JP2002272461A - Method for screening cell having protein processing activity - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、蛋白質切
断活性（プロセッシング活性）を有する細胞のスクリー
ニング方法とこの方法により特定された細胞に関するも
のである。さらに詳しくは、この出願の発明は、生体内
で発現している蛋白質に対して特異的なプロセッシング
活性を有する細胞を特定するためのスクリーニング方法
と、この方法によって特定された細胞に関するものであ
る。TECHNICAL FIELD The invention of this application relates to a method for screening cells having a protein-cleaving activity (processing activity) and cells identified by this method. More specifically, the invention of this application relates to a screening method for specifying a cell having a specific processing activity for a protein expressed in a living body, and a cell specified by this method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】細胞の染色体DNAから産生される蛋白質
は細胞の内外で様々な修飾を受け、生理活性を持つ場合
がある。そのような修飾の一つとして蛋白質の切断（プ
ロセッシング）があり、染色体DNAから産生された全長
蛋白質が切断酵素（プロセッシング酵素）によって選択
的に切断され、部分蛋白質として特有な生理活性を発揮
するようになる。2. Description of the Related Art In some cases, proteins produced from chromosomal DNA of a cell undergo various modifications inside and outside the cell and have a physiological activity. One such modification is protein cleavage (processing), in which the full-length protein produced from chromosomal DNA is selectively cleaved by a cleavage enzyme (processing enzyme) to exert a unique physiological activity as a partial protein. become.
【０００３】このような蛋白質の切断は、生理的条件に
おいてのみならず、多くの病理学的条件においても重要
な役割を果たしている。例えば、ハンチントン病、マシ
ャド−ジョセフ病（Machado-Joseph diaease：MJD）、
球脊髄性筋萎縮症等の遺伝性神経変性疾患は、ポリグル
タミンをコードする長いCAG反復を有する蛋白質によっ
て引き起こされることが知られており（文献1-3）、そ
れ故に「ポリグルタミン病」と呼ばれている（文献4、
5）。この出願の発明者らは、MJDの原因遺伝子であるMJ
D遺伝子を単離し（文献2）、その遺伝子産物であるMJD
蛋白質の全長においてではなく、蛋白質フラグメントの
一部としてポリグルタミンが発現した場合に、それらが
凝集して培養細胞に細胞死を生じさせ、in vivoではト
ランスジェニックマウスに神経変性を誘導することを証
明した（文献7）。このことは、MJD遺伝子から産生され
たMJD蛋白質が発現後に切断されること、そしてそのMJD
蛋白質に対してプロセッシング活性を有する細胞が生体
内に存在することを明確に示している。また、他のポリ
グルタミン病においても、同様に原因蛋白質の限定分解
がその発病の原因であると考えられ、そのプロセッシン
グ活性を有する細胞の存在を強く示唆する。[0003] Such cleavage of proteins plays an important role not only in physiological conditions but also in many pathological conditions. For example, Huntington's disease, Machado-Joseph disease (MJD),
Hereditary neurodegenerative diseases such as spinal and bulbar muscular atrophy are known to be caused by proteins with long CAG repeats that encode polyglutamine (References 1-3), and are therefore referred to as "polyglutamine diseases". (Ref. 4,
Five). The inventors of the present application propose that MJD
The D gene was isolated (Reference 2) and its gene product, MJD
Demonstrates that when polyglutamine is expressed as part of a protein fragment rather than the full length of the protein, they aggregate and cause cell death in cultured cells, inducing neurodegeneration in transgenic mice in vivo (Reference 7). This means that the MJD protein produced from the MJD gene is cleaved after expression, and that the MJD
This clearly shows that cells having a processing activity for the protein exist in the living body. Similarly, in other polyglutamine diseases, limited degradation of the causative protein is considered to be the cause of the pathogenesis, strongly suggesting the presence of cells having the processing activity.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、MJDや
他のポリグルタミン病における原因蛋白質の切断のメカ
ニズムを解明することは、その発病の危険性の診断法
や、あるいは治療法、治療薬を開発するうえで極めて重
要である。しかしながら、そのような蛋白質のin vivo
における切断活性は微弱であるため、分析することが極
めて困難である。そこで、標的となる蛋白質に対して特
異的なプロセッシング活性を有する細胞を特定すること
ができれば、蛋白質切断メカニズムを解明するための有
効な手段となることが期待されるが、そのような細胞を
特定する方法も従来は全く存在していなかった。As described above, elucidation of the mechanism of cleavage of the causative protein in MJD and other polyglutamine diseases requires a method of diagnosing the risk of the onset of the disease, or a method of treatment or a therapeutic agent. It is extremely important for development. However, in vivo of such proteins
Is very difficult to analyze because its cleavage activity is weak. Therefore, the identification of cells having specific processing activity for the target protein is expected to be an effective means for elucidating the protein cleavage mechanism. Conventionally, there has been no method for performing such a method.
【０００５】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、ポリグルタミン病原因蛋白質等
の標的蛋白質に対して特異的なプロセッシング活性を有
する細胞を確実に特定することのできる新しい細胞スク
リーニング方法を提供することを課題としている。The present invention has been made in view of the above circumstances, and can reliably identify cells having a processing activity specific to a target protein such as a polyglutamine disease-causing protein. It is an object to provide a new cell screening method.
【０００６】また、この発明は、前記のスクリーニング
方法によって特定された細胞を提供することを課題とし
てもいる。Another object of the present invention is to provide a cell identified by the above-mentioned screening method.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決する発明として、標的蛋白質に対する切断活性を
有する細胞をスクリーニングする方法であって、以下の
ステップ、(i) 以下の２つのDNAを細胞内に導入するス
テップ、(a) 標的蛋白質をコードするDNAの一端に膜貫
通蛋白質の膜貫通領域をコードするDNAを、他端には転
写活性化因子をコードするDNAを連結した融合DNA；およ
び(b) 転写活性化因子に応答するプロモーター配列を
コードするDNAと、薬剤に対する耐性遺伝子をコードす
るDNAとを連結したDNA、(ii) この細胞を前記薬剤耐性
遺伝子が抵抗性を示す薬剤を含む培地で培養し、薬剤耐
性を示す細胞を選択するステップ、を有することを特徴
とする細胞スクリーニング方法を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for screening cells having a cleavage activity for a target protein, comprising the following steps: A) a fusion DNA in which DNA encoding the transmembrane region of the transmembrane protein is linked to one end of the DNA encoding the target protein, and DNA encoding the transcriptional activator is linked to the other end. And (b) a DNA obtained by ligating a DNA encoding a promoter sequence responsive to a transcriptional activator and a DNA encoding a resistance gene to a drug, and (ii) a drug exhibiting resistance to the cells by the drug resistance gene. And selecting cells exhibiting drug resistance by culturing in a medium containing the following.
【０００８】またこの出願の発明は、前記発明のスクリ
ーニング方法によって特定された細胞を提供する。以
下、この出願の発明についてその実施形態を詳しく説明
する。[0008] The invention of this application also provides a cell specified by the screening method of the invention. Hereinafter, embodiments of the invention of this application will be described in detail.
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】この発明の細胞スクリーニング方
法は、細胞の持つ弱い蛋白質プロセッシング活性を強い
転写活性に転換し、それによって発現される薬剤耐性を
指標として目的の細胞を特定することを特徴としてい
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The cell screening method of the present invention is characterized in that a weak protein processing activity of a cell is converted into a strong transcriptional activity, and a target cell is specified using the drug resistance expressed thereby as an index. I have.
【００１０】具体的には、この発明の細胞スクリーニン
グ方法は以下の２段階のステップからなっている。 ステップ(i)： 目的とするプロセッシング活性を有す
ると想定される候補細胞へのDNA(a)(b)の導入 融合DNA(a)は、標的蛋白質をコードするDNAの両端に、
膜貫通蛋白質の膜貫通領域をコードするDNAと転写活性
化因子をコードするDNAを連結した融合DNAである。[0010] Specifically, the cell screening method of the present invention comprises the following two steps. Step (i): Introduction of DNA (a) (b) into Candidate Cells Presumed to Have Desired Processing Activity The fusion DNA (a) is located at both ends of the DNA encoding the target protein.
It is a fusion DNA in which DNA encoding a transmembrane region of a transmembrane protein and DNA encoding a transcriptional activator are linked.
【００１１】標的蛋白質は、ポリグルタミン病の原因遺
伝子産物である蛋白質の他、生体内でのプロセッシング
によって生理活性を有するような蛋白質の全てを対象と
することができる。それらの蛋白質をコードするDNA
は、それぞれの公知のcDNAを用いることができる。ま
た、cDNAが未知の蛋白質については、蛋白質の部分アミ
ノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして既存のcDNAライブラリーを公知の方法により
スクリーニングすることによって、目的とする標的蛋白
質をコードするDNAを得ることができる。[0011] The target protein may be any protein that has a biological activity by processing in vivo, in addition to the protein that is the product of the gene responsible for polyglutamine disease. DNA encoding those proteins
For each, known cDNAs can be used. Further, for a protein whose cDNA is unknown, the DNA encoding the target protein of interest can be obtained by screening an existing cDNA library by a known method using an oligonucleotide synthesized based on the partial amino acid sequence of the protein as a probe. Obtainable.
【００１２】膜貫通蛋白質の膜貫通領域をコードするDN
Aとしては、ポンプ蛋白質、トランスポーター、イオン
チャンネル、受容体蛋白質、膜構造蛋白質等として知ら
れている公知の膜貫通蛋白質のcDNAから、その膜貫通ド
メインを構成するDNA部分を単離して用いることができ
る。目的とするDNA部分を単離するためには、全長cDNA
クローンの制限酵素による切断や、PCR増幅等を用いる
ことができる。[0012] DN encoding a transmembrane region of a transmembrane protein
As A, a DNA portion constituting a transmembrane domain is isolated from cDNA of a known transmembrane protein known as a pump protein, a transporter, an ion channel, a receptor protein, a membrane structural protein, and the like, and used. Can be. In order to isolate the target DNA portion, a full-length cDNA
Cleavage of the clone with restriction enzymes, PCR amplification and the like can be used.
【００１３】転写活性化因子は、それが作用するプロモ
ーター配列が既知であるものであれば特段の制限はな
く、公知の転写活性化因子を用いることができるが、転
写活性の強いものが好ましく、さらには哺乳動物の細胞
がもたないものが好ましい。例えば、実施例で例示した
人工転写活性化因子Gal4VP16等を好ましく用いることが
できる。The transcriptional activator is not particularly limited as long as the promoter sequence on which it acts is known, and any known transcriptional activator can be used, but those having strong transcriptional activity are preferable. Further, those having no mammalian cells are preferable. For example, the artificial transcriptional activator Gal4VP16 exemplified in Examples can be preferably used.
【００１４】膜貫通領域をコードするDNAと、転写活性
化因子をコードするDNAは、標的蛋白質をコードするDNA
のいずれの端部に連結してもよい。以上のとおりの融合
DNA断片(a)は、公知の発現ベクターに連結し、公知の方
法（電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、
DEAEデキストラン法等）によって候補細胞にトランスフ
ェクションすることができる。このようにして細胞にト
ランスフェクションされた融合DNA(a)は、膜貫通領域＋
標的蛋白質＋転写活性化因子からなる融合蛋白質を細胞
内で発現する。そして、例えば膜貫通領域をN末端に有
し、転写活性化因子をC末端に有する融合蛋白質は、そ
のN末端部分が細胞膜を貫通して膜に局在する。The DNA encoding the transmembrane region and the DNA encoding the transcriptional activator are the DNA encoding the target protein.
May be connected to either end. Fusion as described above
The DNA fragment (a) is ligated to a known expression vector, and is ligated by a known method (electroporation, calcium phosphate method,
Candidate cells can be transfected by the DEAE dextran method. The fusion DNA (a) transfected into the cells in this manner contains a transmembrane region +
A fusion protein consisting of a target protein and a transcriptional activator is expressed in a cell. Then, for example, in a fusion protein having a transmembrane region at the N-terminus and a transcription activator at the C-terminus, the N-terminal portion penetrates the cell membrane and is localized on the membrane.
【００１５】次に、DNA(b)は、転写活性化因子に応答す
るプロモーター配列をコードするDNAと、薬剤に対する
耐性遺伝子をコードするDNAとを連結した融合DNA断片で
ある。Next, DNA (b) is a fusion DNA fragment in which DNA encoding a promoter sequence responding to a transcription activator and DNA encoding a resistance gene to a drug are linked.
【００１６】プロモーター配列をコードするDNAは、前
記融合DNA(a)に用いた転写活性化因子に対応するプロモ
ーター配列であり、例えば、Gal4VP16転写活性化因子を
用いた場合には、Gal4応答プロモーター配列をコードす
るDNAを使用することができる。また、薬剤に対する耐
性遺伝子は、公知の薬剤耐性遺伝子を特段の制限なく使
用することができる。The DNA encoding the promoter sequence is a promoter sequence corresponding to the transcriptional activator used in the fusion DNA (a). For example, when a Gal4VP16 transcriptional activator is used, a Gal4 responsive promoter sequence is used. Can be used. Known drug resistance genes can be used as the drug resistance gene without any particular limitation.
【００１７】このようなDNA(b)もまた、公知の発現ベク
ターに連結し、公知の方法によって候補細胞にトランス
フェクションすることができる。なお、DNA(a)(b)は、
同時にトランスフェクションしてもよく、あるいはいず
れかの融合DNAを先にトランスフェクションして、その
形質転換細胞を選別し、その形質転換細胞にもう一方の
融合DNAをトランスフェクションするようにしてもよ
い。Such a DNA (b) can also be ligated to a known expression vector and transfected into a candidate cell by a known method. In addition, DNA (a) (b)
The transfection may be performed simultaneously, or any of the fusion DNAs may be transfected first, and the transformed cells may be selected, and the transformed cells may be transfected with the other fusion DNA.
【００１８】DNA(a)(b)をトランスフェクションする候
補細胞は、特段の制限はなく、どのような細胞であって
もよいが、好ましくは、標的蛋白質が機能する組織の細
胞または細胞株を対象とする。 ステップ(ii)： 細胞のスクリーニング 前記のステップ(i)でDNA(a)(b)をトランスフェクション
した細胞を、薬剤耐性遺伝子が抵抗性を示す薬剤を含む
培地で培養し、薬剤耐性を指標として、標的蛋白質に対
してプロセッシング活性を有する細胞を選択する。The candidate cells for transfecting the DNA (a) (b) are not particularly limited and may be any cells. Preferably, cells or cell lines of a tissue in which the target protein functions are used. set to target. Step (ii): Cell screening The cells transfected with the DNA (a) and (b) in the step (i) are cultured in a medium containing a drug whose drug resistance gene is resistant, and the drug resistance is used as an index. Then, a cell having a processing activity for the target protein is selected.
【００１９】すなわち、DNA(a)(b)をトランスフェクシ
ョンした細胞が標的蛋白質に対するプロセッシング活性
を有する場合には、融合DNA(a)から発現する融合蛋白質
の標的蛋白質部分がプロセッシングされ、転写活性化因
子部分を含む蛋白質フラグメントが核内に移行し、DNA
(b)のプロモーター配列に転写活性化因子が結合する。
これによって薬剤耐性遺伝子が発現し、細胞は薬剤耐性
能を獲得する。従って、薬剤耐性を示す細胞は、標的蛋
白質に対してプロセッシング活性を有する細胞が含まれ
ると判定することができる。That is, when the cells transfected with the DNAs (a) and (b) have a processing activity for the target protein, the target protein portion of the fusion protein expressed from the fusion DNA (a) is processed to activate transcription. The protein fragment containing the factor part translocates into the nucleus,
A transcriptional activator binds to the promoter sequence of (b).
As a result, the drug resistance gene is expressed, and the cells acquire drug resistance performance. Therefore, it can be determined that cells exhibiting drug resistance include cells having a processing activity for the target protein.
【００２０】以下、実施例を示してこの出願の発明につ
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。Hereinafter, the invention of this application will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the invention of this application is not limited by the following examples.
【００２１】[0021]
【実施例】1.材料および方法 1.1 蛋白質 以下の蛋白質を使用した。EXAMPLES 1. Materials and Methods 1.1 Protein The following proteins were used.
【００２２】グリーン蛍光タンパク質（GFP）；MJD79
（病理学的長さである79個のポリグルタミン反復を含
み、flag標識した完全長MJD蛋白質[文献2、7、13]）；M
JD35（正常な長さである35個のポリグルタミン反復を含
み、flag標識した完全長MJD蛋白質（[文献2、7、1
3]）；Q79（flag標識したMJD蛋白質からの79個のポリグ
ルタミン配列（[文献2、7、13]）；Hu586-23（23個のポ
リグルタミン反復を含んでいる586アミノ酸長のN末端ハ
ンチンチンフラグメント（文献1）；Hu649-86（86個の
ポリグルタミン反復を含む649アミノ酸長のN末端ハンチ
ンチンフラグメント（文献1）。なお、以下の記載にお
いて、ハイフンで連結された蛋白質は、たとえばMJD79-
GFPおよびGFP-MJD79は、それぞれGFPがMJD79のCおよび
Ｎ末端に融合されていることを示す。 1.2 細胞培養および細胞選択 PC12細胞を文献13の記載に従って培養した。3.2μgのpC
MX-TM-MJD35-Gal4VP16と、0.8μgのpGalRE-MTV-Zeoと
を、TransFAST(プロメガ)を用いて1×106個のPC12細胞
にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日
後に細胞を再播種し、100μg ml-1のゼオシン（Invitro
gen）にて選択し、36個のコロニーを単離して分析し
た。２回目の選択は、400μg ml-1のゼオシンを用いて
行った。 1.3 凝集分析 ７.5×104個のPC12細胞親株および薬剤選択されたサブ
クローンに、1μgのpCMX-MJD79-GFPを6ウェルシャーレ
中にてトランスフェクトした。翌日培養液を交換し、神
経分化を誘導した（文献13）。トランスフェクションの
３、６、９、および12日後に、GFP陽性の生細胞で、凝
集物が観察された細胞数を数えた。約300個のトランス
フェクトした細胞が数えられた。正確を期すため、以上
の手続を少なくとも４回繰返した。 1.4 ウェスタンブロッティング ７.5×104個のPC12細胞親株と、B16よびC10細胞とに、1
μgのpCMX-MJD35-GFP、-MJD79-GFP、-Hu586-23-GFP、ま
たは-Hu649-86-GFPをトランスファストを用いてトラン
スフェクトし、細胞を分化させてトランスフェクション
の６日後に集め、1%トリトンX-100、0.25%デオキシコー
ル酸ナトリウム、0.25 M NaCl、5 mM EDTA、1 mM PMS
F、20 mM-トリス−HCl, pH 7.4を用いて溶解した。10μ
gの細胞溶解物をSDS-PAGE電気泳動し、ウサギの抗GFPポ
リクローナル抗体（MBL）と反応させた。シグナルはECL
システム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて検出
した。 2.結果 2.1 PC12細胞のMJD蛋白質プロセッシング活性 MJD蛋白質のプロセシング活性を有する培養細胞を同定
するため、MJD79を種々の細胞系において発現させ、発
現されたMJD79蛋白質を免疫化学的に調べた（文献2、
7、13）。その結果、分裂細胞にはMJD蛋白質の切断を示
唆するいかなる証拠も認められなかった。しかしなが
ら、MJD79のトランスフェクションの数日後、神経細胞
様に分化したPC12細胞では、約数百個に１個が、その細
胞内においてポリグルタミンを含む凝集物を生ずること
が観察された。これらの凝集物は、MJD蛋白質のポリグ
ルタミン部分のすぐ下流のひと続きのアミノ酸を認識す
る抗体を用いてのみ検出されたが、MJD蛋白質のＮ−末
端に付着されたタグに対する抗体では検出されなかった
（文献13）。MJD79-GFPのトランスエクションに対し
も、その数日後の分化した細胞では同様の頻度で生細胞
中に凝集物の形成が検出されたが、GFP-MJD79では検出
されなかった（図１）。均一のGFPシグナル内に観察さ
れたこれらの凝集物は、Q79-GFPをトランスフェクトし
た細胞で観察されたものと見分けがつかなかった。Green fluorescent protein (GFP); MJD79
(Flag-labeled full-length MJD protein containing 79 polyglutamine repeats of pathological length [Refs. 2, 7, 13]); M
JD35 (flag-labeled full-length MJD protein containing 35 normal-length polyglutamine repeats [Refs. 2, 7, 1
3)); Q79 (79 polyglutamine sequences from flag-labeled MJD protein ([2, 7, 13]); Hu586-23 (586 amino acid long N-terminal containing 23 polyglutamine repeats) Huntingtin fragment (Reference 1); Hu649-86 (N-terminal huntingtin fragment of 649 amino acids containing 86 polyglutamine repeats (Reference 1). In the following description, a hyphen-linked protein is, for example, MJD79-
GFP and GFP-MJD79 indicate that GFP is fused to the C and N termini of MJD79, respectively. 1.2 Cell culture and cell selection PC12 cells were cultured as described in Reference 13. 3.2 μg pC
MX-TM-MJD35-Gal4VP16 and 0.8 μg of pGalRE-MTV-Zeo were transfected into 1 × 10 6 PC12 cells using TransFAST (Promega). Cells were replated 3 days after transfection and 100 μg ml −1 Zeocin (Invitro
gen) and 36 colonies were isolated and analyzed. The second selection was performed using 400 μg ml −1 of zeocin. 1.3 Aggregation Analysis 7.5 × 10 4 PC12 cell parent lines and drug selected subclones were transfected with 1 μg of pCMX-MJD79-GFP in a 6-well dish. The next day, the culture medium was changed to induce nerve differentiation (Reference 13). At 3, 6, 9, and 12 days after transfection, the number of aggregates observed in viable GFP-positive cells was counted. Approximately 300 transfected cells were counted. The procedure was repeated at least four times for accuracy. 1.4 Western Blotting 7.5 × 10 4 PC12 cell parent lines and B16 and C10 cells
μg of pCMX-MJD35-GFP, -MJD79-GFP, -Hu586-23-GFP, or -Hu649-86-GFP were transfected with the transfer, the cells were differentiated and collected 6 days after transfection, 1% Triton X-100, 0.25% sodium deoxycholate, 0.25 M NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMS
F, dissolved using 20 mM Tris-HCl, pH 7.4. 10μ
g of cell lysate was subjected to SDS-PAGE electrophoresis and reacted with rabbit anti-GFP polyclonal antibody (MBL). The signal is ECL
Detection was performed using a system (Amersham Pharmacia Biotech). 2. Results 2.1 MJD protein processing activity of PC12 cells In order to identify cultured cells having MJD protein processing activity, MJD79 was expressed in various cell lines, and the expressed MJD79 protein was examined immunochemically (Reference 2). ,
7, 13). As a result, the dividing cells did not show any evidence for cleavage of the MJD protein. However, several days after transfection with MJD79, it was observed that approximately one in hundreds of PC12 cells that differentiated like neurons produced aggregates containing polyglutamine in their cells. These aggregates were detected only with an antibody that recognized a stretch of amino acids immediately downstream of the polyglutamine portion of the MJD protein, but not with an antibody against a tag attached to the N-terminus of the MJD protein. (Reference 13). Aggregate formation in viable cells was detected at a similar frequency in differentiated cells several days after transfection with MJD79-GFP, but not in GFP-MJD79 (FIG. 1). These aggregates observed within the homogeneous GFP signal were indistinguishable from those observed in cells transfected with Q79-GFP.
【００２３】以上の結果は、PC12の非常に小さい集団が
MJD蛋白質に対するプロセッシング活性を有しており、
またこの活性が非常に弱いために、分裂細胞では切断さ
れたMJD産物が凝集物を形成するに充分な蓄積をしない
ことが示唆された。 2.2 MJD蛋白質に対してプロセッシング活性を有する細
胞の単離 この出願の発明方法を用いて、MJD蛋白質に対してプロ
セッシング活性を有するPC12細胞を単離した。The above results indicate that a very small population of PC12
Has processing activity for MJD protein,
This activity was also very weak, suggesting that cleaved MJD products did not accumulate enough to form aggregates in dividing cells. 2.2 Isolation of cells having processing activity on MJD protein PC12 cells having processing activity on MJD protein were isolated using the method of the present invention.
【００２４】標的蛋白質（MJD蛋白質）としては、その
切断されたフラグメントの凝集物形成による細胞死を避
けるため、正常な長さのポリグルタミンリピートをもつ
MJD35を用いた。また、膜貫通領域としてFasレセプター
の膜貫通ドメイン（TM）（文献15）を、転写活性化因子
としてGal4VP16を用い、融合蛋白質TM-MJD35-Gal4VP16
を発現する融合DNA(a)を作成し、pCMXベクターに組み換
えた。この融合DNA(a)によって細胞内で発現される融合
蛋白質TM-MJD35-Gal4VP16はTM部分が細胞膜を貫通する
ことによって細胞膜に付着されることが免疫学的分析に
より確認された（データは示さず）。The target protein (MJD protein) has a normal length polyglutamine repeat in order to avoid cell death due to the formation of aggregates of the cleaved fragments.
MJD35 was used. In addition, the transmembrane domain of the Fas receptor (TM) (Reference 15) is used as the transmembrane region, and Gal4VP16 is used as the transcriptional activator, and the fusion protein TM-MJD35-Gal4VP16 is used.
Was prepared and recombined into a pCMX vector. Immunological analysis confirmed that the fusion protein TM-MJD35-Gal4VP16 expressed in the cells by this fusion DNA (a) was attached to the cell membrane by the TM moiety penetrating the cell membrane (data not shown). ).
【００２５】一方、DNA(b)の発現系としては、Gal4応答
プロモーター配列の支配下でゼオシン（Zeocin）耐性遺
伝子を発現するGal4レポータープラスミドを用いた。そ
の結果、100μg ml-1のゼオシンを用いた選択によってP
C12細胞のいくつかのサブクローンを取得した（図２
Ａ）。これらのサブクローンのうち、一つのサブクロー
ン（B16）は強いMJDプロセッシング活性を有していた。
このB16細胞においては、MJD79-GFPトランスフェクショ
ンの12日後に、GFP陽性細胞の約7.5%において凝集物が
観察され、このような凝集物陽性の細胞は、やがて数日
後に死滅した。On the other hand, as a DNA (b) expression system, a Gal4 reporter plasmid expressing a Zeocin resistance gene under the control of a Gal4 responsive promoter sequence was used. As a result, P by selection with 100 μg ml -1 zeocin
Several subclones of C12 cells were obtained (Fig. 2
A). Among these subclones, one subclone (B16) had strong MJD processing activity.
In these B16 cells, aggregates were observed in about 7.5% of the GFP positive cells 12 days after MJD79-GFP transfection, and such aggregate positive cells eventually died several days later.
【００２６】このB16細胞を用いて、さらに高い濃度（4
00μg ml-1）のゼオシンによる薬剤選択を繰返し、B16
細胞よりもさらに強いMJDプロセッシング活性を有する
いくつかのサブクローンを単離することに成功した（図
２Ａ）。このようなサブクローンの中で、C10細胞が最
も高いMJDプロセッシング活性を有していた。B16および
C10の両細胞においては、ポリグルタミンを介する凝集
物は時間に依存する様式で増加し（図２Ｂ）、MJD79-GF
Pトランスフェクションの12日後のC10細胞では、GFP陽
性細胞の約24%において凝集物が観察された。この時点
では、多くのGFP陽性の死細胞が培養液中に浮遊してお
り、それはB16細胞におけるよりもさらに著しいことか
ら、凝集物陽性のC10細胞の真のパーセントはさらに高
いであろうと推測される。MJD35-GFPを用いたトランス
フェクションでは、B16およびC10細胞には凝集物形成は
観察されず、GFPのみのトランスフェクションと比較し
た場合の細胞死には差は観られなかった（データは示さ
ず）。 2.3 単離された細胞におけるMJD蛋白質の特異的切断 B16およびC10細胞におけるMJD蛋白質の特異的切断を、
ウェスタンブロッティングにより生化学的に確認した
（図３）。トランスフェクトされた完全長MJD35-GFPお
よびMJD79-GFP蛋白質は、各々65 kDaおよび73 kDaのバ
ンドとして、抗GFP抗体を用いて検出された。これらの
バンドに加えて、B16およびC10細胞からの細胞抽出物
は、MJD35-GFPトランスフェクションでは約40 kDaの、
またMJD79-GFPトランスフェクションでは約46 kDaの付
加的なバンドを示した。ポリグルタミンリピートの長さ
は、これらの細胞におけるMJD蛋白質の切断効率に影響
を及ぼさなかった。Using this B16 cell, a higher concentration (4
The drug selection with zeocin (00 μg ml -1 ) was repeated.
Several subclones with even stronger MJD processing activity than the cells were successfully isolated (FIG. 2A). Among such subclones, C10 cells had the highest MJD processing activity. B16 and
In both C10 cells, polyglutamine-mediated aggregates increased in a time-dependent manner (FIG. 2B) and MJD79-GF
Aggregates were observed in approximately 24% of GFP positive cells in C10 cells 12 days after P transfection. At this point, many GFP-positive dead cells are suspended in culture, which is even more pronounced than in B16 cells, suggesting that the true percentage of aggregate-positive C10 cells would be even higher. . Aggregate formation was not observed in B16 and C10 cells when transfected with MJD35-GFP, and no difference was seen in cell death when compared to transfection with GFP alone (data not shown). 2.3 Specific cleavage of MJD protein in isolated cells Specific cleavage of MJD protein in B16 and C10 cells,
It was confirmed biochemically by Western blotting (FIG. 3). Transfected full-length MJD35-GFP and MJD79-GFP proteins were detected using anti-GFP antibodies as 65 kDa and 73 kDa bands, respectively. In addition to these bands, cell extracts from B16 and C10 cells were approximately 40 kDa for MJD35-GFP transfection,
MJD79-GFP transfection showed an additional band of about 46 kDa. The length of the polyglutamine repeat did not affect the efficiency of cleavage of the MJD protein in these cells.
【００２７】さらに、B16およびC10細胞の蛋白質プロセ
ッシング活性の特異性を検討するため、ハンチントン病
および球脊髄性筋萎縮症の原因となる遺伝子産物である
（それぞれハンチンチンおよびアンドロゲンレセプタ
ー）に対するプロセッシング活性を調べた。その結果、
図３に示したように、B16およびC10細胞では、ハンチン
チンに対するプロセッシング活性は全く観察されなかっ
た。またアンドロゲンレセプターに対するプロセッシン
グ活性も観察されなかった（データは示さず）。これら
の結果からも、B16およびC10細胞における増強されたプ
ロセッシング活性がMJD蛋白質に対して特異的であるこ
とが確認された。また、この発明の細胞スクリーニング
方法が、特定の標的蛋白質に対して強いプロセッシング
活性を有する細胞を選択的にスクリーニング可能である
ことが確認された。Furthermore, in order to examine the specificity of the protein processing activity of B16 and C10 cells, the processing activity for the gene products (huntingtin and androgen receptor, respectively) that are responsible for Huntington's disease and spinal and bulbar muscular atrophy was examined. Examined. as a result,
As shown in FIG. 3, no processing activity against huntingtin was observed in B16 and C10 cells. Also, no processing activity on the androgen receptor was observed (data not shown). These results also confirmed that the enhanced processing activity in B16 and C10 cells was specific for the MJD protein. Further, it was confirmed that the cell screening method of the present invention can selectively screen cells having a strong processing activity for a specific target protein.
【００２８】さらに、切断された産物の大きさからの、
MJD蛋白質の切断部位のおよその算定では、MJD蛋白質は
これらの細胞内では、そのC末端に向かって250番目のア
ミノ酸残基周辺で切断されることが示唆される（文献
2）。大腸菌発現系を用いて合成されたMJD蛋白質のNMR
構造分析に関する発明者らの予備データでは、MJD蛋白
質はそのN末端部分により高次の構造を、またポリグル
タミンの伸長残基があるC末端の付近には比較的自由な
構造を有することが示された。このことと一致して、ト
リプシン処理はMJD蛋白質を、その206番目のリジンの後
ろの単一部位で切断する（文献2）が、このトリプシン
切断部位へのアミノ酸変異の導入によっても、B16およ
びC10細胞ではMJD蛋白質は切断された（データは示さ
ず）。このことは、B16およびC10細胞におけるMJD蛋白
質のプロセッシングは、トリプシンまたはトリプシン様
のプロテアーゼによるものではないことを示している。
従って、この発明方法によって単離された細胞は、MJD
蛋白質に対するプロセシング活性のさらなる特徴づけ
と、まだ未知のMJDプロセッシング酵素の同定に有用で
ることが強く示唆された。Furthermore, from the size of the cleaved product,
Approximate calculations of the cleavage site of the MJD protein suggest that the MJD protein is cleaved in these cells around the 250th amino acid residue toward its C-terminus (literature
2). NMR of MJD protein synthesized using Escherichia coli expression system
Our preliminary data on structural analysis indicate that the MJD protein has a higher-order structure due to its N-terminal part and a relatively free structure near the C-terminal where the polyglutamine extension residue is located. Was done. Consistent with this, trypsin treatment cleaves the MJD protein at a single site after its 206th lysine (Reference 2), but also by introducing amino acid mutations into this trypsin cleavage site, B16 and C10 In cells, the MJD protein was truncated (data not shown). This indicates that processing of the MJD protein in B16 and C10 cells is not due to trypsin or trypsin-like protease.
Therefore, cells isolated by the method of the invention
It was strongly suggested that the protein would be useful for further characterization of the protein's processing activity and for the identification of yet unknown MJD processing enzymes.
【００２９】[0029]
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、生体内でプロセッシングを受ける蛋白質
に対して特異的なプロセッシング活性を有する細胞を高
精度でスクリーニングすることのできる新しい方法が提
供される。この方法によって特定される細胞は、例えば
その細胞が産生する蛋白質切断酵素の単離・精製によ
り、各種の疾患原因蛋白質を切断する活性を阻害するこ
とを薬理機序とする新規薬剤の開発、すなわち蛋白質の
特異的な切断が原因となる疾患に対する治療法や薬剤開
発に有用である。As described in detail above, the invention of this application provides a new method capable of screening cells having a processing activity specific to a protein to be processed in vivo with high precision. . Cells identified by this method can be used for the development of new drugs with a pharmacological mechanism of inhibiting the activity of cleaving various disease-causing proteins, for example, by isolating and purifying protein-cleaving enzymes produced by the cells, It is useful for therapeutic methods and drug development for diseases caused by specific cleavage of proteins.
【００３０】[0030]
1. Cell 72, 971-983 1993. 2. Nat. Genet. 8, 221-228, 1994. 3. Nature 352, 77-79, 1991. 4. Curr. Opin. Neurol. 10, 285-290, 1997. 5. Trend. Genet. 14, 396-402, 1998. 6. Neuron 15, 493-496, 1995. 7. Nat. Genet. 13, 196-202, 1996. 8. Science 277, 1990-1993, 1997. 9. Ann. Neurol. 44. 249-254, 1998. 10.Brain Pathol. 8, 669-679, 1998. 11.Hum. Molec. Genet. 7, 1355-1361, 1998. 12.Neuron 24, 275-286, 1999. 13.Genes Cells 4, 743-756, 1999. 14.Cancer Res. 58, 2282-2287, 1998. 15.Cancer Res. 56, 4164-4170, 1996. 1. Cell 72, 971-983 1993. 2. Nat. Genet. 8, 221-228, 1994. 3. Nature 352, 77-79, 1991. 4. Curr. Opin. Neurol. 10, 285-290, 1997. 5. Trend. Genet. 14, 396-402, 1998. 6. Neuron 15, 493-496, 1995. 7. Nat. Genet. 13, 196-202, 1996. 8. Science 277, 1990-1993, 1997. 9. Ann. Neurol. 44. 249-254, 1998. 10. Brain Pathol. 8, 669-679, 1998. 11. Hum. Molec. Genet. 7, 1355-1361, 1998. 12. Neuron 24, 275. -286, 1999. 13.Genes Cells 4, 743-756, 1999. 14.Cancer Res. 58, 2282-2287, 1998. 15.Cancer Res. 56, 4164-4170, 1996.
【図１】生細胞におけるポリグルタミン凝集物を可視化
した顕微鏡像である。PC12細胞にGFP-MJD79、MJD79-GF
P、およびQ79-GFPをトランスフェクトし、神経細胞様に
分化した生細胞中に発現されたタンパク質を蛍光顕微鏡
により調べた。GFP-MJD79（A）およびMJD79-GFP（B）
は、トランスフェクションの12日後の細胞において細胞
全体に均等に検出された。１％より少ないMJD79-GFPト
ランスフェクト細胞が、トランスフェクションの12日後
に、ポリグルタミンを介する凝集物様GFPシグナルを示
した（C）。Q79-GFPをトランスフェクトした細胞は、ト
ランスフェクションのはや３日後に、すべてのトランス
フェクトした細胞において凝集物を形成した（D）。FIG. 1 is a microscopic image in which a polyglutamine aggregate in a living cell is visualized. GFP-MJD79, MJD79-GF in PC12 cells
Proteins expressed in live cells transfected with P and Q79-GFP and differentiated like neurons were examined by fluorescence microscopy. GFP-MJD79 (A) and MJD79-GFP (B)
Was detected evenly throughout the cells in cells 12 days after transfection. Less than 1% of MJD79-GFP transfected cells showed a polyglutamine-mediated aggregate-like GFP signal 12 days after transfection (C). Cells transfected with Q79-GFP formed aggregates in all transfected cells 3 days after transfection (D).
【図２】MJD蛋白質に対して高いプロセッシング活性を
もつ細胞を単離した結果であり、GFP陽性細胞のうちで
顕在的な凝集物を含んでいる細胞のパーセントである。
トランスフェクションの12日後（A）、およびトランス
フェクションの３、６、９、および12日後（B）に細胞
を検査した。３回の実験の平均値が示されている。バー
はs.d.を示す。グラフ中の白カラムはPC12細胞親株、灰
色カラムはB16細胞、黒カラムはC10細胞である。FIG. 2 is a result of isolating cells having high processing activity against MJD protein, and is the percentage of cells containing a visible aggregate among GFP-positive cells.
Cells were examined 12 days after transfection (A), and 3, 6, 9, and 12 days after transfection (B). The average of three experiments is shown. Bars indicate sd. In the graph, the white column is the parent strain of PC12 cells, the gray column is B16 cells, and the black column is C10 cells.
【図３】MJD35-GFP、MJD79-GFP、Hu586-23-GFP、および
Hu649-86-GFPでそれぞれトランスフェクションした６日
後の、PC12細胞親株（A）、B16、およびC10細胞からの
細胞抽出物のウェスタンブロット分析の結果である。切
断された蛋白質のバンドは矢印で示した。FIG. 3. MJD35-GFP, MJD79-GFP, Hu586-23-GFP, and
FIG. 6 shows the results of Western blot analysis of cell extracts from PC12 cell parental lines (A), B16, and C10 cells 6 days after transfection with Hu649-86-GFP, respectively. The band of the cleaved protein is indicated by an arrow.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 幸男 大阪府吹田市古江台６−２−４ 財団法人 大阪バイオサイエンス研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA07 DA02 EA04 FA02 GA11 HA11 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ79 QR48 QS33 QX02 4B065 AA91X AB01 AC10 BA25 CA24 CA46 ────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (72) Inventor Yukio Yamamoto 6-2-4 Furuedai, Suita-shi, Osaka F-term in Osaka Bioscience Institute (Reference) 4B024 AA11 CA07 DA02 EA04 FA02 GA11 HA11 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ79 QR48 QS33 QX02 4B065 AA91X AB01 AC10 BA25 CA24 CA46
Claims (2)
胞をスクリーニングする方法であって、以下のステッ
プ、(i) 以下の２つのDNAを細胞内に導入するステッ
プ、(a) 標的蛋白質をコードするDNAの一端に膜貫通蛋
白質の膜貫通領域をコードするDNAを、他端には転写活
性化因子をコードするDNAを連結した融合DNA；および
(b) 転写活性化因子に応答するプロモーター配列をコ
ードするDNAと、薬剤に対する耐性遺伝子をコードするD
NAとを連結したDNA、(ii) この細胞を前記薬剤抵抗性
遺伝子が抵抗性を示す薬剤を含む培地で培養し、薬剤耐
性を示す細胞を選択するステップ、を有することを特徴
とする細胞スクリーニング方法。1. A method for screening cells having a cleavage activity for a target protein, comprising the following steps: (i) introducing the following two DNAs into the cells: (a) DNA encoding the target protein A fusion DNA comprising a DNA encoding a transmembrane region of a transmembrane protein and a DNA encoding a transcriptional activator at the other end; and
(b) DNA encoding a promoter sequence responsive to a transcription activator and D encoding a resistance gene to a drug
DNA linked to NA, (ii) culturing the cells in a medium containing a drug in which the drug resistance gene shows resistance, and selecting cells showing drug resistance. Method.
特定された細胞。2. A cell identified by the screening method according to claim 1.
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