JP2001527402A - NGF mutant - Google Patents

NGF mutant

Info

Publication number
JP2001527402A
JP2001527402A JP54714498A JP54714498A JP2001527402A JP 2001527402 A JP2001527402 A JP 2001527402A JP 54714498 A JP54714498 A JP 54714498A JP 54714498 A JP54714498 A JP 54714498A JP 2001527402 A JP2001527402 A JP 2001527402A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ngf
binding
trkc
mutant
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP54714498A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ジー プレスタ，レオナ−ド
ウルファー，ローマン
ダブリュ ウィンスロウ，ジョン
Original Assignee
ジェネンテック，インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/845,541 external-priority patent/US6333310B1/en
Application filed by ジェネンテック，インコーポレーテッド filed Critical ジェネンテック，インコーポレーテッド
Publication of JP2001527402A publication Critical patent/JP2001527402A/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 ｔｒｋＣ結合活性及びｔｒｋＣシグナル誘導活性を有するＮＧＦ変異体が提供される。該変異体は任意に、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢ結合及びシグナル誘導活性を有する。本発明のＮＧＦ変異体は、ニューロン疾患の治療において有用である。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸及び発現ベクターもまた提供される。   (57) [Summary] An NGF mutant having trkC binding activity and trkC signal inducing activity is provided. The variant optionally has trkA or trkB binding and signal inducing activity. The NGF variants of the present invention are useful in treating neuronal disease. Nucleic acids encoding NGF mutant neurotrophins and expression vectors are also provided.

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＧＦ変異体 発明の背景 技術分野 本出願は、神経組織、特にニューロンの成長、調節または維持に関与するタン パク質に関する。特にそれは、もう一つの神経栄養因子ＮＴ−３の活性を有する ＮＧＦ変異体に関する。ｔｒｋＣ結合活性及びｔｒｋＣシグナル誘導活性を有す るＮＧＦ変異体が提供される。該変異体は任意に、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢ結合 及びシグナル誘導活性を有する。本発明のＮＧＦ変異体は、ニューロン疾患の治 療に有用である。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸及び発現ベ クターもまた提供される。 序論 脊椎動物ニューロンの分化した機能の生存及び維持は、ニューロトロフィンと 称される特異的なタンパク質の利用によって影響される。ニューロトロフィンは 、脊椎動物神経系の発達及び成熟段階の間、ニューロンの生存及び維持に対して 重要である成長因子の非常に相同なファミリーを形成している(文献として９９ を参照)。ニューロトロフィンの制限された生産は、過剰なニューロンの死を引 き起こす(文献として(１)；(２)を参照)。様々なニューロトロフィンが、中枢及 び末梢神経系における別個のニューロン集団の生存を助ける能力において機能的 に分化している(３)、(４)；(５)、(８０)。 ニューロトロフィンのファミリー(family)は、ＮＴ−３(６，７，５，８，９ ，１０)、神経成長因子（ＮＧＦ）(１１，１２)、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮ Ｆ）（１３，１４）並びにニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）(１５， １６，１７)及びニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）(９１，９２)を含む非常 に相同なファミリーである。 研究は、ニューロトロフィンが、ｔｒｋとして周知なＭr＝１４０−１４５， ０００のチロシンキナーゼ含有レセプターのクラスのリガンド依存的活性化を通 じて、少なくとも部分的に細胞内シグナリングを伝達することを示唆する(１８) ；(１９)(２１)；(２０)(２２)；(２３)；(２４)；(２５)；(２６)。ニューロト ロフィンの結合は、シグナル伝達カスケードにおける後の段階の誘発するｔｒｋ レセプターの自己リン酸化を誘導する(９５)。それ故、ニューロトロフィンのシ グナル伝達経路は、特異的なチロシンキナーゼレセプターに対する高親和性結合 及びそれらの活性化、並びに引き続くレセプター自己リン酸化によって開始され る(１９)；(２７)。ニューロトロフィンと様々なｔｒｋの間にはある程度の交差 レセプター相互作用が存在するが、顕著な特異性は、ＮＧＦ／ｔｒｋＡ、ＢＤＮ Ｆ／ｔｒｋＢ、及びＮＴ−３／ｔｒｋＣに存在すると思われ、その一方で、ＮＴ −４／５はＢＤＮＦと同程度の効率性でｔｒｋＢと主に相互作用するように思わ れる(２７)；(１９)(２１)；(２５)；(２２)；(２８)；(１８)；(２８ａ)。ＮＧ ＦはｔｒｋＡと過度に相互作用する（２１）一方で、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／ ５はｔｒｋＢに結合する(２９)。ｔｒｋＡおよびｔｒｋＢは、複数のニューロト ロフィンに対して特定の環境下、インビトロで応答することができる(６)；(２ ３)。ｔｒｋＣは、ＮＴ−３に対して過度に応答する(２５)；(２６)。ＮＴ−３ は、ｔｒｋＣを通じて好ましくはシグナル伝達するが、より低い親和性でｔｒｋ ＡおよびｔｒｋＢにも結合する（２５；１０１)(図１)。それ故、特異性の観点 からｔｒｋレセプターの最もストリンジェントなメンバー（ｔｒｋＣ）は、ニュ ーロトロフィンファミリーの最も相手を選ばないリガンド（ＮＴ−３）と過度に 相互作用する。 しかしながら、ニューロンの環境は、好ましくないニューロトロフィンリガン ドに対して応答する能力においてｔｒｋＡ及びｔｒｋＢを制限している(２９)。 レセプターのｔｒｋファミリーに加えて、ニューロトロフィンは、ｐ７５低親和 性ＮＧＦレセプター（ｐ７５；(３０)；(３１)）と称される異なるクラスのレセ プターにも結合することができ、該レセプターは、膜貫通シグナリングの未知の 機構を有しているが、腫瘍壊死因子レセプター(ＴＮＦＲ)、ＣＤ４０、ＯＸ４０ 、及びＣＤ２７を含むレセプター遺伝子ファミリーに構造的に関連している(３ ２)；(３３)；(３４)；(３５)；(３６)；(３７)。ニューロトロフィンの高親和 性結合部位の形成及びシグナル伝達経路における、ｇｐ７５の役割は、未だ明ら かではない(文献として(３８)；(３９)を参照)。 ニューロトロフィンの一次アミノ酸配列の調査により、ファミリーのメンバー の間の配列の多様性の８５％を説明する、それぞれ７−１０残基の７個の領域が 明らかにされている。 神経成長因子（ＮＧＦ）は、末梢神経系の感覚及び交感ニューロンを発達する ことに顕著な効果を有する１２０アミノ酸ポリペプチドホモダイマータンパク質 である。ＮＧＦは、ニューロンの生存を助け、軸索成長を促進し、及び神経化学 的分化を増大するために、応答ニューロン上の特異的な細胞表面レセプターを介 して機能する。ＮＧＦ機能は、ニューロン膜(４０)、（４１）における、ニュー ロンタンパク質のリン酸化の状態(４２)、（４３）における、並びにニューロン の分化及び機能において役割を果たすと思われる特定のｍＲＮＡ及びタンパク質 の富化（例えば（４４）参照）における改変を伴う。 前脳コリン作用性ニューロンもＮＧＦに応答し、栄養の補助のためにＮＧＦを 必要とする(４５)。実際、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＮＧＦ及びそのレセプ ターの配置及び発生は、ＮＧＦが基底の前脳コリン作用性ニューロンに対する標 的由来神経栄養因子として機能することを示唆する(４６)、(８１)。 ＮＴ−３の転写は、広範囲の末梢組織（例えば腎臓、肝臓、皮膚）と同様に、 中枢神経系（例えば小脳、海馬）においても検出されている(５)；(７)、(８２) 。発育の間、ＮＴ−３ｍＲＮＡの転写は、ニューロンの増殖、移動及び分化が生 じている、中枢神経系の領域において最も著しい(５０)。ニューロンの発展にお ける役割についての証拠を支えることには、神経堤細胞（５１）に対するＮＴ− ３の促進効果、及びインビボにおける稀突起神経膠前駆細胞の増殖の刺激が含ま れる。ＮＴ−３はまた、結節性神経節（ＮＧ）由来の感覚ニューロン(７)；(５) 、（８３）及び脊髄神経節（ＤＲＧ）由来の筋感覚ニューロンの集団（５２）の 生存をインビトロでも助ける。これらのインビトロでの研究に加えて、最近の研 究により、アルツハイマー病で見出される細胞欠損のパターンに似たモデルで、 ＮＴ−３が青斑（locus coemlus）の成人中枢ノルアドレナリン性ニューロン の分解をインビボで妨げることが示された。 ヒトＮＴ−３（１０１）並びにマウス及びヒトＮＧＦ（５５；９８）の高範囲 にわたる突然変異分析により、ｔｒｋＣ及びｔｒｋＡのそれぞれに対する結合部 位が示唆された。いくつかのニューロトロフィンの三次元構造が、Ｘ線結晶解析 によって解明されている(２９；９３；９６)。ＮＧＦにおいて、Ｎ末端残基はｔ ｒｋＡに対する親和性に顕著に寄与し、特異性に対する最も重要な決定因子を提 供する(５５；１０１)。生物学的活性及びレセプター結合の顕著な欠損が、アミ ノ及びカルボキシ末端で修飾された相同な切り詰めた形態を表す、ヒト及びマウ スＮＧＦの精製されたホモダイマーで観察された(４７)；(４８)；(４９)。精製 組換えヒトＮＧＦのＮ末端の最初の９残基及びＣ末端の最後の２残基の欠損から 導かれる１０９アミノ酸種（１０−１１８）ｈＮＧＦは、（１−１１８）ｈＮＧ Ｆと比較してヒトｔｒｋＡレセプターからマウス［125Ｉ］ＮＧＦを解離させる ことにおいて３００倍効率的ではない。(４９)。それは、（１−１１８）ｈＮＧ Ｆと比較して脊髄神経節及び交感神経節の生存において５０から１００倍活性が 低い(４８)。（１０−１１８）ｈＮＧＦは、顕著に低いｔｒｋＡチロシンキナー ゼ自己リン酸化活性を有することが報告されている(４９)。 ＮＴ−３について、ｔｒｋＣに対するエピトープは、中央のβ鎖束領域におけ る残基によって形成されているが、非保存的なループまたはＮ末端の最初の６残 基由来の残基を含まないことが示されている(１０１)。しかしながら、４０−４ ９残基（ＮＧＦ残基数は本明細書を通じて使用されるであろう）を包含する非保 存的なβヘアピンループは、ｔｒｋＡ／ｔｒｋＣ特異性を介在することを示すが (９４)、このループはｔｒｋＣのＮＴ−３の結合には寄与しない(１０１)。しか しながら、特にｔｒｋＣに対する結合に関与するＮＴ−３中の最も重要な残基、 Ｒ１０３が全てのニューロトロフィンで保存されているため、ｔｒｋＣの識別の 機構は不明である。 ニューロトロフィン特異性に対する構造的な決定因子の解明は、このファミリ ーの成長因子の機能及び進化を理解するために重要である。さらに、神経病変の モデルに対するニューロトロフィンの投与は、ニューロンの再生及び生存に対し て有益であることが示されている(９７；１０３)。ニューロトロフィンは様々な 神経変性疾患に対する治療薬の候補となっているため、ニューロトロフィンの特 異性及び機能の構造的な機構の知見は、新規なニューロトロフィンベースの治療 薬の開発の助けになるであろう。 キメラまたは全ニューロトロフィン因子を作製する制限された試みが存在する ((５３)；(５６)；(５４)、（５５）を参照)。神経変性疾患に関与するニューロ ン集団は、一つ以上のｔｒｋレセプターを発現し、それ故ＭＮＴＳ−１（１０１ ）またはＰＮＴ−１（５５）のような複数の特異性を有する分子の投与が、単一 の特異性を有するニューロトロフィンまたは単一の特異性を有するニューロトロ フィンの混合物の投与と比較して有利であろう。例えば、ニューロトロフィンの ファミリーの様々なメンバーが、異なる薬物生体反応を有し、それ故ニューロト ロフィン混合物の挙動は、予測されたものまたは制御されたものとは異なるであ ろう。一つ以上のニューロトロフィン活性を有し、及び／または改良された薬物 生体反応学的性質を有し、及び投与される準備が整い、有効性を維持しているニ ューロトロフィン分子に対する必要性が存在する。これらの及び他の利点は、こ こで提示される分子及び方法によって提供される。 要約 本発明は、ＮＴ−３の中央のβ鎖束の部分であり、ニューロトロフィンの間で 保存されていない特定の残基が、ＮＧＦに接合された場合ｔｒｋＣ結合及びｔｒ ｋＣシグナル誘導活性を与えることができるという発見に一部基づく。ＮＴ−３ 相補体による１８，２０，２３，２９，８４及び８９位のＮＧＦ残基の交換は、 ｔｒｋＡに対する親和性を維持する一方で、ｔｒｋＣに結合するＮＧＦ変異体を 導き、ｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞の自己リン酸化および分化を誘導するこ とができた。これらのＮＧＦ変異体は、２３位（ＮＧＦにおいてグリシン／ＮＴ −３においてトレオニン）でのアミノ酸はｔｒｋＣ認識にとって必須であり、そ の一方で他の残基はｔｒｋＣに対するＮＴ−３の特異性を微調整する。この結果 により、ｔｒｋＣとのＮＴ−３の相互作用に対する中央のβ鎖束領域の非保存的 な残基の重要性が示され、ＮＴ−３／ｔｒｋＣおよびＮＧＦ／ｔｒｋＡリガンド ／レセプターペアで使用される特異性の決定因子の異なる機構が強調される。 従って、ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を有するＮＧＦ変異体が提供され る。ＮＧＦ変異体は、任意にｔｒｋＡ結合及びシグナル誘導活性を有し、及び任 意にｔｒｋＢ結合及びシグナル誘導活性を有する。一つの実施態様として、該変 異体はｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ活性の両者を有する。もう一つの実施態様として、 該変異体はｔｒｋＣ活性を有するが、ｔｒｋＡ活性を欠いている。ＮＧＦ変異体 のアミノ酸配列は、典型的には天然のＮＧＦ配列である元となるＮＧＦアミノ酸 配列の一つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって得られる。好ましく は、ＮＧＦは、天然で生じる哺乳動物ＮＧＦである。最も好ましくは、それはヒ トＮＧＦである。ＮＧＦ変異体は、それが得られたＮＧＦの元の分子と少なくと も７５％のアミノ酸配列同一性を典型的に維持するであろう。これらのＮＧＦ変 異体の実質的な量は、組換えＤＮＡ法を使用して提供される。 さらに、本発明の一面として、ＮＧＦ変異体をコードする組換え核酸、並びに これらの核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞が提供される。 本発明のさらなる一面として、本発明の核酸、ベクター及び宿主細胞を使用す る方法を含む、ＮＧＦ変異体を生産する方法が提供される。一つの実施態様とし て、ＮＧＦ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターを使用して形質転換され た宿主細胞が、組換えＮＧＦ変異体を生産するために核酸の発現が可能となるよ うに培養される。 さらに、本発明のＮＧＦ変異体を使用する、哺乳動物のニューロン疾患を治療 するための方法及び組成物が提供される。 神経変性疾患に関与するニューロン集団は、一つ以上のｔｒｋレセプターを発 現するので、ここでのＮＧＦ変異体のような、複数の特異性を有する分子の投与 は、単一の特異性を有するニューロトロフィンまたは単一の特異性を有するニュ ーロトロフィンの混合物の投与と比較して有利である。例えば、ニューロトロフ ィンのファミリーの様々なメンバーが、異なる薬物生体反応を有し、それ故、ニ ューロトロフィン混合物の挙動は、ここでのＮＧＦ変異体のものとは対照的に予 測または制御し難い。神経病変モデルは、ニューロンの再生及び生存におけるニ ューロトロフィン活性を調べるために利用可能である(９７；１０３)。 本発明の他の利点及び面は、以下の詳細な説明、図面、及び請求の範囲から明 らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、ニューロトロフィン／ｔｒｋレセプター相互作用の特異性を示す図表 である。 図２は、ヒトＮＧＦ及びヒトＮＴ−３の配列のアライメントを示す。ＮＧＦ配 列に対して与えられる残基数は、本出願を通じて使用されている。星印は、本研 究で分析された変異体において突然変異されたＮＧＦ残基を強調する。横線は、 ネズミＮＧＦのＸ線構造におけるβ鎖の位置を示す(５９)。 図３ＡはヒトＮＴ−３のモデルを表し、図３ＢはネズミＮＧＦの結晶構造を示 す。各ニューロトロフィンの二つのモノマーが、濃淡で示されている；ＮＧＦ淡 色モノマーにおける残基数は、*によって表されている。特徴的な残基について 、側鎖の酸素原子は赤色に、側鎖の窒素原子は青色に示されている。１０３残基 （ＮＧＦとＮＴ−３の両者においてＡｒｇ）は紫色である。ＮＴ−３相補体を使 用して置換され、結合及び特異性に影響するＮＧＦ残基は黄色である；結合及び 特異性に影響しない残基は緑色である。ＮＧＦ結晶構造に見られる最初の残基（ １０残基）は茶色である。特異性に影響すると以前に提案されていた（９４）可 変βヘアピンループ（４０−４９残基）は青緑色で示されている。 図４Ａ及び４Ｂは、ラットｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞におけるｔｒｋＡ のチロシンリン酸化を表す。細胞を５分間、１００ｎｇ／ｍｌのそれぞれのニュ ーロトロフィンを使用して処理する。溶解物を細胞タンパク質について等量化し 、抗ｔｒｋＡ特異的ポリクローナル抗血清を使用して免疫沈降し、７．５％ＳＤ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。チロシンリン酸化を、抗ホスホ チロシンｍＡｂ ４Ｇ１０を使用して検出した。ＮＧＦ／Ｐ、精製されたＮＧＦ ；ＮＧＦ／Ｕ、ＮＧＦ発現２９３細胞の濃縮上清；ＮＴ−３／Ｐ、精製されたＮ Ｔ−３：ＮＴ−３／Ｕ、ＮＴ−３発現２９３細胞の濃縮上清；０，偽処理化２９ ３細胞。図４Ａ及び４Ｂは、上記各レーンに挙げたニューロトロフィンを使用し た二 つの別々の実験からの結果を示す。 図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、ラットｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞におけるｔ ｒｋＣのチロシンリン酸化を表す。細胞を５分間、１００ｎｇ／ｍｌのそれぞれ のニューロトロフィンを使用して処理する。溶解物を細胞タンパク質について等 量化し、抗ｔｒｋＣ特異的抗血清６５６を使用して免疫沈降し、７．５％ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。チロシンリン酸化を、抗ホスホチロ シンｍＡｂ ４Ｇ１０を使用して検出した。ＮＧＦ／Ｐ、精製されたＮＧＦ；Ｎ ＧＦ／Ｕ、ＮＧＦ発現２９３細胞の濃縮上清；ＮＴ−３／Ｐ、精製されたＮＴ− ３；ＮＴ−３／Ｕ、ＮＴ−３発現２９３細胞の濃縮上清；０，偽処理化２９３細 胞。図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、上記各レーンに挙げたニューロトロフィンを使用 した三つの別々の実験由来の結果を示す。 発明の詳細な説明 定義 アミノ酸に対する一文字コードは、以下の表１に従って本分野で周知なように ここで使用される： 表１ それ故、アミノ酸残基の識別は、一文字のアミノ酸コード、引き続き該残基の 位置数で表記される。位置数は、特定のニューロトロフィン骨格に相当するもの と理解される；それ故、Ｄ１５Ａ ＮＴ３は、ＮＴ３の１５位のアスパラギン酸 が、アラニンに変化することを意味する。以下に定義される「定常領域」内に見 出されるこのアスパラギン酸は、ＮＧＦはＮ末端で一つのさらなるアミノ酸を有 するため、ＮＧＦのＤ１６位に相当する。 本発明は、ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を有するニューロトロフィンＮ ＧＦ変異体を提供する。一般的にニューロトロフィンは、神経系、特にニューロ ンの発達、再生及び維持に関与するタンパク質である。現在では、いくつかの周 知の重要な神経栄養因子が存在する：神経成長因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィ ン−３(ＮＴ３)、ニューロトロフィン−４(ＮＴ４、また場合によりニューロト ロフィン−５（ＮＴ５）またはＮＴ４／５とも呼ばれる)、脳由来神経栄養因子( ＢＤＮＦ)、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及びＮＴ−６。 ここでの用語、「ＮＧＦ変異体」は、天然で生じるＮＧＦとは異なり、ｔｒｋ Ｃ結合及びｔｒｋＣシグナル誘導に対するＮＴ−３のニューロトロフィン特異性 を 有するニューロトロフィンを意味する。つまり、該変異体はこれらのＮＴ−３活 性を与えるまたは授ける変化を含む。一つの実施態様としてこれは、本発明のＮ ＧＦ変異体が少なくともｔｒｋＣに結合し、任意に好ましくはｔｒｋＡ及び／ま たはｔｒｋＢといった様々なニューロトロフィンレセプターに結合することを意 味する。それ故例えば、ｔｒｋＡレセプターに対する天然のまたは本来のリガン ドである天然で生じるＮＧＦは、高い親和性を有してｔｒｋＢまたはｔｒｋＣレ セプターのそれぞれに対して検出できるようには結合しない；例えばＮＧＦは、 ＢＤＮＦまたはＮＴ−３のそれぞれよりも、５００−３０００倍高いＫDを有し てこれらのレセプターに結合する。しかしながらＮＧＦ変異体、すなわちそのア ミノ酸骨格がＮＧＦに基づくニューロトロフィンは、少なくともｔｒｋＣに結合 することができる。一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＣ及びｔｒ ｋＡに結合するが、ｔｒｋＢには結合しない。好ましい実施態様として、それは ｔｒｋＣに結合するが、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢには結合しない。代わりに一つ の実施態様として、該変異体はｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣ、同様にｐ７５ レセプターに結合する。もう一つの実施態様として、該変異体はｔｒｋＣ及びｔ ｒｋＢに結合するが、ｔｒｋＡには結合しない。 一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体は、ＮＧＦについて天然で見出されるも のより高い親和性を有してｔｒｋＡ以外のレセプターに結合し、親和性は実質的 にそのレセプターの天然のリガンドのものである。例えば、ＮＧＦはｔｒｋＡに 強力に結合し、ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣには非常に弱く結合するかまたは全く結合 しない。それ故、一つのＮＧＦ変異体の実施態様は、正常なまたは実質的に正常 な結合親和性を有してｔｒｋＡに結合し、ｔｒｋＣの天然のリガンド、ＮＴ−３ と実質的に同様な親和性を有してｔｒｋＣに、またはｔｒｋＢの天然のリガンド 、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５または両者と実質的に同様な親和性を有してｔｒｋ Ｂに結合する。 一つの実施態様として、ニューロトロフィンレセプターに対してＮＧＦ変異体 は、ｔｒｋＣに対するＮＴ−３と比較して約５０倍以下に減少した、好ましくは 約２０倍未満に減少した、さらに好ましくは約１５倍未満に減少した、よりさら に好ましくは約１０倍未満に減少した、そしてまたよりさらに好ましくはｔｒｋ Ｃに対するＮＴ−３より約５倍未満に減少したｔｒｋＣに対する結合親和性を示 す。もう一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体は、ＮＴ−３よりも約３倍未満の ｔｒｋＣに対する親和性を有するであろう。ＮＧＦ変異体は、ＮＴ−３と同様の または実質的に同様の親和性を有することができ、若しくはそれらはＮＴ−３よ り１０倍以下の高い活性を有することができる。上記親和性の比較は、ＢＤＮＦ と比較したＮＧＦ変異体ｔｒｋＢ結合にも適用される。 この親和性は、当業者に理解される様々な方法によって測定される。好ましい 方法は、（８４）及び実施例中で示されている競合アッセイの使用である。一般 的に結合親和性は、ＩＣ50、つまりレセプターに対する標識化リガンドの結合の ５０％を阻害する非標識競合物の濃度として記録される。 代わりの実施態様として、ニューロトロフィン活性は、ニューロトロフィンレ セプターに対する結合親和性によってではなく、むしろニューロン生存アッセイ または軸索成長アッセイによって測定される。これは、ｔｒｋ細胞シグナリング に対する変異体の能力を示す。それ故、多くのニューロトロフィンが、胚神経堤 由来感覚ニューロンの生存を助長する(７７)、(７８)、(７)、(１７)。胚交感ニ ューロンの生存はＮＧＦによってのみ助長される一方で、プラコード由来感覚ニ ューロンの生存はＮＴ−３及びＢＤＮＦによって助長される(８５)。脊髄神経節 の感覚ニューロンは、ＮＧＦとＢＤＮＦの両者によって助長される(１３)。ＮＴ −３は、脊髄神経節、交感神経鎖神経節、及び結節神経節由来の感覚ニューロン の軸索成長を導き、同様に結節神経節ニューロン及び脊髄神経節ニューロンの生 存を助長する。それ故、ニューロン生存アッセイまたは軸索成長アッセイは、Ｎ ＧＦ変異体ニューロトロフィンの活性を測定するために機能することができる。 運動ニューロンの生存は、もう一つの好ましいＮＧＦ変異体活性である。 一つの好ましい実施態様として、ＮＧＦ変異体の活性は、ｔｒｋＣを発現する ＰＣ１２細胞の分化を刺激する能力によって測定される。ｔｒｋＣを発現するＰ Ｃ１２細胞（２６；１００）は、コラーゲン被膜組織培養皿上に置かれ、軸索所 有細胞の集団に対してアッセイすることができる。軸索所有細胞は、３日後の細 胞体の長さが少なくとも２倍になる工程を含むものとして定義される。代わりに 、ｔｒｋＢを発現するＰＣ１２細胞を、ｔｒｋＢシグナル誘導活性に対して試験 す るために使用することができ、ｔｒｋＡを発現するＰＣ１２細胞を、ｔｒｋＡシ グナル誘導活性に対して試験するために使用することができる。好ましいＮＧＦ 変異体は、培地中で同じ濃度で比較した場合、最も好ましくは最大の応答に必要 なＮＴ−３の濃度で比較した場合、少なくとも約２５％のＮＴ−３の最大の応答 、より好ましくは約５０％、さらにより好ましくは約７５％、またさらにより好 ましくは約９０％、最も好ましくは約１００％の最大のＮＴ−３応答で軸索成長 を達成するであろう。例えば表４中で、好ましい比較は、培地のｍｌ当たりの因 子の１ナノグラムでなされる。 それ故、ニューロトロフィン特異性は、ニューロトロフィンレセプター結合、 及びニューロン生存アッセイ及び／または軸索成長アッセイによって測定される 。それ故、ここで定義されるＮＧＦ変異体は、少なくともＮＴ−３の結合性質、 ニューロン生存アッセイ特異性、または軸索成長アッセイ特異性を示すニューロ トロフィンＮＧＦである。任意に、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５特異性を有するＮ ＧＦ変異体は、ＮＴ−３活性について議論された向性を有して、ＢＤＮＦまたは ＮＴ４／５のそれぞれの少なくとも結合特異性、ニューロン生存アッセイ特異性 、または軸索成長アッセイ特異性を示し、例えばそれはＢＤＮＦの少なくとも約 ２５％の最大の応答、より好ましくは約５０％での軸索成長等である。 ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を有するＮＧＦ変異体は典型的に、それが 由来するＮＧＦの元となる分子と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を維持 するであろう。他の実施態様として、該ＮＧＦ変異体は、それが由来するＮＧＦ の元となる分子と好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％ の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を維持するであろう。 ＮＴ−３上のｔｒｋＣ結合部位は、中央のβ鎖束領域における残基によって占 められているので、ｔｒｋＣは他のニューロトロフィンからＮＴ−３を区別する ためにこの一連の残基を認識すると仮定された(１０１)。本研究において、この 構造領域に位置する一連の５個の残基を、ヒトＮＴ−３からヒトＮＧＦに変換し た(図２)。ｔｒｋＣに結合する、生じたＮＧＦ変異体Ｇ２３Ｔ／Ｖ１８Ｅ／Ｖ２ ０Ｌ／Ｔ８１Ｋ／Ｈ８４Ｑ（ＮＧＦ１２）はｔｒｋＡに対する親和性を維持し、 ｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞の自己リン酸化および分化を刺激した。さらな る突然変異誘発により、特異的なｔｒｋＣ結合に対する最も重要な決定因子が２ ３位及び８４位に位置し、１８，２０，２９及び８６位の残基がｔｒｋＣに対す る特異性を微調整することが明らかにされた。これらの結果は、ｔｒｋＣとのＮ Ｔ−３の相互作用のための中央のβ鎖束領域の非保存的な残基の重要性によって 、ＮＴ−３／ｔｒｋＣ及びＮＧＦ／ｔｒｋＡリガンド／レセプターペアにおいて 使用される特異性の決定因子の異なる機構が強調され、短いアミノ酸「活性部位 」とは対照的にニューロトロフィンの全体の構造が、ニューロトロフィン特異性 を決定することを支持することを示す(５６)。 本発明のＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＣを結合し、レセプターシグナリングを誘導 するＮＧＦ変異体を得るために、ｔｒｋＣ結合を与えるまたは補充するＧ２３， Ｈ８４およびＶ１８またはＶ２０のいずれか（または両者）のアミノ酸位置での 置換によってＮＧＦから得ることができる。好ましい実施態様として、Ｖ２０が 置換される。任意にさらに、ＮＧＦ変異体は、ＮＴ−３特異性を増大または微調 整することができるＦ８６，Ｔ８１またはＴ２９の置換をさらに含むことができ る。好ましいＮＧＦ変異体は、実施例（表３参照）に提供されるようなヒトＮＧ Ｆ配列における置換を有するＮＧＦ１３０，ＮＧＦ１３１，ＮＧＦＲ２及びＮＧ ＦＲ３を含む。ｔｒｋＣ結合を得るために、これらの部位での好ましい置換は、 Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ、Ｖ１８Ｅ、Ｖ２０Ｌ、Ｆ８６Ｙ、Ｔ８１Ｋ及びＴ２９Ｉで ある。しかしながら、例えば保存的及び相同的な一連の置換といった、ｔｒｋＣ 結合及びシグナル誘導活性を補充するこれらの部位での他の置換をなすことがで きる。例えばＶ１８は、好ましい置換の保存的なものまたは相同体一例えばｔｒ ｋＣ結合を増大するためにアスパラギン酸またはグルタミンを使用したグルタミ ン酸の置換−であるアミノ酸置換を使用して置換することができる。Ｖ２０は、 ｔｒｋＣ結合を増大するために、トレオニンまたはより大きい疎水性アミノ酸（ イソロイシン、メチオニン）を使用して置換することができる。Ｇ２３は、セリ ンまたはアラニンを使用して置換することができる。Ｔ２９は、イソロイシン、 バリンまたはロイシンを使用して置換することができる。好ましくは、Ｔ２９Ｉ は、Ｆ８６Ｙが存在する場合に存在する。Ｈ８４は、アスパラギンまたはグルタ ミンを使用して置換することができる。Ｆ８６は、ｔｒｋＣ結合に影響するため に、メチオニンまたはトリプトファンを使用して置換することができる。 ｔｒｋＣ補充を微調整するために、実質的なｔｒｋＣ結合を補充するように置 換されていない中央のβ鎖束における天然のＮＧＦアミノ酸は、好ましくはこの 場合維持される。しかしながらあまり好ましくはない置換も存在する：１８位の バリンは、ロイシンまたはトレオニンを使用して保存的に置換することができ、 Ｖ２０は、アラニンを使用して置換することができ、Ｔ２９は、セリンを使用し て置換することができ、そしてＴ８１は、アルギニン、イソロイシン、バリン、 ロイシンまたはセリンを使用して置換することができる。Ｙ７９は、グルタミン 、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファンま たはアスパラギンを使用して置換することができるが、好ましくはＹ７９は維持 される。 さらにＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＣに加えてｔｒｋＢをも結合するＮＧＦ変異体 を生産するためにｔｒｋＢ結合を補充するまたは与えるＮＧＦ配列に対する修飾 を含むことができる。該修飾は、該分子に対するいかなる化学的変化でもあり得 る。修飾には、置換、挿入、欠失、及び脱アミド化、アセチル化、アシル化、Ｐ ＥＧ化、リン酸化、ミリスチル化および酸化を制限することなく含む化学的修飾 が含まれる。好ましい修飾は、Ｄ１６でのアミノ酸置換である。好ましい変異体 は、Ｄ１６Ａ置換を有する。Ｄ１６Ａ ＮＧＦを開示する１９９５年１２月１４ 日に印刷された国際特許出願ＷＯ ９５／３３８２９は、参考としてここに取り 込まれる。Ｄ１６での他のアラニン保存的置換は、ｔｒｋＢ結合を得るために成 され得る。ある実施態様として、特定のニューロトロフィンに依存するであろう ニューロトロフィン特異性を与えることができるニューロトロフイン内の一つ以 上のドメインが存在する。例えばＢＤＮＦは、ＢＤＮＦ特異性を与えると思われ る数多くのドメインを有する。例えば９３−９９位（ＳＫＫＲＩＧ）由来のＢＤ ＮＦ配列の置換は、ＮＧＦにおけるＢＤＮＦ特異性を与えるであろう(５５)。 ＮＧＦは、修飾された場合ＮＧＦ特異性に影響することができる数多くのドメ インを有する。ＮＧＦのＮ末端アミノ酸は、ｔｒｋＡ結合に対して影響のあるＮ ＧＦにおける主要な領域である。生物学的活性及びレセプター結合の顕著な損失 が、ヒト及びマウスＮＧＦの精製されたホモダイマーを使用して観察され、アミ ノ及びカルボキシ末端で修飾された相同な切り詰められた形態を表す。精製組換 えヒトＮＧＦのＮ末端の最初の９残基及びＣ末端の最後の２残基の損失から導か れる１０９アミノ酸種（１０−１１８）ｈＮＧＦは、（１−１１８）ｈＮＧＦと 比較してヒトｔｒｋＡレセプターからマウス［125Ｉ］ＮＧＦを置換するのに３ ００倍のより小さい有効性を有する。それは、（１−１１８）ｈＮＧＦと比較し て脊髄神経節及び交感神経節の生存において５０から１００倍不活性である。Ｎ ＧＦ変異体は、ｔｒｋＡ結合を減少または除去するために１０アミノ酸Ｎ末端領 域の修飾を含むことができる。一つの実施態様として、ＮＧＦの７個のＮ末端ア ミノ酸（ＳＳＳＨＰＩＦ）が、例えば減少または損失したｔｒｋＡ結合活性を有 するＮＧＦ変異体を得るために、欠失またはＮＴ−３のＮ末端アミノ酸（ＹＡＥ ＨＫＳ）を使用して置換することができる。約４個から約１０個のＮ末端残基が 交換された場合、修飾されたＮＧＦ Ｎ末端残基の正確な数は必須ではないが、 ある実施態様として、単一のアミノ酸変化が重要であろう。一つの実施態様とし て、１０個のＮ末端アミノ酸の少なくとも一つが、ｔｒｋＡ結合を減少または除 去するために欠失または置換される。修飾の特に好ましい位置は、ＮＧＦ特異性 に非常に重要であると思われる４位のアミノ酸のヒスチジン、同様に５位のプロ リンである。同様に、ＮＧＦの他の残基の数は、ＮＧＦ ｔｒｋＡレセプター結 合、同様に生物学的活性アッセイにおいて重要であることが示されている。例え ば、突然変異させた場合、ＮＧＦ活性を喪失する数多くの残基が存在する。これ らの残基には、Ｄ３０，Ｙ５２，Ｒ５９，Ｒ６９およびＨ７５が制限されること なく含まれる。アラニンを、ｔｒｋＡ結合を破壊するためにこれらの位置で置換 することができる一方、該位置でのアミノ酸に対して非保存的な他のアミノ酸も また、使用することができる。ＮＧＦ活性を喪失したＮＧＦ変異体を開示する１ ９９５年１２月１４日に印刷された国際特許出願ＷＯ ９５／３３８２９は、参 考としてここに取り込まれる。ｔｒｋＢ補充修飾は、ｔｒｋＣ及びｔｒｋＢの両 者を結合するが、ｔｒｋＡは結合しない変異体を生産するためにｔｒｋＡ減少修 飾と組み合わせることができる。 Ｖ１８，Ｖ２０，Ｇ２３，Ｈ８４及びＦ８６，Ｙ７９またはＴ８１のいずれか 若しくはこれらの三つのいずれかの組み合わせのアミノ酸位置でｔｒｋＣ補充 置換を有するＮＧＦを含むＮＧＦ変異体もまた提供され、この場合該変異体はｔ ｒｋＣを結合する。好ましい実施態様として、これらの変異体は、ｔｒｋＣ結合 活性を増大または微調整するためにＴ８１及びＦ８６の両者で置換される。さら にＮＧＦ変異体は、Ｔ２９の置換を含むことができる。置換には、Ｇ２３Ｔ、Ｇ ２３Ａ、Ｙ７９Ｙ、Ｙ７９Ｑ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｉ、Ｙ７９Ｌ、Ｙ７９Ｗ、Ｙ７ ９Ｎ、Ｈ８４Ｑ、Ｈ８４Ｎ、Ｖ１８Ｅ、Ｖ１８Ｄ、Ｖ１８Ｑ、Ｖ２０Ｌ、Ｖ２０ Ｔ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２０Ｍ、Ｆ８６Ｙ、Ｆ８６Ｗ、Ｔ８１Ｋ及びＴ２９Ｉを含むこ とができる。しかしながら、ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を与えるこれら の位置での他の置換、例えば保存的及び相同な一連の置換をなすことができる。 好ましい置換は、Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ、Ｖ１８Ｅ、Ｖ２０Ｌ、Ｆ８６Ｙ、Ｔ８１ Ｋ及びＴ２９Ｉであり、７９位ではＹが好ましい。このタイプの好ましいＮＧＦ 変異体には、ＮＧＦ１２６，ＮＧＦ１２３４，ＮＧＦ１２４，ＮＧＦ１２５，Ｎ ＧＦ１２，ＮＧＦＲ４及びＮＧＦ１２３，及びＮＧＦ１２７が含まれ、ヒトＮＧ Ｆにおける特異的なアミノ酸置換は、実施例の表３に提供される。 ＮＧＦは、１２０アミノ酸ポリペプチドホモダイマータンパク質である。ＮＧ Ｆは１２０の形態で生産することができる一方、ＮＧＦ変異体のより好ましいパ ターンまたは骨格は、１１８アミノ酸形態であり、好ましくはダイマー形態であ る。１１８形態において、Ｒ１１９及びＡ１２０は存在しない。この形態は、１ １８ＮＧＦコード核酸を使用した発現によって、または１２０形態の選択的な翻 訳後タンパク質溶解、例えばトリプシンを使用して得ることができる。もう一つ の実施態様として、１１７ＮＧＦ形態が、ＮＧＦのパターンまたは骨格として機 能することができる。ＮＧＦ変異体及び生理学的に許容できる担体を含む組成物 もまた提供される。 さらに、上述の残基の近傍における残基は、ＮＴ−３特異性を増大するまたは 微調整することもできる。ある実施態様として、定常領域における変化は、ＮＴ ３特異性を与えることもある。代わりに、ｔｒｋＣに対するＮＴ−３結合の増大 を引き起こすＮＴ−３におけるＲ３１及びＥ９２位での突然変異、特にＲ３１Ａ 及びＥ９２Ａ ＮＴ３は、以下に記載された方法を使用して、ＮＧＦにおける相 当する位置内に取り込むことができる。 さらに、ＮＧＦ結合及び／または生物学的活性を増大するＮＧＦにおける数多 くのアミノ酸置換が存在する。従って、これらの置換は、ＮＧＦ特異性を増大す るためのＮＧＦ変異体骨格中に含まれる。これらの残基には、Ｅ１１，Ｆ１２， Ｄ２４，Ｅ４１，Ｎ４６，Ｓ４７，Ｋ５７，Ｄ７２，Ｎ７７，Ｄ１０５及びＫ１ １５が制限されることなく含まれる。アラニンは、ｔｒｋＡ結合を維持または増 大するためにこれらの位置で置換することができる一方、アラニンまたはその位 置でのアミノ酸に保存的な他のアミノ酸もまた使用することができる。以下に概 略を示す。 ニューロトロフィン特異性において重要である残基は、実施例で記載された方 法、及び部位特異的突然変異誘発として周知の方法を使用して、他のアミノ酸残 基のいずれかによって置換することができる。一般的に、置換されるアミノ酸は 、当業者に理解されている特性に基づいて選択される。例えば、特性における小 さな改変が要求される場合、置換は一般的に以下の表に従ってなされる： 表２ 機能における実質的な変化または免疫学的同一性は、表１に示されたものより 保存性でない置換を選択することによってなされる。例えば、より顕著に影響す る置換がなされる：改変の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばアルフ ァヘリックスまたはベータシート構造；標的部位での該分子の電荷または疎水性 度；または側鎖の大きさ。一般的にポリペプチドの性質における最大の変化を生 ずると予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはトレオニルを 、疎水性の残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルま たはアラニルで（またはそれらによって）置換すること；（ｂ）システインまた はプロリンをいずれかの他の残基で（またはそれらによって）置換すること；（ ｃ）正電荷の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジルを 、負電荷残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルで（またはそれらによって ）置換すること；若しくは（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えばフェニルアラ ニルを、側鎖を有さないもの、例えばグリシルで（またはそれらによって）置換 することである。好ましい実施態様として、残基はアラニン残基に変化される。 さらに、相同的走査突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、カセット突然変異 誘発が、推定のＮＧＦ変異体を生産するために全て使用することができ、それか ら実施例に記載された方法及び本分野で周知の方法を使用して、レセプター結合 に対してスクリーニングされる。 ここでの用語、「ニューロトロフィンレセプター」または文法的な類義語は、 ニューロトロフィンリガンドを結合するレセプターを意味する。ある実施態様と して、ニューロトロフィンレセプターは、一般的に「ｔｒｋ」レセプターと称さ れるチロシンキナーゼファミリーのレセプターのメンバーであり、それは別個の ニ ューロン集団の表面で発現される。ｔｒｋファミリーには、ｔｒｋＡ(ｐ１４０t rk としても知られる)；ｔｒｋＢ(ｐ１４５trkBとしても知られる)；ｔｒｋＣ（ ｐ１４５trkCとしても知られる）が制限されることなく含まれる。他の実施態様 として、ニューロトロフィンレセプターはｐ７５NGFRであり、それはｐ７５また は低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）とも称される。他の未だ発見 されていないニューロトロフィンレセプターもまた、本発明のＮＧＦ変異体ニュ ーロトロフィンに結合できることが理解され、それは当業者によって容易に確認 できる。 一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体によるｐ７５レセプターに対する結合は 、実質的に減少または除去されている。例えば、突然変異が減少したｐ７５結合 を導くｐ７５結合に寄与する様々なアミノ酸残基が存在する。ＮＧＦにおいて、 Ｆ１２，１３１，Ｋ３２，Ｋ３４，Ｋ５０，Ｙ５２，Ｒ６９，Ｋ７４，Ｋ８８， Ｌ１１２，Ｓ１１３，Ｒ１１４及びＫ１１５位での突然変異は、全て減少したｐ ７５結合を引き起こす。Ｆ１２，１３１，Ｋ５０，Ｙ５２，Ｒ６９及びＫ７４は 全て定常領域内に存在する。 上記記載したアミノ酸に加えて、当業者は、アミノ酸配列のいくつかの可変性 が、ニューロトロフィンの特異性及び特徴を改変することなく許容されることを 理解するであろう。それ故、ＮＧＦ変異体は、ｔｒｋ結合に影響することはない が単に該配列の変異型である野生型配列と比較して、アミノ酸の置換、挿入また は欠失を有することができる。ある実施態様として、これらの突然変異は、特異 性に対して重要であると同定されたものと同じ位置内で見出されるであろう、す なわちある場合、中立の突然変異が、ニューロトロフィンの特異性を変化するこ となくなされるであろう。 本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、組換え法を使用して、様々な方 法で作成することができる。ここでの用語、「組換え核酸」は、天然では通常見 出されない形態における核酸を意味する。つまり、組換え核酸は、核酸を天然で は接合されないヌクレオチド配列によって接合する、または天然では通常見出さ れない配列を有する。組換え核酸は、もともと制限エンドヌクレアーゼによる核 酸の操作によってインビトロで形成され、または代わりにポリメラーゼ連鎖反応 の ような方法を使用して形成することができる。一度組換え核酸が作製され、宿主 細胞または生物内に再導入されると、それは非組換え的に複製される、すなわち インビトロの操作よりむしろ宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して複製され るであろうことが理解される；しかしながら、一度組換え的に生産された上記核 酸は、実質的に非組換え的に複製されるが、本発明の目的のために未だ組換え体 と考えられる。 同様に、用語、「組換えタンパク質」は、組換え法を使用して、すなわち上記 記載のような組換え核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。組換えタ ンパク質は、少なくとも一つ以上の特徴によって天然で生じるタンパク質とは区 別される。例えば、該タンパク質は、野生型宿主に通常それが関連しているいく つかのまたは全てのタンパク質及び化合物から単離される。該定義には、同じま たは異なる生物または宿主細胞における一つの生物からのＮＧＦ変異体ニューロ トロフィンの生産が含まれる。例えば、該タンパク質は、その増大したレベルが 作製されるような誘導可能または高発現プロモーターの使用を通じて、通常見出 されるよりも顕著に高い濃度で、それが由来する同じ生物において作製される。 代わりに、該タンパク質は、エピトープ標識またはアミノ酸置換、挿入及び欠失 を加えることのような、天然では通常見出されない形態で存在するであろう。 ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする本発明の核酸を使用して、様々 な発現ベクターが作製される。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター、ま たは宿主ゲノム内に挿入するベクターのいずれかである。一般的に、発現ベクタ ーには、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸に機能的に連結した 転写及び翻訳調節核酸が含まれる。本文脈で用語、「機能的に連結した」とは、 転写が開始される態様のように、転写及び翻訳調節ＤＮＡがＮＧＦ変異体ニュー ロトロフィンのコード配列に関して位置することを意味する。一般的にこれは、 プロモーター及び転写開始またはスタート配列が、ＮＧＦニューロトロフィンコ ード領域に対して５’側に位置することを意味するであろう。転写及び翻訳調節 核酸は一般的に、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを発現するために使用される 宿主細胞に対して適切なものであろう；例えば、哺乳動物細胞に対する転写及び 翻訳調節核酸配列は、哺乳動物細胞においてＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを 発 現するために使用される。数多くのタイプの適切な発現ベクター及び適切な調節 配列が、様々な宿主細胞に対して本分野で周知である。 一般的に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、シグナル配列、リ ボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ターミネー ション及びポリＡシグナル配列、及びエンハンサーまたはアクチベーター配列が 制限されることなく含まれる。好ましい実施態様として、調節配列には、プロモ ーター並びに翻訳開始及び終結配列が含まれる。組換え脊椎動物細胞培養物にお けるＮＧＦ変異体の合成に対する応用のための適切な方法、ベクター及び宿主細 胞は、Gething等,Nature,293:620-625(1981);Mantei等,Nature,281:40-46(1979) ;欧州特許出願EP 117,060;及び欧州特許出願EP 117,058に記載されている。ＮＧ Ｆ変異体の哺乳動物細胞培養発現のための特に有様なプラスミドは、ｐＲＫ５( 欧州特許出願EP 307,247)、ｐＲＫ７またはｐＳＶ１６Ｂである。１９９１年６ 月１３日に印刷された国際特許出願WO 91/08291は、参考としてここに取り込ま れる。 プロモーター配列は、構成的または誘導可能プロモーターのいずれかをコード する。一つ以上のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーター もまた本分野で周知であり、本発明において有用である。 さらに発現ベクターは、さらなる要素を含むであろう。例えば発現ベクターは 、二つの複製系を有し、それ故二つの生物において、例えば発現のために哺乳動 物細胞において、並びにクローン化及び増幅のために原核生物宿主において維持 することが可能である。さらに組み込み発現ベクターについては、発現ベクター は、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも一つの配列、好ましくは発現構築物の両 端に並んだ二つの相同な配列を含む。組み込みベクターは、ベクター内の挿入物 に対して適切な相同な配列を選択することによって宿主細胞における特異的な部 位に向けられる。組み込みベクターのための構築物は、本分野で周知である。 さらに好ましい実施態様として、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の 選択を許容する選択可能マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は本分野で周知であ り、使用される宿主細胞について多様である。 本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィ ンの発現を誘導または導く適切な条件の下で、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィン をコードする核酸を含む発現ベクターを使用して形質転換された宿主細胞を培養 することによって生産される。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの発現のための 適切な条件は、選択される発現ベクター及び宿主細胞によって変化し、当業者に 容易に確立されるであろう。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーター の使用には、宿主細胞の成長及び増殖を最適化することが必要とされ、一方で誘 導可能または抑制的プロモーターの使用には、誘導または抑制のために適切な増 殖条件が必要とされる。 好ましい実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、発現の後に精 製または単離される。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、サンプル中に存在す る他の構成成分に依存して、当業者に周知の様々な方法において単離または精製 される。標準的な精製法には、電気泳動、イオン交換、ハイブリッド、アフィニ ティー及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む分子的、免疫学的及びクロマ トグラフィー的方法、クロマトフォーカシングが含まれる。タンパク質濃縮物に 連結した限外濾過及び二重濾過法もまた有用である。適切な精製法における一般 的な手順としては、（５７）を参照。必要とされる精製の程度は、ＮＧＦ変異体 ニューロトロフィンの使用に依存するであろう。いくつかの場合には、精製は必 要とされないであろう。 適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、糸状菌のような真菌、並びに植物 細胞及び哺乳動物細胞を含む動物細胞が含まれる。特に興味あるものは、Saccha romyces cerevisiae及び他の酵母、大腸菌、枯草菌、Pichia pastoris，ＳＦ９ 細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Neurospora及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細 胞、固定化哺乳動物ミエロイド及びリンパ細胞系である。好ましい宿主細胞は哺 乳動物細胞であり、最も好ましい宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、 及びヒト胎児腎細胞系２９３が含まれる。 好ましい実施態様として、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、哺乳 動物細胞で発現される。哺乳動物発現系もまた本分野で周知である。 いくつかの遺伝子は、イントロンが存在する場合より効率的に発現される。し かしながら、いくつかのｃＤＮＡは、スプライシング配列を欠くベクターから効 率的に発現されている。それ故、いくつかの実施態様においては、ＮＧＦ変異体 ニューロトロフィンをコードする核酸はイントロンを含む。 哺乳動物宿主、同様に他の宿主内に外来の核酸を導入する方法は本分野で周知 であり、使用される宿主によって変化し、そしてデキストラン介在トランスフェ クション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン介在トランスフェクション、プロ トプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド のカプセル化、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる 。 一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは酵母細胞で生産さ れる。酵母発現系は本分野で周知であり、Saccharomyces cerevisiaeに対する発 現ベクターが含まれる。Candida albicans及びC.maltasa,Hansenula polymorpha ,Kluyveromyces fragilis及びK.lactis,Pichia Guilerimondii及びP.pastoris,S chizosaccharomyces pombe及びYarrowia lipolyticaに対する発現ベクターが含 まれる。酵母宿主、同様に他の宿主内に外来核酸を導入する方法は本分野で周知 であり、使用される宿主細胞によって変化するであろう。 好ましい実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、細菌系におい て発現される。細菌のための発現ベクターは本分野で周知であり、枯草菌、大腸 菌、Streptococcus cremoris及びStrcptococcus lividans及び他のものに対する ベクターが含まれる。細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポ レーション、及び他の方法のような本分野で周知の方法を使用して細菌宿主内に 形質導入される。 一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、昆虫細胞におい て生産される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特にバキュロウイル ス−ベースの発現ベクターが、本分野で周知である。バキュロウイルス／昆虫細 胞発現系のための物質及び方法は、キットの形態で商業的に入手可能である；例 えばSan DiegoにおけるInvitrogcn社製の”ＭａｘＢａｃ”キットが挙げられる 。 組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞内への感染のた めに開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、Aedes acgypti,Auto grapha califomica,Bombyx mori,Drosophila melangaster,Spodoptera frugiper da及びTrichoplusia niに対して開発されている。 一度発現されると、ＮＧＦ変異体ニュートロフィンは、神経栄養因子として使 用される。これらのＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、様々な診断及び治療上 の応用において利用される。ＮＧＦ変異体はまた、動物の食料としても使用可能 である。 本発明のＮＧＦ変異体ニュートロフィンは、ニュートロフィンレセプターを検 出する診断方法において有用である。例えば、本発明のＮＧＦ変異体ニュートロ フィンは標識することができる。ここでの用語、「標識されたＮＧＦ変異体ニュ ートロフィン」は、ＮＧＦ変異体ニユートロフィンまたはニュートロフィンレセ プターに結合したＮＧＦ変異体ニュートロフィンの検出を可能にするように付着 した放射性同位元素または化合物である、少なくとも一つの要素を有するＮＧＦ 変異体ニュートロフィンを意味する。一般的に、標識は三つのクラスに分類され る：ａ）放射性同位元素または重同位元素である同位元素標識；ｂ）抗体または 抗原である免疫学的標識；及びｃ）色素または蛍光染料。標識はいずれかの位置 でＮＧＦ変異体ニューロトロフィン内に取り込まれる。一度標識化されると、Ｎ ＧＦ変異体ニューロトロフィンは、インビトロまたはインビボのいずれかで、ニ ューロトロフィンレセプターを検出するために使用される。例えば、ニューロト ロフィンレセプターの存在は、特定の細胞タイプの存在の指標となり得、診断に おいて有用である。つまり、特定の細胞タイプの二次集団は、レセプターを介し て該細胞に標識化されたＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを結合することによっ て示される。 さらに、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、ニューロトロフィンア ッセイの標準として有用である。例えば、いずれかの特定のアッセイにおけるＮ ＧＦ変異体ニューロトロフィンの活性は、周知のニューロトロフィン標準を使用 して測定され、それからＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを、ニューロトロフィ ンの診断及び定量において使用する。 さらに、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、多くの神経細胞が成長 因子を必要とするため、インビボにおける神経細胞の培養における使用のための 培養培地の構成成分として有用である。当業者に理解されるように、本発明のＮ ＧＦ変異体ニューロトロフィンは、培地の構成成分として頻繁に使用される他の 神経栄養因子の代わりとなることができる。標準的なアッセイで使用される、添 加されるＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの量は、容易に測定することができる 。 本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンはまた、生物または患者内のニュー ロトロフィンまたはニューロトロフィン抗体の診断、同定及び局在において使用 することができる抗体を生産するためにも有用である。例えば、ＮＧＦ変異体ニ ューロトロフィンは、当業者に周知なようにポリクローナルまたはモノクローナ ル抗体を作製するために使用することができる。それから該抗体を標識化し、ニ ューロトロフィンの存在または非存在を検出するために使用する。それ故、ニュ ーロトロフィンと関連する神経疾患の診断が検出される。代わりに、該抗体は二 次抗体を使用することによって間接的に検出される。例えば、一次抗体をマウス またはウサギにおいて作製し、それから標識化された抗マウスまたは抗ウサギ抗 体を一次抗体を検出するために使用する。これらの方法のそれぞれ、同様に類似 の方法は本分野で周知であり、様々な組織においてニューロトロフィンを検出す ることを可能にする。 さらに、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンに対して生産された抗体は 、ニューロトロフィン及びＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの精製のためにも有 用である。一般的にＮＧＦ変異体ニューロトロフィンのアミノ酸置換は少ないた め、多くの免疫学的エピトープをニューロトロフィン及びＮＧＦ変異体ニューロ トロフィンが共有する。それ故、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンに対して向け られた抗体は、天然で生じるニューロトロフィンに結合し、それ故精製において 有用である。例えば本分野で周知なように、アフィニティークロマトグラフィー 法に基づく精製スキームを使用することができる。 本発明のＮＧＦ変異体製剤は、中枢(脳及び脊髄)、末梢(交感、副交感、感覚 及び内臓ニューロン)、及び運動ニューロンを含む、インビトロ及びインビボで のニューロンの形成、維持または再生を促進する場合に有用であると考えられる 。従って、本発明のＮＧＦ変異体製剤は、様々な神経学的疾患及び疾病の治療の ための方法において有用である。好ましい実施態様として、本発明の製剤は、神 経疾患を治療するために患者に投与される。ここでの用語、「神経疾患」は、ニ ューロンの変質または損傷と関連する中枢及び／または末梢神経系の疾患を意味 する。 神経疾患の特徴的な例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティ ングトン舞踏病、発作、ＡＬＳ、末梢神経障害、及び中枢、末梢、または運動ニ ューロンのいずれかの、ニューロンの壊死または損失によって特徴付けされる他 の疾患が制限されることなく含まれ、さらに外傷、火傷、腎機能障害、傷害、並 びにガン及びＡＩＤＳを治療するために使用される化学療法試薬の毒性効果のた めに、損傷された神経を治療することが含まれる。例えば、糖尿病、ＡＩＤＳま たは化学療法と関連する神経障害のような、特定の病気と関連する末梢神経障害 が、本発明の製剤を使用して治療される。それはまた、インビトロまたはエクス ビボで神経細胞を培養する際の使用のため、培養培地の構成成分としても有用で ある。 本発明の様々な実施態様において、ＮＧＦ変異体処法は、ニューロンの生存ま たは成長を促進するために、外傷、手術、発作、虚血、感染、代謝疾患、栄養失 調、悪性腫瘍、または毒性試薬によって損傷された神経系を有する患者、または ＮＧＦ、ＮＴ−３，ＢＤＮＦまたはＮＴ４−５を使用して治療されているいずれ かの疾患を有する患者に投与される。予測されるように、治療または効果は、特 定のｔｒｋ結合機能またはＮＧＦ変異体に存在する機能に依存する。例えば、本 発明のＮＧＦ変異体製剤は、外傷または手術によって損傷された運動ニューロン の生存または成長を促進するために使用することができる。本発明のＮＧＦ変異 体製剤はまた、筋萎縮性側索硬化症(ルー・ゲーリック病)、ベル麻痺、及び棘筋 萎縮症または麻痺を含む様々な疾患のような、運動ニューロン疾患を治療するた めに使用することができる。本発明のＮＧＦ変異体製剤は、アルツハイマー病、 パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症、神 経性難聴、及びメニエール病のような、ヒト神経変性疾患を治療するために使用 することができる。本発明のＮＧＦ変異体製剤は、特に痴呆または外傷における 認識を促進するために、認識エンハンサーとして使用することができる。熟年層 における痴呆の５０％以上の原因としてNational Institutes of Agingによって 確認されているアルツハイマー病は、６５歳を越えるアメリカ人において第四位 または第五位の死を導く原因である。８５歳を越えるアメリカ人（米国人口の最 も急速に増える部分である）の４０％である４百万人のアメリカ人が、アルツハ イマ ー病に罹患している。パーキンソン病を有する全ての患者の２５パーセントもま た、アルツハイマー病様の痴呆に苦しんでいる。そして痴呆を有する患者の約１ ５％において、アルツハイマー病及び多梗塞痴呆が共存している。アルツハイマ ー病と血管性痴呆症に次いで、痴呆の第三の一般的な原因は、アルコール中毒に 間接的に関連した器質脳症候群のための認識障害であり、それはアルコール中毒 患者の約１０％で生じている。しかしながら、アルツハイマー病、同様に血管性 痴呆症、及びアルコール中毒に関連する器質脳症候群による認識障害についての 、最も一致した異常は、基底の前脳（ＢＦ）からコデックス(codex)及び海馬の 両者に生じるコリン作用系の変質である(Bigl等,Brain Cholinergic Systems,M. Steliade及びD.Biesold編、Oxford University Press,Oxford,pp.364-386(1990) )。そして、アルツハイマー病によって影響を受ける数多くの他の神経伝達物質 系が存在する(Davies,Med.Res.Rev.3:221(1983))。しかしながら、例えばコリン 作用性神経伝達物質系の変質に関連する認識障害は、痴呆に苦しんでいる患者に 制限されない。それはまた、他の健康な高齢の成人及びラットにも見られる。高 齢のラットにおける減少した大脳皮質血液流の程度と、認識障害の程度を比較す る研究は、適切な相関関係を示す(Berman等,Neurobiol.Aging 9:691(1988))。慢 性アルコール中毒患者においては、アルツハイマー病及び正常な加齢と同様の、 生じた器質脳症候群もまた、コリン作用性ニューロンが生じ(前脳基底)、それら が機能する（大脳皮質）脳の領域における大脳皮質血液流の拡散した減少によっ て特徴付けされる(Lofti等,Cerebrovasc.and Brain Metab.Rev 1:2(1989))。上 記痴呆は、本発明のＮＧＦ変異体製剤の投与によって治療することができる。 さらに本発明のＮＧＦ変異体製剤は、神経障害、特に末梢神経障害を治療する ために、好ましくは使用される。用語、「末梢神経障害」は、末梢神経系に作用 する疾患を示し、最も頻繁には、運動、感覚、感覚運動、または自律神経機能不 全の一つまたは組み合わせとして表される。末梢神経障害によって示される広範 囲の形態はそれぞれ、同様に多数の原因に独特に基づいている。例えば、末梢神 経障害は一般的に後天的であり、全身性の疾患から由来し、または毒性試薬によ って誘導され得る。例として、糖尿病性末梢神経障害、遠位の感覚運動神経障害 、または胃腸管の減少した動きや膀胱の無緊張症のような自律神経障害が制限さ れ ることなく含まれる。全身性の疾患と関連した神経障害の例として、ポストポリ オ症候群またはＡＩＤＳ関連性神経障害が含まれる；遺伝的な神経障害の例とし て、シャルコー-マリー-ツース病、レフサム病、無β-リポ蛋白血症、タンジア ー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、及びドゥジュリーヌ-ソ ッタ病が含まれる。そして毒性試薬によって引き起こされる神経障害の例として 、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、または3'-アジド-3'-デ オキシチミジンのような化学療法試薬を使用した治療によって引き起こされるも のが含まれる。従って、ＮＧＦ変異体の治療上の有効量を哺乳動物に投与するこ とを含む、哺乳動物における神経障害を治療する方法が提供される。好ましくは 、神経疾患は、末梢神経障害であり、より好ましくは糖尿病性末梢神経障害、化 学療法誘発性末梢神経障害、またはＨＩＶ関連性神経障害である。好ましくは、 末梢神経障害は、運動ニューロンに影響する。 さらに、ＮＴ−３の投与は、アルツハイマ一病で見出される細胞損失のパター ンに似たモデルにおいて、青斑(locus coerulus)の成人中枢ノルアドレナリン作 用性ニューロンのインビトロでの変質を妨げる(８６)。さらに、ＮＴ３の添加に より、発生の間、同様に成人の脊髄病変の後に、皮質脊髄路の新芽発生を促進す ることが示されている。実際、ＮＴ３を、ミエリン関連性成長阻害タンパク質を 阻害する抗体と共に投与した場合、長距離の再生が見られた。それ故、本発明の ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、この応用においてＮＴ３の代わりに使用す ることができる。 本実施態様では、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの治療上の有効量が、患者 に投与される。ここでの用語、「治療上の有効量」は、それが投与されるものに 対して治療上の効果を生ずる投与量を意味する。正確な投与量は、例えば治療さ れる疾患、投与の形態、及び治療される患者の臨床上の状態に依存し、周知の方 法を使用して当業者によって確立されるであろう。一般的に、本発明のＮＧＦ変 異体ニューロトロフィンは、一日当たり約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ で投与される。さらに、本分野で周知なように、年齢、同様に体重、通常の健康 状態、性別、食事、投与時間、薬剤の相互作用、及び疾患の程度に対する調節が 必要とされ、当業者によって通常の実験により確立されるであろう。 ある実施態様では、０．０７から２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０８から１ ５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．０９から１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは ０．１から２ｍｇ／ｍｌの量のＮＧＦ変異体を含む組成物が調製される。末梢神 経障害に苦しんでいるヒト患者に対する投与におけるこれらの組成物の使用につ いて、例えばこれらの組成物は、上記治療のための現在企図されているＮＧＦ投 与量に相当する、約０．１ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ変異体を含む 。ＮＧＦ変異体は、ＮＧＦと同様に良好な許容性を有すると考えられ、必要であ れば臨床医によって測定されるように、より高い投与量を投与することができる 。１μｇ／ｋｇのＮＧＦの単一のＩＶまたはＳＣ投与量が、ヒト患者において注 射部位の痛覚過敏及び全体または部分的な筋肉痛を引き起こすことが観察される ので、好ましい単一のＩＶまたはＳＣ投与量は、好ましくは１μｇ／ｋｇのＮＧ Ｆより少ないが、本分野で周知なように痛覚過敏及び筋肉痛を改善する段階を踏 めば、より高い投与量を与えることができる。末梢神経障害に対する好ましい摂 生は、一週間に３回ＳＣで０．１μｇ／ｋｇ、または一週間に一度ＳＣで０．３ μｇ／ｋｇである。 本発明の目的に対して用語、「患者」は、ヒト及び他の動物と生物の両者を含 む。それ故本方法は、ヒトの治療及び獣医学的応用の両者に応用可能である。 本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの投与は、例えば経口、皮下、静脈 内、大脳下、鼻孔間、経皮的、腹膜内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、動脈内、 病変内、脳内の心室間、眼内を制限することなく含む特異適応に対して周知の経 路といった様々な方法でなすことができる。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは 、ＣＮＳの液体貯蔵内への点滴によって継続的に投与されるが、ポンプまたは移 植のような、本分野で周知の方法を使用した、丸薬注射も許容することができる 。ある例として、例えば外傷の治療において、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィン は、溶液またはスプレーとして直接に適用される。持続放出系を使用することも できる。一般的に、疾患が許す場合には、部位特異的な輸送としてＮＧＦ変異体 を処方または投与すべきである。投与は、継続的または断続的であることができ る。投与は、一定のまたはプログラム化された循環の移植可能ポンプ、若しくは 断続的な注射によって成し遂げることができる。 半透過性移植可能膜器具は、特定の環境に薬剤を輸送する手段として有用であ る。例えば、可溶性ＮＧＦ変異体を分泌する細胞をカプセル化でき、上記器具を 患者内に、例えばパーキンソン病に苦しんでいる患者の脳または脊髄（ＣＳＦ） 内に移植することができる。Aebischer等の米国特許第4,892,538号；Aebischer 等の米国特許第5,011,472号；Aebischer等の米国特許第5,106,627号；国際特許 出願WO 91/10425；国際特許出願WO 91/10470；Winn等,Exper.Neurology,113:322 -329(1991)；Aebischer等,Exper.Neurology,111:269-275(1991)；及びTresco等, ASAIO,38:17-23(1992)参照。最後に本発明は、半透過性膜及び該膜内にカプセル 化されたＮＧＦ変異体を分泌する細胞を含む、神経損傷またはここで教示される 他の細胞に対する損傷を予防または治療するための移植器具を含み、該膜はＮＧ Ｆ変異体に対して透過性であり、該細胞に有害な患者由来の因子に透過性ではな い。エクスビボでＮＧＦ変異体を生産するように形質転換された患者自身の細胞 は、任意に上記カプセル化することなく患者内に直接移植することができる。生 きた細胞の膜カプセル化のための方法体系は当業者に周知であり、カプセル化細 胞の調製及び患者内への移植は、本分野で周知なように容易に成し遂げることが できる。好ましくは、分泌ＮＧＦ変異体は、患者がヒトである場合ヒト成熟ＮＧ Ｆ骨格変異体である。移植物は好ましくは非免疫原性であり、及び／または免疫 原性移植化細胞が免疫系によって認識されることを妨げる。ＣＮＳ輸送のために 、好ましい移植の部位は、脊髄の大脳脊髄液である。 本発明の製薬組成物には、患者への投与に適した形態のＮＧＦ変異体ニューロ トロフィンが含まれる。好ましい実施態様として、製薬組成物は水溶性形態であ り、担体、賦形剤、安定剤、緩衝液、塩類、抗酸化剤、親水性ポリマー、アミノ 酸、炭化水素、イオン性または非イオン性界面活性剤、及びポリエチレンまたは プロピレングリコールのような生理学的に許容可能な物質を含む。ＮＧＦ変異体 ニューロトロフィンは移植のための一定時間放出形態で存在し、または本分野で 周知の方法を使用してマイクロカプセル内にカプセル化される。 ＮＧＦ変異体は好ましくは、これらの組成物の安定性を著しく増大するために 、ｐＨ５からｐＨ６までの生理学的に許容可能な酢酸緩衝液内に調剤化される。 酢酸濃度は、０．１から２００ｍＭ、さらに好ましくは１から５０ｍＭ、またさ ら に好ましくは５から３０ｍＭ、そして最も好ましくは１０から２０ｍＭの範囲で あり得る。一つの好ましい実施態様は２０ｍＭの酢酸を有し、もう一つは溶液内 に１０ｍＭの酢酸を有する。安定性を増大させ容量を緩衝するための好ましい酢 酸塩は、酢酸ナトリウムである。ここでの組成物の調製のための適切なｐＨの範 囲は５から６，好ましくは５．４から５．９，より好ましくは５．５から５．８ である。好ましいｐＨは５．５であり、それは安定性を増大し容量を緩衝する。 もう一つの好ましい実施態様は、ｐＨ５．８である。 任意に、しかし好ましくは、製剤は製薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化 ナトリウムを好ましくはほぼ生理学的な濃度で含む。低濃度、例えば０．３Ｍか ら０．５Ｍより低い、好ましくは０．１６から０．２０ＭのＮａＣｌ、より好ま しくは０．１３から０．１５Ｍが好ましい。好ましい実施態様として、塩化ナト リウム濃度は１３６ｍＭである。もう一つの好ましい実施態様として、該濃度は １４２ｍＭである。 任意に本発明の製剤は、製薬学的に許容可能な防腐剤を含むことができる。あ る実施態様として、防腐剤の濃度は０．１から２０％、典型的にはｖ／ｖの範囲 である。適切な防腐剤には、製薬学の分野で周知のものが含まれる。ベンジルア ルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベ ンが、好ましい防腐剤である。ベンジルアルコールは増大したＮＧＦ安定性を導 く特に好ましい防腐剤である。特に好ましいベンジルアルコール濃度は、０．７ から１．２％、より好ましくは０．８から１．０％であり、特に好ましい濃度は ０．９％である。 任意に本発明の製剤は、製薬学的に許容可能な界面活性剤を含むことができる 。好ましい界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。好ましい界面活性剤には 、Ｔｗｅｅｎ２０及びプルロン酸（Ｆ６８）が含まれる。Ｆ６８は、ＮＧＦ変異 体安定性を増大するために特に好ましい。適切な界面活性剤濃度は、０．００５ から０．０２％である。界面活性剤のための好ましい濃度は０．０１％である。 界面活性剤は、特定の形態を最小化するために使用される。 特に好ましい実施態様として、該組成物は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦ 変異体、２０ｍＭ、ｐＨ５．５の濃度の酢酸ナトリウム、１３６ｍＭの濃度の塩 化ナトリウム、及び０．９％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含む。も う一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体濃度は２．０ｍｇ／ｍｌ、酢酸ナトリウ ム濃度は１０ｍＭ、ｐＨ５．５，及び塩化ナトリウム濃度は１４２ｍＭである。 本発明のもう一つの実施態様として、製薬学的な有効量のＮＧＦ変異体及び製 薬学的に許容可能な酢酸含有緩衝液を含む、本発明の製薬組成物を含むバイアル または容器を含む、ＮＧＦ変異体投与のためのキットが提供される。好ましいバ イアル容量は、サンプルの繰り返される使用中止が可能である、複数投与量の使 用のために適したものである。本発明の製剤に関して達成される増大した安定性 のため、複数投与量液体製剤が可能である。典型的に複数投与量のバイアルは、 一月間、好ましくは一週間一人の患者に対して十分な投与量を提供するような十 分な製剤を提供するであろう。例えば組成物の容量は一般的に、投与濃度、頻度 及び使用の容易性に依存して、０．３から１０．０ｍｌ、より好ましくは１．６ から２．０ｍｌの範囲である。例えば１．８ｍｌの容量は、０．３μｇ／ｋｇま たは０．１μｇ／ｋｇのそれぞれが使用される場合、それぞれ７または２４の投 与が可能であり簡便である。ベンジルアルコールのような光感作性構成成分が存 在する場合、バイアルは強烈な光から保護される。一般的に、暗い冷蔵庫または 不透明な箱内にバイアルを貯蔵することで十分である。しかしながらバイアルの 壁は、光透過減少物質を含むことができる。例えば、半透明コハクまたは茶色バ イアル若しくは半透明バイアルを使用することができる。好ましい実施態様とし て、バイアルは複数投与量製剤を含む。バイアルの形態については、選択された 複数投与量液体製剤が、１．８ｍＬの満たされた容量を有する３ｃｃタイプＩガ ラスバイアルに満たすことができる。栓の選択は、選択された製剤と様々なタイ プの栓の適合性に基づくであろう。 本発明の組成物は、典型的には２から８℃で貯蔵される。該製剤は、ここに示 されるような数多くの凍結解凍サイクルに対して安定である。 もう一つの実施態様として、製剤は上記酢酸濃度で調製される。 製剤の調製のための好ましい手段は、最終処方緩衝液内に大量のＮＧＦ変異体溶 液を溶解することである。最終ＮＧＦ変異体濃度は、ＮＧＦ変異体の非存在の処 方緩衝液を使用して、製剤を適切に調節することによって成し遂げられる。 凍結乾燥形態を含むここでの組成物は、本質的に周知である一般的に利用可能 な製薬学的混合法を使用して構成成分を混合することによって一般的に調製され る。同様に、標準的な凍結乾燥法及び本分野で周知の装置が使用される。ここで のＮＧＦ変異体製薬組成物を調製するための特定の方法は、ゲル濾過または透析 のようないくつかの周知の緩衝液交換法のいずれか一つにおいて、（いずれかの 標準的なタンパク質精製スキームに従って）精製されたＮＧＦ変異体、好ましく はｒｈＮＧＦ変異体を利用することを含む。 ここで議論されるＮＧＦ変異体コード遺伝子構築物は、トランスフェクション 、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＥＡＥデキストラン法、及び 細胞銃を制限することなく含む、本分野で周知のいずれかの方法を使用して、標 的細胞内に挿入することができる。構築物及び加工された標的細胞を、ＮＧＦ変 異体発現標的細胞が議論されている方法を使用して選択される、導入遺伝子とし て上記記載の構築物を有するトランスジェニック動物の生産のために使用するこ とができる。代わりに、ＮＧＦ変異体を、ＮＧＦ変異体コード核酸を使用した遺 伝子治療によって輸送することができる。適切な細胞における組換えＮＧＦ変異 体の選択的な発現が、組織特異的または誘導可能プロモーターによって、または 本分野で周知の特定のアデノウイルスのような、組換えＮＧＦ変異体遺伝子を運 ぶ複製欠損ウイルスを使用した局在化した感染を生ずることによって、制御され たＮＧＦ変異体遺伝子を使用して達成することができる。 遺伝子治療応用において、遺伝子は、例えば欠損遺伝子の置換のために、治療 上有効な遺伝子産物のインビボでの合成を達成するように細胞内に導入される。 用語、「遺伝子治療」は、継続した効果が単一の治療によって達成される伝統的 な遺伝子治療、及び治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの一度または繰り返しの 投与を含む遺伝子治療薬剤の投与の両者を含む。生存細胞内に核酸を導入するた めに利用可能な様々な方法が存在する。該方法は、インビトロで培養細胞内に、 または企図された宿主の細胞にインビボで核酸を導入するかどうかに依存して変 化する。インビトロで哺乳動物細胞内に核酸を導入するために適した方法は、リ ポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融 合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法等が含まれる。現在好ま しい インビボでの遺伝子導入法には、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクタ ーを使用したトランスフェクション、及びウイルスコートタンパク質−リポソー ム介在トランスフェクションが含まれる(Dzau等,Trends in Biotechnology,11:2 05-210(1993))が、裸のＤＮＡも有効である。ある場合には、細胞表面膜タンパ ク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド 等のような、標的細胞を標的化する試薬を使用して核酸源を提供することが望ま しい。リポソームを利用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タ ンパク質に結合するタンパク質、例えば特定の細胞タイプに反応性のカプシドタ ンパク質またはその断片、サイクリングにおいて中和を受けるタンパク質に対す る抗体、及び細胞内局在を標的化し細胞半減期を増大するタンパク質を、標的化 するため及び／または取り込みを容易にするために使用する。レセプター介在エ ンドサイトーシスの方法は、例えばWu等,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)； 及びWargner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3410-3414(1990)に記載されている 。遺伝子操作及び遺伝子治療プロトコールの文献としては、Anderson等,Science ,256:808-813(1992)参照。 ＮＧＦの生物学的有用性は、ＮＴ−３のものより優れている。従って、本発明 はＮＴ−３の活性及びＮＧＦの優れた生物学的有用性を有するニューロトロフィ ン分子を提供する。さらに、本発明は、以前の因子と比較して予測できない優れ た全ニューロトロフィン活性を有するニューロトロフィン分子を提供し、それ故 個々のニューロトロフィンの混合物と関連したいずれかの問題を除去するさらな る利点を有する。 以下の実施例は、上記記載の発明を使用する方法をより十分に記載するように 機能し、同様に本発明の様々な面を実施することを企図した最適な方法を示す。 いずれの場合にもこれらの実施例は、本発明の真の範囲を制限するために機能す るものではなく、むしろ説明の目的で提供される。本明細書中の全ての引用文献 の開示は、完全にここで明白に取り込まれる。 実施例 実施例Ｉ ｔｒｋＣに結合するＮＧＦ変異体のデザインと合成 ＮＧＦ変異体のデザイン：ヒトＮＴ−３の完全なミューテーション分析により、 そのレセプターｔｒｋＣに対するＮＴ−３の結合エピトープの詳細な調査が導か れた(１０１)。結合部位は、単一の残基、Ｒ１０３によって支配されている(図 ３Ａ)。Ｒ１０３の構造的近傍の分析により、ＮＴ−３／ｔｒｋＣ相互作用に対 するさらなる重要な残基が明らかにされた：ベータ鎖Ｃ中のＫ８１およびＱ８４ ，ベータ鎖Ａ及びＡ’を連結するループ中のＴ２３、及びより小さな効果を有す るものとしてベータ鎖Ｂ中の二つの保存的な残基Ｅ５５及びＲ５７である(図２ ，３Ａ)。マウスＮＧＦにおいては、ＮＴ−３Ｋ８１及びＱ８４の対応する残基 であるＴ８１及びＨ８４（図２，３Ｂ）が、ｔｒｋＡに対するＮＧＦ結合に関与 することが示されており(５５)、それ故それらは特異性に関与していると考えら れる。ヒトＮＧＦにおいては、Ｖ１８，Ｇ２３，Ｔ８１及びＨ８４が、ｔｒｋＡ 結合に関与していることが示されている。他の非保存的なＮＴ−３残基、Ｔ２３ は、種を通じてニューロトロフィンの各種類の中で保存された領域に位置してい るが、ＮＴ−３，ＢＤＮＦ及びＮＧＦの間で多様化している。Ｔ２３の近傍及び 該分子の同じ面に位置しているのがＥ１８及びＬ２０である(図３Ａ)。それらは ｔｒｋＣへの結合に直接は関与していないが、ＮＧＦ（Ｖ１８及びＶ２０）(図 ３Ｂ)及びＢＤＮＦ（１１８及びＥ２０）におけるそれらの構造的に大変異なっ た相補体が、ｔｒｋＣへの結合を妨げている。これは、ＮＧＦ残基Ｖ１８，Ｖ２ ０，Ｇ２３，Ｔ８１及びＨ８４並びにＮＴ−３におけるそれらのそれぞれの相補 体が、ｔｒｋＣに対する特異性を決定することに関与していることを示唆した( １０１)。それ故、これらの位置でＮＴ−３アミノ酸を有するＮＧＦの変異体が 構築され、ｔｒｋＣ結合の補充に対して分析された。 ＮＧＦ変異体の合成：ＮＧＦ及びＮＴ−３は以前にクローン化され、シークエン スされ、大腸菌における二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの生産、同様にサイトメガロウ イルスプロモーターの制御の下での哺乳動物系におけるニューロトロフィンの発 現を可能にするベクター内にサブクローン化された(８３)。このベクター上での 突然変異誘発を、Kunkelの方法にしたがって実施した(６６)。大腸菌株ＸＬ１− Ｂｌｅｕ(Stratagene,San Diego,CA)内への形質転換の後、コロニーを、Sequena s eバージョン2.0kit(U.S.Biochemical Corp.,Cleveland,OH)を使用して二本鎖Ｄ ＮＡをシークエンスすることによって所望の突然変異の存在についてスクリーニ ングした。成熟ＮＧＦ及びＮＧＦ変異体をコードする完全なＤＮＡ配列を、全て の陽性クローンについて確認した。二本鎖ＤＮＡを、QIAGEN DNA精製キット(Qia gen Inc.,Chatsworth CA)を使用してＸＬ−１ Ｂｌｅｕから単離した。 野生型及び変異体ニューロトロフィンの発現：ＮＧＦまたは変異体コード配列の それぞれを含有するプラスミドＤＮＡを、リン酸カルシウム沈降によってヒト胎 児腎細胞系２９３内に導入した(７０)。７５％の融合細胞を、１５ｍｍ細胞培養 皿当たり１０μｇのプラスミドＤＮＡ及び１μｇのＡｄＶＡプラスミドを使用し て共トランスフェクトし、血清含有培地で１５時間インキュベートした。次いで 培地を除去し、１０ｍｇ／Ｌの組換えウシインスリン、１ｍｇ／Ｌのトランスフ ェリン及び微量元素を補った血清非含有培地（ＰＳＯ４）と交換した。４８及び ９６時間後に上清を回収し、Centriprep-10濾過ユニット(Amicon,Berverly,MA) を使用しておよそ２０倍に濃縮し、滅菌濾過した。 ニューロトロフィン変異体の定量：特異的ＮＧＦ ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検 定法）は、ハムスター由来のプロテインＡ精製抗血清(Genentech,Inc.)に基づき 、引き続き標準的なＥＬＩＳＡ法を実施した。ポリクローナル血清を、抗体に対 する変異体の様々な交差反応性に対する能力を減少するために使用した。標準曲 線を、精製組換えＮＧＦを使用して測定した。 濃縮後のＮＧＦ変異体の量は、０．３μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌの間で変 化した。ＥＬＩＳＡアッセイは、偽のトランスフェクト細胞由来の上清において はいずれのＮＧＦも検出しなかった。ＮＧＦ変異体の各発現セットについて、野 生型ＮＧＦ発現を実施し、レセプター結合研究に対する比較野生型濃度を得るた めに並行してＥＬＩＳＡによって定量した。全ての変異体を発現し、定量し、少 なくとも二度アッセイした。 実施例ＩＩ ＮＧＦの中央のベータ鎖束での突然変異は、ｔｒｋＣに結合する変異体を導く 変異体ＮＧＦ１及びＮＧＦ２は、それぞれＴ８１Ｋ及びＧ２３Ｔ／Ｖ１８Ｅ／ Ｖ２０Ｌのミューテーションを有する。５個の点突然変異を変異体ＮＧＦ１２で 組み合わせた。これらの３個の変異体、同様にＮＧＦ及びＮＴ−３を発現させ、 ｔｒｋＣ細胞外ドメインに結合する能力についてアッセイした。 レセプターイムノアドヘシンタンパク質を、免疫グロブリン定常ドメインに融 合したヒトｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ細胞外ドメインを使用して構築した(８８)。結 合アッセイを、９６穴プレートフォーマットを使用して記載されたように（８８ ）実施した。各ウェル内の標識されたニューロトロフィンの最終濃度は、ｔｒｋ Ａ及びｔｒｋＣ結合アッセイのためにおよそ３０ｐＭであった。精製組換えヒト ＮＴ−３，ＢＤＮＦ及びＮＧＦ(Genentech)を記載されたようにヨウ素化した(１ ０１)。通常２０μｇのニューロトロフィンを、２０００−３０００Ｃｉ／ｍｍ ｏｌの範囲の特異的な活性にヨウ素化した。標識された物質を４℃に貯蔵し、調 製の２週間以内に使用した。変異体を、複数の発現物のそれぞれに対し少なくと も２回ｔｒｋＡ及びｔｒｋＣレセプターに対する結合親和性のためアッセイした 。本方法は、それぞれの変異体に対する親和性測定における誤差の見積もりが可 能であった。全てのデータを、Kaleidagraphソフトウェアーパッケージを使用し て一連のデータに対して４パラメータ適合法を適用することによって分析した。 表３における結合結果は、ＩＣ５０ｍｕｔ／ＩＣ５０ｗｔ比として表されている 。ＩＣ５０は、天然のニューロトロフィンの結合の５０％阻害を導く変異体の濃 度である。 競合的置換結合アッセイにおいて、ＮＴ−３野生型は、ｔｒｋＣに対して２１ ．０±４．９ｐＭの親和性を示す一方、ＮＧＦは、ＮＴ−３に比較して３５８７ 倍まで減少した親和性を有してこのレセプターに結合した(表３)。変異体ＮＧＦ １及びＮＧＦ２は、それぞれＮＴ−３より１０３６倍及び２９１倍低い親和性を 有してｔｒｋＣに結合した(表３)；これはＮＧＦと比較した場合、それぞれ３． ５倍及び１２倍のｔｒｋＣに対する親和性の増大を表す。ＮＧＦ１及びＮＧＦ２ における突然変異を変異体ＮＧＦ１２で組み合わせた場合、ｔｒｋＣに対する親 和性は共同的な方法で実質的に増大した。この変異体は、ＮＴ−３と比較した場 合１４．７倍のみの減少した親和性でｔｒｋＣに結合し、ＮＧＦと比較した場合 ２４４倍の増大した親和性を表す(表３)。 表３：ｔｒｋＣ及びｔｒｋＡに対するＮＧＦ変異体の相対的親和性 実施例ＩＩＩ 中央のベータ鎖束中の突然変異を有するＮＧＦ変異体は ｔｒｋＡ結合を維持する 全てのＮＧＦ変異体、ＮＧＦ及びＮＴ−３を、ｔｒｋＡ結合についてアッセイ した。ＮＧＦは３３．９±７．５ｐＭの親和性を示す一方、ＮＴ−３はＮＧＦと 比較して１３７倍減少した親和性を有して結合した(表３)。親和性のこの減少は 、初期の結果と一致する(１０１)。変異体ＮＧＦ１，ＮＧＦ２及びＮＧＦ１２は 、それぞれ０．７倍、２．１倍及び１．５倍減少した親和性を有してｔｒｋＡに 結合する(表３)。これは、ＮＧＦ２における変化が、ｔｒｋＡに対するわずかに 減少した親和性を導く一方、ＮＧＦ１における変化が、親和性の小さな増大を導 くことを示す。ＮＧＦ１及びＮＧＦ２をＮＧＦ１２として組み合わせた場合、ｔ ｒｋＡに対するＮＧＦ１２の親和性は累積的である；ｔｒｋＣに対するＮＧＦ１ ２の親和性と対照的に、ＮＧＦ１及びＮＧＦ２と比較した場合共同的であった( 表３)。 実施例ＩＶ ｔｒｋＣ特異性に対する個々の残基の重要性 ＮＧＦ１２において変化した個々の残基の特異性に対する重要性を測定するた めに、これらの残基のそれぞれをＮＧＦ配列に戻すように変化した。変異体ＮＧ ＦＲ１，ＮＧＦＲ２，ＮＧＦＲ３，ＮＧＦＲ４及びＮＧＦＲ５（表３）は、それ ぞれＧ２３，Ｖ１８，Ｖ２０，Ｔ８１及びＨ８４の特異性に対する寄与を試験し た。変異体ＮＧＦＲ１は、ｔｒｋＣとの相互作用の能力のほとんどを喪失し、Ｎ ＧＦＲ３及びＮＧＦＲ５は、わずかに減少した親和性を有する一方、ＮＧＦＲ２ 及びＮＧＦＲ４は、ＮＧＦ１２と同様のｔｒｋＣに対する親和性を有した(表３) 。これらのデータは、ｔｒｋＣ結合に対する最も重要な特異性決定因子が、Ｔ２ ３／Ｇ２３，Ｑ８４／Ｈ８４及びＬ２０／Ｖ２０（ＮＴ３／ＮＧＦ）であること を示唆した。 実施例Ｖ ｔｒｋＣに対する増大した親和性を有するＮＧＦ１２変異体 ヒトＮＴ−３のモデル（１０１）及びマウスＮＧＦのＸ線構造（５９）の比較 により、二つの分子の間の差異である主要な特異性決定因子に近いいくつかの残 基が明らかにされた。さらにｔｒｋＣに対するＮＧＦ１２の親和性を増大するた めに、これらの残基のいくつかを類似するＮＴ−３アミノ酸に変化した。ＮＧＦ １２に対してＦ５４Ｙ／Ｋ５７Ｒの変化を加えることは、ｔｒｋＣ結合を改良し なかった(ＮＧＦ１２５，表３)。対照的に、Ｙ７９Ｑ／Ｆ８６Ｙを加えることは 、ＮＧＦ１２と比較して２倍の結合を増大した(ＮＧＦ１２４，表３)。ＮＧＦ１ ２を背景にこれらの二つの残基を個々に変化することにより、Ｆ８６Ｙ変化が有 益な変化を示す一方で、Ｙ７９Ｑ変化は有害な変化であることが示された(ＮＧ Ｆ１２６及びＮＧＦ１２７，表３)。最後に、Ｔ２９Ｉの変化を評価した。ＮＧ Ｆ１２の背景においては、Ｔ２９Ｉは結合においてわずかな減少を与えた（ＮＧ Ｆ１１２３に対してＮＧＦ１２を比較する、表３）が、ＮＧＦ１２４及びＮＧＦ １２６の背景においては、それはわずかに結合を改良した(ＮＧＦ１２３４に対 してＮＧＦ１２４変異体を、及びＮＧＦ１３１に対してＮＧＦ１３０を比較する 、表３)。これは１０３残基を２９及び８６残基の間に配置したため、５９，８ ６及び１０３位で側鎖の相互作用が生じたためであろう(図３)。代わりに、２９ 及び８６位の側鎖は、ｔｒｋＣ中の同じアミノ酸と相互作用し、それによってｔ ｒｋＣアミノ酸を介して互いに影響するであろう。 これらのデータに基づいて、二つのさらなる変異体をデザインした。変異体Ｎ ＧＦ１３１は、Ｖ２０Ｌ、Ｇ２３Ｔ、Ｖ１８Ｅ、Ｔ２９Ｉ、Ｈ８４Ｑ及びＦ８６ Ｙの５個の変化を含み、ＮＴ−３に比較して３．３倍だけ減少した親和性を有し てｔｒｋＣに結合した。これらの変化は、ｔｒｋＡ結合に影響しなかった(表３ ）。ＮＧＦ１２６及びＮＧＦ１３１は、ｔｒｋＣ及びｔｒｋＡに等しく十分に結 合する。両変異体は、共通にＶ２０Ｌ、Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ及びＦ８６Ｙの突然 変異を有する；ＮＧＦ１２６は、さらにＶ１８Ｅ及びＴ８１Ｋの突然変異を有す る一方で、ＮＧＦ１３１は、さらにＴ２９Ｉの突然変異を有する。これは、ＮＧ ＦにおけるＶ２０Ｌ、Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ及びＦ８６Ｙの変化が、ｔｒｋＣ結合 の補充に必要とされる最小のものであることを示唆する。実際、これらの４つの 突然変異を有するＮＧＦ１３０は、ＮＧＦ１２６及びＮＧＦ１３１と同様にｔｒ ｋＣに結合した(表３)。 実施例ＶＩ ＮＧＦ変異体はｔｒｋＣレセプター自己リン酸化を誘導する ＰＣ１２細胞系でｔｒｋレセプター自己リン酸化を刺激するＮＧＦ変異体の能 力を測定した。およそ１×１０7ＰＣ１２細胞（２６）を、１００ｎｇ／ｍｌの ニューロトロフィンを使用して３７℃で５分処理した。ＮＰ−４０プレート溶解 及び抗ｔｒｋＡ特異的ポリクローナル抗血清（Dr.Louis Reichardt,University of California,San Francisco由来）または抗ｔｒｋＣ特異的ポリクローナル抗 血清６５６（１０１）を使用した免疫沈降を、以前に記載されたように実施した (２６)。ホスホチロシン含有量を、以前に記載されたようにモノクローナル抗体 ４Ｇ１０を使用してウエスタンブロットによって分析した(２３；２６)。全ての 自己リン酸化アッセイを、アッセイされた各ニューロトロフィンについて少なく とも二度実施した。 ラットｔｒｋＣを継続的に発現するように操作されたＰＣ１２細胞は、ｔｒｋ Ｃの強力な自己リン酸化の誘導及び軸索伸長の形成によってＮＴ−３に応答する (２６)。精製ＮＧＦ(ＮＧＦ／Ｐ)、同様にＮＧＦ発現２９３細胞の上清（ＮＧＦ ／Ｕ）は、ｔｒｋＡ自己リン酸化に対する強力なシグナルを導く（図４）が、ｔ ｒｋＣの自己リン酸化を誘導しなかった(図５Ａ)。精製ＮＴ−３（ＮＴ−３／Ｐ ）及びＮＴ−３発現２９３細胞の上清（ＮＴ−３／Ｕ）は、ｔｒｋＣの自己リン 酸化を誘導する（図５Ａ）が、ｔｒｋＡは誘導しなかった(図４Ａ)。ｔｒｋＣに 対するＮＧＦ１２の親和性から予測されるように、この変異体は、ｔｒｋＣ自己 リン酸化に対する強力なシグナルを導く（図５Ａ）が、ｔｒｋＡの自己リン酸化 を引き出す能力を維持していた(図４Ａ)。変異体ＮＧＦ１及びＮＧＦ２のｔｒｋ Ｃに対するかなり低い親和性は、ｔｒｋＣ自己リン酸化における弱いシグナルに 反映される(図５Ａ)。しかしながら、両変異体は未だ、ＮＧＦと比較した場合、 わずかに減少した活性のみを有してｔｒｋＡレセプターの自己リン酸化を誘導し た(図４Ａ)。 変異体ＮＧＦＲ１及びＮＧＦＲ５を、ＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞の自己リン酸化 の誘導に対してアッセイし、ＮＧＦＲ１は大変弱いシグナルを導く一方で、ＮＧ ＦＲ５の応答はＮＧＦ１２とＮＧＦＲ１の間のものであった(図５Ｂ)。これらの 結果は、ｔｒｋＣに対する変異体の測定された親和性と相関した。ｔｒｋＣに対 する親和性をさらに増大するＮＧＦの変異体（ＮＧＦ１２３，ＮＧＦ１２４，Ｎ ＧＦ１２５及びＮＧＦ１２３４）は、ＮＴ−３によって引き出されるものと同様 であるｔｒｋＣ自己リン酸化に対するシグナルを導いた(図５Ｂ)。ｔｒｋＣに対 して最も結合する３つの変異体−−ＮＧＦ１２６，ＮＧＦ１３０及びＮＧＦ１３ １−−もまた、ｔｒｋＣ(図５Ｃ)、同様にｔｒｋＡ（図４Ｂ）の自己リン酸化の ための強力なシグナルを引き出した。これらの結果は、ｔｒｋＣに対する増大し た親和性を有するＮＧＦ変異体は、モデルのニューロン様の細胞系に対してもこ のレセプターと相互作用することができることを示す。さらに、これらの細胞は 、ｔｒｋＡもまた発現すること、及び両レセプター（ｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ）は 多機能性リガンドと競合することに注意することは重要である。ＮＧＦ変異体が ｔｒｋＡ／ｔｒｋＣヘテロダイマーの形成を導くことができる一方で、これは二 つのレセプターのトランスリン酸化を導かない(９０)。 実施例ＶＩＩ ＮＧＦ変異体はｔｒｋＣ細胞シグナリングを誘導する ｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞の分化を刺激するＮＧＦ変異体の能力を測定 した。これは、ｔｒｋＣ細胞シグナリングを誘導する変異体の能力を示す。ｔｒ ｋＣを発現するおよそ１０3ＰＣ１２細胞（２６；１００）を、全部で２ｍｌの 培地を含む３５ｍｍコラーゲンコート組織培養皿上にまいた。ＰＣ１２／ｔｒｋ Ｃ細胞を、２５０ｐｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲のニューロトロフィン 濃度でアッセイした。軸索所有細胞の集団を、３日後に細胞体の長さを少なくと も二度測定することを含む細胞の数をカウントすることによって測定した。全て の軸索伸長アッセイを少なくとも二度実施した。 ＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞の軸索成長の誘導からの結果は、結合及び自己リン酸 化アッセイと一致する(表４)。ＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞がｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ の両者を所有する一方で、ＮＴ−３は、ニューロトロフィンの適用後の最初の３ 日間で軸索の顕著な誘導を導くが、ＮＧＦは導かないことが以前に示されている ；しかしながら１０日目でＮＧＦ及びＮＴ−３は、同様な軸索成長を誘導する( １００)。そこでＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞を、３日後の軸索について評価した。 ｔｒｋＣに対する減少した結合を示す変異体もまた減少した応答を示した。ＮＧ Ｆ１２は、天然のＮＴ−３と比較してより高い値にシフトする投与量−応答性を 示し、最も少ない結合を有する変異体（ＮＧＦ１，ＮＧＦ２，ＮＧＦＲ１及びＮ ＧＦＲ５）は、試験された最も高い投与量の場合さえ最大の応答性に到達しなか った(表４)。ＮＧＦ１２６は、天然のＮＴ−３と同様の軸索誘導の能力を有し、 変異体ＮＧＦ１２６，ＮＧＦ１３０及びＮＧＦ１３１を通じてｔｒｋＣ結合は同 量である（表３）が、ＮＧＦ１２６は、軸索を誘導する点でより有効であり、Ｎ ＧＦ１３０及びＮＧＦ１３１の１０ｎｇ／ｍｌと比較して１ｎｇ／ｍｌで最大の 応答に到達した(表４)。特に、これらのＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＡがその結合に ついてｔｒｋＣと競合する環境においてｔｒｋＣを通じて軸索を誘導することが できた。１０日目、ＮＧＦ１２，ＮＧＦ１及びＮＧＦ２変異体は、ｔｒｋＡに対 するこれらの変異体の結合から予期されるように、軸索を誘導する点でＮＧＦ（ データは示されていない）と同様に機能した(表３)。 表４：ラットｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞における軸索成長の誘導 議論 ニューロトロフィンは、ｔｒｋレセプターチロシンキナーゼとの相互作用によ って細胞内へシグナルを伝達する(９５)。ニューロトロフィン及びｔｒｋの両者 は、高い相同性を有するタンパク質ファミリーを形成する。各ファミリーの中で 、異なるメンバーが同様な構造を有しているようであるが、二つのファミリーの 個々のメンバーは、大変特異的な方法で互いに相互作用する。ニューロトロフィ ンのこの本質的な特異性は、その生物学的な機能にとって必要であり、それ故特 異性決定因子の機構の情報は、ニューロトロフィーファミリーの機能及び進化の 理解に寄与する。 ヒトＮＴ−３の分子モデリング及びアラニンスキャン突然変異誘発(１０１)、 並びにヒトｔｒｋのドメイン欠失／置換（１０２）は、このリガンド／レセプタ ー系の結合エピトープを決定した。以前の研究により、レセプターｔｒｋＣに対 するＮＴ−３の結合部位が、Ｒ１０３残基及びさらなる近傍の決定因子によって 支配されていることが明らかにされた。結合部位は中央のβ鎖束の周りに広がり 、ｔｒｋＡに対するＮＧＦ結合部位とは対照的に、ループ由来の残基及びＮ末端 の最初の６個の残基を含まない(図３)。結合部位の一部を構成する非保存的残基 には、Ｔ２３，Ｋ８１及びＱ８４が含まれる。Ｌ１８及びＥ２０と共に残基Ｔ２ ３は、ニューロトロフィンファミリーのメンバーのそれぞれ内で全ての種を通じ て保存されている領域に位置するが、ＮＴ−３，ＮＧＦ及びＢＤＮＦの間では多 様化している。それ故、これらの５個の残基は、ｔｒｋＣ結合に対するＮＴ−３ における特異性決定因子の考え得る候補であると思われる。ｔｒｋＣに結合する ための重要性を試験するために、ＮＧＦ中の残基（Ｖ１８，Ｖ２０，Ｇ２３，Ｔ ８１及びＨ８４）を、相当するＮＴ−３アミノ酸（Ｅ１８，Ｌ２０，Ｔ２３，Ｋ ８１及びＱ８４）に変化し、生じたタンパク質ＮＧＦ１２を、ｔｒｋＣ結合の補 充 及びｔｒｋＣ介在生物学的活性について分析した。ＮＧＦ１２はｔｒｋＣに結合 し、ＰＣ１２細胞上で発現されたｔｒｋＣの自己リン酸化を誘導するが、ｔｒｋ Ａに対する親和性を喪失していなかった(表３，図４，５)。 ここで示されるように、グリシン２３からトレオニンへの変化は、ＮＧＦ１２ における補充効果を示す。各突然変異残基が個々に元のＮＧＦアミノ酸に戻って 変化したＮＧＦ１２のさらなる変異体（すなわちＥ１８Ｖ、Ｌ２０Ｖ、Ｔ２３Ｇ 、Ｋ８１Ｔ、Ｑ８４Ｈ）は、ＮＴ−３においてｔｒｋＣ特異性に対する最も重要 な決定因子がＴ２３であり、次いでＱ８４及びＬ２０であることを示した。いず れか一つの理論に制限されるものではないが、ＮＧＦにおけるグリシンからトレ オニンへの変化は、ｔｒｋへの結合に必須である側鎖を導入する；代わりにＧ２ ３Ｔの変化は、骨格構造の変化に影響し、それによってその近傍で側鎖の構造に 影響する。８４位では、ヒスチジンからグルタミンへの変化が、ｔｒｋＣに対し て反発する潜在的な電荷残基を除去し、グルタミン側鎖が特異的な水素結合に必 要である。最後に、２０位でのバリンよりロイシンを好むことは、結合部位での 疎水性相互作用のかなり厳格な空間的必要性のためであろう。 Ｔ２３，Ｑ８４及びＬ２０に加えて、８６位のアミノ酸は、ｔｒｋＣに対する ニューロトロフィン特異性に重要である。ＮＧＦ１２にＮＴ−３残基を加えるこ とは、ｔｒｋＣに対する結合に４．５倍の改良で影響する一方、ｔｒｋＡに対す る結合を維持する(変異体ＮＧＦ１２６，表３)。残基８６は、ｔｒｋＣに対する 結合のための最も重要な決定因子であるＲ１０３（図３）に近く、さらにｔｒｋ Ｃ認識のための構造的領域の支配性を確認する。ＮＧＦにおいては、８６位はフ ェニルアラニンであり、ＮＴ−３においてはそれはチロシンであることは、いず れかの一つの理論に制限されるものではないが、側鎖ヒドロキシル基がｔｒｋＣ 認識に必要とされる特異的水素結合に関与していることを示唆する。 最後に、１８及び２９位の残基は、ｔｒｋＣに対するＮＴ−３の特異性を微調 整する。２９位での影響は、８６位のアミノ酸の特性に依存しているようである 。Ｔ２９Ｉの変化がＮＧＦ１２（それはＦ８６を有する）内に導入された場合、 ｔｒｋＣ結合はわずかに減少し、一方でＴ２９Ｉが二つの他の変異体（それらは Ｙ８６を有する）に導入された場合、結合はわずかに改良される(ＮＧＦ１２３ ４ に対してＮＧＦ１２４を、ＮＧＦ１３１に対してＮＧＦ１３０を比較した場合、 表３)。８６残基と同様に、２９残基は重要なＲ１０３の近傍に存在する(図３) 。１８位では、Ｖ１８Ｅの突然変異が、ｔｒｋＣ結合にわずかにのみ寄与する( すなわちＮＧＦ１２及びＮＧＦＲ２，表３)。しかしながら、ＮＧＦ１２６及び ＮＧＦ１３０による軸索成長の誘導の比較により、Ｖ１８Ｅの突然変異を含むこ とが軸索成長の誘導を改良することが示された；Ｖ１８Ｅを含むＮＧＦ１２６は 、天然のＮＴ−３と同様の軸索成長を導く（すなわち、１ｎｇ／ｍｌで最大の応 答に到達する）一方で、ＮＧＦ１３０は、最大の応答を引き出すために１０倍の ニューロトロフィンを必要とした（１０ｎｇ／ｍｌ）(表４)。 要約すると、ここに提示された結果は、ヒトＮＧＦにヒトＮＴ−３由来の中央 のβ鎖束の特異的な一連の残基を接合することは、非同種レセプター（ｔｒｋＣ ）に対する結合を補充することができる一方で、同種レセプター（ｔｒｋＡ）に 対する親和性を維持することを示す。ｔｒｋＣに対するＮＴ−３上の主要な特異 性決定因子には、Ｌ２０，Ｔ２３，Ｑ８４及びＹ８６が含まれる。残基Ｅ１８及 び１２９は、特異性において小さな役割を演じるであろう。６個の残基は二つの クラスターを形成する：Ｑ８４及びＹ８６は、ｔｒｋＣ結合に関与する最も重要 な残基であるＲ１０３の近傍に位置し、Ｅ１８及びＴ２３は共に位置するが、Ｒ １０３クラスターからは離れている(図３)。これらは、いずれかの一つの理論に 制限されるものではないが、ｔｒｋＣが、様々なニューロトロフィンの間を識別 するために、少なくとも二つの独特な空間的に離れた部位を使用することを示唆 する。 ネズミ及びヒトニューロトロフィンの初期の突然変異分析により、ＮＧＦのＮ 末端の最初の５個の残基が、ｔｒｋＡに対する特異的な結合に対して重要である ことが提案された(５５；１０１；９８)。ＮＧＦ由来のＮ末端を有するＮＧＦ変 異体を構築し、生じた分子ＭＮＴＳ−１及びＰＮＴ−１は実際にＮＧＦと同様な ｔｒｋＡに対する親和性を獲得した(１０１；５５)。ＭＮＴＳ−１がｔｒｋＣに 対する親和性を失わないという観察は、ＮＴ−３のＮ末端残基が、ｔｒｋＣ認識 に関与しないことを意味し、その結論はＮＴ−３ Ｎ末端の部位特異的突然変異 誘発によって確認された(１０１)。本研究は、ＮＴ−３の機能及び特異性に対す る 中央のβ鎖束に位置する残基の重要性を確立する。ここに示されるように、ＮＴ −３の非保存的なアミノ酸−−Ｔ２３及びＱ８４−−は、ＮＧＦにおいて置換す ることができ、ｔｒｋＣ結合を補充する。さらに、ＮＴ−３における非保存的な アミノ酸−−Ｅ１８，Ｌ２０，１２９及びＹ８６−−もまた、ＮＧＦ変異体／ｔ ｒｋＣ相互作用の特異性に寄与することができるが、Ｔ２３及びＱ８４と比較し て減少した効果を示す。ＮＴ−３相補体を使用してＮＧＦ中のこれらの６個の残 基を置換することは、ｔｒｋＡに対する十分な親和性を維持する。ここで提示さ れる研究に関して、中央のβ鎖束中のＮＴ−３残基は特異性に影響する一方で、 ＮＧＦにおいてはＮ末端残基が特異性に影響すると思われる。 異なる種由来のＮＧＦ中の配列保存に基づいて、初期の研究により、Ｙ７９， Ｔ８１及びＨ８４がｔｒｋＡとＮＧＦの相互作用を介在しているものと提案され た(５５)。本研究において、残基８１はｔｒｋＡまたはｔｒｋＣに対する結合ま たは特異性に影響せず(ＮＧＦ１２及びＮＧＦＲ４参照，表３)、残基８４がｔｒ ｋＣ特異性に対して重要であるがｔｒｋＡ特異性に対しては重要ではない（ＮＧ Ｆ１２及びＮＧＦＲ５参照、表３）ことが決定した。本研究はまた、ＮＧＦ残基 ７９がｔｒｋＡ特異性には関与しない一方で、ｔｒｋＣに対して天然のヒトＮＧ Ｆ変異体（Ｙ７９）は、ヒトＮＴ−３ Ｑ７９と比較してわずかに好ましいこと が解った(ＮＧＦ１２７，表３)。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                               NGF mutant                                Background of the Invention Technical field   The present application describes proteins involved in the growth, regulation or maintenance of neural tissue, particularly neurons. About Parkin. In particular, it has the activity of another neurotrophic factor NT-3 For NGF variants. Has trkC binding activity and trkC signal inducing activity NGF variants are provided. The variant optionally has trkA or trkB binding And has a signal inducing activity. The NGF variants of the present invention may be used to cure neuronal disease. It is useful for medical treatment. Nucleic acid encoding NGF mutant neurotrophin and expression vector Is also provided. Introduction   The survival and maintenance of the differentiated function of vertebrate neurons depends on neurotrophins. Affected by the use of specific proteins referred to. Neurotrophins For the survival and maintenance of neurons during the development and maturation stages of the vertebrate nervous system Form a very homologous family of important growth factors (99 See). Limited production of neurotrophins leads to excessive neuronal death (See (1); (2) for references). Various neurotrophins are central Functional in assisting the survival of distinct neuronal populations in the peripheral and peripheral nervous systems (3), (4); (5), (80).   The family of neurotrophins is NT-3 (6,7,5,8,9). , 10), nerve growth factor (NGF) (11, 12), brain-derived neurotrophic factor (BDN) F) (13, 14) and neurotrophin 4/5 (NT-4 / 5) (15, 16, 17) and neurotrophin-6 (NT-6) (91, 92). Is a family homologous to   Studies have shown that neurotrophins have been tested for Mk, known as trk.r= 140-145, Through ligand-dependent activation of a class of 000 tyrosine kinase-containing receptors Suggest at least partially transduce intracellular signaling (18) (19) (21); (20) (22); (23); (24); (25); (26). New Lotto The binding of rophin is triggered by a later step in the signaling cascade, trk Induces autophosphorylation of the receptor (95). Therefore, neurotrophin The signal signaling pathway has high affinity binding to specific tyrosine kinase receptors And their activation, followed by receptor autophosphorylation (19); (27). Some intersection between neurotrophins and various trks Although there are receptor interactions, the remarkable specificity is that NGF / trkA, BDN F / trkB and NT-3 / trkC, while NT -4/5 appears to interact predominantly with trkB with the same efficiency as BDNF (27); (19) (21); (25); (22); (28); (18); (28a). NG F interacts excessively with trkA (21), while BDNF and NT-4 / 5 binds to trkB (29). trkA and trkB are multiple neurots. It can respond to rofin in vitro under specific circumstances (6); (2) 3). trkC responds excessively to NT-3 (25); (26). NT-3 Preferably transduces through trkC, but with lower affinity trk It also binds to A and trkB (25; 101) (FIG. 1). Hence the perspective of specificity The most stringent member of the trk receptor (trkC) is -The most unrestricted ligand of the rotrophin family (NT-3) Interact.   However, the environment of neurons is not favorable for neurotrophin ligands. Limits trkA and trkB in their ability to respond to In addition to the trk family of receptors, neurotrophin has a p75 low affinity Class of receptors referred to as sex NGF receptors (p75; (30); (31)) Can also bind to the receptor, and the receptor Has mechanisms, but tumor necrosis factor receptor (TNFR), CD40, OX40 And structurally related to the receptor gene family including CD27 (3 (33); (34); (35); (36); (37). High affinity of neurotrophin The role of gp75 in the formation of sexual binding sites and signaling pathways is still unclear. (Refer to (38); (39) for references).   A survey of the primary amino acid sequence of neurotrophins revealed members of the family Seven regions of 7-10 residues each account for 85% of the sequence diversity between It has been revealed.   Nerve growth factor (NGF) develops sensory and sympathetic neurons in the peripheral nervous system 120-amino acid polypeptide homodimer protein having particularly remarkable effect It is. NGF helps neurons survive, promotes axonal growth, and Through specific cell surface receptors on responding neurons to increase selective differentiation Function. NGF function is found in neuronal membranes (40) and (41). In the state of phosphorylation of Ron protein (42), (43) and in neurons MRNAs and proteins that may play a role in differentiation and function of cells (For example, see (44)).   Forebrain cholinergic neurons also respond to NGF and use NGF for nutritional support. Need (45). In fact, NGF and its receptors in the central nervous system (CNS) The placement and development of the receptor is determined by the fact that NGF targets the basal forebrain cholinergic neurons It suggests that it functions as a target-derived neurotrophic factor (46), (81).   Transcription of NT-3, as well as a wide range of peripheral tissues (eg, kidney, liver, skin), It has also been detected in the central nervous system (eg, cerebellum, hippocampus) (5); (7), (82) . During development, transcription of NT-3 mRNA results in neuronal proliferation, migration and differentiation. Most pronounced in the area of the central nervous system (50). For the development of neurons To support the evidence for a role in neuronal crest cells, NT- 3, including stimulation of oligodendrocyte progenitor cell proliferation in vivo It is. NT-3 is also a sensory neuron derived from nodular ganglia (NG) (7); (5) , (83) and a population of muscle sensory neurons from the spinal ganglia (DRG) (52). It also aids survival in vitro. In addition to these in vitro studies, recent studies In a model similar to the pattern of cell loss found in Alzheimer's disease, NT-3 is an adult central noradrenergic neuron with locus coemlus Has been shown to prevent degradation of in vivo.   High range of human NT-3 (101) and mouse and human NGF (55; 98) Over time, the binding sites for each of trkC and trkA The position was suggested. X-ray crystallographic analysis of some three-dimensional structures of neurotrophins (29; 93; 96). In NGF, the N-terminal residue is t It contributes significantly to the affinity for rkA and provides the most important determinant for specificity. (55; 101). Significant deficiencies in biological activity and receptor binding Human and mouse representing a homologous truncated form modified at the amino and carboxy termini (47); (48); (49). Purification From deletion of the first 9 residues at the N-terminus and the last 2 residues at the C-terminus of recombinant human NGF The derived 109 amino acid species (10-118) hNGF is (1-118) hNG F from mouse trkA receptor compared to mouse125I] Dissociate NGF In that it is not 300 times more efficient. (49). It is (1-118) hNG 50 to 100 times more active in the survival of spinal and sympathetic ganglia compared to F Low (48). (10-118) hNGF is a significantly lower trkA tyrosine kinase It has been reported to have ze autophosphorylation activity (49).   For NT-3, the epitope for trkC is located in the central β-chain bundle region. Non-conservative loop or the first 6 residues at the N-terminus It has been shown not to contain residues from the group (101). However, 40-4 Non-reserved, including 9 residues (NGF residue numbers will be used throughout this specification) Although an existing beta hairpin loop is shown to mediate trkA / trkC specificity, (94), this loop does not contribute to the binding of trkC to NT-3 (101). Only However, the most important residues in NT-3 involved in binding to trkC, Since R103 is stored in all neurotrophins, the identification of trkC The mechanism is unknown.   The elucidation of the structural determinants for neurotrophin specificity is in this family. It is important to understand the function and evolution of growth factors. In addition, neurological lesions Administration of neurotrophins to the model has an effect on neuronal regeneration and survival. And has been shown to be beneficial (97; 103). Various neurotrophins As a candidate for a therapeutic drug for neurodegenerative disease, Knowledge of the structural mechanisms of isomerism and function suggests a novel neurotrophin-based therapy Will help in drug development.   Limited attempts to create chimeric or whole neurotrophin factors exist (See (53); (56); (54), (55)). Neuros involved in neurodegenerative diseases The human population expresses one or more trk receptors, and therefore MNTS-1 (101 ) Or multiple specificities of molecules such as PNT-1 (55) Neurotrophin with specificity or neurotrophy with single specificity It would be advantageous to administer a mixture of fins. For example, neurotrophin Different members of the family have different drug biologic reactions, and The behavior of the lophine mixture is different from the expected or controlled Would. Drugs having one or more neurotrophin activities and / or improved Have bioreactive properties and are ready to be administered and remain effective There is a need for a neurotrophin molecule. These and other advantages are Provided by the molecules and methods presented herein.                                   wrap up   The present invention is part of the central β-strand bundle of NT-3, TrkC binding and tr when specific non-conserved residues are conjugated to NGF Based in part on the discovery that it can confer kC signal inducing activity. NT-3 The exchange of NGF residues at positions 18, 20, 23, 29, 84 and 89 by the complement is NGF variants that bind to trkC while retaining affinity for trkA To induce autophosphorylation and differentiation of PC12 cells expressing trkC. I was able to. These NGF variants are identified at position 23 (glycine / NT in NGF). The amino acid at threonine at -3 is essential for trkC recognition and On the other hand, the other residues fine-tune the specificity of NT-3 for trkC. As a result Provide a non-conservative central β-strand bundle region for NT-3 interaction with trkC. The importance of various residues has been shown, and NT-3 / trkC and NGF / trkA ligands The different mechanisms of the specificity determinants used in / receptor pairs are highlighted.   Accordingly, an NGF mutant having trkC binding and signal inducing activity is provided. You. The NGF variant optionally has trkA binding and signal inducing activity, and It has trkB binding and signal inducing activity. In one embodiment, the transformation The variant has both trkA and trkC activity. In another embodiment, The mutant has trkC activity, but lacks trkA activity. NGF mutant The amino acid sequence of the base NGF amino acid is typically the native NGF sequence. Obtained by substitution, insertion or deletion of one or more amino acids in the sequence. Preferably NGF is a naturally occurring mammalian NGF. Most preferably, it is NGF. An NGF variant is at least as similar to the original molecule of NGF from which it was obtained. Will typically maintain 75% amino acid sequence identity. These NGF changes A substantial amount of the variant is provided using recombinant DNA techniques.   Further, as one aspect of the present invention, a recombinant nucleic acid encoding an NGF mutant, and Expression vectors and host cells containing these nucleic acids are provided.   As a further aspect of the present invention, the nucleic acids, vectors and host cells of the present invention are used. A method for producing an NGF variant is provided. In one embodiment And transformed using an expression vector containing a nucleic acid encoding an NGF variant. Host cells can express nucleic acids to produce recombinant NGF variants. Cultured.   Further, treating a neuronal disease in a mammal using the NGF variant of the present invention. Methods and compositions are provided.   A population of neurons involved in a neurodegenerative disease develops one or more trk receptors. Administration of molecules with multiple specificities, such as NGF variants herein Are neurotrophins with a single specificity or neurons with a single specificity This is advantageous compared to the administration of a mixture of -rotrophin. For example, Neurotrof Various members of the family of dins have different drug biologic reactions and are therefore The behavior of the neurotrophin mixture is predictable in contrast to that of the NGF variant here. Difficult to measure or control. The neuropathy model is a key to neuronal regeneration and survival. It is available for examining neurotrophin activity (97; 103).   Other advantages and aspects of the present invention are apparent from the following detailed description, drawings, and claims. Will be clear.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 is a chart showing the specificity of neurotrophin / trk receptor interaction. It is.   FIG. 2 shows an alignment of the sequences of human NGF and human NT-3. NGF distribution The residue numbers given for the columns are used throughout this application. The star mark is the main research institute The mutated NGF residues in the mutants analyzed in this study are highlighted. The horizontal line is The position of the β-chain in the X-ray structure of murine NGF is shown (59).   FIG. 3A shows a model of human NT-3, and FIG. 3B shows the crystal structure of murine NGF. You. The two monomers for each neurotrophin are shown in shades; The number of residues in the color monomer is*Is represented by About characteristic residues , The oxygen atom in the side chain is shown in red and the nitrogen atom in the side chain is shown in blue. 103 residues (Arg in both NGF and NT-3) is purple. Use NT-3 complement NGF residues substituted for and affecting binding and specificity are yellow; binding and Residues that do not affect specificity are green. The first residue found in the NGF crystal structure ( 10 residues) are brown. Previously proposed to affect specificity (94) Yes The altered beta hairpin loop (residues 40-49) is shown in turquoise.   4A and 4B show trkA in PC12 cells expressing rat trkC. Represents tyrosine phosphorylation of Cells are incubated for 5 minutes at 100 ng / ml in each well. Process using rotrotrophin. Lysate is equalized for cellular proteins Immunoprecipitated using anti-trkA specific polyclonal antiserum, 7.5% SD Electrophoresis was performed on an S-polyacrylamide gel. Tyrosine phosphorylation with anti-phospho Detection was performed using tyrosine mAb 4G10. NGF / P, purified NGF NGF / U, concentrated supernatant of NGF-expressing 293 cells; NT-3 / P, purified N T-3: NT-3 / U, concentrated supernatant of NT-3 expressing 293 cells; 0, mock-treated 29 3 cells. 4A and 4B use the neurotrophins listed in each lane above. Taji Shown are results from two separate experiments.   FIGS. 5A, 5B and 5C show the t.c. in PC12 cells expressing rat trkC. Represents tyrosine phosphorylation of rkC. Cells were incubated at 100 ng / ml for 5 minutes each. Process using Neurotrophin. Lysates for cellular proteins, etc. Quantified and immunoprecipitated using anti-trkC specific antiserum 656, 7.5% SDS Electrophoresis was performed on polyacrylamide gel. Tyrosine phosphorylation with anti-phosphotyrosine Detection was performed using the thin mAb 4G10. NGF / P, purified NGF; N GF / U, concentrated supernatant of NGF expressing 293 cells; NT-3 / P, purified NT- 3: Concentrated supernatant of NT-3 / U, NT-3 expressing 293 cells; 0, mock-treated 293 cells Vesicles. Figures 5A, 5B and 5C use the neurotrophins listed in each lane above The results from three separate experiments are shown.                             Detailed description of the invention Definition   The one letter code for amino acids is as is well known in the art according to Table 1 below. Used here:                                   Table 1   Therefore, the identification of an amino acid residue consists of a one-letter amino acid code followed by the residue's It is represented by the number of positions. The number of positions corresponds to a specific neurotrophin skeleton It is understood that D15A NT3 is an aspartic acid at position 15 of NT3. Means alanine. Look within the “constant region” defined below. This aspartic acid that is released shows that NGF has one additional amino acid at the N-terminus. Therefore, it corresponds to position D16 of NGF.   The present invention relates to a neurotrophin N having trkC binding and signal inducing activity. GF variants are provided. In general, neurotrophins are It is a protein involved in the development, regeneration and maintenance of proteins. At present, several weeks There are important neurotrophic factors of knowledge: nerve growth factor (NGF), neurotrophy -3 (NT3), Neurotrophin-4 (NT4, and optionally Neurotrophin) Rofin-5 (also called NT5) or NT4 / 5), brain-derived neurotrophic factor ( BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF) and NT-6.   As used herein, the term “NGF variant” is different from naturally occurring NGF and Neurotrophin specificity of NT-3 for C-binding and trkC signal induction To Means having neurotrophin. In other words, the mutants have these NT-3 activities. Includes changes that impart or confer sex. In one embodiment, this corresponds to the N The GF variant binds at least trkC, and preferably, preferably, trkA and / or Or binding to various neurotrophin receptors such as trkB. To taste. Thus, for example, natural or native ligands for the trkA receptor Naturally occurring NGF, which is a key, has high affinity with trkB or trkC It does not detectably bind to each of the receptors; for example, NGF 500-3000 times higher K than BDNF or NT-3 respectivelyDHas Bind to these receptors. However, NGF mutants, Neurotrophins whose amino acid backbone is based on NGF bind at least to trkC can do. In one embodiment, the NGF variant comprises trkC and tr Binds to kA but not to trkB. In a preferred embodiment, it is Binds to trkC, but not to trkA or trkB. One instead In one embodiment, the variants are trkA, trkB and trkC, as well as p75. Binds to receptor. In another embodiment, the variants are trkC and trkC. Binds to rkB but not to trkA.   In one embodiment, the NGF variant is one which is naturally found for NGF. Binds to receptors other than trkA with higher affinity of The natural ligand of the receptor. For example, NGF is trkA Binds strongly and binds very weakly or not at all to trkB and trkC do not do. Therefore, one embodiment of the NGF variant is normal or substantially normal. Binds trkA with high binding affinity and is a natural ligand of trkC, NT-3 To trkC with substantially similar affinity to, or the natural ligand of trkB , BDNF or NT4 / 5 or both with substantially similar affinity to trk Binds to B.   In one embodiment, an NGF variant for a neurotrophin receptor Reduced by about 50-fold or less compared to NT-3 for trkC, preferably Less than about 20-fold, more preferably less than about 15-fold, even more Preferably less than about 10-fold, and even more preferably trk 5 shows binding affinity for trkC reduced to less than about 5-fold than NT-3 for C You. In another embodiment, the NGF variant is less than about 3-fold less than NT-3. Will have affinity for trkC. NGF mutants are similar to NT-3 Or may have substantially similar affinities, or they may be 10 times or less higher activity. The above affinity comparison was performed using BDNF Also applies to NGF mutant trkB binding as compared to   This affinity is measured by various methods understood by those skilled in the art. preferable The method is the use of the competition assay shown in (84) and the examples. General Binding affinity is IC50That is, the binding of the labeled ligand to the receptor Recorded as the concentration of unlabeled competitor that inhibits 50%.   In an alternative embodiment, the neurotrophin activity is neurotrophin level. Neuronal survival assays rather than by binding affinity for sceptors Or as measured by an axon growth assay. This is trk cell signaling 3 shows the ability of the mutant to Therefore, many neurotrophins are Promotes survival of derived sensory neurons (77), (78), (7), (17). Embryo sympathy Survival of urones is facilitated only by NGF, while placode-derived sensory Survival of urones is facilitated by NT-3 and BDNF (85). Spinal ganglia Sensory neurons are facilitated by both NGF and BDNF (13). NT -3 represents sensory neurons derived from spinal ganglia, sympathetic chain ganglia, and nodular ganglia Leads to axonal growth of the nodule and the production of nodular and spinal ganglion neurons as well. Encourages survival. Therefore, a neuron survival assay or an axon growth assay It can function to measure the activity of a GF mutant neurotrophin. Motor neuron survival is another preferred NGF variant activity.   In one preferred embodiment, the activity of the NGF variant expresses trkC It is measured by its ability to stimulate differentiation of PC12 cells. P expressing trkC C12 cells (26; 100) were placed on collagen-coated tissue culture dishes and placed at axonal sites. Assays can be performed on a population of cells. The axon-bearing cells are It is defined as including the step of at least doubling the length of the endoplasmic reticulum. instead of Test PC12 cells expressing trkB for trkB signal inducing activity You PC12 cells expressing trkA can be used to Can be used to test for signal induction activity. Preferred NGF Mutants are most preferably required for maximal response when compared at the same concentration in the medium Response of at least about 25% of NT-3 when compared at different concentrations of NT-3 , More preferably about 50%, even more preferably about 75%, and even more preferably Axon growth with a maximum NT-3 response of preferably about 90%, most preferably about 100% Will achieve. For example, in Table 4, the preferred comparison is the factor per ml of medium. Made with one nanogram of offspring.   Therefore, neurotrophin specificity is determined by neurotrophin receptor binding, And measured by neuron survival assay and / or axon growth assay . Therefore, an NGF variant as defined herein has at least the binding properties of NT-3, Neurons showing neuronal survival or axon growth assay specificity Trophin NGF. Optionally, N with BDNF or NT4 / 5 specificity The GF variants have the tropism discussed for NT-3 activity and are either BDNF or NT4 / 5 at least binding specificity, neuronal survival assay specificity Or axonal growth assay specificity, eg, it is at least about Axon growth at 25% maximal response, more preferably at about 50%.   NGF variants with trkC binding and signal inducing activity are typically Maintains at least 75% amino acid sequence identity with the originating molecule of NGF Will do. In another embodiment, the NGF variant is the NGF from which it is derived. Preferably 80% identity, more preferably at least 90%, , Most preferably at least 95%.   The trkC binding site on NT-3 is occupied by residues in the central β-strand bundle region. TrkC distinguishes NT-3 from other neurotrophins It was hypothesized to recognize this set of residues (101). In this study, A series of five residues located in the structural region were converted from human NT-3 to human NGF. (FIG. 2). Resulting NGF mutant G23T / V18E / V2 binding to trkC 0L / T81K / H84Q (NGF12) maintains affinity for trkA, It stimulated autophosphorylation and differentiation of PC12 cells expressing trkC. Sarana By mutagenesis, the most important determinant for specific trkC binding is 2 Residues at positions 18, 20, 29 and 86 are located at positions 3 and 84 relative to trkC It has been shown to fine-tune specificity. These results indicate that N with trkC Due to the importance of non-conserved residues in the central β-strand bundle region for T-3 interactions , NT-3 / trkC and NGF / trkA ligand / receptor pairs The different mechanisms of the specificity determinants used are highlighted, and the short amino acid "active site In contrast, the overall structure of neurotrophins is (56).   The NGF variants of the present invention bind trkC and induce receptor signaling G23, which confer or supplement trkC binding to obtain NGF variants At the amino acid position of H84 and either (or both) V18 or V20 It can be obtained from NGF by substitution. In a preferred embodiment, V20 is Will be replaced. Optionally further, the NGF variant may increase or fine-tune NT-3 specificity Further comprising a substitution of F86, T81 or T29 that can be adjusted. You. Preferred NGF variants are human NG as provided in the Examples (see Table 3). NGF130, NGF131, NGFR2 and NG with substitutions in the F sequence Includes FR3. Preferred substitutions at these sites to obtain trkC binding are: G23T, H84Q, V18E, V20L, F86Y, T81K and T29I is there. However, trkC, e.g., a series of conservative and homologous substitutions Other substitutions can be made at these sites to recruit binding and signal-inducing activity. Wear. For example, V18 may be a conservative or homolog of a preferred substitution, eg, tr Glutami using aspartic acid or glutamine to increase kC binding Substitution of an acid can be substituted using an amino acid substitution that is-. V20 is To increase trkC binding, threonine or larger hydrophobic amino acids ( (Isoleucine, methionine). G23 is auction And alanine can be substituted. T29 is isoleucine, It can be substituted using valine or leucine. Preferably, T29I Exists when F86Y is present. H84 is asparagine or gluta It can be replaced using a min. F86 affects trkC binding Can be substituted using methionine or tryptophan.   In order to fine tune trkC recruitment, it was necessary to recruit substantial trkC binding. The natural NGF amino acid in the unreplaced central β-chain bundle is preferably Case is maintained. However, there are also less preferred substitutions: Valine can be conservatively substituted using leucine or threonine, V20 can be replaced using alanine, and T29 can be replaced using serine. And T81 is arginine, isoleucine, valine, Substitution can be made using leucine or serine. Y79 is glutamine , Phenylalanine, methionine, isoleucine, leucine, tryptophan, etc. Or asparagine, but preferably is maintained at Y79 Is done.   Further, the NGF mutant is an NGF mutant that binds trkB in addition to trkC. To NGF sequence to supplement or confer trkB binding to produce Can be included. The modification can be any chemical change to the molecule You. Modifications include substitutions, insertions, deletions, and deamidations, acetylations, acylations, P Chemical modification including without limitation EGylation, phosphorylation, myristylation and oxidation Is included. A preferred modification is an amino acid substitution at D16. Preferred variants Has a D16A substitution. D14A Disclosure of NGF December 14, 1995 International Patent Application WO 95/33829, printed on the date of this publication, is hereby incorporated by reference. Be included. Other conservative alanine substitutions at D16 were made to obtain trkB binding. Can be done. In certain embodiments, it will depend on the particular neurotrophin One or more neurotrophins that can confer neurotrophin specificity The above domain exists. For example, BDNF appears to confer BDNF specificity Have many domains. For example, BD from position 93-99 (SKKRIG) Substitution of the NF sequence will confer BDNF specificity in NGF (55).   NGF has a number of domains that, when modified, can affect NGF specificity. With in. The N-terminal amino acid of NGF has an effect on Nrk that affects trkA binding. It is a major area in GF. Significant loss of biological activity and receptor binding Was observed using purified homodimers of human and mouse NGF, 1 represents a homologous truncated form modified at the amino and carboxy termini. Purification and recombination Derived from the loss of the first 9 residues at the N-terminus and the last 2 residues at the C-terminus of human NGF 109 amino acid species (10-118) hNGF are In comparison, mouse trkA receptor was used for mouse [125I] 3 to replace NGF It has less than 00 times the effectiveness. It compares with (1-118) hNGF And is 50 to 100 times inactive in the survival of spinal and sympathetic ganglia. N The GF variant has a 10 amino acid N-terminal region to reduce or eliminate trkA binding. Area modifications can be included. In one embodiment, the seven N-terminal Amino acids (SSSHPIF) have reduced or lost trkA binding activity, for example In order to obtain NGF mutants, the N-terminal amino acid of NT-3 (YAE HKS). About 4 to about 10 N-terminal residues When exchanged, the exact number of modified NGF N-terminal residues is not essential, In some embodiments, a single amino acid change may be important. In one embodiment At least one of the 10 N-terminal amino acids reduces or eliminates trkA binding. Deleted or replaced to remove it. Particularly preferred positions for modification are NGF specific Histidine, an amino acid at position 4, which appears to be very important to This is Rin. Similarly, the number of other residues in NGF is different from NGF trkA receptor binding. Have also been shown to be important in biological activity assays. example For example, there are numerous residues that, when mutated, lose NGF activity. this These residues are restricted to D30, Y52, R59, R69 and H75. Not included. Alanine is substituted at these positions to break trkA binding While other amino acids that are non-conservative for the amino acid at that position It can also be used. 1 discloses NGF mutants that have lost NGF activity International Patent Application WO 95/33829, printed on December 14, 995, It is taken into consideration here. The trkB recruitment modification is compatible with both trkC and trkB. To produce a mutant that binds but does not bind trkA. Can be combined with decoration.   V18, V20, G23, H84 and any of F86, Y79 or T81 Or trkC recruitment at amino acid positions in any combination of these three Also provided are NGF variants, including NGFs having substitutions, wherein the variant comprises t rkC is bound. In a preferred embodiment, these variants have trkC binding Replaced with both T81 and F86 to increase or fine tune activity. Further NGF variants may include a T29 substitution. G23T, G 23A, Y79Y, Y79Q, Y79F, Y79I, Y79L, Y79W, Y7 9N, H84Q, H84N, V18E, V18D, V18Q, V20L, V20 T, V20I, V20M, F86Y, F86W, T81K and T29I Can be. However, those that confer trkC binding and signal inducing activity Other substitutions at position, such as a series of conservative and homologous substitutions, can be made. Preferred substitutions are G23T, H84Q, V18E, V20L, F86Y, T81 K and T29I, and at position 79, Y is preferred. Preferred NGF of this type Mutants include NGF126, NGF1234, NGF124, NGF125, NGF GF12, NGFR4 and NGF123, and NGF127 Specific amino acid substitutions in F are provided in Table 3 of the Examples.   NGF is a 120 amino acid polypeptide homodimer protein. NG F can be produced in the form of 120, while the more preferred The turn or backbone is in the form of 118 amino acids, preferably in the form of a dimer. You. In the 118 configuration, R119 and A120 are absent. This form is 1 By expression using 18NGF-encoding nucleic acid, or by selectively inverting 120 forms Later translation can be obtained using proteolysis, for example using trypsin. one more In some embodiments, the 117 NGF form comprises a NGF pattern or scaffold. Can work. Composition comprising an NGF variant and a physiologically acceptable carrier Is also provided.   In addition, residues in the vicinity of the aforementioned residues increase NT-3 specificity or You can also fine-tune. In one embodiment, the change in the constant region is NT It may confer trispecificity. Instead, increased NT-3 binding to trkC Mutations at positions R31 and E92 in NT-3, particularly R31A And E92A NT3 were identified in NGF using the method described below. It can be taken in the corresponding position.   In addition, a number of NGFs that increase NGF binding and / or biological activity There are many amino acid substitutions. Thus, these substitutions increase NGF specificity Included in the NGF variant backbone. These residues include E11, F12, D24, E41, N46, S47, K57, D72, N77, D105 and K1 15 are included without limitation. Alanine maintains or increases trkA binding. While substitutions can be made at these positions to increase Other amino acids that are conservative for the amino acid at the position can also be used. The outline below Abbreviated.   Residues that are important for neurotrophin specificity are those described in the Examples. And other amino acid residues using methods well known as site-directed mutagenesis. It can be substituted by any of the groups. Generally, the substituted amino acid is , Based on characteristics understood by those skilled in the art. For example, a small Where minor modifications are required, substitutions are generally made according to the following table:                                   Table 2   Substantial changes in function or immunological identity are greater than those shown in Table 1. This is done by selecting non-conservative substitutions. For example, affect more prominently Substitutions are made: the structure of the polypeptide backbone in the region of modification, eg, alpha Helix or beta sheet structure; charge or hydrophobicity of the molecule at the target site Degree; or the size of the side chain. Generally produces the largest change in polypeptide properties. Substitutions that are predicted to shift include (a) adding a hydrophilic residue, such as seryl or threonyl. , Hydrophobic residues such as leucyl, isoleucyl, phenylalanyl, valyl or Or with (or by) alanyl; (b) cysteine or Is replacing proline with (or by) any other residue; ( c) a residue having a positively charged side chain, such as lysyl, arginyl or histidyl. , With a negatively charged residue such as glutamyl or aspartyl (or ) Substituting; or (d) a residue having a large side chain, such as phenylala Substituted with (or by) glycyl without side chains, such as glycyl It is to be. In a preferred embodiment, the residue is changed to an alanine residue.   In addition, homologous scanning mutagenesis, random mutagenesis, cassette mutation Induction can all be used to produce putative NGF variants, Receptor binding using methods described in the Examples and methods well known in the art. Is screened against.   As used herein, the term "neurotrophin receptor" or grammatical synonym is A receptor that binds a neurotrophin ligand is meant. Certain embodiments and Thus, neurotrophin receptors are commonly referred to as "trk" receptors. Are members of the tyrosine kinase family of receptors, which are distinct D It is expressed on the surface of the neuron population. The trk family includes trkA (p140t rk TrkB (p145)trkBTrkC (also known as p145trkCAlso known without limitation. Other embodiments The neurotrophin receptor is p75NGFRWhich is p75 or Is also referred to as low affinity nerve growth factor receptor (LNGFR). Other still found Neurotrophin receptors that have not been engineered are also described by the NGF mutants of the present invention. Is understood to be capable of binding to it can.   In one embodiment, the binding to the p75 receptor by the NGF variant is , Have been substantially reduced or eliminated. For example, p75 binding with reduced mutation There are various amino acid residues that contribute to p75 binding leading to In NGF, F12, 131, K32, K34, K50, Y52, R69, K74, K88, Mutations at positions L112, S113, R114 and K115 all have reduced p Causes 75 bonds. F12, 131, K50, Y52, R69 and K74 are All are in the constant region.   In addition to the amino acids described above, one skilled in the art will recognize some variability in the amino acid sequence. Is acceptable without altering the specificity and characteristics of the neurotrophin. You will understand. Therefore, NGF mutants do not affect trk binding Is compared to a wild-type sequence that is simply a variant of the sequence, Can have a deletion. In one embodiment, these mutations are specific Will be found in the same locations as those identified as important for gender, That is, in some cases, neutral mutations can alter the specificity of neurotrophins. Will be done.   The NGF mutant neurotrophins of the present invention can be used in various ways using recombinant methods. Can be created by law. The term "recombinant nucleic acid" as used herein is not normally found in nature. A nucleic acid in a non-issued form is meant. In other words, a recombinant nucleic acid Are joined by unjoined nucleotide sequences or are normally found in nature. Have a different sequence. Recombinant nucleic acids are originally nucleated by restriction endonucleases. Formed in vitro by acid manipulation, or alternatively polymerase chain reaction of It can be formed using such a method. Once the recombinant nucleic acid is produced, the host When reintroduced into a cell or organism, it is non-recombinantly replicated, ie Replicated using the host cell's in vivo cellular machinery rather than in vitro manipulation It is understood, however, that the nucleus once produced recombinantly The acid is substantially non-recombinantly replicated but is still recombinant for the purposes of the present invention. it is conceivable that.   Similarly, the term “recombinant protein” is used using recombinant methods, ie, A protein made through the expression of a recombinant nucleic acid as described. Recombinant Proteins are distinguished from naturally occurring proteins by at least one or more characteristics. Separated. For example, the protein is normally associated with a wild-type host. Isolated from some or all proteins and compounds. The definition includes the same Or NGF mutant neurons from one organism in a different organism or host cell Includes trophin production. For example, the protein may have an increased level Through the use of inducible or high expression promoters as produced, Produced at significantly higher concentrations in the same organism from which it is derived. Alternatively, the protein may be an epitope tag or amino acid substitution, insertion and deletion. Will exist in a form not normally found in nature.   Using the nucleic acids of the invention to encode NGF mutant neurotrophins, An expression vector is produced. Expression vectors can be self-replicating extrachromosomal vectors or Or a vector that is inserted into the host genome. Generally, an expression vector For one, the nucleic acid was operably linked to a nucleic acid encoding an NGF mutant neurotrophin. Transcription and translation regulatory nucleic acids are included. The term "functionally linked" in the present context means As in the manner in which transcription is initiated, transcriptional and translational regulatory DNA is It means to be located with respect to the rotrophin coding sequence. Generally this is The promoter and transcription initiation or start sequence are Would be located on the 5 'side of the loading region. Transcription and translation regulation Nucleic acids are commonly used to express NGF mutant neurotrophins It will be appropriate for the host cell; for example, transcription to mammalian cells and The translation regulatory nucleic acid sequence is capable of expressing the NGF mutant neurotrophin in mammalian cells. Departure Used to manifest. Numerous types of suitable expression vectors and proper regulation Sequences are well known in the art for a variety of host cells.   Generally, transcription and translation control sequences include promoter sequences, signal sequences, Bosome binding site, transcription initiation and termination sequences, translation initiation and termination sequences, terminators And the polyA signal sequence, and the enhancer or activator sequence Included without limitation. In a preferred embodiment, the regulatory sequence comprises a promoter. And translation initiation and termination sequences. For recombinant vertebrate cell culture Methods, Vectors and Host Cells for Applications to the Synthesis of NGF Variants in Vesicles, Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979). European Patent Application EP 117,060; and European Patent Application EP 117,058. NG A particularly plausible plasmid for mammalian cell culture expression of the F variant is pRK5 ( European patent application EP 307,247), pRK7 or pSV16B. 1991/6 International Patent Application WO 91/08291, printed on March 13, is incorporated herein by reference. It is.   The promoter sequence encodes either a constitutive or an inducible promoter I do. A hybrid promoter that combines elements of one or more promoters Are also well known in the art and are useful in the present invention.   Further, the expression vector will contain additional elements. For example, an expression vector Has two replication systems and is therefore, in two organisms, e.g. Maintained in target cells and in prokaryotic hosts for cloning and amplification It is possible to As for the integrated expression vector, the expression vector Is at least one sequence homologous to the host cell genome, preferably both expression constructs. Contains two homologous sequences flanked by edges. An integrating vector is an insert in a vector Specific sites in host cells by selecting appropriate homologous sequences to Turned to rank. Constructs for integrating vectors are well known in the art.   In a further preferred embodiment, the expression vector comprises a transformed host cell. Includes a selectable marker gene that allows for selection. Selection genes are well known in the art. And will vary with the host cell used.   The NGF mutant neurotrophin of the present invention may be an NGF mutant neurotrophin. Under appropriate conditions to induce or direct the expression of NGF, the NGF mutant neurotrophin Culturing transformed host cells using an expression vector containing a nucleic acid encoding Produced by doing. For expression of NGF mutant neurotrophin Appropriate conditions will vary depending on the expression vector and host cell selected, and will be within the skill of the art. Will be easily established. For example, a constitutive promoter in an expression vector Requires the optimization of host cell growth and proliferation, while inducing The use of inducible or repressible promoters requires appropriate amplification for induction or repression. Breeding conditions are required.   In a preferred embodiment, the NGF mutant neurotrophin is purified after expression. Manufactured or isolated. NGF mutant neurotrophin is present in the sample Isolated or purified in various ways well known to those skilled in the art, depending on the other components Is done. Standard purification methods include electrophoresis, ion exchange, hybrid, affinity Molecular, immunological and chromatographic methods including tea and reverse phase HPLC chromatography Includes chromatographic methods, chromatofocusing. For protein concentrates Coupled ultrafiltration and double filtration methods are also useful. General in appropriate purification methods See (57) for a typical procedure. The required degree of purification depends on the NGF variant Will depend on the use of neurotrophin. In some cases, purification is Will not be required.   Suitable host cells include fungi such as yeast, bacteria, archaebacteria, filamentous fungi, and plants. Cells and animal cells, including mammalian cells, are included. Of particular interest is Saccha romyces cerevisiae and other yeasts, E. coli, Bacillus subtilis, Pichia pastoris, SF9 Cells, C129 cells, 293 cells, Neurospora and CHO, COS, HeLa cells Vesicles, immobilized mammalian myeloids and lymphoid cell lines. Preferred host cells are Most preferred host cells are mammalian cells, such as CHO cells, COS-7 cells, And the human fetal kidney cell line 293.   In a preferred embodiment, the NGF mutant neurotrophin of the present invention It is expressed in animal cells. Mammalian expression systems are also well known in the art.   Some genes are more efficiently expressed when introns are present. I However, some cDNAs are available from vectors lacking splicing sequences. It is expressed at a constant rate. Therefore, in some embodiments, the NGF variants Nucleic acids encoding neurotrophins include introns.   Methods for introducing foreign nucleic acids into mammalian hosts, as well as other hosts, are well known in the art. Dextran-mediated transfer, depending on the host used. Fractionation, calcium phosphate precipitation, polybrene-mediated transfection, Toplast fusion, electroporation, polynucleotide into liposome And direct microinjection of DNA into the nucleus .   In one embodiment, the NGF mutant neurotrophin is produced in yeast cells. It is. Yeast expression systems are well known in the art and have been developed for Saccharomyces cerevisiae. The current vector is included. Candida albicans and C. maltasa, Hansenula polymorpha , Kluyveromyces fragilis and K. lactis, Pichia Guilerimondii and P. pastoris, S Expression vectors for chizosaccharomyces pombe and Yarrowia lipolytica are included. I will. Methods for introducing foreign nucleic acids into yeast hosts, as well as other hosts, are well known in the art. And will vary with the host cell used.   In a preferred embodiment, the NGF mutant neurotrophin is present in bacterial systems. Expressed. Expression vectors for bacteria are well known in the art, and include Bacillus subtilis, colon Against fungi, Streptococcus cremoris and Strcptococcus lividans and others Vector included. Bacterial expression vectors were treated with calcium chloride and electroporated. Into the bacterial host using methods well known in the art, such as Transduced.   In one embodiment, the NGF mutant neurotrophin is found in insect cells. Produced. Expression vectors for the transformation of insect cells, especially baculoyl S-based expression vectors are well known in the art. Baculovirus / insect cell Materials and methods for vesicle expression systems are commercially available in kit form; examples An example is the "MaxBac" kit from Invitrogcn in San Diego. .   Recombinant baculovirus expression vectors are capable of infecting some insect cells. Is being developed for For example, recombinant baculovirus is available from Aedes acgypti, Auto grapha califomica, Bombyx mori, Drosophila melangaster, Spodoptera frugiper Developed for da and Trichoplusia ni.   Once expressed, the NGF mutant Neutrophin is used as a neurotrophic factor. Used. These NGF mutant neurotrophins have various diagnostic and therapeutic uses. Used in applications. NGF variants can also be used as animal food It is.   The NGF mutant neutrophin of the present invention detects the neutrophin receptor. It is useful in the diagnostic method that is issued. For example, the NGF mutant Neutro of the present invention Fins can be labeled. As used herein, the term "labeled NGF mutant -Trophin "refers to NGF mutant Neutrophin or Neutrophin receptor. Attachment to enable detection of NGF mutant Neutrophin bound to puter NGF having at least one element that is an isolated radioisotope or compound Mutant Neutrophin is meant. Generally, signs are divided into three classes. A) an isotope label that is a radioisotope or heavy isotope; b) an antibody or An immunological label that is an antigen; and c) a dye or fluorescent dye. Signs are in any position Is incorporated into the NGF mutant neurotrophin. Once labeled, N GF mutant neurotrophins can be used either in vitro or in vivo. Used to detect the neurotrophin receptor. For example, Neuroto The presence of the rophin receptor can be an indicator of the presence of a particular cell type, It is useful in That is, a secondary population of a particular cell type By binding the labeled NGF mutant neurotrophin to the cells. Shown.   Further, the NGF mutant neurotrophin of the present invention is a neurotrophin. Useful as a standard for essays. For example, N in any particular assay GF mutant neurotrophin activity is determined using well-known neurotrophin standards The NGF mutant neurotrophin is then measured for neurotrophy. It is used in diagnosis and quantification of cancer.   In addition, the NGF mutant neurotrophin of the present invention is capable of growing many neurons. Factor for use in culturing neurons in vivo. It is useful as a component of a culture medium. As will be appreciated by those skilled in the art, the N The GF mutant neurotrophin is another component frequently used as a component of a culture medium. Can replace neurotrophic factor. Assays used in standard assays The amount of NGF mutant neurotrophin added can be easily measured .   The NGF mutant neurotrophins of the present invention can also be used in organisms or patients. Used in the diagnosis, identification and localization of rotrophin or neurotrophin antibodies It is also useful for producing antibodies that can be For example, NGF mutant Neurotrophins can be polyclonal or monoclonal, as is well known to those skilled in the art. Can be used to generate antibodies. The antibody is then labeled and Used to detect the presence or absence of neurotrophin. Therefore, A diagnosis of a neurological disorder associated with rotrotrophin is detected. Alternatively, the antibody is It is detected indirectly by using a secondary antibody. For example, if the primary antibody is Or anti-mouse or anti-rabbit antibodies made in rabbits and then labeled The body is used to detect the primary antibody. Each of these methods is similarly similar Are well known in the art, and detect neurotrophins in various tissues. To be able to   Furthermore, antibodies raised against the NGF mutant neurotrophins of the invention Also useful for the purification of neurotrophins and NGF mutant neurotrophins It is for. In general, NGF mutant neurotrophins have few amino acid substitutions. Many immunological epitopes have been identified for neurotrophins and NGF mutant neurons. Trophins share. Therefore, directed against the NGF mutant neurotrophin The resulting antibody binds to naturally occurring neurotrophins and therefore in purification Useful. For example, as is well known in the art, affinity chromatography A purification scheme based on the method can be used.   The NGF mutant preparation of the present invention can be used for central (brain and spinal cord), peripheral (sympathetic, parasympathetic, And visceral neurons), and motoneurons, in vitro and in vivo May be useful in promoting the formation, maintenance, or regeneration of neurons in . Therefore, the NGF mutant preparation of the present invention is useful for treating various neurological diseases and diseases. Useful in a method for In a preferred embodiment, the formulation of the invention It is administered to a patient to treat a trans-disease. The term "neurological disorder" here Refers to diseases of the central and / or peripheral nervous system associated with the alteration or damage of urones I do. Characteristic examples of neurological disorders include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and Hunty's disease. Ngton chorea, seizures, ALS, peripheral neuropathy, and central, peripheral, or motor Urones, any of which are characterized by neuronal necrosis or loss Disease, including, but not limited to, trauma, burns, renal dysfunction, The toxic effects of chemotherapeutic reagents used to treat cancer and AIDS This includes treating damaged nerves. For example, diabetes, AIDS or Peripheral neuropathy associated with a specific disease, such as neuropathy associated with or chemotherapy Are treated using the formulations of the present invention. It can also be in vitro or Useful as a component of culture media for use in culturing neurons in vivo is there.   In various embodiments of the present invention, the NGF variant treatment involves reducing neuronal survival. Trauma, surgery, stroke, ischemia, infection, metabolic disease, malnutrition to promote growth A patient with a nervous system that has been damaged by a tone, malignancy, or toxic reagent, or Any treated with NGF, NT-3, BDNF or NT4-5 It is administered to patients with the disease. As expected, the treatment or effect is It depends on the specific trk binding function or the function present in the NGF variant. For example, a book The NGF variant preparations of the invention can be used for motor neurons damaged by trauma or surgery. Can be used to promote survival or growth. NGF mutations of the invention Body preparations also include amyotrophic lateral sclerosis (Lou Gehrig's disease), Bell's palsy, and spinal muscles. To treat motor neuron diseases, such as various diseases including atrophy or paralysis Can be used for The NGF mutant preparation of the present invention may contain Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, multiple sclerosis, Huntington's chorea, Down syndrome, God Used to treat human neurodegenerative diseases, such as transepitopic hearing loss and Meniere's disease can do. The NGF mutant preparation of the present invention is particularly useful for dementia or trauma. It can be used as a recognition enhancer to promote recognition. Mature National Institutes of Aging Causes More Than 50% of Dementia in Children Confirmed Alzheimer's disease ranks fourth in Americans over 65 Or the fifth leading cause of death. Americans over the age of 85 Is a rapidly growing part), or 40% of the 4 million Americans Ima -I have a disease. 25 percent of all patients with Parkinson's disease He also suffers from Alzheimer's disease-like dementia. And about one of the patients with dementia In 5%, Alzheimer's disease and multi-infarct dementia coexist. Alzheimer's After disease and vascular dementia, alcohol poisoning is the third common cause of dementia. Cognitive impairment for indirectly related organic brain syndrome, which is alcoholism It occurs in about 10% of patients. However, Alzheimer's disease, as well as vascular Dementia and cognitive deficits due to organic brain syndrome associated with alcoholism , The most consistent abnormalities were the codex and hippocampus from the basal forebrain (BF). It is an alteration of the cholinergic system that occurs in both (Bigl et al., Brain Cholinergic Systems, M. Steliade and D. Biesold, Oxford University Press, Oxford, pp. 364-386 (1990) ). And numerous other neurotransmitters affected by Alzheimer's disease A system exists (Davies, Med. Res. Rev. 3: 221 (1983)). However, for example, choline Cognitive deficits associated with altered neurotransmitter system may affect patients suffering from dementia Not restricted. It is also found in other healthy elderly adults and rats. High Of the degree of reduced cerebral cortical blood flow and the degree of cognitive impairment in aged rats Studies have shown appropriate correlations (Berman et al., Neurobiol. Aging 9: 691 (1988)). Pride In patients with alcoholism, similar to Alzheimer's disease and normal aging, The resulting organic brain syndrome also produces cholinergic neurons (basal forebrain), Is caused by a diffuse decrease in cerebral cortical blood flow in the functioning (cerebral cortex) area of the brain. (Lofti et al., Cerebrovasc. and Brain Metab. Rev 1: 2 (1989)). Up Dementia can be treated by administration of the NGF variant formulation of the present invention.   Further, the NGF mutant preparation of the present invention treats neuropathy, particularly peripheral neuropathy. Is preferably used. The term "peripheral neuropathy" affects the peripheral nervous system Dysfunction, most often motor, sensory, sensorimotor, or autonomic dysfunction. All represented as one or a combination. Widespread by peripheral neuropathy Each of the enclosure configurations is uniquely based on a number of causes as well. For example, peripheral god Transoral disorders are generally acquired, derived from systemic disease, or caused by toxic reagents. Can be induced. Examples include diabetic peripheral neuropathy, distal sensorimotor neuropathy Or limited autonomic dysfunction, such as reduced movement of the gastrointestinal tract or bladder intonia Re Included without being. Examples of neuropathy associated with systemic disease include postpoly. Includes Syndrome or AIDS-related neuropathy; examples of genetic neuropathy Charcot-Marie-Tooth disease, Refsum disease, abeta-lipoproteinemia, Tandia Disease, Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Fabry disease, and Dujrine-so Includes tta disease. And as an example of neuropathy caused by toxic reagents , Vincristine, cisplatin, methotrexate, or 3'-azide-3'-de Also caused by treatment with chemotherapeutic reagents such as oxythymidine Is included. Therefore, a therapeutically effective amount of an NGF variant can be administered to a mammal. There is provided a method of treating a neurological disorder in a mammal, comprising: Preferably , The neurological disorder is a peripheral neuropathy, more preferably a diabetic peripheral neuropathy, A chemotherapy-induced peripheral neuropathy or an HIV-related neuropathy. Preferably, Peripheral neuropathy affects motor neurons.   In addition, administration of NT-3 can reduce the pattern of cell loss found in Alzheimer's disease. Adult-type noradrenaline production of locus coerulus in a model similar to Prevents the transformation of utility neurons in vitro (86). Furthermore, for the addition of NT3 Promotes sprouting of corticospinal tracts during development, as well as after adult spinal cord lesions Is shown. Indeed, NT3 is a myelin-related growth inhibitory protein. When administered with an inhibitory antibody, long-range regeneration was seen. Therefore, the present invention NGF mutant neurotrophin is used in place of NT3 in this application. Can be   In this embodiment, the therapeutically effective amount of the NGF variant neurotrophin is Is administered. The term "therapeutically effective amount" as used herein refers to what it is administered for. A dose that produces a therapeutic effect on the contrary. The exact dose will be Depends on the disease to be treated, the mode of administration and the clinical condition of the patient being treated, and It will be established by those skilled in the art using methods. Generally, the NGF modification of the present invention Heterologous neurotrophin is present at about 1 μg / kg to about 100 mg / kg per day Is administered. Further, as is well known in the art, age, as well as weight, normal health Regulation of condition, gender, diet, time of administration, drug interactions, and extent of disease It will be required and will be established by the skilled person by routine experimentation.   In some embodiments, 0. 07 to 20 mg / ml, preferably 0.1 to 0.2 mg / ml. 08 to 1 5 mg / ml, more preferably 0.1 mg / ml. 09 to 10 mg / ml, most preferably 0. Compositions containing NGF variants in an amount of 1 to 2 mg / ml are prepared. Peripheral god The use of these compositions in administration to human patients suffering from Thus, for example, these compositions may be presently contemplated for NGF administration for the treatment. About 0.1 equivalent to the dosage. Contains 1 mg / ml to about 2 mg / ml NGF variant . NGF variants are considered to be as well tolerated as NGF and Higher doses as measured by the clinician . A single IV or SC dose of 1 μg / kg NGF was injected in human patients. Observed to cause hyperalgesia and total or partial muscle pain at the injection site Thus, a preferred single IV or SC dose is preferably 1 μg / kg NG F, but taking steps to improve hyperalgesia and muscle pain as is well known in the art. Higher doses can be given. Preferred intake for peripheral neuropathy Students live at SC three times a week. 1 μg / kg or SC once a week. 3 μg / kg.   For the purposes of the present invention, the term "patient" includes both humans and other animals and organisms. No. The method is therefore applicable for both human therapy and veterinary applications.   The administration of the NGF mutant neurotrophin of the present invention can be performed, for example, orally, subcutaneously, or intravenously. Inside, below cerebrum, between nostrils, percutaneously, intraperitoneally, intramuscularly, in lung, in vagina, in rectum, in artery, Well-known indications for specific indications including, without limitation, intralesional, intraventricular, interventricular, and intraocular It can be done in various ways, such as by road. NGF mutant neurotrophin , Continuously administered by infusion into the liquid reservoir of the CNS, but by pump or transfer Pill injections using methods well known in the art, such as planting, are also acceptable. . In some examples, for example, in the treatment of trauma, NGF mutant neurotrophins Is applied directly as a solution or spray. You can also use sustained release systems it can. Generally, if the disease allows, NGF mutant Should be prescribed or administered. Administration can be continuous or intermittent You. Administration may be a constant or programmed circulating implantable pump, or It can be achieved by intermittent injections.   Semipermeable implantable membrane devices are useful as a means of transporting drugs to a particular environment. You. For example, cells that secrete soluble NGF variants can be encapsulated, Within the patient, for example, the brain or spinal cord (CSF) of a patient suffering from Parkinson's disease Can be implanted within. U.S. Pat. No. 4,892,538 to Aebischer et al .; Aebischer US Patent No. 5,011,472; Aebischer et al US Patent No. 5,106,627; International Patent Application WO 91/10425; International Patent Application WO 91/10470; Winn et al., Exper. Neurology, 113: 322 -329 (1991); Aebischer et al., Exper. Neurology, 111: 269-275 (1991); and Tresco et al., See ASAIO, 38: 17-23 (1992). Finally, the present invention provides a semipermeable membrane and a capsule within the membrane. Nerve damage or taught herein, including cells secreting a modified NGF variant A transplant device for preventing or treating damage to other cells, the membrane comprising NG F permeable to F variants and not permeable to patient-derived factors that are harmful to the cells. No. Patient's own cells transformed to produce NGF variants ex vivo Can be implanted directly into the patient without the optional encapsulation. Raw Methods for membrane encapsulation of cells that have been obtained are well known to those skilled in the art, and Preparation of cells and implantation into a patient can be easily accomplished as is well known in the art. it can. Preferably, the secreted NGF variant is human mature NG when the patient is human. It is an F-skeleton variant. The implant is preferably non-immunogenic and / or immune Prevents primary transplanted cells from being recognized by the immune system. For CNS transportation A preferred site of implantation is the cerebrospinal fluid of the spinal cord.   Pharmaceutical compositions of the invention include NGF variant neurons in a form suitable for administration to a patient. Contains trophin. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition is in a water-soluble form. Carrier, excipient, stabilizer, buffer, salt, antioxidant, hydrophilic polymer, amino Acids, hydrocarbons, ionic or non-ionic surfactants, and polyethylene or Contains physiologically acceptable substances such as propylene glycol. NGF mutant Neurotrophin exists in a time release form for implantation, or It is encapsulated in microcapsules using well-known methods.   NGF variants are preferably used to significantly increase the stability of these compositions. Formulated in a physiologically acceptable acetate buffer from pH 5 to pH 6. Acetic acid concentration is 0. 1 to 200 mM, more preferably 1 to 50 mM, or La Preferably in the range of 5 to 30 mM, and most preferably in the range of 10 to 20 mM. possible. One preferred embodiment has 20 mM acetic acid and the other is in solution. Has 10 mM acetic acid. Preferred vinegar to increase stability and buffer volume The acid salt is sodium acetate. Suitable pH ranges for the preparation of the compositions herein The box is between 5 and 6, preferably 5. 4 to 5. 9, more preferably 5. 5 to 5. 8 It is. The preferred pH is 5. 5, which increases stability and buffers capacity. Another preferred embodiment is pH5. 8   Optionally, but preferably, the formulation is a pharmaceutically acceptable salt, preferably chloride It preferably contains sodium at near physiological concentrations. Low concentration, e.g. 3M 0. Lower than 5M, preferably 0. 16 to 0. 20M NaCl, more preferred Or 0. 13 to 0. 15M is preferred. In a preferred embodiment, sodium chloride The concentration of lium is 136 mM. In another preferred embodiment, the concentration is 142 mM.   Optionally, the formulations of the present invention can include a pharmaceutically acceptable preservative. Ah In one embodiment, the concentration of the preservative is 0.1. 1 to 20%, typically in the v / v range It is. Suitable preservatives include those well known in the art of pharmacy. Benzil Alcohol, phenol, m-cresol, methylparaben, and propylparabe Is a preferred preservative. Benzyl alcohol leads to increased NGF stability It is a particularly preferred preservative. A particularly preferred benzyl alcohol concentration is 0.1. 7 From 1. 2%, more preferably 0. 8 to 1. 0%, and a particularly preferred concentration is 0. 9%.   Optionally, the formulations of the present invention can include a pharmaceutically acceptable surfactant. . Preferred surfactants are non-ionic surfactants. Preferred surfactants include , Tween 20 and pluronic acid (F68). F68 is an NGF mutation Particularly preferred for increasing body stability. A suitable surfactant concentration is 0.1 005 To 0. 02%. The preferred concentration for the surfactant is 0.1. 01%. Surfactants are used to minimize certain forms.   In a particularly preferred embodiment, the composition comprises 0.1. NGF at a concentration of 1 mg / ml Mutant, 20 mM, pH5. Sodium acetate at a concentration of 5; salt at a concentration of 136 mM Sodium chloride, and 0. Contains benzyl alcohol at a concentration of 9% (v / v). Also In another embodiment, the NGF variant concentration is 2. 0mg / ml, sodium acetate The system concentration is 10 mM, pH5. 5, and the sodium chloride concentration is 142 mM.   In another embodiment of the present invention, a pharmaceutically effective amount of an NGF variant and A vial containing the pharmaceutical composition of the invention, comprising a pharmaceutically acceptable buffer containing acetic acid Alternatively, a kit for administering an NGF variant, comprising a container, is provided. Preferred ba The vial volume is determined by the use of multiple doses, allowing repeated discontinuations of the sample. It is suitable for business. Increased stability achieved with formulations of the invention Thus, multiple dose liquid formulations are possible. Typically, multiple dose vials are Enough to provide a sufficient dose to one patient for one month, preferably one week. Would provide a simple formulation. For example, the volume of the composition will generally be And depending on the ease of use. 3 to 10. 0 ml, more preferably 1. 6 From 2. The range is 0 ml. For example, 1. The volume of 8 ml is 0,1. Up to 3μg / kg Or 0. If 1 μg / kg each is used, 7 or 24 doses each Can be given and is convenient. Contains photosensitizing components such as benzyl alcohol When present, the vial is protected from intense light. Generally, a dark refrigerator or It is sufficient to store the vial in an opaque box. However, the vial The wall can include a light transmission reducing material. For example, translucent amber or brown ba Ials or translucent vials can be used. As a preferred embodiment Thus, the vial contains a multiple dose formulation. Vial form selected The multi-dose liquid formulation comprises: 3 cc type I gas with 8 mL full capacity Can be filled into las vials. The choice of stopper depends on the formulation selected and the variety of ties. It will be based on the suitability of the tap stopper.   The compositions of the present invention are typically stored at 2-8 ° C. The formulation is shown here It is stable to many freeze-thaw cycles.   In another embodiment, the formulation is prepared at the acetic acid concentration described above. A preferred means for preparing the formulation is to dissolve large amounts of the NGF variant in the final formulation buffer. Dissolving the liquid. The final NGF variant concentration is determined by the absence of NGF variant. This is accomplished by using a buffer and adjusting the formulation appropriately.   The compositions herein, including lyophilized forms, are generally available that are known per se Prepared by mixing the components using a simple pharmaceutical mixing method. You. Similarly, standard lyophilization methods and equipment well known in the art are used. here Specific methods for preparing NGF variant pharmaceutical compositions of the invention include gel filtration or dialysis. In any one of several well-known buffer exchange methods, such as Purified NGF variants (according to standard protein purification schemes), preferably Involves utilizing a rhNGF variant.   The NGF variant-encoding gene constructs discussed here were transfected. Electroporation, calcium phosphate / DEAE dextran method, and Using any method known in the art, including without limitation cell guns, Target cells. The construct and the processed target cells are transformed with NGF Allogen-expressing target cells may be selected using the methods discussed, as transgenes. Used for the production of transgenic animals having the constructs described above. Can be. Alternatively, the NGF variant may be replaced with the NGF variant encoding nucleic acid. Can be transported by gene therapy. Recombinant NGF mutations in appropriate cells Selective expression of the body by a tissue-specific or inducible promoter, or It carries a recombinant NGF mutant gene, such as certain adenoviruses well known in the art. Controlled by producing a localized infection using a replication-defective virus Can be achieved using a modified NGF mutant gene.   In gene therapy applications, genes can be used in therapeutics, for example, to replace defective genes. The highly effective gene product is introduced intracellularly to achieve in vivo synthesis. The term "gene therapy" is a traditional treatment in which a continuous effect is achieved by a single treatment. Gene therapy and once or repeated treatment of therapeutically effective DNA or mRNA Including administration of gene therapy agents including administration. For introducing nucleic acids into living cells There are various methods available for this. The method comprises the steps of: Or changes depending on whether the nucleic acid is introduced in vivo into cells of the intended host. Become Suitable methods for introducing nucleic acids into mammalian cells in vitro are described in Posome use, electroporation, microinjection, cell lysis In this case, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation and the like are included. Currently preferred New In vivo gene transfer methods include viral (typically retroviral) vectors Using transfection and virus coat protein-liposome Mediated transfection (Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11: 2 05-210 (1993)), but naked DNA is also effective. In some cases, cell surface membrane proteins Antibodies specific for proteins or target cells, ligands for receptors on target cells It is desirable to provide a source of nucleic acids using reagents that target the target cells, such as New When using liposomes, cell surface membranes involved in endocytosis Protein binding proteins, such as capsidota, which is reactive for certain cell types Proteins or fragments thereof against proteins that are neutralized during cycling Antibodies that target intracellular localization and increase cell half-life And / or to facilitate uptake. Receptor mediated For example, Wu et al., J. Chem. Biol. Chem. , 262: 4429-4432 (1987); And Wargner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). . For literature on genetic manipulation and gene therapy protocols, see Anderson et al., Science. , 256: 808-813 (1992).   The biological utility of NGF is superior to that of NT-3. Therefore, the present invention Is a neurotrophy with the activity of NT-3 and the excellent biological utility of NGF Provide molecules. Furthermore, the present invention provides an unexpectedly superior advantage compared to previous factors. A neurotrophin molecule having total neurotrophin activity, and Further eliminating any problems associated with the mixture of individual neurotrophins Have the advantage.   The following examples are provided to more fully describe the methods of using the above described invention. FIG. 3 illustrates an optimal method that works and is also intended to implement various aspects of the invention. In each case, these embodiments serve to limit the true scope of the invention. It is not provided, but rather for illustrative purposes. All references in this specification Is hereby expressly incorporated herein in its entirety.                                  Example                                 Example I              Design and synthesis of NGF mutants that bind trkC Design of NGF mutant: complete mutation analysis of human NT-3 Detailed investigation of NT-3 binding epitope for its receptor trkC (101). The binding site is governed by a single residue, R103 (Fig. 3A). Analysis of the structural proximity of R103 revealed that the NT-3 / trkC interaction Important residues were identified: K81 and Q84 in beta chain C , T23 in the loop connecting beta strands A and A ', and has a smaller effect Two conserved residues in beta chain B, E55 and R57 (FIG. 2). , 3A). In mouse NGF, the corresponding residues of NT-3K81 and Q84 T81 and H84 (FIGS. 2 and 3B) are involved in NGF binding to trkA (55) and therefore they are considered to be involved in specificity. It is. In human NGF, V18, G23, T81 and H84 are trkA It has been shown to be involved in binding. Another non-conserved NT-3 residue, T23 Are located in conserved areas within each type of neurotrophin throughout the species However, it is diversified among NT-3, BDNF and NGF. Near T23 and Located on the same plane of the molecule are E18 and L20 (FIG. 3A). They are Although not directly involved in binding to trkC, NGF (V18 and V20) (Fig. 3B) and their structural differences in BDNF (118 and E20) Complement prevents binding to trkC. This is because NGF residues V18, V2 0, G23, T81 and H84 and their respective complements in NT-3. The body was suggested to be involved in determining specificity for trkC ( 101). Therefore, variants of NGF with NT-3 amino acids at these positions Constructed and analyzed for recruitment of trkC binding. Synthesis of NGF variants: NGF and NT-3 were previously cloned and sequenced. Production of double- and single-stranded DNA in E. coli, as well as cytomegalo Neurotrophin development in mammalian systems under the control of the ils promoter It was subcloned into a vector that allows for expression (83). On this vector Mutagenesis was performed according to the method of Kunkel (66). E. coli strain XL1- After transformation into Bleu (Stratagene, San Diego, CA), colonies were harvested from Sequena. s e version 2. 0kit (U. S. Biochemical Corp. , Cleveland, OH) Screening for the presence of the desired mutation by sequencing the NA I did. Complete DNA sequences encoding mature NGF and NGF variants Positive clones were confirmed. Use double-stranded DNA with QIAGEN DNA Purification Kit (Qiagen gen Inc. , Chatsworth CA) using XL-1 Bleu. Expression of wild-type and mutant neurotrophins: NGF or mutant coding sequence Plasmid DNA containing each was isolated from human embryos by calcium phosphate precipitation. It was introduced into the fetal kidney cell line 293 (70). 75% of fused cells are cultured in 15mm cells Using 10 μg of plasmid DNA and 1 μg of AdVA plasmid per dish Co-transfected and incubated in serum-containing medium for 15 hours. Then The medium was removed and 10 mg / L recombinant bovine insulin, 1 mg / L transfection The medium was replaced with a serum-free medium (PSO4) supplemented with serum and trace elements. 48 and After 96 hours, the supernatant was collected and Centriprep-10 filtration unit (Amicon, Berverly, MA) And concentrated approximately 20-fold using sterile filtration. Quantification of neurotrophin mutants: specific NGF ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Conventional method) is a hamster-derived protein A purified antiserum (Genentech, Inc. Based on , Followed by a standard ELISA method. Polyclonal serum It was used to reduce the ability of the mutants to be cross-reactive. Standard song Lines were measured using purified recombinant NGF.   The amount of the NGF mutant after concentration is 0. Change between 3 μg / ml and 30 μg / ml It has become. ELISA assays were performed on supernatants from mock transfected cells. Did not detect any NGF. For each expression set of NGF mutants, Live NGF expression was performed to obtain comparative wild-type concentrations for receptor binding studies. Quantification was performed by ELISA in parallel. All variants are expressed, quantified, and Assayed at least twice.                                Example II   Mutation in the central beta-strand bundle of NGF leads to a mutant that binds trkC   Mutants NGF1 and NGF2 were T81K and G23T / V18E / It has a V20L mutation. 5 point mutations in mutant NGF12 Combined. Expressing these three mutants, similarly NGF and NT-3, The ability to bind to the trkC extracellular domain was assayed.   Receptor immunoadhesin protein fused to immunoglobulin constant domain It was constructed using the combined human trkA and trkC extracellular domains (88). Conclusion The binding assay was performed as described using a 96-well plate format (88 )Carried out. The final concentration of labeled neurotrophin in each well is trk Approximately 30 pM for A and trkC binding assays. Purified recombinant human NT-3, BDNF and NGF (Genentech) were iodinated as described (1. 01). Usually, 20 μg of neurotrophin is added to 2000-3000 Ci / mm. ol range of specific activities. Store labeled material at 4 ° C and prepare Used within 2 weeks of the product. At least one mutant for each expression Were also assayed twice for binding affinity to the trkA and trkC receptors. . This method allows estimation of errors in affinity measurement for each mutant. Noh. All data was collected using the Kaleidagraph software package A series of data was analyzed by applying a four parameter fit method. The binding results in Table 3 are expressed as IC50mut / IC50wt ratio. . The IC50 is the mutant concentration leading to a 50% inhibition of the binding of native neurotrophin. Degrees.   In a competitive displacement binding assay, NT-3 wild-type showed 21% against trkC. . 0 ± 4. While showing an affinity of 9 pM, NGF was 3587 compared to NT-3. Binds to this receptor with a two-fold reduced affinity (Table 3). Mutant NGF 1 and NGF2 have 1036- and 291-fold lower affinities than NT-3, respectively. And bound to trkC (Table 3); which, when compared to NGF, respectively 3. Represents a 5-fold and 12-fold increase in affinity for trkC. NGF1 and NGF2 Parental to trkC when the mutation in was combined with mutant NGF12 Compatibility has been substantially increased in a cooperative manner. This mutant shows a comparative effect with NT-3. Go 14. Binds to trkC with only 7-fold reduced affinity when compared to NGF Represents a 244-fold increased affinity (Table 3). Table 3: Relative affinity of NGF variants for trkC and trkA                               Example III            NGF variants with mutations in the central beta-strand bundle                          Maintain trkA binding   Assay all NGF variants, NGF and NT-3 for trkA binding did. NGF shows an affinity of 33.9 ± 7.5 pM, while NT-3 shows an affinity for NGF. It bound with a 137-fold reduced affinity compared to it (Table 3). This decrease in affinity , Coincide with the initial result (101). Mutants NGF1, NGF2 and NGF12 are To trkA with 0.7-fold, 2.1-fold and 1.5-fold reduced affinity, respectively Bind (Table 3). This indicates that changes in NGF2 are slightly Changes in NGF1 while leading to reduced affinity lead to small increases in affinity. To indicate that When NGF1 and NGF2 are combined as NGF12, t The affinity of NGF12 for rkA is cumulative; NGF1 for trkC In contrast to the affinity of 2, they were synergistic when compared to NGF1 and NGF2 ( Table 3).                                Example IV                 Importance of individual residues for trkC specificity   To determine the importance of individual residues altered in NGF12 for specificity For this purpose, each of these residues was changed back to the NGF sequence. Mutant NG FR1, NGFR2, NGFR3, NGFR4 and NGFR5 (Table 3) The contribution of G23, V18, V20, T81 and H84 to the specificity was tested, respectively. Was. Mutant NGFR1 loses most of its ability to interact with trkC, GFR3 and NGFR5 have slightly reduced affinity while NGFR2 And NGFR4 had a similar affinity for trkC as NGF12 (Table 3). . These data indicate that the most important specificity determinant for trkC binding is T2 3 / G23, Q84 / H84 and L20 / V20 (NT3 / NGF) Suggested.                                 Example V          NGF12 variants with increased affinity for trkC   Comparison of the model of human NT-3 (101) and the X-ray structure of mouse NGF (59) Some residuals close to the major specificity determinant, the difference between the two molecules The group was revealed. Further increases the affinity of NGF12 for trkC For this reason, some of these residues were changed to similar NT-3 amino acids. NGF Adding F54Y / K57R changes to 12 improved trkC binding None (NGF125, Table 3). In contrast, adding Y79Q / F86Y , Increased binding 2-fold compared to NGF12 (NGF124, Table 3). NGF1 By changing these two residues individually against background 2, F86Y changes may be present. While showing a positive change, the Y79Q change was shown to be a detrimental change (NG F126 and NGF127, Table 3). Finally, the change in T29I was evaluated. NG In the context of F12, T29I gave a slight decrease in binding (NG Table 3) comparing NGF12 to F1123 shows that NGF124 and NGF In the 126 background, it improved binding slightly (versus NGF1234). To compare NGF124 mutant and NGF130 to NGF131 , Table 3). This placed 103 residues between 29 and 86 residues, so 59,8 This may be due to side chain interaction at positions 6 and 103 (FIG. 3). Instead, 29 And the side chain at position 86 interacts with the same amino acid in trkC, thereby They will affect each other via rkC amino acids.   Based on these data, two additional mutants were designed. Mutant N GF131 is V20L, G23T, V18E, T29I, H84Q and F86. Includes five changes in Y and has a 3.3-fold reduced affinity compared to NT-3 To bind to trkC. These changes did not affect trkA binding (Table 3). ). NGF126 and NGF131 bind equally well to trkC and trkA. Combine. Both mutants have the common V20L, G23T, H84Q and F86Y sudden mutations. Has mutations; NGF126 has additional V18E and T81K mutations On the other hand, NGF131 also has a T29I mutation. This is NG Changes in V20L, G23T, H84Q, and F86Y in F indicate trkC binding Suggests that it is the minimum required for replenishment. In fact, these four NGF130 with the mutation is tr, similar to NGF126 and NGF131. bound to kC (Table 3).                                Example VI          NGF mutant induces trkC receptor autophosphorylation   Ability of NGF variants to stimulate trk receptor autophosphorylation in PC12 cell line The force was measured. About 1 × 107PC12 cells (26) were prepared at 100 ng / ml. Treatment was performed at 37 ° C. for 5 minutes using neurotrophin. NP-40 plate dissolution And anti-trkA-specific polyclonal antiserum (Dr. Louis Reichardt, University of California, San Francisco) or anti-trkC specific polyclonal anti Immunoprecipitation using serum 656 (101) was performed as previously described. (26). Phosphotyrosine content was determined using monoclonal antibodies as previously described. Analyzed by Western blot using 4G10 (23; 26). All of Autophosphorylation assays should be reduced for each neurotrophin assayed. Both were performed twice.   PC12 cells engineered to continuously express rat trkC are trk Responds to NT-3 by inducing strong autophosphorylation of C and forming axonal outgrowth (26). Purified NGF (NGF / P) as well as the supernatant of NGF-expressing 293 cells (NGF / U) leads to a strong signal for trkA autophosphorylation (FIG. 4) while It did not induce rkC autophosphorylation (FIG. 5A). Purified NT-3 (NT-3 / P ) And the supernatant of NT-3 expressing 293 cells (NT-3 / U) were trkC autophosphorus. Induces oxidation (FIG. 5A) but not trkA (FIG. 4A). to trkC As predicted by the affinity of NGF12 for NGF12, this mutant Leading to a strong signal for phosphorylation (FIG. 5A), trkA autophosphorylation (Fig. 4A). Trk of mutant NGF1 and NGF2 The rather low affinity for C results in a weak signal in trkC autophosphorylation. Reflected (FIG. 5A). However, both mutants are still not comparable when compared to NGF Induces trkA receptor autophosphorylation with only slightly reduced activity (FIG. 4A).   Mutant NGFR1 and NGFR5 are autophosphorylated in PC12 / trkC cells NGFR1 leads to a very weak signal while NGFR1 The response of FR5 was between NGF12 and NGFR1 (FIG. 5B). these The results correlated with the measured affinity of the mutant for trkC. against trkC Mutants of NGF that further increase affinity (NGF123, NGF124, NGF GF125 and NGF1234) are similar to those derived by NT-3 A signal for trkC autophosphorylation was derived (FIG. 5B). against trkC And the three mutants that bind the most-NGF126, NGF130 and NGF13 1- is also responsible for the autophosphorylation of trkC (Fig. 5C), as well as trkA (Fig. 4B). Pulled out a strong signal for. These results show an increase in trkC NGF variants with different affinities are also present in model neuron-like cell lines. Can interact with the receptor. In addition, these cells , TrkA are also expressed, and both receptors (trkA and trkC) It is important to note that it competes with multifunctional ligands. NGF mutant While this could lead to the formation of a trkA / trkC heterodimer, this Does not lead to transphosphorylation of one receptor (90).                               Example VII             NGF mutant induces trkC cell signaling   Measuring the ability of NGF variants to stimulate differentiation of PC12 cells expressing trkC did. This indicates the ability of the mutant to induce trkC cell signaling. tr Approximately 10 expressing kCThreePC12 cells (26; 100) were transferred to a total of 2 ml. Plated on 35 mm collagen-coated tissue culture dishes containing medium. PC12 / trk C cells were treated with neurotrophins ranging from 250 pg / ml to 100 ng / ml. Assayed by concentration. The axonal-owning cell population was reduced in cell body length after three days. It was also determined by counting the number of cells, including measuring twice. all Was performed at least twice.   The results from the induction of axonal growth of PC12 / trkC cells indicate that binding and autophosphate (Table 4). PC12 / trkC cells are trkA and trkC While NT-3 possesses the first three after the application of neurotrophin. It has been previously shown that days lead to marked induction of axons but not NGF However, at day 10, NGF and NT-3 induce similar axonal growth ( 100). Thus, PC12 / trkC cells were evaluated for axons 3 days later. Mutants showing reduced binding to trkC also showed a reduced response. NG F12 has a dose-response that shifts to higher values compared to native NT-3. Mutants with the least binding shown (NGF1, NGF2, NGFR1 and N GFR5) does not reach maximal responsiveness even at the highest dose tested (Table 4). NGF126 has the same ability to guide axons as native NT-3, TrkC binding is identical through mutant NGF126, NGF130 and NGF131. Although abundant (Table 3), NGF126 is more effective at inducing axons; The largest at 1 ng / ml compared to 10 ng / ml for GF130 and NGF131. A response was reached (Table 4). In particular, these NGF variants show that trkA Inducing axons through trkC in an environment that competes with trkC did it. On day 10, NGF12, NGF1 and NGF2 mutants responded to trkA. As expected from the binding of these mutants, NGF ( (Data not shown) (Table 3). Table 4: Induction of axonal growth in PC12 cells expressing rat trkC Discussion   Neurotrophins interact with trk receptor tyrosine kinases Thus, a signal is transmitted into the cell (95). Both neurotrophin and trk Form a family of proteins with high homology. Within each family , Different members seem to have similar structures, but the two families Individual members interact with each other in a very specific way. Neurotrophy This intrinsic specificity of a component is necessary for its biological function and therefore Information on the mechanism of isomerism determinants provides information on the function and evolution of the neurotrophy family. Contribute to understanding.   Molecular modeling and alanine scan mutagenesis of human NT-3 (101), As well as the human trk domain deletion / substitution (102) The binding epitope of the system was determined. Previous studies have shown that receptor trkC Binding site of NT-3 depends on the R103 residue and additional nearby determinants It was revealed that they were controlled. Binding site extends around central β-strand bundle , The residues from the loop and the N-terminus, in contrast to the NGF binding site for trkA Does not include the first six residues of (FIG. 3). Non-conserved residues that form part of the binding site Include T23, K81 and Q84. Residue T2 with L18 and E20 3 through all species within each of the members of the neurotrophin family Although it is located in an area that is conserved, there are many among NT-3, NGF and BDNF. It has been diversified. Therefore, these five residues are responsible for NT-3 for trkC binding. Appear to be possible candidates for specificity determinants in. binds to trkC In order to test the importance of the NGF, the residues in NGF (V18, V20, G23, T 81 and H84) with the corresponding NT-3 amino acids (E18, L20, T23, K 81 and Q84) and convert the resulting protein NGF12 to complement trkC binding. Filling And trkC-mediated biological activity. NGF12 binds to trkC Induces autophosphorylation of trkC expressed on PC12 cells, Affinity for A was not lost (Tables 3, 4 and 5).   As shown here, the change from glycine 23 to threonine was due to NGF12 Shows the replenishment effect of. Each mutated residue individually returns to the original NGF amino acid Additional variants of altered NGF12 (ie E18V, L20V, T23G , K81T, Q84H) are the most important for trkC specificity in NT-3 The major determinant was T23, followed by Q84 and L20. Izu Without being limited to any one theory, the glycine in NGF The change to onin introduces a side chain that is essential for binding to trk; Changes in 3T affect changes in the backbone structure, thereby altering the structure of the side chain in the vicinity. Affect. At position 84, the change from histidine to glutamine is relative to trkC Glutamine side chains are essential for specific hydrogen bonding. It is important. Finally, the preference for leucine over valine at position 20 is due to the binding site It may be due to the rather stringent spatial requirements of hydrophobic interactions.   In addition to T23, Q84 and L20, the amino acid at position 86 is relative to trkC. Important for neurotrophin specificity. Add NT-3 residue to NGF12 Refers to a 4.5-fold improvement in binding to trkC, while affecting binding to trkA. (Variant NGF126, Table 3). Residue 86 is for trkC Close to the most important determinant for binding, R103 (FIG. 3), and also trk Confirm dominance of structural area for C recognition. In NGF, position 86 is Phenylalanine, and in NT-3 it is tyrosine, Without being limited to any one of these theories, the side chain hydroxyl group is trkC This suggests that it is involved in specific hydrogen bonding required for recognition.   Finally, residues 18 and 29 fine-tune the specificity of NT-3 for trkC. Adjust. The effect at position 29 appears to depend on the properties of the amino acid at position 86 . If the change in T29I was introduced into NGF12, which has F86, trkC binding was slightly reduced, while T29I was replaced by two other mutants (they (With Y86), the binding is slightly improved (NGF123 4 When comparing NGF124 to NGF130 and NGF130 to NGF131, Table 3). Like 86 residues, 29 residues are near the critical R103 (FIG. 3). . At position 18, the mutation in V18E contributes only slightly to trkC binding ( That is, NGF12 and NGFR2, Table 3). However, NGF126 and Comparison of the induction of axonal growth by NGF130 indicates that the Improved induction of axonal growth; NGF126 containing V18E Leads to axonal growth similar to native NT-3 (ie, 1 ng / ml for maximal response). NGF130, on the other hand, has a factor of 10 to elicit the maximum response. Neurotrophin was required (10 ng / ml) (Table 4).   In summary, the results presented here show that human NGF has a human NT-3 derived center. Conjugating a specific series of residues in the β-strand bundle of a non-cognate receptor (trkC ) Can be recruited while cognate receptors (trkA) It shows that the affinity for the protein is maintained. Major anomaly on NT-3 for trkC Sex determinants include L20, T23, Q84 and Y86. Residues E18 and And 129 will play a small role in specificity. Six residues are two Form a cluster: Q84 and Y86 are the most important involved in trkC binding Is located near R103, which is an important residue, and E18 and T23 are located together. It is far from the 103 cluster (Fig. 3). These are one of the theories Without limitation, trkC distinguishes between various neurotrophins Suggests using at least two unique spatially separated sites to I do.   Early mutation analysis of murine and human neurotrophins revealed that NGF The first five residues at the end are important for specific binding to trkA (55; 101; 98). NGF modification with N-terminus derived from NGF Constructing the variant, the resulting molecules MNTS-1 and PNT-1 are actually similar to NGF Affinity for trkA was acquired (101; 55). MNTS-1 becomes trkC The observation that the affinity for NT-3 is not lost indicates that the N-terminal residue of NT-3 is trkC-recognized. And the conclusion is that site-directed mutation of the NT-3 N-terminus Confirmed by provocation (101). This study examined the function and specificity of NT-3. To Establish the importance of residues located in the central β-strand bundle. As shown here, NT -3 non-conservative amino acids--T23 and Q84-- are substituted in NGF And recruit trkC binding. Furthermore, non-conservative NT-3 Amino acids--E18, L20, 129 and Y86--are also NGF variants / t Can contribute to the specificity of the rkC interaction, but compared to T23 and Q84 Shows a reduced effect. Using the NT-3 complement, these six residues in NGF Substituting groups maintains sufficient affinity for trkA. Presented here For some studies, the NT-3 residue in the central β-strand bundle affects specificity, while In NGF, the N-terminal residue appears to affect specificity.   Based on sequence conservation in NGF from different species, earlier studies showed that Y79, It has been proposed that T81 and H84 mediate the interaction of trkA and NGF. (55). In this study, residue 81 binds to trkA or trkC. Or no specificity (see NGF12 and NGFR4, Table 3), residue 84 was tr Important for kC specificity but not for trkA specificity (NG See F12 and NGFR5, Table 3). This study also included NGF residues 79 is not involved in trkA specificity while native human NG F variant (Y79) is slightly preferred compared to human NT-3 Q79 (NGF127, Table 3).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ウィンスロウ，ジョン ダブリュ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94018 エル グレナダ ピー．オー．ボックス 1232──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/19 C12P 21/02 C 1/21 (C12P 21/02 5/10 C12R 1:91) C12P 21 / 02 C12N 15/00 ZNAA // (C12P 21/02 5/00 A C12R 1:91) A61K 37/24 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL , IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Winslow, John W. United States California 94018 EL Grenada P. Oh. Box 1232

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ｔｒｋＣを結合することを特徴とする、ｔｒｋＣ結合を与えるアミノ酸Ｇ２ ３及びＨ８４、及びＶ１８またはＶ２０位のいずれかで置換を有するＮＧＦを含 むＮＧＦ変異体。 ２．Ｖ２０が置換されていることを特徴とする請求項１記載のＮＧＦ変異体。 ３．さらにＦ８６，Ｔ８１及びＴ２９のいずれか一つ以上の置換を含む請求項１ 記載のＮＧＦ変異体。 ４．置換が、Ｇ２３Ｔ、Ｇ２３Ｓ、Ｇ２３Ａ、Ｈ８４Ｑ、Ｈ８４Ｎ、Ｖ１８Ｅ、 Ｖ１８Ｄ、Ｖ１８Ｑ、Ｖ２０Ｌ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２０Ｍ及びＶ２０Ｔより成る群か ら選択されることを特徴とする請求項１記載のＮＧＦ変異体。 ５．置換が、Ｆ８６Ｙ、Ｆ８６Ｍ、Ｆ８６Ｗ、Ｆ８６Ｓ、Ｆ８６Ｔ、Ｔ８１Ｋ、 Ｔ２９Ｉ、Ｔ２９Ｖ、Ｔ２９Ｌ及びＴ８１Ｎより成る群から選択されることを特 徴とする請求項３記載のＮＧＦ変異体。 ６．ＮＧＦ１３０，ＮＧＦ１３１，ＮＧＦＲ２及びＮＧＦＲ３より成る群から選 択される請求項１記載のＮＧＦ変異体。 ７．ｔｒｋＢを結合することを特徴とする、さらにｔｒｋＢ結合を与えるアミノ 酸置換を含む請求項１記載のＮＧＦ変異体。 ８．ｔｒｋＢを与えるアミノ酸置換がＤ１６で存在することを特徴とする請求項 ７記載のＮＧＦ変異体。 ９．さらにｔｒｋＡ結合を減少または除去する１０アミノ酸Ｎ末端領域の修飾を 含む請求項１記載のＮＧＦ変異体。 １０．１０個のＮ末端アミノ酸の少なくとも一つが、ｔｒｋＡ結合を減少または 除去するために欠失または置換されていることを特徴とする請求項９記載のＮＧ Ｆ変異体。 １１．Ｎ末端アミノ酸ＳＳＳＨＰＩＦが、存在しないまたはＹＡＥＨＫＳを使用 して置換されていることを特徴とする請求項１０記載のＮＧＦ変異体。 １２．ｔｒｋＢを結合することを特徴とする、さらにｔｒｋＢ結合を与えるアミ ノ酸置換を含む請求項９記載のＮＧＦ変異体。 １３．ｔｒｋＢを与えるアミノ酸置換がＤ１６で存在することを特徴とする請求 項１２記載のＮＧＦ変異体。 １４．さらにアミノ酸Ｒ１１９またはＡ１２０またはその両者の欠失を含む請求 項１記載のＮＧＦ変異体。 １５．さらにアミノ酸Ｒ１１８の欠失を含む請求項１４記載のＮＧＦ変異体。 １６．請求項１記載のＮＧＦ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。 １７．請求項１６記載の核酸を含む発現ベクター。 １８．請求項１６記載の核酸を含む宿主細胞。 １９．ＮＧＦ変異体の発現を許容する条件の下で請求項１８記載の宿主細胞を培 養することを含む、ＮＧＦ変異体を生産する方法。 ２０．さらにＮＧＦ変異体を単離する工程を含む請求項１９記載の方法。 ２１．請求項１記載のＮＧＦ変異体及び担体を含む組成物。 ２２．請求項１記載のＮＧＦ変異体の治療上の有効量を哺乳動物に投与すること を含む、哺乳動物における神経疾患を治療する方法。 ２３．神経疾患が末梢神経障害であることを特徴とする請求項２２記載の方法。 ２４．神経疾患が糖尿病性末梢神経障害であることを特徴とする請求項２３記載 の方法。 ２５．神経疾患が毒素誘導性末梢神経障害であることを特徴とする請求項２３記 載の方法。 ２６．神経疾患が化学療法誘導性末梢神経障害であることを特徴とする請求項２ ５記載の方法。 ２７．末梢神経障害がＨＩＶ関連性であることを特徴とする請求項２３記載の方 法。 ２８．末梢神経障害が運動ニューロンに影響することを特徴とする請求項２３記 載の方法。 ２９．ｔｒｋＣを結合することを特徴とする、ｔｒｋＣ結合を与えるアミノ酸Ｖ １８，Ｖ２０，Ｇ２３及びＨ８４，及びＦ８６，Ｙ７９またはＴ８１位のいずれ かで置換を有するＮＧＦを含むＮＧＦ変異体。 ３０．Ｔ８１及びＦ８６の両者が置換されていることを特徴とする請求項２９記 載のＮＧＦ変異体。 ３１．さらにＴ２９の置換を含む請求項２９記載のＮＧＦ変異体。 ３２．ＮＧＦ１２６、ＮＧＦ１２３４、ＮＧＦ１２４、ＮＧＦ１２５、ＮＧＦ１ ２，ＮＧＦＲ４、及びＮＧＦ１２３、及びＮＧＦ１２７より成る群から選択され る請求項２９記載のＮＧＦ変異体。 ３３．さらにｔｒｋＢ結合を与えるアミノ酸置換、若しくはｔｒｋＡ結合を減少 または除去する修飾のいずれか、若しくは両者を含む請求項２９記載のＮＧＦ変 異体。 ３４．請求項２９記載のＮＧＦ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸 。 ３５．請求項３４記載の核酸を含む発現ベクター。 ３６．請求項３４記載の核酸を含む宿主細胞。 ３７．ＮＧＦ変異体の発現を許容する条件の下で請求項３６記載の宿主細胞を培 養することを含む、ＮＧＦ変異体を生産する方法。 ３８．さらにＮＧＦ変異体を単離する工程を含む請求項３７記載の方法。 ３９．請求項２９記載のＮＧＦ変異体及び担体を含む組成物。 ４０．請求項２９記載のＮＧＦ変異体の治療上の有効量を哺乳動物に投与するこ とを含む、哺乳動物における神経疾患を治療する方法。[Claims] 1. Amino acid G2 providing trkC binding, characterized by binding trkC 3 and H84, and NGF with substitutions at either V18 or V20. NGF mutant. 2. 2. The NGF variant according to claim 1, wherein V20 is substituted. 3. 2. The method of claim 1, further comprising the substitution of one or more of F86, T81 and T29. The described NGF variant. 4. Wherein the substitution is G23T, G23S, G23A, H84Q, H84N, V18E, V18D, V18Q, V20L, V20I, V20M and V20T The NGF variant according to claim 1, which is selected from the group consisting of: 5. The replacement is F86Y, F86M, F86W, F86S, F86T, T81K, In particular, it is selected from the group consisting of T29I, T29V, T29L and T81N. The NGF variant according to claim 3, which is a feature. 6. Selected from the group consisting of NGF130, NGF131, NGFR2 and NGFR3. 2. The NGF variant of claim 1, which is selected. 7. Amino acid that further provides trkB binding, characterized by binding trkB 2. The NGF variant of claim 1, comprising an acid substitution. 8. An amino acid substitution that confer trkB is present at D16. 8. The NGF variant according to 7. 9. Further modifications of the 10 amino acid N-terminal region to reduce or eliminate trkA binding 2. The NGF variant of claim 1 comprising: 10. At least one of the 10 N-terminal amino acids reduces trkA binding or 10. The NG according to claim 9, which has been deleted or substituted for removal. F mutant. 11. N-terminal amino acid SSSHPIF is absent or uses YAEHKS The NGF mutant according to claim 10, wherein the NGF mutant is substituted. 12. An amino acid that provides trkB binding, characterized by binding trkB. 10. The NGF variant of claim 9, comprising a no acid substitution. 13. Amino acid substitutions conferring trkB are present at D16. Item 13. The NGF mutant according to Item 12. 14． Claims further comprising the deletion of amino acids R119 or A120 or both. Item 7. An NGF mutant according to Item 1. 15. 15. The NGF variant according to claim 14, further comprising a deletion of amino acid R118. 16. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the NGF variant of claim 1. 17． An expression vector comprising the nucleic acid according to claim 16. 18. A host cell comprising the nucleic acid according to claim 16. 19. 19. culturing the host cell according to claim 18 under conditions permitting expression of the NGF mutant. A method of producing an NGF mutant, comprising feeding. 20. 20. The method of claim 19, further comprising the step of isolating the NGF variant. 21. A composition comprising the NGF variant according to claim 1 and a carrier. 22. Administering a therapeutically effective amount of the NGF variant of claim 1 to a mammal. A method for treating a neurological disease in a mammal, comprising: 23. 23. The method according to claim 22, wherein the neurological disease is a peripheral neuropathy. 24. 24. The neurological disorder is diabetic peripheral neuropathy. the method of. 25. 24. The method according to claim 23, wherein the neurological disease is toxin-induced peripheral neuropathy. The method described. 26. 3. The neurological disease is chemotherapy-induced peripheral neuropathy. 5. The method according to 5. 27. 24. The method according to claim 23, wherein the peripheral neuropathy is HIV-related. Law. 28. 24. The method according to claim 23, wherein the peripheral neuropathy affects motor neurons. The method described. 29. Amino acid V conferring trkC binding, characterized by binding trkC 18, V20, G23 and H84, and any of F86, Y79 or T81 position An NGF variant comprising NGF having a substitution with 30. 30. The method according to claim 29, wherein both T81 and F86 are substituted. NGF variants as indicated. 31. 30. The NGF variant of claim 29, further comprising a T29 substitution. 32. NGF126, NGF1234, NGF124, NGF125, NGF1 2, selected from the group consisting of NGFR4, and NGF123, and NGF127. 30. The NGF variant according to claim 29. 33. Amino acid substitutions that further confer trkB binding or reduce trkA binding 30. The NGF modification of claim 29, wherein the modification comprises one or both of the modifications to remove. Variant. 34. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the NGF variant of claim 29. . 35. An expression vector comprising the nucleic acid according to claim 34. 36. A host cell comprising the nucleic acid of claim 34. 37. 37. Cultivating the host cell of claim 36 under conditions permitting expression of the NGF mutant. A method of producing an NGF mutant, comprising feeding. 38. 38. The method of claim 37, further comprising the step of isolating the NGF variant. 39. A composition comprising the NGF variant according to claim 29 and a carrier. 40. Administering to a mammal a therapeutically effective amount of the NGF variant of claim 29. A method for treating a neurological disease in a mammal, comprising:
JP54714498A 1997-04-25 1998-04-23 NGF mutant Ceased JP2001527402A (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/845,541 US6333310B1 (en) 1994-06-03 1997-04-25 NGF variants
US84104597A 1997-04-29 1997-04-29
US08/841,045 1997-04-29
US08/845,541 1997-04-29
PCT/US1998/008242 WO1998049308A1 (en) 1997-04-25 1998-04-23 Ngf variants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001527402A true JP2001527402A (en) 2001-12-25

Family

ID=27126232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54714498A Ceased JP2001527402A (en) 1997-04-25 1998-04-23 NGF mutant

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0977860A1 (en)
JP (1) JP2001527402A (en)
AU (2) AU7154698A (en)
CA (1) CA2286558A1 (en)
IL (1) IL132251A0 (en)
WO (1) WO1998049308A1 (en)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6683058B1 (en) 1998-04-15 2004-01-27 Regents Of The University Of California Methods for therapy of neurodegenerative disease of the brain
US6656474B1 (en) * 1999-01-15 2003-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using a neurotrophin and its analogues for the treatment of gastrointestinal hypomotility disorders
AU2001271422B2 (en) * 2000-06-22 2005-12-22 Genentech, Inc. Agonist anti-trk-C monoclonal antibodies
NZ524070A (en) 2000-07-19 2008-05-30 Univ California Methods for therapy of neurodegenerative disease of the non-human brain
WO2004084836A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating taxol-induced gut disorder
WO2005040335A2 (en) * 2003-10-23 2005-05-06 Monika Holmberg A novel mutated nerve growth factor beta gene, proteins encoded thereby, and products and methods related thereto
US8309057B2 (en) 2005-06-10 2012-11-13 The Invention Science Fund I, Llc Methods for elevating neurotrophic agents
ITRM20060367A1 (en) * 2006-07-13 2008-01-14 Lay Line Genomics Spa HNGF MUTEIN THERAPEUTIC USES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS
IT201800009384A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-11 Cosmo Srl Peptide for cosmetic application

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728803A (en) * 1994-06-03 1998-03-17 Genentech, Inc. Pantropic neurotrophic factors

Also Published As

Publication number Publication date
EP0977860A1 (en) 2000-02-09
AU2002300365B9 (en) 2007-03-15
AU2002300365B2 (en) 2006-07-13
CA2286558A1 (en) 1998-11-05
AU7154698A (en) 1998-11-24
AU2002300365A1 (en) 2003-01-30
WO1998049308A1 (en) 1998-11-05
IL132251A0 (en) 2001-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6333310B1 (en) NGF variants
US6365373B2 (en) Nucleic acids encoding NGF variants
US8101571B2 (en) Treatment methods using NGF variants
RU2266129C2 (en) Method for treating neurodegenerative disorder or myelinogenesis disorder
DE69121208T2 (en) NEW NEUROTROPICAL FACTOR
CN1318084C (en) Neuroprotective peptides
UA66339C2 (en) Glial cells line-derived cut neurotrophic factor (gdnf), dna molecule coding gdnf, vector containing said dna molecule, host cell, a method for the preparation of cut gdnf, a pharmaceutical composition and a method for the treatment
CN102924585A (en) Neublastin variants
US20090018060A1 (en) Thymus-specific protein
US20050164948A1 (en) Methods of treatment with prosaposin-derived peptides
JP4493854B2 (en) Method for enhancing biological activity of a ligand
JP2001527402A (en) NGF mutant
US7144983B1 (en) Pantropic neurotrophic factors
WO1998039357A1 (en) Method of alleviating neuropathic pain
IE83306B1 (en) The ciliary neurotrophic factor receptor
US6809175B1 (en) Cadherin derived growth factor and its use
JP2001524944A (en) How to relieve neuropathic pain
Ip Regulation of expression of neurotrophic factors and their receptors during the formation of neuromuscular junction
Neet et al. Selectivity of Cell Signaling in the Neuronal Response Based on NGF Mutations and Peptidomimetics in the Treatment of Alzheimers Disease
TREANOR et al. Therapeutic Use of Neurotrophic

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050318

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070724

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071023

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20071211

A313 Final decision of rejection without a dissenting response from the applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A313

Effective date: 20080515

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20080624