JP2002500896A

JP2002500896A - 治療標的の同定法

Info

Publication number: JP2002500896A
Application number: JP2000528722A
Authority: JP
Inventors: ロバーツ，ブルース・エル; シャンカラ，スリニヴァス
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1998-01-26
Filing date: 1999-01-25
Publication date: 2002-01-15
Also published as: EP1053349A1; CA2319148A1; AU756357B2; WO1999037816A1; EP1053349A4; AU2339199A

Abstract

(57)【要約】本発明は細胞の表現型を「機能的遺伝子型」、すなわち細胞内で発現する塩基配列の一群と関係づける方法を広く供給する。加えて、本発明は治療上関連性のある遺伝子および遺伝子産物を識別するための方法を供給する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は１９９８年１月２６日、１９９８年３月１３日および１９９８年１０
月５日に各々提出された仮出願番号６０／１００，４３６；６０／０７７，８５
３；および６０／１０３，２３０、すなわち本開示中に参考事項として挙げられ
れている内容について、米国３５Ｕ．Ｓ．Ｃ１１９（ｅ）の規定により、優
先権を主張する。

【０００２】

【発明の属する技術分野】

本発明は分子生物学、細胞生物学および免疫学の分野に属する。さらに詳細に
は、本発明は細胞の表現型をその遺伝子発現様式と関連付け、および新たな治療
標的を同定する機能ゲノム学の技術を使用する。

【０００３】

【従来の技術】

近く全ヒトゲノム塩基配列が獲得されることにより遺伝子およびゲノムの構造
および組織の情報という富が提供されるだろう。この遺伝子情報の莫大な富をヒ
トの疾患の予知および治療に使用するために、データの解析法を開発することが
次の段階である。特に、異なる細胞間の、または同細胞の異なる病理段階間の異
なる遺伝子発現の全体的な様式を同定可能とするような方法が要求されている。
この型の方法はしばしば機能ゲノム学と呼ばれる。

【０００４】いかなる時点においても細胞内に存在する多くの、しかし全てではない遺伝子
が発現されていることはよく知られている。生物学の基本的な疑問はどの遺伝子
が転写されているかということおよび異細胞間における転写産物の相対量の知識
を必要とする。典型的には、遺伝子がいつおよびどの程度の量発現されるか解析
されるのは、一度に一遺伝子についてである。

【０００５】よって、細胞における全ての発現遺伝子の同定およびこれらの遺伝子の発現程
度に関する情報は活性化、分化、老化、ウィルスの転換、形態発生および体細胞
分裂等の多くの細胞過程の研究を容易にすると考えられる。同または異環境刺激
下におけるある特定の細胞または様々な個体または種由来の同細胞の発現遺伝子
の比較は細胞の分子生物学に価値ある知識を提供する。

【０００６】したがって、他の細胞に対する特定の細胞の発現遺伝子の比較を提供する方法
は非常に価値があると考えられる。本発明は他と比較してある細胞に異なって発
現されている治療関連遺伝子を同定するための方法を提供する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】

本発明は概ね細胞の表現型を「機能的な遺伝子型」すなわち細胞において発現
された塩基配列の型と関連付ける方法を提供する。さらに、本発明は治療関連遺
伝子および遺伝子産物を同定する方法を提供する。本発明はまたコンピューター関連システムおよび方法をも提供する。より詳細に
は、本発明は自動的に細胞試料から遺伝子標識のデータベースを産出し、細胞か
らの標識数からさらなる試行および解析のための有意な候補を抽出するためのデ
ータベースを使用するシステムおよび方法を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】

様々な出版物、特許および開示されている特許明細書は個々の引用により参照
とされている。これらの出版物、特許および開示されている特許明細書の開示は
、本発明が関係する当該分野の現状をより完全に記載するために本開示中に参考
事項により編入される。

【０００９】本発明は選択された表現型に関与する遺伝子を同定する方法を提供する。その
ような遺伝子の塩基配列の知識はまた当業者にその遺伝子のタンパク質産物の配
列および構造を提供する。望ましい態様において、遺伝子および／またはその産
物の機能は選択された表現型について原因となるかまたは何らかの点で関与する
と考えられる。

【００１０】本発明の実施は、特別の記述がない場合は、当該技術分野における分子生物学
、微生物学、細胞生物学および組み変えＤＮＡの従来の技術を使用すると考えら
れる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬ
ＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ第２
版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔｅｌ．ｅｄｓ．，（１
９８７））；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯ
ＧＹ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：ＡＰＲＡＣ
ＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａ
ｍｅｓａｎｄＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒｅｄｓ．（１９９５））ａｎｄＡＮ
ＩＭＡＬＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１
９８７））．等参照。定義本明細書および特許請求範囲中で使用される場合、単数形の名詞は文脈に明確
に述べていない限り複数を含む。例えば、「細胞」という語は複数の細胞やそれ
らの混合物を含む。

【００１１】「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という語は何らかの長さの核酸の多
量体型を示すのに互換的に使用される。ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸、
リボ核酸および／またはそのアナログを含む可能性がある。核酸はいずれかの三
次元構造を有し得、既知または未知の機能を果たし得る。「ポリヌクレオチド」
という語は例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子
断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃ
ＤＮＡ、組み変えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、
ベクター、いずれかの塩基配列の単離ＤＮＡ、いずれかの塩基配列の単離ＲＮＡ
、核酸プローブおよびプライマーを含む。核酸分子は修飾核酸分子をも含む可能
性がある。

【００１２】「異なって発現された」という語は対照細胞より多くまたは少なく発現されて
いるか、または対照細胞では発現されていないところで発現されているか、また
は対照細胞では発現されているところで発現されていないかのいずれかである細
胞または組織における核酸の塩基配列を言及する。

【００１３】「オリゴヌクレオチド」は約５から１００塩基の一本鎖または二本鎖ＤＮＡの
ポリヌクレオチドを言及する。オリゴヌクレオチドはオリゴマーまたはオリゴと
しても知られ、遺伝子から単離されるかまたは当該分野において知られる方法に
より化学合成されうる。［遺伝子」は古典的な意味でゲノムまたは染色体内の特
別な位置（場所）を占める遺伝的な単位であり、組織の表現型に一つ以上の特異
的な効果を有する単位であり、様々な対立遺伝子型に突然変異可能な単位であり
、他の単位等と組み変わる単位である。以下の三種のポリヌクレオチドが現在で
は認識されている。（１）ｍＲＮＡに転写され、そしてポリペプチド鎖に翻訳さ
れる構造遺伝子、（２）直接的に使用されるｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ分子に翻訳
される構造ポリヌクレオチド、（３）転写はされないが、ＤＮＡ複製および転写
に含まれる酵素または他のタンパク質の認識部位を提供する調節塩基配列。

【００１４】「プライマー」は酵素媒介の核酸合成の開始のための３’ヒドロキシル末端を
提供するたいてい一本鎖のオリゴヌクレオチドを言及する。プライマー塩基配列
は鋳型の正確な塩基配列を反映する必要はない。「ＰＣＲプライマー」は、Ｔａ
ｑポリメラーゼ等の熱安定性なポリメラーゼ、および二つのオリゴヌクレオチド
プライマー（一方は増幅される配列の一端にあるプラス鎖に相補的であり、他方
は他端のマイナス鎖に相補的である）を使用してＤＮＡ塩基配列を増幅する方法
である「ポリメラーゼ鎖反応」または「ＰＣＲ」において使用されるプライマー
を言及する。新たに合成されたＤＮＡ鎖は同じプライマー配列の付加的な鋳型と
して連続的に供給されうるので、プライマーのアニーリング、鎖の伸長および解
離の連続的な回転は望む塩基配列の対数的および高度に特異的な増幅を産生する
。ＰＣＲはまたＤＮＡ試料中の定義された塩基配列の存在を検出するためにも使
用されうる。

【００１５】「塩基配列タグ」または「ＳＡＧＥタグ」はメッセンジャーＲＮＡにおけるあ
る位置に生じる一般的に約２０ヌクレオチド以下の短い塩基配列である。タグは
対応する転写産物およびそれる転写元の遺伝子を同定するために使用されうる。
「ダイタグ」は二つの塩基配列タグの二量体である。

【００１６】「ｃＤＮＡ」という語は相補ＤＮＡ、すなわち細胞または組織に存在する逆転
写酵素等の酵素によりｃＤＮＡに作られるｍＲＮＡに相当する。「ｃＤＮＡライ
ブラリー」は細胞または組織に存在し、逆転写酵素でｃＤＮＡに全て転換され、
そして「ベクター」（外来ＤＮＡの付加後に複製し続けうる他のＤＮＡ分子）に
挿入された全てｍＲＮＡの収集物に対応する。例えばライブラリーのベクターは
バクテリオファージ（ファージとしても知られる）、バクテリアに感染するウィ
ルス、例えばラムダファージを含む。ライブラリーによって関心のある特異的な
ｃＤＮＡ（つまりｍＲＮＡ）について調べることが可能である。

【００１７】「免疫効果細胞」という語は抗原に結合しおよび免疫反応を媒介することが可
能な細胞を言及する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核白血球、マクロフ
ァージ、ＮＫ細胞および毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）、例えばＣＴＬ系、ＣＴＬ
クローン、および腫瘍、炎症または他の浸潤由来のＣＴＬを含むが、これに限ら
ない。特定の疾患組織は特異的な抗原を発現しこれらの抗原に特異的なＣＴＬが
同定される。例えば、色素細胞腫の約８０％はＧＰー１００として知られている
抗原を発現する。

【００１８】本明細書中で記載されている「Ｔリンパ球」という語は、典型的には抗ＣＤ３
モノクローナル抗体を適した標識技術との組み合わせで使用することにより検出
される表現型的にＣＤ３＋であるリンパ球を意味する。本発明のＴリンパ球はま
た一般的にＣＤ４、ＣＤ８または両方に対して陽性である。

【００１９】本明細書中で使用されている際は、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限
酵素」という語は認識部位または認識核酸塩基配列と呼ばれる特異的な二本鎖の
ＤＮＡ塩基配列に結合し、およびその特異的な認識部位にあるまたは近辺の二本
鎖ＤＮＡを切断する細菌性酵素を言及する。「ＩＩＳ型」制限エンドヌクレアー
ゼは認識部位から定義された距離（２０塩基まで離れ得る）で切断する。エンド
ヌクレアーゼは当業者に知られている。（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１９９５，Ｅｄ．Ａｕ
ｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｔ３．１．１５；ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＣａｔａｌｏｇ，１９９５等参照）。「ナイー
ブ（未処理）」細胞は抗原に一度もさらされていない細胞である。

【００２０】「培養」という語は細胞または組織の様々な種の培地上または内でのインビト
ロでの生殖反応を言及する。培養液において生育した細胞の子孫は親細胞と完全
に同一ではない（形態学的に、遺伝学的にまたは表現型的に）可能性もあること
は理解される。「増殖した」とはいかなる細胞増殖または分裂も意味する。

【００２１】「被検者」は脊椎動物、好ましくはほ乳動物、さらに好ましくはヒトである。
ほ乳動物はネズミ、類人猿、ヒト、家畜動物、競技動物および愛玩動物を含むが
、これに限定されない。

【００２２】「宿主細胞」または「受容細胞」はベクターまたは外因性の核酸分子、ポリヌ
クレオチドおよび／またはタンパク質が合併したものの受体となりうるまたはな
っているいずれかの個体の細胞または細胞培養を含むことを意図する。それはま
た、単一細胞の子孫を含むことも意図し、その子孫は生来の、偶然のまたは意図
的な突然変異のためその起源の親細胞と（形態学においてまたはゲノムまたは全
ＤＮＡ相補において）完全に同一である必要はないかもしれない。細胞は原核生
物または真核生物であることができ、および細菌性細胞、酵母細胞、動物細胞お
よびほ乳細胞、例えばネズミ、ラット、類人猿またはヒトを含むが、これに限定
されない。「抗体」は抗原と結合可能な免疫グロブリン分子である。本明細書中
で使用されている際は、その語は完全な免疫グロブリン分子だけでなく、要求さ
れた特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の抗イディオタイプ型抗体
、突然変異体、断片、融合タンパク質、ヒト化タンパク質および修飾をも包含す
る。

【００２３】「抗体複合体」は抗体（上記で定義した）およびその結合相手またはリガンド
との組み合わせである。天然抗原はポリペプチド、タンパク質または抗原決定基を含む断片であり、基
質の免疫応答を誘導する。

【００２４】「単離した」という語は成分、細胞およびその他から分離することを意味し、
そこにおいてはポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体
またはその断片が天然には通常結合している。当業者に明らかなように、非天然
に生じるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体または
その断片は天然に生じる対応物からそれを区別する「単離」を必要としない。さ
らに、「濃縮した」「分離した」または「希釈した」ポリヌクレオチド、ペプチ
ド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、濃度または体積当たり
の分子数が天然に生じる対応物よりもより「濃縮され」またはより「分離され」
ていないという点で天然に生じる対応物から区別可能である。一次塩基配列にお
いてまたは例えば、グリコシル化の様式によって天然に生じる対応物と異なるポ
リヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は
その一次塩基配列または選択的にグリコシル化の様式等の他の特徴によって天然
に生じる対応物と区別できるため単離体で存在する必要はない。本明細書中に開
示されている各々の発明に対して明白に述べてはいないが、下記に開示された各
構成物に対しておよび適切な条件下の全ての上記の具体例が本発明により提供さ
れたことは理解されうる。よって、非天然的に生じるポリヌクレオチドは単離さ
れた天然に生じるポリヌクレオチドとは別のものとして提供される。細菌性細胞
において産生されたタンパク質は真核生物細胞（そこでは天然に産生される）か
ら単離された天然に生じるタンパク質とは別のものとして提供される。

【００２５】細胞の「分離した」または「濃縮した」集団は天然に結合している細胞および
物質から「十分に遊離して」いる。「十分に遊離して」または「十分に精製され
て」いるということは少なくとも集団の５０％、好ましくは少なくとも７０％、
さらに好ましくは少なくとも８０％、およびさらにより好ましくは少なくとも９
０％が望む細胞型であることを意味する。

【００２６】「組成物」は活性剤および、補助薬等の不活性な（例えば、検出可能成分、固
体支持または標識剤）または活性な他の化合物または組成物の組み合わせを意味
する。

【００２７】「製薬組成物」はインビトロ、インビボまたはエクスビボの診断または治療に
使用するのに適した組成物をつくる、不活性または活性な担体と活性化剤の組み
合わせを含む傾向がある。

【００２８】本明細書中で使用されている際は、「製薬学的に受容可能な担体」という語は
、りん酸緩衝生理食塩水、水、油／水または水／油エマルジョン等のエマルジョ
ン、および様々な型の湿潤剤等のいずれかの基本的な製薬担体を包含する。組成
物はまた安定化剤および防腐剤も含むことが可能である。担体、安定化剤および
補助薬の例は、Ｍａｒｔｉｎ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ＳＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．
，第１５版（ＭａｃｋＰｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））参照。「有効量」は有益または望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量
は一回以上の投与、適用または投薬において投与されることが可能である。

【００２９】下記により詳細に記載されるように、本方法は選択された表現型を単一細胞、
複数細胞、組織に与えるかまたは与えるのに関与し、または潜在的な治療標的を
提示することに関与するポリヌクレオチド断片又は遺伝子を同定する。本方法は
対照細胞に比べて試料細胞では異なって発現されている遺伝子を表す特有のポリ
ヌクレオチドを同定することを要求する。ある態様において、特有のポリヌクレ
オチドに相当する遺伝子は同定およびクローン化され、それによって、試料細胞
に選択された表現型を与える、または選択された表現型の原因ではないが選択さ
れた表現型に関連している遺伝子の塩基配列および正体を提供する。特有のポリ
ヌクレオチドは、差異的に対照細胞に比べて試料細胞では過剰発現または発現量
が低下している遺伝子を象徴するか、またはそれに相当するか、またはその断片
である可能性がある。一つより多い試料細胞型を一つの対照細胞と比較し得、ま
たは、一つより多い対照細胞型を一つの試料細胞と比較しうる。治療標的は本明
細書中に開示されている方法を用いて同定されうる。これらのポリヌクレオチド
と遺伝子にコードされているポリペプチドとタンパク質はさらに産生され、単離
され特性分析されることが可能である。

【００３０】ある態様においては、本方法は一つ以上の分泌された生物因子および／または
該因子またはその断片をコードする遺伝子を同定するのに有用である。本方法は
、因子を分泌する一つ以上の試料細胞およびその因子を分泌しない一つ以上の対
照細胞を提供すること；試料細胞における遺伝子発現を表すポリヌクレオチドの
組を得；対照細胞における遺伝子発現を示すポリペプチドの組を得；および試料
細胞に共通するが対照細胞において存在しないかまたは低い程度で発現されてい
る特有のポリヌクレオチドを一つ以上同定することの段階を含む。最終的に、特
有のポリヌクレオチドに相当する遺伝子を決定することにより、一つ以上の分泌
された生物因子が同定される。

【００３１】本発明の実施はある細胞（試料細胞）と他方（対照細胞）の間で異なるいかな
る特質に関連する遺伝子の同定にも適用されうる。そのような特質は疾患状態、
感染、薬剤耐性、サイトカイン分泌、分泌タンパク質の発現、分化状態、成長調
節、外界環境刺激にさらされたことの結果等を含むが、これに限定されない。さ
らに、本発明の実施は一例として植物、動物および微生物を含むいかなる細胞型
にも適用されうる。［材料および方法］試料細胞本発明は試料細胞における選択された表現型に関連する、ポリヌクレオチド、
遺伝子およびその断片を同定および獲得する方法を提供する。”試料細胞”は腫
瘍細胞、薬剤耐性腫瘍細胞、血管新生を促進する腫瘍細胞、脱分化した細胞、分
化した細胞、アポトーシスする細胞、過剰増殖性の細胞、病原体に感染した細胞
または病原体に感染した薬剤耐性細胞を含むが、それらに限定されない。

【００３２】本発明の方法に用いられるために得られ得る細胞が由来する癌は、癌、肉腫、
白血病、および神経系の細胞に由来する癌を含む。これらは、星細胞腫、乏突起
膠腫、上衣腫、髄芽腫、および原始神経外胚葉腫瘍（ＰｒｉｍｉｔｉｖｅＮｅ
ｕｒａｌＥｃｔｏｄｅｒｍａｌＴｕｍｏｒ、ＰＮＥＴ）のような脳腫瘍；膵
臓管腺癌のような膵臓腫瘍；小細胞および大細胞腺癌、鱗細胞腫瘍、気管支肺胞
腫のような肺癌；上皮腺癌のような大腸癌、およびこれらの腫瘍の肝転移物；肝
細胞腫、胆管腫のような肝臓癌；管および小葉腺癌のような胸部癌；子宮頚部の
鱗および腺癌、および子宮および卵巣上皮腺癌のような婦人科的腫瘍；前立腺腺
癌のような前立腺癌；移行、鱗細胞腫のような膀胱癌；ＢおよびＴ細胞リンパ腫
（結節および拡散）、プラズマ細胞腫、および急性および慢性白血病のような細
網内皮系（ＲｅｔｉｃｕｌｏＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＳｙｓｔｅｍ，ＲＥＳ
）の癌；黒色腫のような皮膚癌；軟組織肉腫および平滑筋肉腫のような軟組織肉
腫を含むが、それらに限定されない。腫瘍細胞は、癌患者より切除、生検、または内視鏡的採取によって得られ、細胞
は直接使用、凍結保存、または培養において維持または増幅される。腫瘍および
患者の血液または血液分画由来の試料の両方は、細胞の共培養の前に全体的に滅
菌性を確認されるべきである。標準的な滅菌性の検査は当該技術分野における技
術を有するものに知られており、ここでは詳細に記載されない。腫瘍細胞はｉｎ
ｖｉｔｒｏで培養して、細胞株を作製することができる。様々な型の腫瘍から
、短期培養を安定に確立し、少なくとも１０⁸の細胞を得る条件はＤｉｌｌｍａ
ｒｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：６５−６
９に記載される。あるいは、腫瘍細胞は使用の前に、例えば生検試料から標準的
な機械的手法により分散され得る。

【００３３】腫瘍細胞は、当該技術分野において知られる任意の方法によって得られ得る。
以下は、技術を有する技術者によって用いられた一つの方法の例である。患者よ
り切除された固形腫瘍（１０−３０ｇ）は滅菌的方法で５ｍｍ³の小片に切断さ
れ、０．０１％ヒアルロニダーゼＶ型、０．００２％ＤＮＡｓｅＩ型、０．１％
コラゲナーゼＩＶ型、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマ
イシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浸され
る。この混合物は、室温で６から２４時間かき回された後、粗い針金の格子を通
されて未消化の組織片が除かれる。その結果生じた腫瘍細胞件懸濁物は４００ｘ
ｇで１０分間遠心分離される。沈殿は、Ｃａ²⁺またはＭｇ²⁺またはフェノールレ
ッドなしのＨａｎｋｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢ
ＳＳ）によって二回洗浄され、ＨＢＳＳに懸濁され、フィコール−ヒパーク勾配
に導入する。生存腫瘍細胞、リンパ球、および単核球を含む勾配の界面を回収し
、さらに二度ＨＢＳＳによって洗浄された。回収された細胞は１０％ＤＭＳＯ（
ｖ／ｖ）を含む型適合性のヒト血清中で保存のために凍結される。

【００３４】単数形または複数形のいずれかで用いられる”新生物細胞”、”腫瘍細胞”ま
たは”癌細胞”という語は、宿主生体に対し病理的となる悪性の形質転換が起き
た細胞を指す。（悪性形質転換の部位の近傍より得られた細胞である）一次癌細
胞は、特に組織学的試験のようなよく確立された技術により、非癌細胞から容易
に区別され得る。本明細書において用いられる癌細胞の定義は一次癌細胞だけで
なく祖先癌細胞に由来するいずれの細胞をも含む。これは、転移した癌細胞、ｉ
ｎｖｉｔｒｏ培養物、および癌細胞に由来する細胞株を含む。通常固形腫瘍と
して明示される種類の癌に言及する場合は、”臨床的に検出可能な”腫瘍は、例
えばＣＡＴ走査、磁気共鳴画像（ＭＲＩ），Ｘ−線、超音波または触診などのよ
うな腫瘍の大きさに基づいて検出可能な物である。生化学的または免疫学的な発
見単独ではこの定義に合うには不十分で有り得る。

【００３５】化学療法薬剤に対する腫瘍細胞の抵抗性の出現は、悪性な血液および固形腫瘍
の治療における主要な問題を有する。形質転換した腫瘍細胞は、多剤耐性（ＭＤ
Ｒ）として知られる現象である、多くの薬剤に対する臨床的な抵抗性を示す傾向
があるため、この抵抗性は、癌患者が任意の抗癌剤に対しての反応への消失を引
き起こす。薬剤取り込みの減少、薬剤放出の増大、酸化還元電位の変更、ＤＮＡ
修復の増大、および薬剤隔離機構の増大または薬剤標的タンパク質の増大を含む
いくつかの機構が、分子および細胞レベルでＭＤＲを説明し得る。抗腫瘍化学療
法効果が証明された、ＭＤＲが観察される薬剤はビンブラスチン、ビンクリスチ
ン、エトポシド、テニポシド、ドクソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノル
ビシン、プリアマイシン、およびアクチノマイシンＤを含む。Ｊｏｎｅｓｅｔ
ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７２：３４８４−３４
８８。（大腸および腎臓の腺癌のような）多くの腫瘍は元来多剤耐性であるが、
（神経芽腫および小児白血病のような）他の腫瘍は治療の間にＭＤＲを獲得する
。本発明の目的となる”薬剤耐性癌細胞”は単一の抗腫瘍化学療法剤に抵抗性を
持つ細胞および二つ以上の抗腫瘍化学治療剤に抵抗性である細胞を含む。抗腫瘍
化学療法剤のような細胞傷害性薬剤は、幾つかのカテゴリーに分類され得る：（
１）メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード
、クロラムブチルおよびカルムスチンのようなアルカリ化薬剤；（２）メトトレ
キセート、フルオロウラシル、アザラビン、メルカプトプリン、チオグアニンお
よびアデニンアラビノシドのような抗代謝薬剤；（３）ビンブラスチン、ビンク
リスチン、ドクソルビシン、ブレオマイシン、トポシド、テニポシド、およびマ
イトマイシン−ｃのような天然産物誘導体；および（４）ヒドロキシウレア、プ
ロカルベジンおよびミチテンのようなその他の薬剤。

【００３６】試料細胞はさらに血管新生を促進する新生物細胞をも含む。腫瘍は、血管新生
因子の過剰発現および血管安定化因子の局所的な阻害の組み合わせによって血管
新生（または新血管新生）を促進する。この方策は腫瘍成長および転移を促進す
る血管新生環境をもたらす。血管新生因子はＣＸＣファミリーのケモカインを含
む（Ａｒｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．（１９９７）Ｊ．ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢ
ｉｏｌ．６２：５５４−５６２）。

【００３７】試料細胞はまた、抗原発現するもの、または抗原を特異的に認識するもの、お
よびＴ−細胞のような免疫応答を誘導するものをも含む。試料細胞はまた、完全
な全体の細胞および、望ましくはＭＨＣクラスＩ分子と連携して一つまたはそれ
以上の抗原提示を誘導することができるその他の分子を含む”抗原提示細胞（Ａ
ｎｔｉｇｅｎＰｒｅｓｅｎｔｉｎｇＣｅｌｌ，ＡＰＣ）”のような、抗原発
現細胞をも含む。適切なＡＰＣの例はマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞のよう
な細胞全体、β２−ミクログロブリンと複合体になった精製されたＭＨＣクラス
Ｉ分子、および養子抗原提示細胞を含むがこれらに限定されない。”養子抗原提
示細胞”という語は、それらが反応すべき免疫効果細胞と通常接触する抗原提示
細胞（ＡＰＣ）の変わりに用いられる、抗原提示能を有する、修飾された、また
は天然に存在する（野生型または突然変異体の）細胞を指す。言葉をかえれば、
Ｔ細胞がｉｎｖｉｖｏで出会わないような、任意の機能的ＡＰＣである。

【００３８】養子抗原提示細胞は以下のように誘導できる。Ｔ２と呼ばれるヒト細胞株１７
４ｘＣＥＭ．Ｔ２は、内在的なペプチドと細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子の結合
を制限するように抗原加工経路に突然変異を持つ。（Ｚｗｅｅｒｉｎｋｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１７６３−１７７１）。こ
れは、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８⁺ＣＴＬに対する抗原提示に必要なＴＡＰ１、
ＴＡＰ２、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２遺伝子を囲むＭＨＣクラスＩＩ領域の大きな
ホモ接合の欠失による。この結果、”空の”ＭＨＣクラスＩ分子だけがこれらの
細胞の表面に提示される。培養液に加えられた外来ペプチドは、そのペプチドが
アリル特異的結合モチーフを含む限りこれらのＭＨＣ分子に結合する。これらの
Ｔ２細胞は”養子”ＡＰＣＳと呼ばれる。

【００３９】試料細胞はポリヌクレオチドにより形質導入をされたものを含む。本明細書に
おいて用いられる”ポリヌクレオチド”という語は、リボヌクレオシドまたはデ
オキシリボヌクレオシドのいずれかの任意の長さの多量体型ヌクレオチドを指す
。したがってこの用語は一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本明
細書で用いられる”ＤＮＡ”は、塩基としてＡ、Ｔ、ＣおよびＧだけでなく、メ
チル化ヌクレオチドのようなそれらの任意の類似物またはこれらの塩基の修飾型
、非電荷架橋およびチオエートのようなヌクレオチド間修飾、糖類似物の使用、
およびポリアミドのような修飾されたおよび／または代替的な骨組み構造をも含
む。含まれる物は一つまたはそれ以上のタンパク質をコードする物またはアンチ
センスＲＮＡまたはリボザイムをつくるように転写され得る物も本発明に含まれ
る。

【００４０】ポリヌクレオチドの取り扱いに関する適切な方法は、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣ
ＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄＥｄ．，Ｖ
ｏｌ．１−３，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）；およ
びＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬ
ＯＧＹ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：ＮｅｗＹ
ｏｒｋ（１９８７）およびその定期的な改訂版を含むがそれらに限定されない
様々な参考文献に記載された物を含む。

【００４１】例えば、精製されたＤＮＡ、ウィルスベクター、またはＤＮＡまたはＲＮＡウ
ィルスを用いたリポフェクション、形質導入、感染または電気穿孔のような、当
該技術分野において知られた任意の方法が、外来のポリヌクレオチドの宿主細胞
への形質転換または挿入に用いられ得る。外来ポリヌクレオチドはたとえば、プ
ラスミドのような取り込まれていないベクターとして維持され得るか、あるいは
宿主細胞ゲノムに取り込まれ得る。

【００４２】試料細胞は病原体に感染した物を含む。”病原体”は原核生物、ウィルスおよ
び単細胞真核生物を含む、細胞に有害でありえる任意の微生物を含む。このよう
な病原体は、ヒト免疫不全症候群ウィルス、エプスタインーバーウィルスのよう
なウィルス、真菌類、クラミジアｓｐｐ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ（ＳｉｎａｉａｎｄＪｏ
ｉｎｅｒ（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：４
１５−４６２）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｏｓａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓのような哺乳類細胞に感染可能な細菌、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｚｏ
ｍａｃｒｕｚｉ、マラリア原虫のような寄生性の原生動物を含むが、それらに
限定されない。対照細胞本発明の実際は試料細胞と対照細胞の間で発現されている遺伝子に対応するポ
リヌクレオチドを比較することを含む。適切な細胞または細胞種の選択は初めに
選択された試料細胞および調査中の試料細胞の形質に依存する。

【００４３】本発明の一つの側面においては、試料細胞は新生物細胞であり、一つまたはそ
れ以上の対応物は別の新生物細胞または試料細胞の非新生物前駆体であり、対照
細胞として用いられ得る。対応物は例えば、試料細胞集団において見られるもの
に関連する細胞または同一の細胞から確立された細胞株を含み得る。例えば、対
照細胞は、対応する正常細胞種、対応する良性細胞種、対応する非転移性細胞種
および新生物細胞の非転移性前駆体のいずれかで有り得る。

【００４４】あるいは、例えば抗原提示細胞のような免疫効果細胞による試料細胞の認識に
関与するペプチドをコードする遺伝子の発現に基づいて試料細胞が選択され得、
適切な対照細胞は、適合するＭＨＣ複合体を持つが抗原を発現しないものである
。このような対照細胞は例えば細胞傷害性Ｔリンパ球による溶解に適合するが細
胞傷害性Ｔリンパ球によって溶解されない。

【００４５】試料細胞が生物学的因子を分泌する細胞である場合、対照細胞はその因子を分
泌しない細胞である。ポリヌクレオチド断片または発現タグ本発明の実際の方法は、発現した細胞の又は対応するポリヌクレオチド断片の
解析を含む。このポリヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られた方法
で試料および対照細胞から得られる。別々に発現されるポリヌクレオチドを同定
する多くの方法が当該技術分野において知られ、それぞれはこれらのポリヌクレ
オチドを提供するために用いられ得る。本明細書において用いられる、”ポリヌ
クレオチド”という語は、（上に定義された）ＳＡＧＥタグおよび、定量的／比
較的な遺伝子発現のデータを得る方法によって得られたほかの任意の核酸を含む
。このような方法はｃＤＮＡ差し引き、ディファレンシャルディスプレイおよび
ＥＳＴ（発現配列タグ）法を含むがそれらに限定されない。ｃＤＮＡ差し引きま
たはディファレンシャルディスプレイに基づく技術は二つの細胞種での遺伝子発
現の違いを比較するのに非常に有用で有り得る（Ｈｅｄｒｉｃｋｅｔａｌ．
（１９８４）ｎａｔｕｒｅ３０８：１４９およびＬｉａｎａｎｄＰａｒｄ
ｅｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６７に記載されている）。発
現配列タグ（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ，ＥＳＴ）のア
プローチは、ノザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護、および逆転写酵素−
ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．
（１９８９）ｓｕｐｒａ；Ａｌｗｉｎｅｅｔａｌ．（１９７７）Ｐ
ＮＡＳ７４：５３５０；Ｚｉｎｎｅｔａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ３
４：８６５；およびＶｅｒｅｓｅｔａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３７：４１５に記載されている）のようなもう一つの有用な遺伝子発見法で
ある。さらなる方法は、同時ＰＣＴおよび代表相違解析(representational diff
erence analysis)と組合せたディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉｓｉｔｉｓ
ｙｎａｎｄＷｉｇｌｅｒ（１９９５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２９１−３０４に記載されている）を利用する。別のアプローチは遺伝
子発現の連続的解析（ＳｅｒｉａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅＥｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳＡＧＥ，米国特許番号５，６９５，９３７に記載されてい
る）として知られる技術である。ＳＡＧＥを用いて、発現された遺伝子に対応す
る配列タグ（タグはポリヌクレオチドと同義に用いられている。）が解析され得
る。

【００４６】配列タグまたは、発現された遺伝子に対応するポリヌクレオチドは基本的に以
下のように調製される。まず、主題の遺伝子を含む試料が提供される。適切な試
料源は細胞、組織、細胞抽出物またはその類似物を含む。望ましくは、試料は、
興味ある特定の病状を持つまたはその特定の発達段階にある個体から得られる。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、例えば当該技術分野において技能を有するもの
に知られた方法を用いて試料から単離される。一つの態様においては、ｃＤＮＡ
はｍＲＮＡからビオチン化されたオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて合成される
。

【００４７】より小さいｃＤＮＡ断片は、望ましくは多くの転写物を一度に解裂させること
が期待される制限酵素を用いて作製される。望ましくは、４塩基対認識部位酵素
が用いられる。一つ以上の制限酵素もまた、連続的あるいは続けて用いられ得る
。解裂したｃＤＮＡは、上記のプライマーに結合された標識に対する捕獲支持体
への結合によって単離され得る。例えば、ｃＤＮＡ合成におけるオリゴｄＴプラ
イマーがビオチン化されている場合、定義された３’ヌクレオチド配列ポリヌク
レオチドを単離するために、ストレプトアビジンビーズが用いられる。他の捕獲
系（例えばビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシジェニン／抗ジゴキシジェ
ニン）もまた用いられ得る。

【００４８】一つの側面において、単離された定義されたヌクレオチド配列のポリヌクレオ
チドは二つのｃＤＮＡプールに分けられる。それぞれのプールは適切なリンカー
を用いてライゲーションされる。リンカーは同一または異なるもので有り得るが
、リンカーが同一の配列を持つ場合にはポリヌクレオチドをプールに分ける必要
はない。第一のオリゴヌクレオチドリンカーはＰＣＲプライマーのハイブリダイ
ゼーションの為の第一の配列を含み、第二のオリゴヌクレオチドリンカーはＰＣ
Ｒプライマーのハイブリダイゼーションの為の第二の配列を含む。加えて、リン
カーはさらに二つ目の制限酵素部位を持つ。リンカーは、第二の制限酵素部位を
持つライゲーション産物の解裂が、定義されたヌクレオチド配列のポリヌクレオ
チド（例えば制限酵素解裂部位の３’側）を持つリンカーの放出をもたらすよう
に設計される。定義されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドは約６から３０
塩基対で有り得る。ポリヌクレオチドは約９から１１塩基対で有ることが望まし
い。したがって、二量体タグ（すなわち二つの配列タグの二量体）は約１２から
６０塩基対であり、望ましくは１８から２２塩基対である。

【００４９】典型的には、第二の制限酵素は、認識部位から離れた部位または認識部位の外
側の部位で解裂させる。例えば、第二の制限酵素はＩＩＳ型制限酵素で有り得る
。ＩＩＳ型制限酵素はその非対称な認識部位から２０塩基対までの決まった距離
だけ離れた部位で解裂させる（ＳｚｙｂａｌｓｋｉＷ．（１９８５）Ｇｅ
ｎｅ４０：１６９）。ＩＩＳ型制限酵素の例は、ＢｓｍＦＩおよびＦｏｋＩを
含む。他の類似した酵素が当該技術分野における技術を有するものに知られ得る
（ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬ
ＯＧＹ，ｓｕｐｒａを見よ）。

【００５０】同一の配列を持つリンカーにライゲーションされた定義されたタグのプールま
たは、異なるヌクレオチド配列を持つリンカーにライゲーションされた定義され
た配列タグを持つ二つのプールは無作為に、互いに”尾部”を合わせるようにラ
イゲーションされる。ｃＤＮＡポリヌクレオチドのリンカーから最も離れた部分
が”尾部”と呼ばれる。これは、二量体タグの上流（５’）に第一の制限酵素部
位をもち、下流（３’）に第一の制限酵素部位を持つ二量体タグ、二量体タグの
上流および下流に第二の制限酵素部位を持つ二量体タグ、および、二量体タグの
上流および下流に、第二の制限酵素認識部位および増幅プライマーハイブリダイ
ゼーション部位をもつ二量体タグを含むリンカーオリゴヌクレオチドをもたらす
。言葉を変えれば、二量体タグは、それぞれ第一の制限酵素部位、第二の制限酵
素解裂部位およびリンカーに囲まれる。

【００５１】それぞれのリンカーの一つの鎖に特異的にハイブリダイズするプライマーを利
用して、この二量体タグは増幅され得る。二量体タグが互いにライゲーションさ
れた後に、例えば米国特許番号４，６８３，１９５に記載されたような標準的な
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて増幅が行われることが望ましい。あ
るいは、二量体タグは原核生物適合ベクターにクローニングされるか、または当
該技術分野における技術を有するものに知られる他の増幅技術によって増幅され
得る。当該技術分野における技術を有するものは同様な増幅のためのプライマー
をリンカーのヌクレオチド配列に基づいて、過度の実験無しに調製し得る。第一の制限エンドヌクレアーゼによる、増幅されたＰＣＲ産物の切断は、ダイ
タグを単離する事を可能にし、それはライゲーションにより連結することが可能
である。ライゲーションの後、必ずしも必要ではないがコンカテマー（鎖状体）
の単離を望んでも良い。ダイタグまたは鎖状体の解析は、増幅が行われていよう
となかろうと、配列解析法により行うことが可能である。鎖状体は一般には２か
ら２００のダイタグからなり、望ましくは８から２０のダイタグからなる。これ
らは鎖状体であることが望まれるが、連結されるダイタグの数は各タグの長さに
依存し、過度の実験をせずとも当該技術者には容易に決定可能である。鎖状体の
形成の後、複数のタグが配列解析のためにベクター中にクローン可能であり、あ
るいは、ダイタグまたは鎖状体は、当該技術者に知られる方法により、手動また
は自動方法のいずれかを用いてクローンせずに直接配列決定することが可能であ
る。

【００５２】本発明の定義されたヌクレオチド配列タグのクローニングのための一般的な手
順は、プラスミドまたはファージといったベクターへのタグの挿入である。本明
細書において記載の方法により生産されたダイタグまたはダイタグの鎖状体は、
さらなる解析、例えば配列決定解析、当該技術者に知られる方法によりタグをプ
ローブとして用いるプラーク／プラスミドハイブリダイゼーション、のために組
換えベクターにクローニングされる。ダイタグがクローンされたベクターは、適
切な宿主細胞に形質転換可能である。「宿主細胞」とはベクターが増幅され、そ
のＤＮＡが発現される細胞である。この単語は宿主細胞のいかなる子孫も含む。
複製の最中に変異が発生する可能性があるため、全ての子孫が親細胞と同一とい
うわけではないと理解されている。しかし、「宿主細胞」という単語が使用され
た時、そのような子孫も含まれる。外来ＤＮＡが宿主において継続的に維持され
ることを意味する、安定な転移体の方法は当該技術分野では知られている。

【００５３】ダイタグを含むベクターの宿主細胞への形質転換は、当該技術者によく知られ
ている平凡な方法で行うことが可能である。宿主がＥ．ｃｏｌｉなどの原核生
物である場合、ＤＮＡの取り込みが可能であるコンピテント細胞は、対数増殖期
後に回収し、その後当該技術分野でよく知られている手順を用いたＣａＣｌ₂法
を用いて処理した細胞より調整可能である。あるいはＭｇＣｌ₂またはＲｂＣｌ
が使用可能である。形質転換はエレクトロポレーションあるいは当該技術分野に
おいて通常使用される他の方法を用いて行うことが可能である。

【００５４】個々のタグまたはダイタグは、固相支持体（例えば、ニトロセルロースフィル
ター、ガラススライド、シリコンチップ）上で固定化したオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズする事が可能である。加えて、ダイタグまたはオリゴヌクレオチ
ドプローブのいずれかは検知可能なラベル、例えばラジオアイソトープ、蛍光化
合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素などでラ
ベルする。当該技術分野において一般的な技術を持つ者は、ダイタグに結合させ
るのに適切なその他のラベルを知っている、または用いているこのようなルーチ
ン実験を確認することが可能である。例えば、ＰＣＲはラベルされた（例えば蛍
光タグ）プライマーを用いて行うことが可能である。

【００５５】ダイタグは、望ましくは系列希釈し、例えば全ての可能な１０量体の順列を提
示する（例えばチップの各格子において）オリゴヌクレオチドを含む固相支持体
（例えば、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７，１９９１に記載さ
れているシリコンチップ）に加えられる一本鎖分子に分割される。固相支持体は
、その後、異なる条件下（例えば、成長因子の存在及び非存在下での細胞の異な
る発生成長段階、通常に対し形質転換した細胞、異なる組織での発現の比較、な
ど）の細胞より生産されたタグと共に、固相支持体上のオリゴヌクレオチドとの
ハイブリダイゼーションにより、固相支持体（例えばチップ上の格子）に含まれ
るタグの差分発現を決定するために用いられる。末端蛍光ラベルしたダイタグの
場合、蛍光の解析は特定の１０量体に対するハイブリダイゼーションを指示する
。固定化したオリゴヌクレオチドが蛍光化した場合、例えば（ハイブリダイズし
たダイタグとラベルしたオリゴが接近することによる）クエンチングによる蛍光
の消失が観察され、遺伝子発現のパターンが解析される。コンピューター解析ポリヌクレオチド情報が得られた後、二つまたはそれ以上の細胞種間で異なっ
た発現をする遺伝子に対応したポリヌクレオチドの単離が解析される。発現する
遺伝子を定義し検出する、以前に単離された及び蓄えられた配列情報を用い、上
記記載の方法を行うことが、本発明の主眼である。この情報は、個人的に、公的
に入手可能な及び商業的に入手可能な配列データベースより得ることができる。

【００５６】例えば、標本細胞標本中が一つの遺伝子産物の存在に依存する表現型、例えば
、その活性をインビトロ解析において測定できる生物因子を分泌する細胞、特定
の抗原を認識する抗体により染色される細胞、または特定の抗原を認識する細胞
障害性Ｔ細胞により溶解される細胞、を有しているかで、細胞または組織を選択
した後、細胞は選択された表現型の極端なものを提示する標本細胞を単離するた
めにさらに選択され、理想的には全てのその他の側面または表現型の特徴におい
て一致する。例えば、例えば同一個体由来で一致した細胞は組織適合性の違いを
扱う必要性を最小にする。

【００５７】理想的には、選択した表現型を顕著に提示する標本細胞の二つの例（いわば「
Ａ」及び「Ｂ」）及び、表現型を全く有さない標本細胞の二つの例（いわば「Ｃ
」及び「Ｄ」）を選択する。本発明の方法を用い、各細胞由来のライブラリー形
態で存在するポリヌクレオチドは、単離されそれらの相対的な発現が記録される
。各ライブラリーは、配列解析され、配列に及びいくつかの態様における相対的
発現に関する情報は、いくつかの機能的に関連したプログラム、例えばＳＡＧＥ
ソフトウェア（ＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓ大学のＫｅｎＫｉｎｚｌｅｒ博士
より入手可能）を用いた比較報告に蓄えられる。比較報告は、ポリヌクレオチド
配列及び、そのライブラリーあたりの定義されたポリヌクレオチドの数（例えば
２５０００）に標準化した標本（例えば上記Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）の量の、表を提
供する。これは直接ＭＳ−ＡＣＣＥＳＳに導入する、または、エクセルスプレッ
ドシートにデータをまずコピーし、その後の追加作業でそこからＭＳ−ＡＣＣＥ
ＳＳに導入するかされる。ＳＹＢＡＳＥまたはポリヌクレオチドの数が比較可能
であるＯｒａｃｌｅなどのその他のプログラムは、ＭＳ−ＡＣＣＥＳＳの代替物
として使用可能である。ソフトウェアに対する増強は、これらの追加機能を取り
込むよう設計可能である。これらの機能は、一般的Ｂｏｏｌｅａｎ、代数性及び
、巨大な入力セットを特に定義された興味のポリヌクレオチドの操作可能な下部
セットに減少させるための様々な組み合わせにおいて応用されるテキスト検索操
作、からなる。

【００５８】研究者は、集団内の特定のポリヌクレオチド数を結合させることにより（例え
ば通常集団＝通常１＋通常２、腫瘍集団＝始源腫瘍１＋腫瘍細胞系列）、一つま
たはそれ以上の企画からなる集団を創造することが可能である。追加の特徴的価
値は、集団における各タグで計算される（例えば、平均数、最小数、最大数）。
研究者は、各タグの数の割合を集団間で、例えば、各ポリヌクレオチドの通常集
団の数の平均と腫瘍集団の数の平均で、計算することが可能である。研究者は観
察された集団間のタグ数における違いの特徴の安定計測を計算することができる
。

【００５９】ＭＳ−ＡＣＣＥＳＳにおけるポリヌクレオチドを単離するために、標本細胞に
おける量に基づいたポリヌクレオチドタグをソートする質問がなされる。この質
問報告からなされる出力は、ソート基準及び様々な標本細胞におけるその量に適
合したポリヌクレオチドを（配列により）リスト化する。

【００６０】ソートは、興味の遺伝子産物（及び対応したポリヌクレオチド）は、選んだ表
現型を全く示さない標本に比べ、選んだ表現型を顕著に示す標本においてより豊
富にあるという原則に基づく。

【００６１】例えば、標本Ａ及びＢにおいて１０またはそれ以上、標本Ｃ及びＤにおいて１
以下の程度で存在するポリヌクレオチドを検出する質問をした場合、検索結果は
、５つのポリヌクレオチドがソート基準に適合し、つまり、表現型を有さないＣ
及びＤに類似の標本に形質転換したとき表現型を与えるか否か決定するよう試験
すべき５つの候補遺伝子が存在することを明らかにする。

【００６２】ソート基準をさらに厳密にすると、ソートはさらに効果的になるべきである。
その結果、もし標本Ａ及びＢにおいて５コピーかそれ以上、及び標本Ｃ及びＤに
おいて５コピー以下のポリヌクレオチドを訪ねた場合、多くの候補が生産される
。しかし、もし差分を大きくすることが可能であるならば、標本が極端な表現型
を示すため（例えば標本Ａ及びＢにおいて１０以上、及び標本Ｃ及びＤにおいて
１以下）、検出される候補の数は制限される。

【００６３】ソート変数のセットを代数的に選択し、データ解析を行い、試験候補を検出で
きるときには、遺伝子産物の量（つまりポリヌクレオチドの量）は表現型を与え
るのに必要であるという先立つ知識は必須ではない。もし、望まれた候補が発見
されない場合、ソート基準の厳密さを減少させれば（つまり、差分を減らす）、
発見される候補を試験することが可能である。ソート及び候補試験の反復周期は
、望まれた候補の成功裏に終わる復帰において、最終的には最高になる。

【００６４】

【表１】回数ソート基準候補の数調べるべき候補の数標本Ａ及びＢにおいて１０１標本Ｃ及びＤにおいて１１０１０（最小差分＝１０×）標本Ａ及びＢにおいて５２標本Ｃ及びＤにおいて２３０２０^* （最小差分＝２．５×）標本Ａ及びＢにおいて５３標本Ｃ及びＤにおいて５８０５０^# （最小差分＝１×） ^*３０の候補の内、１０は回数１において既に調べられるので、２０候補のみ
が調査する必要がある。

【００６５】 ^#８０の候補の内、３０は既に調べられているので（１０は回数１において、
２０は回数２において）、５０候補のみが調査する必要がある。遺伝子産物の量（つまりポリヌクレオチドの量）は表現型を与えるのに必要で
あるという知識は、厳密なソート基準の合理的使用を許可し、望まれた遺伝子を
一握りの候補の中に捕らえるような検出過程を大幅に加速する。

【００６６】遺伝子産物の量は表現型を与えるのに必要であるということを確立するのは、
疑問の特定の表現型及び、その表現型を測定する解析の感度に依存する。例えば、発明者は、１／５０００の頻度（２５０００のライブラリーの大きさ
に標準化した５コピーのＳＡＧＥタグ）が標本細胞において抗原特異的Ｔ細胞に
より溶解されるほどの感受性を与える腫瘍抗原の発現と十分に関連しており、１
／２５０００の頻度が溶解に弱く感受性であることと関連することを発見した。

【００６７】つまり、候補の腫瘍抗原に向かうために、５以上のソート基準を溶解されやす
い標本細胞において、及び、１以下を溶解されにくい標本において使用可能であ
る。

【００６８】それゆえ、あらゆる知られている遺伝子と一致するか、またはそれらは潜在的
に新規である（一致せず＝ＮＭ）か、を決定するために質問報告由来の個々のポ
リペプチド配列をプログラムに挿入する。

【００６９】その後、質問報告由来の特異的配列に対応したｃＤＮＡを回収し、それらは表
現型を与えるかを決定するための適切な生物学的解析において、個別に試験する
。知られている遺伝子に対応した候補の内から、これら候補の相補ＤＮＡを得て
、表現型を示さない細胞に形質転換したときに特定の表現型を与えるかを決定す
るために個別に試験するのはたやすい仕事である。知られている遺伝子の内で表
現型を与えるものが存在しない場合、質問報告の一致しなかった配列に対応する
ｃＤＮＡを、ＰＣＲクローニングにより回収し、表現型を与える能力について新
規ｃＤＮＡを個別に試験する。ここまでにできた仮説が十分であるなら（つまり
単一の遺伝子産物が表現型を与える；ソート基準が望まれた候補を閉め出すほど
には厳密すぎない）、質問報告の候補の一つに対応するｃＤＮＡは、表現型を与
えることが判明し探索は終わる。しかしもし表現型を与える候補が発見されない
場合、「粗い網を投げる」ためにソート変数の厳密性を減らし、上記のように試
験するより多くの候補を捕らえる。

【００７０】一つの態様において、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列は、例えば、標本配
列を既知の配列と一致させるためにコンピューター方法を使用することにより、
配列データベースと比較されることも可能である。配列の一義性は、例えば当該
技術分野において既知の、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＩＮＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１
９８７）サプリメント３０、セクション７．７．１８、表７．７．１のような配
列整列化プログラムを用いた配列比較により決定することが可能である。所望の
整列化プログラムは、ＡＬＩＧＮＰｌｕｓ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で
あり、以下の初期設定変数を用いることが所望である：ミスマッチ＝２；オープ
ンギャップ＝０；及びエクステンドギャップ＝２。その他の所望のプログラムは
、二つのヌクレオチド配列の整列化を行うＢＬＡＳＴプログラムであり、以下の
初期設定変数を用いる：オープンギャップ＝５０；エクステンションギャップ−
２ペナルティー；ギャップＸドロップオフ＝０；エクスペクト＝１０；ワードサ
イズ＝１１。ＢＬＡＳＴプログラムは以下のインターネットアドレスにおいて入
手可能である：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ。あ
るいは、高い、中間及び低い厳密性条件下でのハイブリダイゼーションが配列の
一義性の度合いを示すことが可能である。本発明の方法を用いた研究に受け入れられる表現型本発明の一つの側面において、癌および腫瘍細胞に関連する遺伝子及び遺伝子
産物が決定される。さらに、本発明の方法は、他の型の細胞の多様な表現型及び
、ＳＡＧＥタグ遺伝型間の関連性を確立するために使用可能である。例えば、他
の側面において、本発明の方法は、遺伝病、先天性疾患及び／または後天性疾患
に関連した遺伝子産物の検出において使用可能である。薬剤耐性及び薬剤代謝に
関連した遺伝子産物もまた検出可能である。薬剤代謝に関連した遺伝子の検出は
、治療効果を最大にし副作用を最小にするために、個体の特定の治療薬に対する
反応を決定するという点で、薬理遺伝学の分野において重要な応用性を有する。
さらなる側面において、本発明の方法は、活性が未成熟または未分化の前駆体に
よっては提示されない点で、成熟したまたは分化した細胞集団において測定可能
な生物学的活性を与える遺伝子産物の検出において使用される。例えば、細胞障
害性Ｔ細胞として知られるＴ細胞のクラスは、標的細胞を認識し溶解する能力を
有する、一方、その他の型のＴ細胞は認識能力はあるが溶解能力はない。本発明
の方法を用いることで、この差分、つまり、細胞障害性Ｔ細胞により標的細胞を
溶解することを特異的に可能とする遺伝子発現、に反応する遺伝子を検出するこ
とが可能である。

【００７１】当該分野の技術者にとっては、細胞の表現型を決定し、その表現型及びそのＳ
ＡＧＥ遺伝子型の間の関連性を確立する能力は、細胞の表現型を確立するために
使用された解析の感度、特異性及び／または複雑さに依存することは明らかであ
る。例えば、多くの因子に依存しやすい転移性などの表現型は、程度が単一の特
定の転写産物の量比に依存する表現型と比べて確立するのがより困難である。以下の実施例は、本明細書において定義されるような発明を示すことを意図す
るものであり、制限するものではない。

【００７２】ポリヌクレオチドに関する配列情報を生産するための平凡な配列を使用するた
めのいくつかの選択肢がある：１）ニトロセルロースフィルター、ガラススライド、またはシリコンシップ（
「平行配列解析」またはＰＳＡ）といった固体マトリックスに固定されたオリゴ
ヌクレオチド配列に対する、タグ、または望ましくは増幅されたタグへのハイブ
リダイゼーション；または２）ダイタグ（または鎖状体）調製物の限界希釈を行い、その後、先立つ増幅
を行い、または行わず、個々のＤＮＡを、例えば質量スペクトロスコピー（クロ
ーナル配列または「ＣＳ」）を含めた技術により配列解析すること。ＰＳＡ望まれるＰＳＡの態様において、以下の段階はダイタグと共に行われる：１）ダイタグはＳＡＧＥ技術により定義されたアンカー酵素により調製、増幅
、及び切断される：ＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＡＴＧＧＴＡＣＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３）単離するもの（例えば蛍光部分、ＦＬ）を含む４塩基オリゴマーは突出部
に相補的に調製される：ＦＬ−ＣＡＴＧ４）ＦＬ−ＣＡＴＧオリゴマー（超過分）はダイタグに結合される：ＦＬ−ＣＡＴＧＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＡＴＧＧＴＡＣＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＴＡＣ−ＦＬ５）ダイタグは精製され及び、一本鎖ＤＮＡを集めるために溶解する：ＦＬ−ＣＡＴＧＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＡＴＧＧＴＡＣＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＴＡＣ−ＦＬ６）一本鎖ＤＮＡの混合物は、系列希釈される。

【００７３】７）各系列希釈物は、適度に厳密な条件下で、格子状の一本鎖オリゴヌクレオ
チドを含む固体基質とともにハイブリダイズする；全てのオリゴヌクレオチドは
、アンカー酵素切断配列の半サイトを含んでいる。本明細書において使用される
例において、オリゴヌクレオチド配列はＣＡＴＧ配列を５’端に含む：ＣＡＴＧＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯ、ＣＡＴＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ、等：（またはもしくはＧＡＴＣ配列を３’端に含む：ＯＯＯＯＯＯＯＯＯＧＴＡＣ）基質は、当該技術分野において知られているいくつかの材質から構築され、オ
リゴヌクレオチドを含むチップは、当該技術分野において知られている手順によ
り精製される、例えば、ＶＬＳＩＰ手順により調製されるオリゴヌクレオチドを
含むシリコンチップ。例えば米国特許番号５４２４１８６を参照。

【００７４】８）オリゴヌクレオチドを含む基質は、格子における各場所において蛍光ダイ
タグが存在するまたは存在しないか調べる。好ましい態様では、全ての可能な１０塩基配列がＣＡＴＧに対して３’に抽出
されているような、一般的な配列ＣＡＴＧＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯの文字盤上の、
４¹⁰または１，０４８，５７６のオリゴヌクレオチドがある。ヒトゲノムにはた
った１００，０００から２００，０００の異なる発現遺伝子が算出されているた
め、ヒトゲノム中の発現遺伝子由来のｃＤＮＡにおいて見られる、３’端付着酵
素部位に連結する全ての可能な配列を識別するための十分なオリゴヌクレオチド
配列が存在する。

【００７５】測定は、異なるライブラリー間で異なる希釈において蛍光データ格子図を比較
することによる、差違発現からなされる。例えば、

【００７６】

【表２】

【００７７】

【表３】

【００７８】要約表から、１Ａおよび３Ｂにハイブリダイズする標識は、（標識が両方のラ
イブラリーに全ての希釈においてハイブリダイズすることから）差違発現されて
いない高度に豊富なｍＲＮＡを反映すること、２ＣはライブラリーＢのみを除き
高度に豊富なｍＲＮＡであること、および４ＤはライブラリーＡのみを除き豊富
であることが結論づけられる。２Ｅは（最低希釈においてのみ検出されることか
ら）差違発現が見いだされない低量の転写物を反映し、３Ｃは、ライブラリーＡ
において低量発現する、（低度ふたつの希釈においてのみ発現することから）ラ
イブラリーＢで中程度に豊富な転写物を反映する。４Ｄは差違発現する、ライブ
ラリーＡに限り高度に豊富な転写物を反映し、５ＡはライブラリーＡにおいて高
度に豊富に発現し、ライブラリーＢにおいて低量のみである転写物を反映し、お
よび５Ｅは（ライブラリーＢにおいて）差違発現する、低量転写物を反映する。

【００７９】他のＰＳＡ態様では、上記ステップ３は蛍光または他の識別物の使用を含まず
、代わりとしてチップ上の半分の分子が標識されるように、二量体タグの増幅最
終回において蛍光ｄＮＴＰが用いられる。

【００８０】さらに他のＰＳＡ態様では、二量体タグに代わり、例えば転写物の３’末端と
最初の酵素付着部位の間の塩基配列といった転写物の特定の一部分が用いられる
。その特別な場合において、ＷＯ９７／１０３６３に記述されるように二本鎖ｃ
ＤＮＡ逆転写産物が生成される。転写物は付着酵素で切断され、ＰＣＲプライマ
ーを含むリンカーが添加され、転写物がまだストレプトアビジンビーズ上にある
一方、（片方の末端のプライマーおよび他の末端のＡ尾部を用い）増幅が開始さ
れる。増幅最終回で、蛍光ｄＮＴＰがチップ上で半分の分子が標識するように用
いられる。リンカープライマーは、断片の大きさを減らすためにこの時点で付着
酵素で任意に除去される。可溶断片は前例のように溶解され、およびＣＡＴＧＯ
ＯＯＯＯＯＯＯＯＯを含む固体基質に定着される。（蛍光塩基を含む半分の断片
のみの）解析および計測は上述のとおりである。ＣＳ：二量体タグまたは鎖状分子は、ウエルが（細胞クローニングのための限界希釈
で行われるように）確率的に一ウエルにつき一ＤＮＡ分子以下を平均的に含むよ
うに希釈され、およびウエルまたは他の容器に添加される。各ウエルはＰＣＲま
たは他の増幅過程の反応物を受け取り、各容器のＤＮＡは例えば定量分光器によ
って塩基配列決定される。結果は、単一の塩基配列（その容器中には単一配列が
あった）、「無」配列（ＤＮＡが存在しない）または廃棄される二つの配列（一
ＤＮＡ分子以上）のいずれかである。その後、差違発現の評価はＳＡＧＥ技術に
よる定義と同様である。

【００８１】前述の議論および例は、当該技術分野を記述することのみを目的とする。当該
技術分野における技術の一つに対し明白なこととして、本発明の精神および視野
から離れることなく、上述に様々な修飾を行ってよい。実施例１．研究者は、腫瘍細胞の根絶につながりうる抗腫瘍細胞免疫応答を創造する目的
で、抗原特異的Ｔ細胞応答の顕在化につとめた。今日まで、腫瘍細胞により過剰
発現される自己タンパク質である分化抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７のような
ウイルス抗原、ＭＡＧＥに類型化される癌／精巣抗原ファミリー、およびｒａｓ
およびｐ５３のような変異タンパク質の４クラスの腫瘍抗原が識別された。分化
抗原の大部分は、メラノーマ付随抗原であり、細胞傷害性Ｔ細胞の標的として好
ましい候補であり得る肺、胎盤、胸、または大腸カルシノーマにより過剰発現さ
れる自己抗原を識別試みは、多くが失敗であった。従って今日まで行われた癌免
疫治療の試みの大部分は、メラノーマ治療のためであり、他の悪性疾患に苦しむ
患者に提供する免疫治療はない。

【００８２】本発明は、標的細胞に対し免疫応答を生むためのワクチンの構築において、標
的細胞中で差違発現する遺伝子の使用を要求する。発明者は、先に腫瘍細胞と付
随しなかった、癌細胞で差違発現する多様な転写物を識別するために、（米国特
許第５，６９５，９３７号に記載された）ＳＡＧＥ分析を適用した。

【００８３】ｇｐ１００特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による溶解に差違感受性で
あるメラノーマ細胞系は、溶解に感受性でない細胞系に存在しない、またはより
豊富でないポリヌクレオチドに対し、感受性である細胞系に共通するＳＡＧＥ標
識を決定するため、ＳＡＧＥ分析の対象とされた。１０個のＳＡＧＥポリヌクレ
オチドが選別基準に合致し、（溶解感受性である）６２４ｍｅｌおよび１３００
ｍｅｌとして識別された細胞系において、（溶解に非感受性である）ＢＡ１およ
びＡ３７５として識別された細胞系より、高程度に提示されることがわかった。
ｇｐ１００ｍＲＮＡの異なるスプライス型を成す、二つの異なるポリヌクレオチ
ドは、差違発現される遺伝子群の中に識別され、候補が迅速に絞り込み得ること
を示し、しかし加えて８個の標識配列は、ｃｄｃ２関連タンパク質キナーゼ（表
２）を成す標識を含むことがわかった。同時に他の差違発現される遺伝子は識別
された。従って、識別された遺伝子が過剰発現されたという事実のおかげで、い
くつかは免疫治療に用いる候補であってよい。

【００８４】

【表４】

【００８５】仮に更なるメラノーマ細胞系が分析された場合、同種の抗原をコードし得る、
発現された転写物を成すＳＡＧＥポリヌクレオチドの数をより制限してよい。二
つの非ＨＬＡ−Ａ２メラノーマ細胞系（例えば、ＮＭ４５５およびＳＫ２８）は
選択され、ＨＬＡ−Ａ２をコードするアデノウイルスベクターでの形質転換によ
り表現型（ｇｐ１００特異的ＣＴＬによる溶解に対する感受性）が構築された。
ＳＡ２８はｇｐ１００特異的ＣＴＬに対する好ましい標的である一方、ＮＭ４５
５はそうでなかった。ＨＬＡ−Ａ２陰性細胞系は、ＳＡＧＥ分析がなされ、およ
びＳＡＧＥポリヌクレオチドは、溶解に対し感受性の少ない細胞系において豊富
でない、溶解感受性である細胞系に共通のポリヌクレオチドを識別するために分
類された（表３参照）。分類基準に合致した二つのポリヌクレオチドのうち、ひ
とつはｇｐ１００標識ＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧであった。従って、ＨＬＡ限定ＣＴ
Ｌによる溶解に対する感受性の異なる、６個の異なるメラノーマ細胞系のＳＡＧ
Ｅ分析を行うことによって、ひとつは同種の抗原の候補である、ただ二つの転写
物に焦点を当てることができ、そのうち一つが目的とする標的であった。

【００８６】

【表５】

【００８７】実施例２ＦＡＣＳ解析により、抗ＨＥＲ−２抗体に対し異なる蛍光反応を呈すると判定
された、メラノーマおよび胸癌細胞系は、低い蛍光平均シグナルを示した細胞系
において豊富でない、高い蛍光平均シグナルを示す細胞系の間で、どのＳＡＧＥ
ポリヌクレオチドが共通であるのかを決定するためにＳＡＧＥ分析が行われた。
４個のＳＡＧＥポリヌクレオチドが分類基準に合致し、および（弱い蛍光シグナ
ルを示す）細胞系ＭＤＡ−４６８，ＳＫ２８，ＢＡ１，ＮＭ４５５および１３０
０ｍｅｌよりも、（強い傾向シグナルを示す）２１ＰＴおよび２１ＭＴ細胞系に
おいて、高程度に提示されることがわかった（表４）。ＨＥＲ−２をなす一つの
標識は識別されたが、さらに他の３’標識配列は、インテグリンアルファー３を
なす標識を含むことがわかった。ＨＥＲ−２が先に患者由来Ｔ細胞に対する標的
として識別された一方、インテグリンアルファー３も患者由来免疫効果細胞また
は抗体に対する標的であり得ることは報告されていなかった。従って、インテグ
リンアルファー３をコードする遺伝子またはそれと一致する遺伝子産物またはペ
プチド断片は、インテグリンアルファー３を差違をもって発現する標的細胞への
免疫応答の誘発に用いうる。インテグリンアルファー３はこの実施例に対し用い
られたが、どのような（ＳＡＧＥによって識別された）差違発現遺伝子または遺
伝子群およびそれらと一致するタンパク質またはペプチド断片は、抗標的細胞免
疫応答の誘発に用いうる。

【００８８】

【表６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０６Ｆ 17/30 １８０Ｇ０６Ｆ 17/30 ２３０Ｚ２３０Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号６０／１０３，２３０ (32)優先日平成10年10月５日(1998．10．5) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CA17 CA18 CA19 CB01 CB02 CB17 CB21 CB26 DA12 DA13 DA14 DA80 FA37 FB02 FB03 FB04 FB12 JA01 JA07 JA20 4B024 AA11 AA20 CA01 4B063 QA01 QA13 QQ02 QQ53 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34 5B075 NR20 QT06 UU19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下に記載されている工程を含む、試料細胞に選択される表現型を与えるある
遺伝子のポリヌクレオチド断片を同定する方法：（ａ）二つまたはそれ以上の試料細胞において遺伝子発現の典型を示すひと
そろいのポリヌクレオチドを獲得し；（ｂ）一つまたはそれ以上の対照細胞において遺伝子発現を示すひとそろい
のポリヌクレオチドを獲得し；および（ｃ）上記二つまたはそれ以上の試料細胞に共通でありおよび対照細胞と比
較して試料細胞において特異的に発現される遺伝子である一つの独特のポリヌク
レオチドを同定する。
【請求項２】（ｃ）において同定される独特のポリヌクレオチドに相当する遺伝子を同定し
、そしてそれにより遺伝子を同定することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】独特のポリヌクレオチドが、対照細胞と比較して少なくとも一つの試料細胞に
おいて過剰発現または過小発現された遺伝子を示唆する、請求項１に記載の方法
。
【請求項４】対照細胞の型が一つ以上使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】少なくとも一つの試料細胞が腫瘍性の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】少なくとも一つの試料細胞が分子、タンパク質または因子を分泌する、請求項
１に記載の方法。
【請求項７】腫瘍性の細胞が乳癌、大腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、および黒色腫から成る
グループから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】腫瘍性の細胞が白血病細胞、リンパ腫細胞および骨髄腫細胞から成るグループ
から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】対照細胞が対照正常細胞型、対照良性細胞型、対照非転移性細胞型および腫瘍
性の細胞の非腫瘍性前駆細胞から成るグループから選択される、請求項５に記載
の方法。
【請求項１０】腫瘍性の細胞が腫瘍から得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】腫瘍性の細胞が乳癌、大腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、および黒色腫から成る
グループから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】腫瘍性の細胞が白血病細胞、リンパ腫細胞および骨髄腫細胞から成るグループ
から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】少なくとも一つの対照細胞が対照正常細胞型、対照良性細胞型、対照非転移性
細胞型および腫瘍性の細胞の非腫瘍性前駆細胞から成るグループから選択される
、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】遺伝子が免疫実行細胞による少なくとも一つの試料細胞の認識において関与す
るペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】免疫実行細胞がＴリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】免疫実行細胞がＢリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】免疫実行細胞がＮＫ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】一つまたはそれ以上の試料細胞が免疫実行細胞により認識される表面マーカー
を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】遺伝子が免疫実行細胞による少なくとも一つの試料細胞の認識において関与す
るペプチドをコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】免疫実行細胞がＴリンパ球である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】免疫実行細胞がＢリンパ球である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】免疫実行細胞がＮＫ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】少なくとも一つの試料細胞が毒性Ｔリンパ球により溶解される腫瘍性の細胞で
ある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】対照細胞が毒性Ｔリンパ球により溶解されないが毒性Ｔリンパ球による溶解と
両立できる細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】少なくとも一つの対照細胞が、対照正常細胞型、対照良性細胞型、対照非転移
性細胞型および腫瘍性の細胞の非腫瘍性前駆細胞から成るグループから選択され
る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】少なくとも一つの対照細胞が、対照正常細胞型、対照良性細胞型、対照非転移性
細胞型および腫瘍性の細胞の非腫瘍性前駆細胞から成るグループから選択される
、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】少なくとも一つの試料細胞が薬剤耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】少なくとも一つの試料細胞が薬剤耐性である、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】少なくとも一つの試料細胞が血管形成を刺激する能力を有する、請求項１に記
載の方法。
【請求項３０】少なくとも一つの試料細胞が病原体に感染されている、請求項１に記載の方法
。
【請求項３１】対照細胞が感染されていない細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】病原体が薬剤または抗生物質に耐性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】病原体が薬剤または抗生物質に耐性を与える、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】少なくとも一つの試料細胞がアポトーシス細胞である、請求項１に記載の方法
。
【請求項３５】少なくとも一つの試料細胞が過剰増殖性の細胞である、請求項１に記載の方法
。
【請求項３６】選択される表現型が遺伝病に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】選択される表現型が代謝活性の変化に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】選択される表現型が老化に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】選択される表現型がアポトーシスに関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】選択される表現型が薬剤代謝に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】選択される表現型がアレルギー性反応に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】試料細胞が動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】試料細胞が哺乳類細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】試料細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】試料細胞が微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】少なくとも一つの試料細胞が分化した細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】対照細胞が分化した試料細胞の状態よりも早い分化の状態の細胞である、請求
項４６に記載の方法。
【請求項４８】遺伝子が分泌される生物因子をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】以下の工程を含む、一つまたはそれ以上の分泌される生物因子に相当する一つ
またはそれ以上のポリヌクレオチドを同定する方法：（ａ）その因子を分泌する一つまたはそれ以上の試料細胞において遺伝子発
現を示すひとそろいのポリヌクレオチドを獲得し；（ｂ）その因子を分泌しない一つまたはそれ以上の対照細胞において遺伝子
発現を示すひとそろいのポリヌクレオチドを獲得し；（ｃ）試料細胞に共通で、対照細胞において非存在またはより低い量の発現
である、一つまたはそれ以上の独特のポリヌクレオチドを同定する。
【請求項５０】（ｃ）において同定されるポリヌクレオチドに相当する遺伝子を決定し、それ
により一つまたはそれ以上の分泌される生物因子を同定することをさらに含む、
請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】以下の工程を含む、治療標的を同定する方法：（ａ）二つまたはそれ以上の試料細胞において遺伝子発現を示すひとそろい
のポリヌクレオチドを獲得し；（ｂ）一つまたはそれ以上の対照細胞において遺伝子発現を示すひとそろい
のポリヌクレオチドを獲得し；および（ｃ）二つまたはそれ以上の試料細胞に共通であり対照細胞と比較して試料
細胞において特異的に発現されている遺伝子を示す一つの独特のポリヌクレオチ
ドを同定する。
【請求項５２】（ｃ）において同定される独特のポリヌクレオチドに相当する遺伝子を決定し
、それによりその遺伝子を同定することをさらに含む、請求項５１に記載の方法
。
【請求項５３】独特のポリヌクレオチドが対照細胞と比較して少なくとも一つの試料細胞にお
いて過剰発現される遺伝子の典型を示す、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】対照細胞の型が一つ以上使用される、請求項５１に記載の方法。【請求項５４】少なくとも一つの試料細胞が腫瘍性の細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】少なくとも一つの対照細胞が腫瘍性の細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】腫瘍性の細胞が腫瘍から得られる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】腫瘍性の細胞が乳癌、大腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、および黒色腫から成る
グループから選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】腫瘍性の細胞が白血病細胞、リンパ腫細胞および骨髄腫細胞から成るグループ
から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】対照細胞が対照正常細胞型、対照良性細胞型、対照非転移性細胞型および腫瘍
性の細胞の非腫瘍性前駆細胞から成るグループから選択される、請求項５５に記
載の方法。
【請求項６０】少なくとも一つの試料細胞および少なくとも一つの対照細胞が腫瘍型が同じま
たは異なる腫瘍性の細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】腫瘍性の細胞が乳癌、大腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、および黒色腫から成る
グループから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】腫瘍性の細胞が白血病細胞、リンパ腫細胞および骨髄腫細胞から成るグループ
から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】少なくとも一つの対照細胞が対照正常細胞型、対照良性細胞型、対照非転移性細
胞型および腫瘍性の細胞の非腫瘍性前駆細胞から成るグループから選択される、
請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】その遺伝子が免疫実行細胞による少なくとも一つの試料細胞の認識に関与する
ペプチドをコードする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】免疫実行細胞がＴリンパ球である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】免疫実行細胞がＢリンパ球である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】免疫実行細胞がＮＫ細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】一つまたはそれ以上の試料細胞が免疫実行細胞により認識される表面マーカー
を発現する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６９】その遺伝子が免疫実行細胞による少なくとも一つの試料細胞の認識に関与する
ペプチドをコードする、請求項５１に記載の方法。
【請求項７０】免疫実行細胞がＴリンパ球である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】免疫実行細胞がＢリンパ球である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】免疫実行細胞がＮＫ細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】少なくとも一つの試料細胞が毒性Ｔリンパ球により溶解される腫瘍性の細胞で
ある、請求項５１に記載の方法。
【請求項７４】対照細胞が毒性Ｔリンパ球により溶解されないが毒性Ｔリンパ球による溶解と
両立できる細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】請求項５１の方法により同定される遺伝子により発現されるポリペプチドに対
する抗体に、試料細胞を接触させることを含む、以前に腫瘍性の表現型と関連が
なくおよび試料細胞において過剰発現されるポリペプチドに対する免疫応答を誘
導する方法。
【請求項７６】請求項５１の方法により同定される遺伝子により発現されるタンパク質に対す
る抗体の効果的な量と試料細胞を接触させることを含む、以前に腫瘍性の表現型
と関連がないポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項７７】ＭＨＣ分子との関連において抗原提示細胞の表面上に存在する、請求項２０の
方法により同定される遺伝子により発現されるタンパク質を提示する抗原提示細
胞への暴露により生じる、免疫実行細胞の効果的な量と試料細胞とを接触させる
ことを含む、以前に腫瘍性の表現型と関連がない細胞に対する免疫応答を誘導す
る方法。
【請求項７８】請求項７７の抗原提示細胞の存在および消費において培養された、集団教育済
の免疫実行細胞の効果的な量と試料細胞を接触させることを含む、以前に腫瘍性
の表現型と関連がないポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項７９】サイトカインまたは共刺激性分子の効果的な量と細胞の接触をさらに含む、請
求項７７または７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】ＭＨＣ分子との関連において抗原提示細胞の表面上に存在する、請求項５１の
方法により同定される遺伝子により発現されるタンパク質を提示する抗原提示細
胞の効果的な量を、適する対象に投与することを含む、以前に腫瘍性の表現型と
関連がないポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項８１】請求項７７の抗原提示細胞の存在および消費において培養された、集団教育済
の免疫実行細胞の効果的な量を適する対象に投与することを含む、以前に腫瘍性
の表現型と関連がないポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項８２】サイトカインまたは共刺激性分子の効果的な量と細胞を接触させることをさら
に含む、請求項８０または８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】請求項５１の方法により同定される遺伝子により発現されるタンパク質に対す
る抗体の効果的な量を対象に投与することを含む、適する対象において以前に腫
瘍性の表現型と関連がないポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項８４】以下の工程を含む、多数の細胞試料を処理する結果として生じるポリヌクレオ
チドのデータのデータベースを作成する方法：ａ）多数の細胞の試料から得られたポリヌクレオチドに相当する多数のシー
クエンス記録を電子工学的にコンピュータープロセッサーに移行することおよび
試料に関連し認められる多量のポリヌクレオチドを含む生データのファイルを作
成し；およびｂ）上記生データのファイルを、他の試料から作成された他の生データのフ
ァイルと連結することにより比較データファイルを作成し；その際、比較データファイルは生データファイルから連結される記録を含み、
そのデータは多数の細胞からそれぞれの試料において多数のポリヌクレオチドの
発生のための試料の割合を指し示すために基準化されるようにする。
【請求項８５】比較データファイルを関係データベース管理（ＲＤＢＭＳ）にロードすること
をさらに含む、請求項８４の方法。
【請求項８６】要求選択基準に適合するポリヌクレオチドの報告書を作成するために、ＲＤＢ
ＭＳ中の比較データファイルに対して、要求選択基準に基づく質問を適用するこ
とをさらに含む、請求項８５の方法。
【請求項８７】以下のシステムを含む、選択されるポリヌクレオチドの記録を同定するための
システム：デジタルコンピューター；コンピュータと連結されたデータベース；その中に保存されるデータを有するデータベースサーバーと連結されるデータ
ベースであり、そのデータはポリヌクレオチドの生ファイルから連結されるデー
タの記録を含み、そのデータは多数の試料のそれぞれのサンプルにおいて多数の
同じ標識の発生のための試料の割合を指し示すために基準化されている；および要求選択基準に適合するポリヌクレオチドの記録の報告書を作成するためにデ
ータベースにおいてデータファイルに要求選択基準に基づく質問を利用するため
のコード機構。
【請求項８８】以下の工程を含む、プロセッサー、メモリー、ディスプレイ、入力／出力装置
を有するコンピューターを使用してデータベースから選択されるポリヌクレオチ
ドの記録を同定するための方法：ａ）中に保存されるデータを有するコンピューターと連結されるデータベー
スの提供、そのデータはポリヌクレオチドの生ファイルから連結されるデータの
表現を含み、そのデータは多数の試料のそれぞれにおいて多数の同じポリペプチ
ドの発生の試料の割合を指し示すために基準化されている；およびｂ）要求選択基準に適合するポリヌクレオチドの記録の報告書を作成するた
めにデータベースにおいてデータファイルに要求選択基準に基づく質問を利用す
るためのコード機構の使用。