JP2002125684A - Ｍａｄｓボックス遺伝子を標的とした植物の花型の改良 - Google Patents
Ｍａｄｓボックス遺伝子を標的とした植物の花型の改良Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 MADSボックス型転写因子を標的として植物の
花型を改変することにより、新たな美的価値を有する観
賞用植物を作出することを課題とする。 【解決手段】 pMADS3のプロモーター領域を含むゲノム
DNAを単離し、これをレポーター遺伝子に連結し、アグ
ロバクテリウムを介してペチュニアに導入した結果、驚
くべきことに、該植物体の雄ずいが花弁様の構造に転換
して二重咲きとなった。
花型を改変することにより、新たな美的価値を有する観
賞用植物を作出することを課題とする。 【解決手段】 pMADS3のプロモーター領域を含むゲノム
DNAを単離し、これをレポーター遺伝子に連結し、アグ
ロバクテリウムを介してペチュニアに導入した結果、驚
くべきことに、該植物体の雄ずいが花弁様の構造に転換
して二重咲きとなった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学的手法
を利用した植物の花型の改変に関する。
を利用した植物の花型の改変に関する。
【０００２】
【従来の技術】花弁が二重またはそれ以上になる多重咲
きの形質は園芸植物の観賞性における重要な要素の一つ
である。多重咲きなどの花の形態上の形質を、遺伝子工
学の手法によって園芸品種に導入できれば、従来の交配
育種で行われていた品種育成と比べて短時間で多様な品
種を作製することができる。
きの形質は園芸植物の観賞性における重要な要素の一つ
である。多重咲きなどの花の形態上の形質を、遺伝子工
学の手法によって園芸品種に導入できれば、従来の交配
育種で行われていた品種育成と比べて短時間で多様な品
種を作製することができる。
【０００３】MADSボックス遺伝子は、MADSボックスと呼
ばれる保存性領域を含む転写因子をコードする遺伝子
で、30以上の遺伝子からなる遺伝子ファミリーを形成し
ている。その多くは転写制御を介して植物の形態形成や
器官形成を制御していることが判明している。花の器官
形成に関与する3つのクラス（ABCモデル）のホメオティ
ック遺伝子の多くは、MADSボックス遺伝子であり、詳細
に研究されている（酒井一，花の形態形成の分子遺伝
学，新版「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）150-
163 (2000)、後藤弘爾，花の形態形成ー花開く植物分
子遺伝学ー，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）
52-61 (1994)、Weigel, D., and Meyerowitz, E. M. Ce
ll 78, 203-209 (1994)）。ペチュニアから単離されたM
ADSボックス型転写因子の一つであるpMADS3（ペチュニ
ア由来のMADS3）は、花の器官の特異性決定に関与する
ホメオティック遺伝子である。その構造および発現パタ
ーンから花のABCモデルではCクラスに属するとされてい
る。ペチュニアの植物体全体にpMADS3遺伝子を発現する
形質転換体では、花弁の先端に葯が形成される（雄しべ
化）、まれにがく片の先端に雌しべ様の構造が形成され
る、などのホメオティック変異が表れることが判明して
いる。この事実もまたMADS3がCクラス遺伝子であること
を示している（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant
Cell 5, 843-853.、高辻博志，花の器官分化を制御する
転写調節因子，「植物の形を決める分子機構」（秀潤
社）96-106 (1994)）。pMADS3に関しては、そのcDNA配
列が文献（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell
5, 843-853.）に報告されている。このようにMADSボッ
クス型転写因子とその植物の花の器官形成における機能
に関しては複数の報告がなされているものの、いまだMA
DSボックス型転写因子を標的として、多重咲きなど観賞
価値の高い植物の作出に成功したとの報告はなされてい
ない。
ばれる保存性領域を含む転写因子をコードする遺伝子
で、30以上の遺伝子からなる遺伝子ファミリーを形成し
ている。その多くは転写制御を介して植物の形態形成や
器官形成を制御していることが判明している。花の器官
形成に関与する3つのクラス（ABCモデル）のホメオティ
ック遺伝子の多くは、MADSボックス遺伝子であり、詳細
に研究されている（酒井一，花の形態形成の分子遺伝
学，新版「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）150-
163 (2000)、後藤弘爾，花の形態形成ー花開く植物分
子遺伝学ー，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）
52-61 (1994)、Weigel, D., and Meyerowitz, E. M. Ce
ll 78, 203-209 (1994)）。ペチュニアから単離されたM
ADSボックス型転写因子の一つであるpMADS3（ペチュニ
ア由来のMADS3）は、花の器官の特異性決定に関与する
ホメオティック遺伝子である。その構造および発現パタ
ーンから花のABCモデルではCクラスに属するとされてい
る。ペチュニアの植物体全体にpMADS3遺伝子を発現する
形質転換体では、花弁の先端に葯が形成される（雄しべ
化）、まれにがく片の先端に雌しべ様の構造が形成され
る、などのホメオティック変異が表れることが判明して
いる。この事実もまたMADS3がCクラス遺伝子であること
を示している（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant
Cell 5, 843-853.、高辻博志，花の器官分化を制御する
転写調節因子，「植物の形を決める分子機構」（秀潤
社）96-106 (1994)）。pMADS3に関しては、そのcDNA配
列が文献（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell
5, 843-853.）に報告されている。このようにMADSボッ
クス型転写因子とその植物の花の器官形成における機能
に関しては複数の報告がなされているものの、いまだMA
DSボックス型転写因子を標的として、多重咲きなど観賞
価値の高い植物の作出に成功したとの報告はなされてい
ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、MADS
ボックス型転写因子を標的として植物の花型を改変する
ことにより、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出
することを課題とする。
ボックス型転写因子を標的として植物の花型を改変する
ことにより、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出
することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】pMADS3遺伝子は、その発
現が雄しべと雌しべに特異的であることが判明している
（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell 5, 843-
853.、高辻博志，花の器官分化を制御する転写調節因
子，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）96-106
(1994)）。そこで、本発明者らは、まず、このような組
織特異性をもつpMADS3のプロモーター領域を含むゲノム
DNAの単離を試み、ペチュニアのゲノムライブラリーか
ら目的のDNAを単離した。次いで、単離したゲノムDNAの
組織特異的プロモーター活性を検出するために、これを
レポーター遺伝子であるGUS遺伝子に連結し、アグロバ
クテリウムを介してペチュニアに導入した。
現が雄しべと雌しべに特異的であることが判明している
（Tsuchimoto, S.et al., (1993). Plant Cell 5, 843-
853.、高辻博志，花の器官分化を制御する転写調節因
子，「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）96-106
(1994)）。そこで、本発明者らは、まず、このような組
織特異性をもつpMADS3のプロモーター領域を含むゲノム
DNAの単離を試み、ペチュニアのゲノムライブラリーか
ら目的のDNAを単離した。次いで、単離したゲノムDNAの
組織特異的プロモーター活性を検出するために、これを
レポーター遺伝子であるGUS遺伝子に連結し、アグロバ
クテリウムを介してペチュニアに導入した。
【０００６】その結果、驚くべきことに、この遺伝子導
入により、ペチュニア植物体におけるpMADS3遺伝子のサ
イレンシングが生じ、該植物体の雄ずいが花弁様の構造
に転換して二重咲きとなった。このような二重咲きの形
質は12系統のうち5系統の形質転換体において認められ
た。また、該植物体は、二重咲きになると同時に、花弁
化した雄ずいの内側の領域には未熟な二次花およびがく
片様花弁様器官が生じた。即ち、本発明者らは、ペチュ
ニア植物体への遺伝子導入により生じたpMADS3遺伝子の
サイレンシングにより、偶然にも、多重咲きという観賞
用植物として有用な形質を有するペチュニア植物体を作
出することに成功した。以上の結果は、植物体における
MADS3遺伝子の機能を抑制することにより、その花型を
改良しうることを示すものである。
入により、ペチュニア植物体におけるpMADS3遺伝子のサ
イレンシングが生じ、該植物体の雄ずいが花弁様の構造
に転換して二重咲きとなった。このような二重咲きの形
質は12系統のうち5系統の形質転換体において認められ
た。また、該植物体は、二重咲きになると同時に、花弁
化した雄ずいの内側の領域には未熟な二次花およびがく
片様花弁様器官が生じた。即ち、本発明者らは、ペチュ
ニア植物体への遺伝子導入により生じたpMADS3遺伝子の
サイレンシングにより、偶然にも、多重咲きという観賞
用植物として有用な形質を有するペチュニア植物体を作
出することに成功した。以上の結果は、植物体における
MADS3遺伝子の機能を抑制することにより、その花型を
改良しうることを示すものである。
【０００７】即ち、本発明は、MADS3遺伝子の機能の抑
制による植物の花形の改変に関し、より詳しくは、
（１） 植物の花型を改変するために用いる、下記
（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA、 （ａ）MADS3遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスR
NAをコードするDNA。 （ｂ）MADS3遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボ
ザイム活性を有するRNAをコードするDNA。 （ｃ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、
MADS3遺伝子の発現を抑制させるRNAをコードし、MADS3
遺伝子と90％以上の相同性を有するDNA。 （ｄ）植物細胞における内在性のMADS3タンパク質に対
してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質を
コードするDNA。 （２） 植物の花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二
次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる
群より選択される少なくとも一つである、（１）に記載
のDNA、（３） （１）または（２）に記載のDNAを含む
ベクター、（４） （１）または（２）に記載のDNAま
たは（３）に記載のベクターを保持する形質転換植物細
胞、（５） （４）に記載の形質転換植物細胞を含む形
質転換植物体、（６） （５）に記載の形質転換植物体
の子孫またはクローンである、形質転換植物体、（７）
野生型植物と比較して花型が改変されている、（５）
または（６）に記載の植物体、（８） 花型の改変が雄
ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花
弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一
つである、（７）に記載の植物体、（９） （５）から
（８）のいずれかに記載の植物体の繁殖材料、（１０）
花型が改変された植物を製造する方法であって、
（ａ）（１）に記載のDNAまたは該DNAを含むベクターを
植物細胞に導入する工程、および（ｂ）該植物細胞から
植物体を再生させる工程、を含む方法、（１１） 植物
の花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、
およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択さ
れる少なくとも一つである、（１０）に記載の方法、を
提供するものである。
制による植物の花形の改変に関し、より詳しくは、
（１） 植物の花型を改変するために用いる、下記
（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA、 （ａ）MADS3遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスR
NAをコードするDNA。 （ｂ）MADS3遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボ
ザイム活性を有するRNAをコードするDNA。 （ｃ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、
MADS3遺伝子の発現を抑制させるRNAをコードし、MADS3
遺伝子と90％以上の相同性を有するDNA。 （ｄ）植物細胞における内在性のMADS3タンパク質に対
してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質を
コードするDNA。 （２） 植物の花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二
次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる
群より選択される少なくとも一つである、（１）に記載
のDNA、（３） （１）または（２）に記載のDNAを含む
ベクター、（４） （１）または（２）に記載のDNAま
たは（３）に記載のベクターを保持する形質転換植物細
胞、（５） （４）に記載の形質転換植物細胞を含む形
質転換植物体、（６） （５）に記載の形質転換植物体
の子孫またはクローンである、形質転換植物体、（７）
野生型植物と比較して花型が改変されている、（５）
または（６）に記載の植物体、（８） 花型の改変が雄
ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花
弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一
つである、（７）に記載の植物体、（９） （５）から
（８）のいずれかに記載の植物体の繁殖材料、（１０）
花型が改変された植物を製造する方法であって、
（ａ）（１）に記載のDNAまたは該DNAを含むベクターを
植物細胞に導入する工程、および（ｂ）該植物細胞から
植物体を再生させる工程、を含む方法、（１１） 植物
の花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、
およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択さ
れる少なくとも一つである、（１０）に記載の方法、を
提供するものである。
【０００８】なお、本発明において「MADS3遺伝子」と
は、ペチュニア由来のMADS3遺伝子（pMADS3遺伝子）お
よび他の植物におけるその相同遺伝子を意味する。本発
明において「雄ずい」とは、種子植物の花の器官の１種
で、雄性生殖器官であり、花糸の先端に葯がついた構造
を有する器官を意味する。本発明において、「花弁」と
は、花冠(corolla)を構成している裸花葉を意味する。
本発明において、「二次花」とは、花の内部に生じ、本
来の（外の）花と同様の構造をしている構造体を意味す
る。本発明において、「がく片様花弁様構造」とは、一
つの花器官の中にがく片の特徴を示す部分と花弁の特徴
を示す部分とをモザイク状に含む構造体を意味する。
は、ペチュニア由来のMADS3遺伝子（pMADS3遺伝子）お
よび他の植物におけるその相同遺伝子を意味する。本発
明において「雄ずい」とは、種子植物の花の器官の１種
で、雄性生殖器官であり、花糸の先端に葯がついた構造
を有する器官を意味する。本発明において、「花弁」と
は、花冠(corolla)を構成している裸花葉を意味する。
本発明において、「二次花」とは、花の内部に生じ、本
来の（外の）花と同様の構造をしている構造体を意味す
る。本発明において、「がく片様花弁様構造」とは、一
つの花器官の中にがく片の特徴を示す部分と花弁の特徴
を示す部分とをモザイク状に含む構造体を意味する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において、植物の花型の改
変の標的となるMADS3遺伝子としては、その遺伝子を保
有する植物が花の器官形成を制御するものであれば特に
制限はない。好ましくはペチュニア、トレニア、トルコ
ギキョウなどの観賞用植物のMADS3遺伝子である。本発
明において「花型が改変されている」とは、野生型植物
の花型と比較して対象植物の花型が相違し、この相違が
人為的に生じたものであることを意味する。本発明にお
ける花型の改変には、雄ずいの花弁への転化、二次花の
形成、およびがく片様花弁様構造の形成が含まれる。そ
の中でも、花の美的価値の増加への効果が大きいという
観点から、雄ずいの花弁への転化が好ましい。
変の標的となるMADS3遺伝子としては、その遺伝子を保
有する植物が花の器官形成を制御するものであれば特に
制限はない。好ましくはペチュニア、トレニア、トルコ
ギキョウなどの観賞用植物のMADS3遺伝子である。本発
明において「花型が改変されている」とは、野生型植物
の花型と比較して対象植物の花型が相違し、この相違が
人為的に生じたものであることを意味する。本発明にお
ける花型の改変には、雄ずいの花弁への転化、二次花の
形成、およびがく片様花弁様構造の形成が含まれる。そ
の中でも、花の美的価値の増加への効果が大きいという
観点から、雄ずいの花弁への転化が好ましい。
【００１０】本発明における植物の花型の改変は、MADS
3遺伝子の機能を抑制することにより行なう。ここで「M
ADS3遺伝子の機能の抑制」とは、MADS3遺伝子の転写か
らMADS3タンパク質の機能の発現に至るいずれかの過程
が阻害されることを意味し、MADS3遺伝子の発現（転写
および翻訳）の抑制およびMADS3タンパク質の機能の抑
制が含まれる。ここでいう「抑制」には、完全な抑制の
みならず部分的な抑制も含まれる。
3遺伝子の機能を抑制することにより行なう。ここで「M
ADS3遺伝子の機能の抑制」とは、MADS3遺伝子の転写か
らMADS3タンパク質の機能の発現に至るいずれかの過程
が阻害されることを意味し、MADS3遺伝子の発現（転写
および翻訳）の抑制およびMADS3タンパク質の機能の抑
制が含まれる。ここでいう「抑制」には、完全な抑制の
みならず部分的な抑制も含まれる。
【００１１】本発明における植物の花型の改変は、植物
の内在性のMADS3遺伝子の発現を抑制することにより行
うことができる。植物における特定の内在性遺伝子の発
現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用す
る方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞に
おけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子
発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRN
Aが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初
めて実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, (1986) Pro
c.Natl.Acad.USA.83:5372)。その後、タバコやペチュニ
アにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺
伝子の発現を低下させる例が報告されており(A.R.van d
er Krolら (1988) Nature 333:866)、現在では植物にお
ける遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
の内在性のMADS3遺伝子の発現を抑制することにより行
うことができる。植物における特定の内在性遺伝子の発
現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用す
る方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞に
おけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子
発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRN
Aが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初
めて実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, (1986) Pro
c.Natl.Acad.USA.83:5372)。その後、タバコやペチュニ
アにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺
伝子の発現を低下させる例が報告されており(A.R.van d
er Krolら (1988) Nature 333:866)、現在では植物にお
ける遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００１２】アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑
制する作用としては、以下のような複数の要因が存在す
る。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポ
リメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた
部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進み
つつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イ
ントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成に
よるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位と
のハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAと
のハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、
キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド
形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位
とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン
近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による
翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハ
イブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核
酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成
による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、ス
プライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝
子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講
座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東
京化学同人,pp.319-347,1993)。
制する作用としては、以下のような複数の要因が存在す
る。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポ
リメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた
部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進み
つつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イ
ントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成に
よるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位と
のハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAと
のハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、
キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド
形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位
とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン
近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による
翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハ
イブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核
酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成
による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、ス
プライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝
子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講
座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東
京化学同人,pp.319-347,1993)。
【００１３】本発明で用いられるアンチセンス配列は、
上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよ
い。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非
翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺
伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域
もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得
る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領
域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利
用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアン
チセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結さ
れ、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連
結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方
法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNA
の配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子または
その一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝
子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなく
てもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写
産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％
以上の相補性を有する。配列の相補性は、上記した検索
により決定することができる。アンチセンス配列を用い
て、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチ
センスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好
ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基
以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さ
は5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよ
い。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非
翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺
伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域
もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得
る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領
域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利
用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアン
チセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結さ
れ、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連
結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方
法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNA
の配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子または
その一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝
子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなく
てもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写
産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％
以上の相補性を有する。配列の相補性は、上記した検索
により決定することができる。アンチセンス配列を用い
て、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチ
センスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好
ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基
以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さ
は5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００１４】なお、pMASD3遺伝子の機能を抑制するため
のDNA構築物を作製するために参考となるペチュニア由
来のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：１に示す。cDNA
の配列については文献（Tsuchimoto, S.et al., (199
3). Plant Cell 5, 843-853.、高辻博志，花の器官分化
を制御する転写調節因子，「植物の形を決める分子機
構」（秀潤社）96-106 (1994)）に開示されている。
のDNA構築物を作製するために参考となるペチュニア由
来のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：１に示す。cDNA
の配列については文献（Tsuchimoto, S.et al., (199
3). Plant Cell 5, 843-853.、高辻博志，花の器官分化
を制御する転写調節因子，「植物の形を決める分子機
構」（秀潤社）96-106 (1994)）に開示されている。
【００１５】ペチュニア以外の植物由来のDNAについて
は、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術（Sout
hern, E.M.: Journal of Molecular Biology, Vol. 98,
503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Sai
ki, R. K. et al. Science,vol.230, 1350-1354, 198
5、Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1
988）を利用して単離し、その配列を決定することがで
きる。このようなDNAを単離するためには、好ましくは
ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反
応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件とは、6M尿素、0.4% SDS、0.5x SSCの条件またはこ
れと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例
えば、6M尿素、0.4% SDS、0.1x SSCの条件を用れば、よ
り相同性の高いDNAの効率的な単離を期待することがで
きる。単離したDNAは公知の塩基配列決定法によりその
塩基配列を解読することができる。
は、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術（Sout
hern, E.M.: Journal of Molecular Biology, Vol. 98,
503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Sai
ki, R. K. et al. Science,vol.230, 1350-1354, 198
5、Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1
988）を利用して単離し、その配列を決定することがで
きる。このようなDNAを単離するためには、好ましくは
ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反
応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件とは、6M尿素、0.4% SDS、0.5x SSCの条件またはこ
れと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例
えば、6M尿素、0.4% SDS、0.1x SSCの条件を用れば、よ
り相同性の高いDNAの効率的な単離を期待することがで
きる。単離したDNAは公知の塩基配列決定法によりその
塩基配列を解読することができる。
【００１６】内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボ
ザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能であ
る。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことを
いう。リボザイムには種々の活性を有するものがある
が、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研
究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザ
イムの設計が可能となった。リボザイムには、グループ
Ｉイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400
ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘ
ッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活
性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子,
(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。
ザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能であ
る。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことを
いう。リボザイムには種々の活性を有するものがある
が、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研
究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザ
イムの設計が可能となった。リボザイムには、グループ
Ｉイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400
ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘ
ッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活
性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子,
(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。
【００１７】例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自
己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断する
が、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重
要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断され
ることが示されている(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett.
228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRN
A配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のU
C、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切
断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumi
ら,(1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄
子,(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191、M.Koizumiら, (19
89) Nucleic Acids Res. 17:7059)。pMADS3遺伝子中に
は標的となりうる部位が複数存在する。
己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断する
が、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重
要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断され
ることが示されている(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett.
228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRN
A配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のU
C、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切
断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumi
ら,(1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄
子,(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191、M.Koizumiら, (19
89) Nucleic Acids Res. 17:7059)。pMADS3遺伝子中に
は標的となりうる部位が複数存在する。
【００１８】また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の
目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例
えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAの
マイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,
1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こ
すように設計できることが示されている(Y.Kikuchiおよ
びN.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、菊池
洋, (1992) 化学と生物 30:112)。
目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例
えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAの
マイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,
1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こ
すように設計できることが示されている(Y.Kikuchiおよ
びN.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、菊池
洋, (1992) 化学と生物 30:112)。
【００１９】標的を切断できるよう設計されたリボザイ
ムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザ
イクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターお
よび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写
されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されて
いると、リボザイムの活性が失われてしまうことがあ
る。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNA
からリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボ
ザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシ
スに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも
可能である(K.Tairaら, (1990) Protein Eng. 3:733、
A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA. 86:4823、C.A.GrosshansおよびR.T.Cech
(1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、K.Tairaら (199
1) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構
成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を
切断できるようにして、より効果を高めることもできる
(N.Yuyamaら Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,19
92)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的とな
る遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現
を抑制することができる。
ムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザ
イクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターお
よび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写
されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されて
いると、リボザイムの活性が失われてしまうことがあ
る。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNA
からリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボ
ザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシ
スに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも
可能である(K.Tairaら, (1990) Protein Eng. 3:733、
A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA. 86:4823、C.A.GrosshansおよびR.T.Cech
(1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、K.Tairaら (199
1) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構
成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を
切断できるようにして、より効果を高めることもできる
(N.Yuyamaら Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,19
92)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的とな
る遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現
を抑制することができる。
【００２０】内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標
的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNA
の形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成
されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と
同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換に
より導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性
遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共
抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においては
しばしば観察される(Curr. Biol. 7:R793, 1997; Curr.
Biol. 6:810, 1996)。例えば、MADS3遺伝子が共抑制さ
れた植物体を得るためには、MADS3遺伝子若しくはこれ
と類似した配列を有するDNAを発現できるように作製し
たベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植
物体から目的の表現型を有する植物、例えば、雄ずいが
花弁化した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝
子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、塩
基レベルで、少なくとも70％以上、好ましくは80％以
上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の
配列の同一性を有する。
的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNA
の形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成
されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と
同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換に
より導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性
遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共
抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においては
しばしば観察される(Curr. Biol. 7:R793, 1997; Curr.
Biol. 6:810, 1996)。例えば、MADS3遺伝子が共抑制さ
れた植物体を得るためには、MADS3遺伝子若しくはこれ
と類似した配列を有するDNAを発現できるように作製し
たベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植
物体から目的の表現型を有する植物、例えば、雄ずいが
花弁化した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝
子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、塩
基レベルで、少なくとも70％以上、好ましくは80％以
上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の
配列の同一性を有する。
【００２１】アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karl
in and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 90:5873-5877, 1993)によって決定するこ
とができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBL
ASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul
et al. J.Mol.Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づ
いてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラ
メーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とす
る。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配
列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore
= 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプ
ログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルト
パラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手
法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
in and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 90:5873-5877, 1993)によって決定するこ
とができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBL
ASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul
et al. J.Mol.Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づ
いてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラ
メーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とす
る。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配
列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore
= 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプ
ログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルト
パラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手
法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００２２】さらに、本発明における内在性遺伝子の機
能の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質
を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達
成することができる。本発明において「ドミナントネガ
ティブの形質を有するタンパク質をコードするDNA」と
は、該DNAを発現させることによって、植物体が本来持
つ本発明の内在性遺伝子がコードするタンパク質の活性
を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコ
ードするDNAのことを指す。例えば、本発明のタンパク
質の転写活性化ドメインが欠失し、DNA結合能を有する
ペプチドをコードするDNAである。
能の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質
を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達
成することができる。本発明において「ドミナントネガ
ティブの形質を有するタンパク質をコードするDNA」と
は、該DNAを発現させることによって、植物体が本来持
つ本発明の内在性遺伝子がコードするタンパク質の活性
を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコ
ードするDNAのことを指す。例えば、本発明のタンパク
質の転写活性化ドメインが欠失し、DNA結合能を有する
ペプチドをコードするDNAである。
【００２３】MADS3遺伝子の機能が抑制された形質転換
植物体を作製する場合には、MADS3遺伝子の機能を抑制
するための上記DNAを適当なベクターに挿入して、これ
を植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物
細胞を再生させればよい。植物細胞の形質転換に用いら
れるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現さ
せることが可能なものであれば特に制限はない。例え
ば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプ
ロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの
35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激によ
り誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクター
を用いることも可能である。また、組織特異的プロモー
ター、例えば、pMADS3プロモーターを用いることも好適
である。
植物体を作製する場合には、MADS3遺伝子の機能を抑制
するための上記DNAを適当なベクターに挿入して、これ
を植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物
細胞を再生させればよい。植物細胞の形質転換に用いら
れるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現さ
せることが可能なものであれば特に制限はない。例え
ば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプ
ロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの
35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激によ
り誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクター
を用いることも可能である。また、組織特異的プロモー
ター、例えば、pMADS3プロモーターを用いることも好適
である。
【００２４】本発明においてベクターの導入される植物
細胞は、植物体を再生しうる限りその形態に特に制限は
ない。例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切
片、カルスなどが含まれる。植物細胞へのベクターの導
入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレク
トロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方
法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法
を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体
の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法
で行うことが可能である。例えば、ペチュニアにおいて
は、オーキシン（IAA：indole acetic acid）およびサ
イトカイニン（BAP:benzylaminopurine）を含む培地上
でシュートを再生させた後、IBA（indole butyric aci
d）を含む培地上で発根させて生育させる(van der Mee
r, I.M. (1999), Methods Mol Biol 111, 327-334.)。
トレニア、タバコ、ガーベラ(Elomaa, P., Mehto, M.,
Kotilainen, M., Helariutta, Y., Nevalainen, L., an
d Teeri, T. H. (1998), PlantJ 16, 93-109.)でも類似
の方法で植物体を再生させることができる。
細胞は、植物体を再生しうる限りその形態に特に制限は
ない。例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切
片、カルスなどが含まれる。植物細胞へのベクターの導
入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレク
トロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方
法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法
を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体
の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法
で行うことが可能である。例えば、ペチュニアにおいて
は、オーキシン（IAA：indole acetic acid）およびサ
イトカイニン（BAP:benzylaminopurine）を含む培地上
でシュートを再生させた後、IBA（indole butyric aci
d）を含む培地上で発根させて生育させる(van der Mee
r, I.M. (1999), Methods Mol Biol 111, 327-334.)。
トレニア、タバコ、ガーベラ(Elomaa, P., Mehto, M.,
Kotilainen, M., Helariutta, Y., Nevalainen, L., an
d Teeri, T. H. (1998), PlantJ 16, 93-109.)でも類似
の方法で植物体を再生させることができる。
【００２５】一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入され
た形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖
または無性生殖により子孫を得ることが可能である。ま
た、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料
（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カル
ス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体
を量産することも可能である。本発明には、本発明のDN
Aが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物
体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、
およびクローンの繁殖材料が含まれる。本発明の植物体
は、花の器官形成を行なう植物であれば特に制限はない
が、特に観賞用植物であることが好ましい。
た形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖
または無性生殖により子孫を得ることが可能である。ま
た、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料
（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カル
ス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体
を量産することも可能である。本発明には、本発明のDN
Aが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物
体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、
およびクローンの繁殖材料が含まれる。本発明の植物体
は、花の器官形成を行なう植物であれば特に制限はない
が、特に観賞用植物であることが好ましい。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例を制限するものではな
い。
明するが、本発明はこれら実施例を制限するものではな
い。
【００２７】[実施例１] pMADS3ゲノムDNAの単離 pMADS3遺伝子のcDNAを通常のランダムプライム法(Sambr
ook, J., et al., (1989). Molecular Cloning, 2 Edit
ion (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Labora
tory Press))を用いて[32P]dCTPで標識して放射性標識D
NAプローブを作製し、これを用いてEMBL3ベクター（Str
atagene）中に作製したペチュニア（Petunia hybrida v
ar. Mitchell）のゲノミックライブラリーをスクリーニ
ングした。その結果得られたクローンに含まれる約8.9k
bのゲノムDNA断片をpBluescriptベクター（Stratagen
e）のSal I-Spe Iサイトにサブクローニングし(pBS/pMA
DS3)、DNA塩基配列を決定した後（配列番号：１）、報
告されているcDNA配列(Tsuchimoto, S.et al.,(1993).
Plant Cell 5, 843-853)からオープンリーディングフレ
ームを推定した（図1a）。
ook, J., et al., (1989). Molecular Cloning, 2 Edit
ion (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Labora
tory Press))を用いて[32P]dCTPで標識して放射性標識D
NAプローブを作製し、これを用いてEMBL3ベクター（Str
atagene）中に作製したペチュニア（Petunia hybrida v
ar. Mitchell）のゲノミックライブラリーをスクリーニ
ングした。その結果得られたクローンに含まれる約8.9k
bのゲノムDNA断片をpBluescriptベクター（Stratagen
e）のSal I-Spe Iサイトにサブクローニングし(pBS/pMA
DS3)、DNA塩基配列を決定した後（配列番号：１）、報
告されているcDNA配列(Tsuchimoto, S.et al.,(1993).
Plant Cell 5, 843-853)からオープンリーディングフレ
ームを推定した（図1a）。
【００２８】[実施例２] pMADS3をコードするポリヌク
レオチドを含む植物発現ベクターの構築 内在性のpMADS3遺伝子をサイレンシングする作用を示す
pMADS3-GUS遺伝子を作製するには、以下の手順にしたが
って、推定された転写開始点の約2.6kb上流からMADS3の
第3イントロン開始点のすぐ下流までのDNA断片（約7.2k
b）をGUSコード領域の上流に連結した。まず、pBS/pMAD
S3を鋳型とし、プライマー1(5'-GTGTGGATCCACTAGACCATA
AAAATGTT-3' ：配列番号：２)およびプライマー2(AGTTG
CAAGATGTACGTGGT：配列番号：３)を用いて96℃／45秒の
後、96℃／45秒、55℃／45秒、72℃／4分を30サイクル
した後、72℃／10分の条件でPCR反応を行った（酵素はP
fu polymerase）。これによって得られたDNA断片はイン
トロン2中からエクソン3の5'末端近傍までの領域に対応
し、3'下流末端近傍にBamHI配列を持つ。このDNA断片
を、NsiIおよびBamHIで切断した後pBS/pMADS3のNsiI/Ba
mHIサイトに挿入してpMADS3遺伝子の一部を再構成し、p
BS/pMADS3-Bを得た。DNA塩基配列を確認したのち、SalI
およびBamHIを用いて約7.2kbのpMADS3配列をpBS/pMADS3
-Bから切り出し、pBINPLUS-GUSプラスミド中のβ-D-グ
ルクロニダーゼ(GUS)遺伝子コード領域の上流（SalIIお
よびBamHIサイト）に挿入した。なお、pBINPLUS-GUS
は、pBINPLUS(van Engelen, F. A.et al., (1995). Tra
nsgenic Res 4, 288-290.)のXbaIおよびEcoRIサイトの
間に、pBI221(クロンテック社から購入）から切り出し
たGUSコード領域およびノパリン合成酵素(NOS)のターミ
ネーターを含むXbaI-EcoRI断片を挿入したものである。
構築されたpMADS3-GUS遺伝子は、図1bから明らかなよう
に、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)の35Ｓプロ
モーター領域（P35S; 0.9kb)、本発明のpMADS3遺伝子の
一部を含むポリヌクレオチド（pMADS3; 7.2kb)およびノ
パリン合成酵素のターミネーター領域（Tnos; 0.3kb)か
ら構成されている。図1b中のPnosは、ノパリン合成酵素
のプロモーター領域、NPTIIはネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼII遺伝子を示す。
レオチドを含む植物発現ベクターの構築 内在性のpMADS3遺伝子をサイレンシングする作用を示す
pMADS3-GUS遺伝子を作製するには、以下の手順にしたが
って、推定された転写開始点の約2.6kb上流からMADS3の
第3イントロン開始点のすぐ下流までのDNA断片（約7.2k
b）をGUSコード領域の上流に連結した。まず、pBS/pMAD
S3を鋳型とし、プライマー1(5'-GTGTGGATCCACTAGACCATA
AAAATGTT-3' ：配列番号：２)およびプライマー2(AGTTG
CAAGATGTACGTGGT：配列番号：３)を用いて96℃／45秒の
後、96℃／45秒、55℃／45秒、72℃／4分を30サイクル
した後、72℃／10分の条件でPCR反応を行った（酵素はP
fu polymerase）。これによって得られたDNA断片はイン
トロン2中からエクソン3の5'末端近傍までの領域に対応
し、3'下流末端近傍にBamHI配列を持つ。このDNA断片
を、NsiIおよびBamHIで切断した後pBS/pMADS3のNsiI/Ba
mHIサイトに挿入してpMADS3遺伝子の一部を再構成し、p
BS/pMADS3-Bを得た。DNA塩基配列を確認したのち、SalI
およびBamHIを用いて約7.2kbのpMADS3配列をpBS/pMADS3
-Bから切り出し、pBINPLUS-GUSプラスミド中のβ-D-グ
ルクロニダーゼ(GUS)遺伝子コード領域の上流（SalIIお
よびBamHIサイト）に挿入した。なお、pBINPLUS-GUS
は、pBINPLUS(van Engelen, F. A.et al., (1995). Tra
nsgenic Res 4, 288-290.)のXbaIおよびEcoRIサイトの
間に、pBI221(クロンテック社から購入）から切り出し
たGUSコード領域およびノパリン合成酵素(NOS)のターミ
ネーターを含むXbaI-EcoRI断片を挿入したものである。
構築されたpMADS3-GUS遺伝子は、図1bから明らかなよう
に、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)の35Ｓプロ
モーター領域（P35S; 0.9kb)、本発明のpMADS3遺伝子の
一部を含むポリヌクレオチド（pMADS3; 7.2kb)およびノ
パリン合成酵素のターミネーター領域（Tnos; 0.3kb)か
ら構成されている。図1b中のPnosは、ノパリン合成酵素
のプロモーター領域、NPTIIはネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼII遺伝子を示す。
【００２９】[実施例３] 各融合遺伝子のペチュニア細
胞への導入 （１）アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA440
4株（Clontechから購入）を250μg/mlのストレプトマイ
シンと50μg/mlのリファンピシンを含むＬ培地中、28℃
で培養した。Nagelら(1990)(Microbiol. Lett., 67:32
5)の方法に従って、細胞懸濁液を調製し、実施例2で構
築したプラスミドベクターをエレクトロポレーションに
より、上記菌株に導入した。 （２）各融合遺伝子をコードするポリヌクレオチドのペ
チュニア細胞への導入 上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスLBA4404株をYEB培地（DNA Cloning第２巻、78
頁）で振とう培養（28℃、200rpm)した後、滅菌水で20
倍に希釈し、ペチュニア（Surfinia)の葉片と共存培養
した。2〜3日後、抗生物質を含む培地で上記細菌を除去
し、2週間ごとに選択培地で継代し、上記２種類の融合
遺伝子と共に導入されたpBINPLUS由来のNPTII遺伝子発
現によるカナマイシン抵抗性の有無で形質転換されたペ
チュニア細胞を選抜し、常法によりカルスを誘導した
後、植物体に再分化した(Jorgensen, R. A..et al., (1
996).Plant Mol. Biol. 31, 957-73.)。
胞への導入 （１）アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA440
4株（Clontechから購入）を250μg/mlのストレプトマイ
シンと50μg/mlのリファンピシンを含むＬ培地中、28℃
で培養した。Nagelら(1990)(Microbiol. Lett., 67:32
5)の方法に従って、細胞懸濁液を調製し、実施例2で構
築したプラスミドベクターをエレクトロポレーションに
より、上記菌株に導入した。 （２）各融合遺伝子をコードするポリヌクレオチドのペ
チュニア細胞への導入 上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスLBA4404株をYEB培地（DNA Cloning第２巻、78
頁）で振とう培養（28℃、200rpm)した後、滅菌水で20
倍に希釈し、ペチュニア（Surfinia)の葉片と共存培養
した。2〜3日後、抗生物質を含む培地で上記細菌を除去
し、2週間ごとに選択培地で継代し、上記２種類の融合
遺伝子と共に導入されたpBINPLUS由来のNPTII遺伝子発
現によるカナマイシン抵抗性の有無で形質転換されたペ
チュニア細胞を選抜し、常法によりカルスを誘導した
後、植物体に再分化した(Jorgensen, R. A..et al., (1
996).Plant Mol. Biol. 31, 957-73.)。
【００３０】[実施例４] pMADS3-GUS遺伝子を導入した
形質転換ペチュニアにおける内在性pMADS3遺伝子の発現 pMADS3-GUS遺伝子を導入した形質転換ペチュニアにおけ
る内在性pMADS3遺伝子の発現を調べるため、ノーザンブ
ロット・ハイブリダイゼーション分析を行った。DIG標
識プローブRNAを作製するには、pMADS3 cDNA(Tsuchimot
o, S.et al.,(1993). Plant Cell 5, 843-853)のPstI-E
coRI断片（塩基番号517-1214）をpBluescriptベクター
にサブクローニングし、BglII(塩基番号572)で切断した
後、T7RNAポリメラーゼを用いてDIG標識UTP存在化に転
写反応を行わせた。ハイブリダイゼーションは、反応後
のフィルターの洗浄を68℃で４時間行った以外はBoerin
ger社のマニュアルに従って行った。
形質転換ペチュニアにおける内在性pMADS3遺伝子の発現 pMADS3-GUS遺伝子を導入した形質転換ペチュニアにおけ
る内在性pMADS3遺伝子の発現を調べるため、ノーザンブ
ロット・ハイブリダイゼーション分析を行った。DIG標
識プローブRNAを作製するには、pMADS3 cDNA(Tsuchimot
o, S.et al.,(1993). Plant Cell 5, 843-853)のPstI-E
coRI断片（塩基番号517-1214）をpBluescriptベクター
にサブクローニングし、BglII(塩基番号572)で切断した
後、T7RNAポリメラーゼを用いてDIG標識UTP存在化に転
写反応を行わせた。ハイブリダイゼーションは、反応後
のフィルターの洗浄を68℃で４時間行った以外はBoerin
ger社のマニュアルに従って行った。
【００３１】内在性のpMADS3遺伝子の発現は本来雄ずい
および雌ずいに局在している。ところが、pMADS3-GUS形
質転換体の各花器官からの総RNAを用いてハイブリダイ
ゼーションを行った結果、12系統のうち5系統の形質転
換体において、雄ずいおよび雌ずいにおける内在性pMAD
S3遺伝子の発現が検出されず、pMADS3遺伝子のサイレン
シングが起こっていることが判明した。そのうちの一系
統についての結果を図2に示す。
および雌ずいに局在している。ところが、pMADS3-GUS形
質転換体の各花器官からの総RNAを用いてハイブリダイ
ゼーションを行った結果、12系統のうち5系統の形質転
換体において、雄ずいおよび雌ずいにおける内在性pMAD
S3遺伝子の発現が検出されず、pMADS3遺伝子のサイレン
シングが起こっていることが判明した。そのうちの一系
統についての結果を図2に示す。
【００３２】なお、ここで観察された遺伝子サイレンシ
ングの分子機構としては、転写後の（post-transcripti
onal）サイレンシングと転写時の（transcriptional）
サイレンシングの2種類が知られている。本実験におい
て観察された遺伝子サイレンシングは、pMADS3からのDN
A断片がどの系統の形質転換体においても全くプロモー
ター活性を示さない（サイレンシングが起こっていない
系統でも）などの理由から、一旦転写が起こることが必
須条件である転写後のサイレンシングではなく、転写時
のサイレンシングである可能性が高い。
ングの分子機構としては、転写後の（post-transcripti
onal）サイレンシングと転写時の（transcriptional）
サイレンシングの2種類が知られている。本実験におい
て観察された遺伝子サイレンシングは、pMADS3からのDN
A断片がどの系統の形質転換体においても全くプロモー
ター活性を示さない（サイレンシングが起こっていない
系統でも）などの理由から、一旦転写が起こることが必
須条件である転写後のサイレンシングではなく、転写時
のサイレンシングである可能性が高い。
【００３３】[実施例５] pMADS3-GUS遺伝子を導入した
形質転換ペチュニアにおける花器官のホメオティック変
化 内在性pMADS3遺伝子のサイレンシングが起こった系統の
形質転換体では以下のような共通の表現型が表れた。図
3に示すように、これらの系統の個体では、雄ずいが花
弁化に転換している。その程度には様々で、弱い表現型
の系統では葯の先端のみが小さな花弁に転換し、花糸(f
ilament)にはほとんど変化が認められないのに対し、強
い表現型の系統では雄ずい全体が花弁化していた。強い
表現型の系統でも雄ずいの花弁化は完全ではなく、葯の
構造は残って花粉も形成される。この時、雌ずいはほと
んど正常な外見を呈していた。花弁化した雄ずいと雌ず
いとの間に相当する同心円状領域には、花弁様がく片様
構造物および二次花のつぼみが1個ないし数個形成され
た。それらの構造物の数は不定であり（1〜4個）、系統
間のばらつきおよび同一の個体中の花によるばらつきが
見られた。二次花においても、本来雄ずいになるべき部
分の器官が花弁に転換しており、一次化と同様のホメオ
ティックな変化が生じていることが判明した。なお二次
花は小さなつぼみの段階で生長を停止するので花の外か
らは見えない。
形質転換ペチュニアにおける花器官のホメオティック変
化 内在性pMADS3遺伝子のサイレンシングが起こった系統の
形質転換体では以下のような共通の表現型が表れた。図
3に示すように、これらの系統の個体では、雄ずいが花
弁化に転換している。その程度には様々で、弱い表現型
の系統では葯の先端のみが小さな花弁に転換し、花糸(f
ilament)にはほとんど変化が認められないのに対し、強
い表現型の系統では雄ずい全体が花弁化していた。強い
表現型の系統でも雄ずいの花弁化は完全ではなく、葯の
構造は残って花粉も形成される。この時、雌ずいはほと
んど正常な外見を呈していた。花弁化した雄ずいと雌ず
いとの間に相当する同心円状領域には、花弁様がく片様
構造物および二次花のつぼみが1個ないし数個形成され
た。それらの構造物の数は不定であり（1〜4個）、系統
間のばらつきおよび同一の個体中の花によるばらつきが
見られた。二次花においても、本来雄ずいになるべき部
分の器官が花弁に転換しており、一次化と同様のホメオ
ティックな変化が生じていることが判明した。なお二次
花は小さなつぼみの段階で生長を停止するので花の外か
らは見えない。
【００３４】pMADS3遺伝子は、アラビドプシスのCクラ
ス遺伝子であるAGAMOUSと構造的類似性を示す。また、
第3および第4輪生（whorl）に特異的に発現しており、C
aMV35Sプロモーターによってエクトピックに発現させる
と花弁が雄ずい化する。これらのことからpMADS3はペチ
ュニアのCクラス遺伝子であるといえる。しかしなが
ら、AGAMOUS遺伝子の機能消失（loss-of-function）変
異は、第3輪生（雄ずいが生じるべき領域）に花弁が生
じ、さらに内側に向かってがく片および花弁からなる輪
生が繰り返すという表現型を示すことが報告されている
(Yanofsky, M. F.et al., (1990). Nature 346, 35-3
9)。本実験によって明らかになったpMADS3遺伝子の機能
消失表現型はAGAMOUS遺伝子のそれとは明らかに異なっ
ており、Cクラス遺伝子に分類されても果たす機能が異
なることを示している。
ス遺伝子であるAGAMOUSと構造的類似性を示す。また、
第3および第4輪生（whorl）に特異的に発現しており、C
aMV35Sプロモーターによってエクトピックに発現させる
と花弁が雄ずい化する。これらのことからpMADS3はペチ
ュニアのCクラス遺伝子であるといえる。しかしなが
ら、AGAMOUS遺伝子の機能消失（loss-of-function）変
異は、第3輪生（雄ずいが生じるべき領域）に花弁が生
じ、さらに内側に向かってがく片および花弁からなる輪
生が繰り返すという表現型を示すことが報告されている
(Yanofsky, M. F.et al., (1990). Nature 346, 35-3
9)。本実験によって明らかになったpMADS3遺伝子の機能
消失表現型はAGAMOUS遺伝子のそれとは明らかに異なっ
ており、Cクラス遺伝子に分類されても果たす機能が異
なることを示している。
【００３５】
【発明の効果】本発明により、MADSボックス遺伝子の機
能喪失により花型を改変された植物および該植物を作出
するための方法が提供された。これにより、従来の交配
育種で行われていた品種育成と比べて短時間で多様な品
種を作製することが可能となった。本発明によれば、植
物に多重咲きの形質を付与することができ、これにより
観賞価値のい園芸植物を作出することが可能である。MA
DS3遺伝子の機能を抑制する分子は、この目的のための
薬剤となる。
能喪失により花型を改変された植物および該植物を作出
するための方法が提供された。これにより、従来の交配
育種で行われていた品種育成と比べて短時間で多様な品
種を作製することが可能となった。本発明によれば、植
物に多重咲きの形質を付与することができ、これにより
観賞価値のい園芸植物を作出することが可能である。MA
DS3遺伝子の機能を抑制する分子は、この目的のための
薬剤となる。
【００３６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Resources Bio-oriented Technology Research Advancement Institution. <120> Improvement of flower shape using a MADS-box gene. <130> MOA-A0006 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 8909 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <220> <223> strain="Mitchell" <220> <223> genomic DNA <220> <221> exon <222> (2577)..(2728) <220> <221> intron <222> (2729)..(2986) <220> <221> exon <222> (2987)..(3224) <220> <221> intron <222> (3225)..(7234) <220> <221> exon <222> (7235)..(7316) <220> <221> intron <222> (7317)..(8030) <220> <221> exon <222> (8031)..(8092) <220> <221> intron <222> (8093)..(8218) <220> <221> exon <222> (8219)..(8318) <220> <221> intron <222> (8319)..(8423) <220> <221> exon <222> (8424)..(8469) <220> <221> intron <222> (8470)..(8609) <220> <221> exon <222> (8610)..(8651) <220> <221> intron <222> (8652)..(8742) <220> <221> exon <222> (8743)..(8909) <400> 1 gtcgacctgc aggtcaacgg atcaatgatt ataaacgata tgcttctaga agaggacaca 60 aggaacctca agcttagaaa gcttataaaa aaaacttcac agattttgag aaaagcagat 120 gtcgctatat cttattgcca tagagaagca aatcatgtga ccaatttcat ggctaaattg 180 gcttcctcaa gttgaaatag tacactctat tattccttcc aacaactatc gaaataggtg 240 aagagactat ttcaactaga taagtgacaa ctttcaagca caagaagaag attcagcaaa 300 gctaacatat ttattactcc ctccgtccca aattgagtgt tttacttttc tttttgtttt 360 gtcccaaaat gagtgcgtca ttctatattt agtaagctga caattcaaac atcctacatg 420 gcagatttaa acccacaaat tcaaaggaca ttttagtaca ttacacacat ctttcattta 480 gaaccacaca attgaaaagt ttccctatat ttttaaaatt ttgtgcccag tcaaactaag 540 acactcaatt tgggatggag ggagtagtta ataaaaatat tgtagatgtc gaaacgttct 600 ttcatagtaa agtctcttcc actatatgtt aaagtcatgc aagtttattt ttggaggtaa 660 ggtgcatgtc cccatcttct tcttgtgcaa ttgaatgagt gggcattgta ggagtcaagc 720 caaaaccccc ccaacaccta tagggaatat acctttggtg atggcttaat cttaattaga 780 aaaaaaattg agaagatcac tttcctgaat tctcaaaaat ctttgcaata ttcacgtagt 840 ctcaactttt tcaaaatgac acttagccca ttaagatttt gagaaatgga caagattgta 900 ttagtcccta tcataagaca cctcatgttt atatagcagc gaagcaaatt ttataaccta 960 ttaaattaat ggtgggcgaa aatccgtttg caagcattaa agagttttta ttgaatgacg 1020 acccgcattc tggcttcctt tatttcaaag tggaagttgt acctagtgta cactggttag 1080 aagaagtgga catgacacat caaaaagtta cggcacacct ttgtaaataa cattcatttc 1140 taaccatatc ttctctgtga cttataccca tattgtagtt gcttctaggg ttccaccggt 1200 gtattcttaa ctaagcacaa aaaataaaat aaaatcttcc caggcccaag ttatgttagc 1260 cttagcagtt aatatgtgta ctccttaaag ggaatagaca ttttgaaata tacgcttcat 1320 agtcttttcc ccttatacgt gaatcttgtg acttcagtgg tcaagggaag ctaatgtatt 1380 ttcttgccaa acaatgttat gtcattgcaa tgttaaacat gtctcatggt tggcatagaa 1440 gaatgacaat tcctatgtga aaataagcat taataagagc aaaagaacaa gaatttaggc 1500 taatgtctag agaggactaa cttattgtaa cgtcgaatca gatcaaaagg gtaaggtcaa 1560 aggctaagta gtggcaaatt gagatgagag tgaaattgga tgaagaaatc atgataacct 1620 aacaaagtag acaagaaaat gaaaaaggtg gaaaagagga aattgaattt gttgtatatg 1680 tcattgagca taaccggcca tatagacaaa tttatgtcct tcttcccaaa gaaacaggta 1740 actttttggc atgatggtaa cttgatagat aagtggttgt tcatagatga gtttcaatag 1800 aaaagaaagt agagcactgg atgtcacatg gcagtcacct tctctgttgt cattgcaagt 1860 ttcactgatc tagttctttt ctctttcttt ttcccttgag tgatctattt atagtctgtg 1920 tttaatgtga gagataaaac aaaagatcac aaagtaaaaa ttatgtacac atagggttgg 1980 taaagttaac agaagaaaag tagtgatggt ggggggagaa taggatgtta aaagcaagga 2040 ttccaagtta gtttgggggg gggggggggg aggggagtaa tgggatgtga agttcacatg 2100 tagaaataaa aaaattaaaa tatttgttgg aaaatattca aatggtccaa atcttaaagg 2160 gcttagaaga acattaaaag atctaatccc atttttgaga agcatttaag cttgagtgta 2220 acctagtcca atgtttctct tcacccatca aacatcagag tcactttcag gggtcatttt 2280 ctcaactctg tccacttcct cccaccaccc accccactcc acccccctct cttccaataa 2340 atgattacaa tctaacaaga aattagaata taaacaagag atcaagaaat atgaatggcc 2400 aagaaaggct gattatcatg agataattcc ctaattaacc atctatccta cttgttcaat 2460 acaagccaac aatctgaaaa agagaactat taaagaaata tgtcaaagtt taatgtaaat 2520 tagcataaga ataaacagac aaagaaaatt caagttagtt aatagtaaca taataaatta 2580 aaagaaacac tctttacttt ataaatacct atcccttagt gcaaactctc ttccattttc 2640 tgcatctatc ctctgcagat taatttgcaa aggaagaact aaaagcttct atctcttatt 2700 ccatctccaa atcttctttt cttatcaggt tagcaattaa actaaaaaca tttacacacc 2760 atgtcaaaaa aatcaatttg aaccattttt tgaatgtaac ataaaataag tggttggata 2820 ttgatcaatg caagatagtt tgagttagta tgattaggaa agtattcacc aaattcttta 2880 gcaatcatca ctgattgctt cattttagtt gtattgaaca ataaaaggtc attttttcca 2940 agtttgtcac atagtttttt tttttgtttt tttgtgtttg atataggtgc tgcaatggag 3000 ttccaaagtg atctaacaag agagatctct ccacaaagga aactaggaag aggaaagatt 3060 gagatcaaga ggatcgaaaa cacgacaaat cggcaagtca ctttttgcaa gagacgcaat 3120 ggtttgctca aaaaagccta tgaattatct gtgctctgtg atgctgaagt tgctttgatt 3180 gtcttctcta gccgaggcag gctctatgag tatgccaaca acaggtaatc ttttaacaaa 3240 aaaaattaga aagtgttaat ttcagaaagt ttaatcttta ccttcttgag tctctacagc 3300 tttgtctagc tagctttacc tttcttcttc atttctcact cttcttttct tgcaattctg 3360 tttgtcttcc ttaaaagaga aaataatcgt gattggaaaa tttgcttgtg ttacagaatg 3420 cttaggaaga tctgaacttt aaaaggagaa agatcatgtt gttttgaagt ttttaaacta 3480 agagtttttc cttctaacaa agaattgact ttcctttcct ttcttttttt attgtttaat 3540 aagttttgtt tgtttctatt tttgtgatcc caattttgtt aaaagacttg tagatgtata 3600 gatctgtttg ttgtaaaaat ttgggaaggt actcatcaca actctgagat cagcatagtt 3660 tcttcatttc agtttctgtt atgttttctc tctctcaaag atgaagcaag agagctgtcg 3720 agttctaatt cgcccattta gcccatcatt aaattagagt taatatggga tttagatctt 3780 atagtagtcc tttcacagcc aatgaaaatt cagattaggg ttttgtactt tgttaatagc 3840 tgtgcattac tgtttttgtc ttgaactttg tttctattgg cagagtcaaa cttgccctaa 3900 ttagggtttt tttttttcag ctagaaaatt attggtgttt ttccaattct ctaaattatt 3960 tcttctttaa caataaaatc tcagatatgc ttctcatgtg tagtgcaaat tctagtgttt 4020 tttcttgaaa taaaatgtag aaatccaatc agtgttcaaa gatcaattat agacaaaagt 4080 tgacattctt caaagtgttt ccgttttccc tttttcttta ctttcccttc ctatttctta 4140 aaatgtttta caccgttgag gaaatggggt catctataca ctctactcta gcttagagtt 4200 ttaagaacca gaaatttgtt ggggtgggtg gttggtgtaa gttttgtctc agttacaaga 4260 atctctggtc acgtcataca agattttaca cttgttgaca aatttgagaa aagacatatt 4320 gtgatgaggg aatggtttcc actgagctat ctcttaaatt tctatcttca attgtgtaaa 4380 attgaaaaca ctagctcctt atttttcttt gagatatctc agtttaatgc tttcacaaag 4440 tttctgaaag tgttggaact taaacagcaa agaaacagaa gtggaagaaa gagaagtact 4500 aaaccaatga aaattttact cacttagcta agttttcaat aggatcttgt gcatagatat 4560 atttgcgtaa gacatgtaat agagttcggg gggggggggt ggatgggtgg gtgttgagaa 4620 agagatcaga catagatccg tacaatttat attccaacca atgagagagt tctgaactct 4680 ctggctttct atcttgcatg gtattggctg ctgaaaatgg acggttgtga tgtgatcaga 4740 tgagacagac aagactggat catactattc actttacctt acaacactgt aaaaatatta 4800 ctttattata gattattgat aaaatgcctt tgaaacaaaa ccctaggtgg gtaaaaacct 4860 agagttgaat ggtattaccc aaggaataac tggtacatga tgcgtggcat agatctgaac 4920 cgttgaaaca gtggaccaat catattgtgg gaacttgtgc cagcttggca gagagcagct 4980 aatcagtagc tcgacgaaat taaggttgta agtagactag gaaatgagag tcattcctca 5040 gtgttggttc ttttctttca atctgaaggt ctatactaga aaatattgta tcaatgtcat 5100 gtttgagtag acagattgag tctgactcaa agcaacactt tgttttttta tttaagctgt 5160 acgtgttggc ctaaattagc aagacataat aggtgtatta aatatggagt aagaaagtat 5220 ctggattttc attacctttt gaacaaaagg gtagtggtta aggcactctt tctatgtttg 5280 cttcaagtga acaagcactc gtgtctaaag atatatgaat agctgaaacc tctctcctta 5340 tgttttggtc cgtagtataa gctttgtttc acgctaaatt aatttctcac gaacttaggt 5400 acaacacttt ttgggggaaa atgacactct gtttttaaag tgtagttgta ataggaaacg 5460 agaaaatttt aagcttaaga gaagattaaa tttgaaactg atattgtcat gagcaatttg 5520 accagtgtgg gcaaataatt aatactctta tctattctat tttatgtagg gacgtttctt 5580 ttttgtgaat tttcaaaata aataaataac tttctaaatt aaaaaataat ttaaattaaa 5640 cttctatatt agtagcacaa atttgttgcc aatactaatc tcactttttt tattttggta 5700 atatttgtag tacccctttc cccaatatat attcttttaa atgtttaaca tcacaagttt 5760 caaaaaaatt ttgattgata ggttcccaac actcttcact tctgctttta attcggtgct 5820 tatcaatact ttgtcaaata aattacgaca aaggtaatta tacctgttgg ctgatttact 5880 atctttgtgt gaaaattagt gaagttcaat actagtaaat aaagatctgg gcaagcttgg 5940 tntacacata cttatcatca catcttatac agatcctttt tcttgcctaa atattggaga 6000 gtacaattaa ttatctttct tcaatttccc atctttactt tgtcaagcca acaaacgact 6060 gcaatttttt tctcttgttt tcttgtattt tccccagtat ctcagcgaag ggtaaatctt 6120 tcatattgat ttatgcaaat gtgtcatttt ccttttcctt tttctccttt cttttcagcc 6180 tttacaccat taaggaagac ttagcaggtg ttaagaacac atagctaact acaactctac 6240 tgtgggaaat gtgttttcac aagttgcttg ttgacagcca aattgaaggg aaatgctctt 6300 tcttttgtta tgtagaatag ctaagcacta gaaacttata acctactagc aaatgatttt 6360 gtgcaagcaa atcttcttta acattattaa ttttcttcct taatctttta agtaccctga 6420 aagctctaga tttgctcgtc tttcatgttt cctaggggag ttgcaagatg tacgtggtca 6480 taagtaatag ccaaaaatca agaatacttt agcaaatgga acaaaccgtg gagatggctt 6540 tggaagatgt tcctttttgt gttcttaatt tttttttttt tttttttttg ggtggaggtg 6600 ggggtggtgg gggcttaaaa tggaacttaa attaatattt aaatatttac aanagtacag 6660 cggaaatagt taatgcatct atttcctctg tttaaaaaaa gatgaaccta ttttttttag 6720 ttcgtttana taaaatgatc tctttctaaa ttttgaaata aacttttact tttaccttta 6780 atganatgat atagcctaca aatatctatg acttacttta naccaagttt caaaagtcat 6840 ttcttcttta ttaaactccg cacaaagtta aatggattca tcatttttga aacaaanana 6900 gtagtgccat ganacgctcc ttttcaaaaa catcagtaac aaaaggttgc ggacttgcgg 6960 tgtgcaaaca ctaattttgt tgtaaaaagg gtagttttcg tggtaanaaa atttgcctca 7020 ttttgctgac accataggag gtcacacaag agggaggcaa accttatttt ggaggaaggg 7080 tcaatagata gaatgctatt aggaaacttt taattcgatc ttgattttga taccgatcaa 7140 aaatatatta atctggttgt aacgcgatag ctgattatgg ttgtctataa attttaagat 7200 tgattagaaa ctgtctaaca tttttatggt ctagtgtgaa agcaacaatt gagaggtaca 7260 agaaagcttg ttcagattcc tcaaacactg gttcaattgc cgaagctaat gctcaggtat 7320 aatttcataa agtcctcttc ctacaacgaa gcctatatta tgacttgctt tgattattca 7380 aacttctttg agattatcga accatttctt atgttactta ttttgattcc ccttcccctt 7440 cagtaatgaa atgttttatt atattagact ttatagagat aaaatctact actacctcat 7500 ttcaaaaaaa aaaataacac atttccttat taaactttct attttaacac aagtattatg 7560 atatatataa aaccacaagt ttcaaaagtt tcatagtaac ataaatgtta tggaaccggg 7620 cttctattgt tattcactct acttaatcag ctgttctaaa gtcgtcaagg tggcacgatt 7680 ggattaagtt tttcatctag tattttattt tgaaagaatt agttttgttt tattttggtc 7740 gtttcttgaa agaaggcatt tgttttgttc tttctttctt ttggttctga actacttatg 7800 ttaaaccatg ttgatttggt ttagtaaaca accaagttaa actgaaatac atctaaggtc 7860 aaattctaag gtcattatag gagcatattc gtatctntag attcagttta catttagtta 7920 attaaaggcc ttctgtccat acataaagtt nttaaccaat atggattata agttgcaagc 7980 attatggatt nttgatctca ttaaatctta tgctgtttaa taaaacccag tattaccagc 8040 aagaagcctc caaactccgt gcacaaattg gaaatntgca gaaccagaac aggtgaaatt 8100 tattgttttc tttttttttt ctctttactt ttctattcac atttgttttc ttaccatttt 8160 tttctcattt tgttatttgt tgttaatggt cctccttaac tcaactactt cgattcagga 8220 actttcttgg tgaatctctt gctgcactga atctcagaga tctgaggaac ctggaacaaa 8280 aaattgaaaa aggcattagc aaaatccgag ccaaaaaggt gtacttacat tatttcccaa 8340 aatttcatat cacttttgtt tggtgaaatt ttcaactcct tgtgatggct atgatttact 8400 aacataccat tctcaaatta cagaatgagc tgttgtttgc tgaaattgag tatatgcaaa 8460 agagggtaag taatcgtgct tacataccat gaaagaatag tttcctaaag ttttaaacag 8520 atgttgaact tatgtgaaat tcataaagat caaaatgttc aagcctttta tgttcatgcc 8580 aaaaagtaac atatgttgat gcacagcagg aaattgattt acacaacaac aatcagtatt 8640 taagagcaaa ggtccatttc ttactcaaat atttgcttgt tagtccttaa atatattcct 8700 tcttctgcaa aaattattgg tttttgtatc taaattaaac agattgctga aactgagaga 8760 tcccagcaga tgaacttgat gcctgggagt tctagctatg accttgtgcc tccccagcag 8820 tcattcgatg cgcggaacta tctacaagtg aatggcttgc agaccaacaa ccattaccct 8880 agacaagacc aaccacctct tcaactagt 8909 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 2 gtgtggatcc actagaccat aaaaatgtt 29 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 agttgcaaga tgtacgtggt 20
【図１】 pMADS3遺伝子の構造およびpMADS3-GUS遺伝子
の構造を示す図である。ａは、pMADS3遺伝子のゲノム構
造を示す。エキソンを箱で示した。ｂはpMADS3-GUS遺伝
子導入のための構築物を示す。エキソン3の5'末端近傍
におけるGUS遺伝子との連結点の配列を示した。
の構造を示す図である。ａは、pMADS3遺伝子のゲノム構
造を示す。エキソンを箱で示した。ｂはpMADS3-GUS遺伝
子導入のための構築物を示す。エキソン3の5'末端近傍
におけるGUS遺伝子との連結点の配列を示した。
【図２】 pMADS3-GUS遺伝子導入による内在性pMADS3遺
伝子のサイレンシングの結果を示す写真である。
伝子のサイレンシングの結果を示す写真である。
【図３】 pMADS3遺伝子のサイレンシングによる雄しべ
の花弁化と二次花の形成の様子を示す写真である。
の花弁化と二次花の形成の様子を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD11 CA06 CA17 CA19 CB02 CD02 CD07 CD09 CD13 4B024 AA08 CA04 DA01 DA05 EA05 FA02 FA10 GA11 4B065 AA11X AA88X AA88Y AB03 BA02 BB35 CA53
Claims (11)
- 【請求項１】 植物の花型を改変するために用いる、下
記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。 （ａ）MADS3遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスR
NAをコードするDNA。 （ｂ）MADS3遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボ
ザイム活性を有するRNAをコードするDNA。 （ｃ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、
MADS3遺伝子の発現を抑制させるRNAをコードし、MADS3
遺伝子と90％以上の相同性を有するDNA。 （ｄ）植物細胞における内在性のMADS3タンパク質に対
してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質を
コードするDNA。 - 【請求項２】 植物の花型の改変が雄ずいの花弁への転
化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成か
らなる群より選択される少なくとも一つである、請求項
１に記載のDNA。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載のDNAを含むベ
クター。 - 【請求項４】 請求項１または２に記載のDNAまたは請
求項３に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。 - 【請求項５】 請求項４に記載の形質転換植物細胞を含
む形質転換植物体。 - 【請求項６】 請求項５に記載の形質転換植物体の子孫
またはクローンである、形質転換植物体。 - 【請求項７】 野生型植物と比較して花型が改変されて
いる、請求項５または６に記載の植物体。 - 【請求項８】 花型の改変が雄ずいの花弁への転化、二
次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる
群より選択される少なくとも一つである、請求項７に記
載の植物体。 - 【請求項９】 請求項５から８のいずれかに記載の植物
体の繁殖材料。 - 【請求項１０】 花型が改変された植物を製造する方法
であって、（ａ）請求項１に記載のDNAまたは該DNAを含
むベクターを植物細胞に導入する工程、および（ｂ）該
植物細胞から植物体を再生させる工程、を含む方法。 - 【請求項１１】 植物の花型の改変が雄ずいの花弁への
転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成
からなる群より選択される少なくとも一つである、請求
項１０に記載の方法。
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| PCT/JP2001/009511 WO2002036776A1 (fr) | 2000-10-30 | 2001-10-30 | Amelioration apportee a un gene a mads box ciblant un type de fleur |
| AU96032/01A AU766333B2 (en) | 2000-10-30 | 2001-10-30 | Improvement of flower morphology of plants by targeting MADS-box gene |
| CA002406820A CA2406820C (en) | 2000-10-30 | 2001-10-30 | Improvement of flower morphology of plants by targeting mads-box gene |
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|---|---|---|---|
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Cited By (2)
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| JP2017018100A (ja) * | 2015-07-13 | 2017-01-26 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 不稔化植物、不稔化植物の作出方法、及びベクター |
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| KR101359457B1 (ko) * | 2011-11-23 | 2014-02-07 | 상명대학교 천안산학협력단 | 화형 또는 화색이 조절된 형질전환 국화과 화훼 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 |
| IT201700065504A1 (it) * | 2017-06-13 | 2018-12-13 | Fond Parco Tecnologico Padano | Nuove piante con fenotipo ‘fiore doppio’ |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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