JP2002360285A - Ｂａｂｅｓｉａｃａｎｉｓワクチン - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】感染力がなく、容易に生産することができ、Ｂ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染に対して、好ましくは全
てのＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ菌株に対して保護を与
えるワクチンが所望されている。 【解決手段】新規Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白
質をコードする核酸配列、ならびにこれらの配列を含む
ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子及び生組換え担体、こ
れらのヌクレオチド配列によってコードされる蛋白質、
又はこれらの蛋白質をコードする遺伝物質を用い、Ｂａ
ｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチン
を調製する。また、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連核
酸配列の検出、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原の
検出、及びＢａｂｅｓａ ｃａｎｉｓ関連抗原性物質に
対する抗体の検出のための診断ツールとして利用する。
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染に対して、好ましくは全
てのＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ菌株に対して保護を与
えるワクチンが所望されている。 【解決手段】新規Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白
質をコードする核酸配列、ならびにこれらの配列を含む
ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子及び生組換え担体、こ
れらのヌクレオチド配列によってコードされる蛋白質、
又はこれらの蛋白質をコードする遺伝物質を用い、Ｂａ
ｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチン
を調製する。また、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連核
酸配列の検出、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原の
検出、及びＢａｂｅｓａ ｃａｎｉｓ関連抗原性物質に
対する抗体の検出のための診断ツールとして利用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規Ｂａｂｅｓｉ
ａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質をコードする核酸配列、これ
らの配列を含むｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子及び生
組換え担体、ならびにかかる核酸配列、ｃＤＮＡ断片、
組換えＤＮＡ分子及び生組換え担体を含む宿主細胞に関
する。さらに、本発明は、これらのヌクレオチド配列に
よってコードされる蛋白質、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉ
ｓ感染を防御するためのワクチンとその調製のための方
法、ワクチンとして使用するためのＢａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ関連抗原物質、及びワクチンの製造におけるＢ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原物質の使用に関す
る。また、本発明は、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連
核酸配列の検出、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原
の検出及びＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原物質に
対する抗体の検出のための診断ツールに関する。
ａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質をコードする核酸配列、これ
らの配列を含むｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子及び生
組換え担体、ならびにかかる核酸配列、ｃＤＮＡ断片、
組換えＤＮＡ分子及び生組換え担体を含む宿主細胞に関
する。さらに、本発明は、これらのヌクレオチド配列に
よってコードされる蛋白質、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉ
ｓ感染を防御するためのワクチンとその調製のための方
法、ワクチンとして使用するためのＢａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ関連抗原物質、及びワクチンの製造におけるＢ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原物質の使用に関す
る。また、本発明は、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連
核酸配列の検出、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原
の検出及びＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原物質に
対する抗体の検出のための診断ツールに関する。
【０００２】バベシア症はマラリアのように限局特性を
持つ疾患である。この理由は、病原体が、脊椎動物個体
群に存在する寄生虫のリザーバーを餌とするマダニによ
って媒介されることによる。マダニが存在する場所にお
いてのみバベシア症が発生する。どちらかといえば、特
に在来の動物においては、寄生生物は重要な疾患を引き
起こすことなく宿主と共存する。多くの場合バベシア症
は、遺伝形質の近親交配及び／又はバベシア症が風土病
である不慣れな環境に動物を輸送することを介して人間
の活動が理由で問題となる（Ｃａｌｌｏｗ，Ｌ．Ｌ．と
Ｄａｌｇｌｉｅｓｈ，Ｒ．Ｊ．，１９８２）。
持つ疾患である。この理由は、病原体が、脊椎動物個体
群に存在する寄生虫のリザーバーを餌とするマダニによ
って媒介されることによる。マダニが存在する場所にお
いてのみバベシア症が発生する。どちらかといえば、特
に在来の動物においては、寄生生物は重要な疾患を引き
起こすことなく宿主と共存する。多くの場合バベシア症
は、遺伝形質の近親交配及び／又はバベシア症が風土病
である不慣れな環境に動物を輸送することを介して人間
の活動が理由で問題となる（Ｃａｌｌｏｗ，Ｌ．Ｌ．と
Ｄａｌｇｌｉｅｓｈ，Ｒ．Ｊ．，１９８２）。
【０００３】イヌでは、この疾患はＢ．ｃａｎｉｓ（カ
クマダニ属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）のダニによって
媒介される）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（チマダニ属（Ｈａｅｍ
ａｐｈｙｓａｌｉｓ）のダニによって媒介される）、
Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（コイタマダニ属（Ｒｈｉｐｉｃｅｐ
ｈａｌｕｓ）のダニによって媒介される）及びＢａｂｅ
ｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）チマダニ属及びコイタマダニ
属のダニによって媒介される）によって引き起こされ
る。自然獲得されたバベシア症における疾患の徴候は、
通常感染から７〜２１日後に始まる。これらの症状は次
のものを含む：発熱、食欲不振、抑うつ、貧血、血色素
尿症及び速やかに発現する衰弱。一般に涙液分泌の上
昇、唾液分泌過多及び筋振せんが起こる。感染の末期に
は神経徴候が発現することがあり、疾患を処置せずに放
置すると死に至る場合もある。汎発性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）に類似した重篤な凝固障害が急性Ｂ．ｃａｎ
ｉｓ感染において報告されている。血栓症は一般的では
ないが、巨核球と結合した小さなヒアリン血栓が報告さ
れている。これらの凝固障害は赤血球の粘着性上昇を導
くと思われる。その結果、微小血管系を通しての血液通
過が妨げられ、内器官のうっ血や充填赤血球量（ＰＣ
Ｖ）の減少をもたらす。これは一部の組織への酸素供給
を低下させ、その後酸素欠乏の結果として組織損傷を導
くと考えられる。Ｂ．ｃａｎｉｓ感染におけるうっ血の
証拠は、イヌを化学療法で処置した実験からのものであ
る。これらの動物の一部は、脾の正常測定値への収縮を
伴って、充填赤血球量が２日間で２５〜３５％回復し
た。
クマダニ属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）のダニによって
媒介される）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（チマダニ属（Ｈａｅｍ
ａｐｈｙｓａｌｉｓ）のダニによって媒介される）、
Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（コイタマダニ属（Ｒｈｉｐｉｃｅｐ
ｈａｌｕｓ）のダニによって媒介される）及びＢａｂｅ
ｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）チマダニ属及びコイタマダニ
属のダニによって媒介される）によって引き起こされ
る。自然獲得されたバベシア症における疾患の徴候は、
通常感染から７〜２１日後に始まる。これらの症状は次
のものを含む：発熱、食欲不振、抑うつ、貧血、血色素
尿症及び速やかに発現する衰弱。一般に涙液分泌の上
昇、唾液分泌過多及び筋振せんが起こる。感染の末期に
は神経徴候が発現することがあり、疾患を処置せずに放
置すると死に至る場合もある。汎発性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）に類似した重篤な凝固障害が急性Ｂ．ｃａｎ
ｉｓ感染において報告されている。血栓症は一般的では
ないが、巨核球と結合した小さなヒアリン血栓が報告さ
れている。これらの凝固障害は赤血球の粘着性上昇を導
くと思われる。その結果、微小血管系を通しての血液通
過が妨げられ、内器官のうっ血や充填赤血球量（ＰＣ
Ｖ）の減少をもたらす。これは一部の組織への酸素供給
を低下させ、その後酸素欠乏の結果として組織損傷を導
くと考えられる。Ｂ．ｃａｎｉｓ感染におけるうっ血の
証拠は、イヌを化学療法で処置した実験からのものであ
る。これらの動物の一部は、脾の正常測定値への収縮を
伴って、充填赤血球量が２日間で２５〜３５％回復し
た。
【０００４】バベシア属の４つの種はその病原性が異な
る。北アフリカＢ．ｖｏｇｅｌｉ菌株は軽度の疾患だけ
を誘発し、この疾患は通常治療を必要としない（オース
トラリアＢ．ｃａｎｉｓ菌株と同様）。ヨーロッパＢ．
ｃａｎｉｓ菌株は北アフリカ寄生生物よりも病原性が強
い。Ｂ．ｃａｎｉｓ Ａ菌株に関する我々の実験では、
約半数の動物が感染後化学療法治療を必要とした。南ア
フリカＢ．ｒｏｓｓｉ菌株は最も病原性が強く、非常に
早期から特徴が認められる。南アフリカＢ．ｒｏｓｓｉ
菌株を使用すると、無傷のイヌは、寄生生物の指数増殖
を特徴とする進行性疾患を発症した。これに対し、ヨー
ロッパＢ．ｃａｎｉｓに感染したイヌにおける寄生虫血
症は通常限られている。後者では、うっ血が主要な疾病
特徴であると思われる。
る。北アフリカＢ．ｖｏｇｅｌｉ菌株は軽度の疾患だけ
を誘発し、この疾患は通常治療を必要としない（オース
トラリアＢ．ｃａｎｉｓ菌株と同様）。ヨーロッパＢ．
ｃａｎｉｓ菌株は北アフリカ寄生生物よりも病原性が強
い。Ｂ．ｃａｎｉｓ Ａ菌株に関する我々の実験では、
約半数の動物が感染後化学療法治療を必要とした。南ア
フリカＢ．ｒｏｓｓｉ菌株は最も病原性が強く、非常に
早期から特徴が認められる。南アフリカＢ．ｒｏｓｓｉ
菌株を使用すると、無傷のイヌは、寄生生物の指数増殖
を特徴とする進行性疾患を発症した。これに対し、ヨー
ロッパＢ．ｃａｎｉｓに感染したイヌにおける寄生虫血
症は通常限られている。後者では、うっ血が主要な疾病
特徴であると思われる。
【０００５】現在バベシア属のためのワクチンは、米国
特許第４，７７７，０３６号に述べられているように、
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの菌株の培養上清から調製
される。しかし、そのようなワクチンはＢ．ｃａｎｉｓ
のこの特定種の菌株の抗原だけしか含まない。そのよう
なワクチンは一般に（野生型）Ｂ．ｃａｎｉｓによる感
染に対してほとんど保護を与えない（Ｌｅｐｅｔｉｔ，
Ｃ．，Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｏｓｅ ｃａｎｉｎｅ ｅｔ
ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，Ｐｉｒｏｄｏｇ，Ｄｏｃｔ
ｏｒａｌ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎａｎｔｅ
ｓ，１９８８）。前記論文の著者は、この感染防御免疫
の欠如について考えられる３つの原因を挙げている： １．ワクチン接種に対するイヌの感受性； ２．ワクチン接種によって誘導される免疫エフェクター
機序のタイプ ３．バベシア属の抗原多様性。
特許第４，７７７，０３６号に述べられているように、
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの菌株の培養上清から調製
される。しかし、そのようなワクチンはＢ．ｃａｎｉｓ
のこの特定種の菌株の抗原だけしか含まない。そのよう
なワクチンは一般に（野生型）Ｂ．ｃａｎｉｓによる感
染に対してほとんど保護を与えない（Ｌｅｐｅｔｉｔ，
Ｃ．，Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｏｓｅ ｃａｎｉｎｅ ｅｔ
ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，Ｐｉｒｏｄｏｇ，Ｄｏｃｔ
ｏｒａｌ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎａｎｔｅ
ｓ，１９８８）。前記論文の著者は、この感染防御免疫
の欠如について考えられる３つの原因を挙げている： １．ワクチン接種に対するイヌの感受性； ２．ワクチン接種によって誘導される免疫エフェクター
機序のタイプ ３．バベシア属の抗原多様性。
【０００６】全弱毒化バベシア属寄生生物を含むワクチ
ンは、寄生生物が再び有毒となり、その結果疾患を治癒
する代わりに疾患を蔓延させる危険性を常にはらんでい
る。それ故、サブユニットワクチンの使用が好ましい。
そこで、感染力がなく、容易に生産することができて、
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染に対して、好ましくは
すべてのＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ菌株に対して保護
を与えるワクチンが所望されている。
ンは、寄生生物が再び有毒となり、その結果疾患を治癒
する代わりに疾患を蔓延させる危険性を常にはらんでい
る。それ故、サブユニットワクチンの使用が好ましい。
そこで、感染力がなく、容易に生産することができて、
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染に対して、好ましくは
すべてのＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ菌株に対して保護
を与えるワクチンが所望されている。
【０００７】各々単独に又は組み合わせたとき、イヌに
おいてＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染防御を誘導する
ことができるＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質を
提供することが、中でも特に、本発明の目的である。意
外にも、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓに特異的に関連す
るそのような２つの新規蛋白質が存在することが発見さ
れた；それらはバベシア種、Ｂ．ｒｏｓｓｉにおいては
認められない。
おいてＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染防御を誘導する
ことができるＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質を
提供することが、中でも特に、本発明の目的である。意
外にも、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓに特異的に関連す
るそのような２つの新規蛋白質が存在することが発見さ
れた；それらはバベシア種、Ｂ．ｒｏｓｓｉにおいては
認められない。
【０００８】新規蛋白質をＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ
に関連すると称することは、これらの蛋白質がＢａｂｅ
ｓｉａ ｃａｎｉｓ寄生生物中に存在することが認めら
れることを意味する。寄生生物の染色体上に遺伝情報が
認められることを意味しない。新規蛋白質についての遺
伝情報は、寄生生物中に認められるが、染色体外情報と
しても存在しうる。
に関連すると称することは、これらの蛋白質がＢａｂｅ
ｓｉａ ｃａｎｉｓ寄生生物中に存在することが認めら
れることを意味する。寄生生物の染色体上に遺伝情報が
認められることを意味しない。新規蛋白質についての遺
伝情報は、寄生生物中に認められるが、染色体外情報と
しても存在しうる。
【０００９】新規蛋白質は、１５ｋＤ蛋白質（又はＢｃ
ｖｉｒ１５）及び３２ｋＤ蛋白質（又はＢｃｖｉｒ３
２）と称される。１５ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列を配列
同定表の配列番号２に示す。この蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡを配列決定し、その核酸配列を配列同定表の配列
番号１に示している。
ｖｉｒ１５）及び３２ｋＤ蛋白質（又はＢｃｖｉｒ３
２）と称される。１５ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列を配列
同定表の配列番号２に示す。この蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡを配列決定し、その核酸配列を配列同定表の配列
番号１に示している。
【００１０】３２ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列を配列同定
表の配列番号４に示す。この蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａを配列決定し、その核酸配列を配列同定表の配列番号
３に示している。
表の配列番号４に示す。この蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａを配列決定し、その核酸配列を配列同定表の配列番号
３に示している。
【００１１】多くの異なる核酸配列が全く同一の蛋白質
をコードしうることは周知技術である。この現象は、ア
ミノ酸をコードする各トリプレットの２番目及び特に３
番目の塩基におけるゆらぎとして一般に知られている。
この現象は、やはり同じ蛋白質をコードする２つの異な
る核酸配列について約３０％の非相同性をもたらしう
る。それ故、約７０％の配列相同性を有する２つの核酸
配列がそれでも全く同一の蛋白質をコードすることがあ
りうる。
をコードしうることは周知技術である。この現象は、ア
ミノ酸をコードする各トリプレットの２番目及び特に３
番目の塩基におけるゆらぎとして一般に知られている。
この現象は、やはり同じ蛋白質をコードする２つの異な
る核酸配列について約３０％の非相同性をもたらしう
る。それ故、約７０％の配列相同性を有する２つの核酸
配列がそれでも全く同一の蛋白質をコードすることがあ
りうる。
【００１２】本発明の１つの実施形態は、１５ｋＤのＢ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質
の免疫原性断片をコードする核酸配列に関し、前記蛋白
質又はその免疫原性断片は、配列番号２に示すようなア
ミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、よ
り好ましくは９５％の相同性を持つ。９８％、さらには
１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質
の免疫原性断片をコードする核酸配列に関し、前記蛋白
質又はその免疫原性断片は、配列番号２に示すようなア
ミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、よ
り好ましくは９５％の相同性を持つ。９８％、さらには
１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
【００１３】本発明のもう１つの実施形態は、３２ｋＤ
のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋
白質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関し、前記
蛋白質又はその免疫原性断片は配列番号４に示すような
アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、
より好ましくは９５％の相同性を持つ。９８％、さらに
は１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋
白質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関し、前記
蛋白質又はその免疫原性断片は配列番号４に示すような
アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、
より好ましくは９５％の相同性を持つ。９８％、さらに
は１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
【００１４】言うまでもなく、本発明に基づいた蛋白質
をコードする核酸配列は、当該蛋白質をコードするＲＮ
Ａ及びこのＲＮＡの遺伝子暗号を担うｃＤＮＡ及びＤＮ
Ａにも等しく適用されることは明白である。結果とし
て、ある核酸配列又はその一部が、例えば配列番号１の
核酸配列と一定レベルの相同性を持つと言われる場合、
この相同性のレベルはｃＤＮＡ及びｃＤＮＡを作製する
ための鋳型として使われるＲＮＡについても等しく当て
はまり、また逆に（ｃ）ＤＮＡ及びそのＤＮＡから転写
されるＲＮＡについても同様である。
をコードする核酸配列は、当該蛋白質をコードするＲＮ
Ａ及びこのＲＮＡの遺伝子暗号を担うｃＤＮＡ及びＤＮ
Ａにも等しく適用されることは明白である。結果とし
て、ある核酸配列又はその一部が、例えば配列番号１の
核酸配列と一定レベルの相同性を持つと言われる場合、
この相同性のレベルはｃＤＮＡ及びｃＤＮＡを作製する
ための鋳型として使われるＲＮＡについても等しく当て
はまり、また逆に（ｃ）ＤＮＡ及びそのＤＮＡから転写
されるＲＮＡについても同様である。
【００１５】本発明が関連する蛋白質の免疫原性断片を
コードする上記核酸配列の部分は非常に小さくてもよ
い。例えば４個のアミノ酸長の免疫原性断片が知られて
いる。そのような免疫原性断片は１２個のヌクレオチド
の核酸配列によってコードされる。そのような非常に短
いアミノ酸配列は、しかしながら、それだけでは免疫原
性を有しない：当該技術において既知である、ＫＨＬの
ような担体と結合する必要がある。より長い断片はそれ
自体で免疫原性となりうる。それ故、免疫原性断片をコ
ードする上記核酸配列の部分は少なくとも１２個のヌク
レオチドを含む。１５個以上、より好ましくは１８個、
２０個、２５個、さらには３０個以上のヌクレオチドを
含む部分が、この順序で選択順位が上がってさらに一層
好ましい。
コードする上記核酸配列の部分は非常に小さくてもよ
い。例えば４個のアミノ酸長の免疫原性断片が知られて
いる。そのような免疫原性断片は１２個のヌクレオチド
の核酸配列によってコードされる。そのような非常に短
いアミノ酸配列は、しかしながら、それだけでは免疫原
性を有しない：当該技術において既知である、ＫＨＬの
ような担体と結合する必要がある。より長い断片はそれ
自体で免疫原性となりうる。それ故、免疫原性断片をコ
ードする上記核酸配列の部分は少なくとも１２個のヌク
レオチドを含む。１５個以上、より好ましくは１８個、
２０個、２５個、さらには３０個以上のヌクレオチドを
含む部分が、この順序で選択順位が上がってさらに一層
好ましい。
【００１６】本発明は、新規Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉ
ｓ関連の１５ｋＤ及び３２ｋＤ蛋白質をコードする核酸
配列を開示し、これにより初めてこれらの蛋白質を十分
な量で入手することが可能となる。これは、例えば当該
蛋白質をコードする遺伝子を発現するような発現系を使
用することによって実施できる。
ｓ関連の１５ｋＤ及び３２ｋＤ蛋白質をコードする核酸
配列を開示し、これにより初めてこれらの蛋白質を十分
な量で入手することが可能となる。これは、例えば当該
蛋白質をコードする遺伝子を発現するような発現系を使
用することによって実施できる。
【００１７】それ故、もう１つの実施形態では、本発明
は、本発明に基づいた核酸配列を含むｃＤＮＡ断片に関
する。ｃＤＮＡは、本発明に基づいた蛋白質をコードす
るＲＮＡの、例えば逆転写酵素によって作製されたＤＮ
Ａのコピーである。そのようなｃＤＮＡ断片の最も短い
形態が、本発明に基づいた核酸配列の一部のＤＮＡコピ
ーである。しかしそれらはまた、コード配列の上流及び
下流に天然には存在しない隣接核酸配列も含みうる。
は、本発明に基づいた核酸配列を含むｃＤＮＡ断片に関
する。ｃＤＮＡは、本発明に基づいた蛋白質をコードす
るＲＮＡの、例えば逆転写酵素によって作製されたＤＮ
Ａのコピーである。そのようなｃＤＮＡ断片の最も短い
形態が、本発明に基づいた核酸配列の一部のＤＮＡコピ
ーである。しかしそれらはまた、コード配列の上流及び
下流に天然には存在しない隣接核酸配列も含みうる。
【００１８】ｃＤＮＡの発現の必須条件は、ｃＤＮＡに
機能的に連結された適切なプロモーターであり、それ故
ｃＤＮＡはプロモーターの制御下にある。プロモーター
の選択が、蛋白質発現のための宿主細胞として使用され
る細胞において遺伝子の転写を指令することができるあ
らゆる真核生物、原核生物又はウイルスプロモーターに
及ぶことは当業者には明白である。それ故、本発明のも
う１つの実施形態は、機能的に連結されたプロモーター
の制御下にある、本発明に基づいたｃＤＮＡ断片又は核
酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは、例え
ば標準的な分子生物学手法によって入手することができ
る（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｉ
ＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）。
機能的に連結された適切なプロモーターであり、それ故
ｃＤＮＡはプロモーターの制御下にある。プロモーター
の選択が、蛋白質発現のための宿主細胞として使用され
る細胞において遺伝子の転写を指令することができるあ
らゆる真核生物、原核生物又はウイルスプロモーターに
及ぶことは当業者には明白である。それ故、本発明のも
う１つの実施形態は、機能的に連結されたプロモーター
の制御下にある、本発明に基づいたｃＤＮＡ断片又は核
酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは、例え
ば標準的な分子生物学手法によって入手することができ
る（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｉ
ＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）。
【００１９】機能的に連結されたプロモーターとは、そ
れらが連結されている核酸配列の転写を制御することが
できるプロモーターである。そのようなプロモーター
は、そのプロモーターが発現に使用される細胞において
機能的であることを条件として、バベシア属プロモータ
ーでありうる。また非相同プロモーターであってもよ
い。宿主細胞が細菌であるとき、使用しうる有用な発現
制御配列は、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオ
ペレーター（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６
１５，１９７８）；外膜蛋白質プロモーター（Ｎａｋａ
ｍｕｒａ，Ｋ．とＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ
Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオフ
ァージラムダプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａ
ｕｔ，Ｅ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ
（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））プロモーター及び
オペレーター、終始配列及び選択した宿主細胞と適合性
である他の発現促進及び制御配列を含む。
れらが連結されている核酸配列の転写を制御することが
できるプロモーターである。そのようなプロモーター
は、そのプロモーターが発現に使用される細胞において
機能的であることを条件として、バベシア属プロモータ
ーでありうる。また非相同プロモーターであってもよ
い。宿主細胞が細菌であるとき、使用しうる有用な発現
制御配列は、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオ
ペレーター（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６
１５，１９７８）；外膜蛋白質プロモーター（Ｎａｋａ
ｍｕｒａ，Ｋ．とＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ
Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオフ
ァージラムダプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａ
ｕｔ，Ｅ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ
（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））プロモーター及び
オペレーター、終始配列及び選択した宿主細胞と適合性
である他の発現促進及び制御配列を含む。
【００２０】宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現制
御配列は、例えばα−交配因子を含む。昆虫細胞につい
ては、バキュロウイルスのポリヘドリン又はｐ１０プロ
モーターが使用できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８
３）。宿主細胞が哺乳類由来であるときには、有用な発
現制御配列の例は、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍ
ａｎ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−
５２７，１９８３）又はメタロチオネインプロモーター
（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９
６，３９−４２，１９８２）又は熱ショックプロモータ
ー（Ｖｏｅｌｌｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８
５）を含む。
御配列は、例えばα−交配因子を含む。昆虫細胞につい
ては、バキュロウイルスのポリヘドリン又はｐ１０プロ
モーターが使用できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８
３）。宿主細胞が哺乳類由来であるときには、有用な発
現制御配列の例は、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍ
ａｎ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−
５２７，１９８３）又はメタロチオネインプロモーター
（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９
６，３９−４２，１９８２）又は熱ショックプロモータ
ー（Ｖｏｅｌｌｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８
５）を含む。
【００２１】細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳類細胞発
現系は非常に頻繁に使用される系である。そのような系
は周知技術であり、一般に入手可能であって、例えばＣ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７，Ｕ
ＳＡを通して市販されている。これらの発現系に次い
で、寄生生物に基づく発現系が非常に魅力的な発現系で
ある。そのような系は、例えばフランス特許願公開番号
２ ７１４ ０７４号及び米国ＮＴＩＳ公開番号ＵＳ０
８／０４３１０９号（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．とＲｏｇｅ
ｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）。
現系は非常に頻繁に使用される系である。そのような系
は周知技術であり、一般に入手可能であって、例えばＣ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７，Ｕ
ＳＡを通して市販されている。これらの発現系に次い
で、寄生生物に基づく発現系が非常に魅力的な発現系で
ある。そのような系は、例えばフランス特許願公開番号
２ ７１４ ０７４号及び米国ＮＴＩＳ公開番号ＵＳ０
８／０４３１０９号（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．とＲｏｇｅ
ｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）。
【００２２】本発明のもう１つの実施形態は、本発明に
基づいたｃＤＮＡ断片又は本発明に基づいた組換えＤＮ
Ａ分子を含む生組換え担体（Ｌｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ Ｃａｒｒｉｅｒ、ＬＲＣ）に関する。そのよ
うな担体は、例えば細菌、寄生生物及びウイルスであ
る。これらのＬＲＣは、付加的な遺伝情報、この場合に
は本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質をコー
ドする核酸配列又はその免疫原性断片がクローニングさ
れている微生物又はウイルスである。そのようなＬＲＣ
に感染した動物は、担体の免疫原に対してだけでなく、
遺伝子コードがＬＲＣ内に付加的にクローニングされて
いる蛋白質の免疫原性部分、例えば１５ｋＤ又は３２ｋ
ＤのｃＤＮＡに対しても免疫原性応答を生じる。
基づいたｃＤＮＡ断片又は本発明に基づいた組換えＤＮ
Ａ分子を含む生組換え担体（Ｌｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ Ｃａｒｒｉｅｒ、ＬＲＣ）に関する。そのよ
うな担体は、例えば細菌、寄生生物及びウイルスであ
る。これらのＬＲＣは、付加的な遺伝情報、この場合に
は本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質をコー
ドする核酸配列又はその免疫原性断片がクローニングさ
れている微生物又はウイルスである。そのようなＬＲＣ
に感染した動物は、担体の免疫原に対してだけでなく、
遺伝子コードがＬＲＣ内に付加的にクローニングされて
いる蛋白質の免疫原性部分、例えば１５ｋＤ又は３２ｋ
ＤのｃＤＮＡに対しても免疫原性応答を生じる。
【００２３】細菌ＬＲＣの例として、当該技術において
既知の弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌
株が魅力的に使用できる。
既知の弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌
株が魅力的に使用できる。
【００２４】生組換え担体寄生生物は、中でも特に、Ｖ
ｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐ
ａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９
８））によって記述されている。
ｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐ
ａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９
８））によって記述されている。
【００２５】また、ＬＲＣウイルスは核酸配列を標的細
胞内に輸送する手段としても使用しうる。生組換え担体
ウイルスはベクターウイルスとも呼ばれる。ベクターと
してしばしば使用されるウイルスは、ワクシニアウイル
ス（Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、
ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２
号）、及び逆ウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら、Ｂａ
ｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖ
ａ，Ｅ．及びＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編集）「実験
的血液学の今−１９８８年（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ−１９８
８）」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ：ｐ．９２−９９（１９８９）より）である。
胞内に輸送する手段としても使用しうる。生組換え担体
ウイルスはベクターウイルスとも呼ばれる。ベクターと
してしばしば使用されるウイルスは、ワクシニアウイル
ス（Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、
ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２
号）、及び逆ウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら、Ｂａ
ｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖ
ａ，Ｅ．及びＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編集）「実験
的血液学の今−１９８８年（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ−１９８
８）」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ：ｐ．９２−９９（１９８９）より）である。
【００２６】当該技術では周知のｉｎ ｖｉｖｏ相同的
組換えの手法を使用して、組換え核酸配列を、宿主動物
において本発明に基づいた挿入核酸配列の発現を誘導す
ることができる、選択した細菌、寄生生物又はウイルス
のゲノムに導入することができる。
組換えの手法を使用して、組換え核酸配列を、宿主動物
において本発明に基づいた挿入核酸配列の発現を誘導す
ることができる、選択した細菌、寄生生物又はウイルス
のゲノムに導入することができる。
【００２７】最後に本発明のもう１つの実施形態は、本
発明に基づいた核酸配列、本発明に基づいたｃＤＮＡ断
片又は組換えＤＮＡ分子、又は本発明に基づいた生組換
え担体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、ｐＢＲ３
２２のような細菌ベースのプラスミド、又はｐＧＥＸの
よな細菌発現ベクター、又はバクテリオファージと組み
合わせた、細菌由来の細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）種の細胞でありうる。宿主細胞はまた真核
生物由来、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合わせ
た酵母細胞、又はベクター又は組換えバキュロウイルス
と組み合わせた昆虫細胞のような高等真核細胞（Ｌｕｃ
ｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−
５５（１９８８）、例えばＴｉプラスミドベースのベク
ター又は植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞
（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ３２：１０３
３（１９８３））、やはり適切なベクター又は組換えウ
イルスと組み合わせた、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はクランデルネコ腎細胞
のような哺乳類細胞であってもよい。
発明に基づいた核酸配列、本発明に基づいたｃＤＮＡ断
片又は組換えＤＮＡ分子、又は本発明に基づいた生組換
え担体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、ｐＢＲ３
２２のような細菌ベースのプラスミド、又はｐＧＥＸの
よな細菌発現ベクター、又はバクテリオファージと組み
合わせた、細菌由来の細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）種の細胞でありうる。宿主細胞はまた真核
生物由来、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合わせ
た酵母細胞、又はベクター又は組換えバキュロウイルス
と組み合わせた昆虫細胞のような高等真核細胞（Ｌｕｃ
ｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−
５５（１９８８）、例えばＴｉプラスミドベースのベク
ター又は植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞
（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ３２：１０３
３（１９８３））、やはり適切なベクター又は組換えウ
イルスと組み合わせた、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はクランデルネコ腎細胞
のような哺乳類細胞であってもよい。
【００２８】本発明のもう１つの実施形態は、本発明に
基づいた新規Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質で
ある１５ｄＤ及び３２ｋＤ蛋白質及びその免疫原性断片
に関する。
基づいた新規Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質で
ある１５ｄＤ及び３２ｋＤ蛋白質及びその免疫原性断片
に関する。
【００２９】免疫原性断片の概念を下記に定義する。
【００３０】ここに包含される個々の蛋白質に関して、
個々のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ菌株に関連する蛋白
質間に天然の変異が存在しうることは明白であろう。こ
れらの変異は、全体的配列内でのアミノ酸の相違によっ
て、又はかかる配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、
逆位又は付加によって明らかにされうる。生物学的及び
免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換が、
例えばＮｅｕｒａｔｈらにより、「蛋白質（Ｔｈｅ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）の中で述べられている。関
連アミノ酸の間でのアミノ酸置換又は進化の過程でしば
しば起こった置換は、中でも特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓ
ｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌ
ｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，「蛋白質の配列
及び構造の図解（Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、
Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓ
ｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８、第５巻、補遺３、
参照）である。他のアミノ酸置換は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓ
ｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌ
ａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕを含むこの情報に基づき、
ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは、迅速で感受性の高い
蛋白質の比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１
４４１，１９８５）及び相同蛋白質間の機能的類似性の
決定のための方法を開発した。本発明の例示的実施形態
のそのようなアミノ酸置換、ならびに欠失及び／又は挿
入を有する変異は、生じる蛋白質が免疫反応性を保持し
ているかぎり本発明の範囲内である。
個々のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ菌株に関連する蛋白
質間に天然の変異が存在しうることは明白であろう。こ
れらの変異は、全体的配列内でのアミノ酸の相違によっ
て、又はかかる配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、
逆位又は付加によって明らかにされうる。生物学的及び
免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換が、
例えばＮｅｕｒａｔｈらにより、「蛋白質（Ｔｈｅ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）の中で述べられている。関
連アミノ酸の間でのアミノ酸置換又は進化の過程でしば
しば起こった置換は、中でも特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓ
ｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌ
ｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，「蛋白質の配列
及び構造の図解（Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、
Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓ
ｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８、第５巻、補遺３、
参照）である。他のアミノ酸置換は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓ
ｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌ
ａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕを含むこの情報に基づき、
ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは、迅速で感受性の高い
蛋白質の比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１
４４１，１９８５）及び相同蛋白質間の機能的類似性の
決定のための方法を開発した。本発明の例示的実施形態
のそのようなアミノ酸置換、ならびに欠失及び／又は挿
入を有する変異は、生じる蛋白質が免疫反応性を保持し
ているかぎり本発明の範囲内である。
【００３１】これにより、本発明に基づいたＢａｂｅｓ
ｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質が、様々な野外分離株から
単離したとき、まだ同じ免疫学的特性、すなわちＢａｂ
ｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染に対する免疫応答を誘導する
能力を備えた同じ蛋白質でありながら、約８０％の相同
性レベルを持ちうる理由が説明される。
ｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質が、様々な野外分離株から
単離したとき、まだ同じ免疫学的特性、すなわちＢａｂ
ｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染に対する免疫応答を誘導する
能力を備えた同じ蛋白質でありながら、約８０％の相同
性レベルを持ちうる理由が説明される。
【００３２】まだＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓによる感
染に対して又は少なくとも感染の臨床症状発現に対して
免疫応答を誘導することができる蛋白質を提供する、本
発明に基づいたある種の蛋白質アミノ酸配列の変異は、
「免疫原性に本質的に影響を及ぼさない」とみなされ
る。
染に対して又は少なくとも感染の臨床症状発現に対して
免疫応答を誘導することができる蛋白質を提供する、本
発明に基づいたある種の蛋白質アミノ酸配列の変異は、
「免疫原性に本質的に影響を及ぼさない」とみなされ
る。
【００３３】それ故、この実施形態の１つの形態は、中
でも特に、１５ｋＤの分子量を持ち、配列番号２に示す
ようなアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミ
ノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質
及びかかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
でも特に、１５ｋＤの分子量を持ち、配列番号２に示す
ようなアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミ
ノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質
及びかかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
【００３４】好ましい形態では、実施形態は、配列番号
２に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ま
しくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ、
そのようなＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質及び
かかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
２に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ま
しくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ、
そのようなＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質及び
かかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
【００３５】９８％、さらには１００％の相同性レベル
がさらに一層好ましい。
がさらに一層好ましい。
【００３６】もう１つの実施形態は、中でも特に、３２
ｋＤの分子量を持ち、配列番号４に示すようなアミノ酸
配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含む
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質及びかかる蛋白
質の免疫原性断片に関する。
ｋＤの分子量を持ち、配列番号４に示すようなアミノ酸
配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含む
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質及びかかる蛋白
質の免疫原性断片に関する。
【００３７】この実施形態の好ましい形態は、配列番号
４に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ま
しくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ、
そのようなＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質及び
かかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
４に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ま
しくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ、
そのようなＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質及び
かかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
【００３８】９８％、さらには１００％の相同性レベル
がさらに一層好ましい。
がさらに一層好ましい。
【００３９】蛋白質の相同性のレベルはコンピュータプ
ログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」でサ
ブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択して決定すること
ができ、このサブプログラムはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ
２，ｈｔｍｌ．でアクセスできる。
ログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」でサ
ブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択して決定すること
ができ、このサブプログラムはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ
２，ｈｔｍｌ．でアクセスできる。
【００４０】このプログラムについての参考文献は、Ｔ
ａｔｉａｎａ Ａ．，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）
である。使用するマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６
２」。使用するパラメータはデフォルトパラメータであ
る：オープンギャップ：１１、エクステンションギャッ
プ：１、ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
ａｔｉａｎａ Ａ．，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）
である。使用するマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６
２」。使用するパラメータはデフォルトパラメータであ
る：オープンギャップ：１１、エクステンションギャッ
プ：１、ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００４１】例えばワクチン接種のため又は抗体を惹起
するために蛋白質を使用するとき、全蛋白質を使用する
必要はない。それ自体で又は例えばＫＬＨのような担体
に結合して、その蛋白質に対する免疫応答を誘導するこ
とができるその蛋白質の断片、いわゆる免疫原性断片を
使用することも可能である。「免疫原性断片」とは、宿
主細胞において免疫応答を誘導する能力を依然として保
持している、すなわちＢ又はＴ細胞エピトープを含む完
全長蛋白質の断片であると理解される。現在、抗原断片
（決定基）をコードするｃＤＮＡ断片を容易に同定する
ために様々な手法が使用可能である。Ｇｅｙｓｅｎらが
述べた方法（特許願ＷＯ８４／０３６５４号、特許願Ｗ
Ｏ８６／０６４８７号、米国特許第４，８３３，０９２
号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３
９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔ
ｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））、いわゆる
ＰＥＰＳＣＡＮ法は、蛋白質の免疫学的重要な領域であ
るエピトープを検出するための、容易に実施でき、迅速
で十分に確立された方法である。かかる方法は世界中で
使用されており、それ自体が当業者には周知である。こ
の（経験的な）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に
適する。また、何らかの蛋白質をコードする遺伝子の配
列が与えられれば、コンピュータアルゴリズムにより、
現在既知であるエピトープとの順序及び／又は構造上の
一致に基づいて特定の蛋白質断片を免疫学的に重要なエ
ピトープとして選定することができる。これらの領域の
決定は、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９
８１））に従った親水性判定基準と、ＣｈｏｕとＦａｓ
ｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第
４，５５４，１０１号）に従った二次構造局面の組合せ
に基づく。Ｔ細胞エピトープは、同様にＢｅｒｚｏｆｓ
ｋｙの両親媒性判定基準（Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３５，
１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許願ＮＴＩ
Ｓ ＵＳ ０７／００５，８８５号）を用いてコンピュ
ータによって配列から予想することができる。簡潔な概
要は次の文献中に認められる：一般的原理に関してはＳ
ｈａｎ Ｌｕ；Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：２３８−２４２
（１９９１）、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄ
ら；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１０ ５９−１０６２（１
９８７）、総説についてはＬｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ １
０：３−７（１９９２），ＨＩＶエピトープについては
Ｂｅｒｚｏｗｓｋｙ；ＴｈｅＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ５：２４１２−２４１８（１９９１）。
するために蛋白質を使用するとき、全蛋白質を使用する
必要はない。それ自体で又は例えばＫＬＨのような担体
に結合して、その蛋白質に対する免疫応答を誘導するこ
とができるその蛋白質の断片、いわゆる免疫原性断片を
使用することも可能である。「免疫原性断片」とは、宿
主細胞において免疫応答を誘導する能力を依然として保
持している、すなわちＢ又はＴ細胞エピトープを含む完
全長蛋白質の断片であると理解される。現在、抗原断片
（決定基）をコードするｃＤＮＡ断片を容易に同定する
ために様々な手法が使用可能である。Ｇｅｙｓｅｎらが
述べた方法（特許願ＷＯ８４／０３６５４号、特許願Ｗ
Ｏ８６／０６４８７号、米国特許第４，８３３，０９２
号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３
９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔ
ｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））、いわゆる
ＰＥＰＳＣＡＮ法は、蛋白質の免疫学的重要な領域であ
るエピトープを検出するための、容易に実施でき、迅速
で十分に確立された方法である。かかる方法は世界中で
使用されており、それ自体が当業者には周知である。こ
の（経験的な）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に
適する。また、何らかの蛋白質をコードする遺伝子の配
列が与えられれば、コンピュータアルゴリズムにより、
現在既知であるエピトープとの順序及び／又は構造上の
一致に基づいて特定の蛋白質断片を免疫学的に重要なエ
ピトープとして選定することができる。これらの領域の
決定は、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９
８１））に従った親水性判定基準と、ＣｈｏｕとＦａｓ
ｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第
４，５５４，１０１号）に従った二次構造局面の組合せ
に基づく。Ｔ細胞エピトープは、同様にＢｅｒｚｏｆｓ
ｋｙの両親媒性判定基準（Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３５，
１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許願ＮＴＩ
Ｓ ＵＳ ０７／００５，８８５号）を用いてコンピュ
ータによって配列から予想することができる。簡潔な概
要は次の文献中に認められる：一般的原理に関してはＳ
ｈａｎ Ｌｕ；Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：２３８−２４２
（１９９１）、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄ
ら；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１０ ５９−１０６２（１
９８７）、総説についてはＬｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ １
０：３−７（１９９２），ＨＩＶエピトープについては
Ｂｅｒｚｏｗｓｋｙ；ＴｈｅＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ５：２４１２−２４１８（１９９１）。
【００４２】そこで、本発明のもう１つの実施形態は、
上述したような本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原
性断片を製薬上許容される担体と共に含む、Ｂａｂｅｓ
ｉａｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関す
る。
上述したような本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原
性断片を製薬上許容される担体と共に含む、Ｂａｂｅｓ
ｉａｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関す
る。
【００４３】本発明に基づいたワクチンを作製する１つ
の方法は、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ寄生生物の増殖
と、１５ｋＤ及び３２ｋＤ蛋白質の精製を含む。これ
は、しかしながら、非常に時間のかかるワクチン製造方
法である。従って工業的規模でそのようなワクチンを製
造することはあまり実用的ではないであろう。
の方法は、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ寄生生物の増殖
と、１５ｋＤ及び３２ｋＤ蛋白質の精製を含む。これ
は、しかしながら、非常に時間のかかるワクチン製造方
法である。従って工業的規模でそのようなワクチンを製
造することはあまり実用的ではないであろう。
【００４４】本発明の利点の１つは初めて１５ｋＤ及び
３２ｋＤ蛋白質をコードする核酸配列を提供することで
ある。それ故、ワクチンとしてこれらの蛋白質又は本発
明に基づいたその免疫原性断片をコードするｃＤＮＡの
発現産物を使用することははるかに便利である。
３２ｋＤ蛋白質をコードする核酸配列を提供することで
ある。それ故、ワクチンとしてこれらの蛋白質又は本発
明に基づいたその免疫原性断片をコードするｃＤＮＡの
発現産物を使用することははるかに便利である。
【００４５】これらのｃＤＮＡの発現産物に基づくワク
チンは、本発明に基づいた一方又は両方の蛋白質又は本
発明に基づいたその免疫原性断片を、下記に述べるよう
な製薬上許容される担体と混合することによって容易に
作製できる。本発明に基づいた一方又は両方の蛋白質又
は本発明に基づいたその免疫原性断片が発現された宿主
細胞と、製薬上許容される担体を直接混合することも可
能である。
チンは、本発明に基づいた一方又は両方の蛋白質又は本
発明に基づいたその免疫原性断片を、下記に述べるよう
な製薬上許容される担体と混合することによって容易に
作製できる。本発明に基づいた一方又は両方の蛋白質又
は本発明に基づいたその免疫原性断片が発現された宿主
細胞と、製薬上許容される担体を直接混合することも可
能である。
【００４６】その代わりに、本発明に基づいたワクチン
は、本発明に基づいた蛋白質又は本発明に基づいたその
免疫原性断片を発現することができる、上述したような
生組換え担体を含みうる。例えば細菌（例えばサルモネ
ラ属）担体、寄生生物又はウイルス担体に基づくそのよ
うなワクチンは、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの自然の
感染方法をよりよく模倣することができるという点でサ
ブユニットワクチンより有利である。さらに、免疫には
少量の組換え担体しか必要としないので、それらの自己
増殖は利点である。そこで、さらにもう１つの実施形態
は、本発明に基づいた生組換え担体と製薬上許容される
担体を含む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御す
るためのワクチンに関する。
は、本発明に基づいた蛋白質又は本発明に基づいたその
免疫原性断片を発現することができる、上述したような
生組換え担体を含みうる。例えば細菌（例えばサルモネ
ラ属）担体、寄生生物又はウイルス担体に基づくそのよ
うなワクチンは、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの自然の
感染方法をよりよく模倣することができるという点でサ
ブユニットワクチンより有利である。さらに、免疫には
少量の組換え担体しか必要としないので、それらの自己
増殖は利点である。そこで、さらにもう１つの実施形態
は、本発明に基づいた生組換え担体と製薬上許容される
担体を含む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御す
るためのワクチンに関する。
【００４７】上述したすべてのワクチンが能動的ワクチ
ン接種に寄与する、すなわち本発明に基づいた１つ又は
それ以上の蛋白質又はその免疫原性断片が引き金となっ
て、宿主の免疫系がこれらの蛋白質又は断片に対する抗
体を産生する又はこれらの蛋白質に関連するエピトープ
によって特異的に惹起されるレセプターでＴ細胞個体群
を増殖させる。
ン接種に寄与する、すなわち本発明に基づいた１つ又は
それ以上の蛋白質又はその免疫原性断片が引き金となっ
て、宿主の免疫系がこれらの蛋白質又は断片に対する抗
体を産生する又はこれらの蛋白質に関連するエピトープ
によって特異的に惹起されるレセプターでＴ細胞個体群
を増殖させる。
【００４８】あるいは、そのような抗体は、例えばウサ
ギにおいて惹起する又は下記に述べるような抗体産生細
胞系統から入手することができる。その後そのような抗
体を宿主動物に投与することができる。このワクチン接
種方法、すなわち受動的ワクチン接種は、動物が既に感
染していて、自然の免疫応答を惹起する時間がないとき
に選択されるワクチン接種法である。また免疫無防備状
態の動物にワクチン接種するための好ましい方法でもあ
る。これらの場合には、投与したＢａｂｅｓｉａ ｃａ
ｎｉｓに対する抗体は、本発明に基づいた蛋白質及びこ
れらの蛋白質に接触した寄生生物と細胞に直接結合する
ことができる。これはＢａｂｅｓｉａｃａｎｉｓの増殖
を低下させる又は停止させるという利点を持つ。
ギにおいて惹起する又は下記に述べるような抗体産生細
胞系統から入手することができる。その後そのような抗
体を宿主動物に投与することができる。このワクチン接
種方法、すなわち受動的ワクチン接種は、動物が既に感
染していて、自然の免疫応答を惹起する時間がないとき
に選択されるワクチン接種法である。また免疫無防備状
態の動物にワクチン接種するための好ましい方法でもあ
る。これらの場合には、投与したＢａｂｅｓｉａ ｃａ
ｎｉｓに対する抗体は、本発明に基づいた蛋白質及びこ
れらの蛋白質に接触した寄生生物と細胞に直接結合する
ことができる。これはＢａｂｅｓｉａｃａｎｉｓの増殖
を低下させる又は停止させるという利点を持つ。
【００４９】それ故、本発明のこの実施形態からのもう
１つの形態は、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ ｃａ
ｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片と、
製薬上許容される担体を含む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
１つの形態は、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ ｃａ
ｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片と、
製薬上許容される担体を含む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
【００５０】もう１つの実施形態は、本発明に基づいた
抗体と製薬上許容される担体を混合することを含む、本
発明に基づいたワクチンの調製のための方法に関する。
抗体と製薬上許容される担体を混合することを含む、本
発明に基づいたワクチンの調製のための方法に関する。
【００５１】ワクチンはまた、本発明に基づいた核酸配
列、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子又は生組換え担体
を含む、上述したような宿主細胞に基づくこともでき
る。
列、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子又は生組換え担体
を含む、上述したような宿主細胞に基づくこともでき
る。
【００５２】それ故、本発明のもう１つの実施形態は、
本発明に基づいた宿主細胞と製薬上許容される担体を含
む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するための
ワクチンに関する。
本発明に基づいた宿主細胞と製薬上許容される担体を含
む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するための
ワクチンに関する。
【００５３】ワクチン接種の代替的で効率的な方法は、
関連抗原をコードするＤＮＡによる直接ワクチン接種で
ある。蛋白質をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種は
多くの異なる蛋白質について成功を収めてきた（例えば
Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、ＴｈｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ
２：２０−２６（１９９３）において検討されている
ように）。
関連抗原をコードするＤＮＡによる直接ワクチン接種で
ある。蛋白質をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種は
多くの異なる蛋白質について成功を収めてきた（例えば
Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、ＴｈｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ
２：２０−２６（１９９３）において検討されている
ように）。
【００５４】このワクチン接種の方法はＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ感染に対するイヌのワクチン接種にとって
も魅力的である。
ｃａｎｉｓ感染に対するイヌのワクチン接種にとって
も魅力的である。
【００５５】それ故、本発明のこの実施形態のさらなる
他の形態は、本発明に基づいた核酸配列と製薬上許容さ
れる担体を含むワクチン、及び本発明に基づいたｃＤＮ
Ａ断片と製薬上許容される担体を含むワクチンに関す
る。
他の形態は、本発明に基づいた核酸配列と製薬上許容さ
れる担体を含むワクチン、及び本発明に基づいたｃＤＮ
Ａ断片と製薬上許容される担体を含むワクチンに関す
る。
【００５６】この実施形態のさらにもう１つの形態は、
本発明に基づいた組換えＤＮＡ分子と製薬上許容される
担体を含むワクチンに関する。ＤＮＡワクチンは、例え
ば無針注射器を用いて、皮内適用を通して容易に投与す
ることができる。この投与方法は、ワクチンを接種する
動物の細胞内にＤＮＡを直接送達する。１〜１００μｇ
のマイクログラム範囲内の量のＤＮＡは非常に良好な成
績を提供する。
本発明に基づいた組換えＤＮＡ分子と製薬上許容される
担体を含むワクチンに関する。ＤＮＡワクチンは、例え
ば無針注射器を用いて、皮内適用を通して容易に投与す
ることができる。この投与方法は、ワクチンを接種する
動物の細胞内にＤＮＡを直接送達する。１〜１００μｇ
のマイクログラム範囲内の量のＤＮＡは非常に良好な成
績を提供する。
【００５７】好ましい実施形態では、本発明に基づいた
ワクチンは、イヌに対して病原性の微生物又はウイルス
から誘導される付加的抗原、又はそのような抗原をコー
ドする遺伝情報を含む。
ワクチンは、イヌに対して病原性の微生物又はウイルス
から誘導される付加的抗原、又はそのような抗原をコー
ドする遺伝情報を含む。
【００５８】そのようなイヌに対して病原性の生物及び
ウイルスは、好ましくはＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉ
ｓ、Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ、ｖｏｇｅｌｉ、
ｒｏｓｓｉ、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａ
ｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌパルボウイル
ス、イヌジステンパーウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ
ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉ
ｃｏｌａ、ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、
ｐｏｍｏｎａ、ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａｂｒａｔｉ
ｓｌａｖａ、イヌ肝炎ウイルス、イヌパラインフルエン
ザウイルス、狂犬病ウイルス、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ
ｃａｎｉｓ及びＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉの群から選択される。
ウイルスは、好ましくはＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉ
ｓ、Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ、ｖｏｇｅｌｉ、
ｒｏｓｓｉ、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａ
ｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌパルボウイル
ス、イヌジステンパーウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ
ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉ
ｃｏｌａ、ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、
ｐｏｍｏｎａ、ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａｂｒａｔｉ
ｓｌａｖａ、イヌ肝炎ウイルス、イヌパラインフルエン
ザウイルス、狂犬病ウイルス、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ
ｃａｎｉｓ及びＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉの群から選択される。
【００５９】本発明に基づいたワクチンはすべて製薬上
許容される担体を含む。製薬上許容される担体は、例え
ば滅菌水又は滅菌生理食塩水でありうる。より複雑な形
態では、担体は例えば緩衝液でありうる。
許容される担体を含む。製薬上許容される担体は、例え
ば滅菌水又は滅菌生理食塩水でありうる。より複雑な形
態では、担体は例えば緩衝液でありうる。
【００６０】ワクチンの調製のための方法は、本発明に
基づいた核酸配列、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子又
は生組換え担体、本発明に基づいた宿主細胞、又は本発
明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片と、製薬上許
容される担体を混合することを含む。
基づいた核酸配列、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子又
は生組換え担体、本発明に基づいた宿主細胞、又は本発
明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片と、製薬上許
容される担体を混合することを含む。
【００６１】そこで、本発明のもう１つの実施形態は、
本発明に基づいた核酸配列、本発明に基づいたｃＤＮＡ
断片、本発明に基づいた組換えＤＮＡ分子、本発明に基
づいた生組換え担体又は本発明に基づいた宿主細胞又は
本発明に基づいた蛋白質と、製薬上許容される担体を混
合することを含む、本発明に基づいたワクチンの調製の
ための方法に関する。
本発明に基づいた核酸配列、本発明に基づいたｃＤＮＡ
断片、本発明に基づいた組換えＤＮＡ分子、本発明に基
づいた生組換え担体又は本発明に基づいた宿主細胞又は
本発明に基づいた蛋白質と、製薬上許容される担体を混
合することを含む、本発明に基づいたワクチンの調製の
ための方法に関する。
【００６２】本発明に基づいたワクチンは、好ましい形
態として、同時にアジュバントを含みうる。一般にアジ
ュバントは、非特異的に宿主の免疫応答を高める物質を
含む。多くのアジュバントが当該技術において知られて
いる。アジュバントの例は、フロイント完全及び不完全
アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマ
ー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商標）
のようなサポン、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）
又はＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油、及びＣａｒｂ
ｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕ
ｖａｃ（登録商標） Ｆｏｒｔｅである。
態として、同時にアジュバントを含みうる。一般にアジ
ュバントは、非特異的に宿主の免疫応答を高める物質を
含む。多くのアジュバントが当該技術において知られて
いる。アジュバントの例は、フロイント完全及び不完全
アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマ
ー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商標）
のようなサポン、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）
又はＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油、及びＣａｒｂ
ｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕ
ｖａｃ（登録商標） Ｆｏｒｔｅである。
【００６３】ワクチンはまた、いわゆる「賦形剤」を含
みうる。賦形剤は、蛋白質がそれに供給結合することな
く付着する化合物である。多用される賦形剤化合物とし
ては、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム
又は酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、及びベント
ナイトである。
みうる。賦形剤は、蛋白質がそれに供給結合することな
く付着する化合物である。多用される賦形剤化合物とし
ては、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム
又は酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、及びベント
ナイトである。
【００６４】抗原が部分的に賦形剤中に包埋されている
というような賦形剤の特殊な形態はいわゆるＩＳＣＯＭ
（ＥＰ １０９，９４２号、ＥＰ １８０，５６４号、
ＥＰ２４２，３８０号）である。
というような賦形剤の特殊な形態はいわゆるＩＳＣＯＭ
（ＥＰ １０９，９４２号、ＥＰ １８０，５６４号、
ＥＰ２４２，３８０号）である。
【００６５】さらに、ワクチンは１つ又はそれ以上の適
当な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴ
ｗｅｅｎを含みうる。
当な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴ
ｗｅｅｎを含みうる。
【００６６】しばしばワクチンは、例えば分解しやすい
蛋白質を分解から保護するため、ワクチンの貯蔵寿命を
高めるため、又は凍結乾燥効率を改善するために安定剤
と混合される。有用な安定剤は、中でも特に、ＳＰＧＡ
（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えばソル
ビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ス
クロース、デキストラン又はグルコース、アルブミン又
はカゼインのような蛋白質又はその分解産物、及びアル
カリ金属リン酸塩のような緩衝剤である。
蛋白質を分解から保護するため、ワクチンの貯蔵寿命を
高めるため、又は凍結乾燥効率を改善するために安定剤
と混合される。有用な安定剤は、中でも特に、ＳＰＧＡ
（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えばソル
ビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ス
クロース、デキストラン又はグルコース、アルブミン又
はカゼインのような蛋白質又はその分解産物、及びアル
カリ金属リン酸塩のような緩衝剤である。
【００６７】さらに、ワクチンは生理的に許容される希
釈剤に懸濁することができる。賦形剤化合物又は希釈剤
を補助し、付加する他の方法、蛋白質を乳化又は安定化
する他の方法も本発明において体現されることは言うま
でもない。
釈剤に懸濁することができる。賦形剤化合物又は希釈剤
を補助し、付加する他の方法、蛋白質を乳化又は安定化
する他の方法も本発明において体現されることは言うま
でもない。
【００６８】そこで、この実施形態の好ましい形態は、
アジュバントを含む、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
アジュバントを含む、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
【００６９】本発明に基づいたワクチンは、１〜１００
マイクログラムの範囲の量で非常に適切に投与しうる
が、より低い用量も原則として使用できる。１００マイ
クログラムを越える用量は、免疫学的には非常に適切で
あるが、商業的理由からあまり魅力的ではないであろ
う。
マイクログラムの範囲の量で非常に適切に投与しうる
が、より低い用量も原則として使用できる。１００マイ
クログラムを越える用量は、免疫学的には非常に適切で
あるが、商業的理由からあまり魅力的ではないであろ
う。
【００７０】上述したＬＲＣウイルス、寄生生物及び細
菌のような生弱毒化組換え担体に基づくワクチンは、そ
れらの感染中に自ら増殖するので、はるかに低い用量で
投与することができる。それ故、適当量は、それぞれ細
菌、寄生生物及びウイルスについて１０３〜１０９ＣＦ
Ｕ／ＰＦＵの間の範囲であろう。
菌のような生弱毒化組換え担体に基づくワクチンは、そ
れらの感染中に自ら増殖するので、はるかに低い用量で
投与することができる。それ故、適当量は、それぞれ細
菌、寄生生物及びウイルスについて１０３〜１０９ＣＦ
Ｕ／ＰＦＵの間の範囲であろう。
【００７１】多くの投与方法が適用できる。例えばワク
チンの筋肉内適用による全身適用は適切な投与法であ
る。この経路を使用する場合には、全身適用のための当
該技術において既知の標準的手法が良好に適する。真皮
内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、皮下及び皮内（ｉｎｔ
ｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与法も魅力的である。
チンの筋肉内適用による全身適用は適切な投与法であ
る。この経路を使用する場合には、全身適用のための当
該技術において既知の標準的手法が良好に適する。真皮
内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、皮下及び皮内（ｉｎｔ
ｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与法も魅力的である。
【００７２】本発明のさらにもう１つの実施形態は、ワ
クチン使用のための本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ関連蛋白質に関する。
クチン使用のための本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ関連蛋白質に関する。
【００７３】本発明のさらにもう１つの実施形態は、Ｂ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチ
ンの製造のための、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ関連蛋白質の使用に関する。
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチ
ンの製造のための、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ関連蛋白質の使用に関する。
【００７４】疾患予防の見地から、Ｂａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ感染の迅速で正確な診断が重要である。
ａｎｉｓ感染の迅速で正確な診断が重要である。
【００７５】それ故、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染
の検出に適した診断ツールを提供することが本発明のも
う１つの目的である。
の検出に適した診断ツールを提供することが本発明のも
う１つの目的である。
【００７６】Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの検出のため
の診断検査は、例えば検査する動物から単離したＲＮＡ
と特異的プローブとの反応に基づく、あるいは例えば１
５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質についてのコード配列に基づ
くＲＴ−ＰＣＲ検査又はかかるコード配列に相補的な核
酸配列に基づくＲＴ−ＰＣＲ検査である。本発明に基づ
いたＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質に特異的な
核酸分子が動物中に存在する場合、これらは、例えば特
異的ＰＣＲプライマーに特異的に結合し、その後ＲＴ−
ＰＣＲ反応において増幅される。次にＤＮＡゲル電気泳
動においてＰＣＲ反応産物を容易に検出することができ
る。ＲＴ−ＰＣＲ反応は周知技術である（下記の参考文
献参照）。核酸分子は、試験する動物の赤血球（その中
に存在する寄生生物）から最も容易に単離できる。標準
的なＰＣＲテキストが、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉ
ａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質に特異的な核酸分子との選択
的ＰＣＲ反応のためのプライマー長を決定する方法を教
示する。少なくとも１２個のヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列を持つプライマーがしばしば使用されるが、１５
個以上、より好ましくは１８個以上のヌクレオチドのプ
ライマーは幾分より選択的である。特に少なくとも２０
個、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチド長を持
つプライマーは極めて一般的に適用しうる。ＰＣＲ手法
は（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；
ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−４４７−５
（１９９５））の中で広汎に記述されている。Ｂａｂｅ
ｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質をコードする核酸配列あ
るいは少なくとも１２個、好ましくは１５個、より好ま
しくは１８個、さらに一層好ましくは、選択順位が上が
る順に２０個、２２個、２５個、３０個、３５個又は４
０個以上のヌクレオチド長を持つそれらの核酸分子の部
分であって、配列番号１又は３に示すような核酸配列又
は配列番号１又は３に示すような核酸配列に相補的な核
酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つ核酸分子又は
その部分も、それ故、本発明の一部である。そのような
核酸分子は、例えば本発明に基づいた蛋白質をコードす
る核酸の量を高めるために（ＲＴ−）ＰＣＲ反応におけ
るプライマーとして使用することができる。これは、例
えば上記に示したような組織におけるＢａｂｅｓｉａの
検出のための診断ツールとして使用するための特異的ヌ
クレオチド配列の迅速な増幅を可能にする。
の診断検査は、例えば検査する動物から単離したＲＮＡ
と特異的プローブとの反応に基づく、あるいは例えば１
５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質についてのコード配列に基づ
くＲＴ−ＰＣＲ検査又はかかるコード配列に相補的な核
酸配列に基づくＲＴ−ＰＣＲ検査である。本発明に基づ
いたＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質に特異的な
核酸分子が動物中に存在する場合、これらは、例えば特
異的ＰＣＲプライマーに特異的に結合し、その後ＲＴ−
ＰＣＲ反応において増幅される。次にＤＮＡゲル電気泳
動においてＰＣＲ反応産物を容易に検出することができ
る。ＲＴ−ＰＣＲ反応は周知技術である（下記の参考文
献参照）。核酸分子は、試験する動物の赤血球（その中
に存在する寄生生物）から最も容易に単離できる。標準
的なＰＣＲテキストが、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉ
ａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質に特異的な核酸分子との選択
的ＰＣＲ反応のためのプライマー長を決定する方法を教
示する。少なくとも１２個のヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列を持つプライマーがしばしば使用されるが、１５
個以上、より好ましくは１８個以上のヌクレオチドのプ
ライマーは幾分より選択的である。特に少なくとも２０
個、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチド長を持
つプライマーは極めて一般的に適用しうる。ＰＣＲ手法
は（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；
ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−４４７−５
（１９９５））の中で広汎に記述されている。Ｂａｂｅ
ｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質をコードする核酸配列あ
るいは少なくとも１２個、好ましくは１５個、より好ま
しくは１８個、さらに一層好ましくは、選択順位が上が
る順に２０個、２２個、２５個、３０個、３５個又は４
０個以上のヌクレオチド長を持つそれらの核酸分子の部
分であって、配列番号１又は３に示すような核酸配列又
は配列番号１又は３に示すような核酸配列に相補的な核
酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つ核酸分子又は
その部分も、それ故、本発明の一部である。そのような
核酸分子は、例えば本発明に基づいた蛋白質をコードす
る核酸の量を高めるために（ＲＴ−）ＰＣＲ反応におけ
るプライマーとして使用することができる。これは、例
えば上記に示したような組織におけるＢａｂｅｓｉａの
検出のための診断ツールとして使用するための特異的ヌ
クレオチド配列の迅速な増幅を可能にする。
【００７７】蛋白質の相同性のレベルはコンピュータプ
ログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」でサ
ブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択して決定すること
ができ、このサブプログラムはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ
２，ｈｔｍｌ．でアクセスできる。
ログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」でサ
ブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択して決定すること
ができ、このサブプログラムはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ
２，ｈｔｍｌ．でアクセスできる。
【００７８】このプログラムについての参考文献は、Ｔ
ａｔｉａｎａ Ａ．，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）
である。使用するマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６
２」。使用するパラメータはデフォルトパラメータであ
る：オープンギャップ：１１、エクステンションギャッ
プ：１、ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
ａｔｉａｎａ Ａ．，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）
である。使用するマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６
２」。使用するパラメータはデフォルトパラメータであ
る：オープンギャップ：１１、エクステンションギャッ
プ：１、ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００７９】もう１つの核酸ベースの試験は、赤血球か
ら得られた寄生生物材料の増殖、次いで古典的ＲＮＡ精
製とそれに続くｃＤＮＡ合成及び／又は放射標識又は色
素標識した１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質特異的なｃＤＮ
Ａ断片との古典的ハイブリダイゼーションに基づく。Ｐ
ＣＲ反応とハイブリダイゼーション反応はいずれも周知
技術であり、中でも特にＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａ
ｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６０に述べら
れている。
ら得られた寄生生物材料の増殖、次いで古典的ＲＮＡ精
製とそれに続くｃＤＮＡ合成及び／又は放射標識又は色
素標識した１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質特異的なｃＤＮ
Ａ断片との古典的ハイブリダイゼーションに基づく。Ｐ
ＣＲ反応とハイブリダイゼーション反応はいずれも周知
技術であり、中でも特にＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａ
ｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６０に述べら
れている。
【００８０】そこで、本発明のもう１つの実施形態は、
試験が、配列番号１又は３に示すような核酸配列と少な
くとも７０％の相同である核酸配列、又はかかる核酸配
列に相補的なヌクレオチド配列、又は少なくとも１２
個、好ましくは１５個、より好ましくは１８個のヌクレ
オチドの長さを持つその断片を含むことを特徴とする、
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連ＲＮＡの検出のための
診断検査に関する。
試験が、配列番号１又は３に示すような核酸配列と少な
くとも７０％の相同である核酸配列、又はかかる核酸配
列に相補的なヌクレオチド配列、又は少なくとも１２
個、好ましくは１５個、より好ましくは１８個のヌクレ
オチドの長さを持つその断片を含むことを特徴とする、
Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連ＲＮＡの検出のための
診断検査に関する。
【００８１】例えば血清、組織又は体液中のＢａｂｅｓ
ｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質に対する抗体の検出のため
の診断検査は、本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ
蛋白質又はその抗原性断片がＥＬＩＳＡプレートの穴の
壁に被覆されている簡単な標準ＥＬＩＳＡ試験でありう
る。そのような抗体の検出のための方法としては、例え
ば１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片を被
験哺乳類からの血清と共に反応させ、次いで関連哺乳類
抗体に対する標識抗体と共に反応させることである。そ
の後呈色反応によってＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連
蛋白質に対する抗体の存在の可否を明らかにすることが
できる。診断検査系のもう１つの例は、本発明に基づい
た１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片を被
験哺乳類の血清と反応させ、その後ウエスタンブロット
分析をすることである。
ｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質に対する抗体の検出のため
の診断検査は、本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ
蛋白質又はその抗原性断片がＥＬＩＳＡプレートの穴の
壁に被覆されている簡単な標準ＥＬＩＳＡ試験でありう
る。そのような抗体の検出のための方法としては、例え
ば１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片を被
験哺乳類からの血清と共に反応させ、次いで関連哺乳類
抗体に対する標識抗体と共に反応させることである。そ
の後呈色反応によってＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連
蛋白質に対する抗体の存在の可否を明らかにすることが
できる。診断検査系のもう１つの例は、本発明に基づい
た１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片を被
験哺乳類の血清と反応させ、その後ウエスタンブロット
分析をすることである。
【００８２】そこで、本発明のもう１つの実施形態は、
試験が本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片を
含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関
連抗原物質に対する抗体の検出のための診断検査に関す
る。
試験が本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片を
含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関
連抗原物質に対する抗体の検出のための診断検査に関す
る。
【００８３】Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原の特
異的１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質の抗原物質の検出に基
づく診断検査であって、それ故Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓ感染の検出に適した診断検査は、例えば標準的サン
ドイッチＥＬＩＳＡ試験でありうる。そのような試験の
一例としては、ＥＬＩＳＡプレート壁が１５ｋＤ又は３
２ｋＤ蛋白質又はその免疫原性断片に対する抗体で被覆
されている。被験物質と共に反応させたあと、標識抗Ｂ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ抗体をウエルに加える。その
後呈色反応によってＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの抗原
物質の存在を明らかにする。
異的１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質の抗原物質の検出に基
づく診断検査であって、それ故Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓ感染の検出に適した診断検査は、例えば標準的サン
ドイッチＥＬＩＳＡ試験でありうる。そのような試験の
一例としては、ＥＬＩＳＡプレート壁が１５ｋＤ又は３
２ｋＤ蛋白質又はその免疫原性断片に対する抗体で被覆
されている。被験物質と共に反応させたあと、標識抗Ｂ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ抗体をウエルに加える。その
後呈色反応によってＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの抗原
物質の存在を明らかにする。
【００８４】それ故、本発明のさらにもう１つの実施形
態は、当該試験が本発明に基づいた蛋白質又はその免疫
原性断片に対する抗体を含むことを特徴とする、Ｂａｂ
ｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原物質の検出のための診断
検査に関する。
態は、当該試験が本発明に基づいた蛋白質又はその免疫
原性断片に対する抗体を含むことを特徴とする、Ｂａｂ
ｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原物質の検出のための診断
検査に関する。
【００８５】上述したようにして発現される本発明に基
づいた蛋白質又はその免疫原性断片を使用して抗体を作
製することができ、かかる抗体はポリクローナル、単一
特異性又はモノクローナル（又はその誘導体）でありう
る。ポリクローナル抗体を所望する場合、ポリクローナ
ル血清を産生し、処理するための手法は周知技術である
（例えばＭａｙｅｒとＷａｌｔｅｒ編集、「細胞及び分
子生物学における免疫化学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。
づいた蛋白質又はその免疫原性断片を使用して抗体を作
製することができ、かかる抗体はポリクローナル、単一
特異性又はモノクローナル（又はその誘導体）でありう
る。ポリクローナル抗体を所望する場合、ポリクローナ
ル血清を産生し、処理するための手法は周知技術である
（例えばＭａｙｅｒとＷａｌｔｅｒ編集、「細胞及び分
子生物学における免疫化学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。
【００８６】本発明に基づいた蛋白質（又はその変異体
又は断片）に対するモノクローナル抗体は、公知技術の
手法により（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５ ４９７，１９７５）、近交系
マウスを免疫することによって調製できる。
又は断片）に対するモノクローナル抗体は、公知技術の
手法により（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５ ４９７，１９７５）、近交系
マウスを免疫することによって調製できる。
【００８７】本発明のさらにもう１つの実施形態は、当
該方法が、血清、組織又は体液を本発明に基づいた１５
ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片に対する抗
体と共に反応することを含む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓからの抗原物質の検出のための方法に関する。
該方法が、血清、組織又は体液を本発明に基づいた１５
ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片に対する抗
体と共に反応することを含む、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓからの抗原物質の検出のための方法に関する。
【００８８】
【実施例】実施例１ ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの分子的特定 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの増殖 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの分離菌（分離菌Ａ及び
Ｂ）をフランスで自然感染したイヌから入手した。それ
らをＳｃｈｅｔｔｅｒｓら（１９９７、Ｐａｒａｓｉｔ
ｏｌｏｇｙ，１１５，４８５−４９３）に従って試験管
内培養で継代した。
Ｂ）をフランスで自然感染したイヌから入手した。それ
らをＳｃｈｅｔｔｅｒｓら（１９９７、Ｐａｒａｓｉｔ
ｏｌｏｇｙ，１１５，４８５−４９３）に従って試験管
内培養で継代した。
【００８９】ｃＤＮＡライブラリーの構築、免疫学的ス
クリーニング及びプラスミドＤＮＡの単離 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）からのｃＤＮ
Ａライブラリーを、Ｃａｒｒｅｔら（１９９９、Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５−１０２
１）がＢ．ｒｏｓｓｉについて述べたようにしてＺＡＰ
Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標） ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃ
ｋ（登録商標） ＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇキッ
ト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて構築した。Ｐｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｐｆ６０多重
遺伝子ファミリーの１つに対するポリクローナル抗体、
抗ＧＳＴ６０．１（抗大腸菌抗体が除去されている）
（Ｃａｒｃｙら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６８：２２１−２３３）を１：１
００の希釈で使用して、Ｃａｒｒｅｔら（１９９９、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５−１０
２１）が述べたようにしてライブラリーをスクリーニン
グした。４−クロロ−１−ナフチルを色素原として使用
して（Ｓｉｇｍａ）、ペルオキシダーゼに複合したヤギ
抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて陽性クローンを
視覚化した。それらを精製し、ＢＣＶＩＲｃＤＮＡを担
うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをＣａｒｒｅｔら（１９９
９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５
−１０２１）が述べたようにして調製した。
クリーニング及びプラスミドＤＮＡの単離 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）からのｃＤＮ
Ａライブラリーを、Ｃａｒｒｅｔら（１９９９、Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５−１０２
１）がＢ．ｒｏｓｓｉについて述べたようにしてＺＡＰ
Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標） ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃ
ｋ（登録商標） ＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇキッ
ト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて構築した。Ｐｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｐｆ６０多重
遺伝子ファミリーの１つに対するポリクローナル抗体、
抗ＧＳＴ６０．１（抗大腸菌抗体が除去されている）
（Ｃａｒｃｙら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６８：２２１−２３３）を１：１
００の希釈で使用して、Ｃａｒｒｅｔら（１９９９、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５−１０
２１）が述べたようにしてライブラリーをスクリーニン
グした。４−クロロ−１−ナフチルを色素原として使用
して（Ｓｉｇｍａ）、ペルオキシダーゼに複合したヤギ
抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて陽性クローンを
視覚化した。それらを精製し、ＢＣＶＩＲｃＤＮＡを担
うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをＣａｒｒｅｔら（１９９
９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５
−１０２１）が述べたようにして調製した。
【００９０】ＤＮＡ配列決定 Ｔ３、Ｔ７万能プライマーと各々の鎖の確立された配列
から誘導したオリゴヌクレオチドを用いて選択したプラ
スミドの両方の鎖に関して、Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓ Ｓ．Ａ．（Ｚｏｎｅ Ａｓｔｅｃ，Ｇｒｅｎｏｂ
ｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によりＳａｎｇｅｒら（１９７
７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４（１２）：５４６３−５４６７）に従ってアルカリ
変性二本鎖鋳型からのジデオキシ法を使用してヌクレオ
チド配列決定を実施した。
から誘導したオリゴヌクレオチドを用いて選択したプラ
スミドの両方の鎖に関して、Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓ Ｓ．Ａ．（Ｚｏｎｅ Ａｓｔｅｃ，Ｇｒｅｎｏｂ
ｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によりＳａｎｇｅｒら（１９７
７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４（１２）：５４６３−５４６７）に従ってアルカリ
変性二本鎖鋳型からのジデオキシ法を使用してヌクレオ
チド配列決定を実施した。
【００９１】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの５’末端のクロー
ニング 完全長ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列を得るために、欠失し
ている５’末端を次のようにして得た：ｃＤＮＡライブ
ラリーを、ベクター配列（ＥｃｏＲＩクローニング部位
の７０ｂｐ上流に位置する）から誘導したＴ３センス万
能プライマー及びＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列（当該ｃＤ
ＮＡの完全な配列においてＥｃｏＲＩクローニング部位
の４７６−４９６下流のヌクレオチド位置、図１及び図
２参照）から誘導したアンチセンスプライマーＰ２
（５’−ＡＴＧＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧ−
３’）を使用するＰＣＲ実験のためのＤＮＡ鋳型として
用いた。ＰＣＲは、ｃＤＮＡライブラリー１μｌ（１０
５ファージ）をＤＮＡ鋳型として用いて、下記に述べる
ように（ＰＣＲ増幅の章）実施した。生じた最大のＰＣ
Ｒ断片を（約５５０ｂｐの大きさ）ゲル抽出スピンカラ
ム（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いてゲル抽出し、ｐＧＥＭ
（登録商標）−ＴベクターシステムＩＩキットを用いて
Ｐｒｏｍｅｇａの推奨する条件下でｐＧＥＭ（登録商
標）−Ｔベクターにクローニングし、Ｔ７及びＳＰ６万
能プライマー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を用い
て下記に述べるように二本の鎖について配列決定した。
ニング 完全長ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列を得るために、欠失し
ている５’末端を次のようにして得た：ｃＤＮＡライブ
ラリーを、ベクター配列（ＥｃｏＲＩクローニング部位
の７０ｂｐ上流に位置する）から誘導したＴ３センス万
能プライマー及びＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列（当該ｃＤ
ＮＡの完全な配列においてＥｃｏＲＩクローニング部位
の４７６−４９６下流のヌクレオチド位置、図１及び図
２参照）から誘導したアンチセンスプライマーＰ２
（５’−ＡＴＧＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧ−
３’）を使用するＰＣＲ実験のためのＤＮＡ鋳型として
用いた。ＰＣＲは、ｃＤＮＡライブラリー１μｌ（１０
５ファージ）をＤＮＡ鋳型として用いて、下記に述べる
ように（ＰＣＲ増幅の章）実施した。生じた最大のＰＣ
Ｒ断片を（約５５０ｂｐの大きさ）ゲル抽出スピンカラ
ム（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いてゲル抽出し、ｐＧＥＭ
（登録商標）−ＴベクターシステムＩＩキットを用いて
Ｐｒｏｍｅｇａの推奨する条件下でｐＧＥＭ（登録商
標）−Ｔベクターにクローニングし、Ｔ７及びＳＰ６万
能プライマー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を用い
て下記に述べるように二本の鎖について配列決定した。
【００９２】ＰＣＲ増幅 ＰＴＣ−１００（商標） Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）において、Ｃａｒｒｅｔら（１
９９９、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．，
４６（３），２９８−３０３）が述べたようにして次の
条件下で増幅を行った：９４℃で３分間、９４℃で１分
間の３０サイクル、５５℃で１分間及び７２℃で１分
間、そしてさらに７２℃で５分間。プライマーＰ１（セ
ンス５’−ＧＡＣＧＴＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＧＧＧ
ＡＡＧＣ−３’）、Ｐ５（センス５’−ＡＧＧＧＡＧＣ
ＴＧＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＴ−３’）、Ｐ２（アンチ
センス）及びＰ１５．２（アンチセンス５’−ＡＡＴＧ
ＡＣＡＴＡＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡＧＣ−３’）はすべて
ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列から誘導したものであり（そ
れぞれの位置は図１に示されている）、この配列の分子
分析に一般的に使用した。
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）において、Ｃａｒｒｅｔら（１
９９９、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．，
４６（３），２９８−３０３）が述べたようにして次の
条件下で増幅を行った：９４℃で３分間、９４℃で１分
間の３０サイクル、５５℃で１分間及び７２℃で１分
間、そしてさらに７２℃で５分間。プライマーＰ１（セ
ンス５’−ＧＡＣＧＴＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＧＧＧ
ＡＡＧＣ−３’）、Ｐ５（センス５’−ＡＧＧＧＡＧＣ
ＴＧＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＴ−３’）、Ｐ２（アンチ
センス）及びＰ１５．２（アンチセンス５’−ＡＡＴＧ
ＡＣＡＴＡＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡＧＣ−３’）はすべて
ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列から誘導したものであり（そ
れぞれの位置は図１に示されている）、この配列の分子
分析に一般的に使用した。
【００９３】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のゲノムＤＮＡ
分析 Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋが述べた標準的手
法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニン
グ：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、
ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）、Ｂａｂｅｓ
ｉａ ｃａｎｉｓ培養からのゲノムＤＮＡ抽出とサザン
ブロット実験を実施した。プローブは、ＢＣＶＩＲ ｃ
ＤＮＡをＤＮＡ鋳型として担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミ
ドを用いてＰ１／Ｐ１５．２又はＰ１／Ｐ２プライマー
の組合せによるＰＣＲを実施して入手し、それらを製造
者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の推奨
する条件下でニックトランスレーションキットを用いて
標識した。またこれらのプローブを、パルスフィールド
ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により０．７％アガロース
（ＩＣＮ）で分離し、ナイロン膜に移したＢ．ｃａｎｉ
ｓの染色体に関しても試験した。
分析 Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋが述べた標準的手
法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニン
グ：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、
ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）、Ｂａｂｅｓ
ｉａ ｃａｎｉｓ培養からのゲノムＤＮＡ抽出とサザン
ブロット実験を実施した。プローブは、ＢＣＶＩＲ ｃ
ＤＮＡをＤＮＡ鋳型として担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミ
ドを用いてＰ１／Ｐ１５．２又はＰ１／Ｐ２プライマー
の組合せによるＰＣＲを実施して入手し、それらを製造
者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の推奨
する条件下でニックトランスレーションキットを用いて
標識した。またこれらのプローブを、パルスフィールド
ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により０．７％アガロース
（ＩＣＮ）で分離し、ナイロン膜に移したＢ．ｃａｎｉ
ｓの染色体に関しても試験した。
【００９４】対照として、同じ膜上でＢ．ｃａｎｉｓ
ＡのＢｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡから誘導したプローブを
ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列から誘導したプローブとハイ
ブリダイズして、ハイブリダイゼーション実験を行っ
た。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈが推奨するように脱ハイブリダイゼーションを実
施した。
ＡのＢｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡから誘導したプローブを
ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列から誘導したプローブとハイ
ブリダイズして、ハイブリダイゼーション実験を行っ
た。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈが推奨するように脱ハイブリダイゼーションを実
施した。
【００９５】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のＲＮＡ分析 Ｐｒｏｍｅｇａに従ってＲＮＡｇｅｎｔｓＲ Ｔｏｔａ
ｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い
て全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ／ＰＣＲ及びノーザンブロッ
ト実験のための出発物質として使用した。
ｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い
て全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ／ＰＣＲ及びノーザンブロッ
ト実験のための出発物質として使用した。
【００９６】ＲＴ−ＰＣＲ。Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｖｉ
ａｎ ＲＴ−ＰＣＲキットの２段階プロトコールを使用
して製造者（Ｓｉｇｍａ）が述べているようにＲＴ−Ｐ
ＣＲを実施した。簡単に述べると、全ＲＮＡ ２５０ｐ
ｇを鋳型として、特異的ｃＤＮＡプライマー（センスＰ
１、センスＰ５（５’−ＡＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧ
ＧＡＡＧＡＴＴ−３’）又はアンチセンスＰ１５．２）
１μＭを使用して４２℃で５０分間第一段階（逆転写）
を実施し、第一段階の反応物の５分の１を鋳型として使
用して、上述したように（ＰＣＲ増幅の章）５０℃のア
ニーリング温度で第二段階を実施した。対照として、Ｄ
ＮＡ汚染について試験した各々のプライマーに関してｅ
ＡＭＶ−ＲＴなしで第一段階を実施し、Ｂ．ｃａｎｉｓ
ＡのＢｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡから誘導した特異的プ
ライマー（センスＢｃｃ１２Ｄ３．１及びアンチセンス
Ｂｃｃ１２Ｄ３．２）に関しても実験を行った。
ａｎ ＲＴ−ＰＣＲキットの２段階プロトコールを使用
して製造者（Ｓｉｇｍａ）が述べているようにＲＴ−Ｐ
ＣＲを実施した。簡単に述べると、全ＲＮＡ ２５０ｐ
ｇを鋳型として、特異的ｃＤＮＡプライマー（センスＰ
１、センスＰ５（５’−ＡＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧ
ＧＡＡＧＡＴＴ−３’）又はアンチセンスＰ１５．２）
１μＭを使用して４２℃で５０分間第一段階（逆転写）
を実施し、第一段階の反応物の５分の１を鋳型として使
用して、上述したように（ＰＣＲ増幅の章）５０℃のア
ニーリング温度で第二段階を実施した。対照として、Ｄ
ＮＡ汚染について試験した各々のプライマーに関してｅ
ＡＭＶ−ＲＴなしで第一段階を実施し、Ｂ．ｃａｎｉｓ
ＡのＢｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡから誘導した特異的プ
ライマー（センスＢｃｃ１２Ｄ３．１及びアンチセンス
Ｂｃｃ１２Ｄ３．２）に関しても実験を行った。
【００９７】ノーザンブロット分析。ノーザンブロット
実験のために、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋが
述べたようにして（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａ
ｌ）、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）、ホル
ムアルデヒドを含むゲルを通して全ＲＮＡを電気泳動
し、ナイロン膜に移した。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列に
関して増幅し、ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ
標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ｄＵＴＰで標
識したＰ１／Ｐ２ ＰＣＲ断片から誘導したプローブで
ハイブリダイゼーションを実施した。ｍＲＮＡを欠く全
ＲＮＡサンプルもハイブリダイゼーション実験のために
使用し、ＰｏｌｙＡ Ｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌ
ａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） ＩＩＩキッ
ト（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｍＲＮＡ除去を行った。
実験のために、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋが
述べたようにして（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａ
ｌ）、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）、ホル
ムアルデヒドを含むゲルを通して全ＲＮＡを電気泳動
し、ナイロン膜に移した。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列に
関して増幅し、ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ
標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ｄＵＴＰで標
識したＰ１／Ｐ２ ＰＣＲ断片から誘導したプローブで
ハイブリダイゼーションを実施した。ｍＲＮＡを欠く全
ＲＮＡサンプルもハイブリダイゼーション実験のために
使用し、ＰｏｌｙＡ Ｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌ
ａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） ＩＩＩキッ
ト（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｍＲＮＡ除去を行った。
【００９８】結果 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの分離と配列 Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＰｆ６０多重遺伝子ファミ
リーの１つに対する抗ＧＳＴ６０．１抗血清（Ｃａｒｃ
ｙら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ．６８：２２１−２３３）を使用したＢ．ｃａ
ｎｉｓ（分離菌Ａ）のｃＤＮＡライブラリーの免疫スク
リーニングによって、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡを分離し、
配列決定した。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの完全なヌクレオ
チド配列は１１３５個のヌクレオチドを含み（ＥｃｏＲ
ＩからＸｈｏＩクローニング制限部位の間）、ポリ
（Ａ）２２テールを有していた（図１Ａ及び図２）。こ
のｃＤＮＡの興味深い特徴は、２つの重複オープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）が推定されることである
（図１Ａ）：ヌクレオチド７５（ＡＴＧ、メチオニンに
ついての開始コドン）と５００（ＴＡＡ、停止コドン）
の間のＯＲＦ１及びヌクレオチド４４８（イソロイシン
についてのＡＴＴコドン）と９３３（ＴＧＡ、停止コド
ン）の間のＯＲＦ２。これら２つのＯＲＦは５２個のヌ
クレオチド（４４８−５００の位置）が重複し、＋１シ
フトしている（図１Ａ）。ＯＲＦ１は、メチオニンから
始まり、１５．７ｋＤａの予想分子量と１０．９の等電
点を持つ１４１個の残基の推定ポリペプチド（Ｂｃｖｉ
ｒ１５と称される）をコードする（図２）。ＯＲＦ２は
コンセンサス翻訳開始配列を含まず、Ｉｌｅによって開
始される（図１Ａ）。１５．２ｋＤａの予想分子量を持
つ１３３個の残基の推定ポリペプチドをコードする。Ｏ
ＲＦ１とＯＲＦ２間の＋１シフトにより、これら２つの
ＯＲＦは重複領域において異なるアミノ酸配列を示す
（図１Ｂ）。ＢＣＶＩＲｃＤＮＡの重複量息の配列分析
は、その領域におけるそのような＋１リボソームフレー
ムシフトが、８５９個のヌクレオチド配列の翻訳から生
じる、２８５個の残基のＯＲＦ１−ＯＲＦ２融合蛋白質
（Ｂｃｖｉｒ３２と称される）を産生したと考えられる
ことを示唆した（図３）。Ｂｃｖｉｒ３２は３２．３ｋ
Ｄａの推定分子量と１０．５の等電点を持つと考えられ
る。
リーの１つに対する抗ＧＳＴ６０．１抗血清（Ｃａｒｃ
ｙら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ．６８：２２１−２３３）を使用したＢ．ｃａ
ｎｉｓ（分離菌Ａ）のｃＤＮＡライブラリーの免疫スク
リーニングによって、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡを分離し、
配列決定した。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの完全なヌクレオ
チド配列は１１３５個のヌクレオチドを含み（ＥｃｏＲ
ＩからＸｈｏＩクローニング制限部位の間）、ポリ
（Ａ）２２テールを有していた（図１Ａ及び図２）。こ
のｃＤＮＡの興味深い特徴は、２つの重複オープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）が推定されることである
（図１Ａ）：ヌクレオチド７５（ＡＴＧ、メチオニンに
ついての開始コドン）と５００（ＴＡＡ、停止コドン）
の間のＯＲＦ１及びヌクレオチド４４８（イソロイシン
についてのＡＴＴコドン）と９３３（ＴＧＡ、停止コド
ン）の間のＯＲＦ２。これら２つのＯＲＦは５２個のヌ
クレオチド（４４８−５００の位置）が重複し、＋１シ
フトしている（図１Ａ）。ＯＲＦ１は、メチオニンから
始まり、１５．７ｋＤａの予想分子量と１０．９の等電
点を持つ１４１個の残基の推定ポリペプチド（Ｂｃｖｉ
ｒ１５と称される）をコードする（図２）。ＯＲＦ２は
コンセンサス翻訳開始配列を含まず、Ｉｌｅによって開
始される（図１Ａ）。１５．２ｋＤａの予想分子量を持
つ１３３個の残基の推定ポリペプチドをコードする。Ｏ
ＲＦ１とＯＲＦ２間の＋１シフトにより、これら２つの
ＯＲＦは重複領域において異なるアミノ酸配列を示す
（図１Ｂ）。ＢＣＶＩＲｃＤＮＡの重複量息の配列分析
は、その領域におけるそのような＋１リボソームフレー
ムシフトが、８５９個のヌクレオチド配列の翻訳から生
じる、２８５個の残基のＯＲＦ１−ＯＲＦ２融合蛋白質
（Ｂｃｖｉｒ３２と称される）を産生したと考えられる
ことを示唆した（図３）。Ｂｃｖｉｒ３２は３２．３ｋ
Ｄａの推定分子量と１０．５の等電点を持つと考えられ
る。
【００９９】ＤＮＡ分析 Ｂ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ及びＢ）のゲノムにおけるＢ
ＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列の存在を、これらの分離菌から
のＤＮＡ（サザンブロット）又は染色体（ＰＦＧＥ）の
両方に関してＰＣＲとハイブリダイゼーション実験によ
って分析した。
ＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列の存在を、これらの分離菌から
のＤＮＡ（サザンブロット）又は染色体（ＰＦＧＥ）の
両方に関してＰＣＲとハイブリダイゼーション実験によ
って分析した。
【０１００】ＰＣＲ実験 これらは、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列からの特異的プラ
イマーの３つの組合せを使用して実施した：ＯＲＦ１を
カバーするＰ１／Ｐ２とＰ５／Ｐ２（それぞれ図４Ａと
４Ｂ）、及びＯＲＦ２及びｃＤＮＡのこれら２つのＯＲ
Ｆ間の重複領域をカバーするＰ５／Ｐ１５．２（図４
Ｃ）。対照として、これらのプライマーの組合せによっ
てｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドが担うｃＤＮＡ ＢＣＶＩ
Ｒ上の約３６０、１６０及び６３０ｂｐのＤＮＡ断片を
増幅し（図４Ａ−Ｃ、レーン５）、非感染イヌから調製
したゲノムＤＮＡに関して陰性であった（図４Ａ−Ｃ、
レーン４）。これらのプライマーの組合せは、Ｂ．ｃａ
ｎｉｓの分離菌Ａ及びＢからのゲノムＤＮＡに関して試
験したときゲノムＤＮＡ断片を増幅できなかった（図
４、それぞれレーン１及び２）のに対し、ＤＮＡ試料に
ついての対照として、Ｂ．ｃａｎｉｓのＢｃｃ１２Ｄ３
ｃＤＮＡから誘導した特異的プライマーは、これらの
試料に関して予想される１２００ｂｐのゲノムＤＮＡ断
片を特異的に増幅することができた（図４Ｄ、それぞれ
レーン１及び２）。さらに、ＢＣＶＩＲｃＤＮＡ配列か
らのプライマーは、Ｂｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡから誘導
したものと同様に、Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆからのゲ
ノムＤＮＡに関するＰＣＲにおいて陰性であった（図
４、レーン３）。
イマーの３つの組合せを使用して実施した：ＯＲＦ１を
カバーするＰ１／Ｐ２とＰ５／Ｐ２（それぞれ図４Ａと
４Ｂ）、及びＯＲＦ２及びｃＤＮＡのこれら２つのＯＲ
Ｆ間の重複領域をカバーするＰ５／Ｐ１５．２（図４
Ｃ）。対照として、これらのプライマーの組合せによっ
てｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドが担うｃＤＮＡ ＢＣＶＩ
Ｒ上の約３６０、１６０及び６３０ｂｐのＤＮＡ断片を
増幅し（図４Ａ−Ｃ、レーン５）、非感染イヌから調製
したゲノムＤＮＡに関して陰性であった（図４Ａ−Ｃ、
レーン４）。これらのプライマーの組合せは、Ｂ．ｃａ
ｎｉｓの分離菌Ａ及びＢからのゲノムＤＮＡに関して試
験したときゲノムＤＮＡ断片を増幅できなかった（図
４、それぞれレーン１及び２）のに対し、ＤＮＡ試料に
ついての対照として、Ｂ．ｃａｎｉｓのＢｃｃ１２Ｄ３
ｃＤＮＡから誘導した特異的プライマーは、これらの
試料に関して予想される１２００ｂｐのゲノムＤＮＡ断
片を特異的に増幅することができた（図４Ｄ、それぞれ
レーン１及び２）。さらに、ＢＣＶＩＲｃＤＮＡ配列か
らのプライマーは、Ｂｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡから誘導
したものと同様に、Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆからのゲ
ノムＤＮＡに関するＰＣＲにおいて陰性であった（図
４、レーン３）。
【０１０１】ハイブリダイゼーション実験 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列からのＰＣＲ断片Ｐ１／Ｐ２
及びＰ５／Ｐ１５．２を用いて合成したプローブとのハ
イブリダイゼーションを、様々な制限酵素によって消化
して（サザンブロット）又は染色体上で（ＰＦＧＥによ
って分離して）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌ＡとＢ及び
Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌ＦのゲノムＤＮＡに関して実施
した。いずれのハイブリダイゼーション実験を実施した
場合も、これらのプローブはＢ．ｃａｎｉｓのゲノムＤ
ＮＡ上のＢＣＶＩＲ配列を検出することができなかった
のに対し、これらのプローブを膜から脱ハイブリダイゼ
ーションした後、Ｂｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡ配列から誘
導したプローブはＢ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡ上のそ
の配列を検出することができた（データは示していな
い）。
及びＰ５／Ｐ１５．２を用いて合成したプローブとのハ
イブリダイゼーションを、様々な制限酵素によって消化
して（サザンブロット）又は染色体上で（ＰＦＧＥによ
って分離して）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌ＡとＢ及び
Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌ＦのゲノムＤＮＡに関して実施
した。いずれのハイブリダイゼーション実験を実施した
場合も、これらのプローブはＢ．ｃａｎｉｓのゲノムＤ
ＮＡ上のＢＣＶＩＲ配列を検出することができなかった
のに対し、これらのプローブを膜から脱ハイブリダイゼ
ーションした後、Ｂｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡ配列から誘
導したプローブはＢ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡ上のそ
の配列を検出することができた（データは示していな
い）。
【０１０２】ＲＮＡ分析 Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａから抽出した全ＲＮＡを使用
して、ＲＴ−ＰＣＲ（図５、Ａ−Ｃ）及びハイブリダイ
ゼーション実験（ノーザンブロット）（図６）によって
ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列の分析を実施した。
して、ＲＴ−ＰＣＲ（図５、Ａ−Ｃ）及びハイブリダイ
ゼーション実験（ノーザンブロット）（図６）によって
ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列の分析を実施した。
【０１０３】ＲＴ−ＰＣＲ実験。ＢＣＶＩＲ配列のＲＴ
−ＰＣＲ分析のため、Ｂｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡ配列の
分析を対照として使用した（図５Ｄ及び５Ｅ）。この対
照に関して予想されたように、Ｂｃｃ１２Ｄ３からの１
２００ｂｐのＤＮＡ断片は、アンチセンスプライマーＢ
ｃｃ２Ｄ３．２で第一の逆転写段階を実施したときには
プライマーＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂｃｃ１２Ｄ３．２の
組合せでのＰＣＲによって増幅されたが（図５Ｅ、レー
ン５）、センスプライマーＢｃｃ１２Ｄ３．１で実施し
たときには増幅されなかった（図５Ｄ、レーン４）。Ｂ
ＣＶＩＲ配列の分析については、予想される６３０ｂｐ
のＤＮＡ断片は、アンチセンスプライマーＰ１５．２で
逆転写の第一段階を実施したときプライマーＰ５／Ｐ１
５．２の組合せでのＰＣＲによって増幅された（図５
Ｃ、レーン３）。しかし意外にも、６３０ｂｐのこのＤ
ＮＡ断片は、センスプライマーＰ５で逆転写の第一段階
を実施したときこのＰ５／Ｐ１５．２プライマーの組合
せでのＰＣＲによっても増幅された（図５Ｂ、レーン
２）。同じように、センスプライマーＰ１で逆転写の第
一段階を実施したときＰ１／Ｐ２プライマーの組合せで
のＰＣＲによって予想外の３６０ｂｐのＤＮＡ断片が増
幅された（図５Ａ、レーン１）。逆転写段階でｅ−ＡＭ
Ｐ逆転写酵素を除いて同じ実験を実施したとき、これら
のプライマーの組合せでのＰＣＲによってＤＮＡ断片を
増幅することはできず（図５、レーン１’−５’）、逆
転写段階でセンスプライマーＰ１又はＰ５を用いて増幅
された３６０及び６３０ｂｐのＤＮＡ断片は、先に認め
られたように（ＤＮＡ分析の章）、ゲノムＤＮＡ由来で
はないことを明らかにした。さらに、それらの配列決定
及び全体的ＢＣＶＩＲ ｃＤＡＮ配列から誘導したプロ
ーブとのハイブリダイゼーション（図５、ＩＩＩ）によ
ってそれらの特異性が確認された。
−ＰＣＲ分析のため、Ｂｃｃ１２Ｄ３ ｃＤＮＡ配列の
分析を対照として使用した（図５Ｄ及び５Ｅ）。この対
照に関して予想されたように、Ｂｃｃ１２Ｄ３からの１
２００ｂｐのＤＮＡ断片は、アンチセンスプライマーＢ
ｃｃ２Ｄ３．２で第一の逆転写段階を実施したときには
プライマーＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂｃｃ１２Ｄ３．２の
組合せでのＰＣＲによって増幅されたが（図５Ｅ、レー
ン５）、センスプライマーＢｃｃ１２Ｄ３．１で実施し
たときには増幅されなかった（図５Ｄ、レーン４）。Ｂ
ＣＶＩＲ配列の分析については、予想される６３０ｂｐ
のＤＮＡ断片は、アンチセンスプライマーＰ１５．２で
逆転写の第一段階を実施したときプライマーＰ５／Ｐ１
５．２の組合せでのＰＣＲによって増幅された（図５
Ｃ、レーン３）。しかし意外にも、６３０ｂｐのこのＤ
ＮＡ断片は、センスプライマーＰ５で逆転写の第一段階
を実施したときこのＰ５／Ｐ１５．２プライマーの組合
せでのＰＣＲによっても増幅された（図５Ｂ、レーン
２）。同じように、センスプライマーＰ１で逆転写の第
一段階を実施したときＰ１／Ｐ２プライマーの組合せで
のＰＣＲによって予想外の３６０ｂｐのＤＮＡ断片が増
幅された（図５Ａ、レーン１）。逆転写段階でｅ−ＡＭ
Ｐ逆転写酵素を除いて同じ実験を実施したとき、これら
のプライマーの組合せでのＰＣＲによってＤＮＡ断片を
増幅することはできず（図５、レーン１’−５’）、逆
転写段階でセンスプライマーＰ１又はＰ５を用いて増幅
された３６０及び６３０ｂｐのＤＮＡ断片は、先に認め
られたように（ＤＮＡ分析の章）、ゲノムＤＮＡ由来で
はないことを明らかにした。さらに、それらの配列決定
及び全体的ＢＣＶＩＲ ｃＤＡＮ配列から誘導したプロ
ーブとのハイブリダイゼーション（図５、ＩＩＩ）によ
ってそれらの特異性が確認された。
【０１０４】ノーザンブロット実験 ＢＣＶＩＲのＯＲＦ１配列に対応するプローブによる
Ｂ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）から抽出した全ＲＮＡへの
ハイブリダイゼーションによって３つの異なるＲＮＡバ
ンドを検出した：約１４００塩基の濃いバンドと約１２
００及び２８００塩基の２つの薄いバンドであった（図
６、レーン２）。開始時には同量の全ＲＮＡを使用し、
ｍＲＮＡを除去してハイブリダイゼーションを実施した
とき、１２００塩基のバンドは消失し（図６、レーン
３）、ｃＤＮＡの大きさと一致して、このＲＮＡバンド
がｍＲＮＡであることを示唆した。またこれは、センス
プライマーで逆転写段階を実施したときＲＴ−ＰＣＲに
よって得られた結果と一致し、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配
列が非メッセンジャーＲＮＡ（１４００及び２８００塩
基の長さのバンド）によって担われることが確認され
た。
Ｂ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）から抽出した全ＲＮＡへの
ハイブリダイゼーションによって３つの異なるＲＮＡバ
ンドを検出した：約１４００塩基の濃いバンドと約１２
００及び２８００塩基の２つの薄いバンドであった（図
６、レーン２）。開始時には同量の全ＲＮＡを使用し、
ｍＲＮＡを除去してハイブリダイゼーションを実施した
とき、１２００塩基のバンドは消失し（図６、レーン
３）、ｃＤＮＡの大きさと一致して、このＲＮＡバンド
がｍＲＮＡであることを示唆した。またこれは、センス
プライマーで逆転写段階を実施したときＲＴ−ＰＣＲに
よって得られた結果と一致し、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配
列が非メッセンジャーＲＮＡ（１４００及び２８００塩
基の長さのバンド）によって担われることが確認され
た。
【０１０５】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列でＢ．ｒｏｓｓ
ｉ（図６、レーン４）又はウシ種であるＢ．ｄｉｖｅｒ
ｇｅｎｓ（図６、レーン１）からの全ＲＮＡにハイブリ
ダイズしたときシグナルは認められなかった。
ｉ（図６、レーン４）又はウシ種であるＢ．ｄｉｖｅｒ
ｇｅｎｓ（図６、レーン１）からの全ＲＮＡにハイブリ
ダイズしたときシグナルは認められなかった。
【０１０６】結論 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列の分子的な特定としては、そ
れがＢ．ｃａｎｉｓゲノムＤＮＡ由来ではないことが示
された。かかる配列が、ｍＲＮＡだけでなく１．４ｋｂ
と３ｋｂの非メッセンジャーＲＮＡによっても担われる
ことを明らかにしている。また、このｃＤＮＡからの配
列はＢ．ｃａｎｉｓのヨーロッパ分離株において特異的
に認められ、Ｂａｂｅｓｉａ ｒｏｓｓｉでは認められ
ないことを明らかになった。
れがＢ．ｃａｎｉｓゲノムＤＮＡ由来ではないことが示
された。かかる配列が、ｍＲＮＡだけでなく１．４ｋｂ
と３ｋｂの非メッセンジャーＲＮＡによっても担われる
ことを明らかにしている。また、このｃＤＮＡからの配
列はＢ．ｃａｎｉｓのヨーロッパ分離株において特異的
に認められ、Ｂａｂｅｓｉａ ｒｏｓｓｉでは認められ
ないことを明らかになった。
【０１０７】実施例２ ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質
の生化学的な特定 大腸菌におけるＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２
組換え蛋白質の発現と精製 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡからのＯＲＦ１とＯＲＦ２によっ
てコードされる産物を組換え蛋白質として発現し、それ
らに対する特異的抗血清を作製するために、２つのＯＲ
Ｆをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
により、インフレームでＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ切断脱リ
ン酸化ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にサブクローニ
ングした。ＯＲＦ１によってコードされるＢｃｖｉｒ１
５蛋白質（ａａＭ１−Ｉ１４１、図２）を産生するた
め、１０４１ｂｐのｃＤＮＡ配列（ＢＣＶＩＲ ｃＤＮ
Ａの５’末端が失われている）を含むＥｃｏＲＩ／Ｘｈ
ｏＩ断片をｐＢＫ−ＣＭＶ組換えプラスミドから切り出
し、ベクターにサブクローニングした。ＯＲＦ２配列か
ら推定されるアミノ酸配列（ａａ配列Ｎ１５４−Ｃ
２８５、図３）、すなわち２つのＯＲＦ間の５２ｂｐの
重複領域（図１におけるヌクレオチド位置４４８−５０
０）を除外したアミノ酸配列に対して特異的な抗血清を
得るため、ＰＣＲ実験によってＯＲＦ２配列内にＥｃｏ
ＲＩ制限部位を設けた。そこで、ｐＢＫ−ＣＭＶプラス
ミドが担う１０４１ｂｐのＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列
を、センスプライマーＰＥＣＯ（５’−ＡＴＧＡＧＧＡ
ＡＴＴＣＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡ−３’；完全なＢＣＶＩ
Ｒ ｃＤＮＡ配列上のヌクレオチド位置５２９−５４９
に位置する、図１及び図２）及びベクター配列から誘導
したアンチセンスＴ７万能プライマー（ＸｈｏＩクロー
ニング部位の７５ｂｐ下流に位置する）によるＰＣＲ実
験のための鋳型ＤＮＡとして使用した。増幅した断片
を、ｐＧＥＭ（登録商標）−ＴベクターＳｙｓｔｅｍ
ＩＩキットを使用してＰｒｏｍｅｇａの推奨条件下でｐ
ＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクターにクローニングした。
ＯＲＦ２からの約６００ｂｐのＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ
／ＸｈｏＩ断片を組換えプラスミドから遊離し、その後
ベクターにサブクローニングした。どちらのクローニン
グについても、大腸菌ＢＬ２１細胞内へのライゲーショ
ン混合物による形質転換を実施し、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮ
Ａ配列からの特異的プライマーでのＰＣＲを用いて陽性
クローンを選択した。
の生化学的な特定 大腸菌におけるＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２
組換え蛋白質の発現と精製 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡからのＯＲＦ１とＯＲＦ２によっ
てコードされる産物を組換え蛋白質として発現し、それ
らに対する特異的抗血清を作製するために、２つのＯＲ
Ｆをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
により、インフレームでＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ切断脱リ
ン酸化ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にサブクローニ
ングした。ＯＲＦ１によってコードされるＢｃｖｉｒ１
５蛋白質（ａａＭ１−Ｉ１４１、図２）を産生するた
め、１０４１ｂｐのｃＤＮＡ配列（ＢＣＶＩＲ ｃＤＮ
Ａの５’末端が失われている）を含むＥｃｏＲＩ／Ｘｈ
ｏＩ断片をｐＢＫ−ＣＭＶ組換えプラスミドから切り出
し、ベクターにサブクローニングした。ＯＲＦ２配列か
ら推定されるアミノ酸配列（ａａ配列Ｎ１５４−Ｃ
２８５、図３）、すなわち２つのＯＲＦ間の５２ｂｐの
重複領域（図１におけるヌクレオチド位置４４８−５０
０）を除外したアミノ酸配列に対して特異的な抗血清を
得るため、ＰＣＲ実験によってＯＲＦ２配列内にＥｃｏ
ＲＩ制限部位を設けた。そこで、ｐＢＫ−ＣＭＶプラス
ミドが担う１０４１ｂｐのＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列
を、センスプライマーＰＥＣＯ（５’−ＡＴＧＡＧＧＡ
ＡＴＴＣＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡ−３’；完全なＢＣＶＩ
Ｒ ｃＤＮＡ配列上のヌクレオチド位置５２９−５４９
に位置する、図１及び図２）及びベクター配列から誘導
したアンチセンスＴ７万能プライマー（ＸｈｏＩクロー
ニング部位の７５ｂｐ下流に位置する）によるＰＣＲ実
験のための鋳型ＤＮＡとして使用した。増幅した断片
を、ｐＧＥＭ（登録商標）−ＴベクターＳｙｓｔｅｍ
ＩＩキットを使用してＰｒｏｍｅｇａの推奨条件下でｐ
ＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクターにクローニングした。
ＯＲＦ２からの約６００ｂｐのＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ
／ＸｈｏＩ断片を組換えプラスミドから遊離し、その後
ベクターにサブクローニングした。どちらのクローニン
グについても、大腸菌ＢＬ２１細胞内へのライゲーショ
ン混合物による形質転換を実施し、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮ
Ａ配列からの特異的プライマーでのＰＣＲを用いて陽性
クローンを選択した。
【０１０８】ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターからの組換えＧ
ＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５蛋白質及び非組換えＧＳＴの発現
と精製をＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８、Ｇｅ
ｎｅ，６７（１）：３１−４０）に従って実施した。し
かし、ＧＳＴ−ＰＲＦ２は封入体内で凝集するため、こ
の標準手法を用いて精製することができなかった。それ
故、ＮａｇａｉとＴｈｏｇｅｒｓｅｎのプロトコール
（１９８７、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」より（Ｒ．ＷｕとＬ．
Ｇｒｏｓｓｍａｎ編集）、１５３、４６１−４８１）に
従って、最初に全細胞抽出物から封入体を分離した。次
にそれらを解離し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した
（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ，１９７４，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｎｄｏｎ），２８７：６８０−６８５）。最後に、組
換えＧＳＴ−ＯＲＦ２をゲルから電気溶出し、下記に述
べるようにウサギを免疫するために使用した。
ＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５蛋白質及び非組換えＧＳＴの発現
と精製をＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８、Ｇｅ
ｎｅ，６７（１）：３１−４０）に従って実施した。し
かし、ＧＳＴ−ＰＲＦ２は封入体内で凝集するため、こ
の標準手法を用いて精製することができなかった。それ
故、ＮａｇａｉとＴｈｏｇｅｒｓｅｎのプロトコール
（１９８７、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」より（Ｒ．ＷｕとＬ．
Ｇｒｏｓｓｍａｎ編集）、１５３、４６１−４８１）に
従って、最初に全細胞抽出物から封入体を分離した。次
にそれらを解離し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した
（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ，１９７４，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｎｄｏｎ），２８７：６８０−６８５）。最後に、組
換えＧＳＴ−ＯＲＦ２をゲルから電気溶出し、下記に述
べるようにウサギを免疫するために使用した。
【０１０９】ＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２蛋
白質に対する抗体の作製 ポリクローナル抗血清。Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎ
ｅ（「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、Ｉ
ＳＢＮ２−９０７５１６−１５−９）に従って、ＧＳＴ
−ＯＲＦ１に対して惹起したポリクローナル抗血清をマ
ウスとウサギにおいて作製し、ＧＳＴ−ＯＲＦ２に対し
て惹起したポリクローナル抗血清をウサギにおいて作製
した。ウサギ（ニュージーランド白色）を、１回目の注
射についてはフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）
（Ｓｉｇｍａ）中に乳化した精製ＧＳＴ組換え蛋白質５
０μｇにより皮下経路で、またその後の２回については
フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）（Ｓｉｇｍ
ａ）を用いて筋肉内注射によって免疫した。Ｂａｌｂ／
Ｃマウスを、１回目の注射についてはＦＣＡ中、またそ
の後の２回についてはＦＩＡ中に乳化したＧＳＴ−ＯＲ
Ｆ１ １５μｇで腹腔内免疫した。動物の注射は３週間
の間隔で実施し、各免疫の８日前に採血を行った。
白質に対する抗体の作製 ポリクローナル抗血清。Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎ
ｅ（「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、Ｉ
ＳＢＮ２−９０７５１６−１５−９）に従って、ＧＳＴ
−ＯＲＦ１に対して惹起したポリクローナル抗血清をマ
ウスとウサギにおいて作製し、ＧＳＴ−ＯＲＦ２に対し
て惹起したポリクローナル抗血清をウサギにおいて作製
した。ウサギ（ニュージーランド白色）を、１回目の注
射についてはフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）
（Ｓｉｇｍａ）中に乳化した精製ＧＳＴ組換え蛋白質５
０μｇにより皮下経路で、またその後の２回については
フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）（Ｓｉｇｍ
ａ）を用いて筋肉内注射によって免疫した。Ｂａｌｂ／
Ｃマウスを、１回目の注射についてはＦＣＡ中、またそ
の後の２回についてはＦＩＡ中に乳化したＧＳＴ−ＯＲ
Ｆ１ １５μｇで腹腔内免疫した。動物の注射は３週間
の間隔で実施し、各免疫の８日前に採血を行った。
【０１１０】モノクローナル抗体の作製とスクリーニン
グ 組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１で免疫したマウスからの脾細胞
をＸ−６３ Ａｇ８−６５３骨髄種と融合する４８時間
前に、ＧＳＴ−ＯＲＦ１ １５μｇの最後の注射を実施
した。モノクローナル抗体を単離するための融合過程と
限界希釈によるクローニングをＢｒｏｗｎら（１９７
９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１：２０
１−２０９）に従って実施した。ハイブリドーマ上清を
下記に述べるような間接免疫蛍光アッセイによってスク
リーニングした。
グ 組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１で免疫したマウスからの脾細胞
をＸ−６３ Ａｇ８−６５３骨髄種と融合する４８時間
前に、ＧＳＴ−ＯＲＦ１ １５μｇの最後の注射を実施
した。モノクローナル抗体を単離するための融合過程と
限界希釈によるクローニングをＢｒｏｗｎら（１９７
９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１：２０
１−２０９）に従って実施した。ハイブリドーマ上清を
下記に述べるような間接免疫蛍光アッセイによってスク
リーニングした。
【０１１１】免疫学的方法 免疫ブロット法 次のようにして調製した精製Ｂ．ｃａｎｉｓメロゾイト
に関して免疫ブロット法を実施した：インビトロ培養か
らの寄生赤血球（２０％の血中寄生虫レベル）を滅菌Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）で十分に洗った。ペレットを３７℃で３０分
間、最終濃度３６Ｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ）からのα−溶血素で溶解し
た。遊離メロゾイトと残りの非溶解細胞を遠心分離（３
５００ｇ、３０分間）によってペレット化し、上清を廃
棄した。ペレットをＴＢＳで１回洗い、ＴＢＳ ２ｍｌ
に懸濁して、１．０９密度の低層と１．０２密度の上層
によって形成したサッカロース勾配での遠心分離（３５
００ｇ、３０分間）によってメロゾイトを精製した。遊
離メロゾイトを界面で採集し、それらを遠心分離（１５
０００ｇ、１０分間）によってペレット化し、ＴＢＳで
３回洗った。次に電気泳動用に処理して、１５％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ上で蛋白質を分離した。ＧＳＴ−ＯＲＦ１及
びＧＳＴ−ＯＲＦ２蛋白質に対するポリクローナル抗血
清について１：１００希釈を用いて、Ｃａｒｃｙら（１
９９１、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７２，９３−１０２）が
Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓに関して述べたようにして免疫
ブロット法を実施した。
に関して免疫ブロット法を実施した：インビトロ培養か
らの寄生赤血球（２０％の血中寄生虫レベル）を滅菌Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）で十分に洗った。ペレットを３７℃で３０分
間、最終濃度３６Ｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ）からのα−溶血素で溶解し
た。遊離メロゾイトと残りの非溶解細胞を遠心分離（３
５００ｇ、３０分間）によってペレット化し、上清を廃
棄した。ペレットをＴＢＳで１回洗い、ＴＢＳ ２ｍｌ
に懸濁して、１．０９密度の低層と１．０２密度の上層
によって形成したサッカロース勾配での遠心分離（３５
００ｇ、３０分間）によってメロゾイトを精製した。遊
離メロゾイトを界面で採集し、それらを遠心分離（１５
０００ｇ、１０分間）によってペレット化し、ＴＢＳで
３回洗った。次に電気泳動用に処理して、１５％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ上で蛋白質を分離した。ＧＳＴ−ＯＲＦ１及
びＧＳＴ−ＯＲＦ２蛋白質に対するポリクローナル抗血
清について１：１００希釈を用いて、Ｃａｒｃｙら（１
９９１、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７２，９３−１０２）が
Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓに関して述べたようにして免疫
ブロット法を実施した。
【０１１２】感染免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ） ＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２蛋白質に対する
ポリクローナル抗血清について１：２００希釈を用い
て、Ｇｒｅｌｌｉｅｒら（１９９４、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ，８２，１２９−１３８）がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍに関して述べたようにしてＢ．ｃａｎｉｓ寄生赤血球
（５％の血清寄生虫レベル）に関してＩＦＡ及び二重Ｉ
ＦＡを実施した。二重ＩＦＡについては、スライドガラ
スを最初は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギ抗血清と共に、次
いでＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するマウスポリクローナル又
はモノクローナル抗体と共にインキュベートした。制限
吸光蛍光のためにスライドガラスをＣｉｔｉｆｌｕｏｒ
溶液（ＣｉｔｉｆｌｕｏｒＬｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ
Ｋ）で封入し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ，Ｚｅ
ｉｓｓ）を用いて蛍光を検出した。
ポリクローナル抗血清について１：２００希釈を用い
て、Ｇｒｅｌｌｉｅｒら（１９９４、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ，８２，１２９−１３８）がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍに関して述べたようにしてＢ．ｃａｎｉｓ寄生赤血球
（５％の血清寄生虫レベル）に関してＩＦＡ及び二重Ｉ
ＦＡを実施した。二重ＩＦＡについては、スライドガラ
スを最初は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギ抗血清と共に、次
いでＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するマウスポリクローナル又
はモノクローナル抗体と共にインキュベートした。制限
吸光蛍光のためにスライドガラスをＣｉｔｉｆｌｕｏｒ
溶液（ＣｉｔｉｆｌｕｏｒＬｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ
Ｋ）で封入し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ，Ｚｅ
ｉｓｓ）を用いて蛍光を検出した。
【０１１３】Ｂ．ｃａｎｉｓ培養の［３５Ｓ］−メチオ
ニン放射標識と免疫沈降法。
ニン放射標識と免疫沈降法。
【０１１４】５０μＣｉ／ｍｌ（１２００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）及び５％の出発血中寄生虫レベルでのＢ．ｃａ
ｎｉｓのインビトロ培養の［３５Ｓ］−メチオニン放射
標識、及び免疫沈降アッセイを、Ｃａｒｃｙら（１９９
１、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７２，９３−１０２）がＢ．
ｄｉｖｅｒｇｅｎｓについて述べたようにして実施し
た。
ｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）及び５％の出発血中寄生虫レベルでのＢ．ｃａ
ｎｉｓのインビトロ培養の［３５Ｓ］−メチオニン放射
標識、及び免疫沈降アッセイを、Ｃａｒｃｙら（１９９
１、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７２，９３−１０２）がＢ．
ｄｉｖｅｒｇｅｎｓについて述べたようにして実施し
た。
【０１１５】ＴＸ−１１４処理による蛋白質相分離 Ｂ．ｃａｎｉｓの蛋白質を、［３５Ｓ］−メチオニン放
射標識寄生赤血球（２０％の血中寄生虫レベル）２００
μｌを出発物質として使用して、Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔら
（１９９１、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９（８）
２７９９−２８０５）がＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓについ
て述べたようにしてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（Ｓｉｇ
ｍａ）で相分離した。
射標識寄生赤血球（２０％の血中寄生虫レベル）２００
μｌを出発物質として使用して、Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔら
（１９９１、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９（８）
２７９９−２８０５）がＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓについ
て述べたようにしてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（Ｓｉｇ
ｍａ）で相分離した。
【０１１６】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のインビトロ翻
訳 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡのフレームシフト誘導能をインビ
トロ翻訳系において検討した。インビトロ翻訳のために
その５’末端にＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列全体、コザッ
ク配列及びＴ７プロモーター配列を含むＰＣＲ ＤＮＡ
断片に関して、ＴＮＴ（登録商標） Ｑｕｉｃｋ Ｃｏ
ｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
てインビトロ翻訳産物を合成した。そのようなｄｎａ断
片を増幅するために、次の２つのプライマーを使用して
不完全な１０４１ｂｐのＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡをＤＮＡ
鋳型として担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドに関してＰＣ
Ｒを実施した：コザック配列とＴ７プロモーター配列だ
けでなく、ＯＲＦ１の開始ＡＴＧコドンを含む全体的Ｂ
ＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列の失われた５’末端（プライマ
ー配列の太字部分；完全なｃＤＮＡ配列のヌクレオチド
位置７５−１３０；図１及び図２参照）も含む、９０ｍ
ｅｒのセンスオリゴヌクレオチド（プライマーＰ０：
５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ
ＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴ
ＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡ
ＡＣＣＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧ−３’）、及びＢＣ
ＶＩＲ ｃＤＮＡ配列からのアンチセンスプライマーＰ
１５．２。環状組換えｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド１００
ｎｇを使用してＰＣＲを次の増幅条件を用いて行った：
９４℃で３分間の１サイクル；９４℃で１分間、３７℃
で１分間及び７２℃で１分間の５サイクル；９４℃で１
分間、５０℃で１分間及び７２℃で１分間の２５サイク
ル。純度を確保するためにＰＣＲ産物を２回ゲル抽出
し、ヌクレアーゼ非含有水に１００ｎｇ／μｌの濃度で
懸濁した。次にそれらを、ＴＮＴＲ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏ
ｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを製造者（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）が述べているように使用して、翻訳する網状赤血球
溶解産物に加えた。対照として、反応物からＰＣＲ断片
を除いて同じ実験を実施した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１又は
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２又は抗ＧＳＴ抗血清及び免疫前ウサ
ギ血清に関する総放射標識翻訳産物（５μｌの反応物）
及び免疫沈降産物（２０μｌの反応物から）を１５％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
訳 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡのフレームシフト誘導能をインビ
トロ翻訳系において検討した。インビトロ翻訳のために
その５’末端にＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列全体、コザッ
ク配列及びＴ７プロモーター配列を含むＰＣＲ ＤＮＡ
断片に関して、ＴＮＴ（登録商標） Ｑｕｉｃｋ Ｃｏ
ｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
てインビトロ翻訳産物を合成した。そのようなｄｎａ断
片を増幅するために、次の２つのプライマーを使用して
不完全な１０４１ｂｐのＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡをＤＮＡ
鋳型として担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドに関してＰＣ
Ｒを実施した：コザック配列とＴ７プロモーター配列だ
けでなく、ＯＲＦ１の開始ＡＴＧコドンを含む全体的Ｂ
ＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列の失われた５’末端（プライマ
ー配列の太字部分；完全なｃＤＮＡ配列のヌクレオチド
位置７５−１３０；図１及び図２参照）も含む、９０ｍ
ｅｒのセンスオリゴヌクレオチド（プライマーＰ０：
５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ
ＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴ
ＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡ
ＡＣＣＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧ−３’）、及びＢＣ
ＶＩＲ ｃＤＮＡ配列からのアンチセンスプライマーＰ
１５．２。環状組換えｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド１００
ｎｇを使用してＰＣＲを次の増幅条件を用いて行った：
９４℃で３分間の１サイクル；９４℃で１分間、３７℃
で１分間及び７２℃で１分間の５サイクル；９４℃で１
分間、５０℃で１分間及び７２℃で１分間の２５サイク
ル。純度を確保するためにＰＣＲ産物を２回ゲル抽出
し、ヌクレアーゼ非含有水に１００ｎｇ／μｌの濃度で
懸濁した。次にそれらを、ＴＮＴＲ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏ
ｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを製造者（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）が述べているように使用して、翻訳する網状赤血球
溶解産物に加えた。対照として、反応物からＰＣＲ断片
を除いて同じ実験を実施した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１又は
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２又は抗ＧＳＴ抗血清及び免疫前ウサ
ギ血清に関する総放射標識翻訳産物（５μｌの反応物）
及び免疫沈降産物（２０μｌの反応物から）を１５％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【０１１７】結果 ＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２の精製。ＯＲＦ
１又はＯＲＦ２によってコードされるポリペプチドに対
して特異的なポリクローナル抗体を作製するために、Ｏ
ＲＦ１の１４１残基（１Ｍ−１４１Ｉ）（７５ＡＴＧか
ら停止コドンＴＡＡ５００までをコードする）（図２）
及びＯＲＦ２の１３２残基（１５４Ｎ− ２８５Ｃ）（ヌ
クレオチド位置５３３ＡＴＴから停止コドンＴＧＡ
９３３までをコードする）（図３）を、ＧＳＴ配列とイ
ンフレームでｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターにクローニング
した。ＢＬ２１大腸菌株においてＧＳＴ−ＯＲＦ１とＧ
ＳＴ−ＯＲＦ２の過剰発現を実施した（図７）。発現試
験によって、ＩＰＴＧ誘導後、組換えｐＧＥＸ−４Ｔ３
−ＯＲＦ１を含む大腸菌培養によって、超音波破砕した
細菌の溶解物中にＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質が可溶性蛋白
質として発現されたことが明らかになった（図７Ａ、レ
ーン１）。溶出後、可溶性ＧＳＴ−ＯＲＦ１を精製した
が、これはの予想分子量として４０ｋＤａを示した（図
７Ａ、レーン２）。これに対し、ＧＳＴ−ＯＲＦ２は、
組換えｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＯＲＦ２を含む大腸菌培養に
おいて不溶性であり、３９ｋＤａの分子量を持つ組換え
蛋白質が主として封入体中に認められた（図７Ｂ、レー
ン５）。精製ＧＳＴ−ＯＲＦ２でウサギを免疫するた
め、１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離した精製封入体抽出
物からゲルで切り出した（図７Ｂ、レーン４）。
１又はＯＲＦ２によってコードされるポリペプチドに対
して特異的なポリクローナル抗体を作製するために、Ｏ
ＲＦ１の１４１残基（１Ｍ−１４１Ｉ）（７５ＡＴＧか
ら停止コドンＴＡＡ５００までをコードする）（図２）
及びＯＲＦ２の１３２残基（１５４Ｎ− ２８５Ｃ）（ヌ
クレオチド位置５３３ＡＴＴから停止コドンＴＧＡ
９３３までをコードする）（図３）を、ＧＳＴ配列とイ
ンフレームでｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターにクローニング
した。ＢＬ２１大腸菌株においてＧＳＴ−ＯＲＦ１とＧ
ＳＴ−ＯＲＦ２の過剰発現を実施した（図７）。発現試
験によって、ＩＰＴＧ誘導後、組換えｐＧＥＸ−４Ｔ３
−ＯＲＦ１を含む大腸菌培養によって、超音波破砕した
細菌の溶解物中にＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質が可溶性蛋白
質として発現されたことが明らかになった（図７Ａ、レ
ーン１）。溶出後、可溶性ＧＳＴ−ＯＲＦ１を精製した
が、これはの予想分子量として４０ｋＤａを示した（図
７Ａ、レーン２）。これに対し、ＧＳＴ−ＯＲＦ２は、
組換えｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＯＲＦ２を含む大腸菌培養に
おいて不溶性であり、３９ｋＤａの分子量を持つ組換え
蛋白質が主として封入体中に認められた（図７Ｂ、レー
ン５）。精製ＧＳＴ−ＯＲＦ２でウサギを免疫するた
め、１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離した精製封入体抽出
物からゲルで切り出した（図７Ｂ、レーン４）。
【０１１８】対照として、天然ｐＧＥＸ ４Ｔ３を含む
大腸菌培養のＩＰＴＧ誘導後にＧＳＴを精製した（図７
Ｂ、レーン３）。
大腸菌培養のＩＰＴＧ誘導後にＧＳＴを精製した（図７
Ｂ、レーン３）。
【０１１９】免疫学的試験 ｃＤＮＡがコードするポリペプチドの免疫学的試験を実
施するため、マウスとウサギを免疫することにより、Ｇ
ＳＴ−ＯＲＦ１又はＧＳＴ−ＯＲＦ２又はＧＳＴに対す
るポリクローナル抗血清を作製した。ＧＳＴ−ＯＲＦ１
に対する２つのモノクローナル抗体も試験した。
施するため、マウスとウサギを免疫することにより、Ｇ
ＳＴ−ＯＲＦ１又はＧＳＴ−ＯＲＦ２又はＧＳＴに対す
るポリクローナル抗血清を作製した。ＧＳＴ−ＯＲＦ１
に対する２つのモノクローナル抗体も試験した。
【０１２０】免疫沈降実験 最初の実験では、Ｂ．ｃａｎｉｓ培養（分離菌Ａ）の全
培養（図８Ａ）及び外部抗原（図８Ｂ）放射標識分画に
関して実験を行った。全抗原分画においては、抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１は１５ｋＤａの主要産物（Ｂｃｖｉｒ１５、
星印で示す）及び約３２ｋＤａの少量産物（推定Ｂｃｖ
ｉｒ３２、矢印で示す）を強く認識する（図８Ａ、レー
ン３）。外部抗原分画では、約３２ｋＤａの少量産物だ
けがかすかに検出された（図８Ｂ、レーン３）。抗ＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ２は、全及び外部抗原分画上の３２ｋＤａ蛋
白質に対して反応がないことが認められた（図８、レー
ン４）。免疫前ウサギ及び抗ＧＳＴ抗血清は、抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１抗血清で認識される抗原に反応がなかった
（図８、それぞれレーン１及び２）。２番目の実験で
は、ＴＸ−１１４処理後に得られたＢ．ｃａｎｉｓ（分
離菌Ａ）抗原の親水性及び疎水性分画を、抗ＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ１との免疫沈降法によって分析した（図９）。親水
性分画において１５ｋＤａ蛋白質が検出され（図９Ａ、
レーン２、星印で示す）、疎水性分画では反応が認めら
れなかった（図９Ｂ、レーン２）。対照として、免疫前
ウサギ血清に関して免疫沈降法を実施したとき、１５ｋ
Ｄａ蛋白質に対する反応性は認められなかった（図９、
レーン１）。ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するＭＡｂは免疫沈
降実験において反応性を示さなかった。
培養（図８Ａ）及び外部抗原（図８Ｂ）放射標識分画に
関して実験を行った。全抗原分画においては、抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１は１５ｋＤａの主要産物（Ｂｃｖｉｒ１５、
星印で示す）及び約３２ｋＤａの少量産物（推定Ｂｃｖ
ｉｒ３２、矢印で示す）を強く認識する（図８Ａ、レー
ン３）。外部抗原分画では、約３２ｋＤａの少量産物だ
けがかすかに検出された（図８Ｂ、レーン３）。抗ＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ２は、全及び外部抗原分画上の３２ｋＤａ蛋
白質に対して反応がないことが認められた（図８、レー
ン４）。免疫前ウサギ及び抗ＧＳＴ抗血清は、抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１抗血清で認識される抗原に反応がなかった
（図８、それぞれレーン１及び２）。２番目の実験で
は、ＴＸ−１１４処理後に得られたＢ．ｃａｎｉｓ（分
離菌Ａ）抗原の親水性及び疎水性分画を、抗ＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ１との免疫沈降法によって分析した（図９）。親水
性分画において１５ｋＤａ蛋白質が検出され（図９Ａ、
レーン２、星印で示す）、疎水性分画では反応が認めら
れなかった（図９Ｂ、レーン２）。対照として、免疫前
ウサギ血清に関して免疫沈降法を実施したとき、１５ｋ
Ｄａ蛋白質に対する反応性は認められなかった（図９、
レーン１）。ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するＭＡｂは免疫沈
降実験において反応性を示さなかった。
【０１２１】ウエスタンブロット法 Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａからの精製メロゾイトに関し
てウエスタンブロット法を実施した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ
１は１５ｋＤａ蛋白質を特異的に認識したが（図１０
Ａ、レーン２、星印で示す）、免疫沈降実験と異なっ
て、少量の３２ｋＤａ産物は認識しなかった。しかし、
ウエスタンブロット実験において種々の蛋白質を認識し
た抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２は、そのような３２ｋＤａ抗原を
検出することができた（図１０Ｂ、レーン２、矢印で示
す）。約１５ｋＤａの蛋白質（ＯＲＦ２の予想１５．２
ｋＤａポリペプチドに対応すると考えられる）は抗ＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ２によって認識されなかった。対照として、
各々の抗血清からの免疫前ウサギ血清はウエスタンブロ
ット法において反応性ではなかった（図１０、レーン
１）。ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するＭＡｂはウエスタンブ
ロット法において反応性ではなかった。
てウエスタンブロット法を実施した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ
１は１５ｋＤａ蛋白質を特異的に認識したが（図１０
Ａ、レーン２、星印で示す）、免疫沈降実験と異なっ
て、少量の３２ｋＤａ産物は認識しなかった。しかし、
ウエスタンブロット実験において種々の蛋白質を認識し
た抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２は、そのような３２ｋＤａ抗原を
検出することができた（図１０Ｂ、レーン２、矢印で示
す）。約１５ｋＤａの蛋白質（ＯＲＦ２の予想１５．２
ｋＤａポリペプチドに対応すると考えられる）は抗ＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ２によって認識されなかった。対照として、
各々の抗血清からの免疫前ウサギ血清はウエスタンブロ
ット法において反応性ではなかった（図１０、レーン
１）。ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するＭＡｂはウエスタンブ
ロット法において反応性ではなかった。
【０１２２】免疫蛍光アッセイ 抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２を用いて
Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａのインビトロ培養からの固定
血液スメアに関するＩＦＡ試験を実施した（図１１）。
ポリクローナルウサギ抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で得られた蛍
光は、多数の寄生生物内小胞に結びついており、寄生生
物の核を除いて寄生生物の細胞質全体に分散していた
（図１１、写真Ａ）。同じパターンの蛍光がＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ１に対するｍＡｂでも認められた。さらに、ＧＳＴ
−ＯＲＦ１に対するｍＡｂ及びポリクローナルウサギ抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２に関して実施した二重ＩＦＡは、抗Ｇ
ＳＴ−ＯＲＦ２によって認識される抗原は（図１１、写
真Ｂ）、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって認識される抗原と
同時に局在することを示唆した。対照として、抗ＧＳＴ
及び免疫前ウサギ抗血清はＩＦＡ試験において反応性で
はなかった。Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ｂからの感染赤血
球に関してＩＦＡ試験を実施したとき、同じプロフィー
ルの蛍光が認められた（データは示していない）。
Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａのインビトロ培養からの固定
血液スメアに関するＩＦＡ試験を実施した（図１１）。
ポリクローナルウサギ抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で得られた蛍
光は、多数の寄生生物内小胞に結びついており、寄生生
物の核を除いて寄生生物の細胞質全体に分散していた
（図１１、写真Ａ）。同じパターンの蛍光がＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ１に対するｍＡｂでも認められた。さらに、ＧＳＴ
−ＯＲＦ１に対するｍＡｂ及びポリクローナルウサギ抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２に関して実施した二重ＩＦＡは、抗Ｇ
ＳＴ−ＯＲＦ２によって認識される抗原は（図１１、写
真Ｂ）、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって認識される抗原と
同時に局在することを示唆した。対照として、抗ＧＳＴ
及び免疫前ウサギ抗血清はＩＦＡ試験において反応性で
はなかった。Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ｂからの感染赤血
球に関してＩＦＡ試験を実施したとき、同じプロフィー
ルの蛍光が認められた（データは示していない）。
【０１２３】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡのインビトロ翻訳 免疫沈降実験によって発現産物を分析するために、網状
赤血球溶解産物においてＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ全配列の
インビトロ翻訳を実施した（図１２、レーン３−４）。
総発現産物の分析は、ｃＤＮＡを用いて実験を行ったと
きには主要な１５ｋＤａ蛋白質が発現されるが（図１
２、レーン４；星印で示す）、対照としてｃＤＮＡを除
いて実験を行ったときには発現されない（図１２、レー
ン１）ことを明らかにした。この主要１５ｋＤａ蛋白質
は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって特異的に免疫沈降する
が、約３２ｋＤａの少量蛋白質も同様であった（図１
２、レーン３；矢印で示す）。対照として、免疫前ウサ
ギ血清及び抗ＧＳＴ抗血清はこれらの産物に関して反応
性ではなかった（データは示していない）。それ故、そ
のような少量の３２ｋＤａ産物が予想された＋１フレー
ムシフト機序から生じたと考えられることを示唆してい
る。先に述べた免疫沈降アッセイの場合と同じように、
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２はこの少量産物に対して反応性では
なかった（データは示していない）。
赤血球溶解産物においてＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ全配列の
インビトロ翻訳を実施した（図１２、レーン３−４）。
総発現産物の分析は、ｃＤＮＡを用いて実験を行ったと
きには主要な１５ｋＤａ蛋白質が発現されるが（図１
２、レーン４；星印で示す）、対照としてｃＤＮＡを除
いて実験を行ったときには発現されない（図１２、レー
ン１）ことを明らかにした。この主要１５ｋＤａ蛋白質
は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって特異的に免疫沈降する
が、約３２ｋＤａの少量蛋白質も同様であった（図１
２、レーン３；矢印で示す）。対照として、免疫前ウサ
ギ血清及び抗ＧＳＴ抗血清はこれらの産物に関して反応
性ではなかった（データは示していない）。それ故、そ
のような少量の３２ｋＤａ産物が予想された＋１フレー
ムシフト機序から生じたと考えられることを示唆してい
る。先に述べた免疫沈降アッセイの場合と同じように、
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２はこの少量産物に対して反応性では
なかった（データは示していない）。
【０１２４】結論 抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清は、１５ｋＤａの親水性主要
蛋白質と３２ｋＤａの少量蛋白質の２つの蛋白質を検出
することができ、後者はＢ．ｃａｎｉｓのインビトロ培
養の上清中で検出される。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清も
３２ｋＤａ蛋白質を検出することができるが、１５ｋＤ
ａ産物は検出することができなかった。これは、ＢＣＶ
ＩＲ ｃＤＮＡのＯＲＦ１が１５ｋＤａ蛋白質（予想１
５．７ｋＤａ産物、Ｂｃｖｉｒ１５と称する）をコード
すること、そしてＯＲＦ２が予想１５．２ｋＤａ産物を
合成できないことを示している。さらに、抗ＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ１と抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清によって共通して認
識された３２ｋＤａ蛋白質の検出は、それが＋１フレー
ムシフト機序から生じ、融合ＯＲＦ１−ＯＲＦ２蛋白質
（Ｂｃｖｉｒ３２と称する）を産生することができる予
想３２．３ｋＤａ産物に対応するであろうことを示唆す
る。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のインビトロ翻訳は、そ
のような機序がｃＤＮＡ配列内で起こりうることを示し
た。Ｂｃｖｉｒ１５蛋白質の高い発現レベルと比較し
て、３２ｋＤａ蛋白質の低いレベルの発現はそのような
機序と一致する。さらに、寄生生物内小胞における、２
つの抗血清によって認識される蛋白質の同時局在は、２
つの抗血清によって認識される３２ｋＤａ蛋白質が同じ
ものであることを示唆しており、そのようなフレームシ
フト機序と合致する。
蛋白質と３２ｋＤａの少量蛋白質の２つの蛋白質を検出
することができ、後者はＢ．ｃａｎｉｓのインビトロ培
養の上清中で検出される。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清も
３２ｋＤａ蛋白質を検出することができるが、１５ｋＤ
ａ産物は検出することができなかった。これは、ＢＣＶ
ＩＲ ｃＤＮＡのＯＲＦ１が１５ｋＤａ蛋白質（予想１
５．７ｋＤａ産物、Ｂｃｖｉｒ１５と称する）をコード
すること、そしてＯＲＦ２が予想１５．２ｋＤａ産物を
合成できないことを示している。さらに、抗ＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ１と抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清によって共通して認
識された３２ｋＤａ蛋白質の検出は、それが＋１フレー
ムシフト機序から生じ、融合ＯＲＦ１−ＯＲＦ２蛋白質
（Ｂｃｖｉｒ３２と称する）を産生することができる予
想３２．３ｋＤａ産物に対応するであろうことを示唆す
る。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のインビトロ翻訳は、そ
のような機序がｃＤＮＡ配列内で起こりうることを示し
た。Ｂｃｖｉｒ１５蛋白質の高い発現レベルと比較し
て、３２ｋＤａ蛋白質の低いレベルの発現はそのような
機序と一致する。さらに、寄生生物内小胞における、２
つの抗血清によって認識される蛋白質の同時局在は、２
つの抗血清によって認識される３２ｋＤａ蛋白質が同じ
ものであることを示唆しており、そのようなフレームシ
フト機序と合致する。
【０１２５】実施例３ Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ増殖阻害試験 抗血清による阻害試験 実験の前に、２％ヘマトクリットで血中寄生虫レベルを
１％に調整した（Ｄ０日）。Ｂ．ｃａｎｉｓ寄生生物を
（「Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖」の中で先に述べた条件下
で）、２４穴プレートで実施した実験については１ｍｌ
又は６穴プレートで実施した実験については２ｍｌでイ
ンビトロ培養した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１と抗ＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ２抗血清の試験管内でのＢ．ｃａｎｉｓ増殖阻害能
を、各々の抗血清を種々の濃度で（１〜８％）培地に加
えて測定した。対照は次のとおりであった：ｉ）同じ濃
度のウサギ免疫前血清又はウサギ抗ＧＳＴ血清又は関連
性のないウサギ抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３血清との反
応；ｉｉ）無処置でのＢ．ｃａｎｉｓインビトロ培養。
１％に調整した（Ｄ０日）。Ｂ．ｃａｎｉｓ寄生生物を
（「Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖」の中で先に述べた条件下
で）、２４穴プレートで実施した実験については１ｍｌ
又は６穴プレートで実施した実験については２ｍｌでイ
ンビトロ培養した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１と抗ＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ２抗血清の試験管内でのＢ．ｃａｎｉｓ増殖阻害能
を、各々の抗血清を種々の濃度で（１〜８％）培地に加
えて測定した。対照は次のとおりであった：ｉ）同じ濃
度のウサギ免疫前血清又はウサギ抗ＧＳＴ血清又は関連
性のないウサギ抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３血清との反
応；ｉｉ）無処置でのＢ．ｃａｎｉｓインビトロ培養。
【０１２６】各濃度での抗血清のＢ．ｃａｎｉｓ（分離
菌Ａ及びＢ）試験管内増殖阻害能を、反応時間をそれぞ
れ約３及び６周期のＢ．ｃａｎｉｓ生活環に相当する２
４時間（Ｄ１日）と４８時間（Ｄ２日）にした後、ギー
ムザ染色したスメアについての血中寄生虫レベルによっ
て、又は水溶液中５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ヒポキ
サンチン（ＩＣＮ）での代謝標識によって測定し、３点
検討した。Ｄ１後、ウエル容量の半量を採取し、培地を
完全に除去して、Ｄ０に使用したのと同じ濃度で抗血清
（及び標識実験については［３Ｈ］−ヒポキサンチン）
を補足した新鮮培地と交換した。採集した感染赤血球
（２４穴と６穴プレートでそれぞれ５及び２０μｌ）を
１８００ｇで５分間遠心分離してペレット化し、ＴＢＳ
中で５回洗った。放射能の取込みを測定するため、それ
らをＲＩＰＡ緩衝液５００μｌに溶解し、１時間氷上に
置いた。溶解産物を１５０００ｇで遠心分離し（１５分
間、４℃）、次に上清２μｌをＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒ−
Ｓａｆｅ（Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）に加えて、取込ま
れた放射能を測定した。
菌Ａ及びＢ）試験管内増殖阻害能を、反応時間をそれぞ
れ約３及び６周期のＢ．ｃａｎｉｓ生活環に相当する２
４時間（Ｄ１日）と４８時間（Ｄ２日）にした後、ギー
ムザ染色したスメアについての血中寄生虫レベルによっ
て、又は水溶液中５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ヒポキ
サンチン（ＩＣＮ）での代謝標識によって測定し、３点
検討した。Ｄ１後、ウエル容量の半量を採取し、培地を
完全に除去して、Ｄ０に使用したのと同じ濃度で抗血清
（及び標識実験については［３Ｈ］−ヒポキサンチン）
を補足した新鮮培地と交換した。採集した感染赤血球
（２４穴と６穴プレートでそれぞれ５及び２０μｌ）を
１８００ｇで５分間遠心分離してペレット化し、ＴＢＳ
中で５回洗った。放射能の取込みを測定するため、それ
らをＲＩＰＡ緩衝液５００μｌに溶解し、１時間氷上に
置いた。溶解産物を１５０００ｇで遠心分離し（１５分
間、４℃）、次に上清２μｌをＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒ−
Ｓａｆｅ（Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）に加えて、取込ま
れた放射能を測定した。
【０１２７】精製免疫グロブリンによる試験管内阻害ア
ッセイ 各々の実験の前に、２％ヘマトクリットで血中寄生虫レ
ベルを１％に調整した（Ｄ０日）。Ｂ．ｃａｎｉｓ及び
Ｂ．ｒｏｓｓｉ寄生生物を９６穴プレートにおいて培地
１００μｌ中でインビトロ培養した。阻害アッセイに使
用する抗血清（抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５、抗ＧＳＴ−
Ｂｃｖｉｒ１５免疫前、抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３、抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清及び抗ＧＳＴ（図１７ではそれ
ぞれＢｃｖｉｒ１５、Ｔ０、ＣＯＮＴ、ｏｒｆ２、ＧＳ
Ｔとして示す））を最初にＨＩＴｒａｐ（商標） Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのＦＰＬＣによって精製
した。次に精製免疫グロブリンをＰＢＳ １Ｘ緩衝液に
対して４℃で一晩透析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ
ＳＡ）を用いて総免疫グロブリンを滴定した。ＥＬＩＳ
Ａを使用して、天然ＧＳＴ蛋白質又はＧＳＴに融合した
各々の組換え蛋白質に対する免疫グロブリンの比率を、
非組換えＧＳＴ ０．１μｇ又はウエルに被覆した組換
え蛋白質０．１μｇへの精製免疫グロブリンの反応性の
比較によって評価した。次にすべての免疫グロブリンサ
ンプルを、ＲＰＭＩで特異的抗ＧＳＴ免疫グロブリンの
同じ濃度に調整した。各々のサンプルがＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ又はＢａｂｅｓｉａ ｒｏｓｓｉのインビ
トロ培養阻害能を、抗血清を得るために使用した組換え
蛋白質の非ＧＳＴ部分に対する特異的免疫グロブリン
１、２、４、８及び１０μｇに関して３回測定した。２
４時間（Ｂ．ｃａｎｉｓ生活環の約３周期）、水溶液中
５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ヒポキサンチン（ＩＣ
Ｎ）での代謝標識によって増殖阻害を評価した。次に、
フィルターで赤血球を遮断し、Ｓｃａｔｒｏｎ装置を用
いて洗浄した。その後、各々のウエルに結合した放射能
を、シンチグラフィーによりＳｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ
（Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ Ｓａｆｅ（商標） Ｐａｃｋ
ａｒｄ，ＵＳＡ）２ｍｌ中で読み取った。
ッセイ 各々の実験の前に、２％ヘマトクリットで血中寄生虫レ
ベルを１％に調整した（Ｄ０日）。Ｂ．ｃａｎｉｓ及び
Ｂ．ｒｏｓｓｉ寄生生物を９６穴プレートにおいて培地
１００μｌ中でインビトロ培養した。阻害アッセイに使
用する抗血清（抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５、抗ＧＳＴ−
Ｂｃｖｉｒ１５免疫前、抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３、抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清及び抗ＧＳＴ（図１７ではそれ
ぞれＢｃｖｉｒ１５、Ｔ０、ＣＯＮＴ、ｏｒｆ２、ＧＳ
Ｔとして示す））を最初にＨＩＴｒａｐ（商標） Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのＦＰＬＣによって精製
した。次に精製免疫グロブリンをＰＢＳ １Ｘ緩衝液に
対して４℃で一晩透析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ
ＳＡ）を用いて総免疫グロブリンを滴定した。ＥＬＩＳ
Ａを使用して、天然ＧＳＴ蛋白質又はＧＳＴに融合した
各々の組換え蛋白質に対する免疫グロブリンの比率を、
非組換えＧＳＴ ０．１μｇ又はウエルに被覆した組換
え蛋白質０．１μｇへの精製免疫グロブリンの反応性の
比較によって評価した。次にすべての免疫グロブリンサ
ンプルを、ＲＰＭＩで特異的抗ＧＳＴ免疫グロブリンの
同じ濃度に調整した。各々のサンプルがＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ又はＢａｂｅｓｉａ ｒｏｓｓｉのインビ
トロ培養阻害能を、抗血清を得るために使用した組換え
蛋白質の非ＧＳＴ部分に対する特異的免疫グロブリン
１、２、４、８及び１０μｇに関して３回測定した。２
４時間（Ｂ．ｃａｎｉｓ生活環の約３周期）、水溶液中
５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ヒポキサンチン（ＩＣ
Ｎ）での代謝標識によって増殖阻害を評価した。次に、
フィルターで赤血球を遮断し、Ｓｃａｔｒｏｎ装置を用
いて洗浄した。その後、各々のウエルに結合した放射能
を、シンチグラフィーによりＳｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ
（Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ Ｓａｆｅ（商標） Ｐａｃｋ
ａｒｄ，ＵＳＡ）２ｍｌ中で読み取った。
【０１２８】組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質による阻害
の回復 組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１が、Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖に対
する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害作用回復能を、上述した
ように継代したインビトロ培養に関して試験した。８％
の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１を含む培地中の種々の濃度の組換
え蛋白質を試験した：２０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍ
ｌ。４つの対照を使用した：ｉ）処置なしでのＢ．ｃａ
ｎｉｓインビトロ培養；ｉｉ）組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１
２０μｇ／ｍｌ又は４０μｇ／ｍｌを含む培養；ｉｉ
ｉ）８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清を含む培養。
の回復 組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１が、Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖に対
する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害作用回復能を、上述した
ように継代したインビトロ培養に関して試験した。８％
の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１を含む培地中の種々の濃度の組換
え蛋白質を試験した：２０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍ
ｌ。４つの対照を使用した：ｉ）処置なしでのＢ．ｃａ
ｎｉｓインビトロ培養；ｉｉ）組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１
２０μｇ／ｍｌ又は４０μｇ／ｍｌを含む培養；ｉｉ
ｉ）８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清を含む培養。
【０１２９】各濃度のＧＳＴ−ＯＲＦ１が抗ＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ１抗血清の阻害作用回復能を３点で試験し、上述し
たようにＤ０、Ｄ１及びＤ２にギームザ染色したスメア
に関する血中寄生虫濃度によって測定した。
ＲＦ１抗血清の阻害作用回復能を３点で試験し、上述し
たようにＤ０、Ｄ１及びＤ２にギームザ染色したスメア
に関する血中寄生虫濃度によって測定した。
【０１３０】結果 抗血清による阻害試験 最初の実験では、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清からの種々
の血液サンプル（図１３ではＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとし
て示す）がＢ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）の試験管内増殖
阻害能を、種々の濃度の各血液サンプル（１〜８％、図
１３ではそれぞれＡ−Ｄとして示す）を培地に加えて試
験した。対照培養では２日間の実験で血中寄生虫レベル
が１％から３５％に上昇したのに対し（図１３Ｅ）、８
％濃度の抗血清の第二及び第三のサンプルに関しては、
Ｄ２にＢ．ｃａｎｉｓの試験管内増殖に対する抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１の有意の阻害作用が認められ、これらの処理
培養ではＤ２に血中寄生虫レベルが約１５％であった
（図１３Ｄ、それぞれＩＩＩ及びＩＶ）。対照として、
免疫前ウサギ血清については使用した濃度にかかわらず
阻害作用が認められなかった（図１３、Ｉ）。
の血液サンプル（図１３ではＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとし
て示す）がＢ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）の試験管内増殖
阻害能を、種々の濃度の各血液サンプル（１〜８％、図
１３ではそれぞれＡ−Ｄとして示す）を培地に加えて試
験した。対照培養では２日間の実験で血中寄生虫レベル
が１％から３５％に上昇したのに対し（図１３Ｅ）、８
％濃度の抗血清の第二及び第三のサンプルに関しては、
Ｄ２にＢ．ｃａｎｉｓの試験管内増殖に対する抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１の有意の阻害作用が認められ、これらの処理
培養ではＤ２に血中寄生虫レベルが約１５％であった
（図１３Ｄ、それぞれＩＩＩ及びＩＶ）。対照として、
免疫前ウサギ血清については使用した濃度にかかわらず
阻害作用が認められなかった（図１３、Ｉ）。
【０１３１】もう１つの実験は、Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖
に対する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清の阻害作用を分析す
るために実施した（図１４）。阻害作用を試験し、抗Ｇ
ＳＴ−ＯＲＦ１抗血清と比較して、免疫前又は抗ＧＳＴ
又は関連性のない抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３ウサギ抗血
清を対照として使用した（図１４）。すべての抗血清を
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害濃度（８５）で試験した。こ
の実験では、Ｄ２に血中寄生虫レベルが対照培養では３
５％であったのに対し、処理培養では２２％であり、抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２の有意の阻害作用が認められた。さら
に、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２の阻害作用は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ
１に関して認められたもの（Ｄ２に血中寄生虫レベルが
約１５％である）よりも低かった。培養を８％の免疫前
又は抗ＧＳＴ又は抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３ウサギ抗血
清で処置しても阻害作用は認められなかった。
に対する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清の阻害作用を分析す
るために実施した（図１４）。阻害作用を試験し、抗Ｇ
ＳＴ−ＯＲＦ１抗血清と比較して、免疫前又は抗ＧＳＴ
又は関連性のない抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３ウサギ抗血
清を対照として使用した（図１４）。すべての抗血清を
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害濃度（８５）で試験した。こ
の実験では、Ｄ２に血中寄生虫レベルが対照培養では３
５％であったのに対し、処理培養では２２％であり、抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２の有意の阻害作用が認められた。さら
に、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２の阻害作用は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ
１に関して認められたもの（Ｄ２に血中寄生虫レベルが
約１５％である）よりも低かった。培養を８％の免疫前
又は抗ＧＳＴ又は抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３ウサギ抗血
清で処置しても阻害作用は認められなかった。
【０１３２】抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清の８％阻害作用
を、処理及び未処理培養を代謝標識した後の［３Ｈ］−
ヒポキサンチンの取込みを測定することによっても検討
し、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌ＡとＢに関して実験を行っ
た（図１５、それぞれＡ及びＢ）。両方の分離菌につい
て、対照培養と比較して、Ｄ２に未処理培養では放射能
が約２０００ｃｐｍであり、分離菌ＡとＢではそれぞれ
２５０と３５０ｃｐｍであったことから、有意の阻害作
用が認められた。血中寄生虫定量ではＤ１には抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１の阻害作用を検出できなかったのに対し、こ
の阻害作用は放射能測定によって同日に視覚化された。
実際に、対照培養における放射能は１０００ｃｐｍであ
ったのに対し、処理培養では分離菌ＡとＢにおいてそれ
ぞれ２００と２５０ｃｐｍであった。
を、処理及び未処理培養を代謝標識した後の［３Ｈ］−
ヒポキサンチンの取込みを測定することによっても検討
し、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌ＡとＢに関して実験を行っ
た（図１５、それぞれＡ及びＢ）。両方の分離菌につい
て、対照培養と比較して、Ｄ２に未処理培養では放射能
が約２０００ｃｐｍであり、分離菌ＡとＢではそれぞれ
２５０と３５０ｃｐｍであったことから、有意の阻害作
用が認められた。血中寄生虫定量ではＤ１には抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１の阻害作用を検出できなかったのに対し、こ
の阻害作用は放射能測定によって同日に視覚化された。
実際に、対照培養における放射能は１０００ｃｐｍであ
ったのに対し、処理培養では分離菌ＡとＢにおいてそれ
ぞれ２００と２５０ｃｐｍであった。
【０１３３】精製免疫グロブリンに関する試験管内阻害 可能性のある増殖阻害の非特異的原因として非免疫グロ
ブリン血清成分を排除するため、上述した実験を精製免
疫グロブリンに関して再度実施した。図１７に示すよう
に、精製免疫グロブリンはＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ
Ａ及びＢの両方試験管内増殖を阻害することができ
る。意外にも、これは、本発明に基づいた１つ又は両方
の蛋白質を含むワクチンが、血液型亜型にかかわらず、
一般的にＢ．ｃａｎｉｓの寄生増殖を阻害しうることを
意味する。予想されたように、Ｂ．ｒｏｓｓｉ Ｍの試
験管内増殖は阻害されない。
ブリン血清成分を排除するため、上述した実験を精製免
疫グロブリンに関して再度実施した。図１７に示すよう
に、精製免疫グロブリンはＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ
Ａ及びＢの両方試験管内増殖を阻害することができ
る。意外にも、これは、本発明に基づいた１つ又は両方
の蛋白質を含むワクチンが、血液型亜型にかかわらず、
一般的にＢ．ｃａｎｉｓの寄生増殖を阻害しうることを
意味する。予想されたように、Ｂ．ｒｏｓｓｉ Ｍの試
験管内増殖は阻害されない。
【０１３４】阻害の回復 Ｂ．ｃａｎｉｓの試験管内増殖に対する抗ＧＳＴ−ＯＲ
Ｆ１の阻害作用を確認するため、異なる濃度の精製組換
えＧＳＴ−ＯＲＦ１を培養液に加えることによってこの
作用を回復させる実験を行った（図１６）。使用した２
つの濃度は、２０及び４０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＯＲＦ
１であった。この実験は、８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で
処理した培地にＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質を加えることに
より、２０及び４０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ５０及
び１００％の阻害の回復が可能となることを示した（図
１６、それぞれＣ及びＤ）。未処理培養にそのような濃
度のＧＳＴ−ＯＲＦ１を加えたときには、寄生生物の増
殖に影響を及ぼさなかった（図１６、それぞれＡ及び
Ｂ）。未処理培養及び８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で処理
した培養をこの実験の対照として使用した（図１６、そ
れぞれＥ及びＦ）。
Ｆ１の阻害作用を確認するため、異なる濃度の精製組換
えＧＳＴ−ＯＲＦ１を培養液に加えることによってこの
作用を回復させる実験を行った（図１６）。使用した２
つの濃度は、２０及び４０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＯＲＦ
１であった。この実験は、８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で
処理した培地にＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質を加えることに
より、２０及び４０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ５０及
び１００％の阻害の回復が可能となることを示した（図
１６、それぞれＣ及びＤ）。未処理培養にそのような濃
度のＧＳＴ−ＯＲＦ１を加えたときには、寄生生物の増
殖に影響を及ぼさなかった（図１６、それぞれＡ及び
Ｂ）。未処理培養及び８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で処理
した培養をこの実験の対照として使用した（図１６、そ
れぞれＥ及びＦ）。
【０１３５】結論 抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１と抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２の両方が、８
％の濃度で、Ｂ．ｃａｎｉｓ分離菌の試験管内増殖を有
意且つ特異的に阻害することができた。この作用はＤ１
で既に認められた。４０μｇ／ｍｌの濃度の組換えＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ１はこの阻害作用を完全に回復させることが
できた。さらに、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ抗血
清の濾過によって、各々の抗血清の８％が１００及び５
０μｇ／ｍｌの培養の免疫グロブリンのそれぞれの濃度
であることが示された（データは示していない）。被覆
した組換えＧＳＴに関して実施したＥＬＩＳＡ試験は、
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１からの免疫グロブリンの半分が組換
えＧＳＴ−ＯＲＦ１のＧＳＴ部分に対するものであるこ
とを示し（データは示していない）、これは、８％の抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ１で認められたＢ．ｃａｎｉｓの試験管
内増殖に対する阻害作用が、蛋白質Ｂｃｖｉｒ１５に対
して特異的な５０μｇ／ｍｌの免疫グロブリンによって
得られたことを意味する。少なくともこれは、抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１抗血清の阻害作用を回復させるために４０μ
ｇの組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１が必要であることと合致す
る。
％の濃度で、Ｂ．ｃａｎｉｓ分離菌の試験管内増殖を有
意且つ特異的に阻害することができた。この作用はＤ１
で既に認められた。４０μｇ／ｍｌの濃度の組換えＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ１はこの阻害作用を完全に回復させることが
できた。さらに、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ抗血
清の濾過によって、各々の抗血清の８％が１００及び５
０μｇ／ｍｌの培養の免疫グロブリンのそれぞれの濃度
であることが示された（データは示していない）。被覆
した組換えＧＳＴに関して実施したＥＬＩＳＡ試験は、
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１からの免疫グロブリンの半分が組換
えＧＳＴ−ＯＲＦ１のＧＳＴ部分に対するものであるこ
とを示し（データは示していない）、これは、８％の抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ１で認められたＢ．ｃａｎｉｓの試験管
内増殖に対する阻害作用が、蛋白質Ｂｃｖｉｒ１５に対
して特異的な５０μｇ／ｍｌの免疫グロブリンによって
得られたことを意味する。少なくともこれは、抗ＧＳＴ
−ＯＲＦ１抗血清の阻害作用を回復させるために４０μ
ｇの組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１が必要であることと合致す
る。
【０１３６】それ故、これらのデータによって、遺伝情
報がＢ．ｃａｎｉｓ内に存在するが、Ｂ．ｃａｎｉｓゲ
ノムＤＮＡによってはコードされない、Ｂｃｖｉｒ１５
及びＢｃｖｉｒ３２（ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの産物）
が、アピコンプレクサ門寄生生物、Ｂ．ｃａｎｉｓの毒
性において重要な役割を果たすことを示唆した。これら
の蛋白質又はこれらの蛋白質をコードする核酸配列に基
づくワクチンは、血液型亜型にかかわりなく、Ｂ．ｃａ
ｎｉｓ寄生生物増殖阻害において重要な役割を果たすこ
とを示している。
報がＢ．ｃａｎｉｓ内に存在するが、Ｂ．ｃａｎｉｓゲ
ノムＤＮＡによってはコードされない、Ｂｃｖｉｒ１５
及びＢｃｖｉｒ３２（ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの産物）
が、アピコンプレクサ門寄生生物、Ｂ．ｃａｎｉｓの毒
性において重要な役割を果たすことを示唆した。これら
の蛋白質又はこれらの蛋白質をコードする核酸配列に基
づくワクチンは、血液型亜型にかかわりなく、Ｂ．ｃａ
ｎｉｓ寄生生物増殖阻害において重要な役割を果たすこ
とを示している。
【図１】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの図式的提示 Ａ：矢印で示したボックス及び配列誘導プライマーで表
わしたＯＲＦのＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ全体の図式的提
示。 Ｂ：予想重複配列とそれから推定されるアミノ酸配列の
提示
わしたＯＲＦのＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ全体の図式的提
示。 Ｂ：予想重複配列とそれから推定されるアミノ酸配列の
提示
【図２】完全なＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの核酸配列とＢｃ
ｖｉｒ１５の推定されるアミノ酸列 Ｂｃｖｉｒ１５と推定Ｂｃｖｉｒ３２間の共通アミノ酸
配列を普通の大文字で示す。グラム陰性固定ヘキサペプ
チドを上部の線で示す。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの２つの
予想されるＯＲＦの重複配列を太字のイタリック体で示
す。クローニング制現部位は太字である。
ｖｉｒ１５の推定されるアミノ酸列 Ｂｃｖｉｒ１５と推定Ｂｃｖｉｒ３２間の共通アミノ酸
配列を普通の大文字で示す。グラム陰性固定ヘキサペプ
チドを上部の線で示す。ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの２つの
予想されるＯＲＦの重複配列を太字のイタリック体で示
す。クローニング制現部位は太字である。
【図３】完全なＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡの核酸配列と推定
されるＢｃｖｉｒ３２蛋白質の推定されるアミノ酸配列 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡのＯＲＦ１とＯＲＦ２の重複領域
を太字のイタリック体で示す。クローニング制現部位は
太字である。
されるＢｃｖｉｒ３２蛋白質の推定されるアミノ酸配列 ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡのＯＲＦ１とＯＲＦ２の重複領域
を太字のイタリック体で示す。クローニング制現部位は
太字である。
【図４】Ｂ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡに関するＢＣＶ
ＩＲ ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ分析 分析したゲノムＤＮＡは、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａ
（レーン１）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ｂ（レーン
２）、Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆ（レーン３）及び非感
染イヌ血液サンプル（レーン４）から抽出した。ＢＣＶ
ＩＲ ｃＤＮＡ配列を担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドを
陽性対照として使用した（レーン５）。プライマー、Ｐ
１／Ｐ２（Ａ）、Ｐ５／Ｐ２（Ｂ）、Ｐ５／Ｐ１５．２
（Ｃ）及びＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂｃｃ１２Ｄ３．２
（Ｄ）の組合せを使用してＰＣＲを実施した。
ＩＲ ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ分析 分析したゲノムＤＮＡは、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａ
（レーン１）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ｂ（レーン
２）、Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆ（レーン３）及び非感
染イヌ血液サンプル（レーン４）から抽出した。ＢＣＶ
ＩＲ ｃＤＮＡ配列を担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドを
陽性対照として使用した（レーン５）。プライマー、Ｐ
１／Ｐ２（Ａ）、Ｐ５／Ｐ２（Ｂ）、Ｐ５／Ｐ１５．２
（Ｃ）及びＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂｃｃ１２Ｄ３．２
（Ｄ）の組合せを使用してＰＣＲを実施した。
【図５】ＢＣＶＩＲ配列のＲＴ−ＰＣＲ分析 Ｂ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）から単離した全ＲＮＡに関
して実験を行った。Ｐ１（レーン１）、Ｐ５（レーン
２）、Ｐ１５．２（レーン３）；ＢＣＶＩＲ配列及びＢ
ｃｃ１２Ｄ３配列のＢｃｃ１２Ｄ３．１（レーン４）又
はＢｃｃ１２Ｄ３．２（レーン５）を逆転写の開始プラ
イマーとして使用した。逆転写の第一段階は、ｅＡＭＶ
−ＲＴ酵素と共に（レーン１−５）又は対照としてｅＡ
ＭＶ−ＲＴ酵素なしで（レーン１’−５’）実施した。
増幅の第二段階は、プライマー、Ｐ１／Ｐ２（Ａ）、Ｐ
５／Ｐ１５．２（Ｂ、Ｃ）及びＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂ
ｃｃ１２Ｄ３．２（Ｄ）の組合せでのＰＣＲによって実
施した。増幅したＰＣＲ産物の特異性を調べるために、
増幅産物を０．８％アガロースゲルで分離し、紫外線下
にＢｅｔ染色によって視覚化するか（Ｉ）、若しくはニ
トロセルロース膜に移して、プローブとして使用したＢ
ＣＶＩＲ ｃＤＮＡ全配列とハイブリダイズした（Ｉ
Ｉ）。
して実験を行った。Ｐ１（レーン１）、Ｐ５（レーン
２）、Ｐ１５．２（レーン３）；ＢＣＶＩＲ配列及びＢ
ｃｃ１２Ｄ３配列のＢｃｃ１２Ｄ３．１（レーン４）又
はＢｃｃ１２Ｄ３．２（レーン５）を逆転写の開始プラ
イマーとして使用した。逆転写の第一段階は、ｅＡＭＶ
−ＲＴ酵素と共に（レーン１−５）又は対照としてｅＡ
ＭＶ−ＲＴ酵素なしで（レーン１’−５’）実施した。
増幅の第二段階は、プライマー、Ｐ１／Ｐ２（Ａ）、Ｐ
５／Ｐ１５．２（Ｂ、Ｃ）及びＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂ
ｃｃ１２Ｄ３．２（Ｄ）の組合せでのＰＣＲによって実
施した。増幅したＰＣＲ産物の特異性を調べるために、
増幅産物を０．８％アガロースゲルで分離し、紫外線下
にＢｅｔ染色によって視覚化するか（Ｉ）、若しくはニ
トロセルロース膜に移して、プローブとして使用したＢ
ＣＶＩＲ ｃＤＮＡ全配列とハイブリダイズした（Ｉ
Ｉ）。
【図６】ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のノーザンブロット
分析 Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓの分離菌Ｒｏｕｅｎ １９８７
からの全ＲＮＡ（レーン１）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌
Ａからの全ＲＮＡ（レーン２）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離
菌Ａからの非メッセンジャーＲＮＡ（レーン３）及び
Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆからの全ＲＮＡ（レーン４）
に関して、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ誘導Ｐ１
／Ｐ２プローブを使用してハイブリダイゼーションを実
施した。
分析 Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓの分離菌Ｒｏｕｅｎ １９８７
からの全ＲＮＡ（レーン１）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌
Ａからの全ＲＮＡ（レーン２）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離
菌Ａからの非メッセンジャーＲＮＡ（レーン３）及び
Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆからの全ＲＮＡ（レーン４）
に関して、ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ誘導Ｐ１
／Ｐ２プローブを使用してハイブリダイゼーションを実
施した。
【図７】大腸菌からのＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−Ｏ
ＲＦ２組換え蛋白質の過剰発現と精製 上述したようにＩＰＴＧで３時間誘導したあと、ＢＬ２
１（ＤＥ３）細胞から蛋白質を精製し、ＳＤＳ／１２％
ポリアクリルアミドゲル上で分離して、クマシーブリリ
アントブルーで染色した。レーン１Ａ、ＧＳＴ−ＯＲＦ
１溶解産物を発現する大腸菌；２Ａ、精製ＧＳＴ−ＯＲ
Ｆ１；３Ｂ、対照精製天然ＧＳＴ；４Ｂ、精製ＧＳＴ−
ＯＲＦ２；ＧＳＴ−ＯＲＦ２を発現する大腸菌からの封
入体溶解産物。
ＲＦ２組換え蛋白質の過剰発現と精製 上述したようにＩＰＴＧで３時間誘導したあと、ＢＬ２
１（ＤＥ３）細胞から蛋白質を精製し、ＳＤＳ／１２％
ポリアクリルアミドゲル上で分離して、クマシーブリリ
アントブルーで染色した。レーン１Ａ、ＧＳＴ−ＯＲＦ
１溶解産物を発現する大腸菌；２Ａ、精製ＧＳＴ−ＯＲ
Ｆ１；３Ｂ、対照精製天然ＧＳＴ；４Ｂ、精製ＧＳＴ−
ＯＲＦ２；ＧＳＴ−ＯＲＦ２を発現する大腸菌からの封
入体溶解産物。
【図８】［３５Ｓ］メチオニン標識Ｂａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ分離菌Ａ抗原の免疫沈降法 放射標識全抗原（Ａ）又は外抗原（Ｂ）を、ウサギ免疫
前血清（１）、抗ＧＳＴウサギポリクローナル血清
（２）、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清
（３）及び抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギポリクローナル血
清（４）によってそれぞれ免疫沈降した。矢印と星印は
それぞれＢｃｖｉｒ１５と推定Ｂｃｖｉｒ３２の位置を
示す。
ａｎｉｓ分離菌Ａ抗原の免疫沈降法 放射標識全抗原（Ａ）又は外抗原（Ｂ）を、ウサギ免疫
前血清（１）、抗ＧＳＴウサギポリクローナル血清
（２）、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清
（３）及び抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギポリクローナル血
清（４）によってそれぞれ免疫沈降した。矢印と星印は
それぞれＢｃｖｉｒ１５と推定Ｂｃｖｉｒ３２の位置を
示す。
【図９】［３５Ｓ］メチオニン標識Ｂａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ Ａ菌株のＴＸ−１１４分配抗原の免疫沈降法 ［３５Ｓ］メチオニン標識したＢａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓ Ａ分離菌のインビトロ培養をＴＸ−１１４に溶解
し、相分離後、水相において親水性抗原を回収し、界面
活性剤相において両親媒性抗原を回収した。免疫前ウサ
ギ血清（１）又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクロー
ナル血清（２）を使用して、水相蛋白質（Ａ）又は界面
活性剤相蛋白質（Ｂ）のいずれかを免疫沈降した。矢印
はＢｃｖｉｒ１５の位置を示す。
ａｎｉｓ Ａ菌株のＴＸ−１１４分配抗原の免疫沈降法 ［３５Ｓ］メチオニン標識したＢａｂｅｓｉａ ｃａｎ
ｉｓ Ａ分離菌のインビトロ培養をＴＸ−１１４に溶解
し、相分離後、水相において親水性抗原を回収し、界面
活性剤相において両親媒性抗原を回収した。免疫前ウサ
ギ血清（１）又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクロー
ナル血清（２）を使用して、水相蛋白質（Ａ）又は界面
活性剤相蛋白質（Ｂ）のいずれかを免疫沈降した。矢印
はＢｃｖｉｒ１５の位置を示す。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離したＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓメロゾイト抗原の免疫ブロット分析 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの分離菌Ａの精製メロゾイ
トに関して実験を行った。抗原を１２％ＳＤＳ／ポリア
クリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースシート
に移した。免疫前ウサギ血清（１Ａ及び１Ｂ）、抗ＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清（２Ａ）又は抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギポリクローナル血清（２Ｂ）と
共に１：１００希釈でインキュベーションを行った。Ｂ
ｃｖｉｒ１５とＢｃｖｉｒ３２の位置をそれぞれ星印と
矢印で示す。
ｃａｎｉｓメロゾイト抗原の免疫ブロット分析 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの分離菌Ａの精製メロゾイ
トに関して実験を行った。抗原を１２％ＳＤＳ／ポリア
クリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースシート
に移した。免疫前ウサギ血清（１Ａ及び１Ｂ）、抗ＧＳ
Ｔ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清（２Ａ）又は抗
ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギポリクローナル血清（２Ｂ）と
共に１：１００希釈でインキュベーションを行った。Ｂ
ｃｖｉｒ１５とＢｃｖｉｒ３２の位置をそれぞれ星印と
矢印で示す。
【図１１】ＢＣＶＩＲ配列発現産物の局在 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓの分離菌Ａに関してＩＦＡ
試験を実施した。 （Ａ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１に結合した蛍光 （Ｂ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２に結合した蛍光
試験を実施した。 （Ａ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１に結合した蛍光 （Ｂ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２に結合した蛍光
【図１２】インビトロ翻訳産物の分析 ｐＢＫ−ＣＭＶ ＢＣＶＩＲ ｃＤＮＡに関するＰ０／
Ｐ１５．２ ＰＣＲ増幅から翻訳した放射標識インビト
ロ産物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。産物全
体（４）又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって免疫沈降した
産物（３）を分析した。ＤＮＡなしの網状赤血球溶解産
物の総発現産物（１）又はＤＮＡなしの網状赤血球溶解
産物からの免疫沈降産物（２）を対照として使用した。
星印はＢｃｖｉｒ１５の位置を示し、矢印はＢｃｖｉｒ
３２の位置を示す。
Ｐ１５．２ ＰＣＲ増幅から翻訳した放射標識インビト
ロ産物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。産物全
体（４）又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって免疫沈降した
産物（３）を分析した。ＤＮＡなしの網状赤血球溶解産
物の総発現産物（１）又はＤＮＡなしの網状赤血球溶解
産物からの免疫沈降産物（２）を対照として使用した。
星印はＢｃｖｉｒ１５の位置を示し、矢印はＢｃｖｉｒ
３２の位置を示す。
【図１３】種々の濃度で抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリ
クローナル血清のＢａｂｅｓｉａｃａｎｉｓ Ａ菌株の
インビトロ培養での阻害能の評価 種々の血液サンプル（それぞれ第一（ＩＩ）、第二（Ｉ
ＩＩ）及び第三（ＩＶ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリ
クローナル血清）を１％（Ａ）、２％（Ｂ）、４％
（Ｃ）及び８％（Ｄ）の最終濃度でＢａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ Ａのインビトロ培養に加えた。免疫前血清
（Ｉ）を、標準条件に保持した培養（Ｅ）と共に対照と
して使用した。
クローナル血清のＢａｂｅｓｉａｃａｎｉｓ Ａ菌株の
インビトロ培養での阻害能の評価 種々の血液サンプル（それぞれ第一（ＩＩ）、第二（Ｉ
ＩＩ）及び第三（ＩＶ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリ
クローナル血清）を１％（Ａ）、２％（Ｂ）、４％
（Ｃ）及び８％（Ｄ）の最終濃度でＢａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ Ａのインビトロ培養に加えた。免疫前血清
（Ｉ）を、標準条件に保持した培養（Ｅ）と共に対照と
して使用した。
【図１４】種々のウサギポリクローナル血清によるＢａ
ｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ Ａ菌株インビトロ培養の阻害 血清を、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ Ａ菌株インビト
ロ培養に８％の割合で加えたときの寄生生物増殖阻害能
について試験した。Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２はそれぞれ試験開
始時、培養増殖の２４時間後及び培養増殖の４８時間後
の血中寄生虫レベルの値を示す。試験した血清はウサギ
ポリクローナル抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ−ＯＲ
Ｆ２であり、対照血清はウサギ免疫前血清、ウサギポリ
クローナル抗ＧＳＴ及びウサギポリクローナル抗ＧＳＴ
−Ｂｃｃ１２Ｄ３であった。対照レーンは、ウサギ血清
を加えない標準条件下での培養を示す。
ｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ Ａ菌株インビトロ培養の阻害 血清を、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ Ａ菌株インビト
ロ培養に８％の割合で加えたときの寄生生物増殖阻害能
について試験した。Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２はそれぞれ試験開
始時、培養増殖の２４時間後及び培養増殖の４８時間後
の血中寄生虫レベルの値を示す。試験した血清はウサギ
ポリクローナル抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ−ＯＲ
Ｆ２であり、対照血清はウサギ免疫前血清、ウサギポリ
クローナル抗ＧＳＴ及びウサギポリクローナル抗ＧＳＴ
−Ｂｃｃ１２Ｄ３であった。対照レーンは、ウサギ血清
を加えない標準条件下での培養を示す。
【図１５】［３Ｈ］−ヒポキサンチン代謝標識によって
評価したＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓインビトロ培養の
阻害試験 抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び対照の免疫前ウサギ血清を、Ｂ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ Ａ菌株（Ｉ）及びＢａｂｅ
ｓｉａ ｃａｎｉｓ Ｂ菌株（ＩＩ）に関して、すべて
８％の最終濃度で試験した。対照レーンは標準条件下で
増殖した双方の寄生生物を示す。
評価したＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓインビトロ培養の
阻害試験 抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び対照の免疫前ウサギ血清を、Ｂ
ａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ Ａ菌株（Ｉ）及びＢａｂｅ
ｓｉａ ｃａｎｉｓ Ｂ菌株（ＩＩ）に関して、すべて
８％の最終濃度で試験した。対照レーンは標準条件下で
増殖した双方の寄生生物を示す。
【図１６】ＧＳＴ−ＯＲＦ１組換え蛋白質に対する阻害
試験 組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質を、ウサギポリクローナ
ル抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１血清がＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉ
ｓ Ａ菌株のインビトロ増殖阻害能を回復させる能力に
関して試験した。蛋白質を、８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１
ウサギポリクローナル血清に対して２０μｇ／ｍｌ
（Ｃ）又は４０μｇ／ｍｌ（Ｄ）で試験した。対照は、
２０μｇ／ｍｌ（Ａ）又は４０μｇ／ｍｌ（Ｂ）の割合
で培養に加えた蛋白質単独、標準条件下での培養（Ｅ）
及び８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血
清との培養（Ｆ）であった。
試験 組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質を、ウサギポリクローナ
ル抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１血清がＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉ
ｓ Ａ菌株のインビトロ増殖阻害能を回復させる能力に
関して試験した。蛋白質を、８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１
ウサギポリクローナル血清に対して２０μｇ／ｍｌ
（Ｃ）又は４０μｇ／ｍｌ（Ｄ）で試験した。対照は、
２０μｇ／ｍｌ（Ａ）又は４０μｇ／ｍｌ（Ｂ）の割合
で培養に加えた蛋白質単独、標準条件下での培養（Ｅ）
及び８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血
清との培養（Ｆ）であった。
【図１７】［３Ｈ］−ヒポキサンチン代謝標識によって
評価した、精製免疫グロブリンによるＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓインビトロ培養阻害試験 精製免疫グロブリン（抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５、抗Ｇ
ＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５免疫前、抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ
３、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清及び抗ＧＳＴ（図１７で
はそれぞれＢｃｖｉｒ１５、Ｔ０、ＣＯＮＴ、ｏｒｆ
２、ＧＳＴとして示す））がＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉ
ｓ又はＢａｂｅｓｉａ ｒｏｓｓｉのインビトロ培養阻
害能を、１、２、４、８及び１０μｇの特異的免疫グロ
ブリンに関して３点で試験した。５０μＣｉ／ｍｌの［
３Ｈ］−ヒポキサンチンでの代謝標識による増殖阻害を
評価した。
評価した、精製免疫グロブリンによるＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓインビトロ培養阻害試験 精製免疫グロブリン（抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５、抗Ｇ
ＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５免疫前、抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ
３、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清及び抗ＧＳＴ（図１７で
はそれぞれＢｃｖｉｒ１５、Ｔ０、ＣＯＮＴ、ｏｒｆ
２、ＧＳＴとして示す））がＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉ
ｓ又はＢａｂｅｓｉａ ｒｏｓｓｉのインビトロ培養阻
害能を、１、２、４、８及び１０μｇの特異的免疫グロ
ブリンに関して３点で試験した。５０μＣｉ／ｍｌの［
３Ｈ］−ヒポキサンチンでの代謝標識による増殖阻害を
評価した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/205 Ａ６１Ｋ 39/23 39/23 39/29 39/29 39/39 39/39 Ａ６１Ｐ 33/02 Ａ６１Ｐ 33/02 Ｃ０７Ｋ 14/44 Ｃ０７Ｋ 14/44 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者 ベルナール・ピエール・ドミニク・カルシ ー フランス国、34070・モンプリエ、リユ・ ドウ・シユエ、15 (72)発明者 パスカル・ロベール・ドラキユロブスキー フランス国、34000・モンプリエ、リユ・ デ・ソール・ノワール、４ (72)発明者 アンドレ・フランソワ・ゴランフロ フランス国、34090・モンプリエ、リユ・ ドウ・レギユロング、424
Claims (22)
- 【請求項１】 １５ｋＤのＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ
関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片をコードす
る核酸配列であって、前記蛋白質又はその免疫原性断片
が配列番号２に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８
０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同
性を有する核酸配列。 - 【請求項２】 ３２ｋＤのＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ
関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片をコードす
る核酸配列であって、前記蛋白質又はその免疫原性断片
が配列番号４に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８
０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同
性を有する核酸配列。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の核酸配列を含む
ｃＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 機能的に連結されたプロモーターの制御
下で、請求項１又は２に記載の核酸配列又は請求項３に
記載のｃＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項５】 請求項３に記載のｃＤＮＡ断片又は請求
項４に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生組換え担体。 - 【請求項６】 請求項１又は２に記載の核酸配列、請求
項３に記載のｃＤＮＡ断片、請求項４に記載の組換えＤ
ＮＡ分子又は請求項５に記載の生組換え担体を含む宿主
細胞。 - 【請求項７】 １５ｋＤの分子量を持ち、配列番号２に
示すようなアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である
アミノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋
白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片。 - 【請求項８】 アミノ酸配列が、配列番号２に示すよう
なアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０
％、より好ましくは９５％相同である、請求項７に記載
のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質、又はかかる
蛋白質の免疫原性断片。 - 【請求項９】 ３２ｋＤの分子量を持ち、配列番号４に
示すようなアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である
アミノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋
白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片。 - 【請求項１０】 アミノ酸配列が、配列番号４に示すよ
うなアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０
％、より好ましくは９５％相同である、請求項９に記載
のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質、又はかかる
蛋白質の免疫原性断片。 - 【請求項１１】 ワクチンとして使用するための請求項
７から１０に記載のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋
白質。 - 【請求項１２】 Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防
御するためのワクチンの製造のための、請求項７から１
０に記載のＢａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連蛋白質の使
用。 - 【請求項１３】 請求項１又は２に記載の核酸配列、請
求項３に記載のｃＤＮＡ断片、請求項４に記載の組換え
ＤＮＡ分子、請求項５に記載の生組換え担体、請求項６
に記載の宿主細胞又は請求項７から１０に記載の蛋白
質、及び製薬上許容される担体を含むことを特徴とす
る、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するための
ワクチン。 - 【請求項１４】 アジュバントを含むことを特徴とす
る、請求項１３に記載のワクチン。 - 【請求項１５】 イヌに対して病原性を有するウイルス
又は微生物から得られる追加の抗原又はかかる抗原をコ
ードする遺伝情報を含むことを特徴とする、請求項１３
又は１４に記載のワクチン。 - 【請求項１６】 イヌに対して病原性を有する前記ウイ
ルス又は微生物が、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、
Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ、ｖｏｇｅｌｉ、ｒｏ
ｓｓｉ、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉ
ａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌパルボウイルス
（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、イヌジステ
ンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖ
ｉｒｕｓ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇ
ａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉｃｏｌａ、ｉｃｔｅ
ｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、ｐｏｍｏｎａ、ｇｒ
ｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、イヌ
肝炎ウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉ
ｒｕｓ）、イヌパラインフルエンザウイルス（Ｃａｎｉ
ｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）、狂犬
病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、Ｈｅｐａｔ
ｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ及びＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒ
ｇｄｏｒｆｅｒｉの群から選択されることを特徴とす
る、請求項１５に記載のワクチン。 - 【請求項１７】 請求項７から１０に記載の蛋白質又は
その免疫原性断片に対する抗体を含むことを特徴とす
る、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ感染を防御するための
ワクチン。 - 【請求項１８】 請求項１又は２に記載の核酸配列、請
求項３に記載のｃＤＮＡ断片、請求項４に記載の組換え
ＤＮＡ分子、請求項５に記載の生組換え担体、請求項６
に記載の宿主細胞又は請求項７から１０に記載の蛋白質
と、製薬上許容される担体を混合することを含む、請求
項１３から１６に記載のワクチンを調製のための方法。 - 【請求項１９】 前記抗体と製薬上許容される担体を混
合することを含む、請求項１７に記載のワクチンを調製
するための方法。 - 【請求項２０】 配列番号１又は３に示すような核酸配
列と少なくとも７０％相同である核酸配列又はかかる核
酸配列に相補的な核酸配列、又は少なくとも１２、好ま
しくは１５、より好ましくは１８のヌクレオチド長を有
する断片を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ ｃ
ａｎｉｓ関連ＲＮＡの検出のための診断検査。 - 【請求項２１】 前記検査が請求項７から１０で定義さ
れるような蛋白質又はその免疫原性断片を含むことを特
徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関連抗原物質に
対する抗体の検出のための診断検査。 - 【請求項２２】 前記試験が請求項７から１０で定義さ
れるような蛋白質又はその免疫原性断片に対する抗体を
含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ関
連抗原物質の検出のための診断検査。
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|---|---|---|---|
| EP01200816.5 | 2001-03-06 | ||
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|---|---|
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