JP2002281961A - 植物プロトプラストの単離方法 - Google Patents
植物プロトプラストの単離方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 疎水性の高い植物材料から、生存状態の植物
プロトプラストを高収率で取得することができ、しかも
簡便に実施することのできる植物プロトプラストの単離
方法を提供すること。 【解決手段】 疎水性の高い植物材料に、界面活性剤の
存在下に、プロトプラスト単離酵素を作用させ、次い
で、該植物材料からプロトプラストを分離することを特
徴とする植物プロトプラストの単離方法。
プロトプラストを高収率で取得することができ、しかも
簡便に実施することのできる植物プロトプラストの単離
方法を提供すること。 【解決手段】 疎水性の高い植物材料に、界面活性剤の
存在下に、プロトプラスト単離酵素を作用させ、次い
で、該植物材料からプロトプラストを分離することを特
徴とする植物プロトプラストの単離方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、疎水性の高い植物
材料から、プロトプラストを高収率で簡単に単離するこ
とができる植物プロトプラストの単離方法に関する。
材料から、プロトプラストを高収率で簡単に単離するこ
とができる植物プロトプラストの単離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
組織培養技術の発達により、プロトプラストからの植物
体再生、またその技術を応用した植物育種が行われてい
る。このような技術においては、植物材料からプロトプ
ラストを単離する必要があるが、表面に毛やワックス成
分が存在し、疎水性が高い植物材料の場合には、酵素が
均一に浸透ぜず、そのため、プロトプラストの生成及び
植物材料からのプロトプラストの分離が困難である。そ
のため、疎水性の高い植物材料からプロトプラストを得
る方法としては、植物材料を細かく切断したり、植物材
料から表皮を剥離した後に、プロトプラスト単離酵素を
作用させる方法が提案されている。しかし、植物材料を
細かく切断する方法は、切断した植物材料から有害物質
が流出して、プロトプラストの生存率が低下する問題が
あり、特に樹木等では流出した有害物質による生存率の
低下が顕著である。また、植物材料から表皮を剥離する
方法は、操作に手間が掛かる上に、操作に熟練を要す
る。
組織培養技術の発達により、プロトプラストからの植物
体再生、またその技術を応用した植物育種が行われてい
る。このような技術においては、植物材料からプロトプ
ラストを単離する必要があるが、表面に毛やワックス成
分が存在し、疎水性が高い植物材料の場合には、酵素が
均一に浸透ぜず、そのため、プロトプラストの生成及び
植物材料からのプロトプラストの分離が困難である。そ
のため、疎水性の高い植物材料からプロトプラストを得
る方法としては、植物材料を細かく切断したり、植物材
料から表皮を剥離した後に、プロトプラスト単離酵素を
作用させる方法が提案されている。しかし、植物材料を
細かく切断する方法は、切断した植物材料から有害物質
が流出して、プロトプラストの生存率が低下する問題が
あり、特に樹木等では流出した有害物質による生存率の
低下が顕著である。また、植物材料から表皮を剥離する
方法は、操作に手間が掛かる上に、操作に熟練を要す
る。
【０００３】従って、本発明の目的は、疎水性の高い植
物材料から、生存状態の植物プロトプラストを高収率で
取得することができ、しかも簡便に実施することのでき
る植物プロトプラストの単離方法を提供することにあ
る。
物材料から、生存状態の植物プロトプラストを高収率で
取得することができ、しかも簡便に実施することのでき
る植物プロトプラストの単離方法を提供することにあ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、疎水性の高い
植物材料に、界面活性剤の存在下に、プロトプラスト単
離酵素を作用させ、次いで、該植物材料からプロトプラ
ストを分離することを特徴とする植物プロトプラストの
単離方法を提供することにより、上記の目的を達成した
ものである。
植物材料に、界面活性剤の存在下に、プロトプラスト単
離酵素を作用させ、次いで、該植物材料からプロトプラ
ストを分離することを特徴とする植物プロトプラストの
単離方法を提供することにより、上記の目的を達成した
ものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明をその好ましい実施
形態に基づいて詳細に説明する。本発明で用いる植物材
料は、疎水性の高い植物材料であり、例えば、毛やワッ
クス成分が表面に存在する植物組織が挙げられる。尚、
表面が疎水性であり、プロトプラスト単離酵素をそのま
ま作用させても、内部に酵素が作用しにくいものは、疎
水性の高い植物材料である。
形態に基づいて詳細に説明する。本発明で用いる植物材
料は、疎水性の高い植物材料であり、例えば、毛やワッ
クス成分が表面に存在する植物組織が挙げられる。尚、
表面が疎水性であり、プロトプラスト単離酵素をそのま
ま作用させても、内部に酵素が作用しにくいものは、疎
水性の高い植物材料である。
【０００６】本発明は、特に植物の葉からプロトプラス
トを単離する場合に適しており、センダン科、クマツヅ
ラ科等の木本植物やウリ科、ナス科等の草本植物の葉か
らプロトプラストを単離する場合に特に効果が顕著であ
る。植物材料としては、植物の苗木、成木、無菌培養物
等から採取したものを用いることができる。採取した植
物材料のうち、非無菌であるものは、通常の方法に従っ
て、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸
化水素水あるいは塩化水銀（昇汞水）等を用いて表面殺
菌を行い、滅菌水で洗浄後、材料として用いることがで
きる。無菌材料は、殺菌をせず使用することができる。
トを単離する場合に適しており、センダン科、クマツヅ
ラ科等の木本植物やウリ科、ナス科等の草本植物の葉か
らプロトプラストを単離する場合に特に効果が顕著であ
る。植物材料としては、植物の苗木、成木、無菌培養物
等から採取したものを用いることができる。採取した植
物材料のうち、非無菌であるものは、通常の方法に従っ
て、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸
化水素水あるいは塩化水銀（昇汞水）等を用いて表面殺
菌を行い、滅菌水で洗浄後、材料として用いることがで
きる。無菌材料は、殺菌をせず使用することができる。
【０００７】酵素処理時に存在させる界面活性剤として
は、非イオン系界面活性剤が好ましく、特にソルビタン
脂肪酸エステル系の界面活性剤が好ましい。ソルビタン
脂肪酸エステル系の界面活性剤としては、例えば、モノ
ラウリン酸エステル、モノパルミチン酸エステル、モノ
ステアリン酸エステル等のＳｐａｎ系や、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンセスキ
オレエート等の、Ｓｐａｎ系に酸化エチレン基を付加し
たＴｗｅｅｎ系、その他、Ｍｙｒｊ系、Ｂｒｉｊ系等が
挙げられる。これらの中でも親水性が高いＴｗｅｅｎ
系、特にポリオキシエチレンソルビタンモノオレートが
特に好ましい。
は、非イオン系界面活性剤が好ましく、特にソルビタン
脂肪酸エステル系の界面活性剤が好ましい。ソルビタン
脂肪酸エステル系の界面活性剤としては、例えば、モノ
ラウリン酸エステル、モノパルミチン酸エステル、モノ
ステアリン酸エステル等のＳｐａｎ系や、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンセスキ
オレエート等の、Ｓｐａｎ系に酸化エチレン基を付加し
たＴｗｅｅｎ系、その他、Ｍｙｒｊ系、Ｂｒｉｊ系等が
挙げられる。これらの中でも親水性が高いＴｗｅｅｎ
系、特にポリオキシエチレンソルビタンモノオレートが
特に好ましい。
【０００８】また、界面活性剤は、ＨＬＢ（親水性親油
性バランス）が３．０〜５．０が好ましく、３．５〜
４．５がより好ましく、特に４．０〜４．５が好まし
い。界面活性剤は、一種を単独で又は二種以上を組み合
わせて使用することができる。
性バランス）が３．０〜５．０が好ましく、３．５〜
４．５がより好ましく、特に４．０〜４．５が好まし
い。界面活性剤は、一種を単独で又は二種以上を組み合
わせて使用することができる。
【０００９】本発明で用いるプロトプラスト単離酵素と
しては、プロトプラストの単離に用いられる各種公知の
酵素を特に制限なく用いることができ、例えばセルラー
ゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ及びこれらの二種以
上の混合物等を用いることができる。
しては、プロトプラストの単離に用いられる各種公知の
酵素を特に制限なく用いることができ、例えばセルラー
ゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ及びこれらの二種以
上の混合物等を用いることができる。
【００１０】プロトプラスト単離酵素は、細胞の死滅を
防止するため、適正な浸透圧に維持された溶液中で作用
させる必要があるが、その浸透圧調節溶液としては、植
物プロトプラストの培養に用いられる各種公知の浸透圧
調節溶液を特に制限なく用いることができる。例えば、
糖の水溶液が好ましく、糖としては、マンニトール、ソ
ルビトール等が挙げられ、糖濃度は０．４〜１．０Ｍが
好ましい。
防止するため、適正な浸透圧に維持された溶液中で作用
させる必要があるが、その浸透圧調節溶液としては、植
物プロトプラストの培養に用いられる各種公知の浸透圧
調節溶液を特に制限なく用いることができる。例えば、
糖の水溶液が好ましく、糖としては、マンニトール、ソ
ルビトール等が挙げられ、糖濃度は０．４〜１．０Ｍが
好ましい。
【００１１】＜前処理＞疎水性の高い植物材料は、プロ
トプラスト単離酵素を作用させる前に、界面活性剤を含
有する浸透圧調節溶液中に所定時間に浸漬しておくこと
が好ましい。酵素処理に先立ち、斯かる前処理を行うこ
とで、酵素処理の際に、植物材料に対して酵素を迅速且
つ効果的に作用させることができる。前処理の時間は３
０〜２４０分、特に３０〜１２０分程度であることが好
ましい。
トプラスト単離酵素を作用させる前に、界面活性剤を含
有する浸透圧調節溶液中に所定時間に浸漬しておくこと
が好ましい。酵素処理に先立ち、斯かる前処理を行うこ
とで、酵素処理の際に、植物材料に対して酵素を迅速且
つ効果的に作用させることができる。前処理の時間は３
０〜２４０分、特に３０〜１２０分程度であることが好
ましい。
【００１２】前処理に用いる界面活性剤としては、酵素
処理時に用いるものと同様のものを用いることができ、
その界面活性剤の濃度は、界面活性剤を含有する浸透圧
調節溶液の全量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）であるこ
とが好ましい。界面活性剤を含有する浸透圧調節溶液
は、マンニトール、ソルビトール等の糖溶液、特に濃度
０．４〜１．０Ｍの糖溶液であることが好ましい。
処理時に用いるものと同様のものを用いることができ、
その界面活性剤の濃度は、界面活性剤を含有する浸透圧
調節溶液の全量に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）であるこ
とが好ましい。界面活性剤を含有する浸透圧調節溶液
は、マンニトール、ソルビトール等の糖溶液、特に濃度
０．４〜１．０Ｍの糖溶液であることが好ましい。
【００１３】＜酵素処理＞酵素処理は、疎水性の高い植
物材料に、界面活性剤の存在下に、プロトプラスト単離
酵素を作用させて行う。具体的には、界面活性剤及びプ
ロトプラスト単離酵素を含有する浸透圧調節溶液（以
下、酵素処理用液という場合がある）中に、植物材料を
浸漬させ、プロトプラスト単離酵素を作用させる。界面
活性剤の存在下にプロトプラスト単離酵素を作用させる
ことにより、植物材料の表面が疎水性であっても、内部
に酵素を容易に浸透させることができ、植物材料の表皮
を剥離したり、植物材料を細かく切断することなく、容
易にプロトプラストを生成及び分離させることが可能で
ある。
物材料に、界面活性剤の存在下に、プロトプラスト単離
酵素を作用させて行う。具体的には、界面活性剤及びプ
ロトプラスト単離酵素を含有する浸透圧調節溶液（以
下、酵素処理用液という場合がある）中に、植物材料を
浸漬させ、プロトプラスト単離酵素を作用させる。界面
活性剤の存在下にプロトプラスト単離酵素を作用させる
ことにより、植物材料の表面が疎水性であっても、内部
に酵素を容易に浸透させることができ、植物材料の表皮
を剥離したり、植物材料を細かく切断することなく、容
易にプロトプラストを生成及び分離させることが可能で
ある。
【００１４】界面活性剤の含有量は、酵素処理用液の全
量中１〜１０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。ま
た、プロトプラスト単離酵素の含有量は、酵素処理用液
の全量中０．１〜３％（ｖ／ｖ）であることが好まし
い。酵素処理の条件は、処理時間が３〜２４時間が好ま
しく、処理温度が１５〜３０℃が好ましく、また、攪拌
せずに行うことが好ましい。尚、酵素処理は、前処理に
用いた溶液とは別の溶液中に移し替えて行っても良い
し、前処理に用いた溶液に酵素を添加して行っても良
い。
量中１〜１０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。ま
た、プロトプラスト単離酵素の含有量は、酵素処理用液
の全量中０．１〜３％（ｖ／ｖ）であることが好まし
い。酵素処理の条件は、処理時間が３〜２４時間が好ま
しく、処理温度が１５〜３０℃が好ましく、また、攪拌
せずに行うことが好ましい。尚、酵素処理は、前処理に
用いた溶液とは別の溶液中に移し替えて行っても良い
し、前処理に用いた溶液に酵素を添加して行っても良
い。
【００１５】＜分離処理＞酵素処理後、植物材料からプ
ロトプラストを分離する。本発明においては、酵素処理
を行った液中で、植物材料からプロトプラストを分離し
ても良いが、酵素処理後の植物材料を、界面活性剤及び
プロトプラスト単離酵素を含有しない浸透圧調節溶液に
移し、該浸透圧調節溶液中でプロトプラストを分離する
ことが好ましい。界面活性剤を含有しない溶液中に移し
替えてから分離することにより、界面活性剤による生存
率の低下を防止することができる。分離処理の際に用い
る浸透圧調節溶液としては、例えば植物プロトプラスト
の培養に用いられる各種公知の浸透圧調節溶液を特に制
限なく用いることができ、マンニトール、ソルビトール
等の糖溶液、特に濃度０．４〜１．０Ｍの糖溶液である
ことが好ましい。
ロトプラストを分離する。本発明においては、酵素処理
を行った液中で、植物材料からプロトプラストを分離し
ても良いが、酵素処理後の植物材料を、界面活性剤及び
プロトプラスト単離酵素を含有しない浸透圧調節溶液に
移し、該浸透圧調節溶液中でプロトプラストを分離する
ことが好ましい。界面活性剤を含有しない溶液中に移し
替えてから分離することにより、界面活性剤による生存
率の低下を防止することができる。分離処理の際に用い
る浸透圧調節溶液としては、例えば植物プロトプラスト
の培養に用いられる各種公知の浸透圧調節溶液を特に制
限なく用いることができ、マンニトール、ソルビトール
等の糖溶液、特に濃度０．４〜１．０Ｍの糖溶液である
ことが好ましい。
【００１６】酵素処理後の植物材料からプロトプラスト
を分離するには、例えば浸透圧調節溶液中において、植
物材料の表面（例えば葉の表面）に、ピンセット等を用
いて数個の微小な穴を開ける。これにより、植物材料の
内部に生成したプロトプラストが無傷のまま溶液中に遊
離し、生存状態のプロトプラストを効率よく単離するこ
とができる。植物材料からプロトプラストを分離する方
法としては、プロトプラストにダメージを与えない方法
であれば特に制限されず、例えば表面に数個の微小な穴
を開けるのに代えて、葉の一部分を切断したり、葉の中
央部に大きめの穴を１つ開ける等の方法を用いても良
い。
を分離するには、例えば浸透圧調節溶液中において、植
物材料の表面（例えば葉の表面）に、ピンセット等を用
いて数個の微小な穴を開ける。これにより、植物材料の
内部に生成したプロトプラストが無傷のまま溶液中に遊
離し、生存状態のプロトプラストを効率よく単離するこ
とができる。植物材料からプロトプラストを分離する方
法としては、プロトプラストにダメージを与えない方法
であれば特に制限されず、例えば表面に数個の微小な穴
を開けるのに代えて、葉の一部分を切断したり、葉の中
央部に大きめの穴を１つ開ける等の方法を用いても良
い。
【００１７】
＜植物材料の準備＞インドネシアから入手したコーキセ
ンダン（Azadirachta excelsa ）の苗木(高さ０．２〜
０．５ｍ) から無菌植物体を再生させ、その無菌植物体
から植物材料としての葉を採取した。葉は、展開直後の
幼葉と展開後２ヶ月経過した成葉を採取し、幼葉と成葉
のそれぞれに以下の操作を行った。尚、苗木から無菌植
物体を再生する方法は、例えば本出願人の出願に係る特
開２０００−１６６４１０号公報に記載されている。
ンダン（Azadirachta excelsa ）の苗木(高さ０．２〜
０．５ｍ) から無菌植物体を再生させ、その無菌植物体
から植物材料としての葉を採取した。葉は、展開直後の
幼葉と展開後２ヶ月経過した成葉を採取し、幼葉と成葉
のそれぞれに以下の操作を行った。尚、苗木から無菌植
物体を再生する方法は、例えば本出願人の出願に係る特
開２０００−１６６４１０号公報に記載されている。
【００１８】＜前処理＞採取後の葉（０．２ｇ）を、切
削等による傷をつけずに、浸透圧調節溶液中に１時間浸
漬した。浸透圧調節溶液としては、０．８Ｍマンニトー
ル溶液を用いた。これに、界面活性剤として、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノオレート（商品名「Ｔｗｅｅ
ｎ８０」，関東化学社，ＨＬＢ４．３）を１％（ｗ／
ｖ）添加した。この浸透圧処理は２６±２℃、暗黒下で
行った。
削等による傷をつけずに、浸透圧調節溶液中に１時間浸
漬した。浸透圧調節溶液としては、０．８Ｍマンニトー
ル溶液を用いた。これに、界面活性剤として、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノオレート（商品名「Ｔｗｅｅ
ｎ８０」，関東化学社，ＨＬＢ４．３）を１％（ｗ／
ｖ）添加した。この浸透圧処理は２６±２℃、暗黒下で
行った。
【００１９】＜酵素処理＞前処理後の葉を酵素処理用液
に移し入れ、２４時間酵素処理を行った。酵素処理用液
としては、セルラーゼ・オノズカＲＳ（商品名，ヤクル
ト薬品工業社）、ドリセラーゼ（商品名，協和醗酵工業
社）、ヘミセルラーゼ（商品名，ＳＩＧＭＡ社）、マセ
ロザイム（商品名，ヤクルト薬品工業社）を、各々１
％、２％、２％、１％となるように０. ８Ｍマンニトー
ル溶液に溶解し、更に、界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ
８０を１％（ｗ／ｖ）添加したものを用いた。酵素処理
は２６±２℃、暗黒下で行った。
に移し入れ、２４時間酵素処理を行った。酵素処理用液
としては、セルラーゼ・オノズカＲＳ（商品名，ヤクル
ト薬品工業社）、ドリセラーゼ（商品名，協和醗酵工業
社）、ヘミセルラーゼ（商品名，ＳＩＧＭＡ社）、マセ
ロザイム（商品名，ヤクルト薬品工業社）を、各々１
％、２％、２％、１％となるように０. ８Ｍマンニトー
ル溶液に溶解し、更に、界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ
８０を１％（ｗ／ｖ）添加したものを用いた。酵素処理
は２６±２℃、暗黒下で行った。
【００２０】＜分離処理＞酵素処理後の植物材料を、界
面活性剤及びプロトプラスト単離酵素を含有しない浸透
圧調節溶液中に移し入れ、該浸透圧調節溶液中で、植物
材料からプロトプラストを分離した。浸透圧調節溶液と
しては、０．８Ｍマンニトール溶液を用いた。植物材料
からのプロトプラストの分離は、ピンセットを用いて葉
の表面に数個の微小な穴を開け、植物材料の内部のプロ
トプラストを溶液中に遊離させた。遊離したプロトプラ
ストのみを遠心分離により回収し、集めたプロトプラス
トを０．８Ｍマンニトール溶液２ｍｌ中に再度分散させ
た。
面活性剤及びプロトプラスト単離酵素を含有しない浸透
圧調節溶液中に移し入れ、該浸透圧調節溶液中で、植物
材料からプロトプラストを分離した。浸透圧調節溶液と
しては、０．８Ｍマンニトール溶液を用いた。植物材料
からのプロトプラストの分離は、ピンセットを用いて葉
の表面に数個の微小な穴を開け、植物材料の内部のプロ
トプラストを溶液中に遊離させた。遊離したプロトプラ
ストのみを遠心分離により回収し、集めたプロトプラス
トを０．８Ｍマンニトール溶液２ｍｌ中に再度分散させ
た。
【００２１】＜全細胞数，生存細胞数の測定＞得られた
プロトプラスト含有液中の細胞数（非生存細胞を含む）
を、以下の方法により測定し、その結果を表１に示し
た。 細胞数の測定方法；プロトプラスト含有液１０μｌを採
取し、血球計算盤（改良ノイバウエル血球計算盤）に流
し込み、顕微鏡下で細胞数をカウントした。尚、１ｍｌ
中に含まれる細胞数は、カウント数を基に、次の計算式
により算出した。 細胞数／ｍｌ＝カウント数×１０4 また、プロトプラスト含有液中の生存細胞数を、以下の
方法により測定し、その結果を、細胞生存率（％）
〔（生存細胞数／全細胞数）×１００〕と共に、表１に
示した。 生存細胞数の測定方法；プロトプラスト含有液１０μｌ
と２％ＦＤＡ染色液１０μｌを混合させた後、混合液１
０μｌを採取し、血球計算盤（改良ノイバウエル血球計
算盤）に流し込み、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
更に、励起発光させ、発光している細胞（生存細胞）の
みをカウントした。細胞数／ｍｌの算出式は同上であ
る。
プロトプラスト含有液中の細胞数（非生存細胞を含む）
を、以下の方法により測定し、その結果を表１に示し
た。 細胞数の測定方法；プロトプラスト含有液１０μｌを採
取し、血球計算盤（改良ノイバウエル血球計算盤）に流
し込み、顕微鏡下で細胞数をカウントした。尚、１ｍｌ
中に含まれる細胞数は、カウント数を基に、次の計算式
により算出した。 細胞数／ｍｌ＝カウント数×１０4 また、プロトプラスト含有液中の生存細胞数を、以下の
方法により測定し、その結果を、細胞生存率（％）
〔（生存細胞数／全細胞数）×１００〕と共に、表１に
示した。 生存細胞数の測定方法；プロトプラスト含有液１０μｌ
と２％ＦＤＡ染色液１０μｌを混合させた後、混合液１
０μｌを採取し、血球計算盤（改良ノイバウエル血球計
算盤）に流し込み、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
更に、励起発光させ、発光している細胞（生存細胞）の
みをカウントした。細胞数／ｍｌの算出式は同上であ
る。
【００２２】＜比較例＞実施例において、前処理及び酵
素処理で用いた溶液中に界面活性剤を添加しない以外
は、実施例と同様にしてプロトプラストを単離した。実
施例と同様にして、細胞数及び生存細胞数を測定し、そ
の結果を、細胞生存率と共に表１に示した。
素処理で用いた溶液中に界面活性剤を添加しない以外
は、実施例と同様にしてプロトプラストを単離した。実
施例と同様にして、細胞数及び生存細胞数を測定し、そ
の結果を、細胞生存率と共に表１に示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】表１の結果から明らかなように、界面活性
剤添加区では、細胞収量（全細胞数）及び生存細胞数の
何れもが無添加区に比べて多く、本発明によれば、生存
状態のプロトプラストを高収率で容易に取得することが
できることが判る。
剤添加区では、細胞収量（全細胞数）及び生存細胞数の
何れもが無添加区に比べて多く、本発明によれば、生存
状態のプロトプラストを高収率で容易に取得することが
できることが判る。
【００２５】
【発明の効果】本発明の植物プロトプラストの単離方法
によれば、疎水性の高い植物材料から、生存状態の植物
プロトプラストを高収率で取得することができ、疎水性
の高い植物材料しか得られない植物についてのプロトプ
ラスト培養や、細胞融合法、遺伝子導入法等による効率
的な育種が可能となる。また、本発明の植物プロトプラ
ストの単離方法によれば、簡単な操作で、熟練を要さず
に、簡便に、生存状態の植物プロトプラストを高収率で
取得することができる。
によれば、疎水性の高い植物材料から、生存状態の植物
プロトプラストを高収率で取得することができ、疎水性
の高い植物材料しか得られない植物についてのプロトプ
ラスト培養や、細胞融合法、遺伝子導入法等による効率
的な育種が可能となる。また、本発明の植物プロトプラ
ストの単離方法によれば、簡単な操作で、熟練を要さず
に、簡便に、生存状態の植物プロトプラストを高収率で
取得することができる。
Claims (6)
- 【請求項１】 疎水性の高い植物材料に、界面活性剤の
存在下に、プロトプラスト単離酵素を作用させ、次い
で、該植物材料からプロトプラストを分離することを特
徴とする植物プロトプラストの単離方法。 - 【請求項２】 前記植物材料は、植物の葉である請求項
１記載の植物プロトプラストの単離方法。 - 【請求項３】 酵素処理前の前記植物材料を、界面活性
剤を含有する浸透圧調節溶液中に所定時間に浸漬する請
求項１又は２記載の植物プロトプラストの単離方法。 - 【請求項４】 酵素処理後の前記植物材料を、界面活性
剤及びプロトプラスト単離酵素を含有しない浸透圧調節
溶液中に移し、該浸透圧調節溶液中でプロトプラストを
分離する請求項１〜３の何れかに記載の植物プロトプラ
ストの単離方法。 - 【請求項５】 前記界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エ
ステル系の界面活性剤である請求項１〜４の何れかに記
載の植物プロトプラストの単離方法。 - 【請求項６】 前記界面活性剤は、ＨＬＢが３．５〜
４．５である請求項１〜５の何れかに記載の植物プロト
プラストの単離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001086706A JP2002281961A (ja) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | 植物プロトプラストの単離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001086706A JP2002281961A (ja) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | 植物プロトプラストの単離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002281961A true JP2002281961A (ja) | 2002-10-02 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001086706A Pending JP2002281961A (ja) | 2001-03-26 | 2001-03-26 | 植物プロトプラストの単離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002281961A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107267436A (zh) * | 2017-07-04 | 2017-10-20 | 西北大学 | 一种千层塔叶片原生质体的制备方法 |
-
2001
- 2001-03-26 JP JP2001086706A patent/JP2002281961A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107267436A (zh) * | 2017-07-04 | 2017-10-20 | 西北大学 | 一种千层塔叶片原生质体的制备方法 |
| CN107267436B (zh) * | 2017-07-04 | 2021-07-13 | 西北大学 | 一种千层塔叶片原生质体的制备方法 |
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