JP2002330768A

JP2002330768A - プローブ設計方法及びバイオチップ

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Publication number: JP2002330768A
Application number: JP2001142170A
Authority: JP
Inventors: Shingo Ueno; 紳吾上野; Akira Nakashige; 亮中重; Yasuyuki Nozaki; 康行野崎; Toshiko Matsumoto; 俊子松本; Takuro Tamura; 卓郎田村
Original assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2002-11-19

Abstract

(57)【要約】【課題】バイオチップで生物種の識別を厳密に行う方
法、種以上のレベルでの生物種の識別を可能にする方法
を提供する。また、多数の生物種間での特異的プローブ
の選択を容易にする。【解決手段】ターゲットの系統樹に基づき、あるノー
ド以下のリーフで共通した塩基配列があれば、それをそ
のノードに固有のプローブとして設計する。このプロー
ブとリーフに固有のプローブをセットにして使用するこ
とにより、生物種の識別を厳密に行うことができ、ま
た、種以上のレベルでの生物種の識別も可能になる。リ
ーフに相当する塩基配列が同じもしくは似ていても、ノ
ードに相当する配列が異なればプローブとして使用可能
であるため、多数の生物種間での特異的プローブの選択
が容易になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中に含ま
れる複数種類のDNAを判別することを目的とするバイオ
チップ及びそのバイオチップにスポットするプローブの
設計方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の遺伝子解析技術の発展によって、
遺伝子の機能や構造が次第に明らかになってきた。中で
も、DNAチップまたはDNAマイクロアレイ（以下、本明細
書ではバイオチップという）の技術は、遺伝子解析に有
効な手段であるとして注目されている。バイオチップと
は、ガラス、シリコン、プラスチックなどの基板上に多
数の異なったプローブを高密度に整列化してスポットし
たものである。プローブとしては、通常cDNAや、20〜30
mer程度の短鎖ヌクレオチドなどが用いられる。バイオ
チップの原理は、DNAを構成する４つの塩基A（アデニ
ン）、T（チミン）、G（グアニン）、C（シトシン）に
おいて、AとT、GとCが互いに水素結合する性質、すなわ
ちハイブリダイゼーションに基づいている。このバイオ
チップ上に蛍光物質などで標識したDNAやRNAなどのター
ゲットを注ぎ、プローブとハイブリダイゼーションさせ
ることにより、ターゲットを捕獲する。捕獲されたDNA
やRNAなどのターゲットは各プローブスポットからの蛍
光シグナルとして検出され、これをコンピュータでデー
タ解析することにより、ターゲット中の数千から数万の
DNAやRNAの状況を一挙に観測することが可能となる。

【０００３】バイオチップの利用方法のひとつとして、
ターゲットとなる遺伝子（またはDNA断片）を捕獲する
ことで、調べたいターゲットのDNAがサンプル中に含ま
れているか検定したり、捕獲したDNAの配列を読み取っ
たり、SNPなどのDNAの多型部分を調べる利用法（SBH
法）がある。

【０００４】バイオチップの具体的な応用例の一つとし
て、生物種の識別方法について説明する。生物種の同定
には通常サンプル中のターゲットDNAの16SrDNA領域を使
うことが多い。16SrDNAはその生物に特異的なDNA配列
で、かつ変異が起こりにくい領域であるので生物種の同
定に使用するのに適しているからである。そして、プロ
ーブはその領域に合わせて設計する。実際の実験では16
SrDNAを特異的に増幅させ、プローブとハイブリダイズ
させることで生物種を識別していく。

【０００５】図１は、バイオチップを用いた細菌同定の
方法を模式的に示す説明図である。まず、細菌のDNA配
列を格納したデータベース１０から各細菌Ｐ，Ｑ，Ｒ，
…に特異的な16SrDNA領域の塩基配列をプローブ１１，
１２，１３，…として選択し、プローブ設計を行う。そ
のプローブ設計に従って各細菌に対応するプローブを作
製し、それを基板上に縦横に並べてスポットし、バイオ
チップ１４を作製する。そのバイオチップ１４上に、患
者の血液、痰などから抽出し蛍光標識したDNAをターゲ
ット１５として注ぎ、バイオチップ１４上のプローブと
ハイブリダイゼーションさせる。その結果、図の中央に
示すように、（横No1：縦No２）のスポットと（横No
３：縦No５）のスポットからシグナルが観測されたとす
る。このとき、バイオチップ上のスポット位置と細菌と
の対応表から細菌[Actinobacillusactinomycetemcomita
ns]と[Klebsiella oxytoca]がターゲットに混入してい
る（可能性がある）ことがわかる。この場合、検出され
るシグナルと菌種とは一対一の関係にある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来のバイオチップの
プローブ設計法は、ターゲットとプローブとを一対一に
対応づけるものである。しかし、このようなプローブ設
計法は必ずしも満足のいくものではなかった。まず第1
に、生物種のDNAとプローブが一対一の関係では、突然
変異や実験誤差によって生物種の判定が厳密に行えない
場合がある。

【０００７】実験誤差の例として、ターゲットのDNA断
片が、バイオチップ上の対応する相補的な配列のプロー
ブと結合しなかったり、あるいは対応しないプローブと
結合したりすることがある。対応するプローブと結合し
ない場合の例として、ターゲットのDNA配列がプローブ
設計時に参照したパブリックデータベースの配列とは異
なることがある。例えば図２に示すように、バイオチッ
プに注ぐターゲット２２のDNAに変異が起きていて、１
塩基置換や１塩基挿入が起こっていると、プローブ２１
とハイブリダイズしない。図２は、ターゲット２２に位
置２３で１塩基挿入があって結合しない場合を示してい
る。

【０００８】対応しないプローブと結合する場合のひと
つとしては、クロスハイブリダイゼーションがある。ク
ロスハイブリダイゼーションとは、図３に示すように、
ターゲットの遺伝子（またはDNA断片）３３，３４と、
バイオチップ上のプローブ３１，３２とが類似したDNA
配列を持つとき、部分的に結合される状態をいう。文
献（Michael D. Kane et al.: Assessment of the sens
itivity and specificity of oligonucleotide (50mer)
microarrays: Nucleic Acids Res.,28(22),4552-4557,
2000）によると、配列の類似度が75％以上のもの、ある
いは類似度がそれほど高くない場合（50〜75％）でも、
長さ15mer以上の連続した相補文字列があれば、クロス
ハイブリダイゼーションする可能性があるとの報告があ
る。

【０００９】一方、クロスハイブリダイゼーションを起
こさないようにするための試みとして、配列に特異的な
プローブを選別する方法（Ken-ichi Kurata et al.: Pr
obeDesign for DNA Chips: Genome Informatics 1999,
225-6,1999）などがあるが、確実にクロスハイブリダイ
ゼーションしないレベルには至っていない。また、ある
程度のクロスハイブリダイゼーションが起こっていると
して、そこから本来の蛍光シグナルがどの程度あるかを
予測する方法（Mitsuteru Nakao et al.: Quantitative
Estimation of Cross-Hybridization in DNA Microarr
ays Based ona Linear Model: Genome Informatics 200
0, 231-232,2000）も考えられているが、これも実用レ
ベルには至っていない。

【００１０】クロスハイブリダイゼーション以外にも、
ハイブリダイゼーション反応のときの温度やターゲット
溶液のpHといった実験条件、実験機器の状態、ターゲッ
トやプローブの濃度などにより、本来該当しないスポッ
トから蛍光シグナルが観測されてしまう可能性はいくつ
もある。現在のバイオチップでは、同じDNA配列のプロ
ーブをチップ上に複数個スポットすることによって、実
験に再現性があるかを確かめてはいるが、この方法では
上に述べた実験誤差に対応することが出来ない。

【００１１】第２に、ターゲットとプローブとを一対一
に対応づけたバイオチップでは、種以上のレベルでの生
物種の同定ができない。従来の生物種同定チップでは、
生物の種ではなく属や科のレベルで分類を行いたい場合
のような大まかなレベルの検出に対する要望には応える
ことができなかった。例えば、ある生物の特徴が種レベ
ルではほとんど差がないため属レベルで生物の分類を行
いたい場合、従来のバイオチップでは対応できない。

【００１２】第３に、多数の生物種それぞれに対して特
異的なプローブを選出しようとすると、生物種が多くな
るにつれ、特異的なプローブの選出に限界が生じてく
る。図４は、例えば５０個のプローブを選出しようとし
たとき、選出されたプローブNo.１〜No.５０の中にDNA
配列が互いに似ているプローブが多くなり、プローブの
選出が非常に困難になる状況を模式的に示している。ま
た、配列が類似していること以外にも、たくさんのプロ
ーブをとるとプローブ間のTm値が揃わないといった問題
もある。Tm値は2本鎖のDNAが解離して1本鎖になる温度
である。ハイブリダイゼーション反応は、高温下では2
本鎖DNAが解離して1本鎖になり、低温下では再び2本鎖
を形成するDNAの性質を利用している。従って、バイオ
チップにおいてはスポットするプローブのTm値を均一に
する必要がある。

【００１３】本発明は、このような従来技術の問題点に
鑑み、ターゲットの遺伝子（またはDNA断片）をより高
精度かつ確実に検出することのできるバイオチップ及び
プローブ設計方法を提供することを目的とする。また、
本発明は、大まかなレベルでの生物種の同定を可能にす
るバイオチップ及びそのプローブ設計方法を提供するこ
とを目的とする。さらに、本発明は、多数の生物種間で
の種特異的プローブの選出を容易にするプローブ設計方
法を提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明では、分子系統樹による生物の分類に基づい
た複数の特徴的なプローブを設計することで、ターゲッ
ト中のDNAがどの生物種由来のものであるかを判定する
ことと、多数の生物種間での種特異的プローブの選出を
容易にする。ここで、分子系統樹とは、生物種の生体高
分子配列の相同性に基づいて作られた樹状図のことであ
り、同一のノード以下に分類される生物種は近縁であり
生物学的に似た性質を持つ。

【００１５】複数の特徴的なプローブを設計する際の方
針は、従来のような生物種との一対一の関係だけでプロ
ーブを設計するのではなく、いくつかのターゲットに共
通するDNA配列をプローブとして選択することである。
その際、分子系統樹を入力データとして各ノードに対応
するプローブを設計していく。つまり、分子系統樹のあ
るノード以下の細菌に共通し、かつ、他の細菌にはない
塩基配列があれば、それをそのノードに固有のプローブ
として設計する。

【００１６】図５は、分子系統樹に基づいてプローブを
設計した例を示す説明図である。図のＩ，Ｊ，Ｋ，Ｌに
対応するノードに固有のプローブがとれた状況を示して
いる。図５の例の場合、塩基配列Ｉは、分子系統樹のノ
ードＩ以下の細菌１，２，３に共通し、しかも他の細菌
にはない塩基配列である。従って、ノードＩに対応する
プローブとして塩基配列Ｉを選定する。同様に、塩基配
列Ｊは、分子系統樹のノードＪ以下の細菌４，５に共通
し、他の細菌にはない塩基配列であるため、ノードＪに
対応するプローブとする。塩基配列Ｋは、分子系統樹の
ノードＫ以下の細菌７，８に共通し、他の細菌にはない
塩基配列であるため、ノードＫに対応するプローブとす
る。塩基配列Ｌは、分子系統樹のノードＬ以下の細菌４
〜８に共通し、他の細菌にはない塩基配列であるため、
ノードＬに対応するプローブとする。なお、塩基配列
Ａ，Ｂ，Ｃ，…，Ｈは、細菌１〜８に固有の塩基配列で
あり、細菌１〜８に一対一対応する各細菌に固有のプロ
ーブとして選出される。

【００１７】このように分子系統樹のノードに対応する
プローブを設計すると、検出されたスポットの菌名だけ
でなく、それらの近縁関係がわかるため、ターゲットに
含まれている細菌をより精密に識別することができる。
実際、分子系統樹はDNA配列の相同性に基づいて作られ
ているが、形態学的に作製された進化系統樹とほぼ一致
する。そのため、進化系統樹に基づく種や属といった分
類法は分子系統樹のノードとリーフの関係と一致するこ
とが多い。

【００１８】また、図５のように分子系統樹による分類
に準じたプローブを用意するプローブ設計法は、１つの
ターゲットに対して固有なプローブを数種類用意する方
法に対して、バイオチップ上に設けるスポットの数量も
削減でき、コスト面と労力面共にメリットがある。そし
て、単に細菌に特異的なプローブを複数用意することに
比べて、多くのスポットからのシグナルで細菌の混入具
合を判別するので、より正確な判定を行うことが出来
る。

【００１９】図６は、図５で選択したプローブＡ〜Ｋを
スポットしたバイオチップにターゲットをハイブリダイ
ゼーションさせたときの結果の例を示す模式図である。
図６に示した例では、プローブＡ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｌ
から信号が検出されており、細菌１、細菌３、細菌７が
混入していることが、細菌に固有なプローブ（Ａ，Ｃ，
Ｇ）と、分子系統樹の中間ノードに対応するプローブ
（Ｉ，Ｋ，Ｌ）から判断することが出来る。このように
中間ノードからのシグナルを利用することにより精度の
高い検出が可能になる。

【００２０】また、図７のように、種に相当するスポッ
トＧからのシグナルが検出されているにもかかわらず中
間ノードに相当するスポットＫ，Ｌからのシグナルが検
出されていない場合は、種に相当するスポットＧでクロ
スハイブリが起こっていると考えられる。つまり、中間
ノードに相当するスポットによりハイブリ反応が正常に
行われたかどうかを判別できる。このような検出手法を
用いることにより一層精度の高い検出が可能となる。ま
た逆に、種に相当するスポットＡ，Ｂ，Ｃからのシグナ
ルが検出されず、中間ノードに相当するスポットＩから
のシグナルが検出されている場合は、未知種または突然
変異した種のDNAがサンプル中に存在していると考えら
れる。この場合は、種レベルまでは識別できなくてもそ
の上位レベルまでは識別することができ、未知のものを
推定する手がかりとなる。

【００２１】菌種を同定するプローブを各菌の16SrDNA
配列から選定するとき、それぞれのプローブは互いに似
ていてはいけない。その結果、菌種が増加してくると互
いに似ていない塩基配列を選ぶことは困難になってく
る。しかし、図８のように、種に相当する塩基配列が同
じもしくは似ていても、中間ノードに相当する配列が異
なれば、中間ノードに相当する配列と組み合わせること
でプローブとして使用可能である。図８の例では、細菌
１〜３はα属に、細菌４８〜５０はβ属に属している。
プローブNo.1とNo.４９は非常に良く似た配列である。
このような状況でも、属に相当するプローブαやβを種
に相当するプローブと同時に使用することにより、本来
なら互いに非常に似ているため使用できない配列No.１
とNo.４９も種のプローブとして利用可能になる。ター
ゲットの検出に当たっては、図６にて説明したように
種、中間ノードそれぞれに相当する複数のプローブから
のシグナルから総合的に判断する。

【００２２】本発明によるプローブの設計方法、バイオ
チップ、ターゲット検出方法の特徴をまとめると、以下
の通りである。（１）サンプル中に含まれる複数種類のターゲット生体
高分子を判別するためのプローブの設計方法において、
前記複数種類のターゲット生体高分子を含む生体高分子
群の分子系統樹のノードに対応するプローブとして、そ
のノード以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダイ
ズするプローブを設計することを特徴とするプローブの
設計方法。

【００２３】（２）サンプル中に含まれる複数種類のタ
ーゲット生体高分子を判別するためのプローブの設計方
法において、前記複数種類のターゲット生体高分子とそ
れぞれ特異的にハイブリダイズするプローブと、前記複
数種類のターゲット生体高分子を含む生体高分子群の分
子系統樹のノードに対応するプローブとして、そのノー
ド以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダズするプ
ローブとを設計することを特徴とするプローブの設計方
法。

【００２４】（３）サンプル中に含まれる複数種類のタ
ーゲット生体高分子を判別するためのプローブの設計方
法において、前記複数種類のターゲット生体高分子を含
む生体高分子群の分子系統樹のノードに対応するプロー
ブとして、そのノード以下の生体高分子とのみ共通して
ハイブリダズするプローブと、前記ノード以下のターゲ
ット生体高分子とそれぞれ特異的にハイブリダイズする
プローブとを設計することを特徴とするプローブの設計
方法。

【００２５】（４）複数種類のターゲット生体高分子を
判別するために基板上に複数のプローブをスポットした
バイオチップにおいて、前記複数種類のターゲット生体
高分子を含む生体高分子群の分子系統樹のノードに対応
するプローブとして当該ノード以下の生体高分子とのみ
共通してハイブリダイズするプローブをスポットしたこ
とを特徴とするバイオチップ。

【００２６】（５）複数種類のターゲット生体高分子を
判別するために基板上に複数のプローブをスポットした
バイオチップにおいて、前記複数種類のターゲット生体
高分子とそれぞれ特異的にハイブリダイズするプローブ
と、前記複数種類のターゲット生体高分子を含む生体高
分子群の分子系統樹のノードに対応するプローブとして
当該ノード以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダ
ズするプローブとをスポットしたことを特徴とするバイ
オチップ。

【００２７】（６）複数種類のターゲット生体高分子を
判別するために基板上に複数のプローブをスポットした
バイオチップにおいて、前記複数種類のターゲット生体
高分子を含む生体高分子群の分子系統樹のノードに対応
するプローブとして当該ノード以下の生体高分子とのみ
共通してハイブリダズするプローブと、前記ノード以下
のターゲット生体高分子とそれぞれ特異的にハイブリダ
イズするプローブとをスポットしたことを特徴とするバ
イオチップ。

【００２８】（７）プローブとのハイブリダイゼーショ
ン反応に基づいてターゲット生体高分子の存在を検出す
るターゲット検出方法において、ターゲットとなるべき
複数種類の生体高分子を含む生体高分子群に対する分子
系統樹の所定のノード以下の生体高分子とのみ共通して
ハイブリダズするプローブとのハイブリダイゼーション
反応と、前記所定のノード以下の生体高分子とそれぞれ
特異的にハイブリダイズするプローブとのハイブリダイ
ゼーション反応とをもとにターゲット生体高分子の存在
を検出することを特徴とするターゲット検出方法。

【００２９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施する場合の一
形態を図面を参照して具体的に説明する。図９は、バイ
オチップの作製、蛍光シグナルの検出、シグナルデータ
の解析を行うバイオチップシステムの構成例を示すブロ
ック図である。このバイオチップシステムは、配列デー
タの入出力及び実験データの解析等を行う中央処理装置
９００、中央処理装置９００での処理に必要なプログラ
ムを格納するプログラムメモリ９１０、キャラクタ及び
グラフィック画面を表示する表示装置９０１、本システ
ムへの値の入力や選択の操作を行うためのキーボード９
０２およびマウス９０３、プローブDNA配列の設計に使
うターゲットDNAの情報が格納されている配列データベ
ース９０４、ノード用プローブの設計に使う系統樹の情
報が格納されている系統樹データ９０９を備える。

【００３０】ここで、配列データベース９０４はローカ
ルなデータベースであってもよいし、ネットワーク等を
介して遠隔地に設置されたサーバーコンピュータが管理
しているデータベースであってもよい。系統樹データ９
０９は既に作成されたデータであってもよいし、新たに
配列データベース９０４から作成したデータであっても
よい。また、系統樹データ９０９はローカルなコンピュ
ータにあるデータであってもよいし、ネットワーク等を
介して遠隔地に設置されたサーバコンピュータが管理し
ているデータであってもよい。中央処理装置９００はコ
ンピュータとそのプログラムによって具体化されるもの
である。

【００３１】プログラムメモリ９１０は、配列データベ
ース９０４のデータを処理する配列データ処理部９１
１、系統樹データ９０９を解析する系統樹データ解析処
理部９１２、キーボード９０２やマウス９０３からの入
力を処理する入力データ処理部９１１、配列データ処理
部９１１の処理結果と系統樹データ解析処理部９１２の
解析結果をもとにプローブの選択処理を行うプローブ選
択処理部９１４、設計したプローブを表示するプローブ
表示処理部９１５からなる。

【００３２】中央処理装置９００は、設計したプローブ
DNA配列から実際のチップに載せるプローブを作製する
プローブ作製装置９０５、プローブ作製装置で作製した
プローブを入れるウェル９０６からプローブを取り出し
てチップ９０８上の所定の位置に載せるスポッタ９０７
の制御も行う。

【００３３】図１０は、本システムが管理するターゲッ
トDNA配列データの例を示したものである。配列情報
は、dnaSeq[i](i = 1,2,…,sNum)という長さsNum個の構
造体の配列に格納する。ただしsNumはプローブ選別で対
象とするターゲットDNAの個数である。配列dnaSeq[]
は、配列名（１０００）、DNA配列（１００１）、DNA配
列の配列長（１００２）、そしてこの配列がどのプロー
ブで検出されるのかを示すPROBE_ID（１００３）からな
る。PROBE_IDには、このターゲットDNAを識別すること
が可能な各プローブの識別子が入る。この識別子は後述
する配列probe[]の識別子を指している。また、これら
の属性に加えて、配列を取り出した生体組織（器官）の
名前、生物種名、属名、配列データベースに関する情報
などをdnaSeq[]の属性として加えてもよい。

【００３４】図１１は、本システムが管理するプローブ
DNA配列データの例を示したものである。プローブDNA配
列データは、probe[i](i = 1,2,…,pNum)という長さpNu
m個の構造体の配列に格納されている。ここでpNumは、
チップ上に載せるプローブの総数である。配列probe[]
は、チップ上でのプローブの座標位置（１１００）、検
出器で観測された蛍光シグナル強度（１１０１）、プロ
ーブのDNA配列（１１０２）、このプローブによって検
出することが可能なターゲットのリストを表すTARGET_I
D（１１０３）からなる。TARGET_IDには、前に述べた配
列dnaSeq[]のインデックスをターゲットの識別子として
入力する。

【００３５】図１２は、本システムの入力データである
系統樹データの例を示したものである。系統樹データは
ファイル形式になっており、系統樹のリーフの部分をdn
aSeq[]の識別子に対応させ、一組の括弧を一つの中間ノ
ードに対応させている。そして中間ノードが（系統樹上
でリーフに近い）中間ノードを持つときは、入れ子構造
で表現する形式をとっている。すなわち、BNF記法で書
くと次のようになる。

【００３６】ノード::=(ノード,ノード)|dnaSeq[]の識別子そして、系統樹データには、このルートに対応するノー
ドがかかれている。図１２で示した系統樹データの例で
は、（１，２）はノードAに対応しており、（（１，
２），３）はノードBに対応している。

【００３７】図１３は、本システムが管理するNode構造
体を示す図である。Node構造体は系統樹における各ノー
ドおよびリーフを示したものである。Nodeはリーフ識別
子１３００、左子ノードへのポインタ１３０１、右子ノ
ードへのポインタ１３０２からなる。リーフの識別子１
３００にはNodeが系統樹における中間ノードのときNode
の下に属するリーフの識別子（dnaSeq[]のインデック
ス）が登録され、Node自体がリーフのときは、リーフの
識別子１３００には対応するdnaSeq[]のインデックスが
登録される。また、Nodeがリーフのときは、左子ノード
のポインタ、右ノードのポインタにはNULLを入れる。

【００３８】図１４はNode構造体の間の関係を示したも
ので、左子ノードと右子ノードへのポインタをつなぎ合
わせることで系統樹のツリー構造を再生している。図１
５は、本発明の概略処理フローを示した図である。ま
ず、配列データベース９０４からプローブ選別で対象と
するターゲットDNA配列データを読み込み、dnaSeq[]に
登録する（ステップ１５００）。次に、系統樹データ９
０９から系統樹データを読み込み、Node構造体に登録す
る。系統樹データ９０９は既に作成されたデータであっ
てもよいし、新たに配列データベースから作成したデー
タであってもよい。入力された系統樹データは、図１４
のように樹状図の形状に合わせて、Node構造体のリンク
を構築していく（ステップ１５０１）。

【００３９】次に、プローブ選別の基準を、キーボード
９０２やマウス９０３を用いて入力する。すなわち、何
merのプローブを作製するのか、プローブのTm値（DNAの
２本鎖が１本鎖に分離する温度）、他のターゲットDNA
との配列類似度の限界値など、プローブDNA配列選別の
要件に関する情報を設定していく。入力方法はこの他に
も、予めプローブ作製に関する情報が入っているファイ
ルを読み込む利用形態がある（ステップ１５０２）。そ
の後、dnaSeq[]及びNodeを用いて、系統樹のノード及び
種に対応するプローブDNA配列を決める（ステップ１５
０３）。この処理については後で詳しく述べる。この処
理によりプローブが配列probe[i](i= 1,…,pNum)に格納
される。

【００４０】これをプローブ作製装置９０５に送り、実
際にプローブを作る（ステップ１５０４）。作ったプロ
ーブをウェル９０６に調整し、ウェルからスポッタ９０
７でバイオチップを作製する（ステップ１５０５）。最
後に樹状図に対応したプローブの選別結果を図１７のよ
うに表示装置９０１に表示する（ステップ１５０６）。
図１７については後で詳しく述べる。

【００４１】図１６は、図１５におけるプローブDNA配
列を決める処理（ステップ１５０３）の詳細フローであ
る。図１５のステップ１５０３では、引数として系統樹
のルートを与えてコールする。図１６において、まず、
引数として与えられたNode構造体のデータを読み込む
（ステップ１６００）。次に、このNodeに子ノードが存
在するかどうか調べる（ステップ１６０１）。子ノード
が存在しないのであれば、Nodeは系統樹の種に対応して
いる。存在するのであれば、系統樹のノードに対応して
いる。

【００４２】Nodeに子ノードが存在しないとき、まず、
このNodeのリーフの識別子メンバ１３００に対応するタ
ーゲットに対するプローブDNA配列を選別する。ターゲ
ットDNA配列から、プローブの長さ分のDNA部分配列（プ
ローブ候補）を取り出し、プローブ候補が、全DNA配列
でユニークであるか、基準となるTm値を満たしている
か、他のDNA配列との配列類似度が限界値を超えていな
いか、クロスハイブリを起こしやすい配列ではないか、
などを調べる。これらの基準を満たし、かつ最も望まし
いプローブ候補をターゲットDNAに固有なプローブとし
て選択する。そして、選別したプローブDNA配列をprobe
[]のDNA配列１１０２に登録し、Nodeのリーフの識別子
メンバをTARGET_ID１１０３に追加する（ステップ１６
０２）。Nodeのリーフ識別子メンバに対応するdnaSeq[]
のPROBE_IDメンバ１００３に選別したプローブの識別子
を追加する（ステップ１６０３）。

【００４３】ステップ１６０１において、Nodeに子ノー
ドが存在するとき、まず、このNodeに対応するプローブ
DNA配列を選別する。Nodeに対応するプローブは、Node
の下の種とは反応し、それ以外の種とは反応しないもの
でなくてはならない。そこで、まず、Nodeのリーフの識
別子メンバで示される識別子のターゲットDNA配列には
含まれ、それ以外のターゲットDNA配列には含まれない
ような、プローブの長さ分の部分配列をプローブ候補と
して求める。その後、Tm値や配列類似度は基準を満たし
ているかなどを調べ、最も望ましいプローブ候補をDNA
配列に固有なプローブとして選別する。選別したプロー
ブDNA配列をprobe[]のDNA配列１１０２に登録し、Node
のリーフの識別子メンバをTARGET_ID１１０３に追加す
る（ステップ１６０４）。Nodeのリーフ識別子メンバに
対応するdnaSeq[]のPROBE_IDメンバ１００３に選別した
プローブの識別子を追加する（ステップ１６０５）。

【００４４】その後、引数をNodeの左右の子ノードとし
て、ステップ１６００から処理を繰返す（ステップ１６
０６、１６０７）。このようにして、系統樹の全てのノ
ード及び種を巡回しながらプローブを選択していく。ま
た、望ましいプローブ候補が得られなかったときは、そ
のことを表示装置９０１に出力する。

【００４５】図１７は、本システムが選別したプローブ
の情報を表示する表示装置９０１の画面の例を示す図で
ある。系統樹データ９０９が読み込まれ表示画面１７０
０に表示されると、マウス９０３のカーソル１７０１を
用いて系統樹のノードを選択する。ノードの選択は、マ
ウス９０３の他、キーボード９０２を用いて行っても良
い。すると１７０２、１７０３，１７０４，１７０５が
表示される。１７０２は、マウスカーソル１７０１で選
択したノードに属する生物種（ここではStr. sanguini
とStr. CanisとEnt. aviumの３つ）のマルチプルアライ
メントの結果である。網掛けの部分は、三つの生物種で
DNA配列が一致する部分である。網掛けでない部分は、
少なくとも一つの生物種でDNA配列が異なる部分であ
る。１７０３は、カーソル１７０１で選択したノードに
対応するプローブの一つである。１７０４は、そのプロ
ーブのDNA配列中における位置を示す。配列１７０３は7
塩基目から始まるので、マルチプルアライメントの7塩
基目から表示される。１７０５は、カーソル１７０１で
選択したノードに対応するプローブの一覧表である。こ
こではプローブの番号、配列、DNA配列中における位
置、反応温度を表示しているが、自分自身で絡み合う度
合いや他の条件を表示しても良い。以上の処理によっ
て、調べたいターゲットDNAの由来する生物種の判別を
対象としたプローブをうまく選別することが可能とな
る。

【００４６】

【発明の効果】本発明によると、ターゲットの遺伝子
（又はDNA断片）を高精度に、あるいは所望の分類レベ
ルで検出することのできるバイオチップを得ることがで
きる。また、調べたいターゲットDNAの種類が増加して
もプローブの選別が容易に行える。それぞれのプローブ
は系統樹のノードとリーフの関係に対応しているので、
ハイブリダイゼーション反応やシグナル読み取りにおけ
るエラーチェックの役割も果たす。

【図面の簡単な説明】

【図１】バイオチップを用いた細菌同定の方法を模式的
に示す説明図。

【図２】ターゲットDNAが対応するプローブと結合しな
い例を示す図。

【図３】ターゲットDNAが対応しないプローブと結合す
る例を示す図。

【図４】菌種が多数の場合、プローブの選別が困難にな
ることを説明する図。

【図５】分子系統樹に対応したプローブの設計例を示す
図。

【図６】本発明のバイオチップを用いた実験結果の例を
示す図。

【図７】本発明のバイオチップを用いた実験結果の他の
例を示す図。

【図８】種に相当する塩基配列が同じもしくは似ていて
も、中間ノードに相当する配列が異なればプローブとし
て使用可能であることを示す図。

【図９】本発明によるバイオチップシステムの構成例を
示すブロック図。

【図１０】ターゲットDNA配列データのデータ構造を示
す図。

【図１１】プローブDNA配列データのデータ構造を示す
図。

【図１２】系統樹データの構造を示した図。

【図１３】Node構造体のデータ構造を示した図。

【図１４】Node構造体のリンク関係を示した図。

【図１５】本発明の概略処理フローを示す図。

【図１６】プローブ配列決定の詳細フローを示す図。

【図１７】プローブ選別結果表示画面例を示す図。

【符号の説明】

１０…配列データベース、１１〜１３…プローブ、１４
…バイオチップ、１５…ターゲット、２１…プローブ、
２２…ターゲット、３１，３２…プローブ、３３，３４
…ターゲット、９００…中央処理装置、９０１…表示装
置、９０２…キーボード、９０３…マウス、９０４…配
列データベース、９０９…系統樹データ、９１０…プロ
グラムメモリ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者中重亮神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社内 (72)発明者野崎康行神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社内 (72)発明者松本俊子神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社内 (72)発明者田村卓郎神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA19 AA20 CA01 CA09 CA11 HA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 FA15 4B063 QA13 QQ05 QQ42 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中に含まれる複数種類のターゲ
ット生体高分子を判別するためのプローブの設計方法に
おいて、前記複数種類のターゲット生体高分子を含む生体高分子
群の分子系統樹のノードに対応するプローブとして、そ
のノード以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダイ
ズするプローブを設計することを特徴とするプローブの
設計方法。
【請求項２】サンプル中に含まれる複数種類のターゲ
ット生体高分子を判別するためのプローブの設計方法に
おいて、前記複数種類のターゲット生体高分子とそれぞれ特異的
にハイブリダイズするプローブと、前記複数種類のターゲット生体高分子を含む生体高分子
群の分子系統樹のノードに対応するプローブとして、そ
のノード以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダズ
するプローブとを設計することを特徴とするプローブの
設計方法。
【請求項３】サンプル中に含まれる複数種類のターゲ
ット生体高分子を判別するためのプローブの設計方法に
おいて、前記複数種類のターゲット生体高分子を含む生体高分子
群の分子系統樹のノードに対応するプローブとして、そ
のノード以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダズ
するプローブと、前記ノード以下のターゲット生体高分子とそれぞれ特異
的にハイブリダイズするプローブとを設計することを特
徴とするプローブの設計方法。
【請求項４】複数種類のターゲット生体高分子を判別
するために基板上に複数のプローブをスポットしたバイ
オチップにおいて、前記複数種類のターゲット生体高分子を含む生体高分子
群の分子系統樹のノードに対応するプローブとして当該
ノード以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダイズ
するプローブをスポットしたことを特徴とするバイオチ
ップ。
【請求項５】複数種類のターゲット生体高分子を判別
するために基板上に複数のプローブをスポットしたバイ
オチップにおいて、前記複数種類のターゲット生体高分子とそれぞれ特異的
にハイブリダイズするプローブと、前記複数種類のター
ゲット生体高分子を含む生体高分子群の分子系統樹のノ
ードに対応するプローブとして当該ノード以下の生体高
分子とのみ共通してハイブリダズするプローブとをスポ
ットしたことを特徴とするバイオチップ。
【請求項６】複数種類のターゲット生体高分子を判別
するために基板上に複数のプローブをスポットしたバイ
オチップにおいて、前記複数種類のターゲット生体高分子を含む生体高分子
群の分子系統樹のノードに対応するプローブとして当該
ノード以下の生体高分子とのみ共通してハイブリダズす
るプローブと、前記ノード以下のターゲット生体高分子
とそれぞれ特異的にハイブリダイズするプローブとをス
ポットしたことを特徴とするバイオチップ。
【請求項７】プローブとのハイブリダイゼーション反
応に基づいてターゲット生体高分子の存在を検出するタ
ーゲット検出方法において、ターゲットとなるべき複数種類の生体高分子を含む生体
高分子群に対する分子系統樹の所定のノード以下の生体
高分子とのみ共通してハイブリダズするプローブとのハ
イブリダイゼーション反応と、前記所定のノード以下の
生体高分子とそれぞれ特異的にハイブリダイズするプロ
ーブとのハイブリダイゼーション反応とをもとにターゲ
ット生体高分子の存在を検出することを特徴とするター
ゲット検出方法。