JP2002000263A - 肝細胞の増殖方法 - Google Patents
肝細胞の増殖方法Info
- Publication number
- JP2002000263A JP2002000263A JP2000191553A JP2000191553A JP2002000263A JP 2002000263 A JP2002000263 A JP 2002000263A JP 2000191553 A JP2000191553 A JP 2000191553A JP 2000191553 A JP2000191553 A JP 2000191553A JP 2002000263 A JP2002000263 A JP 2002000263A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- ascorbic acid
- hepatocyte
- proliferating
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、肝実質細胞成長因子HGFを使用す
ることなく、肝細胞を、生体外でも、生体内と同様に増
殖させる技術を提供する。 【解決手段】 肝臓組織より得た肝実質細胞画分を、
アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体の濃度
が培地に対して０．１ｍＭ以上含む培地にて培養する。
ることなく、肝細胞を、生体外でも、生体内と同様に増
殖させる技術を提供する。 【解決手段】 肝臓組織より得た肝実質細胞画分を、
アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体の濃度
が培地に対して０．１ｍＭ以上含む培地にて培養する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、肝細胞の増殖方法
に関するものである。
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】肝臓組織を手術で３分の１程度切除して
も、すぐに回復し、元と同じような大きさまで戻ること
が知られている。しかし肝細胞は、生体外では増殖が困
難な系として知られている。そのため、肝細胞を利用し
た生体細胞利用肝臓補助システムの構築に支障を来して
いた。また、初代培養肝臓細胞を利用したスクリーニン
グテストでも、増殖の低下と機能の停止は大きな問題で
あった。さらに、肝実質細胞画分の増殖培養系の先行研
究は、培地への肝実質細胞成長因子（Hepatocyte Growt
h Factor 以下HGFという）添加を基本とするものであ
が、増殖した肝細胞の肝特異的機能を誘導するために培
地以外の工夫をすることとHGF自体がかなり高価である
という難点があった。
も、すぐに回復し、元と同じような大きさまで戻ること
が知られている。しかし肝細胞は、生体外では増殖が困
難な系として知られている。そのため、肝細胞を利用し
た生体細胞利用肝臓補助システムの構築に支障を来して
いた。また、初代培養肝臓細胞を利用したスクリーニン
グテストでも、増殖の低下と機能の停止は大きな問題で
あった。さらに、肝実質細胞画分の増殖培養系の先行研
究は、培地への肝実質細胞成長因子（Hepatocyte Growt
h Factor 以下HGFという）添加を基本とするものであ
が、増殖した肝細胞の肝特異的機能を誘導するために培
地以外の工夫をすることとHGF自体がかなり高価である
という難点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、肝実質細胞
成長因子HGFを使用することなく、肝細胞を、生体外で
も、生体内と同様に増殖させる技術を提供するものであ
る。
成長因子HGFを使用することなく、肝細胞を、生体外で
も、生体内と同様に増殖させる技術を提供するものであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】肝臓組織より得た肝実質
細胞画分を、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸
誘導体を含む培地にて、培養することにより、細胞増殖
を誘起し、さらに増殖した細胞のアンモニヤ代謝などの
肝特異機能発現を亢進させることを見いだし、本発明を
完成させるに至った。
細胞画分を、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸
誘導体を含む培地にて、培養することにより、細胞増殖
を誘起し、さらに増殖した細胞のアンモニヤ代謝などの
肝特異機能発現を亢進させることを見いだし、本発明を
完成させるに至った。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明で用いることが出来る培地
としては、William's E培地、ＬＩＳ培地、ＤＭＥＭ培
地等がある。アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体
は単独で用いても、両者を併用して用いても効果がある
ことが確認されている。本発明で用いることが出来るア
スコルビン酸誘導体としては、 Ascorbic asid2-phosph
ate magnesium Saltで代表される安定化アスコルビン酸
誘導体がある。さらに培地に添加する成分としては、EG
F（上皮性細胞増殖因子）、Dexamethazone、FBS（牛胎
児血清）、インスリン 等がある。
としては、William's E培地、ＬＩＳ培地、ＤＭＥＭ培
地等がある。アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体
は単独で用いても、両者を併用して用いても効果がある
ことが確認されている。本発明で用いることが出来るア
スコルビン酸誘導体としては、 Ascorbic asid2-phosph
ate magnesium Saltで代表される安定化アスコルビン酸
誘導体がある。さらに培地に添加する成分としては、EG
F（上皮性細胞増殖因子）、Dexamethazone、FBS（牛胎
児血清）、インスリン 等がある。
【０００６】本発明の実施の形態は、種々あるが、まと
めると以下のとおりである。 （１） 肝臓組織より得た肝実質細胞画分を、アスコル
ビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体の濃度が培地に
対して０．１ｍＭ以上含む培地にて培養する肝細胞の増
殖方法。 （２） アスコルビン酸誘導体が、 Ascorbic asid 2-p
hosphate magnesiumSaltまたは安定化アスコルビン酸誘
導体である上記（１）記載の肝細胞の増殖方法。 （３） 培地の添加成分として、EGF、Dexamethazone、
FBS の少なくとも１種以上を併用する上記（１）又は
上記（２）に記載された肝細胞の増殖方法。 （４） 培地として、William's E培地、ＬＩＳ培地、
ＤＭＥＭ培地のいずれかひとつを用いる 上記（１）な
いし上記（３）のいずれかひとつに記載された肝細胞の
増殖方法。
めると以下のとおりである。 （１） 肝臓組織より得た肝実質細胞画分を、アスコル
ビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体の濃度が培地に
対して０．１ｍＭ以上含む培地にて培養する肝細胞の増
殖方法。 （２） アスコルビン酸誘導体が、 Ascorbic asid 2-p
hosphate magnesiumSaltまたは安定化アスコルビン酸誘
導体である上記（１）記載の肝細胞の増殖方法。 （３） 培地の添加成分として、EGF、Dexamethazone、
FBS の少なくとも１種以上を併用する上記（１）又は
上記（２）に記載された肝細胞の増殖方法。 （４） 培地として、William's E培地、ＬＩＳ培地、
ＤＭＥＭ培地のいずれかひとつを用いる 上記（１）な
いし上記（３）のいずれかひとつに記載された肝細胞の
増殖方法。
【０００７】
【実施例】以下に実施例を示すが本発明は実施例によっ
て何ら制限されることはない。 実施例１ （培地） 通常の肝細胞培地として知られているWillia
m's E培地に25ng/ml EGF,10-8M Insulin, 10-7M Dexame
thazone, 10%FBSを加えたものに、さらに1.5mM Ascorbi
c asid 2-phosphate magnesium Saltを加えたものを本
培養法の培地とした。
て何ら制限されることはない。 実施例１ （培地） 通常の肝細胞培地として知られているWillia
m's E培地に25ng/ml EGF,10-8M Insulin, 10-7M Dexame
thazone, 10%FBSを加えたものに、さらに1.5mM Ascorbi
c asid 2-phosphate magnesium Saltを加えたものを本
培養法の培地とした。
【０００８】（細胞） 成豚（150-200日齢）の肝臓左
中葉の先端を切り取り、断面の血管からEDTA含有灌流
液、EDTA不含灌流液、ディスパーゼ含有灌流液、コラゲ
ナーゼ含有灌流液の順で灌流し、細胞を分散させる。ガ
ーゼで濾過して未分散の組織を除き、60g,1-2分の遠心
操作により沈降する画分（肝実質細胞画分）を得る。
中葉の先端を切り取り、断面の血管からEDTA含有灌流
液、EDTA不含灌流液、ディスパーゼ含有灌流液、コラゲ
ナーゼ含有灌流液の順で灌流し、細胞を分散させる。ガ
ーゼで濾過して未分散の組織を除き、60g,1-2分の遠心
操作により沈降する画分（肝実質細胞画分）を得る。
【０００９】（培養） 上記の操作で得られた細胞を3X
104 cells/cm2 の密度でコラーゲンコートしたポリス
チレンディシュに播種し、37℃、5%二酸化炭素（水蒸気
飽和）下で培養する。翌日以降１日おきに培地を交換す
る。 （比較例）比較のため、実施例１においてAscorbic asi
d 2-phosphate magnesium Saltを添加しない培地を用
い、その他は全く同じ条件で培養実験を行った。
104 cells/cm2 の密度でコラーゲンコートしたポリス
チレンディシュに播種し、37℃、5%二酸化炭素（水蒸気
飽和）下で培養する。翌日以降１日おきに培地を交換す
る。 （比較例）比較のため、実施例１においてAscorbic asi
d 2-phosphate magnesium Saltを添加しない培地を用
い、その他は全く同じ条件で培養実験を行った。
【００１０】（結果） 細胞数は、図１に示すように１
０日以内に4-8倍程度に増加し、増殖した細胞は肝実質
細胞様の形態を呈するようになった。通常の増殖方法で
は、生体外で３日以上は増殖しないが、本発明の増殖法
では９日まで増殖を続けた。アンモニヤ代謝能は、図２
に示されるように2-4日後までに大幅に低下し、その後
初期の値を上回るまでに回復した。通常の増殖方法で
は、３日目以降はほとんどアンモニヤの代謝能はない
が、本発明の増殖法では２０日間以上も代謝能があっ
た。培養7-12日目の細胞をホルマリン固定し、肝細胞の
マーカーであるアルブミン、トランスフェリン、α１ア
ンチトリプシンの抗体を用いて、免疫細胞化学染色を行
ったところ、染色された。一方、比較例のものは、ほと
んどアンモニヤ代謝能の回復が見られず、免疫染色にも
染色されなかった。
０日以内に4-8倍程度に増加し、増殖した細胞は肝実質
細胞様の形態を呈するようになった。通常の増殖方法で
は、生体外で３日以上は増殖しないが、本発明の増殖法
では９日まで増殖を続けた。アンモニヤ代謝能は、図２
に示されるように2-4日後までに大幅に低下し、その後
初期の値を上回るまでに回復した。通常の増殖方法で
は、３日目以降はほとんどアンモニヤの代謝能はない
が、本発明の増殖法では２０日間以上も代謝能があっ
た。培養7-12日目の細胞をホルマリン固定し、肝細胞の
マーカーであるアルブミン、トランスフェリン、α１ア
ンチトリプシンの抗体を用いて、免疫細胞化学染色を行
ったところ、染色された。一方、比較例のものは、ほと
んどアンモニヤ代謝能の回復が見られず、免疫染色にも
染色されなかった。
【００１１】
【発明の効果】培地においてアスコルビン酸及び/又は
アスコルビン酸誘導体を用いれば、肝実質細胞成長因子
HGFを使用することなく、肝細胞を、生体外でも、生体
内と同様に増殖させる効果があることが確認された。
アスコルビン酸誘導体を用いれば、肝実質細胞成長因子
HGFを使用することなく、肝細胞を、生体外でも、生体
内と同様に増殖させる効果があることが確認された。
【００１２】
【図１】細胞増殖の経過図
【図２】アンモニウム除去活性の経過図
Claims (4)
- 【請求項１】 肝臓組織より得た肝実質細胞画分を、ア
スコルビン酸及び／又はアスコルビン酸誘導体の濃度が
培地に対して０．１ｍＭ以上含む培地にて培養する肝細
胞の増殖方法。 - 【請求項２】 アスコルビン酸誘導体が、 Ascorbic as
id 2-phosphate magnesium Saltである請求項１又は請
求項２記載の肝細胞の増殖方法。 - 【請求項３】 培地の添加成分として、EGF、Dexametha
zone、FBS の少なくとも１種以上を併用する請求項１
ないし請求項３のいずれかひとつに記載された肝細胞の
増殖方法。 - 【請求項４】 培地として、William's E培地、ＬＩＳ
培地、ＤＭＥＭ培地のいずれかひとつを用いる 請求項
１ないし請求項３のいずれかひとつに記載された肝細胞
の増殖方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000191553A JP2002000263A (ja) | 2000-06-26 | 2000-06-26 | 肝細胞の増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000191553A JP2002000263A (ja) | 2000-06-26 | 2000-06-26 | 肝細胞の増殖方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002000263A true JP2002000263A (ja) | 2002-01-08 |
Family
ID=18690840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000191553A Pending JP2002000263A (ja) | 2000-06-26 | 2000-06-26 | 肝細胞の増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002000263A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014208381A1 (ja) * | 2013-06-28 | 2014-12-31 | 株式会社日本生物製剤 | 肝細胞増殖剤 |
-
2000
- 2000-06-26 JP JP2000191553A patent/JP2002000263A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014208381A1 (ja) * | 2013-06-28 | 2014-12-31 | 株式会社日本生物製剤 | 肝細胞増殖剤 |
| US9616046B2 (en) | 2013-06-28 | 2017-04-11 | Japan Bio Products Co., Ltd. | Hepatocyte-proliferating agent |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Douglas et al. | The formation of histotypic structures from monodisperse fetal rat lung cells cultured on a three-dimensional substrate | |
| JP3553858B2 (ja) | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール | |
| ES2316353T3 (es) | Celulas progenitoras del higado humanas. | |
| CA1083987A (en) | Process for serially culturing keratinocytes | |
| EP2281875B1 (en) | Isolated liver stem cells | |
| Gordon et al. | Isolation, short-term culture, and transplantation of small hepatocyte-like progenitor cells from retrorsine-exposed rats1 | |
| Gerlach et al. | Use of hepatocytes in adhesion and suspension cultures for liver support bioreactors | |
| ATE384784T1 (de) | Verfahren zur produktion von adenovirus | |
| WO2001081549A3 (en) | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells | |
| IL150819A (en) | Method of processing donor liver to obtain progenitor cells | |
| US20050032218A1 (en) | Method to manufacture a cell preparation and such manufactured cell preparations | |
| ATE364408T1 (de) | Verfahren zur kultivierung von knorpelersatz und biomatrix nach diesem verfahren hergestellt | |
| JPWO2017119512A1 (ja) | 低分子化合物による成熟肝細胞からの肝幹／前駆細胞の作製方法 | |
| Li et al. | In vivo dedifferentiation of human epidermal cells | |
| Koebe et al. | Collagen gel immobilisation provides a suitable cell matrix for long term human hepatocyte cultures in hybrid reactors | |
| Strain | Ex VivoLiver Cell Morphogenesis: One Step Nearer to the Bioartificial Liver? | |
| Tilles et al. | Critical issues in bioartificial liver development | |
| JP2002000263A (ja) | 肝細胞の増殖方法 | |
| Bellemann | Primary monolayer culture of liver parenchymal cells and kidney cortical tubules as a useful new model for biochemical pharmacology and experimental toxicology: Studies in vitro on Hepatic Membrane Transport, Induction of Liver Enzymes, and Adaptive Changes in Renal Cortical Enzymes | |
| Inderbitzin et al. | Functional Comparison of Bone Marrow–Derived Liver Stem Cells: Selection Strategy for Cell-Based Therapy | |
| US20080026463A1 (en) | Matrix and method for isolation of hepatic progenitor cells | |
| Mizumoto et al. | Hepatic differentiation of embryonic stem cells in HF/organoid culture | |
| JP4998969B2 (ja) | 凍結保存可能な小型肝細胞の調製方法、およびその凍結保存方法 | |
| Ide et al. | Formation of ductular structures in vitro by rat pancreatic epithelial oval cells | |
| Higashiyama et al. | Maintenance of hepatocyte functions in coculture with hepatic stellate cells |