JP2001517951A - Methods for identification and breeding of corn with increased grain oil concentration - Google Patents

Methods for identification and breeding of corn with increased grain oil concentration

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JP2001517951A JP54448798A JP54448798A JP2001517951A JP 2001517951 A JP2001517951 A JP 2001517951A JP 54448798 A JP54448798 A JP 54448798A JP 54448798 A JP54448798 A JP 54448798A JP 2001517951 A JP2001517951 A JP 2001517951A
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イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 高油トウモロコシ生殖質を用いる育種方法が開示される。当該方法は穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座に関連する遺伝標識形質の使用を必要とする。これらの遺伝標識形質は育種集団で穀粒油濃度について選抜するのに使用される。おそらく、優れた子孫を生産する遺伝標識形質を使用する相補的な油の親供給源の選抜方法もまた開示される。トウモロコシの穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座もまた開示される。   (57) [Summary] Breeding methods using high oil corn germplasm are disclosed. The method requires the use of genetic marker traits associated with trait loci that control kernel oil concentrations. These genetic marker traits are used to select for grain oil concentrations in the breeding population. A method for selecting a complementary oil parent source, possibly using genetic marker traits that produce superior progeny, is also disclosed. A trait locus that controls corn kernel oil levels is also disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】 増大された穀粒油濃度を有するトウモロコシの同定および育種方法 発明の分野 本発明は植物育種および分子生物学の分野にある。より具体的には、本発明は 、遺伝標識形質を使用する増大された穀粒(kernel)油濃度を与えるトウモロコシ 遺伝子座の同定ならびに増大された穀粒油濃度のトウモロコシの同定および育種 に対する補助としての遺伝標識形質の使用に関する。 発明の背景 トウモロコシは人間の食糧源、動物飼料、ならびに炭水化物、油、タンパク質 および繊維の供給源として使用される主要作物である。それは主として動物飼料 中のエネルギー源、もしくはデンプン、タンパク質飼料(feed)画分、繊維、側面 粗碾きトウモロコシ(flanking grits)、小麦粉および油の回収の原料として使用 される。 米国中で生産される大部分の商業的トウモロコシは雑種の種子から生産されて いる。トウモロコシ雑種の生産は、相互交配(intermating)に際して作物学上優 れた雑種を生じる選り抜きの(elite)トウモロコシ近親交配体(inbred)の開発を 必要とする。トウモロコシ近親交配体の開発の間に、植物育種者は作物学的性能 に影響を及ぼす多数の異なる形質について選抜する。これらの形質は、茎の強さ 、倒伏(lodging)、病害抵抗性、穀粒(grain)水分および穀粒収量を包含するがし かしこれらに制限されない。作物学的形質は独立よりむしろ連続的な分布で定量 的に測定される傾向がある。量的形質は小さくかつ一般に同等な影響をもついく つかの遺伝子により制御されると理論化される。さらに、観察される 表現型は部分的にこの遺伝成分および環境成分による。 ある形質の遺伝率は、広い意味で、全体的な表現型の変動に対する遺伝子の変 動の比と定義される。多くの作物学的形質は低遺伝率を表わす;すなわち親植物 の能力は子孫(offspring)の能力の不十分な予言者(predictor)である。従って、 低遺伝率の形質は観察された変異に比較して小さな遺伝子変動成分を有する。植 物育種者に対する影響は、育種集団においてある植物の遺伝子組成の値が作物学 的形質測定から決定することが困難であることである。それらの識別能力を最大 にする試みにおいて、育種者は、系統(descent)により関連付けられる個体およ び多くの環境の双方から複数の測定値を収集する。この戦略は資源を集約的に用 いる。なぜならそれは植物改良の小さな利益さえなすための広範囲の試行の使用 を伴うからである。これは、改良されたトウモロコシの系統(line)が複数の形質 について同時に選抜されるという事実と一緒にされて、優れたトウモロコシ近親 交配体の開発を時間のかかるおよび高価の双方の仕事にする。 トウモロコシ育種プログラムにおける新規形質の付加は植物育種者にさらなる 負担を負わせる。新規形質の遺伝子の複雑さに依存して(すなわち単一遺伝子対 多くの遺伝子)、時間および努力の有意の増大が新規形質を含有する選り抜きの 系統を生じるのに必要とされる。こうした1つの形質が穀粒油濃度である。 増大された穀粒油濃度のトウモロコシは、それが家禽類(ハン(Han Y.)ら(198 7)Poultry Sci.66:103-111)および家畜(ノルトシュトロム(Nordstrom,J.W.) ら(1972)J.An.Sci 35(2):357-361)について改良された飼料価値を保有する ため重要である。慣習的トウモロコシ雑種 からの穀粒は典型的には4%の油を含有する。穀粒油濃度を増大させる努力にお いては、長期の繰り返し選抜プログラムが、1896年にホプキンス(C.G.Hopkins) により自然受粉された転換(cv.)バーズホワイト(Burr's White)で開始された 。イリノイ ハイ オイル(Illinois High Oil)(IHO)として知られるこの 繰り返して選抜された集団は、90を超える世代の間、改変集団選抜を使用して増 大された油濃度について選抜されている(ダッドリー(Dudley,J.W.)とランバー ト(R.J.Lambert)(1992)Maydica 37:1-7)。結果として油濃度はこの集団で20 %を上回って増大した。生殖質はほとんど使用されなかった。なぜなら、誘導さ れた素材(material)は慣習的品種より本質的により低い収量を有したからである (アレキサンダー(Alexander,D.E.)(1988)Proc.43rd Ann.Corn and Sorghu m Res.Conf.Am.Seed Trade Assoc.、ワシントンDC pp97-105中)。 38種の自然受粉された栽培品種および合成種(synthetic)を使用して、アレキ サンダー(Alexander)は、穀粒油を増大させるための第二の繰り返し選抜プログ ラム(アレクスホー(Alexho)合成体)を開始した(アレキサンダー(Alexander, D.E.)(1988)Corn and Corn Improvement.シュプラーク(G.F.Sprague)とダッ ドリー(J.W.Dudley)編 アメリカ作物学会(American Society of Agronomy)、ウ ィスコンシン州マディソンPp869-880中)。IHOと同等の油濃度が、単一雌穂 の油濃度を基礎としそして後の世代では単一穀粒の油濃度を基礎とした選抜を使 用した28周期で達成された。単交雑雑種(single cross hybrid)(高油近親交配 体×慣習的近親交配体)における、アレクスホー(Alexho)から誘導された素材の 収量能力は、おそらく当初利用可能なより大きな遺伝的変異性によ りIHOを上回って改良されるとは言え、能力は慣習的雑種と同等でなかった。 増大された穀粒油濃度もまた含有する作物学的に選り抜きのトウモロコシ生殖質 の開発は明らかに慣習的植物育種方法を使用する挑戦である。 穀粒油濃度は多様な分析方法を使用して表現型的に測定され得る。油濃度は、 いくつかの遺伝子座により制御される定量的に遺伝される形質に共通の非離散(n on-discrete)分布を表わす。穀粒油測定は最高の表現型発現を伴う育種系統を選 抜する。不幸なことに、高油についての遺伝的潜在能力(genetic potential)は これらの系統の大部分で制限される。なぜならそれらの真の遺伝子組成を基礎と して系統を識別することが不可能であるからである。この状況は作物学的性能に ついての同時の選抜が実施される場合にさらに悪化される。従って、選抜を集団 中の植物の遺伝子型に基づかせることが有利であるとみられる。遺伝標識形質、 とりわけ核酸標識が、複雑な量的形質についての間接的選抜方法として利益を得 る(advantage)のに使用されるかも知れない。増大された油を与える対立遺伝子 を同定する遺伝標識形質は、従って、選り抜きの高油トウモロコシ生殖質を開発 する植物育種プログラムに有利な道具であるとみられる。 増大された油収量を予測する遺伝標識形質の同定に関する刊行された情報は制 限される。カーラー(Kahler)(カーラー(Kahler,A.L.)(1985)Proc.40th Ann .Corn and Sorghum Res.Conf.Am.Seed Trade Assoc.、ワシントンDC pp66 -89中)は、アレクスホー(Alexho)合成体での25周期の選抜後のアイソザイムの 対立遺伝子の頻度の変化を測定し、そして8個の有意の遺伝子座を見出した。こ れらの対立遺伝子の頻度の変 化の大部分は無作為の遺伝的浮動を測定する試験についてもまた有意であり、こ れらのアイソザイムの対立遺伝子を基礎とした選抜が有用であるとみられると結 論することを困難にした。より最近、ゴールドマン(Goldman)ら(ゴールドマン( Goldman,I.L.)ら(1994)Crop Sci.34:908-915)およびベルケ(Berke)とロッ クフォード(Rocheford)(ベルケ(Berke,T.G.)とロックフォード(Rocheford,T. R.)(1995)Crop Sci.35:1542-1549)は、RFLP標識を使用してイリノイ長 期選抜集団(Illinois long-term selection population)で油濃度に関連した有 意の標識遺伝子座を同定した。これらの研究は、増大された油と有意に関連した バーズホワイト(Burr’s White)由来の集団でそれぞれ25および31種の標識を同 定した。有意のRFLP標識遺伝子座により同定される領域のいくつかはこの2 研究の間で共通であるかも知れないが、しかしながら双方の研究で使用された15 種のRFLP標識のうち6種は油濃度に対するそれらの影響に関して不一致であ った。これらの研究では、使用された集団は共通の祖先(バーズホワイト(Burr ’s White))由来であったが;しかしながら、これらの集団は多くの世代にわ たって異なる形質(油およびタンパク質)について選抜された。多くの同定され た油遺伝子座が分析された各集団に独特であるとみられることは驚くべきことで ない。従って、育種プログラムで使用されている生殖質を独特に予測する遺伝標 識形質を同定することが望ましい。 発明の要約 増大された穀粒油濃度のトウモロコシについて信頼性がありかつ予想どおりに 育種するための方法が開示される。当該方法は、a)標識補助選抜(marker-assi sted selection)により一トウモロコシ育種集団から あるトウモロコシ植物を選抜するのに1種もしくはそれ以上の遺伝標識形質を使 用すること(ここで、遺伝標識形質は、s1375、s1384、s1394、 s1416、s1422、s1432、s1457、s1480、s1476、 s1478、s1484、s1500、s1513、s1529、s1544、 s1545、s1630、s1633、s1647、s1750、s1756、 s1757、s1767、s1772、s1774、s1780、s1797、 s1813、s1816、s1817、s1836、s1853、s1860、 s1870、s1921、s1922、s1925、s1931、s1933、 s1939、s1946、s1949、s2054、s2055、s2057、 s2058、s2097、s2122、s2125、s2150、s2156お よびs2175から成る群から選択されるものである);そしてb)選抜された トウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物と交雑すること(ここで交雑の後代 (progeny)は増大された穀粒油濃度を表わすものである)、を含んで成る。高油 トウモロコシ生殖質の好ましい供給源(source)はアレクスホー(Alexho)合成体集 団の構成員もしくはその子孫である。 育種集団の創製に親としての使用するためのトウモロコシ植物もしくはトウモ ロコシ系統の同定方法もまた開示され、当該方法は、a)1種もしくはそれ以上 の遺伝標識形質でトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ系統の遺伝子型を決定 すること(genotyping)であって、ここで、遺伝標識形質は、s1375、s13 84、s1394、s1416、s1422、s1432、s1457、s14 80、s1476、s1478、s1484、s1500、s1513、s15 29、s1544、 s1545、s1630、s1633、s1647、s1750、s1756、 s1757、s1767、s1772、s1774、s1780、s1797、 s1813、s1816、s1817、s1836、s1853、s1860、 s1870、s1921、s1922、s1925、s1931、s1933、 s1939、s1946、s1949、s2054、s2055、s2057、 s2058、s2097、s2122、s2125、s2150、s2156お よびs2175から成る群から選択され;そしてb)穀粒油濃度についての超越 分離体を生じることがそれらの遺伝子型を基礎として予測されるトウモロコシ植 物もしくはトウモロコシ系統を同定すること、を含んで成る。 本発明は、増大されたトウモロコシ穀粒油濃度を制御する遺伝子の同定および これについての選抜の方法を提供する。これらの油対立遺伝子は、当初、アレク スホー(Alexho)合成体育種集団から構成されるかもしくはこれに由来する素材で 同定された。さらに、当該方法は、新たな高油トウモロコシ生殖質を開発すると いう目的の育種プログラムにおけるこの高油素材の使用を容易にする。 とりわけ、当該方法は、トウモロコシ育種プログラムで系統の油育種価(oil b reeding value)を予測するのに遺伝標識形質を使用する。これらの標識を使用す る油遺伝子座の間接的選抜により、増大された穀粒油濃度について最大の遺伝的 潜在能力をもつ系統が選ばれる。 当該方法に従えば、いずれかの型の遺伝標識形質が穀粒油濃度との関連を同定 するのに使用されてよい。当該方法は与えられた標識遺伝子座での多形を測定す る能力により制限されるのみである。当業者は、使用されうる多様な遺伝標識形 質は、制限断片長多形(RFLP)、無作為 増幅多形(random amplified polymorphic)DNA(RAPD)、単純配列反復( SSR)、AFLP、多様な単一塩基対検出方法、アロザイムおよび表現型標識 を包含するがしかしこれらに制限されないことを認識することができる。本方法 の実務で有用なSSR標識は、s1375、s1384、s1394、s141 6、s1422、s1432、s1457、s1476、s1478、s148 0、s1484、s1500、s1513、s1529、s1544、s154 5、s1630、s1633、s1647、s1750、s1756、s175 7、s1767、s1772、s1774、s1780、s1797、s181 3、s1816、s1817、s1836、s1853、s1860、s187 0、s1921、s1922、s1925、s1931、s1933、s193 9、s1946、s1949、s2054、s2055、s2057、s205 8、s2097、s2122、s2125、s2150、s2156およびs2 175を包含する。 本発明のさらなる一態様は、トウモロコシ穀粒油濃度の発現を制御する形質遺 伝子座である。これらの遺伝子座は本発明の標識遺伝子座により同定されかつ定 義される(すなわち染色体上に位置づけられる)。 本発明の付加的な一態様は、本育種方法を使用して生産されるトウモロコシ植 物および高油トウモロコシ生殖質である。 発明の詳細な記述 表1は本発明の一部を形成する遺伝標識形質の簡潔な記述を提供する。各標識 は、トウモロコシゲノムの特定の標識遺伝子座の増幅を助長するその構成核酸プ ライマー(順(forward)および逆(reverse))により定義される。各配列に必要と される識別記号(identifier)もまた示される。 表1に列挙される識別記号は、連邦規則集第37条§1.821以下参照により 要求されるような配列表(以下)に列挙されるものに対応する。 本発明の目的上われわれは以下の用語を定義する。すなわち、 トウモロコシ。トウモロコシ(Zea mays L.)のいずれかの品種、栽培品種もし くは集団。 選り抜きの。この用語は、高収量、良好な穀粒品質および病害抵抗性のような しかしこれらに制限されない好都合な形質を保有する植物もしくは品種の特徴を 述べる。これは、儲ける(at a profit)種子もしくは穀粒の商業的生産でのその 使用を可能にする。この用語はまた、こうした植物もしくは品種を生じさせる親 の特徴も述べる。 高油トウモロコシ生殖質。この用語は、多様な他配(outcrossing)の組み合わ せで雄性もしくは雌性のいずれかの親として自家受粉されるもしくは使用される のいずれかの場合に、非高油生殖質により生じられる穀粒と比較される場合に増 大された油を伴う穀粒を生じるトウモロコシ植物の特徴を述べる。高油トウモロ コシ生殖質の例は、自然受粉された変種(varieties)、雑種、合成体、近交系、 品種(races)および集団もしくは上述の一由来のトウモロコシ植物を包含するが しかしこれらに制限されない。 品種もしくは栽培品種。これらの用語は、構造的特徴および性能により同一種 内の他の変種もしくは栽培品種から同定され得る一群の類似の植物を指す。 系統。この用語は共通の祖先からの一群の個体;変種より狭く定義された一群 を指す。 合成体。この用語は、近親交配体、雑種、変種(varieties)、集団、品種(race s)もしくは他の合成体のいずれかの組み合わせの相互交配により創製された既知 の祖先の植物の遺伝的に不均一な収集物を指す。 近親交配体。この用語は本質的にホモ接合性の個体、品種もしくは系統を指す 。 組換え近親交配体。完全なホモ接合性が近づけられるまで各世代を反復して自 家受粉させることにより開発された、独立して生じられた系統の一集団。各組換 え近親交配体は単一種子系統(single seed descent)と普遍的に称される育種方 法を使用して単一のF2植物から生じられる。 育種。制御された遺伝子操作によりある種の植物もしくは動物を改良する技術 および科学。 標識補助選抜。優れた表現型の潜在能力をもつ植物を同定かつ選抜するための 遺伝標識形質の使用。1個の形質遺伝子座もしくは形質遺伝子座類に関連するこ とが前に決定された遺伝標識形質(1種もしくは複数)が、標識遺伝子座と形質 遺伝子座との間の連鎖によって形質遺伝子座での遺伝子型を明らかにするのに使 用される。所望の形質の対立遺伝子を含有する植物が、連結された(linked)標識 遺伝子座でのそれらの遺伝子型を基礎として選ばれる。 アレクスホー(Alexho)合成体。イリノイ大学(University of Illinoi s)でアレキサンダー(Denton Alexander)により開発された、繰り返し選抜された 高油トウモロコシ生殖質。アレクスホー(Alexho)合成体高油トウモロコシ生殖質 は、繰り返し選抜育種プログラムの前進のそれらの周期により定義される複数の 合成体集団から構成される。 育種集団。所望の表現型の特徴をもつ1種もしくはそれ以上の個体を同定する という目的上創製された植物の遺伝的に不均一な収集物。 表現価。1種もしくはそれ以上の植物の特徴の観察される発現。 表現型価。ある形質遺伝子座でのある対立遺伝子の期待される発現の尺度。あ る形質遺伝子座でのある対立遺伝子の表現型価は代替の対立遺伝子に比較してそ の発現の強さに依存性である。個体の表現型価、そしてこれゆえにその表現型の 潜在能力は、与えられた形質についての全遺伝子座でのその全体の遺伝子型組成 を基礎とする。 超越分離体。その表現型が親により予測される表現型の変異を超える個体。 遺伝標識形質。DNA多形を示すいずれかの形態学的、生化学的もしくは核酸 を基礎とした表現型の差異。遺伝標識形質の例は、RFLP、RAPD、アロザ イム、SSRおよびAFLPを包含するがしかしこれらに制限されない。 標識遺伝子座。遺伝標識形質により示されるようなDNA多形の遺伝子的に特 定された位置。 形質遺伝子座。観察される特徴に寄与する1個もしくはそれ以上の遺伝子(対 立遺伝子)の収集物についての遺伝子的に特定された位置。 遺伝子型。研究中の遺伝子座(genetic loci)でのある個体の対立遺伝子組成。 制限断片長多形(RFLP)。制限エンドヌクレアーゼで生じるDNA断片の 大きさの差異がハイブリダイゼーションを介して観察される、DNAを基礎とし た遺伝標識形質(ボトシュタイン(Botstein,D.)ら1980.Am.J.Hum.Genet.3 2:314-331)。 無作為増幅多形DNA(RAPD)。短い、配列が自由裁量のプライマーが使 用され、そして生じる増幅産物が大きさで分離されかつ増幅パターンの差異が観 察される、DNA増幅を基礎とした遺伝標識形質(ウィリアムス(Williams J.G. K.)ら1990.Nucleic Acids Res.18:6531-6535)。 単純配列反復(SSR)。縦列に反復される配列モチーフの短い伸長(streche s)が増幅され、そして生じる増幅産物が大きさで分離されかつヌクレオチド反復 の長さの差異が観察される、DNA増幅を基礎とした遺伝標識形質(タウツ(Tau tz D.)1989.Nucleic Acids Res.112:4127-4138)。 AFLP。制限エンドヌクレアーゼで生じるDNA断片が、制限された(restr icted)DNA断片の増幅を助長する短いDNA断片に連結される、DNA増幅を 基礎とした遺伝標識形質(フォス(Vos,P.)ら1995.Nucleic Acids Res.23:440 7-4414)。増幅された断片が大きさで分離されかつ増幅パターンの差異が観察さ れる。 アロザイム。電気泳動的に分離されかつ酵素活性についての染色を介して検出 される酵素異型(シュトゥーバー(Stuber,C.W.)とグッドマン(M.M.Goodman)。 1983.USDA Agric.Res.Results、Southern Ser.、No.16)。 本発明は、遺伝標識形質の使用による穀粒油濃度を制御する形質遺伝 子座の発見に関する。穀粒油濃度および遺伝標識形質の対立遺伝子の双方につい ての変異が存在する集団において、油の測定および標識を基礎とした遺伝子型を 集団の構成員について生じさせた。最小二乗法を使用して、油濃度の遺伝子座の 位置をこれらの形質遺伝子座に遺伝子的に連鎖される標識に関して決定した。好 ましい油遺伝子座の間接的選抜を、今や1個もしくはそれ以上の連鎖された遺伝 標識形質での情報を使用して実施することができる。選抜されたトウモロコシ植 物は高油の表現型をコードする1個もしくはそれ以上の対立遺伝子を含んで成る 。 いくつかの異なる集団および集団型が目的の形質遺伝子座の位置を突き止める のに使用され得ることが認識されている。集団型のいくつかは、組換え近親交配 体、戻し交雑体、F2またはそれらの自家受粉されたもしくは相互交配された派 生物、および合成体を包含するがしかしこれらに制限されない。さらに、集団内 の表現型および遺伝子型の変異の測定に対する一代替は集団間の遺伝子型および 表現型の測定であることが理解される。この代替において第二集団は第一集団の 選抜された派生物であり、選抜は目的の形質(表現型選抜)もしくは特定の標識 対立遺伝子(遺伝子型選抜)のいずれかに対してである。代替の統計学的アプロ ーチが標識遺伝子座と形質遺伝子座との間の連鎖関係を決定するのに使用されう ることもまた当業者により認識される。 実施例 本発明は以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明 の好ましい態様を示しつつ、具体的な説明のみとして示されることが理解される べきである。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須の特徴 を確かめ得、また、その技術思想および範囲か ら離れることなく本発明の多様な変更および改変をなしてそれを多様な使用法お よび条件に適合させ得る。 実施例1 増大された穀粒油濃度を与える遺伝子座の位置 集団の発育および形質の測定 ホールデンズ ファウンデーション シード カンパニー(Holden’s Foundat ion Seed Co.)、アイオワ州ウィリアムスバーク、により開発された2種の近親 交配トウモロコシ系統、LH119wxおよびLH51を、合成体集団ASKC 28wx(アメリカン タイプ カルチャー コレクション(American Type Cul ture Collection)、メリーランド州ロックヴィル、に寄託された;受託番号AT CC 75105)(蝋質の穀粒がASKC28において高度に表わされ、そし て、その意味において私はASKC28を蝋質であると呼称した)からの個体植 物と独立して相互交配した。F1植物を自家受粉させ、そして生じるF2集団を 成長させた。個々のF2植物を自家受粉させ、そして生じられた穀粒を、6世代 の自家受粉による単一種子系統(S6)を使用して成長させて組換え近交系を生 じさせた。S6世代からの20個までの穀粒を成長させかつ自家受粉させて各組換 え近交系を表わすS7雌穂の一族を生じさせた。油価を、近赤外透過率(ウィリ アムズ(Williams,P.C.)(1987)Near Infrared Technology in the Agricultur al and Food Industries;ウィリアムズ(P.C.Williams)とノリス(C.Norris)編 アメリカ穀物化学者協会(American Association of Cereal Chemists)中)を使 用して一族内の各雌穂について測定した。 遺伝子型の決定 194種(LH119wx×ASKC28wx)もしくは204種(LH51×AS KC28wx)の組換え近交系のそれぞれを表わす単一雌穂からの10個の種子を 濡らされた濾紙上で発芽させた。根区分を発芽された種子から摘出し、各雌穂に ついてプールし、そして自動化DNA抽出機械を使用して抽出した。この機器は マーレイ(Murray)とトンプソン(Thompson)のCTAB処置(マーレイ(Murray,M .G.)とトンプソン(Thompson,W.F.)(1980)Nucl.Acids Res.8:4321-4325)の 変法を使用する。DNAサンプルを、ヨウ化YoPro−1(商標)(モレキュ ラー プローブス インク(Molecular Probes,Inc.)、オレゴン州ユージーン) を使用して蛍光を介して定量し、そして4μg/mlに希釈した。 各DNAサンプルのSSR領域を以下のプロトコルを使用して分析した。すな わち 1.10μlの増幅カクテル(表2を参照)を5μl(20ng)の抽出されたDNAに 添加し; 2.増幅カクテル中に存在するプライマーに相補的な配列により隣接されたDN A断片を、以下のプロトコルすなわち 1)45周期の95℃で50秒、54℃で50秒そして72℃で80秒、および2)1周期の72 ℃で300秒、 を使用するPCR(米国特許第4,683,202号および米国特許第4,68 3,195号)により増幅し; 3.各サンプルのおよそ8μlを、2%メタフォア(Metaphor)(FMCコーポレ ーション(FMC Corp.)、メーン州ロックランド)、1×TBEおよび0.5μg/ml臭 化エチジウムから構成されるアガロースゲル上に負荷し、そして1×TBE緩衝 液および0.5μg/ml臭化エチジウムを添 加した水平電気泳動装置中6.1V/cmで2時間電気泳動し;そして 4.DNAバンドをUV蛍光により可視化した。油遺伝子座の位置推定 133個の多形SSR標識遺伝子座を使用してLH119wx×ASKC28w x交雑からの組換え近親交配体を遺伝子型分類し、また、103個の多形SSR標 識遺伝子座を使用してLH51×ASKC28wxから生じられた集団を遺伝子 型分類した。加えて、前に確立された染色体位置をもちかつ全10個のトウモロコ シ染色体を包括する20個の公的に入手可能な多形SSR遺伝子座(リサーチ ジ ェネティックス(Research Genetics)、アラバマ州ハンツヴィル、から入手可能 )もまた双方の集団で染色体上に位置づけた。 遺伝子連鎖および標識遺伝子座間の距離を、マップメーカー(MAPMAKER)3.0 (リンカーン(Lincoln,S.E.)ら(1993)Whitehead Inst.Biomed.Res.、マサ チューセッツ州ケンブリッジ)を使用して各集団につ いて独立に決定した。これは、トウモロコシの10個の染色体に対応する各集団の 10個の連鎖群の確立をもたらした。各連鎖群を公的なSSR標識に対する連鎖を 基礎として1個の染色体に割り当てた。LH119wx×ASKC28wxおよ びLH51×ASKC28wx集団におけるそれぞれ23および10種の標識は、遺 伝子連鎖が明瞭に確立され得なかったため、染色体位置を割り当てられなかった 。 分散分析を使用して、増大された油濃度を与える形質遺伝子座との連鎖にある 標識遺伝子座を同定した。油濃度を独立変数として使用し、また、独立した(sep arate)ANOVAを、単一の従属変数として各標識遺伝子座を使用するSAS Proc GLM(SAS Inst.、ノースカロライナ州ケイリー)を用いて算出した (エドワーズ(Edwards,M.D.)ら(1987)Genetics 116:113-125)。従って、各 ANOVA検定について標識対立遺伝子分類の平均油値を比較した。標識遺伝子 座はp<0.05の場合に有意と宣言した。 有意の標識遺伝子座の連鎖のデータを検査して存在する形質遺伝子座の数およ びそれらのありそうな位置の双方を決定した。同一連鎖群の有意の標識遺伝子座 は、同一の形質遺伝子座を検出しているかもしくは二者択一的に異なる形質遺伝 子座であるかいずれかである。染色体に沿った各標識遺伝子座により説明される 表現型の変異の慎重な検査により、連鎖群の形質遺伝子の数の決定を行った。同 一連鎖群上でかつ有意でない標識遺伝子座により中断される有意の標識遺伝子座 を、染色体上の同一の形質遺伝子座を検出していると宣言した。同一染色体上の 有意の標識遺伝子座が有意でない標識遺伝子座により中断された場合には、各有 意の領域を、同一染色体上で複数の形質遺伝子座をもたらす1個の形質 遺伝子座を含有すると宣言した。 形質遺伝子座の数を確認するため、連鎖群に割り当てられた標識のデータおよ び油のデータをマップメ-カー(MapMaker)/QTL1.0(リンカーン(Lincoln ,S.E.)ら(1990)Whitehead Inst.Biomed.Res.、マサチューセッツ州ケンブ リッジ)を用いてもまた分析した。マップメーカー(MapMaker)/QTLでの結果 は各染色体上の形質遺伝子座の数についての最初の分析と一致した。 穀粒油濃度を制御する11個および12個の遺伝子座が、それぞれLH119wx ×ASKC28wxおよびLH51×ASKC28wxの組換え近親交配体集団 中で位置を突き止められた。各油遺伝子座は1個もしくはそれ以上の連鎖された 標識遺伝子座により定義される。 同一の標識遺伝子座が双方の集団で使用された場合には連鎖群の整列が可能で ある。大部分の場合に双方の集団が同一の油遺伝子座を局在化したことが見出さ れた。共通の標識遺伝子座を考慮することにより、穀粒油濃度を制御する全体で 17個の遺伝子座を見出した。各油遺伝子座に自由裁量の文字の呼称を割り当てた (表3)。 比較がなされ得た場合には、1集団で同定された油遺伝子座は第二集団で同一 位置で同定された。2個の例外では1個の油遺伝子座が1集団で見出されたがし かし第二集団では見出されなかった。第一の場合には、正の油の影響をもつ対立 遺伝子がLH51中に見出され、そして従ってLH119wx×ASKC28w x集団中の同一の遺伝子座を同定することは予期されないことであったであろう 。第二の場合には、多様なASKC28wxから誘導された標識対立遺伝子が集 団中で分離していたことが見出され;従って、各集団はこの形質遺伝子座での異 なるASKC28wx対立遺伝子の油の影響を測定していた。LH119wx× A SKC28wx中で分離する最も豊富なASKC28wxの油対立遺伝子は代替 のLH119から生じられた対立遺伝子に対して正の油の影響を有した一方、L H51×ASKC28wx集団では、豊富なASKC28wx対立遺伝子は正の 油の影響を有しなかった。標識s1480に連結された油遺伝子座を除けば、油 濃度に対する正の影響をもつ全対立遺伝子はASKC28wx由来であった。 実施例2 増大された穀粒油濃度の遺伝標識形質を使用する育種系統の標識補助選抜 油の形質遺伝子座との連鎖にある遺伝標識形質の遺伝子座は油濃度を高度に予 測し、そして、その意味で標識補助選抜プログラムで穀粒油の間接的測定値とし て使用できる。従って、連鎖された標識遺伝子座からの遺伝子型の情報は増大さ れた油濃度の育種系統の選抜を助長するとみられる。直接の油測定は同等な表現 型の影響をもつ多様な遺伝子型の形質遺伝子座の組成を識別し得ない。これは、 油遺伝子座の制限された固定のみが起こった育種集団を早期に世代分離すること においてとりわけ問題である。 例として、トウモロコシ育種プログラムの一目的は、増大された穀粒油濃度を 与える形質対立遺伝子を含有する新たな選り抜きの近交系の創製であり得る。こ れらの形質対立遺伝子は1種もしくはそれ以上の選り抜きのトウモロコシ近親交 配体との高油生殖質の相互交配により導入されるとみられる。結果として生じる 雑種は、慣習的な系統(pedigree)育種プログラムを開始するという目的上、F2 集団を生じさせるよう自家受粉され得る(アラード(Allard,R.W.)(1960)Prin ciples of Plant Breeding.ジョン ワイリー アンド サンズ インク(John Wiley & Sons,In c.)、ニューヨーク。Pp115-128)。 所望の遺伝子型をもつF2個体を同定するために、植物組織を集団中の各F2 個体から収集しそして表1に列挙されるSSR標識遺伝子座を用いて遺伝子型を 決定することができた。高油の供給源由来のSSR標識対立遺伝子の最高頻度の F2個体を選抜しそしてそれらの作物学的適合性を基礎としてさらに選別するこ とができた。継続された近親交配および分離で、ヘテロ接合状態の油遺伝子座が 高油もしくは低油のいずれかの対立遺伝子について固定されたようになり得た。 従って、後の世代の素材の遺伝子型の決定および選抜が、それらの標識対立遺伝 子、そしてこれゆえに油対立遺伝子の組成を基礎として育種系統をさらに分離す るために実施されうるとみることができる。 集団の大きさおよび思いがけないものを偶然に発見する能力に依存して、系統 育種プログラムからの生じる近親交配体は十分な作物学的競合性もしくは十分な 穀粒油発現を立証しないかも知れない。なぜなら不十分な数の油対立遺伝子が回 収されたからである。これらの新たな近親交配体は従って親素材として使用され 得、そして新たな育種プロジェクトが開始され得る。SSR標識は、再度、記述 されたとおり油のさらなる選抜に使用され得る。 選抜の方法論に対する多くの変形が予見されるであろうことが当業者に明白で ある。選抜は、ある集団に存在する形質の油遺伝子座を同定する1種もしくはそ れ以上の標識遺伝子座の対立遺伝子組成を基礎とするとみられる。さらなる選抜 が、個体植物、一族もしくはそれらの子孫からの遺伝子型の検査および選抜によ り実施されるとみられる。多様な予 測モデルが遺伝子型情報を使用して開発され得、これは多様な選抜指数を生じさ せ得る。これらのモデルは標識遺伝子座により予測される影響の重み付け(weigh ting)を可能にするとみなせる。これは、個々の標識遺伝子座の予測値が、対応 する形質遺伝子座からのその遺伝距離ならびにその形質遺伝子座の表現度に依存 性であるからである。表現型を基礎としたおよび遺伝子型を基礎とした選抜を組 み合わせる選抜戦略もまた予見されるかも知れない。 ここで提示される標識遺伝子座はアレクスホー(Alexho)合成体集団中の油遺伝 子座を予測する。ASKC28wxは遺伝的に閉鎖された集団の28番目の油の育 種周期を表わすため、より早期の育種周期は同一の油遺伝子座から構成される。 周期は、同定された油遺伝子座でのそれらの対立遺伝子頻度で単純に異なること が期待される。従って、より早期のアレクスホー(Alexho)周期から生じられた育 種集団では、本発明に記述される標識遺伝子座が油遺伝子座の同定および油濃度 の予測で有用であろう。 実施例3 穀粒油濃度についての超越分離体の産生のための親としての使用のためのトウモ ロコシ植物の同定 親として使用される場合に優れた能力をもつ子孫を生産する最大の可能性を有 するトウモロコシ植物および系統を同定することが重要である。こうした親の超 越分離体の子孫(offspring)は、高油の表現型を与える対立遺伝子の補足的な(co mplementary)組との親の交雑から生じるとみられる。本明細書に提供される情報 を使用すれば、与えられた標識遺伝子座での所望の形質の性能(すなわち高油) を予測する標識対立遺伝子 が知られる。それらの標識遺伝子座で系統を遺伝子型分類することにより、親と してのそれらの系統の値が示される。例えば、5個の独立した油遺伝子座(A〜 E)で優れた対立遺伝子を含有する個体を創製することを欲する場合は、遺伝子 座A、BおよびCの所望の対立遺伝子から構成される親を同定することができ、 そしてB、DおよびEでの所望の対立遺伝子から構成される親と交雑することが できる。これらの親は、それらが全5個の遺伝子座で所望の対立遺伝子を含有す る後代(progeny)の回収を可能にするため、補足的である。理想的には、組み合 わせられる場合に遺伝子座の最大の補足性(complemantation)を確実にする親が 選ばれるとみられ、その結果高頻度の所望の組換え体が回収される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Methods of Identifying and Breeding Maize with Increased Grain Oil Concentration Field of the Invention The present invention is in the field of plant breeding and molecular biology. More specifically, the present invention relates to the identification of corn loci that provide increased kernel oil concentrations using genetic marker traits and as an aid to the identification and breeding of corn with increased kernel oil concentrations. For the use of genetic marker traits. BACKGROUND OF THE INVENTION Corn is a major crop used as a source of human food, animal feed, and a source of carbohydrates, oils, proteins and fibers. It is used primarily as an energy source in animal feed or as a raw material for the recovery of starch, protein feed fractions, fiber, side-milled corn, flaking grits and oil. Most commercial corn produced throughout the United States is produced from hybrid seed. The production of maize hybrids requires the development of elite maize inbreds that yield excellent agronomic hybrids upon intermating. During the development of maize inbreds, plant breeders select for a number of different traits that affect agronomic performance. These traits include, but are not limited to, stem strength, lodging, disease resistance, grain moisture and grain yield. Cropological traits tend to be measured quantitatively in a continuous rather than independent distribution. It is theorized that quantitative traits are controlled by several genes that are small and generally have equivalent effects. Furthermore, the phenotype observed is due in part to this genetic and environmental component. The heritability of a trait is broadly defined as the ratio of genetic variation to overall phenotypic variation. Many agronomic traits exhibit low heritability; that is, the ability of the parent plant is a poor predictor of offspring ability. Thus, low heritability traits have a small genetic variation compared to the observed mutations. The effect on plant breeders is that the value of the genetic composition of a plant in a breeding population is difficult to determine from agronomic trait measurements. In an attempt to maximize their discriminatory ability, breeders collect multiple measurements from both individuals and many environments associated by descent. This strategy uses resources intensively. Because it involves the use of extensive trials to make even the small gains of plant improvement. This, combined with the fact that improved corn lines are selected for multiple traits simultaneously, makes the development of excellent maize inbreds both a time-consuming and expensive task. The addition of new traits in a maize breeding program places an additional burden on plant breeders. Depending on the genetic complexity of the novel trait (ie, a single gene versus many genes), a significant increase in time and effort is required to generate a selected line containing the novel trait. One such trait is kernel oil concentration. Maize with increased grain oil concentration can be found in poultry (Han Y. et al. (1977) Poultry Sci. 66: 103-111) and livestock (Nordstrom, JW) et al. (1972). ) J. An. Sci 35 (2): 357-361) is important for retaining improved feed value. Grains from conventional corn hybrids typically contain 4% oil. In an effort to increase kernel oil concentrations, a long-term recurring selection program was launched in 1896 with a naturally pollinated (cv.) Burr's White by Hopkins. This repetitively selected population, known as Illinois High Oil (IHO), has been selected for increased oil concentrations using modified population selection for over 90 generations (Dudley ( Dudley, JW) and Lambert (RJ. Lambert) (1992) Maydica 37: 1-7). As a result, oil concentrations increased by more than 20% in this population. Germplasm was rarely used. Because the derived material had a substantially lower yield than conventional varieties (Alexander, DE (1988) Proc. 43rd Ann. Corn and Sorghum Res. Conf. Am. Seed Trade Assoc., Washington DC, pp97-105). Using 38 naturally pollinated cultivars and synthetics, Alexander launches a second iterative selection program (Alexho complex) to increase grain oil (Alexander, DE (1988) Corn and Corn Improvement, edited by Sprague and JW. Dudley, American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, Pp 869-880). Oil concentrations equivalent to IHO were achieved in 28 cycles using single ear oil concentration-based selection and later generations using single kernel oil concentration-based selection. The yield capacity of Alexho-derived material in single cross hybrids (high oil inbreeds x conventional inbreeds) is likely due to the greater genetic variability initially available due to the IHO However, the performance was not as good as that of conventional hybrids, although it was improved. The development of agronomically selected maize germplasm that also contains increased grain oil concentrations is clearly a challenge using conventional plant breeding methods. Grain oil concentration can be measured phenotypically using a variety of analytical methods. Oil concentration represents a non-discrete distribution common to quantitatively inherited traits controlled by several loci. Grain oil measurement selects breeding lines with the highest phenotypic expression. Unfortunately, the genetic potential for high oils is limited in most of these lines. This is because it is not possible to identify strains based on their true genetic composition. This situation is exacerbated when simultaneous selection for agronomic performance is performed. Therefore, it may be advantageous to base the selection on the genotype of the plants in the population. Genetic marker traits, especially nucleic acid markers, may be used to advantage as an indirect selection method for complex quantitative traits. Genetic marker traits that identify alleles conferring enhanced oil therefore appear to be an advantageous tool for plant breeding programs to develop select high oil corn germplasm. Published information on identifying genetic marker traits that predict increased oil yield is limited. Kahler (Kahler, AL) (1985) Proc. 40th Ann. Corn and Sorghum Res. Conf. Am. Seed Trade Assoc., Washington, DC, pp. 66-89. Changes in isozyme allele frequency after 25 cycles of selection were determined and eight significant loci were found. Most of the changes in the frequency of these alleles are also significant for tests that measure random genetic drift, concluding that allele-based selection of these isozymes may be useful Made it difficult. More recently, Goldman et al. (Goldman, IL, et al. (1994) Crop Sci. 34: 908-915) and Berke and Rocheford (Berke, TG and Rock Ford (Rocheford, TR) (1995) Crop Sci. 35: 1542-1549) uses RFLP labeling to identify significant marker loci related to oil concentration in the Illinois long-term selection population. Identified. These studies identified 25 and 31 markers, respectively, in a population from Burr's White that were significantly associated with increased oil. Some of the regions identified by significant RFLP label loci may be common between the two studies; however, of the 15 RFLP labels used in both studies, six There was disagreement about their effects. In these studies, the population used was from a common ancestor (Burr's White); however, these populations were screened for different traits (oil and protein) over many generations . It is not surprising that many of the identified oil loci appear to be unique to each population analyzed. Therefore, it is desirable to identify genetic marker traits that uniquely predict germplasm used in breeding programs. SUMMARY OF THE INVENTION A method is disclosed for reliable and predictive breeding of maize with increased grain oil concentration. The method comprises the steps of: a) using one or more genetic marker traits to select a corn plant from a maize breeding population by marker-assisted selection (where the genetic marker trait is selected). Are s1375, s1384, s1394, s1416, s1422, s1432, s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1775, s1767, s1767, s1767, s1767, s1767, s1767, s1767, s1767, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s1817, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, s1925, s1931, s1933, s19 9, s1946, s1949, s2054, s2055, s2057, s2058, s2097, s2122, s2125, s2150, s2156 and s2175); and b) converting the selected corn plant to a second corn. Crossing with a plant (where the progeny of the cross is indicative of an increased kernel oil concentration). A preferred source of high oil corn germplasm is a member of the Alexho synthetic population or a descendant thereof. Also disclosed is a method of identifying a corn plant or corn line for use as a parent in creating a breeding population, the method comprising the steps of: a) identifying the genotype of the corn plant or corn line with one or more genetic marker traits; Genotyping, wherein the genetic marker traits are s1375, s1384, s1394, s1416, s1422, s1432, s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544. S1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1557, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s1817, s1836, s1853, s1860, s 1870, s1921, s1922, s1925, s1931, s1933, s1939, s1946, s1949, s2054, s2055, s2057, s2058, s2097, s2122, s2125, s2150, s2156 and s2175; and b) grain oil Identifying maize plants or maize lines that are predicted to produce transcendental isolates for concentrations based on their genotype. The present invention provides methods for identifying and selecting for genes that control increased corn kernel oil concentrations. These oil alleles were initially identified in materials that consisted or were derived from the Alexho synthetic breeding population. Furthermore, the method facilitates the use of this high oil material in breeding programs aimed at developing new high oil corn germplasm. In particular, the method uses genetic marker traits to predict the oil breeding value of a line in a corn breeding program. Indirect selection of oil loci using these markers selects the line with the greatest genetic potential for increased kernel oil concentration. According to the method, any type of genetic marker trait may be used to identify an association with kernel oil concentration. The method is only limited by the ability to measure polymorphism at a given marker locus. One skilled in the art will recognize that the various genetic marker traits that can be used include restriction fragment length polymorphism (RFLP), random amplified polymorphic DNA (RAPD), simple sequence repeat (SSR), AFLP, various simple It can be appreciated that this includes, but is not limited to, single base pair detection methods, allozymes and phenotypic labels. SSR labels useful in the practice of the present method include s1375, s1384, s1394, s1416, s1422, s1432, s1457, s1476, s1478, s1480, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1757, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s181 3, s1816, s1817, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, s1925, s1931, s1933, s1939, s1939 s1949, s2054, s2055, s2057, s2058, s2097, s2122, s2125, s2150, s2156 and s2175 Encompasses. A further aspect of the invention is a trait locus that regulates the expression of corn kernel oil levels. These loci are identified and defined (ie, located on chromosomes) by the marker loci of the present invention. An additional aspect of the present invention is a corn plant and high oil corn germplasm produced using the breeding method. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Table 1 provides a brief description of the genetic marker traits that form part of the present invention. Each label is defined by its constituent nucleic acid primers (forward and reverse) that facilitate amplification of a particular marker locus in the corn genome. The required identifier for each sequence is also indicated. The identifiers listed in Table 1 correspond to those listed in the Sequence Listing (below) as required by reference to the Code of Federal Regulations, Article 37, §1.821 et seq. For the purposes of the present invention, we define the following terms: That is, corn. Any cultivar, cultivar or group of corn (Zea mays L.). Of choice. The term describes characteristics of plants or varieties that possess favorable traits such as, but not limited to, high yield, good grain quality and disease resistance. This allows its use in the commercial production of at a profitable seeds or grains. The term also describes the characteristics of the parent that gives rise to such plants or varieties. High oil corn germplasm. The term is used to refer to grains produced by non-high oil germplasm when either self-pollinated or used as either male or female parents in various outcrossing combinations. Characterize corn plants that produce grains with increased oil when done. Examples of high oil corn germplasm include, but are not limited to, naturally pollinated varieties, hybrids, synthetics, inbred lines, breeds (races) and populations or corn plants from one of the above. . Varieties or cultivars. These terms refer to a group of similar plants that can be identified from other varieties or cultivars within the same species by structural characteristics and performance. system. The term refers to a group of individuals from a common ancestry; a group defined more narrowly than a variant. Composite. The term refers to the genetic heterogeneity of plants of known ancestry created by intercrossing of inbreeding hybrids, hybrids, varieties, populations, races, or any combination of other synthetics. Collection. Inbred mating. The term refers to an essentially homozygous individual, variety or line. Recombinant inbred hybrid. A population of independently generated lines developed by repeatedly self-pollinating each generation until complete homozygosity is approached. Each recombinant inbred is generated from a single F2 plant using a breeding method commonly referred to as a single seed descent. breeding. The technology and science of improving certain plants or animals through controlled genetic manipulation. Signage assistance selection. Use of genetic marker traits to identify and select plants with excellent phenotypic potential. The genetic marker trait or traits previously determined to be associated with a trait locus or trait loci are identified at the trait locus by linkage between the marker locus and the trait locus. Used to determine genotype. Plants containing alleles of the desired trait are selected on the basis of their genotype at the linked marker locus. Alexho composite. A repeatedly selected high oil corn germplasm developed by Alexon at the University of Illinois. Alexho composite high oil corn germplasm is composed of multiple composite populations defined by their cycle of progression of a recurrent selection breeding program. Breeding groups. A genetically heterogeneous collection of plants created for the purpose of identifying one or more individuals with the desired phenotypic characteristics. Expression value. Observed expression of one or more plant characteristics. Phenotypic value. A measure of the expected expression of an allele at a trait locus. The phenotypic value of an allele at a trait locus is dependent on the strength of its expression relative to the alternative allele. The phenotypic value of an individual, and hence the potential of that phenotype, is based on its overall genotype composition at all loci for a given trait. Transcendental separator. An individual whose phenotype exceeds the phenotypic variation predicted by the parent. Genetic marker trait. Any morphological, biochemical or nucleic acid based phenotypic differences indicative of DNA polymorphism. Examples of genetic marker traits include, but are not limited to, RFLP, RAPD, allozyme, SSR and AFLP. Marker loci. Genetically specified location of the DNA polymorphism as indicated by the genetic marker trait. Trait loci. A genetically specified location for a collection of one or more genes (alleles) that contribute to the observed feature. Genotype. Allele composition of an individual at the genetic loci under study. Restriction fragment length polymorphism (RFLP). DNA-based genetic marker traits (Botstein, D., et al., 1980. Am. J. Hum. Genet.), Where differences in size of DNA fragments caused by restriction endonucleases are observed via hybridization. 3 2: 314-331). Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). DNA amplification-based genetic marker traits (Williams JGK et al. 1990) in which short, sequence-arbitrary primers are used and the resulting amplification products are separated in size and differences in amplification pattern are observed. Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535). Simple sequence repeat (SSR). DNA amplification-based genetic marker traits in which short stretches of tandemly repeated sequence motifs are amplified and the resulting amplification products are separated in size and differences in nucleotide repeat length are observed. (Tautz D. 1989. Nucleic Acids Res. 112: 4127-4138). AFLP. DNA amplification-based genetic marker traits (Vos, P. et al. 1995) in which a DNA fragment produced by a restriction endonuclease is ligated to a short DNA fragment that facilitates the amplification of a restricted DNA fragment. Nucleic Acids Res. 23: 440 7-4414). The amplified fragments are separated by size and differences in amplification pattern are observed. Allozyme. Enzyme variants separated by electrophoresis and detected via staining for enzyme activity (Stuber, CW) and Goodman (MM. Goodman. 1983. USDA Agric. Res. Results, Southern Ser., No.16). The present invention relates to the discovery of trait loci that control kernel oil concentrations by using genetic marker traits. In populations where mutations were present for both grain oil concentration and alleles of the genetic marker traits, genotypes based on oil measurements and labeling were generated for members of the population. Using the least squares method, the locations of the oil concentration loci were determined with respect to markers genetically linked to these trait loci. Indirect selection of preferred oil loci can now be performed using information on one or more linked genetic marker traits. The selected corn plants comprise one or more alleles encoding a high oil phenotype. It is recognized that several different populations and population types can be used to locate a trait locus of interest. Some of the population types include, but are not limited to, recombinant inbreds, backcrosses, F2 or self-pollinated or intercrossed derivatives thereof, and synthetics. In addition, it is understood that one alternative to measuring phenotype and genotype variation within a population is to measure genotype and phenotype between populations. In this alternative, the second population is a selected derivative of the first population, where the selection is for either the trait of interest (phenotype selection) or a particular marker allele (genotype selection). It will also be appreciated by those skilled in the art that alternative statistical approaches can be used to determine linkage between the marker locus and the trait locus. Examples The present invention is further defined in the following examples. It should be understood that these examples are provided as specific illustrations only, illustrating preferred embodiments of the invention. From the above discussion and these examples, those skilled in the art will be able to ascertain the essential features of the invention and make various changes and modifications in the invention without departing from its spirit and scope. It can be adapted to laws and conditions. Example 1 Measurement of the Development and Traits of a Local Population of Loci That Provide Elevated Kernel Oil Concentrations Two Relatives Developed by Holden's Foundation Seed Co., Williamsberg, Iowa Crossbred maize lines, LH119wx and LH51, were deposited with the synthetic population ASKC 28wx (American Type Culture Collection, Rockville, MD; accession number AT CC 75105) (waxy kernels). Was highly expressed in ASKC28, and in that sense I independently referred to ASKC28 as waxy) and crossed independently with individual plants. F1 plants were selfed and the resulting F2 population was grown. Individual F2 plants were selfed and the resulting kernels were grown using six generations of selfed single seed lines (S6) to give rise to recombinant inbred lines. Up to 20 grains from the S6 generation were grown and self-pollinated to give rise to the S7 ears clan representing each recombinant inbred line. The oil value is measured by the near-infrared transmittance (Williams (PC) (1987) Near Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries; Williams (PC. Williams) and C. Norris (eds.) American Association of Grain Chemists ( The American Association of Cereal Chemists)) was used to measure each ear in the family. Genotyping Ten seeds from a single ear, representing 194 (LH119wx x ASKC28wx) or 204 (LH51 x ASKC28wx) recombinant inbred lines, respectively, were germinated on wet filter paper. . Root sections were removed from germinated seeds, pooled for each ear and extracted using an automated DNA extraction machine. This instrument is a modification of Murray and Thompson's CTAB treatment (Murray, M.G.) and Thompson, WF (1980) Nucl. Acids Res. 8: 4321-4325. use. DNA samples were quantified via fluorescence using iodide YoPro-1 ™ (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.) And diluted to 4 μg / ml. The SSR region of each DNA sample was analyzed using the following protocol. 1. Add 10 μl of amplification cocktail (see Table 2) to 5 μl (20 ng) of extracted DNA; The DNA fragments flanked by sequences complementary to the primers present in the amplification cocktail were prepared using the following protocol: 1) 45 cycles of 50 seconds at 95 ° C, 50 seconds at 54 ° C and 80 seconds at 72 ° C, and 2 2.) Amplification by PCR (US Pat. No. 4,683,202 and US Pat. No. 4,683,195) using one cycle at 72 ° C. for 300 seconds; Approximately 8 μl of each sample was loaded on an agarose gel composed of 2% Metaphor (FMC Corp., Rockland, Maine), 1 × TBE and 0.5 μg / ml ethidium bromide, 3. Electrophoresis for 2 hours at 6.1 V / cm in a horizontal electrophoresis apparatus supplemented with 1 × TBE buffer and 0.5 μg / ml ethidium bromide; DNA bands were visualized by UV fluorescence. Estimation of Oil Locus Genotyping of recombinant inbred hybrids from the LH119wx x ASKC28w x cross using 133 polymorphic SSR-labeled loci and also using 103 polymorphic SSR-labeled loci The population generated from LH51 × ASKC28wx was then genotyped. In addition, 20 publicly available polymorphic SSR loci with previously established chromosomal locations and encompassing all 10 maize chromosomes (Research Genetics, Huntsville, Alabama) (Available) was also located on the chromosome in both populations. The distance between the gene linkage and the labeled loci was determined independently for each population using MapMaker 3.0 (Lincoln, SE, et al. (1993) Whitehead Inst. Biomed. Res., Cambridge, Mass.). Were determined. This resulted in the establishment of 10 linkage groups in each population corresponding to the 10 chromosomes of maize. Each linkage group was assigned to one chromosome based on linkage to a public SSR marker. The 23 and 10 markers, respectively, in the LH119wx × ASKC28wx and LH51 × ASKC28wx populations were not assigned chromosomal locations because gene linkage could not be clearly established. Analysis of variance was used to identify marker loci in linkage with trait loci that give increased oil concentrations. Oil concentration was used as an independent variable, and separate ANOVA was calculated using SAS Proc GLM (SAS Inst., Cary, NC) using each marker locus as a single dependent variable. (Edwards, MD, et al. (1987) Genetics 116: 113-125). Therefore, the average oil values of the labeled allele classes were compared for each ANOVA test. Label loci were declared significant when p <0.05. The linkage data of the significant marker loci was examined to determine both the number of trait loci present and their likely location. Significant marker loci in the same linkage group either detect the same trait locus or are alternatively different trait loci. Careful examination of the phenotypic variation described by each marker locus along the chromosome made a determination of the number of trait genes in the linkage group. Significant marker loci on the same linkage group and interrupted by insignificant marker loci were declared as detecting identical trait loci on the chromosome. If significant marker loci on the same chromosome were interrupted by insignificant marker loci, each significant region would be declared to contain one trait locus resulting in multiple trait loci on the same chromosome did. To confirm the number of trait loci, label data and oil data assigned to linkage groups were mapped to MapMaker / QTL1.0 (Lincoln, SE, et al. (1990) Whitehead Inst. Biomed. Res., Cambridge, Mass.). Results with MapMaker / QTL were consistent with initial analysis for the number of trait loci on each chromosome. Eleven and twelve loci controlling grain oil concentration were located in the LH119wx x ASKC28wx and LH51 x ASKC28wx recombinant inbred populations, respectively. Each oil locus is defined by one or more linked marker loci. Linkage group alignment is possible if the same marker locus is used in both populations. It was found that in most cases both populations localized the same oil locus. By considering common marker loci, a total of 17 loci controlling grain oil concentration were found. Each oil locus was assigned a discretionary letter designation (Table 3). If a comparison could be made, the oil loci identified in one population were identified at the same location in a second population. With two exceptions, one oil locus was found in one population, but not in a second population. In the first case, an allele with a positive oil effect was found in LH51, and it was therefore unexpected to identify the same locus in the LH119wx × ASKC28wx population. Would. In the second case, it was found that the labeled alleles derived from the various ASKC28wx were segregated in the population; therefore, each population was affected by the oil effects of the different ASKC28wx alleles at this trait locus. Was measured. The most abundant ASKC28wx oil allele segregating in LH119wx × A SKC28wx had a positive oil effect on the allele generated from the alternative LH119, while the LH51 × ASKC28wx population had a rich ASKC28wx allele. The gene had no positive oil effect. Except for the oil locus linked to tag s1480, all alleles with a positive effect on oil concentration were from ASKC28wx. Example 2 Marker-Assisted Selection of Breeding Lines Using Increased Kernel Oil Concentration Gene Markers The genetic marker trait loci in linkage with the oil trait loci highly predict oil concentration, and In that sense, it can be used as an indirect measure of kernel oil in tag-assisted selection programs. Thus, genotypic information from linked marker loci would facilitate selection of breeding lines with increased oil concentrations. Direct oil measurements cannot identify the composition of trait loci of various genotypes with equivalent phenotypic effects. This is particularly problematic in the early generational segregation of breeding populations in which only limited fixation of oil loci has occurred. As an example, one goal of a corn breeding program could be the creation of new select inbred lines containing trait alleles that give increased kernel oil concentrations. These trait alleles are likely to be introduced by high oil germplasm intercrossing with one or more selected maize inbreds. The resulting hybrids can be self-pollinated to give rise to an F2 population for the purpose of initiating a conventional pedigree breeding program (Allard, RW (1960) Principles of Plant Breeding. John Wiley). And Sands, Inc. (John Wiley & Sons, Inc.), New York, pp 115-128). To identify F2 individuals with the desired genotype, plant tissue could be collected from each F2 individual in the population and genotyped using the SSR-marked loci listed in Table 1. The highest frequency F2 individuals of the SSR-tagged allele from high oil sources could be selected and further screened on the basis of their agronomic suitability. With continued inbreeding and segregation, the heterozygous oil locus could become fixed for either the high or low oil allele. Thus, it can be seen that genotyping and selection of later generations of material can be performed to further isolate breeding lines based on the composition of their labeled alleles, and therefore oil alleles. Depending on the size of the population and the ability to accidentally discover the unexpected, inbreds resulting from lineage breeding programs may not demonstrate sufficient agronomic competitiveness or sufficient grain oil expression. Because an insufficient number of oil alleles were recovered. These new inbreds can therefore be used as parent material and new breeding projects can be started. The SSR label can again be used for further selection of the oil as described. It will be apparent to those skilled in the art that many variations on the selection methodology will be foreseen. Selection will be based on the allelic composition of one or more marker loci that identify the oil loci for the trait present in a population. Further selection will be performed by genotyping and selection from individual plants, clan or their progeny. A variety of predictive models can be developed using genotype information, which can result in a variety of selection indices. These models can be considered to allow for the weighing of the effects predicted by the marker loci. This is because the predicted value of an individual marker locus is dependent on its genetic distance from the corresponding trait locus, as well as the expressivity of that trait locus. Selection strategies that combine phenotype-based and genotype-based selection may also be envisioned. The marker loci presented here predict oil loci in the Alexho composite population. Since ASKC28wx represents the 28th oil breeding cycle of a genetically closed population, earlier breeding cycles are composed of the same oil loci. Cycles are expected to simply differ in their allele frequencies at the identified oil loci. Thus, in breeding populations resulting from earlier Alexho cycles, the marker loci described in the present invention would be useful in identifying oil loci and predicting oil concentrations. Example 3 Identification of Maize Plants for Use as Parents for Production of Transcendental Isolates for Grain Oil Concentration Has the Greatest Potential to Produce Progeny with Excellent Performance When Used as Parents It is important to identify corn plants and lines. Offspring of such parental transcendental isolates is likely to result from parental crosses with a complementary set of alleles conferring a high oil phenotype. Using the information provided herein, tag alleles are known that predict the performance of a desired trait (ie, high oil) at a given marker locus. Genotyping strains at their marker loci indicates the value of those strains as parents. For example, if one wants to create an individual containing superior alleles at five independent oil loci (AE), the parent composed of the desired alleles at loci A, B, and C can be used. Can be identified and crossed with a parent composed of the desired allele at B, D and E. These parents are complementary as they allow the recovery of progeny containing the desired allele at all five loci. Ideally, the parent that, when combined, ensures the greatest complementation of the locus will be chosen, so that a high frequency of the desired recombinant is recovered.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY ,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM ,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA, CN,CU,CZ,EE,GE,GW,HU,ID,I L,IS,JP,KG,KP,KR,KZ,LC,LK ,LR,LT,LV,MD,MG,MK,MN,MX, NO,NZ,PL,RO,RU,SG,SI,SK,S L,TJ,TM,TR,TT,UA,US,UZ,VN ,YU────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, M W, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY) , KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, GW, HU, ID, I L, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LC, LK , LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, S L, TJ, TM, TR, TT, UA, US, UZ, VN , YU

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1.a)1種もしくはそれ以上の遺伝標識形質を使用して標識補助選抜によりト ウモロコシ育種集団からあるトウモロコシ植物を選抜すること、ここで、遺伝標 識形質が、s1375、s1384、s1394、s1416、s1422、s 1432、s1457、s1480、s1476、s1478、s1484、s 1500、s1513、s1529、s1544、s1545、s1630、s 1633、s1647、s1750、s1756、s1757、s1767、s 1772、s1774、s1780、s1797、s1813、s1816、s 1817、s1836、s1853、s1860、s1870、s1921、s 1922、s1925、s1931、s1933、s1939、s1946、s 1949、s2054、s2055、s2057、s2058、s2097、s 2122、s2125、s2150、s2156およびs2175から成る群か ら選択されるものであり;そして b)選抜されたトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物と交雑すること、こ こで交雑の後代のトウモロコシ植物が増大された穀粒油濃度を表わすものである 、 を含んで成る、増大された穀粒油濃度のトウモロコシの育種方法。 2.選抜されたトウモロコシ植物が、アレクスホー(Alexho)合成体集団の構成員 もしくはその後代である、請求の範囲1の方法。 3.育種集団の創製のための親としての使用のためのトウモロコシ植物もしくは トウモロコシ系統の同定方法であって、当該方法が、 a)1種もしくはそれ以上の遺伝標識形質でトウモロコシ植物もしくはトウモロ コシ系統の遺伝子型を決定すること、ここで、遺伝標識形質が、 s1375、s1384、s1394、s1416、s1422、s1432、 s1457、s1480、s1476、s1478、s1484、s1500、 s1513、s1529、s1544、s1545、s1630、s1633、 s1647、s1750、s1756、s1757、s1767、s1772、 s1774、s1780、s1797、s1813、s1816、s1817、 s1836、s1853、s1860、s1870、s1921、s1922、 s1925、s1931、s1933、s1939、s1946、s1949、 s2054、s2055、s2057、s2058、s2097、s2122、 s2125、s2150、s2156およびs2175から成る群から選択され るものであり;そして b)穀粒油濃度についての超越分離体を生産することがそれらの遺伝子型を基礎 として予想されるトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ系統を同定すること、 を含んで成る方法。 4.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs2054、 s1647、s1500、s1545、s1774およびs2097から成る群 から選択される1種の遺伝標識形質により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 5.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1817お よびs2057から成る群から選択される1種の遺伝標識形質により染色体上に 位置づけられる遺伝子座。 6.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1860、 s1931、s2150およびs1925から成る群から選択 される1種の遺伝標識形質により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 7.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1457、 s2055、s1757、s2125、s1780、s1375、s1797、 s1416、s1432およびs1921から成る群から選択される1種の遺伝 標識形質により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 8.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1544、 s1633、s1384、s1813、s1767、s2058、s1933、 s1513およびs1484から成る群から選択される1種の遺伝標識形質によ り染色体上に位置づけられる遺伝子座。 9.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1476、 s1772、s1816、s2122およびs1836から成る群から選択され る1種の遺伝標識形質により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 10.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1939 およびs1946から成る群から選択される1種の遺伝標識形質により染色体上 に位置づけられる遺伝子座。 11.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1478 、s1853およびs1949から成る群から選択される1種の遺伝標識形質に より染色体上に位置づけられる遺伝子座。 12.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座がs1630 、s1122およびs2156から成る群から選択される1種の遺伝標識形質に より染色体上に位置づけられる遺伝子座。 13.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座が遺 伝標識形質s1756により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 14.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座が遺伝標識形 質s1922により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 15.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座が遺伝標識形 質s1529により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 16.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座が遺伝標識形 質s1394により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 17.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座が遺伝標識形 質s1750により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 18.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座が遺伝標識形 質s1870により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 19.穀粒油濃度を制御する形質遺伝子座であって、当該遺伝子座が遺伝標識形 質s2175により染色体上に位置づけられる遺伝子座。 20.請求の範囲1の方法により生産される増大された穀粒油濃度を表わすトウ モロコシ植物。[Claims] 1. a) using one or more genetic marker traits by marker-assisted selection Selecting a corn plant from a maize breeding population, where a genetic marker The trait is s1375, s1384, s1394, s1416, s1422, s 1432, s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s 1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s 1633, s1647, s1750, s1756, s1557, s1767, s 1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s 1817, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s 1922, s1925, s1931, s1933, s1939, s1946, s 1949, s2054, s2055, s2057, s2058, s2097, s The group consisting of 2122, s2125, s2150, s2156 and s2175 Is selected from; and b) crossing the selected corn plant with a second corn plant; Here progeny maize plants of the cross show increased grain oil concentrations , A method of breeding corn with increased grain oil concentration comprising: 2. Selected maize plants are members of the Alexho synthetic population Or the method of claim 1, which is a progeny thereof. 3. Maize plant for use as a parent for the creation of a breeding population or A method for identifying a corn line, the method comprising: a) maize plant or corn with one or more genetic marker traits Determining the genotype of a Koshi line, wherein the genetic marker trait is s1375, s1384, s1394, s1416, s1422, s1432, s1457, s1480, s1476, s1478, s1484, s1500, s1513, s1529, s1544, s1545, s1630, s1633, s1647, s1750, s1756, s1557, s1767, s1772, s1774, s1780, s1797, s1813, s1816, s1817, s1836, s1853, s1860, s1870, s1921, s1922, s1925, s1931, s1933, s1939, s1946, s1949, s2054, s2055, s2057, s2058, s2097, s2122, selected from the group consisting of s2125, s2150, s2156 and s2175 That is; and b) Producing transcendental isolates for grain oil concentration based on their genotype Identifying a corn plant or corn line expected as A method comprising: 4. A trait locus controlling grain oil concentration, wherein the locus is s2054, group consisting of s1647, s1500, s1545, s1774 and s2097 A locus located on a chromosome by one genetic marker trait selected from: 5. A trait locus controlling grain oil concentration, wherein the locus is s1817 or On the chromosome by one genetic marker trait selected from the group consisting of The locus that is positioned. 6. A trait locus that controls grain oil concentration, wherein the locus is s1860, selected from the group consisting of s1931, s2150 and s1925 Locus located on the chromosome by one of the genetic marker traits. 7. A trait locus controlling grain oil concentration, wherein the locus is s1457; s2055, s1557, s2125, s1780, s1375, s1797, one type of inheritance selected from the group consisting of s1416, s1432 and s1921 A locus located on the chromosome by the marker trait. 8. A trait locus controlling grain oil concentration, wherein the locus is s1544; s1633, s1384, s1813, s1767, s2058, s1933, one genetic marker trait selected from the group consisting of s1513 and s1484; Loci located on the chromosome. 9. A trait locus that controls grain oil concentration, wherein the locus is s1476, selected from the group consisting of s1772, s1816, s2122 and s1836. A locus located on a chromosome by one genetic marker trait. 10. A trait locus controlling grain oil concentration, wherein the locus is s1939. Chromosome by one genetic marker trait selected from the group consisting of Loci located in 11. A trait locus controlling grain oil concentration, wherein the locus is s1478. S1853 and s1949, one genetic marker trait selected from the group consisting of A locus located more on a chromosome. 12. A trait locus controlling grain oil concentration, wherein the locus is s1630 S1122 and s2156, one genetic marker trait selected from the group consisting of A locus located more on a chromosome. 13. A trait locus that controls grain oil concentration, A locus located on the chromosome by the transgenic trait s1756. 14. A trait locus that controls grain oil concentration, where the locus is a genetic marker Locus located on the chromosome by quality s1922. 15. A trait locus that controls grain oil concentration, where the locus is a genetic marker Locus located on chromosome by quality s1529. 16. A trait locus that controls grain oil concentration, where the locus is a genetic marker Locus located on the chromosome by quality s1394. 17. A trait locus that controls grain oil concentration, where the locus is a genetic marker Locus located on the chromosome by quality s1750. 18. A trait locus that controls grain oil concentration, where the locus is a genetic marker Locus located on chromosome by quality s1870. 19. A trait locus that controls grain oil concentration, and the locus is a genetic marker Locus located on chromosome by quality s2175. 20. A tow exhibiting increased kernel oil concentration produced by the method of claim 1. Sorghum plant.
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