JP2002022738A - 薬剤−薬剤間相互作用試験サンプル調製物のための方法及び装置 - Google Patents

薬剤−薬剤間相互作用試験サンプル調製物のための方法及び装置

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 医薬候補化合物のスクリーニング・ツールと
しての、薬剤−薬剤間相互作用の試験のための自動化さ
れた方法及び装置の提供。 【解決手段】 特異的プローブ基質及び新規化合物阻害
剤の少量サンプルを、解凍されたヒト・ミクロソーム、
バッファー、及び補因子が事前に充填されているマルチ
ウエル反応プレート内に自動的に小分けする。この反応
プレートをインキュベートし、そして反応生成物を、上
記化合物の関連相互作用効果の生物学的測定のために試
験する。上記調製のために使用される装置は、コンピュ
ータ制御された多液体ハンドリング・カニューレ、マイ
クロピペッティング・メンバー、フリーザー、及び温度
制御されたインキュベーター・ユニット、真空濾過装
置、上記プレートのバーコード・トラッキング、マルチ
ウエル・プレートの移動及び操作のための輸送メカニズ
ム、及びサンプル混合要素を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明の分野 本発明は、シトクロームＰ４５０ｓ（ＣＹＰ）を新規化
学物質と関係させる薬剤−薬剤間相互作用に関する潜在
能力を測定するための改良されたインビトロにおける方
法に関する。本発明は、さらに、特にそれらが、薬剤候
補としての化合物についての初期又は１次スクリーンと
して、肝臓の代謝に影響を及ぼすとき、インビボにおけ
る薬剤−薬剤間相互作用のインビトロにおける測定試験
に関する。
【０００２】本発明の背景 不所望な薬剤−薬剤間相互作用（ｄｒｕｇ−ｄｒｕｇ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（ＤＤＩ））は、臨床関連Ｄ
ＤＩの約１〜２％の原因である。これは、比較的小さな
数であるが、新規化学物質が薬剤発見プログラムを超え
て開発に首尾よく進むかどうかの決定において重要なフ
ァクターである。さらに、有望な候補のための（使用か
ら薬剤を取り除いてしまうであろう）臨床的に有意な薬
剤−薬剤間相互作用の遅れた発見は、プロジェクトに既
に費された試験の資源のかなりの経済的浪費をもたらす
ことができるであろう。
【０００３】それ故、早期に潜在的な相互作用について
スクリーニングし、そして最適なインビボ試験を選択す
ることが重要である。この点で、シトクロームＰ４５０
ｓ（ＣＹＰｓ）との薬剤相互作用は特に重要である。Ｃ
ＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ｃ，ＣＹＰ２Ｄ６、及びＣＹＰ３
Ａ４は、全肝Ｐ４５０の９０％超を表し、そして治療薬
のほぼ８０％が、これらと同じ酵素により代謝される。
上記酵素の中の１以上とのインビボにおける相互作用
は、クリニックにおける潜在的に関連のある事件を課
す。最近、インビトロ系がＤＤＩの傾向を予想する能力
を証明していることが確立された。なぜなら、それらは
代謝に責任を負うＣＹＰｓの同定を許容し、そして阻害
された経路の全体的な排除への相対的な貢献の決定を許
容するからである。
【０００４】製薬会社により合成される多分子の数は、
コンビナトリアル・ケミストリーの利用とともに劇的に
増加してきたので、今日、代謝に関する高処理量インビ
トロ試験のより早期の実施又はリード最適化が強調され
ている。インビトロ方法、例えばヒト・ミクロソーム
（ＨＬＭｓ）、肝細胞又は個々の発現されたＣＹＰｓを
用いた新規化学物質（ＮＣＥｓ）の薬剤−薬剤間相互作
用の予想は、潜在的なインビボにおける相互作用を信頼
できるやり方で回避する一つの方法として、重要性及び
使用規模の両者において高まっている。
【０００５】実際のＤＤＩ試験、例えば、ＩＣ50又はＫ
ｉ値の測定は、比較的効率よく、そして迅速である。し
かしながら、そのサンプルの調製は、その試験プロトコ
ールの最も厳密さを要する部分である有効なインビトロ
結果を提供し、そして（試験材料の分解の関数として
の）厳格な短時間の制限の拘束内のそのような調製、利
用できる人、装置、及び制限された量の材料（ミクロソ
ーム、化合物サンプル、等）は、化合物の初期評価及び
スクリーニングの高まったスケール・アップを制限して
いる。
【０００６】手作業による試験サンプル調製に関わる最
近の方法論は、増大した処理量に関して不適当であるこ
とが証明されている。このような不適性の主な要因は、
試験材料の不安定性、特に、解凍され、そして冷凍庫か
らインキュベートされた後約１時間までに活性が低下す
る傾向にあるミクロソームである。上記調製、タイミン
グ、及び試験が注意深く制御され、かつ、協調されない
場合、酵素活性の有意な損失が生じる前の利用可能な時
間枠内で調製され、かつ、試験されていない材料から、
不正確な結果が得られるであろう。
【０００７】さらに、初期スクリーニングに関して試験
されるべき莫大な数の化合物のために、このような初期
試験のために、ほんの少量の化合物を合成することが実
用的である。さらに、増加した処理量のために要求され
るであろうとき、莫大に増加した数の化合物の試験のた
めのほんの制限された量のミクロソームの入手可能性が
在る。従って、スケール・アップ試験のために要求され
る時間軸に加えて、試験材料の制限された入手可能性を
もって正確な試験結果を適切に得る必要性が在る。
【０００８】最近、ＤＤＩのインビトロにおける測定の
ための手作業による調製が、９６及び３８４ウェル・プ
レートの使用及び試験サンプル材料のマルチウェル・ピ
ペッティングを通して、速さ及び効率を増してきてい
る。しかしながら、サンプルの解凍、インキュベーショ
ン、プレート輸送、混合、等の他の操作は、信頼性をも
って調製されることができる試験サンプルの数を制限す
るタイミング及び協調の問題を伴って、未だ手作業によ
り行われている。
【０００９】少なくとも４つの試験プレートが、１の試
験手順において使用され又は（化合物／ＣＹＰ酵素基
質、反応、濾過、及び回収のために）操作され、これ
は、緩衝液化され、そして補因子を提供された特定のプ
ローブ（シトクロームＰ４５０−特異的基質）及び解凍
ミクロソームを用いて試験される阻害剤化合物（ＮＣＥ
ｓ）の解凍、調製、インキュベーション、混合、及び処
理のステップを含む。処理の間の各種プレートのハンド
リングの協調及び効率は、試験される化合物の増大した
数と、そのために化合物が調製されるところの試験の数
の増加にともなって変わらない処理のために許される短
い時間枠とにより、指数的により困難になる。
【００１０】本発明の要約 従って、本発明の目的は、材料分解の時間拘束内で、実
行可能性のための初期スクリーニングとしての薬剤−薬
剤間相互作用のための多数の薬剤候補化合物の調製のた
めの効率的な時間軸において自動化されたシステムを提
供することである。調製は、材料の解凍及びインキュベ
ーションの操作、試験ウェルの充填、（付随反応を伴
う）混合、並びに真空濾過、及び操作ステーションへの
強調された試験プレートの輸送を含む。
【００１１】本発明のさらなる目的は、材料分解の開始
前に、実際の試験前に、全て、必要な時間枠内で、調製
及び（解凍、緩衝液化、及び補因子の添加後の）ＨＬＭ
の試験ウェルへの充填、ＣＹＰ−特異的プローブ基質及
び試験されるべき阻害剤化合物（ＮＣＥｓ）及び対照の
添加；インキュベーション、混合、試験トレー又はプレ
ートのハンドリング、並びに調製、操作、及び試験ステ
ーションへの輸送の、連続的な必要なステップを自動的
に実行するシステムを提供することである。
【００１２】本発明のさらに他の目的は、特に、標準の
内部及び相関（ｉｎｔｒａ ａｎｄｉｎｔｅｒ）再現性
の試験を強化することにより、合成された阻害剤化合物
サンプル及びミクロソームのほんの少量の利用可能性に
より、そして特に、化合物及び酵素の自動化された単一
濃度の試験により、試験サンプル量を有効に最小化する
ことである。
【００１３】２０００年３月３１日に出願された同時係
属中のプロビジョナル出願は、有効なＤＤＩ測定のため
の単一点濃度の使用について記載している。その開示を
本明細書に全体として援用する。その開示は、既に、厳
密な結果の獲得において正確さの有意な損失を伴わずに
結果を得るに際しての付随する速度をもった材料の必要
性を最小化し、そしてその利用は、その自動化によって
さらに高められる。
【００１４】本発明の他の目的は、手作業を介在せずに
処理される成分及び材料の保存能力の制限に自動的に適
合される完全に操作される試験調製システムを提供する
ことである。
【００１５】一般に、本発明は、哺乳動物及び特にヒト
における実行可能性のための最初のステップのスクリー
ニングとしての、薬剤−薬剤間相互作用試験のための、
特に、シトクロームＰ４５０（ＣＹＰ），ＣＹＰ１Ａ
２，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９，ＣＹＰ２Ｄ６、及
びＣＹＰ３Ａ４に関する試験のための、薬剤のための候
補である化合物（ＮＣＥｓ）の完全に自動化されたマル
チ−プレート・インビトロ調製のための、同期され、時
機を強調された方法及び装置を含む。この時機を協調さ
れた調製を容易にするために、この調製に係る非分解性
要素は、分解性材料、例えばミクロソームとの実際の試
験実行の直前に作られる。従って、一般に安定な候補化
合物（ＮＣＥｓ）は、好ましくは、マルチ・ウェル・プ
レート内で、試験試料調製及びミクロソームとの反応の
間の使用のために、必要な置換及び組合せにおいて、Ｃ
ＹＰ−特異的プローブ基質と事前−混合される。
【００１６】本発明の方法は、所定数の単一試験プレー
ト又は試験プレート対の中の１、及び好ましくは試験プ
レートのオフセット又はタンデム対を、試験実行におい
て、以下自動化ステップ： ａ）冷凍ミクロソーム・サンプルを、計時され、自動化
された機械的な輸送メカニズムにより、（約−２０℃の
保存条件をもった）冷凍保存ユニットから、解凍部又は
ユニットまで取り出し（より好ましくない態様において
は、上記冷凍ユニット自体の温度は、輸送の必要性のな
い解凍条件まで高められる）； ｂ）例えば、４℃の周囲条件に晒すことにより解凍し
（ｄｅｆｒｏｓｔｉｎｇｏｒ ｔｈａｗｉｎｇ）、そし
てその解凍されたミクロソーム・サンプルの計測された
部分（例えば、アリコート）を補因子（例えば、ＮＡＤ
ＰＨ及び再生系）及びバッファーと併合して、実質的に
均質な混合物（Ｍ／Ｃ／Ｂ）を得； ｃ）（例えば、アリコーティングにより）、所定量の上
記併合物（Ｍ／Ｃ／Ｂ）を、マルチウェル反応プレート
の個々のウェルの各々の内に機械的に導入し、そして好
ましくは上記併合物をプレ−インキュベートし； ｄ）（例えば、アリコート導入により）、上記反応プレ
ートのウェル内の上記（Ｍ／Ｃ／Ｂ）サンプルを、事前
に選択されたＣＹＰ−特異的プローブ基質と阻害剤化合
物（ＮＣＥｓ）のＳ／Ｉ溶液と自動的、機械的に併合
し； ｅ）上記反応プレートを、含まれたミクロソーム・サン
プル（Ｍ／Ｃ／Ｂ）、事前選択されたＣＹＰ−特異的プ
ローブ基質、及び阻害剤化合物（ＮＣＥｓ）とともに、
所定の時間期間にわたり（ヒトの又は特定の哺乳動物の
ための他のインビボ・エミュレーション条件のために）
３７℃まで、インキュベートして、反応の行って反応生
成物を得； ｆ）上記所定の時間期間の終わりに、生じた反応の全て
を停止させ、反応生成物を精製し、そしてその反応生成
物を、対応の阻害剤化合物（ＮＣＥｓ）及び対応のＣＹ
Ｐ−特異的プローブ基質に対して、薬剤−薬剤間相互作
用の程度を測定するためのアッセイ試験において使用す
る；を用いて処理することを含み；ここで、ステップ
ｃ）〜ｆ）を、事前に解凍されたミクロソーム・サンプ
ルを用いて、各試験を実行するとき、所定の回数、繰り
返し、ここで、１の実行のパラグラフｃ）〜ｆ）のステ
ップと同時に、追加のミクロソームを上記冷凍ユニット
から取り出し、解凍し、そしてその後の試験の実行のス
テップｃ）〜ｆ）において直ちに使用するために、待機
部に保持し、ここで、上記冷凍ミクロソームがステップ
ｃ）〜ｆ）の間に解凍のために初めに取り出されるタイ
ミングは、取り出しが、各試験実行の各ステップの間の
同一時点となるようなタイミングであり、そしてここ
で、解凍及び事前インキュベーションの時間は、上記実
行の全てに関して同一であり、そしてインキュベーショ
ン時間は、事前に計算されており、そして試験実行の間
の上記プレート内の各々において同一の時間をもつよう
に合わせられている。
【００１７】プレート対の処理に関しては、第１のプレ
ートは第１のインキュベーター内にありながら、ステッ
プａ）〜ｆ）が、事前に解凍されたミクロソーム・サン
プルを含む、上記試験実行の第１対の第２プレートに関
して、直ちに繰り返される。全てのケースにおいて、
（上記ユニットのため、又は適用できる場合には上記対
のいずれかのために）１の実行のパラグラフａ）〜ｆ）
のステップと同時に、その後の試験実行のステップａ）
〜ｆ）において直ちに使用するために、追加のミクロソ
ーム・サンプルが上記冷凍装置から取り出され、解凍さ
れ、そして待機部で保持される。上記冷凍ミクロソーム
がステップａ）〜ｅ）の間、解凍のために最初に取り出
されるタイミングは、この取り出しが、その次の試験実
行の各々の上記ステップの間の同一時点にあるようにな
っている。さらに、解凍の時間（ｄｕｒａｔｉｏｎ）
は、上記実行の全てに関して実質的に同じであり、さら
に同期する操作を維持するために、（存在する場合）全
ての事前インキュベーション及びインキュベーション期
間は、事前に計算されており、そして単一の又は適用で
きる場合、対のプレートの試験実行につき同一時間をも
つように合わせられている。従って、試験実行につき、
追加数のきっちり同時に処理されたプレートが単に計量
され、そして計時されることがわかる。
【００１８】１のプレートがインキュベートされた後、
又は対のプレート態様のためには、一旦、プレート２が
上記インキュベーターに戻されれば、それらのプレート
は、以下のステップｇ）〜ｉ）に記載するように、順次
処理される： ｇ）所定量の上記反応生成物を、マルチウェル濾過プレ
ートの個々のウェル内に機械的に移し、そして反応生成
物を、例えば真空濾過により得る；そして収集プレート
を覆い、そして次の分析試験のために保存する。
【００１９】ｈ）ステップｇ）を、適用できる場合、プ
レート対の第２プレートのために繰り返す。
【００２０】ｉ）ステップａ）〜ｉ）を、次に、薬剤−
薬剤間相互作用試験のために、その後のユニット又はプ
レート対のために繰り返す。
【００２１】ステップａ）〜ｉ）が、薬剤−薬剤間相互
作用試験のために単一プレート又はプレート対に関して
完了した後、積み重ねられた濾過収集プレートを、上記
自動化ワーク・ステーションから取り出し、そして上記
反応生成物の個々の濾液を、薬剤−薬剤間相互作用の程
度を測定するための分析、例えばＩＣ50又はＫｉ試験の
ために送られる。
【００２２】上記ステップを実行するために使用される
本発明の試験調製装置は、以下の： ａ）ミクロソーム又は組換えミクロソームを保存するた
めの冷凍ユニット； ｂ）試験サンプルの調製における上記ミクロソームの使
用前に、上記ミクロソームを解凍するための解凍ユニッ
ト又は部（この解凍ユニットは、解凍温度まで加熱され
ることができる上記冷凍ユニットの部分を含んでもよ
い）； ｃ）上記ミクロソームの解凍のための上記冷凍ユニット
から上記解凍ユニットまで冷凍ミクロソームを取り出す
ための（又は取り出されずに上記冷凍ユニットから解凍
ユニットまでの変換のための）時機を計算された手段； ｄ）上記ミクロソームの緩衝液化のための手段であっ
て、上記ミクロソームに補因子を添加することによるも
の、例えば所定量のミクロソームを補因子材料及びバッ
ファーを含むトラフ（Ｍ／Ｃ／Ｂトラフ）に移す液体導
入手段を備えたもの、及びミクロソーム、バッファー、
及び補因子を上記トラフ内で均一に混合するための混合
手段； ｅ）マルチ−ウェル試験プレートを、上記装置の操作ス
テーションへ、そして、から、保持、輸送、及び取り出
すための、そして上記プレートをそこでの適切な操作の
ために上記操作ステーションに位置決めするための、コ
ンピュータ制御され、計時された、操作及び輸送メカニ
ズム、ここで上記プレートは反応プレート、濾過プレー
ト、及び収集プレートの中のいずれか１である； ｆ）反応プレートの複数の所定ウェルに所定量のＭ／Ｃ
／Ｂを同時に充填するための液体導入手段を備えた第１
操作ステーション； ｇ）その後の反応時間を容易にするために、所定の時間
期間にわたり所定の温度までＭ／Ｃ／Ｂを場合により事
前インキュベートするための第２操作ステーション； ｈ）上記反応プレート内のミクロソームを、シトクロー
ムＰ４５０酵素基質、及び阻害剤化合物（Ｓ／Ｉ）と併
合するための第３操作ステーション； ｉ）所定の時間期間にわたり、その反応のために約３７
℃の温度まで、ステップｈ）における上記反応プレート
内の上記併合物をインキュベートするための第４操作ス
テーション； ｊ）所定の時間期間の後、上記反応を停止させるための
クエンチング手段； ｋ）上記反応プレートの上記ウェルから、濾過プレート
のウェルまで、反応生成物を移すための輸送手段； ｌ）上記反応生成物の濾過するための濾過手段、例えば
真空； ｍ）上記プレートの各々に関する、そして上記プレート
のウェル内の対応の内容物に関する同時操作、並びに上
記解凍のタイミング、及び事前インキュベーション期
間、適当な場合インキュベーション期間、及びその後の
試験実行のためのミクロソームの解凍の開始を、同期さ
せるためのコンピュータによるタイミング手段； ｎ）例えば、各プレートを追跡するためにバーコード識
別を読むことによる、試験プレート及びその内容物を追
跡するためのステーション； ｏ）その後の試験実行における使用のためのミクロソー
ムの各事前解凍されたバイアルのための保持部； ｐ）上記装置、さらに、所定数の実行における使用のた
めにプレートを維持するための保存領域を含み、ここ
で、その対応のプレートは上記操作及び輸送メカニズム
によりアクセスされうる。
【００２３】溶液輸送手段は、好ましくは、多数アリコ
ート操作を行う多数チップ・カニューレ又はピペットに
おいて具体化される。
【００２４】用語“充填”は、充填する行為をいい、そ
してウェルの全容量の充填の完了として解釈されてはな
らない。インキュベーションのための３７℃の使用は、
ヒトＤＤＩ試験による本発明の使用に対して相対的であ
り、そして他のインビボ・エミュレーション条件が、特
定の哺乳動物に関して決定される。
【００２５】本発明の上記目的、特徴、及び利点は、以
下の討議及び図面からより明らかになるであろう。
【００２６】本発明の詳細な説明 典型的な試験事前調製においては、標準的な９６ウェル
試験プレート（１２×８ウェル配置）を用いて、５０マ
イクロリッターの新規化合物（０．１２ミリモル溶液中
ＮＣＥｓ）を、メタノールと水の等容量混合物から成る
溶液（この溶媒混合物は単に好ましい溶媒の例示であ
り、他の溶媒も同様に使用されうる）中の５つのシトク
ロームＰ４５０基質の中の１又は一定の組合せ物（５つ
の異なるシトクローム基質は現存し、かつ、商業的に入
手可能である）とともに、所定のウェル内に、個々にア
リコートする。各新規化合物（ＮＣＥ）は、（上記５つ
のシトクローム基質を用いた試験のために）５つの異な
るプレート内の１の試験調製ウェル内への上記アリコー
ティングを用いた試験のために、調製される。各プレー
トは、知られた特性をもつ阻害剤化合物との、ＣＹＰ−
特異的プローブ基質から成る２つの会合対照を含む。典
型的な試験は、例えば、薬剤相互作用の相対的指標とし
てのＩＣ50又はＫｉ値の測定のためのものである。
【００２７】プレート及び対応ウェルの上記置換は、各
プレートについてＣＹＰ−特異的プローブ基質の中の１
又は組合せ物をもって、各ウェルについて異なる化合物
（ＮＣＥ）をもつ置換である。他の置換も可能であり、
個々のウェル組成は注意して追跡される。全てがユニー
クな個々のバーコード識別をもつ上記調製プレートを、
上記実際の試験実行調製及び試験の間の使用のために、
わきに置く。
【００２８】本発明の装置は、本質的には、（充填及び
混合操作におけるアクセスのために、そしてこぼれを防
止するために）、上からアクセス可能なプレートの試験
ウェルを備えた水平面内で同時に少なくとも２つの試験
プレートを、移動可能な状態で同時に保持するための可
動性プレート保持手段（保持されるプレートの数は、時
機を協調される効率及び能力の関数である）を提供され
た（知られ、そして商業的に入手可能な個々の構成成分
をもつ）プログラムされたロボット処理装置である。本
装置は、約３７℃の平衡温度（ヒトの体温）まで、処理
されるべき化合物（ＮＣＥｓ）、基質酵素材料、及びミ
クロソームの保存され、冷蔵又は冷凍された溶液を加熱
するためのインキュベーション手段（例えば、温度制御
された加熱要素）をさらに含む。冷凍装置から解凍位置
まで、ミクロソーム含有バイアルを移動させるための、
解放可能なプレートグリッピング要素を備えた輸送メカ
ニズムが、バーコード・リーディング及びプレート追跡
のための手段と同様に、さらに本装置内に含まれる。
【００２９】ソフトウェアにより制御されたコンピュー
タによる操作は、ミクロソームの同時調製、冷凍装置か
らの取り出し、４℃までの解凍、上記ミクロソームのア
リコーティング、上記ミクロソーム・トラフへのバッフ
ァーの添加、上記ミクロソームとバッファー（pH７．４
におけるホスフェート）及び活性化のための補因子（Ｎ
ＡＤＰＨ）との混合（Ｍ／Ｃ／Ｂ）；特定比及び合計量
における上記プローブ特異的基質及び阻害剤化合物（Ｎ
ＣＥｓ）、並びにＣＹＰ−特異的プローブ基質を含むが
阻害剤化合物を含まない、又は知られた特性をもつ阻害
剤を含む対照調製（又は好ましくは事前調製）に同期
し、そしてこれを追跡する。
【００３０】全体的な事前調製プロセスにおいては、別
々のプレートが、まず、上記基質酵素及び上記阻害剤化
合物（ＮＣＥｓ）の希釈のために調製される。上記２つ
のプレートの内容物を、次に１：１の比で併合して、上
記試験実行の間に使用される基質と阻害剤溶液のマスタ
ー・プレート（Ｓ／Ｉプレート）を作る。
【００３１】残りのアッセイ成分、ミクロソーム、補因
子とバッファーの併合物（Ｍ／Ｃ／Ｂ）を、オープン・
トラフ内で４℃において調製し、そして（典型的には、
不活性ポリプロピレン材料から成り、９６ウェルをも
つ）反応プレートに移す。ウェルの寸法は、ウェルの合
計数の関数であり、そして小さくとも、処理及び／又は
その後の試験のために必要な量の溶液を少なくとも保持
するための大きさであり、そしてカニューレ先端の挿入
に適合するために十分に大きなものである。
【００３２】上記反応プレートを３７℃まで事前に温
め、そして各ウェル内の反応を、上記Ｓ／Ｉプレートか
らそれにアリコートを添加することにより開始させる。
上記反応を３７℃において進行させる。この反応を停止
させ、濾過し、そしてサンプルを、ＨＰＬＣ及び／又は
質量分析上での分析のために調製する。上記プローブ基
質の代謝産物のピーク面積を、質量分析装置又は蛍光検
出により計測し、そしてＭｃＱｕａｎ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎから入手可能なソフトウェアを用いて分析す
る。
【００３３】試験サンプル中のＣＹＰ１Ａ２特異的プロ
ーブ基質を用いた阻害剤化合物の調製において使用され
る、以下の方法例は本発明の手順の例示である。
【００３４】方法：以下は、本発明の好ましい方法及び
システムのステップの時系列である。記載したように、
上記方法は、３０分間以内で１以上のプローブＣＹＰ酵
素基質とミクロソーム・サンプルを用いて、又は約５時
間以内で（２連における５つの試験プレートを用いた）
５つのＣＹＰ酵素を用いた、（単一試験プレートの）９
０の異なる阻害剤化合物（ＮＣＥｓ）のＩＣ50又はＫｉ
試験のための調製及び実行を可能にする。比例した操作
が異なる数のウェルをもつプレートのために適合されう
る。
【００３５】操作前調製ステップは以下のものを含む： １．本発明の好ましい装置は、ミクロソームソーム及び
酵素の分解を最小にするための冷却及び冷凍ユニット要
素を含む。上記装置の操作のための調製における第１の
ステップとして（冷媒を閉じ込めた）冷却再循環要素
が、設定温度に達するようにされる（上記装置はコンピ
ュータ制御され、そして全モニター温度がコンピュータ
・スクリーン上に表示される）。
【００３６】２．上記装置内の、上記試験材料をヒトの
体温（３７℃）までインキュベートするための、ヒータ
ー要素は、（必要な体温までのインキュベーションのた
めに）３７℃を上廻る設定温度に達するようにされる。
上記要素はコンピュータ制御され、そして全モニター温
度がコンピュータ・スクリーン上に表示される。
【００３７】３．特異的プローブ基質と阻害剤化合物
（ＮＣＥｓ）を混合し、そして小分けするための、９６
の永久カニューレを備えた、上記装置内のピペッティン
グ・システムが起動される（本明細書中、その商業的に
入手可能な源として“Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａ”と
いう）。
【００３８】４．リザーバー・トラフに補因子をロード
する。
【００３９】５．本方法の間の反応をクエンチするため
に使用される溶液リザーバーに、クエンチング溶液（一
般に、メタノールと水から成る溶液）を充填する。
【００４０】６．それを通して上記システム内に液体が
輸送されるところのラインを、保持された空気をパージ
することにより全て、呼び水を差す。
【００４１】７．（試験実行の５つの対のために設定さ
れた）上記装置のワークステーションを以下のものを備
えている： ・必要に応じて上記ミクロソームを提供するための、上
記装置の冷凍装置保存領域内の、冷凍ミクロソームを含
む１０のフタをしていないＣｒｙｏｖｉａｌｓ（＃１−
１０） ・使い捨て滅菌ピペット・チップをもつ２つの吸引ピペ
ット（１のピペットは１２のカニューレをもち、そして
１は１のカニューレをもつ） ・１０の反応プレート（＃１−１０） ・１０のＳ／Ｉプレート（そのウェルは、計測された量
の上記特異的基質ＣＹＰ酵素／阻害剤化合物（ＮＣＥ
ｓ））を事前に提供されている（＃１−１０） ・１０のフィルター（マルチ−スクリーン）プレート
（＃１−１０） ・上記カバー・ネスト内の、カバーをもつ１０の収集プ
レート（＃１−１０） 上記ワークステーションは、その使用が要求されるまで
上記プレートを保持するための保存領域を含み、そして
選択及び輸送メカニズムが、必要に応じて上記プレート
を選択するために使用され、そしてそれらを、上記装置
の操作ステーションに輸送する。各タイプのプレートの
数、及び各々の内のウェルの数（例えば、９６）は同じ
であるべきである。プレートの数は、再ローディングな
しで実行されるべき試験の数の関数である。
【００４２】上記の予備的な調製が行われた後、サンプ
ル調製と試験実行が、以下の時間軸ステップを用いて開
始される： １．バッファー溶液中にミクロソームを含むＣｒｙｏｖ
ｉａｌ＃１を、自動化、機械化輸送メカニズムにより冷
凍位置から解凍位置まで、上記装置内に輸送する（すな
わち、冷凍装置から取り出す）。
【００４３】２．反応プレート＃１を、上記保存部から
選択し、そして待機位置まで移動する（“輸送ネス
ト”）。
【００４４】３．ミクロソームが、少なくとも８分間
（完全な解凍のための最短時間）で、そして同期のため
に、上記実行の間上記Ｃｒｙｏｖｉａｌｓの１０個全て
について等しい、解凍時間を提供するであろう追加の時
間にわたり、完全に解凍された後；使い捨てピペットを
備えた単一のカニューレが、Ｃｒｙｏｖｉａｌ＃１まで
移動されて、上記ミクロソーム溶液を混合する。上記ピ
ペットは、混合プロトコールにおいて要求されるとき、
何回でも、その部分容量を吸引し、そしてその部分容量
を上記Ｃｒｙｏｖｉａｌに戻すことにより、上記ミクロ
ソーム溶液を混合するために使用される。
【００４５】４．同期された解凍時間が、上記試験実行
において要求されるステップに基づいて測定される。１
０バイアル系のためには、そして本例において列挙され
るパラメーターを用いれば、各Ｃｒｙｏｖｉａｌのため
の同期された解凍時間は１５分である。
【００４６】５．所定のミクロソーム容量を、上記単一
カニューレにより吸引し、そして（１０トラフの中の）
トラフ＃１に小分けする。
【００４７】６．他の単一・カニューレを、上記バッフ
ァー・リザーバーから所定のバッファー（補因子を含
む）容量を吸引し、そして次に、上記バッファー容量を
トラフ＃１に小分けするために移動させる。
【００４８】７．（使い捨てピペット先端を備えた）１
２のカニューレ・ピペットを、トラフ＃１に移動して上
記の希釈ミクロソーム容量を吸引して、上記Ｍ／Ｃ／Ｂ
を混合する。次に、ステーションが振動して、上記トラ
フの内容物を混合する。（使い捨てピペット・チップを
備えた）１２のカニューレ・ピペットを、トラフ＃１ま
で移動させて、上記希釈されたミクロソーム容量を吸引
し、そして次に上記輸送ネストに移動して、上記希釈さ
れたミクロソーム容量を、上記反応プレート（９６ウェ
ル、１２ウェル／列の８列）に、その最初の４列内に、
小分けする。
【００４９】８．ステップ７を、上記反応プレート＃１
のＥ−Ｈ列を充填するために繰り返す。
【００５０】９．上記の充填された反応プレート＃１プ
レートを、次に上記の入れられたミクロソーム溶液の温
度を所定温度まで上昇させるために十分な“事前インキ
ュベーション時間”にわたりヒーター部に移動させ、そ
して反応プレート＃１“事前インキュベーション開始時
間”を記録する。上記１２ピペット及び単一ピペット・
カニューレを、上記試験実行の間、再使用するために洗
浄する（それらは、異なる試験実行のために交換され
る）。上記事前インキュベーション時間を、上記試験実
行における各反応プレートに関して同一となるように調
整される。（Ｃｒｙｏｖｉａｌ＃２を、凡そこの時点で
冷凍部から解凍部まで移動させる。この移動の実際の時
間は、上記反応プレート実行の各々についての等価は時
間に基づいて決定される。） １０．事前調製された９６ウェルＳ／Ｉプレート＃１を
拾い上げ、そして上記デッキ・ワーク・スペースの外に
プレートを移動させることができる第２グリッパー・ア
ームを用いてＲｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａ ９６ピペッ
ト・システムまで輸送する。調製されたＳ／Ｉプレート
は、試験のための９０の異なる阻害剤化合物（ＮＣＥ
ｓ）を充填された９０のウェル、及びその全ウェル内に
特異的プローブ基質を含む。２つのウェルは、対照とし
て、知られた特徴をもつ阻害剤化合物とともに上記特異
的プローブ基質を含み、そして４つのウェルは、５０／
５０メタノール／水溶媒だけの対照を含む（別の置換、
例えば、上記５つのＣＹＰ酵素とともに１の阻害剤化合
物も、同様に可能である）。
【００５１】１１．上記方法において使用される各プレ
ートは、ユニークな識別バーコードが提供され、そのＳ
／Ｉプレートのバーコードは、その内に入れられた化合
物のその後の識別及び相関のために、上記ピペット・シ
ステム部において読まれる。
【００５２】１２．上記９０の化合物と対照の“Ｓ／Ｉ
容量”は、上記Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａピペットに
より吸引され、そしてＳ／Ｉプレート＃１は、まず、上
記バーコード・プレート・ネストまで輸送され、そして
次に上記Ｓ／Ｉプレートの“空”スタック領域に移動さ
れる（上記ウェルの容量の約１０〜２５％が吸引され、
そして必要な場合、追加の試験のために上記ウェル内に
残った材料が利用可能である）。
【００５３】１３．反応プレート＃１のための所定の
“事前インキュベーション時間”が終了した後、それ
は、上記バーコード・ネスト及び第２アームを介して、
上記Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓ
ｙｓｔｅｍに輸送される（この、“事前インキュベーシ
ョン終了時間”は記録される）。上記吸引されたＳ／Ｉ
容量は、上記ピペットにより、反応プレート＃１の対応
ウェル内に小分けされ、そして１回混合される。
【００５４】１４．次に、反応プレート＃１は、“イン
キュベーション時間”の間、上記ヒーターに戻し輸送さ
れ、そしてこの“反応プレート＃１インキュベーション
開始時間”が記録される。このインキュベーション時間
は、３７℃の周囲反応温度を達成するために十分なもの
であり、そして上記試験実行の全体において、反応プレ
ート・インキュベーションの各対のために同一であるよ
うに事前に計算される期間をもつ。
【００５５】１５．上記反応プレート＃１の“反応”の
間：ステップ５〜１４が、反応プレート＃２のために繰
り返される。一旦、反応プレート＃２が、プレート＃１
と同じ“インキュベーション時間”の間、上記ヒーター
に戻されれば、その時、“反応プレート＃２インキュベ
ーション開始時間”が記録される。
【００５６】１６．上記自動化プロセスが、その後、濾
過のためにプレート＃１を設定する： ・上記Ｈｙｄｒａ９６ピペット・システムがきれいに濯
がれ、そして“Ｑｕｅｎｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ”が吸引さ
れるところの、クエンチ溶液トラフに移動される； ・収集プレート＃１カバーが外され、そしてカバー・ネ
ストにおいて保持位置に置かれる： ・収集プレート＃１バーコードが、ウェル・サンプルの
相関のために読まれ、そして収集プレート＃１が拾い上
げられ、そして真空濾過チャンバーの底に移動され、こ
のチャンバーのカバーが閉められ、そしてフィルター・
プレート＃１を拾い上げ、そして上記真空チャンバーの
上部に移動させる。
【００５７】１７．反応プレート＃１のための“インキ
ュベーション時間”が満了したとき、反応プレート＃１
を、ヒーター＃１から取り出し、そして“Ｑｕｅｎｃｈ
Ｖｏｌｕｍｅ”が反応プレート＃１（すなわち、上記
ウェルの各々）内に小分けされるところの、上記９６ピ
ペット・システムに置く： １８．上記反応プレート＃１を、輸送ネストに移動させ
る。ここで、“サンプル容量”は、反応プレート＃１の
Ａ列から上記１２ピペット・カニューレにより吸引さ
れ、そしてこの“サンプル容量”を、フィルター・プレ
ート＃１のＡ列に小分けする。
【００５８】１９．上記１２ピペット・カニューレを洗
浄し、そしてステップ１７を、Ａ−Ｈ列の全てのために
繰り返す。
【００５９】２０．所定の“濾過時間”の間、上記濾過
プレートのために真空を起動し、そして次に、停止し
（反応プレート＃１とフィルター・プレート＃１を廃棄
し）、そして収集プレート＃１を保持スタックに移動さ
せ（ここで、収集プレート・カバー＃１を置き直す）。
【００６０】２１．ミクロソームを含むＣｒｙｏｖｉａ
ｌ＃（現在＋２）を、冷凍位置から解凍位置に移動させ
て、その内のミクロソームを、上記輸送メカニズムが現
在のプロセスとともに終了したとき又はその後直ちに、
準備できているようにする。例えば、プレート＃１を処
理しているとき、Ｃｒｙｏｖｉａｌ＃３が移動されるで
あろう。（このステップを、１０のＣｒｙｏｖｉａｌｓ
の全てにとって一貫した又は等しい解凍時間を作り出
す、上記プロセスの間の時点において遂行すべきであ
る。） ２２．ステップ１６〜２１を、反応プレート＃２に関し
て繰り返す。次に、上記プロセスを、２連で、残りのミ
クロソーム・サンプル、及び反応プレートの全てに関し
て繰り返す。
【００６１】９６ウェル・プレートを使用する典型的な
実行は、ミクロソーム分解の時間枠内で、約１時間の期
間をもつ。記載したように、９０の化合物が、１時間の
スパンにおいて単一の特異的プローブ基質を用いて、そ
して約５時間において全５つのＣＹＰ酵素を用いて、２
連でテストされることができる。従って、１０００近く
の化合物が、上記の同時係属中のプロビジョナル出願中
に記載された一点測定を用いて典型的な週５日労働の間
にＤＤＩについて効率的にテストされることができる。
より大きなプレート、例えば３８４又はさらに１５３６
ウェルの使用は、処理時間軸に従って、アリコーティン
グ・ピペッティングの同時進行アップグレーディングと
ソフトウェアのトラッキングにより、上記試験収率を実
質的に増加させることができる。
【００６２】上記手順において、成分の使用される濃度
レンジ及び量は、典型的に以下のものである： ａ）阻害剤のため最終インキュベート濃度において０．
０１μＭ〜１００μＭ、及び特異的プローブ基質に関し
て２mM、両者、５０／５０メタノール−水溶液中。
【００６３】ｂ）５０μｌを、上記阻害剤化合物及び基
質溶液の各々から吸引し、そして９６ウェルＳ／Ｉプレ
ートのウェル内にピペットし（ウェル数の増加に比例し
てプレート内で使用される量は減少する）、そして連続
した５０％容量の吸引及び戻しにより３回混合する。上
記事前調製したＳ／Ｉプレートにカバーをし、そして使
用前５日以内の間４℃で保存する。
【００６４】ｃ）上記ミクロソーム／補因子／バッファ
ー混合物（Ｍ／Ｃ／Ｂ）は、以下の処方に従う： ｉ）ＮＡＤＰＨ−再生補因子溶液＝１０％（ｖ／ｖ） ii）ミクロソーム＝０．１〜０．５mg／mlタンパク質濃
度 iii） 残りの容量を１００mMリン酸ナトリウム・バッフ
ァー、pH７．４で調製する。
【００６５】vi）上記ミクロソーム・タンパク質を、そ
れを安定のままにしながら、最大使用のための使用の直
前に添加する。
【００６６】ｄ）使用の間、１９０μｌのＭ／Ｃ／Ｂ
を、上記リザーバー・トラフから上記反応プレートのウ
ェルまで移す。事前インキュベーションは、その温度を
３７℃にもっていき、そしてＮＡＤＰＨ+ を生成する。
【００６７】ｅ）１０μｌを、上記事前調製されたＳ／
Ｉプレートから上記反応プレートのウェルの各々まで移
す。
【００６８】ｑ）例えば、２０μｌの５０／５０メタノ
ール／水は、上記反応プレートに添加されるとき、反応
停止剤として役立つ。
【００６９】ｒ）試験のために、１００μｌの上記反応
生成物を、上記反応プレートから９６ウェル・マルチス
クリーン−ＨＡフィルター・プレートまで取り出す（自
動化が異なる容量を規定する）。サンプルを、弱い真空
により上記フィルター・プレートを通してゆっくりと吸
引し、そしてポリプロピレン９６ウェル収集プレート内
に採取する。
【００７０】ｓ）３０秒〜４分毎に行われるインジェク
ションにより、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析のために５〜３０μ
ｌである。
【００７１】図面の詳細な説明及び好ましい態様 図面、及び上記手順を参照して、図１は、９６ウェルプ
レート１を示す。それに関して、上記試験調製装置１０
（図２及び３）が使用のために適合されている。上記装
置の変更は、特に使用されるウェル・プレート、及びそ
の中のウェルの数、例えば例示した９６、並びに３８４
（４倍）及び１５３６（１６倍）ウェルに相関し、上記
のように、同時進行の高められた処理量及び処理要求と
ともにあることが理解される。
【００７２】ウェル・プレート１は、以下のために使用
される： ａ）肝ミクロソームとの反応のための阻害剤化合物及び
酵素を個々に供給するための、通常事前に調製された形
態にある、化合物／基質を入れるため（Ｓ／Ｉプレート
１ａ）； ｂ）上記化合物、酵素、及びミクロソームがインキュベ
ートされ、そして反応されるところの反応部として（反
応プレート１ｂ）； ｃ）濾過のため、（多孔ウェル・ベースをもつ濾過プレ
ート１ｃ）、ここで反応生成物は、真空濾過のために、
この濾過プレートに移される；及び ｄ）分析装置、例えばＨＰＬＣ及び／又は質量分析装置
によるその後のＤＤＩ試験のための真空濾過された反応
生成物を集めるため（カバー１ｅをもつ収集プレート１
ｄ）。
【００７３】全てのプレートは、好ましくは、各目的の
ために同数のウェル、例えば、図示するプレートにおい
て９６を、そして容易にされた材料輸送並びに容易にさ
れた輸送及びハンドリングのために同一の全体寸法をも
つ（多吸引及びアリコーティングは、一般に、適当な操
作のためにウェルの同一の相対的置き替えを要求す
る）。さらに、各ウェル・プレートは、全てのプレート
を追跡するためにユニークなバーコード識別２をもち、
プレート機能と相関され、そしてテストされる化合物と
特定の酵素の識別を、調製ステージ、事前選択されたパ
ラメーター、及びその後の試験結果と相関させる。
【００７４】図示するウェル・プレート１内では、特定
のウェルが、８つの下のＡ−Ｈ行及び１２の列１〜１２
の英数字標識支点により識別される。上記プレートは、
不活性材料、例えばポリプロピレンから作られ、そして
濾過プレートを除き、本質的に同じである。濾過プレー
トは、個々のウェルの底に多孔性濾過エレメントを備え
る。
【００７５】図２〜３中に示す、試験調製装置１０は、
要素をローディングせずに、（上記試験プレートのタイ
プの全てに関して合計４０ウェル・プレートを用いた）
５対の試験実行のために適合されている。
【００７６】最初の試験調製実行の開始前に、各タイプ
の１０のプレートを、対応位置に積み重ねる：反応プレ
ート１ｂの保持のために３３位、上記Ｓ／Ｉプレート１
ａの保持のために３２位、上記濾過プレート１ｃのため
に３４位、及びカバー１ｅを備えた収集プレート１ｄの
ために３５位。上記Ｓ／Ｉプレート１ａは各々、そのウ
ェルの９０の内に阻害剤化合物とＣＹＰ酵素の所定の組
合せ物を事前にロードされており、６つのウェルは、阻
害剤化合物を含まない対照又は知られた相互作用特徴を
もつ化合物を含む対照として働く。
【００７７】１０のチャンバー２０ａ−ｊを備え、そし
て−２０℃で維持された冷凍ユニット２０に、ヒト肝ミ
クロソームを入れた１０のフタをしていないＣｒｙｏｖ
ｉａｌｓ １６ａ−ｊを挿填し、そして１０のオープン
・トラフ３０ａ−ｊに、補因子を含む所定濃度のバッフ
ァー溶液を充填する。４℃で維持された解凍ステーショ
ン２１は、Ｃｒｙｏｖｉａｌ保持部材２１ａ−ｊを備え
た冷凍ユニット２０の直接隣にある。上記冷凍ユニット
から上記解凍ステーションまでのＣｒｙｏｖｉａｌｓの
輸送は、上記適切な冷凍ユニットのチャンバー・ドアー
（ドア２３ａ−ｊの中の１）を開け、そして適切なエジ
ェクション・フィンガー２２ａ−ｊにより、上記選択さ
れたＣｒｙｏｖｉａｌを上記隣接保持部材２１ａ−ｊ内
に、エジェクション・プッシングすることにより、行わ
れる。
【００７８】カニューレ・ユニット１４は、まず、以下
のように機能する： ａ）上記Ｃｒｙｏｖｉａｌｓから上記隣接バッファー補
因子トラフまで、解凍されたミクロソームの材料輸送を
提供する； ｂ）上記トラフから選択された反応プレートまで、Ｍ／
Ｃ／Ｂ（ミクロソーム／補因子／バッファー）の材料輸
送を提供する。
【００７９】カニューレ・ユニット１４は、ウェル・プ
レート１の全体行１〜１２との操作可能な係わりのため
に大きさを合わされ、そして配置された手作業により交
換可能なピペット先端を備える、１２のステンレス・ス
チールのカニューレの行１５を含む。カニューレ・ユニ
ット１４はさらに、Ｃｒｙｏｖｉａｌｓ １６ａ〜ｊの
いずれか１から隣接Ｍ／Ｃ／Ｂトラフへの解凍ミクロソ
ームの輸送における使用のための、別個の単一ステンレ
ス・スチール・カニューレ１７と交換可能なピペット先
端をさらに含む。生物分解性バイオ材料としての上記ミ
クロソームの性質に因り、ピペット先端の使い捨てが滅
菌よりも好ましい。カニューレ・ユニット１４は、適当
な輸送を行うために、上記Ｃｒｙｏｖｉａｌｓとトラフ
に対して移動可能である。
【００８０】プレート輸送要素１１ａと１１ｂの各々
は、プレート１を拾い上げ、保持し、そして開放し、そ
してそれらを、要求時Ｘ−Ｙ−Ｚ輸送方向において上記
装置の処理ステーションのいずれか及び全てに移動させ
る（ここで、それらはさらなる輸送のために開放又は保
持される）ための、拡大及び収縮サポート１３上に分離
可能な試験プレート・グリッパー１２を含む。グリッパ
ー１２は、上記サポート１３の収縮及び拡大により横方
向に広がることができ、それによりプレートをつかみ、
そして解放する。輸送エレメント１１ａと１１ｂは、場
所移動能力及び範囲内で重複し、要素１１ａは、プレー
ト保存領域（３２〜３５）、バーコードリーダー３６、
インキュベーター２５ａと２５ｂ、ネスト４０と４１、
並びに真空チャンバー５０まで、かつ、それからトレー
を輸送し、一方、要素１１ｂは、ハイドラ（ｈｙｄｒ
ａ）１８、バーコード・リーダー３６、インキュベータ
ー２５ａと２５ｂ、及び真空チャンバー５０まで、か
つ、それからトレーを輸送する。
【００８１】上記試験プレートは、地面と平行に維持さ
れ、その対応ウェルは、有効な充填及び液体維持の目的
として地面から離れた方向に、開放している。
【００８２】上記試験調製装置１０は、それと整列する
ように輸送要素１１ｂにより輸送されたプレートのウェ
ルのそれぞれに、計測された量の溶液材料を吸引し、か
つ、小分けすることができる９６カニューレをもつ固定
された位置のＲｏｂｂｉｎｓＨｙｄｒａユニット１８を
含む。このＨｙｄｒａユニット１８は、Ｓ／Ｉプレート
から、Ｍ／Ｃ／Ｂを含有する反応プレートにＳ／Ｉ溶液
を吸引・小分けし、そして反応体を混合するために使用
される。
【００８３】操作中、Ｃｒｙｏｖｉａｌは、上記冷凍ユ
ニットから取り出され、そして、解凍され、そしてその
内に入れられたミクロソームは、補因子及びバッファー
との混合のためにトラフ（適宜、３０ａ−ｊ）まで単一
カニューレ１７を介して移動される。トラフ・アレー３
０ａ−ｊは、カム要素上１６’上に置かれ、それは、混
合を行うための及び上記Ｍ／Ｃ／Ｂ混合物の均質性を保
証するための監視された緩やかな振動を行う。輸送要素
１１ａは、３３位にあるスタックの上から反応プレート
１ｂを選び、そしてそれを、輸送ネスト４０に輸送す
る。カニューレ・ユニット１４のカニューレの行１５
は、（適宜）トラフ３０ａ−ｊの中の１からＭ／Ｃ／Ｂ
混合物を吸引し、そして行毎に上記反応プレート１ｂの
ウェルを充填するために移動する。次に反応プレート１
ｂは、事前インキュベーション期間にわたり（上記試験
実行の全てに関して等しくあるように事前に決定された
時間にわたり）ヒーター２５ａ又は２５ｂの中の１に輸
送要素１１ａにより輸送される。
【００８４】第１プレートがインキュベートされている
間、上記試験対の第２反応プレートが同様に、上記Ｍ／
Ｃ／Ｂ混合物を充填され、そしてヒーター２５ａと２５
ｂの中の他方の内で事前インキュベートされる。事前イ
ンキュベーションの後、Ｓ／Ｉプレートを輸送要素１１
ｂにより上記ハイドラ・ユニット１８に輸送し、ここ
で、上記事前ロードされた阻害剤化合物とＣＹＰ酵素溶
液が、９６カニューレ・ピペットにより吸引される。上
記Ｓ／Ｉプレートを、再スタック又は空プレート位置３
５ａに取り出し、そして最初に充填されたＭ／Ｃ／Ｂ反
応プレートを、対応化合物の溶液を充填するために上記
ハイドラ１８に輸送し、そしてその後、上記反応プレー
トを、３７℃のヒト体温までのインキュベーションのた
めに、ヒーターまで戻す。上記対の第２プレートを同様
に反応及びインキュベーションに供する。
【００８５】上記試験対の両プレートに関しては、イン
キュベーション及び付随反応は（上記のように決定され
た所定の時間期間にわたり進行する。上記反応プレート
が上記ヒーターにおいてインキュベートされている間、
ハイドラ１８は、阻害剤化合物、酵素基質、及びミクロ
ソームを含む、反応をクエンチングするために好適なメ
タノールと水の溶液の如き溶液を入れたクエンチ溶液リ
ザーバーから、クエンチ溶液を吸引する。収集プレート
１ｄは、３５位から取り出され、そして真空チャンバー
５０の底に置かれ、そしてカバー１ｅが、カバー・ネス
トにおいて置かれる。フィルター・プレート１ｃが３４
位にある上記スタックから取り出され、そして真空チャ
ンバー５０の上部に置かれる。
【００８６】所定のインキュベーション期間の後、上記
第１反応プレートを、対応のヒーターからハイドラ１８
まで輸送し、このハイドラは、その内の全ての反応を停
止させるために、上記の吸引されたクエンチ溶液を、上
記反応プレートの反応ウェルに小分けする。この反応プ
レートを、上記ハイドラ部から輸送要素１１ｂにより取
り出し、そして輸送ネスト４０上に置く。ここで、ピペ
ット１５の行をもつカニューレ要素１４が順番に、上記
反応プレートのＡ−Ｈ行から、上記真空チャンバー内の
フィルター・プレート１ｃの対応ウェルまで、上記行の
全てが事前に決定されたように充填されるまで、計測さ
れた反応生成物溶液を吸引・小分けする。
【００８７】上記真空チャンバーを起動して、反応材料
の、収集プレート１ｄへの濾過を行なう。このフィルタ
ー・プレートと反応プレートを取り出し、そして収集プ
レートを取り出し、カバーをし、そして保存し、又は反
応生成物及びＤＤＩの程度の分析のために送付する。
【００８８】上記クエンチング及び濾過方法を、第２プ
レートのために繰り返す。
【００８９】ハイドラ１８と本装置の他のステーション
との間に置かれたバーコードリーダー３６は、特に、識
別されたプレートの識別されたウェル内の阻害剤化合物
と特定のＣＹＰ酵素の識別を、その後の試験及び分析の
結果と相関させるために、そのスキャナー内に通過する
プレートとウェルを追跡するために使用される。
【００９０】コンピュータ１００は、上記の逐次的及び
同時（例えば、その後の試験実行のためのミクロソーム
の解凍）の計時された操作、並びに、コンピュータのモ
ニター上に表示されるインキュベーション温度等のプロ
セスのパラメーターにより、プロセス条件の追跡及びバ
ーコード識別を提供する。上記コンピュータは、操作の
入力変更をも可能にし、例えば、試験実行の数、ウェル
の数、そしてさらにそれに関してＤＤＩがテストされる
ところの哺乳動物の種の変更に際して必要であることが
できる。
【００９１】上記の例及び図面は本発明の方法及び装置
を説明するためのものであり、そして材料及びＤＤＩの
タイプの変更（例えば、適当な酵素及びミクロソーム並
びにインビトロ条件のエミュレーションを用いたヒト以
外の哺乳動物への適用可能性、構造、ステップ、及び成
分の変更が、以下の請求の範囲に記載する本発明から逸
脱せずに行われうることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明において使用される、典型的な
９６ウェル試験トレー又はプレートの上面図である。
【図２】図２は、本発明の装置の上面図である。
【図３】図３は、本発明の装置の正面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダイアン リン ジョンソン アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー グローバル リサーチ アンド デベロップメント (72)発明者 ケビン ジョージ ケリー アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー グローバル リサーチ アンド デベロップメント Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB20 BB46 CB01 CB26 CB30 DA36 DA77 FB01 FB02 HA02 HA05 HA06 HA12 HA16 JA07 JA08 JA09

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物におけるインビボにおける薬剤
    −薬剤間相互作用のインビトロ試験のための阻害剤化合
    物（ＮＣＥｓ）の製造方法であって、以下の自動ステッ
    プ： ａ）冷凍保存装置から組換え体又は上記哺乳動物種の冷
    凍ミクロソームを取り出し； ｂ）上記冷凍ミクロソームを解凍し； ｃ）マルチウェル反応プレートの個々のウェル内に、所
    定量の上記解凍されたミクロソーム、補因子、及びバッ
    ファーを機械的に導入し、そして所定の時間にわたり上
    記哺乳動物のためのインビボ温度まで、上記反応プレー
    トを含まれたミクロソームとともに事前インキュベート
    し； ｄ）上記反応プレートの各ウェル内の上記の解凍された
    ミクロソームを、所定量の、上記阻害剤化合物（ＮＣＥ
    ｓ）の中の１と事前に選択したＣＹＰ−特異的プローブ
    基質との組合せ物と、機械的に併合し； ｅ）上記反応プレートを、所定の時間にわたり上記イン
    ビボ温度まで、含まれた、ミクロソーム、ＣＹＰ−特異
    的プローブ基質、及び阻害剤化合物（ＮＣＥｓ）ととも
    にインキュベートして、上記各ウェル内で反応を行っ
    て、対応の反応生成物を得； ｆ）上記所定の時間の終わりに、生じている反応を全て
    停止させ、反応生成物を精製し、そして上記対応の阻害
    剤化合物（ＮＣＥｓ）を対応のＣＹＰ−特異的プローブ
    基質に対して、薬剤−薬剤間相互作用の程度を測定する
    ための分析試験において上記反応生成物を使用する、を
    含み、ここで、ステップｃ）〜ｆ）を、事前に解凍され
    たミクロソーム・サンプルを用いて、各試験を実行する
    とき、所定の回数、繰り返し、ここで、１の実行のパラ
    グラフｃ）〜ｆ）のステップと同時に、追加のミクロソ
    ームを上記冷凍装置から取り出し、解凍し、そしてその
    後の試験の実行のステップｃ）〜ｆ）において直ちに使
    用するために、待機位置に保持し、ここで、上記冷凍ミ
    クロソームがステップｃ）〜ｆ）の間に解凍のために初
    めに取り出される時機は、取り出しが、各試験実行の各
    ステップの間の同一時点となるような時機であり、そし
    てここで、解凍及び事前インキュベーションの時間は、
    上記実行の全てに関して同一であり、そしてインキュベ
    ーション時間は、事前に計算されており、そして試験実
    行の間の上記プレート対の各々において同一の時間をも
    つように合わせられている、前記製造方法。
  2. 【請求項２】 哺乳動物におけるインビボにおける薬剤
    −薬剤間相互作用の試験のための阻害剤化合物（ＮＣＥ
    ｓ）の製造のための装置であって、上記装置はコンピュ
    ータ制御され、かつ、協調して働く装置であって、以下
    の： ａ）ミクロソームを保存するための冷凍ユニット； ｂ）試験サンプルの調製における上記ミクロソームの使
    用に先立って上記ミクロソームを解凍するための解凍手
    段； ｃ）上記冷凍ユニットから、上記ミクロソームの解凍の
    ための上記解凍手段へ、冷凍ミクロソームを取り出すた
    めの、時機を計算されたエレメント； ｄ）上記装置の操作ステーションに、マルチウェル試験
    プレートを保持し、かつ、輸送するための、そしてそこ
    における適切な操作のために上記操作ステーションに上
    記プレートを位置決めするための、２つのコンピュータ
    制御され、かつ、時機を制御された操作及び輸送メカニ
    ズム； ｅ）事前に設定された量の解凍されたミクロソームを、
    反応試験プレートの複数の所定ウェルの各々に同時に充
    填するための液体導入エレメントを備えた第１操作ステ
    ーション； ｆ）上記反応試験プレートの対応ウェル内のミクロソー
    ムを、阻害剤化合物及びシトクロームＰ４５０酵素基質
    と併合するための第２操作ステーション； ｇ）反応生成物を作るために所定の時間にわたりその反
    応のための上記哺乳動物のためのインビボ温度まで上記
    対応ウェルの各々の内の上記併合物をインキュベートす
    るための第３操作ステーション； ｈ）上記反応プレートのウェルから全ての反応生成物を
    精製するための手段； ｉ）上記プレートの各々、及び上記プレートのウェル内
    の対応の内容物の各々に関しての同時操作、並びに解凍
    時機並びにに事前インキュベーション及びインキュベー
    ション時間並びにその後の試験実行のためのミクロソー
    ムの解凍の開始を、同期させるためのコンピュータ計算
    された時機制御手段； ｊ）その後の試験実行における使用のための事前に解凍
    されたミクロソームを保持するための各バイアルのため
    の少なくとも１の保持領域、を有する、前記装置。
  3. 【請求項３】 以下のステップ： ａ）自動化された機械輸送メカニズムを用いて冷凍保存
    装置から冷凍ミクロソーム・サンプルを取り出し； ｂ）上記冷凍ミクロソーム・サンプルを解凍し； ｃ）計測された量の上記ミクロソーム及びバッファー
    を、貯蔵トラフ（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ ｔｒｏｕｇ
    ｈ）内に、補因子とともに自動的、機械的に導入し； ｄ）等量の、解凍されたミクロソーム、バッファー、及
    び補因子の併合物を、マルチウェル反応プレートの各ウ
    ェル内に自動的、機械的に導入し； ｅ）所定の時間にわたり上記の解凍されたＭ／Ｃ／Ｂサ
    ンプルの事前インキュベーション加熱のための加熱装置
    に、上記マルチウェル反応プレートを、その後、自動
    的、機械的に輸送し； ｆ）上記インキュベートされたマルチウェル反応プレー
    ト内の上記Ｍ／Ｃ／Ｂサンプルに、事前に選択されたＣ
    ＹＰ−特異的プローブ基質と阻害剤化合物（Ｓ／Ｉ）溶
    液混合物の併合物を、自動的、機械的に導入し、そして
    混合し； ｇ）所定の時間にわたり上記哺乳動物のためのインビボ
    温度まで上記反応プレートを、その後インキュベート
    し； ｈ）上記所定時間の後に生じているであろう反応の全て
    を停止させ； ｉ）マルチウェル濾過プレートの個々のウェル内に、所
    定量の上記反応混合物を機械的に導入し、そしてその内
    の反応生成物の全てを真空濾過し； ｊ）存在する場合、上記化合物の薬剤−薬剤間相互作用
    の程度を測定するための、分析試験において上記反応生
    成物を使用する、を含み、ここで、ステップｃ）〜ｊ）
    を、事前に解凍されたミクロソーム・サンプルを用い
    て、各試験を実行するとき、所定の回数、繰り返し；こ
    こで、１の実行のパラグラフｃ）〜ｉ）のステップと同
    時に、追加のミクロソームを上記冷凍装置から取り出
    し、解凍し、そしてその後の試験の実行のステップｃ）
    〜ｊ）において直ちに使用するために、待機位置に保持
    し；そしてここで、上記冷凍ミクロソームがステップ
    ｃ）〜ｊ）の間に解凍のために初めに取り出される時機
    は、取り出しが、各試験実行の各ステップの間の同一時
    点となるような時機であり、そしてここで、解凍の時間
    は、上記実行の全てに関して同一であり、そして各試験
    実行の全ての事前インキュベーション及びインキュベー
    ション時間の全てが、事前に計算されており、そして同
    一の時間をもつように合わせられている、請求項１に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 前記機械的導入が、液体溶液のコンピュ
    ータ制御された吸引及び小分けにより自動操作可能な多
    数のカニューレ・エレメントを用いて行われる、請求項
    １に記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法のステップを実行
    するための装置であって、以下の： ａ）少なくとも２つのプレートをタンデムに保持するた
    めの統合されたエレメントであって、ここで各トレーが
    多数の試験ウェルをもつもの； ｂ）それを解凍するために冷凍装置の位置から冷凍ミク
    ロソームを取り出し、そして上記ミクロソームを緩衝液
    化し、かつ、それに補因子を添加するためのエレメン
    ト； ｃ）上記装置の操作ステーションに上記試験プレートを
    輸送し、そしてそこでの適切な操作のために上記操作ス
    テーションに上記プレートを位置決めするための、操作
    及び輸送メカニズム； ｄ）事前に設定された量のミクロソームを、反応プレー
    トの、複数の事前に決定されたウェルに同時に充填する
    ための手段を備えた少なくとも１の操作ステーション； ｅ）３７℃の温度まで、上記ミクロソーム、上記阻害剤
    化合物、及びシトクロームＰ４５０酵素基質、並びにそ
    れらの混合物をインキュベートするためのエレメント； ｆ）上記インキュベーションにより得られた反応生成物
    を真空濾過するためのメカニズム；及び ｇ）上記プレートの各々及び上記プレートのウェル内の
    対応の内容物の各々に関しての同時操作、並びに上記解
    凍の時機並びに事前インキュベーション及びインキュベ
    ーション時間並びにその後の試験実行のためのミクロソ
    ームの解凍の開始を、同期させるための、コンピュータ
    による時機制御手段、をもつコンピュータ制御され、か
    つ、協調された装置を含む、前記装置。
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