JP2001526049A - 改良されたサイクルシークエンシング熱プロフィール - Google Patents
改良されたサイクルシークエンシング熱プロフィールInfo
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、サイクルシークエンシングからポリヌクレオチド配列決定反応産物を生成する、改良された方法に関し、そして本方法における使用のための種々の装置および試薬に関する。サイクルシークエンシングと組合せた「ステップダウン」熱プロフィールの使用が記載される。ステップダウン熱プロフィールは、各熱サイクルセットのアニーリング温度が、それに先行する熱サイクルセットのアニーリング温度を下回るようにしていくつかの熱サイクルセットを組合せることにより構成した。本発明の１つの実施態様は、複数の配列決定溶液調製物をステップダウン熱プロフィールに供すること（すなわち、反復される熱サイクルセットへさらすことであり、各熱サイクルセットは、それに先行する熱サイクルセットのアニーリング段階のアニーリング温度を下回るアニーリング温度を有する）により、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並行して生成する方法である。本発明の他の実施態様は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並行して生成するためのシステムを含む。このシステムは、（ｉ）ステップダウン熱プロフィールを実行するようにプログラムされているプログラム可能なサーマルサイクラー、および（ｉｉ）複数のポリヌクレオチド配列決定調製物を含む。本発明のさらなる実施態様は、ポリヌクレオチド配列決定反応調製物のセットを含み、これは本発明の方法において使用され得る。本発明の別の局面は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を生成するためのデバイスである。本発明のデバイスは、（ｉ）複数のポリヌクレオチド配列決定反応調製物チャンバー（各チャンバーは、配列決定プライマーを収容する）、（ｉｉ）共通液体流入口、および（ｉｉｉ）液体分配チャネル（このチャネルは、各々の配列決定反応調製物チャンバーを共通液体流入口に連結する）を備える。このデバイス中の、少なくとも２つの配列決定プライマーは、互いに少なくとも２℃異なるＴｍを有する。
Description
【０００１】 ポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、遺伝学的解析における中枢技術になっ
ている。ポリヌクレオチド配列決定のための多くの技術が開発されている。これ
ら技術の中で主要なものはサンガー配列決定であり、これは、電気泳動により解
析され得る配列決定反応産物の生成のためのチェーンターミネーターとして、２
’３’ジデオキシヌクレオチドの使用を含む。サンガー配列決定法の最近開発さ
れた変法が、サイクルシークエンシングである。サイクルシークエンシングは、
数ある箇所の中でとりわけ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ７：４９４−４９９（１９８９）およびＭｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：８８−８９（１９８９）に記載される。サイクル
シークエンシングは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用、ならびに配列決定反応
産物の線形増幅を達成するための、配列決定プライマーのアニーリング、伸長、
および変性という反復サイクルを含む。サイクルシークエンシングは、配列決定
の鋳型が少量で存在する場合に、特に有用である。同一のサーマルサイクラー装
置において、並行していくつかのサイクルシークエンシング反応を実行すること
を試みる場合に、困難が生じ得る。これらの困難は、異なる配列決定プライマー
のＴｍ間の差異から生じる。異なるＴｍを有するプライマーは、異なるパラメー
ターを有する熱サイクル手順を、大量の有用な配列情報を生じるために必要とす
る。この、異なるプライマーのための異なる熱サイクルパラメーターの必要性に
より、有意に異なるＴｍを有するプライマーを用いるサイクルシークエンシング
反応をサーマルサイクラー装置の連続実行（または複数の装置の使用）において
実行することが、必要である。サイクルシークエンシングの使用に関する別の問
題は、（例えば、非特異的プライミングから生じる）配列決定人工産物の生成で
あり、最善でない熱サイクルパラメーターの使用により引き起こされる。
ている。ポリヌクレオチド配列決定のための多くの技術が開発されている。これ
ら技術の中で主要なものはサンガー配列決定であり、これは、電気泳動により解
析され得る配列決定反応産物の生成のためのチェーンターミネーターとして、２
’３’ジデオキシヌクレオチドの使用を含む。サンガー配列決定法の最近開発さ
れた変法が、サイクルシークエンシングである。サイクルシークエンシングは、
数ある箇所の中でとりわけ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ７：４９４−４９９（１９８９）およびＭｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：８８−８９（１９８９）に記載される。サイクル
シークエンシングは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用、ならびに配列決定反応
産物の線形増幅を達成するための、配列決定プライマーのアニーリング、伸長、
および変性という反復サイクルを含む。サイクルシークエンシングは、配列決定
の鋳型が少量で存在する場合に、特に有用である。同一のサーマルサイクラー装
置において、並行していくつかのサイクルシークエンシング反応を実行すること
を試みる場合に、困難が生じ得る。これらの困難は、異なる配列決定プライマー
のＴｍ間の差異から生じる。異なるＴｍを有するプライマーは、異なるパラメー
ターを有する熱サイクル手順を、大量の有用な配列情報を生じるために必要とす
る。この、異なるプライマーのための異なる熱サイクルパラメーターの必要性に
より、有意に異なるＴｍを有するプライマーを用いるサイクルシークエンシング
反応をサーマルサイクラー装置の連続実行（または複数の装置の使用）において
実行することが、必要である。サイクルシークエンシングの使用に関する別の問
題は、（例えば、非特異的プライミングから生じる）配列決定人工産物の生成で
あり、最善でない熱サイクルパラメーターの使用により引き起こされる。
【０００２】 サイクルシークエンシングに関する以上の問題を考慮して、複数のサイクルシ
ークエンシング反応を並行して実行するための改良された方法およびシステムを
提供することが目的である。サイクルシークエンシングに関連する人工産物の数
を減少するための新しい技術を開発することもまた目的である。
ークエンシング反応を並行して実行するための改良された方法およびシステムを
提供することが目的である。サイクルシークエンシングに関連する人工産物の数
を減少するための新しい技術を開発することもまた目的である。
【０００３】 （要旨） 本発明は、サイクルシークエンシングからのポリヌクレオチド配列決定反応産
物の生成の改良された方法に関し、そして本方法における使用のための種々の装
置および試薬に関する。サイクルシークエンシングに組合せた「ステップダウン
」熱プロフィールの使用が記載される。ステップダウン熱プロフィールは、各熱
サイクルセットのアニーリング温度が、それに先行する熱サイクルセットのアニ
ーリング温度よりも低いようにしていくつかの熱サイクルセットを組合せること
により構成される。本発明を使用して、異なるＴｍを有する配列決定プライマー
から生成される複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を、並行して生成し得
る。本発明を使用して、単一のポリヌクレオチド配列決定反応産物から優れた配
列情報を得ることもできる。
物の生成の改良された方法に関し、そして本方法における使用のための種々の装
置および試薬に関する。サイクルシークエンシングに組合せた「ステップダウン
」熱プロフィールの使用が記載される。ステップダウン熱プロフィールは、各熱
サイクルセットのアニーリング温度が、それに先行する熱サイクルセットのアニ
ーリング温度よりも低いようにしていくつかの熱サイクルセットを組合せること
により構成される。本発明を使用して、異なるＴｍを有する配列決定プライマー
から生成される複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を、並行して生成し得
る。本発明を使用して、単一のポリヌクレオチド配列決定反応産物から優れた配
列情報を得ることもできる。
【０００４】 本発明の１つの実施態様は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並
行して生成する方法であり、それは複数の配列決定溶液調製物をステップダウン
熱プロフィールに供す（すなわち、反復される熱サイクルセットにさらす）こと
による。ここで各熱サイクルセットは、それに先行する熱サイクルセットのアニ
ーリング段階のアニーリング温度よりも低いアニーリング温度を有する。ある熱
セットにおける熱サイクルは、そのアニーリング温度とは異なる温度で、別々の
伸長段階を必要に応じて有し得る。続く熱サイクルセットの伸長段階での伸長温
度もまた、先行の熱サイクルセットの伸長段階の伸長温度よりも低いことがあり
得る。
行して生成する方法であり、それは複数の配列決定溶液調製物をステップダウン
熱プロフィールに供す（すなわち、反復される熱サイクルセットにさらす）こと
による。ここで各熱サイクルセットは、それに先行する熱サイクルセットのアニ
ーリング段階のアニーリング温度よりも低いアニーリング温度を有する。ある熱
セットにおける熱サイクルは、そのアニーリング温度とは異なる温度で、別々の
伸長段階を必要に応じて有し得る。続く熱サイクルセットの伸長段階での伸長温
度もまた、先行の熱サイクルセットの伸長段階の伸長温度よりも低いことがあり
得る。
【０００５】 本発明の他の実施態様は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並行し
て生成するためのシステムを含む。このシステムは、（ｉ）ステップダウン熱プ
ロフィールを実行するようにプログラムされた、プログラム可能なサーマルサイ
クラーおよび（ｉｉ）複数のポリヌクレオチド配列決定調製物を含む。
て生成するためのシステムを含む。このシステムは、（ｉ）ステップダウン熱プ
ロフィールを実行するようにプログラムされた、プログラム可能なサーマルサイ
クラーおよび（ｉｉ）複数のポリヌクレオチド配列決定調製物を含む。
【０００６】 本発明の他の実施態様は、本発明の方法において使用され得るポリヌクレオチ
ド配列決定反応調製物のセットを含む。このセットを形成するポリヌクレオチド
配列決定反応調製物の各々は、配列決定プライマーを有する。このセットにおけ
る少なくとも２つの異なる配列決定プライマーは、少なくとも２℃互いに異なる
Ｔｍを有する。
ド配列決定反応調製物のセットを含む。このセットを形成するポリヌクレオチド
配列決定反応調製物の各々は、配列決定プライマーを有する。このセットにおけ
る少なくとも２つの異なる配列決定プライマーは、少なくとも２℃互いに異なる
Ｔｍを有する。
【０００７】 本発明の別の局面は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を生成するた
めのデバイスである。本発明のデバイスは、（ｉ）複数のポリヌクレオチド配列
決定反応調製物チャンバー（各チャンバーは配列決定プライマーを収容する）、
（ｉｉ）共通液体流入口、および（ｉｉｉ）液体分配チャネル（このチャネルは
、各々の配列決定反応調製物チャンバーを共通液体流入口に連結する）を備える
。このデバイスにおいて少なくとも２つの配列決定プライマーが、少なくとも２
℃互いに異なるＴｍを有する。
めのデバイスである。本発明のデバイスは、（ｉ）複数のポリヌクレオチド配列
決定反応調製物チャンバー（各チャンバーは配列決定プライマーを収容する）、
（ｉｉ）共通液体流入口、および（ｉｉｉ）液体分配チャネル（このチャネルは
、各々の配列決定反応調製物チャンバーを共通液体流入口に連結する）を備える
。このデバイスにおいて少なくとも２つの配列決定プライマーが、少なくとも２
℃互いに異なるＴｍを有する。
【０００８】 （定義） 「サイクルシークエンシング」の記述は、多くの箇所の中でとりわけ、Ｍｕｒ
ｒａｙ Ｖ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１７：８８８９（１９８９）に
見出され得る。代表的には、サイクルシークエンシングは、以下の工程を含む、
ポリヌクレオチド配列決定を生じる技術である：（ａ）プライムされた鋳型を形
成するために、配列決定のための鋳型に対してプライマーオリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズする工程、（ｂ）そのプライマーを、ＤＮＡポリメラーゼを用い
て伸長する工程、（ｃ）その伸長反応を、チェーンターミネーター（例えば、ジ
デオキシターミネーター）を用いて終了する工程、（ｄ）プライムされた鋳型を
変性する工程、（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）を複数サイクルの間繰り返す工程。
ｒａｙ Ｖ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１７：８８８９（１９８９）に
見出され得る。代表的には、サイクルシークエンシングは、以下の工程を含む、
ポリヌクレオチド配列決定を生じる技術である：（ａ）プライムされた鋳型を形
成するために、配列決定のための鋳型に対してプライマーオリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズする工程、（ｂ）そのプライマーを、ＤＮＡポリメラーゼを用い
て伸長する工程、（ｃ）その伸長反応を、チェーンターミネーター（例えば、ジ
デオキシターミネーター）を用いて終了する工程、（ｄ）プライムされた鋳型を
変性する工程、（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）を複数サイクルの間繰り返す工程。
【０００９】 用語「熱プロフィール」は、サイクルシークエンシング反応からポリヌクレオ
チド配列決定反応産物を生成するために実行される全ての熱サイクルの合計をい
う。例えば、熱プロフィールのグラフ表示を図１に示す。
チド配列決定反応産物を生成するために実行される全ての熱サイクルの合計をい
う。例えば、熱プロフィールのグラフ表示を図１に示す。
【００１０】 本明細書中に定義される「熱サイクル」は、規定された容積において温度を変
化させるプロセスであり、このプロセスは、以下の３つの段階により特徴付けら
れる：アニーリング温度と呼ばれる温度で起こるアニーリング段階（鋳型に対す
るプライマーのアニーリングのため）、伸長温度と呼ばれる温度で起こる伸長段
階（アニールされたプライマーの伸長のため）および変性温度と呼ばれる温度で
起こる変性段階（伸長されたプライマーおよび鋳型の変性のため）。アニーリン
グ段階および伸長段階は、単一の温度で起こる単一の段階に併合し得る；この併
合されたアニーリング段階および伸長段階を、ひとまとめにしてアニーリング段
階と呼ぶ。各段階は、特定の時間の間起こる。従って、所定の熱サイクルは、３
つの温度パラメーターおよび３つの時間パラメーターにより特徴付けられ得るか
、または併合されたアニーリングおよび伸長段階を有する、本発明の実施態様に
おいては、所定の熱サイクルは、２つの温度パラメーターおよび２つの時間パラ
メーターにより特徴付けられ得る。
化させるプロセスであり、このプロセスは、以下の３つの段階により特徴付けら
れる：アニーリング温度と呼ばれる温度で起こるアニーリング段階（鋳型に対す
るプライマーのアニーリングのため）、伸長温度と呼ばれる温度で起こる伸長段
階（アニールされたプライマーの伸長のため）および変性温度と呼ばれる温度で
起こる変性段階（伸長されたプライマーおよび鋳型の変性のため）。アニーリン
グ段階および伸長段階は、単一の温度で起こる単一の段階に併合し得る；この併
合されたアニーリング段階および伸長段階を、ひとまとめにしてアニーリング段
階と呼ぶ。各段階は、特定の時間の間起こる。従って、所定の熱サイクルは、３
つの温度パラメーターおよび３つの時間パラメーターにより特徴付けられ得るか
、または併合されたアニーリングおよび伸長段階を有する、本発明の実施態様に
おいては、所定の熱サイクルは、２つの温度パラメーターおよび２つの時間パラ
メーターにより特徴付けられ得る。
【００１１】 熱サイクルセットは、本明細書中では、同一のアニーリング温度パラメーター
および伸長温度パラメーターを用いる、１回以上連続的に実行される熱サイクル
であると定義する。熱サイクルセットを続ける熱サイクルの全ての温度パラメー
ターは、互いに同一である。好ましくは、熱サイクルセットを続ける所定の熱サ
イクルの全ての時間パラメーターおよび全ての温度パラメーターは、互いに同一
である。熱サイクルは単一の熱サイクルから構成され得、そのような熱サイクル
セットを、単一熱サイクルセットと呼ぶ。
および伸長温度パラメーターを用いる、１回以上連続的に実行される熱サイクル
であると定義する。熱サイクルセットを続ける熱サイクルの全ての温度パラメー
ターは、互いに同一である。好ましくは、熱サイクルセットを続ける所定の熱サ
イクルの全ての時間パラメーターおよび全ての温度パラメーターは、互いに同一
である。熱サイクルは単一の熱サイクルから構成され得、そのような熱サイクル
セットを、単一熱サイクルセットと呼ぶ。
【００１２】 用語「配列決定反応調製物」は、サイクルシークエンシング反応からポリヌク
レオチド配列決定反応産物を生成するために十分である試薬の混合物（代表的に
は溶液中）をいう。配列決定反応調製物の例示は以下である：配列決定プライマ
ーを含む配列決定反応調製物、適切な反応緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、
２’３’ジデオキシヌクレオチド（またはその機能的等価物）、およびデオキシ
ヌクレオチド。プライマーのジデオキシヌクレオチドは、蛍光ベースのポリヌク
レオチド配列分析システムにおける配列決定反応産物の分析のために準備するた
めに蛍光標識され得る。例えば、米国特許第５，５４３，０２６号、同５，４８
３，０７５号、同５，４３４，０４９号、同５，３０７，１４８号、および同５
，２６８，０８０号を参照のこと。配列決定反応調製物は、配列決定のための鋳
型を含んでもよいし、または含まなくてもよい。もちろん、配列決定のための鋳
型は、配列決定反応産物が生成されるべき場合は、必須である。
レオチド配列決定反応産物を生成するために十分である試薬の混合物（代表的に
は溶液中）をいう。配列決定反応調製物の例示は以下である：配列決定プライマ
ーを含む配列決定反応調製物、適切な反応緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、
２’３’ジデオキシヌクレオチド（またはその機能的等価物）、およびデオキシ
ヌクレオチド。プライマーのジデオキシヌクレオチドは、蛍光ベースのポリヌク
レオチド配列分析システムにおける配列決定反応産物の分析のために準備するた
めに蛍光標識され得る。例えば、米国特許第５，５４３，０２６号、同５，４８
３，０７５号、同５，４３４，０４９号、同５，３０７，１４８号、および同５
，２６８，０８０号を参照のこと。配列決定反応調製物は、配列決定のための鋳
型を含んでもよいし、または含まなくてもよい。もちろん、配列決定のための鋳
型は、配列決定反応産物が生成されるべき場合は、必須である。
【００１３】 用語「Ｔｍ」は、所定の環境（例えば、サイクルシークエンシングのために使
用される緩衝液）において完璧に相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ
される場合、所定のオリゴヌクレオチドの変性温度をいう。Ｔｍは、経験的に計
算し得る。都合上、所定のオリゴヌクレオチドプライマーについてのＴｍを、推
定し得る。このオリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ以外である場合、Ｔｍの
計算は、この異なるヌクレオチドの結合特性における差異を考慮に入れ得る。Ｔ
ｍを合理的に推定し得ない本発明の実施態様において、Ｔｍは、当業者に周知の
技術（例えば、変性の際のＵＶ吸収シフト測定）を使用して経験的に計算され得
る。
用される緩衝液）において完璧に相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ
される場合、所定のオリゴヌクレオチドの変性温度をいう。Ｔｍは、経験的に計
算し得る。都合上、所定のオリゴヌクレオチドプライマーについてのＴｍを、推
定し得る。このオリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ以外である場合、Ｔｍの
計算は、この異なるヌクレオチドの結合特性における差異を考慮に入れ得る。Ｔ
ｍを合理的に推定し得ない本発明の実施態様において、Ｔｍは、当業者に周知の
技術（例えば、変性の際のＵＶ吸収シフト測定）を使用して経験的に計算され得
る。
【００１４】 本明細書中で使用される場合、用語「配列決定反応産物」は、鎖伸長終結ヌク レオチドアナログを用いてサンガー型配列決定反応を行った後に生成される標識
ポリヌクレオチドをいう。配列決定反応産物の特徴付け（例えば電気泳動による
）を、実際のヌクレオチド配列を確認するために使用する。
ポリヌクレオチドをいう。配列決定反応産物の特徴付け（例えば電気泳動による
）を、実際のヌクレオチド配列を確認するために使用する。
【００１５】 （特定の実施態様の説明） 本発明の種々の実施態様は、特定の熱プロフィールをサイクルシークエンシン
グ反応のために使用することにより、サイクルシークエンシングを通じてポリヌ
クレオチド配列決定情報を生成する方法に関する。直接または間接的のいずれか
で、本発明の実施態様に組み込まれる熱プロフィールは、複数の連続して実施さ
れる熱サイクルを使用し、各熱サイクルはそれに先行する熱サイクルのアニーリ
ング温度よりも低いアニーリング温度を有する。このような熱プロフィールを、
本明細書中で「ステップダウン」熱プロフィールと呼ぶ。
グ反応のために使用することにより、サイクルシークエンシングを通じてポリヌ
クレオチド配列決定情報を生成する方法に関する。直接または間接的のいずれか
で、本発明の実施態様に組み込まれる熱プロフィールは、複数の連続して実施さ
れる熱サイクルを使用し、各熱サイクルはそれに先行する熱サイクルのアニーリ
ング温度よりも低いアニーリング温度を有する。このような熱プロフィールを、
本明細書中で「ステップダウン」熱プロフィールと呼ぶ。
【００１６】 本発明の特定の実施態様は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応を並行して
実行するために使用され得る。本発明の他の実施態様は、個々のサイクルシーク
エンシング反応を実行するために使用され得る。本発明の実施態様は、ポリヌク
レオチド配列決定反応産物を生成する方法、複数のポリヌクレオチド配列決定反
応産物を並行して生成するためのシステム、本方法に関する使用のためのポリヌ
クレオチド配列決定反応調製物のセット、および複数のポリヌクレオチド配列決
定反応産物を並行して生成するためのデバイス、を含む。
実行するために使用され得る。本発明の他の実施態様は、個々のサイクルシーク
エンシング反応を実行するために使用され得る。本発明の実施態様は、ポリヌク
レオチド配列決定反応産物を生成する方法、複数のポリヌクレオチド配列決定反
応産物を並行して生成するためのシステム、本方法に関する使用のためのポリヌ
クレオチド配列決定反応調製物のセット、および複数のポリヌクレオチド配列決
定反応産物を並行して生成するためのデバイス、を含む。
【００１７】 本発明の実施態様は、「ステップダウン」熱プロフィールと本明細書中で呼ば
れる特定の型の熱プロフィールの使用に関する。各ステップダウン熱プロフィー
ルは、少なくとも２つの熱サイクルセットを含む。代表的には、ステップダウン
熱プロフィールは、１０〜４０の熱サイクルセットを含む。ステップダウン熱プ
ロフィールの各熱サイクルセット（最初の熱サイクルセット以外）は、それに先
行する熱サイクルセットの熱サイクルのアニーリング温度よりも低いアニーリン
グ温度を有する熱サイクルからなる。別々のアニーリング段階および伸長段階を
有する熱サイクルを使用する、本発明の実施態様において、ステップダウン熱プ
ロフィールの各熱サイクルセット（最初の熱サイクルセット以外）は、好ましく
は、それに先行する熱サイクルセットの伸長温度よりも低い伸長温度を有する熱
サイクルからなる。次の熱サイクルセットにおいて減少するアニーリング温度お
よび減少する伸長温度を有するステップダウン熱プロフィールを使用する、本発
明の実施態様において、連続する熱サイクルセットのアニーリング温度間の温度
減少の増分は、好ましくは、連続する熱サイクルセットの伸長温度間の温度減少
の増分と同一である。
れる特定の型の熱プロフィールの使用に関する。各ステップダウン熱プロフィー
ルは、少なくとも２つの熱サイクルセットを含む。代表的には、ステップダウン
熱プロフィールは、１０〜４０の熱サイクルセットを含む。ステップダウン熱プ
ロフィールの各熱サイクルセット（最初の熱サイクルセット以外）は、それに先
行する熱サイクルセットの熱サイクルのアニーリング温度よりも低いアニーリン
グ温度を有する熱サイクルからなる。別々のアニーリング段階および伸長段階を
有する熱サイクルを使用する、本発明の実施態様において、ステップダウン熱プ
ロフィールの各熱サイクルセット（最初の熱サイクルセット以外）は、好ましく
は、それに先行する熱サイクルセットの伸長温度よりも低い伸長温度を有する熱
サイクルからなる。次の熱サイクルセットにおいて減少するアニーリング温度お
よび減少する伸長温度を有するステップダウン熱プロフィールを使用する、本発
明の実施態様において、連続する熱サイクルセットのアニーリング温度間の温度
減少の増分は、好ましくは、連続する熱サイクルセットの伸長温度間の温度減少
の増分と同一である。
【００１８】 本発明は、ステップダウン熱プロフィールにおける連続する熱サイクルのアニ
ーリング温度間または伸長温度間の、多くの異なる温度増分を含む。一般に、こ
の増分は、０．１℃〜３．０℃の範囲にある。好ましくは、この温度増分は、０
．５℃〜１．５℃の範囲にあり、１．０℃の温度増分が特に好ましい。
ーリング温度間または伸長温度間の、多くの異なる温度増分を含む。一般に、こ
の増分は、０．１℃〜３．０℃の範囲にある。好ましくは、この温度増分は、０
．５℃〜１．５℃の範囲にあり、１．０℃の温度増分が特に好ましい。
【００１９】 所定のステップダウン熱プロフィールの連続する熱サイクルセットのアニーリ
ング温度間または伸長温度間の温度増分は、互いに同一であってもよいしまたは
異なっていてもよい。好ましい実施態様において、所定のステップダウン熱プロ
フィールの連続する熱サイクルセットのアニーリング温度（および、この実施態
様において別々の伸長温度段階を使用する場合、伸長温度も）間の温度増分は、
互いに同一である。最初の熱サイクルの熱サイクルのアニーリング温度は、並行
して処理される配列決定調製物のセット中で最も高いＴｍを有する配列決定プラ
イマーの推定Ｔｍと同一であるかまたはこれよりも高い（一般に１℃〜１５℃高
い）。熱プロフィール中の最高アニーリング温度と最低アニーリング温度の間の
差異は、配列決定調製物のセット中の特定のプライマーのＴｍに従って変化し、
この配列決定調製物のセットは、全ての鋳型−プライマーの組み合わせから配列
産物生成のために準備するために並行して処理される。
ング温度間または伸長温度間の温度増分は、互いに同一であってもよいしまたは
異なっていてもよい。好ましい実施態様において、所定のステップダウン熱プロ
フィールの連続する熱サイクルセットのアニーリング温度（および、この実施態
様において別々の伸長温度段階を使用する場合、伸長温度も）間の温度増分は、
互いに同一である。最初の熱サイクルの熱サイクルのアニーリング温度は、並行
して処理される配列決定調製物のセット中で最も高いＴｍを有する配列決定プラ
イマーの推定Ｔｍと同一であるかまたはこれよりも高い（一般に１℃〜１５℃高
い）。熱プロフィール中の最高アニーリング温度と最低アニーリング温度の間の
差異は、配列決定調製物のセット中の特定のプライマーのＴｍに従って変化し、
この配列決定調製物のセットは、全ての鋳型−プライマーの組み合わせから配列
産物生成のために準備するために並行して処理される。
【００２０】 ステップダウン熱プロフィールの各熱サイクルセット中の熱サイクルの数は、
互いに同一であってもよいしまたは異なっていてもよい。本発明の好ましい実施
態様において、ステップダウン熱プロフィールの各熱サイクルセット中の熱サイ
クルの数は、同一である。ステップダウン熱プロフィールの熱サイクルセット中
の熱サイクルの数は、変動できる。代表的に（必ずではないが）、ステップダウ
ン熱プロフィールの熱サイクルセット中の熱サイクルの数は、１〜１０の範囲（
およびその両端を含む範囲）、例えば１〜５および１〜３にある。ステップダウ
ン熱プロフィールは、一連の単一の熱サイクルセットから構成され得る。
互いに同一であってもよいしまたは異なっていてもよい。本発明の好ましい実施
態様において、ステップダウン熱プロフィールの各熱サイクルセット中の熱サイ
クルの数は、同一である。ステップダウン熱プロフィールの熱サイクルセット中
の熱サイクルの数は、変動できる。代表的に（必ずではないが）、ステップダウ
ン熱プロフィールの熱サイクルセット中の熱サイクルの数は、１〜１０の範囲（
およびその両端を含む範囲）、例えば１〜５および１〜３にある。ステップダウ
ン熱プロフィールは、一連の単一の熱サイクルセットから構成され得る。
【００２１】 本発明の１つの実施態様は、ステップダウン熱プロフィールを使用してポリヌ
クレオチド配列決定反応産物を生成することである。この方法は、ポリヌクレオ
チド配列決定調製物をステップダウン熱プロフィールにさらす工程を包含する。
サイクルシークエンシングのためのステップダウン熱プロフィールの使用は、配
列決定プライマーとその同種の鋳型との間の不適切なアニーリングにより生じる
問題を避ける。従って、通常よりも大量の正確にアニールされた（すなわち、所
望の部位で、かつ所望の様式でアニールされた）プライマー−鋳型複合体が形成
され、それにより配列決定産物より得られる改良された情報を生じる。ステップ
ダウン熱プロフィールが、最適温度を下回って起こり得るプライマー−鋳型アニ
ーリングを生じると仮定すると、これら種々の実施態様により得られる優れた配
列決定の結果は意外である。
クレオチド配列決定反応産物を生成することである。この方法は、ポリヌクレオ
チド配列決定調製物をステップダウン熱プロフィールにさらす工程を包含する。
サイクルシークエンシングのためのステップダウン熱プロフィールの使用は、配
列決定プライマーとその同種の鋳型との間の不適切なアニーリングにより生じる
問題を避ける。従って、通常よりも大量の正確にアニールされた（すなわち、所
望の部位で、かつ所望の様式でアニールされた）プライマー−鋳型複合体が形成
され、それにより配列決定産物より得られる改良された情報を生じる。ステップ
ダウン熱プロフィールが、最適温度を下回って起こり得るプライマー−鋳型アニ
ーリングを生じると仮定すると、これら種々の実施態様により得られる優れた配
列決定の結果は意外である。
【００２２】 本発明の別の局面は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並行して生
成する方法を提供することである。この方法は、少なくとも２つのポリヌクレオ
チド配列決定調製物をステップダウン熱プロフィールにさらす工程を包含する。
複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並行して生成するためのステップダ
ウン熱プロフィールの使用は、都合がよい。なぜならば、数ある理由の中でもと
りわけ、有意に異なるＴｍを有する配列決定プライマーを、同一のサーマルサイ
クル装置において並行して使用し得るからである。
成する方法を提供することである。この方法は、少なくとも２つのポリヌクレオ
チド配列決定調製物をステップダウン熱プロフィールにさらす工程を包含する。
複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並行して生成するためのステップダ
ウン熱プロフィールの使用は、都合がよい。なぜならば、数ある理由の中でもと
りわけ、有意に異なるＴｍを有する配列決定プライマーを、同一のサーマルサイ
クル装置において並行して使用し得るからである。
【００２３】 本発明のさらなる実施態様は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並
行して生成するためのシステムを含む。これらのシステムは、（ｉ）プログラム
可能なサーマルサイクラー（そのサーマルサイクラーのサンプル加熱チャンバー
中に配置されるサンプルにステップダウン熱プロフィールを実行するようにプロ
グラムされている）、および（ｉｉ）複数のポリヌクレオチド配列決定反応調製
物（サンプル加熱チャンバーと機能的に接触している）、を含む。用語「機能的
な接触」とは、加熱チャンバーが、サンプルの温度を加熱ブロックの温度と一致
して変更するような様式でサンプル（通常、密封された容器中に存在する）と接
触していることを示摘するために使用される。従って、サンプルの温度は、加熱
チャンバー（または米国特許第５，５２５，３００号に記載されるロボットマル
チブロックシステムのような等価なロボットマルチブロックシステム）の温度の
上昇および下降と共に上昇および下降する。
行して生成するためのシステムを含む。これらのシステムは、（ｉ）プログラム
可能なサーマルサイクラー（そのサーマルサイクラーのサンプル加熱チャンバー
中に配置されるサンプルにステップダウン熱プロフィールを実行するようにプロ
グラムされている）、および（ｉｉ）複数のポリヌクレオチド配列決定反応調製
物（サンプル加熱チャンバーと機能的に接触している）、を含む。用語「機能的
な接触」とは、加熱チャンバーが、サンプルの温度を加熱ブロックの温度と一致
して変更するような様式でサンプル（通常、密封された容器中に存在する）と接
触していることを示摘するために使用される。従って、サンプルの温度は、加熱
チャンバー（または米国特許第５，５２５，３００号に記載されるロボットマル
チブロックシステムのような等価なロボットマルチブロックシステム）の温度の
上昇および下降と共に上昇および下降する。
【００２４】 広範な種類のサーマルサイクラーを、本発明のシステムにおいて、または本発
明の方法を実行するために、使用し得る。プログラム可能なサーマルサイクラー
（ステップダウン熱サイクルを実行するようにプログラムされ得る）を使用して
ステップダウン熱サイクルを実行し得る。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実
行するために適切なサーマルサイクラーは、一般的に、本発明のシステムにおけ
る使用のために、および本発明の方法を実行するために適切である。このような
サーマルサイクラーおよびその使用は、数ある箇所の中でもとりわけ、米国特許
第５，６０１，１４１号、同第５，５２５，３００号、同第５，６０２，７５６
号、同第５，６１６，３０１号、同第５，１８７，０８４号、および同第５，４
３５，３７８号に記載される。多くの市販のサーマルサイクラー装置（例えばＰ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．、ＵＳＡ））
を使用し得る。
明の方法を実行するために、使用し得る。プログラム可能なサーマルサイクラー
（ステップダウン熱サイクルを実行するようにプログラムされ得る）を使用して
ステップダウン熱サイクルを実行し得る。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実
行するために適切なサーマルサイクラーは、一般的に、本発明のシステムにおけ
る使用のために、および本発明の方法を実行するために適切である。このような
サーマルサイクラーおよびその使用は、数ある箇所の中でもとりわけ、米国特許
第５，６０１，１４１号、同第５，５２５，３００号、同第５，６０２，７５６
号、同第５，６１６，３０１号、同第５，１８７，０８４号、および同第５，４
３５，３７８号に記載される。多くの市販のサーマルサイクラー装置（例えばＰ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．、ＵＳＡ））
を使用し得る。
【００２５】 本システムにおける使用のためのサーマルサイクラーは、サンプルをサーマル
サイクルにさらすためのサンプル加熱チャンバー(単数または複数）（すなわち 、ポリヌクレオチド配列決定反応調製物を収容する容器）を備える。
サイクルにさらすためのサンプル加熱チャンバー(単数または複数）（すなわち 、ポリヌクレオチド配列決定反応調製物を収容する容器）を備える。
【００２６】 本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチド配列決定反応調製物のセットを含
み、これは、所望のポリヌクレオチド配列決定反応産物を生成するためにステッ
プダウン熱プロフィールにさらすことにより、並行して処理され得る。ポリヌク
レオチド配列決定反応調製物の本セットは、少なくとも２℃異なるＴｍを有する
少なくとも２つの配列決定プライマーを含む。ポリヌクレオチド配列決定反応調
製物の本セットは、２℃を越えて（例えば、３〜１０℃（両端を含む）など）異
なるＴｍを有する少なくとも２つの配列決定プライマーを含み得る。複数のポリ
ヌクレオチド配列決定反応産物を並行して生成するためのステップダウン熱プロ
フィールの使用がない場合、ポリヌクレオチド配列決定反応の本セットを生成す
るわけがない。なぜならば、従来の熱プロフィールに供される場合、異なるプラ
イマーは適切にアニールできないからである。
み、これは、所望のポリヌクレオチド配列決定反応産物を生成するためにステッ
プダウン熱プロフィールにさらすことにより、並行して処理され得る。ポリヌク
レオチド配列決定反応調製物の本セットは、少なくとも２℃異なるＴｍを有する
少なくとも２つの配列決定プライマーを含む。ポリヌクレオチド配列決定反応調
製物の本セットは、２℃を越えて（例えば、３〜１０℃（両端を含む）など）異
なるＴｍを有する少なくとも２つの配列決定プライマーを含み得る。複数のポリ
ヌクレオチド配列決定反応産物を並行して生成するためのステップダウン熱プロ
フィールの使用がない場合、ポリヌクレオチド配列決定反応の本セットを生成す
るわけがない。なぜならば、従来の熱プロフィールに供される場合、異なるプラ
イマーは適切にアニールできないからである。
【００２７】 代表的には、ポリヌクレオチド配列決定反応調製物の本セットに含まれるプラ
イマーは、別々の溶液中に供給される；各ポリヌクレオチド配列決定反応調製物
は、単一のプライマーを有する。しかし、ポリヌクレオチドプライマーのセット
を、種々の形態の多重ＤＮＡ配列決定を容易にするために、同一の溶液中に供給
し得る。必要に応じて、本プライマーセットを、ポリヌクレオチド配列決定反応
産物（および従って配列情報）を、隣接する配列情報または実質的に隣接する配
列情報を生成するのに十分に近位にともに間隔があけられる鋳型の領域から生成
するように、設計し得る。ポリヌクレオチドプライマーのセットのこのような実
施態様は、遺伝子の完全な配列またはその有意な部分を生成するために、特に有
用である。
イマーは、別々の溶液中に供給される；各ポリヌクレオチド配列決定反応調製物
は、単一のプライマーを有する。しかし、ポリヌクレオチドプライマーのセット
を、種々の形態の多重ＤＮＡ配列決定を容易にするために、同一の溶液中に供給
し得る。必要に応じて、本プライマーセットを、ポリヌクレオチド配列決定反応
産物（および従って配列情報）を、隣接する配列情報または実質的に隣接する配
列情報を生成するのに十分に近位にともに間隔があけられる鋳型の領域から生成
するように、設計し得る。ポリヌクレオチドプライマーのセットのこのような実
施態様は、遺伝子の完全な配列またはその有意な部分を生成するために、特に有
用である。
【００２８】 本発明の他の実施態様は、複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を並行し
て生成するためのデバイスを含む。本デバイスは、ポリヌクレオチド配列決定反
応産物を並行して生成する。本デバイスは、ポリヌクレオチド配列決定反応産物
の異なるセットを、このデバイスに導入されたサンプルを含む共通のＤＮＡ（ま
たは他のポリヌクレオチド）から生成する。サンプルは、このデバイス中に存在
する異なる配列決定プライマーに対してアニーリングするためのＤＮＡ鋳型を含
む。本デバイスは、複数のポリヌクレオチド配列決定反応チャンバー、液体流入
口、および液体分配チャネルを備える。この液体分配チャネルは、各々の配列決
定反応チャンバーと液体流入口を連結する。このポリヌクレオチド配列決定反応
チャンバーは、液体分配チャネルにより液体流入口と、液体流入口へ導入された
液体サンプルが、配列決定反応チャンバーの内容物間での交叉汚染を容認するこ
となく、配列決定反応チャンバーへ分配されるような様式で連結される。この配
列決定反応チャンバーは、配列決定プライマーを収容する。このデバイスの所定
の実施態様において、少なくとも２つの異なる配列決定プライマーが、少なくと
も２℃異なるＴｍを有する。本デバイスは、配列決定鋳型を含む溶液を液体流入
口に導入すること、および鋳型を含む溶液を配列決定反応チャンバーに分配させ
ることにより、使用され得る。鋳型を含む溶液を配列決定反応調製物チャンバー
に分配した後、このデバイスを本発明のステップダウン熱プロフィールに供し、
これにより配列決定反応産物を生成する。次いで、この配列決定反応産物をこの
デバイスから取り出し、そして（例えば、電気泳動により）配列情報を提供する
ために分析する。本デバイスに導入される鋳型を含む溶液は、鋳型を含むのに加
え、サイクルシークエンシングに必要な、そして全ての配列決定反応に共通の、
１つ以上の試薬を含み得る。このような試薬は、耐熱ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝
液、ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド（標識された、またはされていない
）などを含む。あるいは、サイクルシークエンシングに必要な１つ以上のこのよ
うな試薬は、チャンバー中に存在するというよりも、（鋳型を含む溶液の添加前
に）配列決定反応チャンバー中に存在し得る。
て生成するためのデバイスを含む。本デバイスは、ポリヌクレオチド配列決定反
応産物を並行して生成する。本デバイスは、ポリヌクレオチド配列決定反応産物
の異なるセットを、このデバイスに導入されたサンプルを含む共通のＤＮＡ（ま
たは他のポリヌクレオチド）から生成する。サンプルは、このデバイス中に存在
する異なる配列決定プライマーに対してアニーリングするためのＤＮＡ鋳型を含
む。本デバイスは、複数のポリヌクレオチド配列決定反応チャンバー、液体流入
口、および液体分配チャネルを備える。この液体分配チャネルは、各々の配列決
定反応チャンバーと液体流入口を連結する。このポリヌクレオチド配列決定反応
チャンバーは、液体分配チャネルにより液体流入口と、液体流入口へ導入された
液体サンプルが、配列決定反応チャンバーの内容物間での交叉汚染を容認するこ
となく、配列決定反応チャンバーへ分配されるような様式で連結される。この配
列決定反応チャンバーは、配列決定プライマーを収容する。このデバイスの所定
の実施態様において、少なくとも２つの異なる配列決定プライマーが、少なくと
も２℃異なるＴｍを有する。本デバイスは、配列決定鋳型を含む溶液を液体流入
口に導入すること、および鋳型を含む溶液を配列決定反応チャンバーに分配させ
ることにより、使用され得る。鋳型を含む溶液を配列決定反応調製物チャンバー
に分配した後、このデバイスを本発明のステップダウン熱プロフィールに供し、
これにより配列決定反応産物を生成する。次いで、この配列決定反応産物をこの
デバイスから取り出し、そして（例えば、電気泳動により）配列情報を提供する
ために分析する。本デバイスに導入される鋳型を含む溶液は、鋳型を含むのに加
え、サイクルシークエンシングに必要な、そして全ての配列決定反応に共通の、
１つ以上の試薬を含み得る。このような試薬は、耐熱ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝
液、ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド（標識された、またはされていない
）などを含む。あるいは、サイクルシークエンシングに必要な１つ以上のこのよ
うな試薬は、チャンバー中に存在するというよりも、（鋳型を含む溶液の添加前
に）配列決定反応チャンバー中に存在し得る。
【００２９】 (実施例） サイクルシークエンシングを行ってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ
の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を配列決定する、実験を行った。
の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を配列決定する、実験を行った。
【００３０】 従来の熱プロフィール条件下で得られた配列情報とステップダウン熱プロフィ
ールを使用して得られた配列情報との間で、比較を行った。試験した４つのプラ
イマーは０００５Ｆ（１６Ｓ遺伝子の５位でアニーリング、正方向）、０５１５
Ｆ（正方向で５１５位でアニーリング）、０８１０Ｒ（逆方向で８１０位でアニ
ーリング）、および１５４０Ｒ（逆方向で１５４０位でアニーリング）であった
。
ールを使用して得られた配列情報との間で、比較を行った。試験した４つのプラ
イマーは０００５Ｆ（１６Ｓ遺伝子の５位でアニーリング、正方向）、０５１５
Ｆ（正方向で５１５位でアニーリング）、０８１０Ｒ（逆方向で８１０位でアニ
ーリング）、および１５４０Ｒ（逆方向で１５４０位でアニーリング）であった
。
【００３１】 サイクルシークエンシングを、従来のサイクルシークエンシング試薬を使用し
て行った。以下のステップダウン熱プロフィールを使用した。
て行った。以下のステップダウン熱プロフィールを使用した。
【００３２】
【表１】 この反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）Ｓｙｓ
ｔｅｍ ９６００サーマルサイクラーにて行った。得られる結果は以下のようで
ある： ０００５Ｆ １６Ｓプライマー ａ）ステップダウン熱プロフィール。実行を通じての改善されたＧシグナルレベ
ルに注意のこと。 ｂ）従来の熱プロフィール。性能はより劣る。
ｔｅｍ ９６００サーマルサイクラーにて行った。得られる結果は以下のようで
ある： ０００５Ｆ １６Ｓプライマー ａ）ステップダウン熱プロフィール。実行を通じての改善されたＧシグナルレベ
ルに注意のこと。 ｂ）従来の熱プロフィール。性能はより劣る。
【００３３】 ０５１５Ｆ １６Ｓプライマー ａ）ステップダウン熱プロフィール。実行を通じてのＴピークより下の改善され
たＣノイズに注意のこと。 ｂ）従来の熱プロフィール。性能はより劣る。
たＣノイズに注意のこと。 ｂ）従来の熱プロフィール。性能はより劣る。
【００３４】 ０８１０Ｒ １６Ｓプライマー ａ）ステップダウン熱プロフィール。実行を通じての減少したＧノイズに注意の
こと。 ｂ）従来の熱プロフィール。高いＧノイズ。
こと。 ｂ）従来の熱プロフィール。高いＧノイズ。
【００３５】 １５４０Ｒ １６Ｓプライマー ａ）ステップダウン熱プロフィール。実行を通じての減少したＧノイズに注意の
こと。 ｂ）従来の熱プロフィール。高いＧノイズ。
こと。 ｂ）従来の熱プロフィール。高いＧノイズ。
【００３６】 （参考としての援用） 本明細書において参照される全ての論文および文書（特許を含む）は、本明細
書中で参考として援用される。
書中で参考として援用される。
【００３７】 （等価物） 本発明は特定の方法および実施態様に関して記載されるが、種々の改変および
変更は本発明から逸脱することなくなされ得ることが、認められる。これらの等
価物および他の等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される
。
変更は本発明から逸脱することなくなされ得ることが、認められる。これらの等
価物および他の等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される
。
【図１】 図１は、３つの異なるタッチダウン熱プロフィールの模式的プロフィールを提
供する。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸は温度を表す。
供する。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸は温度を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドッジ， デボラ イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94706， オールバニー， ゲートビュー アベニ ュー 746 (72)発明者 スミス， ダグラス エイチ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94024， ロス アルトス， トパー アベニュー 1461 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB02 FA15 4B063 QA13 QQ06 QQ54 QR08 QR42 QR62 QR66 QS24 QS39 4G057 AD01 AD04
Claims (14)
- 【請求項１】 ポリヌクレオチド配列決定反応産物を生成する方法であって
、 少なくとも１つのポリヌクレオチド配列決定調製物を、少なくとも２つの熱サ
イクルセットにさらす工程であって、ここで各熱サイクルセットは少なくとも１
つの熱サイクルからなり、そして各熱サイクルは、アニーリング温度でのアニー
リング段階を含み、 そして、最初の熱サイクルセット以外の各熱サイクルセットは、それに先行す
る熱サイクルセットのアニーリング段階のアニーリング温度よりも低いアニーリ
ング温度でのアニーリング段階を有する熱サイクルからなる、工程 を包含する、方法。 - 【請求項２】 複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物が、並行して生成
される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 各熱サイクルセットが同数の熱サイクルを含む、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項４】 各熱サイクルセットとそれに先行する熱サイクルセットとの
間のアニーリング温度における差異が同一である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 各熱サイクルセットが、少なくとも３つの熱サイクルからな
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を、並行して生成
するためのシステムであって、該システムは、 請求項１に記載の方法を実行するようにプログラムされ、かつサンプル加熱チ
ャンバーを備える、プログラム可能なサーマルサイクラー、 該サンプル加熱チャンバーと機能的に接触している、複数のポリヌクレオチド
配列決定反応調製物 を含む、システム。 - 【請求項７】 最初の熱サイクルセット以外の各熱サイクルセットが、それ
に先行する熱サイクルセットの伸長温度より低い伸長温度での伸長段階を有する
熱サイクルからなる、請求項６に記載のシステム。 - 【請求項８】 各熱サイクルセットが同数の熱サイクルを含む、請求項６に
記載のシステム。 - 【請求項９】 各熱サイクルセットとそれに先行する熱サイクルセットとの
間のアニーリング温度における差異が同一である、請求項６に記載のシステム。 - 【請求項１０】 各熱サイクルセットが、少なくとも３つの熱サイクルから
なる、請求項６に記載のシステム。 - 【請求項１１】 請求項１に記載の方法に従って並行して処理され得る、ポ
リヌクレオチド配列決定反応調製物のセットであって、該セットは、複数のポリ
ヌクレオチド配列決定反応調製物を含み、ここで各調製物は、 推定Ｔｍを有する配列決定プライマーを含み、 ここで少なくとも２つの配列決定プライマーが、少なくとも２℃異なるＴｍを
有する、セット。 - 【請求項１２】 各配列決定調製物が配列決定のための鋳型を含む、請求項
１１に記載のセット。 - 【請求項１３】 各反応調製物がジデオキシヌクレオチドを含む、請求項１
１に記載のセット。 - 【請求項１４】 複数のポリヌクレオチド配列決定反応産物を、並行して生
成するためのデバイスであって、該デバイスは、 複数のポリヌクレオチド配列決定反応チャンバーであって、ここで各チャンバ
ーは、配列決定のための鋳型に関する推定Ｔｍを有する配列決定プライマーを収
容し、少なくとも２つの配列決定プライマーが、少なくとも２℃異なるＴｍを有
する、チャンバー、 液体流入口、 液体分配チャネルであって、該チャネルは、各々の該配列決定反応チャンバー
を、該液体流入口に連結する、チャネル を備える、デバイス。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/986,176 US5998143A (en) | 1997-12-05 | 1997-12-05 | Cycle sequencing thermal profiles |
| US08/986,176 | 1997-12-05 | ||
| PCT/US1998/025286 WO1999029900A1 (en) | 1997-12-05 | 1998-11-25 | Improved cycle sequencing thermal profiles |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000524471A Withdrawn JP2001526049A (ja) | 1997-12-05 | 1998-11-25 | 改良されたサイクルシークエンシング熱プロフィール |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5998143A (ja) |
| EP (1) | EP1034306A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001526049A (ja) |
| AU (1) | AU740708B2 (ja) |
| CA (1) | CA2317732C (ja) |
| WO (1) | WO1999029900A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US20030190644A1 (en) | 1999-10-13 | 2003-10-09 | Andreas Braun | Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers |
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| US20030220844A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Marnellos Georgios E. | Method and system for purchasing genetic data |
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| CA2574610A1 (en) * | 2004-07-22 | 2006-03-02 | Sequenom, Inc. | Methods for identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof |
| US7604940B1 (en) * | 2005-03-16 | 2009-10-20 | Applied Biosystems, Llc | Compositions and methods for analyzing isolated polynucleotides |
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