JP2002142775A

JP2002142775A - Nucleic acids for detecting fungi belonging to genus candida and method for detecting fungi belonging to genus candida

Info

Publication number: JP2002142775A
Application number: JP2000347184A
Authority: JP
Inventors: Koji Yokoyama; 耕治横山
Original assignee: SSP Co Ltd
Current assignee: SSP Co Ltd
Priority date: 2000-11-14
Filing date: 2000-11-14
Publication date: 2002-05-21
Also published as: WO2002040713A1

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide nucleic acids capable of species-specifically detecting pathogens for deep mycosis, in particular five species of fungi belonging to the genus Candida, i.e., C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, and C. dubliniensis. SOLUTION: Nucleic acids having base sequences for detecting Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, and C. dubliniensis are provided that are comprised of fifteen consecutive bases or more from 3' end in different specific base sequences.

Description

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、５種のカンジダ属
真菌を区別して検出するための核酸及びそれを用いて５
種のカンジダ属真菌を区別して検出する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid for distinguishing and detecting five species of Candida fungi, and a method for detecting nucleic acid using the same.
The present invention relates to a method for distinguishing and detecting Candida species.

【０００２】[0002]

【従来の技術】深在性真菌症の主要な病原菌としては、
カンジダ（Candida、以下C.と略す。）属真菌、アスペ
ルギルス（Aspergillus、以下A.と略す。）属真菌、ク
リプトコッカス（Cryptococcus、以下Cr.と略す。）属
真菌などが知られている。カンジダ属の主要な病原菌と
しては、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、カ
ンジダ・グラブラータ（C. glabrata）、カンジダ・ト
ロピカリス（C. tropicalis）、カンジダ・パラプシロ
ーシス（C. parapsilosis）カンジダ・ドゥブリニエン
シス（C. dubliniensis）などが、クリプトコッカス属
の主要な病原菌としては、クリプトコッカス・ネオフォ
ルマンス（Cr. neoformans）が知られている。アスペル
ギルス属の主要な病原菌としては、アスペルギルス・フ
ミガタス（A.fumigatus）、アスペルギルス・フラバス
（A. flavus）、アスペルギルス・ニガー（A.niger）
およびニガーグループ、アスペルギルス・ニドランス
（A.nidurans）、アスペルギルス・テレウス（A.terreu
s）などがあり、これらの菌種を迅速に検出・分類・同
定することが望まれている。2. Description of the Related Art As a major pathogen of deep mycosis,
Fungi of the genus Candida (hereinafter abbreviated as C.), fungi of the genus Aspergillus (hereinafter abbreviated as A.), fungi of the genus Cryptococcus (hereinafter abbreviated as Cr.) And the like are known. Major pathogens of the genus Candida include C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. tropicalis, C. parapsilosis and C. parabranosis. (C. dubliniensis) and the like are known as major pathogens of the genus Cryptococcus, such as Cryptococcus neoformans. The main pathogens of the genus Aspergillus include Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), Aspergillus flavus (A. flavus), and Aspergillus niger (A. niger).
And the Niger Group, Aspergillus nidurans, A. terreu
s), and it is desired to rapidly detect, classify, and identify these bacterial species.

【０００３】近年、深在性真菌症は免疫不全患者に日和
見感染症として増加しているが、その患者は重篤な基礎
疾患を持つことが多く、早期に起炎菌を明らかにして的
確な治療をすることが必要である。深在性真菌症の診断
は血液培養法が基本であるが検出感度などに問題があ
る。これまでに抗体による診断薬が市販されているが、
抗体による診断は免疫不全状態の患者には役立たない。
このような現状で、近年、抗原やその他の菌体成分を直
接検出する方法が開発されてきている。たとえば、マン
ナン、Ｄ−アラビニトル、グルカンなどを検出して感染
を診断する方法が開発されている。一方、分子生物学の
発展につれて、結核菌やクラミジアなど各種病原菌のＤ
ＮＡを抽出し、いわゆるＰＣＲ法などによって核酸を検
出することによって診断する方法が開発されている。深
在性真菌症の分野でもリボゾームＲＮＡを検出して診断
する方法（臨床病理、４３卷補冊、１１９頁、１９９５
年）などが提示されている。本発明者らは、先にこれら
各種真菌症の原因となる真菌のミトコンドリアに存在す
るチトクロームｂの遺伝子に着目し、アスペルギルス属
真菌を検出するために用いられる核酸を提供し、さらに
それを用いることによる簡便、迅速、特異的かつ高感度
な深在性真菌症の原因菌、さらにはアスペルギルス属真
菌の検出方法を開発した（真菌類の検出用材料及び検出
法、WO98/10073）。[0003] In recent years, deep mycosis has increased as an opportunistic infection in immunodeficient patients, but those patients often have serious underlying illness, and the pathogenic bacterium was clarified at an early stage to make an accurate determination. It is necessary to treat. Diagnosis of deep mycosis is based on the blood culture method, but has problems in detection sensitivity and the like. Although diagnostics using antibodies have been marketed so far,
Diagnosis with antibodies does not help immunocompromised patients.
Under such circumstances, in recent years, methods for directly detecting antigens and other bacterial cell components have been developed. For example, a method for detecting infection by detecting mannan, D-arabinitol, glucan, and the like has been developed. On the other hand, with the development of molecular biology, various pathogens such as Mycobacterium tuberculosis and Chlamydia
Methods for diagnosing by extracting NA and detecting nucleic acids by the so-called PCR method have been developed. Methods for Detecting and Diagnosing Ribosomal RNA in the Field of Deep Mycosis (Clinical Pathology, Vol. 43, 119, 1995)
Year) is presented. The present inventors previously focused on the gene of cytochrome b present in the mitochondria of fungi that cause these various mycosis, provided a nucleic acid used for detecting a fungus of the genus Aspergillus, and further using it. A simple, rapid, specific and highly sensitive method for the detection of fungi causing deep mycosis, as well as a method for detecting fungi of the genus Aspergillus, has been developed (materials and methods for detecting fungi, WO98 / 10073).

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、深在
性真菌症の原因菌のうちカンジダ属に属する５種の真
菌、すなわち、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グ
ラブラータ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・
トロピカリス及びカンジダ・ドゥブリニエンシスを種特
異的に検出することができる核酸を提供し、さらにそれ
を用いることによる簡便、迅速、特異的かつ高感度なこ
れらの深在性真菌症の原因菌の検出方法を提供すること
である。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide five fungi belonging to the genus Candida among the causative fungi of deep mycosis, namely Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida cerevisiae.
Provided is a nucleic acid capable of detecting species tropicalis and Candida dubriniensis in a species-specific manner, and furthermore, by using the nucleic acid, a simple, rapid, specific and highly sensitive causative bacterium of these deep mycosis is provided. It is to provide a detection method.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、各種深在
性真菌症の原因菌、なかでもカンジダ属真菌の遺伝子に
関する種々の検討を重ねた結果、これら各種深在性真菌
症の原因となる真菌のミトコンドリアに存在するチトク
ロームｂの遺伝子の一部を増幅し、その配列を解読する
ことに成功した。本発明者らは、その配列をもとにさら
に研究を重ねた結果、カンジダ属真菌の各種ごとに特異
的な配列を見出し、それらを基にそれぞれの種に特異的
なプライマーを設計した。例えば、カンジダ・アルビカ
ンス特異的なプライマーとして配列表の配列番号１と６
を、カンジダ・グラブラータに特異的なプライマーとし
て配列表の配列番号２と７を、カンジダ・パラプシロー
シスに特異的なプライマーとして配列表の配列番号３と
８を、カンジダ・トロピカリスに特異的なプライマーと
して配列表の配列番号４と９を、カンジダ・ドゥブリニ
エンシスに特異的なプライマーとして配列表の配列番号
５と１０などを見出した。これらを基に、簡便、迅速、
特異的かつ高感度にカンジダ属真菌を検出・分類・同定
するための核酸を取得し、更にそれを用いた検出法を確
立して本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted various studies on the genes of causative fungi of various kinds, especially of the genes of Candida spp. A part of the cytochrome b gene present in the fungal mitochondria was successfully amplified and its sequence was successfully decoded. As a result of further studies based on the sequence, the present inventors have found specific sequences for each type of fungi of the genus Candida, and designed primers specific to each species based on the sequences. For example, as primers specific for Candida albicans, SEQ ID NOS: 1 and 6
As primers specific to Candida glabrata, SEQ ID NOs: 2 and 7 in the sequence listing as primers specific to Candida parapsilosis, and SEQ ID NOs. 3 and 8 in the sequence listing as primers specific to Candida tropicalis, as primers specific to Candida tropicalis SEQ ID NOs: 5 and 10 in the Sequence Listing were found as primers specific to Candida dubriniensis using SEQ ID NOs: 4 and 9 in the Sequence Listing. Based on these, simple, quick,
The present invention has completed the present invention by obtaining a nucleic acid for detecting, classifying and identifying Candida fungi with specific and high sensitivity, and further establishing a detection method using the nucleic acid.

【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
又は６で示される塩基配列（ただし、任意の位置のチミ
ンはウラシルと置換されていてもよい）若しくはその相
補的な塩基配列中の３’末端から連続する少なくとも１
５塩基から成る塩基配列又は該塩基配列とストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するカ
ンジダ・アルビカンス検出用核酸を提供する。また、本
発明は、配列表の配列番号２又は７で示される塩基配列
（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換されて
いてもよい）若しくはその相補的な塩基配列中の３’末
端から連続する少なくとも１５塩基から成る塩基配列又
は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする塩基配列を有するカンジダ・グラブラータ検出
用核酸を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番
号３又は８で示される塩基配列（ただし、任意の位置の
チミンはウラシルと置換されていてもよい）若しくはそ
の相補的な塩基配列中の３’末端から連続する少なくと
も１５塩基から成る塩基配列又は該塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有す
るカンジダ・パラプシローシス検出用核酸を提供する。
さらに、本発明は、配列表の配列番号４又は９で示され
る塩基配列（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと
置換されていてもよい）若しくはその相補的な塩基配列
中の３’末端から連続する少なくとも１５塩基から成る
塩基配列又は該塩基配列とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズする塩基配列を有するカンジダ・トロピ
カリス検出用核酸を提供する。さらに、本発明は、配列
表の配列番号５又は１０で示される塩基配列（ただし、
任意の位置のチミンはウラシルと置換されていてもよ
い）若しくはその相補的な塩基配列中の３’末端から連
続する少なくとも１５塩基から成る塩基配列又は該塩基
配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
塩基配列を有するカンジダ・ドゥブリニエンシス検出用
核酸を提供する。さらに、本発明は、上記各検出用核酸
を用いる上記カンジダ属真菌の検出方法を提供する。さ
らに、本発明は、上記各検出用核酸を含む上記各カンジ
ダ属真菌検出用試薬キットを提供する。[0006] That is, the present invention relates to SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
Or at least one continuation from the 3 ′ end in the nucleotide sequence represented by 6 (however, thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary nucleotide sequence
Provided is a nucleic acid for detecting Candida albicans having a base sequence consisting of 5 bases or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions. In addition, the present invention relates to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7 in the sequence listing (however, thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary base sequence from the 3 ′ end. Provided is a nucleic acid for detecting Candida glabrata having a nucleotide sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence under stringent conditions. Furthermore, the present invention relates to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8 in the Sequence Listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary base sequence from the 3 ′ end. Provided is a nucleic acid for detecting Candida parapsilosis having a nucleotide sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence under stringent conditions.
Furthermore, the present invention relates to the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 9 in the Sequence Listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary base sequence from the 3 ′ end. Provided is a nucleic acid for detecting Candida tropicalis having a nucleotide sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence under stringent conditions. Furthermore, the present invention provides a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 10 (provided that
Thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary nucleotide sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides from the 3 'end or hybridizing with the nucleotide sequence under stringent conditions. The present invention provides a nucleic acid for detecting Candida dubliniensis having a base sequence of: Further, the present invention provides a method for detecting the above Candida fungi using the above-described nucleic acids for detection. Further, the present invention provides the above-mentioned reagent kit for detecting a fungus of the genus Candida, comprising the above-described nucleic acid for detection.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】上記の通り、本発明のカンジダ・
アルビカンス検出用核酸は、配列表の配列番号１又は６
で示される塩基配列（ただし、任意の位置のチミンはウ
ラシルと置換されていてもよい）若しくはその相補的な
塩基配列中の３’末端から連続する少なくとも１５塩基
から成る塩基配列又は該塩基配列とストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するものであ
る。チミンはウラシルと置換されていてもよいことから
明らかなように、本発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよい。本発明のカンジダ・アルビカンス検
出用核酸としては、配列表の配列番号１又は６で示され
る塩基配列（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと
置換されていてもよい）中の３’末端から連続する少な
くとも１５塩基から成る塩基配列を有するものが好まし
く、とりわけ、配列番号１又は６で示される塩基配列を
有するものが好ましい。もっとも、本発明のカンジダ・
アルビカンス検出用核酸は、配列表の配列番号１又は６
で示される塩基配列（ただし、任意の位置のチミンはウ
ラシルと置換されていてもよい）又はその相補的な塩基
配列のうち、３’末端から連続する少なくとも１５塩基
から成る塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするものであれば、上記した塩基配列に、塩基
の置換、欠失、挿入又は付加を含んでいてもよい。ここ
で、「ストリンジェントな条件下」とは、下記実施例に
記載するような通常のＰＣＲにおけるアニーリング条件
下で、鋳型となる標的核酸にハイブリダイズし、プライ
マーとして機能することを意味する。なお、配列番号１
及び配列番号６で示される塩基配列は、カンジダ・アル
ビカンスの決定したミトコンドリア、チトクロームｂ遺
伝子内の16nt〜45ntの領域及び242nt〜270ntの領域それ
ぞれとハイブリダイズするものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION As described above, the Candida
Albicans detection nucleic acid is SEQ ID NO: 1 or 6 in the sequence listing.
(Provided that thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary base sequence, consisting of at least 15 bases continuous from the 3 ′ end, or the base sequence It has a base sequence that hybridizes under stringent conditions. As is clear from the fact that thymine may be substituted with uracil, the nucleic acid of the present invention may be DNA or RN.
A may be used. The nucleic acid for detecting Candida albicans of the present invention includes a sequence starting from the 3 ′ end in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6 in the Sequence Listing (though thymine at any position may be substituted with uracil). Preferably, it has a base sequence of at least 15 bases, and particularly preferably has a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6. However, Candida according to the present invention
Albicans detection nucleic acid is SEQ ID NO: 1 or 6 in the sequence listing.
(However, thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary base sequence, which is a stringent base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the 3 ′ end. The base sequence described above may include base substitution, deletion, insertion or addition as long as it hybridizes under the conditions. Here, “under stringent conditions” means that it hybridizes to a target nucleic acid serving as a template and functions as a primer under annealing conditions in ordinary PCR as described in Examples below. In addition, SEQ ID NO: 1
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 hybridizes with the mitochondria determined by Candida albicans, the 16 nt to 45 nt region, and the 242 nt to 270 nt region in the cytochrome b gene.

【０００８】上記本発明のカンジダ・アルビカンス検出
用核酸は、後述の通り、標識剤を結合してプローブとし
て用いることができるし、ＰＣＲのような核酸増幅法の
プライマーとして用いることもできる。プライマーとし
て用いる場合、配列番号１に示される塩基配列を有する
核酸（上記したその一部分及び変異体を包含する。な
お、以下、紛らわしくならない限り、「配列番号１で示
される塩基配列を有する核酸」を簡便のために単に「配
列番号１」と記載することがある））をフォワード側プ
ライマーとして用い、配列番号６（上記したその一部分
及び変異体を包含する）をリバース側プライマーとし
て、組み合わせて用いることが好ましい。配列番号１を
フォワード側プライマー、配列番号６をリバース側プラ
イマーとして用いた場合には、被検試料中にカンジダ・
アルビカンスのミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子が
存在していれば、255塩基対の長さの核酸（配列番号１
１）が増幅される。この場合、他の種のカンジダ属真菌
の遺伝子が存在していても増幅は起きない。従って、増
幅の有無を調べることにより種の同定が可能である。The nucleic acid for detecting Candida albicans of the present invention can be used as a probe by binding a labeling agent, as described later, or can be used as a primer in a nucleic acid amplification method such as PCR. When used as a primer, a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (including the above-described portions and variants thereof. Unless otherwise confused, a "nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1" For the sake of simplicity, simply use "SEQ ID NO: 1")) as the forward primer and SEQ ID NO: 6 (including the above-described parts and variants) as the reverse primer. Is preferred. When SEQ ID NO: 1 was used as the forward primer and SEQ ID NO: 6 was used as the reverse primer, Candida
If the mitochondrial cytochrome b gene of Albicans is present, a nucleic acid having a length of 255 base pairs (SEQ ID NO: 1)
1) is amplified. In this case, amplification does not occur even if genes of other species of Candida fungi are present. Therefore, species can be identified by examining the presence or absence of amplification.

【０００９】本発明のカンジダ・グラブラータ検出用核
酸は、配列表の配列番号２又は７で示される塩基配列
（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換されて
いてもよい）若しくはその相補的な塩基配列中の３’末
端から連続する少なくとも１５塩基から成る塩基配列又
は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする塩基配列を有するものである。チミンはウラシ
ルと置換されていてもよいことから明らかなように、本
発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明のカンジダ・グラブラータ検出用核酸としては、
配列表の配列番号２又は７で示される塩基配列（ただ
し、任意の位置のチミンはウラシルと置換されていても
よい）中の３’末端から連続する少なくとも１５塩基か
ら成る塩基配列を有するものが好ましく、とりわけ、配
列番号２又は７で示される塩基配列を有するものが好ま
しい。もっとも、本発明のカンジダ・グラブラータ検出
用核酸は、配列表の配列番号２又は７で示される塩基配
列（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換され
ていてもよい）又はその相補的な塩基配列のうち、３’
末端から連続する少なくとも１５塩基から成る塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするもの
であれば、上記した塩基配列に、塩基の置換、欠失、挿
入又は付加を含んでいてもよい。ここで、「ストリンジ
ェントな条件下」とは、上記の通りである。なお、配列
番号２及び配列番号７で示される塩基配列は、カンジダ
・グラブラータの決定したミトコンドリア、チトクロー
ムｂ遺伝子内の24nt〜48ntの領域及び210nt〜230ntの領
域それぞれとハイブリダイズするものである。The nucleic acid for detecting Candida glabrata of the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7 in the sequence listing (provided that thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary sequence. It has a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the 3 'end in the base sequence or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions. As is clear from the fact that thymine may be substituted for uracil, the nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA.
As the nucleic acid for detecting Candida glabrata of the present invention,
In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7 in the sequence listing (provided that thymine at any position may be substituted with uracil), the base sequence having at least 15 bases continuous from the 3 ′ end Those having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7 are particularly preferable. Needless to say, the nucleic acid for detecting Candida glabrata of the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7 in the sequence listing (provided that thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary base. 3 'of the sequence
The base sequence described above may include base substitution, deletion, insertion or addition as long as it hybridizes under stringent conditions to a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the terminal. Here, the “stringent conditions” are as described above. The nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 7 hybridize to the 24 nt to 48 nt region and 210 nt to 230 nt region in mitochondria and cytochrome b gene determined by Candida glabrata.

【００１０】上記本発明のカンジダ・グラブラータ検出
用核酸は、後述の通り、標識剤を結合してプローブとし
て用いることができるし、ＰＣＲのような核酸増幅法の
プライマーとして用いることもできる。プライマーとし
て用いる場合、配列番号２（上記したその一部分及び変
異体を包含する）をフォワード側プライマーとして用
い、配列番号７（上記したその一部分及び変異体を包含
する）をリバース側プライマーとして、組み合わせて用
いることが好ましい。配列番号２をフォワード側プライ
マー、配列番号７をリバース側プライマーとして用いた
場合には、被検試料中にカンジダ・グラブラータのミト
コンドリアチトクロームｂ遺伝子が存在していれば、20
5塩基対の長さの核酸（配列番号１２）が増幅される。
この場合、他の種のカンジダ属真菌の遺伝子が存在して
いても増幅は起きない。従って、増幅の有無を調べるこ
とにより種の同定が可能である。As described below, the nucleic acid for detecting Candida glabrata of the present invention can be used as a probe by binding a labeling agent, or can be used as a primer in a nucleic acid amplification method such as PCR. When used as a primer, SEQ ID NO: 2 (including the above-described portions and variants) is used as the forward primer, and SEQ ID NO: 7 (including the above-described portions and variants) is used as the reverse primer in combination. Preferably, it is used. When SEQ ID NO: 2 was used as the forward primer and SEQ ID NO: 7 was used as the reverse primer, if the mitochondrial cytochrome b gene of Candida glabrata was present in the test sample, 20
A 5 base pair long nucleic acid (SEQ ID NO: 12) is amplified.
In this case, amplification does not occur even if genes of other species of Candida fungi are present. Therefore, species can be identified by examining the presence or absence of amplification.

【００１１】本発明のカンジダ・パラプシローシス検出
用核酸は、配列表の配列番号３又は８で示される塩基配
列（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換され
ていてもよい）若しくはその相補的な塩基配列中の３’
末端から連続する少なくとも１５塩基から成る塩基配列
又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする塩基配列を有するものである。チミンはウラ
シルと置換されていてもよいことから明らかなように、
本発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよ
い。本発明のカンジダ・パラプシローシス検出用核酸と
しては、配列表の配列番号３又は８で示される塩基配列
（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換されて
いてもよい）中の３’末端から連続する少なくとも１５
塩基から成る塩基配列を有するものが好ましく、とりわ
け、配列番号３又は８で示される塩基配列を有するもの
が好ましい。もっとも、本発明のカンジダ・パラプシロ
ーシス検出用核酸は、配列表の配列番号３又は８で示さ
れる塩基配列（ただし、任意の位置のチミンはウラシル
と置換されていてもよい）又はその相補的な塩基配列の
うち、３’末端から連続する少なくとも１５塩基から成
る塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするものであれば、上記した塩基配列に、塩基の置
換、欠失、挿入又は付加を含んでいてもよい。ここで、
「ストリンジェントな条件下」とは、上記の通りであ
る。なお、配列番号３及び配列番号８で示される塩基配
列は、カンジダ・パラプシローシスの決定したミトコン
ドリア、チトクロームｂ遺伝子内の46nt〜68ntの領域及
び366nt〜395ntの領域それぞれとハイブリダイズするも
のである。[0011] The nucleic acid for detecting Candida parapsilosis of the present invention comprises a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8 in the sequence listing (provided that thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary sequence. 3 'in base sequence
It has a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the terminal or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions. As is clear from the fact that thymine may be substituted for uracil,
The nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA. As the nucleic acid for detecting Candida parapsilosis of the present invention, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 8 in the sequence listing (however, thymine at any position may be substituted with uracil) is continuously from the 3 ′ end. At least 15
Those having a base sequence consisting of bases are preferred, and those having the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 8 are particularly preferred. Needless to say, the nucleic acid for detecting Candida parapsilosis of the present invention has a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8 in the sequence listing (however, thymine at any position may be substituted with uracil) or a base complementary thereto. If the sequence hybridizes under stringent conditions with a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the 3 ′ end, the base sequence described above contains base substitutions, deletions, insertions or additions. You may go out. here,
"Stringent conditions" are as described above. The nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 8 hybridize with the mitochondria determined by Candida parapsilosis, the 46 nt to 68 nt region and the 366 nt to 395 nt region in the cytochrome b gene.

【００１２】上記本発明のカンジダ・パラプシローシス
検出用核酸は、後述の通り、標識剤を結合してプローブ
として用いることができるし、ＰＣＲのような核酸増幅
法のプライマーとして用いることもできる。プライマー
として用いる場合、配列番号３（上記したその一部分及
び変異体を包含する）をフォワード側プライマーとして
用い、配列番号８（上記したその一部分及び変異体を包
含する）をリバース側プライマーとして、組み合わせて
用いることが好ましい。配列番号３をフォワード側プラ
イマー、配列番号８をリバース側プライマーとして用い
た場合には、被検試料中にカンジダ・パラプシローシス
のミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子が存在していれ
ば、355塩基対の長さの核酸（配列番号１３）が増幅さ
れる。この場合、他の種のカンジダ属真菌の遺伝子が存
在していても増幅は起きない。従って、増幅の有無を調
べることにより種の同定が可能である。As described below, the nucleic acid for detecting Candida parapsilosis of the present invention can be used as a probe by binding a labeling agent, or can be used as a primer in a nucleic acid amplification method such as PCR. When used as a primer, SEQ ID NO: 3 (including the above-described portions and variants) is used as a forward primer, and SEQ ID NO: 8 (including the above-described portions and variants) is used as a reverse primer in combination. Preferably, it is used. When SEQ ID NO: 3 was used as the forward primer and SEQ ID NO: 8 was used as the reverse primer, if a mitochondrial cytochrome b gene of Candida parapsilosis was present in the test sample, a nucleic acid having a length of 355 base pairs would be used. (SEQ ID NO: 13) is amplified. In this case, amplification does not occur even if genes of other species of Candida fungi are present. Therefore, species can be identified by examining the presence or absence of amplification.

【００１３】本発明のカンジダ・トロピカリス検出用核
酸は、配列表の配列番号４又は９で示される塩基配列
（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換されて
いてもよい）若しくはその相補的な塩基配列中の３’末
端から連続する少なくとも１５塩基から成る塩基配列又
は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする塩基配列を有するものである。チミンはウラシ
ルと置換されていてもよいことから明らかなように、本
発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明のカンジダ・トロピカリス検出用核酸としては、
配列表の配列番号４又は９で示される塩基配列（ただ
し、任意の位置のチミンはウラシルと置換されていても
よい）中の３’末端から連続する少なくとも１５塩基か
ら成る塩基配列を有するものが好ましく、とりわけ、配
列番号４又は９で示される塩基配列を有するものが好ま
しい。もっとも、本発明のカンジダ・トロピカリス検出
用核酸は、配列表の配列番号４又は９で示される塩基配
列（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換され
ていてもよい）又はその相補的な塩基配列のうち、３’
末端から連続する少なくとも１５塩基から成る塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするもの
であれば、上記した塩基配列に、塩基の置換、欠失、挿
入又は付加を含んでいてもよい。ここで、「ストリンジ
ェントな条件下」とは、上記の通りである。なお、配列
番号４及び配列番号９で示される塩基配列は、カンジダ
・トロピカリスの決定したミトコンドリア、チトクロー
ムｂ遺伝子内の-13nt〜10ntの領域及び363nt〜392ntの
領域それぞれとハイブリダイズするものである。[0013] The nucleic acid for detecting Candida tropicalis of the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 9 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complement. A base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the 3 'end of the base sequence or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions. As is clear from the fact that thymine may be substituted for uracil, the nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA.
As the nucleic acid for detecting Candida tropicalis of the present invention,
In the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 9 in the sequence list (though thymine at any position may be substituted with uracil), a base sequence having at least 15 bases continuous from the 3 ′ end Those having the base sequence of SEQ ID NO: 4 or 9 are particularly preferable. Of course, the nucleic acid for detecting Candida tropicalis of the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 9 in the sequence listing (provided that thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary sequence. 3 'of the base sequence
The base sequence described above may include base substitution, deletion, insertion or addition as long as it hybridizes under stringent conditions to a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the terminal. Here, the “stringent conditions” are as described above. The nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 9 hybridize with the mitochondria determined by Candida tropicalis, the -13 nt to 10 nt region, and the 363 nt to 392 nt region in the cytochrome b gene, respectively. .

【００１４】上記本発明のカンジダ・トロピカリス検出
用核酸は、後述の通り、標識剤を結合してプローブとし
て用いることができるし、ＰＣＲのような核酸増幅法の
プライマーとして用いることもできる。プライマーとし
て用いる場合、配列番号４（上記したその一部分及び変
異体を包含する）をフォワード側プライマーとして用
い、配列番号９（上記したその一部分及び変異体を包含
する）をリバース側プライマーとして、組み合わせて用
いることが好ましい。配列番号４をフォワード側プライ
マー、配列番号９をリバース側プライマーとして用いた
場合には、被検試料中にカンジダ・トロピカリスのミト
コンドリアチトクロームｂ遺伝子が存在していれば、40
5塩基対の長さの核酸（配列番号１４）が増幅される。
この場合、他の種のカンジダ属真菌の遺伝子が存在して
いても増幅は起きない。The nucleic acid for detecting Candida tropicalis of the present invention can be used as a probe by binding a labeling agent, as described later, or can be used as a primer in a nucleic acid amplification method such as PCR. When used as a primer, SEQ ID NO: 4 (including the above-described portions and variants) is used as a forward primer, and SEQ ID NO: 9 (including the above-described portions and variants) is used as a reverse primer in combination. Preferably, it is used. When SEQ ID NO: 4 was used as the forward primer and SEQ ID NO: 9 was used as the reverse primer, if the mitochondrial cytochrome b gene of Candida tropicalis was present in the test sample, 40
A 5 base pair long nucleic acid (SEQ ID NO: 14) is amplified.
In this case, amplification does not occur even if genes of other species of Candida fungi are present.

【００１５】本発明のカンジダ・ドゥブリニエンシス検
出用核酸は、配列表の配列番号５又は１０で示される塩
基配列（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換
されていてもよい）若しくはその相補的な塩基配列中の
３’末端から連続する少なくとも１５塩基から成る塩基
配列又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする塩基配列を有するものである。チミンは
ウラシルと置換されていてもよいことから明らかなよう
に、本発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであっても
よい。本発明のカンジダ・ドゥブリニエンシス検出用核
酸としては、配列表の配列番号５又は１０で示される塩
基配列（ただし、任意の位置のチミンはウラシルと置換
されていてもよい）中の３’末端から連続する少なくと
も１５塩基から成る塩基配列を有するものが好ましく、
とりわけ、配列番号５又は１０で示される塩基配列を有
するものが好ましい。もっとも、本発明のカンジダ・ド
ゥブリニエンシス検出用核酸は、配列表の配列番号５又
は１０で示される塩基配列（ただし、任意の位置のチミ
ンはウラシルと置換されていてもよい）又はその相補的
な塩基配列のうち、３’末端から連続する少なくとも１
５塩基から成る塩基配列とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするものであれば、上記した塩基配列
に、塩基の置換、欠失、挿入又は付加を含んでいてもよ
い。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、上記
の通りである。なお、配列番号５及び配列番号１０で示
される塩基配列は、カンジダ・ドゥブリニエンシスの決
定したミトコンドリア、チトクロームｂ遺伝子内の61nt
〜90ntの領域及び336nt〜366ntの領域それぞれとハイブ
リダイズするものである。The nucleic acid for detecting Candida dubliniensis of the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 10 in the sequence listing (provided that thymine at any position may be substituted with uracil) or its complement. And a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the 3 'end in a typical base sequence or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions. As is clear from the fact that thymine may be substituted for uracil, the nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA. As the nucleic acid for detecting Candida dubriniensis of the present invention, the 3 ′ terminal in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 10 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) Those having a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from
In particular, those having the base sequence of SEQ ID NO: 5 or 10 are preferred. Needless to say, the nucleic acid for detecting Candida dubliniensis of the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 10 in the sequence listing (however, thymine at any position may be substituted with uracil) or its complement. At least one continuous sequence from the 3 'end
The base sequence described above may include a base substitution, deletion, insertion or addition as long as it hybridizes with a base sequence consisting of 5 bases under stringent conditions. Here, the “stringent conditions” are as described above. The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 5 and 10 correspond to 61 nt of mitochondria and cytochrome b gene determined by Candida dubriniensis.
It hybridizes with the region of 9090 nt and the region of 336 nt to 366 nt.

【００１６】上記本発明のカンジダ・ドゥブリニエンシ
ス検出用核酸は、後述の通り、標識剤を結合してプロー
ブとして用いることができるし、ＰＣＲのような核酸増
幅法のプライマーとして用いることもできる。プライマ
ーとして用いる場合、配列番号５（上記したその一部分
及び変異体を包含する）をフォワード側プライマーとし
て用い、配列番号１０（上記したその一部分及び変異体
を包含する）をリバース側プライマーとして、組み合わ
せて用いることが好ましい。配列番号５をフォワード側
プライマー、配列番号１０をリバース側プライマーとし
て用いた場合には、被検試料中にカンジダ・ドゥブリニ
エンシスのミトコンドリアチトクロームｂ遺伝子が存在
していれば、305塩基対の長さの核酸（配列番号１５）
が増幅される。この場合、他の種のカンジダ属真菌の遺
伝子が存在していても増幅は起きない。As described below, the nucleic acid for detecting Candida dubliniensis of the present invention can be used as a probe by binding a labeling agent, or can be used as a primer in a nucleic acid amplification method such as PCR. When used as a primer, SEQ ID NO: 5 (including the above-described portions and variants) is used as the forward primer, and SEQ ID NO: 10 (including the above-described portions and variants) is used as the reverse primer in combination. Preferably, it is used. When SEQ ID NO: 5 was used as the forward primer and SEQ ID NO: 10 was used as the reverse primer, if the mitochondrial cytochrome b gene of Candida dubriniensis was present in the test sample, the length was 305 base pairs. Nucleic acid (SEQ ID NO: 15)
Is amplified. In this case, amplification does not occur even if genes of other species of Candida fungi are present.

【００１７】上記した本発明の核酸は、市販のＤＮＡ合
成機等を用い、化学合成により容易に製造することがで
きる。The above-described nucleic acid of the present invention can be easily produced by chemical synthesis using a commercially available DNA synthesizer or the like.

【００１８】上記の通り、本発明の上記各核酸は、上記
各カンジダ属真菌のミトコンドリアのチトクロームｂ遺
伝子内の領域とハイブリダイズするので、本発明の各核
酸をプローブ又は核酸増幅法用プライマーとして用いる
ことにより、上記各カンジダ属真菌を検出することがで
きる。As described above, each of the nucleic acids of the present invention hybridizes with a region in the cytochrome b gene of mitochondria of each of the above Candida fungi, and thus each of the nucleic acids of the present invention is used as a probe or a primer for nucleic acid amplification. Thereby, each of the above Candida fungi can be detected.

【００１９】本発明の核酸をプローブとして用いる場
合、標識剤で標識した核酸を用いることが好ましい。こ
の場合、標識された本発明の核酸をプローブとし、被験
試料中のカンジダ属真菌遺伝子と該標識プローブをハイ
ブリダイズさせた後に、カンジダ属真菌遺伝子と標識プ
ローブとの結合物もしくは非結合の標識プローブを、標
識剤に適した適当な検出法で検出する。プローブに用い
る標識剤はこの分野において周知であり、蛍光標識、放
射標識、酵素標識、ビオチン等を挙げることができる。
検体、すなわち被験試料中の真菌遺伝子とプローブとの
ハイブリダイゼーションは、検体を通常の方法で前処
理、精製したものを被験試料とし、それとプローブとし
ての標識核酸とを混合し、室温から70℃で10分から48時
間処理することにより実施できる。また、検体はあらか
じめ本発明の核酸をプライマーとして増幅反応を行って
おいてもよい。When the nucleic acid of the present invention is used as a probe, it is preferable to use a nucleic acid labeled with a labeling agent. In this case, the labeled nucleic acid of the present invention is used as a probe, and after the Candida fungal gene in the test sample and the labeled probe are hybridized, a bound product of the Candida fungal gene and the labeled probe or an unbound labeled probe Is detected by an appropriate detection method suitable for the labeling agent. Labeling agents used for probes are well known in this field, and include fluorescent labels, radioactive labels, enzyme labels, biotin, and the like.
Specimen, that is, hybridization between the fungal gene in the test sample and the probe, the sample is pretreated and purified in the usual way to obtain a test sample, and then mixed with a labeled nucleic acid as a probe, at room temperature to 70 ° C. This can be done by treating for 10 minutes to 48 hours. The sample may be subjected to an amplification reaction in advance using the nucleic acid of the present invention as a primer.

【００２０】本発明の各核酸を核酸増幅法用のプライマ
ーとして用いる場合、本発明の各核酸をプライマーとし
て、ＤＮＡポリメラーゼ等による伸長反応を行い遺伝子
増幅することにより上記各カンジダ属真菌のチトクロー
ムｂ遺伝子断片のみを特異的に増幅させ、この増幅産物
を測定することによって真菌を検出することができる。
またこの場合、プライマーとして本発明の核酸を前述し
たごとく標識剤で標識化して得られる標識核酸を用いて
もよい。ここで用いられる遺伝子増幅法としては、具体
的にはＰＣＲ法が例示されるが、特にこの方法に限定さ
れるものではなく、短鎖のオリゴ核酸をプライマーとし
て遺伝子合成の開始のために用いるいずれの遺伝子増幅
法をも用いることができる。本発明の真菌の検出法は、
上記方法により増幅された増幅産物すなわちチトクロー
ムｂ遺伝子断片を検出することにより行うことができ
る。あるいは増幅されたチトクロームｂ遺伝子断片を制
限酵素によって断片化し、その断片の生成パターンを比
較することによっても行うことができる。ここで用いる
制限酵素は単独、あるいは組み合わせて使用される。増
幅産物増幅されたチトクロームｂ遺伝子断片、または制
限酵素でさらに断片化された遺伝子断片の検出手段は特
に限定されることはなく、通常の遺伝子の検出方法（例
えば電気泳動法など）が使用できる。増幅産物は、例え
ば電気泳動により分画され、特異的かつ検出に十分な程
度に鮮明なバンドとして容易に検出できる。プライマー
がまた増幅反応時に、適当な標識剤で標識化されたデオ
キシリボ核酸混合物（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）もしく
はリボ核酸混合物（ATP、UTP、GTP、CTP）をＤＮＡもし
くはＲＮＡ合成の原料として使用することにより、増幅
産物を高感度に直接検出することが可能である。もしく
は、プライマーとして本発明の核酸を標識化して得られ
る標識核酸を用いることにより、増幅産物を同様に高感
度に直接検出することができる。かかる場合、標識化に
用いられる標識剤として、好ましくは放射性物質、蛍光
物質などである。また、いわゆるリアルタイム検出ＰＣ
Ｒのプライマーとしても用いることができ、この場合に
は被検核酸の定量も可能になる。従って、本明細書にお
ける「検出」には、定量的な検出も包含される。When each nucleic acid of the present invention is used as a primer for a nucleic acid amplification method, each nucleic acid of the present invention is used as a primer to carry out an elongation reaction with a DNA polymerase or the like to amplify the gene, whereby the cytochrome b gene of each of the above Candida spp. A fungus can be detected by specifically amplifying only the fragment and measuring the amplification product.
In this case, a labeled nucleic acid obtained by labeling the nucleic acid of the present invention with a labeling agent as described above may be used as a primer. Specific examples of the gene amplification method used herein include a PCR method, but are not particularly limited to this method, and any method using a short-chain oligonucleic acid as a primer to initiate gene synthesis can be used. Can also be used. The method for detecting a fungus of the present invention comprises:
The detection can be performed by detecting the amplification product amplified by the above method, that is, the cytochrome b gene fragment. Alternatively, it can also be performed by fragmenting the amplified cytochrome b gene fragment with a restriction enzyme and comparing the production patterns of the fragment. The restriction enzymes used here are used alone or in combination. Means for detecting a cytochrome b gene fragment amplified with an amplification product or a gene fragment further fragmented with a restriction enzyme is not particularly limited, and an ordinary gene detection method (for example, an electrophoresis method) can be used. The amplification product is fractionated by, for example, electrophoresis and can be easily detected as a specific and sufficiently sharp band for detection. Primers also use a deoxyribonucleic acid mixture (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) or ribonucleic acid mixture (ATP, UTP, GTP, CTP) labeled with an appropriate labeling agent as a raw material for DNA or RNA synthesis during amplification reaction By doing so, it is possible to directly detect the amplification product with high sensitivity. Alternatively, by using a labeled nucleic acid obtained by labeling the nucleic acid of the present invention as a primer, the amplified product can be directly detected with high sensitivity. In such a case, the labeling agent used for labeling is preferably a radioactive substance, a fluorescent substance, or the like. Also, a so-called real-time detection PC
It can also be used as an R primer, and in this case, the amount of the test nucleic acid can be determined. Therefore, "detection" in the present specification includes quantitative detection.

【００２１】本発明の上記各カンジダ属真菌検出用の試
薬キットは、本発明の核酸又はこの核酸を適当な標識剤
で標識した標識核酸を含むことを特徴とするものであ
る。本発明の試薬キットは上記核酸を含んでいればよ
く、他の成分として標識検出用試薬や緩衝液などを含ん
でいてもよい。本発明の試薬キット中の核酸は、プライ
マーとして用いることもできるし、またプローブとして
用いることもできる。核酸をプライマーとして用いるか
プローブとして用いるかは、その手段が異なるのみであ
って、真菌の検出に関しては本質的には同じである。当
該試薬キットは、核酸をプローブとして使用する場合
は、上述のプローブを用いた方法による上記各カンジダ
属真菌検出のための試薬キットとして、またプライマー
として使用する場合は、上述の核酸増幅法による上記各
カンジダ属真菌検出のための試薬キットとして用いるこ
とができる。The reagent kit of the present invention for detecting each fungus of the genus Candida includes a nucleic acid of the present invention or a labeled nucleic acid obtained by labeling the nucleic acid with a suitable labeling agent. The reagent kit of the present invention may contain the above-described nucleic acid, and may contain a label detection reagent, a buffer, and the like as other components. The nucleic acid in the reagent kit of the present invention can be used as a primer or a probe. Whether a nucleic acid is used as a primer or a probe is different only in its means, and is essentially the same with respect to detection of fungi. When the nucleic acid is used as a probe, the reagent kit is used as a reagent kit for detecting each Candida fungus by the method using the above-described probe, and when the nucleic acid is used as a primer, the above-described nucleic acid amplification method is used. It can be used as a reagent kit for detecting each Candida fungus.

【００２２】試薬キット中の核酸をプローブとして用い
る場合の本発明の試薬キットは、本発明の上記各カンジ
ダ属真菌検出用核酸もしくは標識化された上記各カンジ
ダ属真菌検出用核酸以外に、標識検出用試薬、緩衝液な
どを含んていてもよい。試薬キット中の核酸をプライマ
ーとして用いる場合の本発明の試薬キットは、本発明の
各カンジダ属真菌検出用核酸もしくは標識化された上記
各カンジダ属真菌検出用核酸以外に、核酸合成酵素（例
えぱ、ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ，逆転
写酵素など）、デオキシリボヌクレオチド混合物（dAT
P、dTTP、dGTP、dCTP）、リボヌクレオチド混合物（AT
P、UTP、GTP、CTP）、制限酵素、緩衝液などを含んでい
てもよい。また、本発明の核酸は固相担体に結合して、
捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕
捉プローブと標識プローブの2つを組合せてサンドイッ
チアッセイを行ってもよい。また標的核酸を標識して捕
捉する方法もある。さらに核酸をビオチンで標識し、ハ
イブリダイゼーション後、アビジン結合担体で捕捉する
方法もある。サンドイッチアッセイにおいてはどちらか
一方に本発明の核酸を用いれば、本発明の核酸にて特異
的な測定が可能となり、他方の核酸の特異性は若干低く
てもなんら問題はない。In the case where the nucleic acid in the reagent kit is used as a probe, the reagent kit of the present invention comprises, in addition to the above-described nucleic acid for detecting a Candida fungus of the present invention or the labeled nucleic acid for detecting a Candida fungus of the present invention, Reagents, buffers and the like. In the case where the nucleic acid in the reagent kit is used as a primer, the reagent kit of the present invention comprises, in addition to the nucleic acid for detecting a Candida fungus of the present invention or the labeled nucleic acid for detecting a Candida fungus, a nucleic acid synthase (eg, , DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, etc.), deoxyribonucleotide mixture (dAT
P, dTTP, dGTP, dCTP), ribonucleotide mixture (AT
P, UTP, GTP, CTP), restriction enzymes, buffers and the like. Further, the nucleic acid of the present invention is bound to a solid support,
It can also be used as a capture probe. In this case, a sandwich assay may be performed using a combination of a capture probe and a labeled probe. There is also a method of labeling and capturing a target nucleic acid. Furthermore, there is a method in which a nucleic acid is labeled with biotin, and after hybridization, the nucleic acid is captured with an avidin-bound carrier. In the sandwich assay, if the nucleic acid of the present invention is used for either one, specific measurement of the nucleic acid of the present invention becomes possible, and there is no problem even if the specificity of the other nucleic acid is slightly low.

【００２３】[0023]

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

【００２４】実施例1（各種核酸の合成）配列表の配列番号1〜１０で表される配列を有する核酸
を化学合成した。以下、配列表の配列番号1〜１０に示
される各種核酸を、それぞれ核酸1〜１０と呼ぶ。Example 1 (Synthesis of Various Nucleic Acids) Nucleic acids having sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 10 in the sequence listing were chemically synthesized. Hereinafter, various nucleic acids represented by SEQ ID NOs: 1 to 10 in the sequence listing are referred to as nucleic acids 1 to 10, respectively.

【００２５】実施例2（カンジダ・アルビカンスのＰＣＲによる同
定）ポテトデキストロース液体培地で培養して得たカンジダ
・アルビカンス（Candida albicans IFM 5728及び4831
1）の菌体を、７５％エタノール処理し殺菌した。1500
ｇ、10分間の遠心分離で菌体を得、これに約40mlの抽出
用緩衝液（0.9Ｍソルビトール、10ｍＭＥＤＴＡ、10ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液pH7.1）を加え、良く振り混ぜた
後、1500ｇ、10分間の遠心分離で上澄みを捨て、30mlの
同緩衝液を加え、同様に遠心分離後上澄みを捨て、9ml
の同緩衝液を加えた。これに同緩衝液に溶解したZymoly
ase（生化学工業社製細胞壁溶解酵素、10mg/ml）を1ml
加え、37℃で1時間保温した後、超音波洗浄機にて1分間
処理した。これを1500ｇ、10分間の遠心分離で上澄みを
得、さらに20000ｇで15分間、遠心分離して沈殿を得
た。この沈殿を抽出用緩衝液で洗浄し、再度20000ｇで1
5分間、遠心分離してミトコンドリア画分を得た。この
ミトコンドリア画分に1mg/mlのプロテアーゼＫ（Protea
se K）を0.5ml加え、37℃で1時間保温した。これにフェ
ノール、クロロホルム、イソアミルアルコール混合液
（25:24:1）を1ml加え、振り混ぜた後、1500ｇ、10分間
の遠心分離で上層を取り、これに水飽和フェノールを1m
l加え、振り混ぜた後、1500ｇ、10分間の遠心分離で上
層を取った。これに0.1mlの３Ｍ酢酸ナトリウム、0.1M
塩化マグネシウム溶液を加え、3mlのエタノールを加え
て、-20℃に一晩放置した。これを1500ｇ、10分間遠心
分離して沈殿を得、この沈殿を-20℃の75％エタノール
で洗浄し、1500ｇ、10分間遠心分離後、上清を捨て、核
酸を得、乾燥後、-20℃に保存した。Example 2 (Identification of Candida albicans by PCR) Candida albicans (Candida albicans IFM 5728 and 4831) obtained by culturing in a potato dextrose liquid medium
The cells of 1) were treated with 75% ethanol and sterilized. 1500
g, and centrifugation for 10 minutes to obtain bacterial cells, into which about 40 ml of an extraction buffer (0.9 M sorbitol, 10 mM EDTA, 10 mM
M Tris-HCl buffer (pH 7.1), shake well, discard the supernatant by centrifugation at 1500 g for 10 minutes, add 30 ml of the same buffer, similarly centrifuge and discard the supernatant, 9 ml
Of the same buffer was added. Add Zymoly dissolved in the same buffer
1 ml of ase (Seikagaku Corporation cell wall lysing enzyme, 10 mg / ml)
In addition, the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour, and then treated with an ultrasonic cleaner for 1 minute. This was centrifuged at 1500 g for 10 minutes to obtain a supernatant, and further centrifuged at 20,000 g for 15 minutes to obtain a precipitate. The precipitate was washed with an extraction buffer, and again
Centrifugation was performed for 5 minutes to obtain a mitochondrial fraction. 1 mg / ml of protease K (Protea
se K) was added, and the mixture was kept at 37 ° C for 1 hour. 1 ml of a mixture of phenol, chloroform and isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added thereto, shaken, and the upper layer was removed by centrifugation at 1500 g for 10 minutes.
After adding and shaking, the upper layer was removed by centrifugation at 1500 g for 10 minutes. 0.1 ml of 3M sodium acetate, 0.1M
A magnesium chloride solution was added, 3 ml of ethanol was added, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. overnight. This was centrifuged at 1500 g for 10 minutes to obtain a precipitate. This precipitate was washed with 75% ethanol at −20 ° C., centrifuged at 1500 g for 10 minutes, the supernatant was discarded, and nucleic acid was obtained. Stored in ° C.

【００２６】この核酸を鋳型にし、実施例１で得られた
核酸１と核酸6をプライマーとして、宝酒造（株）のTaK
aRa PCR Amplification Kit(R011)を用い、サンヨーの
ＤＮＡ増幅装置(MIR-D30)を使用して以下の方法でＰＣ
Ｒ反応を行い、チトクロームｂ遺伝子の一部を増幅し
た。反応液の組成は次の通りであった。Using this nucleic acid as a template, and using the nucleic acid 1 and the nucleic acid 6 obtained in Example 1 as primers, TaK of Takara Shuzo Co., Ltd.
Using the aRa PCR Amplification Kit (R011) and a Sanyo DNA amplification device (MIR-D30),
An R reaction was performed to amplify a part of the cytochrome b gene. The composition of the reaction solution was as follows.

【００２７】 x10 PCR緩衝液（キットの試薬） 5μl PCR dNTP混合液（キットの試薬） 4μl Taq DNA合成酵素（キットの試薬） 1μl(2.5U) 核酸１ 1μl 核酸6 1μl ミトコンドリアＤＮＡ 1μl 水にて全量を50μlにした。X10 PCR buffer (kit reagent) 5 μl PCR dNTP mixture (kit reagent) 4 μl Taq DNA synthase (kit reagent) 1 μl (2.5 U) nucleic acid 1 1 μl nucleic acid 6 1 μl mitochondrial DNA 1 μl To 50 μl.

【００２８】反応条件は次の通りであった。熱変性：94℃、l分アニーリング：50℃、１分重合反応：72℃、２分サイクル数：３０回The reaction conditions were as follows. Thermal denaturation: 94 ° C, 1 minute Annealing: 50 ° C, 1 minute Polymerization reaction: 72 ° C, 2 minutes Number of cycles: 30

【００２９】増幅されたＤＮＡを電気泳動で検出した
（図１、レーン８、９）。検出された核酸断片の長さを
算出したところ、約２５５塩基対と同定された。The amplified DNA was detected by electrophoresis (FIG. 1, lanes 8, 9). When the length of the detected nucleic acid fragment was calculated, it was identified as about 255 base pairs.

【００３０】実施例３（カンジダ・グラブラータのＰＣ
Ｒによる同定）実施例２と同様な方法で、実施例１で得られた核酸2と
核酸7を用い、カンジダ・グラブラータ(Candida glabra
ta IFM 5768 及び46843)からチトクロームｂ遺伝子の一
部をＰＣＲ反応で増幅し、増幅されたＤＮＡを電気泳動
で検出した（図1、レーン１０、１１）。検出された核
酸断片の長さを算出したところ、約２０５塩基対と同定
された。Example 3 (PC of Candida Gravlata)
R) Candida glabra using the nucleic acid 2 and the nucleic acid 7 obtained in Example 1 in the same manner as in Example 2.
ta IFM 5768 and 46843), a part of the cytochrome b gene was amplified by PCR, and the amplified DNA was detected by electrophoresis (FIG. 1, lanes 10, 11). When the length of the detected nucleic acid fragment was calculated, it was identified as about 205 base pairs.

【００３１】実施例４（カンジダ・パラプシローシスの
ＰＣＲによる同定）実施例２と同様な方法で、実施例１で得られた核酸3と
核酸8を用い、カンジダ・パラプシローシス(Candida pa
rapsilosis IFM 5464及び46829)からチトクロームｂ遺
伝子の一部をＰＣＲ反応で増幅し、増幅されたＤＮＡを
電気泳動で検出した（図1、レーン４、５）。検出され
た核酸断片の長さを算出したところ、約３５５塩基対と
同定された。Example 4 (Identification of Candida parapsilosis by PCR) In the same manner as in Example 2, using nucleic acid 3 and nucleic acid 8 obtained in Example 1, Candida parapsilosis was used.
rapsilosis IFM 5464 and 46829), a part of the cytochrome b gene was amplified by PCR, and the amplified DNA was detected by electrophoresis (FIG. 1, lanes 4, 5). When the length of the detected nucleic acid fragment was calculated, it was identified as about 355 base pairs.

【００３２】実施例５（カンジダ・トロピカリスのＰＣ
Ｒによる同定）実施例２と同様な方法で、実施例１で得られた核酸4と
核酸9を用い、カンジダ・トロピカリス(Candida tropic
alis IFM 46816及び48776)からチトクロームｂ遺伝子の
一部をＰＣＲ反応で増幅し、増幅されたＤＮＡを電気泳
動で検出した（図1、レーン２、３）。検出された核酸
断片の長さを算出したところ、約４０５塩基対と同定さ
れた。Example 5 (PC of Candida tropicalis)
Identification by R) Candida tropicalis (Candida tropicalis) using the nucleic acid 4 and the nucleic acid 9 obtained in Example 1 in the same manner as in Example 2.
alis IFM 46816 and 48776), a part of the cytochrome b gene was amplified by PCR, and the amplified DNA was detected by electrophoresis (FIG. 1, lanes 2, 3). When the length of the detected nucleic acid fragment was calculated, it was identified as about 405 base pairs.

【００３３】実施例６カンジダ・ドゥブリニエンシス
のＰＣＲによる同定）実施例２と同様な方法で、実施例１で得られた核酸4と
核酸9を用い、カンジダ・ドゥブリニエンシス(Candida
dubliniensis IFM 48184及び48313)からチトクロームｂ
遺伝子の一部をＰＣＲ反応で増幅し、増幅されたＤＮＡ
を電気泳動で検出した（図1、レーン６、７）。検出さ
れた核酸断片の長さを算出したところ、約３０５塩基対
と同定された。Example 6 Identification of Candida dubriniensis by PCR Using the nucleic acids 4 and 9 obtained in Example 1 in the same manner as in Example 2, Candida dubriniensis (Candida
cytochrome b from dubliniensis IFM 48184 and 48313)
A part of the gene is amplified by PCR, and the amplified DNA
Was detected by electrophoresis (FIG. 1, lanes 6, 7). When the length of the detected nucleic acid fragment was calculated, it was identified as about 305 base pairs.

【００３４】[0034]

【発明の効果】本発明により、カンジダ・アルビカン
ス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシロー
シス、カンジダ・トロピカリス及びカンジダ・ドゥブリ
ニエンシスを種特異的に検出することができる核酸及び
それを用いたこれらのカンジダ属真菌の種特異的な検出
方法が提供された。本発明により従来、分類・同定に時
間のかかっていたカンジダ属真菌を迅速、簡便に特異的
且つ高感度で検出・分類・同定することが可能となっ
た。本発明の核酸は増幅反応のプライマーとしても、直
接検出用のプローブとしても用いることが可能である。
また、プライマーにより増幅した産物をプローブで検出
することにより、感度、特異性をさらに高くすることも
可能であり、その臨床的意義は大きい。According to the present invention, nucleic acids capable of species-specifically detecting Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis and Candida dubriniensis, and these Candida using these nucleic acids A method for species-specific detection of a genus fungus has been provided. According to the present invention, Candida fungi, which conventionally took a long time to classify and identify, can be quickly, easily and specifically detected and classified and identified with high sensitivity. The nucleic acid of the present invention can be used as a primer for an amplification reaction or as a probe for direct detection.
Further, the sensitivity and specificity can be further increased by detecting the product amplified by the primer with the probe, and its clinical significance is great.

【００３５】[0035]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SSP CO., LTD. <120> Oligonucleotides for detecting fungi belonging to Genus Candida a nd method for detecting fungi using the same <130> 00686 <160> 15[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> SSP CO., LTD. <120> Oligonucleotides for detecting fungi belonging to Genus Candida and method for detecting fungi using the same <130> 00686 <160> 15

【００３６】 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida albicans <400> 1 atacctttca taggtaatga tatcgtacca 30<210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida albicans <400> 1 atacctttca taggtaatga tatcgtacca 30

【００３７】 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida glabrata <400> 2 ttggtcaaga tattgtacaa tga 23<210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida glabrata <400> 2 ttggtcaaga tattgtacaa tga 23

【００３８】 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida parapsilosis <400> 3 ttccgtttat ttgaggaggt ttcagtgt 28<210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida parapsilosis <400> 3 ttccgtttat ttgaggaggt ttcagtgt 28

【００３９】 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida tropicalis <400> 4 tacagttatt actaacctac tgt 23<210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida tropicalis <400> 4 tacagttatt actaacctac tgt 23

【００４０】 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida dubliniensis <400> 5 ttctctgtaa gtaatcctac aatacagcgt 30<210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a forward primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida dubliniensis <400> 5 ttctctgtaa gtaatcctac aatacagcgt 30

【００４１】 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida albicans <400> 6 taataagaat acaaagacag taattaagt 29<210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida albicans <400> 6 taataagaat acaaagacag taattaagt 29

【００４２】 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida glabrata <400> 7 aaataaccat gcattccaat t 21<210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida glabrata <400> 7 aaataaccat gcattccaat t 21

【００４３】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida parapsilosis <400> 8 gcatagaaag gtaatagata tcactctgga 30<210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida parapsilosis <400> 8 gcatagaaag gtaatagata tcactctgga 30

【００４４】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida tropicalis <400> 9 tagaatggta ataggtatca ctcaggtacg 30<210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida tropicalis <400> 9 tagaatggta ataggtatca ctcaggtacg 30

【００４５】 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida dubliniensis <400> 10 acaattgatg gaggtgtcac cattgggttt 30<210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used as a reverse primer for amplifying a region in mitochondrial cytochrome b gene of Candida dubliniensis <400> 10 acaattgatg gaggtgtcac cattgggttt 30

【００４６】 <210> 11 <211> 255 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 11 atacctttca taggtaatga tatcgtacca tttatatgag gaggtttctc tgttagtaac 60 cctactatac aacggttctt cgcattgcat ttcttattac ctttcatact tgctgcatta 120 gtatgtatgc acttgatggc cttacatgta catggttcat ctaaccctgt aggtattact 180 ggtaatattg atagattgcc aatgcatcct tacttcatat ttaaagactt aattactgtc 240 tttgtattct tatta 255[0046] <210> 11 <211> 255 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 11 atacctttca taggtaatga tatcgtacca tttatatgag gaggtttctc tgttagtaac 60 cctactatac aacggttctt cgcattgcat ttcttattac ctttcatact tgctgcatta 120 gtatgtatgc acttgatggc cttacatgta catggttcat ctaaccctgt aggtattact 180 ggtaatattg atagattgcc aatgcatcct tacttcatat ttaaagactt aattactgtc 240 tttgtattct tatta 255

【００４７】 <210> 12 <211> 205 <212> DNA <213> Candida glabrata <400> 12 ttggtcaaga tattgtacaa tgattatgag gaggtttctc agtatctaat cctactattc 60 aaagattctt tgcattacat tatttagtac catttattat tgctgcttta gtagtaatgc 120 attttatggc tttacatgta catggttcat ctaatccttt aggtattaca ggtaatatgg 180 atagaattgg aatgcatggt tattt 205<210> 12 <211> 205 <212> DNA <213> Candida glabrata <400> 12 ttggtcaaga tattgtacaa tgattatgag gaggtttctc agtatctaat cctactattc 60 aaagattctt tgcattag cat tatttagtac catttattat tgctgag cattattg cattattg cattattg catg

【００４８】 <210> 13 <211> 355 <212> DNA <213> Candida parapsilosis <400> 13 ttccgtttat ttgaggaggt ttcagtgtaa gtaaccctac aattcaaaga ttctttgctc 60 ttcacttctt attaccattc attttagctg ctttagtatg tatgcattta atggcattac 120 atgttaatgg ttcatctaac ccattaggta ttacaggtaa cgttgataga ttaccaatgc 180 atccttactt tatttttaaa gatttagtaa ctgtatttgt attcttatta gtatttagtt 240 tatttgtatt ctattctcca aatacattag gtcaccctga taactatatt cctggtaacc 300 ctttagttac tcctccttct attgttccag agtgatatct attacctttc tatgc 355[0048] <210> 13 <211> 355 <212> DNA <213> Candida parapsilosis <400> 13 ttccgtttat ttgaggaggt ttcagtgtaa gtaaccctac aattcaaaga ttctttgctc 60 ttcacttctt attaccattc attttagctg ctttagtatg tatgcattta atggcattac 120 atgttaatgg ttcatctaac ccattaggta ttacaggtaa cgttgataga ttaccaatgc 180 atccttactt tatttttaaa gatttagtaa ctgtatttgt attcttatta gtatttagtt 240 tatttgtatt ctattctcca aatacattag gtcaccctga taactatatt cctggtaacc 300 ctttagttac tcctccttct attgttccag agtgatatct attacctttc tatgc 355

【００４９】 <210> 14 <211> 405 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 14 tacagttatt actaacctac tgtcagccat tccattcatt ggtaacgata tcgttccctt 60 tatttgaggt ggtttctcag taagtaaccc tactatccaa cggttctttg ccttacactt 120 ccttctacca ttcatcttag ctgcccttgt atgtatgcat ttaatggcat tacatgtaaa 180 tggatcatct aaccctgttg gtatcacagg taacatcgac cgattaccaa tgcatcctta 240 cttcatcttc aaagatctag taacagtctt cgtattcatc cttatattca gcctgtttgt 300 gttctatagc cctaacacgc taggacaccc agataactac atcccaggta accctatggt 360 aacacctcct tcaatcgtac ctgagtgata cctattacca ttcta 405[0049] <210> 14 <211> 405 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 14 tacagttatt actaacctac tgtcagccat tccattcatt ggtaacgata tcgttccctt 60 tatttgaggt ggtttctcag taagtaaccc tactatccaa cggttctttg ccttacactt 120 ccttctacca ttcatcttag ctgcccttgt atgtatgcat ttaatggcat tacatgtaaa 180 tggatcatct aaccctgttg gtatcacagg taacatcgac cgattaccaa tgcatcctta 240 cttcatcttc aaagatctag taacagtctt cgtattcatc cttatattca gcctgtttgt 300 gttctatagc cctaacacgc taggacaccc agataactac atcccaggta accctatggt 360 aacacctcct tcaatcgtac ctgagtc cctattaccattc

【００５０】 <210> 15 <211> 305 <212> DNA <213> Candida dubliniensis <400> 15 ttctctgtaa gtaatcctac aatacagcgt ttctttgcat tacatttctt attacctttt 60 atattagcag cattagtatg tatgcactta atggcattac atgtaaatgg ttcatcaaac 120 cctgtaggta taacaggtaa tatagataga ttaccaatgc atccttattt catatttaaa 180 gatcttataa ctgtatttgt attcttatta atatttagtt tatttgtatt ttattcacct 240 aatacattag gtcatcctga taattatata ccaggaaacc caatggtgac acctccatca 300 attgt 305[0050] <210> 15 <211> 305 <212> DNA <213> Candida dubliniensis <400> 15 ttctctgtaa gtaatcctac aatacagcgt ttctttgcat tacatttctt attacctttt 60 atattagcag cattagtatg tatgcactta atggcattac atgtaaatgg ttcatcaaac 120 cctgtaggta taacaggtaa tatagataga ttaccaatgc atccttattt catatttaaa 180 gatcttataa ctgtatttgt attcttatta atatttagtt tatttgtatt ttattcacct 240 aatacattag gtcatcctga taattatata ccaggaaacc caatggtgac acctccatca 300 attgt 305

[Brief description of the drawings]

【図１】本発明の実施例において、本発明の各核酸を用
いたＰＣＲにより増幅された増幅産物の電気泳動パター
ンを示す模式図である。レーン1：サイズマーカー（100、200、300、400、500、
600、700、900、1000、15000）レーン2：カンジダトロピカリス IFM 46816 レーン3：カンジダトロピカリス IFM 48776 レーン4：カンジダパラプシローシス IFM 46829 レーン5：カンジダパラプシローシス IFM 5464 レーン6：カンジダドゥブリニエンシス IFM 48184 レーン7：カンジダドゥブリニエンシス IFM 48313 レーン8：カンジダアルビカンス IFM 48311 レーン9：カンジダアルビカンス IFM 5728 レーン10：カンジダグラブラータ IFM 46843 レーン11：カンジダグラブラータ IFM 5768FIG. 1 is a schematic diagram showing an electrophoresis pattern of an amplification product amplified by PCR using each nucleic acid of the present invention in an example of the present invention. Lane 1: Size markers (100, 200, 300, 400, 500,
Lane 2: Candida tropicalis IFM 46816 Lane 3: Candida tropicalis IFM 48776 Lane 4: Candida parapsilosis IFM 46829 Lane 5: Candida parapsilosis IFM 5464 Lane 6: Candida dubriniensis IFM 48184 lanes 7: Candida dubriniensis IFM 48313 Lane 8: Candida albicans IFM 48311 Lane 9: Candida albicans IFM 5728 Lane 10: Candida grabrata IFM 46843 Lane 11: Candida grabrata IFM 5768

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:74） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:72）Ｃ１２Ｒ 1:72）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12R 1:74) (C12Q 1/68 A (C12Q 1/68 C12R 1:72) C12R 1:72) C12N 15/00 ZNAA

Claims

[Claims]

Claims 1. A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary nucleotide sequence at least from the 3 'end. A nucleic acid for detecting Candida albicans having a base sequence consisting of 15 bases or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions.

2. At least 15 continuous from the 3 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil).
The nucleic acid according to claim 1, which has a base sequence consisting of bases.

3. The nucleic acid according to claim 2, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (provided that thymine at any position may be substituted with uracil).

4. The nucleic acid according to claim 2, which is a forward primer in a nucleic acid amplification method.

5. A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or a nucleotide sequence complementary to at least 3 'end of the nucleotide sequence. A nucleic acid for detecting Candida glabrata having a base sequence consisting of 15 bases or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions.

6. A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil), at least 15 continuous from the 3 ′ end.
The nucleic acid according to claim 5, which has a base sequence consisting of bases.

7. The nucleic acid according to claim 6, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.

8. The nucleic acid according to claim 6, which is a forward primer in a nucleic acid amplification method.

9. A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or a nucleotide sequence complementary thereto at least from the 3 ′ end of the nucleotide sequence. A nucleic acid for detecting Candida parapsilosis having a base sequence consisting of 15 bases or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions.

10. At least one continuation from the 3 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil)
10. The nucleic acid according to claim 9, which has a base sequence consisting of 5 bases.

11. The nucleic acid according to claim 10, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.

12. The nucleic acid according to claim 10, which is a forward primer in a nucleic acid amplification method.

13. The base sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing (though thymine at any position may be replaced with uracil) or its complementary base sequence of 3 ′
A nucleic acid for detecting Candida tropicalis having a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the terminal or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions.

14. At least one continuation from the 3 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil).
14. The nucleic acid according to claim 13, which has a base sequence consisting of 5 bases.

15. The nucleic acid according to claim 14, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.

16. The nucleic acid according to claim 14, which is a forward primer in a nucleic acid amplification method.

17. The base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary 3 ′ in the base sequence
A nucleic acid for detecting Candida dubriniensis having a nucleotide sequence consisting of at least 15 nucleotides continuous from the terminal or a nucleotide sequence hybridizing with the nucleotide sequence under stringent conditions.

18. At least one continuation from the 3 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil)
18. The nucleic acid according to claim 17, which has a base sequence consisting of 5 bases.

19. The nucleic acid according to claim 18, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.

20. The nucleic acid according to claim 18, which is a forward primer in a nucleic acid amplification method.

21. The base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary 3 ′ in the base sequence
A nucleic acid for detecting Candida albicans having a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the terminal or a base sequence hybridizing with the base sequence under stringent conditions.

22. At least one continuation from the 3 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil)
22. The nucleic acid according to claim 21, which has a base sequence consisting of 5 bases.

23. The nucleic acid according to claim 22, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil).

24. The nucleic acid according to claim 22, which is a reverse primer in a nucleic acid amplification method.

25. The base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing (though thymine at any position may be replaced with uracil) or its complementary 3 ′ in the base sequence
A nucleic acid for detecting Candida glabrata having a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the terminal or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions.

26. At least one continuation from the 3 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil)
26. The nucleic acid according to claim 25, having a base sequence consisting of 5 bases.

27. The nucleic acid according to claim 26, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.

28. The nucleic acid according to claim 26, which is a reverse primer in a nucleic acid amplification method.

29. The base sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary 3 ′ in the base sequence
A nucleic acid for detecting Candida parapsilosis having a nucleotide sequence consisting of at least 15 nucleotides continuous from the terminal or a nucleotide sequence hybridizing with the nucleotide sequence under stringent conditions.

30. At least one continuation from the 3 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil)
30. The nucleic acid according to claim 29 having a base sequence consisting of 5 bases.

31. The nucleic acid according to claim 30, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.

32. The nucleic acid according to claim 30, which is a reverse primer in a nucleic acid amplification method.

33. The base sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary 3 ′ in the base sequence
A nucleic acid for detecting Candida tropicalis having a base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the terminal or a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions.

34. At least one continuation from the 3 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (provided that thymine at any position may be substituted with uracil)
34. The nucleic acid according to claim 33 having a base sequence consisting of 5 bases.

35. The nucleic acid according to claim 34, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.

36. The nucleic acid according to claim 34, which is a forward primer in a nucleic acid amplification method.

37. A base sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) or its complementary base sequence at least from the 3 ′ end in the base sequence. A nucleic acid for detecting Candida dubliniensis having a base sequence consisting of 15 bases or a base sequence hybridizable with the base sequence under stringent conditions.

38. A base sequence consisting of at least 15 bases continuous from the 3 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing (though thymine at any position may be substituted with uracil) 38. The nucleic acid of claim 37 having

39. The nucleic acid according to claim 38, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.

40. The nucleic acid according to claim 38, which is a reverse primer in a nucleic acid amplification method.

41. A method for detecting Candida albicans using the nucleic acid for detecting Candida albicans according to any one of claims 1 to 4 and 21 to 24.

42. A method for detecting Candida glabrata using the nucleic acid for detecting Candida glabrata according to any one of claims 5 to 8 and 25 to 28.

43. A method for detecting Candida parapsilosis using the nucleic acid for detecting Candida parapsilosis according to any one of claims 9 to 12 and 29 to 32.

44. Claims 13 to 16 and 33.
37. A method for detecting Candida tropicalis using the nucleic acid for detecting Candida tropicalis according to any one of claims 36 to 36.

45. Claims 17 to 20 and 37.
41. A method for detecting Candida dubliniensis using the nucleic acid for detecting Candida dubliniensis according to any one of 40 to 40.

46. A method comprising performing a nucleic acid amplification method using the forward primer according to claim 4 and the reverse primer according to claim 24, and detecting an amplification product.
Candida albicans detection method.

47. A method comprising performing a nucleic acid amplification method using the forward primer according to claim 8 and the reverse primer according to claim 28, and detecting an amplification product.
How to detect Candida glabrata.

48. A method for detecting Candida parapsilosis, comprising performing nucleic acid amplification using the forward primer according to claim 12 and the reverse primer according to claim 32, and detecting an amplification product.

49. A method for detecting Candida tropicalis, comprising performing a nucleic acid amplification method using the forward primer according to claim 16 and the reverse primer according to claim 36, and detecting an amplification product.

50. A method for detecting Candida dubriniensis, comprising performing a nucleic acid amplification method using the forward primer according to claim 20 and the reverse primer according to claim 40, and detecting an amplification product. .

51. A reagent kit for detecting Candida albicans comprising the nucleic acid for detecting Candida albicans according to any one of claims 1 to 4 and 21 to 24.

52. A reagent kit for detecting Candida glabrata comprising the nucleic acid for detecting Candida glabrata according to any one of claims 5 to 8 and 25 to 28.

53. A reagent kit for detecting Candida parapsilosis comprising the nucleic acid for detecting Candida parapsilosis according to any one of claims 9 to 12 and 29 to 32.

54. Claims 13 to 16 and 33.
37. A reagent kit for detecting Candida tropicalis comprising the nucleic acid for detecting Candida tropicalis according to any one of claims 36 to 36.

55. Claims 17 to 20 and 37.
41. A reagent kit for detecting Candida dubliniensis according to any one of claims 40 to 40.