【発明の詳細な説明】
C−末端にカルボニル基及び複素環基を有するドラスタチン15誘導体
[発明の背景]
細胞成長の阻害剤として顕著な活性を有する短鎖ペプチドは、インド洋のアメ
フラシDolabella auriculariaから単離されたものが多い(Bai,et al.,Bioche
m.Pharmacology,40:1859-1864(1990);Beckwith,et al.,J.Natl.Cnacer I
nst.,85:483-488(1993)及びその中に引用された文献)。これらには、ドラス
タチン(Dolastatin)1〜10(米国特許番号481644号明細書、Pettit et
alに付与)及びドラスタチン15(欧州特許出願番号398558号)に記載さ
れている。ドラスタチン15は、例えば、ナショナル・キャンサー・インスティ
チュート(National Cancer Institute)のP388リンパ球性白血病(PS系)細
胞系−種々のタイプの人の悪性腫瘍に対する有効性の強い予言物質である−の成
長を顕著に阻害する。Dolabella auriculariaに存在する極微量の種々のドラス
タチンペプチド(100kgのアメフラシ当たり約1mg)、及びその結果必然
的に発生する評価と使用に十分な量を精製するための困難性が、これらの化合物
の合成に向ける努力に駆り立ててきた(Roux,etal.,Tetrahedron,50:5345-536
0(1994);Shioiri,et al.,Tetrahedron,49:1913-24(1993);Patino,et al.
,Tetrahedron,48:4115-4122(1992)及びその中に引用された文献)。しかし
ながら、合成ドラスタチン15には、欠点として、水系における低溶解性及び合
成のために高価な出発物質が必要なことがある。このため、順に、構造的に変更
されたドラスタチン15誘導体の合成そして評価されるに至った(参照:Bioorg
anic & Med.Chem.Lett.,4:1947-50(1994);WO93/03054;JP−A
−06234790;WO93/23424)。
しかしながら、ドラスタチン15の生物活性を有し、必要な水溶解性及び効率
良く且つ経済的に製造できる合成化合物が必要である。
[発明の要旨]
本発明の化合物は、式(I):
A−B−D−E−F−G (1)
で表されるペプチド及びその酸塩である。A、B、D及びEがα−アミノ酸残基
を表し、そしてAはアミノ末端基である。一つの態様において、Fがアザシクロ
アルカンカルボン酸残基を表す。この態様では、Gが、例えば水素、アルキル、
アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシアルキル、カルボキシ
ル、カルボキシアルキル、アミノカルボニルアルキル、アリールアルキル、ヘテ
ロアリールアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アリールオキシカルボニ
ルアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アリールスルフィニルアルキル、
アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、ヒドロカルボニル
、アリールオキシカルボニル、アルキル若しくはアリールスルフィニル、アルキ
ル若しくはアリールスルホニル等の一価の基を表す。別の態様において、Fがア
ザシクロアルキルを表し、Gが炭素炭素結合でFと結合したヘテロアリールを表
す。
本発明の別の側面において、式(I)の化合物及び医薬的に受容可能な担体を
含む医薬組成物を包含する。
本発明の他の側面は、医薬的に受容可能な組成物として、式(I)で表される
化合物又はその酸塩を治療有効量で、ヒト等の哺乳動物に投与することを特徴と
する哺乳動物の癌を治療する方法である。
[発明の詳細な記述]
本発明は、抗腫瘍活性を有するペプチドに関する。本発明は、またこれらの化
合物を含む医薬組成物、及びこれらの組成物を哺乳動物に投与することによるヒ
ト等の哺乳動物を治療する方法も包含する。
ドラスタチン15、インド洋のアメフラシDolabella auriculariaから単離さ
れたペプチドは、細胞成長に効力のある阻害剤である。しかしながら、この化合
物は、アメフラシに痕跡量で存在するだけで、従って単離が困難である。それは
、また合成するのに高価であり、そして低い水溶解性との不利がある。しかしな
がら、ここに示すように、ドラスタチン15はこれらの不利を克服する化合物開
発の端緒としての役割を担うものであり、一方抗腫瘍剤作用を保持するか、或
いは天然物に比べてより大きい抗腫瘍剤作用を示すものである。出願人は、ドラ
スタチン15のある構造的変更により、ドラスタチン10又は15に比較して、
腫瘍性疾患を治療できる可能性が驚く程改善された化合物をもたらされることを
見出した。このドラスタチン15誘導体は、複数薬剤−抵抗腫瘍系においても活
性を示し、水性溶剤に予想できないほどの高い溶解性を示す。さらに、本発明の
化合物は、下記に詳細に示すように、便宜的に合成することができる。
本発明の目的において、用語「一価の基」は、第2の電気的に中性の分子片と
一個の共有結合を形成することができる電気的に中性の分子片を意味するもので
ある。一価の基としては、水素原子、アルキル(例、メチル、エチル及びプロピ
ル)、ハロゲン原子(例、フッ素、塩素及び臭素)、アリール(例、フェニル及
びナフチル)、そしてアルコキシ(例、メトキシ及びエトキシ)を挙げることが
できる。隣接するσ結合原子の2個の一価の基は、合体して隣接原子の間にπ結
合を形成することもできる。また、2個の一価の基は、互いに結合して、環構造
(例えばポリメチン単位による)を形成しても良い。例えば、単位−N(R)R
’[但し、R及びR’は、それぞれ一価の基を表す]は、窒素原子と共に複素環
を形成しても良い。さらに、同じ原子に結合する2個の一価の基は、合体して2
価の基、例えばアルキリデン(例、プロピリデン)又は酸素原子を形成しても良
い。
本発明の目的において、用語「残基」は、分子、例えばアミノ酸又はヒドロキ
シ酸から水分子(1個の酸素、2個の水素)を除去した後の分子片を言う。
本発明の目的では、用語「直鎖アルキル」とは、分岐していない又は直鎖状の
アルキル、例えば直鎖プロピル(n−プロピル、−CH2CH2CH3)を言う。
本発明の化合物は、式I:
A−B−D−E−F−G (I)
[但し、A、B、D及びEが、それぞれα−アミノ酸残基を表す。]
により表すことができる。一態様において、Fがアザシクロアルカンカルボン酸
残基を表す。この態様では、Gが、水素、アルキル、アルコキシアルキル、カル
ボキシアルキル、アミノカルボニルアルキル、アリールアルキル、アルコキシカ
ルボニルアルキル、アミノアルキル、アリールオキシカルボニルアルキル、アル
キルスルフィニルアルキル、アリールスルフィニルアルキル、アルキルスルホニ
ルアルキル、アリールスルホニルアルキル、ヒドロカルボニル、アリールオキシ
カルボニル、アルキル若しくはアリールスルフィニル及びアルキル若しくはアリ
ールスルホニルから選択される一価の基である。別の態様において、Fがアザシ
クロアルキルを表し、Gが炭素炭素結合でFと結合したヘテロアリールを表す。
式Iのペプチドは、一般にL−アミノ酸から構成されるが、一個以上のD−ア
ミノ酸を含むことができる。これらは、生理学的に耐性の酸との塩として存在し
得る。この塩としては、塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、燐酸、メタンスルホン
酸、酢酸、蟻酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸
、L−グルタミン酸、L−アスパラギン酸、ピルビン酸、ムチン酸、安息香酸、
グリクロン酸、蓚酸、アスコルビン酸又はN−アセチルグリシンを挙げることが
できる。
本発明に関して、下記には、個々の成分について、及び請求の範囲の化合物を
用いる方法について、詳細に記載されている。
本発明の化合物
Aの共通点
一態様において、Aは下記の式IIaで表されるプロリン誘導体である:
上式において、IIaが整数を表し、0、1、2又は3が好ましい。Raが、一価
の基、例えば水素原子、又は無置換若しくは1〜3個のフッ素で置換された、直
鎖、分岐若しくは環式のC1〜C3アルキル(適当な例、メチル、エチル、イ
ソプロピル、2−フルオロエチル、2,2,2−トリフルオロエチル、1−メチ
ル−2−フルオロエチル、1−フルオロメチル、2−フルオロエチル、又はシク
ロプロピル)を表し、メチル、エチル又はイソプロピルが好ましい。
この態様では、R1 aが、水素原子、又はメチル、エチル、プロピル又はフェニ
ル等の一価の基である。フェニルは、置換されていても良く、好適な置換基は、
1個以上のハロゲン原子(フッ素、塩素及び臭素が好ましい)、C1〜C4アルキ
ル、メトキシ、エトキシ、トリフルオロメチル又は又はニトロである。
R2 a、R3 a、R4 a及びR5 aが、それぞれ独立して水素原子又はメチル等の一価
の基を表す。RaとR1 aが合体してプロピレン橋かけを形成することもできる。
別の態様において、Aが、下記の式IIIaで表される置換グリシン誘導体である
:
上式において、Raが式IIaで述べた意味を有する。R1 aが、一価の基、例えば
水素原子、又は低アルキル、好ましくはメチル、エチル又はプロピルを表す。
この態様において、R6 aが一価の基、例えば水素原子、直鎖若しくは分岐のC1
〜C8アルキルで、6個までのハロゲン(好ましくはフッ素)で置換されていて
も良く、或いはC3〜C8シクロアルキル、C3〜C8シクロアルキル−C1〜C4ア
ルキル、C1〜C4オキソアルキル(例、メトキシメチル、1−メトキシエチル又
は1,1−ジメチルヒドロキシメチル)、C2〜C5アルケニル(例、ビニル及び
1−メチルビニル)、置換又は無置換フェニルを表す。好適なフェニルの置換基
は、1個以上のハロゲン原子(好ましくはフッ素、塩素又は臭素)、そしてアル
キル、メトキシ、エトキシ、トリフルオロメチル又はニトロである。R7 aが一価
の基で、好ましくはメチル又はエチルを表す
他の態様において、Aが、式IVaで表されるα−アミノ酸残基を表す: 上式において、maが整数、好ましくは1又は2を表す。Ra及びR7 aが式IIIa
で記載された意味を有する。
他の態様において、Aが、式Vaで表されるα−アミノ酸残基を表す:
上式において、Ra及びR7 aが式IIIaで記載された意味を有する。
別の態様において、Aが、式VIaで表される置換プロリン誘導体を表す:
上式において、Ra及びR1 aが式IIaで記載された意味を有し、Xaが一価の基
、好ましくはヒドロキシル、メトキシ或いはエトキシ又はフッ素原子を表す。
他の態様において、Aが、式VIIaで表されるチアプロリル誘導体を表す: 上式において、Ra、R1 a、R2 a、R3 a、R4 a及びR5 aが、式IIaで記載された
意味を有する。
別の態様において、Aが、式VIIIaで表される1,3−ジヒドロイソインドー
ル誘導体を表す:
上式において、Raが式IIaで記載された意味を有する。
他の態様において、Aが、式IXaで表される2−アザビシクロ[2.2.1]
ヘプタン−3−カルボン酸誘導体を表す:
上式において、Zaが単結合又は2重結合であり、そしてRaが式IIaで記載さ
れた意味を有する。3−カルボニル置換基がエンド配向又はエキソ配向のいずれ
かを持つことができる。
Bの共通性
Bは、バリル残基、イソロイシル残基、アロ−イソロイシル残基、ノルバリル
残基、2−tert−ブチルグリシル残基又は2−エチルグリシル残基である。
Bはまた、下記の式IIbで表される残基であることもできる:
上式において、R1 b及びR2 bがそれぞれ一価の基を表す。好ましくは、R1 bが
水素原子を表し、そしてR2 bが、例えばシクロプロピル、n−ブチル、イソブチ
ル、tert−ブチル、メトキシメチル、1−メトキシエチル、又は1−メチル
ビニルを表す。さらに、R1 bとR2 bとが、合体してイソプロピリデンを形成する
ことができる。
Dの共通性
Dが、N−アルキルバリル残基、N−アルキル−2−エチルグリシル残基、N
−アルキル−2−tert−ブチルグリシル残基、N−アルキルノルロイシル残
基、N−アルキルイソロイシル残基、N−アルキル−アロ−イソロイシル残基、
又はN−アルキルノルバリル残基を表し、上記アルキルはメチル又はエチルであ
ることが好ましい。
別の態様において、Dが、下記の式IIdで表されるα−アミノカルボン酸誘導
体を表す:
上式において、Rdが式IIIaのRaで記載した意味を有し、R1 dが一価の基を表
し、好ましくは水素原子を表し、そしてR2 dが一価の基を表し、好ましくはシク
ロプロピル、メトキシメチル、1−メトキシエチル、又は1−メチルビニルを表
す。さらに、R1 dとR2 dとが、合体してイソプロピリデンを形成することがで
きる。
或いは、Dが、下記の式IIIdで表されるプロリン誘導体を表すことができる:
上式において、ndが整数を表し、例えば1又は2を表し、そしてR3 dが式IIIa
のR1 dについて記載した意味を有する。Xdが一価の基、好ましくは水素原子を
表し、ndが1の場合、Xdがヒドロキシル、メトキシ又はエトキシ、又はフッ素
原子を表す。
Eの共通性
Eが、プロリル残基、チアゾリジニル−4−カルボニル残基、ホモプロリル残
基又はヒドロキシプロリル残基を表すか、下記の式IIeで表される環式α−アミ
ノカルボン酸残基を表す:
上式において、neが整数、好ましくは0、1又は2を表す。R1 eが式IIIaの
R1 dについて記載した意味を有する。R2 e及びR3 eがそれぞれ一価の基を表し、
独立して水素原子又はメチルであることができる。R4 eが一価の基を表し、好ま
しくは水素原子、ヒドロキシル、メトキシ又はエトキシ、又はフッ素原子を表す
。R5 eが一価の基を表し、好ましくは水素原子である。
neが1を表しそしてR3 eとR4 eとが合体して二重結合を形成するか、或いは
R4 eとR5 eとが合体して二重結合酸素(double-bonded oxygen)基を形成する。ne
が1又は2を表す場合、R1 eとR2 eとが合体して二重結合を形成する。
別の態様において、Eが、下記の式IIIeで表される2−又は3−アミノシクロ
ペンタンカルボン酸残基を表す:
上式において、Reが一価の基、例えばメチル又はエチルを表し、そしてR1 e
が式IIIaのR1 aについて記載した意味を有する。
Fの共通性
本発明の一態様において、Fが、下記の式IIfで表されるアザシクロアルカン
カルボン酸残基を表す:
上式において、afが整数、好ましくは0、1又は2を表す。カルボニル基が
窒素原子に関して1又は2位(好ましくは1位)にある。
この態様において、Gは、水素原子、6個までハロゲン原子(好ましくはフッ
素)で置換されても良い直鎖又は分岐のC1〜C8アルキル、C3〜C8シクロアル
キル又はC3〜C8シクロアルキル−C1〜C4アルキルを表すことができる。
Gはまた、下記の式IIgで表されるアリールアルキル、ヘテロアリールアルキ
ル、アリール又はヘテロアリールを表すことができる: 上式において、agが0、1又は2を表す。R1 1が一価の基、例えば置換又は
無置換のアリール、好ましくはフェニル又はナフチルを表す。好適なこのアリー
ルの置換基としては、1個以上のハロゲン(好ましくはフッ素、臭素又は塩素)
、C1〜C4アルキル、メトキシ、エトキシ、トリフルオロメチル、ジオキシメチ
レン、ニトロ又はシアノ、C1〜C7アルコキシカルボニル、C1〜C7アルキルス
ルホニル、アミノ又はC1〜C6ジアルキルアミノを挙げることができ、上記のア
ルキル基は合体して5員又は6員の複素環基を形成することができる。R1 1が無
置換又は置換のヘテロアリールであっても良く、それは5員又は6員の、好まし
くは窒素、酸素又は硫黄含有環系であり、ベンゼン環と縮合されても良い。例え
ば、
イミダゾール、ピロール、チオフェン、フラン、チアゾール、オキサゾール、ピ
ラゾール、1,2,4−若しくは1,2,3−トリアゾール、オキサジアゾール
、チアジアゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラジン、ピリダジン
、ピリミジン、ピリジン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾイミダゾー
ル、ベンゾチアゾール、ベンゾピラン、インドール、イソインドール、インダゾ
ール又はキノリンから、水素原子を除去することにより誘導されるヘテロアリー
ルを挙げることができる。このヘテロアリールの置換基としては、1個以上のC1
〜C6アルキル、ヒドロキシル又はフェニルを挙げることができる。
本発明の下位の化合物としては、Gが下記の式IIIgで表されるアルコキシカル
ボニルアルキル、アリールオキシカルボニルアルキル、アルコキシカルボニル又
はアリールオキシカルボニルを表す場合の式Iの化合物である:
上式において、bgが整数、好ましくは1、2又は3を表し、そしてcgが整数
、好ましくは0又は1を表す。bgとcgが同時に0となることはない。R2 1が一
価の基、例えば水素原子、6個までのハロゲン(好ましくはフッ素、特にCF2
−部分)で置換されていても良い直鎖又は分岐C1〜C8アルキル、C3〜C8シク
ロアルキル、C3〜C8シクロアルキル−C1〜C4アルキル、又は置換若しくは無
置換のアリール(好ましくはフェニル又はナフチル)を表す。このアリールの置
換基の適当なものとしては、1個以上のハロゲン原子(好ましくはフッ素、臭素
又は塩素)、C1〜C4アルコキシ(例、メトキシ、エトキシ)、トリフルオロメ
チル、ジオキシメチレン、ニトロ、シアノ、C1〜C7アルコキシカルボニル、C1
〜C7アルキルスルホニル、アミノ若しくはC1〜C6ジアルキルアミノを挙げる
ことができ、上記アルキル基は窒素原子と合体して5員又は6員の複素環を形成
することもできる。
Gはまた、下記の式IVgで表されるアミノカルボニルアルキル又はアミノカル
ボニルであることができる:
上式において、dgが整数、好ましくは1、2又は3を表し、egが整数、好ま
しくは0又は1を表す。dgとegが同時に0となることはない。
R3 1及びR4 1が、それぞれ独立に一価の基であり、水素原子、6個までのハロ
ゲン(好ましくはフッ素、特にCF2−部分)で置換されていても良い直鎖又は
分岐C1〜C8アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C3〜C8シクロアルキル−C1
〜C4アルキル、置換若しくは無置換のアリール(好ましくはフェニル又はナフ
チル)から選択される基を相互に独立して表す。このアリールの好適な置換基と
しては、1個以上のハロゲン原子(好ましくはフッ素、臭素又は塩素)、又は1
個以上のC1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、ジオキシメチレン、ニトロ
、シアノ、C1〜C7アルコキシカルボニル、C1〜C7アルキルスルホニル、アミ
ノ又はC1〜C6ジアルキルアミノを挙げることができ、後者では、アルキル基は
窒素原子と合体して5員又は6員の複素環を形成することもできる。
N(R3 1)R4 1は、さらに式N(CH2)fg[但し、fgは4、5又は6の整数で
ある]で表される環系を形成することができる。
本発明の他の下位概念の化合物としては、Gが、下記の式Vgで表されるアル
キル若しくはアリールスルフィニルアルキル、アルキル若しくはアリールスルホ
ニルアルキル、アルキル若しくはアリールスルフィニル、又はアルキル若しくは
アリールスルホニルを表す場合の式Iの化合物である:
上式において、ggが整数、例えば1又は2を表す。hgが1又は2を表し、一
方、R5 1が、一価の基、好ましくはメチル、トリフルオロメチル、エチル又はフ
ェニルを表す。
Gはまた、下記の式VIgで表されるアルキル若しくはアリールカルボニルアル
キル又はヒドロカルボニルアルキルを表すこともできる:
上式において、igが整数、例えば1又は2を表し、そしてR6 1が一価の基、
例えば水素原子、6個までのハロゲン(好ましくはフッ素)で置換されていても
良い直鎖又は分岐C1〜C8アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C3〜C8
シクロアルキル−C1〜C4アルキル、又は置換若しくは無置換のアリール若しく
はヘテロアリール(好ましくはフェニル又はナフチル)を表す。このアリール及
びヘテロアリールの好適な置換基としては、1個以上のハロゲン原子(好ましく
はフッ素、塩素又は臭素)、又は1個以上のC1〜C4アルコキシ、トリフルオロ
メチル、ジオキシメチレン、ニトロ又はシアノ、C1〜C7アルコキシカルボニル
、C1〜C7アルキルスルホニル、アミノ又はC1〜C6ジアルキルアミノを挙げる
ことができ、上記アルキル基は所望により窒素原子と合体して5員又は6員の複
素環を形成することもできる。
本発明の別の態様において、Fが、下記の式IIIfで表されるアザシクロアルカ
ン誘導体を表す: 上式において、bfが整数、例えば0、1又は2を表す。この態様では、Gが
窒素原子に関して1位又は2位(好ましくは1位)で炭素炭素結合でFに結合す
るヘテロアリールを表す。例えば、Gが、下記の式VIIgで表されるヘテロアリー
ルであることができる:
上式において、XがNH基、酸素原子又は硫黄原子を表し、そしてR7 1及びR8 1
が、それぞれ独立に一価の基を表し、また相互に独立して水素原子、ハロゲン
(好ましくはフッ素)で置換されていても良い直鎖又は分岐C1〜C8アルキ
ル、C3〜C8シクロアルキル又はC3〜C8シクロアルキル−C1〜C4アルキルを
表すことができる。
R7 1及びR8 1が、それぞれ独立に下記の式IIlで表される一価の基であること
もできる。
上式において、alが整数、好ましくは0、1又は2を表し、そしてR9 1が一
価の基、例えば置換若しくは無置換のアリール(アリールは好ましくはフェニル
またはナフチルである)を表す。このアリールの好適な置換基は、1個以上のハ
ロゲン原子(好ましくはフッ素、臭素又は塩素)、C1〜C4アルキル基、メトキ
シ、エトキシまたはトリフルオロメチル基、ジオキシメチレン、ニトロまたはシ
アノ基、C1〜C7アルコキシカルボニル、C1〜C7アルキルスルホニル、アミノ
若しくはC1〜C6ジアルキルアミノである。後者では、アルキル基は窒素原子と
と共に5員又は6員の複素環を形成することもできる。R9 1が、無置換若しくは
置換ヘテロアリール、例えばベンゼン環と縮合していても良い5員若しくは6員
の、好ましくは窒素、酸素又は硫黄含有環系を表し、例えばイミダゾール、ピロ
ール、チオフェン、フラン、チアゾール、オキサゾール、ピラゾール、1,2,
4−若しくは1,2,3−トリアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、
イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ピリ
ジン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾー
ル、ベンゾピラン、インドール、イソインドール、インダゾール又はキノリンか
ら水素除去により誘導される基を挙げることができる。このヘテロアリールの好
ましい置換基は1個以上のC1〜C6アルキル、ヒドロキシル又はフェニルである
。
Gが、下記の式VIIIgで表されるヘテロアリール基を表すこともできる:
上式において、XがNR12 1基を表し、R12 1が水素原子、6個までのハロゲン
(好ましくはフッ素)で置換されていても良い直鎖又は分岐C1〜C8アルキル、
C3〜C8シクロアルキル又はC3〜C8シクロアルキル−C1〜C4アルキルを表し
;或いはXが酸素原子を表す。R10 1及びR11 1が、それぞれ独立に水素原子、直
鎖又は分岐C1〜C8アルキル、ハロゲン置換の直鎖又は分岐C1〜C8アルキル、
C3〜C8シクロアルキル又はC3〜C8シクロアルキル−C1〜C4アルキルを表し
;或いは
R10 1及びR11 1が、それぞれ独立に、前述の式IIlの一価の基を表す。
Gが、下記の式IXgで表される芳香族ジアゾ基を表すこともできる:
上式において、XがNH、酸素原子又は硫黄原子を表し、R13 1が水素原子、
6個までのハロゲン(好ましくはフッ素)で置換されていても良い直鎖又は分岐
C1〜C8アルキル、C3〜C8シクロアルキル又はC3〜C8シクロアルキル−C1
〜C4アルキルを表す。R13 1が、前述の式IIlの一価の基を表すこともできる。
[化合物の合成]
本発明の化合物は、公知のペプチド合成法により製造することができる。従っ
て、ペプチドを、個々のアミノ酸から連続的に、或いは適当な小さなペプチド断
片を結合することにより、組み立てることができる。連続組立では、ペプチド鎖
は、C−末端で開始して、段階毎に1個のアミノ酸で段階的に延長される。断片
カップリングでは、異なる長さの断片を、相互に結合し、そして断片は順にアミ
ノ酸から連続組立により或いはより小さいペプチドの断片カップリングにより得
ることができる。
連続組立及び断片カップリングの両方とも、種々の酵素的、化学的方法により
達成され得るアミド結合の形成により単位を結合することが必要である。アミド
結合を形成するための化学的方法は、ペプチド化学の基本的な文献に詳細に記載
されている。この文献としては、Mueller,Methoden der organischen Chemie第
XV/2巻,1-364,Thieme Verlag,Stuttgart,(1974);Stewart & Young,Solid
Phase Peptide Synthesis,31-34 & 71-82,Pierce Chemical Company,Rockfol
d,IL(1984);Bodansky,et al.,Peptide Synthesis,85-128,John Wiley &
Sons,New York,(1976)を挙げることができる。好ましい方法としては、アジ
ド法、対称及び混合酸無水物法、系内発生又は実施の活性エステルの使用、アミ
ノ酸のウレタン保護N−カルボキシ酸無水物の使用、及びカップリング試薬使用
によるアミド結合の形成を挙げることができる。カップリング試薬としては、カ
ルボン酸活性化剤、特にジシキロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプ
ロピルカルボジイミド(DIC)、1−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1
,2−ジヒドロキノリン(EEDQ)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ
ピロリル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、n−プロパン−ホスホン酸無水物
(PPA)、N,N−ビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)イミド−塩化
ホスホリル(BOP−Cl)、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサ
フルオロホスフェート(PyBrop)、ジフェニルホスホリルアジド(DPP
A)、キャストロ試薬(Castro's reagent)(BOP、PyBop)、O−ベン
ゾトリアゾリル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム塩(HBTU)
、ジエチルホスホリルシアニド(DEPCN)、2,5−ジフェニル−2,3−
ジヒドロ−3−オキソ−4−ヒドロキシ−チオフェンジオキシド(ステグリッヒ
試薬(Steglich's reagent);HOTDO)、及び1,1’−カルボニル−ジイミ
ダゾール(CDI)を挙げることができる。カップリング試薬
は、単独で、或いは添加剤と共に使用することができる。添加剤としては、N,
N−ジメチル−4−アミノピリジン(DMAP)、N−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール(HOBt)、N−ヒドロキシベンゾトリアジン(HOOBt)、N−ヒ
ドロキシコハク酸イミド(HOSu)、N−ヒドロキシアゾベンゾトリアゾール
(HOAt)、アザベンゾトリアゾリル−テトラメチルウロニウム塩(HATU
、HAPyU)又は2−ヒドロキシピリジンを挙げることができる。
保護基の使用は、一般に酵素的ペプチド合成においては必要ないが、アミド結
合の形成に関与しない反応基の可逆保護は化学合成の反応材料の両方に必要であ
る。3種の慣用保護基技術は、化学的ペプチド合成に対して好ましい:ベンジル
オキシカルボニル(Z)、t−ブトキシカルボニル(Boc)及び9−フルオレ
ニルメトキシカルボニル(Fmoc)技術。それぞれの場合、鎖延長単位のα−
アミノ基上の保護基が確認される。アミノ酸保護基の詳細な概説は、Mueller,M
ethoden der organishen Chemie第XV/1巻,pp.20-906,Thime Verlag,Stuttgas
rt(1974)に記載されている。ペプチド鎖の組立に使用される単位は、溶液、懸濁
液で反応させることができ、或いはMerrifield in J.Am.Chem.Soc.,85:2149
(1963)に記載の方法と類似の方法により反応させることができる。特に好ましい
方法は、ペプチドを、連続的に組み立てるか、或いはZ,Boc又はFmoc保
護基技術を用いる断片カップリングにより組み立てる。その際、上記Merrifield
技術の反応材料の1種を不溶な高分子担体(以下樹脂とも呼ばれる)に結合させ
る。これは、Boc又はFmoc保護基技術を用いて、成長ペプチド鎖をC末端
で不溶性の樹脂粒子に共有結合させながら、高分子担体上で連続的にペプチドを
組み立てる過程を伴うことが典型的である。この手順により、ろ過による試薬及
び副生物の除去が可能となり、中間体を再結晶させる必要もなくなる。
保護されたアミノ酸は、使用する溶剤に不溶性の適当なポリマーに結合させる
ことができ、そしてろ過ができる安定した物理的形態を持つ必要がある。このポ
リマーは、最初の保護されたアミノ酸を共有結合で結合させる官能基を含む必要
がある。広範な種類のポリマーがこの目的に適当であり、例えばセルロース、ポ
リビニルアルコール、ポリメタクリレート、スルホン化ポリスチレン、クロロメ
チル化スチレン/ジビニルベンゼン共重合体(Merrifield樹脂)、4−メチルベ
ンズヒドリルアミン樹脂(MBHA樹脂)、フェニルアセトアミドメチル樹脂(
Pam−樹脂)、p−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、ベンズヒドリル
アミン樹脂(BHA樹脂)、4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルオキシメチル
樹脂、Breipohl等の樹脂(Tetrahedron Letters,28:565(1987);BACHEM社製)、
4−(2,4−ジメトキシフェニルアミノメチル)フェノキシ樹脂(Novabioche
m社製)又はo−クロロトリチル樹脂(Biohellas社製)を挙げることができる。
ペプチド合成に好適な溶剤としては、反応条件下に不活性なものであれば良く
、特に水、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(
DMSO)、アセトニトリル、塩化メチレン(DCM)、1,4−ジオキサン、
テトラヒドロフラン(THF)、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)、及び
これらの溶剤の混合物を挙げることができる。
高分子担体上でのペプチドの合成は、アミノ酸誘導体の出発材料が溶解する適
当な不活性有機溶剤中で行うことができる。しかしながら、さらにDMF、DC
M、NMP、アセトニトリル及びDMSO等のような樹脂膨潤性を有する溶剤が
好ましい。合成後、ペプチドが高分子担体から除去される。この分裂の種々の樹
脂タイプについての条件は、文献に記載されている。最も普通に使用されるこの
分裂反応は、酸又はパラジウムによる触媒反応であり、前者は例えば液体の無水
フッ化水素、無水トリフルオロメタンスルホン酸、希薄又は高濃度トリフルオロ
酢酸、及び酢酸/塩化メチレン/トリフルオロメタノール混合物の中で行われる
。後者は、モルホリン等の弱塩基の存在下に、THF又はTHF−DCM混合物
中で行うことができる。一定の保護基も、これらの条件下で切断除去される。
ペプチドの部分的な保護除去も、一定の誘導体反応の前に必要であろう。例え
ば、N−末端でジアルキル化されたペプチドは、適当なN,N−ジアルキルアミ
ノ酸をペプチドに溶液中でカップリングさせること、或いはDMF/1%酢酸中
の樹脂で縛られたペプチドを、NaCNBH3及び適当なアルデヒドを用いて還
元アルキル化すること、或いはアルデヒド又はケトンの存在下にPd/Clで水
素化すること、により製造することができる。
下記の3つの図式は、本発明の化合物の合成について、さらに詳細に記述する
ものである。
図式I
ここで、テトラペプチドA−B−D−E−OHは、上記で議論されたペプチド
のカップリング法を用いて、アザシクロアルキル誘導体F−Gとカップリングさ
れる。
図式II
ここで、N−末端保護テトラペプチドA’−B−D−E−OHは、上記で議論
されたペプチドのカップリング法を用いて、アザシクロアルキル誘導体F−Gと
カップリングされ、中間化合物A’−B−D−E−F−Gを得る。N−保護基は
、その後上述の従来法により除去される。基Ra及びR7 aは、その後上述のよう
に還元アルキル化によりアミノ末端に結合することができる。
図式III
図式IIIでは、テトラペプチドは、構成ブロックFの保護形態であるF’とカ
ップリングする。Fはまた、基Gの前駆体と結合することもできる。中間体A−
B−D−E−F’は、その後酸化反応又は還元反応等の反応により最終生成物に
変換される。一態様において、F’はピロリジニルアルコールであり、中間体A
−B−D−E−F’は、Swern酸化又はDess-Martin試薬による酸化等の穏和な酸
化法により酸化され、最終生成物とされる。
請求の範囲の化合物の合成に使用される構成ブロックは、下記の一般的な方法
により製造することができる:
(a)ピロリジニルケトン及びピペリジニルケトン
ピロリジニルケトンへの幾つかの経路が文献に知られている。ラセミ体のピロ
リジニルケトンは、対応するピロリルケトンを酸化白金触媒で水素化することに
より得ることができる(Kaiser,et al.,J.Org.Chem.,49:4203(1984))。キ
ラルピロリジニルケトンのためには、L−又はD−プロリンを、出発材料として
使用することができるであろう。環状窒素の保護基として、tert−ブチルオ
キシカルボニル基(boc-基)、ベンジルオキシカルボニル(Z-基)又はフルオレ
ニルオキシカルボニル基(fmoc基)を使用することができるであろう。
N−Boc−保護ピロリジニルケトンは、ピロリン誘導体、特にN−Boc−
プロリン−2−チオピリジルエステル又はN−Boc−プロリンN−メトキシ−
N−メチルアミドを、グリニャール試薬又はリチウム試薬等の有機金属試薬で処
理して得ることができる。幾つかの例は、文献に報告されており、例えばN−B
oc−プロリンN−メトキシ−N−メチルアミドからのN−Boc−ピロリジニ
ルメチルケトン(Trost,J.Am.Chem.Soc.,111:4988(1989));N−Boc−
プロリンN−メトキシ−N−メチルアミドからのN−Boc−ピロリジニルペン
タフルオロエチルケトン(Angelastro,M.R.,et al.,Tetrahedron Letters,3
3:3265.(1992));そしてN−Boc−プロリン2−チオピリジルエステルから
のN−Boc−ピロリジニルメチルケトン(Conrow,R.,et al.,J.Org.Chem
.,51:938(1986))を挙げることができる。
Boc−保護基の除去は、HCI(参照、例えば、Angelastro,M.R.,et al.
,Tetrahedron Letters,33:3265(1992))、又はトリフルオロ酢酸(参照、例え
ばGoldstein,S.W.,et al.,J.Org.Chem.,57:1179(1992))等の強酸による
処理で達成することができる。アルキル及びアリールピロリジニルケトンが、こ
の方法により製造されている。
これらの構成ブロックへの第二のアプローチとしては、Boc−保護プロリン
アルデヒドを求核試薬で処理して対応するアルコールを製造する方法を挙げるこ
とができる。このアルコールは、通常のやり方で、保護除去及びカップリングが
行われる。アルコールの酸化は、Swern酸化又はDess-Martin試薬による酸化等の
穏和な酸化法により達成される。ピロリジノチアゾリルケトンを含むペプチドの
合成の例は、Tsutsumi,S.,et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,4:831(1994
)に記載されている。或いは、アルコールを、まず酸化してケトンにし、次いで
N−保護基を除去することができる。アルデヒドの市販のトリフルオロメチルト
リメチルシランによるトリフルオロメチル化は、テトラブチルアンモニウムフッ
化物により触媒作用で行われる(Olah,G.,J.Am.Chem.Soc.,111:393(1989)
)。保護除去及びテトラペプチドへのカップリングの後、アルコールをSwern酸
化又はDess-Martin試薬による酸化等の穏和な酸化法によりケトンに酸化するこ
とができる。
プロリンの種々のα−、β−及びγ−ジカルボニル誘導体は記載されている。
従って、(S)−1−ピロリジニル)−1,2−プロパンジオン塩酸塩は、Bo
c−保護誘導体をHClで処理することにより得られる(Conrow,R.,et al.,
J.Org.Chem.,51:938(1986))。N−Boc−ピロリジニル−β−ケト酢酸
エチルは、リシオエチルアセテートのN−Boc保護プロリナル(prolinal)へ
の付加、及び続く例えば三酸化クロムの酸化により得られる(Hanson,G.J.,et
al.,Tetrahedron Letters,27:3577(1986))。アミノ酸誘導体からβ−ケトジ
フルオロエステルの製造は、記載されており(J.Med.Chem.,35:4795(1992))
、そして、第一段階でブロモジフルオロアセテートのReformatsky試薬を用い、
酸化段階でDess-Martin-試薬を用いる、ケトエステルについて上述した手順と類
似のものである。
ピロリジニルケトンについて上述したものと類似の方法は、ピペリジニルケト
ン及び7員のアザ複素環の合成に使用することができる。これらの合成の出発材
料としては、ピペコリン酸、市販の3種の異性体全て、及び2−ピペコリン酸に
はそのエナンチオマーを挙げることができる。例えば、メチルケトンはN−Bo
c−((2−ピリジルチオ)−カルボニル)ピペリジンをメチルグリニャール試
薬で処理して製造される(J.Am.Chem.Soc.,115:11393(1993))。
(b)ピロリジニルオキサゾール及びピペリジニルオキサゾール
アミノ酸から誘導されるオキサゾールの数種の合成アプローチは、文献に記載
されている。一般に、N−保護アミノ酸は、アミノケトン又は他の2−アミノカ
ルボニル誘導体と、上述のペプチド合成の従来法を用いてカップリングされる。
例えば、Z−又はBoc−保護基は、アミノ窒素を保護するために使用すること
ができる。次いで、水を、アミノ酸のβ−ケトアミドから除去し、対応するオキ
サゾールを得る。幾つかの試薬がこれらの化合物の脱水に使用され、例えば五酸
化燐、三塩化燐、五塩化燐、及び塩化チオニルを挙げることができる。別の好ま
しい方法は、トリアルキル−又はトリアリール−ホスフィン等のホスフィン、好
ましくはトリフェニルホスフィンを、ハロゲン化炭化水素、好ましくはクロロ−
又はブロモ−炭化水素(例、四塩化炭素、四臭化炭素、クロロホルム及びペルク
ロロエタンと組合わせて、トリエチルアミン、ジアザビシクロウンデカン、メチ
ルモルホリン又はピリジン等の塩基の存在下に、アセトニトリル等の極性溶剤中
で使用する方法である。例えば、トリプトファン誘導オキサゾールは次の方法(
Gordon,T.D.,et al.,J.Org.Chem.,34:1901(1993))に従い製造される。ま
た、トリフェニルホスフィン、ヨウ素及びトリエチルアミンの組合せが、オキサ
ゾールの良好な収率を与えることが報告されている(Wipf,P.,et al.,J.Or
g.Chem.,58:3604(1993))。
オキサゾールを形成する他の方法としては、アミノ酸を2−アミノアルコール
と、ペプチド合成のアミド結合の通常の形成方法を用いてカップリングする方法
を挙げることができる。オキサゾリンへの環化は、Burgess試薬、(メチルN−
(トリエチルアミノスルホニル)カルバメート)を用いて(Wipf,P.,et al.,
Tetrahedron Letters,33:907(1992);Wipf,P.,et al.,J.Am.Chem.Soc.
,114:01975(1992);Wipf,P.,et al.,J.Org.Chem.,58:1575(1992))又はM
itsunobu反応(トリフェニルホスフィン/ジイソプロピルアゾジシクロカルボキ
シレート)(Wipf,P.,et al.,Tetrahedron Letters,33:6267(1992))により
行うことができる。オキサゾールへの酸化は、過酸化ニッケルを用いて行うこと
ができる(Evans,D.L.,et al.,J.Org.Chem.,44:497(1979))。
これらの方法は、N−保護D−又はL−プロリンのいずれかから出発する対応
するピロリジニルオキサゾールの合成、及びN−保護D−又はL−ピペコリン酸
から出発して対応するピペリジニルオキサゾールの合成にも使用することができ
る。
オキサゾールの生成に続いて、N−保護基は、例えばBoc−保護化合物を、
塩酸又はトリフルオロ酢酸等の酸で処理することにより除去される得る。得られ
た塩又は遊離塩基は、その後次のカップリング工程で使用することができる。
(c)ピロリジニルチアゾール及びピペリジニルチアゾール
チアゾール合成のための一般的な方法は、Hantzsch合成であり、それはアミノ
酸のN−保護チオアミドの、置換ハロ−ピルベート(halo-pyruvate)との縮合を
包含する。しかしながら、この反応は、通常アミノ酸部分でのラセミ化により達
成される。Milder法はラセミ化を回避するために開発された。まず、N−保護ア
ミノ酸は、アミノケトン又は他の2−アミノカルボニル誘導体と、上述のペプチ
ド合成のための従来の方法を利用してカップリングすることができる。チオン酸
化(thionation)、環化及び脱水は、Lawesson試薬(Gordon,T.D.,et al.,Te
trahedron Letters,34:1901(1993))を用いて、高温、例えば還流テトラヒドロ
フラン中で、単一ポット反応により達成され得る。
チアゾリンは下記のように合成することができる:まず対応するN−保護アミ
ノ酸を、ペプチド合成の通常のアミド結合法を用いて2−シロキシエチルアミン
とカップリングさせる。そのアミドのLawesson試薬によるチオン酸塩化後、シリ
ル基を除去し、チアゾリンへの環化がBurgess試薬(メチルN−(トリエチルア
ンモニオ−スルホニル)カルバメート)又はMitsunobu反応(トリフェニルホス
フィン/ジイソプロピルアゾジシクロカルボキシレート)(Wipf,P.,et al.,
Tetrahedron Letters,33:6267(1992))により行われる。
(d)ピロリジニルイミダゾール及びピペリジニルイミダゾール
イミダゾールは、対応するアミノ酸のβ−ケトアミドをアンモニウム塩又はア
ミンで処理し、次いで脱水剤又は水との共沸除去を用いる脱水により製造するこ
とができる(Gordon,T.D.,et al.,Tetrahedron Letters,34:1901(1993))。
(e)ピロリジニルイソオキサゾール及びピペリジニルイソオキサゾール
イソオキサゾールは、ヒドロキシアミンの1,3−ジケトンとの反応、3−ケ
トオキシムの環化、或いはN−オキシドのアルキンへの1,3−双極環付加によ
り製造することができる。5−(N−メチルピロリジニル)−3−メチルイソオ
キサゾールの合成は、メタンスルホニルクロリド及び塩基としてトリエチルアミ
ンを用いて、(N−メチルピロリジン−2−イル)−4−オキソブチル−2−オ
キシムの環化によると記載されている(Elliot,R.,et al.Synthesis,7:772
(1950))。
ニトリルオキシドの製造方法及び対応するイソオキサゾールはK.B.G.Torssel
l,Nitrile Oxides,Nitrones and Nitronates in Organic Synthesis,VCH Ver
lagsgesellscafft,Wernheimに記載されている。
(f)ピロリジニルピラゾール及びピペリジニルピラゾール
ピラゾールは、ヒドラジン又はモノ置換ヒドラジンと対応する1,3−ジケト
ン又は3−ケトアセトニトリルとを、極性溶剤(例、アルコール又はN,N−ジ
メチルホルムアミド)中で反応させることにより製造することができる。ピロリ
ジニルケトンの合成は記載されている。例えば、2−メチル−5−(1−メチル
ピロリジン−2−イル)−2H−ピラゾール−3−イルアミンは、対応するニト
リル及びヒドラジンから製造される(Adachi,et al.,Chem.Pharm.Bull.,35
:3235(1987))。
(g)ピロリジニルオキサジアゾール及びピペリジニルオキサジアゾール
ピロリジニルオキサジアゾール及びピペリジニルオキサジアゾールは、対応す
るジアシルヒドラジンをホスホン酸無水物及び痕跡量の酸(例、メタンスルホン
酸)で、或いはヘキサメチルジシラザン及びテトラブチルアンモニウムフッ化物
で脱水することに。より製造することができる(Rigo,et al.,J,.Heterocycl
.Chem.,23:253(1986);Rigo,et al.,Synthe.Comm.16:1665(1986))。
ジアシルヒドラジンは、対応するN−保護カルボン酸と別のカルボン酸のヒドラ
ジドとのカップリングにより製造される(Sheradsky,et al.,Tet.Lett.,32:
133(1991))。別の穏和な方法は、ヒドラジンを塩化チオニル及びピリジンと反
応させて1,2,3,4−オキサチアジアゾール−S−オキシド中間体を形成す
る方法である。1,3,4−オキサジアゾールは、その後二酸化硫黄の熱除去に
より形成される(Borg,et al.,J.Org.Chem.,60:3112(1995))。
(h)ピロリジニルチオジアゾール及びピペリジニルチオジアゾール
ピロリジニル−1.3.4−チアジアゾール及びピペリジニル−1.3.4−
チアジアゾールは、対応するヒドラゾンのLawesson試薬又はP4S10との反応に
より得ることができる(Sawtney,et al.,J.Indian Chem.Soc.B,30:407(1
991);Lancelot,et al.,J.Heterocycl.Chem.,17:625(1980))。アシルヒ
ドラジンは、上述のように製造することができる。
[請求の範囲の化合物の使用方法]
別の態様において、本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおける、充実性腫瘍(
例、肺、胸(乳房)、結腸、前立腺、膀胱、直腸及び子宮内膜の腫瘍)又は血液
悪性腫瘍(例、白血病及びリンパ種)の、生成を部分的又は全体的に阻害し、或
いは、哺乳動物に治療有効量の式Iの化合物又はその組合せを投与することに
より治療(例、更なる増殖に拮抗又は阻害)する方法を含む。薬剤は、単独でも
、薬剤と受容可能な担体又は稀釈剤を含む医薬組成物の形で投与することができ
る。投与は医薬、好ましくは腫瘍学用薬剤に通常使用されるどのような手段で行
っても良く、例えば、経口、又は非経口(例、皮下に、静脈で、筋肉で、腹腔内
で、或いは鼻腔から、又は直腸から)等の手段を挙げることができる。
哺乳動物(例、ヒト)に与える投薬は治療有効量のここに記載の化合物を含ん
でいる。ここで使用されるように、「治療有効量」は、腫瘍の形成又は血液悪性
腫瘍の発生を阻害(部分的又は全体的に)、或いは充実性腫瘍又は他の悪性腫瘍
を拮抗、或いはその更なる成長を低下させるために十分な量である。治療の特定
の条件又は方法については、投与量は公知の方法を用いて経験的に決定され、使
用される特定の化合物の生物学的活性;投与手段;レシピエントの年齢、健康状
態及び体重;症状の性質又は程度;治療の頻度;他の治療の投与量;及び所望の
効果等の因子により変化する。典型的な1日の用量は、経口では体重1kg当た
り約1〜約50mgであり、非経口では体重1kg当たり約0.5〜約20mg
である。
本発明の化合物は、通常の固体又は液体の医薬投与の形、例えば非被覆又は(
フィルム)被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、坐剤又は溶液の形で与えられる得
る。これらは、公知の方法で製造される。活性物質は、この目的のために、通常
の医薬上の助剤、例えば錠剤バインダ、フィラー、防腐剤、錠剤分解剤、流れ調
整剤、可塑剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、溶剤、持効性組成物、酸化防止剤及び
/又は発射剤用ガス(参照、H.Sucker et al.,Pharmazeutische Technologie
,Thime-Verlag,Stuttgart,1978)で加工することができる。
下記の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、本発明を限定するも
のではない。
[実施例]
タンパク質のアミノ酸は、実施例では公知の3文字コードを用いて省略形にし
た。他の略語は次の通りである:TFA=トリフルオロ酢酸、Ac=酢酸、DC
M=ジメチルスルホキシド、DMSO=ジメチルスルホキシド、Bu=ブチ
ル、Et=エチル、、Me=メチル、Bzl=ベンジル。列挙した化合物におい
て、全てのタンパク質のアミノ酸は、特に断らない限りL−アミノ酸である。
一般材料及び方法
本発明の式A−B−D−E−OH又はA’−B−D−E−OH(但し、A’は
AのN−保護体を意味する)で表されるテトラペプチド、又は対応するエステル
は、前記で論議した標準のZ−又はBoc−方法(methodology)を用いて古典的
な溶液合成により合成される。これらのテトラペプチドへの一般的な経路は、独
国特許出願No.DE4415998に記載されており、テトラペピチドとして
は特にZ−Val−Val−MeVal−Pro−OMe;Me2Val−Va
l−MeVal−Pro−OMe×HCl;Z−Ile−Ile−MeVal−
Pro−OMe及びMe2Ile−Ile−MeVal−Pro−OMeである
。
これらのテトラペプチドの酸は、DE4415998に記載の水酸化リチウム
又はナトリウムを用いるエステルの塩基加水分解により得ることができる。
さらに、本発明のテトラペプチドは、完全自動モデル431A合成装置(APPL
IEDBIOSYSTEMS社製)を用いて固体相合成の標準法により合成される。この装置
では、下記のように、Boc及びFmoc保護基技術のための異なる合成サイク
ルが使用される。
Boc及びFmoc保護基技術のための合成サイクル
1.30%トリフルオロ酢酸DCM溶液 1×3分
2.50%トリフルオロ酢酸DCM溶液 1×1分
3.DCM洗浄 5×1分
4.5%ジイソプロピルエチルアミンDCM溶液 1×1分
5.5%ジイソプロピルエチルアミンNMP溶液 1×1分
6.NMP洗浄 5×1分
7.前活性化保護アミノ酸の添加
(1当量のDCC及び1当量のHOBtの
NMP/DCM溶液による活性化);
ペプチドカップリング(第1回部分) 1×30分
8.DMSOを20容量%含むまで、
反応混合物にDMSOを添加
9.ペプチドカップリング(第2回部分) 1×16分
10.3.8当量のジイソプロピルエチルアミン
の反応混合物への添加
11.ペプチドカップリング(第2回部分) 1×7分
12.DCM洗浄 3×1分
13.転化が完全でない場合、カップリング
の繰り返し(工程5に戻る)
14.10%無水酢酸、
5%ジイソプロピルエチルアミンDCM溶液 1×2分
15.10%無水酢酸DCM溶液 1×4分
16.DCM洗浄 4×1分
17.工程1に戻る。
BOP−Cl及びPyBropを、アミノ酸をN−メチルアミノ酸にカップリ
ングするための試薬として使用される。反応時間は対応して増加させる。溶液合
成においては、それぞれ、Boc−保護アミノ酸NCAs(N−tert−ブチ
ルオキシカルボニルアミノ酸−N−カルボキシ酸無水物)又はZ−保護アミノ酸
NCAs(N−ベンジルオキシカルボニルアミノ酸−N−カルボキシ酸無水物)
のいずれかを使用することが、この種のカップリングに最も好ましい。
Fmoc保護基技術のための合成サイクル
1.DMF洗浄 1×1分
2.20%ピペリジンDMF溶液 1×4分
3.20%ピペリジンDMF溶液 1×16分
4.DMF洗浄 5×1分
5.前活性化保護アミノ酸の添加
(1当量のTBTU及び1.5当量のDIPEAの
DMF溶液による活性化);
ペプチドカップリング 1×61分
6.DMF洗浄 3×1分
7.転化が完全でない場合、カップリング
の繰り返し(工程5に戻る)
8.10%無水酢酸DMF溶液 1×8分
9.DMF洗浄 3×1分
10.工程2に戻る。
BOP−Cl及びPyBropを、アミノ酸をN−メチルアミノ酸にカップリ
ングするための試薬として使用される。反応時間は対応して増加させる。
N末端の還元アルキル化
前述のように製造されたペプチド樹脂のN末端における保護を除去し、その後
3倍モル量の過剰のアルデヒド又はケトンのDMF/1%酢酸の溶液と、3当量
のNaCNBH3を添加しながら反応させる。反応終了後(ネガティブ・カイザ
ーテスト)、樹脂を、水、イソプロパノール、DMF及び塩化メチレンを用いて
数回洗浄した。
ペプチド樹脂の後処理
Boc保護基法により得られたペプチド樹脂を減圧下に乾燥し、テフロンHF
装置(PENINSULA社製)の反応容器に移した。その後、捕捉剤、通常アニソール
(1ml/樹脂1g)を添加し、さらにトリプトファン含有ペプチドの場合、チ
オール(0.5ml/樹脂1g)、好ましくはエタンジチオールを添加し、イン
ドールホルミル(illdolic formyl)基を除去する。これに続いて、液体N2浴中で
、フッ化水素(10ml/樹脂1g)中にて凝縮させる。混合物を0℃に暖め、
この温度で45分攪拌した。その後、フッ化水素を、減圧下に除去し、残渣を酢
酸エチルで洗浄し、残存捕捉剤を除去した。ペプチドを30%酢酸で抽出
し、ろ過し、ろ液を凍結乾燥した。
Fmoc保護基法により得られたペプチド樹脂減圧下に乾燥し、その後下記の
分解処理の内の1処理(アミノ酸組成物により異なる)を行った(Wada,Tregea
r,Howard Florey Fmoc Workshop Manual,Melbourne 1985)。ペプチド樹脂の
適当なTFA混合物中懸濁液を、上述の時間、室温で攪拌し、その後樹脂をろ過
し、TFA及びDCMで洗浄した。ろ液及び洗浄液を濃縮し、ジエチルエーテル
の添加によりペプチドを析出させた。氷浴で冷却後、沈殿をろ過し、30%酢酸
に溶解させ、凍結乾燥した。
0−クロロトリチル樹脂(Biohellas社製)を用いた場合、酢酸/トリフルオ
ロメタノール/塩化メチレン混合物(1:1:3)中のペプチド樹脂懸濁液を室
温で1時間攪拌した。その後、懸濁液を吸引ろ過し、ペプチド樹脂を分解溶液で
十分に洗浄した。ろ液を集め、真空濃縮し、水で処理した。沈殿固体をろ過又は
遠心分離で除去し、ジエチルエーテルで洗浄し減圧下に乾燥した。
ペプチドの精製及び特性決定
精製は、ゲル・クロマトグラフィ(SEPHADEXG−10、G−15/10%HO
Ac、SEPHADEXLH20/MeOH)で行い、次いで必要により中圧クロマトグ
ラフィ(固定層:HD−SIL C−18、20〜45mm、100Å;移動層
:A=0.1%TEA/MeOH、B=0.1%TFA/H2Oの勾配)で行っ
た。得られた生成物の純度は、分析HPLC(固定層:100 2.1mm V
YDAC C−18 51、300Å;移動層:A=CH3CN/H2Oの勾配、
0.1%TFA、40%Cで緩衝されている)で決定される。
ポリペプチドは、高速原子衝撃質量分光学により特性が決定される。
[実施例1:ピロリジニルケトンの合成]
(a)N−メチル−N−メトキシ−(Boc−プロリン)−アミドの合成 30gのBoc−プロリン及び13.6gのN,O−ジメチルヒドロキシルア
ミン塩酸塩を250mlの塩化メチレンに溶解した液に、26.73gの1−エ
チル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、18.83
gのN−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び49.34gのN−メチルモルホリ
ンを0℃で加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を、次いで飽和炭
酸水素ナトリウム、クエン酸の5%水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を硫
酸ナトリウム上で乾燥した。ろ過後、溶剤を真空下に除去し、22.2gのN−
メチル−N−メトキシ−(Boc−プロリン)−アミドを得た。
1H−NMR(CDCl3,270MHz)、d=1.4、1.45(s,9H
)、1.8〜2.3(m,4H)、3.2(s,3H)、3.3〜3.6(m,
2H)、3.7(s,3H)、3.8(s,3H)、4.6、4.7(d,1H
)ppm。
(b)(S)−Boc−ピロリジン−2−イル−メチルケトンの製造
2.0gのN−メチル−N−メトキシ−(Boc−プロリン)−アミドを70
mlのテトラヒドロフランに溶解した液に、3Mメチル塩化マグネシウムテトラ
ヒドロフラン溶液の内3ml分を−40℃にて滴下した。混合物を室温まで暖め
、一晩攪拌した。溶液をジエチルエーテルで稀釈し、ブラインで洗浄し、そ
して硫酸ナトリウム上で乾燥した。ろ過後、溶剤を真空下に除去した。残渣を、
シリカゲルクロマトグラフィ(ヘプタン/酢酸エチル=2:1)で精製し、1.
66gの(S)−Boc−ピロリジン−2−イル−メチルケトンを得た。1H−NMR(CDCl3,270MHz)、d=1.4、1.45(s,9H
)、1.75〜1.9(m,4H)、2.1、2.15(s,3H)、3.4〜
3.6(m,2H)、4.2、4.3(d,1H)ppm。
(c)(S)−ピロリジン−2−イル−メチルケトントリフルオロ酢酸塩の製造
1.66gの(S)−Boc−ピロリジン−2−イルーメチルケトンを25m
lの塩化メチレンに溶解した液に、25ml分のトリフルオロ酢酸を加えた。得
られた混合物を室温で、3時間攪拌した。溶剤を除去し、0.80gの(S)−
ピロリジン−2−イルーメチルケトントリフルオロ酢酸塩を得た。
1H−NMR(CDCl3,270MHz)、d=1.75〜2.0(m,4H
)、2.2(s,3H)、3.1(m,2H)、4.5(d,1H)、8.7(
m,1H)、10.4(m,1H)ppm。
[実施例2:ピロリジニル複素環の製造]
(a)N−(N’−BOC−ピロリジニル)メチルフェニルケトンの合成
BOC−pro−OH(6.2g、29ミリモル)及び2−アミノアセトフェ
ノン・HCl(5.0g、29ミリモル)を290mlの乾燥CH2Cl2に溶解
し、得られた溶液を0℃に冷却した。HOBT・H2O(1.4g、9.6ミリ
モル)、EDC・HClを加え、次いでNMM(3.8ml、35ミリモル)を
加えた。反応混合物は、室温で一晩攪拌し、その後飽和炭酸水素ナトリウム(3
×)、水(3×)、5%クエン酸及び水で洗浄した。そして硫酸ナトリウム上で
乾燥した後、溶剤を減圧下に除去し、9.5gの黄色油を得た。その油をジイソ
プロピルエーテルに溶解したとき、白色結晶の生成物が沈殿した。これを乾燥し
、直接次工程に用いた。収率:8.6g(89%)。
1H−NMR(DMSO−d6):8.1〜8.25,m,1H;8.0,d,
2H;7.65,t,1H;7.5,t,2H;4.5〜4.7,m,2H;4
.1〜4.25,m,1H;3.2〜3.5,m,2H;2.0〜2.2,m,
1H;1.7〜1.9,m,3H;1.3及び1.4,s,共に9H。
(b)2−(N−BOC−ピロリジニル)−4−フェニルオキサゾールの製造
N−(N’−BOC−ピロリジニル)メチルフェニルケトン(2.5g、7.
5ミリモル)を、窒素(2原子分子)雰囲気下、40mlの乾燥アセトニトリル
に溶解した。混合物を−20℃まで冷却し、その後トリフェニルホスフィン(4
.0g、15ミリモル)ペルクロロエタン(3.6g、15ミリモル)及びトリ
エチルアミン(4.3ml、30ミリモル)を加えた。室温で一晩攪拌後、反応
混合物を酢酸エチルで稀釈し、炭酸ナトリウム飽和水溶液、5%クエン酸及びブ
ラインで洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥した後、溶剤を減圧下に除去し、得
られた粗固体をシリカゲル上でクロマトグラフィにより精製し、1.5g(64
%)の淡褐色固体を得た。1H−NMR(DMSO−d6):7.6〜7.8,m,3H;7.5,t,2
H;7.4,t,1H;4.8〜5.0,m,1H;3.45〜3.6,m,1
H;3.3〜3.45,m,1H;2.2〜2.4,m,1H;1.8〜2.1
,m,3H;1.2及び1.4,s,共に9H。
(c)2−(N−BOC−ピロリジニル)−4−フェニルオキサゾールの保護の
除去 BOC保護化合物3(100mg、0.3ミリモル)を、10mlの乾燥ジエ
チルエーテルに溶解し、12mlのHCl飽和エーテルで処理した。得られた懸
濁液を室温で5日間攪拌した。その後、pHを2NNaOH溶液で11に調節し
た。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下に蒸発させて、69.
2mgの無色油を得た。
1H−NMR(DMSO−d6):7.6〜7.8,m,3H;7.5,t,2
H;7.4,t,1H;74.8〜5.0,m,1H;3.45〜3.6,m,
1H;3.3〜3.45,m,1H;2.2〜2.4,m,1H;1.8〜2.
1,m,3H;1.2及び1.4,s,共に9H。
[実施例3:(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−メチルケトン(化合物I−1)の合成]
(a)(S)−Z−Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジン−2−イ
ル)−メチルケトンの合成 3.0gのZ−Val−Val−MeVal−Pro−OH及び0.89gの
(S)−ピロリジン−2−イル−メチルケトン・トリフルオロ酢酸塩の塩化メチ
レン溶液に、1.03gの−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カル
ボジイミド・塩酸塩、0.72gのN−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び2.
16gのN−メチルモルホリンを、0℃にて加えた。混合物を室温で一晩攪拌し
た。その後反応混合物を塩化メチレンで稀釈し、次いで炭酸水素ナトリウム飽和
水溶液、5%クエン酸水溶液及びブラインで洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥
し、次いでろ過し、溶剤を真空下に除去した。残渣を、シリカゲルクロマトグラ
フィ(塩化メチレン/イソプロパノール/トリエチルアミン=94:5:1)に
より精製し、1.03gの((S)−Z−Val−Val−MeVal−Pro
−ピロリジン−2−イル)−メチルケトンを得た。
FAB−MS:656.9(M+H+)
(b)(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジン−2
−イル)−メチルケトンの合成
1.03gの((S)−Z−Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−メチルケトンを150mlのメタノールに溶解した液に、38
mgの活性炭上のパラジウム(10重量%のPd)を加えた。得られた懸濁液を
室温、大気圧下で3時間水素化した。ホルムアルデヒド水溶液(37重量%)1
.0ml分及び0.226gの活性炭上パラジウムを加えた。混合物を、室温、
大気圧下で一晩水素化した。ろ過後、溶剤を真空下に除去した。残渣を、シリカ
ゲルクロマトグラフィ(酢酸エチル/イソプロパノール/トリエチルアミン=9
4:5:1)により精製し、0.64gの(S)−(Me2Val−Val−M
eVal−Pro−ピロリジン−2−イル)−メチルケトンを得た。FAB−M
S:(550.8(M+H+)
1H−NMR(DMSO−d6、270MHz):δ=0.7(m,6H)、0
.8〜1.0(m,12H)、1.75〜2.05(m,7H)、2.0(s,
3H)、2.2(s,6H)、2.6(d,1H)、3.05(s,3H)、3
.55(m,1H)、3.7(m,1H)、4.35(m,1H)、4.5〜4
.6(m,2H)、4.95(d,1H)、8.05(d,1H)PPm。
[実施例4:2−[(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピ
ロリジン−2−イル)]−5−フェニルオキサゾール(化合物III−12)の合
成]
Me2Val−Val−MeVal−Pro−OH(1.72g、3.8ミリ
モル)及び2−(ピロリジン−2−イル)−4−フェニルーオキサゾール(0.
8g、3.8ミリモル)を40mlの塩化メチレンに溶解し、得られた溶液を0
℃に冷却した。その後、HOBT・H2O(0.5g、3.8ミリモル)及びE
DC・HCl(0.7g、3.8ミリモル)を、次いでNMM(0.5ml、4
.5ミリモル)を加えた。室温で、一晩攪拌後、反応混合物を2NのNaOH及
び水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶剤を減圧下除去し、得られた粗材
料をシリカゲル上でクロマトグラフィにより精製した。
収率:1.85g。
FAB−MS:651(M+H+)。
下記の化合物は、上述の方法により製造された:
I−5 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジン
−2−イル)ブチルケトン、FAB−MS:592.5(M+H+)
I−12 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)メトキシメチルケトン、FAB−MS:581(M+H+)
I−14 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)ベンジルケトン、FAB−MS:626(M+H+)
I−15 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)フェニルケトン、FAB−MS:612(M+H+)
I−19 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−(4−トリフルオロメチルフェニル)ケトン、FAB−MS:
680(M+H+)
I−20 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−(2−メトキシフェニル)ケトン、FAB−MS:642(M
+H+)
I−22 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−(4−メトキシフェニル)ケトン、FAB−MS:642.5
(M+H+)
I−32 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−(4−フルオロフェニル)ケトン、FAB−MS:630.5
(M+H+)
I−37 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−(2,4−ビス(メトキシ)フェニル)ケトン、FAB−MS
:672(M+H+)
I−39 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−(3,4,5−トリス(メトキシ)フェニル)ケトン、FAB
−MS:702(M+H+)
I−49 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−(2−チアゾリル)ケトン、FAB−MS:619(M+H+
)
I−54 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−トリフルオロメチルケトン、FAB−MS:621.5(M+
H3O+)
I−63 (S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピロリジ
ン−2−イル)−3−オキソプロピオン酸エチル、FAB−MS:622(M+
H+)
I−79 N−ベンジル−(S)−(4)−(Me2Val−Val−MeV
al−Pro−ピロリジン−2−イル)−4−オキソブタノイルアミド、FAB
−MS:711(M+H+)
III−26 2−−[(S)−(Me2Va1−Val−MeVal−Pro−
ピロリジン−2−イル)]−4−メチルチアゾール、FAB−MS:605(M
+H+)
III−28 2−[(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピ
ロリジン−2−イル)]−3,4−ジメチルチアゾール、FAB−MS:619
(M+H+)
III−32 2−[(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピ
ロリジン−2−イル)]−5−tert−ブチルチアゾール、FAB−MS:6
47(M+H+)
III−35 2−[(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピ
ロリジン−2−イル)]−4−フェニルチアゾール、FAB−MS:667(M
+H+)
III−36 2−[(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピ
ロリジン−2−イル)]−5−フェニルチアゾール、FAB−MS:667(M
+H+)
III−46 2−[(S)−(Me2Val−Val−MeVal−Pro−ピ
ロリジン−2−イル)]−4−カルボニルエトキシチアゾール、FAB−MS:6
63(M+H+)
下記の表1〜8に列挙した化合物は、上述の方法及び上記に概要を示した種々
の構成ブロックの合成法を用いて、下記のように製造することができる:
化合物I−1〜I−103及びII−1〜II−103:ピロリジニルケトン及び
ピペリジニルケトン;
化合物III−1〜III−24及びIV−1〜IV−24:ピロリジニルオキサゾール
及びピペリジニルオキサゾール;
化合物III−25〜III−48及びIV−25〜IV−48:ピロリジニルチアゾー
ル及びピペリジニルチアゾール;
化合物III−49〜III−72及びIV−49〜IV−72:ピロリジニルイミダゾ
ール及びピペリジニルイミダゾール;
化合物V−1〜V−24及びVI−1〜VI−24:ピロリジニルイソオキサゾー
ル及びピペリジニルイソオキサゾール;
化合物V−25〜V−48及びVI−25〜VI−48:ピロリジニルピラゾール
及びピペリジニルピラゾール;
化合物VII−1〜VII−9及びVIII−1〜VIII−9:ピロリジニル−1,3,4
−オキサジアゾール及びピペリジニル−1,3,4−オキサジアゾール;
化合物VII−10〜VII−17及びVIII−10〜VIII−17:ピロリジニル−1
,3,4−チアジアゾール及びピペリジニル−1,3,4−チアジアゾール。
表1:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro及びFが
式IIf、afが1及び−(C=O)−G基が式IIfの窒素原子に対して1位にある
。
表2:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro、Fが式I
If、afが2及び−(C=O)−G基が式IIfの窒素原子に対して1位にある。
表3:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro、Fが式I
IIf、Gが式VIIg、bfが1及びGが式IIIfの窒素原子に対して1位にある。
表4:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro、Fが式I
IIf、Gが式VIIg、bfが2及びGが式IIIfの窒素原子に対して1位にある。
表5:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro、Fが式I
IIf、Gが式VIIIg、bfが1及びGが式IIIfの窒素原子に対して1位にある。
表6:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro、Fが式I
IIf、Gが式VIIIg、bfが1及びGが式IIIfの窒素原子に対して1位にある。
表7:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro、Fが式I
IIf、Gが式IXg、bfが1及びG力拭IIIfの窒素原子に対して1位にある。
表8:AがMe2Val、BがVal、DがMeVal、EがPro、Fが式I
IIf、Gが式VIXg、bfが2及びGが式IIIfの窒素原子に対して1位にある。
[生物活性の評価]
試験管内の方法
細胞毒(Cytotoxicity)を、付着性細胞系の標準方法、例えば極微有機体培養の
テトラゾリウムアッセイ(MTT)を用いて測定した。このアッセイ(assay)の
詳細は刊行ぶつに記載されている(Alley,M.C.,et al.,Cancer Research,48
:589-601,(1988))。HT−29結腸癌細胞の指数関数的成長培地を、ミクロ価
(microtiter)平板培養を作製するために使用した。細胞は、96−ウェルプレー
ト(96-well plate)(150mlの培地に)当たり5000〜20000細胞で、
播種した。試験化合物は、10倍に薄められ、10-4M〜10-10Mの範囲で変
化させて加えられた。その後、細胞は48時間培養した。各ウェルの生育できる
細胞数を決定するため、MTT色素(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−
イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドの3mg/ml塩類(sali
ne)溶液50ml)を加えた。この混合物を37℃で5時間培養し、その後50
mlの25%SDS、pH2を各ウェルに加えた。一晩培養後、各ウェルの55
0nmにおける吸光度をELISAリーダを用いて読んだ。複製したウェルのデ
ータの平均+/−SD値を、式%T/C(%:処理して生育可能細胞/対照)を
用いて計算した。T/Cが50%の成長阻害を与える試験化合物の濃度は、IC50
として示した。
下記の表9に、HT−29細胞系において決定されたIC50の値を示す:
表9
生体内の方法
本発明の化合物は、治療適性を示す、生体内活性のための種々の前臨床アッセ
イ(assay)のいずれかで試験した。このようなアッセイは、腫瘍組織、好ましく
はヒト由来のものを、この分野で良く知られているように移植した(外因子性グ
ラフとした(xenografted))ヌードマウスを用いて行った。試験化合物を、外因
子性グラフトされたマウス(xenograft-bearing mice)への投与につながる抗癌有
効性があるかどうか評価する。
上記列挙した化合物I−15を、P338マウスのリンパ球性白血病のふるい
分けモデルで試験した。P388細胞を、移植7日後に腹膜潅流によりドナーマ
ウスから採取し、そして薬剤を連続5日間、静脈注射で投与した。未処理(未治
療)のマウスの生存期間は、11〜13日の範囲であった。そのデータを下記の
表9に示す。またこのデータは、生存期間を意味するように表されている(MS
Tと、T/C%(処理細胞/対照%)としての、対照と比較して寿命の増加)。
ナショナル・キャンサー・インスティチュート・ガイドライン(National Cancer
Institute guideline)に従って、128〜190%のT/C%は、穏や
かな〜良好な活性を示す。
表10:P338マウス白血病に対する化合物I−15の活性度
さらに、無胸腺(athymic)のヌードマウスで成長したヒト腫瘍を、寸法が約5
0mgの腫瘍片を用いて、新しいレシピレント動物に移植することができる。移
植した日を0日目とした。6〜10日後、マウスを、静脈注射又は腹腔内注射に
より試験化合物で処理した。その際、各用量に対して5〜10匹のマウスを用い
て行った。化合物は、体重1kが当たり10〜100mgの用量で、5日間、1
0日間又は15日間、毎日与えられた。腫瘍の直径及び体重を1週間に2度測定
した。腫瘍の重量は、フェルニール(Vernier)・カリパスを用いて測定された直
径及び下記式を用いて計算した:
(長さ×幅2)/2=腫瘍重量mg
平均腫瘍重量は、各処理グループについて計算され、そしてT/C値は各グル
ープについて、未処理の対照腫瘍に対して決定された。
[等価物]
当業者は、単にルーチン実験操作を用いて、ここに記載された発明の特定の態
様の多くの等価物を確認又は確かめることができる。このような等価物は以下の
請求の範囲に包含される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Dolastatin 15 derivative having carbonyl group and heterocyclic group at C-terminal
[Background of the Invention]
Short peptides with significant activity as inhibitors of cell growth are from the Indian Ocean
Mostly isolated from Dorabella auricularia (Bai, et al., Bioche
m. Pharmacology, 40: 1859-1864 (1990); Beckwith, et al., J. Am. Natl. Cnacer I
nst., 85: 483-488 (1993) and references cited therein). These include Doras
Dolastatin 1-10 (U.S. Pat. No. 481,644; Pettit et al.
al.) and dolastatin 15 (European Patent Application No. 398558).
Have been. Dolastatin 15 is, for example, a National Cancer Institute
Tutu (National Cancer Institute) P388 lymphocytic leukemia (PS) cells
Vesicle system-a strong predictor of efficacy against various types of human malignancies-
Notably inhibits length. Trace amounts of various doras present in Dolabella auricularia
Thatatin peptide (about 1 mg per 100 kg of Aplysia), and consequently
The difficulty in purifying quantities sufficient for evaluation and use that occur in
(Roux, et al., Tetrahedron, 50: 5345-536).
0 (1994); Shioiri, et al., Tetrahedron, 49: 1913-24 (1993); Patino, et al.
, Tetrahedron, 48: 4115-4122 (1992) and references cited therein). However
On the other hand, synthetic dolastatin 15 has disadvantages such as low solubility and
Expensive starting materials may be required for formation. Therefore, structurally change in order
The synthesis and evaluation of a modified dolastatin 15 derivative (see: Bioorg
anic & Med. Chem. Lett., 4: 1947-50 (1994); WO 93/03054; JP-A
-06234790; WO93 / 23424).
However, it has the biological activity of dolastatin 15 and requires the required water solubility and efficiency.
There is a need for synthetic compounds that can be manufactured well and economically.
[Summary of the Invention]
The compounds of the present invention have the formula (I):
AB-D-E-F-G (1)
And a salt thereof. A, B, D and E are α-amino acid residues
And A is an amino terminal group. In one embodiment, F is azacyclo
Represents an alkanecarboxylic acid residue. In this embodiment, G is hydrogen, alkyl,
Aryl, cycloalkyl, heteroaryl, alkoxyalkyl, carboxy
, Carboxyalkyl, aminocarbonylalkyl, arylalkyl, hete
Lowarylalkyl, alkoxycarbonylalkyl, aryloxycarboni
Alkyl, alkylsulfinylalkyl, arylsulfinylalkyl,
Alkylsulfonylalkyl, arylsulfonylalkyl, hydrocarbonyl
, Aryloxycarbonyl, alkyl or arylsulfinyl, alkyl
Represents a monovalent group such as aryl or arylsulfonyl. In another embodiment, F is
Represents a cycloalkyl and represents a heteroaryl in which G is bonded to F by a carbon-carbon bond.
You.
In another aspect of the invention, a compound of formula (I) and a pharmaceutically acceptable carrier are
Including pharmaceutical compositions.
Another aspect of the present invention is a pharmaceutically acceptable composition represented by formula (I):
Administering the compound or an acid salt thereof to a mammal such as a human in a therapeutically effective amount.
To treat cancer in a mammal.
[Detailed Description of the Invention]
The present invention relates to peptides having antitumor activity. The present invention also provides
Pharmaceutical compositions comprising the compounds and humans by administering these compositions to mammals.
And methods for treating mammals such as
Dolastatin 15, isolated from the Indian sea hare Dolabella auricularia
These peptides are potent inhibitors of cell growth. However, this compound
The object is only present in trace amounts in Aplysia and is therefore difficult to isolate. that is
, Are also expensive to synthesize, and have the disadvantage of low water solubility. But
However, as shown here, dolastatin 15 is a compound that overcomes these disadvantages.
It plays a role as a starting point, while retaining the antitumor effect, or
Or have a greater antitumor effect than natural products. Applicant
Due to certain structural changes in statins 15, compared to dolastatin 10 or 15,
The potential for treating neoplastic diseases could lead to surprisingly improved compounds
I found it. This dolastatin 15 derivative is also active in multiple drug-resistant tumor systems.
It exhibits an unexpectedly high solubility in aqueous solvents. Furthermore, the present invention
The compounds can be conveniently synthesized as described in detail below.
For the purposes of the present invention, the term “monovalent group” refers to a second electrically neutral molecule
An electrically neutral molecule that can form a single covalent bond.
is there. The monovalent group includes a hydrogen atom, an alkyl (eg, methyl, ethyl and propyl).
), Halogen atoms (eg, fluorine, chlorine and bromine), aryl (eg, phenyl and
And naphthyl), and alkoxy (eg, methoxy and ethoxy)
it can. Two monovalent groups of adjacent σ-bonding atoms combine to form a π bond between adjacent atoms.
A combination can also be formed. Further, two monovalent groups are bonded to each other to form a ring structure.
(Eg, by polymethine units). For example, the unit -N (R) R
[Where R and R 'each represent a monovalent group] is a heterocyclic ring together with a nitrogen atom.
May be formed. Further, two monovalent groups attached to the same atom combine to form 2
May form a valence group such as an alkylidene (eg, propylidene) or an oxygen atom.
No.
For the purposes of the present invention, the term “residue” refers to a molecule, such as an amino acid or a hydroxy.
It refers to molecular fragments after water molecules (one oxygen, two hydrogens) are removed from the silicic acid.
For the purposes of the present invention, the term “straight chain alkyl” refers to unbranched or straight chain
Alkyl, such as linear propyl (n-propyl, -CHTwoCHTwoCHThreeSay).
The compounds of the present invention have the formula I:
AB-D-E-F-G (I)
[However, A, B, D, and E each represent an α-amino acid residue. ]
Can be represented by In one embodiment, F is an azacycloalkanecarboxylic acid
Represents a residue. In this aspect, G is hydrogen, alkyl, alkoxyalkyl, cal
Boxyalkyl, aminocarbonylalkyl, arylalkyl, alkoxyca
Rubonylalkyl, aminoalkyl, aryloxycarbonylalkyl, al
Killsulfinylalkyl, arylsulfinylalkyl, alkylsulfoni
Alkyl, arylsulfonylalkyl, hydrocarbonyl, aryloxy
Carbonyl, alkyl or arylsulfinyl and alkyl or ant
Is a monovalent group selected from thiosulfonyl. In another embodiment, F is a seal
G represents heteroalkyl bonded to F by a carbon-carbon bond.
The peptides of formula I are generally composed of L-amino acids, but may contain one or more D-amino acids.
It can include a mino acid. These exist as salts with physiologically resistant acids.
obtain. This salt includes hydrochloric acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, phosphoric acid, methanesulfone
Acid, acetic acid, formic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, succinic acid, malonic acid, sulfuric acid
, L-glutamic acid, L-aspartic acid, pyruvic acid, mucinic acid, benzoic acid,
Glycuronic acid, oxalic acid, ascorbic acid or N-acetylglycine may be mentioned.
it can.
In the context of the present invention, the following refers to the individual components and to the compounds in the claims.
The method used is described in detail.
Compound of the present invention
Common points of A
In one embodiment, A has the following formula II:aIs a proline derivative represented by:
In the above formula, IIaRepresents an integer, and 0, 1, 2, or 3 is preferable. RaBut one price
Group, for example, a hydrogen atom, or unsubstituted or substituted with 1 to 3 fluorines,
Chain, branched or cyclic C1~ CThreeAlkyl (as appropriate, methyl, ethyl, i
Isopropyl, 2-fluoroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 1-methyl
2-fluoroethyl, 1-fluoromethyl, 2-fluoroethyl, or
Propyl), and methyl, ethyl or isopropyl is preferred.
In this embodiment, R1 aIs a hydrogen atom, or methyl, ethyl, propyl or phenyl
It is a monovalent group such as Phenyl may be substituted, and suitable substituents are
At least one halogen atom (preferably fluorine, chlorine and bromine), C1~ CFourArchi
Methoxy, ethoxy, trifluoromethyl or or nitro.
RTwo a, RThree a, RFour aAnd RFive aAre each independently a monovalent such as a hydrogen atom or methyl
Represents a group. RaAnd R1 aCan be combined to form a propylene bridge.
In another embodiment, A is of the formula IIIaIs a substituted glycine derivative represented by
:
In the above formula, RaIs the formula IIaIt has the meaning described in. R1 aIs a monovalent group, for example
Represents a hydrogen atom or lower alkyl, preferably methyl, ethyl or propyl.
In this embodiment, R6 aIs a monovalent group, for example, a hydrogen atom, a linear or branched C1
~ C8Alkyl substituted with up to 6 halogens (preferably fluorine)
Or CThree~ C8Cycloalkyl, CThree~ C8Cycloalkyl-C1~ CFourA
Luquil, C1~ CFourOxoalkyl (eg, methoxymethyl, 1-methoxyethyl or
Is 1,1-dimethylhydroxymethyl), CTwo~ CFiveAlkenyl (eg, vinyl and
1-methylvinyl), substituted or unsubstituted phenyl. Suitable phenyl substituents
Represents one or more halogen atoms (preferably fluorine, chlorine or bromine), and
Kill, methoxy, ethoxy, trifluoromethyl or nitro. R7 aIs one price
Preferably represents methyl or ethyl
In another embodiment, A is of the formula IVaRepresents an α-amino acid residue represented by: In the above equation, maRepresents an integer, preferably 1 or 2. RaAnd R7 aIs the formula IIIa
Has the meaning described in.
In another embodiment, A is of the formula VaRepresents an α-amino acid residue represented by:
In the above formula, RaAnd R7 aIs the formula IIIaHas the meaning described in.
In another embodiment, A is of the formula VIaRepresents a substituted proline derivative represented by:
In the above formula, RaAnd R1 aIs the formula IIaX has the meaning described inaIs a monovalent group
, Preferably a hydroxyl, methoxy or ethoxy or fluorine atom.
In another embodiment, A is of the formula VIIaRepresents a thiaprolyl derivative represented by: In the above formula, Ra, R1 a, RTwo a, RThree a, RFour aAnd RFive aHas the formula IIaDescribed in
Meaningful.
In another embodiment, A is of the formula VIIIa1,3-dihydroisoindole represented by
Represents a derivative:
In the above formula, RaIs the formula IIaHas the meaning described in.
In another embodiment, A is of the formula IXa2-azabicyclo [2.2.1] represented by
Represents a heptane-3-carboxylic acid derivative:
In the above formula, ZaIs a single or double bond, and RaIs the formula IIaDescribed in
Has the meaning given. Whether the 3-carbonyl substituent is endo- or exo-oriented
Can have.
Commonality of B
B is valyl residue, isoleucyl residue, allo-isoleucyl residue, norvalyl
A 2-tert-butylglycyl residue or a 2-ethylglycyl residue.
B also has the formula IIbCan be a residue represented by:
In the above formula, R1 bAnd RTwo bRepresents a monovalent group. Preferably, R1 bBut
Represents a hydrogen atom, and RTwo bIs, for example, cyclopropyl, n-butyl, isobutyl
Tert-butyl, methoxymethyl, 1-methoxyethyl, or 1-methyl
Represents vinyl. Further, R1 bAnd RTwo bAnd coalesce to form isopropylidene
be able to.
D commonality
D is an N-alkylvalyl residue, an N-alkyl-2-ethylglycyl residue, N
-Alkyl-2-tert-butylglycyl residue, N-alkylnorleucyl residue
Group, N-alkyl isoleucyl residue, N-alkyl-allo-isoleucyl residue,
Or an N-alkylnorvalyl residue, wherein the alkyl is methyl or ethyl.
Preferably.
In another embodiment, D is of the formula IIdΑ-aminocarboxylic acid derivative represented by
Represent the body:
In the above formula, RdIs the formula IIIaRaAnd has the meaning described in1 dRepresents a monovalent group
And preferably represents a hydrogen atom;Two dRepresents a monovalent group, preferably
Ropropyl, methoxymethyl, 1-methoxyethyl, or 1-methylvinyl
You. Further, R1 dAnd RTwo dAnd can combine to form isopropylidene
Wear.
Alternatively, D is of the formula IIIdCan represent a proline derivative represented by:
In the above equation, ndRepresents an integer, for example 1 or 2, and RThree dIs the formula IIIa
R1 dHas the meaning described. XdIs a monovalent group, preferably a hydrogen atom
Represents ndIf is 1, XdIs hydroxyl, methoxy or ethoxy, or fluorine
Represents an atom.
E commonality
E is a prolyl residue, a thiazolidinyl-4-carbonyl residue, a homoprolyl residue;
Represents a group or a hydroxyprolyl residue or has the formula IIeA cyclic α-amido represented by
Represents the carboxylic acid residue:
In the above equation, neRepresents an integer, preferably 0, 1 or 2. R1 eIs the formula IIIaof
R1 dHas the meaning described. RTwo eAnd RThree eRepresents a monovalent group,
It can be independently a hydrogen atom or methyl. RFour eRepresents a monovalent group, and is preferably
Or a hydrogen atom, hydroxyl, methoxy or ethoxy, or a fluorine atom
. RFive eRepresents a monovalent group, and is preferably a hydrogen atom.
neRepresents 1 and RThree eAnd RFour eAnd combine to form a double bond, or
RFour eAnd RFive eCombine with to form a double-bonded oxygen group. ne
Represents 1 or 2, R1 eAnd RTwo eAnd combine to form a double bond.
In another embodiment, E is of the formula IIIe2- or 3-aminocyclo represented by
Represents a pentanecarboxylic acid residue:
In the above formula, ReRepresents a monovalent radical, for example methyl or ethyl, and R1 e
Is R of formula IIIa1 aHas the meaning described.
Commonality of F
In one embodiment of the present invention, F isfAzacycloalkane represented by
Represents a carboxylic acid residue:
In the above equation, afRepresents an integer, preferably 0, 1 or 2. Carbonyl group
It is at the 1 or 2 position (preferably the 1 position) with respect to the nitrogen atom.
In this embodiment, G is a hydrogen atom, up to six halogen atoms (preferably fluorine).
Linear or branched C which may be substituted1~ C8Alkyl, CThree~ C8Cycloal
Kill or CThree~ C8Cycloalkyl-C1~ CFourIt can represent alkyl.
G also has the formula IIgArylalkyl, heteroarylalkyl represented by
, Aryl or heteroaryl can be represented by: In the above equation, agRepresents 0, 1 or 2. R1 1Is a monovalent group, such as substituted or
Represents unsubstituted aryl, preferably phenyl or naphthyl. This allie suitable
As a substituent of chloro, one or more halogen (preferably fluorine, bromine or chlorine)
, C1~ CFourAlkyl, methoxy, ethoxy, trifluoromethyl, dioxymethyl
Len, nitro or cyano, C1~ C7Alkoxycarbonyl, C1~ C7Alkyls
Rufonyl, amino or C1~ C6Dialkylamino can be mentioned, and
The alkyl groups can be combined to form a 5- or 6-membered heterocyclic group. R1 1Is nothing
It may be substituted or substituted heteroaryl, which is a 5- or 6-membered, preferably
Or a ring system containing nitrogen, oxygen or sulfur, which may be condensed with a benzene ring. example
If
Imidazole, pyrrole, thiophene, furan, thiazole, oxazole,
Lazole, 1,2,4- or 1,2,3-triazole, oxadiazole
, Thiadiazole, isoxazole, isothiazole, pyrazine, pyridazine
, Pyrimidine, pyridine, benzofuran, benzothiophene, benzimidazo
Benzothiazole, benzopyran, indole, isoindole, indazo
Derived from the removal of a hydrogen atom from an aryl or quinoline
Can be mentioned. The heteroaryl substituent may include one or more C1
~ C6Alkyl, hydroxyl or phenyl can be mentioned.
In a sub-compound of the invention, G is of the formula IIIgRepresented by the alkoxycal
Bonylalkyl, aryloxycarbonylalkyl, alkoxycarbonyl or
Is a compound of formula I when representing an aryloxycarbonyl:
In the above equation, bgRepresents an integer, preferably 1, 2 or 3, and cgIs an integer
, Preferably 0 or 1. bgAnd cgDo not become 0 at the same time. RTwo 1But one
Divalent groups such as hydrogen atoms, up to 6 halogens (preferably fluorine, especially CFTwo
Straight-chain or branched C which may be substituted1~ C8Alkyl, CThree~ C8Shiku
Lower alkyl, CThree~ C8Cycloalkyl-C1~ CFourAlkyl, or substituted or unsubstituted
Represents a substituted aryl (preferably phenyl or naphthyl). This aryl placement
Suitable substituents include one or more halogen atoms (preferably fluorine, bromine
Or chlorine), C1~ CFourAlkoxy (eg, methoxy, ethoxy), trifluoromethyl
Chill, dioxymethylene, nitro, cyano, C1~ C7Alkoxycarbonyl, C1
~ C7Alkylsulfonyl, amino or C1~ C6List dialkylamino
Wherein the alkyl group is combined with a nitrogen atom to form a 5- or 6-membered heterocyclic ring.
You can also.
G also has the formula IVgAn aminocarbonylalkyl or aminocarb represented by
Bonyl can be:
In the above equation, dgRepresents an integer, preferably 1, 2 or 3, and egIs an integer, preferably
Or 0 or 1. dgAnd egDo not become 0 at the same time.
RThree 1And RFour 1Is independently a monovalent group, a hydrogen atom, up to 6 halo
Gen (preferably fluorine, especially CFTwo-Moiety) optionally substituted with a straight chain or
Branch C1~ C8Alkyl, CThree~ C8Cycloalkyl, CThree~ C8Cycloalkyl-C1
~ CFourAlkyl, substituted or unsubstituted aryl (preferably phenyl or naph
Tyl) independently of one another. With the preferred substituents of this aryl
And one or more halogen atoms (preferably fluorine, bromine or chlorine), or 1
More than C1~ CFourAlkoxy, trifluoromethyl, dioxymethylene, nitro
, Cyano, C1~ C7Alkoxycarbonyl, C1~ C7Alkylsulfonyl, amine
No or C1~ C6Dialkylamino can be mentioned, in the latter, the alkyl group is
It can also combine with a nitrogen atom to form a 5- or 6-membered heterocycle.
N (RThree 1) RFour 1Is further represented by the formula N (CHTwo)fg[However, fgIs an integer of 4, 5 or 6
The ring system represented by the formula:
In another sub-compound of the invention, G is a compound of formula VgAl represented by
Killed or arylsulfinylalkyl, alkyl or arylsulfo
Nilalkyl, alkyl or arylsulfinyl, or alkyl or
A compound of formula I when representing arylsulfonyl:
In the above equation, ggRepresents an integer, for example, 1 or 2. hgRepresents 1 or 2,
One, RFive 1Is a monovalent group, preferably methyl, trifluoromethyl, ethyl or
Represents phenyl.
G is also the following formula VIgAlkyl or arylcarbonyl al represented by
Kill or hydrocarbonylalkyl can also be represented:
In the above equation, igRepresents an integer, for example 1 or 2, and R6 1Is a monovalent group,
For example, even if substituted with a hydrogen atom, up to six halogens (preferably fluorine)
Good linear or branched C1~ C8Alkyl, CThree~ C8Cycloalkyl, CThree~ C8
Cycloalkyl-C1~ CFourAlkyl or substituted or unsubstituted aryl or
Represents heteroaryl (preferably phenyl or naphthyl). This aryl and
Suitable substituents for heteroaryl and heteroaryl include one or more halogen atoms (preferably
Is fluorine, chlorine or bromine), or one or more C1~ CFourAlkoxy, trifluoro
Methyl, dioxymethylene, nitro or cyano, C1~ C7Alkoxycarbonyl
, C1~ C7Alkylsulfonyl, amino or C1~ C6List dialkylamino
The alkyl group may be optionally combined with a nitrogen atom to form a 5- or 6-membered compound.
Elementary rings can also be formed.
In another embodiment of the present invention, F is of the formula IIIfAn azacycloalkali represented by
Represents a derivative: In the above equation, bfRepresents an integer, for example, 0, 1 or 2. In this embodiment, G is
Linked to F at the 1- or 2-position (preferably the 1-position) with respect to the nitrogen atom by a carbon-carbon bond
Represents a heteroaryl. For example, if G is of the formula VII:gHeteroary represented by
Can be:
In the above formula, X represents an NH group, an oxygen atom or a sulfur atom;7 1And R8 1
Each independently represents a monovalent group, and each independently represents a hydrogen atom or a halogen
(Preferably fluorine) linear or branched C which may be substituted1~ C8Archi
Le, CThree~ C8Cycloalkyl or CThree~ C8Cycloalkyl-C1~ CFourAlkyl
Can be represented.
R7 1And R8 1Are each independently of the formula IIlMust be a monovalent group represented by
Can also.
In the above equation, alRepresents an integer, preferably 0, 1 or 2;9 1But one
Valent groups such as substituted or unsubstituted aryl (aryl is preferably phenyl
Or naphthyl). Preferred substituents on the aryl are one or more
A halogen atom (preferably fluorine, bromine or chlorine), C1~ CFourAlkyl group, methoxy
Ethoxy, trifluoromethyl, dioxymethylene, nitro or
Ano group, C1~ C7Alkoxycarbonyl, C1~ C7Alkylsulfonyl, amino
Or C1~ C6Dialkylamino. In the latter, the alkyl group is
May form a 5- or 6-membered heterocyclic ring together with the compound. R9 1Is unsubstituted or
Substituted heteroaryl, for example 5- or 6-membered optionally condensed with a benzene ring
, Preferably a nitrogen, oxygen or sulfur containing ring system, e.g. imidazole, pyro
Thiophene, furan, thiazole, oxazole, pyrazole, 1,2,2
4- or 1,2,3-triazole, oxadiazole, thiadiazole,
Isoxazole, isothiazole, pyrazine, pyridazine, pyrimidine, pyri
Gin, benzofuran, benzothiophene, benzimidazole, benzothiazole
Benzopyran, indole, isoindole, indazole or quinoline
And groups derived by removing hydrogen therefrom. This heteroaryl
Preferred substituents are one or more C1~ C6Is alkyl, hydroxyl or phenyl
.
G is the following formula VIIIgIt may also represent a heteroaryl group represented by:
In the above formula, X is NR12 1R represents a group12 1Is a hydrogen atom, up to 6 halogens
(Preferably fluorine) linear or branched C which may be substituted1~ C8Alkyl,
CThree~ C8Cycloalkyl or CThree~ C8Cycloalkyl-C1~ CFourRepresents alkyl
Or X represents an oxygen atom. RTen 1And R11 1Are each independently a hydrogen atom,
Chain or branch C1~ C8Alkyl or halogen-substituted linear or branched C1~ C8Alkyl,
CThree~ C8Cycloalkyl or CThree~ C8Cycloalkyl-C1~ CFourRepresents alkyl
Or
RTen 1And R11 1Are, independently of each other,lRepresents a monovalent group.
G is the following formula IXgIt can also represent an aromatic diazo group represented by:
In the above formula, X represents NH, an oxygen atom or a sulfur atom;13 1Is a hydrogen atom,
Straight-chain or branched which may be substituted with up to 6 halogens (preferably fluorine)
C1~ C8Alkyl, CThree~ C8Cycloalkyl or CThree~ C8Cycloalkyl-C1
~ CFourRepresents alkyl. R13 1Is the above formula IIlCan also represent a monovalent group.
[Synthesis of Compound]
The compound of the present invention can be produced by a known peptide synthesis method. Follow
To separate peptides from individual amino acids, either consecutively or with appropriate small peptide fragments.
By combining the pieces, they can be assembled. In continuous assembly, peptide chains
Is stepwise extended with one amino acid per step, starting at the C-terminus. fragment
In coupling, fragments of different lengths are joined to each other, and the fragments are
Obtained from amino acids by continuous assembly or by fragment coupling of smaller peptides.
Can be
Both continuous assembly and fragment coupling can be accomplished by a variety of enzymatic and chemical methods.
It is necessary to link the units by the formation of amide bonds that can be achieved. Amide
Chemical methods for forming bonds are described in detail in the basic literature on peptide chemistry
Have been. This document includes Mueller, Methoden der organischen Chemie
XV / 2, 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart, (1974); Stewart & Young, Solid
Phase Peptide Synthesis, 31-34 & 71-82, Pierce Chemical Company, Rockfol
d, IL (1984); Bodansky, et al., Peptide Synthesis, 85-128, John Wiley &
Sons, New York, (1976). The preferred method is
Method, symmetric and mixed acid anhydride method, use of in-system generated or practiced active ester,
Use of urethane-protected N-carboxyanhydride of carboxylic acid and use of coupling reagent
To form an amide bond. Coupling reagents include
Rubonic acid activators, especially dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropane
Ropylcarbodiimide (DIC), 1-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1
, 2-Dihydroquinoline (EEDQ), 1-ethyl-3- (3-dimethylamino)
Pyrrolyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), n-propane-phosphonic anhydride
(PPA), N, N-bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) imide-chloride
Phosphoryl (BOP-Cl), bromo-tris-pyrrolidinophosphonium hexa
Fluorophosphate (PyBrop), diphenylphosphoryl azide (DPP)
A), Castro's reagent (BOP, PyBop), O-ben
Zotriazolyl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium salt (HBTU)
, Diethylphosphoryl cyanide (DEPCN), 2,5-diphenyl-2,3-
Dihydro-3-oxo-4-hydroxy-thiophene dioxide (Steglich
Reagent (Steglich's reagent); HOTDO) and 1,1'-carbonyl-diimidone
Dazole (CDI) can be mentioned. Coupling reagent
Can be used alone or with additives. As additives, N,
N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP), N-hydroxybenzotria
Sol (HOBt), N-hydroxybenzotriazine (HOOBt), N-
Droxysuccinimide (HOSu), N-hydroxyazobenzotriazole
(HOAt), azabenzotriazolyl-tetramethyluronium salt (HATU)
, HAPyU) or 2-hydroxypyridine.
The use of protecting groups is generally not necessary in enzymatic peptide
Reversible protection of reactive groups not involved in the formation of union is necessary for both reactive materials in chemical synthesis.
You. Three conventional protecting group techniques are preferred for chemical peptide synthesis: benzyl
Oxycarbonyl (Z), t-butoxycarbonyl (Boc) and 9-fluor
Nylmethoxycarbonyl (Fmoc) technology. In each case, the chain extension unit α-
The protecting group on the amino group is identified. For a detailed review of amino acid protecting groups, see Mueller, M.
ethoden der organishen Chemie Volume XV / 1, pp.20-906, Thime Verlag, Stuttgas
rt (1974). The units used for peptide chain assembly are solution, suspension
The reaction can be carried out in a liquid or Merrifield in J.C. Am. Chem. Soc., 85: 2149
The reaction can be carried out by a method similar to the method described in (1963). Especially preferred
The method involves assembling the peptides either continuously or by Z, Boc or Fmoc preservation.
Assembled by fragment coupling using protecting group technology. At that time, the above Merrifield
One of the technology's reaction materials is bound to an insoluble polymer carrier (hereinafter also called resin)
You. This uses the Boc or Fmoc protecting group technology to link the growing peptide chain to the C-terminal
Peptide on the polymer carrier while covalently bonding to insoluble resin particles
It typically involves an assembly process. This procedure allows reagents and
And the removal of by-products, eliminating the need to recrystallize intermediates.
The protected amino acid is linked to a suitable polymer that is insoluble in the solvent used.
It must have a stable physical form that can be filtered and filtered. This port
Limmer must contain a functional group that covalently attaches the first protected amino acid
There is. A wide variety of polymers are suitable for this purpose, such as cellulose,
Rivinyl alcohol, polymethacrylate, sulfonated polystyrene, chloroform
Cylated styrene / divinylbenzene copolymer (Merrifield resin), 4-methylbenzene
Hydrylamine resin (MBHA resin), phenylacetamidomethyl resin (
Pam-resin), p-benzyloxybenzyl alcohol resin, benzhydryl
Amine resin (BHA resin), 4- (hydroxymethyl) benzoyloxymethyl
Resins, resins such as Breipohl (Tetrahedron Letters, 28: 565 (1987); BACHEM),
4- (2,4-dimethoxyphenylaminomethyl) phenoxy resin (Novabioche
m) or o-chlorotrityl resin (Biohellas).
A solvent suitable for peptide synthesis may be any solvent that is inert under the reaction conditions.
In particular, water, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (
DMSO), acetonitrile, methylene chloride (DCM), 1,4-dioxane,
Tetrahydrofuran (THF), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), and
Mixtures of these solvents can be mentioned.
Synthesis of the peptide on the polymer carrier is suitable for dissolving the starting material of the amino acid derivative.
It can be carried out in an appropriate inert organic solvent. However, further DMF, DC
Solvents having resin swellability such as M, NMP, acetonitrile and DMSO
preferable. After synthesis, the peptide is removed from the polymeric carrier. Various trees of this division
Conditions for fat types are described in the literature. This most commonly used
The fission reaction is a catalytic reaction with an acid or palladium.
Hydrogen fluoride, trifluoromethanesulfonic anhydride, dilute or high concentration trifluoro
Performed in acetic acid and acetic acid / methylene chloride / trifluoromethanol mixture
. The latter, in the presence of a weak base such as morpholine, THF or a THF-DCM mixture
Can be done in Certain protecting groups are also cleaved off under these conditions.
Partial protective removal of the peptide may also be required prior to certain derivative reactions. example
For example, a peptide dialkylated at the N-terminus can be converted to a suitable N, N-dialkylamide.
Noic acid is coupled to the peptide in solution or in DMF / 1% acetic acid
NaCNBHThreeAnd using the appropriate aldehyde
Alkylation or water over Pd / Cl in the presence of an aldehyde or ketone
By simplification, it can be manufactured.
The following three schemes describe the synthesis of the compounds of the present invention in more detail.
Things.
Scheme I
Here, the tetrapeptide ABDEOH is the peptide discussed above.
Is coupled with an azacycloalkyl derivative FG by the coupling method of
It is.
Scheme II
Here, the N-terminal protected tetrapeptide A'-BDE-OH is discussed above.
Azacycloalkyl derivative FG by using the coupling method of the obtained peptide.
Coupling yields the intermediate compound A'-BDEGF. The N-protecting group is
, And then removed by the conventional method described above. Group RaAnd R7 aThen as described above
To the amino terminus by reductive alkylation.
Scheme III
In Scheme III, the tetrapeptide is combined with the protected form of building block F, F '.
To pull. F can also be attached to a precursor of group G. Intermediate A-
B-D-E-F 'is then converted into a final product by a reaction such as an oxidation reaction or a reduction reaction.
Is converted. In one embodiment, F 'is pyrrolidinyl alcohol and intermediate A
-BDE-F 'is a mild acid such as Swern oxidation or oxidation by Dess-Martin reagent.
It is oxidized by the chemical conversion method to obtain a final product.
The building blocks used in the synthesis of the claimed compounds are described in the general methods below.
Can be manufactured by:
(A) pyrrolidinyl ketone and piperidinyl ketone
Several routes to pyrrolidinyl ketones are known in the literature. Racemic pyro
Lysinyl ketone involves hydrogenating the corresponding pyrrolyl ketone with a platinum oxide catalyst.
(Kaiser, et al., J. Org. Chem., 49: 4203 (1984)). Ki
For ralpyrrolidinyl ketone, L- or D-proline is used as starting material
Could be used. As a protecting group for cyclic nitrogen, tert-butyl
Xycarbonyl group (boc-group), benzyloxycarbonyl (Z-group) or fluor
A nyloxycarbonyl group (fmoc group) could be used.
N-Boc-protected pyrrolidinyl ketones are pyrroline derivatives, especially N-Boc-
Proline-2-thiopyridyl ester or N-Boc-proline N-methoxy-
N-methylamide is treated with an organometallic reagent such as Grignard reagent or lithium reagent.
Can be obtained by processing. Some examples have been reported in the literature, for example NB
N-Boc-pyrrolidinini from oc-proline N-methoxy-N-methylamide
Methyl ketone (Trost, J. Am. Chem. Soc., 111: 4988 (1989)); N-Boc-
N-Boc-pyrrolidinyl pen from proline N-methoxy-N-methylamide
Tafluoroethylketone (Angelastro, M.R., et al., Tetrahedron Letters, 3
3: 3265. (1992)); and from N-Boc-proline 2-thiopyridyl ester
N-Boc-pyrrolidinyl methyl ketone (Conrow, R., et al., J. Org. Chem.
., 51: 938 (1986)).
Removal of the Boc-protecting group is described in HCI (see, eg, Angelastro, M.R., et al.
, Tetrahedron Letters, 33: 3265 (1992)) or trifluoroacetic acid (see, eg,
For example, Goldstein, S.W., et al. Org. Chem., 57: 1179 (1992))
Processing can be achieved. Alkyl and aryl pyrrolidinyl ketones
It is manufactured by the method described above.
A second approach to these building blocks is to use Boc-protected proline
Here is a method to produce the corresponding alcohol by treating the aldehyde with a nucleophile.
Can be. The alcohol is protected and removed in the usual manner.
Done. Oxidation of alcohol can be performed by Swern oxidation or oxidation by Dess-Martin reagent
Achieved by a mild oxidation process. Of peptides containing pyrrolidinothiazolyl ketone
Examples of synthesis are described in Tsussumi, S., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 4: 831 (1994
)It is described in. Alternatively, the alcohol is first oxidized to ketone and then
The N-protecting group can be removed. Commercial trifluoromethyl aldehyde
Trimethylation with trimethylsilane is used for tetrabutylammonium fluoride.
(Olah, G., J. Am. Chem. Soc., 111: 393 (1989)).
). After deprotection and coupling to the tetrapeptide, the alcohol is
Oxidation to ketone by a mild oxidation method such as oxidation or oxidation with Dess-Martin reagent
Can be.
Various α-, β- and γ-dicarbonyl derivatives of proline have been described.
Therefore, (S) -1-pyrrolidinyl) -1,2-propanedione hydrochloride is represented by Bo
Obtained by treating the c-protected derivative with HCl (Conrow, R., et al.,
J. Org. Chem., 51: 938 (1986)). N-Boc-pyrrolidinyl-β-ketoacetic acid
Ethyl to N-Boc protected prolinal of lysioethyl acetate
And subsequent oxidation of, for example, chromium trioxide (Hanson, GJ, et al.
al., Tetrahedron Letters, 27: 3577 (1986)). Β-Ketoji from amino acid derivatives
The preparation of fluoroesters has been described (J. Med. Chem., 35: 4795 (1992)).
, And in the first step using Reformatsky reagent of bromodifluoroacetate,
The procedure and analogs described above for ketoesters using the Dess-Martin- reagent in the oxidation step
It is similar.
An analogous method to that described above for pyrrolidinyl ketone is piperidinyl keto
And 7-membered azaheterocycles. Starting materials for these syntheses
The ingredients include pipecolic acid, all three commercially available isomers, and 2-pipecolic acid.
Can include its enantiomers. For example, methyl ketone is N-Bo
c-((2-pyridylthio) -carbonyl) piperidine was tested for methyl Grignard
It is manufactured by treating with a drug (J. Am. Chem. Soc., 115: 11393 (1993)).
(B) pyrrolidinyl oxazole and piperidinyl oxazole
Several synthetic approaches to oxazoles derived from amino acids are described in the literature
Have been. Generally, the N-protected amino acid is an aminoketone or other 2-amino
It is coupled with the rubonyl derivative using the above-described conventional methods of peptide synthesis.
For example, a Z- or Boc-protecting group may be used to protect an amino nitrogen.
Can be. The water is then removed from the amino acid β-ketoamide and the corresponding oxo is removed.
Get Sasol. Several reagents are used to dehydrate these compounds, for example pentaacid
Phosphorus chloride, phosphorus trichloride, phosphorus pentachloride, and thionyl chloride can be mentioned. Another favored
New methods include phosphines such as trialkyl- or triaryl-phosphines,
Preferably, triphenylphosphine is converted to a halogenated hydrocarbon, preferably chloro-
Or bromo-hydrocarbons (eg, carbon tetrachloride, carbon tetrabromide, chloroform and perk
In combination with loroethane, triethylamine, diazabicycloundecane, methyl
In a polar solvent such as acetonitrile in the presence of a base such as rumorpholine or pyridine.
It is a method used in. For example, tryptophan-derived oxazole can be obtained by the following method (
Gordon, T.D., et al., J. Org. Chem., 34: 1901 (1993)). Ma
The combination of triphenylphosphine, iodine and triethylamine is
It has been reported to give good yields of sols (Wipf, P., et al., J. Or.
g. Chem., 58: 3604 (1993)).
Another method of forming oxazoles involves converting amino acids to 2-amino alcohols.
And coupling using a conventional method for forming an amide bond in peptide synthesis
Can be mentioned. Cyclization to oxazoline is carried out using the Burgess reagent, (methyl N-
(Triethylaminosulfonyl) carbamate) using (Wipf, P., et al.,
Tetrahedron Letters, 33: 907 (1992); Wipf, P., et al., J. Am. Am. Chem. Soc.
, 114: 01975 (1992); Wipf, P., et al., J. Am. Org. Chem., 58: 1575 (1992)) or M
itsunobu reaction (triphenylphosphine / diisopropylazodicyclocarboxy)
(Silate) (Wipf, P., et al., Tetrahedron Letters, 33: 6267 (1992))
It can be carried out. Oxidation to oxazole should be performed using nickel peroxide
(Evans, D.L., et al., J. Org. Chem., 44: 497 (1979)).
These methods correspond to the corresponding starting from either N-protected D- or L-proline.
Of N-protected D- or L-pipecolic acid
Can also be used to synthesize the corresponding piperidinyl oxazole starting from
You.
Following formation of the oxazole, the N-protecting group can be, for example, a Boc-protected compound,
It can be removed by treatment with an acid such as hydrochloric acid or trifluoroacetic acid. Obtained
The salt or free base can then be used in the next coupling step.
(C) pyrrolidinylthiazole and piperidinylthiazole
A common method for thiazole synthesis is the Hantzsch synthesis, where amino
The condensation of the N-protected thioamide of the acid with a substituted halo-pyruvate
Include. However, this reaction is usually achieved by racemization at the amino acid portion.
Is done. The Milder method was developed to avoid racemization. First, the N-protected
The amino acid is an aminoketone or other 2-aminocarbonyl derivative and the above-described peptide.
Coupling can be accomplished using conventional methods for synthesizing compounds. Thionic acid
The thionation, cyclization and dehydration are carried out by the Lawesson reagent (Gordon, T.D., et al.,
trahedron Letters, 34: 1901 (1993)) at elevated temperatures, such as refluxing tetrahydro
It can be achieved by a single pot reaction in furan.
Thiazolines can be synthesized as follows: First, the corresponding N-protected amino acid
The acid is converted to 2-siloxyethylamine using the usual amide bond method of peptide synthesis.
And coupling. After thionation of the amide with Lawesson's reagent,
The cyclization to the thiazoline is carried out using the Burgess reagent (methyl N- (triethyl alcohol).
Ammonium-sulfonyl) carbamate) or Mitsunobu reaction (triphenylphospho)
Fin / diisopropylazodicyclocarboxylate) (Wipf, P., et al.,
Tetrahedron Letters, 33: 6267 (1992)).
(D) pyrrolidinyl imidazole and piperidinyl imidazole
Imidazole converts the β-keto amide of the corresponding amino acid into an ammonium salt or
Treated with water and then dehydrated using a dehydrating agent or azeotropic removal with water.
(Gordon, T.D., et al., Tetrahedron Letters, 34: 1901 (1993)).
(E) pyrrolidinyl isoxazole and piperidinyl isoxazole
Isoxazole is obtained by reacting hydroxyamine with 1,3-diketone,
Cyclization of toxime or 1,3-dipolar cycloaddition of N-oxide to alkyne
Can be manufactured. 5- (N-methylpyrrolidinyl) -3-methylisothio
The synthesis of oxazoles involves methanesulfonyl chloride and triethylamido as the base.
(N-methylpyrrolidin-2-yl) -4-oxobutyl-2-o
It is described as being due to the cyclization of the oxime (Elliot, R., et al. Synthesis, 7: 772).
(1950)).
The process for the production of nitrile oxide and the corresponding isoxazole are described in K.B.G. Torssel
l, Nitrile Oxides, Nitrones and Nitronates in Organic Synthesis, VCH Ver
lagsgesellscafft, Wernheim.
(F) pyrrolidinyl pyrazole and piperidinyl pyrazole
Pyrazoles are hydrazines or monosubstituted hydrazines and the corresponding 1,3-diketo.
Or a 3-ketoacetonitrile with a polar solvent (eg, alcohol or N, N-diene).
(Methylformamide). Pylori
The synthesis of dinylacetone has been described. For example, 2-methyl-5- (1-methyl
Pyrrolidin-2-yl) -2H-pyrazol-3-ylamine is the corresponding nitro
Manufactured from ril and hydrazine (Adachi, et al., Chem. Pharm. Bull., 35
: 3235 (1987)).
(G) pyrrolidinyl oxadiazole and piperidinyl oxadiazole
Pyrrolidinyl oxadiazole and piperidinyl oxadiazole are the corresponding
Diacylhydrazine is converted to phosphonic anhydride and trace amounts of acid (eg, methanesulfone
Acid) or hexamethyldisilazane and tetrabutylammonium fluoride
To dehydrate with. (Rigo, et al., J, Heterocycling).
. Chem., 23: 253 (1986); Rigo, et al., Synthe. Comm. 16: 1665 (1986)).
Diacyl hydrazine is a hydration of the corresponding N-protected carboxylic acid and another carboxylic acid.
Produced by coupling with zide (Sheradsky, et al., Tet. Lett., 32:
133 (1991)). Another mild method is to react hydrazine with thionyl chloride and pyridine.
To form a 1,2,3,4-oxathiadiazole-S-oxide intermediate
It is a method. 1,3,4-oxadiazole is then used for the heat removal of sulfur dioxide
(Borg, et al., J. Org. Chem., 60: 3112 (1995)).
(H) pyrrolidinylthiodiazole and piperidinylthiodiazole
Pyrrolidinyl-1.3.4-thiadiazole and piperidinyl-1.3.4-
The thiadiazole is available from Lawesson's reagent or P of the corresponding hydrazone.FourSTenTo react with
(Sawtney, et al., J. Indian Chem. Soc. B, 30: 407 (1
991); Lancelot, et al., J. Am. Heterocycl. Chem., 17: 625 (1980)). Asilhi
Drazine can be manufactured as described above.
[Method of Using Compounds in Claims]
In another embodiment, the present invention relates to solid tumors in mammals, such as humans.
Eg, lung, breast (breast), colon, prostate, bladder, rectal and endometrial tumors) or blood
Partially or totally inhibit the production of malignant tumors (eg, leukemias and lymphomas), or
Or administering to the mammal a therapeutically effective amount of a compound of Formula I or a combination thereof.
More therapeutic (eg, antagonizing or inhibiting further growth). Drug alone
Can be administered in the form of a pharmaceutical composition comprising the drug and an acceptable carrier or diluent.
You. Administration is by any means commonly used for pharmaceuticals, preferably for oncology drugs.
For example, oral or parenteral (eg, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intraperitoneally)
Or from the nasal cavity or rectum).
The dosage given to a mammal (eg, a human) includes a therapeutically effective amount of a compound described herein.
In. As used herein, a "therapeutically effective amount" refers to tumor formation or hematologic malignancy.
Inhibits (partially or completely) the development of a tumor, or a solid tumor or other malignant tumor
Is sufficient to antagonize or reduce its further growth. Identification of treatment
With regard to the conditions or methods of the above, the dose is determined empirically using a known method and used.
Biological activity of the particular compound used; means of administration; age and health of the recipient
Condition and weight; nature or degree of symptoms; frequency of treatment; dosage of other treatments;
It changes depending on factors such as effects. A typical daily dose is 1 kg body weight orally
About 1 to about 50 mg, and parenterally about 0.5 to about 20 mg per kg of body weight.
It is.
The compounds of the present invention may be in the form of conventional solid or liquid pharmaceutical dosage forms, such as uncoated or (
Films) can be provided in the form of coated tablets, capsules, powders, granules, suppositories or solutions
You. These are manufactured by a known method. Active substances are usually used for this purpose.
Pharmaceutical auxiliaries such as tablet binders, fillers, preservatives, disintegrants,
Stabilizers, plasticizers, wetting agents, dispersants, emulsifiers, solvents, sustained release compositions, antioxidants and
And / or propellant gases (see H. Sucker et al., Pharmazeutische Technologie)
, Thime-Verlag, Stuttgart, 1978).
The following examples illustrate the invention but do not limit the invention.
Not.
[Example]
The amino acids of the proteins are abbreviated in the examples using known three-letter codes.
Was. Other abbreviations are as follows: TFA = trifluoroacetic acid, Ac = acetic acid, DC
M = dimethyl sulfoxide, DMSO = dimethyl sulfoxide, Bu = butyl
, Et = ethyl, Me = methyl, Bzl = benzyl. Smell of listed compounds
The amino acids of all proteins are L-amino acids unless otherwise specified.
General materials and methods
A-BDE-OH or A'-BDE-OH of the present invention (where A 'is
A means the N-protected form of A) or the corresponding ester
Is a classical method using the standard Z- or Boc-methodology discussed above.
It is synthesized by simple solution synthesis. The general route to these tetrapeptides is
The national patent application no. Described in DE 4415998 and as tetrapepitide
Especially Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe; MeTwoVal-Va
1-MeVal-Pro-OMe × HCl; Z-Ile-Ile-MeVal-
Pro-OMe and MeTwoIle-Ile-MeVal-Pro-OMe
.
The acid of these tetrapeptides is a lithium hydroxide described in DE 4415998.
Alternatively, it can be obtained by base hydrolysis of an ester using sodium.
Furthermore, the tetrapeptide of the present invention is a fully automatic model 431A synthesizer (APPL).
(IEDBIOSYSTEMS) according to the standard method of solid phase synthesis. This device
Now, as described below, different synthetic cycles for Boc and Fmoc protecting group technology.
Is used.
Synthetic cycles for Boc and Fmoc protecting group technology
1.30% trifluoroacetic acid DCM solution 1 × 3 minutes
2. 50% trifluoroacetic acid DCM solution 1 × 1 minute
3. DCM wash 5 × 1 minute
4.5% diisopropylethylamine DCM solution 1 × 1 minute
5.5% diisopropylethylamine NMP solution 1 × 1 minute
6. NMP cleaning 5 × 1 minute
7. Addition of preactivated protected amino acid
(1 equivalent of DCC and 1 equivalent of HOBt
Activation with NMP / DCM solution);
Peptide coupling (1st part) 1 × 30 minutes
8. Until it contains 20% by volume of DMSO
Add DMSO to reaction mixture
9. Peptide coupling (2nd part) 1 × 16 minutes
10.3.8 equivalents of diisopropylethylamine
To the reaction mixture
11. Peptide coupling (2nd part) 1 × 7 minutes
12. DCM wash 3 × 1 minute
13. If conversion is not complete, coupling
(Return to step 5)
14.10% acetic anhydride,
5% diisopropylethylamine DCM solution 1 × 2 minutes
15.10% Acetic anhydride in DCM 1 × 4 min
16. DCM wash 4 × 1 minute
17. Return to step 1.
Coupling BOP-Cl and PyBrop with amino acids to N-methyl amino acids
Used as a reagent for The reaction time is correspondingly increased. Solution
The Boc-protected amino acids NCAs (N-tert-butyl
Roxycarbonylamino acid-N-carboxyanhydride) or Z-protected amino acid
NCAs (N-benzyloxycarbonylamino acid-N-carboxylic anhydride)
Is most preferred for this type of coupling.
Synthetic cycle for Fmoc protecting group technology
1. DMF washing 1 × 1 minute
2.20% piperidine DMF solution 1 × 4 minutes
3.20% piperidine DMF solution 1 × 16 minutes
4. DMF washing 5 × 1 minute
5. Addition of preactivated protected amino acid
(1 equivalent of TBTU and 1.5 equivalents of DIPEA
Activation with DMF solution);
Peptide coupling 1 × 61 minutes
6. DMF washing 3 × 1 minute
7. If conversion is not complete, coupling
(Return to step 5)
8.10% acetic anhydride DMF solution 1 × 8 minutes
9. DMF washing 3 × 1 minute
10. Return to step 2.
Coupling BOP-Cl and PyBrop with amino acids to N-methyl amino acids
Used as a reagent for The reaction time is correspondingly increased.
N-terminal reductive alkylation
Removal of the protection at the N-terminus of the peptide resin produced as described above,
3-fold molar excess of a solution of aldehyde or ketone in DMF / 1% acetic acid and 3 equivalents
NaCNBHThreeThe reaction is carried out while adding. After the reaction (Negative Kaiser
-Test), the resin is prepared using water, isopropanol, DMF and methylene chloride.
Washed several times.
Post treatment of peptide resin
The peptide resin obtained by the Boc protecting group method is dried under reduced pressure,
It was transferred to the reaction vessel of the device (manufactured by PENINSULA). Then the scavenger, usually anisole
(1 ml / g of resin), and for tryptophan-containing peptides,
All (0.5 ml / g of resin), preferably ethanedithiol,
Remove the illdolic formyl group. Following this, the liquid NTwoIn the bath
And hydrogen fluoride (10 ml / 1 g resin). Warm the mixture to 0 ° C.
Stir at this temperature for 45 minutes. Thereafter, the hydrogen fluoride is removed under reduced pressure, and the residue is vinegared.
Washing with ethyl acid removed the residual scavenger. Extract peptides with 30% acetic acid
The mixture was filtered, and the filtrate was freeze-dried.
The peptide resin obtained by the Fmoc protecting group method was dried under reduced pressure, and then
One of the decomposition treatments (depending on the amino acid composition) was performed (Wada, Tregea)
r, Howard Florey Fmoc Workshop Manual, Melbourne 1985). Peptide resin
The suspension in the appropriate TFA mixture is stirred at room temperature for the above-mentioned time, after which the resin is filtered
And washed with TFA and DCM. Concentrate the filtrate and washings with diethyl ether
Was added to precipitate the peptide. After cooling in an ice bath, the precipitate was filtered and 30% acetic acid was added.
And lyophilized.
When 0-chlorotrityl resin (manufactured by Biohellas) is used, acetic acid / trifluoro
A suspension of the peptide resin in a romethanol / methylene chloride mixture (1: 1: 3) was added to the chamber.
Stirred at room temperature for 1 hour. Then, the suspension is subjected to suction filtration, and the peptide resin is decomposed with
Washed thoroughly. The filtrate was collected, concentrated in vacuo and treated with water. Filter the precipitated solid or
It was removed by centrifugation, washed with diethyl ether and dried under reduced pressure.
Purification and characterization of peptides
Purification was performed by gel chromatography (SEPHADEX G-10, G-15 / 10% HO).
Ac, SEPHADEXLH20 / MeOH), then medium pressure chromatography if necessary
Raffy (fixed layer: HD-SIL C-18, 20 to 45 mm, 100 mm; moving layer
: A = 0.1% TEA / MeOH, B = 0.1% TFA / HTwoO gradient)
Was. The purity of the product obtained was determined by analytical HPLC (fixed layer: 100 2.1 mm V
YDAC C-18 51, 300 °; moving layer: A = CHThreeCN / HTwoThe gradient of O,
0.1% TFA, buffered with 40% C).
Polypeptides are characterized by fast atom bombardment mass spectroscopy.
[Example 1: Synthesis of pyrrolidinyl ketone]
(A) Synthesis of N-methyl-N-methoxy- (Boc-proline) -amide 30 g Boc-proline and 13.6 g N, O-dimethylhydroxyl
26.73 g of 1-E was added to a solution of min hydrochloride dissolved in 250 ml of methylene chloride.
Tyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 18.83
g of N-hydroxybenzotriazole and 49.34 g of N-methylmorpholine
Was added at 0 ° C. The mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction mixture is then saturated
Washed with sodium hydrogen oxyate, 5% aqueous citric acid and brine. Sulfur organic layer
Dried over sodium acid. After filtration, the solvent was removed under vacuum and 22.2 g of N-
Methyl-N-methoxy- (Boc-proline) -amide was obtained.
1H-NMR (CDClThree, 270 MHz), d = 1.4, 1.45 (s, 9H)
), 1.8-2.3 (m, 4H), 3.2 (s, 3H), 3.3-3.6 (m, 4H).
2H), 3.7 (s, 3H), 3.8 (s, 3H), 4.6, 4.7 (d, 1H)
) Ppm.
(B) Production of (S) -Boc-pyrrolidin-2-yl-methylketone
2.0 g of N-methyl-N-methoxy- (Boc-proline) -amide was added to 70 g
3M methylmagnesium chloride tetra
3 ml of the hydrofuran solution was added dropwise at -40 ° C. Warm the mixture to room temperature
And stirred overnight. The solution was diluted with diethyl ether, washed with brine, and
And dried over sodium sulfate. After filtration, the solvent was removed under vacuum. The residue
Purification by silica gel chromatography (heptane / ethyl acetate = 2: 1).
66 g of (S) -Boc-pyrrolidin-2-yl-methylketone were obtained.1H-NMR (CDClThree, 270 MHz), d = 1.4, 1.45 (s, 9H)
) 1.75-1.9 (m, 4H), 2.1, 2.15 (s, 3H), 3.4-
3.6 (m, 2H), 4.2, 4.3 (d, 1H) ppm.
(C) Production of (S) -pyrrolidin-2-yl-methylketone trifluoroacetate
1.66 g of (S) -Boc-pyrrolidin-2-yl-methylketone was added to 25 m
To a solution dissolved in 1 methylene chloride was added 25 ml of trifluoroacetic acid. Profit
The resulting mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The solvent was removed and 0.80 g of (S)-
Pyrrolidin-2-yl-methylketone trifluoroacetate was obtained.
1H-NMR (CDClThree, 270 MHz), d = 1.75 to 2.0 (m, 4H)
), 2.2 (s, 3H), 3.1 (m, 2H), 4.5 (d, 1H), 8.7 (
m, 1H), 10.4 (m, 1H) ppm.
[Example 2: Production of pyrrolidinyl heterocycle]
(A) Synthesis of N- (N'-BOC-pyrrolidinyl) methyl phenyl ketone
BOC-pro-OH (6.2 g, 29 mmol) and 2-aminoacetophen
Non-HCl (5.0 g, 29 mmol) was added to 290 ml of dry CH.TwoClTwoDissolved in
Then, the obtained solution was cooled to 0 ° C. HOBT ・ HTwoO (1.4 g, 9.6 mm
Mol), EDC.HCl and then NMM (3.8 ml, 35 mmol)
added. The reaction mixture is stirred at room temperature overnight, and then saturated sodium bicarbonate (3.
×), washed with water (3 ×), 5% citric acid and water. And on sodium sulfate
After drying, the solvent was removed under reduced pressure to give 9.5 g of a yellow oil. Diiso the oil
When dissolved in propyl ether, a white crystalline product precipitated. Dry this
Was used directly in the next step. Yield: 8.6 g (89%).
1H-NMR (DMSO-d6): 8.1 to 8.25, m, 1H; 8.0, d,
2H; 7.65, t, 1H; 7.5, t, 2H; 4.5 to 4.7, m, 2H;
. 1 to 4.25, m, 1H; 3.2 to 3.5, m, 2H; 2.0 to 2.2, m,
1H; 1.7-1.9, m, 3H; 1.3 and 1.4, both 9H.
(B) Production of 2- (N-BOC-pyrrolidinyl) -4-phenyloxazole
N- (N'-BOC-pyrrolidinyl) methyl phenyl ketone (2.5 g, 7.
5 mmol) in 40 ml of dry acetonitrile under nitrogen (diatomic molecule) atmosphere
Was dissolved. The mixture was cooled to −20 ° C. and then triphenylphosphine (4
. 0 g, 15 mmol) perchloroethane (3.6 g, 15 mmol) and tri
Ethylamine (4.3 ml, 30 mmol) was added. After stirring at room temperature overnight, react
The mixture was diluted with ethyl acetate and saturated aqueous sodium carbonate, 5% citric acid and
Washed in line. After drying over sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure to give
The crude solid obtained is purified by chromatography on silica gel and 1.5 g (64
%) Of a light brown solid.1H-NMR (DMSO-d6): 7.6-7.8, m, 3H; 7.5, t, 2
H; 7.4, t, 1H; 4.8 to 5.0, m, 1H; 3.45 to 3.6, m, 1
H; 3.3 to 3.45, m, 1H; 2.2 to 2.4, m, 1H; 1.8 to 2.1.
, M, 3H; 1.2 and 1.4, s, both 9H.
(C) protection of 2- (N-BOC-pyrrolidinyl) -4-phenyloxazole
Removal BOC protected compound 3 (100 mg, 0.3 mmol) was added to 10 ml of dry die
Dissolved in chill ether and treated with 12 ml HCl saturated ether. Obtained suspension
The suspension was stirred at room temperature for 5 days. Thereafter, the pH was adjusted to 11 with a 2N NaOH solution.
Was. Separate the organic layer, dry over sodium sulfate and evaporate under reduced pressure.
2 mg of a colorless oil were obtained.
1H-NMR (DMSO-d6): 7.6-7.8, m, 3H; 7.5, t, 2
H; 7.4, t, 1H; 74.8 to 5.0, m, 1H; 3.45 to 3.6, m,
1H; 3.3-3.45, m, 1H; 2.2-2.4, m, 1H; 1.8-2.
1, m, 3H; 1.2 and 1.4, s, both 9H.
[Example 3: (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
Synthesis of N-2-yl) -methylketone (Compound I-1)
(A) (S) -Z-Val-Val-MeVal-Pro-pyrrolidine-2-i
B) Synthesis of methyl ketone 3.0 g Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH and 0.89 g
Methyl chloride of (S) -pyrrolidin-2-yl-methylketone trifluoroacetate
1.03 g of -ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carb
1. Bodiimide hydrochloride, 0.72 g of N-hydroxybenzotriazole and
16 g of N-methylmorpholine were added at 0 ° C. Stir the mixture at room temperature overnight
Was. The reaction mixture is then diluted with methylene chloride and then saturated with sodium bicarbonate.
Washed with aqueous solution, 5% citric acid aqueous solution and brine. Dry over sodium sulfate
And then filtered and the solvent was removed under vacuum. The residue is purified by silica gel chromatography.
(Methylene chloride / isopropanol / triethylamine = 94: 5: 1)
More purified, 1.03 g of ((S) -Z-Val-Val-MeVal-Pro
-Pyrrolidin-2-yl) -methylketone was obtained.
FAB-MS: 656.9 (M + H+)
(B) (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-pyrrolidine-2
Synthesis of -yl) -methyl ketone
1.03 g of ((S) -Z-Val-Val-MeVal-Pro-pyrrolidine
N-2-yl) -methyl ketone was dissolved in 150 ml of methanol, and 38
mg of palladium on activated carbon (10 wt% Pd) was added. The resulting suspension
Hydrogenate at room temperature under atmospheric pressure for 3 hours. Formaldehyde aqueous solution (37% by weight) 1
. 0 ml and 0.226 g of palladium on activated carbon were added. The mixture is brought to room temperature,
Hydrogenated at atmospheric pressure overnight. After filtration, the solvent was removed under vacuum. Residue, silica
Gel chromatography (ethyl acetate / isopropanol / triethylamine = 9
4: 5: 1) and 0.64 g of (S)-(MeTwoVal-Val-M
eVal-Pro-pyrrolidin-2-yl) -methylketone was obtained. FAB-M
S: (550.8 (M + H+)
1H-NMR (DMSO-d6, 270 MHz): δ = 0.7 (m, 6H), 0
. 8 to 1.0 (m, 12H), 1.75 to 2.05 (m, 7H), 2.0 (s,
3H), 2.2 (s, 6H), 2.6 (d, 1H), 3.05 (s, 3H), 3
. 55 (m, 1H), 3.7 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.5 to 4
. 6 (m, 2H), 4.95 (d, 1H), 8.05 (d, 1H) PPm.
[Example 4: 2-[(S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-P
Loridin-2-yl)]-5-phenyloxazole (compound III-12)
Configuration]
MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-OH (1.72 g, 3.8 mm
Mol) and 2- (pyrrolidin-2-yl) -4-phenyl-oxazole (0.
8 g, 3.8 mmol) in 40 ml of methylene chloride.
Cooled to ° C. Then, HOBT ・ HTwoO (0.5 g, 3.8 mmol) and E
DC.HCl (0.7 g, 3.8 mmol) followed by NMM (0.5 ml, 4 ml)
. 5 mmol) was added. After stirring overnight at room temperature, the reaction mixture was washed with 2N NaOH and
And washed with water. After drying over sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure.
The material was purified by chromatography on silica gel.
Yield: 1.85 g.
FAB-MS: 651 (M + H+).
The following compounds were prepared by the method described above:
I-5 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-pyrrolidine
-2-yl) butyl ketone, FAB-MS: 592.5 (M + H+)
I-12 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
-2-yl) methoxymethylketone, FAB-MS: 581 (M + H+)
I-14 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
N-2-yl) benzylketone, FAB-MS: 626 (M + H+)
I-15 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
-2-yl) phenylketone, FAB-MS: 612 (M + H+)
I-19 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
2-Nyl)-(4-trifluoromethylphenyl) ketone, FAB-MS:
680 (M + H+)
I-20 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
-2-yl)-(2-methoxyphenyl) ketone, FAB-MS: 642 (M
+ H+)
I-22 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
2--2-yl)-(4-methoxyphenyl) ketone, FAB-MS: 642.5
(M + H+)
I-32 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
2--2-yl)-(4-fluorophenyl) ketone, FAB-MS: 630.5
(M + H+)
I-37 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
N-2-yl)-(2,4-bis (methoxy) phenyl) ketone, FAB-MS
: 672 (M + H+)
I-39 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
N-2-yl)-(3,4,5-tris (methoxy) phenyl) ketone, FAB
-MS: 702 (M + H+)
I-49 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
2--2-yl)-(2-thiazolyl) ketone, FAB-MS: 619 (M + H+
)
I-54 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
-2-yl) -trifluoromethylketone, FAB-MS: 621.5 (M +
HThreeO+)
I-63 (S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-Pyrrolidi
Ethyl-2-oxo) -3-oxopropionate, FAB-MS: 622 (M +
H+)
I-79 N-benzyl- (S)-(4)-(MeTwoVal-Val-MeV
al-Pro-pyrrolidin-2-yl) -4-oxobutanoylamide, FAB
-MS: 711 (M + H+)
III-26 2 ---- [(S)-(MeTwoVa1-Val-MeVal-Pro-
Pyrrolidin-2-yl)]-4-methylthiazole, FAB-MS: 605 (M
+ H+)
III-28 2-[(S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-P
Loridin-2-yl)]-3,4-dimethylthiazole, FAB-MS: 619
(M + H+)
III-32 2-[(S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-P
Loridin-2-yl)]-5-tert-butylthiazole, FAB-MS: 6
47 (M + H+)
III-35 2-[(S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-P
Loridin-2-yl)]-4-phenylthiazole, FAB-MS: 667 (M
+ H+)
III-36 2-[(S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-P
Loridin-2-yl)]-5-phenylthiazole, FAB-MS: 667 (M
+ H+)
III-46 2-[(S)-(MeTwoVal-Val-MeVal-Pro-P
Loridin-2-yl)]-4-carbonylethoxythiazole, FAB-MS: 6
63 (M + H+)
The compounds listed in the following Tables 1 to 8 are based on the methods described above and the various outlined above.
Can be prepared as follows using the synthesis of the building blocks of
Compounds I-1 to I-103 and II-1 to II-103: pyrrolidinyl ketone and
Piperidinyl ketone;
Compounds III-1 to III-24 and IV-1 to IV-24: pyrrolidinyl oxazole
And piperidinyl oxazole;
Compounds III-25 to III-48 and IV-25 to IV-48: pyrrolidinyl thiazole
And piperidinylthiazole;
Compounds III-49 to III-72 and IV-49 to IV-72: pyrrolidinyl imidazo
And piperidinyl imidazole;
Compounds V-1 to V-24 and VI-1 to VI-24: pyrrolidinyl isoxazole
And piperidinyl isoxazole;
Compounds V-25 to V-48 and VI-25 to VI-48: pyrrolidinyl pyrazole
And piperidinyl pyrazole;
Compounds VII-1 to VII-9 and VIII-1 to VIII-9: pyrrolidinyl-1,3,4
-Oxadiazole and piperidinyl-1,3,4-oxadiazole;
Compounds VII-10 to VII-17 and VIII-10 to VIII-17: pyrrolidinyl-1
, 3,4-thiadiazole and piperidinyl-1,3,4-thiadiazole.
Table 1: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro and F
Formula IIf, AfIs 1 and the-(C = O) -G group is of the formula IIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom of
.
Table 2: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro, F is Formula I
If, AfIs 2 and the-(C = O) -G group is of the formula IIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom.
Table 3: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro, F is Formula I
IIf, G is of the formula VIIg, BfIs 1 and G is formula IIIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom.
Table 4: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro, F is Formula I
IIf, G is of the formula VIIg, BfIs 2 and G is formula IIIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom.
Table 5: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro, F is Formula I
IIf, G is the formula VIIIg, BfIs 1 and G is formula IIIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom.
Table 6: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro, F is Formula I
IIf, G is the formula VIIIg, BfIs 1 and G is formula IIIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom.
Table 7: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro, F is Formula I
IIf, G is the formula IXg, BfIs 1 and G force wipe IIIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom.
Table 8: A is MeTwoVal, B is Val, D is MeVal, E is Pro, F is Formula I
IIf, G is the formula VIXg, BfIs 2 and G is formula IIIfIs in the first position with respect to the nitrogen atom.
[Evaluation of biological activity]
In-tube method
Cytotoxicity can be measured using standard methods for adherent cell lines, such as microorganism culture.
It was measured using a tetrazolium assay (MTT). Of this assay
Details are given in the publications (Alley, M.C., et al., Cancer Research, 48
: 589-601, (1988)). Exponential growth medium for HT-29 colon cancer cells was
(microtiter) Used to generate plate cultures. Cells are 96-well play
5000-20,000 cells per 96-well plate (in 150 ml of medium)
Seeded. The test compound is diluted 10-fold,-FourM-10-TenVariable in the range of M
Was added. Thereafter, the cells were cultured for 48 hours. Can grow in each well
To determine cell numbers, the MTT dye (3- (4,5-dimethylthiazole-2-
Yl) -3 mg / ml salt of 2,5-diphenyltetrazolium bromide (sali
ne) solution (50 ml) was added. The mixture is incubated at 37 ° C. for 5 hours,
ml of 25% SDS, pH 2 was added to each well. After overnight culture, 55
The absorbance at 0 nm was read using an ELISA reader. Duplicate well data
The mean +/- SD value of the data was calculated using the formula% T / C (%: treated viable cells / control).
Calculated using The concentration of test compound at which T / C gives 50% growth inhibition is determined by the IC50
As shown.
Table 9 below shows the IC determined in the HT-29 cell line.50Shows the value of:
Table 9
In vivo methods
The compounds of the present invention can be used in a variety of preclinical assays for in vivo activity that have therapeutic potential.
Tested on either of the assays. Such assays may be used in tumor tissue, preferably
Was transplanted from a human source as is well known in the art (exogenous groups).
Performed using xenografted nude mice. Test compound
Has anticancer activity that leads to administration to xenograft-bearing mice
Evaluate for efficacy.
Compound I-15 listed above was used to screen for lymphocytic leukemia in P338 mice.
It was tested with the split model. P388 cells were transduced 7 days after transplantation by peritoneal perfusion.
The mice were harvested and the drug was administered intravenously for 5 consecutive days. Unprocessed (Uncured
The survival time of the mice in the (treatment) ranged from 11 to 13 days. The data below
It is shown in Table 9. Also, this data is expressed to mean survival (MS
T and increase in longevity compared to control as T / C% (treated cells /% control)).
National Cancer Institute Guidelines
According to the Institute guideline), T / C% of 128-190% is moderate
It shows good activity.
Table 10: Activity of compound I-15 on P338 mouse leukemia
In addition, human tumors grown in athymic nude mice were reduced to approximately 5 mm in size.
A 0 mg tumor piece can be used to implant a new recipient animal. Transfer
The day of planting was designated as day 0. Six to ten days later, mice are injected intravenously or intraperitoneally.
More treated with test compound. At that time, 5 to 10 mice were used for each dose.
I went. The compound is administered at a dose of 10-100 mg / k body weight,
They were given daily for 0 or 15 days. Measure tumor diameter and body weight twice a week
did. Tumor weights were measured directly using Vernier calipers.
Calculated using the diameter and the following formula:
(Length x widthTwo) / 2 = mg of tumor weight
The average tumor weight was calculated for each treatment group and the T / C value was calculated for each group.
Determined for untreated control tumors.
[Equivalent]
One of ordinary skill in the art will recognize, using merely routine experimentation, that certain aspects of the invention described herein may be used.
Many equivalents can be identified or confirmed. Such equivalents are
Included in the claims.
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(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
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W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM
,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,
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,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,
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G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,V
N,YU,ZW
(72)発明者 バルロッツァリ,テレサ
アメリカ合衆国、マサチューセッツ州
02181、ウェルズリー、サウス ウッドサ
イド アヴェニュー、24
(72)発明者 ハウプト,アンドレアス
アメリカ合衆国、マサチューセッツ州
01532、ノースバロー、キャサリン ドラ
イヴ、33
(72)発明者 ジャンセン,ベルント
アメリカ合衆国、マサチューセッツ州
01752、マールバロー、アップルブライア
ー レイン、114
(72)発明者 クリング,アンドレアス
ドイツ国、D―68239、マンハイム、リー
グラー、ヴェーク、14────────────────────────────────────────────────── ───
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, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM
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G, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT
, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL,
TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, V
N, YU, ZW
(72) Barrotzzari, Theresa
Massachusetts, United States
02181, Wellesley, South Woods
Id Avenue, 24
(72) Inventor Haupt, Andreas
Massachusetts, United States
01532, North Barrow, Catherine Dora
Eve, 33
(72) Inventor Jansen, Bernd
Massachusetts, United States
01752, Marlborough, Apple Briar
ー Rain, 114
(72) Inventor Cling, Andreas
Germany, D-68239, Mannheim, Lee
Grar, Wech, 14