシンでタグしたフィブロネクチンフラグメントも
検査した。これらのペプチドは、フィブロネクチンのＣ末端に向かって１つのア
ミノ酸残基により増加的に置換されたチロシンでタグされた８残基フィブロネク
チンフラグメントに相当する（表１の配列番号：１０〜１６）。結果を図３及び
４に示す。予期せぬことに、Ｃ末端ＬｉｐＡｒモチーフを含むこれらのペプチド
のみがα４β１インテグリン依存性細胞接着を阻害することにおいて活性であっ
た。細胞阻害を有する最も活性なペプチドはＣ末端ＩＩＹ配列（−Ile-Ile-Tyr
−）の端を有するものであった。このペプチドの全配列はＡＲＩＴＧＹＩＩＹ（
配列番号：１４）であった。α４β１インテグリン依存性細胞接着阻害を示した
他の２つのＹでタグされたフィブロネクチンフラグメントはＲＡＲＩＴＧＹＩＹ
（配列番号：１３）であった。Ｃ末端Thr-Tyr （“ＴＹ”）、Gly-Tyr （“ＧＹ
”）、Tyr-Tyr （“ＹＹ”）又はLys-Tyr （“ＫＹ”）モチーフを有するＹでタ
グされたフィブロネクチンフラグメントはＲａｍｏｓ細胞のα４β１インテグリ
ン依存性接着を阻害しなかった。

【００２８】実施例３−スクランブルＩＹタグ化配列 α４β１依存性細胞接着の阻害へのＮ末端の７つのアミノ酸配列の効果を検査
するために、ＦＮＣ／ＨＶ＋ＹのIle-Tyr Ｃ末端スクランブル型を検査した
。２つのスクランブルペプチドの８アミノ酸ｄｅｓ−チロシンアナログの活性も
対照として検査した。図５及び６に示す結果は、明らかに、“ＬｉｐＡｒ”Ｃ末
端ペプチドＡＲＩＴＧＹＩＩＹ（配列番号：１４）、ＰＲＱＡＷＲＰＩＹ（配列
番号：１８）及びＲＰＡＰＱＲＷＩＹ（配列番号：２０）のみが細胞接着を阻害
することを示した。各々の例において、Ｃ末端チロシン残基を欠如する同一の最
初のアミノ酸配列はＲａｍｏｓ細胞接着を示さなかった。決定的でないのが、こ
の結果は、Ｃ末端ＬｉｐＡｒモチーフを有するペプチドがβ１インテグリンサブ
ユニット依存性細胞接着を阻害するために、配列のＮ末端部分についてはほとん
ど又は全く必要性がないことを強力に示唆する。

【００２９】実施例４−短いＩＹ末端ペプチドによる阻害 α４β１依存性細胞接着の阻害のために要求されるＩＹ−ペプチドの最小サイ
ズを確立するために、Ｎ末端残基を系統的に削除した一連のトランケートしたＦ
ＮＣ／ＨＶ＋Ｙアナログで研究を行った。結果を図７及び８に示す。そのデ
ータは“ＩＹ”ジペプチド自体がα４β１インテグリン依存性細胞接着を阻害す
ることができることを確立する。ジペプチドの活性はいくつかのより長いＩＹ末
端ペプチドで観察されたのよりも小さかった。６残基ペプチドＰＲＡＲＩＹ（配
列番号：２４）及び５残基ペプチドＲＡＲＩＹ（配列番号：２５）の細胞接着阻
害活性は、９残基ペプチドＹ−タグＦＮＣ／ＨＶのものと等モルベースで匹
敵した。これら２つの短いペプチドは両方とも２つのアルギニン残基（“Ｒ”）
を含み、中性pHで＋２の実効電荷を有する。配列ＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：
２２）、ＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：２３）、ＡＲＩＹ（配列番号：２６）及び
ＲＩＹを有する他の短いＩＹ末端ペプチドも、α４β１インテグリン依存性細胞
接着阻害活性を示した。ＡＲＩＹ（配列番号：２６）及びＲＩＹの細胞接着阻害
活性はＹ−タグ化ＦＮＣ／ＨＶのものと等モルベースで匹敵した。

【００３０】実施例５−Ile-Tyr 対Ｉｌｅ及び／又はＴｙｒの阻害対照実験として、単一アミノ酸、イソロイシン及びチロシンも、単独で及び混
合物の一部として、細胞接着阻害活性において検査した。図９に示す結果は、個
々のアミノ酸イソロイシン及びチロシンの混合物でさえ、ジペプチド“Ile-Tyr
”が活性である濃度近くでも細胞接着を阻害するのに不十分であることを確立し
た。

【００３１】実施例６−“Xaa-Tyr ”末端ペプチドによる阻害 “ＬｉｐＡｒ”モチーフの構造的要求を検査するために、α４β１依存性Ｒａ
ｍｏｓ細胞接着の阻害を、２番目のＣ末端アミノ酸残基での置換でいくつかのＦ
ＮＣ／ＨＶ＋Ｙアナログについて検査した。結果を図１０及び１１に示す。
２番目のＣ末端位置を置換した親油性脂肪族側鎖残基（Ｌｅｕ又はＶａｌ）を伴
う２つのアナログ、ＷＱＰＰＲＡＲＬＹ（配列番号：２８）及びＷＱＰＰＲＡＲ
ＶＹ（配列番号：２９）はＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙのものに匹敵する細胞接着阻害
活性を有した。２番目のＣ末端位置に塩基性残基（Ｌｙｓ）、ヒドロキシ側鎖残
基（Ｔｈｒ）、メチオニン残基（Ｍｅｔ）又はアラニン残基（Ａｌａ）を有する
対応するアナログはアッセイにおいて実質的に不活性であった。

【００３２】実施例７−Ｃ末端変異体による阻害 “ＬｉｐＡｒ”モチーフの構造的要求を検査するため、α４β１依存性Ｒａｍ
ｏｓ細胞接着の阻害を、Ｃ末端アミノ酸残基での置換を有するいくつかのＦＮ
Ｃ／ＨＶ＋Ｙアナログについて検査した。結果を図１２に示す。Ｃ末端位置に
芳香族基（Ｐｈｅ又はＴｒｐ）を含む側鎖を有するＣ末端アミノ酸残基を有する
２つのアナログ、ＷＱＰＰＲＡＥＩＲ（配列番号：３２）及びＷＱＰＰＲＡＲＩ
Ｗ（配列番号：３３）を、ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙのものに匹敵する細胞接着阻害
活性を有した。

【００３３】実施例８−Ｃ末端変異体による阻害異なる位置にあるＩＹモチーフを有するいくつかのＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙアナ
ログについてのα４β１依存性Ｒａｍｏｓ細胞接着の阻害を検査した。結果を図
１３に示す。Ｎ末端に“ＩＹ”モチーフを有するペプチド、ＩＹＷＱＰＰＲＡＲ
（配列番号：３４）、又はそのペプチドの中央部分、ＷＱＰＩＹＰＲＡＲ（配列
番号：３５）はアッセイにおいて不活性であった。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙアナロ
グのＣ末端でＩｌｅ及びＴｙｒ残基の順番を変えたもの、ＷＱＰＰＲＡＲＹＩ（
配列番号：３５）もα４β１依存性Ｒａｍｏｓ細胞接着阻害アッセイで不活性で
あるペプチドを生じた。最後に、ＦＮＣ／ＨＶ＋ＹのＣ末端から除去したチ
ロシンタグを有する対照ペプチド、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号：３５）もその
アッセイにおいて不活性であった。

【００３４】実施例９−負に荷電した“ＬｉｐＡｒ”ペプチドによる接着の阻害Ｒａｍｏｓ細胞接着阻害アッセイにおいて活性である上述の例に記載されるＬ
ｉｐＡｒ末端ペプチド全てが正味の正電荷を有する。この活性のために正味の正
電荷が要求されるか否かを決定するために。２つのアルギニン（正に荷電）をア
スパラギン酸残基（負に荷電）により置換したＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙアナログを
評価した。重要なのは、Ｃ末端“ＬｉｐＡｒ”モチーフ（“ＴＹ”）がこのペプ
チドＷＱＰＰＤＡＤＩＹ（配列番号：３８）において保持されたことであった。
図１４はアルギニンのアスパラギン酸残基での置換はβ１インテグリンサブユニ
ット依存性接着を阻害するペプチドの能力を変化させないことを明らかに示し、
それによりこの活性への“ＬｉｐＡｒ”の重要性を更に証明する。

【００３５】実施例１０−ＰＲＡＲＩＹ対ＰＲＡＲＩによる接着の阻害 β１インテグリンサブユニット依存性接着とのＣ末端ＬｉｐＡｒモチーフの相
関関係を更に証明する実験においてペプチドＰＲＡＲＩＹ（配列番号：２４）及
び末端芳香族残基（“Ｔｙｒ”）を欠如する対応する配列を、それらがＲａｍｏ
ｓ細胞アッセイにおいて接着を阻害する能力について評価した。Ｃ末端“Ｌｉｐ
Ａｒ”モチーフのための要求を証明する先の結果と一致して、ＰＲＡＲＩＹは III ＣＳ−ＧＳＴへのα４β１媒介Ｒａｍｏｓ細胞接着を阻害することができた
がＰＲＡＲＩはそうでなかった。（図１５を参照のこと）。

【００３６】実施例１１−α５β１インデグリン依存性接着の阻害Ｃ末端イソロイシン−チロシンによる接着の阻害がα４β１インテグリン接着
に限定されるか否かを決定するために、ペプチドＲＩＹ並びにイソロイシン−チ
ロシン（ＰＲＡＲＩＹ）及びイソロイシン（ＰＲＡＲＩ）をコードするペプチド
をα５β１インテグリン媒介細胞接着を阻害する能力について評価した。細胞接
着アッセイを上述の通り行った。１mM ＭｎＣｌ₂で刺激したＫ５６２細胞を示
される濃度のペプチドと共にプレインキュベートし、ＦＮに接着させた。結果を
図１６及び１７に示す。ここで、（Ｖ），（ｓＶ）は、各々ペプチドＦＮ−Ｃ／
ＨＶ−Ｙ及びスクランブルＦＮ−Ｃ／ＨＶ−Ｙを示す。各々のデータ点は、
３回重複の測定の平均を示し、誤差棒は、平均の標準偏差を示す。連結線は、陰
性対照基質、ＢＳＡへの接着を示す。

【００３７】 α５β１を発現するがα４β１インテグリンを発現しない赤白血病細胞系Ｋ５
６２のＦＮへの接着は、テストした最大濃度、０．８４mMでの可溶性ＲＧＤ又は
ＦＮ−Ｃ／ＨＶ−Ｙとプレインキュベーションの後、完全に阻害される（図１
６，１７）。可溶性ペプチドＲＧＤ及びＦＮ−Ｃ／ＨＶ−Ｙについての最大の
半分の阻害濃度は各々０．１mM及び０．２mMであった。更に、ペプチドＲＩＹ又
はＰＲＡＲＩＹはテストした最大濃度０．８４mMでＦＮへのα５β１依存性Ｋ５
６２接着を完全に阻害したが、ＰＲＡＲＩはそうでなかった。ＲＩＹ及びＰＲＡ
ＲＩＹの両方の最大の半分の阻害濃度はＲＧＤ及びＦＮ−Ｃ／ＨＶ−Ｙについ
て観察されたのと同様に約０．２mMであった。これらの結果は、ペプチドＦＮ−
Ｃ／ＨＶ−Ｙと同様に、最も小さな最大活性のペプチドＲＩＹ及びイソロイシ
ン−チロシンの端を有するペプチドは（α４β１に加えて）α５β１インテグリ
ン媒介接着を阻害したがイソロイシン（ＰＲＡＲＩ）はそうでなかった（図１６
及び１７を参照のこと）。

【００３８】実施例１２−α２β１，α３β１インテグリン依存性接着の阻害ヒト黒色腫細胞（Ｍ１４＃５）に基づくアッセイを用いてα２β１，α３β１
インテグリン依存性細胞接着を阻害するＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ（配列番号：１）
の能力を検査するために実験を行った。ラミニン、IV型コラーゲン及びＢＳＡを、１０μｇ／mlで９６ウェルマイクロ
タイタープレートで一晩、コートし、０．３％ＢＳＡでブロックした。Ｍ１４
＃５細胞を（０．４２mM ＦＮ−Ｃ／ＨＶ及びスクランブルＦＮ−Ｃ／ＨＶ
及び０．１７mM ＣＳＩと等量の）０．５mg／mlのペプチドとプレインキュベー
トし、３０分、基質に接着させた。

【００３９】可溶性ペプチドＦＮ−Ｃ／ＨＶはラミニン及びIV型コラーゲンでコートした
基質へのヒト黒色腫Ｍ１４＃５細胞接着を阻害したが、スクランブルＦＮ−Ｃ／
ＨＶは効果がなかった（図１８を参照のこと）。この接着は特定の抗インテグ
リンブロッキングｍＡｂを用いて測定して、α２β１及びα３β１インテグリン
に依存する（データは示さない）。

【００４０】実施例１３−α４β１インテグリン依存性接着の阻害へのキラリティーの影響本ペプチドによるβ１インテグリン依存性細胞接着の潜在的なキラル依存性を
、全てＤ型のＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ（配列番号：１）及び全てＬ型のretro inve
rso ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ（配列番号：４０；全てＬ型のＹＩＲＡＲＰＰＱＷ，
ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙの逆プライマリー配列）を調製することにより検査した。
これら２つの化合物を８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞接着アッセイにおいて検査し
た。

【００４１】結果（図１９に示す）は、ＦＮ−Ｃ／ＨＶ−Ｙの接着阻害活性へのキラル依
存性があることを示す。これは、Ｃ末端のイソロイシン−チロシンがＬ−エナン
チオマー型であるべきであることを示唆する。なぜならＤ−アミノ酸ＦＮ−Ｃ／
ＨＶ−Ｙ及び（逆プライマリー配列中Ｌ−アミノ酸からなる）retro-inverso
ＦＮ−Ｃ／ＨＶ−Ｙは両方とも接着を阻害できないからである。

【００４２】Ｒａｍｏｓ細胞及びβ１インデグリン刺激性ｍＡｂ８Ａ２を示される濃度の合
成ペプチドとプレインキュベートし、次にｒＣＳＩをコートしたウェルに加えた
。（Ｖ），（ｓＶ）は、各々ＦＮ−Ｃ／ＨＶ−Ｙ及びスクランブルＦＮ−Ｃ／
ＨＶ−Ｙを示す。各々のデータ点は３回の測定の平均を示し、誤差棒は平均の
標準偏差を示す。ＧＳＴへのＲａｍｏｓ接着のバックグラウンドを連続黒像で示
す。

【００４３】実施例１４−α１β２インテグリン依存性接着の阻害可溶性ＦＮ−Ｃ／ＨＶによる接着の阻害がｂ１インテグリンに特異的である
か否かを決定するために、このペプチドがβ２インテグリン依存性接着を阻害す
る能力も評価した。これらの研究のため、可溶性ＦＮ−Ｃ／ＨＶの存在下での
精製ｒＣＳＩ又は組換えＩＣＡＭへの（機能的α４β１及びα１β２インテグリ
ンの両方を発現する）Ｂ細胞系Ｍ１６Ｂの接着を研究した。予想通り、ｒＣＳＩ
へのα４β１インテグリン依存性Ｍｎ⁺²刺激化Ｍ１６Ｂ接着は可溶性ＦＮ−Ｃ／
ＨＶ及びＣＳＩにより完全に阻害された。しかしながら、ｒＩＣＡＭへのα１
β２（ＬＦＡ−１）インテグリン依存性接着は可溶性ＦＮ−Ｃ／ＨＶによって
阻害されなかった。但し、この接着は抗β２インテグリンブロッキングｍＡｂに
より阻害することができる。

【００４４】本発明は、種々の特定の及び好ましい実施形態及び技術を引用して記述されて
いる。しかしながら、本発明の精神及び範囲内にある多くのバリエーション及び
改良を行うことができることが理解されるはずである。表Ｉ−ペプチド配列配列番号アミノ酸配列実効電荷２ＲＰＱＩＰＷＡＲＹ＋２３ＡＱＰＰＲＡＲＩＹ＋２４ＷＡＰＰＲＡＲＩＹ＋２５ＷＱＡＰＲＡＲＩＹ＋２６ＷＱＰＡＲＡＲＩＹ＋２７ＷＱＰＰＡＡＲＩＹ＋１８ＷＱＰＰＲＡＡＩＹ＋１９ＷＱＰＰＲＡＲＡＹ＋２１０ＱＰＰＲＡＲＩＴＹ＋２１１ＰＰＲＡＲＩＴＧＹ＋２１２ＰＲＡＲＩＴＧＹＹ＋２１３ＲＡＲＩＴＧＹＩＹ＋２１４ＡＲＩＴＧＹIIＹ＋１１５ＲＩＴＧＹIIＫＹ０１６ＩＴＧＹIIＫＹＹ −１１７ＰＲＱＡＷＲＰＩ＋２１８ＰＲＱＡＷＲＰＩＹ＋２１９ＲＰＡＰＱＲＷＩ＋２２０ＲＰＡＰＱＲＷＩＹ＋２２１ＡＲＩＲＴＧII ＋１２２ＱＰＰＲＡＲＩＹ＋２２３ＰＰＲＡＲＩＹ＋２２４ＰＲＡＲＩＹ＋２２５ＲＡＲＩＹ＋２２６ＡＲＩＹ＋１２７ＷＱＰＰＲＡＲＫＹ＋１２８ＷＱＰＰＲＡＲＬＹ＋２２９ＷＱＰＰＲＡＲＶＹ＋２３０ＷＱＰＰＲＡＲＴＹ＋２３１ＷＱＰＰＲＡＲＭＹ＋２３２ＷＱＰＰＲＡＲＩＦ＋２３３ＷＱＰＰＲＡＲＩＷ＋２３４ＩＹＷＱＰＰＲＡＲ＋２３５ＷＱＰＩＹＰＲＡＲ＋２３６ＷＱＰＰＲＡＲＹＩ＋２３７ＷＱＰＰＲＡＲＩ＋２３８ＷＱＰＰＤＡＤＩＹー２３９ＰＲＡＲＩ＋２４０ＹＩＲＡＲＰＰＱＷ＋２

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのいくつかのアラニンノックアウトアナログの濃度の関
数としての、III ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）
のグラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びＣ末端ＩＹモチーフを欠如するスク
ランブル変異体（“ｓＶ”；ＲＰＱＩＰＷＡＲＹ（配列番号：２１）を対照とし
て含めた。

【図２】ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのいくつかのアラニンノックアウトアナログの濃度の関
数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）の
グラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対照
として含めた。

【図３】Ｃ末端チロシン残基でタグをしたいくつかのフィブロネクチンフラグメントの
濃度の関数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率
（％）のグラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓ
Ｖを対照として含めた。

【図４】Ｃ末端チロシン残基でタグをしたいくつかのフィブロラクチンの濃度の関数と
してのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラ
フを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対照とし
て含めた。

【図５】２つの“ＩＹ”Ｃ末端ペプチド及びそれらの対応する“ｄｅｓ−Ｙ”アナログ
の濃度の関数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着
率（％）のグラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログ
ｓＶを対照として含めた。

【図６】別の“ＩＹ”Ｃ末端ペプチド及びその対応する“ｄｅｓ−Ｙ”アナログの濃度
の関数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％
）のグラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを
対照として含めた。

【図７】ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙのいくつかのトランケートしたアナログの濃度の関数と
してのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラ
フを示す。対照としてＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶ
を含めた。

【図８】ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙのいくつかのトランケートしたアナログの濃度の関数と
してのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラ
フを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対照とし
て用いた。

【図９】 “ＩＹ”及びその成分の１つのアミノ酸残基の濃度の関数としてのIII ＣＳ−
ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラフを示す。ＦＮ
Ｃ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対照として用いた。

【図１０】ＦＮＣ／ＨＶ＋ＨのいくつかのＣ末端から２番目の置換変異体の濃度の関
数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）の
グラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対照
として用いた。

【図１１】ＦＮＣ／ＨＶ＋ＨのいくつかのＣ末端から２番目の置換変異体の濃度の関
数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）の
グラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対照
として用いた。

【図１２】ＦＮＣ／ＨＶ＋ＹのいくつかのＣ末端置換変異体の濃度の関数としてのII
I ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラフを示す
。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログを対照として用いた。

【図１３】ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙの“ＩＹ”配置変異体の濃度の関数としてのIII ＣＳ−
ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラフを示す。ＦＮ
Ｃ／ＨＶ＋Ｙ、そのスクランブルアナログｓＶ、及びタグしていないＦＮＣ
／ＨＶ（ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号：３７））を対照として用いた。

【図１４】負に荷電したＬｉｐＡｒで終わるペプチドの濃度の関数としてのIII ＣＳ−Ｇ
ＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラフを示す。ＦＮＣ
／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対照として用いた。

【図１５】ＰＲＡＲＩＹ（配列番号：２４）及びＰＲＡＲＩ（配列番号：３９）の濃度の
関数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴへの８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）
のグラフを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ及びそのスクランブルアナログｓＶを対
照として用いた。

【図１６】ＰＲＡＲＩＹ（配列番号：２４）及びＰＲＡＲＩ（配列番号：３９）の濃度の
関数としてのフィブロネクチン（“ＦＮ”）への赤白血病Ｋ５６２細胞のα５β
１インテグリン依存性Ｍｎ⁺²刺激化接着の接着率（％）のグラフを示す。ＦＮ
Ｃ／ＨＶ＋Ｙ、そのスクランブルアナログｓＶ、ＲＧＤ及びＢＳＡ（ウシ血清
アルブミン）を対照として用いた。

【図１７】ＲＩＹの濃度の関数としてのフィブロネクチン（“ＦＮ”）への赤白血病Ｋ５
６２細胞のα５β１インテグリン依存性Ｍｎ⁺²刺激化接着の接着率（％）のグラ
フを示す。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ、そのスクランブルアナログｓＶ、ＲＧＤ，Ｃ
ＳＩ及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を対照として用いた。

【図１８】ラミニン（“ＬＭ”）、IV型コラーゲン（“ＴＩＶ”）及びウシ血清アルブミ
ン（“ＢＳＡ”）へのα２β１，α３β１インテグリン依存性ヒトメラノーマＭ
１４＃５細胞接着の接着率（％）のグラフを示す。

【図１９】全てのＤ−ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙ（配列番号：１）、及びＦＮＣ／ＨＶ＋
Ｙのretro inverso 型対種々の対照の濃度の関数としてのIII ＣＳ−ＧＳＴに対
する８Ａ２刺激化Ｒａｍｏｓ細胞の接着率（％）のグラフを示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年８月１２日（１９９９．８．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】フィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメインの異なるフラグメントに対応す
る配列を有する４つのＣ末端チロシンでタグされたペプチドは、末梢血液単核細
胞及び脾臓細胞のフィブロネクチン及び内皮細胞単層への結合を阻害すると報告
されている（例えばWahlら、J.Clin.Invest., 94, 655-662 (1994)を参照のこと
）。これらのペプチドの２つ、ＦＮ−Ｃ／ＨＩ＋Ｙ及びＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ
Ｃ末端ＬｉｐＡｒモチーフを含む。ＦＮ−Ｃ／ＨＩ＋Ｙのアミノ酸配列はYEKP
GSPPREV-VPRPRPGVY （配列番号：４２）である。ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのアミノ
酸配列はＷＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：１）である。他の２つのＴｙｒでタグ
したフィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメイン関連ペプチドはＣ末端Ｌｉｐ
Ａｒモチーフを含まない（両ペプチドとも端は“ＴＹ”（Ｔｈｒ−Ｔｙｒ））。
これらの他の２つのフィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメインフラグメント
のアミノ酸配列はKNNQKSEPLIGR-KKTY （ＦＮ−Ｃ／Ｈ II＋Ｙ；（配列番号：４
３））、及びＳＰＰＲＲＡＲＶＴＹ（ＦＮ−Ｃ／Ｈ IV＋Ｙ；（配列番号：４４
））である。全部で４つのＹでタグしたフラグメントは試験管内でフィブロネク
チンへの白血球接着を阻害し、それら４つのうちの３つだけ、ＦＮ−Ｃ／ＨＩ
＋Ｙ，ＦＮ−Ｃ／Ｈ II＋Ｙ及びＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙが生体内ラットモデルに
おいて抗炎症特性を示すと報告されている。それら４つのうちの１つ、ＦＮ−Ｃ
／ＨＶ＋Ｙは別の細胞外マトリックスタンパク質であるＶＣＡＭへの接着を阻
害しなければならないとも報告されている。その報告された結果は、Ｙでタグし
たフィブロネクチンＣ末端ヘパリン結合ドメインフラグメントの生物活性がそれ
らペプチドの各々の特定の配列の関数であることを示唆する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】しかしながら、Ｃ末端ＬｉｐＡｒモチーフを保存する（即ちＣ末端Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒジペプチド配列を保持する）ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのアラニンノックアウト
アナログがβ１インテグリン依存性細胞接着を阻害することができることが驚く
ことに発見された。本明細書に用いる場合、用語“アラニンノックアウトアナロ
グ”は、１つの残基がアラニンに置換されているペプチドのアナログをいう。Ｆ
Ｎ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙのアラニンノックアウトアナログのうち２つは、以前に刺激
化接着域形成に関連することが証明されている（例えばWoods ら、Mdec.Biol.Ce
ll, 4, 605-613 (1993))ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙ内の“ＰＲＡＲＩ”モチーフ（Pr
o-Arg-Ala-Arg-Ile （配列番号：３９））内のアルギニン残基の一方のかわりに
置換されたアラニン残基を有する。これらのアラニンノックアウトアナログは、
アミノ酸配列ＷＱＰＰＲＡＡＩＹ（配列番号：８）及びＷＱＰＰＡＡＲＩＹ（配
列番号：１７）を有する。他のアラニンノックアウトアナログのうちの２つ、Ａ
ＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：３）、ＷＡＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：４）も、
非保存性アミノ酸置換により、ＦＮ−Ｃ／ＨＶ＋Ｙと異なる（各々Ｔｒｐのか
わりにＡｌａ及びＧｌｎのかわりにＡｌａ）。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】本明細書に用いる場合、用語“相同性（％）”は、もとのペプチド配列のもの
と同一であるか又は保存性アミノ酸置換の結果としてのみもとのペプチド配列か
ら異なるペプチドのアミノ酸残基のパーセンテージをいう。例えば、ペプチドＰ
ＡＩＦＤＲＳＣＧＳ（配列番号：４１）はペプチド配列ＰＫＶＭＥＲＴＣＤＳ（
配列番号：４５）に対して４０％の同一性及び８０％の相同性である。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】実施例 α４β１依存性細胞接着の阻害についてのアッセイ以下に記載のアッセイを、特定のペプチドがβ１インテグリンサブユニットが
調節する細胞接着を阻害し、特にα４β１リガンドであるIII ＣＳ−ＧＳＴへの
α４β１依存性Ｒａｍｏｓ細胞接着を阻害することができるか否かを決定するた
めに行った。III ＣＳ−ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（“Ｇ
ＳＴ”）に融合した血漿フィブロネクチンのIII 型ＣＳ領域（“III ＣＳ”）か
らのフラグメントを含む組換え生産された融合タンパク質である。フィブロネク
チンフラグメントはフィブロネクチンアミノ酸残基１９６１〜２０３９に相当し
(米国特許４，８３９，４６４に示されるフィブロネクチンについての配列ナン
バリング）、DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST （配列番号：４６）アミノ酸配列（“
ＣＳＩ”；のフィブロネクチン残基１９６１〜１９８５）を含む。ＣＳＩ配列を
有する合成で調製されたペプチドはヒトリンパ球上α４β１インテグリンと相互
作用して細胞接着を促進するがヘパリンに結合しないことが示されている。アッ
セイにおいて、９６ウェルプレートを基質III ＣＳ−ＧＳＴでコートした。β１
活性化モノクローナル抗体８Ａ２( “Ａｂ８Ａ２”）で刺激したＲａｍｏｓ細胞
をそれらのIII ＣＳ−ＧＳＴに接着する能力について評価すべきペプチドの１つ
と予めインキュベートした。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】実施例８−Ｃ末端変異体による阻害異なる位置にあるＩＹモチーフを有するいくつかのＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙアナ
ログについてのα４β１依存性Ｒａｍｏｓ細胞接着の阻害を検査した。結果を図
１３に示す。Ｎ末端に“ＩＹ”モチーフを有するペプチド、ＩＹＷＱＰＰＲＡＲ
（配列番号：３４）、又はそのペプチドの中央部分、ＷＱＰＩＹＰＲＡＲ（配列
番号：３５）はアッセイにおいて不活性であった。ＦＮＣ／ＨＶ＋Ｙアナロ
グのＣ末端でＩｌｅ及びＴｙｒ残基の順番を変えたもの、ＷＱＰＰＲＡＲＹＩ（
配列番号：３６）もα４β１依存性Ｒａｍｏｓ細胞接着阻害アッセイで不活性で
あるペプチドを生じた。最後に、ＦＮＣ／ＨＶ＋ＹのＣ末端から除去したチ
ロシンタグを有する対照ペプチド、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号：３５）もその
アッセイにおいて不活性であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０９６，２１２ (32)優先日平成10年８月12日(1998．8．12) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ファークト，レオティー．アメリカ合衆国，ミネソタ 55405，ミネアポリス，ウエストトゥエンティーファーストストリート 2100 (72)発明者ブリエンゾ，アンジェラアメリカ合衆国，ウィスコンシン 53188，ウォークシャ，キスドンヒルドライブ 3108，シー／オースコットアンドリンフレイＦターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 BA23 MA01 NA14 ZB212 ZB262 4H045 AA11 BA11 BA15 CA40 DA01 EA28 FA33 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ末端のＬｉｐＡｒモチーフを含む６以下のアミノ酸残基を
有するペプチド。
【請求項２】Ｉｌｅ，Ｖａｌ及びＬｅｕからなる群から選択される後ろか
ら２番目のＣ末端Ｌｉｐ残基を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる群から選択され
るＣ末端Ａｒ残基を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】 Ile-Tyr, Ile-Phe, Ile-Trp, Val-Tyr及びLeu-Tyr からなる
群から選択されるＣ末端モチーフを含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】Ｃ末端のIle-Ile-Tyr モチーフを含む請求項１に記載のペプ
チド。
【請求項６】 Pro-Arg-Ala-Arg-Ile-Tyr （配列番号：２４）、Arg-Ala-Ar
g-Ile-Tyr （配列番号：２５）、Ala-Arg-Ile-Tyr （配列番号：２６）、Arg-Il
e-Tyr 又はIle-Tyr を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】前記ペプチドがβ１インテグリンサブユニット依存性接着を
調節することができることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】前記ペプチドがβ１インテグリンサブユニット依存性接着を
阻害することができることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】前記ペプチドがα４β１インテグリン依存性接着を調節する
ことができることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項１０】前記ペプチドがα４β１インテグリン依存性細胞接着を阻
害することができることを特徴とする請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】前記ペプチドが、α４β１インテグリン結合性フィブロネ
クチンフラグメントへのＲａｍｏｓ細胞のα４β１インテグリン依存性接着を阻
害することができることを特徴とする請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】Ｃ末端のＬｉｐＡｒモチーフを含み、ＷＱＰＰＲＡＲＩＹ
（配列番号：１）と約８０％以下の同一性を有する約１０以下のアミノ酸残基を
有するペプチドであって、Ｄ−アミノ酸残基を含まないことを特徴とするペプチ
ド。
【請求項１３】ＡＲＩＴＧＹIIＹ（配列番号：１４）、ＲＡＲＩＴＧＹＩ
Ｙ（配列番号：１３）、ＰＲＱＡＷＲＰＩＹ（配列番号：１８）、ＲＰＡＰＱＲ
ＷＩＹ（配列番号：２０）、及びＷＱＰＰＤＡＤＩＹ（配列番号：３８））から
なる群から選択されるＣ末端配列を含む請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】ＷＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：１）と約５０％以下の相
同性を有する請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１５】ＡＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：３）、ＷＡＰＰＲＡＲＩ
Ｙ（配列番号：４）、ＷＱＡＰＲＡＲＩＹ（配列番号：５）、ＷＱＰＡＲＡＲＩ
Ｙ（配列番号：６）、ＷＱＰＰＡＡＲＩＹ（配列番号：７）、ＷＱＰＰＲＡＡＩ
Ｙ（配列番号：８）、ＡＲＩＴＧＹIIＹ（配列番号：１４）、ＲＡＲＩＴＧＹＩ
Ｙ（配列番号：１３）、ＰＲＱＡＷＲＰＩＹ（配列番号：１８）、ＲＰＡＰＱＲ
ＷＩＹ（配列番号：２０）、ＷＱＰＰＲＡＲＬＹ（配列番号：２８）、ＷＱＰＰ
ＲＡＲＶＹ（配列番号：２９）、ＷＱＰＰＲＡＲＩＦ（配列番号：３２）、ＷＱ
ＰＰＲＡＲＩＷ（配列番号：３３）、及びＷＱＰＰＤＡＤＩＹ（配列番号：３８
）からなる群から選択されるＣ末端の配列を含む約５０アミノ酸以下の残基を有
するペプチド。
【請求項１６】配列：ＡＱＰＰＲＡＲＩＹ（配列番号：３）、ＷＡＰＰＲ
ＡＲＩＹ（配列番号：４）、ＷＱＰＰＡＡＲＩＹ（配列番号：７）又はＷＱＰＰ
ＲＡＡＩＹ（配列番号：８）を有する請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】配列：ＷＱＡＰＲＡＲＩＹ（配列番号：５）又はＷＱＰＡ
ＲＡＲＩＹ（配列番号：６）を有する請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１８】配列：ＡＲＩＴＧＹIIＹ（配列番号：１４）又はＲＡＲＩ
ＴＧＹＩＹ（配列番号：１３）を有する請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１９】配列：ＰＲＱＡＷＲＰＩＹ（配列番号：１８）又はＲＰＡ
ＰＱＲＷＩＹ（配列番号：２０）を有する請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２０】配列：ＷＱＰＰＲＡＲＬＹ（配列番号：２８）、ＷＱＰＰ
ＲＡＲＶＹ（配列番号：２９）、ＷＱＰＰＲＡＲＩＦ（配列番号：３２）、又は
ＷＱＰＰＲＡＲＩＷ（配列番号：３３）を有する請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２１】配列：ＷＱＰＰＤＡＤＩＹ（配列番号：３８）を有する請
求項１５に記載のペプチド。
【請求項２２】約１５アミノ酸以下の残基を有する請求項１５に記載のペ
プチド。
【請求項２３】細胞の基質への接着を調節するための方法であって、ペプチドを前記細胞の懸濁液と組み合わせて改変した細胞懸濁液を形成するス
テップであって、前記ペプチドは約６アミノ酸以下の残基を有し、かつＣ末端の
ＬｉｐＡｒモチーフを含むステップと、前記改変した細胞懸濁液を前記基質に接触させるスッテプと、を含む方法。