JP2001525790A - 肝臓指向性化合物及びその製造のための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 肝臓指向性化合物、そのような化合物の製造に有用な試薬及び方法及び組成物を開示する。肝臓指向性化合物少なくとも３個のヘキソース残基、好ましくはガラクトース残基、及び結合部、ターゲティング部または活性薬剤と反応し得る官能性部を含む。肝臓指向性化合物は、通常、指向されにくい化合物の代謝機構とは程度又は種類が異なる代謝機構により処理される。肝臓指向性化合物は、肝臓への活性薬剤のデリバリー、及びターゲティング比の改善のために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 肝臓指向性化合物及びその製造のための試薬技術的分野 本発明は、肝臓指向性化合物(hepatic directed compound)、該化合物の製造 に有用な試薬、並びに関連する方法及び組成物に関する。肝臓指向性化合物は、 通常、指向(direct)されにくい化合物の代謝機構とは程度又は種類が異なる代謝 機構により処理される。肝臓指向性化合物は、肝臓を経てレシピエントから除去 され、通常、対応する非指向性化合物に比べて短い血清半減期を有する。発明の背景 従来の癌療法には解決を要する２つの問題がある。一般的に達成可能なターゲ ティング比（腫瘍に局在する投与薬量対血液中に循環する投与薬量の比、または 腫瘍に局在する投与薬量対骨髄に移行する投与薬量の比）は低い。また、多くの 症例では、腫瘍にデリバリーされる放射線または治療薬の絶対量は有意な腫瘍応 答を誘発するために十分でない。腫瘍に対するターゲティング比または絶対量の 向上が求められてる。 ターゲティング比を改良する試みにおいて使用される方法の一つは、化合物の 血清濃度を低下させることである。投与された化合物の血清濃度を減少させる方 法の一つは、肝臓を経て迅速に除去され、且つ第一の投与化合物に結合するよう に設計された分子を、続けて投与することである。ガラクトース-HSA-ビオチン 抱合体は、PCT/US93/05406で論じられているように、循環するターゲティング剤 −ストレプトアビジン複合体の血流からの消失を促進する。予め投与された分子 の一部を指向するガラクトシル化抗体も、この目的に使用されている。 さらに、肝臓は、活性薬剤の肝臓デリバリーが有用であり得る種々の条件に影 響され易い。これらの環境において、肝動脈を介する活性薬剤デリバリーが提案 されている。この方法は、健康な組織を侵すものであり、従って、活性薬剤を肝 臓にデリバリーするための他の方法が求められている。発明の概要 本発明は、肝臓指向性化合物、該化合物の製造及び使用のための試薬及び方法 に関する。肝臓指向性化合物は、肝臓への活性薬剤のデリバリー、ターゲティン グ比の改善、またはその両者のために使用され得る。肝臓指向性化合物は、予め 投与された部分または毒性もしくは潜在的に毒性の部分を、除去するために肝臓 代謝経路に導くためにも使用され得る。 本発明の肝臓指向性化合物の一実施態様は、通常、ディレクター部分(directo r moiety)及び活性薬剤を含む。本発明のこの実施態様においては、一またはそ れ以上の活性薬剤がディレクター部分に直接にまたは間接的に結合し得る。間接 的な結合の例には、ポリマー担体、リポソーム、特別な剤形等が含まれる。その ような肝臓指向性化合物は、特に活性薬剤を肝臓にデリバリーして、肝臓の状態 を処理するのに有用である。ディレクター部分は、肝臓指向性化合物の肝臓への 局在化を導き、活性薬剤は疾患の処理を行う。 ターゲティング比の改良が求められている状況において、本発明の肝臓指向性 化合物は、通常、治療または診断すべきターゲット細胞集団を指向するターゲッ ト部分及びディレクター、並びに、所望により活性薬剤型エフェクターを含む。 これらの状況の下では、ターゲティング部分か化合物のターゲット細胞への局在 化を導き、活性薬剤が疾患を処理し、ディレクター部分が化合物が肝臓経由で循 環からの除去されるのを促進し、これにより、レシピエントの通常の組織の活性 薬剤への暴露を減少させる。 本発明の別の実施態様において、本発明の肝臓指向性化合物は、通常、ディレ クター部分及びレシピエントの血流または血管外流体域内の予め投与された薬剤 または他の毒性物質を認識する結合部分を含む。そのような肝臓指向性化合物は 、予め投与された分子、例えばターゲット部位に付着し、且つ続いて投与される レセプターを認識する活性薬剤含有分子の局在化を促進するように設計されたタ ーゲット部分−レセプター構築物のクリアランスに特に有用である。従って、本 発明のこの実施態様は、ここに記載したプレターゲティングプロトコルに特に適 する。 さもなければ、結合部分は、レシピエントの血管外流体域の循環に局在する毒 性または潜在的に毒性の部分に指向される。ディレクター部分は肝臓指向性化合 物の肝臓への局在化を指向し、結合部分は肝臓経路を経て除去されるべき分子に 結合する。 本発明の好ましいディレクター部分は、肝臓上のレセプター集団により認識さ れる分岐した糖構造（即ち、糖クラスター）である。この目的のために例示され る糖類は、ガラクトース及びマンノースである。典型的には、分岐構造により、 肝臓レセプターによる糖類の認識が促進される。そのようなレセプターは一定構 造の糖のクラスターを最も効率良く処理することが多いからである。 より好ましくは、本発明によるディレクター部分は、ガラクトースまたはガラ クトース誘導体を含む。好ましいディレクター部分の実施態様は、４の倍数のガ ラクトースを含む。通常は、４，８，１６及び３２のガラクトース残基を有する ディレクター部分が、本発明のプレターゲティングに好ましく使用される。別の 分岐構造、例えば３，９，２７等の糖を有するものも、本発明において意図され ている。 ディレクター部分は、そのための適当な試薬を用いて肝臓指向性化合物に導入 されても良い。本発明のディレクター試薬は、例えば上記のようなガラクトース クラスターと、アミン活性エステル、マレイミド、アルキルハライド、ヒドラジ ド、チオール、イミデート、アルデヒド等のような官能基とを含む。図面の簡単な説明 図１は、NR-LU-10-ストレプトアビジン抱合体(LU-10-StrAv)の腫瘍取込プロフ ィルを、対照として用いた天然型NR-LU-10完全抗体のプロフィルと比較して示す 。 図２ａ，図２ｂ，図２ｃは、１６ガラクトースクラスター-ビオチン抱合体の 製造を模式的に示す。 図３は、８ガラクトース含有ガラクトースクラスターの合成を模式的に示す。 図４は、延長された８ガラクトース含有ガラクトースクラスターの合成を模式 的に示す。 図５は、N,N'-ビス（ジスルフィジル-4-メチルフェニル）−γ，γ’−ジアミ ノイソバレレートＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの合成を示す。発明の詳細な説明 本発明を説明する前に、本文中で使用したいくつかの用語を定義しておくのが 有用であろう。ターゲティング部分(Targeting moiety)： 所定の細胞集団に結合する分子。ターゲティング部分は、レセプター、オリゴ ヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、またはターゲット細胞集団上もしくは該 集団内に存在する他の結合部位に結合し得る。本明細書の記載ではターゲティン グ部分の典型例として抗体を使用している。また、本発明の説明においてターゲ ットの典型例として腫瘍を使用している。 リガンド/アンチリガンド対(Ligand/anti-ligand palr)： 一般に比較的高い親和性の特異的結合を示す相補性/アンチ相補性分子対。典 型的なリガンド/アンチリガンド対としては、ジンクフィンガータンパク質/dsDN Aフラグメント、酵素/阻害物質、ハプテン/抗体、レクチン/糖質、リガンド/レ セプター、S-タンパク質/S−ペプチド、頭部活性化(head activator)タンパク質 (それ自身結合する)、システイン-C/カテプシンB、及びビオチン/アビジンがあ る。本明細書の記載ではリガンド/アンチリガンド対の典型例としてビオチン/ア ビジンを使用している。 アンチリガンド(Anti-ligand)：本文中に定義された「アンチリガンド」は、 相補性リガンドと高親和性結合、好ましくは多価結合する分子を意味する。急激 な腎クリアランスを防止するようにアンチリガンドが十分に大きく、また、ター ゲティング部分-リガンド抱合体の架橋及び凝集を得るために十分な高価数のも のが好ましいが、一価のアンチリガンドも本発明の対象となる。本発明のアンチ リガンドは、例えば肝取込みを指令するガラクトース残基のように、その取込み を指令する構造的な特徴を示すかまたは示すように誘導体化され得る。本明細書 では典型的なアンチリガンドとしてアビジン及びストレプトアビジンを使用して いる。 アビジン(avidin)： 本文中で定義された「アビジン」なる用語は、アビジン、ストレプトアビジン 、または、ビオチンと高親和性の多価結合または一価結合を生じ得るその誘導体 もしくは類似体を包含する。 リガンド(Ligand)： 本文中で定義された「リガンド」なる用語は、動物またはヒトに静脈内投与さ れたとき、アンチリガンドによって高いアフィニティーで結合する、好ましくは 、迅速な血清、血中及び/または全身クリアランスを示す比較的小さい可溶性分 子を意味する。典型的なリガンドとしてビオチンを使用している。 低アフィニティリガンドまたは低アフィニティアンチリガンド(Lower Affinit y Ligand or Lower Affinity Anti-ligand) ： 相補的なリガンドーアンチリガンド対のメンバーに、本来のリガンドまたはア ンチリガンドが相補的なメンバーと結合する場合よりも弱いアフィニティで結合 するリガンドまたはアンチリガンド。好ましくは、低アフィニティリガンドまた はアンチリガンドは、相補的アンチリガンドまたはリガンドの本来の形態に対し て約10^-6から10^-10Mの間の結合アフィニティを示す。しかしなから、アビジン/ ストレプトアビジン及び他の著しく高いアフィニティ結合分子については、低ア フィニティは、10^-6〜10^-13Mの範囲であり得る。低アフィニティリガンド及びア ンチリガンドは、本発明のクリアリング剤または活性薬剤含有抱合体に使用する ことができる。 活性薬剤(Active Agent)： 放射性核種、薬物、抗腫瘍剤、毒素などのような診断薬または治療薬（「ペイ ロード(payload)」）。典型的な活性薬剤として放射性核種治療薬を使用してい る。 NxSy キレート(Chelates)： 本文中で定義された「NxSyキレート」なる用語は、(i)金属または放射性金属 と配位結合することができ、且つ、(ii)ターゲティング部分、リガンドまたはア ンチリガンドに共有結合し得る二官能キレート化剤を意味する。特に好ましいNx SyキレートはN₂S₂及びN₃Sコアを有している。代表的なNxSyキレートは、例えばF ritzberg et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 85:4024-29,1988;Weber et al. ，Bioconj ．Chem．1:431-37,1990;及びこれらの引用文献に記載されている。 プレターゲティング(Pretargeting)：本文中で定義されたプレターゲティング なる用語は、リガンド/アンチリガンド対の一方に結合したターゲティング部分 をターゲット部位に局在させることを意味する。このターゲティング部分抱合体 の最適のターゲット対非ターゲット蓄積比が生じる十分な時間が経過した後、リ ガンド/アンチリガンド対の他方に結合した活性薬剤を投与し、ターゲット部位 においてターゲティング部分抱合体に（直接または間接的に）結合させる（２段 階プレターゲティング）。本文中に記載した３段階方法及び他の関連方法も本発 明に包含される。 クリアリング剤(clearing agent)： レシピエントの循環中に存在する被投与部分（例えば、ターゲティング部分- リガンド、ターゲティング部分-アンチリガンドまたはアンチリガンド単独）と 結合、錯化または他の方法で結合することができ、これによって、レシピエント の体内からの循環部分のクリアランス、血液循環からの除去または循環中の部分 の不活性化を容易にする物質を意味する。クリアリング剤は、クリアリング剤と 同じ処理プロトコルで使用されるターゲティング部分によって認識されるターゲ ット細胞集団へのクリアリング剤の接近を制限する物理的特性、例えは、大きさ 、電荷、立体配置またはその組合わせを特徴とすることが好ましい。 抱合体(Conjugate)： 抱合体は、化学的抱合体（共有結合または非共有結合）、融合タンパク質など を包含する。 肝臓指向性化合物(Hepatic-directed compounds)： 通常、ディレクター及びエフェクターを含む抱合体。１またはそれ以上のエフ ェクター分子が直接にまたは間接的に１またはそれ以上のディレクターに結合し 得る。 間接的結合(Indirect Binding)： 担体、例えばポリマー、リポソーム、特別な剤形等を介してのエフェクター分 子のディレクター分子への結合。 直接結合(DirectBinding)： 肝臓指向性化合物の成分間の直接の化学結合、またはスペーサー、エキステン ダー、または担体としてよりはむしろリンカーとして構成された他の化学的リン カー分子を組み込むそのような化学的結合。 ディレクター(Director)： 投与により成分に結合し、またはin vivoで結合するようになり、その成分の クリアランスを指向することのできる部分。本発明のディレクター部分は、肝臓 経由のクリアランスを指向する。 エフェクター(Effector)： 特定の用途のための望ましい効果を奏することのできる部分、例えば活性薬剤 ；リガンド、アンチリガンド等を含む結合部分；ターゲティング部分；等。 結合部分(Binding Molety)： レシピエントの循環または血管外流体域内に存在する予め投与された分子（例 えば相補的リガンドまたはアンチリガンドを有するもの）、または他の毒性また は潜在的に毒性の分子に、該毒性または潜在的に毒性の分子に関連するエピトー プの結合部分による認識を経て、in vivo結合できるリガンド、アンチリガンド または他の部分。 糖クラスター(Sugar cluster)：肝臓のレセプターにより認識される形状の糖 残基を複数個有すディレクター部分。そのようなクラスターは、好ましくは、分 岐した構造で連結した糖残基により構成され、他の糖クラスター含有抱合体成分 に一の接点で付加される。好ましくは、分岐するネットワークは、２または３に 分かれる分岐からなる、即ち、２，４，８，１６，３２または６４の糖残基また は、３，９，２７または８１の糖残基からなる。 糖クラスタークリアリング剤(Sugar Cluster Clearing Agent)： 糖クラスター部分を組み込むプレターゲティングプロトコルにおいてクリアリ ング剤として使用するために設計された肝臓指向性化合物。 ガラクトースクラスター(Galactose cluster)： 複数の分岐した構造で連結した約３乃至約１００ガラクトース残基を有するデ ィレクター部分。５０未満のガラクトース残基を有するのが好ましい。好ましく は、分岐ネットワークは、２または３に分かれる、即ち、２，４，８，１６，３ ２または６４のガラクトース残基または、３，９，２７または８１のガラクトー ス残基からなる。 ガラクトースクラスタークリアリング剤(Galactose cluster Clearing Agent) ： ガラクトースクラスターディレクターを組み込むプレターゲティングプロトコ ルにおいてクリアリング剤として使用するために設計された肝臓指向性化合物。 ディレクター試薬(Director Reagent)： ディレクター部分と１またはそれ以上の官能基とを有するエフェクター部に結 合して肝臓指向性化合物を形成するための試薬。 本発明の実施態様は、活性薬剤エフェクターを肝臓ターゲットにデリバーする のに適する肝臓指向性化合物であって： 化合物の肝臓取込を指向し得る糖残基のクラスターを含むディレクター；及び 該ディレクターに直接にまたは間接的に結合した、肝動脈についての診断また は治療に適用できる活性薬剤を含むものに関する。 本発明のこの実施態様において、ディレクターは、活性薬剤を肝臓ターゲット にデリバーする役割を果たす。活性薬剤は、肝臓ターゲットにおいて診断または 治療に寄与する。さらに、所望により活性薬剤担体を用いると、複数の活性薬剤 分子または複合的な活性薬剤の肝臓へのデリバリーが促進される。 本発明の別の実施態様は、循環または血管外流体域におけるバックグラウンド 活性薬剤またはターゲティング部分の濃度の減少に適する肝臓指向性化合物であ って： 化合物の肝臓取込を指向できる糖残基のクラスターを含むディレクター； 目的のターゲットに局在化するターゲティング部分であって、所望によりレセ プターに共有結合または非共有結合するもの；及び所望により ディレクターまたはターゲティング部分に（好ましくはターゲティング部分に ）直接にまたは間接的に結合した、ターゲットの診断または治療に適用できる活 性薬剤を含むものに関する。 本発明のこの実施態様において、ターゲティング部はターゲットに局在し、レ セプターまたは活性薬剤をデリバーする。ディレクターは、肝臓を経由の肝臓指 向性化合物の除去を促進し、肝臓指向性化合物の非ターゲット蓄積を減少させる 。所望によりレセプターが使用される場合は、続いて投与される活性薬剤含有構 造のための結合部位が提供される。所望により活性薬剤が使用される場合は、タ ー ゲットにおける診断または治療効果が得られる。さらに、所望により活性薬剤担 体が使用される場合には、複数の活性薬剤分子または複合的な活性薬剤のターゲ ットへのデリバリーが促進される。 本発明のさらに別の実施態様は、レシピエントの循環系または血管外流体域に 存在する分子の除去に関する代謝経路を指向するのに適する肝臓指向性化合物で あって： 化合物の肝臓取込を指向できる糖残基のクラスターを含むディレクター；及び レシピエントの循環または血管外流体域に存在する一定の分子と直接にまたは 間接的にin vivoで錯化することができる結合部分を含むものに関する。 本発明のこの実施態様において、ディレクターは、肝臓指向性化合物と、これ とin vivo結合するようになる構築物の生体分布を指向するのに寄与する。結合 部は、レシピエントの循環または血管外流体域内に存在する予め投与された分子 、または他の毒性または潜在的に毒性の分子との、in vivo結合を促進する。さ らに、所望による結合剤担体は、循環または血管外流体域内における複数の結合 剤分子の輸送を促進する。 放射性核種を活性薬剤として使用する場合、本発明の構築物は：続いて放射性 核種と結合するためのキレート組み込み肝臓指向性化合物（後形成(post-formed )アプローチを経る結合）並びに予め放射性核種と結合した放射性核種組み込み 肝臓指向性化合物（前形成(pre-formed)アプローチを経る結合）を含む。 好ましくは、ヘキソースクラスターを本発明の実施におけるディレクターとし て使用する。この記載の目的に使用される典型的なヘキソースクラスターはガラ クトースクラスターである。本発明のヘキソースクラスターは、ガラクトースク ラスターの設計の内容について示した下記の基準をふまえて設計される： １）クラスター内のガラクトースの数； ２）クラスター内のガラクトース間の距離； 及び ３）ガラクトースクラスターと、循環する分子またはターゲットに結合すべき結 合成分との距離。 基準の１番については、文献に、ヒト肝細胞表面のガラクトースレセプターが ヘテロトリマーとして、且つおそらくはビス−ヘテロトリマーとしてグループ化 されていることが示されている。Hardy et al.，Biochemistry，24:22-8，1985 参照。そのようなレセプターに最適のアフィニティを得るために、本発明の発明 者は、各々のガラクトースクラスターが少なくとも３個のガラクトース残基を有 するのが好ましいと信じている。一般には、クラスター中の糖の数が大きいほど 、クラスターが肝臓のレセプターにより認識される傾向も大きくなる。 糖クラスターの大きさが増すと、循環する分子またはターゲットへの結合が阻 害され得る。そのような結合において著しい阻害（例えば本来のターゲット部分 または結合部分の結合能力が２０％未満に減少）が見られる場合、二つの部分の 間により長いリンカーを使用するか、または本発明の肝臓指向性化合物にそのよ うな大きなクラスターを使用しないべきである。本発明は、任意の数のヘキソー ス残基またはその混合物を含むクラスターを含み、得られた肝臓指向性化合物分 子は、有効な肝臓クリアランスを示す。 基準の２番については、各トリマーの範囲内のガラクトースレセプターは互い に１５，２２及び２５オングストローム離れている。従って、本発明の発明者は 、クラスター内のガラクトースが好ましくは少なくとも２５オングストロームの 離間距離を与えるような柔軟なリンカーにより分離されるべきであると信じる。 糖残基の間の空間は、糖残基の数が減少すると、さらに重要になると思われる。 より大きな構造になると、直接には隣接していない糖残基（即ち、直接に隣接す るものからさらに離れている糖残基）に関しては適当な空間が生じやすくなる。 平均的な結合長が１．５オングストロームであると仮定すると、本発明の好まし い糖クラスターは、隣接する糖残基が約１０結合長以上離れていることを特徴と する。他の好ましい構造は、隣接する糖残基が約２５結合長以上離れていること を特徴とするガラクトースクラスターを含む。 基準の３番に関しては、ターゲティング部分及び／または結合部分成分及びガ ラクトースクラスターの間の距離が、ガラクトースクラスターの大きさまたは配 向により生じる不利益な立体的影響を、これらの成分の結合能力に及ぼすのを防 ぐのに十分であるべきである。この距離は、好ましくは約７結合長または約１０ オングストロームより大きい。必要であれば、エキステンダー(extender)分子を 関連する結合成分の間に導入し、必要な距離を与える。例えは、そのようなエキ ステンダーはガラクトースクラスターとリンカー（ガラクトースクラスターとタ ーゲティングまたは結合成分を結合する）との間、またはターゲティングまたは 結合成分とリンカーとの間に位置して必要な距離を与え得る。 前記のパラメーターは、ガラクトースについて最適のものであると考えられる か、これらのファクターは、他のヘキソース類またはそれらの混合物においては 変化してもよく、同じレセプターに結合しても結合しなくてもよく、または異な って結合しても良いことに注目すべきである。この出願における教示を得れば、 当該分野の技術者は、利用可能な合成技術を用いて他のヘキソースクラスターを 有する構造を製造し、これらの構造が最適な効果を与えることを確認することが できる。 本発明の実施においては、上記基準に適合する任意の分岐糖構造を使用し得る 。本発明の好ましいガラクトースクラスターは、下記の構造を有するものである ： 式中、Ｘは好ましくはＨまたはメチル基であり、これにより、ガラクトースクラ スターは各々４，８，１６及び３２のガラクトース残基を有する。分岐構造の繰 り返しにより、ガラクトースを、３２，６４等のガラクトース残基を含むように 拡張できる。さらに、糖自体と分岐構造との間のリンカー部分（−Ｓ−（ＣＨ₂ ）₄−ＮＸ−として示した）の長さも変化し得る。 別の分岐構造も本発明によるガラクトースクラスターの設計に使用し得る。例 えば、分岐により、ガラクトース残基の数が２倍になる他の構造を使用しうる。 さらに、分岐によりガラクトース残基の数が３倍または他の都合の良い倍数にな る構造も本発明に含まれる。 他の有効な分岐構造は、分子状ビスーホモトリス：(HO-CH₂)₃-C-NH₂をベース とする。この分子のスルフヒドリル含有誘導体を使用してもよい。本発明のこの 実施態様において、ビスホモトリス分子の各アームは伸長され、カルボン酸で終 わる：(HO₂C-(CH₂)_y-Z-(CH₂)₃-C-NH₂，ＺはＳまたはＯであり、ｙは１から約１ ０の範囲である。本発明のこの実施態様に関して、好ましいガラクトースクラス ターは、下記の構造を有することを特徴とする。 Ｘは、好ましくはＨまたはメチルてある。ｙは１から約１０の範囲てあり；Ｚは ＯまたはＳである。上記の構造は、各々３，９，２７個のガラクトース残基を表 す。分岐をさらに繰り返すことにより、ガラクトース残基を８１等まで拡大する ことができる。 また、Ｘはメチル基とは異なる低級アルキル部分、例えはエチル、第三ブチル 等であってもよい。Ｘはヘテロ原子を有する低級アルキル基、例えは低級アルキ ルの酸、エステル、アルデヒド、ケトンまたはエーテルであってもよい。Ｘの目 的は、アミド結合を開裂しうる代謝／分解酵素に立体障害を与えることである。 Ｘは、それが結合する薬剤の機能を変化させるべきではなく、従って、決められ た用途における必要に応じて、溶解性の増加／減少、電荷、他の物理的性質は変 化させ得る。 ガラクトースクラスターディレクター分子は、ディレクター試薬を用いて肝臓 指向性化合物に導入される。異なる官能基を有する一群のディレクター試薬を、 そのようなディレクター試薬を種々の他の分子に結合して、本発明による種々の 肝臓指向性化合物を形成するのに使用し得る。本発明の好ましいディレクター試 薬群は、次式で表され得る： Ｘ’は、利用可能な官能基を有し、Ｘは、Ｈまたはメチル基てあり、その結果、 ガラクトースクラスターは１６個のガラクトース残基を有する。別の４の倍数の ガラクトース残基を有する他の関連するディレクター試薬も同様の構造を有する 。 Ｘ’の利用可能な官能基は肝臓指向性化合物の他の成分の性質によって選択され る。有用なＸ’官能基の例には、アミン、活性エステル、マレイミド、イソシア ネート、イソチオシアネートアルキルハライド（例えば、ヨードアセテート）、 α−ハロケトン、α−ハロ酸、ヒドラジド、チオール、イミダート、アルデヒド 、光分解性複合体基等が含まれる。 例えば、活性化されたエステルを、ガラクトースクラスターをアミン（第一ま たは第二）、ヒドロキシル、スルフヒドリル等に結合させるのに使用してもよい 。マレイミドは、チオール等への結合を促進する。アルキルハライドは、チオー ル、ヒドロキシル、アミン等への結合に有用である。ヒドラジド基は、活性化エ ステル類、アルデヒド類、ケトン類等への結合を促進する。チオールは、ガラク トースクラスターのチオール類、マレイミド類、アルキルハライド類、α−ハロ −ケトン類等への結合に使用され得る。イミデート類は、アミン等への結合を促 進する。アルデヒド類は、還元してまたは還元せずに、シッフ塩基の形成を介し てのアミン類への結合等を促進し得る。 これらのＸ’官能基は、本発明のあらゆるディレクター試薬群のディレクター 試薬として使用し得る。ディレクター試薬群は、下記のように構成された単一の 分子から形成し得る：ヘキソースクラスター−ベースの（構造的な意味で）官能 基−利用可能な（立体的意味で）官能基。ベースの官能基は、誘導体化によりベ ースの官能基と同一のまたは異なる利用可能な官能基を有するＸ’部分を提供す ることができる。塩基官能性の例は、−ＮＨ₂、活性エステル、マレイミド、ス ルフヒドリル等である。−ＮＨ₂塩基官能性については、適当なＸ’は下記のも のを含む： アミン； −ＮＲ−ＣＯ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−ＮＨＳ； −ＮＲ−ＣＯ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−ＮＨＳ−ＳＯ₃Ｎａ； −ＮＲ−ＣＯ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−テトラフルオロフェニル； マレイミド； −ＮＲ−エキステンダー−マレイミド、但し、エキステンダーは、アミノカプ ロエート基、−（ＣＨ₂）_n等である。ｎは１〜約１０の範囲である； −３（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド； −ＮＲ−ＣＯ−ＣＨ₂−ＳＨ； −ＮＲ−ＣＯ−ＣＨ₂−ハライド、好ましくはＩまたはＢｒ； −ＮＲ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂； −ＮＲ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂、ｎは１〜約１０の範囲であ る； −ＮＲ−ＣＯ−（ＣＨ₂）₂Ｃ＝ＮＨ₂ ⁺−ＯＣＨ₃； −ＮＲ−ＣＯ−ＣＨ₂−ｐ−Ｎ₃−フェニル；等。 さらに、ベースの官能基は、さらにＮ−アルキル化して、肝細胞中の代謝的分 解または滞留に対する安定性を強化してもよい。従って、ＲはＨ，ＣＨ₃，ＣＨ₂ ＣＯＯＨ等でありうる。 実施例VIIは、上記のディレクター試薬群（式中、Ｘ’はアミンを表し、ガラ クトースクラスターは８個のガラクトース残基を有する）の関連するメンバーの 製造方法を示す。さらに、このガラクトースクラスターディレクター試薬からの 肝臓指向性化合物の一実施態様の製造が、実施例VIII及び実施例IXに記載されて いる。 本発明の肝臓指向性化合物は、適当なリンカーを用いて製造してもよい。二成 分肝臓指向性分子は、二官能性のリンカーを用いて形成される。他の成分との結 合に適当であり且つ利用可能な官能基が一個より多い成分のない三成分肝臓指向 性化合物については、三官能性リンカーが好ましい。少なくとも一の成分が他の 成分との結合に利用可能であり且つ適当な二またはそれ以上の官能基を有する三 成分肝臓指向性分子については、結合の形成に二官能性リンカーが好ましい。肝 臓指向性化合物成分の結合に有用なリンカーまたはリンカーの組み合わせの任意 のものを使用し得る。適する三官能性及び二官能性リンカーを下記に示す。 結合に“利用可能な”官能基は、立体的な束縛により結合の形成を妨げないも のである。結合に“適する”官能基は、化学的な意味で、他の結合成分の利用可 能な官能基と反応しうるものである。さらに、“適する”官能基の結合は、該官 能基が関与する成分の必要な機能を実質的に損なわないものである。例えば、抗 体ターゲティング部位の相補性決定領域に位置する官能基は、通常、結合に“適 する”官能基ではない。そのような結合により、抗体のターゲティング機能が実 質的に損なわれ得るからである。 ターゲティング部位、結合部位または活性薬剤、及び三成分肝臓指向性化合物 のガラクトースクラスター成分は、これらの成分の一つが上記で論じたような性 質を有する場合には、三官能性リンカーを介して結合し得る。適する三官能性リ ンカーは、三つの結合成分または結合構造に用いられる任意のエキステンダー部 分の利用可能な官能基と結合できるものである。有用な二官能性リンカーは、α −アミノ、ε−アミノ及びカルボキシル基が用いられているリシンである。当業 者は、他の三可能性リンカーを確認し、ここに記載したように使用することがで きる。 本発明において有用なエキステンダー分子は、例えばターゲティング成分及び リンカー、またはガラクトースクラスター成分及びリンカーと、結合できる二官 能性分子である。適するエキステンダー分子には、アミノカプロエート分子、Ｈ Ｓ−（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨまたは活性化エステル形（式中、ｎは２〜約５である） 、４−アミノブタンチオール等である。当業者は、他の適当なエキステンダー分 子を確認し、ここに記載したように使用することができる。さもなければ、エキ ステンダー機能は、適当な構築リンカーにより提供され得る。 また、本発明においては、結合機能部分を使用してもよい。そのような部分は 二官能性であり、結合成分、例えばガラクトースクラスター、ターゲティング部 分、結合部分、活性薬剤、キレート、リンカー、及びエキステンダーの結合を促 進する。そのような結合機能部分の例には、尿素基、チオ尿素基、スクシネート 橋、マレイミド等が含まれる。そのような結合機能部分は、当業者により確認さ れ使用され得る。 リンカー−エキステンダー−バインダー機能システムの例を下記に示す： 式中、リシンリンカーのα−アミンは、尿素またはチオ尿素官能基を介してアミ ノカプロエートスペーサーに結合し（これは図示しないガラクトースクラスター に結合する）；リシンカルボキシレートは、キレート（図示せず）への結合に利 用することができ；そして、リシンリンカーのε−アミンはターゲティング成分 の、例えば、スクシネート橋（図示せず）を介してのリシン残基への結合に利用 可能である。ターゲティング成分の他のアミノ酸残基、例えばシステインも結合 のために使用しうる。さもなければ、マレイミド−Ｓ−（ＣＨ₂）_nＣＯ−結合機 能部分−エキステンダーの組み合わせを糖残基とリシンの結合に使用しうる。 また、ガラクトースクラスターをキレート成分に結合することができ、これは さらに抱合体のターゲティング成分に、例えば二またはそれ以上の二官能性リン カーを介して結合することができる。好ましくは、例えば抱合体のターゲティン グ成分は、結合を有するガラクトースクラスターの形成の最後に付加される。適 する二官能性リンカーは、例えばビス−Ｎ，Ｎ−（６−（１−ヒドロキシカルボ ニルヘキシル）アミン等であり、結合方法は当業者により確認され、使用されう る。 好ましくは、血管外流体域の局所へのターゲティングまたは血管外流体域に存 在する分子のクリアリングのために設計された本発明の肝臓指向性化合物は、血 管外流体域に拡散されるのに十分小さい分子量を有するものである。そのような 物質の分子量は、好ましくは約１５００〜約２０，０００ダルトンの範囲である 。 放射性核種活性薬剤を使用する場合、肝臓指向性化合物成分の化学的方法によ る製造は、キレートに放射性核種を結合する前に（前形成アプローチ）または後 に（後形成アプローチ）行い得る。しかしながら、抱合体に使用されるキレート が放射性核種を室温で急速に結合できるものでない限り、そのような結合は、好 ましくは放射性金属の錯化に続いて行われる。 本発明の「ターゲティング部分」は、腫瘍細胞のような所定のターゲット細胞 集団に結合する。この意味で有用な好ましいターゲティング部分としては、抗体 、抗体フラグメント、ペプチド及びホルモンがある。既知の細胞表面レセプター に対応するタンパク質（低密度リポタンパク質、トランスフェリン及びインスリ ン等）、繊維素溶解酵素、抗-HER2、アネキシンのような血小板結合タンパク質 、生物学的応答調節剤（インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチ ン 及びコロニー形成刺激因子等）も好ましいターゲティング部分である。また、レ セプターに結合後にインターナリゼーションを受けある程度まで核に達する抗-E GFレセプター抗体は、オージェ電子エミッタ及び核結合薬剤をターゲット細胞核 に容易にデリバリーするために本発明で使用される好ましいターゲティング部分 である。オリゴヌクレオチド、例えばターゲット細胞核酸(DNAまたはRNA)の部分 に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明を実施するためのターゲテ ィング部分として有用である。細胞表面に結合するオリゴヌクレオチドも有用で ある。所定のターゲット細胞集団に結合する能力を維持している上記に挙げたタ ーゲティング部分の類似体も請求の範囲に記載の発明の範囲内で使用され得る。 さらに、合成ターゲティング部分も設計できる。 上記分子の機能的等価物も本発明のターゲティング部分として有用である。タ ーゲティング部分の機能的等価物の一例は「模倣」化合物、即ちターゲティング 部分-ターゲット細胞結合のための適正な立体配置及び/または配向を模倣するよ うに設計された有機化学的構築物である。別のターゲティング部分の機能的等価 物は、コンピューター支援分子モデリング及び改変された結合親和性を有する突 然変異体を用いて構築した「最小」ポリペプチドと呼ばれる短いポリペプチドで ある。この最小ポリペプチドはターゲティング部分の結合親和性を示す。 本発明の好ましいターゲティング部分は抗体（ポリクローナルまたはモノクロ ーナル）、ペプチド、オリゴヌクレオチド等である。本発明の実施に有用なポリ クローナル抗体はポリクローナル(Vial and Callahan，Univ．Mich ．Med．Bull. ，20:284-6,1956)、アフィニティ精製ポリクローナルまたはそのフラグメント（ Chao et al.，Res ．Comm．in Chem．Path．& Pharm.，9:749-61,1974）である。 本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は完全抗体及びそのフラグメントを 包含する。このようなモノクローナル抗体及びフラグメントは、ハイブリドーマ 合成、組換えDNA法及びタンパク質合成のような慣用の方法によって産生できる 。有用なモノクローナル抗体及びフラグメントは、任意の種（ヒトを含む）に由 来することができ、あるいは２以上の種からの配列を使用するキメラタンパク質 として形成されてもよい。概要に関しては、Kohler and Milstein，Nature 256: 495-97,1975;Eur ．J．Immunol．6:511-19,1976を参照。 ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」ネズミ抗体も本発明のターゲティン グ部分として有用である。例えば欧州特許出願第0,411,893A2号に開示されたも のと同様の方法を用い、例えばネズミFv領域（即ち、抗原結合部位を含有する領 域）またはその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメ イン領域及びFc領域で遺伝子組換えすることによってネズミモノクローナル抗体 を「ヒト化」する。適正なターゲット部位結合特性を確保するためにいくつかの ネズミ残基をヒト可変領域フレームワークドメインに維持してもよい。ヒト化し たターゲティング部分は、宿主レシピエント中の抗体またはポリペプチドの免疫 反応性を減少させ、半減期を延長させ、且つ、不都合な免疫反応の可能性を減少 させるものと認識される。 本発明で有用な活性薬剤（診断用または治療用）の種類には、毒素、抗腫瘍薬 、薬物及び放射性核種がある。本発明で使用できる有効な毒素のいくつかは、Ａ 鎖及びＢ鎖からなる。Ａ鎖は細胞毒性部分であり、Ｂ鎖は在来毒素分子（ホロト キシン）のレセプター結合部分である。毒素Ｂ鎖は非ターゲット細胞結合を媒介 するので、毒素Ａ鎖だけをターゲティングタンパク質に結合させるのが有利な場 合が多い。しかし、毒素Ｂ鎖の除去は非特異的細胞毒性を減少させることはでき るが、一般的な傾向として、対応するホロトキシン-ターゲティングタンパク質 抱合体と比較して毒素Ａ鎖-ターゲティングタンパク質抱合体の効力の減少を招 く。 この点に関して好ましい毒素は、アブリン、リシン、モデシン(modeccin)、シ ュードモナス(Pseudomonas) 外毒素Ａ、ジフテリア（Diphtheria）毒素、百日咳 毒素及び志賀毒素のようなホロトキシン；リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａの酵素部分、ジフテリア毒素Ａ鎖、百日咳毒素の 酵素部分、志賀毒素の酵素部分、ゼロニン(gelonin)、アメリカヤマゴボウ抗ウ イルスタンパク質、サポリン(saporin)、トリチン(tritin)、大麦毒素及びヘビ 毒ペプチドのようなＡ鎖または「Ａ鎖様」分子である。リボソーム不活性化タン パク質(RIP)、転位及び細胞結合能力の欠如した天然タンパク質合成阻害物質も 本発明に適宜使用し得る。パリトキシン(palytoxin)のような極めて毒性の高い 毒素も本発明の実施に有用であると考えられる。 本発明に適宜使用し得る好ましい薬物は、慣用の化学療法剤、例えば、ビンブ ラスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、メトトレキセート、5-フルオロウ ラシル、6-チオグアニン、シタラビン、シクロホスファミド、及びシスプラチナ ムのような化学療法剤、並びに、Cancer:Principles and Practice of Oncology ， 2d ed.，V.T．DeVita，Jr.，S．Hellman，S.A．Rosenberg，J.B．Lippincott Co.，Philadelphia，PA，1985，Chapter14に記載されたような他の慣用の化学療 法剤である。本発明の範囲内の特に好ましい薬物はトリコテセン（trichothecen e）である。 トリコテセンは、不完全菌類種(Fungi imperfecti)の土壌菌類によって産生さ れるかまたはBaccharus megapotamicaから単離された薬物である(Bamburg，J.R ．Proc ．Molec．Subcell．Biol．8:41-110,1983;Jarvis & Mazzola，Acc ．Chem ．Res ．15:338-395,1982)。これらは炭素と水素と酸素とだけを含有する最も毒 性の分子であると考えられる(Tamm，C．Fortschr ．Chem．Org．Naturst．31:61- 117,1974)。これらはすべて、タンパク質合成を開始、延長及び終結期に阻害す る物質としてリボソームのレベルで作用すると報告されている。 トリコテセンは２つの大きなクラス、即ち中心セスキテルペノイド構造だけを 有するものと付加的な巨大環を有するものとに分類できる（それぞれ単純トリコ テセン及び巨大環状トリコテセンと呼ぶ）。単純トリコテセンは、米国特許第4, 744,981号及び第4,906,452号（引用によって本明細書に含まれるものとする）に 記載されているように３つのグループ（即ち、グループＡ、Ｂ及びＣ）に細分さ れる。グループＡの単純トリコテセンの代表例としては、シルペン（Scirpen） 、ロリジンＣ、ジヒドロトリコテセン、シルペン-4,8-ジオール、ベルカロール 、シルペントリオール、T-2テトラオール、ペンタヒドロキシシルペン、4-デア セチルネオソラニオール、トリコデルミン、デアセチルカロネクトリン、カロネ クトリン、ジアセチルベルカロール、4-モノアセトキシシルペノール、4,15-ジ アセトキシシルペノール、7-ヒドロキシジアセトキシシルペノール、8-ヒドロキ シジアセトキシシルペノール（ネオソラニオール）、7,8-ジヒドロキシジアセト キシシルペノール、7-ヒドロキシ-8-アセチルジアセトキシシルペノール、8-ア セチルネオソラニオール、NT-1、NT-2、HT-2、T-2及ひアセチルT-2毒素がある。 グループＢの単純トリコテセンの代表例としては、トリコテコロン、 トリコテシン、デオキシニバレノール、3-アセチルデオキシニバレノール、5-ア セチルデオキシニバレノール、3,15-ジアセチルデオキシニバレノール、ニバレ ノール、4-アセチルニバレノール（フサレノン-X）、4,15-ジアセチルニバレノ ール、4,7,15-トリアセチルニバレノール及びテトラ-アセチルニバレノールがあ る。グループＣの単純トリコテセンの代表例としては、クロトコール及びクロト シンがある。巨大環状トリコテセンの代表例としては、ベルカリンＡ、ベルカリ ンＢ、ベルカリンＪ（サトラトキシンＣ）、ロリジンＡ、ロリジンＤ、ロリジン Ｅ（サトラトキシンＤ）、ロリジンＨ、サトラトキシンＦ、サトラトキシンＧ、 サトラトキシンＨ、ベルチスポリン、ミトキシンＡ、ミトキシンＣ、ミトキシン Ｂ、ミロトキシンＡ、ミロトキシンＢ、ミロトキシンＣ、ミロトキシンＤ、ロリ トキシンＡ、ロリトキシンＢ及びロリトキシンＤがある。さらに、一般的な「ト リコテセン」セスキテルペノイド環構造は、高等植物Baccharis megapotamicaか ら単離された「バッカリン」と呼ばれる化合物中にも存在する。これらは文献に 記載されており、例えばJarvis et al．によって開示されている(Chemistry of Alleopathy，ACS Symposium Series No.268:ed．A.C．Thompson，1984，pp.149- 159)。実験的薬剤、例えばメルカプトプリン、N-メチルホルムアミド、2-アミノ -1,3,4-チアジアゾール、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、硝酸ガリウム 、3%チミジン、ジクロロメトトレキセート、ミトグアゾン、スラミン、ブロモデ オキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、セムスチン、1-(2-クロロエチル)-3 -(2,6-ジオキソ-3-ピペリジル)-1-ニトロソウレア、N,N'-ヘキサメチレン-ビス- アセタミド、アザシチジン、ジブロモダルシトール、エルウィニアアスパラギナ ーゼ、イホスファミド、2-メルカプトエタンスルホネート、テニポシド、タキソ ール、3-デアザウリジン、可溶性ベーカーアンチフォル、ホモハリントニン、シ クロシチジン、アシビシン、ICRF-187、スピロムスチン、レバミソール、クロロ ゾトシン、アジリジニルベンゾキノン、スピロゲルマニウム、アクラルビシン、 ペントスタチン、PALA、カルボプラチン、アムサクリン、カラセミド、イプロプ ラチン、ミソニダゾール、ジヒドロ-5-アザシチジン、4'-デオキシ-ドキソルビ シン、メノガリル、リン酸トリシリビン、ファザラビン、チアゾフリン、テロキ シロン、エチオホス、N-(2-ヒドロキシエチル)-2-ニトロ-1H-イミダ ゾール-1-アセタミド、ミトキサントロン、アコダゾール、アモナフィド、リン 酸フルダラビン、ピベンジモール、ジデムニンＢ、メルバロン、ジヒドロレンペ ロン、フラボン-8-酢酸、オキサントラゾール、イポメアノール、トリメトレキ セート、デオキシスペルグアリン、エチノマイシン及びジデオキシシチジン等も 好ましい(NCI Investigational Drugs ，Pharmaceutical Data1987，NIH Publica tion No.88-2141,Revised November 1987参照）。 本発明に有用な放射性核種としては、ガンマ-エミッタ、ポジトロン-エミッタ 、オージェ電子-エミッタ、X-線エミッタ及び蛍光-エミッタがあり、治療用には ベーターエミッタ及びアルファ-エミッタが好ましい。放射性核種は当業界で公 知であり、¹²³I、¹²⁵I、¹³⁰I、¹³¹I、¹³³I、¹³⁵I、⁴⁷Sc、⁷²As、⁷²Se、⁹⁰Y、⁸⁸Y、⁹⁷Ru、^{10 0} Pd、^101mRh、¹¹⁹Sb、¹²⁸Ba、¹⁹⁷Hg、²¹¹At、²¹²Bi、¹⁵³Sm、¹⁶⁹Eu、²¹²Pb、¹⁰⁹ Pd、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁷Cu、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、^99mTc、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹¹⁶ Ho及び¹⁸Fがある。好ましい治療用放射性核種としては¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、²⁰³Pb、^{21 2} Pb、²¹²Bi、¹⁰⁹Pd、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、⁷⁷Br、²¹¹At、⁹⁷Ru、¹⁰⁵Rh 、¹⁹⁸Au及び¹⁹⁹Ag、¹¹⁶Hoまたは¹⁷⁷Luがある。 他の抗腫瘍剤、例えば細胞増殖の抑制活性をもつ薬剤も本発明に従って投与し 得る。抗腫瘍剤の例としては、IL-2、腫瘍壊死因子等のサイトカイン類,L-セレ クチン、E-セレクチン、P-セレクチンなどのレクチン炎症応答促進剤、並びに同 様の分子がある。 ガラクトースクラスター試薬は、肝臓への遺伝子デリバリーに有用であり得る 。本発明のこの観点によりデリバリーされるオリゴヌクレオチド配列には、転写 活性遺伝子配列及び治療用薬剤のアンチセンスフォーマットに有用な遺伝子配列 が含まれる。肝臓は非常に代謝性であり大量の動脈流の出力を受けるので、転写 活性遺伝子のデリバリーは、特に有利である。肝臓で一時的にまたは長期にわた って発現し、循環中に分泌される遺伝子は、生体を容易に灌流し得る。従って、 肝臓へのオリゴヌクレオチド配列のデリバリーは、肝臓の障害の緩和、肝細胞内 の肝臓毒性薬剤による中毒の直接化学的解毒による処理に寄与することができ、 または他の循環誘発性疾患を処理する治療薬剤の製造のプラットフォーム(plat- form)として寄与しうる。 肝臓疾患の診断又は治療に使用するのに好ましい活性薬剤は、下記のものを含 む：抗寄生虫剤、駆虫剤、抗コレステロール剤、抗細菌剤、抗真菌剤、遺伝子配 列、ビタミン類、スルフヒドリル（例えばシステイン、グルタチオン）、キレー ト（例えは、DTPA）、ニコチンアミドコファクター（例えは、ＮＡＤＨ，ＮＡＤ ＰＨ，ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）、グルココルチコイド、アルコール／アルデヒドデ ヒドロゲナーゼ、アシクロビル、ビダラビン、α−インターフェロン、コルチコ ステロイド等。そのような活性薬剤は、本発明のヘキソースクラスターに、その クラスターの別の結合についてここに記載したのと類似の技術により結合されう る。当業者であれば、ここに記載された教示に基づき、そのような結合を行い得 る。 本発明の一の実施態様は、患者の循環系または血管外の流体域に存在する予め 投与された分子または毒素分子のクリアランスに使用するためのハイブリッド剤 の製造及び使用を含む。予め投与された分子は、活性薬剤含有抱合体、ターゲテ ィング部分-レセプター抱合体、例えば、モノクローナル抗体またはフラグメン ト−リガンドまたはアンチリガンド抱合体）等を含んでいてもよい。この状況に おいて、本発明の肝臓指向性化合物は、予め投与された分子を非ターゲット部位 から一掃するために使用される。 本発明の好ましい肝臓指向性化合物は、循環中に存在し、血管外流体域に進入 することができる。従って、循環中または血管外流体域に存在する予め投与され た化合物は、本発明の肝臓指向性化合物の影響を受ける。循環する化合物は、肝 臓指向性化合物の関与により、肝臓レセプターを経て除去される。血管外流体域 に存在するが、ターゲット細胞またはエピトープとは関係のない予め投与された 化合物は、肝臓レセプターを介して除去され、そのような化合物は、肝臓指向性 化合物の関与により循環中へ拡散して戻るからである。ターゲットされる薬剤（ 例えばターゲティング部分-アンチリガンド抱合体）に結合するようになり得る 残存する肝臓指向性化合物は時間をかけて分離すべきであり、これにより、続い て投与される局在化するように設計された活性薬剤がターゲット剤にアクセスで きるようにする。 レシピエントの循環または血管外流体域から除去され得る毒性または潜在的に 毒性の分子には：化学療法薬（例えばアルキル化薬）、重金属等が含まれる。レ シピエントの循環または血管外流体域に存在する毒性または潜在的に毒性の分子 に関与することのできる結合部分には、該毒素または潜在的な毒素の特徴的なエ ピトープにディレクトする抗体またはそのフラグメントが含まれる。他の有用な 結合部分には、本発明のプレターゲティング態様におけるオリゴヌクレオチド、 任意のリガンドまたはアンチリガンドが含まれる。 結合部分をターゲティング部分−リガンドまたはアンチリガンド抱合体のレシ ピエントの循環または血管外流体域からの除去のために使用する本発明のプレタ ーゲティングの観点において、有用な結合部分の特徴を下記で論じる。本発明の 肝臓指向性化合物の結合部分と循環または血管外流体域からクリアリングすべき 分子との間の結合は、一時的、即ち、分子が循環または血管外流体域から肝臓へ クリアリングされるのに十分な時間内のものである必要がある。このような状況 下で、本発明の肝臓指向性分子は、患者の循環または血管外流体域から毒性また は潜在的に毒性の分子を除去するのに使用される。 通常は、肝臓指向性化合物の結合部分と結合すべき分子との相互作用を特徴づ ける結合定数は、肝臓指向性部分のターゲット部位への滞留時間が短くなるよう に十分に低いべきである。また、結合定数は、結合すべき分子を捕らえ、その分 子を肝臓へ送るのに十分高くなければならない。本発明の肝臓指向性化合物に用 いられる結合部分の理想的な結合定数の選択は、下記のファクターによる： (i)in vivo関連構築物（例えば、モノクローナル抗体−アンチリガンド−リガン ドガラクトースクラスター）の肝臓によるクリアランス速度；及び (ii)活性薬剤含有抱合体が投与されるまでの時間（肝臓指向性化合物が予め投与 された部分をクリアリングするために使用される本発明の実施態様において）。 基準(i)については、クリアランス速度が速ければ、結合定数は低く（弱く） なる必要がある。基準(ii)については、肝臓指向性化合物及び活性薬剤の投与間 隔が大きいと、ターゲットされる構築物から結合部を分離するのに利用しうる時 間か長くなるので結合定数を大きく（強く）することができる。臨床的な便宜か らは、比較的短い間隔で投与し、従って、結合定数は幾分弱くするのが好ましい 。 本発明の結合部分は、リガンド、アンチリガンド、及び他のターゲットエピト ープ認識部分を含む。当業者は、ここで特に論じた結合部分を他の可能な部分に 変えることができる。好ましい結合部分は、モノクローナル抗体のFabフラグメ ントの分子量またはそれ未満の分子量により特徴づけられる。そのような結合部 は、問題の他の分子、例えばペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、及び他の小 分子の結合を可能にするための適切な官能基を含むように変化させ得る。 造影または治療のためのターゲティング部分−放射性同位体結合体のin vivo 投与に関して認識されている不利益は、非ターゲット及びターゲット部位におけ る結合した放射性薬剤の局在化である。投与された放射性標識結合体が循環から クリアリングされるまで、通常の器官及び組織は、結合した放射性薬剤に一時的 に暴露される。例えば、in vivo投与された放射性標識完全抗体は、比較的遅い 血中クリアランスを示し；最大ターゲット部位局在は、通常、投与後１〜３日で 起こる。一般的には、循環からの抱合体のクリアランス時間が長いほど、非ター ゲット器官の放射線暴露が大きい。単独でのまたはターゲティングされる抱合体 としての治療薬剤は、同様の欠点を伴う。 非ターゲット組織の診断薬または治療薬への曝露を減少させる１つの方法は、 ターゲティング部分をターゲット部位に「プレターゲティング」し、次いで、タ ーゲット部位に「プレターゲッティングされた」ターゲティング部分に結合し得 るクリアランスの速い診断薬または治療薬抱合体を投与することである。いくつ かのプレターゲティング方法の実施態様が米国特許第4,863,713号(Goodwin et a l.)に記載されている。 「２段階」手順は、ターゲティング部分-リガンドまたはターゲティング部分- アンチリガンドを投与し、次いでリガンド-アンチリガンド対の他方と抱合体を 形成している活性薬剤を投与することを特徴とする。本発明の２段階プレターゲ ティング方法の任意の「1.5」段階として、（好ましくはリガンドまたはアンチ リガンド単独でない）クリアリング剤を投与して、循環中のターゲティング部分 含有抱合体のクリアランスを容易にする。 ２段階プレターゲティング方法において、クリアリング剤は、ターゲット細胞 集団に直接結合することもなく、予め投与されターゲット細胞に結合したターゲ ティング部分-アンチリガンド抱合体またはターゲティング部分-リガンド抱合体 を介して結合することもないものであることか好ましい。２段階プレターゲティ ングの一例では、アビジン-ターゲティング部分抱合体のクリアリング剤として 、ビオチン化ヒトトランスフェリンを使用する。このクリアリング剤は、トラン スフェリン-ビオチン-循環アビジン-ターゲティング部分複合体の肝クリアラン スを生じさせる大きさを有しており、ターゲット細胞部位に結合したアビジン- ターゲティング部分抱合体との結合は実質的に阻止される(Goodwin,D.A.,Antibo d ．Immunoconj．Radiopharm. ，4:427-34,1991参照)。 本発明で使用される適当なリガンドとしては、ビオチン、ハプテン類、レクチ ン類、エピトープ、dsDNAフラグメント、酵素阻害物質及びその類似体及び誘導 体かある。有用な相補的アンチリガンドとしては、アビジン（対ビオチン）、糖 質（対レクチン類）、及び抗体及びそのフラグメントまたは模倣体を含むその類 似体（対ハプテン類及びエピトープ）、ジンクフィンガータンパク質（対dsDNA フラグメント）並びに酵素（対酵素阻害物質）がある。リガンドとアンチリガン ドとは少なくとも約k_D≧10⁹Mの親和性で互いに結合するのが好ましい。他の有用 なリガンド／アンチ−リガンドシステムは、Ｓ−タンパク質／Ｓ−ペプチド、ヘ ッドアクチベーター(head activator)タンパク質（それ自体に結合するもの）。 システイン−Ｃ／カテプシンＢ等である。 本発明において使用される好ましいキレートシステムの一つは、1,4,7,10-テ トラアザシクロドデカン-N,N',N",N'''-テトラ酢酸(DOTA)構築物をベースとする ものである。DOTAはY-90及び他の放射性核種に強力に結合するので、放射性免疫 療法に使用することが提案されてきた。治療に使用する場合、放射性核種がDOTA キレート内部に安定に結合し、DOTAキレートがリガンドまたはアンチリガンドの ようなエフェクターに安定に結合することが極めて重要である。 本発明のDOTA-含有分子及び抱合体の設計戦略では主として以下の３つの特性 に配慮した： （1）in vivo安定性（ビオチニダーゼ及び汎用のペプチダーゼ活性に対する抵抗 性を含む）。当初許容基準は100%安定性が１時間維持されることである。 （2）腎排泄、及び、 （3）合成の容易性。 同一または類似の基準を別のエフェクターに対して適用することができ、当業 者により容易に確認され得る。 本発明の実施に好ましく使用されるDOTA-ビオチン抱合体は以下の戦略の１つ またはそれ以上の実行を反映するものである： （1）開裂されやすいアミド窒素に隣接する炭素の置換、 （2）開裂されやすいアミド窒素のアルキル化、 （3）アルキルアミノ基によるアミドカルボニルの置換、 （4）D-アミノ酸並びにその類似体または誘導体の組込み、または、 （5）チオウレア結合の組込み。 本発明によるDOTA−ビオチン抱合体は、公開されたPCT特許出願PCT/US93/0540 6に記載されている。DOTA−ビオチン抱合体の好ましい製造方法は、実施例IIIに 記載されている。 前記の好ましいリンカーは、以下の利点を１つ以上有するDOTA−ビオチンまた は他のDOTA−小分子抱合体を調製するために有用である。 −遊離ビオチンと同じまたは実質的に同じ親和性でアビジンまたはストレプト アビジンと結合する、 −高い動力学的安定性で効率的に金属M⁺³イオンに結合する、 −主として腎臓から尿に排泄される、 −内因性酵素的または化学的分解（例えば体液アミダーゼ、ペプチダーゼ等） に対して安定である、 −組織に速やかに浸透し、プレターゲットされたアビジンまたはストレプトア ビジンに結合する、 −速やかに排泄され全身の滞留半減期は約５時間未満である。 好ましい二段階プレターゲティングプロトコルにおいて投与される成分の一つ は、ターゲティング部分−アンチリガンドまたはターゲティング部分−リガンド 抱合体である。ストレプトアビジン-タンパク質ターゲティング部分抱合体は、 好ましくは実施例XIに後述するように調製され、この調製は、SMCC誘導化ストレ プトアビジンの調製と、DTT還元タンパク質ターゲティング部分の調製と、この ように調製された２つの部分の抱合と、架橋(抗体-ストレプトアビジン-抗体)及 び凝集した種からのモノ置換及び/またはジ置換(ストレプトアビジン置換)抱合 体の精製とからなる段階を含む。好ましくは精製した分画を、HPLCサイズ排除、 SDS-PAGE、免疫反応性、ビオチン結合能力及びin vivo検査等のいずれか１つ以 上を用いてさらに特性決定する 本発明の一実施態様のアンチリガンド/リガンド(例えばアビジン/ビオチン)- ターゲッティング部分(例えば抗体)抱合体のin vivo複合体形成及び血中クリア ランスのための使用を容易にするような物理的特性を有するクリアリング剤を提 供する。これらのクリアリング剤は、ターゲッティング部分抱合体のターゲット ：血中比を改善するために有用である。 これらのクリアリング剤の他の用途は、抗体-活性薬剤デリバリーの方式を用 いた凝血塊に関する造影または治療を含む。例えば、有効な凝血防止剤は、速や かなターゲット局在化と高いターゲット：非ターゲットのターゲティング比とを 与える。有効なクリアリング剤を用い、本発明のプレターゲティングプロトコル で投与される活性薬剤は、望ましい形態でターゲット化され、従って、肺塞栓症 及び深在性静脈血栓症のような症状の造影/治療に有用である。 本発明の実施に有用なクリアリング剤は好ましくは、 −ターゲッティング部分-リガンド(またはアンチリガンド)抱合体との複合体 の迅速で有効なin vivo形成、 −後で投与される相補的アンチリガンドまたはリガンド含有分子と結合し得る ターゲッティング部分抱合体の速やかな血中クリアランス、 −大量のターゲッティング部分抱合体のクリアリング(または不活性)の高い能 力、 −低い免疫原性、 の特徴のいずれか１つまたはそれ以上を有している。 好ましいクリアリング剤は、糖クラスターを有する部分を含む。そのようなク ラスターに使用される糖は、好ましくはヘキソースである。そのようなヘキソー スクラスターを含有するクリアリング剤は、アシュウェル(Ashwell)レセプター または他のレセプター、例えば内皮細胞及び/または肝臓のクッパー細胞に結合 したマンノース/N-アセチルグルコサミンレセプターもしくはマンノース6-ホス フェートレセプターによって認識される３つまたはそれ以上のヘキソース（六炭 素糖部分）のクラスターを含むように誘導化された分子である。このようなヘキ ソースの例としては、ガラクトース、マンノース、マンノース6-ホスフェート、 N-アセチルグルコサミン、ペンタマンノシルホスフェート等がある。グルコース 、N-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、ペンタマンノシルホスフェー ト、ガラクトースのチオグリコシド並びにD-ガラクトシド類及びグルコシド類全 般のようなアシュウェルレセプターによって認識される他の部分も本発明の実施 に使用され得る。本明細書ではガラクトースが典型的なクリアリング剤のヘキソ ース誘導体である。ガラクトースクラスターの露出ガラクトース残基はそれにつ いての特異的レセプター（アシュウェルレセプター）が媒介する肝内細胞取り込 み作用によってクリアリング剤の迅速なクリアランスを起こす。これらのレセプ ターはクリアリング剤と結合し、肝細胞内取込み作用を誘発し、リソソームと融 合させる。レセプターは細胞表面に戻り再利用される。このクリアランスメカニ ズムの特徴は、高い効率、高い能力及び速い動力学にある。 下記のように、ヒト血清アルブミン(HSA)を組み込んだクリアリング剤が既に 開発されている： (ヘキソース)m-ヒト血清アルブミン(HSA)--(リガンド)n、 （nは１から約10までの範囲の整数、mは１から約45までの範囲の整数であり、ヘ キソースはアシュウェルレセプターによって認識される。 本発明のガラクトースクラスターを有するクリアリング剤は、（1）リガンド- アンチリガンド親和性を介して対応するリガンド-またはアンチリガンド-含有抱 合体との複合体を迅速かつ有効に形成でき、（2）形成された複合体が、肺及び 脾臓等の普遍的なRES系に取込まれる凝集複合体とならずに、肝特異的分解系で あるガラクトースレセプターを介して血液からクリアされるのが好ましい。さら に、ガラクトースに媒介される肝取込みの迅速な動力学と、リガンド-アンチリ ガンド相互作用の親和性との共存によって、中間的な分子量の担体の使用が可能 であり、低分子量の担体の使用さえ可能である。 ガラクトース-またはビオチン-誘導化クリアリング剤を使用したクリアリン グ剤評価実験に関しては実施例IVで詳述する。実施例IVの実験で試験した特定の ヒト血清アルブミンのガラクトース及びビオチン誘導体、並びに、分子量70,000 ダルトンのデキストランのビオチン及びガラクトース誘導体である。実験により 、ガラクトース及びビオチンの双方を含有するようなタンパク質及びポリマーの 誘導体を合成することができ、得られた誘導体分子は循環中のストレプトアビジ ン-タンパク質抱合体をレシピエントの血清から有効に除去し得ることを示した 。循環アビジン含有抱合体の血液プールのクリアと、ストレプトアビジン含有抱 合体によって認識されたターゲット部位に後で投与されたビオチン化同位元素を デリバリーする能力とに対する効果を判定するために、ビオチン添加量を種々に 変更した。投与成分の相対用量がクリアリング剤の効果に与える効果も試験した 。そのようなクリアリング剤を本発明のこれらのヘキソースクラスター露出部分 と比較した実験を下記の実施例VIに示す。 小分子クリアリング剤は、タンパク質性クリアリング剤に比べて、コスト、調 節及び特性の観点から優れている。さらに詳しくは、小分子クリアリング剤は、 入手しうるかまたは容易に合成しうる成分から製造することができ、より正確な 特性が得られる。さらに、ビオチンの放出が問題となる場合には、安定性の高い ビオチンリンカーを取り込むことができるかまたは低アフィニティビオチン類縁 体を取り込むことのできる小分子クリアリング剤を用いることにより、そのよう な放出を避けるか、またはそのような放出の影響を最小限にとどめることができ る。 本発明は、リガンド誘導体またはアンチリガンド誘導体を取り込む糖クラスタ ー含有クリアリング剤を提供し、そのような誘導体は、相補的なリガンド／アン チリガンド対のメンバーに対してその化合物の本来の形態よりも低いアフィニテ ィを示す（即ち低アフィニティリガンドまたはアンチリガンド）。ビオチン−ア ビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンリガンド／アンチリガンド対を用い る本発明の態様では、クリアリング剤は、低アフィニティビオチン（アビジンま たはストレプトアビジンに対して本来のビオチンより低いアフィニティを示す） または低アフィニティアビジンまたはストレプトアビジン（ビオチンに対して本 来のアビジンまたはストレプトアビジンより低いアフィニティを示す）を取り込 むものが好ましい。 リガンド／アンチリガンド対のメンバー（先にターゲット部分と共に抱合体に 投与された）に相補的なリガンドまたはアンチリガンド部分を用いる糖クラスタ ー含有クリアリング剤は、本発明の実施において有用である。そのようなクリア リング剤が肝細胞に局在すると、それらは一般的に速やかに分解される。この分 解により多量の遊離リガンドまたは遊離アンチリガンドが循環中に放出される。 リガンドまたはアンチリガンドがこのように一度に大量に放出されると、ター ゲティング部分−リガンドまたはターゲティング部分−アンチリガンドの結合部 位について、その後投与される活性薬剤−リガンドまたは活性薬剤−アンチリガ ンド抱合体と競合する。 この競合は、より低いアフィニティのリガンドまたはアンチリガンドを取り込 む糖クラスタ−含有クリアリング剤を用いることにより得られる。言い換えれば 、クリアリング剤の構造に使用されるリガンドまたはアンチリガンドは、相補的 リガンド／アンチリガンド対のメンバーに、本来のリガンドまたはアンチリガン ドよりも弱く結合する。その結果、ターゲットに局在したターゲティング部分− アンチリガンドまたはターゲット部分−リガンド抱合体に結合するより低いアフ ィニティのリガンドまたはアンチリガンド誘導体は、その後に投与される活性薬 剤−本来の（即ちより高い結合アフィニティのリガンド）または活性薬剤−本来 の（即ちより高い結合アフィニテイの）アンチリガンドー抱合体により置き換え られ得る。 ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンリガンド−アンチリ ガンド対を用いる２段階プレターゲッティングプロトコルでは、低アフィニティ ビオチン、低アフイニテイアビジンまたは低アフィニティストレプトアビジンを 用いることができる。例えば、低アフィニティビオチン分子の例は、アビジンま たはストレプトアビジンに、本来のビオチンのもの（１０^-15）より小さいアフ ィニティで結合し、アビジンまたはストレプトアビジンとの結合について特異性 を保持し、哺乳動物レシピエントに対する毒性がない等の特性を示す。例えば、 低アフイニテイアビジンまたはストレプトアビジン分子の例は、ビオチンに本来 のアビジンまたはストレプトアビジンのものより小さいアフィニティで結合し、 ビオチンとの結合について特異性を保持し、哺乳動物レシピエントに対する毒性 がない等の特性を示す。 低アフィニティビオチン分子の例としては、２’−チオビオチン；２’−イミ ノビオチン；１’−Ｎ−メトキシカルボニルビオチン；３’−Ｎ−メトキシカル ボニルビオチン；１−オキシ−ビオチン；１−オキシ−２’−チオビオチン；１ −オキシ−２’−イミノビオチン；１−スルホキシド−ビオチン；１−スルホキ シド−２’−チオビオチン；１−スルホキシド−２’−イミノビオチン；１−ス ルホン−ビオチン；１−スルホン−２’−チオビオチン；１−スルホン−２’− イミノビオチン；デスチオビオチン（ｄ及びｄ１光学異性体）、ｄ１−デスチオ ビオチンメチルエステル、ｄ１−デスチオビオチノール、Ｄ−４−ｎ−ヘキシル −イミダゾリドン、Ｌ−４−ｎ−ヘキシルイミダゾリドン、ｄ１−４−ｎ−ブチ ル−イミダゾリドン、ｄ１−４−ｎ−プロピルイミダゾリドン、ｄ１−４−エチ ル−イミダゾリドン、ｄ１−４−メチルイミダゾリドン、イミダゾリドン、ｄ１ −４，５−ジメチルイミダゾリドン、メソ−４，５−ジメチルイミダゾリドン、 ｄ１−ノルロイシンヒダントイン、Ｄ−４−ｎ−ヘキシル−２−チオノ−イミダ ゾリジン、ｄ−４−ｎ−ヘキシル−２−イミノ−イミダゾリジン等のようなイミ ダゾリドン誘導体；Ｄ−４−ｎ−ヘキシルオキサゾリドン、Ｄ−５−ｎ−ヘキシ ルオキサゾリドン等のようなオキサゾリドン誘導体；［５−（３，４−ジアミノ −チオファン−２−イル］ペンタン酸；リポ酸；４−ヒドロキシ−アゾベンゼン −２’−カルボン酸等が挙げられる。本発明の実施で使用するのに好ましい低ア フイニテイビオチン分子は、２’−チオビオチン、デスチオビオチン、１−オキ シ−ビオチン、１−オキシ−２’−チオビオチン、１−スルホキシド−ビオチン 、１−スルホキシド−２’−チオビオチン、１−スルホン−ビオチン、１−スル ホン−２’−チオビオチン、リポ酸等である。これらの低アフィニティビオチン 分子の例は、そのためのものとして公知の手順に実質的に従って製造できる。例 示の低アフィニティビオチン分子を、糖クラスターディレクターに、そのための ものとして公知の手順及びビオチン抱合に関して本明細書に記載した手順に実質 的に従って抱合させる。 ビオチン類縁体のアビジンに対する結合アフィニティについては多くが報告さ れている。通常の当業者であれば、当該分野で知られていることに基づいて、ス トレプトアビジン、アビジンまたはそれらの誘導体の類縁体に対する特定のビオ チンの結合アフィニティを確認するために、公知の技術を容易に選択または使用 できるであろう。 本発明はさらに、哺乳動物レシピエントのターゲット細胞部位における活性薬 剤の局在化を増加させる方法であって、 レシピエントにターゲティング部分及びリガンド−アンチリガンド結合対のメ ンバーを含む第１の抱合体を投与し、 その後レシピエントに、レシピエントの肝細胞レセプターを介して、循環して いる第１の抱合体のクリアランスを起こすことができる糖クラスターを有するク リアリング剤を投与し、そのクリアリング剤がリガンドーアンチリガンド結合対 の低アフィニティの相補的メンバーを取込み、 次にレシピエントに活性薬剤及びリガンド／アンチリガンド結合対のメンバー を含む第２の抱合体を投与することを含み、第２の抱合体の結合対のメンバーは 第１の抱合体のものに相補的なものであり、好ましくは、そのメンバーの本来の 形態または高アフィニティの形態を構成するものである方法を提供する。 本発明のクリアリング剤は、一回でまたは分割してまたは連続的な点滴により 投与し得る。例えば、ビオチン化クリアリング剤を一回で投与すると、血行中の ターゲティング部分-ストレプトアビジンレベルが急激に低下し、次いで多少上 昇する。その理由は、少なくともその一因として、レシピエントの生理的区画内 でターゲティング部分-ストレプトアビジンの平衡が回復するためであると推測 される。従ってターゲティング部分-ストレプトアビジンのクリアランスを補う ために２次的用量即ち追加用量のクリアリング剤を投与してもよい。あるいは、 ターゲティング部分-ストレプトアビジンを連続的にクリアするのに十分な時間 にわたってクリアリング剤を静脈内注入してもよい。 本発明の実施においては、循環中のターゲティング部分-リガンドまたは-アン チリガンド抱合体をレシピエントの循環から除去するためには、他の種類のクリ アリング剤及びクリアランスシステムも有用である。例えば、実施例Ｉは微粒子 を主成分とするクリアリング剤を記載している。そのような微粒子を主成分と するクリアリング剤は、本発明の肝臓指向性化合物を提供するために糖クラスタ ーとの結合に使用できる。 本発明の実施態様において、I-125、I-123、Er-165、Sb-119、Hg-197、Ru-97 、T1-201及びI-125及びBr-77のようなオージェ電子エミッタまたは核結合薬剤を ターゲット細胞核にデリバリーする場合には即効性のクリアリング剤が有効であ る。本発明のこれらの実施態様では、ターゲット細胞表面のインターナリゼーシ ョンレセプターに局在させたターゲティング部分を利用して、ターゲティング部 分含有抱合体(即ち、好ましい２段階プロトコルではターゲティング部分-アンチ リガンド抱合体)をターゲット細胞集団にデリバリーする。このようなインター ナリゼーションレセプターとしては、EGFレセプター、トランスフェリンレセプ ター、HER2レセプター、IL-2レセプター、他のインターロイキン及びクラスター 分化抗原レセプター、ソマトスタチンレセプター、他のペプチド結合レセプター 等がある。 抱合体をターゲット細胞に局在させるために十分な時間であるが、レセプター 媒介事象(receptor-mediated event)を介した細胞によるターゲットに向けらさ れた抱合体のインターナリゼーションが誘発されるためには不十分である時間の 経過後、即効性のクリアリング剤を投与する。好ましい２段階プロトコルにおい ては、循環中のターゲティング部分含有抱合体との複合体を形成する機会がクリ アリング剤に与えられた直後に、ビオチン-オージェ電子エミッタまたはビオチ ン-核作用薬のような活性薬剤含有のリガンドまたはアンチリガンド抱合体を投 与する。クリアリング剤投与と活性薬剤投与との時間差は約24時間未満である。 このようにして、活性薬剤はターゲット細胞レセプターを介したインターナリゼ ーションによって容易にインターナリゼーションを受ける。循環中のオージェ電 子エミッタは無毒であると考えられているが、本発明のブレターゲティングプロ トコルによって実現する特異的ターゲティングは、入手し得る安定に結合できる I-123のような半減期の短いオージェ電子エミッタの効果を増強する。 下記の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は説明のために 提示されたものであり、本発明を限定するものではない。実施例Ｉ 粒状クリアリング剤 キメラ性モノクローナル抗体−アビジンのクリアランスは粒状型クリアリング 剤（例えば複数のビオチン分子が結合したポリマー粒子）を投与することにより 助長される。このような粒状クリアリング剤は複数のビオチン分子が結合した生 分解性ポリマーキャリアを構成することが好ましい。本発明の粒状クリアリング 剤は投与された循環抱合体と結合し、該抱合体をレシピエントから除去する能力 を示す。本発明のこの形態の粒状クリアリング剤はこの目的に適した任意の形態 をとり得る。好ましい粒状クリアリング剤は下記特徴のうちの１つ以上を示す： −微粒状(例えば直径約0.5μm〜約100μm、より好ましくは約0.5〜約２μm)の さらさらした粉末構造； −約３〜約180日間、より好ましくは約10〜約21日間で生分解するように設計 された生分解性構造、又は非生分解性構造； −クリアリング剤の分布、代謝及び排泄の過程にわたってレシピエントの生理 機構と生体適合し、より好ましくは生体適合性生分解生成物を含むこと；及び −１個以上の結合部分(好ましくはリガンド／アンチリガンド対の相補的な構 成員(メンバー))を介してレシピエントから消失あるいは除去され易くするよう に１個以上の循環抱合体と結合できること。粒状クリアリング剤の総モル結合能 は、選択された粒子径及びリガンド又はアンチリガンド置換比に依存する。結合 部分は本明細書中に記載するように共有又は非共有的な様式で粒状剤形の表面構 造と結合することができ、先に投与した循環する結合対構成員との結合に使用可 能なリガンド又はアンチリガンドを提供する。 本発明の好ましい粒状クリアリング剤は生分解性又は非生分解性の微粒子であ る。より好ましくは、粒状クリアリング剤はランダムな非酵素的加水分解切断に より生分解するマトリックスを含むポリマーから形成される。 本発明で使用するには、αヒドロキシカルボン酸及び関連ラクトンの縮合から 誘導されるポリマーがより好ましい。特に好ましい部分は熱可塑性ポリエステル （例えばポリラクチド又はポリグリコリド）の混合物又は、ポリ（ラクチド-コ -グリコリド）等のラクチド及びグリコリド成分から成るコポリマーから形成さ れる。構造の例としてランダムポリ(DL-ラクチド-コ-グリコリド)を下記に示す 。x及びyの値は、望ましい微粒子特性が得られるように操作することが当業者に は可能である。 本発明の粒状クリアリング剤を形成するのに適した他の物質としてはポリオル トエステル類とポリアセタール類（Polymer Letters, 18:293，1980）及びポリ オルトカーボネート類（米国特許第4,093,709号）等が挙げられる。 本発明のマトリックス粒子を含む好ましい乳酸／グリコール酸ポリマーはエマ ルジョンに基づく方法により調製されるが、これは溶剤抽出法の変法であり、こ のような方法は例えば、カウザーら(Cowsar et al.)，“Poly(Lactide-Co-Glyco ide)Microcapsules for Controlled Release of Steroids，”Methods Enzymolo gy ，112:101-116，1985(微粒子中へのステロイドトラップ);エルドリッジら(Eld ridge et al.)，“Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glyc olide)Microspheres as an Adjuvant for StaphylococcalEnterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Tpxin-Neutralizing Antibodies,”Infection a nd Immunity ，59:2978-2986，1991(トキソイドトラップ);コーエンら(Cohen et al.)，“Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly（Lactic/G lycolic Acid）Microspheres,”Pharmaceutical Research, 8(6):713-720，1991 （酵素トラップ）；及びサンダースら(Sanders et al.)，“Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lacti de-Co-Glycolide)Microspheres,”J ．Pharmaceutical Science, 73(9):1294-129 7，1984（ペプチドトラップ）に記載されている。 一般に、本発明の粒状クリアリング剤を形成する手順には、ポリマーをハロゲ ン化炭化水素溶剤に溶解する段階と、ハロゲン化炭化水素溶剤に対しては溶剤と して機能するがポリマーの溶剤としては機能しない付加物質を加える段階が含ま れる。ポリマーはポリマー-ハロゲン化炭化水素溶液から析出する。粒子形成後 、洗浄し、有機溶剤で硬化させる。次いで水洗工程及び水性非イオン界面活性剤 による洗浄工程を行い、その後室温で減圧乾燥する。 生体適合性を持たせるために、粒状クリアリング剤を包装、貯蔵又は投与前に 滅菌する。滅菌はこの目的に適した任意の方法で実施することができる。例えば 、γ線照射が粒子に結合している結合部分の構造又は機能に悪影響を与えない場 合には、粒子にγ線を照射することができる。結合部分が悪影響を受ける場合に は、粒状クリアリング剤を滅菌条件下で製造すればよい。 好ましいラクチド／グリコリド構造は哺乳動物生理環境に生体適合性を示す。 また、これらの好ましい徐放性投与形態は、その生分解によりいずれも哺乳動物 の通常の代謝産物である乳酸とグリコール酸を形成するという利点がある。 場合によっては非分解性又は生分解性ポリマー単位と共に結合部分と粒子の結 合に必要な官能基を粒状構造に組み込む。この目的に利用可能な官能基としては 、リガンド又はアンチリガンド及びヘキソースクラスターディレクター試薬と反 応性の基が挙げられ、例えばカルボキシル基、アミン基、スルフヒドリル基等で ある。好ましい結合増強部分としては、好ましい（ラクチド-グリコリド）ポリ マーを含むマトリックス等の末端カルボキシル基が挙げられる。当業者は適当な 官能基を選択し、これらの官能基が関与する抱合反応をモニターすることができ る。 上記の種類の粒状クリアリング剤を使用することにより得られる利点を以下に 述べる： −「ミクロン」寸法範囲の粒子がこの能力が得られるようなガラクトース誘導 化又は電荷修飾増強法によりRES及び肝臓に局在し、好ましくは粒子がクリアラ ンス機能を発揮するのに十分な時間循環中に維持されるように設計される； −粒子の寸法によりその中枢血管区画における保持が助長され、末梢又は血管 外区画への平衡化が実質的に阻止される； −粒子に結合するリガンド又はアンチリガンドに望ましい置換基をポリマー構 造内に導入できる； −望ましい特性（例えば、粒子-ビオチンクリアリング剤からのビオチン代謝 物の放出を減少させる血清ビオチニダーゼ耐性）をもつリガンド又はアンチリガ ンド-粒子結合が得られる；及び −複数のリガンド又はアンチリガンドを粒子に結合することかでき、循環ター ゲティング剤-リガンド又はアンチリガンド抱合体の最適な架橋と架橋種の有効 なクリアランスを得ることができる。この利点は、貯蔵中及びin vivo投与時に 粒状の凝集が生じないように注意すると最も良く達成される。 実施例II ２段階in vivoプレターゲッティングのための ターゲッティング部分-アンチリガンド抱合体 A ．SMCC誘導化ストレプトアビジンの調製． ストレプトアビジン31mg（0.48mol）をPBS9.0mlに溶解し、3.5mg/mlの最終溶 液を調製した。0.5Mホウ酸バッファー，pH8.5，0.9mlを加えて溶液のpHを8.5に 調整した。SMCCのDMSO溶液(3.5mg/ml)を調製し、この溶液477l(4.8mol)をタンパ ク溶液に攪拌しなから滴下混合した。30分間撹拌した後、溶液をG-25（PD-10， ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュー・ジャージー）カラムクロマトグラフィ ーにより精製し、未反応または加水分解したSMCCを除去した。精製SMCC誘導化ス トレプトアビジンを単離した(28mg，1.67mg/ml)。 B ．DTT還元NR-LU-10の調製． PBS15.0ml中のNR-LU-10 77mg(0.42mol)に0.5M ホウ酸バッファー（pH8.5）1.5mlを加えた。400mg/ml（165l）のDTT溶液をタン パク溶液に加えた。室温で30分間撹拌後、還元抗体をG-25サイズ排除クロマトグ ラフィーにより精製した。精製DTT還元NR-LU-10を得た(74mg，2.17mg/ml)。 C ．SMCC-ストレプトアビジンとDTT還元NR-LU-10の抱合． DTT還元NR-LU-10(6 3mg，29ml，0.42mol)をPBS 44.5mlで希釈した。SMCC-ストレプトアビジンの溶液 （28mg，17ml，0.42mol）をNR-LU-10の撹拌溶液に素早く加えた。反応混合物中 の総タンパク濃度は1.0mg/mlであった。反応の進行を 分後に5mMの最終濃度まで固体四チオン酸ナトリウムを加えるこにとより反応を 停止した。 D. 抱合体の精製． 小規模の反応では、HPLC Zorbax(分取)サイズ排除クロマ トグラフィーを使用して（ストレプトアビジンに関して）モノ又はジ置換された 抱合体を得た。求めるモノ置換又はジ置換抱合体生成物は14.0-14.5分（流速3.0 ml/min）で溶出し、未反応NR-LU-10は14.5-15分で溶出し、未反応誘導化ストレ プトアビジンは19-20分で溶出した。 大規模な抱合反応では、DEAEイオン交換クロマトグラフィーを使用してモノ置 換又はジ置換付加物を単離することができる。粗抱合体混合物を濃縮した後、ホ ウ酸ナトリウムバッファー（pH8.6）中2.5%キシリトールでカラムを溶離するこ とにより遊離ストレプトアビジンを除去した。その後、水酸化ナトリウムでpH8. 6に調整した20mMジエタノールアミンに増加する塩勾配を用いて、結合している 未反応抗体及び求める抱合体をカラムから逐次溶出させた。 E. 抱合体の特性決定． 1. 小規模精製に関しては、上記のようにHPLCサイズ排除を実施した。 2. 非変性条件下で5%ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGE分析を実施し た。評価しようとする抱合体はSDSを含むサンプルバッファー中で煮沸せず、ス トレプトアビジンが15kDサブユニットに解離しないようにした。モノ及びジ置換 抱合体に対応する２つの生成物バンドがゲル上に観察された。 3. 例えば競合結合ELISAにより遊離抗体と比較した免疫反応性を評価した。 得られた値は遊離抗体の10%以内であった。 4. 例えば既知量の抱合体をp-[¹²⁵I]-ヨードベンゾイルビオシチンで滴定す ることによりビオチン結合能を評価した。標識ビオシチン４当量を添加すると、 ビオチン結合部位の飽和が観察された。 5. 反応生成物を特性決定するためには、例えば血清クリアランスプロフィル 、抱合体が抗原陽性腫瘍をターゲットする能力、抱合体の経時的腫瘍保持及びビ オチン化分子が腫瘍でストレプトアビジン抱合体と結合する能力等の試験を含むin vivo 試験が有用である。 これらのデータによると、天然NR-LU-10完全抗体と同様の血中クリアランス特 性と、最低でも天然NR-LU-10と同等の腫瘍取り込み及び保持特性を示す1:1 ストレプトアビジン-NR-LU-10完全抗体が合成により形成されたことが容易に判 断される。 例えば、図１は天然NR-LU-10完全抗体の対照プロフィルと比較したNR-LU-10- ストレプトアビジン抱合体(LU-10-StrAv)の腫瘍取り込みプロフィルを示す。LU- 10-StrAvはストレプトアビジン成分のみが放射性ラベルされており、LU-10-StrA vがNR-LU-10完全抗体自体と同程度に効果的にターゲット細胞に局在することを 明白に示した。 実施例III DOTA-ビオチン抱合体の合成 A.ニトロベンジル-DOTAの合成 アミノベンジル-DOTAの合成は、実質的にマクマリーら(McMurry et al.)，Bio conjugate Chem. ，3:108-117，1992の手順に従って実施した。この従来技術の合 成の必須段階は、ジスクシンイミジルN-(tert-ブトキシカルボニル)イミノジア セテートとN-(2-アミノエチル)-4-ニトロフェニルアラニンアミドの分子間環化 により、1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-(4-ニトロベンジル)-3,6,11-トリオキ ソ-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカンを調製する段階である。言い換えると、 必須段階はビス-NHSエステルとジアミンの分子間環化により、環化ドデカンを得 る段階である。マクマリーら(McMurry et al.)は140mmol規模で環化工程を実施 し、DMF 100mlにそれぞれの試薬を溶解し、ジオキサン４リットルを入れた反応 釜にシリンジポンプにより48時間かけて加えた。 マクマリーら(McMurry et al.)の手順の５倍スケールアップは反応容量、添加 速度及び反応時間の点で実際的ではなかった。プロセス化学試験の結果、求める 環化生成物を同等の収率で獲得しながら、反応添加速度を実質的に増加し且つ溶 剤容量を大幅に低減できることが判明した。そこで、30mmol規模でそれぞれの試 薬をDMF 500mlに溶かし、ジオキサン３リットルを入れた反応釜に27時間かけて 添加漏斗で加えた。使用した方法は添加速度5.18mmol／時で反応濃度は0.047Mで あった。 B.N- メチルグリシンと結合した抱合体の合成． D-アラニンと結合したDOTA-ビオチン抱合体を調製するのに用いたのと同様の 方法により、N-メチルグリシンと結合したDOTA-ビオチン抱合体を調製した。N- メチルグリシン（慣用名サルコシン、シグマ・ケミカル社より入手可能）をDMF 及びトリメチルアミン中でビオチン-NHSエステルと縮合し、N-メチルグリシルビ オチンを得た。次にN-メチルグリシルビオチンをEDCI及ひNHSで活性化した。で きたNHSエステルを単離せずにDOTA-アニリン及び過剰のピリジンとその場で縮合 させた。反応溶液を60℃に10分間加熱した後、蒸発させた。残渣を分取HPLCによ り精製し、[(N-メチル-N-ビオチニル)-N-グリシル]-アミノベンジル−DOTAを得 た。 1.(N-メチル)グリシルビオチンの調製。DMF(8.0ml)及びトリメチルアミン（0. 61ml，4.35mmol）を固体N-メチルグリシン(182mg，2.05mmol)及びN-ヒドロキシ スクシンイミジルビオチン(500mg，1.46mmol)に加えた。混合物を85℃の油浴中 で１時間加熱すると、この間に固体は溶解し、無色透明溶液となった。次に溶剤 を蒸発させた。黄色い油状残渣を氷酢酸で酸性化し、蒸発させ、シリカ50ｇを充 填した27mmカラム上で30% MeOH/EtOAc 1% HOAcで溶出するクロマトグラフィーに かけ、生成物を白色固体（383mg）として得た（収率66%）。 2.[(N-メチル-N-ビオチニル)グリシル]アミノベンジル-DOTAの調製。N-ヒドロ キシスクシンイミド（10mg，0.08mmol）及びEDCI（15mg，6.08mmol）をN-メチル グリシルビオチン（24mg，0.08mmol）のDMF(1.0ml)溶液に加えた。溶液を23℃で 64時間撹拌した。ピリジン（0.8ml）及びアミノベンジル-DOTA(20mg，0.04mmol) を加えた。混合物を63℃の油浴中で10分間加熱した後、23℃で４時間撹拌した。 溶液を蒸発させた。残渣を分取HPLCにより精製し、生成物をオフホワイト固体(8 mg，0.01mmol)として得た（収率27%）。 実施例IV クリアリング剤評価実験 A.ヒト血清アルブミン(HSA)のガラクトース及びビオチン誘導化． 安価且つ 非免疫原性であるという利点を示すことからHSAを評価した。AOに関して先に述 ベられているのと同様の化学により、ビオチン濃度を変えて（１〜約９ビオチン ／分子）HSAを誘導化した。より詳しく言えば、シグマ・ケミカル社から入手可 能なHSAの溶液(PBS中5-10mg/ml)に10% v/v 0.5Mホウ酸ナトリウムバッファー（p H8.5）を加えた後、NHS-LC-ビオチン（シグマ・ケミカル社）のDMSO溶液を求め るモル供給比（反応体の相対モル当量）で撹拌溶液に滴下した。反応混合物中の 最終DMSO百分率は5%を越えるべきでない。室温で１時間撹拌した後、反応が完了 した。HSA上へのビオチンの取り込みが効率90%で一般に観察された。その結果、 LC-ビオチンのNHSエステル３モル当量を導入した場合には、約2.7ビオチン/HSA 分子が得られた。G-25サイズ排除クロマトグラフィーを用いてビオチン誘導化HS Aから未反応ビオチン試薬を除去した。あるいは、粗生成物を直接ガラクトシル 化してもよい。予めビオチン化されていないデキストランをビオチン化する場合 にも同一の化学を適用できる。 次に12-45ガラクトース／分子でHSA-ビオチンを誘導化した。ビオチン化HSAの ガラクトース誘導化は、リーら(Lee，et al.)，Biochemistry，15：3956，1976 の手順に従って実施した。より詳しく言えば、シアノメチル-2,3,4,6-テトラ-O- アセチル-1-チオ-D-ガラクトピラノシドの0.1Mメタノール溶液を調製し、メタノ ール中10% v/v 0.1M NaOMeと12時間反応させ、反応性ガラクトシルチオイミデー トを生成した。ビオチン化HSAのガラクトシル化は、300倍モル過剰の反応性チオ イミデートからの無水メタノールを最初に蒸発させることにより開始した。10% v/v 0.5Mホウ酸ナトリウムで緩衝したPBS中のビオチン化HSAを油状残渣に加えた 。室温で２時間撹拌した後、混合物を４℃で12時間保存した。次にガラクトシル 化HSA-ビオチンをG-25サイズ排除クロマトグラフィ-又はバッファー交換により 精製し、求める生成物を得た。デキストランのガラクトシル 化にも同一の化学が利用可能である。HSA上へのガラクトースの取り込み効率は 約10%である。 24時間前にStrAv-MAb 200μg又はPBS 200μlを予め投与しておいたマウスに12 -45のガラクトース残基と９個のビオチンを含むガラクトース-HSA-ビオチン（G- HSA-B）70μgを投与した。その結果、G-HSA-BはStrAv-MAbを循環から除去するの に有効であることが示された。また、G-HSA-Bの薬物動力学は循環MAb-StrAvの有 無を問わず撹乱されず且つ迅速である。 B.非タンパク性クリアリング剤． 約18ビオチン／分子で予め誘導化し且つ同 数の遊離１級アミンを有する分子量70,000ダルトンの市販の形態のデキストラン を試験した。１級アミン部分は、上述のHSAベースのクリアリング剤について考 察した手順に実質的に従って約９ガラクトース／分子の濃度でガラクトシル化試 薬を用いて誘導化した。ガラクトース対HSAのモル当量供給比は約300:1であり、 ガラクトースの約３分の１が活性形態に転化された。次に、24時間前にMAb-StrA v抱合体200μgを静脈内投与しておいた一群のマウスにガラクトース-デキストラ ン-ビオチン（GAL-DEX-BT）40μgをi.v.注射し、別の同様の群のマウスにGAL-DE X-BT80μgを注射した。GAL-DEX-BTはStrAv-MAb抱合体を迅速且つ有効にクリアし 、クリアリング剤投与から４時間以内に循環抱合体の66%を越える量が除去され た。存在する循環StrAv抱合体の化学量論量の1.6倍(40μg)及び3.2倍(80μg)に 対応するクリアリング剤用量の両方で同等の効果が観察された。 C.G-HSA-B クリアリング剤の用量変動． MAb-StrAv抱合体200μgを投与し、24 時間後にクリアリング剤を投与し、２時間後にPIP-ビオシチン5.7μgを投与する という基本フォーマットに従って用量変動試験を行った。 用量変動試験はG-HSA-Bクリアリング剤を用いて実施し、９ビオチン／分子及 び12-45ガラクトース残基／分子の負荷から開始した。MAb-StrAv抱合体200μg用 量投与から24時間後に20、40、70及び120μgの用量を投与した。クリアリング剤 投与から２時間後にI-131-PIP-ビオシチン5.7μgを投与した。PIP-ビオシチンの 腫瘍取り込み及び血液保持をその投与から44時間後（クリアリング剤投与から46 時間後）に調べた。その結果、G-HSA-Bを投与することにより40μg 以上の全ての用量でPIP-ビオシチンの血中保持の最下点が達成されることが示さ れた。もっとも、G-HSA-Bを増加させていく各用量で、PIP-ビオシチンの腫瘍結 合が明らかに用量依存的に低下した。MAb-StrAv抱合体の腫瘍局在化に影響を及 ぼす用量依存性効果は観察されなかったので、このデータは代謝分解されたクリ アリング剤からのビオチンの放出により腫瘍と結合したMAb-StrAv抱合体が比較 的より高度に遮蔽されることを示すものと解釈された。腫瘍／血液比のプロット に関してアシアロオロソムコイドクリアリング剤について先に述べたものと同様 の結果がG-HSA-Bでも認められ、約40μg用量で血中クリアランスと腫瘍保持の間 の最適なバランスが生じた。 このクリアリング剤により放出可能なビオチンのモル量は高用量時に比較的大 きいので、低レベルのビオチン化がクリアリング剤の有効性に及ぼす効果を評価 する試験を行った。９、５又は２ビオチン／分子のいずれかで誘導化したG-HSA- Bは同一のタンパク用量のクリアリング剤でMAb-StrAv抱合体を血液からクリアす ることができた。全レベルのビオチン化で血液からの有効で迅速なMAb-StrAvの クリアランスが得られた。 腫瘍を有するマウスで60μg用量の各クリアリング剤を用いて、これらの９、 ５及び２ビオチンで誘導化したクリアリング剤と単一ビオチンG-HSA-Bクリアリ ング剤との比較を行った。この実験の結果、各クリアリング剤はクリアリング剤 投与から２時間後にMAb-StrAv抱合体の血中クリアランス及び腫瘍保持において 実質的に同等に有効であることが示された。単一ビオチンを含むG-HSA-Bを、PIP -ビオシチンの予備局在化されたMAb-StrAv抱合体との腫瘍結合を維持しながら血 液中で後に投与されるビオチン化小分子（PIP-ビオシチン）の結合を低下させる 能力について試験した。PIP-ビオシチン投与から44時間後に測定したところ、MA b-StrAv抱合体とPIP-ビオシチンの両者の腫瘍局在化は広い用量範囲(90-180μg) にわたって１ビオチン／分子を含むG-HSA-Bにより良好に維持された。単一ビオ チンG-HSA-Bクリアリング剤の用量を増加することにより、腫瘍局在を本質的に 一定に維持しながらPIP-ビオシチンの血中保持の漸減が達せられ、このクリアリ ング剤はビオチン化レベルが低いものが好ましいことが示された。これが好まし いのは、単一ビオチンG-HSA-Bクリアリング剤が広い用量範囲にわたって MAb-StrAvをクリアするのに有効であり（患者毎に最適用量を滴定する必要がな くなる可能性かある）、全身の循環に放出される競合ビオチンが高ビオチン負荷 レベルの同じクリアリング剤よりも少いと思われることによる。 クリアリング剤から放出されるビオチンが、活性薬剤-ビオチン抱合体の予備 局在化ターゲティング部分-ストレプトアビジン抱合体に対する結合に及ぼす効 果を低下させる別の方法は、保持リンカーを用いてタンパク若しくはポリマー又 は他の主要クリアリング剤成分をビオチンに結合させることである。保持リンカ ーは、ペプチド結合を開裂する薬剤に対して耐性を示す化学構造を有し、場合に よってはリソソームなどの代謝空間に存在するとプロトン化される。本発明の好 ましい保持リンカーは上記特徴の両方を有するD-アミノ酸の短鎖又は小分子であ る。本発明の保持リンカーの例は塩化シアヌルであり、これはタンパク性主要ク リアリング剤成分のリシンのεアミノ基と、（上述の）還元され化学的に修飾さ れたビオチンカルボキシ部分のアミン部分との間に挿入され、下記構造： の化合物を形成することができる。上記化合物が代謝分解空間で代謝分解される と、複素環はプロトン化される。環プロトン化により代謝分解物はリソソームか ら出られなくなる。こうして複素環を含むビオチン代謝分解物は代謝分解部位に 拘束され、従って、予備局在化されたターゲティング部分-ストレプトアビジン ターゲット部位に関して活性薬剤-ビオチン抱合体とは競合しない。 G-HSA-B用量変動試験で観察された放射性ラベルPIP-ビオシチンの腫瘍／血液 局在化を比較した結果、広い用量範囲(90-180μg)にわたって最適な腫瘍対バッ クグラウンドターゲティングが達せられることが示され、その結果、クリアリン グ剤用量が多くても有効であると予想された。用量変動実験の別の重要な結果は 、１分子当たり平均１個しかビオチンをもたないG-HSA-Bがアシュウエルレセプ ターメカニズムを介してのみMAb-StrAv抱合体をクリアすると推測されることで あり、これはMAb-StrAv抱合体とクリアリング剤の架橋及び凝集を生じるにはビ オチンが少なすぎることによる。このような凝集体は細網内皮系により除去され る。 D.G-HSA-B を用いた腫瘍ターゲティング評価． この実験のプロトコルは以下 の通りであった： 時刻０：400μgのMAb-StrAv抱合体を投与し； 24時間後：１ビオチン及び12-45ガラクトースを含むG-HSA-B240μgを投与し； 26時間後：６μgのを投与した。Lu-177は公知の方法を用いてDOTAキレートと錯化される。 腫瘍１g当たり20-25%の注射用量でLu-177-DOTA-ビオチン小分子の有効な分配 が観察された。これらの値はMAb-StrAv抱合体の分配効率と同等である。この非 最適化クリアリング剤用量で得られたAUC_tumor/AUC_bloodは匹敵する直接のMAb- 放射性ラベル投与で得られる値の300%であった。その後の実験では、匹敵する通 常のMAb-放射性ラベル投与により得られる値の1000%高いAUC_tumor/AUC_bloodが得 られた。さらに、HSAをベースとするクリアリング剤はヒトにおいて示す免疫原 性の程度は低いと予想される。 実施例Ｖ 低分子量クリアリング剤の調製 この手順は図２に概略的に図示する。 メチル6-ブロモヘキサノエート． 20g（102.5mmol）の6-ブロモヘキサン酸及 び500mLのメタノールを充填した１リットルの丸底フラスコに、塩化水素ガスを2 -3分間吹き込んだ。この混合物を室温で４時間撹拌して濃縮し、21.0gの生成物 を黄色油状物として得た(99%)： メチル6-アミノヘキサノエート塩酸塩． 40.0gのアミノカプロン酸を充填し た１リットルの丸底フラスコに500mLのメタノールを加えた。この混合物に塩化 水素ガスを５分間吹き込み、混合物を室温で５時間撹拌した。その後、ロータリ ーエバポレーションにより、次いで完全真空ポンプ圧力（<0.1mmHg）下で混合物 を濃縮し、55gの生成物を白色固体として得た(99%)： メチル6-(トリフルオロアセトアミド)-ヘキサノエート． 25.0g(138mmol)の メチル6-アミノヘキサノエート塩酸塩及び500mLの塩化メチレンを充填した１リ ットルの丸底フラスコに、24mL(170mmol)の無水トリフルオロ酢酸を添加した。 混合物を氷浴で冷却し、42mL(301mmol)のトリエチルアミンを25-30分かけて添加 した。０℃の混合物を室温になるまで２時間撹拌し、次いで濃縮した。残渣を15 0mLのジエチルエーテル及び150mLの石油エーテルで希釈し、得られた溶液を、先 ず１NのHCl水溶液（3ｘ150mL）で洗浄し、次いで飽和重炭酸ナトリウム水溶液（ 3ｘ150mL）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して濃縮し 、32.9gの生成物を淡黄色油状物として得た(99%)： N,N' −ビス(6-メトキシカルボニルヘキシル)アミン塩酸塩． 12.0g(50.0mmol )の二級アミド、メチル6-（トリフルオロアセトアミド)-ヘキサノエート及び250 mLの乾燥テトラヒドロフランを充填した500mLの乾燥丸底フラスコに、2.2g（55m mol,，1.1当量)の60%水素化ナトリウムを添加した。混合物を室温で30分間撹拌 し、次いで10.25g（49.0mmol、0.98当量）のアルキルブロミド、メチル6-ブロモ ヘキサノエートを添加した。混合物を還流しながら３時間撹拌した。さらに5.80 g（27.7mmol、0.55当量）のメチル6-ブロモヘキサノエートを添加し、混合物を 還流しながら70時間撹拌した。混合物を冷却し、150mLの1N HCl水溶液で希釈し 、次いで酢酸エチル（3ｘ100mL）で抽出した。有機抽 出物を合わせて、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して濃縮した。残渣を200m Lのメタノールで希釈し、次いで30mLの10N水酸化ナトリウム水溶液で処理した。 混合物を室温で18時間撹拌した後、濃縮した。残渣を200mLの脱イオン水で希釈 し、37%の濃HClでpH1-2に酸性化した。溶液をジエチルエーテル（3ｘ100mL）で 洗浄した。水相を濃縮した。残渣を200mLのメタノールで希釈し、再濃縮した。 その残渣を250mLのメタノールで希釈し、HClガスを混合物に2-3分間吹き込み室 温で３時間撹拌した。混合物を濃縮した。残渣を300mLのメタノールで希釈し、 濾過して無機塩を除去した。濾液を３gの活性炭で処理し、セライト（J.T.ベー カー製）で濾過し、濃縮した。黄白色固体の残渣を100mLの2-プロパノールから 再結晶させると、7.0gの生成物が白色固体として得られた。濾液を濃縮し、残渣 をさらに再結晶させると、さらに1.65gの生成物が得られた：総収量8.65g（56% ）： メチル4-メチルアミノブチレート塩酸塩． 30.0g(195mmol)の4-メチルアミノ 酪酸及び500mLのメタノールを充填した１リットルの丸底フラスコに、HClガスを 1-2分間吹き込んだ。混合物を室温で3-4時間撹拌し、次いで濃縮し、32.5gの生 成物を泡状黄白色固体として得た(99%)： 4- メチルアミノブタノール． 32.5g(194mmol)のエステル、メチル4-メチルア ミノブチレート塩酸塩を充填した１リットルの丸底フラスコに、１Mのボランを 含む500mLのテトラヒドロフラン溶液を０℃で１時間かけて添加した。添加が完 了した後、混合物を20時間還流し、０℃に冷却し、100mLのメタノールを慎重に 添加して余剰のボランを破壊した。メタノール全量を添加した後、混合物を室温 で１時間撹拌し、次いで濃縮した。残渣を400mLのメタノールで希釈し、次いで 溶液にHClガスを５分間吹き込んだ。混合物を16時間還流した。混合物を 冷却して濃縮し、次いで250mLの脱イオン水で希釈した。生成物を先ず10Nの水酸 化ナトリウム水溶液を添加によりpH9-9.5にして遊離の塩基とし、次いで70gのAG 1 X-8アニオン交換樹脂（水酸化物型、バイオラドより市販）を添加し、溶液を ２時間撹拌した。樹脂を濾別し、150mLの脱イオン水で洗浄した。水性濾液を合 わせて濃縮した。残渣を200mLの2-プロパノールで希釈し、濾過した。収集した 固体を100mLの2-プロパノールで洗浄した。有機濾液を合わせて濃縮した。残渣 を減圧下で蒸留し、12.85gの生成物を無色油状物として得た(0.1-0.2mmHgで沸点 6℃，64%)： 4-(N- メチル-トリフルオロアセトアミド)-1-ブタノール． 100mLの乾燥メタ ノール中の10.0g(96.9mmol)のアミン、4-メチルアミノブタノールを充填した250 mLの丸底フラスコに、17.5mL(147mmol)のトリフルオロ酢酸エチルを添加した。 混合物を室温で24時間撹拌し、次いで濃縮して、18.55gの生成物をほぼ無色の油 状物質として得た(96%)： 1-(p- トルエンスルホニルオキシ)-4-(N-メチル-トリフルオロアセトアミド)ブ タン ． 400mLの塩化メチレン中の17.0g(85.4mmol)のアルコール、4-(N-メチル- トリフルオロアセトアミド)-1-ブタノールを充填した１リットルの乾燥丸底フラ スコに、17.1g（89.7mmol、1.05当量）のトルエンスルホニルクロリド及び30mL （213mmol、2.5当量）のトリエチルアミンを０℃で10分間でかけて添加した。０ ℃の混合物を室温になるまで15時間撹拌し、次いで5% v/vのHCl水溶液で洗浄し た（3ｘ200mL）。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して濃縮した。残 渣を、先ず50:50のヘキサン／塩化メチレン、次いで塩化メチレンで溶出するシ リカゲルクロマトグラフィーにかけ、25.1gの生成物を淡黄色油状物質として得 た(83%)； 1-S-(2,3,4,6- テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-2-チオシュード ウレア臭化水素酸塩 ． 5.08g（60.8mmol、1.09当量）のチオウレア及び36mLの アセトンを充填した250mLの丸底フラスコに、25.0g(66.7mmol)のテトラ-アセチ ル-α-D-ガラクトピラノシルブロミドを添加した。混合物を還流下で15-20分間 撹拌し、次いで氷冷した。混合物をブフナー漏斗で濾過し、25mLの氷冷アセトン ですすいだ。固体を50mLのアセトンで処理し、15分間還流し、氷冷し、濾過した 。固体を25mLの冷アセトンですすぎ、風乾した後、減圧下に乾燥して、22.6gの 生成物を白色固体として得た(76%)： 4-(N- メチルアミノブチル)-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド． 70mLの脱イ オン水中の上記のように調製したチオシュードウレア臭化水素酸塩20.7g（42.5m mol、1.07当量）を充填した500mLの丸底フラスコに、6.4g（46.3mmol、1.16当量 ）の炭酸カリウム及び4.7g（45.2mmol、1.13当量）の重亜硫酸水素ナトリウムを 添加し、次いで直ちに70mLのアセトン中の14.1g（39.9mmol、1.0当量）のトシレ ート、1-(p-トルエンスルホニルオキシ)-4-(N-メチルトリフルオロアセトアミド )ブタンを添加した。混合物を室温で16時間撹拌した。次いで混合物を50mLの塩 水で希釈し、酢酸エチルで抽出した（3ｘ200mL）。有機抽出物を合わせて、硫酸 マグネシウム上で乾燥し、濾過して濃縮した。残渣を、先ず75%塩化メチレン／ ヘキサン、次いで塩化メチレン、次に2%メタノール／塩化メチレン、最後に10% メタノール／塩化メチレンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。 種々のアセチル化度のアルキル化生成物を含有する分画を合わせて濃縮した。残 渣を250mLのメタノール及び150mLの脱イオン水で希釈し、110gのAG-1X-8樹脂（ 水酸化物型；乾燥重量１gあたり2.6ミリ当量；バイオラド社から市販）で処理し た。混合物を室温で18時間撹拌した。混合物を濾過し、樹脂をメタノール（2ｘ1 50mL）で洗浄した。濾液を合わせて 濃縮し、6.1gの生成物を得た(54%)： ビオチンビス-メチルエステル： 1.00g（3.23mmol、1.13当量）のアミン塩酸 塩、N,N'-ビス-(6-メトキシカルボニルヘキシル)アミン塩酸塩及び1.30g（2.86m mol）のカプロアミドビオチンNHS-エステル（標準的方法により調製可能、或い はシグマ・ケミカル・カンパニーより市販）と10mLの乾燥ジメチルホルムアミド を充填した50mLの丸底フラスコに、1.5mL(10.6mmol)のトリエチルアミンを添加 した。混合物を85℃で２時間撹拌し、次いで減圧ロータリーエバポレーションで 濃縮した。残渣を、75:25:0.05の酢酸エチル／メタノール／酢酸で溶出するシリ カゲルクロマトグラフィーにかけ、1.63gの生成物を白色泡状固体として得た(93 %)： ビオチンビス-酸： 1.61g(2.63mmol)のビオチン ビス-メチルエステル及び5 0mLのメタノールを充填した200mLの丸底フラスコに、５mLの３Nの水酸化ナトリ ウム水溶液を添加した。混合物を40℃で３時間撹拌し、次いで減圧ロータリーエ バポレーションで濃縮した。残渣を50mLの脱イオン水で希釈し、次いで３NのHCl 水溶液をpH1-2になるまで添加した。混合物を再度濃縮した。残渣を、最初に20: 80:0.1のアセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸、次いで50:50:0.1のアセトニ トリル／水／トリフルオロ酢酸で溶出するC-18逆相シリカゲルクロマトグラフィ ーにかけた。生成物を含有する分画を合わせて濃縮した。残渣を40mLの水及び20 mLのアセトニトリルで希釈した。溶液を冷凍し（-70℃）、凍結乾燥して、1.42g の生成物を綿毛状の白色固体として得た(92%)： ビオチン テトラーメチルエステル： 350mg（0.599mmol）のビオチンビス- 酸、402mg（1.30mmol、2.16当量）のアミン塩酸塩、N,N'-ビス-(6-メトキシカル ボニルヘキシル)アミン塩酸塩、及び10mLの乾燥ジメチルホルムアミドを充填し た50mLの丸底フラスコに、556mg（1.26mmol、2.10当量）のBOP及び500μL（3.54 mmol、5.91当量）のトリエチルアミンを添加した。混合物を室温で２時間撹拌し 、次いで減圧ロータリーエバポレーションで濃縮した。残渣を、最初に50:50 メタノール／水、次いで85:15 メタノール／水で溶出するC-18逆相シリカゲル クロマトグラフィーにかけ、618mgの生成物を泡状白色固体として得た(95%)： ビオチンテトラー酸： 350mg（0.319mmol）のビオチン テトラメチル-エス テル及び15mLのメタノールを充填した50mLの丸底フラスコに、５mLの１Nの水酸 化ナトリウム水溶液及び５mLの脱イオン水を添加した。混合物を室温で14時間撹 拌し、次いで減圧ロータリーエバポレーションで濃縮した。残渣を15mLの脱イオ ン水で希釈し、６NのHCl水溶液を加えてpH1-2に酸性化し、次いで再度濃縮した 。残渣を、最初に50:50 メタノール／水、次いで70:30 メタノール／水で溶出 するC-18逆相シリカゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有する分画を 合わせて濃縮した。残渣を10mLの水及び８mLのアセトニトリルで希釈した。溶液 を冷凍し(-70℃)、凍結乾燥して、262mgの生成物を綿毛状白色固体として得た(7 9%)： ビオチンオクタ-メチルエステル： 220mg（0.710mmol、4.93当量）のアミン 塩酸塩、N,N'-ビス-(6-メトキシカルボニルヘキシル)アミン塩酸塩、150mg（0.1 44mmol）のビオチンテトラ-酸、及び５mLの乾燥ジメチルホルムアミドを充填し た25mLの丸底フラスコに、300mg（0.678mmol、4.71当量）のBOP、続いて500μl のトリエチルアミン（3.54mmol、24.0当量）を添加した。混合物を室温で３時間 撹拌し、次いで減圧ロータリーエバポレーションで濃縮した。残渣を、最初に60 :40のメタノール／水、次いで90:10のメタノール／水で溶出するC-18逆相シリカ ゲルクロマトグラフィーにかけ、246mgの生成物を泡状白色固体として得た(83%) ： ビオチンオクタ-酸： 235mg（0.114mmol）のビオチンオクタメチルエステル 及び10mLのメタノールを充填した50mLの丸底フラスコに、５mLの１Nの水酸化ナ トリウム水溶液及び５mLの脱イオン水を添加した。混合物を室温で14時間撹拌し 、次いで減圧ロータリーエバポレーションで濃縮した。残渣を10mLの脱イオン水 で希釈し、６NのHCl水溶液でpH1-2に酸性化し、再度濃縮した。残渣を、最初に5 0:50のメタノール／水、次いで75:25のメタノール／水で溶出するC-18逆相シリ カゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有する分画を合わせて濃縮した 。残渣を20mLの1:1（容量比）アセトニトリル／水で希釈した。溶液を冷凍し(-7 0℃)、凍結乾燥して、202mgの生成物を綿毛状白色固体として得た(91%)： ビオチンヘキサデカ-メチルエステル： 154mg（0.497mmol、10.0当量）のア ミン塩酸塩、N,N'-ビス-(6-メトキシカルボニルヘキシル)アミン塩酸塩、97mg（ 0.0497mmol）のビオチンオクタ-酸及び５mLの乾燥ジメチルホルムアミドを充填 した25mLの丸底フラスコに、202mg（0.457mmol、9.2当量）のBOP、500μl（3.54 mmol、71.2当量）のトリエチルアミンを順次添加した。混合物を室温で８時間撹 拌し、次いで減圧ロータリーエバポレーションで濃縮した。残渣を、最初に70:3 0のメタノール／水、次いで95:5のメタノール／水で溶出するシリカゲルクロマ トグラフィーにかけ、149mgの生成物を泡状白色固体として得た(75%)： ビオチンヘキサデシル-酸： 141mg(0.0353mmol)のビオチンヘキサデシル-メ チルエステル及び15mLのメタノールを充填した50mLの丸底フラスコに、８mLの１ Nの水酸化ナトリウム水溶液及び５mLの脱イオン水を添加した。混合物を室温で1 4時間撹拌し、次いで減圧ロータリーエバポレーションで濃縮した。残渣を15mL の脱イオン水で希釈し、６NのHCl水溶液を加えてpH1-2に酸性化し、再度濃縮し た。残渣を、最初に60:40のメタノール／水、次いで85:15のメタノール／水で溶 出するC-18逆相シリカゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有する分画 を合わせて濃縮した。残渣を20mLの1:1アセトニトリル／水で希釈した。溶液を 冷凍し(-70℃)、凍結乾燥して、130mgの生成物を綿毛状白色固体として得た(75% )： ヘキサデカ-ガラクトシルビオチン： 125mg(0.0332mmol)のビオチンヘキサデ カ-酸、179mg（0.636mmol、19.2当量）のガラクトース-アミン、4-(N- メチルアミノブチル)-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド、及び４mLの乾燥ジメチ ルホルムアミドを充填した25mLの丸底フラスコに、264mg（0.597mmol、18.0当量 ）のBOP、400μL（2.87mmol、86.5当量）の乾燥トリエチルアミンを順次添加し た。混合物を室温で17時間撹拌し、次いで減圧ロータリーエバポレーションで濃 縮した。残渣を、最初に60:40のメタノール／水、次いで75:25のメタノール／水 で溶出するC-18逆相シリカゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有する 分画を合わせて濃縮し、最初に40:60:0.1のアセトニトリル／水／トリフルオロ 酢酸、次いで50:50:1のアセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸で溶出するC-18 逆相シリカゲルクロマトグラフィーに再度かけた。生成物を含有する分画を再度 合わせて濃縮した。残渣を20mLの水に溶解した。溶液を冷凍し(-70℃)、凍結乾 燥して、173mgの生成物を泡状白色固体として得た(65%)： 上記の手順は16ガラクトース残基から成るガラクトースクラスターを形成する ためのものである。４又は８ガラクトース体はテトラ酸又はオクタ酸から、上記 の16-ガラクトースクラスターについて述べたガラクトース誘導化工程に進むこ とによりこの手順で製造することができる。同様に、32ガラクトースクラスター 構造体等も本発明にメチルエステル及び酸形成工程をより多く反復して用いるこ とによって調製することができる。求める数の酸残基が形成された時点で、酸残 基の数に適応するように調整した成分比でガラクトース誘導化工程を用いる。実施例VI 低分子クリアリング剤の評価 記載の低分子クリアリング剤の有効性を証明するために、ビオチン結合部分及 びガラクトース残基クラスターディレクターを用いて幾つかの上記のような抱合 体を合成した。これらの抱合体は種々の数のガラクトース残基を結合させて合成 した。さらに、これらの抱合体は以下に図示するような長鎖リンカー（LC=ガラ クトースが結合したアミン及びビオチンが結合したカルボキシル部分の間にアミ ノカプロイルスペーサーを含む）又は短鎖リンカー（SC=ガラクトースが結合し たアミン及びビオチンが結合したカルボキシル部分の間が直接結合している）の いずれかを含んでいた。 試験した抱合体を以下に示す： （ガラクトシル）１−ＳＣ−ビオチン （ガラクトシル）１−ＬＣ−ビオチン （ガラクトシル）２−ＳＣ−ビオチン （ガラクトシル）４−ＳＣ−ビオチン（ガラクトシル）４−ＬＣ−ビオチン （ガラクトシル）８−ＳＣ−ビオチン （ガラクトシル）８−ＬＣ−ビオチン （ガラクトシル）１６−ＬＣ−ビオチン これらの化合物の幾つか又は全てについて２組の実験でクリアランス・ディレ クティング活性をアッセイした。最初の一組の実験では、予め複合体になったモ ノクローナル抗体-ストレプトアビジン-ビオチン-ガラクトースクラスター抱合 体をI-125でラベルしたもののex vivoでの調製、この抱合体のマウスモデルでの 静脈内投与、及び抱合体の血清レベルの経時的測定が行われた。第二の組の実験 ては、MAb-ストレプトアビジン抱合体の静脈内投与、及びそれに続くビオチン- ガラクトースクラスター抱合体の投与が行われた。 NR-LU-10抗体(MW 150kD)を（上記の実施例IIに述へたように）ストレプトアビ ジンに抱合させて、以下に述べるように¹²⁵I/PIP-NHSで放射性ラベルした。抱合 体の抗体成分はp-アリールチンフェニレートNHSエステル(PIP-NHS)及び¹²⁵Iヨウ 化ナトリウムを用いて放射性ヨウ素化した。一般に、２、４及び８ガラクトース -ビオチン構造体に係わる実験は以下に述べるような16ガラクトース-ビオチン構 造体で行うのと同様の方法で行った。 これらの実験のデータから少なくとも４個のガラクトース残基かビオチン分子 に結合するまでは（MAb-ストレプトアビジン抱合体そのものと比較して）血清ク リアランスに有意の増加は起きないことが示される。さらに、そのデータはガラ クトースクラスターをビオチン分子から分離する長いリンカーの方が優れたクリ アランス速度をもたらしたことを示している。これは、立体相互作用を最小にす るために適正な長さのスペーサーを使用しないとガラクトースクラスターがクリ アされる抱合体に結合するのを妨害するか又は糖-肝細胞相互作用が立体配置的 に妨げられるという発明者らの見解に一致する。 in vivoでプレターゲティング形式（例えば、放射性ラベルしたMAb-ストレプ トアビジン抱合体を投与した後、クリアリング剤を投与する）で行った第三の組 の実験では、(ガラクトシル)₈-LC-ビオチン抱合体を上記のように調製したガラ クトース-HSA-ビオチンとさらに比較した。この比較はBalb/cマウスモデル で行い、時間関数として見た場合のI-125ラベルモノクローナル抗体-ストレプト アビジン抱合体（I-125 LU-10-ストレプトアビジン）を循環からクリアする能力 について行った。この実験の結果から、(ガラクトシル)₈-LC-ビオチン抱合体の ストレプトアビジン含有抱合体を循環からクリアする能力はガラクトシル化-HSA -ビオチンと同等であることが示される。その後の実験からさらに16ガラクトー ス残基を含む肝臓指向化合物が８ガラクトース残基を含むものよりもいっそう優 れたクリアランスを行うことが示されている。 ビオチンに最も近接するアミドの窒素が安定化作用を持つ第三アミン構造をと らない16ガラクトースクラスター-ビオチン構造体を評価するために実験を設計 して実施した。そのような安定化された構造体の調製は上記の実施例Ｖに述ベら れている。メスのBALB/cマウス(20-25g)にI-125で放射性ラベルしたNR-LU-10-ス トレプトアビジン抱合体120μgを静脈内投与し、n=3のマウスから血液を順次採 取した。血液からの抱合体のクリアランスはこれらの対照マウスにおいて測定し た。別のマウスのグループに、20倍のモル過剰量でビオチン類縁体を抗体抱合体 と混合しサイズ排除クロマトグラフィーで過剰の低分子を蛋白から精製すること によって16ガラクトース-ビオチン構造体と予め複合体化した放射性ラベル化モ ノクローナル抗体-ストレプトアビジン抱合体を120又は12μgのいずれかの量で 注射した。予め複合体化した抱合体はいずれの投与量でも、抗体抱合体対照に比 べて極めて迅速な血液クリアランスを示した。 予め複合体化した物質が迅速且つ有効な血液クリアランスを示すことが明らか にされたので、迅速なin vivoクリアランスを示す複合体を形成するために、種 々の用量の16ガラクトース-ビオチンの有効性を測定する実験を行った。マウス に400μgのI-125 NR-LU-10-ストレプトアビジン抱合体を静脈注射し、約22時間 後に循環中のモノクローナル抗体-ストレプトアビジン抱合体に対して100、50又 は10:1（それぞれ、456、228及び45μg）のモル過剰用量で16ガラクトース-ビオ チン構造体を注射した。各用量が抱合体のクリアリングに有効であったが、最も 有効な用量は（反応用量及び絶対用量ともに）10:1投与量であった。高用量の場 合にはいずれも、16ガラクトース-ビオチン構造体投与後約１時間までは抱合体 クリアランスの平坦域が見られるので、肝臓レセプターのある 程度の飽和か存在することは明らかである。これらの高用量は肝臓レセプターに 対する複合体化及び非複合体化16ガラクトース-ビオチンの間に拮抗が達成され るほど十分に高く、複合体化されたMAb-ストレプトアビジン抱合体の最初の少量 の画分以外の全てが肝臓経由でクリアリングされるのが妨害されると考えられる 。この平坦域期間後、抱合体のクリアリングは依然として緩慢であり、場合によ っては低用量で達成されるクリアリングよりも不完全である(高用量では約10%の 抱合体が循環中に残存するのに対して、低用量では２%)。この知見に関する別の 説明は、考えられるビオチニダーゼ介在性の開裂に対してこの16ガラクトース- ビオチン構造体が安定化されていないという事実に基づく（例えば、化学合成で はメチル基、低級アルキル基、カルボン酸、低級アルキルカルボン酸等は取り込 まれず、水素以外の置換基はビオチンに最も近接するアミド窒素に結合しなかっ た）。16ガラクトース-ビオチン構造体が安定でない場合、高用量では相当のビ オチンが遊離されて循環抱合体のかなりの部分がそれによってブロックされ、従 って肝臓を介した取り込みによるクリアリングを受けなかった。 血管内及び血管外の抱合体濃度の平衡が失われた後に循環中の抱合体の血中レ ベルの「リバウンド」或いは漸増が生じないことが全部の群で明らかである。こ れは、ガラクトースクラスター-ビオチン構造体が血管外流体中に溢れ出し、血 管外で複合体化した抱合体が血管内区画に戻るときに極めて速やかにクリアする ことの現在における最良の証拠を示す。 同じ動物モデルの別の実験で、上記のように調製した(ガラクトース)₃₅-HSA-( ビオチン)₂クリアリング剤と漸減用量の16ガラクトース-ビオチン構造体をin vi vo クリアリング剤として比較した。46μg用量の16ガラクトース-ビオチンが最適 であり、従来の最適用量の(ガラクトース)₃₅-HSA-(ビオチン)₂よりも有効である ことが判明した。より低い用量(12及び23μg)及びより高い用量(228μg)の16ガ ラクトース-ビオチンは循環する抱合体の除去においては効果が低く、低い用量 はかなりのリバウンド効果を示し、これは循環中の抱合体との複合体化が不完全 に行われているらしいことを示す。 適当な用量の16ガラクトース-ビオチン構造体で有効なクリアリングが達成さ れることが示されたので、腫瘍ヌードマウスを用いた試験によって小分子16 ガラクトース-ビオチンによる腫瘍結合抱合体のブロッキング可能性を評価した 。SW-1222結腸腫瘍を異種組織移植したか又はSHT-1小細胞肺癌（SCLC）腫瘍を異 種組織移植したマウスをNR-LU-10-ストレプトアビジンでプレターゲティングし 、22時間後に46μgの16ガラクトース-ビオチンを投与した。２時間後、上記のよ うに調製したY-90-DOTA-ビオチンを投与し、投与２時間後に屠殺して組織の放射 能をカウントすることによって腫瘍内及び非ターゲット組織内への取込み及び保 持を評価した。 (ガラクトース)₃₅-HSA-(ビオチン)₂を使用した従来の対照と比較すると、腫瘍 ターゲティングは抗原発現性の高い結腸異種移植片中では僅かに低下していたが 、抗原発現性の低いSCLC異種移植片中では僅かに上昇していた。これらの実験の 変動性が標準的であると想定すると、放射能の腫瘍取込みはほぼ同等と評価され たか、これは16ガラクトース-ビオチンによるターゲット取込みの能力を考慮す ると意外な結果であった。16ガラクトース-ビオチンを投与した動物の肝臓が僅 かに高いレベルを示した以外はどの器官でも非ターゲット器官の取込みは同等で あった。クリアリング剤及び放射能投与の間の３時間の間に従来の対照実験を行 った。16ガラクトース-ビオチンと放射能投与の間に３時間の期間を与えると、 肝臓レベルは低下してHSA含有性クリアリング剤でのレベルと同等であった（お よそ1%注射用量/g）。 また、I-125ラベル化MAb-ストレプトアビジン抱合体及びIn-111ラベル化DOTA- ビオチンを用いて実験を行い、16ガラクトース-ビオチンをクリアリング剤とし て使用したときの腫瘍ターゲット部位におけるこれらの物質の相対的化学量論を 評価した。(ガラクトース)₃₅-HSA-(ビオチン)₂を用いた従来の試験では、このク リアリング剤を最適用量で用いた場合の腫瘍では予測された4:1のDOTA-ビオチン 対MAb-ストレプトアビジン比（ストレプトアビジンは４個のビオチン結合部位を 持つ）が得られることが判明していた。16ガラクトース-ビオチン構造体につい て同様のプロトコールで試験すると、DOTA-ビオチン対MAb-ストレプトアビジン 比は2.65でしかなかった。これは、腫瘍結合ストレプトアビジンがある程度充填 されていることを示したものであるが、そのようなブロッキングの性質（そこか ら放出される16ガラクトース-ビオチン又はビオチ ン）は解明されていない。このブロッキングの性質を評価するための実験は現在 進行中である。 要約すると、ガラクトースクラスターが十分な数の適当なスペーサーを有する ガラクトシル残基を含む場合、ガラクトースクラスター抱合体は循環抱合体をク リアする能力を示した。16ガラクトース-ビオチンは（血管内腔及び血管外隙の 両方における）循環MAb-ストレプトアビジンをクリアリングするための有効な構 造体であることが証明された。腫瘍上の幾つかのプレターゲティングされたビオ チン結合部位ではブロッキングが明らかであるにもかかわらず、この物質を用い ると有効な腫瘍ターゲティングを達成することができる。ビオチン及びガラクト ースクラスターの間の結合を安定化させることによって、ガラクトースクラスタ ー-ビオチン構造体による何らかの腫瘍結合ビオチン結合部位への影響を最少に することができる。 実施例VII ディレクター試薬の調製 この手順は図３に概略図として示す。 N-BOC- ビスメチルエステル． 塩酸アミン、即ち上記のように調製した塩酸N, N-ビス-(6-メトキシカルボニルヘキシル)アミン1.00g（3.23mmol）に、トリエチ ルアミン1.5mL（10.6mmol）を加えた後、BOC-ON、2-(tert-ブトキシカルボニル オキシイミノ)-2-フェニルアセトニトリル875mg（3.55mmol、1.1当量）を加えた 。この混合物を室温で18時間攪拌した後、濃縮した。残渣を100mLの酢酸エチル で希釈し、１N塩酸水溶液(3ｘ50mL)、次いで飽和重炭酸ナトリウム水(2ｘ50mL) で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し濃縮した。残渣 をシリカゲルによるクロマトグラフィーにかけ、15%（容量パーセント）酢酸エ チル／ヘキサンで溶出した。生成物を含むクロマトグラフィー分画を合わせて濃 縮し、ほぼ無色の油状物質として生成物990mg(83%)を得た。 N-BOC- ビス-酸． 10mLメタノール中の上記工程で調製したジエステル980mg（ 2.62mmol）に、5.8mLの１N 水酸化ナトリウム（5.8mmol）を加えた。 この混合物を室温で16時間攪拌した後、濃縮した。残渣を30mLの脱イオン水で希 釈した後、pH1.5-2に酸性化した。この混合液を酢酸エチルで抽出した(6ｘ50mL) 。有機抽出液を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し濃縮した。残渣をJ.T ．ベイカー社から市販されている逆相C-18シリカゲルによるクロマトグラフィー にかけ、65%メタノール／水で溶出した。生成物を含むクロマトグラフィー分画 を合わせて濃縮し、ほぼ無色の油状物質として生成物851mg（94%）を得た。N-BOC- テトラ-メチルエステル． 35mLの乾燥ジメチルホルムアミド中の上記 のように調製したビス-酸825mg（2.39mmol）に、1.75g（5.65mmol、2.36当量） の塩酸アミン、即ち塩酸N,N-ビス-(6-メトキシカルボニルヘキシル)アミン、及 び3.0mLのトリエチルアミン、次いで2.4g（5.4mmol、2.3当量）のBOPを加えた。 この混合物を室温で17時間攪拌した後、濃縮した。残渣を100mLの酢酸エチルで 希釈し、１N塩酸水溶液(3ｘ50mL)、次いで重炭酸ナトリウム水(2ｘ50mL)で洗浄 した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し濃縮した。残渣をシリ カゲルによるクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルで溶出した。生成物を含む クロマトグラフィー分画を合わせて濃縮し、ほぼ無色の油状物質として生成物1. 63g（80%）を得た。 N-BOC- テトラ-酸． 上記のように調製したテトラ-メチルエステル1.41g（1.6 5mmol）のメタノール溶液25mLに、7.4mL（7.4mmol）の１N 水酸化ナトリウム水 溶液を加えた。この混合物を室温で22時間攪拌した後、濃縮した。残渣を30mLの 脱イオン水で希釈し、１N塩酸水溶液でpH２に酸性化した。この混合液を3:1（容 量比）酢酸エチル／イソプロパノールで抽出した（3ｘ100mL）。この有機抽出液 を濃縮した。残渣を逆相C-18シリカゲルによるクロマトグラフィーにかけ、最初 は50:50（容量比）メタノール／水で、最終的には75:25メタノール／水で溶出し た。生成物を含むクロマトグラフィー分画を合わせて濃縮し、無色の油状物質と して生成物1.19g（90%）を得た。 N-BOC オクタ-メチルエステル． 上記のように調製したテトラー酸501mg(0.62 6mmol)及び乾燥ジメチルホルムアミド30mLの混合物に、968mg（3.12mmol、5.0当 量）の塩酸アミン、即ち塩酸N,N'-ビス-(6-メトキシカルボキシ ヘキシル)アミン、及び2.0mL（14.2mmol）のトリエチルアミン、次いで1.22g（2 .76mmol、4.6当量）のBOPを加えた。この混合物を室温で19時間攪拌した後、濃 縮した。残渣を75mLの酢酸エチルで希釈し、１N塩酸水溶液(2ｘ50mL)で洗浄した 。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し濃縮した。残渣を逆相C-18 シリカゲルによるクロマトグラフィーにかけ、最初は60:40メタノール／水で、 最後に90:10メタノール／水で溶出した。生成物を含むクロマトグラフィー分画 を合わせて濃縮し、無色の油状物質として生成物715mg(63%)を得た。 N-BOC オクタ-酸． 上記のように調製したオクタ-メチルエステル715mg(0.393 mmol)のメタノール溶液20mLに、６mL（6mmol）の１N 水酸化ナトリウム水溶液 及び脱イオン水５mLを加えた。この混合物を室温で16時間攪拌した後、濃縮した 。残渣を20mLの脱イオン水で希釈し、この溶液をpH1.5-2.0に酸性化した。この 混合液を濃縮し、残渣を逆相C-18シリカゲルによるクロマトグラフィーにかけ、 最初は50:50メタノール／水で、最終的には80:20メタノール／水で溶出した。生 成物を含むクロマトグラフィー分画を合わせて濃縮し、ほとんど無色の油状物質 として生成物647mg（96%）を得た。 上記手順は８ガラクトース残基から成るガラクトースクラスターを形成する目 的で設計されている。４ガラクトース体はテトラ酸から、下記の８ガラクトース クラスターについて述べるガラクトース誘導化工程に進むことによりこの手順で 製造することができる。同様に、16、32ガラクトースクラスター構造体等も本発 明にメチルエステル及び酸形成工程を２回多く反復して行うことによって調製す ることができる。より詳しく言えば、16-メチルエステル構造体、16-酸、32-メ チルエステル等は本質的にはテトラ及びオクタ形態について上で述べたように調 製できる。必要な数の酸残基が形成された時点でガラクトース誘導化工程を酸残 基の数に適応するように合わせた成分比で行う。 N-BOC- オクタ-ガラクトシル構造体． 乾燥ジメチルホルムアミド８mL中の上 記のように調製したオクタ-酸161mg（94mmol）及び225mg（906μmol、9.64当量 ）のガラクトースアミン、即ち4-N-メチルアミノブチル-1-チオ-ベータ-D-ガラ クトピラノシドの混合液に、0.5mL(3.54mmol)のトリエチルアミ ン、次いで371mg（839μmol、8.4当量）のBOPを加えた。この混合物を室温で17 時間攪拌した後、濃縮した。残渣を逆相C-18シリカゲルによるクロマトグラフィ ーにかけ、最初は40:60メタノール／水で、最終的には70:30メタノール／水で溶 出した。生成物を含むクロマトグラフィー分画を合わせて濃縮し、ほとんど無色 の油状物質として生成物170mg（47%）を得た。 オクタ-ガラクトシルアミン． 上記のように調製したN-BOC-オクタ-ガラクト シル構造体170mgにトリフルオロ酢酸５mLを加えた。この混合物を室温で10分間 攪拌した後、濃縮した。残渣をメタノール10mLで希釈して、再濃縮した。残渣は それ以上精製せずに使用する。 上記にように形成される構造体のアミン基以外の官能基を有する他のディレク ター試薬類は、アミンを他の官能基に転化する標準的な化学的技術を用いてアミ ン構造体から製造することができる。 実施例VIII 伸長ディレクター試薬の調製 伸長-ガラクトースクラスター調製 図４にこの手順の概略図を示す。この手順は、必要な場合にディレクター試薬 抱合を容易にするために行われる。この実施例におけるアミン官能基を保存する 伸長手順はここに考察するような代わりの官能基を導入する際にも使用できる。 メチル6-(N-BOC)-アミノカプロエート． 塩酸アミン、即ち上記のように調製 した塩酸メチル-6-アミノヘキサノエートの混合物に、1.1当量のBOC-ON、次いで 2-3当量のトリエチルアミンを加える。この混合物を15-30℃で16-24時間攪拌し た後、濃縮する。残渣を酢酸エチルに溶解し、１N塩酸水溶液、次いで飽和重炭 酸ナトリウム水で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し 、減圧ロータリーエバポレーションで濃縮する。残渣をシリカゲルによるクロマ トグラフィーにかけ、25%酢酸エチル／ヘキサンで溶出する。生成物を含むクロ マトグラフィー分画を合わせて濃縮し、生成物を得る。 6-(N-BOC)- アミノカプロン酸． メチルエステル体、すなわちメチル6-(N- BOC)-アミノカプロエートのメタノール溶液に、1.5当量の１N水酸化ナトリウム 水溶液を加える。この混合物を15-30℃で16-24時間攪拌した後、濃縮する。残渣 を脱イオン水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。有機抽出液を合わせて、硫酸マ グネシウム上で乾燥させて、濾過し、濃縮する。残渣をシリカゲルによるクロマ トグラフィーにかけ、最初は25%酢酸エチル／ヘキサンで、最後に100%酢酸エチ ルで溶出する。生成物を含むクロマトグラフィー分画を合わせて濃縮し、生成物 を得る。N-BOC 伸長オクタ-ガラクトシル構造体． 上記のように調製したオクタ-ガラ クトシルアミンのジメチルホルムアミド溶液及び1.5-3当量の6-(N-BOC)-アミノ カプロン酸に、4-6当量のトリエチルアミン、次いで1.1-1.5当量のBOPを加える 。この混合物を15-30℃で4-24時間攪拌した後、濃縮する。残渣を脱イオン水で 希釈し、１N塩酸水溶液を加えてpHを1.5-2.0に調整する。この混合液を酢酸エチ ルで洗浄する。水相を濃縮し、残渣を逆相C-18シリカゲルによるクロマトグラフ ィーにかけ、最初は50:50メタノール／水で、最後に65:35メタノール／水で溶出 する。生成物を含むクロマトグラフィー分画を合わせて濃縮し、生成物を得る。 アミン伸長オクタ-ガラクトシル構造体． 先の工程で調製したN-BOC保護アミ ンにトリフルオロ酢酸を加える。この混合物を15-30℃で10分間攪拌した後、濃 縮する。残渣をメタノールで希釈し、再び濃縮して、生成物を得る。これをそれ 以上精製せずに使用する。 実施例IX 放射性ラベルしたアネキシン-ガラクトースクラスター抱合体 ３官能基リンカー・アプローチ Ａ．キレート調製 図５に概略図として示すように、キレートN,N'-ビス(2-ジスルフィジル-4-メ チルフェニル)-γ,γ'-ジアミノ-イソバレレートN-ヒドロキシスクシンイミドを 製造する。 3- ヨードメチル-4-ヨードブチル酸： （キノシタ及びヒラノ、J ． Hetrocyclic Chem. ，29:1025，1992、の手順で調製した）3-ヒドロキシメチル-4 -ブタノリド1.61g（10mmol）の四塩化炭素溶液100mLに、８g（40mmol）のヨード トリメチルシランを加える。反応混合物を窒素下で12時間、50℃に加熱する。こ の混合物をクロロホルムで希釈し、水(3ｘ100mL)、5%チオ硫酸ナトリウム水溶液 （100mL）、10%重炭酸ナトリウム水溶液及び塩水で洗浄する。有機層を硫酸マグ ネシウム上で乾燥させて濾過し、蒸発させて求める粗生成物を得る。この粗生成 物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：酢酸エチル−ヘキサン=3:7）で精 製して、3-ヨードメチル-4-ヨードブチル酸を得る。エチル-3-ヨードメチル-4-ヨードブチレート： 3-ヨードメチル-4-ヨードブ チル酸2.831g（8mmol）のエタノール溶液80mLにHClガスを0℃で飽和させる。こ の溶液を室温で２日間攪拌した後、溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに 溶解する。ジクロロメタン層を10%重炭酸ナトリウム水溶液（3ｘ100mL）、水（1 ｘ100mL）及び塩水で洗浄する。分かれたジクロロメタン層を硫酸マグネシウム 上で乾燥させて、濾過し、蒸発させてエチル-3-ヨードメチル-4-ヨードブチレー トを得る。 エチル-γ,γ'-ジ(4-メチルアニリノ)イソバレレート： 30mLの乾燥ジメチル スルホキシト中の4-トルイジン7.5g(70mmol)、エチル-3-ヨードメチル-4-ヨード ブチレート2.764g（7mmol）及び重炭酸ナトリウム0.588g(7mmol)の溶液を窒素下 で攪拌しながら３時間100℃に加熱する。冷却したこの混合液を攪拌しながら400 mLの氷水中に注ぐ。できた沈殿を濾取する。この沈殿中に残存する4-トルイジン を酢酸水溶液で数回洗浄して除去する。この洗浄済沈殿をヘプタン中で再結晶さ せて生成物を得る。 エチル-γ,γ'-[1,3-ジ(2-イミノ-6-メチルベンズチアゾリル-3)]イソバレレ ート ： 250mLの氷酢酸中のエチル-γ,γ'-ジ(4-メチルアニリノ)イソバレレー トの懸濁液をマグネチックスターラーで攪拌しながら、チオシアン酸アンモニウ ム(3.5g、0.046mol)を加え、次いで臭素(7.27g、0.046mol)の氷酢酸溶液50mLを 滴下混合する。添加終了後、攪拌を一晩続ける。ジヒドロ臭素塩の黄色沈殿を濾 取し乾燥させる。その後、乾燥した固体を熱水に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム 溶液でベンゾチアゾール遊離塩基を遊離させる。白色固体を濾 取し、乾燥させて粗生成物を得る。これをそれ以上精製せずに使用する。 N,N'- ビス(2-ジスルフィジル-4-メチルフェニル）-γ,γ'-ジアミノイソバレリ アン酸 ： 40mLの蒸留水によるエチル-γ,γ'-[1,3-ジ(2-イミノ-6-メチルベン ズチアゾリル-3)]イソバレレートの懸濁液に、固体水酸化カリウムペレット(20. 0g、0.037mol)を加え、できた溶液を120℃で15-24時間加熱する。数時間の加熱 の後、懸濁液は透明溶液となる。この反応混合液を氷浴中で冷却し、5.0、酢酸 でpH5.0に酸性化して、この水溶液を酢酸エチル100mLで３回抽出する。合わせた 酢酸エチル抽出液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過する。濾液から溶媒 を減圧留去し、粗生成物を得る。この粗生成物をシリカゲルカラムで酢酸エチル ：ヘキサンの20:80混合液に1%酢酸を加えたものを溶離剤に用いるクロマトグラ フィーにかけ、生成物を黄色結晶固体として得る。 N,N'- ビス(2-ジスルフィジル-4-メチルフェニル)-γ,γ'-ジアミノイソバレレ ートN-ヒドロキシスクシンイミド ： N,N'-ビス(2-ジスルフィジル-4-メチルフ ェニル）-γ,γ'-ジアミノイソバレリアン酸を、室温でテトラヒドロフラン(THF )又はジメチルホルムアミド(DMF)のいずれかの中でN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS)及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)と反応させる。室温で一晩攪拌 した後、溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製す る。 Ｂ．抱合体形成． このキレートは以下に述べるように本発明の放射性ラベルされたアネキシン- ガラクトースクラスター抱合体を形成するために適当な３官能基リンカーと共に 用いるのに適している。 市販のN-ε-t-BOC-リジン（シグマ・ケミカル・カンパニー）を無水トリフル オロ酢酸を用いてN-α-トリフルオロアセトアミド付加物に転化する。例えばア ルドリッチ・ケミカル・カンパニーから市販されているBOP（ベンゾトリアゾー ル-1-イルオキシ-トリス(ジメチル-アミノ)-ホスホニウム ヘキサフルオロホス フェート）によるカルボン酸の機能的活性化及び、活性化された部分の、例えば 上記のように形成されたガラクトースクラスター上の利用可能な一個のアミンと の反応によって、ガラクトースクラスター-３官能基リンカー種が得られ る。このガラクトースクラスター-３官能基リンカー種のリジン３官能基リンカ ー成分のα-アミンはメタノール性水酸化ナトリウムを用いて脱遮蔽される。こ の実施例のパートＡで示したように形成されたキレート分子のN-ヒドロキシスク シンイミドエステルとの反応によりガラクトースクラスター-キレート-３官能基 リンカー種が得られる。トリフルオロ酢酸を用いたリジン３官能基リンカー成分 のεアミンの脱保護、及びそれに続く無水コハク酸との反応から、カルボン酸の （例えば、BOPによる）活性化に続いてアネキシンを抱合体にすることにより、 利用可能なカルボン酸官能価が得られる。 上記成分の１種以上を含むキットも本発明に含まれる。例えば、ガラクトース クラスター-ビオチン抱合体を滅菌容器に入れてプレターゲティング方法で使用 できるように提供することができる。或いは、そのようなガラクトースクラスタ ー-ビオチン抱合体を非滅菌条件下でバイアルに入れて、研究用試薬として用い ることができる。 以上、本発明の特定の態様について説明を目的として記載しているが、本発明 の概念及び範囲から逸脱することなく種々の変形が可能であることが理解されよ う。従って、本発明は請求の範囲のみにより限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アクスワーシー ドナルド ビー アメリカ合衆国、ワシントン州 98036、 ブライアー、3615−トゥーハンドレッドト ゥウェンティセブンス ストリート サウ スウェスト (72)発明者 レノ ジョン エム アメリカ合衆国、ワシントン州 98036、 ブライアー、エルム ドライブ 2452

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも３個のヘキソース残基により特徴づけられるヘキソースクラスタ ー；及び 結合部、ターゲティング部または活性薬剤と反応し得る官能性部を含む、肝臓 指向性化合物の製造に有用な試薬。 ２．ヘキリースクラスターがガラクトース残基により形成されている請求の範囲 １項記載の試薬。 ３．ヘキソースクラスターが４，８，１６または３２個のガラクトース残基によ り形成されている請求の範囲１項記載の試薬。 ４．ヘキソースクラスターが１６個のガラクトース残基により形成されている請 求の範囲１項記載の試薬。 ５．ガラクトースクラスターが下記式で表される請求の範囲１項記載の試薬。 （式中、ＸはＨまたはメチル基である。） ６．ガラクトースクラスターが下記式で表される請求の範囲１項記載の試薬。 （式中、ＸはＨまたはメチル基である。） ７．ガラクトースクラスターが下記式で表される請求の範囲１項記載の試薬。 （式中、ＸはＨまたはメチル基である。） ８．ガラクトースクラスターが下記式で表される請求の範囲１項記載の試薬。（式中、ＸはＨまたはメチル基であり、ｙは１〜１０であり、ＺはＯまたはＳで ある。） ９．ガラクトースクラスターが下記式で表される請求の範囲１項記載の試薬。 （式中、ＸはＨまたはメチル基であり、ｙは１〜１０であり、ＺはＯまたはＳで ある。） １０．ガラクトースクラスターが下記式で表される請求の範囲１項記載の試薬。 （式中、ＸはＨまたはメチル基であり、ｙは１〜１０であり、ＺはＯまたはＳで ある。） １１．官能性部分が活性化エステルである請求の範囲１項記載の試薬。 １２．官能性部分がマレイミドである請求の範囲１項記載の試薬。 １３．官能基がイソシアネートである請求の範囲１項記載の試薬。 １４．官能基がハロゲン化アルキルである請求の範囲１項記載の試薬。 １５．官能基がヒドラジドである請求の範囲１項記載の試薬。 １６．官能基がチオールである請求の範囲１項記載の試薬。 １７．官能基がイミデートである請求の範囲１項記載の試薬。 １８．官能基がアルデヒドである請求の範囲１項記載の試薬。 １９．ガラクトースクラスターが約１６〜約６４個のガラクトース残基を含む請 求の範囲１項記載の試薬。 ２０．ガラクトースクラスターが３２個のガラクトース残基を含み、下記の構造 式で表される請求の範囲１９項記載の試薬。（式中、ＸはＨまたはメチル基である。）