JP2001525669A - Methods and constructs for inhibiting cell migration - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なベクターからなる組換え核酸分子であり、該ベクターは結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するドメインからなる発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸挿入物を含む。結合機能を有するドメインは受容体結合ドメインからなり、エフェクター機能を有するドメインは酵素的活性、とくにプロテアーゼ阻害剤活性を有する。該ベクターは、哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なウイルス（たとえば、アデノウイルスまたはレトロウイルス）または非ウイルスベクターである。発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸挿入物は細胞または組織特異的プロモータの制御下にある。局所的タンパク質分解活性、細胞外マトリックスの分解、細胞遊走、細胞浸潤、または組織リモデリングを防止するための方法であり、該組換え核酸分子を用いて、それによってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の局所発現を得るために、関連の細胞またはそれらの環境にある細胞をトランスフェクションまたは形質導入することからなる方法。発現および産生されたハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の任意の回収のために、該組換え核酸分子を用いて哺乳類細胞をトランスフェクションまたは形質導入することにより該ハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法。 (57) [Summary] A recombinant nucleic acid molecule comprising a vector useful for transfection or transduction of mammalian cells, wherein the vector encodes an expressible hybrid polypeptide or protein comprising a domain having a binding function and a domain having an effector function. Includes insert. The domain having a binding function is composed of a receptor binding domain, and the domain having an effector function has an enzymatic activity, particularly a protease inhibitor activity. The vector is a viral (eg, adenovirus or retrovirus) or non-viral vector useful for transfection or transduction of mammalian cells. The nucleic acid insert encoding the expressible hybrid polypeptide or protein is under the control of a cell or tissue specific promoter. A method for preventing local proteolytic activity, extracellular matrix degradation, cell migration, cell invasion, or tissue remodeling, wherein the recombinant nucleic acid molecule is used to encode a hybrid polypeptide or A method comprising transfecting or transducing relevant cells or cells in their environment to obtain local expression of the protein. For producing the hybrid polypeptide or protein by transfecting or transducing mammalian cells with the recombinant nucleic acid molecule for any recovery of the expressed and produced hybrid polypeptide or protein. Method.
Description
【発明の詳細な説明】 細胞遊走の阻害のための方法および構築物 発明の分野 本発明は、細胞遊走および／または組織のリモデリングがおきる疾患の治療の ための治療手段および治療方法の分野にある。さらに、本発明はバイオテクノロ ジー、とくに組換えＤＮＡ技術および遺伝子治療の分野にある。 発明の背景 細胞の遊走は、腫瘍転移、創傷の治癒、再狭窄、新脈管形成、またはリウマチ 性関節炎など、組織リモデリングがおきる多くの生理学的および病理学的プロセ スにおいて、必須の段階である。遊走細胞は、周辺の細胞外マトリックスを通ら なければならない。細胞外マトリックス成分の限定されたタンパク質分解性の分 解が、細胞遊走中にしばしばみられる。この細胞遊走を媒介するために、遊走細 胞は、プラスミノーゲン活性化因子、金属プロテアーゼ、またはエラスターゼな どのタンパク質分解酵素を産生するか、または細胞の直接的環境(directenviron ment)から調達する。たとえば、腫瘍転移または創傷の治癒中の細胞遊走の誘導 は、しばしばこれらの酵素産生の誘導に関連する。 病態生理学的条件下の細胞遊走におけるタンパク質分解酵素の関与がよく認め られているが、これらのタンパク質分解酵素を阻害することにより細胞遊走を阻 害するための試みはほとんどなされていない。プロテアーゼ阻 害剤の限られた使用に対する可能な説明は、これらのタンパク質分解酵素が病理 的かつ生理学的な多くのプロセス（フィブリン溶解、創傷の治癒、増殖因子の活 性などを含む）に関与するという事実、全身的に適用されたプロテアーゼ阻害剤 によるこれらのプロテアーゼ系の阻害が強い副作用を有しうるか、または局所の 細胞遊走プロセスに強い作用をもたらすことなしに阻害化合物の拡散または除去 に至り得るという事実である。 細胞遊走および組織のリモデリングを妨げるプロテアーゼ阻害剤の使用におけ る他の問題は、これらのプロセスを媒介するプロテアーゼが細胞表面の受容体に 結合できることである。このように、タンパク質分解酵素は本阻害剤の作用に対 して保護されている細胞周囲の微小環境において局所的に活性でありうる。 ｕ−ＰＡ（アミノ末端断片(aminoterminal fragment)、すなわちＡＴＦ）の受 容体結合部とインビトロで産生される尿のトリプシン阻害剤との間の抱合体がイ ンビトロで腫瘍細胞の遊走を阻害することが開示された（コバヤシ(Kobayashi) 、ゴトウ(Gotoh)、ヒラシマ(Hirashima)、フジエ(Fujie)、スギノ(Sugino)、お よびテラオ(Terao)、インビトロの腫瘍細胞浸潤におけるヒトのウロキナーゼと 尿のトリプシン阻害剤との抱合体の阻害効果(Inhibitory effect of a conjugat e between human urokinase and urinary trypsin inhibitor on tumor cellinv asion in vitro.)、J．Biol．Chem.(1995)270,8361-8366)。これらの著者達が用 いる抱合体は、単離されたＡＴＦ断片とトリプシン阻害剤を混合することにより 合成的につくられる。 最近、これらの抱合体も組換え的に産生されうることが開示された（ＷＯ第９ ７／２５４２２号）。 酵母で組換え的に産生させるための、受容体結合のｕ−ＰＡ断片およびその阻 害剤ＰＡＩ−２からなる同様の構築物が、ＷＯ第９２／０２５５３号（ＰＣＴ／ ＧＢ９１／０１３２２）で腫瘍細胞遊走を阻害するために記載されている。この ように、細胞表面の特異的受容体であるウロキナーゼ受容体に結合し得るプロテ アーゼ阻害剤がつくられ、この阻害剤は細胞遊走を阻害できる（インビトロ）。 インビボでのこれらの構築物の使用に関して、課題は、インビボにおける所望の 作用部位への適用およびそこでのより長い滞留である。 発明の要旨 本発明は、哺乳類の、たとえばヒトの、細胞のトランスフェクションまたは形 質導入に有用なベクターからなる組換え核酸分子を提供する。前記ベクターは、 結合機能をもつドメインおよびエフェクター機能をもつドメインからなる発現可 能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸の挿入物(i nsertion)を含む。本明細書において、結合機能をもつドメインは、好ましくは 受容体結合ドメインを含み、エフェクター機能をもつドメインは、好ましくは酵 素的活性を有し、もっとも好ましくはプロテアーゼ阻害剤活性を有する。 好ましくは、受容体結合ドメインは、ウロキナーゼのウロキナーゼ受容体結合 ドメイン、上皮増殖因子の受容体結合ドメイン、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ α2−マクログロブリン受容体）に結合する受容体関連タンパ ク質、およびＶＬＤＬ受容体からなる群より選択される。 好ましくは、エフェクター機能をもつドメインは、プロテアーゼ阻害剤の活性 を有し、そのプロテアーゼ阻害剤または活性部を含み、該プロテアーゼ阻害剤は 、（ウシの）膵臓のトリプシン阻害剤、（ウシの）脾臓のトリプシン阻害剤、尿 のトリプシン阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ１の組織の阻害剤、マトリ ックス金属プロテアーゼ２の組織の阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ３の 組織の阻害剤、およびエラスターゼ阻害剤からなる群より選択される。エフェク ター機能をもつドメインは、２つ以上の異なるプロテアーゼ阻害剤（の活性部） 、または２つ以上のプロテアーゼ阻害剤（の活性部）のコピー、または両方を含 む。 好ましくは、ベクターは、哺乳類の細胞のトランスフェクションまたは形質導 入に有用なウイルスベクターおよび非ウイルスベクターからなる群より選択され る。ベクターは、ヒトの細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なア デノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターでもよい。 発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸の 挿入物は、内皮細胞特異的プロモータ、または血管平滑筋細胞特異的プロモータ 、または肝臓特異的プロモータなどの細胞または組織特異的プロモータの制御下 にあり得る。 さらに本発明は、局所のタンパク質分解活性、細胞外マトリックス分解、細胞 遊走、細胞浸潤、または組織のリモデリングを防止するための方法であり、本明 細書で定義される組換え核酸分子によってコードされるハイブ リッドのポリペプチドまたはタンパク質の局所的発現を得るために、関連の細胞 またはそれらの環境にある細胞を該核酸分子でトランスフェクションまたは形質 導入することからなる方法を提供する。 また、本発明は、結合機能をもつドメインおよびエフェクター機能をもつドメ インからなるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方 法であり、本明細書で定義される組換え核酸分子によってコードされるハイブリ ッドのポリペプチドまたはタンパク質の発現を得るために、哺乳類の細胞をを該 核酸分子でトランスフェクションまたは形質導入し、産生される該ハイブリッド のポリペプチドまたはタンパク質を任意に回収することからなる方法を提供する 。 図面の簡単な説明 図１は、プラスミドのｐＣＲＩＩ−ｕＰＡ（左）およびｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ（ 右）を概略的に表す。 図２は、プラスミドのｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＢＰＴＩを概略的に表す。 図３は、プラスミドのｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩを概略的に表す。 図４は、タンパク質分解のマトリックス分解実験の結果を示す。 本発明の詳細な説明 本発明は、機能タンパク質の局所的作用を誘導するために、ならびに全身的作 用および／または拡散を防止するために、受容体結合ドメインをこのタンパク質 に結合 させた、ハイブリッドタンパク質の使用に関する。とくに本発明は、発現ベクタ ーによるトランスフェクションまたは形質導入後に標的細胞としての細胞部分集 団によって産生されるようなハイブリッドタンパク質に関する。より明確には、 本発明は、遊走または浸潤細胞の表面でのプロテアーゼの阻害による細胞遊走お よび組織リモデリングの防止のために、受容体結合ドメインおよびプロテアーゼ 阻害剤ドメインからなるハイブリッドタンパク質をコードする発現ベクターの使 用に関する。 本発明で記載される方法および構築物は、細胞遊走および／または組織リモデ リングが起きる疾患の治療として適用されうる。 本発明は、先行技術にしたがう前述の阻害剤の使用に関与するいくつかのネガ ティブな側面の解決に取り組む。 遊走細胞自身または近接の環境(immediateenvironment)にある細胞によるタン パク質の産生により、標的細胞の直接的環境における局所的な高濃度のハイブリ ッドタンパク質が得られる。この産生は、ハイブリッドタンパク質をコードする 適切なベクターによる一定の細胞部分集団のトランスフェクションまたは形質導 入により誘導され得る。この目的のため、組換えアデノウイルスベクター、レト ロウイルスベクター、プラスミドベクターなどを使用して良い。 ハイブリッドタンパク質（その受容体結合ドメイン）を標的細胞の細胞表面に 結合させることにより、阻害剤の拡散および全身的副作用が防止される。このハ イブリッドタンパク質の局所的発現もまた全身的副作用の減少に寄与し、一方、 該タンパク質の拡散のネガティブな作 用は、作用が要求される部位での産生により低減する。たとえば新脈管形成中に 遊走しやすい内皮細胞などの細胞の特異的な部分集団におけるハイブリッドタン パク質の局所的発現は、細胞型特異的または組織特異的発現ベクターを用いて促 進され、該タンパク質の発現は、細胞型特異的または組織特異的制御因子を備え たプロモータの制御下にある。 細胞表面受容体にプロテアーゼ阻害剤が結合することで、該阻害剤は、分子標 的、すなわち細胞表面に結合したタンパク質分解酵素に密接して局在できる。細 胞周囲の微小環境におけるタンパク質分解活性の局所的阻害が、この方法で達成 され得る。 プロテアーゼ阻害剤が、ウロキナーゼ受容体などのタンパク質分解酵素に対す る細胞表面受容体に結合することは、さらなる阻害的作用を有し得る。細胞遊走 を強く阻害し得る受容体へのｕ−ＰＡの結合を遮断することが示されるようにタ ンパク質分解酵素の受容体への結合が防止され、それゆえこの酵素の作用は強く 低減される。 発現ベクターが該コードＤＮＡ配列を含む、ハイブリッドタンパク質は、細胞 表面受容体に結合し、続いて内在化することのない領域を含む。この目的のため に使用され得る受容体結合ドメインは、たとえばウロキナーゼプラスミノゲン活 性化因子のｕ−ＰＡＲ結合ドメイン、上皮増殖因子、α2−マクログロブリン受 容体とも呼ばれるＬＤＬ−Ｒ関連タンパク質(LRP)に結合する受容体関連タンパ ク質(RAP)、およびＶＬＤＬ受容体の受容体結合ドメインである。 コードされたハイブリッドタンパク質の阻害剤部分は、 アプロチニンまたはトラシロール（登録商標）とも呼ばれるウシ膵臓トリプシン 阻害剤、尿のトリプシン阻害剤などの他のトリプシン阻害剤、金属プロテアーゼ ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、およびＴＩＭＰ−３の組織阻害剤などのマトリッ クスを分解する金属プロテアーゼに対する阻害剤などの多様なプロテアーゼ阻害 剤またはそれらの変異体からなる。また、エラスターゼなどの他のプロテアーゼ に対する阻害剤は、ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現 ベクターへの組み込みに非常に適している。たとえば、阻害剤部分、または異な る阻害剤の組み合わせ、またはそれらの誘導体である、ハイブリッドタンパク質 の機能タンパク質部分をコードするＤＮＡ配列の多重コピーが、発現ベクターの ＤＮＡ構築物へ組み込まれる。 他の非常に興味ある可能性としては、標的細胞の局所環境においてその作用を 行使し得るいかなる機能的タンパク質、たとえば増殖因子の活性化または他の、 たとえば血管調節成分の活性化に関与するプロテアーゼを適用するために、ハイ ブリッド受容体結合タンパク質をコードする発現ベクターなどの使用である。 機能タンパク質またはハイブリッドタンパク質のタンパク質ドメインの作用は 、受容体結合ドメインを標的細胞の表面にある受容体に結合させることにより、 標的細胞の直接的な微小環境(direct microenvironment)に局在させられる。標 的細胞の直接的環境における、または標的細胞自身による、ハイブリッドタンパ ク質の産生は、非ウイルスの、またはアデノウイルスの、またはレトロウイルス のベクター系に基づく発現ベクターの使用によ るこれらの細胞のトランスフェクションまたは形質導入により得られる。特異的 な細胞または組織のタイプにおける発現は、発現ベクターでの特異的なプロモー タエレメントの使用により達成し得る。たとえば、内皮細胞に特異的な発現のた めに、ヒトまたはマウスのプレプロエンドセリン遺伝子（それぞれＨＵＭＥＤＮ １ＢおよびＭＭＵ０７９８２、遺伝子配列データバンク(GENBANK)）のプロモー タ領域（のエレメント）が使用され、血管平滑筋細胞に特異的な発現のために、 ヒトの血管平滑筋α−アクチン遺伝子（ＨＵＭＡＣＴＳＡ、遺伝子配列データバ ンク）のプロモータ領域（のエレメント）が使用され、肝臓に特異的な発現のた めに、ヒトのアルブミン遺伝子（ＨＵＭＡＬＢＧＣ、遺伝子配列データバンク） のプロモータが使用され得る。 これらのベクターの局所輸送は、カテーテル、ベクターまたは標的輸送系を含 む典型的に適用されるゲルなどの、通常使用される様々な方法を用いて行なわれ る。たとえば、血管形成後の再狭窄および管壁のリモデリングを防止するための 管壁への部位特異的輸送に対して、特別なカテーテルが使用され得る。現在、ハ イドロゲルを含むベクターで被覆された二重バルーンカテーテル、チャネル(cha nneled)バルーンカテーテル、多針(multipleneedle)カテーテル、およびバルー ンカテーテルが、管壁に特異的な輸送に使用され得る。ベクターを管壁に直接輸 送するための他の方法には、被覆剤を含むベクターで被覆されたステントの使用 、血管の外部にハイドロゲルを含むベクターの塗布、または移植手術中に血管へ の直接的なイクスビボ(ex vivo)輸送がある。再注射前のレト ロウイルスベクターを用いる増殖細胞のイクスビボ形質導入もまた、作用が要求 される部位にベクター構築物を輸送するために使用され得る。 本件出願は、つぎの実施例を参照しながら、以下にさらに詳細に記載されるだ ろう。これらの実施例は単に本発明を説明するために役立つものであり、本発明 を限定するものではないことが特筆される。 実施例１ 以下の本明細書でＡＴＦと呼ばれるウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子(u -PA)のアミノ末端断片である、アミノ酸１〜１３８番をコードする発現プラスミ ドは、以下のオリゴヌクレオチド5'-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3'および5'- agggtcaccaaggaagagaatggc-3'によるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、全長 のｕ−ＰＡに対して発現ベクター中の１３９から４０１までのアミノ酸をコード するＤＮＡ配列を欠失させることにより構築され得る。ＰＣＲによる増幅後、新 しく形成されたＤＮＡ断片は、発現プラスミドの環状性質に戻すためにライゲー ションにより環状化され得る。この方法で、ＡＴＦ、および終止コドンを含むＣ 末端の１１アミノ酸残基をコードする発現プラスミドが構築され得る。 ついでｕ−ＰＡ ＡＴＦ断片をコードする、このように形成されたＤＮＡ構築 物の配列が決定され、構築手順の間に導入される可能な変異に対する対照として の推定配列と比較される。 ＰＣＲを使用してｐＣＲＩＩ−ｕＰＡ由来の構築物ｐ ＣＲＩＩ−ＡＴＦが図１に示される。図１では、ライン間に示される領域がＰＣ Ｒ増幅中に除去され、ＡＴＦプラスミドを得た。プラスミドｐＣＲＩＩ−ｕＰＡ は左に、プラスミドｐＣＴＩＩ−ＡＴＦは右に示される。 実施例２ ウシの大動脈内皮細胞から単離されたゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行な うことにより、ウシ膵臓トリプシン阻害剤(BPTI)のアミノ酸残基３６〜９３およ びウシ脾臓トリプシン阻害剤(BSTI)の相同なアミノ酸残基をコードするＤＮＡ断 片が単離され得、該ＰＣＲ反応では以下のオリゴヌクレオチド：公表された配列 （遺伝子配列データバンク、ＢＴＢＰＴＩＧ）にしたがってＢＰＴＩ遺伝子の２ ５０９から２５３３のヌクレオチドに相当する5'-tcgcgacctgacttctgcctagagc-3 '（クローニングの目的用に（下線の）ＮｒｕＩ部位を導入するため、オリゴヌ クレオチドの５'領域にイタリックで示される改変あり）、ならびに公表された 配列（遺伝子配列データバンク、ＢＴＢＰＴＩＧ）にしたがってＢＳＴＩ遺伝子 の２４４２から２４６２のヌクレオチド、ならびにＢＰＴＩ遺伝子の２６７７か ら２７０４およびＢＳＴＩ遺伝子の２６１０から２６３６のヌクレオチドに対応 する5'-ggtcacccagggcccaatattaccacc-3'(（下線の）ＢｓｔＥＩＩおよびＳｓｐ Ｉ部位をそれぞれ導入するため、示されたヌクレオチド（イタリック体）で改変 )を用いる。ついで、増幅したＤＮＡ断片は適切なプラスミドベクター、ｐＣＲ ＩＩまたはｐＵＣ１３へクローニングし、ついで、単離されたクローンでの増幅 されたＤＮＡ断片の正確な配列は、非常に高い相同度を有するＢ ＰＴＩおよびＢＳＴＩを識別するために分析された。 実施例３ 下記のオリゴヌクレオチド：（遺伝子配列データバンクＨＳＴＩＭＰＲの配列 にしたがって）ヒトＴＩＭＰ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド４１から６５に相当 する5'-agagagacaccagagaacccaccat-3'およびヌクレオチド７４０から７５５ま でに相当する5'-tcattgtccggaagaaagatgggag-3'を用いて、ヒトの包皮線維芽細 胞から単離された全ＲＮＡに対して逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行なうこ とにより、金属プロテアーゼタイプ１のヒト組織阻害剤の１から２０７のアミノ 酸をコードするＤＮＡ断片が単離される。増幅されたＤＮＡ断片は、適切な宿主 ベクターであるｐＵＣ１３へクローニングされ、単離されたクローン中の増幅さ れたＤＮＡ断片の正確な配列が分析された。 実施例４ ＡＴＦ．ＢＰＴＩハイブリッドタンパク質をコードする配列を含む組換えアデ ノウイルスの構築のために、この配列は、アデノウイルスベクターの構築物アダ プターおよび発現プラスミドｐＭＡＤ５でクローニングされる。このプラスミド は、野生型アデノウイルスタイプ５ＤＮＡ配列の部分、後期主要プロモータ(MLP )、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含み、組換えアデノウイルスを 構築するために発現ベクターまたはシャトルベクターとして使用され得る。この プラスミドは、下記のようにプラスミドｐＭＬＰ１０から得られた。まず、ｐＭ ＬＰ１０−ｌｉｎは、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩ、ＳｐｌＩ、ＳｎａＢｌ 、ＳｐｅＩ、ＡｓｕＩＩ、および ＭｕｎＩに対する唯一の部位を備えた合成ＤＮＡ断片をｐＭＬＰ１０のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿入することによって構築された。続いて、Ａｄ５ゲノムのヌクレ オチド３３２８から８９１４にわたるアデノウイルスＢｇｌＩＩ断片をｐＭＬＰ １０−ｌｉｎのＭｕｎＩ部位に挿入した。最後に、テトラサイクリン耐性遺伝子 を不活性化させるために、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を欠失させ、プラスミドｐ ＭＡＤ５を得た。ＡＴＦ．ＢＰＴＩ配列をＭＬＰプロモータおよびポリＡシグナ ル間でｐＭＡＤ５プラスミドにクローニングするために、下記の方策がとられた 。 ＵＰＡ ｃＤＮＡの１３７３塩基対断片がクローニングされたｐＣＲＩＩプラ スミドを出発材料として、ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドを作製するため、実施 例１に記載するようにオリゴヌクレオチド5'-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3' （下線のＳｍａＩ部位およびイタリック変形のヌクレオチド）および5'-agggtca cc aaggaagagaatggc-3'(下線のＢｓｔＥＩＩ部位およびイタリック変形のヌクレ オチド)をもちいたＰＣＲ反応を行なった（図１参照）。次に、このｐＣＲＩＩ −ＡＴＦプラスミドを制限酵素のＳｍａＩおよびＢｓｔｅＩＩで消化した。平行 して、ｐＣＲＩＩ−ＢＰＴＩプラスミドを制限酵素のＮｒｕＩおよびＢｓｔｅＩ Ｉで消化し、ＢＰＴＩを含有する断片をｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドへクロー ニングした（図２参照）。構築物ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＢＰＴＩが図２で示され る。 次の段階で、ＡＴＦ−ＢＰＴＩ配列がｐＭＡＤ５にクローニングされた。これ は、制限酵素ＥｃｏＲＶおよび ＳｐｅＩでｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＢＰＴＩプラスミドを消化し、ＡＴＦ−ＢＰＴ ＩをコードするＤＮＡ断片を単離し、この断片をＳｎａＢＩおよびＳｐｅＩで消 化されたｐＭＡＤ５プラスミドでクローニングすることによってなされた。クロ ーニングは、制限分析および配列分析によって試験された。 ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスベクターの構築用のｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−Ｂ ＰＴＩシャトルベクターが図３に示される。 実施例５ ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩのために、実施例４に記載の同様な方法で、Ｂ ＳＴＩ遺伝子を含むプラスミド（ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＳＴＩ）が、ｐＣＲＩ Ｉ−ＢＰＴＩプラスミドのかわりにｐＣＲＩＩ−ＢＳＴＩプラスミドを用いて構 築された。 実施例６ ＡＴＦ−ＴＩＭＰ１ハイブリッドタンパク質をコードする配列を含む組換えア デノウイルスの構築のために、この配列は、発現プラスミドｐＭＡＤ５へクロー ニングされる。このプラスミドは、野生型アデノウイルスタイプ５ＤＮＡ配列の 部分、後期主要プロモータ(MLP)、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを 含み、組換えアデノウイルスを構築するために発現ベクターまたはシャトルベク ターとして使用され得る。ＡＴＦ−ＴＩＭＰ１配列をＭＬＰプロモータおよびポ リＡシグナル間でｐＭＡＤ５プラスミドにクローニングするために、下記の方策 がとられた。 ｕＰＡ ｃＤＮＡの１３７３塩基対断片がクロ ーニングされたｐＣＲＩＩプラスミドを出発材料として、ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプ ラスミドを作製するため、実施例１に記載するようにオリゴヌクレオチド5'-ccc gggcttttttccatctgcgcagtc-3'および5'-agggtcaccaaggaagagaatggc-3'をもちい たＰＣＲ反応を行なった（図１参照）。次に、このｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミ ドを制限酵素のＳｍａＩおよびＢｓｔｅＩＩで消化した。 並行して、シグナルペプチドおよび終止コドンを欠いた成熟タンパク質の１か ら１８４のアミノ酸残基をコードするｐＵＣ１３−ＴＩＭＰ１でＴＩＭＰ１のｃ ＤＮＡの断片が、下記のオリゴヌクレオチド5'-tcgcgatgcacctgtgtcccacc-3'お よび5'-ggtcacccaaatattggctatgtgggaccgcaggg-3'を用いて増幅された。これら のオリゴヌクレオチドは制限酵素のＮｒｕＩ（１番目のオリゴヌクレオチド、下 線）、およびＢｓｔＥＩＩ、およびＳｓｐ１（２番目のオリゴヌクレオチド、下 線）に対する認識部位をそれぞれ含み、これらの部位はクローニングの手順に必 要である。 増幅されたＤＮＡ断片は、ｐＣＲＩＩベクターへクローニングされ、ｐＣＲＩ Ｉ−ＴＩＭＰ１と呼ばれた。続いて、このベクターを制限酵素のＮｒｕＩおよび ＢｓｔｅＩＩで消化し、ＴＩＭＰ１を含むＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラ スミドへクローニングした(図１参照)。 次の段階で、ＡＴＦ−ＴＩＭＰ配列がｐＭＡＤ５にクローニングされた。これ は、制限酵素のＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩでｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＴＩＭＰプラ スミドを消化し、ＡＴＦ−ＴＩＭＰをコードするＤＮＡ断片を 単離し、この断片をＳｎａｂＩおよびＳｐｅＩで消化されたｐＭＡＤ５プラスミ ドでクローニングすることによってなされた。クローニングは、制限分析および 配列分析によって試験された。 ＡＴＦ．ＴＩＭＰ１ハイブリッドタンパク質をコードする配列を含む組換えア デノウイルスの構築のために、この配列は、発現プラスミドのｐＭＡＤ５へクロ ーニングされる。このプラスミドは、野生型アデノウイルスタイプ５ＤＮＡ配列 の部分、後期主要プロモータ(MLP)、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル を含み、組換えアデノウイルスを構築するために発現ベクターまたはシャトルベ クターとして使用され得る。ＡＴＦ．ＴＩＭＰ１配列をＭＬＰプロモータおよび ポリＡシグナル間でｐＭＡＤ５プラスミドにクローニングするために、下記の方 策がとられた。 ｕＰＡ ｃＤＮＡの１３７３塩基対断片がクローニングされたｐＣＲＩＩプラ スミドを出発材料として、ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドを作製するため、実施 例１に記載するようにオリゴヌクレオチド5'-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3' および5'-agggtcaccaaggaagagaatggc-3'をもちいたＰＣＲ反応を行なった（図１ 参照）。次に、このｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドにおいて、オリゴヌクレオチ ド5'-aatattattgaacttcatcaagttcc-3'および5'-gactctagagcaaaaatgacaaccag-3' を用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩクローニングベ クターへクローニングした。この方法で、ｕ−ＰＡのシグナルペプチドが除去さ れ、ＳｓｐＩ制限酵素認識部位 が導入される（下線）。得られたプラスミドＤＮＡをｐＣＲＩＩＡＴＦ★と呼ぶ 。 平行して、シグナルペプチドを含むが、終止コドンを欠いたＴＩＭＰ−１タン パク質の−２３から１８４のアミノ酸残基をコードするｐＵＣ１３−ＴＩＭＰ１ へＴＩＭＰ１のｃＤＮＡの断片が、オリゴヌクレオチド5'-agagagacaccagagaacc caccat-3'および制限酵素Ｓｓｐ１（下線）の認識部位を含む5'-aatattggctatct gggaccgcagg-3'を用いて増幅され、ｐＣＲＩＩクローニングベクターへクローニ ングした。得られたプラスミドＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰ１★と呼ぶ。 続いて、このベクターを制限酵素のＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ＴＩ ＭＰ１を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶ−ＳｓｐＩで消化したｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ★ プラスミドでクローニングした。得られたＴＩＭＰ−ＡＴＦＤＮＡ断片を含む プラスミドはｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰ−ＡＴＦと呼ばれた。次の段階で、ＴＩＭＰ −ＡＴＦ配列をｐＭＡＤ５へクローニングした。これは、制限酵素のＥｃｏＲＶ およびＳｐｅＩでｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰ−ＡＴＦプラスミドを消化し、ＴＩＭＰ −ＡＴＦをコードするＤＮＡ断片を単離し、この断片をＳｎａｂＩおよびＳｐｅ Ｉで消化されたｐＭＡＤ５プラスミドでクローニングすることによってなされた 。クローニングは、制限分析および配列分析によって試験された。 実施例７ ＡＴＦドメインに連結させたＢＰＴＩユニットの多重コピーを含むハイブリッ ドタンパク質をコードするベク ターが構築された。これらの多重ＢＰＴＩベクターを構築するために、以下の方 策がとられる。 実施例４に記載されたｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩは、制限酵素のＳｓｐＩ およびＢｓｔＥＩＩで消化される。この方法で、ベクターは、ＢＰＴＩ配列の末 端の読み取り枠中で正確に開かれる。実施例２に記載されるｐＣＲＩＩ−ＢＰＴ ＩプラスミドはＮｒｕＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化され、１つの平滑末端(NruI) を備えたＢＰＴＩをコードするＤＮＡ断片を得る。その断片をＳｓｐＩ Ｂｓｔ ＥＩＩ ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩベクターに一方向にクローニングした。 したがって、ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩ−ＢＰＴＩという名の構築されたプ ラスミドは、組換えアデノウイルスの構築のためにシャトルベクターとして使用 された。 このアプローチは、多重ＢＰＴＩドメインを含むベクターを構築するために多 数回反復され得る。 実施例８ ＡＴＦドメインに連結させたＢＰＴＩユニットおよびＴＩＭＰ１ユニットの両 方を含むハイブリッドタンパク質をコードするベクターが構築された。このＢＰ ＴＩ−ＴＩＭＰベクターを構築するために、以下の方策がとられる。 実施例４に記載されたｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩは、制限酵素のＳｓｐＩ およびＢｓｔＥＩＩで消化される。この方法で、ベクターは、ＢＰＴＩ配列直後 で開かれる。実施例６に記載されるｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰプラスミドはＮｒｕＩ およびＢｓｔＥＩＩで消化され、１つの平滑末端を備えたＴＩＭＰ１をコードす るＤＮＡ断片 を得る。その断片をＳｓｐＩ ＢｓｔＥＩＩ ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩベ クターにクローニングした。したがって、ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩ−ＴＩ ＭＰという名の構築されたプラスミドは、組換えアデノウイルスの構築用にシャ トルベクターとして使用された。 実施例９ ｐＭＡＤ５による細胞のトランスフェクション後または組換え複製欠損性のＡ ＴＦ−ＢＰＴＩをコードするアデノウイルスによる形質導入後に機能的ＡＴＦ− ＢＰＴＩハイブリッドタンパク質の産生をモニターするために、下記の試験が実 施された。 ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞によ るハイブリッドＡＴＦ−ＢＰＴＩタンパク質の産生が、ｕ−ＰＡのアミノ末端断 片であるＡＴＦを認識するｕＰＡ ＥＬＩＳＡを用いて分析された。ｐＭＡＤ５ −ＡＴＦ−ＢＰＴＩプラスミド（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ／２４時間）によるＣ ＨＯ細胞の一過性のトランスフェクション後およびＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードす るアデノウイルスベクター（１．５μｇ／ｍｌ／２４時間まで）による形質導入 後の両方で、ＡＴＦ−ＢＰＴＩの産生は明確に検出されるものであった。 ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスで形質導入されたＣＨＯ細胞の細胞培地をウ ェスタンブロッティング技術を用いて分析した。電気泳動およびブロッティング 後に、（トラシロール（登録商標）に対して生じた）ｕ−ＰＡまたはＢＰＴＩに 対するポリクローナル抗体を用いて、並行のフィルターを分析した。両方のフィ ルターにおいて、約２０ｋＤａの同じ予想される位置にシグナルが検 出された。これは、実際に産生されたタンパク質がｕ−ＰＡおよびＢＰＴＩの断 片を含み、したがってハイブリッドタンパク質が産生されることを示している。 ＡＴＦ−ＢＰＴＩウイルスに感染したＣＨＯ細胞（約１．８μｇ／ｍｌ）の希 釈培地を用いて、ＡＴＦ−ＢＰＴＩタンパク質のプラスミン活性の阻害剤として の機能が、まず溶液中で分析された。それらはプラスミン（１ｎＭ）とインキュ ベートし、色素基質を用いてプラスミンの活性を測定した。トラシロール（登録 商標）の希釈は、対照参考として使用された。ＡＴＦ−ＢＰＴＩ培地によるプラ スミン阻害は、非常に効果的であり、培地を１０００Ｘに希釈することにより（ すなわち１００ｎＭＡＴＦ−ＢＰＴＩ）１ｎＭプラスミンの活性を５０％阻害し 、同様の阻害が１００ｎＭのトラシロール（登録商標）で観察された。したがっ て、ＡＴＦ−ＢＰＴＩの活性は、市販で入手できるトラシロール（登録商標、バ イエル(Bayer)、ドイツ）の活性に匹敵する。 ヒトｕＰＡ受容体遺伝子でトランスフェクションされている、またはされてい ないマウス細胞系統を用いて、ｕ−ＰＡ受容体(uPAR)とＡＴＦドメインの相互作 用を経て、細胞表面に結合するプラスミンに対する阻害剤としてのＡＴＦ−ＢＰ ＴＩの機能が試験された。これらの細胞をＡＴＦ−ＢＰＴＩウイルスで感染させ たＣＨＯ細胞の希釈培地で６時間インキュベートした。ｕＰＡＲでトランスフェ クションされた細胞およびヒトｕＰＡＲを欠いた親マウスの細胞から細胞抽出物 を作製した。細胞抽出物を作製する前に、短い酸処理が並行の培養に施された（ ｐＨ３、３分）。 この処理により、ｕ−ＰＡ受容体に結合するｕ−ＰＡまたはＡＴＦのいずれも 除去される。細胞抽出物は１ｎＭのプラスミンとインキュベートし、プラスミン 活性が測定された。プラスミン活性は、ｕ−ＰＡＲを含む細胞系統の細胞抽出物 によってのみ阻害され得る。ｕ−ＰＡ受容体を欠いた親の細胞系統の細胞抽出物 および酸で処理されたｕ−ＰＡＲを含む細胞系統においては、酸処理プラスミン 活性の阻害は観察されなかった。これは明らかにＡＴＦ−ＢＰＴＩがｕ−ＰＡＲ 結合プラスミン阻害剤として機能し得ることを示す。 表１実施例１０ たとえば新脈管形成時に内皮細胞の遊走を特異的に阻害するために、アデノウ イルスベクターにおけるＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードするＤＮＡ前のヒトのプレプ ロエンドセリン１遺伝子のプロモータ配列（ＨＵＭＥＤＮ１Ｂ（遺伝子配列デー タバンク）のヌクレオチド２１８０〜３６８０）をクローニングすることにより 、内皮細胞におけるＡＴＦ−ＢＰＴＩの細胞特異的発現が到達される。この方法 で、ＡＴＦ−ＢＰＴＩハイブリッドタンパク質の高度な上皮細胞特異的発現が得 られる。 実施例１１ 細胞外マトリックスのタンパク質分解性の分解は、多くの細胞遊走および組織 リモデリングのプロセスにおいて重要な段階である。このタンパク質分解性のマ トリックス分解は、ウロキナーゼタイプのプラスミノゲン活性によって媒介され ることがしばしば見られる。ＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードするアデノウイルスによ る感染がプラスミン媒介性細胞外マトリックス分解を阻害し得るかどうかを試験 するために、ヒトの滑膜細胞を用いて実験が行なわれた。これらの細胞は、ウシ 軟骨物質にある3Ｈで標識された細胞外マトリックス上に播種されると同時に、 ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスにより感染された。マトリックス分解の強い阻 害がウイルス処理された細胞で観察され（図４）、マトリックス分解がＡＴＦ− ＢＰＴＩをコードするウイルスによる感染細胞により阻害され得ることを示して いる。 図４は、プラスミノゲンの存在下におけるヒトの滑膜による軟骨マトリックス の分解を示す。マトリックスを対照培地（レーン１）、滑膜細胞（レーン２）、 ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスで感染された滑膜細胞（レーン３）、およびト ラシロール（登録商標）（１００ＫＩＵ／ｍｌ）とインキュベートした滑膜細胞 （レーン４）でインキュベートした。 実施例１２ 再狭窄のプロセスにおいて、平滑筋細胞の遊走および管壁リモデリングは、細 胞外マトリックス成分のプラスミン媒介性タンパク質分解が関与する重要な出来 事である。このプロセスにおいて妨害用の一般的なプラスミン阻害剤のインビボ 適用は、全身的な副作用を有し得る。 遊走細胞の表面にプラスミン阻害剤を適用することにより、これらの副作用が防 止され得る。たとえば移植された「冠状動脈バイパス」移植片において、新脈管 内膜(neointima)の形成が予期されうる部位でのＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイル スによる血管壁の感染は、局所的にＡＴＦ−ＢＰＴＩがを産生するための理想的 方法であり、したがって遊走（平滑筋）細胞の直接的環境においてプラスミン活 性を阻害し、結果として新脈管内膜形成が低減する。 新脈管内膜の形成が非常に現実的に模擬され得るモデルシステムであるヒトの 伏在静脈器官の培養を用いて、この原理が試験された。ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノ ウイルスで感染された、または感染されていない並行の培養において、３および ４週間後に新脈管内膜の形成が分析された。非処理の組織において、明確な新脈 管内膜の形成が観察された。１０10ｐｆｕ／ｍｌ ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイ ルスで処理された組織において、新脈管内膜形成の強い阻害が観察された。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Methods and constructs for inhibiting cell migration Field of the invention The present invention relates to the treatment of diseases in which cell migration and / or tissue remodeling occurs. In the field of therapeutic means and methods of treatment. Furthermore, the present invention G, especially in the field of recombinant DNA technology and gene therapy. Background of the Invention Cell migration can lead to tumor metastasis, wound healing, restenosis, angiogenesis, or rheumatism. Many physiological and pathological processes that cause tissue remodeling, such as osteoarthritis This is an essential step in The migrating cells pass through the surrounding extracellular matrix. There must be. Limited proteolytic content of extracellular matrix components Solutions are often seen during cell migration. To mediate this cell migration, Vesicles contain plasminogen activator, metalloprotease, or elastase. Which proteolytic enzymes are produced or the direct environment of the cell (directenviron ment). For example, induction of cell migration during tumor metastasis or wound healing Is often associated with the induction of production of these enzymes. Proteolytic enzymes are often involved in cell migration under pathophysiological conditions However, inhibition of these proteases inhibits cell migration. Very few attempts have been made to harm. Protease inhibition A possible explanation for the limited use of harmful agents is that these proteolytic enzymes may Physiological and physiological processes (fibrinolysis, wound healing, growth factor activity) Including systemicity), systemically applied protease inhibitors Inhibition of these protease systems can have strong side effects or Diffusion or removal of inhibitory compounds without having a strong effect on the cell migration process Is the fact that In the use of protease inhibitors to prevent cell migration and tissue remodeling Another problem is that the proteases that mediate these processes are associated with cell surface receptors. It can be combined. Thus, proteolytic enzymes have an effect on the action of this inhibitor. Can be locally active in the microenvironment surrounding the cells that are being protected. Receiving u-PA (aminoterminal fragment, or ATF) A conjugate between the receptor junction and an in vitro produced urinary trypsin inhibitor is Inhibition of tumor cell migration in vitro (Kobayashi) , Gotoh, Hirashima, Fujie, Sugino, And Terao, with human urokinase in tumor cell invasion in vitro Inhibitory effect of a conjugat with urinary trypsin inhibitor e between human urokinase and urinary trypsin inhibitor on tumor cellinv asion in vitro.); Biol. Chem. (1995) 270, 8361-8366). These authors Some conjugates are obtained by mixing the isolated ATF fragment with a trypsin inhibitor. Made synthetically. Recently, it has been disclosed that these conjugates can also be produced recombinantly (WO 9). 7/25422). Receptor-bound u-PA fragments and their inhibition for recombinant production in yeast A similar construct consisting of the harmful agent PAI-2 is described in WO 92/02553 (PCT / GB 91/01322) for inhibiting tumor cell migration. this Proteins that can bind to the urokinase receptor, a specific receptor on the cell surface An enzyme inhibitor is made, which can inhibit cell migration (in vitro). With respect to the use of these constructs in vivo, the challenge is to obtain the desired in vivo Application to the site of action and longer residence there. Summary of the Invention The present invention relates to transfection or morphology of mammalian, eg, human, cells. The present invention provides a recombinant nucleic acid molecule comprising a vector useful for transfection. The vector is Expressable consisting of a domain with a binding function and a domain with an effector function Insert of a nucleic acid encoding a functional hybrid polypeptide or protein (i nsertion). In the present specification, the domain having a binding function is preferably A domain that includes a receptor binding domain and has an effector function is preferably an enzyme. It has an intrinsic activity, most preferably a protease inhibitor activity. Preferably, the receptor binding domain is a urokinase receptor binding urokinase Domain, epidermal growth factor receptor binding domain, LDL receptor-related protein ( αTwoReceptor associated with macroglobulin receptor) And a VLDL receptor. Preferably, the domain having an effector function is the activity of a protease inhibitor. Comprising a protease inhibitor or active moiety thereof, wherein the protease inhibitor comprises , (Bovine) pancreatic trypsin inhibitor, (bovine) spleen trypsin inhibitor, urine Trypsin inhibitor, matrix metalloproteinase 1 tissue inhibitor, matrix Tissue metalloproteinase 2 inhibitor, matrix metalloproteinase 3 It is selected from the group consisting of tissue inhibitors and elastase inhibitors. Effek Domains with two or more different protease inhibitors Or copies of (active parts of) two or more protease inhibitors, or both. No. Preferably, the vector is used for transfection or transduction of mammalian cells. Selected from the group consisting of viral and non-viral vectors useful for You. Vectors are useful vectors for transfection or transduction of human cells. It may be a denovirus vector or a retrovirus vector. Of nucleic acids encoding expressible hybrid polypeptides or proteins The insert is an endothelial cell-specific promoter or a vascular smooth muscle cell-specific promoter. Or under the control of a cell or tissue specific promoter, such as a liver specific promoter Could be. Further, the present invention relates to local proteolytic activity, extracellular matrix degradation, A method to prevent migration, cell invasion, or tissue remodeling. Hive encoded by a recombinant nucleic acid molecule as defined in the specification Related cells to obtain local expression of the polypeptide or protein of the lid Or transfecting or transfecting cells in their environment with the nucleic acid molecule. Provide a method consisting of introducing. The present invention also relates to a domain having a binding function and a domain having an effector function. For producing hybrid polypeptides or proteins consisting of ins The hybrid nucleic acid encoded by the recombinant nucleic acid molecule as defined herein. To obtain expression of the polypeptide or protein of the mammal, mammalian cells are The hybrid produced by transfection or transduction with a nucleic acid molecule Optionally recovering the polypeptide or protein of the invention. . BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows plasmids pCRII-uPA (left) and pCRII-ATF (left). (Right) is schematically represented. FIG. 2 schematically represents the plasmid pCRII-ATF-BPTI. FIG. 3 schematically represents the plasmid pMAD5-ATF-BPTI. FIG. 4 shows the results of a matrix degradation experiment for protein degradation. Detailed description of the invention The present invention is directed to inducing local effects of functional proteins, as well as systemic effects. To prevent and / or prevent spread, a receptor binding domain Joined to Related to the use of hybrid proteins. In particular, the present invention provides an expression vector Cell subsets as target cells after transfection or transduction Hybrid proteins as produced by the group. More specifically, The present invention is directed to cell migration and migration by inhibiting proteases on the surface of migrating or infiltrating cells. Receptor binding domain and protease to prevent tissue and tissue remodeling Use of an expression vector encoding a hybrid protein comprising an inhibitor domain About. The methods and constructs described in the present invention may be used for cell migration and / or tissue remodeling. It can be applied as a treatment for diseases in which ring occurs. The present invention provides several negatives involving the use of the aforementioned inhibitors according to the prior art. Work on the active aspects. Tangling by the migrating cells themselves or cells in the immediate environment (immediateenvironment) Production of protein leads to local high concentration of hybrids in the direct environment of the target cells. Protein is obtained. This production encodes a hybrid protein Transfection or transduction of certain cell subpopulations with appropriate vectors Can be induced by For this purpose, recombinant adenovirus vectors, A virus vector, a plasmid vector, or the like may be used. Hybrid protein (its receptor binding domain) on the cell surface of target cells The conjugation prevents diffusion of the inhibitor and systemic side effects. This c Local expression of the hybrid protein also contributes to reduced systemic side effects, Negative work of diffusion of the protein Use is reduced by production at the site where action is required. For example, during angiogenesis Hybrid tan in specific subpopulations of cells, such as endothelial cells, which are likely to migrate Local expression of proteins is facilitated using cell type-specific or tissue-specific expression vectors. And expression of the protein comprises cell type-specific or tissue-specific regulators. Under the control of a promoter. Binding of the protease inhibitor to the cell surface receptor allows the inhibitor to become a molecular beacon. Specifically, that is, it can be localized close to the proteolytic enzyme bound to the cell surface. Fine Local inhibition of proteolytic activity in the perivesicular microenvironment is achieved in this way Can be done. Protease inhibitors inhibit proteolytic enzymes such as urokinase receptor Binding to certain cell surface receptors can have additional inhibitory effects. Cell migration As shown to block the binding of u-PA to receptors that can strongly inhibit The binding of the proteinase to the receptor is prevented and therefore the action of this enzyme is strong. Reduced. The hybrid protein wherein the expression vector comprises the coding DNA sequence is Includes regions that bind to surface receptors and are not subsequently internalized. For this purpose Receptor binding domains that can be used for, for example, urokinase plasminogen activity U-PAR binding domain of sexualizing factor, epidermal growth factor, αTwo-Macroglobulin receptor Receptor-related proteins that bind to LDL-R-related proteins (LRPs), also called receptors Protein (RAP), and the receptor binding domain of the VLDL receptor. The inhibitor portion of the encoded hybrid protein is Bovine pancreatic trypsin, also called aprotinin or trasilol® Inhibitors, other trypsin inhibitors such as urinary trypsin inhibitor, metalloproteases Matrix such as tissue inhibitors of TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-3 Various protease inhibitors, such as inhibitors for metalloproteases that decompose Agents or variants thereof. Also other proteases such as elastase Inhibitors comprising a DNA sequence encoding a hybrid protein Very suitable for integration into vectors. For example, an inhibitor moiety, or a different Hybrid proteins, which are combinations of inhibitors or derivatives thereof Multiple copies of the DNA sequence encoding the functional protein portion of Incorporated into DNA construct. Another very interesting possibility is that its action in the local environment of the target cells Any functional protein that can be exercised, such as activation of growth factors or other For example, to apply proteases involved in the activation of vasoregulatory components, Use of an expression vector encoding a brid receptor binding protein. The effect of the protein domain of a functional or hybrid protein is By binding the receptor binding domain to a receptor on the surface of the target cell, It is localized in the direct microenvironment of the target cell. Mark Hybrid proteins in the direct environment of target cells or by the target cells themselves Production of non-viral, adenoviral, or retroviral Use of an expression vector based on the vector system of Obtained by transfection or transduction of these cells. Specific Expression in various cell or tissue types is specifically promoted with expression vectors. This can be achieved by the use of element elements. For example, expression of endothelial cells First, the human or mouse preproendothelin gene (HUMEDN, respectively) 1B and MMU07982, Promoted by Gene Sequence Data Bank (GENBANK) (Elements) are used for expression specific to vascular smooth muscle cells. Human vascular smooth muscle α-actin gene (HUMACTSA, gene sequence database) (Elements of the promoter region) are used to express liver-specific First, the human albumin gene (HUMLBBGC, Gene Sequence Data Bank) May be used. Local delivery of these vectors includes catheters, vectors or targeted delivery systems. Performed using a variety of commonly used methods, such as typically applied gels. You. For example, to prevent restenosis and remodeling of the vessel wall after angioplasty For site-specific delivery to the vessel wall, special catheters can be used. Currently, c Dual balloon catheter coated with vector containing idrogel, channel (cha nneled) balloon catheters, multipleneedle catheters, and balloon catheters. A catheter can be used for delivery specific to the vessel wall. Vector transfer directly to pipe wall Another method for delivering is the use of a stent coated with a vector containing a coating. Applying a vector containing hydrogel to the outside of a blood vessel, or into a blood vessel during transplant surgery There is direct ex vivo transport of Leto before reinjection Ex vivo transduction of proliferating cells with rovirus vectors also requires action Can be used to transport the vector construct to the site to be created. The present application will be described in further detail below with reference to the following examples. Would. These examples serve merely to illustrate the invention, and It is noted that this is not a limitation. Example 1 The urokinase plasminogen activator (u, hereinafter referred to as ATF) -PA), an expression plasmid encoding amino acids 1-138, which is an amino-terminal fragment of The following oligonucleotides 5'-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3 'and 5'- Using the polymerase chain reaction (PCR) by agggtcaccaaggaagagaatggc-3 ', the full length Encodes amino acids 139 to 401 in the expression vector for u-PA By deleting the corresponding DNA sequence. After amplification by PCR, The properly formed DNA fragment is ligated to restore the circularity of the expression plasmid. Can be cyclized by the In this manner, ATF and C containing a stop codon An expression plasmid encoding the terminal 11 amino acid residues can be constructed. The DNA construct thus formed, which then encodes the u-PA ATF fragment As a control for possible mutations that have been sequenced and introduced during the construction procedure Is compared with the deduced sequence. PCRII-uPA derived construct p using PCR CRII-ATF is shown in FIG. In FIG. 1, the area shown between the lines is PC Removed during R amplification, yielding ATF plasmid. Plasmid pCRII-uPA Is shown on the left and the plasmid pCTII-ATF is shown on the right. Example 2 A PCR reaction was performed on genomic DNA isolated from bovine aortic endothelial cells. Thus, amino acid residues 36 to 93 and bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) DNA fragment encoding homologous amino acid residues of bovine spleen trypsin inhibitor (BSTI) A piece can be isolated and the following oligonucleotides are used in the PCR reaction: published sequence (Gene sequence data bank, BTBPTIG) 5'- corresponding to nucleotides 509 to 2533tcgcgacctgacttctgcctagagc-3 '(To introduce an (underlined) NruI site for cloning purposes, the oligonucleotide 5 'region of nucleotides in italics), and published BSTI gene according to the sequence (gene sequence data bank, BTBPTIG) Nucleotides 2442 to 2462, as well as 2677 of the BPTI gene 2704 and nucleotides 2610 to 2636 of the BSTI gene Do 5'-ggtcacccagggcccaatattaccacc-3 '(underlined) BstEII and Ssp Modified with indicated nucleotides (italics) to introduce each I site ) Is used. Then, the amplified DNA fragment was digested with an appropriate plasmid vector, pCR. II or pUC13 and then amplification on the isolated clone The exact sequence of the DNA fragment obtained is that of B with very high homology. Analyzed to identify PTI and BSTI. Example 3 The following oligonucleotides: (sequence of gene sequence data bank HSTIMPR) Corresponding to nucleotides 41 to 65 of human TIMP-1 cDNA 5'-agagagacaccagagaacccaccat-3 'and nucleotides 740 to 755 5'-tcattgtccggaagaaagatgggag-3 'corresponding to Perform reverse transcriptase polymerase chain reaction on total RNA isolated from cells. And amino acids of 1 to 207 of human protease inhibitors of metalloprotease type 1 A DNA fragment encoding the acid is isolated. The amplified DNA fragment is transferred to a suitable host Amplification in isolated clones cloned into vector pUC13 The exact sequence of the DNA fragment was analyzed. Example 4 ATF. Recombinant adeno-containing sequence encoding BPTI hybrid protein This sequence is used to construct the adenovirus vector construct for adenovirus construction. And cloned into the expression plasmid pMAD5. This plasmid Is the portion of the wild-type adenovirus type 5 DNA sequence, the late major promoter (MLP ), And a polyadenylation (polyA) signal, It can be used as an expression vector or shuttle vector to construct. this The plasmid was obtained from plasmid pMLP10 as described below. First, pM LP10-lin contains the restriction endonucleases MluI, SplI, SnaBl , SpeI, AsuII, and A synthetic DNA fragment having a unique site for MunI was isolated from Hind of pMLP10. Constructed by insertion at the III site. Subsequently, the Ad5 genome The adenovirus BglII fragment spanning from otide 3328 to 8914 was converted to pMLP It was inserted into the 10-lin MunI site. Finally, the tetracycline resistance gene The SalI-BamHI fragment was deleted in order to inactivate MAD5 was obtained. ATF. BPTI sequence to MLP promoter and poly A signal For cloning into the pMAD5 plasmid between the following strategies, the following measures were taken: . PCRII plasmid into which a 1373 base pair fragment of UPA cDNA was cloned Starting from Smid, the procedure was performed to construct the pCRII-ATF plasmid. Oligonucleotide 5'- as described in Example 1cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3 ' (Underlined Smal site and italicized nucleotide) and 5'-agggtca cc aaggaagagaatggc-3 '(underlined BstEII site and italic variant PCR was carried out (see FIG. 1). Next, this pCRII -The ATF plasmid was digested with the restriction enzymes SmaI and BsteII. parallel The pCRII-BPTI plasmid was then replaced with the restriction enzymes NruI and BsteI. I and digest the fragment containing BPTI into the pCRII-ATF plasmid. (See FIG. 2). The construct pCRII-ATF-BPTI is shown in FIG. You. In the next step, the ATF-BPTI sequence was cloned into pMAD5. this Are the restriction enzymes EcoRV and The pCRII-ATF-BPTI plasmid is digested with SpeI and ATF-BPT DNA fragment encoding I was isolated and this fragment was digested with SnaBI and SpeI. This was done by cloning on the pMAD5 plasmid. Black Was tested by restriction analysis and sequence analysis. PMAD5-ATF-B for construction of ATF-BPTI adenovirus vector The PTI shuttle vector is shown in FIG. Example 5 For pMAD5-ATF-BPTI, in a similar manner as described in Example 4, B Plasmid containing the STI gene (pMAD5-ATF-BSTI) was The pCRII-BSTI plasmid is used instead of the I-BPTI plasmid. Was built. Example 6 Recombinant DNA containing a sequence encoding ATF-TIMP1 hybrid protein This sequence was cloned into the expression plasmid pMAD5 for construction of the denovirus. Be tuned. This plasmid contains the wild-type adenovirus type 5 DNA sequence. Partial, late major promoter (MLP), and polyadenylation (polyA) signals Expression vector or shuttle vector to construct a recombinant adenovirus. Can be used as a The ATF-TIMP1 sequence is transferred to the MLP promoter and To clone into the pMAD5 plasmid between the A signals, the following strategy Was taken. A 1373 base pair fragment of uPA cDNA PCRII-ATF plasmid using the pCRII plasmid To make the lathmid, oligonucleotide 5'-ccc as described in Example 1 gggcttttttccatctgcgcagtc-3 'and 5'-agggtcaccaaggaagagaatggc-3' PCR reaction was performed (see FIG. 1). Next, the pCRII-ATF plasmid Was digested with the restriction enzymes SmaI and BsteII. In parallel, one of the mature proteins lacking the signal peptide and the stop codon PUC13-TIMP1 encoding 184 amino acid residues The DNA fragment is the following oligonucleotide 5'-tcgcgatgcacctgtgtcccacc-3 ' And 5'-ggtcacccaaatattAmplified using ggctatgtgggaccgcaggg-3 '. these Is the restriction enzyme NruI (first oligonucleotide, below Line), and BstEII, and Ssp1 (second oligonucleotide, bottom Line), these sites are necessary for the cloning procedure. It is important. The amplified DNA fragment is cloned into a pCRII vector and It was called I-TIMP1. Subsequently, this vector was replaced with the restriction enzymes NruI and After digestion with BsteII, the DNA fragment containing TIMP1 was digested with pCRII-ATF plasmid. It was cloned into Smid (see FIG. 1). In the next step, the ATF-TIMP sequence was cloned into pMAD5. this Is a pCRII-ATF-TIMP plasmid with the restriction enzymes EcoRV and SpeI. After digesting the sumid, a DNA fragment encoding ATF-TIMP was digested. The fragment was isolated and this fragment was digested with SnabI and SpeI in pMAD5 plasmid. This was done by cloning in Cloning involves restriction analysis and Tested by sequence analysis. ATF. Recombinant DNA containing sequence encoding TIMP1 hybrid protein This sequence is cloned into the expression plasmid pMAD5 for construction of the denovirus. Is trained. This plasmid contains the wild type adenovirus type 5 DNA sequence. Part, late major promoter (MLP), and polyadenylation (polyA) signal And an expression vector or shuttle vector for constructing a recombinant adenovirus. Can be used as a reactor. ATF. The TIMP1 sequence is added to the MLP promoter and To clone the pMAD5 plasmid between the polyA signals, the following A measure was taken. pCRII plasmid into which a 1373 base pair fragment of uPA cDNA was cloned Starting from Smid, the procedure was performed to construct the pCRII-ATF plasmid. Oligonucleotide 5′-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3 ′ as described in Example 1 And a PCR reaction using 5′-agggtcaccaaggaagagaatggc-3 ′ (FIG. 1) reference). Next, in this pCRII-ATF plasmid, oligonucleotide Do 5'-aatattattgaacttcatcaagttcc-3 'and 5'-gactctagagcaaaaatgacaaccag-3' A PCR reaction is carried out using the Cloned into the vector. In this way, the signal peptide of u-PA is removed. And the SspI restriction enzyme recognition site Is introduced (underlined). The obtained plasmid DNA was replaced with pCRIIATF.★Call . In parallel, a TIMP-1 protein containing a signal peptide but lacking a stop codon PUC13-TIMP1 encoding amino acid residues -23 to 184 of protein The fragment of the cDNA of TIMP1 is converted to the oligonucleotide 5′-agagagacaccagagaacc 5'- including the recognition sites for caccat-3 'and the restriction enzyme Ssp1 (underlined)aatattggctatct Amplified using gggaccgcagg-3 'and cloned into pCRII cloning vector I did. The obtained plasmid DNA was used for pCRII-TIMP1★Call. Subsequently, this vector was digested with the restriction enzymes SspI and EcoRV, PCRII-ATF obtained by digesting a DNA fragment containing MP1 with EcoRV-SspI★ Cloned with plasmid. Including the obtained TIMP-ATF DNA fragment The plasmid was called pCRII-TIMP-ATF. In the next stage, TIMP -The ATF sequence was cloned into pMAD5. This is the restriction enzyme EcoRV Digest the pCRII-TIMP-ATF plasmid with Spel and TIMP -A DNA fragment encoding ATF is isolated and this fragment is I by digestion with the pMAD5 plasmid digested . Cloning was tested by restriction and sequence analysis. Example 7 A hybrid containing multiple copies of the BPTI unit linked to the ATF domain Vector that encodes a protein Was built. To construct these multiple BPTI vectors, the following Measures are taken. PMAD5-ATF-BPTI described in Example 4 is a restriction enzyme SspI. And BstEII. In this way, the vector contains the end of the BPTI sequence. Opened exactly in the reading frame at the edge. PCRII-BPT described in Example 2 The I plasmid was digested with NruI and BstEII, and one blunt end (NruI) To obtain a DNA fragment encoding BPTI provided with The fragment was converted to SspI Bst It was unidirectionally cloned into the EII pMAD5-ATF-BPTI vector. Therefore, a constructed program named pMAD5-ATF-BPTI-BPTI was Rasmid is used as a shuttle vector for the construction of recombinant adenovirus Was done. This approach is useful for constructing vectors containing multiple BPTI domains. It can be repeated several times. Example 8 Both BPTI and TIMP1 units linked to the ATF domain A vector encoding a hybrid protein containing the two was constructed. This BP In order to construct the TI-TIMP vector, the following measures are taken. PMAD5-ATF-BPTI described in Example 4 is a restriction enzyme SspI. And BstEII. In this way, the vector is placed immediately after the BPTI sequence. Opened in. The pCRII-TIMP plasmid described in Example 6 was NruI And TIMP1 digested with BstEII and having one blunt end DNA fragment Get. The fragment was digested with SspI BstEII pMAD5-ATF-BPTI vector. Cloned into the vector. Therefore, pMAD5-ATF-BPTI-TI The constructed plasmid, named MP, is used for recombinant adenovirus construction. Torr vector. Example 9 A. After transfection of cells with pMAD5 or recombinant replication deficient A Functional ATF- after transduction with an adenovirus encoding TF-BPTI The following tests were performed to monitor the production of BPTI hybrid proteins. It was given. By CHO cells transfected with pMAD5-ATF-BPTI Production of a hybrid ATF-BPTI protein that is The pieces were analyzed using a uPA ELISA that recognizes the ATF. pMAD5 C by ATF-BPTI plasmid (50-100 ng / ml / 24 hours) After transient transfection of HO cells and encoding ATF-BPTI Transduction with adenovirus vector (up to 1.5 μg / ml / 24 hours) Both later, ATF-BPTI production was clearly detectable. Cell culture medium of CHO cells transduced with ATF-BPTI adenovirus The analysis was performed using a Western blotting technique. Electrophoresis and blotting Later, on u-PA or BPTI (generated against Trasilol®) Parallel filters were analyzed using the corresponding polyclonal antibodies. Both files In the Luther, a signal was detected at the same expected position of about 20 kDa. Was issued. This means that the proteins actually produced are u-PA and BPTI Pieces, thus indicating that a hybrid protein is produced. CHO cells infected with ATF-BPTI virus (about 1.8 μg / ml) As an inhibitor of plasmin activity of ATF-BPTI protein, Was first analyzed in solution. They are plasmin (1 nM) and incubate Then, the activity of plasmin was measured using a dye substrate. Trasilol (Register (Trademark) dilution was used as a control reference. Plastic using ATF-BPTI medium Sumin inhibition is very effective, by diluting the medium to 1000X ( That is, the activity of 100 nMATF-BPTI) 1 nM plasmin was inhibited by 50%. A similar inhibition was observed with 100 nM Trasilol®. Accordingly Thus, the activity of ATF-BPTI was measured using commercially available Trasilol (registered trademark, ba Comparable to the activity of Bayer, Germany. Has been or has been transfected with the human uPA receptor gene Interaction between u-PA receptor (uPAR) and ATF domain using a murine cell line ATF-BP as an inhibitor for plasmin bound to the cell surface The function of the TI was tested. These cells were infected with the ATF-BPTI virus. Incubated for 6 hours in diluted CHO cell dilution medium. Transfer with uPAR Extracts from Transfected Cells and Parental Mouse Cells Lacking Human uPAR Was prepared. Prior to making cell extracts, a short acid treatment was applied to parallel cultures ( pH 3, 3 minutes). This treatment results in either u-PA or ATF binding to the u-PA receptor. Removed. Cell extracts were incubated with 1 nM plasmin, plasmin Activity was measured. Plasmin activity was determined in cell extracts of cell lines containing u-PAR. Can only be inhibited by Cell extract of parental cell line lacking u-PA receptor And acid-treated plasmin in cell lines containing u-PAR treated with acid. No inhibition of activity was observed. This is clearly because ATF-BPTI is u-PAR 4 shows that it can function as a bound plasmin inhibitor. Table 1Example 10 For example, to specifically inhibit endothelial cell migration during angiogenesis, Human prep before DNA encoding ATF-BPTI in ills vector Loendothelin 1 gene promoter sequence (HUMEDN1B (gene sequence data By cloning nucleotides 2180-3680) of Cell-specific expression of ATF-BPTI in endothelial cells is reached. This way High level of epithelial cell-specific expression of ATF-BPTI hybrid protein Can be Example 11 Proteolytic degradation of the extracellular matrix is responsible for many cell migration and tissue This is an important step in the remodeling process. This proteolytic Trick degradation is mediated by urokinase-type plasminogen activity Is often seen. By an adenovirus encoding ATF-BPTI Test that different infections can inhibit plasmin-mediated extracellular matrix degradation To do so, experiments were performed using human synovial cells. These cells are In cartilage substanceThreeSeeded on H-labeled extracellular matrix, Infected by ATF-BPTI adenovirus. Strong inhibition of matrix decomposition Damage was observed in virus-treated cells (FIG. 4), and matrix degradation was observed in ATF- Showing that it can be inhibited by cells infected by the virus encoding BPTI I have. FIG. 4 shows cartilage matrix from human synovium in the presence of plasminogen. Shows the decomposition of The matrix was treated with control medium (lane 1), synovial cells (lane 2), Synovial cells infected with ATF-BPTI adenovirus (lane 3); Synovial cells incubated with Rasilol® (100 KIU / ml) (Lane 4). Example 12 In the process of restenosis, smooth muscle cell migration and tube wall remodeling are Important events involving plasmin-mediated proteolysis of extracellular matrix components Is the thing. In vivo of common plasmin inhibitors for interference in this process The application may have systemic side effects. Applying a plasmin inhibitor to the surface of migrating cells prevents these side effects. Can be stopped. For example, in an implanted “coronary artery bypass graft, ATF-BPTI adenovirus at sites where neointima formation can be expected Infection of the vascular wall by spores is ideal for the local production of ATF-BPTI Plasmin activity in the immediate environment of migrating (smooth muscle) cells. And reduces neointimal formation as a result. Human model, a model system in which neointimal formation can be very realistically simulated This principle was tested using saphenous vein organ culture. ATF-BPTI adeno In parallel cultures infected or uninfected with virus, 3 and Four weeks later, neointimal formation was analyzed. A clear new vein in unprocessed organizations The formation of an intima was observed. 10Tenpfu / ml ATF-BPTI adenowi Strong inhibition of neointimal formation was observed in tissue treated with Lus.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年６月２５日（１９９９．６．２５） 【補正内容】 請求の範囲 （請求項１８および１９を追加。これに伴い、請求項１８および１９の項番号を ２０および２１に調整（内容に変更なし）。） 18．ヒトなどの哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用な該ベ クターからなる組換え核酸分子であって、 前記ベクターが結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するド メインからなる発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコー ドする核酸挿入物を含み、結合機能を有する該ドメインが細胞表面受容体結合ド メインである組換え核酸分子。 19．ヒトなどの哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なベク ターからなる組換え核酸分子であって、 前記ベクターが発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコ ードする核酸挿入物を含み、該核酸挿入物がウロキナーゼのウロキナーゼ受容体 結合ドメイン、上皮増殖因子、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（α2−マクログロ ブリン受容体）に結合する受容体関連タンパク質、およびＶＬＤＬ受容体の受容 体結合ドメインと、プロテアーゼ阻害剤またはその活性部からなるプロテアーゼ 阻害剤活性を有するドメインとからなる群より選択される受容体結合ドメインと からなり、該プロテアーゼ阻害剤が（ウシの）膵臓トリプシン阻害剤、（ウシの ）脾臓トリプシン阻害剤、尿のトリプシン阻害剤、マトリックスの金属プロテア ー ゼ１の組織阻害剤、マトリックスの金属プロテアーゼ２の組織阻害剤、マトリッ クスの金属プロテアーゼ３の組織阻害剤、およびエラスターゼ阻害剤からなる群 より選択されてなる組換え核酸分子。 20．局所的タンパク質分解活性、細胞外マトリックスの分解、細胞遊走、細胞浸 潤、または組織リモデリングを防止するための方法であって、請求の範囲第１項 、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第１０ 項、第１１項、第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第１６項、第１７項 、第１８項または第１９項記載の組換え核酸分子を用いて、該核酸分子によって コードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の局所発現を得るた めに、関与する細胞またはそれらの環境にある細胞をトランスフェクションまた は形質導入することからなる方法。 21．結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するドメインからな るハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法であり、 請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項 、第９項、第１０項、第１１項、第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第 １６項、第１７項、第１８項または第１９項記載の組換え核酸分子を用いて、該 核酸分子によってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の 発現を得るために、哺乳類の細胞をトランスフェクションまたは形質導入し、産 生されたハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を任意的に回収すること からなる方法。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] June 25, 1999 (June 25, 1999) [Details of Amendment] Claims (Claims 18 and 19 have been added. The item numbers of Claims 18 and 19 have been adjusted to 20 and 21 (with no change in content). A recombinant nucleic acid molecule comprising the vector useful for transfection or transduction of a mammalian cell such as a human, wherein the vector is an expressible hybrid polypeptide comprising a domain having a binding function and a domain having an effector function, or A recombinant nucleic acid molecule comprising a nucleic acid insert encoding a protein, wherein the domain having a binding function is a cell surface receptor binding domain. 19. A recombinant nucleic acid molecule comprising a vector useful for transfection or transduction of mammalian cells such as humans, said vector comprising a nucleic acid insert encoding a hybrid polypeptide or protein capable of being expressed, said nucleic acid insert There urokinase receptor binding domain of urokinase, epidermal growth factor, LDL receptor-related protein - receptor-associated protein that binds to the (alpha 2 macroglobulin receptor), and the receptor binding domain of the VLDL receptor, protease inhibitors or A receptor binding domain selected from the group consisting of a domain having a protease inhibitory activity comprising the active portion thereof, wherein the protease inhibitor is (bovine) pancreatic trypsin inhibitor, (bovine) spleen trypsin inhibitor Urinary trypsin inhibitor, matrix Tissue inhibitor of genus protease 1, tissue inhibitor of metalloproteinase 2 matrix, recombinant nucleic acid molecule is selected from the group consisting of tissue inhibitor, and elastase inhibitor metalloproteinase 3 matrix. 20. A method for preventing local proteolytic activity, extracellular matrix degradation, cell migration, cell invasion, or tissue remodeling, wherein the method is claimed in claims 1, 2, 3, and 4. , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, Use of the recombinant nucleic acid molecule of paragraph 17, 18, or 19 in the cells or their environment involved to obtain local expression of a hybrid polypeptide or protein encoded by the nucleic acid molecule A method comprising transfecting or transducing a cell. twenty one. A method for producing a hybrid polypeptide or protein consisting of a domain having a binding function and a domain having an effector function, wherein the method comprises the steps of claim 1, claim 2, claim 3, claim 4, and claim 5. , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 17 The recombinant nucleic acid molecule of paragraph 18 or 19 was used to transfect or transduce mammalian cells to obtain expression of a hybrid polypeptide or protein encoded by the nucleic acid molecule. Optionally recovering the hybrid polypeptide or protein.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フェルヘイエン、ヨハン ヘンドリクス オランダ国、エヌエル―2651 ヴェーベー ベルケル エン ロデンリース、フェル ジストラート 14────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, L S, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ , BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL , AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, E E, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU , ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, M D, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL , PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, U Z, VN, YU, ZW (72) Inventors Verheien, Johan Hendricks Nuel 2651 Webbe, The Netherlands Berkel en Rodenries, Fell Gystrato 14
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