JP2001521762A - 真核細胞に遺伝子を移した後に細胞活力と効率を並行して決定するための手法と二重テストシステム - Google Patents
真核細胞に遺伝子を移した後に細胞活力と効率を並行して決定するための手法と二重テストシステムInfo
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
Abstract
(57)【要約】
真核細胞に遺伝子を移した後に細胞活力と効率を並行して決定するための手法と二重テストシステムを開示する。真核細胞に遺伝子を移した後に、移行された細胞の細胞数を改良酸性ホスファターゼ酵素活性によって決定し、それに続き、イオン強度とｐＨ値を変えてレポーター遺伝子の活性を決定（β-ガラクトシダーゼアッセイ）することによって、同じ反応容器内で遺伝子移行の効率を決定する。
Description
【０００１】 本発明は、真核細胞に遺伝子を移した後に、レポート遺伝子使用下で細胞活力
と効率を同じ培養容器内で並行して決定するための方法と二重テストシステムに
関する。
と効率を同じ培養容器内で並行して決定するための方法と二重テストシステムに
関する。
【０００２】 真核細胞にＤＮＡを挿入することは分子生物学の重要な技術である。この目的
のために、次のような一連の手法が知られている：カルシウムフォスフェイトpr
azipation 法（Grahm-FL; EB-AJ-van der (1973).A new technique for the ass
ay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52: 456-67), 種々
のウィルス媒介法（Rosen-CA; Sodroski-JG; Haseltine-WA (1985). The locati
on of cis-acting regulatory sequences in the human T cell lymphotropic v
irus type III(HTLV-III/LAV) long terminal repeat. Cell 41: 813-23), 陽イ
オン・リポゾームを使ったＤＮＡ投与（Felgner-PL; Gadek-TR; Holm-M; Rp,am-
R; Chan-HW; Wenz-M; Northrop-JP; Ringold-GM; Danielsen-M (1987). Lipfect
ion: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc
-Natl-Acid-Sci-U-S-A. 84: 7413-7)ならびにポリマー投与（Fauci-AS (1986).
Current issues in developing a strategy for dealing with the acquired im
munodeficiency syndrome. Proc-Natl-Acid Sci-U-S-A. 83: 9278-83; Mosca-JD
; Bedarik-DF; Raj-NB; Rosen-CA; Sodroski-JG; Haseltine-WA; Pitha-PM (198
7). Herpers simplex virus type-1 can reactive transcription of latent hu
man immunodeficiency virus. Nature. 325: 67-70; Gendelman-HE; Phelps-W; Feigenbaum-L; Ostrove-MA (1986). Tra
nsactivation of the human immunodeficiency virus long terminal repeat se
quence b DNA viruses. Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A. 83: 9759-63) 物理的方法 を使ったもの（O'Hare-P; Hayward-GS (1985). Evidence for a direct role fo
r both the 175,000- and 110,000-molecular-weight immediate early protein
s of herpers simplex virus in the transactivation of delayed-early promo
ters. J-Virol. 53: 751-60, Gorman-CM; Moffat-LF; Howard-BH (1982). Recom
binant genoms which express chloramphenical acetyltransferase in mammali
an cells. Mol-Cell-Biol. 2: 104-51）。
のために、次のような一連の手法が知られている：カルシウムフォスフェイトpr
azipation 法（Grahm-FL; EB-AJ-van der (1973).A new technique for the ass
ay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52: 456-67), 種々
のウィルス媒介法（Rosen-CA; Sodroski-JG; Haseltine-WA (1985). The locati
on of cis-acting regulatory sequences in the human T cell lymphotropic v
irus type III(HTLV-III/LAV) long terminal repeat. Cell 41: 813-23), 陽イ
オン・リポゾームを使ったＤＮＡ投与（Felgner-PL; Gadek-TR; Holm-M; Rp,am-
R; Chan-HW; Wenz-M; Northrop-JP; Ringold-GM; Danielsen-M (1987). Lipfect
ion: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc
-Natl-Acid-Sci-U-S-A. 84: 7413-7)ならびにポリマー投与（Fauci-AS (1986).
Current issues in developing a strategy for dealing with the acquired im
munodeficiency syndrome. Proc-Natl-Acid Sci-U-S-A. 83: 9278-83; Mosca-JD
; Bedarik-DF; Raj-NB; Rosen-CA; Sodroski-JG; Haseltine-WA; Pitha-PM (198
7). Herpers simplex virus type-1 can reactive transcription of latent hu
man immunodeficiency virus. Nature. 325: 67-70; Gendelman-HE; Phelps-W; Feigenbaum-L; Ostrove-MA (1986). Tra
nsactivation of the human immunodeficiency virus long terminal repeat se
quence b DNA viruses. Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A. 83: 9759-63) 物理的方法 を使ったもの（O'Hare-P; Hayward-GS (1985). Evidence for a direct role fo
r both the 175,000- and 110,000-molecular-weight immediate early protein
s of herpers simplex virus in the transactivation of delayed-early promo
ters. J-Virol. 53: 751-60, Gorman-CM; Moffat-LF; Howard-BH (1982). Recom
binant genoms which express chloramphenical acetyltransferase in mammali
an cells. Mol-Cell-Biol. 2: 104-51）。
【０００３】 生体内における遺伝子投与の効率を調べるために、Lacz-Gen (Lim-K; Chae-CB
(1989). A simple assay for DNA transfection by incubation of the cells
in culture dishes with substrates for beta-galactosidase. Biotechniques.
7: 576-9)，Luziferase-Gen (Nordeen-SK (1988). Luciferase reporter gene
vectors for analysis of promoters and enhancers. Biotechniques. 6: 454-8
)，Chloramphenicolacetyltransferase-Gen (Gorman et al (1982), S.O.)など 、一連のいわゆるレポーター遺伝子が使われる。Lacz-Genは他のレポーター遺伝
子と比べさまざまな利点がある。まず第一に、レポーター細胞がexprimierenす る個々の細胞、transfizierenされる細胞を、いわゆるX-Gal-染色（Lojda-Z; Sl
aby-J; Kraml-J; Kolinska-J(1973).Synthetic substrates in the histochemic
al demonstration of intestinal disaccharidases. Histochemie. 34: 361-9）
によって染色することが可能である。さらに、より多数の細胞の全遺伝子発現の
決定を、簡単な染色テストで決定することができる。この遺伝子発現の決定は、
他の多くのレポーター遺伝子とは反対に、どんな実験室でも実施することができ
る。放射能測定やluminometoricな測定は全く必要なく、必要なのは染色発展(Fa
rb-entwicklung)の測定だけだからである。
(1989). A simple assay for DNA transfection by incubation of the cells
in culture dishes with substrates for beta-galactosidase. Biotechniques.
7: 576-9)，Luziferase-Gen (Nordeen-SK (1988). Luciferase reporter gene
vectors for analysis of promoters and enhancers. Biotechniques. 6: 454-8
)，Chloramphenicolacetyltransferase-Gen (Gorman et al (1982), S.O.)など 、一連のいわゆるレポーター遺伝子が使われる。Lacz-Genは他のレポーター遺伝
子と比べさまざまな利点がある。まず第一に、レポーター細胞がexprimierenす る個々の細胞、transfizierenされる細胞を、いわゆるX-Gal-染色（Lojda-Z; Sl
aby-J; Kraml-J; Kolinska-J(1973).Synthetic substrates in the histochemic
al demonstration of intestinal disaccharidases. Histochemie. 34: 361-9）
によって染色することが可能である。さらに、より多数の細胞の全遺伝子発現の
決定を、簡単な染色テストで決定することができる。この遺伝子発現の決定は、
他の多くのレポーター遺伝子とは反対に、どんな実験室でも実施することができ
る。放射能測定やluminometoricな測定は全く必要なく、必要なのは染色発展(Fa
rb-entwicklung)の測定だけだからである。
【０００４】 ＤＮＡを真核細胞に投与するたいていのテクニックは、ある程度の細胞破壊を
伴うので、遺伝子移行後の細胞活力の決定ならびに毒性の決定は、その手法の効
率と確実性を性格付けするために重要である。結合毒性を決定するためには、た
いていは細胞の代表的な酵素の活性を測定する、あるいは生きている細胞を手で
数える、といった内容をもった、一連の手法がある。多数回試行する実験では、
酵素法が最も広く使われてきた。これに関してとくに重要なのはいわゆるＭＴＴ
テスト（Mosmann-T (1983). Rapi colorimetric assay for cellular growth an
d survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J=Immu
nol-Methods. 65: 55-63）とSaurePhosphataseテスト（Connolly-DT; Knight-MB
; Harakas-NK; Wittwer-AJ; Feder-J (1986). Determination of the number of
endothelial cells in culture using an acid phosphatase assay. Anal Bioc
hem. 152: 136-40）であり、これらのテストではミトコンドリアのデヒドロッゲ
ナーゼ（MTT）ならびにcytosolicな酸性フォスファターゼが決定される。これま
でのところ、レポーター遺伝子活性で方法の効率を決定するのと、細胞に代表的
な酵素活力で方法の毒性を決定するのは、別々の手法で行うしか方法がない。
伴うので、遺伝子移行後の細胞活力の決定ならびに毒性の決定は、その手法の効
率と確実性を性格付けするために重要である。結合毒性を決定するためには、た
いていは細胞の代表的な酵素の活性を測定する、あるいは生きている細胞を手で
数える、といった内容をもった、一連の手法がある。多数回試行する実験では、
酵素法が最も広く使われてきた。これに関してとくに重要なのはいわゆるＭＴＴ
テスト（Mosmann-T (1983). Rapi colorimetric assay for cellular growth an
d survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J=Immu
nol-Methods. 65: 55-63）とSaurePhosphataseテスト（Connolly-DT; Knight-MB
; Harakas-NK; Wittwer-AJ; Feder-J (1986). Determination of the number of
endothelial cells in culture using an acid phosphatase assay. Anal Bioc
hem. 152: 136-40）であり、これらのテストではミトコンドリアのデヒドロッゲ
ナーゼ（MTT）ならびにcytosolicな酸性フォスファターゼが決定される。これま
でのところ、レポーター遺伝子活性で方法の効率を決定するのと、細胞に代表的
な酵素活力で方法の毒性を決定するのは、別々の手法で行うしか方法がない。
【０００５】 本発明によれば、驚くべきことに、細胞活力とレポーター遺伝子発現を同時に
決定するために、一部修正した酸性ホスファターゼ活性を、比色測定または蛍光
測定によるレポーター遺伝子アッセイ、とくにβ-ガラクトシダーゼアッセイと 組み合わせることが可能なのである。
決定するために、一部修正した酸性ホスファターゼ活性を、比色測定または蛍光
測定によるレポーター遺伝子アッセイ、とくにβ-ガラクトシダーゼアッセイと 組み合わせることが可能なのである。
【０００６】 本発明は前記請求の態様にしたがって実現される。 細胞はレポート遺伝子（トランスフェクション後 24-72h）の発現にしたがっ てリン酸塩緩衝液 (PBS)で洗う。続いて、酸性ホスファターゼを決定するために
緩衝液を加える。その組成は、とくにSubstratとしてp-Nitrophenylphosphat(pN
PP)、緩衝剤として2-Morpholinoethanolスルホン酸(MES)、細胞溶解剤としてAlk
ylphemyipolyethylenglycol(Triton X-100)またはNaphtylphosphatin Natriumac
etat/Triton x-100からなる。15分から30分37度でインキュベートした後、Tris
(hydroxymethyl) aminomethane-HCL (pH 8.0) (Tris-HCl)またはHEPESを加えて 反応を止め、反応生成物の量を405nmでスペクトル光測定または蛍光測定で決定 する。特定の酸性ホスファターゼ活性の高さが生きている細胞の数の尺度となる
。
緩衝液を加える。その組成は、とくにSubstratとしてp-Nitrophenylphosphat(pN
PP)、緩衝剤として2-Morpholinoethanolスルホン酸(MES)、細胞溶解剤としてAlk
ylphemyipolyethylenglycol(Triton X-100)またはNaphtylphosphatin Natriumac
etat/Triton x-100からなる。15分から30分37度でインキュベートした後、Tris
(hydroxymethyl) aminomethane-HCL (pH 8.0) (Tris-HCl)またはHEPESを加えて 反応を止め、反応生成物の量を405nmでスペクトル光測定または蛍光測定で決定 する。特定の酸性ホスファターゼ活性の高さが生きている細胞の数の尺度となる
。
【０００７】 続いて、同じセル・カルチャー・シャーレにβ-ガラクトシダーゼアッセイ緩 衝液を加える。この緩衝液はCPRGならびにONPG in Hank's Balancierter塩溶液 （HBSS）または／および MUG in HBSS、MUG-Stammlosung in DMSO and HBSSを 含んでいる。２分から２４時間のインキュベーションの後、反応生成物の量を54
0-580nmにおけるスペクトル光測定または蛍光解析で決定する。このようにして 例えば塩化フェノールレッドの量はレポーター遺伝子の発現の尺度になる。
0-580nmにおけるスペクトル光測定または蛍光解析で決定する。このようにして 例えば塩化フェノールレッドの量はレポーター遺伝子の発現の尺度になる。
【０００８】 真核細胞に遺伝子を移した後に細胞活力と効率を並行して決定するための二重
テストシステムは次のことを包括する。
テストシステムは次のことを包括する。
【０００９】 ａ） 酸性ホスファターゼの決定のための基質及び細胞溶解のための緩衝液に
よる活力アッセイ、及び ｂ） レポーター遺伝子アッセイのための基質及び効率決定のための緩衝液に
よるレポーター遺伝子アッセイ。
よる活力アッセイ、及び ｂ） レポーター遺伝子アッセイのための基質及び効率決定のための緩衝液に
よるレポーター遺伝子アッセイ。
【００１０】 本発明にしたがったテストによって、一度にそして細胞培養容器の中で直接、
遺伝子移行法の効率と毒性を決定することが初めて可能になる。このとき使われ
る手法は、遺伝子を移行した後の細胞活力(Vitality)とlacZ-Gens投与による遺 伝子生成物の活性(Aktivitaet)のマーカーとして酵素酸性ホスファターゼを使い
、遺伝子投与の効率のマーカーとしてβ-ガラクトシダーゼの活性を使う。第一 ステップでは、酸性ホスファターゼの活性の決定を一部修正したアッセイによっ
て行う。酸性ホスファターゼに優先的に与えられた基質pNPPはこのとき p-ニト ロフェノールに変わり、反応生成物の量は405nmにおける光吸収によって光度測 定で決定される。この決定の際に使われる緩衝液はこれまでの方法に比べ緩衝物
質の濃度が薄く、細胞活性を決定するのに適している。さらに、緩衝溶液のイオ
ン強度が低いと、酸性ホスファターゼの活性を決定した後に、Tris-HCl緩衝液ま
たはHEPES-緩衝液を過剰に加えることにより、5.5から約7.8までｐＨ値を変更す
ることが可能になる。この混合緩衝液は、β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を 加えると、β-ガラクトシダーゼ活性の決定に適している。基質としてCPRG, ONP
G, あるいは MUGが使われる。CPRGを使った場合、β-ガラクトシダーゼの反応生
成物の吸収最大値は570nm付近にある。したがって、酸性ホスファターゼの反応 生成物としてすでにある p-ニトロフェノールのスペクトルは、その後の分析を 妨害しない。加水分解生成物である o-ニトロフェノールは酸性ホスファターゼ の反応生成物 p-ニトロフェノールに比べ、より長波長領域にずれた吸収スペク トルをもっている。これにより、β-ガラクトシダーゼ反応の決定が例えば490nm
で可能になる。β-ガラクトシダーゼ反応の反応生成物としてのmethylumbellife
ronはMUGを使って蛍光測定によって決定できる。放射スペクトルが重ならなけれ
ば、二つの蛍光活性の基質を組み合わせることもできる。したがって、リン酸ナ
フチルを酸性ホスファターゼ反応の基質として、MUGをβ-ガラクトシダーゼ反応
の基質として使うこともできる。
遺伝子移行法の効率と毒性を決定することが初めて可能になる。このとき使われ
る手法は、遺伝子を移行した後の細胞活力(Vitality)とlacZ-Gens投与による遺 伝子生成物の活性(Aktivitaet)のマーカーとして酵素酸性ホスファターゼを使い
、遺伝子投与の効率のマーカーとしてβ-ガラクトシダーゼの活性を使う。第一 ステップでは、酸性ホスファターゼの活性の決定を一部修正したアッセイによっ
て行う。酸性ホスファターゼに優先的に与えられた基質pNPPはこのとき p-ニト ロフェノールに変わり、反応生成物の量は405nmにおける光吸収によって光度測 定で決定される。この決定の際に使われる緩衝液はこれまでの方法に比べ緩衝物
質の濃度が薄く、細胞活性を決定するのに適している。さらに、緩衝溶液のイオ
ン強度が低いと、酸性ホスファターゼの活性を決定した後に、Tris-HCl緩衝液ま
たはHEPES-緩衝液を過剰に加えることにより、5.5から約7.8までｐＨ値を変更す
ることが可能になる。この混合緩衝液は、β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を 加えると、β-ガラクトシダーゼ活性の決定に適している。基質としてCPRG, ONP
G, あるいは MUGが使われる。CPRGを使った場合、β-ガラクトシダーゼの反応生
成物の吸収最大値は570nm付近にある。したがって、酸性ホスファターゼの反応 生成物としてすでにある p-ニトロフェノールのスペクトルは、その後の分析を 妨害しない。加水分解生成物である o-ニトロフェノールは酸性ホスファターゼ の反応生成物 p-ニトロフェノールに比べ、より長波長領域にずれた吸収スペク トルをもっている。これにより、β-ガラクトシダーゼ反応の決定が例えば490nm
で可能になる。β-ガラクトシダーゼ反応の反応生成物としてのmethylumbellife
ronはMUGを使って蛍光測定によって決定できる。放射スペクトルが重ならなけれ
ば、二つの蛍光活性の基質を組み合わせることもできる。したがって、リン酸ナ
フチルを酸性ホスファターゼ反応の基質として、MUGをβ-ガラクトシダーゼ反応
の基質として使うこともできる。
【００１１】 酵素酸性ホスファターゼの活性測定を先に行うことによってβ-ガラクトシダ ーゼの決定が阻害されることは１０パーセント代以下であり、（この数字なら）
受け入れられる。というのは、β-ガラクトシダーゼ酵素はここで使われる条件 下では十分に安定しており、またテストの感受性（精度）はインキュベーション
の時間を長くすることによってさらに上げることができるからである。本発明に
基づく手法は、毒性と効率性という点から遺伝子移行法を評価するために使うこ
とができる。記述されている酸性ホスファターゼテストは、細胞数決定するには
、広く使われているMTTテストより速いし正確である。さらに、毒性のある化学 薬品の使用を減らすことができる。これまで記されてきた方法とは反対に、ここ
での手法ではイオン強度の低い緩衝液が使われる。このことは方法の感受性（精
度）には影響せず、しかもより高イオンの弱アルカリ緩衝システムを加えること
により、引き続きpH値を上げることが可能になる。このとき得られる条件は、そ
の次に続く第二の酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素の決定に好都合である。この 酵素の活性は、その前に行われる酸性ホスファターゼの決定によっても、ほんの
わずかしか減少せず、そしてテストされているすべての細胞溶解液中と主要な C
ornea Endothel Zellen des Rindesの中でレポーター遺伝子の発現を決定するの
には十分高い。このテストは、遺伝子投与のためのさまざまな方法ならびに素材
を、広範囲に迅速に手軽にテストするのに非常に適している。
受け入れられる。というのは、β-ガラクトシダーゼ酵素はここで使われる条件 下では十分に安定しており、またテストの感受性（精度）はインキュベーション
の時間を長くすることによってさらに上げることができるからである。本発明に
基づく手法は、毒性と効率性という点から遺伝子移行法を評価するために使うこ
とができる。記述されている酸性ホスファターゼテストは、細胞数決定するには
、広く使われているMTTテストより速いし正確である。さらに、毒性のある化学 薬品の使用を減らすことができる。これまで記されてきた方法とは反対に、ここ
での手法ではイオン強度の低い緩衝液が使われる。このことは方法の感受性（精
度）には影響せず、しかもより高イオンの弱アルカリ緩衝システムを加えること
により、引き続きpH値を上げることが可能になる。このとき得られる条件は、そ
の次に続く第二の酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素の決定に好都合である。この 酵素の活性は、その前に行われる酸性ホスファターゼの決定によっても、ほんの
わずかしか減少せず、そしてテストされているすべての細胞溶解液中と主要な C
ornea Endothel Zellen des Rindesの中でレポーター遺伝子の発現を決定するの
には十分高い。このテストは、遺伝子投与のためのさまざまな方法ならびに素材
を、広範囲に迅速に手軽にテストするのに非常に適している。
【００１２】 実施例を通して、本発明をさらに詳しく解説する。 省略形： MUG: Methylumbelliferyl-β−Ｄ−Galaktopyranosid ONPG:o-Nitrophenol-β−Ｄ−Galaktopyranosid PBS: Phosphat gepuffertte Salineリン酸塩で緩衝した塩水 CPRG:Chlorphenolrot-β−Ｄ−Galaktopyranosid pNNP:p-NitrophenolPhosphat pNP: p-Nitrophenol DMSO:Dimethylsulfoxid HBSS:Hank's Balancierte Salzlosung
【００１３】 方法： p-Nitrophenol, o-Nitrophenol,Chlorphenolrotの吸収スペクトルの決定 基質pNPPはp-Nitrophenolのなかのセル・カルチャーの中で変化させられる。さ らに、MCF-7セル・カルチャーに基質溶液 10mM pNPP in 0.02M MES (pH 5.5)と0
.1% Triton x-100が細胞溶解のために加えられる。一時間インキュベーションし
た後、残留物を除き、細胞の破片は遠心によって除く。その後スペクトロフォト
メーターでスペクトルを測定する。
.1% Triton x-100が細胞溶解のために加えられる。一時間インキュベーションし
た後、残留物を除き、細胞の破片は遠心によって除く。その後スペクトロフォト
メーターでスペクトルを測定する。
【００１４】 基質ONPGとCPRGはHBSS中のβ-ガラクトシダーゼ標準液を加えることにより、 完全に 加水分解される。続いて、同様にして反応生成物 Chlorphenolrotと o-N
itrophenolのスペクトルを可視光領域で決定する（図１を比較せよ）。
itrophenolのスペクトルを可視光領域で決定する（図１を比較せよ）。
【００１５】 水性媒体におけるβ-ガラクトシダーゼアッセイ HBSSのなかで希β-ガラクトシダーゼ標準液が作られ、標準液10μｌが96-Well
-プレートの個々のWellに与えられる。テストされるβ-ガラクトシダーゼ酵素の
活性は、100〜0.0001mU/Well の間にある。
-プレートの個々のWellに与えられる。テストされるβ-ガラクトシダーゼ酵素の
活性は、100〜0.0001mU/Well の間にある。
【００１６】 次の緩衝液が使われる： HBSS, HBSS with 0.1%Triron X-100 (HBSS-TX)と0.02M MES-緩衝液, pH 5.5 w
ith 0.1% Triton X-100(MES-TX)。
ith 0.1% Triton X-100(MES-TX)。
【００１７】 β-ガラクトシダーゼ標準液を含んだそれぞれのWellに 100μｌ HBSSまたはHB
SS-TXならびに80 lMES-TXを与える。続いて３７度、５％ ＣＯ2で３０分インキ
ュベーションする。それから、β-ガラクトシダーゼ標準液とMES-TX緩衝液の入 ったwellに20μｌ 0.5M Tris-HCLかあるいは20μｌ 0.5M HEPEs (pH 0.8)を与え
る。さらに、150 μｌ CPRG 基質溶液とHBSSに溶かした1 mg/ml CPRGを加える。
540-580 nmでの光学密度が、異なる時間にMikrotiterplatteフォトメーターで決
定される（図２を比較せよ）。
SS-TXならびに80 lMES-TXを与える。続いて３７度、５％ ＣＯ2で３０分インキ
ュベーションする。それから、β-ガラクトシダーゼ標準液とMES-TX緩衝液の入 ったwellに20μｌ 0.5M Tris-HCLかあるいは20μｌ 0.5M HEPEs (pH 0.8)を与え
る。さらに、150 μｌ CPRG 基質溶液とHBSSに溶かした1 mg/ml CPRGを加える。
540-580 nmでの光学密度が、異なる時間にMikrotiterplatteフォトメーターで決
定される（図２を比較せよ）。
【００１８】 リポゾームの生成 LipideをTrichlormethanに溶かし、そしてTrichlormethanを気化と数時間の真
空乾燥によって除く。続いて脱イオン化した水を与えVortexerで二分間強く攪拌
することによってリポゾームができる。
空乾燥によって除く。続いて脱イオン化した水を与えVortexerで二分間強く攪拌
することによってリポゾームができる。
【００１９】 セル・カルチャー MCF-7, MaTu, CC531, 293, LS174細胞はPRMI 1640 Mediumで、F98細胞,Bovine
Cornea Endothel細胞はDulbecco's modifiziertem Eagle's Medium（DMEM)で、
N64, N39, U343, U373細胞は modifiziertem Eagle's Medium(MEM)で培養する。
すべてのMedienは10%の fotales 子牛の血清, 100 U/ml ペニシリンＧ, 100 μ
g/mlのストレプトマイシンスルフェート、0.25μg/mlの Amphoterizinを含む。 細胞は5% CO2/95% air 37度のセル・キューベーターで培養する。
Cornea Endothel細胞はDulbecco's modifiziertem Eagle's Medium（DMEM)で、
N64, N39, U343, U373細胞は modifiziertem Eagle's Medium(MEM)で培養する。
すべてのMedienは10%の fotales 子牛の血清, 100 U/ml ペニシリンＧ, 100 μ
g/mlのストレプトマイシンスルフェート、0.25μg/mlの Amphoterizinを含む。 細胞は5% CO2/95% air 37度のセル・キューベーターで培養する。
【００２０】 細胞数の決定 細胞はトリプシン化され、細胞数はトリパンブルー染色と顕微鏡下でのカウン
トによって決定する。続いて、 125から30000個の細胞を 96er Mikrotiterplatt
eのWellごとにausgesaetする。翌日、Mediumを除き、付着する細胞をリン酸緩衝
化した塩水 (PBS)で一度洗う。MTTテストで細胞数を決定するのに、100 μl Med
ium with 0.5 mg/ml MTT-Reagenzを加える。３７度５％ＣＯ2で３−４時間セル ・インキュベーションをした後、Mediumを除き、Formazan結晶をジメチルスルフ
ォイドに溶かす。続いてMikrotiterplatteフォトメーター 540nmで（レファラン
ス・フィルター 690nm）光学密度を決定する（図３を比較せよ）。
トによって決定する。続いて、 125から30000個の細胞を 96er Mikrotiterplatt
eのWellごとにausgesaetする。翌日、Mediumを除き、付着する細胞をリン酸緩衝
化した塩水 (PBS)で一度洗う。MTTテストで細胞数を決定するのに、100 μl Med
ium with 0.5 mg/ml MTT-Reagenzを加える。３７度５％ＣＯ2で３−４時間セル ・インキュベーションをした後、Mediumを除き、Formazan結晶をジメチルスルフ
ォイドに溶かす。続いてMikrotiterplatteフォトメーター 540nmで（レファラン
ス・フィルター 690nm）光学密度を決定する（図３を比較せよ）。
【００２１】 酸性ホスファターゼテストを実施の際に、PBSで細胞を洗った後に基質緩衝液
10mM pNPP in 0.02 M MES/ 0.1% Triron X-100を加える（異なる実験プレートの
ための正確な分量は表１を参照）。３７度５％ＣＯ2で３０分インキュベーショ ンした後、Tris-HClまたは0.5M HEPES (pH 8.0)を加えて反応を止める。続いて 、マイクロ・プレート・測定器で405nm（レファランス波長 690nm）での吸収を 決定することによって p-ニトロフェノール濃度を決定する。
10mM pNPP in 0.02 M MES/ 0.1% Triron X-100を加える（異なる実験プレートの
ための正確な分量は表１を参照）。３７度５％ＣＯ2で３０分インキュベーショ ンした後、Tris-HClまたは0.5M HEPES (pH 8.0)を加えて反応を止める。続いて 、マイクロ・プレート・測定器で405nm（レファランス波長 690nm）での吸収を 決定することによって p-ニトロフェノール濃度を決定する。
【００２２】
【表１】 異なるセル・カルチャー・プレートにおける異なるテスト緩衝液の分量の一覧 酸性ホスファターゼ ストップ緩衝液 β-カ゛ラクトシタ゛ーセ゛ テスト緩衝液（μl ） （μl ） テスト緩衝液（μl ） 96-well-シャーレ ８０ ２０ １５０ 24-well-シャーレ ２４０ ６０ ４５０ 6-well-シャーレ ８００ ２００ １５００ ＊β-ガラクトシダーゼ活性を決定するのに、β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液
を50μlのみ使用することも同様に可能である。
を50μlのみ使用することも同様に可能である。
【００２３】 例： 酸性ホスファターゼテスト緩衝液： 10mM pNPP in 0.02M MES/0.1% Triton x-100 10 mM pNPP in 0.02M Natriumacetat/0.1% Triton x-100 1mM Naphtylphosphat in 0.02M Natriumacetat/0.1% Triton x-100 ストップ緩衝液： 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0) 0.5M HEPES (pH 8.0) β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液： 1 mg/ml CPRG in HBSS (50μl) 2 mg/ml ONPG in HBSS (100μl) 1mM MUG in HBBSS (100μl) MUG-Stammlosung 20mM in DMSO and HBSS 細胞のトランスフェクション： 遺伝子移行実験のためには、96-well の底が平らなカルチャー・プレートが使
われる。
われる。
【００２４】 ｆotal の子牛の血清10％を含んだ Medium 100 μｌの中の10000から20000個 の細胞がwellごとにausgesatされる。翌日、Lipid/DNA複合体を次のように用意 する（Felgnerとその共同研究者による 1994）：Lipidを血清の入っていないMed
ium中の別個のプレートで二倍に希釈する。10μｌ Lipid/wellから初め、全体積
50μｌの中に 0.3l μｇ Lipid/Wellまで薄める。続いて、他の96-wellプレート
上に、ＤＮＡも同様に二倍に希釈する。50μｌの同様に血清の入っていないMedi
umで２μｇから0.03μｇまで薄め、その後薄めたＤＮＡを細胞にpipertteirenす
る。複合体を形成するのに双方の希釈液を混ぜたものを１５−３０分室温でイン
キュベートする。そして細胞に複合体を加える。３−５分のインキュベーション
の後、100μｌのMediumに２０％のfotal の子牛の血清を加え、細胞を２４−７ ２時間インキュベートし、投与した遺伝子の発現を調べる。
ium中の別個のプレートで二倍に希釈する。10μｌ Lipid/wellから初め、全体積
50μｌの中に 0.3l μｇ Lipid/Wellまで薄める。続いて、他の96-wellプレート
上に、ＤＮＡも同様に二倍に希釈する。50μｌの同様に血清の入っていないMedi
umで２μｇから0.03μｇまで薄め、その後薄めたＤＮＡを細胞にpipertteirenす
る。複合体を形成するのに双方の希釈液を混ぜたものを１５−３０分室温でイン
キュベートする。そして細胞に複合体を加える。３−５分のインキュベーション
の後、100μｌのMediumに２０％のfotal の子牛の血清を加え、細胞を２４−７ ２時間インキュベートし、投与した遺伝子の発現を調べる。
【００２５】 毒性とレポーター遺伝子発現の二重テスト lacz-レポーター遺伝子の構成をトランスフェクトして 24-72時間後、その方 法における細胞活性ならびに毒性を血清フォスファターゼテストで決定する。細
胞のセル・カルチャー・Mediumは除き、細胞を100μｌのPBSで一度洗う。細胞活
力と遺伝子発現の決定はさまざまな方法で行われる。
胞のセル・カルチャー・Mediumは除き、細胞を100μｌのPBSで一度洗う。細胞活
力と遺伝子発現の決定はさまざまな方法で行われる。
【００２６】 例１： 細胞を洗った後、血清フォスファターゼ・テスト・緩衝液 80μｌを加える（1
0mM pNPP in 0.02M MES または0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-1
00 for the Zellyse, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.
5M HEPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-N
itrophenolの吸収で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、CPRG-
β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 50または 150μｌ 1mg/ml
CPRG in HBSS）。続いて、lacz-レポーター遺伝子の発現を、β-ガラクトシダー
ゼテスト緩衝液を加えてから２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さがどのく
らいかによって540-580nmでの反応生成物のCholorphenolrotの光吸収測定で分析
する。表現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることがで き、細胞と同じ方法で取り扱う。
0mM pNPP in 0.02M MES または0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-1
00 for the Zellyse, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.
5M HEPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-N
itrophenolの吸収で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、CPRG-
β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 50または 150μｌ 1mg/ml
CPRG in HBSS）。続いて、lacz-レポーター遺伝子の発現を、β-ガラクトシダー
ゼテスト緩衝液を加えてから２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さがどのく
らいかによって540-580nmでの反応生成物のCholorphenolrotの光吸収測定で分析
する。表現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることがで き、細胞と同じ方法で取り扱う。
【００２７】 例２： 細胞を洗った後、血清フォスファターゼ・テスト・緩衝液80μｌを加える（10
mM pNPP in 0.02M MES または0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-10
0 for the Zellyse, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5
M HEPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-Ni
trophenolの吸収で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、ONPG- β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 100μｌ 1mg/ml ONPG in H
BSS）。続いて、lacz-レポーター遺伝子の発現を、ONPG-β-ガラクトシダーゼテ
スト緩衝液を加えてから２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さがどのくらい
かによって470-490nmでの反応生成物のo-Nitrophenolの光吸収測定で分析する。
表現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることができ、細 胞と同じ方法で取り扱う。
mM pNPP in 0.02M MES または0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-10
0 for the Zellyse, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5
M HEPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-Ni
trophenolの吸収で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、ONPG- β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 100μｌ 1mg/ml ONPG in H
BSS）。続いて、lacz-レポーター遺伝子の発現を、ONPG-β-ガラクトシダーゼテ
スト緩衝液を加えてから２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さがどのくらい
かによって470-490nmでの反応生成物のo-Nitrophenolの光吸収測定で分析する。
表現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることができ、細 胞と同じ方法で取り扱う。
【００２８】 例３： 細胞を洗った後、血清フォスファターゼ・テスト・緩衝液80μｌを加える（10
mM pNPP in 0.02M MES または0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-10
0 for the Zellyse, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5
M HEPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-Ni
trophenolの吸収で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、MUG-β
-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 100μｌ 1mM MUG in HBSS, 5
% DMSO; from MUS-Stammlosung 20 mM in DMSO and HBSS）。続いて、lacz-レポ
ーター遺伝子の発現を、MUG-β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加えてから２ 分から２４時間後に、遺伝子発現の高さがどのくらいかによって、約350nmで刺 激（Anregung）した後の460-540nmでの反応生成物Methylumbelliferonの光放射 を測定して分析する。発現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連 付けることができ、細胞と同じ方法で取り扱う。
mM pNPP in 0.02M MES または0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-10
0 for the Zellyse, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5
M HEPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-Ni
trophenolの吸収で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、MUG-β
-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 100μｌ 1mM MUG in HBSS, 5
% DMSO; from MUS-Stammlosung 20 mM in DMSO and HBSS）。続いて、lacz-レポ
ーター遺伝子の発現を、MUG-β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加えてから２ 分から２４時間後に、遺伝子発現の高さがどのくらいかによって、約350nmで刺 激（Anregung）した後の460-540nmでの反応生成物Methylumbelliferonの光放射 を測定して分析する。発現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連 付けることができ、細胞と同じ方法で取り扱う。
【００２９】 例４： 細胞を洗った後、血清フォスファターゼ・テスト・緩衝液80μｌを加える（1m
M Naphtylphosphat in 0.02 Mナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-100 for t
he Zellyse, pH 5.5）。２−４時間後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5M H
EPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。約350nmでの刺激（Anre
gung）の後、約 405 nmで反応正生物のNaphtolの光放出を測定して、細胞数を数
える。Naphtol濃度の測定後、MUG-β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える。
（例えば 100μｌ 1mM MUG in HBSS, 5% DMSO; from MUS-Stammlosung 20 mM in
DMSO and HBSS）。続いて、lacz-レポーター遺伝子の発現を、MUG-β-ガラクト
シダーゼテスト緩衝液を加えてから２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さが
どのくらいかによって、約350nmで刺激（Anregung）した後の460-540nmでの反応
生成物Methylumbelliferonの光放射を測定して分析する。表現の全高度はβ-ガ ラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることができ、細胞と同じ方法で取り扱
う。
M Naphtylphosphat in 0.02 Mナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-100 for t
he Zellyse, pH 5.5）。２−４時間後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5M H
EPES, pH8.0）で、血清フォスファターゼ反応を止める。約350nmでの刺激（Anre
gung）の後、約 405 nmで反応正生物のNaphtolの光放出を測定して、細胞数を数
える。Naphtol濃度の測定後、MUG-β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加える。
（例えば 100μｌ 1mM MUG in HBSS, 5% DMSO; from MUS-Stammlosung 20 mM in
DMSO and HBSS）。続いて、lacz-レポーター遺伝子の発現を、MUG-β-ガラクト
シダーゼテスト緩衝液を加えてから２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さが
どのくらいかによって、約350nmで刺激（Anregung）した後の460-540nmでの反応
生成物Methylumbelliferonの光放射を測定して分析する。表現の全高度はβ-ガ ラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることができ、細胞と同じ方法で取り扱
う。
【００３０】 例５： 細胞を洗った後、血清フォスファターゼ・テスト・緩衝液80μｌを加える（10
mM pNPP in 0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-100 for the Zellys
e, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5M HEPES, pH8.0）
で、血清フォスフェターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-Nitrophenolの吸収 で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、ONPG-MUG-β-ガラクト シダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 100μｌ 1mM MUG, 7mM OMPG, 5% DMSO
in HBSS; from MUS-Stammlosung 20 mM in DMSO and HBSS）。続いて、lacz-レ ポーター遺伝子の発現を、OMPG-β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加えてから
２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さを分析する。
mM pNPP in 0.02M ナトリウムアセテ−ト／0.1% Triton X-100 for the Zellys
e, pH 5.5）。３０分後、20μｌ 0.5MのTris-HCl（または 0.5M HEPES, pH8.0）
で、血清フォスフェターゼ反応を止める。405-450 nmでのp-Nitrophenolの吸収 で細胞数を数える。p-Nitrophenol濃度を測定した後に、ONPG-MUG-β-ガラクト シダーゼテスト緩衝液を加える（例えば 100μｌ 1mM MUG, 7mM OMPG, 5% DMSO
in HBSS; from MUS-Stammlosung 20 mM in DMSO and HBSS）。続いて、lacz-レ ポーター遺伝子の発現を、OMPG-β-ガラクトシダーゼテスト緩衝液を加えてから
２分から２４時間後に、遺伝子発現の高さを分析する。
【００３１】 このとき遺伝子発現の決定は １）約350nmで刺激（Anregung)した後の460-540nmでの反応生成物Methylumbel
liferonの光放射測定による。そして
liferonの光放射測定による。そして
【００３２】 ２）470-490nmでの反応生成物のo-Nitrophenolの光吸収測定による二つの基質
を組み合わせることによって、非常に高濃度のβ-ガラクトシダーゼの測定もONP
G-基質によって可能になり、非常に低いβ-ガラクトシダーゼ濃度の決定もMUG- 基質によって可能になる。これによって、テストの線形性が広範囲に引き延ばさ
れる。発現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることがで き、細胞と同じ方法で取り扱う。
を組み合わせることによって、非常に高濃度のβ-ガラクトシダーゼの測定もONP
G-基質によって可能になり、非常に低いβ-ガラクトシダーゼ濃度の決定もMUG- 基質によって可能になる。これによって、テストの線形性が広範囲に引き延ばさ
れる。発現の全高度はβ-ガラクトシダーゼ測定曲線の値に関連付けることがで き、細胞と同じ方法で取り扱う。
【００３３】
【表２】 「遺伝子移行法の細胞活力ならびに毒性」と「遺伝子移行法の効率」を二重に決
定するための異なる手法の比較 例 １ ２ ３ ４ ５ 酸性ホスファ pNPP pNPP pNPP リン酸- pNPP ターゼ基質 ナフチル 酸性ホスファ 光学的 光学的 光学的 蛍光測定 光学的 ターゼ試験 β-ガラクトシダ CPRG CPRG MUG MUG MUG/ONPG ーゼ基質 β-ガラクトシダ 光学的 光学的 蛍光測定 蛍光測定 光学的/ ーゼ試験 蛍光測定 β-ガラクトシダ ＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ―ゼ感度
定するための異なる手法の比較 例 １ ２ ３ ４ ５ 酸性ホスファ pNPP pNPP pNPP リン酸- pNPP ターゼ基質 ナフチル 酸性ホスファ 光学的 光学的 光学的 蛍光測定 光学的 ターゼ試験 β-ガラクトシダ CPRG CPRG MUG MUG MUG/ONPG ーゼ基質 β-ガラクトシダ 光学的 光学的 蛍光測定 蛍光測定 光学的/ ーゼ試験 蛍光測定 β-ガラクトシダ ＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ―ゼ感度
【図１】 使用した酵素基質の反応生成物の吸収スペクトルの比較
【図２】 さまざまな緩衝液でのβ-ガラクトシダーゼ反応のプロセス。テスト されたβ-ガラクトシダーゼの活性は、100から0.01 mU/Wellの間にある。次の緩
衝液が利用された： HBSS, HBSS with 0.1%Triron X-100 (HBSS-Triton)と0.02M MES-緩衝液, pH 5
.5 with 0.1% Triton X-100MES)。β-ガラクトシダーゼ標準液が入ったそれぞれ
のWellに 100μｌ HBSSまたはHBSS-Tritonならびに80μｌ MES−緩衝液を与える
。続いて37度、５％ＣＯ2 で３０分インキュベーションする。それから、β-ガ ラクトシダーゼ標準液とMES-緩衝液が入ったwellに20μｌ 0.5M Tris-HCL(pH 0.
8)を与えた。さらに、150 μｌ CPRG Substrar溶液とHBSSに溶かした1 mg/ml CP
RGを加えた。540-580 nmでの光密度（optische Dichte）がいくつかの異なる時 間にMikrotiterplatteフォトメーターで決定された。
衝液が利用された： HBSS, HBSS with 0.1%Triron X-100 (HBSS-Triton)と0.02M MES-緩衝液, pH 5
.5 with 0.1% Triton X-100MES)。β-ガラクトシダーゼ標準液が入ったそれぞれ
のWellに 100μｌ HBSSまたはHBSS-Tritonならびに80μｌ MES−緩衝液を与える
。続いて37度、５％ＣＯ2 で３０分インキュベーションする。それから、β-ガ ラクトシダーゼ標準液とMES-緩衝液が入ったwellに20μｌ 0.5M Tris-HCL(pH 0.
8)を与えた。さらに、150 μｌ CPRG Substrar溶液とHBSSに溶かした1 mg/ml CP
RGを加えた。540-580 nmでの光密度（optische Dichte）がいくつかの異なる時 間にMikrotiterplatteフォトメーターで決定された。
【図３】 MosmannによるMTT-Assayと酸性ホスファターゼアッセイによる細胞数
決定の比較。酸性ホスファターゼアッセイの実施は本文に記した通り。細胞数決
定の際の緩衝液：80μｌ 10mM pNPP in 0.02 M MES/ with 0.1% Triron X-100（
pH 5.5）, 20μｌ Tris-HCl(pH 8.0)。
決定の比較。酸性ホスファターゼアッセイの実施は本文に記した通り。細胞数決
定の際の緩衝液：80μｌ 10mM pNPP in 0.02 M MES/ with 0.1% Triron X-100（
pH 5.5）, 20μｌ Tris-HCl(pH 8.0)。
【図４】 MosmannによるMTT-Assay（Ａ）、LimBとChaeによるβ-ガラクトシダ ーゼアッセイ（Ｂ）、二重アッセイ（Ｃ、Ｄ； Ｃ：酸性ホスファターゼアッセ
イの結果； Ｄ：酸性ホスファターゼアッセイ後に行ったβ-ガラクトシダーゼ アッセイ）の比較。 MCF-7細胞は、DOCSPER-リポゾームとPlasmid-DNA pUT 651 (Cayla, Toulouse,
フランス)とともに、Felgnerと共同研究者（1994）が記した方法でtransfizier
enされた。Transfektionをして３日後、細胞活性とβ-ガラクトシダーゼ発現の 決定を、例１（80μｌ 10mM pNPP in 0.02M MES; 0.1% Triton X-100（pH 5.5）
, 20μｌ Tris-HCl (pH 8.0), 150μｌ 1 mg/ml CPRG in HBSS）に記した通り行
った。コントロール細胞の細胞活性と実験での最大β-ガラクトシダーゼ発現は1
00%確定された。
イの結果； Ｄ：酸性ホスファターゼアッセイ後に行ったβ-ガラクトシダーゼ アッセイ）の比較。 MCF-7細胞は、DOCSPER-リポゾームとPlasmid-DNA pUT 651 (Cayla, Toulouse,
フランス)とともに、Felgnerと共同研究者（1994）が記した方法でtransfizier
enされた。Transfektionをして３日後、細胞活性とβ-ガラクトシダーゼ発現の 決定を、例１（80μｌ 10mM pNPP in 0.02M MES; 0.1% Triton X-100（pH 5.5）
, 20μｌ Tris-HCl (pH 8.0), 150μｌ 1 mg/ml CPRG in HBSS）に記した通り行
った。コントロール細胞の細胞活性と実験での最大β-ガラクトシダーゼ発現は1
00%確定された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA40 BB02 BB20 BB52 CB21 DA20 FA11 FA26 FA29 FB01 FB04 FB12 FB20 GC06 GC10 GC14 HA16 4B063 QA01 QQ33 QQ35 QR41 QR57 QX01 QX02
Claims (6)
- 【請求項１】 真核細胞に遺伝子を移した後に、細胞活力と効率を並行して決定
するための手法であって、 移行された細胞の細胞数を代表的な酵素活性によって決定し、それに続き、イ
オン強度とｐＨ値を変えてレポーター遺伝子の活性を決定することによって、同
じ反応容器内で遺伝子移行の効率を決定することを特徴とする、前記手法。 - 【請求項２】 酵素活性を酸性ホスファターゼの定量によって調べることを特徴
とする、請求項１の手法。 - 【請求項３】 効率決定するのに緩衝強度を下げることを特徴とする、請求項１
又は２の手法。 - 【請求項４】 真核細胞に遺伝子を移した後に、細胞活力と効率を並行して決定
するための二重テストシステムであって、 ａ） 酸性ホスファターゼの決定のための基質及び細胞溶解のための緩衝液に
よる活力アッセイ、及び ｂ） レポーター遺伝子アッセイのための基質及び効率決定のための緩衝液に
よるレポーター遺伝子アッセイ を含むことを特徴とする、前記二重テストシステム。 - 【請求項５】 ａ）基質が pNPPであり 、及び ｂ）β-ガラクトシダーゼアッセイが比色分析による ことを特徴とする、請求項４の二重テストシステム。
- 【請求項６】 ａ）基質が pNPPまたは リン酸ナフチルであり、及び ｂ）β-ガラクトシダーゼアッセイが蛍光分析法による ことを特徴とする、請求項４の二重テストシステム。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19750790 | 1997-11-07 | ||
| DE19750790.5 | 1998-02-13 | ||
| DE19805818.7 | 1998-02-13 | ||
| DE19805818A DE19805818C2 (de) | 1997-11-07 | 1998-02-13 | Verfahren zur Bestimmung von Zellvitalität und Effizienz nach Gentransfer in eukaryontische Zellen und duales Testsystem |
| PCT/DE1998/003245 WO1999024602A2 (de) | 1997-11-07 | 1998-11-06 | Verfahren zur parallelen bestimmung der zellvitalität und gentransfer-effizienz |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000519595A Pending JP2001521762A (ja) | 1997-11-07 | 1998-11-06 | 真核細胞に遺伝子を移した後に細胞活力と効率を並行して決定するための手法と二重テストシステム |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1029241B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001521762A (ja) |
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| WO (1) | WO1999024602A2 (ja) |
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1998
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