JP2001514906A - Methods and compositions for detecting or quantifying nucleic acid species - Google Patents

Methods and compositions for detecting or quantifying nucleic acid species

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、基体に固定されたプローブのアレイおよび多数の標識プローブを用いて標的核酸種を検出する方法を提供する。 (57) Abstract: The present invention provides a method of detecting a target nucleic acid species using an array and multiple labeled probe probes fixed to a substrate. 本発明はまた、物理的性質に基づいて多数のセットに分類できる離散粒子に結合されたオリゴヌクレオチドプローブに関する。 The present invention also relates to an oligonucleotide probe bound to the discrete particles can be classified into a number of sets based on physical properties. 異なるプローブがそれぞれのセットの離散粒子に結合され、プローブの正体は離散粒子をその物理的性質から同定することで決定される。 Different probes is coupled to discrete particles of each set, the identity of the probe is determined by identifying the discrete particles from its physical properties. 本発明はさらに、相補的ポリヌクレオチド鎖の結合を不安定にする(結合エネルギーを低下させる)薬剤または相補的ポリヌクレオチド鎖間の結合の安定性を高める(結合エネルギーを増大させる)薬剤を使用する方法に関する。 The present invention further provides a complementary polynucleotide strand to destabilize binding of (reduce binding energy) to increase the stability of the bond between the drug or the complementary polynucleotide strand (increase binding energy) using a drug a method for. 図面はプローブアレイを大量生産するための装置の概略図である。 Drawings is a schematic view of an apparatus for the mass production of probe arrays.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 関係出願へのクロス参照 本出願は、1997年8月15日出願された米国特許出願第08/912,885号の一部継続 、かつ1997年10月9日出願された米国特許出願第08/947,779号の一部継続、かつ1 [0001] The cross-reference this application to the relevant application, US patent application Ser. No. 08, filed a continuation-in-part, and October 9, 1997 of US patent application Ser. No. 08 / 912,885, filed August 15, 1997 / 947,779 No. of continuation-in-part, and 1
997年7月14日出願された米国特許出願第08/892,503号の一部継続、かつ1997年3 月4日出願された米国特許出願第08/812,951号の一部継続、かつ1997年1月16日出願された米国特許出願第08/784,747号の一部継続である。 997, July 14-filed continuation-in-part of U.S. Patent Application Serial No. 08 / 892,503, and continuation-in-part of filed March 4, 1997 U.S. Patent Application Serial No. 08 / 812,951, and January 1997 16 days filed a continuation-in-part of U.S. Patent application Serial No. 08 / 784,747.

【0002】 発明の分野 本発明は全体的には核酸分析のための方法および装置(apparatus)に関し、 特定的には核酸分析の方法および装置(apparati)に関する。 [0002] relates to a method and apparatus for nucleic acid analysis Overall FIELD The present invention of the invention (Apparatus), particularly to a method and apparatus for nucleic acid analysis (apparati).

【0003】 背景 核酸サンプル中の4種の核酸の配列を決定する速度は、分子生物学、医薬、および生物工学の一層の進歩にとって主な技術的障害である。 [0003] rate to determine the sequence of four nucleic acid in a background nucleic acid sample, molecular biology, medicine, and is a major technical obstacle for further advancement of biotechnology. ゲル中で核酸分子を分離する核酸配列決定法は、1978年以来使われている。 Nucleic acid sequencing method of separating nucleic acid molecules in the gel has been used since 1978. 核酸配列決定のための他の実証された方法はハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)である。 Other proven methods for nucleic acid sequencing is sequencing by hybridization (SBH).

【0004】 ヌクレオチド配列(すなわち、サンプルのA、G、CおよびTヌクレオチドの順序)を決定する伝統的な方法は、無作為な末端をもち、異なる標識を付した核酸断片の混合物を調製し、特異的なヌクレオチドで分解し、または複製鎖のジデオキシ鎖末端によって行われる。 [0004] Nucleotide sequences (ie, A, G, the order of C and T nucleotides samples) traditional method of determining has a random end, a mixture of nucleic acid fragments labeled with different labels prepared, decompose at specific nucleotide, or by dideoxy chain termination of replicating strands. その後、1〜500bpの範囲の得られた核酸断片をゲル上で分離して、隣接サンプルが1個のヌクレオチドだけ長さが異なるバンドのラダーを作製する。 Thereafter, a nucleic acid fragment obtained in the range of 1~500bp separated on a gel, the length by one nucleotide adjacent samples to produce a ladder of different bands.

【0005】 SBHのアレイに基くアプローチは、核酸分子の分離、分解、合成またはイメー ジングにおける単一塩基分解を必要としない。 [0005] approach based on an array of SBH is, the separation of nucleic acid molecules, degradation does not require single base decomposition in the synthesis or Imaging. 長さがK塩基の短いオリゴヌクレ オチドの誤対合を識別するハイブリダイゼーションを使って、標的核酸に対して構成K-merオリゴヌクレオチドのリストを決定することができる。 Length using hybridization to identify the mismatch of short Origonukure fault of K bases, it is possible to determine a list of the configuration K-mer oligonucleotides to the target nucleic acid. 標的核酸に対 する配列を、ユニークにオーバーラップしてスコアされるオリゴヌクレオチドにより構築することができる。 The sequence pair to target nucleic acids, uniquely overlap can be constructed by oligonucleotide score.

【0006】 ハイブリダイゼーションにより配列決定を達成するために複数のアプローチを利用できる。 [0006] can be used more than one approach in order to achieve the sequencing by hybridization. SBHフォーマット1と呼ぶプロセスでは、核酸サンプルをアレイし 、標識プローブをサンプルとハイブリダイズさせる。 In a process referred to as SBH Format 1, the nucleic acid sample to the array, to the labeled probe is a sample hybridized. 同じサンプル核酸のセットをもつレプリカ膜(replica membranes)をいくつかのプローブの平行スコアリ ングに使うことができるし、そして/またはプローブを多重化することができる。 It replica film (replica membranes) with the same set of sample nucleic acids can be used in parallel scoring of several probes and / or probe may be multiplexed. 核酸サンプルをナイロン膜または他の適当な支持体上でアレイしてハイブリダイズさせることができる。 The nucleic acid sample can be hybridized to the array on a nylon membrane or other suitable support. それぞれの膜アレイを何回も再使用することができる。 Each membrane array can be reused many times. フォーマット1は、多数のサンプルのバッチ処理用に特に効率的である。 Format 1 is especially efficient for batch processing large numbers of samples.

【0007】 SBHフォーマット2では、プローブをそれぞれの配列に対応する基体上の位置 にアレイし、標識した核酸サンプル断片をアレイしたプローブにハイブリダイズさせる。 [0007] In SBH Format 2, arrayed in a position on the substrate corresponding probes each sequence is hybridized to labeled nucleic acid sample fragments to an array probe. この場合、ある断片に関する配列情報を、全アレイ配列プローブとの同時ハイブリダイゼーション反応で決定することができる。 In this case, the sequence information for some fragments, can be determined by simultaneous hybridization reactions with the entire array sequence probe. 他の核酸断片を配列決定するために、同じオリゴヌクレオチドアレイを再使用することができる。 To sequence the other nucleic acid fragment, you can reuse the same oligonucleotide array. 該アレイはスポットすることにより、またはプローブのin situ合成によって作製す ることができる。 The array can it to prepare by in situ synthesis by spotting or probe.

【0008】 SBHフォーマット3では、2セットのプローブを使う。 [0008] In the SBH format 3, use two sets of probes. 1つの実施様態では、 1つのセットは既知の位置をもつプローブのアレイの形であることができ、そして他の標識したセットはマルチウエルプレート中に貯えることができる。 In one embodiment aspect, one set may be in the form of an array of probes with a known position, and the other labeled sets can be stored in the multi-well plate. この場合、標的核酸を標識する必要はない。 In this case, it is not necessary to label the target nucleic acid. 標的核酸および1つ以上の標識プローブをアレイしたプローブセットに加える。 Add target nucleic acid and one or more labeled probes to the probe set that array. もし1つの結合されたプローブと1つの標識プローブが両方とも標的核酸に近接してハイブリダイズすれば、それらは共有結合により連結反応し、連結反応したプローブの長さの合計に等しい検出配列を生成する。 If hybridizes If one bound probe and one labeled probe is proximate both the target nucleic acid, they were ligated covalently, generates a detection sequence equal to the sum of the length of the ligation probe to. 該プロセスにより、長い核酸断片、例えば完全な細菌ゲノムを、核酸が小片にサブクローニングすることなく配列決定することが可能になる。 By the process, a long nucleic acid fragment, for example a complete bacterial genome, the nucleic acid is capable of sequencing without subcloning into small pieces.

【0009】 本発明において、SBHは、1つ以上の核酸サンプルの効率的な同定および配列 決定に応用される。 [0009] In the present invention, SBH is applied to the efficient identification and sequencing one or more nucleic acid samples. 該方法は、核酸診断、法医学、および遺伝子マッピングに多くの応用がある。 The method may nucleic diagnosis, forensics, and gene mapping in many applications. それはまた、遺伝子障害および他の形質に関連する変異を同定し、生物多様性を評価し、そして核酸配列に依存する多くの他の型のデータを作るために使うことができる。 It also identified mutations associated with genetic disorders and other traits, to assess biodiversity, and can be used to make many other types of data depending on the nucleic acid sequence.

【0010】 発明の概要 本発明は、標的核酸種を検出する方法であって、基体に固定されたプローブのアレイと多数の標識されたプローブを用意し、ここに各標識プローブは標的核酸の第1部分に相補的である第1核酸配列を有するものが選択され、そしてここに基体に固定された少なくとも1つのプローブの核酸配列は標的核酸配列の第2部分に相補的でありかつ該第2部分は該第1部分に隣接しており;プローブ配列を相補的配列とハイブリダイゼーションするのに適当な条件下で、標的核酸をアレイに添加し;標識プローブをアレイに導入し;基体に固定したプローブを標的核酸とハイブリダイズさせ;標識プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ;標識プローブを、アレイ中の隣接してハイブリダイズしたプローブに固定させ; [0010] SUMMARY OF THE INVENTION The invention is a method for detecting a target nucleic acid species, prepared probes are arrayed a plurality of label probes fixed to a substrate, wherein the each labeled probe target nucleic first It has been selected to have a first nucleic acid sequence that is complementary to a first portion, and the nucleic acid sequence of at least one probe immobilized here the substrate is complementary to the second portion of the target nucleic acid sequence and said second under conditions suitable for complementary sequences and hybridization probes sequences were added to the target nucleic acid to the array; moiety is adjacent to the first portion and fixed to the base; a labeled probe is introduced into the array probe was a target nucleic acid hybridized; the labeled probe is hybridized to the target nucleic acid; labeled probes, is fixed to the hybridized probe with adjacent in the array; してアレイ中のプローブに固定した標識プローブを検出するステップを含む上記方法を提供する。 It provides the above method comprises detecting the labeled probe fixed to the probe in the array by. 本発明の好ましい方法によると、基体に固定されたプローブのアレイはプローブの普遍的セットを含む。 According to a preferred method of the present invention, an array of probes fixed to a substrate includes a universal set of probes. 本発明の他の好ましい様態では、基体に固定された少なくとも2つのプローブが標的核酸配列のオーバーラップする配列を定義し、さらに好ましくはすくなくとも2つの標識プローブが標的核酸配列のオーバーラップする配列を定義する。 In another preferred aspect of the present invention, it defines at least two probes define an overlapping sequence of the target nucleic acid sequence, even more preferably is at least two labeled probe overlaps the target nucleic acid sequence sequence is fixed to the base body to. そしてさらに本発明の他の様態によると、 And According to yet another aspect of the present invention,
既知配列の標的核酸を検出する方法であって、核酸サンプルを固体基体に結合した固定オリゴヌクレオチドプローブの1セットとハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここに該固定プローブは上記標的核酸配列の異なる部分と特異的ハイブリダイゼーションの能力があり;標的核酸を溶液中の標識オリゴヌクレオチドプローブの1セットとハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここに該標識プローブは固定プローブに隣接した上記標的核酸配列の異なる部分と特異的ハイブリダイゼーションする能力があり;該固定プローブを、標的配列上の固定プローブにすぐ隣接する標識プローブに(例えばリガーゼで)共有結合で接続し; A method for detecting a target nucleic acid of known sequence, different portions of the nucleic acid sample is contacted with one set and hybridization conditions of fixed oligonucleotide probes attached to a solid substrate, wherein the said fixed probe the target nucleic acid sequence There is a specific hybridization capability; target nucleic acid is contacted with one set and hybridization conditions of labeled oligonucleotide probes in solution, different parts of here to the labeled probe is the target nucleic acid sequence adjacent to a fixed probe It is capable of specific hybridization with; the immobilized probe, the labeled probe immediately adjacent to the fixed probe on the target sequence (for example ligase) connected by covalent bond;
連結反応してない標識プローブを除去し;標的核酸の存在を固定プローブに結合された上記標識プローブの存在を検出することによって検出するステップを含んでなる上記方法が提供される。 Ligation was labeled probe is removed is not; the method comprising the steps of detecting by detecting the presence of target nucleic acid the labeled probe for the presence coupled to the fixed probe is provided. 本発明はまた、細胞型、組織または組織混合物内に部分的または完全に配列決定された遺伝子のセットのメンバーの発現を決定する方法であって、配列決定された遺伝子に特異的な固定されかつ標識されたプローブの対を定義し;非標識の核酸サンプルと対応する標識プローブを1つ以上の固定したプローブのアレイとハイブリダイズさせ;隣接するハイブリダイズした標識されかつ固定されたプローブ間に共有結合を形成させ;連結反応してないプローブを除去し;そして、アレー中の予め特定した位置に結合した標識プローブの検出により配列決定された遺伝子の存在を決定するステップを含んでなる上記方法を提供する。 The present invention also relates to cell type, a method of determining partial or expression of fully sequenced set of genes Members in tissue or tissue mixtures, are specific fixed to genes sequenced and define a pair of labeled probes; shared between the labeled hybridized adjacent and fixed probe; unlabeled nucleic acid sample and the corresponding labeled probe was hybridized with the array of one or more fixed probe bond to form a; removing the probe that is not ligated; and, the method comprising the step of determining the presence of a previously identified gene sequenced by the detection of the bound labeled probe to a position in the array provide. 本発明のこの様態の好ましい実施様態では、標的核酸は感染剤の存在を同定するであろう。 In a preferred embodiment of this aspect of the present invention, the target nucleic acid will identify the presence of infective agents.

【0011】 さらに、本発明は、ナイロン膜(該ナイロン膜上にオリゴヌクレオチドプローブの複数のサブアレイがあり、該サブアレイは複数の個別スポットを含んでなり、ここに各スポットは同じ配列の複数のオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる);および複数の疎水性バリアー(ナイロン膜上のサブアレイ間に位置し、それにより隣接サブアレイ間の交叉汚染を防止する)を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを提供する。 Furthermore, the present invention is a nylon membrane (there are a plurality of sub-arrays of oligonucleotide probes on the nylon membrane, the sub-array comprises a plurality of discrete spots, a plurality of oligo each spot same sequence here nucleotide probe comprising); and located between the sub-arrays on the plurality of hydrophobic barrier (nylon membrane, thereby providing an array of oligonucleotide probes comprising preventing) the cross-contamination between adjacent subarrays.

【0012】 さらに、本発明は、標的核酸の第1末端および第2末端を有する反復配列の配列を決定する方法であって、(a)複数の様々な長さのスペーサーオリゴヌクレオ チドであって、該反復配列を含んでなるスペーサーオリゴヌクレオチドを用意し、;(b)反復配列の第1末端に隣接することが知られている第1オリゴヌクレオ チドを用意し;(c)その1つが反復配列の第2末端に隣接する複数の第2オリゴ ヌクレオチドであって、標識されている複数の第2オリゴヌクレオチドを用意し;(d)第1および複数の第2オリゴヌクレオチド、ならびに複数のスペーサーオ リゴヌクレオチドの1つを、標的核酸にハイブリダイズすること;(e)ハイブリ ダイゼーションしたオリゴヌクレオチドを連結反応させること;(f)連結反応し たオリゴヌクレオ Furthermore, the present invention provides a method of determining the sequence of repetitive sequences having a first end and a second end of the target nucleic acid, a spacer oligonucleosomes tides of (a) a plurality of different lengths , prepared spacer oligonucleotide comprising said repeated sequences,; (b) providing a first Origonukureo tides known to be adjacent to the first end of the repeat sequence; (c) one of which is repeated a plurality of second oligonucleotide which is adjacent to the second end of the sequence, by preparing a plurality of second oligonucleotide which is labeled; (d) a first and a plurality of second oligonucleotides and a plurality of spacers Oh, one of oligo nucleotides, capable of hybridizing to the target nucleic acid; (e) be linked reacting hybridization oligonucleotide; (f) Origonukureo linked reaction チドを連結反応してないオリゴヌクレオチドから分離すること;そして(g)連結反応したオリゴヌクレオチド中の標識を検出するステップを含 んでなる上記方法を提供する。 It is separated from the oligonucleotide not linked reacting tides; and (g) of detecting the label in the ligation oligonucleotide provides the above method comprising Nde free.

【0013】 そしてさらに、本発明は、標的核酸内の第1末端および第2末端を有する分枝点(branch point)配列の配列決定する方法であって、(a)分枝点配列の第1部 分と相補的である第1オリゴヌクレオチドを用意し、ここに該第1オリゴヌクレオチドは分枝点配列の第1末端から少なくとも1つのヌクレオチドだけ伸長し; [0013] and further, the present invention provides a method of sequencing branch points having a first end and a second end within a target nucleic acid (branch point) sequence, first (a) branch points sequence providing a part component and the first oligonucleotide is complementary to, wherein in the first oligonucleotide is extended by at least one nucleotide from the first end of the branch point sequence;
(b)標識されかつ分枝点配列の第2部分と相補的である複数の第2オリゴヌクレ オチドを用意し、ここに複数の第2オリゴヌクレオチドは分枝点配列の第2末端から少なくとも1つのヌクレオチドだけ伸長し、かつここに分枝点配列の第2末端から伸長する第2オリゴヌクレオチドの該部分は分枝点配列から生じる複数の配列と相補的である配列を含んでなり;(c)第1オリゴヌクレオチドおよび複数 の第2オリゴヌクレオチドの1つを標的DNAとハイブリダイズし、;(d)ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結反応させ;(e)連結反応したオリゴヌクレ オチドを連結反応していないオリゴヌクレオチドから分離し;そして(f)連結反 応したオリゴヌクレオチドの標識を検出するステップを含んでなる上記方法を提供する。 (B) providing a labeled plurality of second Origonukure fault is and complementary to the second portion of the branch-point sequence, wherein the plurality of second oligonucleotide from the second end of the branch point sequence at least one was extended by nucleotides, and partial second oligonucleotide extending from the second end of the branch point sequence herein comprises a sequence that is complementary to a plurality of sequences resulting from branch point sequence; (c) one of the first oligonucleotide and a plurality of second oligonucleotide and the target DNA hybridized,; (d) the hybridized oligonucleotides were ligated; (e) not ligation ligation was Origonukure fault It separated from the oligonucleotide; and (f) coupling provides the above method comprising the step of detecting a label reaction oligonucleotides.

【0014】 そしてさらに、本発明は、標的核酸にネガティブであると予測されるプローブを使って配列を確める方法を提供する。 [0014] and further, the present invention provides a sure Mel method an array with probes that are predicted to be negative to the target nucleic acid. その場合、標的の配列は、標的核酸を「 In that case, the sequence of the target, the target nucleic acid "
ネガティブ」プローブとハイブリダイズさせてこれらのプローブが標的核酸と完全な対合を形成しないことを確めることによって、確められる。 By 確Meru it that these probes do not form a perfect match with the target nucleic acid negative "probe is hybridized, is ascertained.

【0015】 そしてさらに、本発明は、プローブを配列情報を失うことなくハイブリダイゼーション反応において多重化できるように、異なる標識と複合体化したオリゴヌクレオチドプローブを使って核酸を分析する方法を提供する(すなわち、異なるプローブの標的とのハイブリダイゼーションを識別できるように、異なるプローブは異なる標識を有する)。 [0015] and further, the present invention is to allow multiplexed in hybridization reactions without loss of sequence information of the probe, to provide a method of analyzing nucleic acids with oligonucleotide probes complexed with different labels ( That is, as can be identified hybridization with the target of different probes, different probes having a different label). 好ましい実施様態では、該標識は放射性同位体、または蛍光分子、または酵素、または電気泳動質量標識である。 In a preferred embodiment, the label is a radioisotope, or a fluorescent molecule or an enzyme or electrophoresis mass label,. さらに好ましい実施様態では、異なる標識を付したオリゴヌクレオチドプローブをフォーマットII In a further preferred embodiment, format the oligonucleotide probes marked with different labels II
I SBHで使用し、多重プローブ(2つ以上で、1つのプローブは固定したプロー ブである)をお互いに連結反応させる。 Use in I SBH, (at least two, one probe is fixed probe) multiplexed probe is ligated to each other.

【0016】 そしてさらに、本発明は、サンプル中に標的が相同的な核酸と比較して非常に小量で存在するとき、既知の配列を有する標的核酸の存在を検出する方法を提供する。 [0016] and further, the present invention is, when the target in the sample are present in very small amounts compared to the homologous nucleic acids, a method of detecting the presence of a target nucleic acid having a known sequence. 好ましい実施様態では、該標的核酸は、多数のソース由来の核酸を有するサンプル中に非常に低頻度で存在する対立遺伝子である。 In a preferred embodiment, the target nucleic acid is an allele that is present at very low frequency in the sample with a nucleic acid derived from a number of sources. 代りの好ましい実施様態では、該標的核酸は変異配列を有し、かつ核酸のサンプル内に非常に低頻度で存在する。 In an alternative preferred embodiment, the target nucleic acid has a mutation sequence, and present in very low frequency in a sample of nucleic acids.

【0017】 そしてさらに、本発明は、シングルパスのゲル配列決定を使って標的核酸の配列を確める方法を提供する。 [0017] and further, the present invention provides a sure Mel method sequence of the target nucleic acid with a gel sequencing single pass. シングルパスのゲル配列決定のためのプライマーは、SBHにより得た配列から誘導し、これらのプライマーを標準サンガー(Sanger )配列決定反応に使って標的核酸のゲル配列情報を提供する。 Primers for gel sequencing single pass is derived from the sequence obtained by SBH, providing gel sequence information of a target nucleic acid using these primers in a standard Sanger (Sanger) sequencing reactions. その後、シングルパスゲル配列決定により得た配列をSBHで誘導した配列と比較して、該配列を確 める。 Then, as compared to the sequences derived sequence obtained by single-pass gel sequencing by SBH, sure Mel the sequence.

【0018】 そしてさらに、本発明は、シングルパスゲル配列決定を使って分枝点を解明する方法を提供する。 [0018] and further, the present invention provides a method to elucidate the branch point with the single-pass gel sequencing. シングルパスゲル配列決定反応のためのプライマーをSBH配 列決定の第1ラウンド後に得たSfsの末端から同定し、そしてこれらのプライマ ーを標準サンガー配列決定反応に使って、Sfsの分枝点を通過するゲル配列決定 情報をあたえる。 Were identified from the end of Sfs obtained a primer after the first round of SBH sequence determined for the single pass gel sequencing reaction, and using these primers in standard Sanger sequencing reaction, the branch points Sfs give gel sequencing information passing. その後、Sfsを、分枝点を通過するサンガー配列決定結果をSfs Thereafter, Sfs Sanger sequencing results of Sfs, passes through the branch point
と比較して整列させ、隣接するSfsを同定する。 Aligned compared to, identifying adjacent Sfs.

【0019】 そしてさらに、本発明は、SBH反応の前に該PCR産物を精製しないで、PCRによ り標的核酸を含むサンプルを調製する方法を提供する。 [0019] and further, the present invention is without purification the PCR product prior to SBH reaction, provides a method of preparing a sample containing the target nucleic acid Ri by the PCR. SBHフォーマットIで、粗 In SBH format I, crude
PCR産物を前精製することなく基体に添加し、標識プローブの導入前に該基体を 洗浄することができる。 Was added to the substrate without prior purification of the PCR product can be cleaned base body prior to introduction of the labeled probe.

【0020】 そしてさらに、本発明は、標的核酸を分析する方法および装置を提供する。 [0020] and further, the present invention provides a method and apparatus for analyzing a target nucleic acid. 該装置は、所望の時間、一緒に混合した核酸の2つのアレイを含んでなる。 The apparatus comprises two arrays of desired time, were mixed together nucleic acid. 好ましい実施様態では、1つのアレーの核酸は標識される。 In a preferred embodiment, the nucleic acid of one array are labeled. さらに好ましい実施様態では、ある材料を2つのアレイ間に配置し、この材料がアレイ中の核酸の混合を防止する。 In a further preferred embodiment, placing a certain material between the two arrays, this material prevents mixing of the nucleic acids in the array. この材料を取除くかまたは浸透できるようにすると、2つのアレイの核酸はお互いに混合される。 If you allow or penetrate remove this material, the nucleic acid of the two arrays are mixed with each other. 代りの好ましい実施様態では、1つのアレイの核酸は標的核酸であり、他のアレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブである。 In an alternative preferred embodiment, the nucleic acid of one array are the target nucleic acid other arrays are oligonucleotide probes. 他の好ましい実施様態では、両アレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブである。 In another preferred embodiment, the nucleic acid of both arrays are oligonucleotide probes.
他の好ましい実施様態では、1つのアレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブおよび標的核酸であり、他のアレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブである。 In another preferred embodiment, the nucleic acid of one array is an oligonucleotide probe and target nucleic acid in the other array is an oligonucleotide probe. 他の好ましい実施様態では、両アレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブおよび標的核酸である。 In another preferred embodiment, the nucleic acid of both arrays are oligonucleotide probes and the target nucleic acid.

【0021】 上に記載の装置を使う本発明の1つの方法は、基体に固定された核酸のアレイを用意し、核酸の第2アレイを用意し、第2アレイ中の核酸が固定されたアレイの核酸と接触することを可能にする条件をあたえ、ここに核酸のアレイの1つは標的核酸であり他のアレイはオリゴヌクレオチドプローブであり、そして該ハイブリダイゼーション結果を分析するステップを含んでなる。 One method of the present invention using the apparatus described above [0021] are prepared an array of nucleic acids fixed to a substrate, providing a second array of nucleic acids, the nucleic acid in the second array is fixed array given conditions that allow contact with the nucleic acid, consisting here other arrays one of the nucleic acid array is a target nucleic acid is an oligonucleotide probe, and including the step of analyzing the hybridization results . 好ましい実施様態では、固定されたアレイは標的核酸であり、第2アレイは標識オリゴヌクレオチドプローブである。 In a preferred embodiment, the fixed array is a target nucleic acid, the second array is a labeled oligonucleotide probe. さらに好ましい実施様態では、2つのアレイ間に配置されたある材料があり、該材料を取除くかまたは核酸へ浸透できるようにするまで核酸の混合を防止する。 In a further preferred embodiment, there is a material disposed between the two arrays, to prevent mixing of the nucleic acids to be able to penetrate into or nucleic remove the material.

【0022】 上に記載の装置を使う本発明の第2の方法は、核酸プローブの2つのアレイを用意し、プローブの2つのアレイがお互いにおよび標的核酸と接触することを可能にする条件をあたえ、標的核酸上で隣接しているプローブを一緒に連結反応させ、そして該結果を分析するステップを含んでなる。 The second method of the present invention using the apparatus described above may provide two arrays of nucleic acid probes, a condition in which two arrays of probes to allow the contact with each other and the target nucleic acid give, probes are adjacent on the target nucleic acid is ligated together, and comprising the step of analyzing the results. 好ましい実施様態では、1 In a preferred embodiment, 1
つのアレイのプローブは固定されかつ他のアレイのプローブは標識されている。 One of the probes of the array probes fixed and the other array is labeled.
さらに好ましい実施様態では、2つのアレイの間に配置されたある材料があり、 In a further preferred embodiment, there is a material disposed between the two arrays,
該材料を取除くかまたはプローブへ浸透できるようにするまでプローブの混合を防止する。 To prevent mixing of the probe to be able to penetrate into or probes remove the material.

【0023】 そしてさらに、本発明は、その上にオリゴヌクレオチドプローブが固定されている基体を提供し、ここに各プローブは隣接プローブからサンプル溶液の流動に抵抗する物理的バリアーにより分離されている。 [0023] and further, the present invention provides a substrate oligonucleotide probe thereon is fixed, each probe here are separated by a physical barrier that resists the flow of the sample solution from the adjacent probe. 好ましい実施様態では、該物理的バリアーは疎水性材料で作られている。 In a preferred embodiment, the physical barrier is made of a hydrophobic material.

【0024】 そしてさらに、本発明は、物理的バリアーにより分離されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを作る方法を提供する。 [0024] and further, the present invention provides a method of making an array of isolated oligonucleotide probes by physical barriers. 好ましい実施様態では、材料を添加するインクジェットヘッドを使って基体にグリッドを添加し、アレイの反応容積を削減する。 In a preferred embodiment, the addition of the grid to the substrate using the ink jet head of adding material, to reduce the reaction volume of the array.

【0025】 そしてさらに、本発明は、その上にオリゴヌクレオチドを固定して3次元アレイを形成する基体を提供する。 [0025] and further, the present invention provides a substrate to form a three-dimensional array by fixing oligonucleotides on it. 3次元アレイは、プローブ結果を読取る高分解( 3D arrays, high-resolution reading the probe result (
各レベルは比較的低密度のプローブ/cm 2を有する)と3次元空間の高情報含量 (多重レベルまたはプローブ)を合わせもつ。 Each level having both high information content of a relatively low density having a probe / cm 2) of the three-dimensional space (multilevel or probe).

【0026】 そしてさらに、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブを固定する基体を提供し、ここに該オリゴヌクレオチドプローブはスペーサーを有し、そしてここに該スペーサーは基体とオリゴヌクレオチドプローブの情報部分(例えば、標的と結合し配列情報を与えるオリゴヌクレオチドプローブの部分)の間の距離を増加する。 [0026] and further, the present invention provides a substrate for fixing an oligonucleotide probe, wherein the said oligonucleotide probe has a spacer, and wherein the said spacer substrate and the information part of the oligonucleotide probes (e.g., increasing the distance between portions) of the oligonucleotide probes to provide the combined sequence information targets. 好ましい実施様態では、スペーサーはリボース糖類およびホスフェートを含んでなり、ここに該ホスフェートはリボース糖類と5'および3'ヒドロキシル基を介してエステルを形成することによりリボース糖類をポリマーに共有結合で結合している。 In a preferred embodiment, the spacer comprises a ribose sugar and phosphate, where the phosphate ribose sugars covalently bound to the polymer by forming an ester through the ribose sugar and 5 'and 3' hydroxyl groups ing.

【0027】 そしてさらに、本発明は、単独の代表的クローンを配列決定の各群から選択できるように、cDNAクローンを類似または同一配列の群中にクラスター化する方法を提供する。 [0027] and further, the present invention is, as can be selected a single representative clones from each group of sequencing, a method to cluster in a group of similar or identical sequences of cDNA clones. 好ましい実施様態では、クラスター化の方法は、複数のクローンの配列決定に使われ、各クローンを複数のオリゴヌクレオチドプローブに照会し; In a preferred embodiment, the method of clustering is used to sequence a plurality of clones, query each clone to a plurality of oligonucleotide probes;
各クローンと結合するプローブおよび各プローブのシグナル強度を決定し;類似のプローブに類似の強度で結合するクローンを同定することによって、クローンを複数の群にクラスター化し;そして各群から少なくとも1つのクローンを配列決定するステップを含んでなる。 Determining the signal strength of the probe and each probe that binds to the clone; by identifying clones that bind with similar strength similar probes, clones were clustered into groups; and at least one clone from each group comprising the step of sequencing. さらに好ましい実施様態では、複数のプローブは約50〜約500の異なるプローブを含んでなる。 In a further preferred embodiment, a plurality of probes comprise different probes from about 50 to about 500. 他のさらに好ましい実施様態で は、複数のプローブは約300の異なるプローブを含んでなる。 In another further preferred embodiment, a plurality of probes comprises a different probes of approximately 300. 最も好ましい実施 様態では、複数のクローンは複数のcDNAクローンである。 In the most preferred embodiment, the plurality of clones is a plurality of cDNA clones.

【0028】 そしてさらに、本発明は、離散粒子と(共有結合でまたは非共有結合で)複合体化されたオリゴヌクレオチドプローブに関係し、該粒子は物理的性質に基いて複数のセットに分類される。 [0028] and further, the present invention, discrete particles and (in covalent or non-covalent) relates to conjugated oligonucleotide probes, the particles are classified into a plurality of sets based on the physical properties that. 好ましい実施様態では、異なるプローブを各セットの離散粒子に結合させ、プローブの同一性を離散粒子の物理的性質を同定することにより決定する。 In a preferred embodiment, to bind the different probes to discrete particles of each set is determined by identifying the physical properties of the discrete particles the identity of the probe. 代りの実施様態では、プローブをプローブの物理的性質に基いて同定する。 In an alternative embodiment aspect, identified on the basis of the probe to the physical properties of the probe. 物理的性質は、離散粒子を識別することに使うことができるどの物理的性質も含み、例えば、サイズ、蛍光性、放射能、電磁荷、または吸光度を含み、または標識を染料、放射性核種、またはEMLのような粒子に結合させるこ とができる。 Physical properties includes any physical properties can be used to identify the discrete particles, for example, size, fluorescence, radioactivity, includes an electromagnetic load or absorbance, or the label dye, radionuclide, or, it is a call to be bound to the particles, such as EML. 好ましい実施様態では、離散粒子は粒子のサイズ、電荷、蛍光、または吸光度を検出するフローサイトメーター(flow cytometer)により分離される。 In a preferred embodiment, the discrete particle size of the particles, the charge, are separated by a flow cytometer (flow cytometer) for detecting the fluorescence or absorbance.

【0029】 本発明はまた、離散粒子と複合体化したプローブを使って標的核酸を分析する方法にも関係する。 [0029] The present invention also relates to a method of analyzing a target nucleic acid with the discrete particles complexed with the probe. これらのプローブは、上に記載のどの方法にでも、離散粒子の物理的性質によりプローブを同定する修正をして使うことができる。 These probes, in any method described above, the physical properties of the discrete particles may be used by the correction to identify the probe. これらのプローブはまた、フォーマットIIIアプローチを使うことができ、この場合、「 遊離した(free)」プローブは標識により同定し、そして離散粒子に複合したプローブは物理的性質により同定する。 These probes may also be able to use the format III approach, in this case, the probe "liberated (free)" is identified by the label, and the probe conjugated to discrete particles are identified by physical properties. 好ましい実施様態では、該プローブは、SB In a preferred embodiment, the probe, SB
Hを使い標的核酸の配列決定をするために使う。 Used to the sequencing of the target nucleic acid using the H.

【0030】 本発明はまた、相補的ポリヌクレオチド鎖の結合を不安定化する(結合エネルギーを低下させる)か、または相補的ポリヌクレオチド鎖間の結合を安定化する(結合エネルギーを増加する)薬剤を使う方法に関係する。 [0030] The present invention also provides (reduce binding energy) destabilizing the binding of the complementary polynucleotide strand or (increasing binding energy) to stabilize the coupling between complementary polynucleotide strands agent It relates to a method to use. 好ましい実施様態では、該薬剤はトリアルキルアンモニウム塩、塩化ナトリウム、リン酸塩、ホウ酸塩、ホルムアミド、グリコール、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルムアミドのような有機溶媒、尿素、グアニジニウム、ベタインのようなアミノ酸類似体、スペルミジンおよびスペルミンのようなポリアミン、またはホスフェート骨格の負電荷を中和する他の正に荷電した分子、ドデシル硫酸塩ナトリウムおよびナトリウムラウリルサルコシネートのような洗剤、小溝/主溝(minor/major In a preferred embodiment, the agent is trialkyl ammonium salt, sodium chloride, phosphates, borates, formamide, glycol, organic solvents such as dimethyl sulfoxide, and dimethyl formamide, urea, guanidinium, amino acid analogs, such as betaines body, polyamines such as spermidine and spermine or charged molecules other positive to neutralize the negative charge of the phosphate backbone, detergents such as sodium dodecyl sulfate and sodium lauryl sarcosinate, small groove / main grooves (minor / major
groove)結合剤、正に荷電したポリペプチド、およびアクリジンのようなインターカレート剤(intercalating agent)、エチジウムブロミド、ならびにアント ラシンである。 groove) binding agents, positively charged polypeptides, and intercalating agents such as acridine (intercalating agent), ethidium bromide, as well as anthracin. 好ましい実施様態では、相補的ポリヌクレオチドの対のT mを低下または上昇させるために薬剤を使う。 In a preferred embodiment aspect, use an agent to reduce or increase the T m of a pair of complementary polynucleotides. さらに好ましい実施様態では、相補的ポリヌクレオチドの対のT mを低下または上昇させるために該薬剤の混合物を使う。 In a further preferred embodiment, using the mixture of the agent in order to decrease or increase the T m of a pair of complementary polynucleotides. 最も好ましい実施様態では、相補的ポリヌクレオチドの誤対合と完全な対合との区別を向上させるために薬剤もしくは薬剤の混合物を使う。 In the most preferred embodiment uses a mixture of the drug or agent to improve the distinction between perfect match and mismatch of a complementary polynucleotide. 好ましい実施様態では、AT塩基対からの結合エネルギーがGC塩基対の結合エネルギーとほぼ等しくなるように単数または複数の薬剤を加える。 In a preferred embodiment, the binding energy of the AT base pair added one or more agents so as to be substantially equal to the binding energy of GC base pairs. これらの相補的ポリヌクレオチドの結合のエネルギーは、ポリヌクレオチド骨格のホスフェート基の負電荷を中和もしくは遮蔽する薬剤を加えることによって、増加させることができる。 Binding energy of these complementary polynucleotides, by adding an agent that neutralizes or shields the negative charge of the phosphate groups of the polynucleotide backbone, it can be increased.

【0031】 好ましい実施様態の詳細な説明 SBHフォーマット1は、大きいサンプルのセットの同時分析に適している。 A preferred embodiment DETAILED DESCRIPTION SBH Format 1 aspect is suitable for the simultaneous analysis of a set of large samples. 膜 の小片を使って、大アレイ上の数千のサンプルの平行スコアリングを、数千の独立したハイブリダイゼーション反応で実施することができる。 Using a small piece of film, parallel scoring thousands of samples on large arrays may be implemented in separate hybridization reactions thousands. DNAの同定は、1 反応当り1〜20個のプローブに関わりうるし、ある場合には、変異の同定は各サ ンプルに対して特定的に選択されたまたは設計された1000以上のプローブに関わりうる。 Identification of DNA to be involved in 1-20 probe per reaction, in some cases, the identification of mutations may be involved specifically chosen or 1000 or more probes designed for each sample . 変異DNAセグメントの性質の同定のために、ハイブリダイゼーションの 第1ラウンドで検出した各変異に対して特定のプローブを合成または選択することがありうる。 For the identification of the nature of the mutant DNA segments may be able to synthesize or select a specific probe for each mutation detected in the first round of hybridization.

【0032】 DNAサンプルを、適当なスペーサーで分離した小アレイ中で調製することがで き、そしてマルチウエルプレートにアレイすることができるオリゴヌクレオチドのセットから選択されるプローブで、該DNAサンプルを同時に試験することがで きる。 [0032] DNA samples, Ki de be prepared in small arrays which had been separated by appropriate spacer, and the probe is selected from a set of oligonucleotides can be arrayed in multi-well plates, the DNA samples simultaneously it is as possible out to be tested. 小アレイは1つ以上のサンプルからなることができる。 Small arrays may consist of one or more samples. それぞれの小アレイ中のDNAサンプルは、変異体または個別の配列サンプルを含むことができる。 DNA samples in each small array may include variants or individual sequences sample. 継続した小アレイをさらに大きいアレイに組織することができる。 It can be organized in an array larger the continuing small array. このような、 like this,
さらに大きいアレイは同じ小アレイの複製物を含むことができるし、または異なるDNA断片サンプルのアレイを含むことができる。 It arrays larger may contain copies of the same small array, or may include an array of different DNA fragments samples. プローブの普遍的セットは、D Universal set of the probe, D
NA断片を予め規定した精度で(例えば各塩基対(「bp」)を読むことの重複性( The NA fragment predefined accuracy (for example, each base pair ( "bp") to Reading redundancy of (
redundancy)について)分析するために十分なプローブを含む。 redundancy) about) contains sufficient probes to analyze. これらのセットは、1つの特定の断片に必要であるより多いプローブを含むことができるが、数千の異なる配列のDNAサンプルを試験するに必要であるより少ないプローブを含 むことができる。 These sets may include a probe greater than is necessary for one specific fragment, the probe less than necessary to test the DNA samples thousands of different sequences may contains Mukoto.

【0033】 DNAもしくは対立遺伝子同定および診断配列決定プロセスは、 1) 手のこんだ、代表的なまたは普遍的なセットから、複数の小アレイのそれぞれとハイブリダイズさせるプローブのサブセットの選択; 2) 平行して分析するアレイのそれぞれの各サブアレイに、第1プローブを加えること; 3) ハイブリダイゼーションを実施し、ハイブリダイゼーション結果のスコアリングをすること; 4) 先に使ったプローブを脱離させること; 5) スコアリングする残りのプローブに対して、ハイブリダイゼーション、スコアリング、脱離のステップを繰返すこと; 6) 取得した結果を処理して、最終分析を得るかまたはハイブリダイズする追加のプローブを決定すること; 7) ある特定のサブアレイについて追加のハイブリダイゼーションを実施す [0033] DNA or allele identification and diagnostic sequencing process, 1) elaborate, from a representative or universal set, selection of a subset of probes which each hybridized with a plurality of small array; 2) to each of the sub-array of the array parallel to analyze, by adding a first probe; 3) hybridization was performed, it is the scoring of the hybridization results; 4) destination to which the probe desorbed using ; 5) for the remaining probe scoring, hybridization, scoring, it repeats the desorption step; 6) treating the obtained results, additional probes or hybridizing give final analysis to perform additional hybridization for the particular subarray 7) there; it determined to こと;および 7) データの完全なセットを処理し、最終分析を得ること のステップを含むことができる。 It; and 7) processes the complete set of data may include the steps of obtaining a final analysis.

【0034】 本アプローチは、1つの型(例えば、DNA、RNA)の少数の核酸サンプルの迅速な同定と配列決定を提供し、また予め合成した管理可能なサイズのプローブセットを使って、サブアレイの形の多くのサンプル型の平行分析を提供する。 The present approach is one type (eg, DNA, RNA) with a few providing a rapid identification and sequencing of nucleic acid samples and probesets previously synthesized manageable size, the sub-arrays providing parallel analysis of many samples type form. 2つのアプローチを組み合わせて、DNA同一性の決定用、DNA診断用、および変異体同定用の、効率的で用途の広いプロセスを作ることができる。 By combining the two approaches, for the determination of DNA identity, it can be made for DNA diagnostics, and for mutants identified, the wide efficient application process.

【0035】 既知配列の同定のために、より短いプローブの小セットをより長いユニークなプローブの代りに使うことができる。 [0035] For the identification of known sequences can be used a small set of shorter probes instead of a longer unique probe. このアプローチで、スコアすべきプローブはより多いが、プローブの普遍的セットをどのタイプの配列もカバーするように合成することができる。 In this approach, although the probe is greater should score can be synthesized so as to be covered any type of array universal set of probes. 例えば、6-merのフルセットは、4096プローブだけを含み、7-merの完全セットは16,384プローブだけを含む。 For example, the full set of 6-mer, contains only 4096 probes, complete set of 7-mer contains only 16,384 probe.

【0036】 DNA断片の完全配列決定は、2つのレベルのハイブリダイゼーションで実施す ることができる。 The complete sequence of the DNA fragment can it to carried out in two levels of hybridization. 1つのレベルは、少なくとも1回どの塩基もみなカバーするに 十分なプローブセットのハイブリダイゼーションである。 One level is hybridization of a sufficient probe set to any base be all covered at least once. この目的のために、標準サンプル用にある特定のプローブセットを合成することができる。 For this purpose, it is possible to synthesize specific probe sets in a standard sample. このようなプローブセットによるハイブリダイゼーションの結果は、非標準サンプルで変異(相異)が起っているかどうか、およびどこで起っているかを明らかにする。 A result of hybridization with such a probe set, clarify whether mutations in non-standard sample (differences) has occurred, and where you are standing. さらに、このプローブセットは、「ポジティブ」プローブのハイブリダイゼーション結果を確めるための「ネガティブ」プローブを含む。 In addition, the probe set includes a "negative" probe for sure Mel hybridization result of "positive" probe. 変化の同一性を決定するために、追加の特異的プローブを該サンプルにハイブリダイズさせることができる。 To determine the identity of the changes, additional specific probes may be hybridized to the sample. この追加のプローブセットは「ポジティブ」(変異配列)および「ネガティブ」の両方のプローブを有し、そして配列変化はポジティブプローブにより同定され、かつネガティブプローブにより確められるであろう。 This additional probe set has a probe both "positive" (mutant sequence) and "negative", and sequence changes is identified by positive probe, and would be ascertained by negative probe.

【0037】 他の実施様態では、普遍的セットからの全プローブをスコアすることができる。 [0037] In another embodiment aspect, it is possible to score the entire probe from the universal set. 普遍的プローブセットにより、2ステップのプロセスで、時間の望ましくない消費をすることなく、サンプル当り比較的小数のプローブのスコアリングが可能になる。 The universal probe set, a two-step process, without an undesirable time consuming, scoring per sample relatively small number of probes is possible. ハイブリダイゼーションプロセスは、最初にハイブリダイズするプローブの最適サブセットを計算する第1ステップ、そして、その後、得られた結果に基いて、普遍的セットのプローブの中からスコアする追加のプローブを決定する第2ステップの逐次的プロービングによることができる。 Hybridization process, and the first step, to calculate the optimal subset of the initially hybridizing probe, then, based on the results obtained, the determining additional probes to score from the universal set probe it is by sequential probing of two steps. 両方のプローブセットは、セット中にポジティブプローブを確めるための「ネガティブ」プローブを有する。 Both probe set has a "negative" probe for sure Mel positive probe in the set. さらに、その後、得られた配列は、該サンプルをSBH結果から同定した「 ネガティブ」プローブセットとハイブリダイズすることにより、別のステップで確めることができる。 Furthermore, subsequently, the sequence obtained, hybridizing and "negative" probe sets identified the samples from SBH result, it is possible 確Meru in a separate step.

【0038】 SBH配列の構築において、分析したDNA断片中に機会または生物学的理由により繰返し存在するK-1オリゴヌクレオチドは、特別な考慮がなされるべきであろう 。 [0038] In the construction of SBH sequence, K-1 oligonucleotides present repeatedly by chance or biological reasons to DNA fragments which had been analyzed will be special considerations are made. もしさらなる情報がなければ、全ての塩基対が数回読まれるように、DNAの比 較的小さい断片を完全に構築することができる。 If there is no additional information, so that all base pair is read several times, it can be constructed entirely of relatively small fragments of DNA.

【0039】 比較的長い断片の構築においては、ポジティブにスコアされるK-1配列のプロ ーブセット(すなわち、プローブ長より短い配列)が反復して存在するために曖昧さが生じうる。 [0039] In the construction of relatively long fragments, professional Busetto of K-1 sequences are scored positively (i.e., shorter sequences probe length) can cause ambiguity because of the presence repeatedly. この問題は、もし変異または類似の配列を決定する場合は存在しない(すなわち、K-1配列は同一に繰返されない)。 This problem, when determining the mutation or similar sequences not present if (i.e., K-1 sequence is not repeated in the same). 1つの配列の知識をテン プレートとして使い、ポジティブプローブをアレイして未知配列が該テンプレートにベストフィットを示すことにより、類似であることがわかっている配列(例えば、データベース中のその存在より)を正しく構築することができる。 Use the knowledge of one sequence as a template, by unknown sequence positive probes by the array exhibits the best fit to the template, the sequences have been found to be similar to (e.g., from the presence in the database) correctly it can be constructed.

【0040】 サンプルのアレイの使用により、1つのシングルサンプルについてまたは小さいセットのサンプルについての多くのオリゴヌクレオチドの継続的スコアリングを回避することができる。 [0040] The use of a sample of the array, it is possible to avoid the continuous scoring of many oligonucleotides for samples of one single sample for or small set. このアプローチにより、ただ1つの物理的オブジェクトの操作によって、平行してより多くのプローブのスコアリングが可能になる。 This approach only by operation of a single physical object allows scoring parallel to more probes.
1000bp長さのDNAサンプルのサブアレイを比較的短い時間に配列決定することが できる。 1000bp sub-array of the length of the DNA sample can be sequenced in a relatively short time. もし該サンプルを1アレイに50サブアレイでスポットし、該アレイを10 If spotted at 50 subarrays said samples per array, 10 the array
回再プローブすると、500プローブをスコアすることができる。 When times re-probe, it is possible to score the 500 probe. 変異の存在のた めのスクリーニングでは、各塩基を3回カバーするに十分なプローブを使うことができる。 Screening of Me other presence of the mutation can be used enough probe to cover three times each base. もし変異が存在すれば、いくつかのカバーするプローブが影響を受けるであろう。 If there is if mutation will have some cover to the probe affected. ネガティブプローブの同一性の情報を使うと、2塩基精度で変異をマッピングすることができる。 With the identity of the information negative probe can be mapped mutations in two base precision. この方法でマッピングした1つの塩基の変異を解明するために、さらに15プローブを用いることができる。 To elucidate the mutation of one base was mapped in this way, it is possible to use a further 15 probes. これらのプローブは、 These probes,
(欠失と挿入が関ってないと仮定して)2つの疑問ある位置に対するどの塩基組合わせもカバーする。 (Assuming inserted deletions no I Seki) which base combinations also covers for the two question a certain position. これらのプローブを、1サイクルに所与のサンプルを含有 する50サブアレイについてスコアリングさせる。 These probes are scored for 50 subarrays which contain the given sample in one cycle. 多重標識カラースキーム(すなわち多重化)の実施では、異なる蛍光染料のような異なる標識をそれぞれ有する In the practice of multiply labeled color scheme (i.e. multiplexing), each having a different label, such as different fluorescent dyes
2〜6プローブをプールとして使い、それによりハイブリダイゼーションのサイクル数を削減し、配列決定プロセスを短縮することができる。 Use 2-6 probe as a pool, thereby reducing the number of cycles of hybridization, you are possible to shorten the sequencing process.

【0041】 さらに複雑な事例では、2つの近接した変異または挿入がありうる。 [0041] In more complex cases, there may be mutations or insertion two close. それらはもっと多いプローブで扱うことができる。 They can be dealt with in more often probe. 例えば、3塩基挿入は64プローブで解決することができる。 For example, 3 base insertion can be solved in 64 probes. 最も複雑な場合は、数ステップのハイブリダイゼーションでアプローチし、前のハイブリダイゼーションの結果に基いて新しいプローブセットを選択することができる。 The most complex case, it is possible to approach the hybridization of several steps, selecting a new probe set on the basis of the results of the previous hybridization.

【0042】 もし分析するサブアレイが数十または数百の1つの型のサンプルを含むならば、それらのいくつかは1つ以上の変化(変異、挿入、または欠失)を含有しうる。 [0042] If containing one type of sample subarray tens or hundreds of analyzing, some of which may contain one or more changes (mutations, insertions, or deletions). 変異が存在する各セグメントに対して、特定のプローブセットをスコアすることができる。 For each segment mutations are present, it is possible to score a particular probe set. サンプルの1つの型に対してスコアすべきプローブの全数は数百でありうる。 Probe total number should score for one type of sample may be several hundreds. 複製アレイの平行スコアリングにより、比較的少ないサイクル数で数百のプローブのスコアリングが可能になる。 The parallel scoring of replication array, scoring hundreds of probes is possible with a relatively small number of cycles. さらに、適合性のあるプローブをプールすることができる。 Furthermore, it is possible to pool probes compatible. ポジティブハイブリダイゼーションを、特定のDNAセグ メントをチェックするために選択されたプローブに割りあてることができる。 Positive hybridization, can be assigned to the selected probe to check particular DNA segment. 何故なら、これらのセグメントは通常、構成塩基の75%が異なるからである。 Since these segments are usually from 75% of the constituent bases are different.

【0043】 より大きいより長いプローブセットを使うことにより、より長い標的を分析することができる。 [0043] By using a long probe set than a larger, it is possible to analyze the longer target. これらの標的はエキソンクローンのプールのような断片のプールを代表することができる。 These targets may represent pools of fragments such as exon clone pools.

【0044】 特異的ハイブリダイゼーションスコアリング法を用いて、二倍体染色体セットからの配列決定すべきゲノムセグメント中の変異体の存在を定義することができる。 [0044] Using specific hybridization scoring method, it is possible to define the presence of a mutant of the genome segment to be sequenced from a diploid chromosomal set. 2つの変形があり;i)1つの染色体からの配列は既知の対立遺伝子を表し、 There are two variants; i) sequences from one chromosome represents a known allele,
他の染色体からの配列は新しい変異を表す場合;または、ii)染色体の両方とも 新しいが異なる変異体である場合である。 If sequences from other chromosomes represent a new mutation; or, ii) both chromosomes new is the case are different variants. 両ケースとも、変化をマッピングするよう設計された走査ステップは、変異位置で2倍の最大シグナル差を与える。 In both cases, scanning step designed to map changes gives a maximal signal difference of 2-fold with mutations position. さらに、該方法を使って、ある遺伝子のどの対立遺伝子が個体(individual)により運ばれ、そして該個体はその遺伝子に対してホモ接合性かヘテロ接合性かを同定することができる。 Further, by using the method, which alleles of a gene is carried by an individual (Individual), and the individual is able to identify whether homozygous or heterozygous for the gene.

【0045】 第1のケースで要求される2倍のシグナル差のスコアリングは、対応シグナルをホモ接合性およびヘテロ接合性対照と比較することにより効率的に実施することができる。 [0045] Scoring twice the signal differences required in the first case, the corresponding signal may be efficiently implemented to by comparison with homozygous and heterozygous control. このアプローチにより、所与のサンプルの各特定プローブに対するハイブリダイゼーションシグナルの相対的減少を決定することが可能になる。 This approach makes it possible to determine the relative decrease in hybridization signal for each particular probe in the given sample. これは、同じ完全な対合標的を有する異なる核酸断片とハイブリダイズした特定のプローブに対して、ハイブリダイゼーション効率が2倍以上変化しうるので、重要である。 This is for a particular probe different nucleic acid fragments hybridized with the same perfect match target, because hybridization efficiency may vary more than 2 times, it is important. さらに、異なる変異部位は、オリゴヌクレオチドプローブの数に依存して1つ以上のプローブに影響を与えることができる。 Furthermore, different mutation site may affect one or more probes, depending on the number of oligonucleotide probes. 2〜4個の継続的プローブに対するシグナルの低下は、変異部位のさらに著しい徴候を与える。 Reduction of the signal for two to four continuous probe gives more significant signs of mutation site. 結果は、 Result is,
選択されたプローブの小さいセットで試験してチェックすることができ、その中で誤対合を含有する二本鎖から来るシグナルより平均で8倍強い完全な対合シグ ナルを与える1つまたは少数のプローブが選択される。 One or a few were tested in a small set of selected probes able to check, give 8 times stronger perfect match signaling null on average than the signal coming from the duplex containing mismatches therein probe is selected.

【0046】 分配した膜により、所与の配列型を表す比較的多数のサンプルまたは比較的小数のサンプルで表される多くの異なる型のサンプルに適合する、非常に柔軟性のある実験組織が可能になる。 [0046] By distributing the film, capable of many different types compatible with the sample, very flexible certain experiments tissue represented by a relatively large number of samples or relatively small number of samples representing a given sequence type become. 4〜256サンプルの範囲を特に効率的に取扱うことができる。 4-256 a range of samples can be especially handled efficiently. この範囲内のドット数のサブアレイを、オリゴヌクレオチドの貯蔵と標識付けのために使う標準マルチウエルプレートの構造とサイズに整合するように設計することができる。 Subarrays number of dots within this range, can be designed to match the structure and size of a standard multi-well plates used for storage and labeling oligonucleotides. サブアレイのサイズを、異なるサンプル数に調節するか、または少数の標準サブアレイサイズを使うことができる。 The size of the subarray, which modulates a different number of samples or a few standard subarray sizes may be used. もしある型の全てのサンプルが1つのサブアレイに適合しないのであれば、追加のサブアレイまたは膜を使って同じプローブで処理することができる。 If all samples of one type are is not to be fit into one sub-array if it can be processed in the same probe with additional subarrays or membranes. さらに、各サブアレイに対する複製数を調節して、同定または配列決定の完了のための時間を変えることができる。 Further, by adjusting the number of replication for each subarray, it is possible to change the time for completion of identification or sequencing.

【0047】 本明細書で使われる「中間断片(intermediate fragment)」は、長さで5〜10 The "intermediate fragment (intermediate- fragment)" as used herein is the length 5-10
00塩基、そして好ましくは長さで10〜40bpのオリゴヌクレオチドを意味する。 00 bases, and preferably means 10~40bp oligonucleotide length.

【0048】 フォーマット3では、既知配列のオリゴヌクレオチドプローブの第1セットは、それらがそれぞれ相補的な配列を有する核酸とハイブリダイズすることを許容する条件下で、固体支持体上に固定する。 [0048] In format 3, a first set of oligonucleotide probes of known sequences, under conditions which permit that they hybridize with a nucleic acid having a sequence complementary respectively, fixed on a solid support. 標識した、第2のオリゴヌクレオチドプローブセットは溶液で用意される。 Labeled second oligonucleotide probes set is prepared in solution. 該プローブは、セット内およびセット間の両方とも、同じ長さまたは異なる長さであってよい。 The probe, both between sets in and set may be the same or different lengths. 配列決定される核酸またはそれらの中間断片は、2本鎖形で(特にrecAタンパク質が存在して非変性条件下のハイブリダイゼーションが可能なとき)または1本鎖で、そして様々な相補性の程度のハイブリッドを可能とする条件下で(例えば、フル対合と1塩基対誤対合ハイブリッドの間の区別を可能とする条件下で)、第1プローブセットに添加することができる。 Nucleic acid or their intermediate fragments are sequenced, in double-stranded form (especially when recA protein is capable of hybridization under non-denaturing conditions exist) or single-stranded, and varying degrees of complementarity under conditions that allow the hybrid (e.g., under conditions that allow the distinction between full pair with one base pair mismatch hybrids) can be added to the first probe set. 配列決定される核酸またはそれらの中間断片は、第1プローブセットに、第2のプローブセットの前、後、または同時に添加することができる。 Nucleic acid or their intermediate fragments are sequenced, the first probe set, before the second probe set can be added after or simultaneously. 標的の隣接部位に結合するプローブを一緒に結合させる(例えば、スタッキング相互作用によって、またはリガーゼもしくは隣接プローブ間に化学結合を形成する他の方法によって)。 Binding probe bonded to the adjacent site of the target together (e.g., by stacking interactions, or between ligase or adjacent probes by other methods of forming a chemical bond). 隣接プローブを結合させた後、表面に第1のプローブセットのメンバーへの化学結合によって固定化されない断片およびプローブは、例えばハイブリッドを融解する高温(100℃以下)洗浄液を使って洗浄除去さ れる。 After binding the adjacent probes, the first fragment and probe not immobilized by chemical binding to members of the probe set on the surface, for example, a high temperature (100 ° C. or less) to melt the hybrid is washed off with the washing liquid. その後、第2セットからの結合したプローブは、用いた標識(例えば、化学発光、蛍光、放射性、酵素、濃度測定、または電気泳動質量の標識であることができる)に適した方法を使って検出することができる。 Then, bound probe from the second set of labeling with (e.g., chemiluminescent, fluorescent, radioactive, enzyme, densitometry, or may be an indicator of the electrophoresis mass) detected using methods suitable for can do.

【0049】 本明細書で、ヌクレオチド塩基は、もしそれらが、規定した条件下で水素結合により安定な2本鎖を形成すれば、「対合する(match)」かまたは「相補的(c [0049] In this specification, nucleotide bases, if they are, by forming a stable duplex by hydrogen bonding under the conditions specified, "pairing to (match)" or "complementary (c
omplementary)」である。 Is a omplementary) ". 例えば、ハイブリダイゼーションアッセイで共通して用いられる条件下で、アデニン(「A」)はチミン(「T」)と対合するが、グアニン(「G」)またはシトシン(「C」)とは対合しない。 For example, under the conditions commonly used in hybridization assays, adenine ( "A") is paired with thymine ( "T"), guanine ( "G") or cytosine ( "C") and the pair not if. 同様に、GはCと対合するが、AまたはTとは対合しない。 Similarly, G is for pairs with C, does not pair the A or T. イノシンまたは普遍的塩基(Universal Base) Inosine or universal base (Universal Base)
(「M」塩基, Nicholsら, 1994)のようなより低い特異性によって水素結合をする他の塩基、またはメチル化した塩基(methylated bases)のような他の修正した塩基は、例えば、規定した条件下でそれらが安定な2本鎖を形成する塩基と相補的である。 ( "M" base, Nichols et al., 1994) other modified bases such as other bases which hydrogen bond with less specificity than like or methylated bases, (methylated bases), for example, defined they are complementary to the base to form a double-stranded stable under the conditions. プローブは、もし該プローブ中の各塩基が核酸中の塩基と水素結合により2本鎖を形成してワットソン・クリック(Watson and Crick)塩基対形成ルール(すなわち、周辺の配列影響がなく、形成された2本鎖が特定のプローブに対して最大の結合エネルギーをもつ)により配列されれば、「完全に相補的( The probe, if the respective bases in the probe to form a duplex by base hydrogen bonds in nucleic acid Wattoson click (Watson and Crick) base pairing rules (i.e., no sequence influence of ambient, is formed if two chains with the greatest binding energy to a particular probe) by the sequence, "fully complementary (
perfectly complementary)」であると言われるかまたは「完全な対合(perfect perfectly complementary) or are said to "be or" perfect match (perfect
match)」であると言われる。 It is said to be a match) ". 「完全に相補的」および「完全な対合」はまた、 "Completely complementary" and "perfect match" also includes,
類似体または修正したヌクレオチドを有するプローブを包含することを意味する。 It is meant to include probes with analog or modified nucleotides. 類似体または修正ヌクレオチドに対する「完全な対合」は、類似体または修正ヌクレオチドに対して選択される「完全な対合ルール」(例えば、特定の類似体または修正ヌクレオチドに対して最大結合エネルギーをもつ結合対)により判断される。 "Perfect match" for analog or modified nucleotide is selected for analog or modified nucleotide "perfect match rules" (e.g., with a maximum binding energy to a particular analog or modified nucleotide It is determined by the binding pair). 「ルール」による結合対を形成しないプローブ中の各塩基は、規定されたハイブリダイゼーション条件下で「誤対合(mismatch)」であると言われる。 Each base in the probe that does not form a binding pair by the "rules" are said to be "mismatched (mismatch)" under defined hybridization conditions.

【0050】 各プローブが配列決定される核酸に完全な対合であるプローブのリストを構築することができる。 [0050] it is possible to build a list of the probe is a perfect match to a nucleic acid the probe is sequenced. その後、このリスト上のプローブを分析して最大オーバーラップ順に整列させる。 Thereafter, aligning the maximum overlap order to analyze the probe on this list. この整列は、第1プローブをリスト上の他のプローブのそれぞれと比較することにより実施して、どのプローブが第2プローブの5'末端の塩基の配列と同一の塩基の最長配列をもつ3'末端を有するかを決定することができる。 This alignment is performed by comparing the first probe and each of the other probes on the list, '3 having the longest sequence of identical bases sequence of bases' end which probes 5 of the second probe it is possible to determine with a terminal. その後、第1および第2プローブをオーバーラップさせることができ、そして該プロセスを繰返すことができ、第2プローブの5'末端を全ての残りのプローブの3'末端と比較しかつ第1プローブの3'末端を全ての残りのプローブの5'末端と比較する。 Then, it is possible to overlap the first and second probes, and can be repeated the process, 'the end 3 of all remaining probes 5' of the second probe as compared to the end and the first probe 'end 5 of all remaining probes' 3 compares terminated. 該プロセスは、他のプローブとオーバーラップしていないリスト上のプローブが無くなるまで続けることができる。 The process may be continued until the probe on the list which does not overlap with other probes is eliminated. あるいは、1つ以上のプローブをポジティブプローブのリストから選択することができ、1セット以上のオーバーラップしたプローブ(「配列核(sequence nucleus)」)を平行して作製することができる。 Alternatively, it is possible to select one or more probes from a list of positive probe, one or more sets of overlapping probes ( "sequence Nuclear (sequence Nucleus)") can be produced in parallel. 配列構築のどちらものこのようなプロセスに対するプローブのリストは、配列決定される核酸に完全に相補的であるプローブの全てのリストであることができ、またはそれらのどれかのサブセットであることができる。 List of the probe to such a process of either sequence construct may be a nucleic acid to be sequenced completely can be a list of all the probes are complementary, or any subset thereof .

【0051】 プローブの5'および3'末端をオーバーラップさせてさらに長い配列の伸展部( The extension of the longer sequence 5 'and 3' ends of the probe are overlapped (
stretches)を作製することができる。 It is possible to fabricate the stretches). プローブ構築のこのプロセスを、分枝点 (あるプローブが該断片中で繰返される)、プローブより長い反復配列、または非クローニングセグメントのために曖昧さが起るまで続ける。 The process of probe constructs, branch point (there probe is repeated in fragments), continued until ambiguity for a long repeat sequence or non-cloned segments, from the probe occurs. 2つの曖昧さの間の配列の伸展部を、サブクローン配列(Sfs)の断片とよぶ。 The extension portion of the sequence between the two ambiguity, referred to as a fragment of subclone sequences (Sfs). プローブとの適当 な代替オーバーラップが利用可能なために配列構築に曖昧さが起ると、オーバーラップ代替物の部位をまたがるさらに長いプローブによるハイブリダイゼーション、競争ハイブリダイゼーション、代替物末端と曖昧さの部位をまたがるプローブの末端対との連結反応、またはシングルパスゲル分析(Sfsの曖昧な整列をつ くるために)を使うことができる。 When ambiguities in sequence constructed for suitable alternative overlap with the probe is available occurs, hybridization with longer probes spanning a region of overlap alternative, competition hybridization, alternative terminal and ambiguity it can be used ligation with terminal pairs of probes spanning the site, or single pass gel analysis (in order to come One ambiguous alignment Sfs).

【0052】 以上の方法を用いることにより、ハイブリダイゼーションのパターン(核酸サンプルの同一性に関係し得て、核酸サンプルを同定するサインの役割を果す)から、オーバーラップまたは非オーバーラッププローブまで、さらに、構築された [0052] By using the above method, the hybridization pattern from (and obtained related to the identity of the nucleic acid sample, plays the role of a sign identifying the nucleic acid sample), until the overlap or non-overlapping probes, further ,It was constructed
Sfsを経て、そして中間断片またはソースDNA分子全体(例えば、染色体)に対する完全配列までの所望のレベルの配列を得ることができる。 Through the sfs, and the entire intermediate fragment or source DNA molecules (e.g., a chromosome) can be obtained sequences of the desired level to full sequence for.

【0053】 配列決定は、一般に以下の工程を含む: (a)その断片が相補的配列を有する固定化プローブとの第1複合体形成を可能 にするのに有効な条件下に、固定化オリゴヌクレオチドプローブのアレイ(arra [0053] Sequencing generally comprises the steps of: (a) under conditions effective for the fragment to allow first complex formation with the immobilized probe having a complementary sequence, immobilized oligo array of nucleotide probe (arra
y)と核酸断片とを接触させ; (b)第1複合体が標識プローブにハイブリダイズし、それによって、その断片 が固定化プローブ及び標識プローブの両者によってハイブリダイズされる第2複合体を形成することを可能にするのに有効な条件下の溶液中で、この第1複合体を標識オリゴヌクレオチドプローブのセットとを接触させ; (c)第2複合体から、固定化プローブに隣接してハイブリダイズしない任意の 標識プローブを除去し; (d)隣接する標識及び非標識プローブの存在を、標識の存在を検出することに よって検出し;そして (e)固定化標識プローブの既知配列と連結することによって、その断片のヌク レオチド配列を決定する。 y) and contacting the nucleic acid fragment; (b) the first complex hybridizes to a labeled probe, thereby forming a second complex fragment thereof is hybridized by both the immobilized probe and the labeled probe in a solution of under conditions effective to allow for, the first complex is contacted with a set of labeled oligonucleotide probes; (c) from the second complex, adjacent to the immobilized probe to remove any labeled probe that does not hybridize; (d) the presence of the adjacent labeled and unlabeled probe, detected thus to detect the presence of the labeled; and (e) coupling the known sequences of the immobilized labeled probe by, for determining the nucleotide sequence of the fragment.

【0054】 ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、実質的に完全対合(match)ハイブ リッド(例えば、断片及びプローブが7つの部位のうち6つでハイブリダイズするものなど)を検出するように選択されるか、完全対合及び1塩基対誤対合の相違 を許容するように選択されるか、又は完全対合ハイブリッドのみの検出を許容するように選択され得る。 [0054] Hybridization and washing conditions are selected so as to detect the substantially perfect match (match) hybrid (e.g., such as fragments and those probe 6 is hybridized of the seven sites) or it may be selected to permit complete or are chosen to permit differences in pairing and 1 bp mismatch, or perfect match hybrids only the detection.

【0055】 好適なハイブリダイゼーション条件は、最適化手順又は試験的検討(studies )によって日常的に決定され得る。 [0055] Suitable hybridization conditions can be routinely determined by optimization procedures or test study (studies). そのような手順及び検討は、研究室で用いられるプロトコールを確立するために、当業者によって日常的に行われる。 Such procedures and study in order to establish a protocol to be used in the laboratory is routinely made by those skilled in the art. 例えば、参照によって本明細書中に組み入れられる、Ausubelら、Current Protocols i For example, incorporated herein by reference, Ausubel et al, Current Protocols i
n Molecular Biology, Vol. 1-2, John Wiley & Sons (1989);Sambrookら、Mol . N Molecular Biology, Vol 1-2, John Wiley & Sons (1989); Sambrook et al., Mol
ecular Cloning A Laboratory Manual, 第2版, Vols. 1-3, Cold Springs Harbo ecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Cold Springs Harbo
r Press (1989);及びManiatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, r Press (1989); and Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring HarborLaboratory Corl Spring Harbor, New York (1982)を参照されたい。 Cold Spring HarborLaboratory Corl Spring Harbor, see New York (1982). 例えば、温度、構成要素(components)の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄時間、バッファー構成要素、並びにそれらのpH及びイオン強度などの条件を、変化させることができる。 For example, the temperature, the concentration of component (components), hybridization and washing times, buffer components, as well as conditions such as those of pH and ionic strength can be varied.

【0056】 標識固定化プローブが物理的又は化学的に結合されない実施態様では、検出は制御ストリンジェンシーの洗浄工程のみに依存し得る。 [0056] In the labeled immobilized probe physically or chemically bound non embodiments, detection may depend only on the process of cleaning the control stringency. そのような条件下では、 Under such conditions,
隣接プローブは、隣接プローブの間での積み重ね相互作用(stacking interacti Adjacent probes, stacking interactions between adjacent probes (stacking interacti
ons)のため、高い結合親和性を有する。 For ons), it has a high binding affinity. 条件は、上記のように工程を最適化す るために変化させ得る。 Conditions may change in order to optimize the process as described above.

【0057】 固定化標識プローブが連結されている実施態様では、連結は、化学連結試薬( [0057] In embodiments where the immobilized labeled probe is connected, connecting the chemical coupling reagents (
例えば、水溶性カルボジイミド又は臭化シアン)によって行うことができるか、 For example, it can be done by water-soluble carbodiimide or cyanogen bromide),
又はリガーゼ酵素、商業的に入手可能なT 4 DNAリガーゼを利用することができる。 Or a ligase enzyme, can be utilized commercially available T 4 DNA ligase. 洗浄条件は、隣接プローブに対する非隣接プローブの安定性の差を利用して、 Wash conditions, by utilizing the difference in stability of the non-adjacent probes to neighboring probes,
隣接標識固定化プローブに対して非隣接標識固定化プローブを識別するように選択できる。 It can be selected to identify the non-contiguous labeled immobilized probe relative to the adjacent labeled immobilized probe.

【0058】 オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光染料、化学発光系、放射活性標識(例えば、 35 S、 3 H、 32 P又は33 P)又は質量分析法によって検出し得る同位体によって 標識できる。 [0058] Oligonucleotide probes can be labeled fluorescent dyes, chemiluminescent system, by radioactive labeling (e.g., 35 S, 3 H, 32 P or 33 P), or isotopes that can be detected by mass spectrometry.

【0059】 未知配列の核酸分子が約45又は50 bpより長い場合、その分子を断片化して、 その断片の配列を決定できる。 [0059] When the nucleic acid molecule of unknown sequence is longer than about 45 or 50 bp, fragmenting the molecule can be determined sequence of the fragment. 断片化は、制限酵素消化、切断(shearing)又は Fragmentation restriction enzyme digestion, cleavage (shearing) or
NaOHによって達成できる。 It can be achieved by NaOH. 断片は、サイズで分離され(例えば、ゲル電気泳動によって)、約10〜40 bpの長さの好ましい断片を得ることができる。 Fragments are separated by size (e.g., by gel electrophoresis), it is possible to obtain a desirable fragment of a length of about 10 to 40 bp.

【0060】 オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の多数の方法(例えば、ヌクレオシドホスホロアミダイト(phosphoramidite)又はリン酸水素化ヌクレオシド(nucleos [0060] Oligonucleotides, a number of methods known to those skilled in the art (e.g., nucleoside phosphoramidite (phosphoramidite) or hydrogen phosphate nucleoside (Nucleos
ide hydrogen phosphorate)などの試薬を用いて、リン酸基を介してレーザー活性化光脱保護アタッチメント(laser-activated photodeprotection attachment ide hydrogen phosphorate) using reagents such as, via a phosphate group laser activation light deprotection attachment (laser-activated photodeprotection attachment
))によって固定化できる。 )) By can be immobilized. ガラス、ナイロン、珪素及びフッ素化炭素支持体を使用できる。 Glass, nylon, silicon and fluorinated carbon supports can be used.

【0061】 オリゴヌクレオチドは、アレイ中に組み込まれ、これらのアレイは、全て若しくは所与の長さの全プローブのサブセットか、又は選択された長さのプローブのセットを含むことができる。 [0061] Oligonucleotides may be incorporated into the array, the arrays can include a set of all or a given one subset of all probes of length, or selected length of the probe. 疎水性分割(partitions)は、プローブ又はプローブのサブアレイを分離するのに使用できる。 Hydrophobic divided (partitions) can be used to separate the sub-arrays of probes or probe. アレイは、多様なアプチケーション(例えば、マッピング、部分配列決定、診断目的の標的領域の配列決定、mRNA配列決定及び大容量配列決定)のために設計できる。 Arrays can be designed a variety of A Petit application (e.g., mapping, partial sequencing, sequencing of targeted regions for diagnostic purposes, mRNA sequencing and large sequencing) for. 特異的チップは、基質上のプローブの組み合わせ及び配列を選択することによって、特定のアプリケーション専用に設計できる。 Specific chips, by selecting the combination and sequence of the probe on the substrate, can be designed specifically to a particular application.

【0062】 例えば、長さ5塩基対の全オリゴヌクレオチドプローブの1024個の固定化プロ ーブアレイ(各アレイは1024個の異なるプローブを含む)が構築できる。 [0062] For example, 1024 immobilized pro Buarei of all oligonucleotide probes 5 base pairs in length (each array contains 1024 different probes) can be constructed. この例のプローブは、情報提供センス中の5-mer(それらは実際にはより長いプローブ であり得る)である。 Probe in this example is a 5-mer in the information providing sense (which may be a longer probes actually). 1024個の5-merプローブの第2のセットは、標識され、各 標識プローブの1つは、配列決定されるべき断片を伴った固定化プローブのアレイに適用され得る。 The second set of 1024 5-mer probes, labeled, one of the labeled probe may be applied to an array of immobilized probes with fragments to be sequenced. この例では、1024個のアレイが大きなスーパーアレイ、又は「スーパーチップ」に結合されるだろう。 In this example, will 1024 array is bound to a large super array, or "super chip". 標識プローブ及び標識プローブの1つが核酸断片に沿って末端−末端(end-to-end)でハイブリダイズするこれらの例では、2つのプローブは、例えば、連結反応によって結合され、未結合標識を除去後、サンプル断片に相補的な10-merが、既知配列の標識プローブが適用される既知配列の固定化プローブを有するアレイ中のポイントでの標識の存在の相関関係によって検出される。 One of ends along the nucleic acid fragments of the labeled probe and labeled probe - in these examples that hybridizes under end (end-to-end), 2 one probe, for example, are joined by ligation, to remove unbound labeled after the complementary 10-mer in the sample fragment is detected by correlation of the presence of the label at the point in the array having the immobilized probes of known sequence labeled probes of known sequence is applied. サンプル断片の配列は、単純に標識プローブの配列中に連続する固定化プローブの配列である。 Sequence of samples fragment is the sequence of the immobilized probe successive simply in the sequence of the labeled probe. このように、全ての100万個の可能な10- In this way, an all one million of the possible 10-
merは、5-merのみを使用し、従ってオリゴヌクレオチド合成の労力量の1000分の mer uses only 5-mer, therefore labor of oligonucleotide synthesis 1000th
1を含む組み合わせ(combinatorial)工程によって試験できる。 1 can be tested by the combination (combinatorial) process including.

【0063】 好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを支持する基体は、アレイ中の各プローブが、例えば、疎水性材料であり得る物理的バリアーによって隣接プローブから分離されるように、部分に仕切られる。 In [0063] preferred embodiment, the substrate supporting the array of oligonucleotide probes, each probe in the array, for example, as separated from the adjacent probes by physical barriers, which may be a hydrophobic material, a partition in a portion It is. 好ましい実施態様では、物理的バリアーは、100μm〜30μmの幅を有する。 In a preferred embodiment, the physical barrier has a width of 100Myuemu~30myuemu. より好ましい実施態 様では、各プローブの中心から任意の隣接プローブの中心までの距離は325μmである。 Is more preferred condition like, the distance from the center of each probe to the center of any adjacent probes is 325Myuemu. これらのプローブアレイは、動かない(nonmoving)固定化基体又はイン クジェットデポジション(deposition)装置、例えば、微小滴液量ヘッド、及び好適なロボットシステム、例えば、アノラドガントリー(anorad gantry)を有 する回転ドラム又はプレートに固定された基体を用いて「大量生産」できる。 These probe arrays are immobile (nonmoving) immobilized substrate or in click-jet deposition (Deposition) apparatus, for example, microdroplets fluid volume head, and a suitable robotic systems, for example, to have a anode rads gantry (Anorad gantry) fixed to the rotary drum or plate substrate can "mass-produced" using.

【0064】 別の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、3次元アレイに固定される。 [0064] In another preferred embodiment, the oligonucleotide probe is immobilized in a three-dimensional array. 3次元アレイは、多数の層から構成され、各層は、他の層から離れて個別に分析できる。 3-dimensional array is composed of multiple layers, each layer can be analyzed separately away from the other layers. 3次元アレイは、、多数の形態をとり得、例えば、次の形態を含む:くぼみの中の異なる深さにプローブが位置している多数のくぼみを有する基体上に配置され得る(各平面は、くぼみ内の同様の深さのプローブで構成されている)を含むか;又は、アレイはくぼみの底、若しくはくぼみ又は幾つかのピークの組み合わせを分割するピークにプローブが位置している異なる深さのくぼみを有する基体上に配置され、くぼみを用いることができる(各平面は一定の深さで全てのプローブから構成されている)か;又はアレイは、積層されて3 3D array can take many forms ,,, for example, it includes the following form: depression probe different depths of the middle of the may be disposed on a substrate having a plurality of recesses which are located (each plane , it contains the same is constituted by the depth of the probe) in the recess; or array depth varies bottom of the recess or recesses or probe peak to split a combination of several peaks, it is located disposed on a substrate having a recess in, or (all of which is composed of the probe in each plane certain depth) can be used depression; or arrays are stacked 3
次元アレイを形成する多数のシートで構成される基体上に配置され得る。 It may be disposed on a substrate composed of a large number of sheets forming a dimension array.

【0065】 これらのアレイ中のプローブは、基体表面とプローブの情報提供部分との間の距離を増すスペーサーを含むことができる。 [0065] probes in these arrays may include a spacer to increase the distance between the substrate surface and the information providing portion of the probe. スペーサーは、炭素、珪素、酸素、 The spacer, carbon, silicon, oxygen,
硫黄、リンなどの少なくとも2価の結合を形成し得る原子から構成され得るか、 又は糖−リン酸基、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、炭化水素、芳香環、炭化水素環、直鎖及び分岐炭化水素などの少なくとも2価の結 合を形成し得る分子から構成され得る。 Sulfur, or it may be composed of atoms capable of forming at least divalent bonding, such as phosphorus, or sugar - phosphate groups, amino acids, peptides, nucleosides, nucleotides, sugars, hydrocarbons, aromatic, hydrocarbon ring, linear and it can be composed of molecules capable of forming at least divalent binding of such branched hydrocarbon.

【0066】 配列決定される核酸サンプルは、断片化又はそれと異なる処理(例えば、recA [0066] The nucleic acid samples to be sequenced, fragmented or a different processing (e.g., recA
の使用によって)をされてサンプル中の第2構造によるハイブリダイゼーションの妨害を避けることができる。 It can be a) by the use of avoiding interference of hybridization with the second structure in the sample. サンプルは、例えば、Cviなどの制限酵素による 消化、物理的切断(例えば、超音波によって)、又はNaOH処理によって断片化できる。 Sample, for example, digestion with restriction enzymes such as Cvi, physical cleavage (e.g., by ultrasound), or fragmented by NaOH treatment. 得られた断片は、ゲル電気泳動によって分離でき、約10 bp〜約40 bpの間などの適切な長さの断片をゲルから抽出できる。 The resulting fragments can be separated by gel electrophoresis, it can be extracted fragments of appropriate length, such as between about 10 bp to about 40 bp from the gel. 好ましい実施態様では、核酸サンプルの「断片」は、プール中の他の断片と連結できない。 In a preferred embodiment, "a fragment" of a nucleic acid sample can not be connected with other fragments in the pool. そのような断片のプールは、断片化された核酸をホスファターゼ(例えば、仔ウシ腸ホスファターゼ)で処理することによって得られる。 Pool of such fragments, fragmented nucleic acid phosphatase (e.g., calf intestinal phosphatase) obtained by treating. あるいは、サンプル核酸の非連結性断片は、サンプル核酸によるSanger−デオキシシークエンシング反応において、ランダムプライマー(例えば、N 5 -N 9 、ここでN=A、G、T、又はC)を用いることによっ て得られる。 Alternatively, unbound fragments of sample nucleic acids by the sample nucleic acid Sanger- In deoxy sequencing reactions, random primer (e.g., N 5 -N 9, wherein N = A, G, T, or C) to be used depending obtained. これは、標的核酸に相補的な配列を有し、他の断片に連結できないジデオキシ残基で停止しているDNA断片を製造するだろう。 This has the sequence complementary to the target nucleic acid, it will produce a DNA fragment that is stopped by the dideoxy residues that can not be linked to other fragments.

【0067】 再利用できるフォーマット3 SBHアレイは、固定化プローブと標識プローブの 間に開裂可能な結合を導入し、次いでフォーマット3分析のラウンドが終了した 後にこの結合を開裂することによって製造できる。 [0067] reusable format 3 SBH array may be prepared by subsequently cleaving this bond by introducing a cleavable bond, then format 3 Analysis of rounds has been completed between the immobilized probe and the labeled probe. 標識プローブは、リボヌクレオチド類又はリボヌクレオチドであり、標識プローブ中の結合塩基として使用でき、このプローブは、続いて例えば、RNAse又はウラシル−DNAグリコシル化処理、又はNaOH処理によって除去され得る。 Labeled probe is a ribonucleotide or ribonucleotide can be used as a binding base in labeled probe, this probe may subsequently example, may be removed by RNAse or uracil -DNA glycosylation process, or NaOH treatment. さらに、化学連結反応によって製造される結合は、選択的に開裂され得る。 Furthermore, bonds that are produced by chemical coupling reaction can be selectively cleaved.

【0068】 他のバリエーションは、特異性又は効率を増加させる修飾オリゴヌクレオチドの使用、例えば、標識プローブの第1セットに最適に選択された条件(例えば、 [0068] Other variations include the use of modified oligonucleotides to increase the specificity or efficiency, for example, optimally selected conditions in the first set of labeled probes (e.g.,
温度)下にハイブリダイゼーションサイクルを行い、次いで標識プローブの第2 Hybridizations are carried out cycle temperature) under and then a second labeled probe
セットに最適に選択された条件下にハイブリダイゼーションすることによる、ハイブリダイゼーションシグナルを増加する循環(cycling)ハイブリダイゼーシ ョンを含む。 Due to hybridization to optimally selected conditions set, including a circulation (cycling) hybridization tion to increase hybridization signals. リーディングフレームのシフトは、それぞれ4つのヌクレオチド塩 基A、T、C及びGで終わるプローブの混合物(好ましくは等モル量の混合物)を使用することによって決定できる。 Shift of reading frame, each of the four nucleotides salt group A, T, a mixture of probes ending in C and G (preferably a mixture of equimolar amounts) can be determined by using.

【0069】 分岐点は、断片の規則正しい配列に関して曖昧さを生じさせる。 [0069] branch point causes ambiguities regarding regular array of fragments. 配列情報はSB The sequence information SB
Hによって決定されるけれども、そのような曖昧さ(「分岐点」)がある場合、 ハイブリダイゼーションデータを整理するために、(i)完全ゲル配列決定のコス ト(cost)画分(fraction)での長い読み出し長さの単一パスゲル配列決定;又は(ii)関連配列との比較のいずれかを使用することができる。 Although it determined by H, if there is such a ambiguity ( "branching point"), in order to organize the hybridization data, by (i) cost of the complete gel sequencing (cost) fraction (fraction) single Pasugeru sequencing long read length of a; or (ii) may be used either comparison with related sequences. 分岐点を介する単一パスゲル配列決定のためのプライマーは、SBH配列情報から、又は既知ベクタ ー配列、例えば、ベクター挿入部位に隣接する配列から同定し、サンプル核酸に関して、標準Sanger−シークエンシング反応を行う。 Primers for single Pasugeru sequencing through the branch point, the SBH sequence information, or known vectors over sequence, for example, identified from sequences flanking the vector insertion site, with respect to the sample nucleic acid, standard Sanger- sequencing reaction do. この単一パスゲル配列決定から得られた配列を、分岐点からの読み込み、読み出し(read into and out of The sequence obtained from this single Pasugeru sequencing reads from the branch point, read (read into and out of
the branch points)、Sfsの順序を同定するSfsと比較する。 the branch points), compared to the Sfs to identify the order of the Sfs. あるいは、Sfsは 、Sfsの配列を関連配列と比較し、Sfsを整列して、関連配列に最も近い配列を製造することによって整列することができる。 Alternatively, Sfs can be compared to the relevant sequence a sequence of Sfs, to align the Sfs, aligned by fabricating closest sequences related sequences.

【0070】 さらに、標的断片中の縦列反復核酸セグメントの数は、シングル−パスゲル配列決定によって決定できる。 [0070] Further, the number of tandem repeats nucleic acid segment in a target fragments, single - can be determined by Pasugeru sequencing. 縦列反復は、遺伝子のタンパク質コード部分中で稀に起きるので、ゲル配列決定工程はこれらの非コード領域の1つが特別に興味あるものとして同定される場合(例えば、それが重要な制御領域である場合)にのみ行われるであろう。 Tandem repeats, so rarely occur in the protein coding portion of the gene, when the gel sequencing step is one of these non-coding regions identified as being special interest (e.g., it is a critical control region If) in will be performed only.

【0071】 たった約200個のオリゴヌクレオチドプローブのセットが示すハイブリダイゼ ーションの程度についての情報を得ることにより、各遺伝子の特有のサイン(si [0071] By obtaining the information about the degree of hybridization indicated by the set of only about 200 oligonucleotide probes, specific signs (si of each gene
gnature)を定義し、ライブラリーからのcDNAの分類に使用でき、ライブラリー が同じ遺伝子の多数のコピーを含んでいるか否かを決定できる。 Defines Gnature), can be used for cDNA classification from a library, it can determine whether the library contains multiple copies of the same gene. そのようなサインによって、同一、類似及び異なるcDNAが区別でき、目録を作成できる。 Such signs identical, indistinguishable similar and different cDNA, can be cataloged.

【0072】 核酸及び核酸を単離し、クローニングし、配列決定する方法は、当業者に周知である。 [0072] METHOD nucleic acids and nucleic acid was isolated, cloned, sequenced, are well known to those skilled in the art. 例えば、参照によって本明細書中に組み込まれる、Ausubelら、Current For example, it is incorporated herein by reference, Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-2, John Wiley & Sons (1989);及 びSambrookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第2版、Vols. 1-3, C . Protocols in Molecular Biology, Vol 1-2, John Wiley & Sons (1989);. 及 beauty Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1-3, C
old Springs Harbor Press (1989)を参照されたい。 See the old Springs Harbor Press (1989).

【0073】 SBHは、当業者に知られている多数の方法によって実施され得る非常に発達し た技術である。 [0073] SBH is very developed technology that may be implemented by a number of methods known to those skilled in the art. 特に、以下の文献のハイブリダイゼーションによる配列決定に関連する技術は、参照によって本明細書中に組み込まれる:Drmanacら、1993年4月 In particular, the techniques related to sequencing by hybridization of the following documents, incorporated herein by reference: Drmanac et al., April 1993
13日発行の米国特許第5,202,231号(これによって参照によって本明細書に組み 込まれる);Drmanacら、Genomics, 4, 114-128 (1989),Drmanacら、Proceeding 13 days issued U.S. Patent No. 5,202,231 (hereby incorporated into the present specification by reference); Drmanac et al, Genomics, 4, 114-128 (1989), Drmanac et al., Proceeding
s of the First Int'l. Conf. Electrophoresis Supercomputing Human Genome, s of the First Int'l. Conf. Electrophoresis Supercomputing Human Genome,
Cantorら編集、World Scientific Pub. Co., Singapore, 47-59 (1991);Drman . Cantor et al., Eds., World Scientific Pub Co., Singapore, 47-59 (1991); Drman
acら、Science, 260, 1649-1652 (1993);Lehrachら、Genome Analysis: Geneti ac et al., Science, 260, 1649-1652 (1993); Lehrach et al., Genome Analysis: Geneti
c and Physical Mapping, 1, 39-81 (1990), Cold Spring Harbor Laboratory P c and Physical Mapping, 1, 39-81 (1990), Cold Spring Harbor Laboratory P
ress;Drmanacら、Nucl. Acids Res., 4691 (1986);Stevanovicら、Gene, 79 1 ress; Drmanac et al, Nucl Acids Res, 4691 (1986);.. Stevanovic et al, Gene, 79 1
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1991);Hoheiselら、Mol. Gen., 4, 125-132 (1991);Strezoskaら、Proc. Nat' 1991);. Hoheisel et al, Mol Gen., 4, 125-132 (1991);. Strezoska et, Proc Nat '
l. Acad. Sci. (USA), 88, 10089 (1991);Drmanacら、Nucl. Acids Res., 19, ... L Acad Sci (USA), 88, 10089 (1991);.. Drmanac et al, Nucl Acids Res, 19,
5839 (1991);及びDrmanacら、Int. J. Genome Res., 1, 59-79 (1992)。 5839 (1991);.. And Drmanac et al, Int J. Genome Res, 1, 59-79 (1992).

【0074】 本発明を以下の実施例で説明する。 [0074] The invention is illustrated by the following examples. 本明細書の開示を考慮すれば、当業者であれば、本発明の範囲内で、多くの他の実施態様及びバリエーションを為すことができることを認識するであろう。 Given the disclosure herein, those skilled in the art within the scope of the present invention will recognize that it is possible to make the many other embodiments and variations. 従って、本発明のより広い側面は以下の実施例の開示に限定されることは意図されていない。 Therefore, broader aspects of the present invention is not intended to be limited to the disclosure of the following examples.

【0075】 実施例1 プローブセットの調製 2タイプのプローブの普遍的セットが調製できる。 [0075] universal set of Example 1 probe set Preparation 2 types of probes can be prepared. 第1は比較的短いプローブ の完全セット(又は少なくとも非相補的サブセット)、例えば、全4096個(又は約2000個の非相補的)の6-mer、又は全16,384個(又は約8,000個の非相補的)の Complete set of first relatively short probes (or at least non-complementary subsets), e.g., all 4096 (or about 2,000 non-complementary) 6-mer of, or all 16,384 (or about 8,000 non complementary)
7-merである。 A 7-mer. 全非相補的8-merサブセット及びより長いプローブは、それらが32 All non-complementary 8-mer subsets and longer probes, they 32
,000個以上のプローブを含むためより便利ではない。 , It is not convenient than to include the 000 or more of the probe.

【0076】 第2タイプのプローブセットは、少なくとも1個のプローブによる任意の配列 のいずれのbp(塩基対)をも読み出す(reading)のに依然十分なプローブの小 さなサブセットとして選択される。 [0076] The second type of probe set is selected as one of the bp (base pairs) also read the (reading) to a small subset of the still sufficient probe of any sequence by at least one probe. 例えば、16個の2-merのうちの12個で十分である。 For example, it is sufficient with 12 of the 16 2-mer. 二本鎖DNAの配列決定のための7-mer、8-mer及び9-merの小さなサブセットは、それぞれ約3,000個、10,000個及び30,000個のプローブであり得る。 Small subset of 7-mer, 8-mer and 9-mer for sequencing double-stranded DNA is about 3,000, respectively, may be 10,000 and 30,000 probes.

【0077】 プローブセットはまた、既知配列の標的核酸を同定、及び/又は既知配列による標的核酸の対立遺伝子又は突然変異体を同定するために選択することもできる。 [0077] Probe sets also the target nucleic acid of known sequence identification, and / or allelic or mutant forms of target nucleic acid with known sequence can be selected to identify. そのようなプローブセットは、標的核酸のいずれのヌクレオチド位置も少なくとも1度読み出されるように、十分なプローブを含んでいる。 Such probe sets, as read out at least once any of the nucleotide positions of the target nucleic acid contains sufficient probe. 対立遺伝子又は突然変異体は、「プラス(positive)」プローブの1つの結合が失われることによって同定される。 Allele or mutant are identified by one bond "plus (positives)" probe is lost. これらの対立遺伝子又は突然変異体の特定配列は、次いで標的核酸と、これらのプローブ位置でのいずれかの可能なヌクレオチド交換及び交換の組み合わせを含む、プローブセットとのインターロゲーション(interrogatin Specific sequences of these alleles or mutants then the target nucleic acid, comprising a combination of any of the possible nucleotide exchange and exchange these probe position, interrogation of the probe set (Interrogatin
g)によって決定される。 g) is determined by.

【0078】 プローブセットはまた、50個のプローブからプローブの普遍的セット(特定長の全プローブ)までで構成されることができ、より好ましくはセットは、100-50 [0078] Probe sets also may be comprised of from 50 probe to universal set of probes (specific length of the entire probe), and more preferably set, 100-50
0個のプローブから構成され、最も好ましい実施態様では、プローブセットは300 Is composed of zero or probes, in a most preferred embodiment, the probe sets 300
個のプローブを含む。 Including the number of probe. 好ましい実施態様では、プローブセットは6〜9個の長さのヌクレオチドであり、cDNAクローンを類似又は同一配列のグループに集める(cl In a preferred embodiment, the probe set is 6-9 nucleotides in length, collected into groups of similar or identical sequences of cDNA clone (cl
uster)のに使用され、単一の代表クローンは配列決定のための各グループから 選択できる。 Uster) are used to, a single representative clone can be selected from each group for sequencing.

【0079】 プローブは、1〜3個の非特定の(混合されたA、T、C及びG)又は末端の普遍的な(例えば、M塩基又はイノシン)塩基による標準化学法を用いて調製できる。 [0079] Probes, 1-3 non-specific (mixed A, T, C and G) or terminal universal (e.g., M base or inosine) can be prepared using standard chemical methods with a base . 放射標識が用いられるならば、プローブは放射標識されたリン酸基による基質活性化(kinasing)のために5'末端にOH基を有することができる。 If radiolabel used, probes may have an OH group at the 5 'end for substrate activation by phosphate groups radiolabeled (kinasing). あるいは、任意の互換性のあるシステム、例えば蛍光染料などによって標識されたプローブを用いることができる。 Alternatively, any compatible system, it is possible to use a probe labeled with, for example, a fluorescent dye. プローブの他のタイプ、例えばPNA(タンパク質核酸)、又 は二本鎖安定性を変化させる修飾塩基を含むプローブも使用できる。 Other types of probes, for example, PNA (protein nucleic acids), or may be used a probe containing modified bases to alter the duplex stability.

【0080】 プローブはバーコードの付された多数ウエルプレートに貯蔵できる。 [0080] Probes can be stored in multiple well plates attached bar code. 少数のプローブには、96−ウエルプレートを使用でき、10,000個以上のプローブには、38 The small number of probes, can use the 96-well plate, the more than 10,000 of the probe, 38
4-又は864−ウエルプレートでの貯蔵が好ましい。 Storage at 4 or 864- well plates is preferred. 5〜50プレートの積み重ねで、 In a stack of 5 to 50 plate,
全プローブを貯蔵するのに十分である。 It is sufficient to store all probes. およそ5 pgのプローブで、1つのDNAサ ンプルでのハイブリダイゼーションに十分であり得る。 In the probe of approximately 5 pg, it may be sufficient for hybridization with one of the DNA samples. このように、プローブ当たり約50 mgの小さな合成から、1,000万個のサンプルが分析できる。 Thus, from a small synthesis of about 50 mg per probe, ten million samples may be analyzed. 各プローブがいつも第3サンプルに使用され、各サンプルが長さ1000 bpであるなら、その ときは、300億個を越える塩基(10人のヒトのゲノム)が、5,000個のプローブセットによって配列決定され得る。 Each probe is always used in the third sample, if the sample is 1000 bp in length, then the bases (ten human genome) above 300 billion, sequenced by 5,000 probe sets It may be.

【0081】 実施例2 修飾されたオリゴヌクレオチドを有するプローブ修飾オリゴヌクレオチドは、それに適切な条件下にハイブリダイゼーションプローブ中に導入され、使用され得る。 [0081] Probe modified oligonucleotide having a second embodiment modified oligonucleotides, it is introduced into the hybridization probe under appropriate conditions, can be used. 例えば、C 5 −位にハロゲンを有するピリミジン類は、塩基積み重ね(stack)に影響を及ぼすことにより二本鎖安定性を改 善するのに使用できる。 For example, C 5 - pyrimidines having a halogen in position, the duplex stability by affecting the base stack (stack) can be used to improve. 2,6−ジアミノプリンは、チミンとの塩基の対合の第3 水素結合を提供するのに使用でき、それによってDNA2本鎖を熱的に安定化させ ることができる。 2,6-diaminopurine may be used to provide a third hydrogen bonding base pairing with thymine, thereby DNA2 stranded may Rukoto is thermally stabilized. 2,5−ジアミノプリンの使用は2本鎖安定性を増加させ、アニ ーリングのよりストリンジェントな条件を可能にし、それによって2本鎖形成の特異性を改善し、バックグラウンドの問題を抑え、より短いオリゴマーの使用を可能にする。 The use of 2,5-diaminopurine increases the double-stranded stability, enabling more stringent conditions of Ani-ring, thereby improving the specificity of a double-stranded form, suppressing background problems, to allow for the use of a shorter oligomers.

【0082】 これらの修飾ヌクレオチド類の3リン酸化体の合成は、Hoheisel & Lehrach (1 [0082] Synthesis of 3-phosphorylated forms of these modified nucleotides is, Hoheisel & Lehrach (1
990)によって開示されている。 Disclosed by 990).

【0083】 Nicholsら(1994)によってデザインされた、非識別性(non-discriminatory) 塩基アナログ、又は普遍的塩基も使用できる。 [0083] designed by Nichols et al. (1994), non-identity (non-discriminatory) base analogs, or universal base may be used. この新規なアナログ、1−(2−デオキシ−D−リボフラノシル)−3−ニトロピロール(Mと呼ぶ)は、遺伝子コー ドの縮重の結果として起きるか、又は断片化されたペプチド配列データのみしか利用できない場合のデザインの問題を解消するためにオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー中で用いるために作り出された。 The novel analog, 1- (2-deoxy -D- ribofuranosyl) -3-nitropyrrole (referred to as M) are either occur as a result of the degeneracy of the genetic code, or fragmented peptide sequence data only only It was created for use in oligonucleotide probes and primers in order to solve the design problem of not be available. このアナログは、積み重ねを最大化する一方、DNA2本鎖を立体的に(sterically)崩壊させることなく、水 素結合相互作用を最小化する。 This analog, while maximizing the stacking, sterically DNA2 stranded (sterically) without disrupting, minimizing hydrogen-bonding interactions.

【0084】 Mヌクレオシドアナログは、ヘテロ芳香環に結合した中性極性置換基を用いて 積み重ね相互作用を最小化するようにデザインされ、鎖内及び鎖間の積み重ね相互作用を高めて塩基の対合の水素結合の役割を小さくした。 [0084] M nucleoside analogue was designed to minimize stacking interactions using aprotic polar substituents linked to heteroaromatic rings, enhancing the stacking interaction between intrachain and chain base pairing of the role of hydrogen bonding and reduced. Nicholsら(1994)は 、その誘導体が2本鎖DNAの最小の既知挿入物の1つである、p−ニトロアニリンとの構造的及び電子的類似性故に3−ニトロピロール 2−デオキシリボヌクレオシドを奨励した。 Nichols et al. (1994), the derivative is one of the smallest known insert of double-stranded DNA, encourage the structural and electronic resemblance because 3-nitropyrrole 2 deoxyribonucleosides of p- nitroaniline did.

【0085】 ヌクレオシドMのジメトキシトリチル保護されたホスホロアミダイトはまた、 配列決定及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のためのプライマーとして用いられ るヌクレオチド中に組み入れるのにも利用できる。 [0085] dimethoxytrityl protected phosphoramidite nucleoside M is also be utilized for incorporation into nucleotides that are used as primers for sequencing and polymerase chain reaction (PCR). Nicholsら(1994)は、相当な 数のヌクレオチドが、プライマーの特異性を低下させることなく、Mによって置 換できることを示した。 Nichols et al. (1994), a substantial number of nucleotides without reducing the specificity of the primers, showed to be able to substitution by M.

【0086】 Mのユニークな特性は、連続したヌクレオシドの長い糸(strings)を置換し、 [0086] A unique characteristic of M is, to replace the long thread (strings) of consecutive nucleosides,
また、機能的配列決定用プライマーを産出するその能力である。 Moreover, its ability to produce functional sequencing primers. 3、6及び9個のM 3, 6 and 9 of the M
置換を有する配列は、全て読み出し可能な(readable)配列決定用ラダー(ladd Sequences having substitutions, all possible read (readable) sequencing ladder (ladd
ers)を与えると報告されており、3個の異なるM−含有プライマーによるPCRは、 ers) give has been reported to, PCR by three different M- containing primers,
全て、正しい産物の増幅をもたらした(Nicholsら、1994)。 All resulted in amplification of the correct product (Nichols et al., 1994).

【0087】 3−ニトロピロール含有オリゴヌクレオチドのプライマーとして機能する能力 は、2本鎖構造が、相補的な鎖によって形成されているに違いないことを強く示唆する。 [0087] The ability to function as a primer 3-nitro pyrrole-containing oligonucleotides strongly suggest that double-stranded structure, must have been formed by the complementary strands. オリゴヌクレオチド対d(5−C 2 −T 5 XT 5 G 2 −3)及びd(5−C 2 A 5 YA 5 G 2 −3 Oligonucleotide pair d (5-C 2 -T 5 XT 5 G 2 -3) and d (5-C 2 A 5 YA 5 G 2 -3
)(ここで、X及びYは、A、C、G、T又はMであり得る)に対して得られる視覚的 な(optical)熱プロフィールは、DNA2本鎖から1本鎖への転移に対して観察さ れる正常なS字パターンと一致することが報告された。 ) (Wherein, X and Y, A, C, G, visual (Optical) thermal profile obtained for the possible) at T or M, with respect to transition to single-stranded from DNA2 stranded to be consistent with the normal S-shaped pattern observed Te was reported. XM塩基対(ここで、Xは、 XM base pairs (wherein, X is
A、C、G又はTであり、YはMである)を含むオリゴヌクレオチドのTm値は、全て、 A, C, G or T, Y is Tm values ​​of oligonucleotide containing a is) M are all
3℃の範囲内に入ることが報告された(Nicholsら、1994)。 To be within the scope of 3 ° C. was reported (Nichols et al., 1994).

【0088】 実施例3 プローブの選択及び標識付けサブアレイのアレイが作製されると、各ハイブリダイゼーションサイクル中で各サブアレイにハイブリダイズされるプローブセットが規定される。 [0088] When the selection and labeling subarrays of the array of Example 3 probe is produced, the probe set are hybridized to each sub-array in each hybridization cycle is defined. 例えば、38 For example, 38
4個のプローブセットは、普遍的セットから選択でき、96のプロービングを各4サイクルで行うことができる。 4 probe sets can be chosen from the universal set, probing can be done in 96 at each four cycles. 1つのサイクル中でハイブリダイズされるように選択されたプローブは、好ましくは類似のG+C含量を有する。 Selected probes as hybridized in one cycle preferably have similar G + C content.

【0089】 各サイクルのために選択されたプローブを96ウエルプレートに移し、次いで貯蔵される前にそれらが(例えば、安定な蛍光染料によって)標識されていないなら、キナージング(kinasing)によって標識するか、又は、他の標識手順によって標識する。 [0089] transferred to a 96-well plate has been a probe selected for each cycle, then if they before being stored (e.g., by a stable fluorescent dyes) are not labeled, or labeled with Kinajingu (Kinasing) or labeled by other labeling procedures.

【0090】 ハイブリダイゼーションの第1ラウンドに基づいて、新たなプローブセットが、さらなるサイクルのための各サブアレイに対して規定できる。 [0090] Based on the first round of hybridization, a new probe set can be defined for each sub-array for further cycles. 一部のアレイは、幾つかのサイクルで使用できない。 Part of an array, can not be used in some of the cycle. 例えば、64の患者サンプルのうちたった8 つしか突然変異を示さず、8個のプローブが各突然変異に対して最初に評価され るならば、そのときは、64全てのプローブが1つのサイクルで評価され、32のサブアレイは使用しない。 For example, only eight with just one of the patient sample 64 showed no mutation, if eight probes Ru are evaluated first for each mutation, then the 64 all probes in a single cycle are evaluated, 32 of the sub-array is not used. これらの未使用のサブアレイは、フィルターの乾燥を防ぐためハイブリダイゼーションバッファーで処理してもよい。 Subarrays These unused, may be treated with hybridization buffer to prevent drying of the filter.

【0091】 プローブは、貯蔵プレートから任意の便利なアプローチ、例えば単一チャンネルピペッティング装置、又はロボットステーション、例えばBeckman Biomek 100 [0091] Probes, any convenient approach from the storage plate, for example, a single channel pipetting device or a robot station, for example, Beckman Biomek 100
0(Beckman Instruments, Fullerton, California)又はMega Twoロボット(Meg 0 (Beckman Instruments, Fullerton, California) or Mega Two robot (Meg
amation, Lawrencevill, New Jersey)、などによって回収できる。 amation, Lawrencevill, New Jersey), can be recovered by such. ロボットス テーションは、データ分析プログラム及びプローブ管理プログラムによって統合され得る。 Robot stations may be integrated by the data analysis program and probe management program. これらのプログラムのアウトプットは、1つ以上のロボットステーションにインプットされ得る。 Outputs of these programs may be inputs to one or more robotic stations.

【0092】 プローブは、1つずつ回収され、ハイブリダイゼーションバッファーによって被覆されているサブアレイに添加することができる。 [0092] Probes can be one recovered, it added to a sub-array is covered by hybridization buffer. 好ましくは、回収プローブが新たなプレートに配置され、標識されるか又はハイブリダイゼーションバッファーと混合される。 Preferably, collection probe is placed in a new plate and mixed with or hybridization buffer is labeled. 好ましい回収方法は、貯蔵プレート1つずつにアクセスして、十分な量のそれぞれ各プレートから選択されたプローブを中継プレート中の特定ウエルにピペッティングする(又は金属ピンによって移す)ことによる。 A preferred recovery method is to access the one by the plates stored one, due to the fact that a sufficient amount of probe that has been selected from each plate respectively pipetted into specific wells in the relay plate (or transferring by metal pins). 個々にアドレス指定可能なピペット又はピンからなるアレイは、回収工程をスピードアップするのに使用できる。 Array of individually addressable pipettes or pins may be used to recovery step to speed up.

【0093】 実施例4 標識プローブの製造オリゴヌクレオチドプローブは、自動合成によって製造でき、そしてそれは当業者にとって日常のことであり、例えば、Applied Biosystemsのシステムを使用する。 [0093] Production oligonucleotide probe of Example 4 labeled probe can be prepared by automated synthesis, and it is that of routine to those skilled in the art, for example, using the system of Applied Biosystems. あるいは、プローブは、多孔性テフロン(Teflon)ウエーハの積層を用いるGenosys Biotechnologies Inc.法を用いて製造できる。 Alternatively, the probe may be prepared using Genosys Biotechnologies Inc. methods using a stack of porous Teflon (Teflon) wafer.

【0094】 オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、100-200 μm又は100-400 μmスポットを有するアレイに対して放射性標識( 35 S、 32 Pであり、好ましくは33 P);非 放射性同位体(Jacobsenら、1990);又は発蛍光団(Brumbaughら、1988)によ って標識できる。 [0094] Oligonucleotide probes, for example, (a 35 S, 32 P, preferably 33 P) 100-200 μm or 100-400 [mu] m radiolabel for an array having a spot; non-radioactive isotopes (Jacobsen et al. , 1990); or fluorophore (Brumbaugh et al., can be labeled me by the 1988). 全てのそのような標識方法は、Sambrookら(1989)中の適切な セクションによって及びSchubertら(1990)、Murakamiら(1991)及びCateら(1991 All such labeling methods, by appropriate sections in Sambrook et al (1989) and Schubert et al. (1990), Murakami et al. (1991) and Cate et al. (1991
)などのさらなる文献によって例示されるように、当業界で日常的であり、そし てこれらの全ての文献は参照によって本明細書中に特定的に組み込まれる。 ) As illustrated by further literature such as are routine in the art, all documents of an element is incorporated specifically herein by reference.

【0095】 放射性標識付けに関して、普通の方法は、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識化又はKlenow又はT7ポリメラーゼを用いる高比放射能標識化である。 [0095] For radioactive labeling, the usual method is a high ratio radiolabeled using terminal labeling or Klenow, or T7 polymerase using T4 polynucleotide kinase.
これらを以下に説明する。 These are described below.

【0096】 合成オリゴヌクレオチドは、それらの5'末端にリン酸基を含まないで合成され、それ故、酵素バクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いる[- 32 P] [0096] Synthetic oligonucleotides are synthesized without including a phosphate group at their 5 'ends, thus, an enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase [- 32 P]
ATP又は[- 33 P]ATPからの- 32 P又は- 33 Pの転移によって容易に標識される。 ATP or [- 33 P] from ATP - 32 P or - 33 are easily labeled by transfer of P. 反応が効率的に行われるならば、そのようなプローブの比放射能は、その[- 32 P]ATP又 は[- 33 P]ATPそれ自身の比放射能と同じくらい高くなり得る。 Provided that the reaction is carried out efficiently, the specific activity of such probes, the [- 32 P] ATP or [- 33 P] can be as high as ATP itself specific activity. 下記反応は、10 pm The following reaction is, 10 pm
oleのオリゴヌクレオチドを高い比放射能で標識するためにデザインされる。 It is designed to label ole oligonucleotide at high specific activity. 異 なる量のオリゴヌクレオチドの標識化は、反応サイズを増加又は減少して、全ての構成要素の濃度を一定に維持することによって容易に達成できる。 Labeling of different amounts of oligonucleotide, reaction size increases or decreases, and can be easily accomplished by maintaining the concentration of all components constant.

【0097】 反応混合物は、10μlのオリゴヌクレオチド(10 pmole/μl);2.0μlの10× バクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー;5.0μlの[- 32 P]AT [0097] The reaction mixture, 10 [mu] l of the oligonucleotide (10 pmole / μl); 10 × bacteriophage T4 polynucleotide kinase buffer 2.0 .mu.l; of 5.0μl [- 32 P] AT
P又は[- 33 P]ATP(比放射能5000 Ci/mmole;水溶液中10 mCi/ml)(10 pmole); P or [- 33 P] ATP (specific activity 5000 Ci / mmole; 10 mCi / ml in aqueous solution) (10 pmole);
及び11.4μlの水を用いて作られるであろう。 And it will be made using water 11.4Myueru. 8単位(約1μl)のバクテリオファ ージT4ポリヌクレオチドキナーゼを、反応混合物に添加し、37℃で45分間インキュベートする。 The bacteriophage chromatography di T4 polynucleotide kinase 8 units (about 1 [mu] l), was added to the reaction mixture and incubated for 45 minutes at 37 ° C.. 反応物を68℃で10分間加熱し、バクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化する。 The reaction was heated 10 minutes at 68 ° C., to inactivate the bacteriophage T4 polynucleotide kinase.

【0098】 32 P又は33 Pのオリゴヌクレオチドへの転移効率及びその比放射能を次いで測定する。 [0098] 32 measuring is then transposition efficiency and specific activity of the P or 33 P oligonucleotide. プローブの比放射能が許容可能であれば、それを精製する。 Specific activity of probes acceptable, purification. 比放射能が低すぎるなら、追加の8単位の酵素を添加し、酵素を不活性化するために反応物を6 If the specific activity is too low, the addition of enzyme additional 8 units, the reaction in order to inactivate the enzyme 6
8℃で10分間加熱する前に、さらに37℃で30分間インキュベートする。 Before heating for 10 minutes at 8 ° C., incubated further 37 ° C. for 30 minutes.

【0099】 放射標識オリゴヌクレオチドの精製は、例えば、エタノールによる沈殿;臭化セチルピリジニウムによる沈殿;バイオ−ゲルP-60によるクロマトグラフィー; [0099] Purification of radiolabeled oligonucleotides, for example, precipitation with ethanol; precipitation with cetylpyridinium bromide; Bio - chromatography by gel P-60;
若しくはSep-Pak C 18カラムでのクロマトグラフィー、又はポリアクリルアミド ゲル電気泳動によって達成できる。 Or Sep-Pak chromatography on a C 18 column, or can be accomplished by polyacrylamide gel electrophoresis.

【0100】 より高い比放射能を有するプローブは、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片を用いて合成オリゴヌクレオチドに相補的なDNA鎖を合成することによって得ら れる。 Probe having a higher specific activity [0101] is obtained, et al is by synthesizing a DNA strand complementary to the synthetic oligonucleotide with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I. 短いプライマーを、配列が所望の放射標識プローブの相補体(complement Short primer, sequence complement of the desired radiolabeled probe (complement
)であるオリゴヌクレオチド鋳型にハイブリダイズさせる。 ) Is hybridized to an oligonucleotide template it is. そして、プライマーを、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片を用いて鋳型指令法(template-direc Then, a primer, with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I template instruction method (template-direc
ted manner)で[- 32 P]dNTP又は[- 33 P]dNTPを導入することによって伸長する。 In ted manner) [- 32 P] dNTP or [- 33 P] extended by introducing dNTPs. 反応後、鋳型及び生成物を、変性し、変性条件下でのポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって分離する。 After the reaction, the template and product was denatured, separated by electrophoresis on polyacrylamide gels under denaturing conditions. この方法によれば、オリゴヌクレオチド分子当たり幾つかの放射活性原子を含むオリゴヌクレオチドプローブを作製することが可能である。 According to this method, it is possible to produce the oligonucleotide probes comprise several radioactive atoms per oligonucleotide molecule.

【0101】 この方法を利用するには、所望の比放射能を達成し、全ての鋳型鎖の合成を完了させるのに十分な計算量の[a- 32 P]dNTP又は[a- 33 P]dNTPを、微小遠心管中で混合する。 [0102] To use this method, to achieve the desired specific activity, [a- 32 P] sufficient computational to complete the synthesis of all template strands dNTP or [a- 33 P] the dNTPs, mixed in microcentrifuge tubes. 次いで、この管に適当量のプライマー及び鋳型DNAを、プライマーを鋳 型よりも3〜10倍モル過剰にして添加する。 Then, the primer and template DNA of an appropriate amount to the tube, is added in 3-10-fold molar excess over type cast primers.

【0102】 次いで、0.1倍容量の10×Klenowバッファーを添加し、よく混合する。 [0102] Then, the addition of 10 × Klenow buffer 0.1 volumes, mix well. 次に、2 Then, 2
-4単位の大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片を反応容量5μlごとに添加し、混合し、4℃で2-3時間インキュベートする。 The Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I -4 units were added per reaction volume 5 [mu] l, mixed and incubated for 2-3 hours at 4 ° C.. 所望ならば、反応の進行を、少量の( If desired, the progress of the reaction, a small amount of (
0.1μl)アリコートを取り出し、10%トリクロロ酢酸(TCA)によって沈殿可能になる放射活性の割合を測定することによってモニターできる。 0.1 [mu] l) aliquots were removed, it can be monitored by measuring the percentage of radioactivity become precipitable with 10% trichloroacetic acid (TCA).

【0103】 反応物は、ゲルローディング(gel-loading)バッファーの等容量によって希 釈し、80℃へ3分間加熱し、次いで全サンプルを変性ポリアクリルアミドゲル上 にローディングする。 [0103] The reactants, by an equal volume of gel loading (gel-loading) buffer was diluted and heated to 80 ° C. 3 min, then loading the entire sample on a denaturing polyacrylamide gel. 電気泳動に続き、ゲルをオートラジオグラフィーにかけ、 Following electrophoresis, multiplied by the gel in autoradiography,
プローブを局在化し、ゲルから除去する。 A probe localized, removed from the gel. 蛍光プローブ標識付けの多様な方法もまた利用でき、例えば、Brumbaughら(1988)は、蛍光的に標識されたプライマー の合成を記載している。 Various methods fluorophores labeling also available, for example, Brumbaugh et al. (1988) describes a fluorescent synthesized labeled primers. C-5位に結合している12個の原子からなる第1アミンの 「リンカーアーム(linker arm)」を有するデオキシウリジン類似体を合成する。 Synthesizing deoxyuridine analog with a "linker arm (linker arm)" primary amine of 12 atom bound to the C-5 position. 類似体の合成は、有機金属中間体を介して2−デオキシウリジンを誘導して5- (メチルプロペニル)-2-デオキシウリジンを得ることからなる。 Synthesis of analogs consists of obtaining through an organometallic intermediate to induce 2-deoxyuridine 5 (methylpropenyl) 2-deoxyuridine. 塩化ジメトキ シトリチル生成物による反応は、対応する5-ジメトキシトリチル付加生成物を生成する。 Reaction with chloride dimethoxy Shitorichiru product generates a corresponding 5-dimethoxytrityl adduct. このメチルエステルを加水分解し、活性化し、適切にモノアシル化されたアルキルジアミンと反応させる。 The methyl ester was hydrolyzed, activated, to properly react with monoacylated alkyl diamine. 精製後、得られたリンカーアームヌクレオシドを化学オリゴヌクレオチド合成に好適なヌクレオシド類似体に変換する。 After purification, to convert the resulting linker arm nucleoside Suitable nucleoside analogs chemical oligonucleotide synthesis.

【0104】 1又は2個のリンカーアーム塩基を含むオリゴヌクレオチドは、次いで修飾ホスホリダイト化学法を用いて作られる。 [0104] 1 or oligonucleotide containing two linker arm bases are then made using modified Hosuhoridaito chemistry. 500 mM炭酸ナトリウム(pH 9.4)25μl中 の50 nmolリンカーアームオリゴヌクレオチドの溶液に、ジメチルスルホキシド 中300 mM FITCの20μlを添加する。 To a solution of 50 nmol linker arm oligonucleotide in 500 mM sodium carbonate (pH 9.4) in 25 [mu] l, the addition of 20μl of dimethylsulfoxide 300 mM FITC. 混合物を室温で6時間攪拌する。 The mixture is stirred at room temperature for 6 hours. 1×30 cmセ ファデックス(Sephadex)G-25カラムから20 mM酢酸アンモニウム(pH 6)で溶 出し、第1のUV吸収ピークの画分を合わせることによって、オリゴヌクレオチドを遊離のFITCから分離する。 1 × out 30 cm cell file index (Sephadex) soluble in G-25 column from 20 mM ammonium acetate (pH 6), by combining a fraction of the first UV absorbing peak to separate the oligonucleotides from free FITC .

【0105】 一般に、その5'末端でのオリゴヌクレオチドの蛍光標識は、2つの工程を含む。 [0105] In general, fluorescent labeling of oligonucleotides at the 5 'end, includes two steps. 第1は、N−保護アミノアルキルホスホルアミダイト誘導体を、自動核酸合成 の間にオリゴヌクレオチドの5'末端に付加する。 First adds the N- protected aminoalkyl phosphoramidite derivative, the 5 'end of the oligonucleotide during automated nucleic acid synthesis. 全ての保護基を除去した後、適切な蛍光染料のNHSエステルを5'−アミノ基と一晩カップリングし、次いで逆相H After removal of all protecting groups, and suitable fluorescent overnight coupling the 5'-amino group of the NHS ester of the dye, followed by reverse-phase H
PLC又はPAGEを用いて過剰の染料から標識オリゴヌクレオチドを精製する。 Purifying labeled oligonucleotide from the excess dye with a PLC or PAGE.

【0106】 Schubertら(1990)は、フルオレセインによって標識されたオリゴヌクレオチ ドが自動DNA合成の間に製造されるのを可能にするホスホルアミダイトの合成を 報告した。 [0106] Schubert et al. (1990) reported the synthesis of phosphoramidite that enables the oligonucleotide de labeled with fluorescein is produced during automated DNA synthesis.

【0107】 Murakamiらも、フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの製造を報告した。 [0107] Murakami et al. Also reported the production of fluorescein-labeled oligonucleotides. Cateら(1991)は、プローブ検出を可能にする直接化学発光基質(AMPPD)との 組み合わせでアルカリホスファターゼに直接コンジュゲートされるオリゴヌクレオチドプローブの使用を報告している。 Cate et al (1991) have reported the use of direct chemiluminescent substrate (AMPPD) in combination with oligonucleotide probes directly conjugated to alkaline phosphatase that allows probe detection.

【0108】 標識プローブは、合成するよりもむしろ、GENSETを含めて多様な商業的ソースから容易に購入できるだろう。 [0108] labeled probes, rather than synthesis, could be easily purchased from a variety of commercial sources, including GENSET.

【0109】 他の標識は、標識抗体に特異的に結合するメンバーとして働くことができるリガンド、化学発光体、酵素、標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして働くことができる抗体などを含む。 [0109] Other labels include ligands that can serve as a member that specifically binds to a labeled antibody, chemiluminescers, enzymes, antibodies which can serve as specific binding pair members for a labeled ligand. 広く多様な標識は、容易に利用できるイムノアッセイで用いられてきた。 A wide variety of labels have been used in immunoassays readily available. また、他の標識は、抗原、特異的な反応性を有する基、及び電気化学的に検出可能な成分を含む。 Further, other labels include antigens, groups with specific reactivity, and electrochemically detectable moieties.

【0110】 一般に、エレクトロフォア質量標識(electrophore mass labels: EML)によ る核酸の標識は、例えば、Xuら、J. Chromatography 764:95-102 (1997)に記載 されている。 [0110] In general, electro Fore mass labels: labels by that nucleic acid (electrophore mass labels EML), for example, Xu et al., J Chromatography 764:. Are described in 95-102 (1997). エレクトロフォアは、電子捕獲質量分光分析(EC-MS)によって高 い感度で検出できる化合物である。 Electro Fore is a compound which can be detected with high have sensitivity by electron capture mass spectrometry (EC-MS). EMLは、ヌクレオチドを可逆的に修飾するた めに当業界で周知の化学(例えば、周知のヌクレオチド合成化学は、分子を保護基としてのヌクレオチドに結合するための多様な方法を教示している)を用いてプローブに結合できる。 EML is well known chemical in order to reversibly modified nucleotide in the art (e.g., a known nucleotide synthesis chemistry, teaches various methods for binding to the nucleotide as a protecting group of the molecule) It can be coupled to the probe used. EMLは、多様な周知の電子捕獲質量分光分析装置(例え ば、Finnigan Corporationによって販売されている装置)を用いて検出される。 EML is (for example, devices sold by Finnigan Corporation) variety of well known electron capture mass spectrometer are detected using.
さらに、EMLの検出に使用できる技術は、例えば、高速原子ボンバードメント(f Furthermore, the techniques can be used to detect the EML, for example, fast atom bombardment (f
ast atomic bombardment)質量分析(例えば、Kosterら、Biomedical Environ, ast atomic bombardment) mass spectrometry (e.g., Koster et al, Biomedical Environ,
Mass Spec. 14:111-116 (1987)を参照);プラズマ脱着質量分析;エレクトロスプレー/イオンスプレー法(例えば、Fennら、J. Phys. Chem. 88:4451-59 (198 . Mass Spec 14: 111-116 (1987)); Plasma desorption mass spectrometry; electrospray / ion spray method (e.g., Fenn et al, J Phys Chem 88:... 4451-59 (198
4)、国際出願第WO90/14148、Smithら、Anal. Chem. 62:882-89 (1990)を参照さ れたい);及びマトリックス補助レーザー脱着/イオン化法(Hillenkampら、"M .. 4), International Application No. WO90 / 14148, Smith et al., Anal Chem 62: 882-89 (see 1990)); and matrix assisted laser desorption / ionization (Hillenkamp et al., "M
atorix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass S atorix Assisted UV-Laser Desorption / Ionization: A New Approach to Mass S
pectrometry of Large Biomolecules." Biological Mass Spectrometry (Burlin pectrometry of Large Biomolecules. "Biological Mass Spectrometry (Burlin
game及びMacCloskey編集)、Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 49 game and MacCloskey editing), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 49
-60, 1990);Huth-Fehreら、"Matrix Assisted Laser Desorption Mass Spectr -60, 1990); Huth-Fehre et al., "Matrix Assisted Laser Desorption Mass Spectr
ometry of Oligodeoxythymidylic Acids", Rapid Communications in Mass Spec ometry of Oligodeoxythymidylic Acids ", Rapid Communications in Mass Spec
trometry, 6:209-13 (1992))を含む。 trometry, 6: including 209-13 (1992)).

【0111】 好ましい実施態様では、EMLは光感受性の共有結合によってプローブに結合さ れている。 [0111] In a preferred embodiment, EML is coupled to the probe by the covalent attachment of the light-sensitive. EMLは、標的核酸とのハイブリダイゼーション後、レーザー又は所望 の波長の光を発する他の光源によってプローブから放出される。 EML after hybridization with the target nucleic acid is released from the probe by the other light sources emitting light of a laser or a desired wavelength. EMLは、次いでG EML is, then G
C-MS(ガスクロマトグラフ−質量分析計)又は他の適切な装置に送り込まれ、その質量によって同定される。 C-MS - fed into (a gas chromatograph mass spectrometer) or other suitable device, identified by its mass.

【0112】 実施例5 配列決定用チップ及びアレイの作製基本的な実施例では、20×20 cmのアレイを得るために組み合わせることがで きる3×3 mmの寸法のチップを得るために50ミクロン表面に結合された6-merを使用する。 [0112] In the production basic embodiment of Example 5 Sequencing chips and arrays, 20 × 20 cm as possible out combined it in order to obtain the array 3 × 3 mm 50 microns in order to obtain the size of the chips using the 6-mer bound to the surface. もう1つの実施例では、5×5 mmの寸法の9-merチップ(そのようなチップの4000単位が30×30 cmアレイを作るのに使用される)を作る10×10ミクロン 表面に結合された9-merオリゴヌクレオチドを使用する。 In another embodiment, coupled to a 10 × 10 microns surface to create a 9-mer chip size of 5 × 5 mm (4000 units of such chips are used to make 30 × 30 cm array) the use of the 9-mer oligonucleotide. 4,000〜16,000個のオリゴチップを含むアレイは、正方形のアレイに配列される。 Arrays containing 4,000~16,000 amino oligo chip are arranged in a square array. 描写されるような、プレート、又は管の収集物は、配列決定用キットの一部としてアレイとともにパッケージすることができる。 As depicted, plate, or collection of tubes, can be packaged with the array as part of a kit for sequencing.

【0113】 アレイは、互いに物理的に又は疎水性表面によって分離できる。 [0113] array may be separated by physical or hydrophobic surfaces to one another. 疎水性ストリップ(strip)分離を利用するための1つの可能な方法は、QA Laboratories, Tr One possible way to utilize the hydrophobic strip (strip) separation, QA Laboratories, Tr
onto, Canadaによって製造されたIso-Grid Microbiology Systemなどの技術を使用することである。 ONTO, it is to use a technique such as Iso-Grid Microbiology System produced by Canada.

【0114】 疎水性グリッド(grid)膜フィルター(HGMF)は、それらが拡張された数値範囲及びコロニーの自動計数というユニークな魅力(attractions)を示す場合、 約10年間分析食品微生物学で用いられてきた。 [0114] Hydrophobic grid (grid) membrane filter (HGMF), when showing the unique charm (Attractions) that automatic counting of them extended numerical range and colony, have been used for about 10 years analyzing food microbiology It was. 1つの商業的に入手可能なグリッドは、その上に1600個(40×40)の正方形のセルからなる黒色の疎水性インクグリッドが印刷された、ポリスルホンポリマー(Gelman Tuffryn HT-450, 0.45μ ポアサイズ)の正方形(60×60 cm)からなるQA Laboratories Ltd. (Toronto, One commercially available grid thereon 1600 to (40 × 40) black hydrophobic ink grid consisting of square cells of printed, polysulfone polymer (Gelman Tuffryn HT-450, 0.45μ pore size QA Laboratories Ltd. (Toronto consisting of a square (60 × 60 cm) of),
Canada)のISO-GRID(登録商標)である。 Canada) which is the ISO-GRID (registered trademark). HGMFは、吸引濾過によって細菌懸濁液 と共に予め植え付けられ、選択された(of choice)、異なる又は選択的な培地 上でインキュベートされる。 HGMF is previously planted with bacterial suspension by suction filtration, it was selected (of choice), and incubated on different or selective media.

【0115】 微生物生育は、膜上の既知の位置及びサイズを有するグリッドセルに制限されるので、HGMF機能は従来のプレート又は膜フィルターよりもMPN装置に類似して いる。 [0115] microbial growth is because it is restricted to grid cells of known position and size on the membrane, HGMF functions is similar to the MPN apparatus than a conventional plate or membrane filter. Peterkinら(1987)は、HGMFレプリケータと共に使用する場合、これらの Peterkin et al. (1987), when used with HGMF replicator, these
HGMFがゲノムライブラリーを増やして貯蔵するのに使用できることを報告した。 HGMF has been reported that can be used to store increase the genomic library.
1つのそのような器具は、ISO-GRIDの1600個の各セルから増殖(growth)を複製し、作られるマスターHGMFの多くのコピーを可能にする(Peterkinら、1987)。 One such instrument replicates growth from 1600 each cell in the ISO-GRID (growth), allows many copies of the master HGMF to be made (Peterkin et al., 1987).

【0116】 Sharpeら(1989)はまた、QA Laboratories からのISO-GRID HGMFおよび自動H [0116] Sharpe et al. (1989) also, from the QA Laboratories ISO-GRID HGMF and automatic H
GMF計数器(MI-100インタプリタ)及びRP-100レプリケータを使用した。 GMF counter the (MI-100 Interpreter) and RP-100 Replicator was used. 彼らは 、多くの微生物培養物を維持し、スクリーニングする技術を報告した。 They are, to maintain many of the microbial culture, reported the screening technology.

【0117】 Peterkin及び同僚は、疎水性グリッド膜フィルター(Peterkinら、1989)を使用したDNAプローブのスクリーニング方法を後に報告した。 [0117] Peterkin and colleagues, hydrophobic grid membrane filter (Peterkin et al., 1989) was reported after a screening method of DNA probes were used. これらの著者は、HGM These authors, HGM
F上での効率のよい直接コロニーハイブリダイゼーション方法を報告した。 Good direct efficient on F reported colony hybridization method. 以前 は、HGMFが上にプリントされたエポキシスルホンポリマーの低いDNA結合能のた めに、貧弱な結果しか得られなかった。 Previously, HGMF is in order with the low DNA binding capacity of printed epoxy sulfone polymer above, was only obtained poor results. しかしながら、Peterkinら(1989)は、 However, Peterkin et al. (1989),
膜表面へのDNAの結合が、DNAに接触する前に、複製されインキュベートされたHG The binding of DNA to the membrane surface, before contacting the DNA, and incubated replicated HG
MFをポリエチレンイミン、ポリカチオンによって処理することによって改善されることを報告した。 MF was reported to be improved by treating polyethyleneimine, by polycations. この初期の研究は、細胞性DNA結合を使用し、本発明とは異 なる目的を有しているが、記載された方法は、フォーマット3 SBHに容易に適用 できる。 This early work uses cellular DNA-binding, method although the present invention has a different purpose, which is described can be easily applied to the format 3 SBH.

【0118】 有用な配列を迅速に同定するために、Peterkinら(1989)は、種々のクローン由来の放射標識プラスミドDNAを使用し、製造されたHGMF上のDNAに対するその特異性を試験した。 [0118] In order to rapidly identify useful sequences, Peterkin et al. (1989), using radiolabeled plasmid DNA from various clones and tested its specificity against the DNA on the prepared HGMF. この方法では、組換えプラスミド由来のDNAは、容易にそして 再現性をもって製造できるHGMF上の100個の微生物に対するコロニーハイブリダ イゼーションによって迅速にスクリーニングされた。 In this way, DNA from recombinant plasmids was rapidly screened by easily and colony hybrida homogenization for 100 microorganisms on HGMF be produced reproducibly.

【0119】 小さな(2-3 mm)チップを用いた操作、および数千の反応の平行実施。 [0119] Small (2-3 mm) parallel implementation of operation using the chip, and thousands of reactions. 本発明の解決策は、チップ及びプローブを対応するアレイ中に維持することである。 The solution of the invention is to maintain the chip and probes in the corresponding arrays. 1
つの実施例では、250,000個の9-merを含むチップを、中間に1 mMの溝を有する8 ×12フォーマット(96個のチップ)で整列された、8×8 mMプレート(15μM/オリゴヌクレオチド、Peaseら、1994)の形状のシリコンウエハー上に合成する。 One of the examples, a chip containing 250,000 9-mer, aligned with 8 × 12 format having a groove of the intermediate to 1 mM (96 chips), 8 × 8 mM plates (15 [mu] M / oligonucleotide, Pease et al., synthesized on a silicon wafer in the form of 1994). プローブを、多チャンネルピペット又はピンアレイのいずれかによって、1つのチップ上に1つのプローブを添加する。 Probes, either by multichannel pipette or pin array, adding one probe on one chip. 全ての4000個の6-merを評価するために は、異なるものを使用するか、又はチップアレイの1つのセットを何回も再使用するかのいずれかによって、42のチップアレイを使用しなければならない。 To evaluate all 4000 6-mer can either use different, or by either of the one set of chip arrays be reused many times, without the use of 42 chips array shall.

【0120】 上記の場合には、本出願の当初の命名法を使用すると、F=9;P=6;及びF+P=15 [0120] In the above case, by using the original nomenclature of the application, F = 9; P = 6; and F + P = 15
である。 It is. チップは、式BxNn(ここで、xは特定塩基Bの数であり;nは非特定塩基 の数であり、その結果x=4〜10であり、n=1〜4である)で示されるプローブを有 することができる。 Chips, wherein BxNn (wherein, x is the number of specific bases B; n is the number of non-specific base is the result x = 4 to 10, n = 1 to 4) shown by it is possible to have a probe. より効率的なハイブリダイゼーションを達成し、かつ任意の支持(support)オリゴヌクレオチドの潜在的な影響を避けるためには、特定塩 基を非特定塩基で囲むことができ、従って、(N)nBx(N)mなどの式で表すことができる。 To achieve more efficient hybridization, and to avoid potential influence of any support (support) oligonucleotide can be enclosed specific salt group in a non-specific base, therefore, (N) NBX ( it can be expressed by the formula, such as N) m.

【0121】 チップのもう1つの実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを支持する基体は、セクションに区分されており、アレイ中の各プローブは、例えば、疎水性材料であり得る物理的バリアーによって隣のプローブから分離されている。 [0121] In another embodiment of the chip, the substrate supporting the array of oligonucleotide probes is divided into sections, each probe in the array, for example, next to the physical barrier, which may be a hydrophobic material It is separated from the probe. 好ましい実施態様では、物理的バリアーは、幅300μm〜30μmを有し、各物 理的バリアーの中心から隣の物理的バリアーの中心の間の距離は、少なくとも32 In a preferred embodiment, the physical barrier has a width 300Myuemu~30myuemu, the distance between the center of the physical barriers adjacent the center of each physical barrier is at least 32
5μmである。 It is 5μm.

【0122】 好ましい実施態様では、疎水性材料は、基体上に配置され、適切なロボットシステムに結合された、インクジェットヘッドを使用して所望の幅のバリアーを形成する。 In [0122] preferred embodiment, the hydrophobic material is disposed on a substrate, coupled to a suitable robot system, using the ink-jet head to form a barrier of desired width. 例えば、所望の疎水性材料(例えば、溶媒が蒸発した後にバリアーを形成する油系材料)の懸濁液又は溶液をアプライするのに適合する、微小滴液量ヘッドは、アノラドガントリー(anorad gantry)システムと結合でき、適切なハ ウジング及び分配システムにはめ込むことができ、疎水性材料のグリッドは、基体上に多数のウエルを形成する所望の基体上に適用できる。 For example, the desired hydrophobic materials (e.g., solvent oil-based material forming the barrier after evaporation) adapted to apply a suspension or solution of the microdroplets fluid volume head, anode rads gantry (Anorad gantry ) system and can be combined, can be fitted into the appropriate housings and distribution system, the grid of hydrophobic material may be applied onto a desired substrate to form a large number of wells on the substrate. 疎水性材料のグリッドを形成した後、グリッド形成に使用されたが、プローブの溶液又は懸濁液をアプライするのに適用したロボットシステムと類似のロボットシステムを使用して、異なるプローブが各ウエル上にスポットされる(又はプローブの混合物を各ウエルにアプライする)。 After forming a grid of hydrophobic material it has been used in a grid formation, using a robotic system similar robotic system applied to apply a solution or suspension of the probes, different probes on each well It is spotted (or applied a mixture of probes to each well). 1つの実施態様では、同じロボットシステムが、疎水性グリッド及びプローブに適用するために使用される。 In one embodiment, the same robotic system is used to apply the hydrophobic grid and probe. この実施態様では、分配システムは、疎水性グリッドがアプライされた後に水で洗い流され、次いでプローブの送達のためにプライムされる(primed)。 In this embodiment, the dispensing system is flushed with water after the hydrophobic grid is applied, then primed for delivery of the probe (primed).

【0123】 実施例6 支持体結合オリゴヌクレオチドの製造オリゴヌクレオチド、すなわち、小さな核酸セグメントは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して普通に実施される、化学手段によってオリゴヌクレオチドを直接合成することによって容易に製造できる。 [0123] Example 6 support bound oligonucleotide of manufacturing an oligonucleotide, i.e., small nucleic acid segments, e.g., is normally carried out using an automated oligonucleotide synthesizer, direct synthesis of oligonucleotides by chemical means It can be readily prepared by.

【0124】 一般に、オリゴヌクレオチドは、適切な反応基によって支持体に結合できる。 [0124] Generally, oligonucleotides can be bound to a support by a suitable reactive group.
そのような基は、当業界で周知であり、例えば、アミノ(−NH 2 );ヒドロキシ ル(−OH);又はカルボキシル(−CO 2 H)基を含む。 Such groups are well known in the art, for example, amino (-NH 2); containing or carboxyl (-CO 2 H) group; hydroxylation (-OH). 支持体に結合されたオリゴヌクレオチドは、ガラス、ポリスチレン又はテフロンなどの任意の好適な支持体を使用した当業者に公知の任意の方法によって製造できる。 Oligonucleotide bound to the support, a glass can be produced by any method known to those skilled in the art using any suitable support such as polystyrene or teflon. 1つの方法は、標準合成装置によって合成されたオリゴヌクレオチドを正確にスポットすることである。 One method is to precisely spot oligonucleotides synthesized by standard synthesizers. 固定化は、例えば、受動吸着(passive adsorption)を使用して(Inouye & Immobilization may, for example, using passive adsorption (passive adsorption) (Inouye &
Hondo, 1989):UV光を使用して(Nagataら、1985;Dahlenら、1987;Morriey 及びCollins、1989):若しくは塩基修飾DNAの共有結合による(Kellerら、1988 Hondo, 1989): using UV light (Nagata et al., 1985; Dahlen et al., 1987; Morriey and Collins, 1989): or by covalent binding of base modified DNA (Keller et al., 1988
;1989);又はプローブと支持体の間のアミド基の形成による(Wallら、1995; ; 1989); or by the formation of an amide group between the probe and the support (Wall et al., 1995;
Chebabら、1992;及びZhangら、1991);(全ての文献は本明細書中に特定的に 組み入れられる)方法を含む多くの方法によって達成できる。 Chebab et al., 1992; and Zhang et al., 1991); (All documents can be accomplished by a number of methods including specifically incorporated are) method herein.

【0125】 利用できるもう1つの方法は、リンカーとしての強いビオチン−ストレプトアビジン相互作用の使用である。 [0125] Another method that can be used is, strong biotin as a linker - is the use of streptavidin interaction. 例えば、Broudeら(1994)は、それらは二本鎖プローブであるが、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上に固定されたビオチン化プローブの使用を報告している。 For example, Broude et al. (1994), they are a double-stranded probe, report the use of immobilized biotinylated probe to the streptavidin coated magnetic beads. ストレプトアビジン被覆ビーズは、Dynal、Osl Streptavidin coated beads, Dynal, Osl
oから購入することができるのはもちろん、この同じ結合化学方法は、ストレプ トアビジンによる任意の表面をコーティングするのに適用できる。 It can be purchased from o, of course, this same linking chemistry method is applicable to coating any surface with Strep Toabijin. ビオチン化プローブは、例えば、Operon Technologies(Alameda, CA)などの種々の供給源から購入できる。 Biotinylated probes, for example, can be purchased from Operon Technologies (Alameda, CA) a variety of sources, such as.

【0126】 Nunc Laboratories (Naperville, IL)も、使用できる好適な材料を販売している。 [0126] Nunc Laboratories (Naperville, IL) is also selling suitable material that could be used. Nunc Laboratoriesは、DNAがコバリンクNH(Covalink NH)と呼ばれるミク ロウエル表面に共有結合できる方法を開発した。 Nunc Laboratories have developed a method in which the DNA can be covalently bound to Miku Lowell surface called CovaLink NH (Covalink NH). コバリンクNHは、さらなる共有結合のための架橋ヘッドとして働く2級アミノ基(>NH)によってグラフト化されたポリスチレン表面である。 CovaLink NH is a grafted polystyrene surface by secondary amino groups (> NH) that serve as bridge head for further covalent coupling. コバリンクモジュール(CovaLink Modules)は、 Koba link module (CovaLink Modules) is,
Nunc Laboratoriesから購入できる。 It can be purchased from Nunc Laboratories. DNA分子は、ホスホロアミデート結合によって5'末端でコバリンクに独占的に結合でき、1 pmolを超えるDNAの固定化を可能 にする(Rasmussenら、1991)。 DNA molecules are CovaLink at 5 'end by phosphoramidate bond can exclusively bind to permit immobilization of the DNA in excess of 1 pmol (Rasmussen et al., 1991).

【0127】 5'末端でのDNA分子の共有結合のためのコバリンクNHストリップの使用が報告 されている(Rasmussenら、1991)。 [0127] 5 'use of CovaLink NH strips for covalent binding of DNA molecules at the end has been reported (Rasmussen et al., 1991). この技術では、ホスホルアミダイト結合が 利用される(Chuら、1983)。 In this technique, phosphoramidite coupling is utilized (Chu et al., 1983). 単共有結合のみを使用する固定化が好ましいので 、これは有益である。 Since immobilization using only a single covalent bond is preferred, which it is beneficial. ホスホルアミダイト結合は、DNAを、2 nmの長さのスペー サーアームによってポリスチレン表面上に共有的にグラフト化されるスペーサーアームの末端に位置するコバリンクNHの2級アミノ基に結合させる。 Phosphoramidite bonds, DNA and is coupled by 2 nm of the length of the space Saamu the secondary amino group of CovaLink NH is located at the end of the spacer arm is covalently grafted onto the polystyrene surface. オリゴヌク レオチドをホスホルアミデート結合を介してコバリンクNHに結合させるには、オリゴヌクレオチド末端は5'末端リン酸基を有していなければならない。 Origonuku Reochido to be bound to CovaLink NH via an phosphoramidate bond, the oligonucleotide terminus must have a 5'-terminal phosphate group. 恐らく、 perhaps,
ビオチンが、コバリンクに共有結合され、次いでストレプトアビジンがプローブを結合するのに使用されることでさえ可能であろう。 Biotin is covalently bound to CovaLink and then streptavidin could be even that used to bind the probes.

【0128】 より詳細には、結合方法は、DNAを水(7.5 ng/μl)中に溶解し、95℃で10分 間変性させ、氷の上で10分間冷却することを含む。 [0128] More specifically, binding method comprises the DNA was dissolved in water (7.5 ng / μl), denatured for 10 min at 95 ° C., cooled on ice for 10 minutes. 次いで、氷冷された0.1 M 1 −メチルイミダゾール、pH 7.0(1-MeIm 7 )を添加して最終濃度10 mM 1-Melm 7にする。 Then, ice-cold 0.1 M 1 - methylimidazole, to a final concentration 10 mM 1-Melm 7 by addition of pH 7.0 (1-MeIm 7) . 次いで、ss DNA溶液を氷上に置かれたコバリンクNHストリップ上に分注する。 Then, dispense ss DNA solution onto CovaLink NH strips placed on ice.

【0129】 10 mM 1-Melm 7中に溶解したカルボジイミド、0.2 M 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)を新たに調製し、ウエル当たり2 [0129] carbodiimide dissolved in 10 mM 1-Melm 7, 0.2 M 1- ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) - carbodiimide (EDC) freshly prepared, well per 2
5μl添加する。 The addition of 5μl. ストリップを50℃で5時間インキュベートする。 The strips incubated for 5 hours at 50 ° C.. インキュベーシ ョン後、ストリップを、例えば、ヌンク−イムノウオッシュ(Nunc-Immuno Wash After Inkyubeshi ® down, the strip, e.g., Nunc - immuno wash (Nunc-Immuno Wash
)を使用して洗浄する。 ) Be cleaned using. すなわち、最初にウエルを3回洗浄し、次いで洗浄液で5 That is, 5 first wells were washed 3 times and then with a washing solution
分間浸し、最後に3回洗浄する(ここで、洗浄液は、50℃に加熱された0.4 N NaO Min soak, and finally washed three times (where the cleaning solution, 0.4 N NaO heated to 50 ° C.
H, 0.25% SDSを含む)。 H, including a 0.25% SDS).

【0130】 本発明による使用のためのさらに好適な方法は、参照によって本明細書中に組み入れられる、PCT特許出願第WO90/03382号(Southern及びMaskos)に記載のも のであると考えられる。 [0130] A more preferred method for use according to the invention, are incorporated herein by reference, believed to be the than described in PCT Patent Application No. WO90 / 03382 (Southern and Maskos). 支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを製造する方法は、共有ホスホジエステル結合によりリン酸基を介してヌクレオシド3'−試薬を、支持体に担持されている脂肪族ヒドロキシル基に結合することを含む。 Method of producing a binding oligonucleotide to the support, includes coupling a nucleoside 3'-reagent through the phosphate group by a covalent phosphodiester bond, the aliphatic hydroxyl groups carried on the support. 次に、 next,
オリゴヌクレオチドは、支持されたヌクレオシド上で合成され、支持体からオリゴヌクレオチドが切断されない標準条件下に合成オリゴヌクレオチド鎖から保護基を除去する。 Oligonucleotides may be synthesized on the supported nucleoside, oligonucleotides removing the protecting group from the synthetic oligonucleotide chain under standard conditions that are not cleaved from the support. 好適な試薬は、ヌクレオシドホスホルアミダイト及びヌクレオシド水素ホスホレートを含む。 Suitable reagents include nucleoside phosphoramidite and nucleoside hydrogen Hosuhoreto.

【0131】 DNAプローブアレイの製造用のDNAプローブの作製のためのオンチップ方法(on [0131] On-chip method for the production of DNA probes for the production of a DNA probe array (on
-chip strategy)が利用できる。 -chip strategy) can be utilized. 例えば、アドレス指定可能なレーザー活性化光脱保護(photodeprotection)は、参照によって本明細書中に組み込まれる、Fod For example, addressable laser-activated light deprotection (photodeprotection) are incorporated herein by reference, Fod
orら(1991)によって報告された、ガラス表面上での直接的なオリゴヌクレオチド化学合成において利用できる。 Reported by or et al. (1991), it may be utilized in direct oligonucleotide chemical synthesis on a glass surface. プローブはまた、Van Nessら(1991)によって報告されたようにナイロン支持体上に固定化するか;又はDuncan及びCavalier( Or the probe may also be immobilized on nylon supports as reported by Van Ness et al. (1991); or Duncan and Cavalier (
1988)の方法を使用してテフロンに結合することもでき、これら全ての文献は、 Using the method of 1988) can also be coupled to Teflon, all documents these,
本明細書中に特定的に組み入れられる。 It incorporated as specifically herein.

【0132】 Van Nessら(1991)によって報告された、ナイロン支持体へのオリゴヌクレオチドの結合は、アルキル化によるナイロン表面の活性化及び塩化シアヌルによるオリゴヌクレオチドの5'−アミンの選択的活性化を必要とする。 [0132] reported by Van Ness et al. (1991), binding of the oligonucleotide to a nylon support, activated nylon surface by alkylation and selective activation of the 5'-amine of oligonucleotides by cyanuric chloride I need.

【0133】 支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを製造するための1つの特別な方法は、参照によって本明細書中に組み入れられる、Peaseら(1994)によって報告さ れた光発生(light-generated)合成を利用することである。 [0133] One particular method for manufacturing a oligonucleotide to the support is incorporated herein by reference, the light generated reported by Pease et al. (1994) (light-generated) it is to use the synthetic. これらの著者は、 現在の写真平版技術を使用して、固定化オリゴヌクレオチドプローブアレイ(DN These authors, using current photolithographic techniques, immobilized oligonucleotide probe arrays (DN
Aチップ)を作り出した。 It created a A chip). 光を使用して高密度微小アレイ中のオリゴヌクレオチ ドプローブの合成を誘導するこれらの方法は、光不安定性5'−保護N−アシル-デオキシヌクレオシドホスホルアミダイト、表面リンカー化学及び多方面にわたる組み合わせ合成方法を利用する。 These methods of using light to induce the synthesis of oligonucleotide Dopurobu in high density micro arrays, photolabile 5'protected N- acyl - deoxynucleoside phosphoramidites, surface linker chemistry and versatile across combinatorial synthesis using the method. 256個の空間的に規定されたオリゴヌクレオチ ドプローブのマトリックスは、この方法で作ることができ、そして本明細書記載の有利なフォーマット3配列決定で使用できる。 256 spatially defined matrix of oligonucleotide Dopurobu may be made in this way, and can be used in an advantageous format 3 sequencing described herein.

【0134】 もちろん、上記の光活性化チップの1つなどのDNAチップを商業的供給源から 容易に購入できるだろう。 [0134] Of course, could be readily purchase a DNA chip, such as one of the above light-activated chips from commercial sources. この点については、Santa Clara, CA 95051のAffymet In this regard, Santa Clara, Affymet of CA 95051
riox及びBeckmanと連絡をとることができる。 It is possible to get in touch with riox and Beckman.

【0135】 好ましい実施態様では、本発明のプローブは、情報提供部分(標的核酸にハイブリダイズし、配列情報を与える部分)、基体(固体支持体)に結合される反応基、及びランダム化された位置(すなわち、4つの塩基のうちの幾つかがこれら の位置で見出される)を含む。 [0135] In a preferred embodiment, the probe of the present invention, the information providing part (hybridized to a target nucleic acid, the portion providing the sequence information), reactive groups bonded to the substrate (the solid support), and were randomized position containing (i.e., some of the four bases found in these positions). 好ましいプローブは、配列5'−(T) 6 −(N) 3 −(B) 5 (ここで、T=チミン(固相支持体に結合する)、N=A、C、G又はT(ランダム化された位置)、及びB=プローブの5個の情報提供位置(情報提供部分)である)を 有する。 Preferred probes are sequences 5 '- (T) 6 - (N) 3 - (B) 5 ( where, T = binds to thymine (solid support), N = A, C, G or T (Random of position), and a B = 5 pieces of information providing position of the probe (information is provided part)). 最も好ましい実施態様では、プローブは、支持体に結合し、スペーサー部分がプローブの末端又はプローブの内部で(N) 3の5'側に見出される。 In a most preferred embodiment, the probe is bound to a support, the spacer moiety is found at the 5 'end of the (N) 3 within the terminal or the probe of the probe. スペーサーは、炭素、珪素、酸素、硫黄、リンなどの少なくとも2つの共有結合を形成で きる原子から構成できるか、又は糖−リン酸基、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、炭水化物、芳香環、炭化水素環、線状及び分岐状炭化水素などの少なくとも2つの共有結合を形成できる分子から構成できる。 Spacer, carbon, silicon, oxygen, sulfur, or be composed of at least two atoms that can be covalently bonded to form, such as phosphorus, or sugar - phosphate groups, amino acids, peptides, nucleosides, nucleotides, sugars, carbohydrates, aromatic ring can be composed of a hydrocarbon ring, molecules capable of forming at least two covalent bonds, such as linear and branched hydrocarbons.

【0136】 実施例7 核酸断片の製造配列決定されるべき核酸は、cDNA、ゲノムDNA、染色体DNA、微細切断された染色体バンド、コスミド又はYACインサート、及びいかなる増幅工程もないmRNAを 含むRNAなどの、任意の適切な供給源から得られる。 [0136] The nucleic acid to be manufactured Sequencing of Example 7 nucleic acid fragments, cDNA, genomic DNA, chromosomal DNA, such as fine cut chromosomal band, cosmid or YAC inserts, and RNA, including any amplification process nor mRNA , obtained from any suitable source. 例えば、Sambrookら(1989 )は、哺乳類細胞由来の高分子量DNAの単離のための3つのプロトコールを報告している(p. 9.14-9.23)。 For example, Sambrook et al (1989) reported the three protocols for the isolation of high molecular weight DNA from mammalian cells (p. 9.14-9.23).

【0137】 標的核酸断片は、M13、プラスミド又はλベクター中のクローンとして製造で き、及び/又はPCR又は他の増幅方法によってゲノムDNA又はcDNAから直接に製造できる。 [0137] Target nucleic acid fragments, M13, can in the production as a clone in a plasmid or λ vectors, and / or by PCR or other amplification methods can be prepared directly from genomic DNA or cDNA. サンプルをマルチウエルプレート中で調製又は分注してもよい。 Samples may be dispensed prepared or minute multiwell plates in. 約100- About 100-
1000 ngのDNAサンプルが最終容量2-500 mlで調製される。 1000 ng of DNA sample is prepared in a final volume of 2-500 ml. PCRによって製造され た標的核酸は、精製することなく、フォーマット1 SBHの基体に直接アプライで きる。 Target nucleic acid produced by PCR, without purification, it kills directly applied to the substrate formats 1 SBH. 標的核酸が一旦基体に固定されれば、基体を洗浄でき、又はプローブと直接アニーリングさせることもできる。 If it is fixed to the target nucleic acid once the substrate, it can clean the substrate, or may be a probe directly annealing.

【0138】 次に、核酸は、例えば、Sambrookら(1989)の9.24-9.28に記載の制限酵素の 使用、超音波及びNaOH処理による切断を含む当業者に公知の任意の方法で断片化されるだろう。 [0138] Next, a nucleic acid, for example, be fragmented by any method known in the art, including the use of restriction enzymes described 9.24-9.28, cleavage by ultrasound and NaOH treatment of Sambrook et al. (1989) right.

【0139】 Schrieferら(1990)(参照によって本明細書中に組み入れられる)によって 報告された、低圧切断も適している。 [0139] Schriefer et al (1990) reported by (incorporated herein by reference) are also suitable low pressure cut. この方法では、DNAサンプルは、低圧から 中圧の様々な圧力の小さなフレンチ(French)圧力セルを通過する。 In this method, DNA samples are passed through a small French (French) pressure cells of various pressure medium pressure from the low pressure. レバー装置によってセルにかける低圧から中圧の圧力の制御が可能である。 It is possible to control the pressure of the medium pressure from the low pressure applied to the cell by a lever device. これらの研究の結果は、低圧切断が超音波及び酵素的DNA断片化方法の代わりとして有用である ことを示している。 The results of these studies indicate that low-pressure cutting is useful as an alternative to ultrasonic and enzymatic DNA fragmentation methods.

【0140】 DNAの断片化に特に好適な1つの方法は、Fitzgeraldら(1992)によって報告 された、2塩基認識エンドヌクレアーゼ、CviJIを使用したものであると考えられる。 [0140] Particularly preferred one method to DNA fragmentation was reported by Fitzgerald et al. (1992), 2 base recognition endonuclease, believed to be using CviJI. これらの著者は、迅速な断片化及びショットガンクローニング及び配列決定に好適であると考えられる特定サイズにDNAを断片化するためのアプローチを報 告した。 These authors, the approach to fragment the DNA was reported in a particular size which is considered to be suitable for rapid fragmentation and shotgun cloning and sequencing. 本発明者は、これもまた、本配列決定技術での使用のための、ランダムであるが比較的小さいDNA断片を作製するのに特に有用であろうと考えている。 The present inventors, also, for use in the present sequencing technology, is a random I believe would be particularly useful for making relatively small DNA fragments.

【0141】 制限エンドヌクレアーゼCviJIは通常、GとCの間の認識配列PuGCPyを開裂して 平滑末端を残す。 [0141] Restriction endonucleases CviJI normally leaves blunt ends by cleavage recognition sequence PuGCPy between G and C. この酵素(CviJI**)の特異性を変化させる、典型的な反応条 件は、DNA断片の準ランダム分布を与え、小分子pUC19(2688塩基対)を形成する。 This enzyme alters the specificity of the (CviJI **), typical reaction conditions gives a pseudo-random distribution of DNA fragments form the small molecule pUC19 (2688 base pairs). Fitzgeraldら(1992)は、高速ゲル濾過法によってサイズ分画されたpUC19のC Fitzgerald et al. (1992), C of pUC19 that was size fractionated by high performance gel filtration
viJI**消化を使用して、この断片化方法のランダム性を定量的に評価し、末端修復することなく、Lac ZマイナスM13クローニングベクターに直接連結した。 Use Viji ** digestion, the randomness of this fragmentation method quantitatively evaluated, without end-repaired and ligated directly to the Lac Z minus M13 cloning vector. 76個のクローンの配列分析は、CviJI**が、PuGCPy部位に加え、pyGCPy及びPuGCPuを 制限すること、及び新たな配列データがランダム断片化と一致する速度で蓄積されることを示した。 Sequence analysis of 76 clones, CviJI ** is added to PuGCPy site, limiting the pyGCPy and PuGCPu, and new sequence data showed that the accumulated random fragmentation and matching speed.

【0142】 文献中に報告されているように、超音波処理及びアガロースゲル分画と比較したこのアプローチの利点は、より少量のDNAを必要とすること(2-5μgに対して0 [0142] As reported in the literature, advantages of this approach compared to sonication and agarose gel fractionation is to require smaller amounts of DNA (relative 2-5Myug 0
.2-0.5μg);及び工程数が少ないこと(前ライゲーション、末端修復、化学抽 出、又はアガロースゲル電気泳動及び溶出の必要がない)を含む。 .2-0.5Myug); and that a small number of steps (pre-ligation, end-repaired, leaving a chemical extraction, or agarose gel electrophoresis and there is no need for elution). これらの利点はまた、フォーマット3による配列決定のためにDNAを調製する時にも有用であることが提案されている。 These advantages have also been proposed to be useful when preparing DNA for sequencing by Format 3.

【0143】 好ましい実施態様では、核酸サンプルの「断片」は、それらが互いに連結され得ないように調製される。 In [0143] preferred embodiment, "a fragment" of a nucleic acid sample is prepared so that they can not be connected to each other. そのような断片のプールは、酵素消化又は物理的切断によって得られた断片化核酸をホスファターゼ(例えば、仔ウシ腸ホスファターゼ)で処理することによって得られる。 Pool of such fragments, phosphatase fragmentation nucleic acids obtained by enzymatic digestion or physical cleavage (e.g., calf intestinal phosphatase) obtained by treating. あるいは、サンプル核酸の非連結断片は、サンプル核酸によるSanger−ジデオキシシークエンシング反応中のその5'末端にリン酸を有しない、ランダムプライマー(例えば、N 5 -N 9 、ここでN=A、G、T、 Alternatively, unbound fragments of sample nucleic acid has no phosphate at its 5 'terminus of Sanger- in dideoxy sequencing reaction with sample nucleic acids, random primer (e.g., N 5 -N 9, wherein N = A, G , T,
又はC)を使用して得られる。 Or C) obtained using. これは、標的核酸に相補的な配列を有し、ジデオ キシ残基で停止しており、他の断片に連結できない、DNA断片をもたらすだろう 。 This has the sequence complementary to the target nucleic acid, and stopped at Jideo alkoxy residues, can not be linked to other fragments, will result in DNA fragments.

【0144】 核酸断片を得る方法又は製造する方法にかかわりなく、DNAを変性させて、ハ イブリダイゼーションに利用できる1本鎖断片を与えることは重要である。 [0144] Irrespective of the method or process for manufacturing obtaining a nucleic acid fragment, denaturing the DNA, it is important to provide a single-stranded fragments that can be used for hybridization. これは、DNA溶液を89-90℃で2-5分間インキュベートすることによって達成される。 This is accomplished by incubating 2-5 minutes DNA solution at 89-90 ° C.. 次いで、溶液を、2℃まで急速に冷却し、チップと接触する前のDNA断片の再生を防ぐ。 The solution was then up to 2 ℃ rapidly cooled to prevent reproduction of DNA fragments prior to contact with the chip.

【0145】 実施例8 DNAアレイの製造アレイは、ナイロン膜などの支持体上にDNAサンプルをスポットすることによ って製造できる。 [0145] Production array according to Example 8 DNA arrays may be prepared me by the spotting DNA samples on a support such as nylon membranes. スポッティングは、金属ピンのアレイ(マイクロタイタープレート中のウエルのアレイに対応する位置)を使用して、ナイロン膜に約20 nlのD Spotting uses of the metal pin array (microtiter plate array corresponding positions of wells in), D of about 20 nl to a nylon membrane
NA溶液を移すことを繰り返して行うことができる。 NA solution can be carried out repeatedly to transfer the. オフセット印刷によって、ウエルの密度よりも高いドットの密度が達成される。 By offset printing, the density of the high dot is achieved than the density of the well. 1〜25個のドットは、使用さ れる標識のタイプによって、1 mm 2中に収容できる。 1-25 dots, depending on the type of label used, can be accommodated in 1 mm 2. 幾つかの予め選択された数 の縦列及び横列でのスポッティングを避けることによって、独立サブセット(サブアレイ)を形成できる。 By avoiding spotting in some preselected number of columns and rows to form a separate subset (sub-array). 1つのサブアレイ中のサンプルは、異なる個体由来の同じゲノム(又は同じ遺伝子)のDNAセグメントであり得るか、又は異なる、オ ーバーラップしたゲノムクローンであり得る。 Samples in one sub-array, or may be a DNA segment of the same genomes from different individuals (or the same gene), or different, may be a Au Barappu genomic clones. 1つの実施例では、選択された遺伝子セグメントは、64人の患者から増幅され得る。 In one embodiment, a gene segment selected can be amplified from 64 patients. 各患者に対して、増幅遺伝子セグメントは、1つの96ウエルプレート中にある(全ての96ウエルが同じサンプルを含む)。 For each patient, the amplified gene segments (including all 96 wells of the same sample) which is in one 96-well plate. 64人の患者のそれぞれに対するプレートが製造される。 Plates are prepared for each of the 64 patients. 96ピン装置を使用することによって、全てのサンプルが1つの8×12 cm膜上にスポットできる。 By using the 96-pin device, all samples may be spotted on one 8 × 12 cm film. サブアレイは、各患者から1つで、64のサンプルを含むことができる。 Subarray, one from each patient, may comprise a sample of 64. 96サブアレイが同一である場合は、ドット間隔(span)を1 mm 2とし、サブアレイ間 を1 mmの間隔とすることができる。 96 If subarrays are identical, the dot interval (span) and 1 mm 2, the inter-sub-array can be an interval of 1 mm.

【0146】 もう1つのアプローチは、例えば、膜を覆うように成形されたプラスチックグリッド(グリッドはマルチウエルプレートの底に適用される膜の種類に類似する)、又は疎水性ストリップなどの物理的スペーサーによって分割できる膜又はプレート(NUNC, Naperville, Illinoisから入手可能)を使用することである。 [0146] Another approach, for example, a plastic grid molded so as to cover the film (grid is similar to the type of film to be applied to the bottom of multiwell plates), or physical spacer such as hydrophobic strip it is to use a split can film or plate (NUNC, Naperville, available from Illinois) by. 固定された物理的スペーサーは、平らなホスホル-ストレージ-スクリーン(phospho Fixed physical spacer is flat phosphoramidite - Storage - Screen (phospho
r-storage screen)又はX線フィルムに暴露することによるイメージングには好ましくない。 r-storage screen) or not preferred for imaging by exposure to X-ray film.

【0147】 実施例9 ハイブリダイゼーションおよび評価過程標識プローブを、ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、(好ましくは多チ ャネルピペットによって)サブアレイにピペットしてもよい。 [0147] EXAMPLE 9 Hybridization and evaluation process labeled probe was mixed with hybridization buffer, (preferably by a multi-Chi Yanerupipetto) may be pipetted into subarrays. サブアレイ間のプ ローブの混合を防ぐため(疎水性の帯または物理的バリアーが膜に印されていな い場合)、プラスチック、金属またはセラミックからなる対応するグリッドを膜 に固定するように圧着してもよい。 To prevent mixing of the probes between subarrays (if have hydrophobic strip or physical barrier is such have marked the film), plastic, and crimped to secure the corresponding grid made of metal or ceramic membrane it may be. また、緩衝液の容量を1mm 2あたり約1ml以 下に減らしてもよい。 Moreover, the capacity of the buffer may be reduced to about 1ml hereinafter per 1 mm 2. 使用するプローブの濃度およびハイブリダイゼーション条件は、既に記載されているようなものでよいが、洗浄用緩衝液は多数のサブアレイに素早く注いで、プローブの迅速な希釈を促して有意なクロスハイブリダイゼーションを防ぐ。 Concentration and hybridization conditions of the probe to be used is already may be such as described, poured washing buffer quickly to a large number of subarrays, significant cross-hybridization to encourage rapid dilution of the probe prevent. 同様の理由のために、最小濃度のプローブを使用し、ハイブリダイゼーション時間を実用レベルで最長の時間まで延長してもよい。 For similar reasons, use the minimum concentration of the probe, it may be extended hybridization times at a practical level to the longest time. DNA検出お よび配列決定のために、「通常」配列の知識により連続積み重なり相互作用現象を使用してシグナルを増強することができる。 For DNA detection contact and sequencing, it is possible to enhance the signal by using the interaction phenomena stacking successive Knowledge of "normal" sequence. 標識プローブに加えて、標識プローブと連続的にハイブリダイズする別の非標識プローブをハイブリダイゼーション反応に加えてもよい。 In addition to the labeled probe may be added to another non-labeled probe for the continuous hybridizing a labeled probe to the hybridization reaction. ハイブリッドの量は数倍に増加してもよい。 The amount of the hybrid may be increased several times. プローブはライゲーションにより連結してもよい。 The probe may be joined by ligation. この方法は、「圧縮状態(compression)」を 形成するDNA領域を分解するのに重要となり得る。 This method can be important to degrade the DNA region to form a "compressed (compression)".

【0148】 放射能標識されたプローブの場合、好ましくは蛍光ストレージ(phosphorstora [0148] When the radiolabeled probe, preferably a fluorescent Storage (Phosphorstora
ge)技術により、フィルターの画像を得ることができる。 The ge) technology, it is possible to obtain an image of the filter. CCDカメラ、共焦点顕微鏡などで蛍光標識の評価ができる。 CCD camera, etc. confocal microscopy can be evaluated fluorescent labels. 異なるハイブリダイゼーション実験において正確に評点し、データを正確にまとめるために、各ドットごとの標的量に基づいて生シグナルを標準化する。 Accurately scored in different hybridization experiments, in order to summarize the data accurately, to normalize the raw signal on the basis of the target amount for each dot. ドットごとの標的DNAの量の差は、各プローブのシ グナルを、1つのドット上にある評価した全てのプローブの平均シグナルで割ることによって補正できる。 Difference in the amount of target DNA per dot, the sheet Gunaru of each probe can be corrected by dividing by the average signal of all the probes was evaluated in the one dot. 標準化したシグナルを、評点(通常1〜100)して、異なる実験のデータを比較する。 The normalized signal, and score (usually 1 to 100), comparing the data of different experiments. また、各サブアレイにおいていくつかの対照DNA を使用して、完全に対合した標的を含まないサンプルの平均バックグラウンドシグナルを決定できる。 Also, using several control DNA in each subarray, the average background signal sample without Perfectly matched target can be determined. 二倍体(倍数体)評価により得られたサンプルには、ホモ接合体対照を用いて、サンプル中のヘテロ接合体を認識できる。 The sample obtained by the diploid (polyploid) evaluation using the homozygous control, can recognize the heterozygotes in the sample.

【0149】 実施例10 オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、Genosys Inc., Houston, Texasより購入するか、またはApplied Biosystems 381A DNA合成器により作製した。 [0149] Hybridization oligonucleotides Example 10 oligonucleotides, Genosys Inc., Houston, either purchased from Texas, or were made by Applied Biosystems 381A DNA synthesizer. 使用したプローブのほ とんどは、HPLCまたはゲル電気泳動によって精製しなかった。 Ho Tondo probes used were not purified by HPLC or gel electrophoresis. 例えば、プローブは、インターフェロン中の921 bp EcoRI-BglIIヒトB1-インターフェロン断片を 含むM13クローン[OhnoおよびTaniguchi, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:4270-4274 For example, the probe, M13 clone containing the 921 bp EcoRI-BglII human B1- interferon fragments in interferon [Ohno and Taniguchi, Proc Natl Acad Sci 74:.... 4270-4274
(1981)]中の完全に相補的な単一の標的、ならびにM13ベクター自体において末端塩基誤対合を有する少なくとも1つの標的の両方を有するように設計した。 (1981)] it was designed to have both at least one target having a terminal base mismatches in the fully complementary single target, as well as the M13 vector itself in.

【0150】 オリゴヌクレオチドの末端標識は、記載されているように[Maniatisら、Molec [0150] end-labeled oligonucleotides, as described [Maniatis et al., Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Sp ular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Sp
ring Harbor, New York (1982)]、T4-ポリヌクレオチドキナーゼ(5単位、Amers ring Harbor, New York (1982)], T4- polynucleotide kinase (5 units, Amers
ham)、γ 32P -ATP(3.3pM、10mCi Amersham 3000 Ci/mM)、およびオリゴヌクレオ チド(4pM、10ng)を含む10ml中で行った。 ham), γ 32P -ATP (3.3pM , 10mCi Amersham 3000 Ci / mM), and Origonukureo tides (4 pM, was performed in 10ml containing 10 ng). プローブの比活性は2.5 -5 ×10 9 cpm/nM The specific activity of the probe 2.5 -5 × 10 9 cpm / nM
であった。 Met.

【0151】 一本鎖DNA(0.5NaOH、1.5M NaCl溶液中に2〜4ml)を、同溶液で湿らせたGene Sc [0151] Single-stranded DNA of (0.5NaOH, 2~4ml in 1.5M NaCl solution), Gene Sc moistened with the same solution
reen膜にスポットした。 It was spotted in reen film. フィルターは0.05 M Na 2 HPO 4 (pH 6.5)で中和し、80℃にて60分間炉で焼成し、1分間紫外線照射した。 Filter was neutralized with 0.05 M Na 2 HPO 4 (pH 6.5), and baked for 60 minutes oven at 80 ° C., and UV irradiation for 1 minute. 次いで、フィルターをハイブリダ イゼーション溶液(0.5M Na 2 HPO 4 (pH 7.2)、7%ナトリウムラウロイルサルコシ ン(sodium lauroyl sarcosine))中で室温にて5分間インキュベートし、プラス チック製のペトリ皿の表面に置いた。 Then, the filter hybridization solution (0.5M Na 2 HPO 4 (pH 7.2), 7% sodium lauroyl sarcosinate emissions (sodium lauroyl sarcosine)) and incubated for 5 minutes at room temperature in, plastic-made surface of the petri dish It was placed. 4nMの濃度の32 P末端標識オリゴマープロ ーブを含むハイブリダイゼーション溶液(10ml、0.5M Na 2 HPO 4 (pH 7.2)、7%ナ トリウムラウロイルサルコシン)を1滴ずつ、フィルターごとに1〜6ドット滴 下し、正方形のポリエチレン片(約1×1cm)を被せ、湿性チャンバ中で所定の温度にて3時間インキュベートした。 Hybridization solution containing 32 P-end labeled oligomer probe at a concentration of 4nM (10ml, 0.5M Na 2 HPO 4 (pH 7.2), 7% sodium lauroyl sarcosine) dropwise, 1-6 dots per filter beat drops covered square polyethylene piece (about 1 × 1 cm), and incubated for 3 hours in a moist chamber at a predetermined temperature. フィルターを6X SSC洗浄用溶液に0℃にて3 A filter to 6X SSC washing solution at 0 ℃ 3
×5分間入れて、ハイブリダイズしていないプローブを除去して、ハイブリダイゼーションを停止した。 Put × 5 minutes, to remove the probe that is not hybridized, it was stopped hybridization. フィルターを乾燥させるか、または所定の時間および温度にてさらに洗浄するかして、オートラジオグラフィーにかけた。 Or drying the filter, or by or further washed at a predetermined time and temperature, and subjected to autoradiography. 識別測定のために、オートラジオグラフィー[蛍光画像化装置 (Molecular Dynamics, Sunnyva For identification measurement, autoradiography [fluorescence imaging apparatus (Molecular Dynamics, Sunnyva
le, California)が使用できる]後の乾燥フィルターからドットを切り出し、液体シンチレーションカクテルに入れ、数を数えた。 le, California) cut dots from the drying filter after can be used, placed in liquid scintillation cocktail and counted. IFドットおよびM13ドットの未 補正cpm比はDとする。 Uncorrected cpm ratio of IF dots and M13 dots and D.

【0152】 本明細書中で報告する条件は、非常に短いオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションが可能でかつ標的核酸に対して相補的であるために、結合する対合オリゴヌクレオチドと誤対合オリゴヌクレオチドとの識別を確実にするようなものである。 [0152] conditions reported herein, very short hybridization with oligonucleotides to a complementary to the possible and the target nucleic acid, binding to mate oligonucleotide mismatches oligonucleotide the identification of is such as to ensure. ハイブリッド中の完全に相補的な標的と、単一の誤対合を有する不完全に相補的な標的との識別(D)の程度に基づく短い特異的配列のハイブリダイゼーションの有効な検出に影響を及ぼす因子は定義されている。 A perfectly complementary target in the hybrid, influence the effective detection of hybridization of short specific sequences based on the degree of discrimination between imperfectly complementary target with a single mismatch (D) factor on are defined. 実験検査において、膜フィルターに結合した2つのM13クローンまたはモデルオリゴヌクレオチド への、6〜8ヌクレオチドの長さの28のプローブのドットブロットハイブリダイゼーションを達成した。 In experiments test, to two M13 clones or model oligonucleotides bound to the membrane filter to achieve a dot blot hybridization of the probe 6-8 nucleotides in length 28. 実験過程の指針となる原理を以下に記載する。 Described below the principles that guide the course of the experiment.

【0153】 プローブ過剰条件下で、膜結合した標的核酸(プローブよりも数ヌクレオチド長い)へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、標的濃度に関する疑似一次反応である。 [0153] Probe excess conditions, oligonucleotide hybridization to the membrane bound target nucleic acid (a few nucleotides longer than the probe) is pseudo-first order reaction for the target concentration. この反応は: S t /S 0 =e -kh[OP]tによって定義される。 This reaction: is defined by S t / S 0 = e -kh [OP] t. 式中、S tおよびS oは、それぞれ時間tおよびt 0におけ る標的配列濃度である。 Wherein, S t and S o are the target sequence concentration that put each time t and t 0. (OP)はプローブ濃度であり、tは温度である。 (OP) is a probe concentration, t is the temperature. ハイブリッド形成の速度定数k hは、0℃〜30℃の範囲でわずかに増加する(Porschkeおよ びEigen、J.Mol.Biol. 62 :361(1971); Craigら, J.Mol. Biol. 62 :383 (1971)) 。 Rate constant k h hybridization is slightly increased in the range of 0 ℃ ~30 ℃ (Porschke and Eigen, J.Mol.Biol 62:.. 361 (1971); Craig et al., J. Mol Biol. 62: 383 (1971)). ハイブリッド溶解は、以下の式で表わされるハイブリッド濃度に関する一次反応である(膜結合状態のため質量に置き換わる): H t /H 0 =e -kmt Hybrid dissolution is an order reaction to hybrid concentration represented by the following formula (replace mass for membrane bound state): H t / H 0 = e -kmt

【0154】 式中、H tおよびH 0は、それぞれ時間tおよびt 0におけるハイブリッド濃度 であり、k mは、温度および塩濃度に依存する、ハイブリッド溶解の速度定数で ある[Ikutaら、Nucl. Acids Res. 15 :797(1987);PorsclikeおよびEigen、J.Mol [0154] In the formula, H t and H 0 is a hybrid concentration at each time t and t 0, k m is dependent on temperature and salt concentration, which is the rate constant of the hybrid dissolution [described by Ikuta et al., Nucl. Acids Res 15:. 797 (1987 ); Porsclike and Eigen, J. Mol
.Biol. 62 :361(1971);Craigら、J.Mol.Biol.62:303(1971)]。 .Biol 62:. 361 (1971) ; Craig et al., J.Mol.Biol.62: 303 (1971)] . 鎖会合過程である ハイブリダイゼーションの間、逆反応、溶解反応、または鎖解離反応も生じる。 During the hybridization a chain association process, the reverse reaction, also dissolution reaction, or strand dissociation occurs.
つまり、時間内に形成されるハイブリッドの量は、正反応および逆反応の結果として生じる。 In other words, the amount of hybrid formed in time is result of forward reaction and the reverse reaction. プローブ濃度を上げて、および/または温度を下げて、平衝をハイ ブリッド形成に向かわせることができる。 Raising the probe concentration, and / or lowering the temperature, it is possible to direct the equilibrium to hybrid formation. しかし、大容量の緩衝液中での洗浄サイクルにおいては溶解反応が優性であり、プローブがないために逆反応ハイブリダイゼーションは有意ではない。 However, in the washing cycle in a buffer of a large capacity is dominant dissolution reaction, reverse reaction hybridization to the probe is not insignificant. この分析は、作用可能な短オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(SOH)条件要件が、プローブ濃度または温度について変 化できることを示す。 This analysis shows that the operable short oligonucleotide hybridization (SOH) conditions requirements can change for probe concentration or temperature.

【0155】 Dあるいは識別は式4によって定義される: D=H p (t w )/H i (t w ) H p (t w )およびH i (t w )はそれぞれ、同量の完全相補的二重鎖および不完全相補的二重鎖について、洗浄時間t wの後に残るハイブリッドの量である。 [0155] D or identification is defined by equation 4: D = H p (t w) / H i (t w) H p (t w) and H i (t w), respectively, completely complementary with the same amount for target duplexes and incomplete complementary double strands, the amount of hybrid remaining after cleaning time t w. 識別D は、所定の温度において、10の長さの洗浄時間に応じて変化し、式5においてH Identification D is at a predetermined temperature, it varies depending on the 10 length washing time of, H in Formula 5 i =Bの際に最大値に到達する。 i = reaches a maximum value when the B.

【0156】 バックグラウンドBは、系において検出可能な最も低いハイブリダイゼーションシグナルを表わす。 [0156] Background B represents the lowest hybridization signal detectable in the system. それ以上低下したH iは検査できない可能性があるため、 続けて洗浄するとDは増加する。 Since the more reduced H i may not be inspected, D is increased and washed in succession. wを超える洗浄は、Bに対するH pを減少させるのみであり、Dの減少として現れる。 It washed more than t w is only reduces the H p for B, manifested as a decrease in D. 不完全ハイブリッドの最適洗浄時間t wは、式3および式5から: t w =-In(B/H i (t 0 ))/K miである。 Optimum cleaning time t w incomplete hybrid, from Equation 3 and Equation 5: t w = -In (B / H i (t 0)) is / K mi.

【0157】 H pも同じt wだけ洗浄されるため、式を組み合わせると以下の最適な識別関数が得られる: D=e In(B/Hi(t0))km,p/km,i XH p (t 0 )/B Tの関数としてのDの変化は、最適洗浄温度の選択のために重要である。 [0157] Since the H p is also cleaned by the same t w, the following optimal discrimination function and combining equation is obtained: D = e In (B / Hi (t0)) km, p / km, i XH p (t 0) / change in D as a function of B T is important for the selection of optimum washing temperature. これは、Arheniusの式: K-=Ae -Ea/RTを、先の式に代入して最終的な式: D=H p ((t 0 )/BX(B/H i (t 0 ))) (Ap/Ai)e(Ea,i-Ea,p)/RTを得る。 This formula Arhenius: K- = Ae -Ea / RT and then substituted into the preceding equation final expression: D = H p ((t 0) / BX (B / H i (t 0)) ) (Ap / Ai) e ( Ea, i-Ea, p) / get RT.

【0158】 式中、BはH i (t 0 )よりも低い。 [0158] In the formula, B is lower than the H i (t 0).

【0159】 完全ハイブリッドの活性エネルギーE a,p 、および不完全ハイブリッドの活性 エネルギーE a,iは、同等またはE a,i <E a,pのいずれかであり、従ってそれぞ れの場合においてDは温度に無関係か、または温度の上昇と共に減少する。 [0159] full hybrid active energy E a, p, and incomplete hybrid active energy E a, i is equal to or E a, i <E a, is either p, therefore in the case of, respectively it D decreases with irrelevant or temperature rise of the temperature. この結果は、SOHにおける良好な識別のためのストリンジェントな温度条件を調べる ことが不当であることを示している。 This result can examine the stringent temperature conditions for good discrimination in SOH it indicates that it is illegal. 低温度で洗浄すれば、同等またはより良好な識別が得られるが、温度低下に従って洗浄時間が指数関数的に長くなる。 If washing at low temperatures, but equal to or better identification is obtained, the washing time is exponentially increased as the temperature decreased. p ( H p (
0 )に対してH i (t 0 )が増える場合、識別はTと共により激しく減少する。 If t 0) H i (t 0 ) is increased with respect to the identification is harder decreases with T.

【0160】 低温度におけるDは、H p (t 0 )/H i (t 0 )比よりもH p (t 0 )/B比の方により依存する。 [0160] D at low temperatures is more dependent on direction of H p (t 0) / H i (t 0) H p (t 0) than ratio / B ratio. この結果は、この工程において得られる識別とは無関係に、ハイブリダイゼーションにおいて十分な量のH pを得る方がより良いことを示す。 This result is independent of the identity obtained in this step indicates that it is better to obtain a sufficient amount of H p in the hybridization. 洗浄によ ってより良好な識別が得られる。 Better identify me by the cleaning is obtained. なぜなら完全ハイブリッドの量が多ければ、差異溶解が効果を示すための時間がより長くなるからである。 Because the more the amount of full hybrid, because the time to differences dissolution shows the effect longer. 同様に、より多くの量の標的核酸は、K m,pとK m,iとの差が小さくても、必要な識別が得られる。 Similarly, the more the amount of target nucleic acid, K m, p and K m, even if the difference between the i is small, the required identification is obtained.

【0161】 この単純なモデルで扱っているものよりも複雑な状況を推定した場合、所与の核酸標的において多くの末端誤対合を有するプローブのハイブリダイゼーションの場合、識別を得るために低温度における洗浄がより重要となる。 [0161] When estimating the complex situations than those covered in this simple model, when the hybridization probe having a number of terminal mismatches in a given nucleic acid target, low temperature in order to obtain an identification cleaning becomes more important in.

【0162】 実験指針として記載した理論的原理を使用すると、信頼できるハイブリダイゼーションは6〜8ヌクレオチドの長さのプローブで得られる。 [0162] Using the theoretical principles described as experimental guideline, reliable hybridization obtained at 6-8 nucleotides in length of the probe. 全ての実験は、フィルター上にハイブリダイゼーション溶液のフィルムを張った浮遊プラスチックシートで行った。 All experiments were performed in floating plastic sheet stretched film of the hybridization solution on the filter. この方法は、プローブの量を最大限に低くするため、ドットブロットハイブリダイゼーションにおける標識のコストが低くなる。 This method is to reduce the amount of probe to maximize the cost of labeling is low in the dot blot hybridization. ホスフェートハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムラウロイルサルフェートの代わりに高濃度のナトリウムラウロイルサルコシンを用いると、反応を室温から12℃にまで下げることができる。 With phosphate hybridization high concentration of sodium lauroyl sarcosine instead of sodium lauroyl sulfate in the buffer, the reaction can be lowered to 12 ° C. from room temperature. 同様に、4 -6 ×SSC、10%ナトリウムラウロイルサルコシン緩衝液により、2℃の低温度におけるハイブリダイゼーションが可能になる。 Similarly, the 4 -6 × SSC, 10% sodium lauroyl sarcosinate buffer allows hybridization at low temperature of 2 ° C.. これらの緩衝液中の界面活性剤は、最高40nMまでの濃度の標識プローブで許容できるバックグラウンドを得るためのものである。 Surfactants of these buffers is for obtaining a background acceptable in labeled probe concentrations up 40 nM. 短オリゴヌクレオチドハイブリッドの熱安定性の初期特性を、50%のG+C含量を有するプロトタイプ8-mer( The thermal stability of the initial characteristics of the short oligonucleotide hybridization, a prototype 8-mer with 50% G + C content (
即ち、配列TGCTCATGのプローブ)で決定した。 That was determined by the probe) sequences TGCTCATG. 理論上の予想では、このプローブ はより不安定な8-merの1つである。 The expected theoretical, the probe is one of the more labile 8-mer. このプローブの遷移エンタルピーは、より安定な7-merのそれに近く、6ヌクレオチドの長さのプローブにさえも近い(Bre Transition enthalpy of the probe is close to that of a more stable 7-mer, close even 6 nucleotides in length of the probe (Bre
sslauerら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83 :3746(1986))。 sslauer et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA 83:. 3746 ( 1986)). パラメーターT d (1 Parameter T d (1
分の単位時間においてハイブリッドの50%が溶解する温度)は18℃である。 Temperature) at which 50% of the hybrid is dissolved in the unit of minutes time is 18 ° C.. 結果 は、8bpのハイブリッドのT dが、11bpの二重らせんのT dよりも15℃低いことを示す[Wallaceら、Nucleic Acids Res. 6 :3543(1979)]。 The result is a hybrid of the T d of 8bp indicates that lower 15 ℃ than T d of the double helix of 11 bp [Wallace et al., Nucleic Acids Res 6:. 3543 (1979)].

【0163】 モデルオリゴヌクレオチドでの実験に加えて、短オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの実施証明用の系としてM13ベクターを選択した。 [0163] In addition to the experiments with model oligonucleotides was chosen M13 vector as a system for implementation proved short oligonucleotide hybridization. 主な目的は、 本発明の方法の種々の応用において使用される標的に類似した標的を用いて有用な末端誤対合識別を示すことであった。 The main aim was to show useful end mismatch identified using the target similar to the target to be used in various applications of the method of the present invention. M13モデルのためのオリゴヌクレオチド プローブは、M13ベクター自体が末端誤対合塩基を含むように選択された。 Oligonucleotide probes for the M13 model, M13 vector itself is selected to include a terminal mismatch bases. ベク ターIF(921bpのヒトインターフェロン遺伝子挿入体を含むM13組換体)は、単一の完全対合標的を担持する。 Vectors IF (M13 recombinants containing the human interferon gene insert of 921bp) carries a single perfectly matched target. 従って、IFは、M13ベクター自体と比べて同数または より多数の誤対合標的を有する。 Thus, IF has a number of mismatches target from the same number, or compared to the M13 vector itself.

【0164】 低温度条件およびドットブロットを使用すれば、完全対合標的および誤対合標的を含むドットと、誤対合標的のみを含むドットとの間で、ハイブリダイゼーションシグナルの十分な差が得られる。 [0164] The use of low temperature conditions and dot blots, dot containing perfectly matched target and mismatched targets, with the dots containing only mismatched targets, sufficient differences in hybridization signal obtained It is. これは、6-merオリゴヌクレオチド、ならびに大きいIF-M13対の核酸にハイブリダイズした7-merおよび8-merオリゴヌクレオチドについても当てはまった。 This was true for the 6-mer oligonucleotides, and large IF-M13 pair of 7-mer was hybridized to the nucleic acid and 8-mer oligonucleotides.

【0165】 ハイブリダイゼーションシグナルは、プローブと反応できる、フィルター上の標的の量に依存する。 [0165] Hybridization signals can be reacted with the probe, depending on the amount of the target on the filter. 対照は、2つのドットにおけるサイン強度の差が核酸の量の差を反映するものでないことを示すために必要である。 Control is necessary to show that the difference in sign intensity at two dots do not reflect the difference in the amount of nucleic acid. IFおよびM13の両方に おいて同じ数および種類の標的を有するプローブでのハイブリダイゼーションは、ドット中に同量のDNAが存在することを示す。 Hybridization with a probe having the same number and type of target Oite both IF and M13 show that same amount of DNA is present in the dots. ハイブリッド形成の有効性はハ イブリッドの長さと共に向上するため、ヌクレオチドを6つ有する二重らせんのシグナルは、フィルターに結合した高質量のオリゴヌクレオチド標的で最も良好に検出できた。 Since the effectiveness of the hybridization increases with the length of the hybrid, the signal of the double helix with six nucleotides could best detected with high mass of an oligonucleotide target bound to the filter. 標的として機能する大きい分子の核酸と比べて分子量が低いオリゴヌクレオチド標的分子の方がより多く所定の表面積に結合することができる。 It can be towards the large molecules of the oligonucleotide target molecules molecular weight is lower than the nucleic acid that functions as a target is bound to more predetermined surface area.

【0166】 未精製DNAでの検出の感度を測定するため、様々な量のファージ上清をフィル ター上にスポットし、 32 P標識8-merとハイブリダイズした。 [0166] To measure the sensitivity of detection in unpurified DNA, spotting phage supernatant varying amounts on filter was 32 P-labeled 8-mer hybridized. たった0.5ngのDNA を含む最小5000万の未精製ファージから検出可能なシグナルが得られ、短オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション方法の感度が十分であることを示した。 Minimum 50 million detectable signal is obtained from the crude phage containing DNA of only 0.5 ng, the sensitivity of the short oligonucleotide hybridization method was sufficient. 実用面では、反応時間が短かいことを付け加える。 In practical use, add the paddle short reaction times.

【0167】 上記理論の節で記載したように、ハイブリッドの平衡収率は、プローブ濃度および/または反応温度に依存する。 [0167] As described in the section above theory, equilibrium yield of hybrid depends on the probe concentration and / or reaction temperature. 例えば、13℃での4nM8-merでの場合、標的 のシグナルレベルは、プローブ濃度が40nMの場合の同量の標的シグナルレベルよりも3倍低く、ハイブリダイゼーション温度を25℃まで上昇すると4.5倍低くな る。 For example, if in 4nM8-mer at 13 ° C., the signal level of the target is 3 times lower than the same amount of target signal levels when the probe concentration is 40 nM, when raising the hybridization temperature to 25 ° C. 4.5 times lower Become.

【0168】 最大限の識別を得るために低温度で洗浄することは実証されている。 [0168] washing at low temperatures in order to obtain the maximum identity has been demonstrated. 現象を明確に可視化するために、IFドットと比べて50倍のDNAをM13ドットに加えて、ベクター特異的プローブでのハイブリダイゼーションを用いた。 To clearly visualize phenomena, by adding 50-fold DNA into M13 dot than the IF dot using hybridization with a vector specific probe. このようにして、実際のプローブでのハイブリダイゼーション工程後のシグナルは、対合の場合よりも誤対合の場合に強くした。 In this way, the actual signal after hybridization step of the probe was strongly in the case of mismatch than the pairing. p /H i比は1:4であった。 H p / H i ratio was 1: 4. 7℃で時間延長して 洗浄すると、完全なハイブリッドを大量に失うことなく、2:1の比でシグナル強度の逆転を得た。 And washed with extended time at 7 ° C., without losing the full hybrid large amounts, 2: to obtain a reversal in signal intensity 1 ratio. 逆に、25℃ではいかなる識別も得ることは不可能であった。 Conversely, it was not possible to get any at 25 ° C. identification.
なぜなら、2分間の洗浄で対合標的シグナルは既にバックグラウンド値にまで下 がる一方、誤対合ハイブリッド由来のシグナルは検出可能なままであるからである。 This is because, while the lower wants to already background values ​​in paired targeting signal washed for 2 minutes, because the signal from mismatches hybrid remains detectable. 13℃での識別の損失は7℃の場合と比べるとそれほど大きくはないが明らかに目で見えるものである。 Loss of identification at 13 ° C. is not so large as compared with the case of 7 ° C. but in which visible clearly eyes. 7℃での90分の時点と13℃での15分の時点とを考慮すると、誤対合ハイブリッドシグナルが、それぞれの条件における最適洗浄時間を表わすバックグラウンド値に近い場合、13℃よりも7℃において量が数倍多いことは明白である。 Considering the time point of 15 minutes at the time of 90 minutes and 13 ° C. at 7 ° C., if mismatched hybrid signal is close to the background values ​​representing the optimum cleaning time for each condition, than 13 ° C. 7 it is clear that several times higher amounts in ° C.. このことについてさらに例示するために、2つの温度における同量の出発ハイブリッドの洗浄による時間経過に伴う識別の変化は、より低い温度においてより高い最大Dを示す。 To further illustrate this fact, the change of the identification with time by the same amount of starting hybrid washing in the two temperatures shows the higher maximum D at lower temperatures. これらの結果から、温度、および洗浄工程の開始時点における2種のハイブリッドの量の比に応じたDの変化の傾向を確認できる。 These results can be confirmed the tendency of change of the D corresponding to the ratio of the two hybrid amount at the start of the temperature, and washing steps.

【0169】 短オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション条件の一般的な利用性を示すために、本発明者らの簡易M13系において、4つの7-mer、10の8-mer、および14 の最長12ヌクレオチドの長さのプローブのハイブリダイゼーションを観察した。 [0169] To demonstrate the general utility of the short oligonucleotide hybridization conditions, the present inventors have simple M13 system, four 7-mer, 10 8-mer, and 14 of up to 12 nucleotides in length It was observed hybridization of the probe.
これらは、GC含量の2つの極値を表わす9-merGTTTTTTAAおよび8-merGGCAGGC , 9-merGTTTTTTAA and 8-merGGCAGGC represent two extremes of GC content
Gを含む。 Including the G. GC含量および配列は、短いハイブリッドの安定性に影響を及ぼすと 予想されるが[Bresslauerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :3746 (1986)] GC content and sequence are expected to affect the short hybrid stability [Bresslauer et, Proc Natl Acad Sci USA 83: .... 3746 (1986)]
、低温度の短オリゴヌクレオチド条件は検査した全てのプローブに対して、十分な識別を得るために適用できた。 , Short oligonucleotide conditions of the low temperature could be applied in order to obtain for all probes examined, sufficient identification. 13ヌクレオチドの長さのプローブで得られた最良の識別値は20であり、配列変化による数倍の低下は容易に許容できる。 13 best identification values ​​obtained by the length of the probe nucleotide is 20, reduction in the number times by sequence changes can be easily tolerated.

【0170】 M13系は、標的DNAの複雑性が識別レベルに及ぼす影響を示す利点を有する。 [0170] M13 system has the advantage of showing the effect of the complexity of the target DNA is on the discrimination level. 誤対合標的が0または5であり、1つのGC対のみ異なる2つの8-merについては、それぞれ観察された識別は18.3および1.7であった。 Mismatched targets is 0 or 5, for one GC pair only two different 8-mer, the identified observed respectively were 18.3 and 1.7.

【0171】 本方法の有用性を示すために、8ヌクレオチドの長さのプローブを3本、Blue [0171] To demonstrate the utility of the present method, three 8 nucleotides in length of the probe, Blue
scriptベクターのライブラリーから作製された51プラスミドDNAドットの集合上 で検査した。 It was tested on a collection of 51 plasmid DNA dots made from a library of script vector. プローブの1つは、Bluescriptベクターに存在し、同ベクターに対して特異的であったが、M13では不在であった。 One of the probes is present in Bluescript vector, but was specific for the vector, it was absent in M13. その他の2つのプローブは、既 知配列挿入体である標的を有していた。 The other two probes had targets that are already known sequence insert. この系では、それぞれのプローブに対して陰性または陽性の対照DNAでのハイブリダイゼーションを行うことができる。 In this system, it is possible to perform hybridization in the control DNA the negative or positive for each probe. このプローブ配列(CTCCCTTT)は、インターフェロン挿入体中にも相補的標的を有していた。 The probe sequence (CTCCCTTT) was also interferon insert in have a complementary target. M13ドットは陰性であり、M13またはBluescript中のインターフェロン挿入体は陽性であるため、ハイブリダイゼーションは配列特異的であった。 M13 dot is negative, interferon insert in M13 or Bluescript because a positive hybridization was sequence-specific. 同様に、プローブは、51の挿入体のうちたった1つにある標的配列を検出し、対照では検査挿入体において標的配列を全く検出せず、適切な標的がクローン中に存在すればハイブリダイゼーションが生じたであろうことを確認した。 Similarly, the probe detects a target sequence one with just one of the insert 51 does not detect any target sequence in the test insert in the control, hybridization if appropriate target exists in clone would have occurred was confirmed that.

【0172】 6〜8ヌクレオチドの長さの非常に短いオリゴヌクレオチドハイブリッドについての熱安定性曲線は、11〜12ヌクレオチドの長さのハイブリッドよりも少なくとも15℃低い[図1およびWallaceら, Nucleic Acids Res. 6 :3543-3557 (1979)] [0172] 6-8 Thermal stability curves for very short oligonucleotide hybrids nucleotides in length, low least 15 ℃ than hybrids 11-12 nucleotides in length [Fig. 1 and Wallace et al., Nucleic Acids Res . 6: 3543-3557 (1979)]
. しかし、低温度にて、かつ非常に実用的な0.4〜40nMの濃度のオリゴヌクレオ チドプローブにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことにより、既知または未知の核酸標的中の相補的な配列の検出が可能になる。 However, at low temperature, and by performing a hybridization reaction in a very practical 0.4~40nM concentration of Origonukureo Chidopurobu allows the detection of known or unknown complementary sequences in the nucleic acid target. 未知の核酸配列を完全に決定するために、65,535の8-merプローブを含む完全セットを使用することができる。 To fully determine the unknown nucleic acid sequence, you can use the full set including 8-mer probe 65,535. この目的のために十分な量の核酸が、都合の良い生物学的サンプル(例えば数マイクロリットルのM13培養物、10mlの細菌培養物から得たプラスミド調 製物または単一コロニーの細菌、1ml未満の標準PCR反応液など)中に存在する 。 A sufficient amount of nucleic acid for this purpose, convenient biological samples (e.g., several M13 culture microliters bacterial plasmid regulating preparations or a single colony was obtained from the bacterial culture 10 ml, less than 1ml present in a standard PCR reaction, etc.).

【0173】 6〜10ヌクレオチドの長さの短いオリゴヌクレオチドから、優れた識別が得られる。 [0173] From short oligonucleotides of 6-10 nucleotides in length, it obtained excellent discrimination. 単一末端誤対合によるハイブリッド安定性の相対的な減少は、長いプローブよりも大きい。 The relative decrease in hybrid stability with a single end mismatch is greater than longer probes. 8-merTGCTCATGから得られる結果がこの結論を裏付ける。 The results obtained from the 8-merTGCTCATG is support this conclusion. 実験において、G/T末端誤対合を有する標的、この種の誤対合を有する標的へのハ イブリダイゼーションは他の全ての種のオリゴヌクレオチドの中で最も安定している。 In the experiment, a target having a G / T terminal mismatch, hybridization to the target with a mismatch of this kind is most stable of all other types of oligonucleotide. 得られた識別は、19塩基対二重らせんにおける内部G/T誤対合と同一かま たは大きい[Ikutaら、Nucl. Acids res. 15:797(1987)]。 The resulting identified, the greater the same bite other and internal G / T mismatch in 19 base pairs double helix [described by Ikuta et al., Nucl Acids res 15:.. 797 (1987)]. 短オリゴヌクレオチドのための記載されているハイブリダイゼーション条件を用いてこれらの識別特性を活用すれば、オリゴヌクレオチド標的の非常に正確な決定が可能である。 Take advantage of these signatures using The listed hybridization conditions for short oligonucleotide, capable of very accurate determination of oligonucleotide targets. 完全ハイブリッドと不完全ハイブリッドとの識別を検出の簡便性に対して、非常に短いオリゴヌクレオチドを用いる上で存在する問題は十分な量のハイブリッドを調製することである。 Relative simplicity of detecting the identity of the full hybrid and imperfect hybrids, a problem that exists in using very short oligonucleotides is to prepare a sufficient amount of the hybrid. 実際には、H pとH iとを識別する必要性は、ドット中のDNA 量および/またはプローブ濃度を上昇すること、またはハイブリダイゼーション 温度を下げることによって補助される。 In fact, the need to identify the H p and H i is aided by lowering to increase the amount of DNA and / or probe concentration in the dot or the hybridization temperature. しかし、高いプローブ濃度は、通常バックグラウンドを上げる。 However, high probe concentrations, increase the normal background. また、実用面での標的核酸の量には限度がある。 Further, there is a limit to the amount of target nucleic acid in practical use. この問題は、4nMのプローブで有効なバックグラウンドをもたらす界面活性剤サルコシルの濃度を高くすることによって解決された。 This problem was solved by increasing the concentration of the surfactant Sarkosyl which provide effective background probe 4 nM. プローブが非特異的にフィルターに結合するのを防ぐための競合相手を使用すること、またはハイブリダイゼーション支持体材料を変えることで更に改良できる。 Probe further be improved by changing the use of competitors for preventing binding to nonspecific filter, or the hybridization support material. さらに、45Kcal/mol未満のE aを有するプローブ(例えば、多くの7-merおよび主な6-mer)については、改変オリゴヌクレオチドの方が、改変されていない相当物よりも安定なハイブリッドが得られる[Asselineら、Proc. Natl. Acad. Sci. 81 :3297 (1984)]。 Further, the probe (e.g., a number of 7-mer and major 6-mer) having the E a of less than 45 kcal / mol for the direction of modified oligonucleotides, unmodified equivalents resulting stable hybrid than is [Asseline et al, Proc Natl Acad Sci 81:. ... 3297 (1984)]. 本発明に記 載されている、低温度を利用する短いオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件により、全ての配列および二重らせんハイブリッドインプットに対してより良好な識別が得られる。 Are placing serial to the present invention, the hybridization conditions for hybridization with short oligonucleotides utilizing low temperature, the better identification for all sequences and duplex hybrid inputs obtained. 異なる配列に対してハイブリダイゼーション条件の均一性を得るための唯一の代償は、洗浄時間が配列によって数分から最長で24時間長くなることである。 The only price for obtaining the uniformity of the hybridization conditions for different sequences is that cleaning time is prolonged for 24 hours at the longest a few minutes by the arrangement. また、洗浄時間は、 In addition, cleaning time,
塩濃度を下げることによってさらに短くすることができる。 It can be further shortened by lowering the salt concentration.

【0174】 短オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、誤対合ハイブリッドに対して1つの対合ハイブリッドを識別する点で優れているが、誤対合ハイブリッド由来のシグナルも存在する。 [0174] Short oligonucleotide hybridization is excellent in point identifies one paired hybrid relative mismatched hybrids, also exist signals from mismatched hybrids. この誤対合ハイブリッドの多くは末端誤対合によるものである。 Many mismatched hybrid is due terminal mismatch. これにより、特定の長さのプローブで有効に検査されうる挿入体の大きさが限定される可能性がある。 Thus, there may be limited in size of the insert that can be effectively examined with a probe of a particular length.

【0175】 配列の複雑性の識別に対する影響は無視できない。 [0175] influence on the identification of the complexity of the array can not be ignored. しかし、複雑性の影響は、 However, the influence of the complexity,
短オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションにより特異的かつ非ランダムな配列について配列情報を定義する場合により有意であり、(適切なプローブの長さ)対(標的の長さ)の比を用いることによって克服できる。 A significant optionally defining the sequence information for specific and non-random sequence by hybridization with short oligonucleotides can overcome by using a ratio of (the length of the appropriate probe) to (length of the target) . 長さ比は、統計に基づいて、識別を消去するか、識別を間違って反転してしまうようないくつかの末端誤対合を有する特異的配列が発生する可能性を無くすように選択する。 Length ratio, based on statistics, or to erase the identification, specific sequences are selected so as to eliminate the possibility of generating with some terminal mismatches that is inverted incorrectly identified. 結果から、0.6、2.5、および10kb未満の標的核酸挿入体に対して、それぞれ6、7 The results, 0.6,2.5, and to a target nucleic acid insert of less than 10 kb, respectively 6,7
、および8ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドの使用が示唆される。 , And 8 using the nucleotides in length of the oligonucleotide it is suggested.

【0176】 実施例11 DNAの配列決定複数のサブアレイからなるアレイにより、反復されたサブアレイの形で並べられたサンプルの小さなセットの効率的な配列決定が可能になる。 [0176] The array of sequencing a plurality of sub-arrays of Example 11 DNA, efficient sequencing of a small set of samples arrayed in the form of repeated sub-array is enabled. 例えば、64個のサンプルを8×8mmのサブアレイ上に並べて、16×24個のサブアレイを15×23cm For example, 64 samples are arranged on a sub-array of 8 × 8 mm and, 16 × 24 sub-arrays of 15 × 23cm
の膜上に1mm幅間隔で反復させもよい。 Or it is repeated at 1mm wide intervals on the film. 幾つかのレプリカ膜を作製してもよい。 It may be made a number of replica film.
たとえば、3072の7-merからなる1つのユニバーサルセットからのプローブを、 For example, a probe from one universal set of 3072 7-mer,
32個の96ウェルプレートに分け、キナーゼにより標識することができる。 Divided into 32 96-well plates, it can be labeled by a kinase. 4つの膜を1サイクルのハイブリダイゼーションの間に並行処理してもよい。 Four film may be parallel processing in one cycle hybridization. 各膜上で、384のプローブを評点してもよい。 On each film, it may be scored probe 384. 全てのプローブを2サイクルのハイブリダ イゼーションで評点してもよい。 All of the probes may be scored on a 2-cycle hybridization of. ハイブリダイゼーション強度を評点し、配列を以下のようにアセンブルすることができる。 The hybridization intensity was scored, the sequence can be assembled as follows.

【0177】 単一のまたは複数のサンプルのサブアレイが幾つかの未知物質を含む場合、特に似たようなサンプルを使用する場合、先に評点したプローブの結果に基づいてプローブを賢く選択すれば、より少ないプローブで十分である。 [0177] If a single or a plurality of samples of the sub-array contains several unknown substances, when using a sample, such as in particular similar, if intelligently select a probe based on the results of the probe was scored earlier, it is sufficient with fewer probe. 例えば、プローブAAAAAAAが陽性でない場合、8つのオーバーラッププローブのうちのいずれか が陽性である可能性は低い。 For example, if the probe AAAAAAA is not positive, potentially one of the eight overlapping probes are positive is low. AAAAAAAが陽性であれば、通常2つのプローブが陽 性である。 If AAAAAAA is positive, usually two probes are positives. この場合、アンカーの順番および各アンカー間のギャップのサイズおよびタイプについて最も可能性の高い仮説のうちの1つを確認する配列決定プロセスは、まずオーバーラップが最小であるプローブからなるサブセットをハイブリダイズして陽性アンカーを定義したあと、プローブを選択することからなる。 In this case, sequencing process to confirm one of the most likely hypotheses about the size and type of the gap between the anchor sequence and the anchor hybridizing a subset of overlapping first consists probe is minimal after you define a positive anchor and consists of selecting a probe.
この第2段階において、各プローブが、そのプールからの他のプローブに対して陽性であると期待されるサンプルとは異なるたった1つのDNAサンプルにおいて のみ陽性であるように選択された場合、2〜10プローブからなるプールを使用することができる。 In this second stage, if the probe were chosen to be positive only in different only one DNA sample to the sample to be expected for other probes from the pool to be positive, 2 it can be used a pool of 10 probes.

【0178】 このサブアレイ方法により、分岐問題を解明するためのプローブの競合(オーバーラッププローブ)またはプローブの協働(プローブの連続的なスタッキング)の効率的な実施が可能となる。 [0178] The sub-array method enables efficient implementation of conflict probes for elucidating the branching problem (overlapping probes) or cooperation of the probe (continuous stacking of probes). プローブのユニバーサルセットをハイブリダイズしたあと、配列アセンブリプログラムにより候補配列のサブ断片(SF)を決定する。 After hybridizing the universal set of probes, determining a sub-fragment of the candidate sequence (SF) by sequence assembly program. SFのさらなるアセンブリのために、(DNA断片のオーバーラップ配列、類 似配列、単一パスゲル配列、また他のハイブリダイゼーションもしくは制限地図データからの)追加情報を提供しなければならない。 For further assembly of SF, it must provide (overlapping sequences of DNA fragments, kind similar sequences, single Pasugeru sequences, also from other hybridization or restriction mapping data) additional information. 分岐点を通る単一パスゲル配列決定のためのプライマーを、SBH配列情報または既知のベクター配列(例え ばベクター挿入部位のフランキング配列)から同定し、標準的なサンガーの配列決定反応をサンプルDNAに対して行う。 Primers for single Pasugeru sequencing through the branch point, identified from SBH sequence information or known vector sequences (flanking sequences of the vector insertion site For example), the standard Sanger sequencing reaction to a sample DNA done for. この単一パスゲル配列決定から得た配列 を、分岐点の中に読みこまれたもしくはそこから読み出されたSfと比較し、Sfの順番を同定する。 The sequence obtained from this single Pasugeru sequencing, compared with Sf read read crowded with or therefrom into the branch point, to identify the order of Sf. さらに、単一パスゲル配列決定をSBHと組み合わせて、核酸を 新たに配列決定するかまたは再配列決定することができる。 Furthermore, in combination with SBH single Pasugeru sequencing, nucleic acid can be determined newly sequenced to or rearrangements.

【0179】 また、競合ハイブリダイゼーションおよび連続的なスタッキング相互作用を使用してSfをアセンブルすることもできる。 [0179] In addition, it is also possible to assemble the Sf using a competitive hybridization and continuous stacking interactions. これらの方法は、SBHでは均一なアレ イを使用する場合に標識されたプローブをアレイに固定されたサンプルに適用するため、大量のサンプルを配列決定するための商業的価値に限界がある。 These methods for applying the labeled probe to a fixed sample array when using the SBH in uniform array is limited in commercial value to sequence a large number of samples. 幸運にも、レプリカサブアレイを用いた少量サンプルの分析により両方の方法の効率的な実施が可能になる。 Fortunately, it is possible to efficient implementation of both methods by analysis of aliquot using replica subarrays. 各レプリカサブアレイ上で、プローブのプールを用いて、 On each replica sub arrays, with a pool of probes,
同じサブアレイの中にスポットされた異なるサンプルの中の突然変異配列を解明するときと同じように(上記参照)、1つの分岐点を1以上のDNAサンプルにつ いて検査することができる。 As if to elucidate the mutant sequence in the spotted different samples in the same subarray (see above), it can be the one branch points have One to one or more DNA samples examined.

【0180】 この実施例に記載した64サンプルの各々には100の分岐点があり、8サンプル を各サブアレイで並行して分析する場合は、少なくとも800のサブアレイプロー ビングにより全ての分岐点を解明する。 [0180] There are branch point 100 to each of the 64 samples described in this example, when analyzed in parallel the eight samples in each sub-array, to elucidate all branch points by at least 800 subarray probing the . これは、3072の塩基プロービングのためにはさらに800のプロービング(25%)が使用されることを意味する。 This means further 800 probing (25%) that is used for the 3072 bases probing. より好ま しくは、2つのプロービングを1つの分岐点で使用する。 More preferred details, uses two probing a single branch point. サブアレイがより小さい場合、追加使用するプロービングはこれより少ない。 If the sub-arrays is less than, probing for additional use is less than this. 例えば、サブアレイが16 For example, sub-array 16
個のサンプルからなる場合、200の追加プロービングが評点される(6%)。 If made of samples, 200 additional probing is scored (6%). 7- 7
merプローブ(N 1-2 B 7 N 1-2 )を用いることにより、および競合的もしくは共同的 な分岐点解明方法またはその両方を用いて、約1000bpの断片を約4000のプロービングによりアセンブルすることができる。 By using the mer probe (N 1-2 B 7 N 1-2) , and competitive or using collaborative branch points elucidating methods, or both, to assemble the fragment of about 4000 probing about 1000bp that can. さらに、8-merプローブ(NB 8 N)を用いて4kbもしくはこれより長い断片を12000のプロービングでアセンブルすることができる。 Furthermore, it is possible to assemble a 4kb or longer fragments than this at 12000 probing using 8-mer probes (NB 8 N). 途切れたプローブ(gapped probe)、例えばNB 4 NB 3 NもしくはNB 4 NB 4 N Interrupted probe (gapped probe), for example, NB 4 NB 3 N or NB 4 NB 4 N
を使用して分岐点の数を減少させることができる。 It is possible to reduce the number of branch points using.

【0181】 実施例12 プローブの一時的なサブアレイへの結合によるDNA解析および標識プローブのラ イゲーション [0181] ra DNA analysis and labeled probe by binding to a temporary subarray of Example 12 Probe Igeshon

【0182】 情報提供の長さを4から40塩基有するオリゴヌクレオチドプローブを、標準的な化学により合成し、試験管またはマルチウェルプレート中に保存する。 [0182] The oligonucleotide probes the length of the provided information from the 4 with 40 bases, were synthesized by standard chemical, it is stored in a test tube or multiwell plates. 1から10,000プローブから成る特定のプローブセットを、別個の支持体またはよ り大きな支持体の異なる部分への沈降、またはin situ 合成により整列させる 。 The particular probe set consisting of 1 to 10,000 probes, precipitation of the different parts of a separate support or good Ri large support or align by in situ synthesis. 後者の場合、その部分またはサブアレイは、物理的または疎水性のバリアーによって分離してもよい。 In the latter case, that portion or subarray may be separated by barrier physical or hydrophobic. このプローブアレイは、in situ合成によって調整して もよい。 The probe array may be adjusted by in situ synthesis. 適当なサイズのサンプルDNAを、一つかそれ以上の特定アレイでハイブ リダイズする。 The appropriate size of the sample DNA, to hybridize with one or more specific arrays. サンプルの多くは同じサブアレイにおけるプールとして、または一つの支持体内に異なるサブアレイを有するものをそれぞれ個別に、コンピュータにかけてもよい。 Many samples as a pool in the same sub-array or a support having a different sub-arrays in the body individually, may be subjected to computer. サンプルと同時に、またはそれに続いて、単一の標識プローブ、または標識プローブのプールを一つ、各サブアレイに加える。 Sample and simultaneously or subsequently adding a single labeled probe or a pool of labeled probes, one to each sub-array. 結合および標識したプローブを、サンプルDNA中の相補的な標的に背中合わせにハイブリダイ ズすると、それらは連結される。 Bound and labeled probe and back to back to hybridize's to complementary target sample in the DNA, they are connected. ライゲーションの発生は、プローブから標識を検出することによって測定する。 Generation ligation is measured by detecting the label from the probe.

【0183】 この手順は、DNAサンプルが支持体に永久的に結合されない、記載のDNA解析方法とは異なる方法である。 [0183] This procedure, DNA samples are not permanently bound to the support, a method different from the DNA analysis method according. 一時的な結合は、支持体に固定したプローブによってもたらされる。 Temporary binding is provided by the fixed probe to the support. この場合、標的DNAアレイの方法は必要ない。 In this case, there is no method of target DNA arrays required. さらに、ライゲーシ ョンにより、短い固定プローブを伴う短い標識プローブを結合することによって、より長いオリゴヌクレオチド配列の検出が可能になる。 Furthermore, the Raigeshi ® down, by combining the short labeled probe with a short fixed probe allows detection of longer oligonucleotide sequences.

【0184】 この方法はいくつかのユニークな特色をもつ。 [0184] This method has several unique features. 基本的に、標的の一時的結合により、その再利用が可能になる。 Basically, the temporary binding of the target allows its reuse. ライゲーションが起きた後、標的を放出してもよく、標識は支持体に共有結合したままとなる。 After ligation has occurred, may emit a target, the label will remain covalently bound to the support. この特色により、標的のサイクリングおよび少量の標的で検出できる信号の産生が可能になる。 This feature allows the production of a signal which can be detected by cycling and small amounts of target target. 最適条件下では、 Under optimum conditions,
標的を増幅する必要はない。 There is no need to amplify the target. 例えば、DNAサンプルの天然源を、診断および配列 決定を目的として、直接使用してもよい。 For example, a natural source of DNA samples, for diagnostic purposes and sequencing may be directly used. 効率のよいハイブリダイゼーションと効率のよい二重らせんの融解との間で温度をサイクリングすることによって、標的を放出させてもよい。 By cycling the temperature between the melting of efficient hybridization and efficient double helix, it may be released targeted. 成分の温度と濃度は、遊離標的とハイブリッド中に入った標的との間で均衡をもつように(およそ50:50%)定義してよい。 Temperature and concentration of components, to have a balance between the entered target in free target hybrids (approximately 50: 50%) may be defined. この場合、 連結した産物が連続して産生される。 In this case, linked product is produced continuously. 目的が異なる場合は、最適均衡比が異なってくる。 If the purpose is different, the optimal equilibrium ratio becomes different.

【0185】 電場を、標的の利用を高めるために使用してもよい。 [0185] The electric field, it may be used in order to enhance the use of the target. まず始めに、各サブアレイ内の水平フィールドパルシング(horizontal field pulsing)を、より早く標的を選別するために使用してよい。 First, a horizontal field pulsing within each subarray (horizontal field pulsing), may be used to screen more quickly target. この段階で、均衡がハイブリッド形成に動き、 At this stage, equilibrium is motion in hybridization,
非標識プローブが使用できる。 Non-labeled probe can be used. 標的を選別する段階を経た後に、適当な洗浄(垂直電場でサンプルの動きを制限することでやりやすくなる)を実施してよい。 After passing through the step of selecting a target, it may be carried out an appropriate washing (made easier by limiting the movement of the sample in the vertical electric field). 識別するハイブリッド融解、ハイブリダイゼーションによる標的の収穫、未使用標的のライゲーションおよび除去の、いくつかのサイクルを、特異性を増すために導入してもよい。 Identifying hybrid melting, harvesting of the target by hybridization, unused target ligation and removal, several cycles may be introduced to increase specificity. 次の段階では、標識したプローブを加え、垂直電気パルスを用いてもよい。 In the next step, the labeled probe was added, may be used vertical electrical pulses. 温度を上昇させて、最適な遊離標的とハイブリダイズした標的との比が得られる。 The temperature was increased, the ratio of the best free target and hybridized target can be obtained. 垂直電場は選別した標的の拡散を防ぐ。 Vertical electric field prevents diffusion of targets sorted.

【0186】 固定プローブのサブアレイおよび標識プローブのセット(特に設計するかまたは一般的なプローブセットから選択する)は、有効でフレキシブルな配列決定および診断方法を可能にするべく、様々にアレンジしてよい。 [0186] (chosen from or common probe set especially designed) subarrays and labeled probes of a set of fixed probes, in order to permit effective and flexible sequencing and diagnostic methods, may be variously arrange . 例えば、細菌ゲノムの短いフラグメント(約100−500bp)を部分的にまたは完全に配列決定す る場合は、既知の配列の塩基上に設計したプローブの小さなアレイ(5−30塩基長)を使用してよい。 For example, if a short fragment of the bacterial genome (approximately 100-500Bp) that determine partial or complete sequence, a small array (5-30 bases in length) of the probe designed on the base of known sequence using it may be. サブアレイ毎、すなわちそれぞれ10個のプローブを有する10のサブアレイ毎に、10の標識プローブからなる別個のプールを調べると、ライゲーションで連結された2塩基を評価すると仮定して、200塩基確認 できる。 Each sub-array, i.e. every 10 sub-arrays having 10 probes respectively, examining the separate pool of 10 labeled probe, assuming evaluating the two bases linked by ligation, 200 bases can be confirmed. ハイブリッドを通じて誤対合を識別する条件下で、プローブは一つ以上の塩基と置き換えて、同数のプローブをもつより長い標的をカバーしてもよい。 Under conditions to identify the mismatch through hybrid, the probe is replaced with one or more bases may cover the long target than with the same number of probes.
長いプローブを用いることにより、サンプル中の残りのDNAから増幅または単離 せずに、直接調べることができる。 By using long probes, without amplification or isolation from the rest of the DNA in the sample can be examined directly. また、いくつかの標的を同時に一つのサンプル中で分析(スクリーニング)してもよい。 Also, some of the targets may be analyzed in one sample (screening) at the same time. 得られた結果が突然変異(または病原体)の発生を示唆する場合、その突然変異のタイプまたは病原体のサブタイプを検出するために、プローブの追加プールを使用してもよい。 If the results obtained suggest the occurrence of mutation (or a pathogen), to detect the sub-type of the mutation type or pathogen, it may be used an additional pool of probes. これはこの方法の特色であり、ほんの一部の患者のみが感染または突然変異を有すると考えられる場合の予防的診断において費用対効果が優れている。 This is a feature of this method, only a fraction of patients have excellent cost effective in preventive diagnosis where considered to have an infection or mutation.

【0187】 実施例で述べた方法においては、いろいろな検出方法を使用してよい。 [0187] In the method described in Example, it may be used a variety of detection methods. 例えば、 For example,
放射性標識、蛍光標識、酵素または抗体(化学発光)、光分散または光の干渉を利用する方法で検出可能な大きな分子または粒子があげられる。 Radioactive labels, fluorescent labels, enzymes or antibodies (chemiluminescence), light scattering or light detectable large molecules or particles in a manner that utilizes the interference of the like.

【0188】 実施例13 8-merおよび9-merを用いた標的の配列決定 8-merおよび9-merのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションから得られるデータは、ハイブリダイゼーションによる配列決定が非常に精度が高いことを示している。 [0188] Data obtained from the hybridization of Example 13 8-mer and 9-mer of sequencing 8-mer and 9-mer target using oligonucleotide by sequencing a very high accuracy hybridization It is shown that. この実験では、隣接してオーバーラップする成分の8-merおよび9 In this experiment, the component overlapping adjacent 8-mer and 9
-merのオリゴヌクレオチドを推定するために、既知の配列を使用した。 To estimate the -mer oligonucleotides were used known sequences.

【0189】 完全に対合するオリゴヌクレオチドに加えて、誤対合のオリゴヌクレオチド、内部または末端誤対合がオリゴヌクレオチドにより形成された二重らせん中に発生する誤対合のオリゴヌクレオチド、ならびに標的を調べた。 [0189] In addition to the oligonucleotide to fully mate, mismatches of the oligonucleotide, internal or terminal mismatches are mismatches occurring double helix formed by oligonucleotides Oligonucleotides and target They were examined. この分析では、ハイブリダイゼーション形成を最大限にするために、最も低い実温度を用いた。 In this analysis, in order to maximize the hybridization formed, using the lowest actual temperature. 誤対合 対 対合オリゴヌクレオチド/標的ハイブリダイゼーションの最大解離率を用いて、必ず最大限の識別ができるように、上記と同じ温度またはより低い温度で洗浄を行った。 Using the maximum dissociation rate of mismatched pairs pairing oligonucleotide / target hybridization, to always provide maximum identification was washed at a temperature lower than the same temperature or above. 絶対ハイブリダイゼーション収率は配列に依存して示してあるが、上記の条件は、全ての配列に適用できるように示してある。 Absolute hybridization yield is shown depending on the sequence, but the above conditions is shown to be applicable to all sequences.

【0190】 不安定さが最小であると仮定できる誤対合は、単一端の誤対合であるので、ハイブリダイゼーションによる配列決定の試験とは、すなわち完全に対合するオリゴヌクレオチド/標的二重らせんを、末端が誤対合したオリゴヌクレオチド/標的二重らせんから識別する能力である。 [0190] mismatch which can be assumed instability is minimal, since it is mismatched single ended, the test of sequencing by hybridization, i.e. oligonucleotide / target duplex to fully mate the spiral, end is the ability to identify from mismatched oligonucleotide / target duplex.

【0191】 ドットブロットフォーマット(dot blot format)中102から105のハイブ リダイズするオリゴヌクレオチドについて、識別を示す値は、精度の高い配列生成を可能とする、2より大きかった。 [0191] The dot blot format (dot blot format) in the oligonucleotide to hybridize to 102 from 105, the values ​​indicating the identification allows for high sequence generation accuracy, greater than 2. このシステムはまたハイブリダイゼーション形成に及ぼす配列の効果ならびにハイブリダイゼーションの不安定性の分析も可能にする。 The system also allows the analysis of the instability of the effects, as well as hybridization sequence on hybridization formation.

【0192】 既知の配列の105のオリゴヌクレオチドプローブの標的核酸への、ハイブリダイゼーションにより得られたデータを用いて、例えば100bpの標的配列のPCR [0192] 105 known sequences of the oligonucleotide probes to the target nucleic acids using the obtained data by hybridization, e.g., PCR of the target sequence of 100bp
で調製したヒトインターフェロン遺伝子の既知の部分の100の塩基対を生成した。 In generating the 100 base pairs of a known portion of the human interferon gene prepared. 使用したオリゴヌクレオチドプローブは、その配列が完全に標的と相補的な配列である、72の8-merと21の9-merのオリゴヌクレオチドを含んでいた。 Oligonucleotide probes used, the sequence is completely target sequence complementary contained 8-mer and 21 of 9-mer oligonucleotide 72. 93のプローブセットにより、一つか二つの塩基をずらした標的配列の連続してオーバーラップするフレームが提供された。 The 93 probe sets, successive frames overlap with the target sequences obtained by shifting one or two bases are provided.

【0193】 誤対合の影響を評価するために、100bpの試験標的配列へハイブリダイズした際に、少なくとも一端の誤対合を含む12の追加プローブについて、ハイブリダイゼーションを調べた。 [0193] To evaluate the effect of mismatches, when hybridized to the test target sequence of 100 bp, about 12 additional probes containing mismatches at least one end, was examined hybridization. また、選んだその他4つの対照核酸配列と末端が誤対合する標的をもつ12のプローブのハイブリダイゼーションを試験したところ、 Furthermore, it was tested hybridization of 12 of the probe with four other control nucleic acid sequences and target end which pair erroneously chosen,
形成した12のオリゴヌクレオチドは、四つの対照DNAをともなう二重らせんハ イブリッドと完全に対合した。 Formed was 12 oligonucleotides were Perfectly matched with double helix hybrid with the four control DNA. こうして、オリゴヌクレオチドと標的の、内部の誤対合、末端誤対合、完全に対合する二重らせん対のハイブリダイゼーションを、試験で使用したオリゴヌクレオチドそれぞれについて評価した。 Thus, the oligonucleotide and the target, internal mismatches, terminal mismatches, completely hybridization of the double helix pairs of mating was evaluated for the oligonucleotides each were used in the test. 絶対DNA標的 濃度が、試験の8-merと9-merのオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションに及ぼす影響を、共増幅したプラスミドDNA内の単一で発生する非標的部 位への異なるオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出し、 Absolute DNA target concentration of 8-mer and 9-mer test the effect on hybridization with oligonucleotides, the different oligonucleotide probes to non-target portion position that occur within a single plasmid DNA were co-amplified and detecting hybridization,
標的DNA濃度を定義することによって決定した。 It was determined by defining target DNA concentration.

【0194】 この試験の結果により、標的に完全に対合する相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド全て、または対照DNAが、誤対合を有するオリゴヌクレオチドよりも強く ハイブリダイズしたことが示された。 [0194] The results of this test, all oligonucleotides comprising Perfectly matched sequences complementary to the target, or control DNA was shown to strongly hybridize than oligonucleotides having mismatches. この結論にいたるため、各プローブについてHpおよびD値を調べた。 Since leading to this conclusion, it was examined Hp and D values ​​for each probe. Hpは試験標的とオリゴヌクレオチドプローブとの間に形成されたハイブリッド二重らせん量を定義する。 Hp defines hybrid duplex amount formed between the test target and an oligonucleotide probe. 0から10の間の値を105 A value between 0 and 10 105
のプローブについて得られたハイブリダイゼーションに当てたところ、105のプローブの68.5%が2より大きいHpであることが明らかとなった。 It was against the hybridization obtained for probe, revealed that 68.5% of the 105 probes is greater than 2 Hp.

【0195】 1)試験オリゴヌクレオチドと標的または対照核酸との間に形成された完全に対合した二重らせんをひとつ含むドットと、2)同じオリゴヌクレオチドと標的または対照核酸内の異なる部位との間に形成された誤対合二重らせんをひとつふくむドット、との間の信号強度の比として定義して、識別(D)値を得た。 [0195] 1) Test the oligonucleotide and the target or dot containing one Perfectly matched duplex formed between the control nucleic acid, 2) the same oligonucleotide and the target or between different sites within the control nucleic acid dots including one mismatched duplexes formed between, and defined as the ratio of the signal strength between the to obtain the identification (D) value. D値の変動は、1)バックグラウンドから信号の視覚化を可能にする、ハイブリダイゼーションの有効性の摂動、または2)試験オリゴヌクレオチドと標的との間に見られた誤対合のタイプ、のどちらかによりもたらされる。 Variations in the value of D, 1) from the background to permit visualization of the signal, the effectiveness of the perturbation of the hybridization or 2) was mismatched type case that seen between the test oligonucleotide and the target, the caused by either. この試験で得られたD値 は、試験をした105のオリゴヌクレオチドプローブのうち102について、2 D values ​​obtained in this test, for 102 of the 105 oligonucleotide probes were tested, 2
から40の間であった。 From was between 40. 102のオリゴヌクレオチドを全体とした群について、 For the entire and the group 102 of oligonucleotides,
D値を計算したところ、平均10.6であった。 It was calculated the D value was an average 10.6.

【0196】 オリゴヌクレオチド/標的二重らせんが末端誤対合を示したのは20例であった。 [0196] The oligonucleotide / target duplex showed a terminal mismatch was 20 cases. このうち5例では、Dは10より大きかった。 In these five cases, D is greater than 10. この場合の大きいD値は、最も安定的な(G/TおよびG/A)末端の誤対合以外により引き起こされる、ハイブリダイゼーションの不安定性によるのではないかと考えられる。 Large D value in this case is the most stable (G / T and G / A) caused by non-mismatched terminal Go is believed that it would be due to instability of the hybridization. その他の可能性としては、オリゴヌクレオチドまたは標的のどちらかの配列にエラーがあったことがあげられる。 Other possibilities, that there was an error in either the sequence of the oligonucleotide or the target and the like.

【0197】 低いHpのプローブの標的におけるエラーの可能性は、このようなエラーがその他8つのオーバーラップするオリゴヌクレオチドそれぞれのハイブリダイゼーションに影響したと考えられるため、除外した。 [0197] less potential for errors in the target of the probe of Hp, such error because it is considered to have influence on the other eight oligonucleotides each hybridization overlapping, were excluded. その他のオーバーラップするオリゴヌクレオチドについて配列の誤対合による明らかな不安定性が見られなかったことは、標的配列が正しかったことを示すものである。 It did not show a clear instability for other overlapping oligonucleotides by mismatch sequence, is an indication that the target sequence was correct. オリゴヌクレオチド配列中のエラーの可能性は、7つの新しく生成したオリゴヌクレオチドを再度調べた後に除外した。 The possibility of errors in the oligonucleotide sequence was excluded after examining seven newly formed oligonucleotide again. 7つのオリゴヌクレオチドのうち一つのみが、よりよいD値をもた らした。 Only one of the seven oligonucleotides were brought about a better D value. 低いハイブリッド形成値は、ハイブリッドの不安定性またはハイブリッド二重らせんの形成の無能力からもたらされる可能性がある。 Low hybridization value is likely to result from the inability of the formation of instability or hybrid duplex hybrid. ハイブリッド二重らせんの形成の無能力、1)選んだプローブの自己相補性または2)標的/標的自己ハイブリダイゼーションのどちらかより起こりえる。 Incapacity of the formation of the hybrid double helix, 1) self-complementarity or second probe chosen) may occur more either of the target / target self-hybridization. プローブが自己相補性であった場合、オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオチド二重らせん形成のほうが、オリゴヌクレオチド/標的ハイブリッド二重らせん形成よりも有利となる可能性がある。 When the probe was self-complementary, more oligonucleotide / oligonucleotide duplex formation, it may be advantageous than oligonucleotide / target hybrid duplex formation. 同様に、標的が自己相補的であった場合には、標的/標的結合が有利となるか、または内部パリンドロームを形成する可能性がある。 Similarly, when the target was self-complementary, there is a possibility of forming a target / target binding is advantageous or internal palindrome. これらの可能性を評価したところ、問題のあるプローブが、自身とハイブリッドを形成しなかったことは、プローブ分析から明らかであった。 Was evaluated these possibilities, a probe with a problem, it did not form itself and the hybrid was evident from the probe analysis. さらに、標的/標的ハイブリダイゼーションの貢献度を検討したところ、問題のあるオリゴヌクレオチドプローブの一つが、同じ標的を含む二つの異なるDNAで非効率的にハイブリダイズした ことが決定された。 Furthermore, was examined the contribution of the target / target hybridization, one oligonucleotide probe with a problem, it has inefficiently hybridized was determined in two different DNA containing the same target. 二つの異なるDNAが同じ標的配列について自己相補的な領域 をもつ可能性が低いということは、標的/標的ハイブリダイゼーションが低いハイブリダイゼーション形成には寄与しなかったという結論を導き出す。 The fact that less likely with self-complementary regions of two different DNA is for the same target sequence, draw conclusions that did not contribute to target / target hybridization is less hybridization formation. したがって、こうした結果は、ハイブリッド形成の無能力ではなく、ハイブリッドの不安定性が、特定のオリゴヌクレオチドに観察された低いハイブリッド形成の原因であったことを示唆している。 Thus, these results are not the incapacity of hybridization, instability hybrids, suggesting that it was the cause of low hybridization observed in particular oligonucleotide. またこうした結果は、低いハイブリッド形成が、一定のオリゴヌクレオチドの特定の配列によるものであることをも示唆している。 Also these results, low hybridization, suggesting also that due specific sequence of certain oligonucleotides.
さらにこうした結果は、8-merおよび9-merのオリゴヌクレオチドを使用すれば、配列を生成するのに信頼できる結果が得られるだろうことを示唆している。 Moreover these results suggest that if using 8-mer and 9-mer oligonucleotide will produce reliable results to generate the sequence.

【0198】 これらの結果は、記載した方法を用いることで、どんな特定の標的核酸の長い配列も、構成するオリゴヌクレオチドの最大限かつユニークなオーバーラップにより生成されるであろうことを示している。 [0198] These results, by using the method described, even long sequences of any specific target nucleic acid, indicates that would be generated by the maximum and unique overlap of the oligonucleotides constituting . このような配列決定方法は、その頻度や位置とは無関係で、個々の構成オリゴマーの内容に依存する。 Such sequencing method is independent of the frequency and position dependent on the contents of the individual component oligomers.

【0199】 下記のアルゴリズムを使って生成する配列は、精度が高い。 [0199] algorithm used to generate the following sequence, there is a high degree of accuracy. 4つ低い信頼値が含まれる、105のハイブリダイゼーション値から生成する配列が正しかったという事実に示されるとおり、このアルゴリズムは、ハイブリダイゼーションドットからの誤った正の信号を許容する。 Four low confidence value is included, as shown in the fact that the sequence produced is correct from the hybridization values ​​of 105, the algorithm allows the false positive signals from the hybridization dots. ハイブリダイゼーションによる配列決定における正確さは、短いオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの「一か八か( Accuracy in sequencing by hybridization, short oligonucleotides high "stakes hybridization (
all or none)」の動態、ならびに完全に対合した二重らせんと誤対合した二重 らせんとの間の二重らせんの安定性の違いによる。 Due to differences in the stability of the duplex between all or none) "kinetics, as well as Perfectly matched duplex with mismatched double helix. 対合した二重らせんおよび末端が誤対合した二重らせんの二重らせん安定性の比は、二重らせん長の減少につれて増す。 Duplex stability of the specific double helix double helix and ends paired is paired erroneous, increases with decreasing duplex length. さらに、結合エネルギーは、二重らせん長の減少につれ低下し、より低いハイブリダイゼーション効率をもたらす。 Furthermore, binding energy, and decreases as reduction of the double helix length results in a lower hybridization efficiency. ただし、こうした結果は、オクタマーハイブリダイゼーションが、二重らせんの安定性に影響する因子の平均化、 However, these results are, octamer hybridization, the average of the factors that affect the stability of the double helix,
ならびにハイブリダイゼーションにより配列決定する精度の高い方法を生み出すための識別を、可能にすることを示す。 As well as identification to produce a method accurate sequencing by hybridization, indicating that possible. その他実施例における結果は、6,7、 The results of the other examples, 6,7,
または8つのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドは、0.5kb(ヘキサマー)、2kb(セプタマー)、6kb(オクタマー)である標的に、信頼できる配列を生成するのに、有効に利用できることが示された。 Or oligonucleotide which is eight nucleotides, 0.5 kb (hexamer), targeting a 2 kb (Seputama), 6 kb (octamer), to generate a reliable sequence was shown to be effectively utilized. 長いフラグメントの配列は、完全なゲノム配列を生成するため、オーバーラップしてもよい。 Sequence of long fragments is to generate a complete genome sequence, may overlap.

【0200】 実施例14 得られたデータの解析イメージファイルを、DOTSプログラム(Drmanacら, 1993)のようなイメージ解 析プログラムで解析し、例えばSCORESプログラム(Drmanacら, 1994)中に含まれ る統計的機能でスケールして評価した。 [0200] The analysis image file of Example 14 the data obtained, DOTS program (Drmanac et al., 1993) and analyzed by an image analysis program such as, for example SCORES program (Drmanac et al., 1994) contained Ru statistics during It was evaluated by scale functions. シグナルの分布から、シグナルを+/-ア ウトプットに変換するために最適閾値を決定する。 From the distribution of the signal, determining the optimum threshold value for converting the signal into +/- A Utoputto. 検出された標識の位置から、 From the detected position of the marker,
断片からのF+Pヌクレオチド配列が標識位置に対応する標識プローブと固定化プ ローブの既知配列を組み合わせることで決定されよう。 F + P nucleotide sequences from the fragment will be determined by combining the known sequence of the labeled probe corresponding to the marker position immobilized probe. その後、ヒト染色体などの元の分子の完全な核酸配列または配列サブフラグメントはコンピュータ演繹法により決定されたオーバーラップするF+P配列からアセンブルされるだろう。 Thereafter, the complete nucleic acid sequence or sequences subfragments of the original molecule, such as a human chromosome would be assembled from F + P sequences overlapping is determined by the computer deduction.

【0201】 一つの選択肢は、配列アセンブリ過程でハイブリダイゼーションシグナル(例えば、スコア)を+/-アウトプットに変換することである。 [0202] One option is to convert the hybridization signal in sequence assembly process (e.g., score) the +/- to the output. この場合に、アセン ブリは非常に高いスコアをもつF+P配列、例えばF+P配列 AAAAAATTTTTT から出発するだろう。 In this case, assemblies are F + P sequence with a very high score, for example, it will start from F + P sequences AAAAAATTTTTT. 4つ全ての可能なオーバーラップするプローブ AAAAATTTTTA、AAAA All four possible overlapping probes AAAAATTTTTA, AAAA
ATTTTTT、AAAAATTTTTTCおよびAAAAATTTTTTG、および冒頭で異なる3つの追加の プローブ(TAAAAATTTTTT; CAAAAATTTTTT; GAAAAATTTTTT)のスコアを比較すると、 Comparing the scores (GAAAAATTTTTT TAAAAATTTTTT;; CAAAAATTTTTT), ATTTTTT, AAAAATTTTTTC and AAAAATTTTTTG, and beginning at three different additional probes
3つの結果が規定される。 Three results are defined. すなわち、(i) 出発プローブと4つのオーバーラップするプローブのうちの1つだけが他の6つのプローブに対して有意に正のスコアを有する。 That is, having (i) a significantly positive score only one relative to the other six probes of the starting probe and four overlapping probes. この場合には、AAAAAATTTTTT配列が右側に1ヌクレオチドだけ伸長される;(ii)出発プローブを除いてどのプローブも有意に正のスコアをもたない。 In this case, AAAAAATTTTTT sequence is extended by one nucleotide on the right; (ii) no score positive significantly any probe except the starting probe.
アセンブリは停止し、例えばAAAAAATTTTT配列が配列決定されるDNA分子の最後にくる;(iii) オーバーラップするプローブおよび/または他の3つのプローブの中に有意に正のスコアが2以上存在する。 Assembly stops, for example AAAAAATTTTT sequence comes to the end of DNA molecules to be sequenced; significantly positive score in the (iii) overlapping probes and / or other three probes is present 2 or more. エラーまたは枝分かれのためにアセンブリが停止される(Drmanacら, 1989)。 Assembly is stopped because of an error or branching (Drmanac et al., 1989).

【0202】 コンピュータ演繹法では、既存のアルゴリズムを用いるコンピュータプログラムが利用されるだろう(例えば、Pevzner, 1989; Drmanacら, 1991; Labat & Dr [0202] In the computer deduction, would a computer program using the existing algorithm is used (for example, Pevzner, 1989; Drmanac et al., 1991; Labat & Dr
manacら, 1993を参照のこと;それぞれを参考としてここに組み入れる)。 manac et al., see 1993; incorporated herein each reference).

【0203】 F+Pのほかに、F(スペース1)P、F(スペース2)P、F(スペース3)PまたはF(スペース4)Pが決定される場合は、アルゴリズムを用いて全てのデータセットをマッチ させることにより、起こりうるエラーを修正したり、枝分かれの問題が存在する事例を解明できるだろう(例えば、Drmanacら, 1989; Bainsら, 1988;それぞれを参考としてここに組み入れる)。 [0203] In addition to the F + P, F (space 1) P, F (space 2) P, F (space 3) P or F (space 4) If P is determined, all using the algorithm by matching the data set, or to correct the errors that may occur will be elucidate cases branching problems exist (e.g., Drmanac et al., 1989; Bains et al., 1988; incorporated herein each reference).

【0204】 実施例15 ツーステップハイブリダイゼーションにより配列決定を行う本発明者により意図される配列決定法の実施を記載するいくつかの実施例に続いて、最初に、全チップを1億bp(1本のヒト染色体)ほどに複雑なDNAの混合 物とハイブリダイズさせる。 [0204] Following some examples describing the implementation of the sequencing method contemplated by the inventors for performing sequenced by Example 15 Two-Step Hybridization, first, the entire chip 100 million bp (1 mixtures of the present human chromosomes) as a complex DNA and hybridized. ハイブリダイゼーションを実施するためのガイドラインは、Drmanacら (1990); Khrapkoら (1991); Broudeら (1994) などの文献に載っている。 Guidelines for conducting hybridization, Drmanac et al. (1990); rests Broude et al (1994) documents, such as; Khrapko et al (1991). これらの文献は、フォーマット3 SBHの初期ステップで使用するの に適するハイブリダイゼーションの温度範囲、緩衝液および洗浄ステップを教示している。 These references, the temperature range of hybridization suitable for use in the initial step of Format 3 SBH, teaches a buffer and wash step.

【0205】 本発明者は、特に、提供され得る標的DNAの濃度が比較的低いために、ハイブ リダイゼーションを高塩濃度にて低温(-2〜5℃)で最大数時間にわたり実施す ることを意図している。 [0205] The present inventors have, in particular, Rukoto be performed due to the relatively low concentration of target DNA that can be provided, for up to several hours hybridization at high salt concentrations at a low temperature (-2~5 ℃) It is intended. そのために、10℃で析出するリン酸ナトリウム緩衝液の代わりにSSC緩衝液を使用する(Drmanacら, 1990)。 Therefore, using the SSC buffer instead of sodium phosphate buffer deposited at 10 ° C. (Drmanac et al., 1990). 洗浄は第2ステップのために十分である必要はなく(2,3分)、高度に複雑なDNAサンプルの配列決定のためにハイブリダイゼーションサイクリングを使用する場合には完全に排除することができる。 Washing can be completely eliminated when using the hybridization cycling for sequencing sufficient but need not (few minutes), highly complex DNA samples for the second step. ハイブリダイゼーションステップと洗浄ステップで同一の緩衝液を用いると、標識プローブを用いる第2ハイブリダイゼーションステップと続行させることができる。 When using the same buffer in washing steps and hybridization steps can be continued with the second hybridization step with labeled probes.

【0206】 各アレイ(例えば、8 x 8mm アレイ)に対して単純なロボットデバイスを使用する適切な洗浄を行った後に、1つの標識プローブ(例えば、6-mer)を添加す る。 [0206] Each array (e.g., 8 x 8 mm array) after the appropriate washing using a simple robotic device to a single-labeled probe (e.g., 6-mer) added. 96-チップまたは96-ピンデバイスを用いて、これを42回実施する。 Using a 96-chip or 96-pin devices, implementing this 42 times. この場合も、科学文献に記載されるような、ある範囲の差別的条件が採用されるだろう。 In this case also, as described in the scientific literature, would discriminatory conditions of a certain range is adopted.

【0207】 本発明者は、特に、次の条件を採用することを意図している。 [0207] The present inventors have found that, in particular, is intended to adopt the following conditions. 最初に、標識プローブを添加して、低温(0〜5℃)で(添加オリゴヌクレオチドの高濃度のため) First, the labeled probe was added, low temperature (0 to 5 ° C.) (for higher concentrations of added oligonucleotides)
数分間だけインキュベートした後、F+P長さに応じて温度を3〜10℃に上げ、洗浄緩衝液を添加する。 After incubation only a few minutes, the temperature is raised to 3 to 10 ° C. Depending on F + P length, adding wash buffer. この時に用いる洗浄緩衝液はどのようなライゲーション反応にも適合しうるもの(例えば、100 mMの塩濃度範囲)である。 Wash buffer as it can fit into any ligation reaction using at this time (e.g., 100 mM salt concentration range) is. リガーゼを添加した後、迅速なライゲーションおよび完全対合と誤対合ハイブリッドのさらなる識別を可能とするために温度を再度15〜37℃に上げる。 After adding ligase, raising again 15 to 37 ° C. The temperature in order to allow further identification of rapid ligation and perfectly matched and mismatched hybrids.

【0208】 Pontius & Berg (1991, 参考としてここに組み入れる)に記載されるように、 [0208] Pontius & Berg as described in (1991, here incorporated by reference),
カチオン界面活性剤の使用が、フォーマット3 SBHでも意図される。 The use of cationic surfactants are contemplated even format 3 SBH. これらの著 者は、2種の単純なカチオン界面活性剤、ドデシル- およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド(DTABおよびCTAB)をDNA再結合において使用することを記述 している。 These authors are two simple cationic surfactants, dodecyl - and and cetyltrimethylammonium bromide (DTAB and CTAB) describes the use in DNA recombination.

【0209】 DTAB およびCTABは、第四級アミンであるテトラメチルアンモニウムブロミド( [0209] DTAB and CTAB are tetramethylammonium bromide quaternary amines (
TMAB)の変異体で、メチル基の1つが12炭素アルキル基(DTAM)または16炭素アル キル基(CTAB)のいずれかで置換されている。 A variant of TMAB), is substituted with any of one of 12 carbon alkyl group (DTAM) or 16 carbon Al killed group methyl group (CTAB). TMABはテトラメチルアンモニウムイオンの臭化物塩であり、融解温度のGC含量バイアスを低下させるための核酸再 結合実験で用いる試薬である。 TMAB is the bromide salt of tetramethylammonium ion, a reagent used in the nucleic acid recombination experiments to reduce the GC content bias of the melting temperature. DTABおよびCTABは構造的にドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に類似しており、SDSの負に荷電した硫酸基が正に荷電した第四級アミンに置き換わっている。 DTAB and CTAB are similar in structure to sodium dodecyl sulfate (SDS), are replaced by quaternary amines are negatively charged sulfate groups of SDS was positively charged. SDSは非特異的結合を減少させかつヌクレアーゼを阻害す るためにハイブリダイゼーション緩衝液中で普通に用いられるが、再結合速度には大きな影響を与えない。 SDS is commonly used in hybridization buffer in order to inhibit the allowed and nuclease reduce nonspecific binding, but recombination rate does not significantly affect.

【0210】 ライゲーション法を使用するとき、酵素は標識プローブと共に、またはバックグラウンドを低下させる適切な洗浄ステップの後に添加されるだろう。 [0210] When using the ligation method, the enzyme will be added after a suitable cleaning step of reducing with labeled probe, or the background. SBH法で の使用についてこれまで提案されたことはないが、リガーゼ技法は分子生物学の分野で十分に確立されている。 It is not that it has been proposed so far for use in SBH method. However, ligase techniques are well established in the field of molecular biology. 例えば、Hoodと共同研究者はリガーゼ媒介遺伝子検出法(Landegrenら, 1988)を記載しており、この方法はフォーマット3 SBHでの使用のために容易に適合させることができる。 For example, Hood and colleagues ligase-mediated gene detection technique (Landegren et al., 1988) describes a, this method can be readily adapted for use in Format 3 SBH. Wu & Wallaceもまた、2つの隣接した短い合成オリゴヌクレオチドを連結するためにバクテリオファージT4 DNAリガーゼの使用を記載している。 Wu & Wallace also describe the use of bacteriophage T4 DNA ligase to join two adjacent short synthetic oligonucleotides. 彼らのオリゴライゲーション反応は、50 mM Tris Their oligo ligation reaction, 50 mM Tris
HCl pH7.6, 10 mM MgCl 2 , 1 mM ATP, 1 mM DTTおよび5% PEG中で実施された。 HCl pH 7.6, was performed in 10 mM MgCl 2, 1 mM ATP , 1 mM DTT and 5% PEG in. ライゲーション反応物を100℃に5〜10分加熱し、続いて0℃に冷却してからT4 DN The ligation reaction was heated for 5 to 10 minutes to 100 ° C., followed was cooled to 0 ° C. T4 DN
Aリガーゼ(1単位; Bethesda Research Laboratory)を添加した。 It was added; A ligase (Bethesda Research Laboratory 1 unit). 大方のライゲーション反応は30℃で実施し、100℃で5分間加熱して終結させた。 Majority of ligation reaction was carried out at 30 ° C., it was terminated by heating for 5 minutes at 100 ° C..

【0211】 その後、ハイブリダイズした隣接する、またはライゲートされた、長さ(F+P) のオリゴヌクレオチドの識別検出に適する最終洗浄を行う。 [0211] After that, adjacent hybridized, or ligated, a final wash suitable for identification detection oligonucleotide length (F + P). この洗浄ステップは、ライゲートされていない全ての標識プローブと他の全ての化合物を洗い流してバックグラウンドを最小に低減させるために、40〜60℃の水の中で数分間実施する。 This washing step, in order to wash away all of the labeled probe and all other compounds which are not ligated reduce background minimizing be performed several minutes in 40 to 60 ° C. water. 共有結合で結合された標識オリゴヌクレオチドのため、検出は単純化される(時間および低温を強制されない)。 For bound labeled oligonucleotide covalently, detection (not forced time and low temperature) which simplified the.

【0212】 用いた標識に応じて、チップのイメージングは異なる装置を用いて行う。 [0212] Depending on the label used, imaging of the chip is performed using a different device. 放射性標識の場合は、ホスホル・ストレージ・スクリーン技術とスキャナーとしての For radioactive labels, as phosphor-storage screen technology and scanner
PhosphorImagerを使用することができる(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) Can be used PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)
. チップをカセットの中に置き、リンスクリーンでカバーする。 Place the chips in a cassette, covered with a phosphorous screen. 1〜4時間の暴露後、スクリーンをスキャンして、イメージファイルをコンピュータのハードディスクに記憶させる。 After exposure to 4 hours, by scanning the screen, and stores the image file in the computer's hard disk. 蛍光標識の検出の場合は、CCDカメラとエピ蛍光または同焦 点顕微鏡を使用する。 For the detection of fluorescent labels, using a CCD camera and epifluorescent or the focal microscope. CCDカメラの画素上に直接作製されたチップについては、E For directly producing chips on the pixel of the CCD camera, E
ggersら(1994, 参考としてここに組み入れる)が記載するとおりに検出を行うことができる。 ggers et al. (1994, incorporated herein by reference) can be detected as described.

【0213】 電荷結合デバイス(charge-coupled device: CCD)検出器は、プローブに基づいたアッセイで標識標的分子を定量的に検出して、その分布をイメージする活性固相支持体として働く。 [0213] charge-coupled device (charge-coupled device: CCD) detector, and quantitative detection of labeled target molecules in an assay based on the probe, acting as an active solid support for images that distribution. これらのデバイスは、高度にパラレルなアッセイ、超高感度検出、ハイスループット、統合データ獲得およびコンピュータ計算に適合するマイクロエレクトロニクスの固有の特徴を使用している。 These devices are used highly parallel assays, ultrasensitive detection, high throughput, the unique characteristics compatible microelectronics integrated data acquisition and computation. Eggersら(1994)は、本発明のフォーマット3 SBHなどのプローブに基づいたアッセイと共に使用するた めのCCDを記述しており、このCCDは採用した高感度および直接結合のために数秒以内での定量的評価を可能にする。 Eggers et al. (1994), describes a CCD of order to be used with the assay based on the probe, such as a format 3 SBH of the present invention, the CCD is in within a few seconds because of the high sensitivity and direct coupling of adopting to enable a quantitative evaluation.

【0214】 統合CCD検出法はチップ上での分子結合イベントの検出を可能にする。 [0214] Integrated CCD detection method allows the detection of molecular binding events on chips. この検 出器はサンプルをユニークに特徴づける二次元パターンを速やかに作成する。 This test can quickly create a two-dimensional pattern which characterizes the sample uniquely. CC CC
Dに基づく分子検出器の特定的な操作においては、個別の生物学的プローブがCCD In a specific operation of the molecular detector based on D, individual biological probes CCD
の画素上に直接固定されるか、またはCCD表面上に置かれた使い捨てカバースリ ップに結合させてもよい。 If directly be fixed on the pixel, or may be joined to a disposable Kabasuri-up placed on the CCD surface. サンプル分子は放射性同位体、化学発光物質または蛍光タグで標識することができる。 Sample molecules can be labeled with radioisotopes, chemiluminescent or fluorescent tags.

【0215】 CCDに基づくプローブアレイにサンプルを暴露すると、フォーマット3の場合には、サンプルが2つの相補的なプローブに結合された画素位置で光子または放射 性同位体の崩壊産物が発生する。 [0215] Exposure of the sample to the probe array based on the CCD, if the format 3, sample breakdown products of photons or radioisotope occurs in combined pixel located two complementary probe. その後、荷電粒子または標識サンプルからの放射線がCCDゲートに入射すると、電子−穴対が形成される。 Thereafter, radiation from charged particles or labels samples made incident on the CCD gate, electron - hole pairs are formed. 次に、電子が隣接す るCCDゲートの下に集められ、ディスプレイモジュールで順次読み取られる。 Then, electrons are collected under the CCD gate you adjacent sequentially read by the display module. そ れぞれの画素で生成された光電子の数は、このような接近している分子結合イベントの数に直接比例している。 Its number of photoelectrons generated in the pixels of the respectively is directly proportional to the number of molecular binding events that such approach. その結果、分子結合を定量的に測定することができる(Eggersら, 1994)。 As a result, it is possible to quantitatively measure the molecular binding (Eggers et al., 1994).

【0216】 イメージングアレイをサンプルに接近して配置することにより、収集効率が従来のCCDカメラに見られるようなレンズに基づく技術よりも少なくとも10倍向上 する。 [0216] By arranging close the imaging array to the sample, the collection efficiency is increased at least 10 times better than techniques based on the lens, as found in conventional CCD cameras. すなわち、サンプル(エミッタ)を検出器(イメージングアレイ)と近くで接触しており、このことがレンズやミラーなどの従来のイメージングオプチックスを排除する。 That is, the sample (emitter) a detector is in contact with (imaging array) and near, this is to eliminate the conventional imaging optics such as lenses and mirrors.

【0217】 放射性同位体がレポーター基として標的分子に結合される場合は、エネルギー粒子が検出される。 [0217] If a radioisotope is bound to the target molecule as a reporter group, energetic particles are detected. さまざまなエネルギーの粒子を発生する数種のレポーター基が微細加工検出器と共に使用されて成功を収めており、 32 P、 33 P、 35 S、 14 Cおよび125 Lなどがある。 And successful with several reporter group capable of generating a variety of energy of the particles is used with microfabrication detector, and the like 32 P, 33 P, 35 S , 14 C and 125 L. 32 P由来のような高エネルギー粒子は最高の分子検出感度を 提供するが、 35 S由来のような低エネルギー粒子はより良い解像度を提供する。 High-energy particles, such as from 32 P to provide the highest molecular detection sensitivity, but low energy particles, such as from 35 S to provide better resolution. それゆえ、放射性同位体レポーターは要求に合わせて選択することができる。 Therefore, radioisotopes reporter can be selected according to requirements. いったん特定の放射性同位体標識が選択されると、Eggersら(1994)が記載するように、シグナル対ノイズ比(SNR)を計算することで検出性能を推定することができ る。 Once the particular radioisotope label is selected, as described Eggers et al (1994) found Ru can estimate the detection performance by calculating signal-to-noise ratio (SNR).

【0218】 別の発光検出法は、標的分子に結合された蛍光または化学発光レポーター基の使用を含む。 [0218] Another luminescent detection methods, including the use of fluorescent or chemiluminescent reporter groups attached to the target molecule. 蛍光標識は共有結合でまたは相互作用を介して結合させることができる。 The fluorescent labels can be conjugated via a or interaction covalent bond. エチジウムブロミドなどの蛍光染料は、強力な吸収バンドがUV(300〜350 Fluorescent dyes such as ethidium bromide, a strong absorption band UV (300~350
nm)域付近にあり、また、主な発光バンドが可視(500〜650 nm)域にあって、用いるCCDデバイスに最も適している。 nm) located near area, also the main emission band is in the visible (500 to 650 nm) regions, it is best suited to the CCD device used. なぜなら、量子効率が蛍光シグナル波長でよ りも励起波長で数桁分低いからである。 This is because the quantum efficiency because several orders of magnitude lower in yo remote excitation wavelength fluorescence signal wavelength.

【0219】 ルミネッセンスを検出する視点からは、ポリシリコンCCDゲートはUV域の入射 光の寄与を濾過するためのビルトイン容量を有し、しかも蛍光レポーター基によって発生した可視ルミネッセンスに対して非常に感度がよい。 [0219] From the viewpoint of detecting the luminescence, the polysilicon CCD gates have the built-in capacity to filter the contribution of the incident light in the UV range, yet are very sensitive to visible luminescence generated by the fluorescent reporter groups good. UV励起に対するこのような大きい固有の識別は、Eggersら(1994)により提案されたCCDで大きなSNR Such large unique identification for UV excitation, large SNR at the proposed CCD by Eggers et al. (1994)
(100より大)を達成することを可能にする。 It makes it possible to achieve the (than the atmospheric 100).

【0220】 検出器へのプローブの固定化のために、ハイブリダイゼーションマトリックスを安価なSiO2ウェーハ上に作製することができ、次にこれがハイブリダイゼー ションおよび乾燥後にCCDの表面に配置される。 [0220] For the immobilization of the probe to the detector, hybridization matrices can be fabricated on an inexpensive SiO2 wafer, then this is arranged in the hybridization and after drying the surface of the CCD. このフォーマットは経済的に効 率がよい。 This format is good economic efficiency. というのは、DNAのハイブリダイゼーションが安価な使い捨てSiO2ウェーハ上で実施され、したがって、比較的高価なCCD検出器の再利用を可能にす るからである。 Since, DNA hybridization is performed on inexpensive disposable SiO2 wafers, thus, it is because that enables reuse of relatively expensive CCD detector. あるいはまた、CCD上に直接プローブを固定化してプローブマト リックスを作製してもよい。 Alternatively, it may be prepared Purobumato helix by immobilizing the probe directly on the CCD.

【0221】 SiO 2コーティング上にプローブを固定するために、エポキシ-シラン試薬と標 準的なSiO 2修飾化学を用いて、フィルム表面に均一なエポキシド層を結合させる。 [0221] In order to fix the probes on SiO 2 coating, epoxy - by using a silane reagent and standard specific SiO 2 modification chemistry to couple a uniform epoxide layer on the film surface. 次に、アミン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、エポキシド環との第二級アミン形成によりSiO 2表面に結合させる。 Next, the amine-modified oligonucleotide probes are bound to the SiO 2 surface by secondary amines formation of epoxide ring. 得られる結合により、オリゴヌクレオチドの3塩基とSiO 2表面とを隔離する17の回転可能な結合が提供される。 The resulting bond, rotatable coupling 17 to isolate the three bases and the SiO 2 surface of the oligonucleotides is provided. 完全なア ミンの脱プロトン化を確実にし、かつ結合中の二次構造体の形成を最小限とするために、反応を0.1 M KOH 中で実施し、37℃で6時間インキュベートする。 Completely Naa to ensure deprotonation of Min, and to minimize the formation of secondary structures in the binding, the reaction was carried out in 0.1 M KOH and incubated 6 hours at 37 ° C..

【0222】 一般的にフォーマット3 SBHでは、シグナルが莫大な数の地点のそれぞれにつ き評価される。 [0222] In general, format 3 SBH, signals are evaluated-out each Nitsu vast number of points. 全てのアレイ、例えば4000の5x5 mmを一度にハイブリダイズさせる必要はなく、より少ない数のアレイの使用も可能である。 All arrays, for example, a 5x5 mm 4000 need not be hybridized at once, it is also possible to use a smaller number of arrays.

【0223】 サイクリングハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションシグナルを増強させうる1つの方法である。 [0223] Cycling hybridizations are one method which are capable of enhancing hybridization signal. 1サイクルにおいて、固定プローブの大部分が標識プローブに非相補的なテイル配列をもつDNA断片とハイブリダイズするだろう 。 In one cycle, most of the fixed probes will hybridize with DNA fragments with non-complementary tail sequence to a labeled probe. 温度を上げることにより、これらのハイブリッドが融解される。 By raising the temperature, these hybrids are melted. 次のサイクルでは、それらの一部(約0.1%)が適切なDNA断片とハイブリダイズし、追加の標識 プローブがライゲートされる。 In the next cycle, some of them (about 0.1%) is appropriate DNA fragments hybridized, additional labeled probe is ligated. この場合には、両方のプローブセットに対して同時にミスマッチをもつDNAハイブリッドの示差的融解が起こる。 In this case, at the same time differential melting of DNA hybrids with mismatches for both probe sets it occurs.

【0224】 サイクルハイブリダイゼーションにおいては、サイクリングを開始する前に、 [0224] In the cycle hybridization, before you start cycling,
全成分を、T4の場合には37℃で、耐熱性リガーゼの場合はより高い温度で添加する。 All ingredients, at 37 ° C. in the case of T4, in the case of thermostable ligase is added at a higher temperature. その後温度を15〜37℃に低下させ、チップを最大10分間インキュベートし、 Thereafter the temperature was lowered to 15 to 37 ° C., the chip was incubated for up to 10 minutes,
次に温度を37℃またはそれ以上に数分間上昇させ、その後再度低下させる。 Then it raised a few minutes the temperature to 37 ° C. or more, thereafter decreasing again. サイクルを10回まで繰り返すことができる。 Cycle can be repeated up to 10 times. ある変法では、サイクリングを行わずにより高い最適温度(10〜50℃)を使用して、より長いライゲーション反応(1〜3時 間)を行うことができる。 In one variant, it is possible to use a higher temperature optimum (10 to 50 ° C.) without cycling, performing a longer ligation reaction (between hours 1-3).

【0225】 ここに記載する方法は、標準的な合成および精確なオリゴヌクレオチドのスポッティングを用いて複雑なチップの製造を可能とするが、それは、必要なオリゴヌクレオチドが比較的少数であるからである。 [0225] The methods described herein include, but enables the production of complex chips using spotting standard synthesis and precise oligonucleotides, it is because a relatively small number need oligonucleotides . 例えば、全て7-merのオリゴ(1638 For example, an oligo of all 7-mer (1638
4のプローブ)を合成する場合には、2億5600万個の14-merのリストを測定するこ とができる。 When synthesizing the 4 probes), lists of 256 million units of 14-mer can and measuring child.

【0226】 本発明方法の1つの重要な変法は、ベースアレイにつき2以上の異なって標識されたプローブを使用することである。 [0226] One important variant of the method of the invention is to use two or more differently labeled probes per base array. これは2つの目的を意図して実施される。 This is done with the intention of two purposes. すなわち、多重化することで、別個にハイブリダイズされるアレイの数を減少させること、または3x6または3x7などのさらに長いオリゴ配列のリストを測定することである。 In other words, by multiplexing, it is to measure a list of separate reducing the number of arrays hybridized, or even longer oligo sequence, such as 3x6 or 3x7. この場合に、2つの標識を用いるならば、3つの連続したオリゴヌクレオチドの特異性は、陽性部位が両方の標識の十分なシグナルをもたねばならないので、ほぼ絶対的でありうる。 In this case, if using two labels, the specificity of three consecutive oligonucleotides, because positive sites must have enough signals of both labels, it can be almost absolute.

【0227】 さらなる追加の変法は、BxNyプローブ(yは1〜4)を含むチップを使用すること である。 [0227] further additional variant is, BxNy probes (y is 1 to 4) is to use the chip including the. これらのチップは異なるフレームでの配列解読を可能とする。 These chips allows for sequencing in different frames. これは適切なセットの標識プローブを用いても達成することができ、また、FプローブとP This can also be achieved by using a labeled probe proper set, also, F probe and P
プローブの両方がいくつかの非特定化末端位置(すなわち、末端縮重のいくつかのエレメント)をもつことができる。 Can have a non-specialized end position both are several probes (i.e., some element of terminal degeneracy). また、特定配列のプローブを固相支持体に結合させるためのリンカーの一部として普遍的(万能)な塩基を使用してもよい。 It may also be used universally (universal) base as part of the linker for binding probe for the specific sequence to a solid support. これにより、プローブはハイブリダイゼーションに一層利用可能となり、構築物がより安定になる。 Thus, the probe becomes more available for hybridization, construct becomes more stable. プローブが5個の塩基をもつ場合、例えば、3個の普遍的塩基をリンカーとして使用することができる。 If the probe has five bases, for example, it can be used three universal bases as a linker.

【0228】 実施例16 ハイブリダイゼーションデータからの配列の決定所定のオーバーラップする(N-1)merが2回以上繰り返される場合には、配列アセンブリが中断されうる。 [0228] When the embodiment 16 overlap determining a predetermined sequence from the hybridization data (N-1) mer repeated more than once, the sequence assembly may be suspended. そのときには、最後のヌクレオチドが異なる2つのN- At that time, the last nucleotide two different N-
merのいずれかを配列の伸長に用いることができる。 It can be any of mer elongation of the array. この枝分かれ地点は配列の 明確なアセンブリを制限する。 This branching point limits the clear assembly sequence.

【0229】 標的核酸にハイブリダイズして標的核酸の完全な配列を生成する既知オリゴヌクレオチドの配列の再アセンブリングは、いくつかの場合には達成され得ない。 [0229] Re-assembling the sequences of known oligonucleotides hybridized to a target nucleic acid to generate a complete sequence of a target nucleic acid can not be achieved in some cases.
というのは、ハイブリッド形成に使用するオリゴヌクレオチドのサイズに対して適切なサイズの断片中に標的核酸が存在しない場合は、いくらかの情報が失われるからである。 Because, when the target nucleic acid is not present in a fragment of appropriate size relative to the size of the oligonucleotides used for hybridization, since some information is lost. 失われる情報の量は配列決定しようとする標的の長さに比例する。 The amount of information lost is proportional to the length of the target to be sequenced. しかし、十分に短い標的を用いるならば、その配列は明確に決定されるだろう。 However, if using a sufficiently short targets, would its sequence is clearly determined.

【0230】 ある長さのDNAに沿って分布している、配列アセンブリを妨害しうる重複配列 の予想される頻度は計算することが可能である。 [0230] There are distributed along the length of the DNA, expected frequency of overlapping sequences that can interfere with sequence assembly can be calculated. この誘導には、配列組織化を処理しなければならないパラメーターの定義を導入する必要がある。 This induction, it is necessary to introduce the definition of parameters that must process sequence organization. すなわち、配列サブフラグメント(SF)である。 That is, an array subfragment (SF). 配列サブフラグメントは、標的核酸の配列の任意の一部が標的配列内で2回以上反復されている(N-1)merから出発してそれで終わるときに結果として生じる。 Sequence subfragments, resulting when ending in it starting from any part of which is repeated two or more times within the target sequence (N-1) mer sequence of the target nucleic acid. かくして、サブフラグメントは本発明方法による配列アセンブリの過程で2つの枝分かれ点の間に生じる配列である。 Thus, subfragments are sequences generated between two branch points in the course of the sequence assembly according to the invention method. 全てのサブフラグメントを合計した長さは、オーバーラップする短い末端のため、実際の標的核酸よりも長い。 The total length of all the sub-fragments, due to the short ends overlap, longer than the actual target nucleic acid. 一般には、サブフラグメントは追加の情報がないと直鎖型にアセンブリされ得ない。 Generally, subfragments may not be assembled in the linear form and there is no additional information. なぜならば、それらは末端部および開始部で(N-1)merを共有するからである。 Because since they share the extremities and beginning the (N-1) mer. 反復(N-1)merの数に応じて各核酸標的について異なる数のサブフラグメントが得られる。 Repeated (N-1) number of sub fragments differ for each nucleic acid target depending on the number of mer is obtained. その数はN-1の値と標的の長さに依存する。 The number depends on the length of the value and the target N-1.

【0231】 確率の計算は2つのファクターの相互関係を推定することができる。 [0231] calculation of the probability can be used to estimate the mutual relationship between the two factors. 陽性のN- Positive N-
merの順序付けが長さN-1のまたはAoの平均距離のオーバーラップ配列を使用することで達成される場合、N-1個のLf塩基長の断片は次の方程式により示される。 If ordering mer is achieved by using overlapping sequences of the average distance length N-1 or Ao, a fragment of the N-1 Lf bases long is illustrated by the following equation. N sf = 1 + Ao XKXP(K, L f ) ここで、Kは2より大きいか2に等しく、P(K, L f )はL f塩基長の断片上にK回存在するN-merの確率を表す。 N sf = 1 + Ao XKXP ( K, L f) where, K is equal to 2 or greater than 2, P (K, L f ) is the N-mer existing K times on a fragment of the L f bases long It represents the probability. また、所定の配列についてN-merの含量からサブ断片を形成することができるコンピュータプログラムは以下の実施例18において説明する。 The computer program capable of forming a sub-fragment from the content of N-mer for a given sequence will be described in the following examples 18.

【0232】 サブ断片の数は所定の長さのプローブの場合に断片の長さの増加とともに増加する。 [0232] The number of subfragments increases with increasing length of the fragments for a given length of the probe. 得られた断片はそれら自体の中でユニークに順序付けられ得ない。 The resulting fragments can not ordered unique among themselves. 完全ではないものの、この情報は比較配列分析および機能的配列特徴の認識にとって非常に有用である。 Although not perfect, this information is very useful for recognition of the comparative sequence analysis and functional sequence characteristics. このタイプの情報は部分配列と呼ばれる。 This type of information is referred to as a partial sequence. 部分配列を得るための別の方法は、所定の長さのオリゴヌクレオチドプローブのサブセットのみを使用することである。 Another way to obtain a partial sequence is to use only a subset of a predetermined length of the oligonucleotide probes.

【0233】 理論により推定された配列とランダムDNA配列のコンピュータシュミレーショ ンとの間には比較的良好な一致が見られる。 [0233] relatively good agreement is observed between the computer Simulated cane down sequence estimated by the theory and the random DNA sequence. 例えば、N-1=7 [8-merまたは5'(A,T For example, N-1 = 7 [8-mer or 5 '(A, T
,C,G) B 8 (A,T,C,G)3'のタイプの16の10-merの群を使用] の場合、200塩基の標 的核酸は平均3つのサブ断片をもつだろう。 , C, G) B 8 ( A, T, C, G) For 3 using type 16 10-mer group of the '], target nucleic acid of 200 bases will have an average of three subfragments . しかし、平均付近のばらつきのため、標的核酸のライブラリーは、2000の標的のうち1未満が3より多いサブ断片をもつように500 bpのインサートをもつべきである。 However, due to variations in the vicinity of the mean, a library of target nucleic acid should have a 500 bp insert to have sub-fragments less than 1 is more than 3 out of a target of 2000. かくして、ランダム配列の長い核酸の配列決定の理想的なケースでは、標的核酸の十分に短いインサートを含む代表的ライブラリーが使用される。 Thus, in the ideal case of sequencing a long nucleic acid of random sequence, a representative library comprising a sufficiently short inserts of target nucleic acid is used. このようなインサートの場合は、本発明の方法により個々の標的を再構築することが可能である。 For such inserts, it is possible to reconstruct the individual target by the method of the present invention. その後、特定された個々のインサート配列を重ね合わせることにより大きな核酸の全配列が得られる。 Thereafter, the entire sequence of a larger nucleic acid by overlapping individual insert sequences were identified obtained.

【0234】 非常に短い断片(例えば、8-merプローブについては50塩基)の必要性を減ず るためには、クローニングのようなランダムDNA断片化方法またはランダムPCRにおいて存在するオーバーラップ断片中に含まれる情報が使用される。 [0234] Very short fragments (e.g., 8-mer 50 bases for probes) in order Genzu the need of, the overlap fragments now present in a random DNA fragmentation methods or random PCR as cloning the information contained is used. また、短い物理的核酸断片のプールを使用することも可能である。 It is also possible to use a pool of short physical nucleic acid fragments. 1メガベースの配列決定のために8-merまたは11-mer、例えば5'(A,T,C,G) N 8 (A,T,C,G)3'を使用すると 、20,000の50 bp断片を必要とする代わりに、たった2,100のサンプルで十分である。 1 8-mer for sequencing megabase or 11-mer, for example, 5 '(A, T, C , G) N 8 (A, T, C, G) 3' With, 20,000 50 bp fragment instead of requiring a sufficient sample of only 2,100. この数は700個の7 kbクローン(基本ライブラリー)、500 bpの20個のクロ ーンの1250のプール(サブ断片順序付けライブラリー)およびジャンピング(または類似の)ライブラリーからの150個のクローンから成る。 The number 700 of 7 kb clones (basic library), 500 bp of the 20 clones of the 1250 pools (subfragments ordering library) and jumping 150 clones from (or similar) library consisting of. 開発されたアルゴ リズム(実施例18参照)により、これらの記載されたサンプルのハイブリダイゼーションデータを用いて配列が再構成される。 The developed algorithm (see Example 18), the sequence is reconstructed using hybridization data of these described samples.

【0235】 実施例17 アルゴリズムこの実施例は、開始核酸配列の最小数のランダムに決めた個々の断片において構成成分であるk-タプルのワードから4文字のアルファベットで書かれる長い 配列を生じさせるアルゴリズムについて記載する(ここで、kはオリゴヌクレオ チドプローブの長さである)。 [0235] Example 17 Algorithm This example algorithm to produce a long sequence written in alphabetical 4 characters are components k- tuple words in the individual fragments randomly determined minimum number of starting nucleic acid sequence describe (where, k is the length of Origonukureo Chidopurobu). このアルゴリズムは主としてハイブリダイゼーション(SBH)プロセスによる配列決定での使用を意図したものである。 This algorithm is obtained by primarily intended for use in sequencing by hybridization (SBH) process. このアルゴ リズムはサブ断片(SF)、情報提供断片(IF)および情報提供断片を定義するのに物理的核酸配列のプールを使用できることに基づいている。 This algorithm is based on the ability to use a pool of physical nucleic acid sequence to define subfragment (SF), the information providing fragment (IF) and the information providing fragments.

【0236】 記載のように、サブ断片は標的核酸k-1オリゴマー配列の反復によるものであ るアセンブリプロセスにおいて分岐点によって引き起こされうる。 [0236] As described, subfragments may be caused by branch points in der Ru assembly process due to repetition of the target nucleic acid k-1 oligomer sequence. サブ断片は配列中に生じる長さK-1の任意の2つの反復ワードの間に見られる配列断片である。 Subfragments is a sequence fragment found between any two repetitive words of length K-1 that occurs in the sequence.
K-1ワードの多重発生は、配列形成プロセスにおけるK-ワードのオーバーラップ の整列の中断の原因である。 Multiple occurrences of the K-1 word is the cause of the interruption of the alignment of the overlap K- words in sequence forming process. 中断により配列はサブ断片の形態のままとなる。 Sequence by interruption remains in the form of subfragments. このように、その順序が独自に決定される分岐点間の明白なセグメントは配列サブ断片と呼ばれる。 Thus, clear segments between branching points whose order is uniquely determined are called sequence subfragments.

【0237】 情報提供断片はオーバーラップした物理的配列断片の最も近い末端によって決定される配列の断片として定義される。 [0237] Information provided fragment is defined as a fragment of a sequence determined by the nearest ends of overlapped physical sequence fragments.

【0238】 ある数の物理的断片は、情報提供断片を定義できる可能性を失わずにプールされうる。 [0238] certain physical fragment number may be pooled without losing the possibility of defining the information providing fragments. ランダムにプールされた断片の全長は配列決定プロセスで使用されるk k total length of randomly pooled fragments were used in the sequencing process
-タプルの長さに依存する。 - depends on the length of the tuple.

【0239】 このアルゴリズムは2つのメインユニットからなる。 [0239] The algorithm consists of two main units. 第1の部分は、配列中に含まれるk-タプルのセットからサブ断片を生じさせるのに使用される。 The first part is used from the set of k- tuple contained in the sequence to produce a sub-fragment. サブ断片 はあるサイズの物理的核酸配列のコード領域内、または長い核酸配列内で定義される情報提供断片内で形成され得る。 Subfragments may be formed certain physical nucleic acid sequence of the coding region of the size, or long information providing the fragments defined in the nucleic acid sequence. 両種の断片は基本ライブラリーに属するものである。 Both types of fragments are those belonging to the basic library. このアルゴリズムでは、この基本ライブラリーの情報提供断片のk- タプルの内容の決定、すなわち配列形成プロセスで使用される情報提供断片の製造段階については記載しない。 In this algorithm, not described for the preparation stage of the determination of the content of the k- tuple information providing fragments of the basic library, i.e. the information providing fragments used in sequence forming process.

【0240】 このアルゴリズムの第2の部分は基本ライブラリーの核酸断片の完全配列を再 形成する目的で得られたサブ断片の直線上の順序を決定する。 [0240] To determine the order of the linear sub-fragments obtained by the purpose second portion to reshape the complete sequence of the nucleic acid fragments of the basic library of this algorithm. この目的のため、 For this purpose,
ランダムにプールされた開始配列の断片からなる第2の整列ライブラリーが使用 される。 Second alignment library of fragments of the starting sequence pooled randomly is used. このアルゴリズムは、全メガベースプラス配列を再形成するための塩基断片の配列を組み合わせるステップを含まない。 This algorithm does not include the step of combining a sequence of nt fragments to reform the entire megabase plus sequence. これは情報提供断片形成の必要条件である基本ライブラリーの断片の連結を用いて達成してもよい。 This coupling of fragments of the basic library which is a prerequisite for the information providing fragmentation may be accomplished using. あるいは、 Alternatively,
通常の末端配列の存在に基づき、それらのオーバーラップに関する検索を使用し、このアルゴリズムにより基本ライブラリーの断片の配列を形成した後これを達成してもよい。 Based on the presence of normal-terminal sequence, using the search for their overlap, it may be achieved this after forming a sequence of a fragment of the basic library by this algorithm.

【0241】 このアルゴリズムは基本および整列ライブラリーの核酸配列における所定のk [0241] predetermined k in this algorithm nucleic acid sequence of the basic and alignment libraries
-タプルの出現数を知る必要もないし、k-タプルのワードの情報が断片の末端に存在するという情報も必要としない。 - It is not necessary to know the number of occurrences of tuples, it does not require information that word information k- tuple exists in the end of the fragment. アルゴリズムは、種々の長さのk-タプル のワードの混合内容物を用いて実行される。 Algorithm is executed using a mixed contents of words of various lengths k- tuple. このアルゴリズムのコンセプトにより、偽陽性および偽陰性のk-タプルを含むk-タプルセットを用いた演算が可能となる。 The concept of this algorithm, the calculation is possible using k- tuple set including k- tuples of false positives and false negatives. 特殊な場合にのみ偽k-タプルの内容は主として生じた配列の完全性お よび正確性に影響を及ぼす。 The contents of the only false k- tuples in special cases affect the integrity of your and accuracy of the mainly resulting array. このアルゴリズムはシミュレーション実験におけるパラメーターの最適化、ならびに実際のSBH実験における配列形成、例えばゲノ ムDNA配列の形成にも使用してよい。 This algorithm optimization parameters in simulation experiments, as well as arranged and formed in the actual SBH experiments, for example may also be used in the formation of the genomic DNA sequence. パラメーターの最適化において、実際の便宜な断片のためのオリゴヌクレオチドプローブ(k-タプル)の選択、ならび に/または定義されたプローブのための最適な長さおよび断片数の選択は特に重要である。 In the optimization of the parameters, the actual selection of the oligonucleotide probes (k-tuples) for convenience fragment, optimal length and the number of selected fragments for probes arranged in / or definition is of particular importance .

【0242】 このアルゴリズムの部分は、k-タプルの内容から配列を形成するプロセスに 中心的な役割を持つ。 [0242] part of the algorithm, the process of forming an array from the contents of the k- tuple having a central role. これは、最大のオーバーラップによるk-タプルの固有の 整列に基づくものである。 This is based on the inherent alignment of the k- tuple by the maximum overlap. 配列の形成における主な障害は、特異的な反復配列と偽陽性および/または偽陰性のk-タプルである。 The main obstacle in the formation of the sequence is specific repeat sequences and false positive and / or false negative k- tuples. このアルゴリズムの部分の目 的は、正しい配列を持つ最小の数のできるだけ最長のサブ断片を得ることである。 The purpose of part of the algorithm is to obtain as much as possible longest subfragment of the smallest number with the correct sequence. このアルゴリズムの部分は1つの基本ステップといくつかの制御ステップからなる。 Part of the algorithm consists of one basic steps and several control steps. ある情報はすべての一次サブ断片の形成後にのみ使用できるので、二段階のプロセスが必要である。 Since information can be used only after the formation of all primary subfragments requires a two step process.

【0243】 配列形成の主な問題は、定義によっては個々のk-タプルの発生数に関する情 報を持たないワード内容から反復配列を得ることである。 [0243] The main problem of the alignments, by definition is to obtain repetitive sequences from the word content does not have the information about the number of occurrence of individual k- tuples. アルゴリズム全体のコンセプトはこの問題を解決するという基本によっている。 Algorithm whole concept is there by the base of solving this problem. 原則として2つの相対 するアプローチがあり、それは1)反復配列がpSFの形成プロセスの最初に得られ るか、または2)反復配列がその後のサブ断片の最終整列プロセスで得られるかである。 There are approaches to two relative principle, it is 1) repeat sequences obtained in the first forming process pSF Luke, or 2) repeated sequences is be obtained in the final alignment process subsequent subfragments. 第1の場合、pSFは過剰な配列を含み、第2の場合では、それらは配列の配列の欠損を含む。 If the first, pSF contains excess sequence, in the second case, they contain a deficit of sequences SEQ. 第1のアプローチは形成された過剰な配列の削除が必要であり 、第2の場合では、配列の最終アセンブリのプロセスでいくつかのサブ断片の多重的な使用を許容する必要がある。 The first approach requires deletion of excess sequence formed, in the second case, it is necessary to allow for multiple use of several sub-fragments in the process of final assembly of the array.

【0244】 K-タプルの固有のオーバーラップの法則の厳格さの程度におけるこの2つの アプローチの違い。 [0244] K- difference between the two approaches in the degree of rigor of the law of the unique overlap of the tuple. あまり厳格でない法則は、k-タプルXは、k-タプルXの最も右側のk-1末端がk-タプルYの最も左側の末端にしか存在しない場合に、またそ の場合だけに、明確にk-タプルYと最大限にオーバーラップするということである。 Law less rigorous, k- tuple X is, k- if rightmost k-1 end of the tuple X is k- tuple exists only in the leftmost end of the Y, only in the case of Mataso clearly maximizing the k- tuple Y is that overlap. この法則によって、反復配列の形成および余剰配列の形成が可能となる。 This law, formation of form and surplus sequences of repetitive sequences is possible.

【0245】 第2のアプローチで使用されるより厳格な法則はさらなる警告を持ち、k-タプルXは、k-タプルXの最も右側のk-1末端がk-タプルYの最も左側の末端にだけ存在する場合、またその場合だけに、かつ、k-タプルYの最も左側のk-1末端が他 のいすれかのk-タプルの最も右側には存在しない場合に明確に最大限にk-タプルオーバーラップする。 [0245] stringent laws than is used in the second approach has the further warning, k- tuple X is, k- the leftmost end of the rightmost k-1 terminal k- tuple Y tuple X If only it exists and only case, and, to a well maximally when leftmost k-1 end of k- tuple Y is not present in the rightmost one of the k- tuple other Isure k - tuple overlap. より厳格な法則に基づくアルゴリズムはより単純で、これが本明細書に記載される。 Algorithm based on the stricter rule is simpler, which is described herein.

【0246】 所定のサブ断片の伸長プロセスは、含まれる最後のk-タプルの右側のk-1末端がいずれかのk-タプルの左側に存在しないか、または2個の以上のk-タプルに 存在する場合に停止する。 [0246] elongation process of a given sub-fragments, the end of the k- or right k-1 end of the tuple is not in the left side of one of k- tuple or two or more k- tuples contained halted when present. もしそれがあるk-タプルに存在すれば、この法則の2 If present if there is it k- tuple, 2 of this law
番目の部分が試験される。 The second part is tested. さらにこれまでに含まれたものとは異なるk-タプル があれば、所定のサブ断片の構築物は最初の最も左側の位置でしか終結しない。 If there is still different k- tuples from those contained in the far construct of a given sub-fragments do not terminate only at the first leftmost position.
もしこの付加的なk-タプルが存在しなければ、この条件は固有のk-1オーバーラップに適合し、所定のサブ断片は右側で1つの構成要素だけ伸長する。 If if there is this additional k- tuples, this condition conforms to the unique k-1 overlap, given sub-fragment extends only one component at right.

【0247】 この基本法則の他、種々の長さのk-タプルの使用を可能にするため、補足的 なものが使用される。 [0247] Another of the fundamental laws, to enable the use of various lengths of k- tuple, those complementary are used. 最大のオーバーラップは、オーバーラップ対のより短いk Maximum of overlap, shorter k of overlap pair
-タプルのk-1の長さでなる。 - consisting of a length of k-1 of the tuple. PSFの形成は、k-タプルが核酸配列におけるそれらの順序からランダムかつ独立して表示されるファイルから得られる最初のk-タ プルから始まって遂行される。 Formation of the PSF, k- tuple is performed starting with the first of k- tuple obtained from the file to be displayed randomly and independently from their order in a nucleic acid sequence. 従って、ファイルのk-タプルは、配列の開始に も、特定のサブ断片の開始にも必ずしも必要ではない。 Thus, k-tuple file to the start of the sequence is not necessarily required to initiate the specific subfragments. サブ断片形成のプロセスは、記載の法則によって定義された固有のオーバーラップによりk-タプルを整 列することによって行われる。 Subfragment formation process is performed by Alignment of k- tuple by a unique overlap defined by law according. 使用された各々のk-タプルはそのファイルから 消去される。 Each of k- tuple used is deleted from the file. 含まれる最後のものと明確にオーバーラップするk-タプルがそれ 以上ないという時点で、サブ断片の構築が終わり、別のpSFの構築が始まる。 At the time that there is no more the last one and clearly overlapping k- tuple is included, end the construction of sub-fragments, it begins construction of another pSF. 大 多数のサブ断片の形成はそれらの実際の開始から始まるわけではないので、形成されたpSFはk-タプルのファイルに加えられ、より長いk-タプルと考えられる 。 Since most formation of multiple sub-fragments do not begin from their actual start, formed pSF are added to the k- tuple file is believed that longer k- tuples. もう1つの可能性としては、開始時のk-タプルから両方向に進行するサブ断 片を形成することである。 Another possibility is to form a sub-fragment which proceeds in both directions from the starting k- tuple. このプロセスは、さらなるオーバーラップ、すなわちサブ断片のいずれもの伸長が可能でない場合に終了する。 The process ends when further overlap, i.e. is not possible any extension of subfragments.

【0248】 pSFは次の3つのグループに分けられる、1)正しいk-タプルセットの場合の最 長かつ正しい配列のサブ断片;2)不完全なセットおよび/または偽陽性のk-タ プルをいくつか有するセットに対する最大かつ明確なオーバーラップ法則の使用によって形成された短いサブ断片;および3)不正確な配列のpSF。 [0248] pSF is divided into the following three groups: 1) correct k- subfragment of longest and correct arrangement in the case of a tuple set; 2) incomplete sets and / or false positive k- tuples short subfragment formed by use of the largest and well-defined overlap rule for a set having several; and 3) pSF incorrect sequence. 2)のセットの 不完全性はハイブリダイゼーション実験の偽陰性の結果、ならびに不正確なk- タプルのセットの使用によって生じる。 2) Set the incompleteness of false negative hybridisation results of experiments, and caused by the use of a set of incorrect k- tuple. これらは偽陽性および偽陰性のk-タプ ルによって形成され、a)誤って連結したサブ断片;b)誤った末端を有するサブ断片;およびc)最小限の誤ったサブ断片として現れる偽陽性のk-タプルである可 能性がある。 These are formed by false positive and false negative k- tuples, a) incorrect subfragment was ligated; b) subfragments with the wrong end; and c) minimize false false positives appear as subfragment there is a possibility that is a k- tuple.

【0249】 偽陽性のk-タプルを考慮すると、誤った塩基を1より多く含むか、または中央部のどこかに1つの誤った塩基を含むk-タプルが存在する可能性、ならびに末 端に誤った塩基を有するk-タプルである可能性がある。 [0249] In view of the false positive k- tuples, possibly or bad base comprises more than 1, or somewhere k- tuple containing one incorrect base of the central portion is present, as well as end edge It could be a k- tuple with the wrong base. 短いか、誤りを有する か、または誤って連結したサブ断片は後者のk-タプルによって生じるものであ る。 Short or sub fragments linked or having errors or incorrectly is Ru der those caused by the latter k- tuple. 前者2種のk-タプルは、k-タプルの長さに等しい長さを有する誤ったpSF を表す。 The former two k- tuple represents a false pSF having a length equal to the length of the k- tuple.

【0250】 ある偽陰性のk-タプルの場合では、最大のオーバーラップが不可能なためにp [0250] In some cases of false negative k- tuple, p in order that can not be a maximum of overlap
SFが生じる。 SF occurs. 最も左側または最も右側の末端に誤った塩基を有する、1つの偽陽性のk-タプルが存在する場合には、明確なオーバーラップが不可能なためpSFが生じる。 Leftmost or most having bases wrong right end, if one false positive k- tuples present, pSF occurs because a clear overlap impossible. 共通のk-1配列を有する偽陽性および偽陰性双方のk-タプルがファイル に存在する場合はpSFが生じ、これらのpSFの1つは関連した末端に偽k-タプル を含む。 If false positives and false negatives both k- tuples having a common k-1 sequences are present in the file occur pSF, one of these pSF include false k- tuples terminal associated.

【0251】 配列に誤りを持つサブ断片を修正して明確に連結したpSFを連結するプロセス は、サブ断片の形成後およびサブ断片の整列プロセス中に行われる。 [0251] The process of connecting the pSF was clearly linked to fix the sub-fragments with error sequence is carried out during the alignment process of forming and after subfragment of subfragments. 誤って連結したpSFを切除し、pSFの明確な連結により最終的なサブ断片を得ることからなる第1のステップを下記に記載する。 Excised pSF linked incorrectly describes first step consisting in obtaining a final sub-fragments by a clear connection pSF below.

【0252】 誤って結合されたサブ断片の形成のためには2つのアプローチがある。 [0252] For the formation of the sub-fragments bound incorrectly There are two approaches. 第1には、長さk-1の反復配列の構築点に偽k-タプルが見られる場合に誤りが生じる。 The first error occurs when the false k- tuples seen in construction point of repeat sequence length k-1.
第2には、反復配列はk-1より短い。 The second repeat sequence is shorter than k-1. これらの状況は各々2つの変異型に生じ得 る。 These situations Ru can occur in each of two variants. 第1の変異型では、反復配列の1つは断片の末端を表す。 In a first variant, one of the repeated sequences represents the end of the fragment. 第2の変異型では、反復配列は断片内のいずれの位置でも生じる。 In a second variant, repetitive sequences occur at any position within the fragment. 第1の可能性に関しては、誤った結合を形成するには、ファイルにk-タプルが存在しないことが(偽陰性)要 求される。 For the first possibility, in order to form a false bond, is the absence of k- tuple in the file is requested (false negatives). 第2の可能性では、ファイルに偽陰性および偽陽性双方のk-タプル が存在する必要がある。 In the second possibility, it is necessary the presence of false negatives and false positives both k- tuple file. K-1配列の反復を考慮すると、どちらかの末端が内部に 反復を持つ場合には1つのk-タプルを欠くだけで十分である。 Considering the repetition of K-1 sequence, it is sufficient lack one k- tuple if either end has an iterative therein. 厳密には内部の 反復には2つ欠如することが必要である。 Strictly inside the iteration it is necessary to lack two. この理由は、配列の末端が、情報科学的には、偽陰性のk-タプルのエンドレスの直鎖状アレイとみなされるからであ る。 This is because the end of the sequence is, the information science, Ru der from are considered linear array of endless k- tuple false negative. 「k-1の場合よりも小さい」ということから、2つまたは3つの特異的な偽k- The fact that "smaller than that of the k-1", 2 or 3 specific false k-
タプルを要する、k-2の長さの反復配列だけが考慮されよう。 It requires tuple, only the repeat sequence of the length of k-2 it will be considered. これらは実際の実 験で検出される唯一のケースであって、その他のものはそれほど頻繁ではない可能性が高い。 These are the only cases that are detected in the actual experiment, the other thing is the high no possibility of less frequent.

【0253】 誤って結合されたサブ断片の認識は、その断片の末端に反復配列が見られない場合により厳密に定義される。 [0253] Recognition of the sub-fragments were coupled incorrectly, repeats to the ends of the fragments are strictly defined by if not found. この状況においては、さらに2つのサブ断片を検 出でき、そのうち1つは最も左側の末端に、もう一方は最も右側の末端にk-2配列を含み、これは誤って結合されたサブ断片にも存在する。 In this situation, you can leave more test the two sub-fragments, to them one of the most left end, includes a k-2 sequence in most other right end, which is the sub-fragments bound erroneously also present. 反復配列が断片の末端にある場合、その最も左側または最も右側の端部でのサブ断片の形成に誤りが生じるk-2配列を含む唯一のサブ断片が存在する。 If the repeat sequences at the ends of the fragment, the only sub fragments exist containing k-2 sequence error occurs in the formation of sub-fragments in the leftmost or rightmost end.

【0254】 切除による誤って結合されたサブ断片の除去は一般的な法則に従って行われる。 [0254] Removal of the sub-fragments were coupled inadvertent ablation is performed according to the general rule. すなわち、いずれかのサブ断片のk-2の長さの最も左側または最も右側の配列 が他のいずれかのサブ断片に存在すれば、そのサブ断片は切断されて、その各々がk-2配列を含む2つのサブ断片となる。 That is, if present in any one of subfragments leftmost or rightmost sequence of the length k-2 is the other sub-fragments, subfragments is cut, each of k-2 sequence the two sub-fragments containing. この法則は、反復k-1配列の点で1つより多い偽陰性のk-タプルが存在するという、反復末端のまれな状況を包含しない 。 This law, that than one of many false negative k- tuples present in terms of iteration k-1 sequences not encompass rare situations iteration ends. この種の誤って結合されたサブ断片は、オーバーラップした断片、または基本ライブラーおよび整列ライブラリーの双方の情報提供断片からの情報情報を用いて認識できる。 Subfragment coupled erroneously of this kind can be recognized by using the overlapping fragments or information information from both the information providing fragments of the basic Leibler and alignment libraries. さらに、誤って結合されたサブ断片は、同一のk-1配列を含む両 方の位置で2以上の偽陰性のk-タプルが生じたときには、そのままである。 Further, the sub-fragments bound by mistake, when two or more false negative k- tuples occurs in positions of both including the same k-1 sequence is intact. それは特異的な偽k-タプルを少なくとも4つ要するので、これは極めてまれな状況である。 Since it takes at least four specific false k- tuples, this is a very rare situation. もし、あるサブ断片の余端および他の断片の開始部分から得たk-2より短 い配列の組合せにより所定の配列が得られるならば、長さkの配列上でこれらの サブ断片を切除するためにさらなる法則を導入することができる。 If a given sequence by a combination of short have sequence than k-2, which were obtained from the beginning of the remaining end and other fragments of the sub-fragments are obtained, excised these subfragment on sequences of length k it is possible to introduce further laws to.

【0255】 記載の法則の厳密な適用により、出力の精度を保証するには幾分完全性が失われる。 [0255] By strict application of the law according somewhat integrity is lost to ensure the accuracy of the output. いくつかのサブ断片は、誤って結合されたサブ断片のパターンに適合するので、連結に誤りがないのに切除される。 Some sub-fragments, so to match the pattern of the sub-fragments bound by mistake, be cut for no error in connection. この種のものにはいくつかの状況がある。 To this kind of thing there are a number of situations. 例えば、断片が少なくとの2つの同一のk-1配列の他にk-1由来のk-2配列のいずれかを含み、あるいは断片は少なくとも2回反復するk-2配列と、中央部に所定のk-2配列を含む少なくとも1つの偽陰性k-タプルとを含む、等。 For example, a fragment comprising two one other to k-1 from the k-2 sequence identical k-1 sequences of the small, or fragments and k-2 sequence repeated at least twice, in the central portion and at least one false negative k- tuples containing a predetermined k-2 sequences, etc.

【0256】 このアルゴリズム部分の目的は、pSFの数を減らして、正しい配列を有するよ り長いサブ断片を最小数にすることである。 [0256] The purpose of this algorithm part, by reducing the number of pSF, is to minimize the number of long sub fragment Ri by having the correct sequence. 特異なより長いサブ断片または完全な配列の形成は2つの状況下で可能となる。 Formation of unique longer subfragments or a complete sequence is possible under two circumstances. 第1の状況は反復するk-1ワードの特 定順序に関するものである。 The first situation relates to a specific sequence of k-1 word repeats. 最大限に伸長したpSF(第1のグループのpSF)のい くつかまたはすべてが固有の順序を持つ場合がある。 Sometimes the extended pSF (pSF the first group) Neu several or all maximally have a unique sequence. 例えば、断片S-R1-a-R2-b- For example, fragments S-R1-a-R2-b-
R1-c-R2-E(ここで、SよびEは断片の開始点および終結点であり、a、bおよびcは個々のサブ断片に特異的な異なる配列であり、R1およびR2はタンデムに反復する In R1-c-R2-E (wherein, S and E is the start and stop positions of the fragments, a, b and c are different sequences specific to individual sub-fragments, R1 and R2 are in tandem repeating
2つのk-1配列である)では、5つのサブ断片が形成される(S-R1、R1-a-R2、R2-B- In a two k-1 sequence), five sub-fragments are formed (S-R1, R1-a-R2, R2-B-
R1、R1-c-R2、およびRE)。 R1, R1-c-R2, and RE). これらは、前記のオリジナル配列またはS-R1-cRb- These are the original sequence or S-R1-cRb-
R1-aREの2通りで整列され得る。 It may be aligned in two ways R1-ARE. これに対し、順序は異なるが同じ数およびタ イプの反復配列を有する断片、すなわちS-R1-a-R1-bRcREでは、すべてサブ 断片を含むそれ以外の配列はない。 In contrast, the order is different fragments having repeating sequences of the same number and type, i.e. the S-R1-a-R1-bRcRE, other sequences not containing subfragments all. このタイプの例はpSFの形成プロセスの後に しか認識できない。 Examples of this type can not be recognized only after the process of forming pSF. それらはpSF形成プロセスの2つのステップの必要性を表すものである。 They are intended to represent the need for the two steps of pSF formation process. ファイルが偽陰性および/または偽陽性のk-タプルを含む場合、非 反復k-1配列の位置での誤った短いサブ断片の形成の第2の状況はより重要である。 If the file contains a k- tuple false negative and / or false positives, a second condition of formation of false short subfragments on positions of non-iterative k-1 sequence is more important.

【0257】 PSFの両グループについては状況は2つの部分からなっている。 [0257] situation for both groups of PSF is made up of two parts. まず、最小のサブ断片の不在として現れる偽陽性のk-タプルが除去される。 First, false positives k- tuples appearing as the absence of the smallest sub-fragments are removed. 最大数の連結の形 成を可能にするには、いずれかの末端にオーバーラップを持たない長さkの、一 方の末端でkaより長く、かつ他方のでkbより長い長さのk-タプルのサブ断片 のすべては除去される。 To enable the shape formed of the connection of the maximum number of length k having no overlap on either end, hand of longer than ka at the end, and the other is longer than kb length k- tuple all sub-fragments are removed. 発明者らの実験では、aとbがそれぞれ2と3の値であれば、十分な数の偽陽性のk-タプルが十分除去されると考えられた。 In our experiments, it was considered a and b if the value of each of 2 and 3, a sufficient number of false positive k- tuples are sufficiently removed.

【0258】 固有に連結され得るサブ断片の組込み(merging)は第2のステップで達成される。 [0258] sub-fragments may be linked to the specific incorporation (merging) is accomplished in a second step. 連結法則は、2つのサブ断片の適した終結点または開始点にあるオーバーラッ プ配列が他のいずれかのサブ断片の開始点および/または終結点に存在しなければ、またその場合にのみ2つのサブ断片が明確に連結するというものである。 Linking law, if the over-wrap sequences in suitable termination point or start point of the two subfragments is not present in the starting point and / or termination point of any other sub-fragments, and only if its 2 one of the sub-fragments are those that clearly linked.

【0259】 考慮される対に由来する1つのサブ断片が同一の開始点および終結点を有している場合は除外される。 [0259] When one sub-fragment derived from pair to be considered have the same start and stop positions are excluded. この場合、同一の終結点を有する別のサブ断片がファイルに存在していたとしても連結は可能である。 In this case, also connected as a separate sub-fragment having the same termination point is present in the file is possible. ここでの主な問題は、オーバーラップ配列の正確な定義である。 Here the main problem is the precise definition of overlapping sequence. もし、1対のサブ断片だけに特異的であるオーバ ーラップ配列がk-2より短いか、同じか、または長いが、k-4より長いいずれかの長さのオーバーラップ配列とともにさらなるサブ断片が存在していれば連結は許容されない。 If either only subfragment of one pair over Rappu sequence is specific is shorter than k-2, either same or long, further sub-fragments with overlapping sequences of the long any length than k-4 linked if present is not allowed. また、pSFの正しい両末端および1つの(または数個の)最後の塩基を除いた後の末端も、オーバーラップ配列とみなされる。 Further, end after removal correct both ends and one (or few) last bases of pSF also considered overlapping sequences.

【0260】 このステップの後、いくつかの偽陽性のk-タプル(最小のサブ断片として) および誤った末端を有するいくつかのサブ断片が残る。 [0260] After this step, few false positives k- tuple (as the smallest sub-fragment) and several sub-fragments with the wrong end remains. さらに、ある数の幾分か特異的な偽k-タプルが同時に存在するという極めてまれな場合では、誤った連 結が起こり得る。 Furthermore, in the case somewhat specific false k- tuples certain number is extremely rare that the simultaneous presence, can occur incorrect concatenation. これらのケースはサブ断片整列プロセスで、また切除されなかった「誤って結合された」サブ断片の取扱いを伴うさらなる制御ステップで検出および解明される。 These cases in subfragments alignment process, also be detected and solved in a further control step involving handling were not excised "is erroneously coupled" subfragments.

【0261】 得られた短いサブ断片には2種類がある。 [0261] The short obtained sub-fragment there are two types. 通常の場合、これらのサブ断片は、 反復するk-1配列が分布しているのでそれら自身の間で明確に連結され得る。 Normally, these sub-fragments, k-1 sequence repeats can be clearly linked among themselves so distributed. これはpSFの形成プロセス後に行われてもよく、pSFの形成プロセスに2つのステ ップが必要であることのよい例である。 This may be performed after the formation process of pSF, it is a good example of it requires two stearyl-up in the formation process of pSF. 偽陽性および/または偽陰性のk-タプ ルを含むファイルを用いる場合、非反復k-1配列の部位に短いpSFが得られる。 When using the file containing false positive and / or false negative k- tuples, short pSF the site of the non-repetitive k-1 sequence is obtained. 偽陽性のk-タプルを考慮すると、k-タプルは誤った塩基を1個より多く含み(あ るいは中央部のどかかに1個の誤った塩基を含む)、さらにその末端にk-タプルを含みうる。 Considering the k- tuple of false positives, k- tuple (in Ah Rui containing one incorrect base or center portion peaceful) more include than one incorrect base, the further the end k- tuple It may include. 短い、誤った(または誤って結合された)サブ断片の形成は、後者のk-タプルによって引き起こされる。 Short, incorrect (or incorrectly coupled with) formed of subfragments is caused by the latter k- tuple. 前者の種のk-タプルは、k-タプルの長 さに等しい長さを有する誤ったpSFを表す。 The former species k- tuple represents a false pSF having a length equal to the length of the k- tuple.

【0262】 アルゴリズムのpSF部分を組み込む目的は、pSFの数を、正確な配列を有する長いサブ断片の最小限の数まで減少させることである。 [0262] The purpose of incorporating the pSF part of the algorithm, the number of pSF, is to reduce to a minimum the number of long subfragments with the correct sequence. 最大限に連結できるよう、 So that can be connected to the maximum,
一方の末端のkaより長く、かつ他方のkbより長い、いずれの末端上でもオーバーラップしないk-タプルのサブ断片をすべて排除する。 Longer than ka of one end, and longer than the other kb, eliminating all the sub-fragments of the k- tuple nonoverlapping also on either end. このように、偽陽性の k-タプルの大部分は棄却される。 In this way, the majority of the false-positive k- tuple is rejected. 連結の法則は、2個のサブ断片が明確に連結され得るか、さらに2個のサブ断片の関連する終結または開始点のオーバーラップ 配列がいずれの他のサブ断片の開始および/または終結部分に存在しないかどうかだけである。 Law of concatenation, or two subfragments can be unambiguously connected, further in the initiation and / or termination portion of the two relevant termination or other subfragment overlapping sequence of any starting point of the sub-fragments but only whether or not exist. 例外は同一の開始および終結点を有するサブ断片である。 Exceptions are subfragments having the same start and termination point. その場合、ファイルに存在する同じ末端を有するもう1個のサブ断片があるという条件 で連結がなされる。 In that case, coupling with the condition is made that there is one more sub-fragments with the same end present in the file. ここでの主要な問題は、オーバーラップ配列の正確な定義である。 Here major problem in an exact definition of overlapping sequences. 偽陽性のおよび偽陰性のk-タプルの連結とともに、k-1またはk-2配列の 反復点の少なくとも2種の特異な偽陰性のk-タプルの存在が消失し、またいくつかのオーバーラップ配列が「マスク」され、pSFの誤りのない明確な連結が生じ 得る。 With coupling of false positive and false negative k- tuples, the presence of at least two specific false negative k- tuples iteration points k-1 or k-2 sequences disappeared, also some overlap sequence is "masked", it may occur a clear connection without error pSF. これを防ぐために、k-2より短い末端配列上で、さらにk-4より長い特別なオーバーラップ配列の存在下ではその連結はなされない。 To prevent this, on the k-2 from the short terminal sequence, further the coupling in the presence of a long special overlapping sequences from the k-4 is not performed. オーバーラップ配列は Overlapping sequences is
pSFの末端から明らかにされており、すなわち1個、またはごく少数の最終の塩 基が除去されている。 From the end of pSF are revealed, that one, or few last salt groups are removed.

【0263】 極めてまれな状況では、一定数のある種の偽陽性のおよび偽陰性のk-タプル の存在により、誤りのある末端を有するあるサブ断片が残存し、ある偽陽性のk [0263] In a very rare situation, the presence of k- tuples and false negatives of certain false positive constant number, a certain sub-fragment remains with terminal erroneous, false positives with k
-タプル(最小限のサブ断片として)が残存し得る、すなわち誤った連結が起こ り得る。 - tuple (as minimal subfragments) can remain, i.e. erroneous connection is obtained Ri Oko. これらの問題はサブ断片整列プロセスで、および未切断の、誤って連結したサブ断片の管理とともにある、さらなる制御ステップで認められ、解決される。 These problems subfragments alignment process, and uncut, is with the management of the sub-fragments linked by mistake, observed in a further control step, is solved.

【0264】 サブ断片整列プロセスは、それらの形成プロセスに類似している。 [0264] subfragments alignment process is similar to their formation process. サブ断片を長いk-タプルと考えるならば、末端のオーバーラップによるそれらの明確な連 結により整列がなされる。 If you consider subfragment long k- tuple alignment is done by a clear consolidation thereof by overlapping ends. 明確な連結のための情報提供基盤は、基本ライブラリーの断片で発生するサブ断片の、それらの断片のセグメントに相当するグループへの分割である。 Providing information base for clear concatenation of sub fragments generated by fragmentation of the basic library, which is divided into groups corresponding to the segment of fragments thereof. その方法は、関連連結配列を有する長いオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づくこの問題の生化学的解決法に類似している。 The method is similar to the biochemical solution of this problem based on hybridization with longer oligonucleotides with relevant connecting sequence.
その連結配列は基本ライブラリー断片の、適当なk-タプルセットのセグメント を用いてサブ断片として形成される。 The coupling sequence of basic library fragments, is formed as a sub-fragments using segments suitable k- tuple set. 関連するセグメントは基本ライブラリーの各断片とオーバーラップする整列ライブラリーの断片により明確にされる。 Associated segment is clear by fragmentation of alignment library overlapping with each fragment of the basic library. 最も短いセグメントが整列ライブラリーの情報提供断片である。 Shortest segments are providing information fragment alignment library. 最も長いものは、隣接するいくつかの情報提供断片または整列および基本ライブラリーに対応する断片の全オーバーラップ部分である。 Longest is the total overlap portion of the fragment corresponding to the number of the information providing fragments or alignment and basic library adjacent. 分離されるサンプル数を減らすために、整列ライブラリーの断片をランダムにプールし、さらに特異なk-タプル内容を決定 する。 To reduce the number of samples to be separated, a fragment of alignment library were pooled randomly, to determine a more specific k- tuple contents.

【0265】 整列ライブラリーの多数の断片を用いることにより、非常に短いセグメントが形成され、よってサブ断片の形成の原因であるk-1配列の多くの出現の機会が減 少する。 [0265] By using a number of pieces of alignment library very short segments are formed, thus many occurrences of opportunities for k-1 sequence which is responsible for the formation of the sub-fragments are decline. さらに、最も長いセグメントは基本ライブラリーの所定の断片の様々な領域からなり、反復するk-1配列を全く含んでいない。 Furthermore, the longest segment made from various regions of the given fragment of the basic library, do not contain any k-1 sequence repeats. あらゆるセグメントで、 連結配列(連結サブ断片)が所定の断片の一定のサブ断片対に形成される。 In every segment, linked sequences (connecting subfragment) is formed in a certain sub-fragment pair given fragment. 整列プロセスは3つのステップ:(1)各セグメントに含まれるk-タプルの形成;(2)各セグメントのサブ断片の形成;および(3)セグメントのサブ断片との連結からな る。 Alignment process three steps: (1) formation of k- tuples in each segment; ing from the connection between the sub-fragments and (3) segment; formation of sub-fragments of (2) each segment. 第1のセグメントは、基本ライブラリーの所定の断片のk-タプル内容と整列ライブラリープールのk-タプル内容との重要な共通部分および相違部分と定義 される。 The first segment is defined as critical intersection and difference from the k- tuple contents of a given fragment of k- tuple contents and alignment library pool of basic library. 第2の(短い)セグメントは第1のセグメントのk-タプル内容の共通部 分と相違部分と定義される。 Second (shorter) segments are defined as the common unit content and different part of the k- tuple contents of the first segment.

【0266】 共通部分および相違部分両方に、偽陽性のおよび偽陰性のk-タプル両方を集 積する問題がある。 [0266] in both the common part and different part, there is a k- tuple both false positives and false negatives for collecting product problem. 偽陽性のk-タプルが関連オーバーラップ領域でない両方の 配列にランダムに発生するとともに、開始配列の偽陰性のk-タプルは共通部分 (オーバーラップ部分)に集積する。 With the false positive k- tuples occur randomly on the sequence of both non-associated overlap regions, k- tuple false negative starting sequence is integrated into a common portion (the overlap portion). 他方、開始配列のいずれかの大部分の偽陽性のk-タプルは共通部分に取り上げられない。 On the other hand, one of the starting sequence majority of false-positive k- tuple is not taken up in the common parts. このことはそれらとオーバーラ ップする断片からの情報を用いて個々の断片からの実験誤差を小さくする例である。 This is an example to reduce the experimental error of the individual fragments by using information from them and the over wrapping fragment. 偽k-タプルは別の理由で相違部分に集積する。 False k- tuple is integrated in different part for another reason. オリジナル配列の偽陰性の もののセットは、共通部分の偽陽性のものに、および誤って共通部分に含まれない、すなわち共通部分には偽陰性であるそれらのk-タプルに対して偽陽性のも ののセットに拡張される。 The set of those false negative of the original sequences, those of false positive intersection, and erroneously not included in the intersection, that is, the intersection is false negative also for false positives for those k- tuple It is extended to the set of. 開始配列が10%偽陰性のデータを含んでいるならば、 第1および第2の共通部分はそれぞれ19%および28%の偽陰性のk-タプルを含んで いるだろう。 If initiation sequence contains the data of 10% false negative, the first and second intersection will contain k- tuples 19% and 28% false negative, respectively. 他方、基本断片およびプールがそれぞれ500bpおよび10,000bpの長 さを有するならば、期待値77の偽陽性のものが推測されよう。 On the other hand, if the basic fragment and pools each having a length of 500bp and 10,000 bp, it will be presumed those false positive expected value 77. しかしながら、「 However,"
失った」k-タプルの大部分を再生する可能性および偽陽性のk-タプルの大部分を排除する可能性がある。 It lost "k- there is a possibility to eliminate the majority of the majority of possibilities and false positives to play k- tuple of tuples.

【0267】 まず、所定の対のk-タプル内容の共通部分として所定のセグメントのk-タプル基本内容を決定する必要がある。 [0267] First, it is necessary to determine the k- tuple basic contents of a given segment as the intersection of k- tuple contents of a given pair. これに次いで、一方の末端にk-1を、他方の 末端に基本セットの2種のk-タプルの末端に生ずるk-+配列を含んでいる共通部 分の開始k-タプル内容の全k-タプルを含んでいることを調べる。 Following this, all k of the k-1 at one end, starting k- tuple contents of the common section fraction at the other end contains a terminal to produce k- + sequences of the two k- tuples of the basic set - check that contains tuples. よってそのプロセスで偽陽性のものの集積を妨げる相違部分が発生する前にこれがなされる。 Therefore this is done before the different part that prevents the accumulation of those false positives in that process occurs.
その後、同一タイプのk-タプル拡張セットを、借りてきたものが共通部分のか らのものであるという相違を有する相違部分に当てはめる。 Thereafter, the same type of k- tuple extension set, which has been rented fit to different part having a difference that is common part of the pressurized et al. 借りてこられる全k All k, which is come to borrow
-タプルは偽陽性のものとして共通部分ファイルから排除される。 - tuple is excluded from the common part file as a false positive.

【0268】 共通部分、すなわち共通なk-タプルのセットがそれぞれの対(基本断片)X( [0268] Common portion, i.e. common k- set of tuples each pair (basic fragment) X (
整列ライブラリーのプール)に対して定義される。 It is defined for the pool) alignment library. そのセットのk-タプル数が 有意であるならば、記載の法則に従い、偽陰性のものにより増大される。 If the number of the k- tuple the set is significant, following the law according is increased by that of the false negative. 第1の 相違部分セットは、所定の基本断片セットから得られた共通セットを減ずることで得られる。 The first difference subset is obtained by subtracting a common set obtained from predetermined basic fragment sets. 偽陰性のk-タプルは、記載の法則に従って共通セットから借りて きて、相違セットにあてはめ、同時に偽陽性のk-タプルとして共通セットから 取り除かれる。 False negative k- tuples is borrowed from a common set according to the law it described, fitted to the difference set, is removed from the common set as simultaneous false positive k- tuples. 基本断片がプールされる断片より長い場合、この相違部分はさらなるステップにおける有用性を幾分減ずる2つの異なるセグメントを意味するであろう。 Longer than fragments basic fragment are pooled, the different part will mean two different segments to reduce some utility in further steps. 第1のセグメントはかなりの数のk-タプルを含む対(基本断片)X(整 列ライブラリーのプール)の共通部分および相違部分を生ずるすべてである。 The first segment is all caused a significant number of k- tuple pair comprising a common part and a different part of the (basic fragment) X (Alignment library pool). The
2のセグメントのk-タプルセットは、第1のセグメントのすべての起こりうる対 のk-タプルセットの比較により得られる。 The second segment k- tuple set is obtained by comparison of all possible pairs of k- tuple set of the first segment. 2つの相違部分はかなりの数のk-タ プルとの共通部分を生ずるそれぞれの対から定義される。 Two different part is defined by a significant number of k- each pair causing the intersection of the tuple. オーバーラップされる断片から入手できる情報の大部分が、共通部分および相違部分を形成する第3の ラウンドより得られるものがほとんどないようにこのステップで回収される。 Most of the information available from the fragments overlap, is recovered in this step so that there is little those obtained from the third round of forming a common portion and a different part.

【0269】 (2)セグメントのサブ断片の形成は基本ライブラリーの断片に関する記載と同 様に行われる。 [0269] (2) Formation of subfragments of the segments is carried out according the same manner related fragments of the basic library.

【0270】 (3)サブ断片との連結法は、いくつかのオーバーラップされる末端を有する所 定の基本ライブラリー断片のサブ断片のうち、正確に連結するサブ断片対を連続的に決定することをからなる。 [0270] (3) joining method of the sub fragments of several sub-fragments of the constant of the basic library fragments where having overlapped ends which determines the sub-fragment pairs that accurately connected continuously consisting of that. 関連する4個の断片(そのうち2個が同一の開始部分を含み、2個が同一終結部分を有する)の場合では、異なる4対の連結され得るサブ断片がある。 Associated four fragments (of which two are comprising the same beginning, two have the same termination portion) in the case of, there is a sub-fragment which may be connected in four different pairs. 一般に、2個は正確であり、2個は誤りである。 In general, two is correct, two is an error. 正確なものを 見つけるために、各対の連結配列の存在が、所定の基本断片のすべての第1およ び第2のセグメントから生ずるサブ断片で試験される。 To find what exact, the presence of the coupling arrangement of each pair is tested in the sub-fragments resulting from all of the first and second segments of predetermined basic fragment. 連結配列の長さおよび位 置は、偶然に起こる配列による妨害を避けるよう選択される。 The length and position of the connecting sequence are chosen to avoid interference with sequences which occur by chance. それらはk+2であ るか、またはより長く、さらに所定の対の両サブ断片のオーバーラップ配列のそばに少なくとも1つのエレメント2を含んでいる。 They k + 2 der Luca, or longer, and further contains at least one element 2 beside overlapping sequence in both subfragments of a given pair. 2つの連結配列が見い出され、 残りの2つが存在しない場合にのみ、連結がなされる。 Two connecting sequences are found and only if no remaining two exist, connection is made. その2個の連結したサブ断片はファイル中の先のサブ断片を戻し、さらにプロセスを周期的に繰り返す。 Two sub-fragments linked to the returns ahead of the sub-fragments in the file, further process periodically repeated.

【0271】 反復配列はこのステップで形成される。 [0271] repeat sequence is formed in this step. これはいくつかのサブ断片が1度ならず連結されるサブ断片に含まれることを意味している。 This means that some subfragments are included in the sub-fragments linked not once. それらは2個の異なるサ ブ断片に関して1個のサブ断片と連結する関連連結配列を見い出すことで認識さ れよう。 They will be recognized by finding the relevant connecting sequence linking the one sub-fragment respect two different sub fragment.

【0272】 pSFを構築するプロセスおよびpSFを組み込むプロセスで生ずる誤って結合された認識は所定の基本ライブラリーのサブ断片の配列がその断片のセグメントで形成されるサブ断片の配列に存在するかどうかの試験に基づいている。 [0272] Whether pSF recognized coupled erroneously occurs in the process of incorporating the processes and pSF building a is present in the sequence of sub-fragments array of sub-fragments of predetermined basic library is formed by segments of the fragments It is based on the test. 誤って連結された位置の配列は誤って結合されたサブ断片を示すことではわからないであろう。 Incorrect sequence of concatenated positioned will not know that they exhibit subfragment coupled erroneously.

【0273】 より完全な配列を誤りなく形成するためには、サブ断片を整列する記載の3ス テップに加えて、さらなるいくつかの対照ステップまたは特定の配列に適用できるステップが必要であろう。 [0273] To form without error than the entire sequence, in addition to the 3 steps according to align the sub-fragments would require steps that can be applied to several further control steps or the particular sequence.

【0274】 セグメントおよびサブ断片中のk-タプル内容の比較により、どのサブ断片が どのセグメントに属しているのかの決定がなされる。 [0274] segment and sub-fragments in k- by tuple contents comparison, Which subfragment belongs to which segment of the determination is made. k-タプル内容中の誤差( プール中の第1の誤差および頻繁なk-タプルの発生による統計的誤差による)のため、サブ断片の正確な分割が不可能である。 k- For in-tuple contents of the error in (Statistical errors by the first error and frequent k- tuples generated in the pool), is not possible exact division of the sub-fragments. よって、「全か無か」の分割の代わりに、各サブ断片ついての所定のセグメントから生ずる機会が決定される。 Thus, instead of dividing the "all or nothing", opportunities arising from certain segments of about each sub-fragment is determined. この可能性はk-タプルの長さ、サブ断片の長さ、整列ライブラリーの断片の長さ 、プールのサイズ、およびファイル中の偽k-タプルのパーセンテージの関数で ある: P(sf,s)=(Ck-F)/Lsf, (式中、Lsfはサブ断片の長さであり、Ckは所定のサブ断片/セグメント対の共 通k-タプル数であり、Fはk-タプルの長さ、基本ライブラリーの断片、プール のサイズ、および誤差%間の関係を含むパラメーターである)。 This possibility k- tuple length, the length of the sub-fragments, the length of the fragment of the alignment library, pool size, and is a function of the percentage of false k- tuples in the file: P (sf, s ) = (Ck-F) / Lsf, (wherein, Lsf is the length of subfragment, Ck is the common k- number of tuples of a given sub-fragments / segments pairs, F is the k- tuple length is a parameter containing fragments of the basic library, the size of the pool, and the relationship between the error%).

【0275】 特定のセグメントのサブ断片は冗長な短いpSFとして処理され、明確な連結の プロセスを受ける。 [0275] subfragment of a particular segment are treated as redundant short pSF, they undergo a process distinct connection. オーバーラップ末端をため、明確な連結の決定はこの場合、 Since the overlap end, the determination of the definite connection this case,
わずかに異なる。 Slightly different. なお、明確な連結の精度は他のセグメントのこれらのサブ断片連結に従い制御される。 Incidentally, the accuracy of the clear coupling is controlled in accordance with these subfragments connecting other segments. 異なるセグメントの連結後、得られたすべてのサブ断片は一緒に組み込まれ、長いサブ断片に含まれる短いものは排除され、さらに残るものは通常の連結プロセスを受ける。 After ligation of the different segments, all of the sub-fragments obtained are incorporated together, long short included in the sub-fragments are eliminated, and further remains subjected to ordinary connection process. 明確な連結の後、その配列が完全に再生されない場合、特定のセグメントに属する確率についての同一のまたは厳密さを欠いた基準でサブ断片の分割および連結プロセスが繰り返される。 After a clear connection, if the sequence is not completely reproduced, the segmentation and concatenation process of the sub-fragments in a reference lacking identical or rigor of the probability that belong to a particular segment are repeated.

【0276】 明確なオーバーラップを定義するための厳密な基準を用いる場合、いくつかの情報は用いられない。 [0276] When using a strict criterion for defining a clear overlap, some information is not used. 完全な配列の代わりに、所定の断片に対する多くの可能性を定義するいくつかのサブ断片が得られる。 Instead of the complete sequence, several subfragments that define a number of possibilities for a given fragment are obtained. 厳密さを欠いた基準を用いる場合、 When using a reference lacking rigor,
正確かつ完全な配列がもたらされる。 Accurate and complete sequence is provided. 一定の状況、例えば誤った連結では、完全ではあるが不的確な配列を、またはそれらの間に連結のない「巨大な」サブ断片をもたらし得る。 Certain circumstances, for example in the wrong connection, complete some a is a non-exact sequence, or may result in "massive" subfragments with no connection between them. 従って、基本ライブラリーの各断片は、a)正確であるという点で可能性あるいくつかの解式およびb)最も有望な正確な解式が得られる。 Thus, each fragment of the basic library, a) Several solutions formula and b) the most promising accurate solution type a potential in that they are correct is obtained. また非常に稀な場合、サブ断片形成プロセス中の誤りにより、または属する見込みについての一定比率により明確な解式が生まれ、または1つ、すなわち最も有望な解 式が生ずる。 Also in very rare cases, the errors in the sub-fragmentation process or belonging prospective birth clear solution equation by a constant ratio for, or one, i.e. occurs most promising solution formula. これらの場合は不完全配列としてあり、または明確な解式は基本ライブラリーの他のオーバーラップされた断片をこれらのデータをものと比較することで得られる。 For these there as an incomplete sequence, or clear Kaishiki is obtained other overlapping fragments of the basic library by comparing ones of these data.

【0277】 記載されたアルゴリズムを、ランダムに形成された、ヒトゲノムのGC内容をシミュレートした40%GCを含む50kb配列に対して試験した。 [0277] The described algorithm, randomly formed were tested against 50kb sequence containing 40% GC to the GC content of the human genome was simulated. この配列の中間部分 には、約4kbの全長を有する様々なすべての、およびいくつか他の反復配列が挿 入された。 The middle part of this sequence, a variety of all with a total length of about 4 kb, and some other repetitive sequences have been inserted. in vitro SBH試験をシミュレートするために、次の操作を行い適当なデータを用意した。 In order to simulate the in vitro SBH test, we were prepared appropriate data do the following: a.

【0278】 -60個の5kbオーバーラップ「クローン」の位置をランダムに定義して、基本ライブラリーの調製をシミュレーションした: -1000個の500bp「クローン」の位置をランダムに定義して、整列ライブラリーの作製をシミュレーションした。 [0278] -60 pieces of to define the position of 5kb overlap "clone" at random, was to simulate the preparation of basic library: -1000 pieces of the position of 500bp "clone" is defined at random, aligned live the simulation of the production of the rally. これらの断片はその配列から得た。 These fragments were obtained from the sequence. 20の断片のランダムプールを作製し:プールのk-タプルセットを決定して、ハードディスク に入れた。 To prepare a 20 fragment random pool of: to determine the k- tuple set of the pool, it was placed in a hard disk. これらのデータはサブ断片整列段階で使用した:同一密度のクローンの代わりに、基本ライブラリーの400万クローンおよび整列ライブラリーの300万クローンをヒト全ゲノムに使用する。 These data were used in the subfragment alignment stage: instead of the same density of clones, 3,000,000 clones 4 million clones and alignment library basic library for use in human whole genome. 全数700万のクローンは、ほとんどすべて のゲノムDNAのランダムクローニングおよびゲルに基づく方法による配列決定用 の数kbの長さのクローン数より数倍低い。 Total number 7 million clones, almost all several times lower than the number of clones length of several kb for sequencing by a method based on random cloning and gels of genomic DNA.

【0279】 5kb断片の開始部分および終結部分のデーターから、117個の「情報提供断片」 [0279] From the data of the start portion and the end portion of the 5kb fragment, of 117 pieces "information provided fragment"
がその配列にあることが決定された。 There it was decided in the sequence. この後、シグナル「情報提供断片」を構成するオーバーラップk-タプルのセットが決定された。 Thereafter, a set of overlapping k- tuples constituting the signal "information provision fragment" is determined. 予め決定されたリストに あるk-タプルのサブセットのみ使用した。 Only a subset of a k- tuple predetermined list were used. そのリストには8-mer65%、9-mer30% 8-mer65% is in the list, 9-mer30%
および10ないし12-mer5%が含まれていた。 And 10 to 12-mer5% were contained. これらのデータに基づいて、サブ断片の形成および整列プロセスを行った。 Based on these data, it was formed subfragments and alignment process.

【0280】 アルゴリズムの試験はシミュレートした2つの試験のデータに基づいて行った 。 [0280] The test of the algorithm was carried out based on the data of the two test simulated. 100%正確なデータセット(20,000bpを超える)、および10%偽k-タプル(5%陽性および5%陰性のもの)を含む26個の情報提供断片(約10,000bp)を含む50個の情報提供断片の配列を再生した。 100% accurate data sets (greater than 20,000Bp), and 50 information including 26 pieces of information providing fragments containing 10% false k- tuples (5% positive and 5% negative ones) (about 10,000 bp) I was playing an array of providing fragments.

【0281】 第1の試験では、すべてのサブ断片が正確であり、50個の情報提供断片のうち1 [0281] In the first test, all subfragments is accurate, one of 50 of the information providing fragments
個だけ配列が完全には再生されず、5個のサブ断片のまま残った。 Only sequences not to completely reproduced pieces, remained five subfragments. 整列ライブラ リーのオーバーラップ断片の位置の分析により、それらが5個のサブ断片の特異 な整列の情報を欠いていることが示された。 Analysis of the position of the overlap fragments of alignment library, they were shown to be devoid of five information specific alignment of the sub-fragments. サブ断片はオーバーラップ末端に基づく2通り、1-2-3-4-5および1-4-3-2-5に連結され得る。 Two ways subfragments based on overlapping ends, may be coupled to 1-2-3-4-5 and 1-4-3-2-5. 唯一の相違点は、サブ 断片2および4の位置が取り換えられることである。 The only difference is that the position of the sub-fragments 2 and 4 are replaced. サブ断片2、3、および4は比 較的短い(すべて約100bp)ため、この場合、すなわちサブ断片3領域で開始、または終結される整列ライブラリーの断片がない場合に比較的多くの機会が存在し、起こった。 Subfragments 2, 3, and 4 are relatively short (all about 100 bp) for, in this case, that is, relatively many opportunities in the absence fragment alignment library starting at subfragment 3 region, or are terminated exist, it happened.

【0282】 実際の配列決定をシミュレートするために、多くの試験ではいくつかの誤った(「ハイブリダイゼーション」)データがインプットとして含められた。 [0282] In order to simulate the actual sequencing, many in the tests were wrong some ( "hybridization") data were included as input. オリゴマーハイブリダイゼーション試験では、目的の条件下で、信頼できないデータを生み出す唯一の事態が誤対合対完全適合ハイブリダイゼーションである。 In the oligomer hybridization test, under the conditions of the purpose, is a mismatched pair fully compatible hybridization only situation that produces unreliable data. それゆえ、シミュレーションで、いずれかの末端の1つのエレメントが実際のものと異 なっているそれらのk-タプルだけが偽陽性のものと考えられた。 Therefore, in the simulation, only those of k- tuple one of the elements of any of the terminal that is and what the actual different was considered to be false positives. これらの「誤 った」セットは次のように作製される。 These "were Tsu false" set is made in the following manner. 情報提供断片のk-タプルの原セットに 対し、5%偽陽性のk-タプルのサブセットを添加する。 Against the original set of information providing fragments k- tuple is added a subset of 5% false positive k- tuples. 偽陽性のk-タプルはそのセットからk-タプルをランダムに選択し、それをコピーして、さらにその開始 または終結部分のヌクレオチドを部分的に変えることにより作製される。 False positive k- tuple selects the k- tuple from the set randomly, copy it, is produced by further changing its initiation or termination portion of the nucleotide partially. この後、ランダムに選択された5% k-タプルのサブセットを除く。 Thereafter, except for the subset of 5% k-tuple randomly selected. このように、正確なk-タプルが末端に誤った塩基を有するk-タプルと置き換えられるという最も複雑な事態が統計的推測数で生ずる。 Thus, the most complex situation that is replaced with the k- tuple having the nucleotide exact k- tuple wrong end occurs at statistical inference number.

【0283】 記載のk-タプルセットの形成により、10%の誤ったデータとなる。 [0283] By forming the description of the k- tuple set, a 10% false data. この値はコピーされ、変えられ、消去されるk-タプルがランダムに選択されるため、あら ゆる場合に応じて変化する。 This value is copied, changed, k-tuple is erased is to be selected at random, vary depending on if the roughness loose. それにもかかわらず、このパーセンテージは実際のハイブリダイゼーション試験での信頼できないデータ量を3ないし4倍超えている。 Nevertheless, this percentage is above 3- to unreliable data amount of the actual hybridization test 4 times. 導かれた10%の誤りが結局、基本ライブラリーの断片(基本ライブラリー情報 提供断片)およびセグメントの両方におけるサブ断片数が2倍増加することにな る。 After all 10% of errors derived it is ing to the number of sub fragments increases twice in both fragments (basic library information providing fragments) and segments of the basic library. 最終サブ断片の約10%は、偽陽性のものを含むk-タプルセットで予測される(第1のサブ断片の形成を参照)ように、末端に誤った塩基を有する。 About 10% of the final sub-fragments as predicted by the k- tuple sets, including those of false positives (see the formation of the first sub-fragments), having a wrong base at the end. サブ断片 が誤った連結をする事例もサブ断片が誤った配列を有する事例も見られなかった。 Case for connecting the sub-fragments also incorrect were seen cases with sequence subfragment was wrong. 整列プロセスで試験された26個のうち4個の情報提供断片で完全な配列が再生 されなかった。 The complete sequence was not regenerated by 26 four information providing fragments of the tested in alignment process. 4つの事例すべてにおいて、配列は同一配列に含まれた数個の長 いサブ断片および数個の短いサブ断片として得られた。 In all four cases, the sequence was obtained as several subfragments and several shorter subfragments have long included in the same sequence. この結果が、アルゴリズム原理がパーセンテージの高い誤ったデータを動かしていることを示している。 The result is an algorithm principle indicates that moving the high false data the percentage.

【0284】 k-タプル含有物からの配列形成の成功は、完全性と正確さに関して記載され る。 [0284] k- success of sequences formed from tuple inclusions, Ru is described for completeness and accuracy. 形成プロセスでは、2つの特別な状況:1)ある情報部分が生じた配列中では 落とされているが、不明確なものがどこにあり、それらがどのタイプに属するのかは分かっている、および2)得られた再生配列が、そこからk-タプル含有物を 生じる配列に適合せず、その誤りが検出できない、が明確にされ得る。 In the formation process, two special situations: 1) there is information portion is dropped in the sequence that occurred, but where those unclear whether they belong to which type is known, and 2) obtained reproduction sequence not compatible with the sequence to produce therefrom k- tuple containing substance, the error can not be detected, it can be clarified. アルゴリズムが理論上の限界まで展開されると仮定すれば、正確なk-タプルを使用する ように第1のシミュレーションだけ行われ得る。 Assuming the algorithm is developed to the limit of theoretical it may be performed by the first simulation to use the correct k- tuple. その点で、不完全さにより一定 数のサブ断片が明確に整列されなくなり、さらに単配列の正確な長さ、すなわち完全な縦列反復数の決定の問題が起こる。 In that regard, a certain number of sub fragments are no longer clearly aligned by imperfections, further exact length of a single sequence, i.e. the problem of determination of the complete tandem repeats number occurs.

【0285】 偽k-タプルにより、不正確な配列が生じると考えられる。 [0285] by false k- tuple, it is considered inaccurate sequences would occur. 誤りの原因はアル ゴリズム不足にではなく、所定のk-タプル含有物が最初のものとは異なる配列 を明確に表しているという事実にある。 Cause of the error is not a lack algorithm lies in the fact that clearly represents a different sequence than the predetermined k- tuple containing material is the first. ファイル中に存在する偽k-タプルの種 類に基づいて、誤りは3つに定義され得る。 Based on the type of false k- tuples present in the file, an error can be defined in three. 偽陰性のk-タプル(偽陽性のものを伴わない)は「欠失」を引き起こす。 Of false negative k- tuple (without those of false positives) may cause a "deletion". 偽陽性のk-タプルは「延長(不等交差) 」を引き起こしている。 Of false positive k- tuple is causing the "extended (unequal cross)". 偽陰性のものを伴う偽陽性のものは、単独または「欠失」を組み合わせての「挿入」が起こる原因である。 Those of false positives with those of false negatives is a cause of "Insert" occurs alone or in a combination of "deletion". 欠失は、サブ断片の2つの可 能な開始部分間のすべてのk-タプル(またはそれらの大部分)が偽陰性のもの である場合に引き起こされる。 Deletion is caused when all k- tuples between 2 Tsunoka ability of the beginning of the sub-fragments (or most of them) are of false negatives. 配列のあらゆる位置がk-タプルにより明確にさ れるため、一般的な場合、欠失が起こる場合にはkの連続した偽陰性のものが必 要である。 Since every position of the sequence is clear by k- tuples, the general case, one of consecutive false negatives of k is required if the deletion occurs. (偽陰性のもの10%およびk=8で、各108エレメントの後にこの状況が 起こる)この状況は非常に稀に、10ゲノム等量を含むランダムなライブラリーを用いる哺乳類ゲノム配列決定にさえある。 (10% and k = 8 as false negative, after happens this situation of each 108 elements) This situation is very rare, even in mammalian genome sequencing using random libraries containing amount 10 genome or the like .

【0286】 偽陽性のk-タプルにより引き起こされる配列の延長は、その配列の末端が偽 陰性のk-タプルの循環直線アレイと考えられ得るため、「挿入」の特殊な例で ある。 [0286] extension of sequence caused by false positive k- tuples, since the end of the sequence may be considered a circulation linear array of k- tuple false negative, a special case of the "insertion". 1つのk-タプルより長いサブ断片を生ずる偽陽性のk-タプルの群と考え られる。 Considered a group of one k- tuple longer subfragments The resulting false positive k- tuples. 整列ライブラリーのランダムな物理的断片のようなオーバーラップ断片でサブ断片が形成されるならば、この種の状況が検出されよう。 If random subfragments with overlapping fragments such as physical fragments of the alignment library is formed, this type of situation it will be detected. 偽陽性および偽陰性のk-タプルの特殊な組合わせの結果として、挿入または欠失の代わりの挿 入が起こり得る。 As a result of the special combination of false positive and false negative k- tuples inserted or inserted in place of the deletion can occur. 第1の場合では連続した偽陰性のk-タプル数がkより低い。 Number of k- tuple false negative continuous in the case the first is less than k. 両 方の場合に、数個のオーバーラップ偽陽性のk-タプルが必要である。 In the case of both, there is a need for several of overlap false positive k- tuple. 数および 偽k-タプルの特異性における必要条件は、非常に単純であるため、挿入および 欠失は実際のかなり大きな影響もなく、概ね理論的に可能性がある。 Requirements in specificity of the number and false k- tuples are the very simple, insertions and deletions are actual no sizeable impact, generally theoretically possible.

【0287】 偽陽性のおよび/または偽陰性のものの種類が最小数であるという理論的な必要条件に合わないその他すべての状況では、k-タプル含有物の誤りが生じた配 列の完全性を低下させると思われる。 [0287] In all other situations that do not meet the theoretical requirement that different ones of false positives and / or false negative is the minimum number, the integrity of the sequence of an error in the k- tuple inclusions It is likely to decrease.

【0288】 SBH、核酸サンプルは、サンプルを既知の配列の支持体結合プローブ、および 標識プローブまたは溶解プローブに曝して配列決定される。 [0288] SBH, nucleic acid sample, support bound probe samples known sequence, and sequenced by exposure to labeled probes or dissolution probe. プローブリガーゼがプローブおよびサンプルの混合物に導入される場合、すなわち支持体がサンプルに沿って背中合わせにハイブリダイズされた結合プローブおよび標識プローブを有する場合、2つのプローブはリガーゼの作用で化学的に結合されよう。 If the probe ligase is introduced into a mixture of probes and sample, that is, when the support has a binding probe and labeled probe hybridized back to back along the sample, the two probes are chemically bonded by the action of a ligase Ocean. 洗浄後 、化学的に結合した支持体結合および標識プローブだけを標識プローブの存在により検出する。 After washing, only a chemically bonded support-bound and labeled probes to detect the presence of the labeled probe. アレイの特定の位置の支持体結合プローブの同一性および標識プローブの同一性を知ることで、サンプルの配列の一部を3つの基体サンプルを有 するフォーマットにおけるアレイのポイントの標識の存在により決定できる。 Knowing the identity of the identity and labeled probe support bound probe specific position of the array can be determined by the presence of the label array points in the format that have a three base sample a portion of an array of samples . 偶然でもなく仕向けたわけでもないが(not chances not working)、結合プローブ 対のすべての配列が最大限にオーバーラップし、サンプルの配列が再構築されよう。 But nor was directed neither coincidence (not chances not working), all sequences of the binding probe pairs will overlap to maximize the sequence of samples will be reconstructed. 配列決定されないサンプルは、核酸断片または10塩基対("bp")のオリゴヌクレオチドであろう。 Sample not been sequenced will be oligonucleotides of the nucleic acid fragments or 10 base pairs ( "bp"). そのサンプルは、好ましくは4ないし1000塩基の長さであ る。 The sample, Ru preferably 4 to 1000 bases in length der.

【0289】 プローブの長さは、10塩基未満の長さの断片であり、好ましくは4ないし9間の塩基の長さである。 [0289] The length of the probe is less than 10 bases is a fragment of the length, the length of preferably 4 to between 9 bases. このように、支持体結合プローブのアレイは所定の長さのすべてのオリゴヌクレオチドを有するか、または特定の試験用に選択されるオリゴヌクレオチドだけを有するであろう。 Thus, an array of support-bound probe will have only oligonucleotide selected for testing or specific with all oligonucleotides of a given length. 所定の長さのすべてのオリゴヌクレオチドを使用する場合、中央のオリゴヌクレオチド数は4 N (Nはプローブの長さである )により算出されるであろう。 When using predetermined lengths of all the oligonucleotides, the center of the oligonucleotide number 4 N (N is the length of the probe) will be calculated by.

【0290】 実施例18 配列決定用チップの使用に関して配列決定法においてライゲーションが採用される場合、通常のオリゴヌクレオチドチップを直ちに再使用するわけにはいかない。 [0290] If the ligation is employed in the sequencing method for the use of Example 18 sequencing chip, it can not immediately re-use the ordinary oligonucleotides chip. 本発明者は、この問題をいろいろなやり方で克服できると考える。 The present inventor believes that can overcome this problem in various ways.

【0291】 第2のプローブであるプローブPのためにリボヌクレオチドを使用することが でき、その結果としてこのプローブをその後のRNAse処理で除去することができ る。 [0291] For the probe P is a second probe can be used ribonucleotides, Ru can remove this probe in subsequent RNAse treatment as a result. RNAse処理では、ピリミジン残基の3'側の一本鎖RNAを特異的に攻撃して隣接ヌクレオチドへのリン酸エステル結合を切断するエンドリボヌクレアーゼ RNAse In RNAse treatment, endoribonuclease RNAse that cleaves the phosphate ester bond to the adjacent nucleotides to specifically attack the single-stranded RNA of the 3 'side of pyrimidine residues
Aを使用する。 Using the A. 最終産物はピリミジン3リン酸と末端ピリミジン3リン酸をもつオリゴヌクレオチドである。 The final product is an oligonucleotide having a pyrimidine triphosphate and terminal pyrimidine 3-phosphate. RNAse A は補因子と二価カチオンの非存在下で働く。 RNAse A works in the absence of cofactors and divalent cations.

【0292】 RNAseを使用するためには、一般的に、Sambrookら(1989;参考としてここに組 み入れる)に記載されるように、適切なRNAse含有緩衝液中でチップをインキュ ベートする。 [0292] To use the RNAse is, see generally, Sambrook et al.; As described in (1989 Add herein set seen by reference), incubate the chip in a suitable RNAse containing buffer. 8x8 mmまたは9x9 mmアレイにつき30〜50μlのRNAse含有緩衝液を37 The 8x8 mm or 9x9 mm RNAse-contacting buffers 30~50μl per array 37
℃で10〜60分間使用することが好ましい。 ℃ in preferably used for 10 to 60 minutes. その後ハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄する。 Thereafter washing with hybridization buffer.

【0293】 広範には適用可能でないが、Craigら(1989;参考としてここに組み入れる)に 記載されるように、特定の実施形態においてウラシル塩基を使用することができる。 [0293] broadly is not applicable, Craig et al .; as described in (1989 incorporated herein by reference), it can be used uracil bases in certain embodiments. ライゲートされたプローブ組合せ物の破壊(再使用可能なチップをもたらす)は、E. coli 修復酵素であるウラシル-DNAグリコシラーゼ(DNAからウラシル を除去する)で消化することにより達成される。 (Resulting in a reusable chip) destruction of the ligated probe combination is accomplished by digestion with E. Coli repair uracil -DNA glycosylase enzymes (to remove uracil from DNA).

【0294】 また、プローブ間に特異的に開裂可能な結合を形成させて、検出後にその結合を切断することもできる。 [0294] Further, by forming a specific cleavable linker between the probes, after the detection may be cut its binding. 例えば、これは、Shabarovaら(1991)およびDolinnaya For example, this is, see: Shabarova et al (1991) and Dolinnaya
ら(1988)(両文献とも参考としてここに組み入れる)に記載されるような化学的 ライゲーションにより達成できる。 Luo (1988) can be achieved by chemical ligation as described in (both documents also are incorporated herein by reference).

【0295】 Shabarovaら(1991)は、縮合剤として臭化シアンを用いてオリゴデオキシリボ ヌクレオチドを縮合させることを記載している。 [0295] Shabarova et al. (1991), describes the condensation of oligodeoxyribonucleotides using cyanogen bromide as a condensing agent. 彼らのワンステップ化学ライゲーション反応では、オリゴヌクレオチドを97℃に加熱し、0℃まで徐々に冷却し 、その後アセトニトリル中の10 mM BrCNを1 μl添加する。 In their one step chemical ligation reaction, heating the oligonucleotide to 97 ° C., gradually cooled to 0 ° C., then added 1 [mu] l of 10 mM BrCN in acetonitrile.

【0296】 Dolinnayaら(1988)は、DNA二本鎖中にホスホルアミダイトおよびピロホスフェートヌクレオチド間結合を如何に組み込むかを記載している。 [0296] Dolinnaya et al (1988) describes how the incorporation of a coupling between the phosphoramidite and pyrophosphate nucleotides in a DNA duplex. 彼らはまた、カップリング剤として水溶性カルボジイミド(CDI)を用いて、DNAの糖リン酸骨格を修飾するための化学的ライゲーション法を使用している。 They also using water-soluble carbodiimide (CDI) as coupling agent, using a chemical ligation method for modifying the sugar phosphate backbone of DNA. ホスホルアミダイト結合の選択的切断には、15% CH 3 COOHと95℃で5分接触させる必要がある。 The selective cleavage of phosphoramidite linkages, it is necessary to contact 5 min 15% CH 3 COOH and 95 ° C.. ピロホスフェート結合の選択的切断には、ピリジン−水混合物(9:1)および新たに蒸留した( The selective cleavage of pyrophosphate bond, pyridine - water mixture (9: 1) and freshly distilled (
CF 3 CO) 2 Oとの接触が必要がある。 CF 3 CO) must contact with the 2 O.

【0297】 実施例19 既知の突然変異の診断-スコアリングまたは完全遺伝子の再配列決定簡単な場合には、選択された既知の突然変異がDNAセグメント中で起こるか否 かを発見することが目的であってもよい。 [0297] EXAMPLE 19 Diagnosis of known mutations - if scoring or complete gene resequencing simple for the purpose that the known mutation chosen to discover whether occurring in DNA segment it may be. この目的には12個未満のプローブで十分であり、例えば、一方の対立遺伝子に陽性のプローブが5個、もう一方に陽性 のものが5個、そして両方に陰性のものが2個である。 This is the purpose are sufficient fewer than 12 probes, for example, one of five positive probe alleles, Positives to the other five, and those negative is two in both. サンプルごとにスコアリングされるプローブの数が少ないため、多数のサンプルを平行して分析することが可能である。 Since a small number of probes to be scored per sample, it can be analyzed in parallel a large number of samples. 例えば、12個のプローブを3回のハイブリダイゼーションサイクル に用いれば、64人の患者からの96個の異なるゲノム遺伝子座または遺伝子セグメントを1枚の6×9インチ膜で分析することができる。 For example, if a twelve probes three hybridization cycle it is possible to analyze 96 different genomic loci or gene segments from 64 patients with a single 6 × 9 inches film. この膜には12×24のサブア レイが含まれており、各サブアレイは、64人の患者由来の同一DNAセグメントを 示す64個のドットを有する。 This membrane includes a subarrays Lei 12 × 24, each sub-array has 64 dots indicating the same DNA segment from 64 patients. 本実施例では、64枚の96ウェルプレートでサンプルを調製してもよい。 In this embodiment, it may be prepared samples in 64 96-well plates. プレート1枚につき患者1人とし、ウェル1個につき分析すべきDNAセグメント1つとすることができる。 One plate per the one patient can be DNA segments one to be analyzed per well. 64枚のプレートからのサンプルを 、同じ膜の4分の1ごとにスポットして4つのレプリカとしてもよい。 Samples from 64 plates may be four replicas were spotted for each quarter of the same film.

【0298】 12個のプローブのセットは、96個のセグメントの各々に対して単一チャネルピペッティングまたは単一ピン移送(transferring)装置(または個別に制御される ピペットもしくはピンのアレイ)によって選択することができ、選択したプロー ブを12枚の96ウェルプレート中に配列させることができる。 [0298] The twelve sets of probes are selected by single channel pipetting or a single pin transferring to each of 96 segments (Transferring) device (or pipette or pin array is individually controlled) it is possible, it is possible to arrange the selected probe in a 96-well plate of 12 sheets. プローブが予備標識されていない場合には標識してもよく、次いで4枚のプレートから得たプローブ をハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、96チャネルピペッティング装置によって優先的にサブアレイに添加すればよい。 Probes may be labeled if it is not pre-labeled, then the probes were obtained from four plates were mixed with the hybridization buffer may be added to the subarrays preferentially by 96 channel pipetting device. ハイブリダイゼーションを1サイク ル行った後、膜を37℃〜55℃にて好ましくは未希釈のハイブリダイゼーション緩衝液もしくは洗浄緩衝液中でインキュベートすることにより、先に適用したプローブを除去することが可能である。 After hybridization one cycle, preferably the film at 37 ° C. to 55 ° C. by incubating the hybridization buffer or washing buffer undiluted, can be removed probes applied earlier it is.

【0299】 一方の対立遺伝子に陽性のプローブが陽性であり、もう一方の対立遺伝子に陽性のプローブが陰性である確率を利用して、2つの対立遺伝子のいずれが存在するのかを判定することができる。 [0299] a positive-positive probe to one allele, that positive probe to the other allele by using the probability is negative, to determine whether which of the two alleles present it can. この重複スコアリングスキームでは、各プローブのハイブリダイゼーションにおいて一定レベル(約10%)のエラーが許容可能である。 In this overlap scoring scheme is acceptable error constant level (about 10%) in the hybridization of each probe.

【0300】 特に、より少ない重複度で十分な場合 (例えば、1または2個のプローブによって2つの対立遺伝子の一方がサンプルに含まれるか否かが証明される場合)には、 [0300] Particularly, when sufficient with less multiplicity (e.g., if one of the two alleles by one or two probes whether contained in a sample is evidenced) is
プローブの不完全なセットを使用して多くの対立遺伝子のスコアリングを行うこともできる。 It is also possible to score many alleles using an incomplete set of probes. 例えば、4000個の8-merのセットを用いると、無作為に選択した遺 伝子座について2つの対立遺伝子の一方に対して陽性であるプローブを少なくと も1つ見出す確率は91%である。 For example, the use of 4000 sets of 8-mer, the probability of finding one also reduces the probes that are positive for one of the two alleles for gene loci randomly selected is 91% . プローブの不完全なセットを、被験サンプルの G+C含量および他の偏り(bias)を反映するように最適化してもよい。 The incomplete set of probes may be optimized to reflect G + C content and other biases in the test sample (bias).

【0301】 完全遺伝子を配列決定する場合には、遺伝子を適切な数のセグメントで増幅すればよい。 [0301] When determining complete gene sequence may be amplified genes in the appropriate number of segments. 各セグメントごとに、プローブのセット(2〜4塩基当たり約1個のプローブ)を選択してハイブリダイズさせればよい。 For each segment, it is sufficient to hybridize to select a set of probes (about one probe per 2-4 bases). これらのプローブによって、被 験セグメントの何処に突然変異が存在するのかが確認できる。 These probes, whether there is where the mutation of the test segment is confirmed. 1つ以上の突然変 異部位が検出されるセグメント(即ち、これらのセグメントを含有するサブアレ イ)は追加のプローブとハイブリダイズし、突然変異部位において正確な配列を 見出すことができる。 Segments of one or more mutation sites are detected (i.e., Sabuare Lee containing these segments) adds the probe hybridizes, may be found the correct sequence in the mutation site. DNAサンプルを第2の6-merの各々で試験した際に、陽性に ハイブリダイズしたプローブTGCAAAおよびTATTCCによって包囲され、かつ3個の 陰性プローブCAAAAC、AAACTAおよびACTATTによって覆われる位置に突然変異が局在化していれば、突然変異ヌクレオチドは、正常な配列のその位置に存在するA および/またはCのはずである。 When tested DNA samples in each of the second 6-mer, is surrounded by the probe TGCAAA and TATTCC hybridized positively, and three negative probes CAAAAC, mutations at positions covered by AAACTA and ACTATT station if the localization, mutant nucleotides should the a and / or C is present at that position in the normal sequence. この変化は、単一塩基突然変異によって、また は塩基AA、ACもしくはCT間において1つもしくは2つのヌクレオチドが欠失したり挿入されたりすることによって生じる。 This change is by a single base mutation, or bases AA, caused by one or two nucleotides or is inserted or deleted between AC or CT.

【0302】 一つのアプローチは、陽性にハイブリダイズしたプローブTGCAAAをヌクレオチド1個分右側へ伸長させたプローブと、同じく陽性にハイブリダイズしたプロー ブTATTCCをヌクレオチド1個分左側へ伸長させたプローブを選択するというもの である。 [0302] One approach, selection and probe that was extending the hybridized probe TGCAAA positive to nucleotide 1 pieces of right-hand side, a probe was also extending the hybridized probe TATTCC positive nucleotide to one minute left is that to. これらの8個のプローブ(GCAAAA、GCAAAT、GCAAAC、GCAAAGおよびATATTC These eight probe (GCAAAA, GCAAAT, GCAAAC, GCAAAG and ATATTC
、TTATTC、CTATTC、GTATTC)を用いて、2つの問題のヌクレオチドを判定する。 , TTATTC, CTATTC, GTATTC) using determines two problems nucleotides.

【0303】 突然変異に関して最も可能性の高い推測を求めることができる。 [0303] can be obtained the most likely guess with respect to mutation. 例えば、AがG For example, A is G
に突然変異することが判る。 It can be seen that the mutation in. これらの結果を満たす解釈には2つある。 There are two in interpreting satisfying these results. 一つは、 one,
AをGで置換えることを唯一の変化とするものであり、もう一つは、この変化の他にも、新たに判定されたGとそれに続くCの間に一定数の塩基が挿入されるというものである。 Is intended to only change that replaced the A in G, the other one, in addition to this change, the base is inserted a certain number of between newly determined to be G and C followed by is that. 架橋プローブを用いた結果が陰性の場合には、まず突然変異位置を含む少なくとも1個の架橋プローブ(AAGCTA)によって、次いで追加の8個のプローブCAAAGA、CAAAGT、CAAAGC、CAAAGGおよびACTATT、TCTATT、CCTATT、GCTATTを用いてこれらの選択肢を確認すればよい。 If the result of using the crosslinking probes is negative, by at least one cross-linking probe containing a mutation position (AAGCTA) First, then additional eight probes CAAAGA, CAAAGT, CAAAGC, CAAAGG and ACTATT, TCTATT, CCTATT , it is sufficient to confirm these choices by using the GCTATT. 突然変異解明プローブを選択するには、 To select a mutation elucidation probe,
他にも多くの方法がある。 There are many ways to other.

【0304】 二倍体の場合には、試験サンプルとホモ接合体対照についてスコアを個別に比較することで、ヘテロ接合体を同定することができる(上記参照)。 [0304] In the case of diploid, for the test sample and homozygous control by comparing the scores individually, it is possible to identify heterozygotes (see above). 連続するプローブで覆われるセグメントが2本の染色体の一方で突然変異している場合には、 これらの連続プローブのいくつかは約2分の1のシグナルを有するものと予測される。 If the segment is covered with successive probes it is mutated on one of the two chromosomes, some of these successive probes are expected to have a 1 signal of approximately 2 minutes.

【0305】 実施例20 遺伝障害および他の形質の原因となる遺伝子(突然変異)の同定長鎖プローブ(8-merまたは9-mer)の普遍的なセットをサンプルの固定化アレイ上で使用すれば、サブクローニングをしなくても5〜20kb程度のDNA断片を配列決定することができる。 [0305] Using Example 20 Genetic disorders and other traits of causative gene (mutation) of the identified long chain probe (8-mer or 9-mer) Sample universal set of immobilized on an array if, it is possible to sequence the DNA fragment of about 5~20kb without subcloning. さらに、配列決定の速度は容易に約10,000,000bp/日/ハイブリダイゼーション装置になり得る。 Furthermore, the speed of the sequencing can be readily about 10,000,000Bp / day / hybridization device. この性能により、科学的または医学的に興味のある個人に由来する大規模画分のヒト遺伝子またはヒトゲノムを繰返し再配列決定することが可能となる。 This performance, it is possible to re-sequenced repeatedly a large fraction of human genes or the human genome derived from individuals with a scientific or medically interesting. ヒト遺伝子の50%を再配列決定するためには、約 To re-sequencing of 50% of human genes, about
100,000,000bpの塩基対がチェックされるが、比較的短い期間に妥当なコストで 実施することができる。 Although bp 100,000,000bp is checked, it can be implemented at reasonable cost in a relatively short period of time.

【0306】 この優れた再配列決定能力を複数の方法に利用して、突然変異および/または障害もしくは任意の他の形質をコードする遺伝子を同定することができる。 [0306] it is possible to identify the gene encoding using this excellent resequencing capability in a plurality of methods, mutation and / or disorders or any other traits. 基本的には、特定の障害を有する患者の特定の組織またはゲノムDNAに由来するmRNA( Basically, mRNA from a particular tissue or genomic DNA of patients with certain disorders (
cDNAに変換し得るもの)を出発材料として使用すればよい。 Those) that can be converted into cDNA may be used as starting materials. 両方のDNA供給源から、クローニング手法またはin vitro増幅手法(例えば、PCR)によって、適切な長 さの異なる遺伝子またはゲノム断片を調製することができる。 From both DNA sources, cloning techniques or in vitro amplification techniques (e.g., PCR), it is possible to prepare different genes or genomic fragments of appropriate length. クローニングを利用する場合に、分析すべきクローンの最小限のセットをライブラリーから選択し、次いでクローニングを行えばよい。 When using the cloning, the minimal set of clones to be analyzed were selected from a library, then it is sufficient to cloning. この操作は、特に、5kbよりも長い少数の クローンを選別しようとする場合には、少数のプローブをハイブリダイゼーションさせればよいので効率的である。 This operation, especially when trying to sort long fewer clones than 5kb is efficient because it is sufficient to hybridization few probes. クローニングを行うことでハイブリダイゼーションのデータ量を約2倍に増やすことができるが、何万ものPCRプライマーを必要とするわけではない。 It can be increased to about twice the amount of data hybridization to clone, but does not require tens of thousands of PCR primers.

【0307】 改良を加えた手順の1つでは、DNAをGACGC(N5')/CTGCG(N10')のように切断する [0307] cutting In one procedure by improving the DNA as GACGC (N5 ') / CTGCG (N10')
HgaI等の酵素による制限切断によって遺伝子断片またはゲノム断片を調製することができる。 It can be prepared gene fragment or genomic fragment by restriction cleavage with enzymes such as HgaI. 5塩基からなる突出末端は断片ごとに異なる。 Overhanging ends of five bases are different for each fragment. 1種類の酵素では、一定数の遺伝子に対して決まった断片が生じる。 In one enzyme, fixed fragments occurs for a certain number of genes. cDNAまたはゲノムDNAを複数の酵 素で別々の反応にて切断することにより、目的の各遺伝子を適切に切り出すことができる。 By cutting in separate reactions cDNA or genomic DNA in multiple enzyme can be excised appropriately the gene of interest. 1つのアプローチでは、切断されたDNAをサイズごとに分画する。 In one approach, fractionated by size the cleaved DNA. このように調製したDNA断片(さらに、3'末端からヌクレオチドを1個ずつ除去し、か つ末端の長さと特異性を増加させるエキソヌクレアーゼIIIで任意に処理したも の)を、チューブまたはマルチウェルプレートに分配してもよい。 The thus prepared DNA fragment (and 3 'is removed from the terminal nucleotide one by one, or One end of the well was treated optionally with exonuclease III to increase the length and specificity) of the tube or multiwell plates may be distributed. 共通部分と適 切な長さの可変突出末端とを有するDNAアダプターの比較的少数のセットから、 増幅させる必要のある遺伝子断片ごとにアダプター対を選択することができる。 From a relatively small number of sets of DNA adapter having a variable protruding end of the common part and suitable sadness length, can be selected adapter pair for each gene fragment that needs to be amplified.
これらのアダプターをライゲートし、次いで普遍的プライマーでPCRを行う。 Ligated these adapters, followed by a PCR with universal primers. 100 100
0個のアダプターから1,000,000対を生成させることができ、従って、アダプターの共通末端に相補的な普遍的プライマー対によって、同一の条件下で1,000,000 通りの異なる断片を特異的に増幅させることが可能である。 From 0 adapters can be produced 1,000,000 pairs, therefore, a common terminal to complementary universal primer pair of adapters, different fragments of 1,000,000 as under the same conditions can be specifically amplify the is there.

【0308】 DNAの相違が複数の患者で繰り返し見出されるのであれば、このような配列変 化はナンセンスであるか、または対応するタンパク質の機能を変化させ得るものであり、従って、突然変異した遺伝子によって障害が引き起こされる可能性がある。 [0308] If the difference in DNA is found repeatedly in multiple patients, which such sequences change may alter the function of the protein or a nonsense, or corresponding, therefore, mutated gene it may be caused failure by. 特定の形質を有する有意数の個人を分析することにより、特定の遺伝子の機能的対立遺伝子変異体を特定の形質と関連付けることができる。 By analyzing a significant number of individuals with particular traits, it may be associated with functional allelic variants of a particular gene and a particular trait.

【0309】 このアプローチを使用すれば、広範な家系に対して高コストの遺伝子マッピングを行う必要がなくなり、また、このような遺伝子データまたは遺伝子材料がなくても特定の有用性が認められる。 [0309] Using this approach, is necessary to perform costly genetic mapping eliminates against broad family, also, such genetic data or genetic material has particular utility is observed even without.

【0310】 実施例21 遺伝子マッピングにおける単一ヌクレオチド多型性のスコアリングこの出願に開示される技術は、単一ヌクレオチド多型性(SNUP)を有するゲノム断片の効率的な同定に適している。 [0310] The techniques disclosed in single nucleotide polymorphism scoring this application in Example 21 Gene mapping is suitable for efficient identification of genomic fragments with single nucleotide polymorphisms (SNUP). 10人の個人において、クローニングまたはin In the individual of 10 people, cloning or in
vitro増幅によって増幅可能な既知の配列の多数のゲノム断片に、記載の配列決定法を適用することにより、SNUPを有する十分な数のDNAセグメントを同定する ことができる。 A large number of genomic fragments of known sequence that can be amplified by vitro amplification, by applying the sequencing method described, it is possible to identify a sufficient number of DNA segments with SNUP. 多型性を有する断片をSNUPマーカーとしてさらに使用する。 It fragments with polymorphic further use as SNUP marker. これらのマーカーは既にマッピングされているものでもよく(例えば、マッピングさ れたSTSに該当)、または下記のスクリーニング手法によってマッピングしてもよい。 These markers may be those already mapped (e.g., corresponding to the mapped STS), or may be mapped by the screening method described below.

【0311】 該当する家族または集団に属する個人ごとに、マーカーを増幅してサブアレイのアレイ形状に配列させることによってSNUPをスコアリングすることが可能である。 [0311] For each individual belonging to the relevant family or group, it is possible to score the SNUP by arranged in an array shape of the sub-array to amplify the marker. サブアレイには、被験個人から増幅された同一のマーカーが含まれる。 The sub-arrays include the same marker amplified from the test individual. 各マーカーごとに、既知の突然変異の診断の場合と同様、一方の対立遺伝子に陽性の For each marker, as in the case of diagnosis of a known mutation, positive for one allele
6個以下のプローブと、もう一方の対立遺伝子に陽性の6個以下のプローブとからなるセットを選択してスコアリングすることができる。 And 6 or fewer probes may be scored to select a set of 6 or less probes positive for the other allele. 1個のマーカーまたはマ ーカー群と障害とを有意に関連付けることによって、原因遺伝子の染色体位置を決定することができる。 By associating one of the marker or markers group and disorders significantly, it is possible to determine the chromosomal location of the causative gene. ハイスループットでかつ低コストのため、何千ものマーカーを何千もの個人についてスコアリングすることができる。 For high throughput at a low cost, it can be scored for of individuals thousands markers thousands. このようなデータ量のため、1,000,000bp未満の分解能レベルで遺伝子の位置を決定することがで き、さらに多遺伝子性疾患に関与する遺伝子の位置を決定することができる。 Because of such data amounts, Ki out to determine the location of a gene at a resolution level of less than 1,000,000Bp, it is possible to further determine the position of the genes involved in polygenic diseases. 該当する正常な個人および疾患状態の個人に由来する特定の領域を配列決定して突然変異をスコアリングすることにより、局在する遺伝子を同定することができる。 By scoring the mutation specific regions sequenced derived from individuals of the appropriate normal individuals and disease state, it is possible to identify the gene localized.

【0312】 ゲノムDNA由来のマーカーの増幅にはPCRが好ましい。 [0312] PCR is preferred for amplification of markers from genomic DNA. 各々のマーカーには、特異的なプライマー対が必要である。 Each of the markers, it is necessary specific primer pairs. 既存のマーカーを転用するか、またはHgaIタイプの制限酵素でゲノムDNAを切断し、アダプター対とライゲートすることによ って調製し得る新しいマーカーを規定してもよい。 Or to divert an existing marker, or the genomic DNA was digested with HgaI type of restriction enzyme, it may define a new marker that may be prepared me by to adapter pair and ligated.

【0313】 SNUPマーカーを増幅したり、プールとしてスポットすることにより、独立した増幅反応の数を減らすことができる。 [0313] or amplify SNUP marker, by spotting as a pool, it is possible to reduce the number of independent amplification reactions. この場合、1サンプル当たりより多くのプ ローブがスコアリングされる。 In this case, many probe than per sample is scored. 4個のマーカーを12個のレプリカ膜上にプールお よびスポットする場合には、48個のプローブ(マーカー当たり12個)を4サイクル でスコアリングできる。 Four markers when spot and with pool into 12 replica film can scoring 48 probes (12 per marker) in 4 cycles.

【0314】 実施例22 DNA断片の正体の検出および検証制限切断、クローニングまたはインビトロにおける複数回の増幅(例えば、P [0314] the identity of Example 22 DNA fragment detection and verification restriction cleavage, multiple amplification in cloning or in vitro (e.g., P
CR)によって作製したDNAを実験で同定できる。 DNA prepared by CR) can be identified in the experiment. 同定は、ゲル電気泳動分析の結果特定サイズのDNAバンドが存在するかどうかを検証することによって実施できる。 Identification can be performed by verifying whether there is a result DNA bands of a particular size of the gel electrophoretic analysis. または、特定のオリゴヌクレオチドを作製して、ハイブリダイゼーションによって問題のDNA試料を検証するために使用できる。 Or, to prepare a specific oligonucleotide, it can be used to verify a DNA sample in question by hybridization. 本明細書において開発された手法により、各断片ごとに特定のオリゴヌクレオチドを作製することなく、大多数の試料をより効率的に同定することが可能になる。 The method developed herein, without making a specific oligonucleotide for each fragment, it becomes possible to identify the majority of the sample more efficiently. 陽性プローブおよび陰性プローブのセットは、既知の配列に基づいて、各断片の普遍的セットから選択できる。 Set of positive probe and negative probe, based on the known sequence, can be selected from the universal set for each fragment. 陽性であると選択されるプローブは、通常、1つまたは数個のオーバーラップ基を形成でき、陰性プローブは全挿入部位に拡散する。 Probes selected as positive can usually form one or several overlapping groups, negative probe diffuses to the entire insertion site.

【0315】 本発明の技術は、YACクローンのマッピング過程の際にSTSsを同定するために使用できる。 [0315] The techniques of the present invention can be used to identify STSs when mapping process YAC clones. 約100個のYACクローンまたはYACクローンのプールについてSTSsの各々を試験することができる。 For pools of about 100 YAC clones or YAC clones can be tested each STSs. これら100の反応によって得られたDNAを1つのサブアレイにスポットする。 The DNA obtained by the reaction of 100 spots in one subarray. 異なるSTSsは逐次的なサブアレイであってもよい。 Different STSs may be a sequential sub-arrays. 数サイクルのハイブリダイゼーションにおいて、D In the hybridization of several cycles, D
NA試料の各々について、所定のYACクローン中に特定のSTSが存在するかどうかをある程度の信頼性をもって証明する、または証明しない識別特性が形成され得る。 For each NA samples, specific STS prove with a certain degree of reliability whether there is or proved not signature, in a given YAC clones can be formed.

【0316】 個々のPCR反応の数または個々のスポット試料の数を減らすために、それぞれ、数個のSTSsを1つの反応において同時に増幅してもよく、またはPCR [0316] To reduce the number of number or individual spot sample of each PCR reaction, respectively, may be amplified simultaneously in one reaction several STSs, or PCR
試料を混合してもよい。 Sample may be mixed. この場合には、1ドットあたりより多くのプローブがスコアリングされなければならない。 In this case, more probes per dot must be scoring. STSs貯蔵は貯蔵中のYACsとは独立しており、1つのYACsまたはYACsのプールに対して使用できる。 STSs storage is independent of the YACs during storage, it can be used for the pool of single YACs or YACs. 異なる色で標識したいくつかのプローブを一緒にハイブリダイゼーションする場合には、 When hybridization several probes labeled with different colors together,
この案は特に魅力的である。 This proposal is particularly attractive.

【0317】 試料中にDNA断片が存在するかどうかを確認する以外に、いくつかの別個のプローブまたはプローブの1つ以上のプールのハイブリダイゼーションの強度を使用してDNAの量を推定できる。 [0317] In addition to see if the DNA fragment is present in the sample, using a number of one or more of the intensity of hybridization of a pool of discrete probes or probes to estimate the amount of DNA. 得られた強度を既知量のDNAを有する対照試料の強度と比較することによって、スポットした全ての試料中のDNA量が同時に求められる。 By comparing the intensity of a control sample having a resultant intensity of a known amount of DNA, DNA of all samples spotted are determined simultaneously. DNA断片の同定にはほんの数プローブしか必要なく、塩基の長さがN塩基のDNAに使用できるプローブをN個と思われるので、本発明の用途では、任意のDNAセグメントを同定するのに十分なプローブは多くのセットを必要としない。 Without only a few probes for the identification of DNA fragments, the length of the base is likely a probe that can be used in the DNA of the N base is N, in the application of the present invention, sufficient to identify any DNA segment a probe does not require a lot of sets. 1000個の8-merから、平均で約30個の全長の対合プローブを1000bp断片のために選択できる。 From 1000 8-mer, the pairing probe of about 30 of the total length on average may be selected for the 1000bp fragment.

【0318】 実施例23 感染性病原生物およびそれらの変種の同定患者のウィルス、細菌、真菌および他の寄生性生物を検出するためのDNAに基づいた試験は、通常、他の方法より信頼性が高く、安価である。 [0318] Example 23 infectious organisms and viruses identified patient variants thereof, bacteria, the test based on DNA for detecting fungi and other parasites, typically, it is more reliable than other methods high, it is inexpensive. DNA試験の主要な利点は特定の菌株および変種を同定でき、最終的には、より効果的な治療を適用できる。 A major advantage of DNA tests can identify specific strains and variants, ultimately, it can be applied more effective treatment.

【0319】 細菌感染症において12種の既知の抗生物質耐性遺伝子が存在することはこれらの遺伝子を増幅することによって試験できる。 [0319] the 12 kinds of known antibiotic resistance genes in bacterial infections is present can be tested by amplifying these genes. 128人の患者の増幅産物を2 2 amplification products 128 patients
つのサブアレイにスポットし、次いで、12種の遺伝子の24のサブアレイを8 One of the sub-arrays spotted, then, the 24 sub-arrays of 12 genes 8
×12cmの膜で4回反復することができる。 × can be repeated 4 times with a film of 12cm. 各遺伝子について、陽性および陰性スコアリングのために12種のプローブを選択できる。 For each gene, it can be selected 12 kinds of probes for positive and negative scoring. ハイブリダイゼーションは3サイクルの条件で実施することができる。 Hybridization can be carried out in three cycles of conditions. これらの試験では、かなり小規模のセットのプローブが普遍的である可能性が最も高い。 In these tests, a significant small set probe is most likely to be universal. 例えば、1000個の8-merから、平均で30個のプローブが1000bpの断片では陽性であり、1 For example, from 1000 8-mer, 30 probesets on average were positive in fragments of 1000 bp, 1
0個の陽性プローブは信頼性の高い同定のためには通常十分である。 0 positive probe for reliable identification is usually sufficient. 実施例9に記載するように、いくつかの遺伝子を一緒に増幅および/またはスポットし、所定のDNA量を求めることができる。 As described in Example 9, several genes amplification and / or spotted together, it is possible to obtain a predetermined amount of DNA. 増幅した遺伝子の量は感染レベルの指標として使用することができる。 The amount of amplified gene may be used as an indicator of infection levels.

【0320】 別の例は、HIVウィルスの1つの遺伝子またはゲノム全体の配列決定の可能性に関係する。 [0320] Another example is related to the possibility of sequencing of one entire gene or genome of the HIV virus. 多様化の速さのために、このウィルスは最適な治療法の選択に多大な困難を呈する。 For speed diversification, the virus exhibits a great difficulty in the selection of the optimal therapy. 64人までの患者から単離したウィルス由来のDNA断片を増幅して、記載されている手法によって再度配列決定することができる。 From the patient up to 64 people to amplify DNA fragments from isolated virus, can be sequenced again by the technique described. 得られた配列に基づいて、最適な治療法を選択することができる。 Based on the obtained sequence, can be selected optimal therapy. 一方が(異型接合型の場合と同様の)基本配列を有する2種のウィルス種の混合物が存在する場合には、そのハイブリダイゼーションスコアを他の試料、特に基本的なウィルス種だけを含有する対照試料のスコアと定量比較することによって同定することができる。 If one is a mixture of the two viruses species is present with a (similar to the case of the heterozygous) basic sequence contains the hybridization scores of other samples, in particular by the basic viral species control it can be identified by scores of the sample and quantitative comparison. 試料中に存在する2種のウィルス種の一方の変異部位をカバーする3〜4つのプローブでは2倍程度のスコアが得られる(上記を参照)。 Scores about twice can be obtained in 3-4 single probes covering one mutation site of two virus types present in the sample (see above).

【0321】 実施例24 法医学的同定および親子の同定配列の多形性は個々のゲノムDNAを独自なものにしている。 [0321] The polymorphic Example 24 forensic identification and parent-child identification sequence are the ones own individual genomic DNA. これにより、犯罪現場から採取した血液または他の体液または組織の分析および犯罪容疑者の試料との比較が可能になる。 Thus, compared with the sample to be analyzed and criminal suspects taken from crime scenes blood or other body fluids or tissues it is possible. 多形部位が十分な数であれば試料の独自の識別特性を形成するようにスコアリングされる。 Polymorphic sites are scored to form a unique signature of a sample if a sufficient number. SBHは1つのヌクレオチド多形を容易にスコアリングしてこのような識別特性を生ずる。 SBH is generated such signatures readily scored one nucleotide polymorphisms.

【0322】 試料および容疑者由来の1セットのDNA断片(10〜1000)を増幅することができる。 [0322] it is possible to amplify a set of DNA fragments from the sample and suspects (10-1000). 1つの断片を提示する試料および容疑者由来のDNAsを1つまたはいくつかのサブアレイにスポットし、各サブアレイを4回複製することができる。 The DNAs from the sample and suspect presents one fragment was spotted in one or several sub-arrays, it can be replicated four times each subarray. 3サイクルで、12個のプローブが各DNA座について容疑者を含む試料の各々に対立遺伝子AまたはBが存在することを判定できる。 In three cycles, it can be determined that the twelve probe exists allele A or B in each of the sample containing suspect for each DNA locus. 試料および容疑者のパターンを対合させることにより、その犯罪の容疑者を発見することができる。 By the pattern of the sample and suspects pairing can be found suspects the crime.

【0323】 同じ手法を子供の親の正体の証明に適用することができる。 [0323] it is possible to apply the same approach to the certification of the children of the parents of identity. DNAを調製し、 DNA was prepared,
子供と大人由来の多形性を示す遺伝子座を増幅し;各々についてハイブリダイゼーションすることによって対立遺伝子AまたはBのパターンを求めることができる。 It can be obtained a pattern of allele A or B by hybridization for each; amplified loci exhibit pleomorphism from children and adults. 得られたパターン並びに陽性および陰性対照の比較は家族関係を決定する際の助力となる。 Comparison of the resulting pattern and positive and negative controls will be help in determining the family relationship. この場合には、同定には対立遺伝子の意義ある部分だけが一方の親と対合する必要がある。 In this case, the identification must be meaningful pairing only with one parent moiety alleles. 遺伝子座のスコアリング数が多いと、この手法の統計誤差またはデノボ変異の遮蔽効果の回避を可能にする。 When a large number of scoring locus, allowing avoidance of the shielding effect of the statistical error or de novo mutation of this approach.

【0324】 実施例25 集団または種の遺伝的多様性および生態学的地位の生物的多様性の評価かなりの数の遺伝子座(例えば、いくつかの遺伝子またはミトコンドリアDN [0324] Example 25 population or species genetic diversity and ecological biological diversity Evaluation significant number of loci status (e.g., several genes or mitochondrial DN
A全体)について対立遺伝子変異の頻度を測定することにより、1つの集団の遺伝子型、歴史および進化または疾患もしくは絶滅の可能性等に対する環境の影響に関する結果などの種々の種類の結果が得られる。 By measuring the frequency of A whole) for allelic variants, genotype one population, history and evolution or disease or of different types, such as results on the effects of the environment on extinction possibilities such results. 特定の既知の対立遺伝子を試験することによって、または小さな変異または環境における変異原の存在を明らかにすることができるデノボ変異を形成することができるようにいくつかの遺伝子座の全長を再度配列決定することによってこれらの評価を実施することができる。 By testing specific known alleles or small mutations or re sequencing the full length of several loci to be able to form a de novo mutation that can reveal the presence of mutagenic in the environment it is possible to carry out these evaluation by.

【0325】 または、リボソームRNAsの遺伝子または高度に保存されているタンパク質の遺伝子などの進化的に保存されているDNA配列を再度配列決定することによって、微生物界における生物多様性を調査することができる。 [0325] or by re-sequencing the DNA sequence is evolutionarily conserved, such as genes of proteins that are conserved ribosomal RNAs genes or highly, it is possible to investigate the biological diversity in microbial community . 環境からDNAを調製し、保存配列に対応するプライマーを使用して特定の遺伝子を増幅することができる。 DNA was prepared from the environment, it is possible to amplify a specific gene using the primers corresponding to conserved sequences. DNA断片は、好ましくは、プラスミドベクターにクローニングされる(または、マルチウェルプレートの1ウェルあたり1分子の濃度まで希釈され、次いで、インビトロで増幅される)。 DNA fragment is preferably cloned into a plasmid vector (or diluted to a concentration of 1 molecule per well in multiwell plates are then amplified in vitro). この方法で作製したクローンを上記のように再度配列決定することができる。 Clones were prepared by this method can be re-sequenced as described above. 2種類の情報が得られる。 Two types of information can be obtained. その最初として、異なる種の一覧表を形成することができると同時に、各種の個体の密度を規定することができる。 As its first, when it is possible to form a list of different species at the same time, it is possible to define the density of the various individuals. 別の情報を使用して、生態的因子または汚染が生態系に与える影響を測定することができる。 Using a different information can be ecological factors or pollution to measure the impact on the ecosystem. いくつかの種が根絶するかどうか、または種の発生量比が汚染によって変更されるかどうかが明らかになる。 Whether eradicate some species, or whether the apparent generation amount ratio of the seed is changed by the contamination. 本発明の方法はまた、化石のDNAsを配列決定するのに適用できる。 The method of the present invention is also applicable to sequence DNAs fossil.

【0326】 実施例26 核酸種の検出または定量基体に固定した未標識プローブまたは溶液中の標識プローブを含むプローブ対を使用して、DNAまたはRNA種を検出および定量することができる。 [0326] Using the probe pair comprising a labeled probe unlabeled probe or solution is fixed to the detection or quantification substrate of Example 26 nucleic acid species, it is possible to detect and quantify DNA or RNA species. 標識プローブおよびリガーゼの存在下で未標識プローブに暴露することによって種を検出および定量することができる。 It is possible to detect and quantify species by exposure to unlabeled probe in the presence of a labeled probe and a ligase. 具体的には、標識および未標識プローブの連結によって試料の核酸骨格に伸長プローブが形成されることは、検出対象の種が存在することを示す。 Specifically, the extender probe to the sample nucleic acid backbone by ligation of labeled and unlabeled probe is formed, indicating that the species to be detected are present. このように、未連結の標識プローブを除去後、基体上のアレイの特定の箇所に標識が存在することは試料の種の存在を示すと同時に、標識の定量は種の発現量を示す。 Thus, after removal of the labeled probe unconnected, at the same time indicate the presence of that sample species label is present on the particular location of the array on the substrate, quantification of the label indicates the expression level of species.

【0327】 または、1つ以上の未標識プローブを、溶液で導入する予定の1つ以上の標識プローブとの対の第1のメンバーとして基体上に配列することができる。 [0327] Alternatively, one or more unlabeled probes can be arranged on a substrate as a first member of the pair with one or more labeled probes that will be introduced in solution. 一方法によると、アレイ上の標識のマルチプレクシングは、識別可能な波長で蛍光を発する染料を使用して実施することができる。 According to one method, multiplexing of the label on the array may be carried out using a dye that fluoresces at a distinct wavelength. この方法では、アレイに適用されるcDNAと被同定種に特異的な標識および未標識プローブの対との混合物は、c In this method, a mixture of pairs of cDNA and the identified species-specific labeled and unlabeled probes applied to the array, c
DNA種の存在および発現量について調査することができる。 It can be investigated for the presence and expression of DNA species. 好ましい実施態様によると、本発明の方法を実施して、被検出cDNAの配列とオーバーラップする配列を含む未標識および標識プローブ対を選択することによって、cDNAs According to a preferred embodiment, to implement the method of the present invention, by selecting the unlabeled and labeled probe pairs including the sequences that overlaps that of the detected cDNA, cDNAs
の一部を配列することができる。 It can be arranged a part of.

【0328】 プローブを選択して、標的病原生物ゲノムにのみ組み合わせた状態で存在する選択されたプローブ対を組成物中に含むことによって、特定の病原生物ゲノムの存在を検出し、定量することができる。 [0328] Select the probe, by including a selected probe pair is present in a combined state only to the target pathogenic organisms genome in the composition to detect the presence of a particular pathogenic organism genome, it is quantified it can. このように、1つのプローブ対は必ずしも病原生物ゲノムに特異的でなくてもよいが、対の組み合わせは特異的である。 Thus, it may be one probe pair not necessarily specific to pathogenic organisms genome, but the combination of the pair is specific.
同様に、cDNAsを検出または配列決定する際には、特定のプローブがcDN Similarly, when detecting or sequencing cDNAs are specific probe cDN
Asまたは他の種類の種に特異的ではないことが生じるかもしれない。 It may occur that not specific for As, or other types of species. にもかかわらず、特定の種の存在および定量は、別個のアレイ位置に選択されたプローブの組み合わせが配置されるということが特定の種の存在を示すという結果によって判定される。 Nevertheless, the presence and quantification of specific species that that a combination of probes selected discrete array locations are arranged is determined by the result that indicates the presence of a particular species.

【0329】 約10kb以上のDNAを有する感染菌は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) [0329] Infection bacterium having about 10kb or more of DNA, polymerase chain reaction (PCR)
または他の標的増幅手法を使用しないで、支持体結合検出チップを使用して検出することができる。 Or not use other target amplification methods, it can be detected using support-bound detection chip. 他の方法によると、細菌およびウィルスを含む感染菌のゲノムは、PCRによって1つの標的ヌクレオチド配列を増幅し、標的配列に特異的な標識プローブのハイブリダイゼーションによって標的の存在を検出することによってアッセイされる。 According to another method, the genome of infectious bacteria including bacteria and viruses, PCR by amplifying a single target nucleotide sequence, be assayed by detecting the presence of a target by hybridization of labeled probes specific to the target sequence that. このようなアッセイは1つの標的配列だけに特異的であるために、検出可能なシグナルとなる十分な標的を提供するために、PCRなどの方法によって遺伝子を増幅することが必要である。 For such assays are specific for only one target sequence, in order to provide sufficient target of a detectable signal, it is necessary to amplify the genes by a method such as PCR.

【0330】 この実施例によると、関心のある感染菌に特異的な多重の異なる固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを含む固相検出チップが調製される、フォーマット3-型反応による感染菌に特徴的なヌクレオチド配列を検出する改善され た方法が提供される。 [0330] Features According to this embodiment, solid phase detection chip including an array of specific multiple different immobilized oligonucleotide probes infected bacteria of interest are prepared, the infectious material in the format 3 type reaction improved method for detecting a nucleotide sequence is provided. 標的核酸に相補的な多くの未標識プローブの混合物を含む1つのドットは、1つの位置における種に特異的な標識を濃縮しており、それによって拡散またはシングルプローブ標識法よりも感度が改善される。 One dot comprising a mixture of complementary many unlabeled probe to the target nucleic acid is to concentrate the specific labeled species in a single position, the sensitivity is improved than diffusion or a single probe labeling whereby that. このような多重プローブは標的ヌクレオチド配列のオーバーラップ配列であってもよいが、 Such multiple probes may be overlapping sequences of the target nucleotide sequence,
非オーバーラップ配列並びに非隣接配列であってもよい。 It may be non-overlapping sequences as well as non-adjacent sequences. このようなプローブは、好ましくは、約5〜12のヌクレオチド長を有する。 Such probes preferably have a nucleotide length of about 5-12.

【0331】 試料中に存在するプローブアレイおよび標的配列に暴露された核酸試料は多重固定プローブとハイブリダイゼーションする。 [0331] The nucleic acid sample is exposed to a probe array and the target sequence present in the sample to multiple fixed probe hybridization. ついで、固定プローブに隣接する標的配列に特異的に結合するように選択された多重標識プローブのプールを試料と共に未標識オリゴヌクレオチドプローブ混合物のアレイに適用する。 Then, the pool of selected multiply labeled probes to specifically bind to the target sequence adjacent to a fixed probe is applied to an array of unlabeled oligonucleotide probe mixture together with a sample. 次いで、 Then,
リガーゼ酵素をチップに適用して、隣接プローブを試料に連結する。 The ligase enzyme is applied to the chip, connecting the adjacent probe to the sample. 次いで、検出チップを洗浄して、プローブと試料核酸のハイブリダイゼーションしなかったものおよび連結しなかったものを除去して、標識の有無によって試料核酸の存在を求めることができる。 Then washed detection chip, to remove those that did not and those linked unhybridized probe and sample nucleic acids can be used to determine the presence of a sample nucleic acid by the presence or absence of the label. この方法は試料薬剤のモル濃度が約1000倍低下した信頼性の高い試料検出法を提供する。 This method provides a sample detection method reliable to achieve a molar concentration in the sample drug was reduced approximately 1000 fold.

【0332】 本発明のさらに別の態様として、それ自体発色多重標識、酵素多重標識または放射性多重標識を含む、またはそれ自体、多重標識されているさらに別のプローブ剤による特異的な結合を受けやすい遊離プローブと共通の末端を提供するなどによって標識プローブシグナルを増幅することができる。 [0332] In yet another aspect of the present invention, per se chromogenic multiple labeling comprises an enzyme multiple or radioactive multiple labeling, or itself, subject to specific binding according to yet another probe agent is multiply labeled it is possible to amplify the labeled probe signals, such as by providing the free probe common terminal. この方法では、第2回目のシグナル増幅を実施することができる。 In this way, it is possible to carry out the second round of signal amplification. 標識または未標識プローブを第2回目の増幅に使用することができる。 The labeled or non-labeled probe can be used for the second round of amplification. この第2回目の増幅では、多重標識を有するDNA試料が長いと増幅強度シグナルが10〜100倍増加し、総増幅シグナルは100,000倍となる。 In the second round of amplification, the amplification intensity signal as the DNA sample with a multiple labeling is long increases 10 to 100 times, the total amplification signals becomes 100,000 times. この実施例の両態様を使用することにより、約10 The use of both aspects of this embodiment, about 10
0,000倍の強度シグナルによってプローブ-DNA連結の陽性の結果を得る ことができる。 It can be obtained a positive result of the probe -DNA linked by 0,000 times the intensity signal.

【0333】 本発明のさらに別の態様により、完全なセットのプローブ、例えば4096個の6-merプローブからなるアレイまたはスーパーアレイを作製することができる。 [0333] According to yet another aspect of the present invention, a complete set of probes can be prepared, for example, an array or super array consisting of 4096 6-mer probes. この種類のアレイは、任意の核酸種の同定、または一部には任意の核酸種の配列決定を完成することができるという意味において普遍的である。 This type of array, the identification of any nucleic acid species, or in part is universal in the sense that it is possible to complete the sequencing of any nucleic acid species. アレイ中の個々のスポットは1つのプローブ種またはプローブの混合物、例えば、1つの反応で合成されるN(1-3)B(4-6)N(1-3)種の混合物を含有してもよい (Nは4ヌクレオチド全てを示し、Bは1つの特異的なヌクレオチドを示し、関連する数字は塩基の数の範囲である、すなわち、1-3は「1〜3個の塩基」を 意味する。)これらの混合物は、同じ長い核酸種分子の異なる部分からシグナルを採取することにより、低濃度で存在する核酸種のより強い信号を提供する。 Individual spots mixture of one probe species or probes in the array, for example, N (1-3) synthesized in one reaction B (4-6) N (1-3) contain a mixture of species which may (N represents all four nucleotides, B represents a single specific nucleotide, relevant numbers in the range of number of bases, i.e., 1-3 mean "1-3 base" to.) these mixtures, by collecting signals from different parts of the same long nucleic acid species molecule, provides a stronger signal of the nucleic acid species present in low concentrations. 普遍的なセットのプローブは多数のサブセットに小分割され、ハイブリダイゼーション緩衝液の拡散を防止するバリアによって分離されたユニットアレイとして試料および標識プローブとともにスポットされる。 Probe universal set is subdivided into a number of subsets, spotted with a sample and the labeled probes as a separate unit array by the barrier which prevents the diffusion of hybridization buffer.

【0334】 既知の配列を有する核酸種を同定するために、未標識固定プローブおよび標識プローブ溶液の両者を含む1種以上のオリゴヌクレオチド配列を選択することができる。 [0334] To identify the nucleic acid species having a known sequence, can be selected one or more oligonucleotide sequence including both unlabeled immobilized probe and the labeled probe solution. 標識プローブを合成するか、または予め合成しておいた完全なセットの例えば、7-merから選択する。 Or to synthesize labeled probes, or for example, pre-synthesized and complete set had to select from 7-mer. リガーゼの添加の結果、プローブが共有結合されるように、固定および標識プローブの対を標的配列に隣接してハイブリダイゼーションするように、標識プローブを対応するユニットアレイの固定プローブに添加する。 Result of the addition of ligase, as the probe is covalently attached, a pair of fixed and labeled probes to hybridize adjacent to the target sequence, adding a labeled probe to a fixed probe corresponding unit array. ユニットアレイが、所定の核酸種において陽性である(分離されたスポットとして、または同じスポット内で)2つ以上の固定プローブを含有する場合には、 If unit array is positive in a given nucleic acid species (as isolated spots, or in the same spot) containing two or more fixed probe,
全ての対応する標識プローブを同じユニットアレイに混合および添加することができる。 It can be mixed and added to all corresponding labeled probe in the same unit array. 核酸種の混合物を試験する場合には、標識プローブの混合物がさらにより重要である。 When testing a mixture of nucleic acid species mixture is even more important in the labeled probe. 核酸種の複雑な混合物の一例は1つの細胞または組織中のmRN An example of a complex mixture of nucleic acid species in a single cell or mRN in tissue
Asである。 Is As.

【0335】 本発明の一実施態様によると、固定プローブのユニットアレイにより、全ての可能な固定プローブと比較的小数の標識プローブの溶液を使用することができる。 [0335] According to one embodiment of the present invention, the unit arrays of immobilized probe may be used a solution of a relatively small number of labeled probes and all possible fixed probe. マルチプレックス標識法を実施する場合には、標識プローブのさらに複雑な溶液を使用することができる。 When performing multiplex labeling method can be used more complex solution of the labeled probe. 好ましいマルチプレクシング方法は異なる蛍光染料または質量分析計で分離できる分子量標識を使用することができる。 Preferred multiplexing method may be used a molecular weight marker that can be separated with a different fluorescent dye or mass spectrometer.

【0336】 または、本発明の好ましい実施態様によると、多数の核酸配列に高頻度でハイブリダイゼーションする比較的短い固定プローブを選択することができる。 [0336] or, according to a preferred embodiment of the present invention, it is possible to select a relatively short fixed probe that hybridize at high frequency in a number of nucleic acid sequences. このような短いプローブを、少なくとも1つの標識プローブが固定プローブの各々に対応するように作製することができる標識プローブの溶液と併用して使用する。 Such short probes, used in combination with a solution of labeled probe capable of at least one labeled probe is prepared so as to correspond to each of the fixed probe.
好ましい溶液は、標識プローブのどれも2つ以上の固定プローブに対応しないものである。 Preferred solutions are those none of labeled probe does not correspond to the two or more fixed probe.

【0337】 実施例27 全ての可能な10-merを用いたHIVウィルスセグメントの審問フォーマットIII SBHのこの実施例では、全ての可能な結合5-mer(1 [0337] Example 27 In this embodiment of the hearing format III SBH the HIV virus segments using all possible 10-mer, all possible binding 5-mer (1
024個の可能なペンタマー)のアレイをナイロン膜(例えば、ジーンスクリーン(Gene Screen))上に作製した。 024 possible pentamer) array nylon membranes (e.g., Gene Screen (Gene Screen) was fabricated on). 5'-TTTTTT-NNN-3 '(N=4種全ての塩基A、C、G、Tで、反応のこの段階では、等しいモル両の4種全ての塩基を添加する)の5'末端を有する結合5-merオリゴヌクレオチドを合成する。 5'-TTTTTT-NNN-3 '(N = 4 kinds all bases A, C, G, at T, at this stage of the reaction, equal addition of all four bases in molar carriages) 5' end binding 5-mer oligonucleotide having synthesized. これらのオリゴヌクレオチドをナイロン膜に正確にスポットし、 These oligonucleotides accurately spot to a nylon membrane,
スポットを乾燥させ、UV光線で乾燥させたスポットを処理することによってオリゴヌクレオチドを固定した。 Dried spot was fixed oligonucleotides by treating the spots were dried in UV light.

【0338】 アレイ中のサブアレイを、各サブアレイが隣接サブアレイによる交差汚染をうけることなく、ハイブリダイゼーションすることを可能にする疎水性ストリップのような物理的バリアによって互いに分配される。 [0338] The sub-arrays in the array, each sub-array without receiving cross contamination by adjacent subarrays are dispensed together by physical barriers such as hydrophobic strip that allows hybridization. 好ましい実施態様において、 In a preferred embodiment,
疎水性ストリップは適当な(このような溶媒は当技術上周知である)溶媒中でシリコーン溶液(例えば、家庭用シリコーンのりおよびシールのり)から作製される。 Hydrophobic strip suitable (such solvents are well known in the art) are made of silicone solution in a solvent (e.g., household silicone glue and seal glue). シリコーングリースのこの溶液をサブアレイ間に適用して、溶媒留去後に細胞を分離する疎水性ストリップとして作用するラインを形成する。 The solution of the silicone grease is applied between the sub-arrays, to form a line that acts as a hydrophobic strip to separate cells after solvent evaporation.

【0339】 このフォーマットIIIの例では、遊離または溶液(未結合)5-めcrsを 5'-NN-3'(N=は4種全ての塩基A、C、G、T)の3'末端を用いて合成した。 [0339] In the example of this format III, the 3 'end of the (N = the all four bases A, C, G, T)' free or solution (unbound) 5-fit crs the 5'-NN-3 It was synthesized using. この実施態様において、遊離の5-merおよび結合5-merを組み合わせて、20kbより少ない既知のDNA配列を配列決定するために可能な全ての10 In this embodiment, a combination of free 5-mer and bonds 5-mer, all possible to sequence the known DNA sequence less than 20 kb 10
-merを作製する。 To produce a -mer. 20kbの2本鎖を40kbの1本さDNAに変性する。 The two strands of 20kb denatured single Is DNA of 40 kb. この40kbのss DNAは全ての可能な10-merの約4%とハイブリダイゼーションする。 The ss DNA of 40kb to about 4% and hybridization of all possible 10-mer. 10-mer結合配列および既知の標的配列の低い頻度により、配列情報を損失することなく、各サブアレイを処理するための遊離または溶液(未結合) The low frequent 10-mer binding sequence and a known target sequence, without loss of sequence information, free or solutions for processing each subarray (unbound)
5-merをプールすることが可能になる。 The 5-mer becomes possible to pool. 好ましい実施態様において、16のプローブを各アレイについてプールし、すべの可能な5-merを遊離の5-merの合計6 In a preferred embodiment, the 16 probes were pooled for each array, a total of 5-mer free the possible 5-mer of all 6
4のプールで表わす。 Represented by 4 of the pool. 従って、全ての可能な10-merを、1024個のサブアレイを使用してDNA試料に対してプローブ化することができる(遊離の5-merの各プールについて16サブアレイ)。 Thus, all possible 10-mer, it is possible to probe against DNA sample using the 1024 sub-arrays (16 subarrays for each pool of free 5-mer).

【0340】 この実施態様における標的DNAはHIVウィルスの2つの600bpセグメントを示す。 [0340] Target DNA in this embodiment shows two 600bp segment of the HIV virus. これらの600bpセグメントは60のオーバーラップする30-m These 600bp segments overlap of 60 30-m
erのプールによって示される(30-merが20ヌクレオチドごとに各隣接30-m Represented by er pool (30-mer each adjacent to each 20 nucleotides 30-m
erとオーバーラップする)。 er and overlap). 30-merのプールは、当技術上周知の技法を使用して処理して標的DNAを切断、消化および/またはランダムPCRして、非常に小さいの断片のランダムプールを作製した標的DNAに類似している。 Pool 30-mer is processed using those known in the art techniques to cleave the target DNA, digestion and / or by random PCR, similar to the target DNA, generated random pool of very small fragments ing.

【0341】 先のフォーマットIIIの例に上記するように、遊離の5-merを放射性同位体、ビオチン、蛍光染料等で標識する。 [0341] As described above in the example of the destination format III, radioisotopes free 5-mer, biotin, labeled with a fluorescent dye. 標識した遊離5-merを結合5-merと共に標的DNAにハイブリダイゼーションし、連結する。 Labeled free 5-mer with coupling 5-mer hybridizes to the target DNA, ligated. 好ましい実施態様において、 In a preferred embodiment,
300〜1000単位のリガーゼを反応液に添加する。 The 300-1000 units of ligase added to the reaction solution. ハイブリダイゼーション条件は、先の実施例の技法に準じて実施した。 Hybridization conditions were carried out according to the techniques of the previous examples. 標的DNAおよび過剰の遊離のプローブを連結し、除去後、(上記の実施例に記載する技法を使用して)アレイをアッセイして、標識プローブの位置を決定する。 Connecting the probe of target DNA and excess free, after removal, and assayed (using the techniques described in the above examples) array to determine the position of the labeled probe.

【0342】 各サブアレイ中の標的の既知のDNA配列、並びに既知の遊離および結合5-m [0342] Known DNA sequence of the target in each subarray, as well known free and bound 5-m
erは、どの結合5-merが各サブアレイ中の標識遊離5-merに連結するかを予測する。 er predicts what bond 5-mer is linked to a label free 5-mer in each subarray. これらの予測ドットの20由来のシグナルは損失し、予測配列由来の標的D 20 from the signals of these predictions dot loss, target D from the predicted sequence
NA中の各変化について20の新たなシグナルが得られる。 New signals 20 for each change in the NA can be obtained. これらの10の新たなドットにおける結合5-merのオーバーラップ配列は、どの遊離の標識5-merが各新たなドット中に結合するかを同定する。 Overlapping sequences of binding 5-mer in the new dots of these 10 identify which free labeled 5-mer binds in each new dot.

【0343】 上記の方法を使用して、遊離の標識5-mer、試験HIVDNA配列のアレイおよびプールに全ての可能な10-merをプローブ処理する。 [0343] Using the above method, the free labeled 5-mer, probe handle all possible 10-mer array and a pool of test HIVDNA sequence. このフォーマットII This format II
I方法を使用して、本発明社らは、試験したセグメントの「野生型」配列並びにこれらの配列に導入されたいくつかの配列「変異体」を正しく同定した。 Using I method, the present invention, Inc. We have correctly identified the "wild type" sequences and some sequences "variant" introduced into these sequences segments tested.

【0344】 実施例28 反復DNA配列の配列決定位置実施態様において、標的DNAにおける反復DNA配列を改良したフォーマットIII方法における「スペーサーオリゴヌクレオチド」を用いて配列決定する。 [0344] In sequencing position embodiment of Example 28 repeated DNA sequences and sequenced using "spacer oligonucleotide" in format III method with improved repetitive DNA sequence in the target DNA. 種々の長さの反復DNA配列のスペーサーオリゴヌクレオチド(反復配列は1回めのSBH操作で同定される)を、第1の既知の隣接するオリゴヌクレオチドおよび第2の既知のまたはスペーサーの他方の端に隣接する可能なオリゴヌクレオチドの群(1回めのSBH操作により周知)とともに標的DNAにハイブリダイゼーションする。 Various lengths of repetitive DNA sequences of spacer oligonucleotides (repeat sequence is identified by SBH operations Me once), the first known adjacent oligonucleotides and second known or the other end of the spacer hybridizing the target DNA with the group of possible oligonucleotides flanking (known by first SBH operation) to. 反復DNAセグメントの長さに一致するスペーサーを標的にハイブリダイゼーションする場合、2つの隣接するオリゴヌクレオチドをスペーサーに連結することができる。 If the spacer that matches the length of the repetitive DNA segments hybridized to the target, two adjacent oligonucleotides can be linked to the spacer. 第1の既知のオリゴヌクレオチドを基体に固定し、第2の既知の、または可能なオリゴヌクレオチドを標識する場合には、適切な長さのスペーサーが標的DNAにハイブリダイゼーションするときに、標識した第2の既知のまたは可能なオリゴヌクレオチドを含む結合連結産物を形成する。 The first known oligonucleotide is fixed to the substrate, when the second of the known or possible oligonucleotide labeling, when the spacer of appropriate length is hybridized to the target DNA, the labeled to form a bond ligation product comprising 2 known or possible oligonucleotides.

【0345】 実施例29 フォーマットIIISBHを用いた分岐点による配列決定一実施態様において、標的DNA中の分岐点を、第3のセットのオリゴヌクレオチドと改良フォーマットIII方法を使用して配列決定する。 [0345] In sequencing one embodiment by the branch point with Example 29 format IIISBH, the branch point in the target DNA, sequencing using a third set of oligonucleotides with improved formatting III methods. 1回目のSBH 1 round of SBH
操作の後に、配列がコンパイルされるときに、いくつかの分岐点を同定することができる。 After the operation, when the sequence is compiled, it is possible to identify several branch points. 分岐点に至る既知の配列の1つと部分的にオーバーラップするオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、次いで、標識され、分岐点を生ずる配列の1つに相当する追加のオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイゼーションすることによってこれは解決される。 The one partially overlapping oligonucleotides of known sequence leading to the branch point and hybridization, then labeled and hybridized additional oligonucleotides corresponding to one of the sequences causing the branch point to the target that This is solved by. 適切なオリゴヌクレオチドが標的DNA Appropriate oligonucleotide target DNA
にハイブリダイゼーションされると、標識オリゴヌクレオチドは他と連結することができる。 Once hybridized, the labeled oligonucleotide can be linked to other. 好ましい実施態様において、1から数ヌクレオチドごとに分岐点からオフセットされる第1のオリゴヌクレオチドを選択し(分岐配列の1つに読み込まれるように)、第1の配列から分岐点の配列に読み込まれる第2のオリゴヌクレオチドを選択し、1から数ヌクレオチドごとに分岐点の配列のオーバーラップを有する全ての可能な分岐配列に対応する第3のオリゴヌクレオチドのセット(第1のオリゴヌクレオチドに対応する)を選択する。 In a preferred embodiment, it is read into the first (as read in one of the branches sequence) oligonucleotides select the sequence of the branch point from the first sequence is offset from the branch point from 1 every few nucleotides selects the second oligonucleotide (corresponding to the first oligonucleotide) third set of oligonucleotides corresponding to all possible branching sequences with overlapping sequences of the branch point every few from 1 nucleotide to select. これらのオリゴヌクレオチドを標的DNAにハイブリダイゼーションし、適切な分岐配列を有する第3のオリゴヌクレオチド(第1のオリゴヌクレオチドの分岐配列と一致する)だけが第1および第2のオリゴヌクレオチドとの連結産物を産生する。 These oligonucleotides hybridized to the target DNA, ligation product of the third oligonucleotide (the first coincides with the oligonucleotide branch sequence) by the first and second oligonucleotide having an appropriate branching sequence the produce.

【0346】 実施例30 標的核酸を分析するためのマルチプレクシングプローブこの実施例において、セットの各プローブがセット中の他のプローブから識別されるように、プローブのセットを異なる標識で標識する。 [0346] In multiplexing probe this embodiment for analyzing Example 30 target nucleic acids, such that each probe in the set is identified from the other probes in the set are labeled probe sets with different labels. 従って、プローブセットを、任意のプローブ情報を損失することなく、1つのハイブリダイゼーション反応において標的核酸と接触させることができる。 Accordingly, the probe set, without loss of any probe information, can be contacted with the target nucleic acid in one hybridization reaction. 好ましい実施態様において、異なる標識は異なる放射性同位体または異なる蛍光標識または異なるEMLs In a preferred embodiment, different labels are different radioactive isotopes, or different fluorescent labels or different EMLs
である。 It is. これらのプローブセットをフォーマットI、フォーマットIIまたはフォーマットIIISBHにおいて使用することができる。 These probe sets format I, can be used in the format II or format IIISBH.

【0347】 フォーマットISBHにおいて、異なるように標識したプローブセットを完全な対合と1塩基対の誤対合とを識別できる条件下で基体に固定した標的核酸にハイブリダイゼーションする。 [0347] In the format ISBH, it hybridizes to differently labeled target nucleic acids immobilized to a substrate under conditions of probe set capable of identifying a mismatch of perfect match and single base pair. 標的核酸に結合する特異的プローブは、異なる標識によって同定され、完全な対合は、少なくとも一部には、この結合情報によって判定される。 Specific probes that bind to the target nucleic acid is identified by different labels, perfect match, at least in part, be determined by the binding information.

【0348】 フォーマットIISBHにおいて、標的核酸を異なるプローブで標識して、プローブアレイにハイブリダイゼーションする。 [0348] In the format IISBH, labeling the target nucleic acid at different probe, hybridizes to the probe array. プローブに結合する特異的な標的核酸は、これらの異なる標識によって同定され、完全な対合は、少なくとも一部には、この結合情報によって判定される。 Specific target nucleic acid to bind to the probe are identified by these different labels, perfect match, at least in part, be determined by the binding information.

【0349】 フォーマットIIISBHにおいて、異なるように標識したプローブセットおよび固定プローブを完全な対合と1塩基対の誤対合とを識別できる条件下で標的核酸にハイブリダイゼーションする。 [0349] In the format IIISBH, hybridize to the target nucleic acid under conditions capable of identifying and mismatch of differently labeled probe sets and the fixed probe perfect match and single base pair. 標識上で、固定プローブに隣接する標識プローブを固定プローブに結合し、これらの産物を検出し、異なる標識によって識別する。 Labeled on bind the labeled probe adjacent to the fixed probe to a fixed probe, to detect these products, identified by different labels.

【0350】 好ましい実施態様において、異なる標識は、電子捕獲型質量分析計(EC- MS)で検出することができるEMLsである。 [0350] In a preferred embodiment, different labels are EMLs which can be detected by electron capture mass spectrometer (EC- MS). EMLsは、ある種の芳香族骨格が特に好ましい種々の骨格分子から作製される。 EMLs that certain aromatic skeleton is made of particularly preferred variety of scaffold molecule. 例えば、Xuら、J. For example, Xu et al., J. Chr Chr
omatog. omatog. 764:95-102(1997)を参照。 764: reference 95-102 (1997). EMLは可逆的で安 定な方法で結合され、プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションされると、 EML is coupled in a reversible and stable way, when the probe is hybridized to the target nucleic acid,
EMLはプローブから除去され、標準的なEC-MS(例えば、EC-MSはガスクロマトグラフ-質量分析計によって実施される)によって同定される。 EML is removed from the probe, the standard EC-MS (e.g., EC-MS gas chromatography - is carried out by the mass spectrometer) are identified by.

【0351】 実施例31 低頻度標的核酸の検出フォーマットIII SBHは、サンプル中に類似の配列の99対1の割合で存在する、1個のヌクレオチドが異なる配列を同定する十分な識別力を有する。 [0351] Detection format III SBH Example 31 infrequent target nucleic acid is present in 99 to 1 ratio of similar sequences in the sample with sufficient discriminatory power for one nucleotide to identify different sequences.
したがって、フォーマットIIIは核酸サンプル、例えば血液由来のサンプル中に、非常に低濃度で存在する核酸を同定するために用いることができる。 Therefore, the format III nucleic acid sample, in a sample from example blood, may be used to identify nucleic acids present at very low concentrations.

【0352】 一つの態様において、2つの配列は嚢胞性線維症の配列であり、これらは互いに3個のヌクレオチド欠失により異なっている。 [0352] In one embodiment, the two sequences are sequences of cystic fibrosis, they are different by three nucleotide deletion with each other. 2つの配列のプローブは以下の通りであった。 Probe Two sequences were as follows. 野生型からの欠失を識別するプローブは基質に固定されており、 Probe for identifying a deletion from the wild-type is fixed to the substrate,
標識した近接プローブは両方に共通であった。 Labeled proximal probe was common to both. これらの標的およびプローブを用いて、欠失突然変異体が野生型の99分の1で存在する場合に、これをフォーマットIII SBHにより検出することができた。 Using these targets and probes, when the deletion mutant is present in a 99 minute wild-type were able This is detected by the format III SBH.

【0353】 実施例32標的核酸を分析するためのポラロイド器具および方法 核酸を分析するための器具を、2つの核酸アレイと、2つのアレイの核酸の混合が望まれるまで混合しないようにする任意の物質とを用いて構成することができる。 [0353] The device for analyzing a Polaroid instruments and methods a nucleic acid for analyzing the Example 32 target nucleic acid, and two nucleic acid array, any that do not mix until mixing of the two arrays nucleic acid is desired it can be constructed by using a material. 器具のアレイは、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレン、または前述の他の物質を含む様々な基質で支持することができるが、これらに制限されることはない。 Array instrument, a nylon membrane, nitrocellulose membrane, or can be supported in a variety of substrates including the aforementioned other substances, but is not limited thereto. 好ましい態様において、基質の一つは疎水性ストリップにより複数のセクターに分けられた膜、またはゲルもしくはスポンジを含むウェルを備える適当な支持物質である。 In a preferred embodiment, one substrate is a suitable support material comprising a well containing membrane or gel or sponge, divided into a plurality of sectors by hydrophobic strips. この態様において、プローブは膜のセクター上、 In this embodiment, the probe membrane on the sector,
またはウェル、ゲル、もしくはスポンジ中に位置し、溶液(標的核酸を含む、または含まない)を膜またはウェルに加えてプローブを可溶化する。 Or well, a gel, or located in the sponge solution (containing the target nucleic acid, or without) a solubilizing a probe in addition to the film or well. 次いで、可溶化したプローブを含む溶液を第二の核酸アレイに接触させる。 Then contacted with a solution containing a probe solubilized in a second nucleic acid array. この核酸はオリゴヌクレオチドプローブまたは標的核酸でもよいが、これらに制限されることはなく、プローブまたは標的核酸は標識されていてもよい。 The nucleic acid can be an oligonucleotide probe or target nucleic acid, but these not to be limited, the probe or target nucleic acid may be labeled. 核酸は、放射性同位体、 The nucleic acid, radioactive isotopes,
蛍光標識またはエレクトロフォアマス標識を含む当技術分野において通常用いられるいかなるラベルで標識されていてもよいが、これらに制限されることはない。 Fluorescent label or electroporation fore mass label may be labeled with any label conventionally used in the art, including, but not limited thereto.

【0354】 核酸の混合を妨げる物質は、物質を除去した時に2つのアレイの核酸が混合するような方法で、2アレイ間に配置することができる。 [0354] agents that interfere with mixing of the nucleic acids can be in such a way nucleic acids of the two arrays are mixed when material was removed and placed between two arrays. この物質はシート、膜、 This material sheet, film,
または他の障壁の形でもよく、また、この物質は拡散の混合を妨げるいかなる物質からなっていてもよい。 Or other may be in the form of barriers, also, the material may consist of any material that prevents mixing of diffusion.

【0355】 この器具は下記の通りフォーマットI SBHにおいて用いることができる。 [0355] The instrument can be used in as format I SBH below.
すなわち、器具の第一のアレイは基質に固定された標的核酸を有し、器具の第二のアレイは標識された核酸プローブを有していて、除去すると第一アレイの核酸に応答指令信号を送ることができる。 That is, the first array of instruments have target nucleic acid is fixed to the substrate, a second array of instruments have a labeled nucleic acid probe, interrogate nucleic first array is removed it can be sent. 2つのアレイは、プローブが標的核酸と接触するのを妨げる物質のシートにより任意に分離されており、シートを除去するとプローブが標的に応答指令信号を送ることができる。 Two arrays, probes are optionally separated by a sheet of material that prevents the contact with the target nucleic acid, probes and removal of the sheet can interrogate a target. 適当なインキュベーションと、(任意の)洗浄段階の後、標的アレイを「読み取り」、どのプローブが標的と完全な対を形成したかを調べることができる。 And appropriate incubation, it is possible to determine the formation of the (optional) After washing step, "read" the target array, which probes the target and full pairs. この読み取りは自動化することもでき、または手動で(例えば、オートラジオグラムを用いた目による読み取り)実施することもできる。 The reading can also be automated, or manually (e.g., reading by eye using an autoradiogram) may also be implemented. フォーマットII SBHでは、以下の手順は標的を標識し、プローブを固定する他は、前述の手順と同様であろう。 In format II SBH, following procedures to label the target, another for fixing the probe would be similar to the above procedure.

【0356】 または、器具は下記の通りフォーマットIII SBHにおいて用いることができる。 [0356] Alternatively, the instrument can be used in as format III SBH below. すなわち、核酸プローブの2アレイを形成し、いずれか、または両方のアレイの核酸プローブを標識してもよく、アレイの一方をその基質に固定してもよい。 That is, to form a 2 array of nucleic acid probes, either, or may be labeled nucleic acid probes of both arrays may be fixed to one of the array to the substrate. 2アレイはプローブを混合しないようにする物質のシートで分離する。 2 array are separated by a sheet of material to prevent mixing probe. フォーマットIIの反応を、標的核酸を加え、シートを除去してプローブをお互いに、および標的と混合させることにより、開始する。 The reaction format II, the target nucleic acid was added, to each other probe to remove the sheet, and by mixing with the target to start. 標的の隣接する部位に結合するプローブは相互に結合し(例えば、塩基積み重ね相互作用または骨格の共有結合による連結により)、結果を読み取ってどのプローブが隣接部位の標的に結合しているかを調べる。 Probes that bind to adjacent sites of a target bind to each other (e.g., by covalent linkage of base stacking interactions or backbone), which probe reads the result is checked whether the binding to the target adjacent region. 一組のプローブを基質に固定する場合、固定したアレイを読み取って、もう一方のアレイのどのプローブが固定したプローブと結合するかを調べることができる。 A set of probes when fixing to a substrate, reading the fixed array, it is possible to determine binding with a probe which probes the other array has been fixed. 前述の方法と同様に、この読み取りは自動化(例えば、ELISA読みとり機を用いて)してもよく、または手動で(例えば、オートラジオグラムを用いた目による読み取り)実施することもできる。 As with the previous method, this reading is automated (e.g., using an ELISA reader) may be, or manually (e.g., reading by eye using an autoradiogram) may also be implemented.

【0357】 実施例33 プローブの3次元アレイ好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブを3次元アレイに固定する。 [0357] In the three-dimensional array preferred embodiment of Example 33 probe, to secure the oligonucleotide probes in a three-dimensional array. 各層が他の層とは別個に、間隔をおいて分析され、または3次元アレイの層の全てが同時に分析されるように、3次元アレイは多数の層を含む。 Independently of each layer and other layers, so that all the layers of the analyzed intervals or three-dimensional array, are analyzed simultaneously, the three-dimensional array includes a number of layers. これらの3次元アレイには、例えば、プローブがくぼみの異なる深さの位置に配置される多数のくぼみを有する基体に配置されたアレイ(各レベルはくぼみの同じ深さの位置のプローブから作られる);または、プローブがくぼみの底部、くぼみを分離するピーク部またはピークとくぼみをくみあわせたところに配置される異なる深さのくぼみを有する基体に配置されたアレイ(各レベルはある種の深さの全てのプローブから作られる);または、層を形成して3次元アレイを形成する多数のシートを含む基体に配置されたアレイを含む。 These three-dimensional arrays, for example, be made from a number of arrays arranged in the base body having a depression (probe position of the same depth of each level depression the probe is placed at different depths of the position of the depression ); or the bottom of the probe recess, the array (each level disposed on a substrate having a different depth recesses that are arranged at that combine depressions and peaks or peak separating depressions certain depth made from all of the probes of the); or comprises an array disposed on a substrate comprising a plurality of sheets forming a 3-dimensional array to form a layer.

【0358】 これらの3次元アレイを合成するための方法は当技術上周知であり、プローブアレイの支持体と同じくらい適当であると本明細書において先に引用した材料を含む。 [0358] Methods for synthesizing these 3-dimensional array are well known in the art, including materials cited herein above as suitable as much as the support of the probe array. また、オリゴヌクレオチドプローブを支持することができ、好ましくは可撓性である他の好適な材料を基体として使用することができる。 Further, it is possible to support the oligonucleotide probes, preferably other suitable material that is flexible may be used as the substrate.

【0359】 実施例34 cDNAクローンをクラスター化するための識別特性配列標準的なpcr、SGH配列識別特性分析およびサンガー(Sanger)の配列決定法を使用して、cDNAライブラリーから複数の別個の核酸配列を得た。 [0359] signature sequence standard pcr for Example 34 cDNA clone clustering, using sequencing methods SGH sequence signature analysis, and Sanger (Sanger), a plurality of separate nucleic acid from a cDNA library sequences were obtained. ライブラリーの挿入部は、挿入部に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを使用したpcrを用いて増幅した。 Insertion portion of the library was amplified using pcr using primers specific for vector sequences flanking the insert. これらの試料をナイロン膜にスポットし、好適な数のオリゴヌクレオチドプローブを用いて調査し、陽性結合プローブの強度を配列の識別特性を与えることによって測定した。 These samples were spotted onto nylon membranes was investigated using a suitable number of oligonucleotide probes was determined by giving the identifying characteristics of the intensity of positive binding probe sequence. クローンを同様のまたは同一の配列の識別特性にクラスター化し、ゲル配列決定のためにクローンを代表するシグナルを各群から選択した。 Clones were clustered into signatures of similar or identical sequences, a signal representative of the clones for gel sequencing was selected from each group. 典型的なサンガー(Sanger)の配列決定プロトコールにおいて逆M13配列決定用プライマーを使用して増幅した挿入物の5'配列を推定する。 Estimating the typical 5 'sequence of Sanger inserts were amplified using primers for the reverse M13 sequencing at the sequencing protocol (Sanger). PCR産物を精製し、蛍光染料ターミネーターサイクル配列決定を実施した。 PCR products were purified and carried a fluorescent dye terminator cycle sequencing. 377アプライド バイオシステムズ(Applied 377 Applied Biosystems (Applied
Biosystems(ABI)シークエンサーを使用してシングルパスゲル配列決定を実施した。 It was performed single pass gel sequencing using Biosystems (ABI) sequencer. この方法によって選択され、配列決定されたクローンの大半は、互いに他と異なる配列を有し、同じ配列を有したのはごく少数であった。 Selected by this method, most of the clones sequenced has other different sequences from each other, and the was very few have the same sequence.

【0360】 実施例35 チップの高スループット生産好適な実施の形態において、プローブのアレイを大量生産するための装置は、 [0360] In the high throughput production preferred embodiment of embodiment 35 chips, a device for the mass production of an array of probes,
インクジェット蒸着装置に結合した回転ドラムもしくはプレート(例えばミクロドロップ注入ヘッドなど)と、好適なロボットシステム(例えばアノラド・ガントリー(anorad gantry))と、を含む。 Including a rotary drum or plate attached to the inkjet deposition apparatus (e.g., micro-drop injection head), a suitable robotic system (e.g. Anorado gantry (Anorad gantry)), a. この装置の特に好適な実施形態は、図 1〜3を参照して記載される。 Particularly preferred embodiments of this device are described with reference to FIGS.

【0361】 該装置は、好適な基体が固定されたシリンダー(1)を含む。 [0361] The apparatus includes a suitable substrate is fixed cylinder (1). この基体は、プローブのアレイに好適であるものとして先に記載した材料のいずれからできていてもよい。 The substrate may be made from any of the materials described above as being suitable for an array of probes. 好適な実施の形態において、該基体はフレキシブルな物質であり、アレイは該基体上に直接作製される。 In a preferred embodiment, said substrate is a flexible material, the array is fabricated directly on the substrate body. 他の実施形態においては、フレキシブルな基体を該シリンダーに固定し、個々のチップを該基体上に固定させる。 In another embodiment, to secure the flexible substrate to said cylinder, to fix the individual chips on said substrate. つぎに該アレイを個々の各チップ上に作製する。 Then making the array on each individual chip.

【0362】 好適な実施形態において、物理的バリアーを基体またはチップ上に設け、ウェルのアレイを画定する。 [0362] In a preferred embodiment, it provided a physical barrier on a substrate or chip, to define an array of wells. この物理的バリアーは、該装置により基体またはチップに設けても良いし、あるいはこの物理的バリアーは、シリンダー(1)に固定する前にチップまたは基体上に設けてもよい。 This physical barrier may be provided on the substrate or chip by the device, or the physical barrier may be provided on a chip or substrate before fixing to the cylinder (1). つぎに、オリゴヌクレオチドプローブの1スポットを各ウェルに入れるが、このとき個々のウェルに配置したプローブは全て同じ配列を有してもよいし、または個々のウェルにスポットされたプローブは異なる配列を有していてもよい。 Next, add 1 spot oligonucleotide probes to each well, the time to all probes placed into individual wells may have the same sequence, or probe different sequences spotted into individual wells it may have. より好適な実施形態において、1つのアレイの中の個々の各ウェルにスポットされた1以上のプローブは、そのアレイの他のウェルにスポットされたプローブと異なる。 In a more preferred embodiment, one or more probes spotted each individual well in a single array is different from the probes spotted other wells of the array. つぎに、複数のアレイを含む配列決定チップをこれらのアレイから組立てることができる。 Then, the sequencing chip including a plurality of arrays can be assembled from these arrays.

【0363】 基体または基体とチップをシリンダー(1)に固定させたあと、モーター(図示せず)により該シリンダーを回転させる。 [0363] After allowed to fix the substrate or substrate and the chip in the cylinder (1), rotating the cylinder by a motor (not shown). このシリンダーの回転速度は、当分野で公知の任意の方法(例えば固定型光学センサーおよびシリンダーと共に回転する光源を用いた方法など)により正確に測定される。 Rotational speed of the cylinder is accurately measured by any method known in the art (for example, a fixed optical sensor and method using a light source that rotates with the cylinder). 分配装置(3)はアーム(2)に沿って移動し、上記のように計算した正確な回転速度を使用して、分配チップ(dispensing tip)(8)を介してプローブや他の試薬を当分野で公知の方法により基体またはチップ上の正確な位置に送達することができる。 Distributor (3) is moved along the arm (2), using the exact rotational speed calculated as described above, the probe and other reagents through the dispensing tip (dispensing tip) (8) those it can be delivered in the correct position on the substrate or chip by methods known in the art. 該分配装置は、リザーバー(6)から供給ライン(7)を介してプローブや試薬を受け取る。 The distributor receives the probe and reagent from the reservoir (6) via a supply line (7). リザーバー(6)は、アレイを作製するのに必要なプローブおよび他の試薬全てを収容する。 Reservoir (6) accommodates all probes and other reagents necessary to produce the array.

【0364】 分配装置は図3に図示されている。 [0364] dispensing device is illustrated in FIG. 該分配装置は、1つまたは複数の分配チップ(14および8)を有することができる。 The dispensing device can have one or more dispensing tip (14 and 8). 各分配チップは、サンプルウェル(13 Each dispensing tip, the sample wells (13
)を本体(12)の中に有し、該サンプルウェル(13)は、サンプルライン(10) ) And has in the body (12), said sample wells (13), a sample line (10)
を介してプローブや他の試薬を受け取る。 Receive probe and other reagents through. 圧力ライン(11)は、分配チップ(14 Pressure line (11), dispensing tip (14
および8)を介してプローブや試薬を移動させるのに十分なpsiまでチャンバー (9)を加圧する。 And 8) pressurizing the chamber (9) to a sufficient psi to move the probe and reagent through. サンプルライン(10)、ウェル(13)および分配チップ(14 Sample line (10), the well (13) and dispensing tip (14
および8)は、プローブまたは試薬の交換の度毎に各交換の間に洗浄しなければならない。 And 8), must be cleaned between each replaced every time the exchange of probes or reagents. サンプルライン(10)または任意の専用洗浄ライン(図示せず)を介して適切な洗浄用緩衝液をサンプルウェル(13)に供給する。 Via sample line (10) or any dedicated cleaning line (not shown) and supplies appropriate wash buffer into the sample well (13). あるいは、任意で、チャンバー(9)の一部または全てを洗浄用緩衝液で充填してもよい。 Alternatively, optionally, it may be filled with some or all of the chamber (9) with washing buffer. つぎに必要であれば、洗浄用緩衝液を、排出ライン(図示せず)により、またはサンプルライン(10)および分配チップ(14および8)を介して、サンプルウェル(13 Then, if necessary, a washing buffer, a discharge line (not shown), or sample line (10) and through a dispensing tip (14 and 8), the sample wells (13
)およびチャンバー(9)から除去する。 ) And removed from the chamber (9).

【0365】 分配手段がプローブを各アレイもしくはチップ中の全ての適切な位置に当てがったら、基体(チップ付きまたはチップなし)をシリンダーから取り出し、新しい基体をシリンダーに固定させる。 [0365] Once wants against the distribution means is a probe in any suitable location in the array or chip, taken out substrate (without tipped or chip) from the cylinder, to fix the new substrate to the cylinder.

【0366】 実施例36 離散粒子と複合体化したプローブを用いた標的核酸の分析この実施形態において、標的核酸を、複数の離散粒子と(共有結合または非共有結合により)複合体形成するプローブ用いて調べる。 [0366] In this embodiment analysis of target nucleic acids using probes complexed with Example 36 discrete particles, the target nucleic acid, a plurality of discrete particles (covalently or non-covalently) with a probe complexed investigate Te. 該離散粒子は、物理的性質(または複数の物理的性質の組合せ)に基づいてそれぞれを識別することができ、該物理的性質により区別した粒子を、異なるプローブと複合体形成させる。 The discrete particles are each able to identify on the basis of the physical properties (or more physical combination of properties), the distinction between particles by the physical properties, is complexed with different probes.
好適な実施形態において、プローブは、既知の配列および長さを有するオリゴヌクレオチドである。 In a preferred embodiment, the probe is an oligonucleotide having a known sequence and length. 従って、プローブは、離散粒子の物理的性質により同定することが可能である。 Thus, the probe can be identified by the physical properties of the discrete particles. この実施形態に好適であるプローブには、先の節で記載した全てのプローブ(全長プローブよりも情報提供部分が短いプローブを含む)が含まれる。 The probe is suitable for this embodiment includes all of the probes described in the previous section (including probe short information providing portion than the full length probe).

【0367】 離散粒子の物理的性質は、粒子を幾つかのセットに分けることができる、当分野で公知である任意の特性でよい。 [0367] Physical properties of the discrete particles can be divided particles into several sets may be any characteristic known in the art. 例えば、粒子は、そのサイズ、蛍光、吸光度、電磁的電荷または重量に基づいて幾つかのセットに分けることができる。 For example, the particles can be divided into its size, fluorescence, absorbance, some set based on electromagnetic charge or weight. あるいは、色素、放射性核種、またはEMLにより粒子を標識することができる。 Alternatively, it is possible to label dyes, particles with radionuclides or EML,. 他の好適な標識としては、標識された抗体に特異的に結合するメンバーとして機能することができるリガンド、化学発光物質、酵素、標識されたリガンドに特異的に結合して対をなすメンバーとして機能することができる抗体等が挙げられる。 Other suitable labels, functions as a member which forms a ligand capable of functioning as a member which specifically binds to a labeled antibody, a chemiluminescent substance, an enzyme, a pair of specific binding to labeled ligand antibodies and the like that can be.
イムノアッセイにおいて、簡単に使用することができる多様な標識が使用されてきた。 In an immunoassay, a variety of labels which can be used easily have been used. 更に他の標識として、抗原、特異的反応性を有する基、および電気化学的に検出可能な成分が挙げられる。 As a further label, antigen, group having specific reactivity and electrochemically detectable moieties, and the like. 更に他の標識としては、先の節に記載した標識のいずれもが挙げられる。 Still other labels include any of the labels described above section is. これらの標識および特性を、当分野で公知の方法(例えば先の節で記載したこれらの方法を含む)により定量的に測定し、およびシグナル強度またはシグナルタイプに基づいて粒子を区別することができる(標識の1つとして、例えば異なる色素強度、または異なるタイプの色素を粒子に適用してもよい)。 These labels and characteristics, quantitatively measured by methods known in the art (e.g. as described in the previous section contains these methods), and can be distinguished particles based on the signal strength or signal type (one label may be applied, for example, different dye intensity or a different type of dye, the particles). 好適な実施形態において、幾つかの物理的性質を組み合わせ、この特性の様々な組合せにより粒子の区別を可能とする(例えば10種類のサイズと10種類の色を組み合わせて100の粒子グループに分けるなど)。 In a preferred embodiment, a combination of several physical properties, such as divided into various combinations by allowing the distinction of the particles (e.g., 10 different sizes and ten 100 particles group of a combination of colors of this property ).

【0368】 粒子-プローブにより、例えば約2000の反応容器を用いて全ての可能な10-mer を合成することができるような、標準的な組合せ方法の活用が可能となる。 [0368] particles - the probe, for example, about 2000 reaction vessel, such as can be synthesized all possible 10-mer with a, it is possible to use a standard combination method. 1024 1024
反応からなる最初の第1セットを行って、1024の異なるように標識した粒子上に全ての可能な5-merを合成する。 Performing an initial first set of reactions to synthesize all possible 5-mer on differently labeled particles of 1024. 得られたプローブ-粒子を混合し、1024の反応 容器からなる他のセットに分ける。 The resulting probes - particles were mixed and divided into other sets of the reaction vessel 1024. これらのサンプルを用いて反応の第2セットを行い、粒子のプールの中のプローブ上に全ての可能な5-mer伸長物を合成する。 Performing a second set of reactions using these samples, to synthesize all possible 5-mer extension product on the probe in the particle pool. この物理的性質は、各プローブの最初の5ヌクレオチドを同定し、反応容器は全てのプローブの第2の5ヌクレオチドを同定する。 The physical properties were identified the first 5 nucleotides of each probe, the reaction vessel is to identify the second 5 nucleotide of all probes. こうして、2048の反応容器を使用して全ての可能な10-merプローブを合成する。 Thus, to synthesize all possible 10-mer probe using the reaction vessel of 2048. この方法は、種々のプローブ長のための全ての可能なn--merを作製するために簡単に修飾される。 This method, all for various probe length possible n - is easily modified to create mer.

【0369】 好適な実施形態において、粒子をその粒子の蛍光強度により幾つかのセットに分ける。 [0369] In a preferred embodiment, the fluorescence intensity of the particles to particles divided into several sets. 各セットの中の粒子は、蛍光標識の強度を変えて調製されるので、これらの粒子は異なる蛍光強度を有する。 Particles in each set, because it is prepared by changing the intensity of the fluorescent label, these particles have a different fluorescence intensity. フルオレセインの蛍光強度は、1:300〜 1:300,000の範囲にかけて濃度に関連し(Lockhartら、1986)、1:3000〜1 :300,000の間には一次関係がある(つまり、フルオレセイン強度は約1〜300の範囲にかけて線形である)。 The fluorescence intensity of fluorescein, 1: 300 to 1: subjected to 300,000 range is related to the concentration (Lockhart et al., 1986), 1: 3000 to 1: 300,000 primary relationship exists between (i.e., fluorescein intensity of about 1 is linear over the range of 300). 検出の線形範囲において、256セットの粒子をフル オレセインで標識する(例えば3〜259)。 In the linear range of detection, labeling 256 sets of the particles in full Oresein (e.g. 3-259). 256セットの粒子により、全ての可能な4-merを異なるセットの粒子に結合させることができる。 The 256 sets of particles can be attached to particles of different sets all possible 4-mer. 該粒子をプールすることにより、全ての可能な5-merを、全ての可能な4-merからなる4つのプールを持たせ、つぎに各プールの中のプローブをA、G、CまたはTだけ伸長することにより、作製することができる。 By pooling the particles, all possible 5-mer, to have a four pool of all possible 4-mer, then the probes in each pool A, G, only C or T by extension, it can be prepared. 同様に、全ての可能な6-merは、全ての可能な4 Similarly, all possible 6-mer is all possible 4
-merからなる16個のプールを持たせ、この中で4-merの各プールを、A、G、C およびTからなる16種類の可能な2塩基順列のうちの1つ分だけ伸長させるこ とにより、作製することができる(また、例えば7-merの場合は64プール、8 This imparted a 16 pool of -Mer, that each pool in the 4-mer, A, G, is only one minute extension of the 16 types of possible two-base permutations consisting of C and T and makes it possible to produce (also, for example, in the case of 7-mer 64 pools, 8
-merの場合は256プールというように)。 In the case of -mer and so on 256 pool).

【0370】 5-merプローブ(4つのプール中)を使用して、標的核酸を調べる。 [0370] Using 5-mer probe (4 pools), examining the target nucleic acid. 標的核酸を他の蛍光色素、または他の異なる標識(上記記載)で標識する。 Labeling a target nucleic acid other fluorescent dyes or other different labels (described above). 標識した標的を4つのプールと混合し、各プールの中の相補的なプローブは、該標的核酸にハイブリダイズする。 Labeled target mixed with four pools, complementary probe within each pool will hybridize to the target nucleic acid. これらのハイブリダイゼーション複合体を、当分野で公知の方法により検出したあと、ハイブリダイズした陽性プローブを、粒子の蛍光強度を検出することにより同定する。 These hybridization complex, after detected by methods known in the art, the hybridized positive probe, identified by detecting the fluorescence intensity of the particles. 多くの好適な実施形態において、プローブ-粒 子と標的核酸との混合物をフロー・サイトメーターまたは他の分離装置を介して1回に1粒子ずつ供給し、粒子標識および標的を測定して、どのプローブが標的核酸と相補的であるかを決定する。 In many preferred embodiments, the probe - supplying one particle at a time through a mixture flow cytometer or other separation apparatus between the particle element and the target nucleic acid, by measuring the particle labels and target, which probe to determine whether complementary to the target nucleic acid.

【0371】 他の実施形態において、1セットの遊離プローブを他の蛍光色素または他の標識(上記)で標識し、個々の遊離プローブを5-merプローブの各プール(4プール)と混合して、この混合物を標的核酸とハイブリダイズさせる。 [0371] In another embodiment, a set of free probe labeled with other fluorescent dyes or other labels (above), were mixed with each pool (4 pools) of 5-mer probes individual free probe and the mixture is target nucleic acid hybridized. 薬剤を加えて遊離プローブを5-merプローブに共有結合させると(上記の好適な薬剤の説明の節を参照のこと)、遊離プローブが標的核酸上の、5-merプローブが結合する部位に隣接する部位に結合する(遊離プローブ部位は、連結することができる5-m When covalently attaching the free probe in 5-mer probe was added to the drug (see section description of the preferred agents above), adjacent to the site of free probe on the target nucleic acid, is 5-mer probes bind 5-m coupled to (free probe site site is capable of connecting
erプローブの端部に隣接していなければならない)。 er at the end of the probe must be adjacent). 次に、当分野で公知の方法により粒子をアッセイし、どの粒子が遊離プローブに共有結合したか(すなわち遊離プローブ標識を有する粒子)を決定し、5-merプローブを粒子の蛍光強度により同定する。 Next, the particles were assayed by methods known in the art, which particles determines covalently linked to free probe (i.e. particles having a free probe label), to identify the 5-mer probes by fluorescence intensity of the particles . 最も好適な実施形態において、プローブ-粒子、遊離プローブお よび標的核酸の混合物をフロー・サイトメーターを介して1回に1粒子ずつ供給し、粒子標識と遊離プローブ標識を測定してどのプローブが標的核酸に相補的であるかを決定する。 In a most preferred embodiment, the probe - particles, a mixture of free probe contact and a target nucleic acid through a flow cytometer supplied one particle at a time, how the probe by measuring the free probe labeled particles labeled target determining whether complementary to the nucleic acid.

【0372】 好適な実施形態において、単一の装置が、プローブ-粒子複合体を用いた標的 核酸の分析操作の全てまたは大部分を備える。 [0372] In a preferred embodiment, a single device, the probe - comprises all or most of the analysis operation of a target nucleic acid using a particle complexes. 該装置は1以上の試薬チャンバーを有し、該チャンバーには緩衝液と標識された標的核酸が完全に混合されている(標的核酸は、手動で加えても自動的に加えてもよい)。 The device has one or more reagent chamber, a target nucleic acid labeled with buffer is thoroughly mixed in the chamber (target nucleic acid may be automatically added in addition manually). 該混合物を試薬チャンバーから複数の反応チャンバーに等分し、各反応チャンバーはプローブ-粒子複 合体のプールを1つ有する。 The mixture was aliquoted from the reagent chamber to the plurality of reaction chambers, each reaction chamber probe - having one particle multi coalescence pool. プローブ-粒子と標的核酸は、標的核酸に相補的な プローブを結合させるような条件下において反応する。 Probe - particles and the target nucleic acid are reacted under conditions such that binding the probes complementary to the target nucleic acid. 過剰な標的核酸(すなわち結合しなかった核酸)を、反応チャンバーから(例えば洗浄により)除去し、 Excess target nucleic acids (i.e. nucleic acid not bound), (for example by washing) from the reaction chamber is removed,
標的核酸に結合した粒子を標的核酸標識と粒子との会合により同定し、該プローブを、粒子の物理的性質により同定する。 The particles bound to the target nucleic acid was identified by association with the target nucleic acid labeled with particles, the probe is identified by the physical properties of the particles. 好適な実施形態において、過剰な標的を除去したあと、該粒子は1列で反応チャンバーから検出装置までチャネルを通って移動する。 In a preferred embodiment, after removal of excess target, the particles move through the channel to the detector from the reaction chamber in one row. 単一粒子が検出装置を通過するとき、これらの装置は標的標識および粒子の物理的性質を測定する。 When a single particle passes through the detection device, these devices measure the physical properties of the target label and particles. 他の好適な実施形態において、過剰な標的を除去する前または除去した後に、粒子を例えばサイズ別に(例えば排除クロマトグラフィー)、電荷により(例えばイオン交換クロマトグラフィー)、および/ In another preferred embodiment, before or after removal to remove excess target particles, for example, by size (e.g., exclusion chromatography), the charge (e.g. ion exchange chromatography), and /
または密度-重量別に、これらの物理的性質の1つまたはこれらの組み合わせを 用いてセットに分ける。 Or density - by weight, divided into sets using one or a combination of these of these physical properties. これらの分画した粒子をつぎに検出装置によりアッセイする。 These fractionated particles then assayed by the detection device.

【0373】 この実施形態の代替として、主要な試薬チャンバーに、緩衝液、標的核酸、プローブ-粒子複合体のプール、および化学的もしくは酵素的な連結試薬を供給す る。 [0373] As an alternative to this embodiment, the main reagent chamber, buffers, target nucleic acid, the probe - you supplied pool, and chemical or enzymatic coupling reagent particle complex. これらの成分を完全に混合し、次に試薬チャンバーから複数の反応チャンバーに等分する。 The components were thoroughly mixed and then aliquoted from the reagent chamber to the plurality of reaction chambers. 各反応チャンバーは1個の標識された遊離プローブを有する。 Each reaction chamber has one labeled free probe. 或いは、プローブ粒子複合体のプールを、試薬チャンバーに加える代わりに、遊離プローブと共に反応チャンバーの中に入れてもよい。 Alternatively, a pool of probe particle complex, instead of adding the reagent chamber may be placed in a reaction chamber with the free probe. さらに、遊離プローブを試薬チャンバーに加えてプローブ粒子のプールを該反応チャンバーに加えることもできる。 Furthermore, a pool of probe particles may be added to the reaction chamber by adding free probe in the reagent chamber. プローブ-粒子、標的核酸、および遊離プローブは、遊離プローブおよ び粒子-プローブが、標的核酸上の隣接部位で結合するような条件下で反応し、 これにより、遊離プローブはプローブ粒子に連結される。 Probe - particles, the target nucleic acid, and the free probes are free probe and particles - probe, and under conditions such that binding at adjacent sites on the target nucleic acid, by this, the free probe is connected to the probe particle that. 過剰な遊離プローブ( Excess free probe (
すなわち連結していないプローブ)、および標的核酸を、反応チャンバーから( That probe not connected), and the target nucleic acid, from the reaction chamber (
洗浄により)除去し、連結されたプローブを、遊離プローブ標識と粒子との会合により同定し、粒子と複合体形成したプローブをその粒子の物理的性質により同定する。 By washing) was removed and the ligated probes, the free probe were identified by association of the label with the particles, to identify probes complexed with the particles by physical properties of the particles. 好適な実施形態において、過剰なプローブと標的を除去したあと、該粒子は1列で反応チャンバーから検出装置までチャネルを通って移動する。 In a preferred embodiment, after removal of excess probe and target, the particles move through the channel to the detector from the reaction chamber in one row. 単一粒子が検出装置を通過するとき、該装置は粒子に共有結合した遊離プローブ標識、 When a single particle passes through the detection device, the device was covalently bound to the particles free probe label,
および粒子の物理的性質を測定する。 And measuring the physical properties of the particles. 他の好適な実施形態において、過剰プローブおよび標的を除去する前または除去した後に、粒子をその物理的性質を用いて、例えばサイズ毎に(例えば排除クロマトグラフィー)、電荷により(例えばイオン交換クロマトグラフィー)、および/または密度・重量毎に、セットに分ける。 In another preferred embodiment, before or after removal to remove excess probe and target, using the physical property of particles, for example (e.g., exclusion chromatography) for each size, (e.g., ion exchange chromatography by charge ), and / or for each density and weight, divided into sets. これらの分画した粒子を検出装置によりアッセイする。 These fractionated particles assayed by the detection device.

【0374】 好適な実施形態において、該装置の中には第2の反応チャンバーのセットがあり、プローブ-粒子のプールを第2反応チャンバーの中に配置する。 [0374] In a preferred embodiment, in the apparatus has a set of second reaction chamber, the probe - placing particles pool in the second reaction chamber. 標的および 緩衝液を試薬チャンバーの中で混合し、これらを、標識された遊離プローブの入った第1反応チャンバーの中に入れる。 Mixed target and buffer in the reagent chamber, it is placed into a first reaction chamber containing the labeled free probe. プローブと標的を混合し、任意でプローブを標的にハイブリダイズさせることができる。 Mixing probe and target, the probe can be hybridized to the target at any. つぎに、この標識されたプローブと標的の混合物を、プローブ-粒子のプールが入った第2反応チャンバーに送 る。 Next, a mixture of the labeled probe and the target, the probe - Ru feed to the second reaction chamber containing the pool of particles. 遊離プローブおよびプローブ-粒子は標的にハイブリダイズし、適当なプロ ーブを第2反応チャンバーの中で連結させる。 Free probe and probe - particles are hybridized to the target, thereby connecting the appropriate probe in a second reaction chamber. 連結剤は、試薬チャンバーで、またはいずれかの反応チャンバーの中で加えても良く、好ましくは、連結剤は、第2反応チャンバーの中で添加する。 Linking agent may be added in the reagent chamber or any of the reaction chamber, preferably, linking agent is added in a second reaction chamber. 第2反応チャンバーの中のプローブ-粒子ハ イブリダイゼーション生成物を上記のように分析する。 Probe in the second reaction chamber - the particles hybridization product was analyzed as described above.

【0375】 1つの実施の形態において、標的核酸は、分析前に(PCRにより、またはλラ イブラリーなどのベクターにより)増幅しない。 [0375] In one embodiment, the target nucleic acid, (by PCR, or by the vector, such as λ library) prior to analysis without amplification. 好ましくは、この実施の形態においてより長い遊離プローブおよび粒子プローブを使用する。 Preferably, use longer free probe and particle probe in this embodiment. というのは、サンプルの配列がより複雑であるためである(即ちバックグラウンドに対して陽性であるものを区別するため)。 Since, because the sequence of samples is more complex (i.e. to distinguish what is positive for the background).

【0376】 この実施例に記載されたプローブ-粒子の実施形態は、先述の用途(上記診断 および配列決定用途を含むがこれらに限定されない)のいずれにも有用である。 [0376] probes described in this example - the embodiment of a particle is also useful in any of the foregoing applications (including the diagnosis and sequencing applications are not limited to).
さらに、これらのプローブ粒子の実施形態は、上記変更および改変により修飾することができる。 Further, embodiments of these probes particles can be modified by the changes and modifications.

【0377】 実施例37 ポリヌクレオチド間の結合を修飾する薬剤の存在下における相補的なポリヌクレ オチドの相互作用この実施形態において、相補的なポリヌクレオチドの結合における誤対合からの完全な対合の識別は、1以上の薬剤の添加により調節される。 [0377] In the interaction this embodiment of the complementary polynucleotide in the presence of the agent that modifies the binding between Example 37 polynucleotide, the perfect match from mismatch in binding complementary polynucleotides identification is adjusted by the addition of one or more agents. 好適な実施形態において、相補的なポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプローブである。 In a preferred embodiment, the complementary polynucleotides are target polynucleotide and polynucleotide probes. 誤対合からの完全な対合の識別は、薬剤の添加により調節することができる。 Identifying perfect match from mismatch may be adjusted by the addition of the drug. この薬剤は、トリアルキルアンモニウム塩(例えばTMAC The drug, trialkylammonium salt (e.g. TMAC
、Ricelliら、Nucl. Acids Res. 21: 3785-3788(1993))、塩化ナトリウム、リ ン酸塩およびホウ酸塩などの塩、ホルムアミド、グリコール、ジメチルスルフォキシド、およびジメチルホルムアミドなどの有機溶媒、尿、グアニジニウム、ベタインなどのアミノ酸類似体(Henkeら、Nucl. Acids Res. 19: 3957-3958(1997 , Ricelli et, Nucl Acids Res 21:.. 3785-3788 (1993)), sodium chloride, salts such as Li down salts and borate salts, formamide, glycol, dimethyl sulfoxide, and an organic solvent such as dimethylformamide , urine, guanidinium, amino acid analogs such as betaine (Henke et al., Nucl acids Res 19:.. 3957-3958 (1997
); Reesら、Biochemistry 32: 137-144(1993))、スペルミジンおよびスペルミ ンなどのポリアミン(Thomasら、Nucl. Acids Res. 25: 2396-2402(1997))、またはホスフェート骨格の負電荷を中和する他の正に荷電した分子、ドデシル硫酸ナトリウム、およびナトリウムラウリルサルコシネート等の界面活性剤、主溝/ ..); Rees et al., Biochemistry 32: 137-144 (1993)), polyamines such as spermidine and misspelled emissions (Thomas et al., Nucl Acids Res 25: 2396-2402 (1997)), or medium a negative charge of the phosphate backbone charged molecules other positive that sum, surfactants such as sodium dodecyl sulfate and sodium lauryl sarcosinate, main grooves /
小溝結合剤、正に荷電したポリペプチド、およびインターカレート剤(例えばアクリジン、臭化エチジウム、およびアントラセンなど)である。 Minor groove binding agent is a positively charged polypeptide, and intercalating agents (e.g., acridine, ethidium bromide, and anthracene, etc.). 好適な実施形態において、薬剤の混合物をハイブリダイゼーション反応に加えて、誤対合からの完全な対合の識別を調節する。 In a preferred embodiment, in addition to mixtures of agents in the hybridization reaction, to adjust the identification of the perfect match from mismatch. これらの薬剤の幾つかは、2つの相補鎖の間の溶解のエントロピーを低減することにより識別を行う。 Some of these agents, and identifies by reducing the entropy of dissolution between the two complementary strands.

【0378】 好適な実施形態において、誤対合からの完全な対合の識別を、1以上の薬剤により改善する。 [0378] In a preferred embodiment, the identification of the perfect match from mismatch, improved by one or more agents. 例えば、ホルムアミド(一般的に使用される変性剤)は、フォーマットIIIの反応における(誤対合):(完全な対合)を選択的に不安定化する ことが分かった。 For example, (modifiers commonly used) formamide have been found to selectively destabilize the (mismatched) :( perfect match) in the reaction of format III. 上記のように、フォーマットIIIの反応を開始し、次にホルム アミドを量を変えて添加した(0%、10%、20%、30%、40%および50%)。 As described above, to start the reaction format III, then formamide was added varying amounts (0%, 10%, 20%, 30%, 40% and 50%). 0
%では、完全な対合シグナルが検出され、バックグラウンド(誤対合)は高かった。 In%, complete pairing signal was detected, the background (mismatched) was high. ホルムアミド10%では、良好な完全対合シグナルがあり、バックグラウンド/誤対合シグナルは減少した。 In formamide 10%, there is good perfect match signal, the background / mismatched signal was decreased. ホルムアミド20%では、完全対合シグナルは(検出可能であったが)減少し、バックグラウンド/誤対合シグナルは無くなった。 In formamide 20%, perfect match signal (was detectable) decreases, the background / mismatched signal was lost.
ホルムアミド30%〜50%では、完全対合シグナルもバックグラウンド/誤対合シグナルも無かった。 In formamide 30% to 50%, perfect match signal even background / mismatched signals may also did.

【0379】 他の実施形態において、薬剤を使用して1対の相補的ポリヌクレオチドのT mを上下させる。 [0379] In another embodiment, using a drug to lower the T m of a complementary polynucleotide of the pair. より好適な実施形態において、薬剤の混合物を使用して1対の相補的ポリヌクレオチドのT mを上下させる。 In a more preferred embodiment, to lower the T m of a complementary polynucleotide of the pair using a mixture of agents. 薬剤は、種々の方法でTmを変更させることができる。 Agent, it is possible to change the Tm in a variety of ways. 本発明を限定するわけではないが、2つの例として、(1)2つの相補的ポリヌクレオチドの塩基間の水素結合を切断する薬剤(Goodman, Proc. N Without limiting the present invention, as two examples, the agent that cleaves hydrogen bonds between the bases of (1) two complementary polynucleotides (Goodman, Proc. N
at'l Acad. Sci. 94: 10493-10495 (1997); Moranら、Proc. Nat'l Acad. Sci. .. At'l Acad Sci 94:.. 10493-10495 (1997); Moran et al., Proc Nat'l Acad Sci.
94: 10506-10511(1997); Nguyenら、Nucl. Acids Res. 25: 3059-3065(1997)) 、および(2)ポリヌクレオチドの糖リン酸骨格の中のリン酸の負電荷を中和もしくは遮蔽する薬剤(Thomasら、Nucl. Acids Res. 25: 2396-2402(1997))が挙げられる。 94:.. 10506-10511 (1997); Nguyen et al., Nucl Acids Res 25: 3059-3065 (1997)), and (2) the negative charge of the phosphate in the polynucleotide of the sugar phosphate backbone neutralized or shielding to drug (Thomas et al., Nucl Acids Res 25:.. 2396-2402 (1997)) and the like. (1)および/または(2)を強化したりまたは弱めたりすることにより、1対の相補的なポリヌクレオチドのT mを調節することが可能である。 (1) and / or by or or weaken strengthening (2), it is possible to adjust the T m of a complementary polynucleotide of the pair.

【0380】 最も好適な実施形態において、GC塩基対の結合エネルギーを弱めたり、AT塩基対の結合エネルギーを強化したり、またはその両方を行うために1以上の薬剤を加える。 [0380] In a most preferred embodiment, addition of weakening the binding energy of GC base pairs, or to enhance the binding energy of AT base pairs, or one or more agents to both. 好適な実施形態において、1以上の薬剤を加えてAT塩基対からの結合エネルギーをGC塩基対の結合エネルギーとほぼ同じにする。 In a preferred embodiment, it is substantially the same binding energy from AT base pair with the binding energy of GC base pairs in addition to one or more agents. このように、これらの相補的ポリヌクレオチド間の結合エネルギーは、長さに全く依存する。 Thus, the binding energy between these complementary polynucleotides are totally dependent on the length. これらの相補的ポリヌクレオチドの結合エネルギーは、ポリヌクレオチド骨格中のリン酸基の負電荷を中和または遮蔽する薬剤を加えることにより、増大させることができる。 Binding energy of these complementary polynucleotides, by adding an agent that neutralizes or shields the negative charge of the phosphate groups in the polynucleotide backbone, it can be increased.

【0381】 本発明は、例示した実施形態によりその範囲を制限するものではなく、これらの実施の形態は本発明の態様を例示することを意図するものであって、機能的に同等な組成物および方法は、本発明の範囲内とする。 [0381] The present invention is not intended to limit its scope by the exemplified embodiments, these embodiments are an intended to illustrate aspects of the present invention, functionally equivalent compositions and methods within the scope of the present invention. 実際に、本明細書の好適な実施形態を考慮すれば、当業者であれば、本発明の実施に際し、様々な改変および変更が思いつくことが予想される。 Indeed, considering the preferred embodiments herein, those skilled in the art, the practice of the present invention, is expected to come up that various modifications and changes. 従って、本発明の範囲を限定するのは、請求の範囲に記載されたもののみである。 Therefore, to limit the scope of the present invention are only those that are claimed. 本明細書中の本体に記載された全ての参考文献は、本明細書中に参考としてその全体が組み込まれるものとする。 All references listed in the body of the herein shall be entirely incorporated by reference herein.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】 図1は、大量生産プローブアレイ用の装置の平面図である。 FIG. 1 is a plan view of the apparatus for mass production probe array.

【図2】 図2は、大量生産プローブアレイ用の装置の側面図である。 Figure 2 is a side view of the apparatus for mass production probe array.

【図3】 図3は、大量生産プローブアレイ用の装置の給液ユニット(dispensing unit )の断面側面図である。 Figure 3 is a cross-sectional side view of a liquid supply unit (dispensing Unit) of the apparatus for mass production probe array.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 08/959,365 (32)優先日 平成9年10月28日(1997.10.28) (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AU,AZ,BA,BB,BG,BR, BY,CA,CN,CU,CZ,EE,GE,HR, ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (31) priority claim No. 08 / 959,365 (32) priority date 1997 October 28 (1997.10.28) (33) priority country the United States (US) ( 81) designated States EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, HR, H U,ID,IL,IS,JP,KG,KP,KR,KZ ,LC,LK,LR,LT,LV,MD,MG,MK, MN,MX,NO,NZ,PL,RO,RU,SG,S I,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,UA,US ,UZ,VN,YU (72)発明者 バイドヤ,ナラヤン アメリカ合衆国 94086 カリフォルニア 州、サニーベール、ヘレン アベニュー ナンバー1 966 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA11 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA17 QA18 QA19 QQ06 QQ07 QQ08 QQ10 QQ42 QQ52 QR31 QR41 QR48 QR49 QR50 QR51 QR56 QR62 QR66 QR84 QS02 QS25 QS34 QS39 QX01 QX02 QX07 4B064 AF27 CA21 DA13 H U, ID, IL, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG , S I, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, US, UZ, VN, YU (72) inventor Baidoya, Narayan United States 94086 California, Sunnyvale, Helen Avenue number 1 966 F-term (reference ) 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA11 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA17 QA18 QA19 QQ06 QQ07 QQ08 QQ10 QQ42 QQ52 QR31 QR41 QR48 QR49 QR50 QR51 QR56 QR62 QR66 QR84 QS02 QS25 QS34 QS39 QX01 QX02 QX07 4B064 AF27 CA21 DA13

Claims (64)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 多数のオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、 基体と、 物理的バリアーを形成している材料で、該基体の上に配置されていて多数のウェルを有するグリッドを形成している該材料、 を含み、多数のオリゴヌクレオチドプローブが多数のウェル中にアレイを形成するように配列されており、各ウェルが該基体上に固定されたプローブの1スポットを含むものである、上記アレイ。 1. A array of multiple oligonucleotide probes, in the material forming the substrate, the physical barrier, forming a grid having a plurality of wells are located on a base body comprises material, are arranged as a number of oligonucleotide probes to form an array in a number of wells, is intended to include one spot of the probe which each well is fixed on the base body, said array.
  2. 【請求項2】 個々の各スポットが前記アレイの他のスポット中の他のプローブと異なる配列をもつプローブを有する、請求項1記載のアレイ。 Wherein each individual spot having a probe with other probes with different sequences in the other spots of the array, according to claim 1 array according.
  3. 【請求項3】 個々の各スポット中のプローブが同一の配列を有する、請求項2記載のアレイ。 Wherein the probes in each individual spot has the same sequence, according to claim 2 array according.
  4. 【請求項4】 あるスポットの中心と隣接スポットの中心間の距離が少なくとも325μmである、請求項1記載のアレイ。 Wherein the distance between certain of the center and the adjacent spots of the spot center is at least 325Myuemu, claim 1 array according.
  5. 【請求項5】 多数の請求項1記載のアレイを含んでなる配列決定用チップ。 5. The number of claims 1 sequencing chip comprising an array according.
  6. 【請求項6】 多数の請求項2記載のアレイを含んでなる配列決定用チップ。 6. The number of claim 2 wherein the sequencing chip comprising array.
  7. 【請求項7】 多数の請求項3記載のアレイを含んでなる配列決定用チップ。 7. A large number of claims 3 sequencing chip comprising an array according.
  8. 【請求項8】 オリゴヌクレオチドプローブが情報提供部分と反応性基を含み、該反応性基により該プローブが基体に結合されている、請求項1記載のアレイ。 8. oligonucleotide probe comprises a reactive group with the information providing part, the probe by the reactive group is bonded to a substrate, according to claim 1 array according.
  9. 【請求項9】 オリゴヌクレオチドプローブがさらに少なくとも1つのランダム化された位置を含む、請求項8記載のアレイ。 9. oligonucleotide probes further comprising at least one of the randomized positions, an array according to claim 8.
  10. 【請求項10】 オリゴヌクレオチドプローブがさらにスペーサーを含む、 10. A oligonucleotide probe further comprises a spacer,
    請求項9記載のアレイ。 Array according to claim 9, wherein.
  11. 【請求項11】 多数のオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、多数の平面を有する基体を含み、多数のプローブが該基体の多数の平面に固定されている、上記アレイ。 11. A array of multiple oligonucleotide probes, including a substrate having a large number of planes, a large number of probes are fixed to a number of the plane of said substrate, said array.
  12. 【請求項12】 各平面を個別に分析することができる、請求項11記載のアレイ。 12. It is possible to analyze each plane individually, an array of claim 11, wherein.
  13. 【請求項13】 多数の平面を同時に分析することができる、請求項11記載のアレイ。 13. The multiple planes can be simultaneously analyzed, the array of claim 11, wherein.
  14. 【請求項14】 オリゴヌクレオチドプローブが情報提供部分と反応性基を含み、該反応性基により該プローブが基体に結合されている、請求項11記載のアレイ。 14. oligonucleotide probe comprises a reactive group with the information providing part, the probe by the reactive group is bonded to a substrate, the array of claim 11, wherein.
  15. 【請求項15】 オリゴヌクレオチドプローブがさらに少なくとも1つのランダム化された位置を含む、請求項14記載のアレイ。 15. oligonucleotide probe further comprises at least one of the randomized positions, the array of claim 14, wherein.
  16. 【請求項16】 オリゴヌクレオチドプローブがさらにスペーサーを含む、 16. oligonucleotide probe further comprises a spacer,
    請求項15記載のアレイ。 Array according to claim 15, wherein.
  17. 【請求項17】 標的核酸を分析する方法であって、 標的核酸を多数のオリゴヌクレオチドプローブに接触させ(ただし、該プローブは物理的性質に基づいて互いに識別できる多数の異なる離散粒子と複合体化されていて、異なるプローブがそれぞれのタイプの離散粒子に結合している)、 標的核酸に対して相補的であるプローブを検出し、そして 相補的プローブのセットから標的核酸を分析する、 各ステップを含む上記方法。 17. A method of analyzing a target nucleic acid, contacting the target nucleic acid in a number of oligonucleotide probes (provided that the probe complexed with many different discrete particles that can be distinguished from each other based on the physical properties have been, different probes are bound to each type of discrete particles), to detect the probes complementary to the target nucleic acid, and analyzing a target nucleic acid from a set of complementary probes, each step the above-described method, including.
  18. 【請求項18】 離散粒子を分離して画分を得るステップをさらに含み、その際、離散粒子を物理的性質に基づいて分離する、請求項17記載の方法。 18. further comprising a step of obtaining fractions were separated discrete particles, in which, separated based on the physical properties of the discrete particles The method of claim 17.
  19. 【請求項19】 相補的プローブのセットがオーバーラップする少なくとも2つのプローブを有する、請求項18記載の方法。 Set of 19. Complementary probes having at least two probes overlap The method of claim 18, wherein.
  20. 【請求項20】 標的核酸の配列が分析ステップにおいて1つにまとめられる、請求項18記載の方法。 20. sequence of the target nucleic acid are combined into one in the analysis step, the method of claim 18, wherein.
  21. 【請求項21】 相補的プローブが離散粒子の物理的性質により同定される、請求項18記載の方法。 21. Complementary probes are identified by the physical properties of the discrete particles, method of claim 18, wherein.
  22. 【請求項22】 物理的性質が色素、放射性ヌクレオチド、EMLおよび蛍光 分子からなる群より選択される分子と関連している、請求項18記載の方法。 22. Physical properties dye, radioactive nucleotides, are associated with the molecule selected from the group consisting of EML and fluorescent molecules The method of claim 18, wherein.
  23. 【請求項23】 物理的性質がサイズ、電荷、吸光度および重量からなる群より選択される、請求項18記載の方法。 23. Physical properties size, charge, is selected from the absorbance and the group consisting of weight, method of claim 18, wherein.
  24. 【請求項24】 物理的性質が物理的性質の強度と関連している、請求項2 24. Physical properties are associated with the intensity of the physical properties, according to claim 2
    3記載の方法。 3 method as claimed.
  25. 【請求項25】 物理的性質が多数の異なる分子と関連している、請求項2 25. Physical properties are associated with a number of different molecules, according to claim 2
    3記載の方法。 3 method as claimed.
  26. 【請求項26】 プローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項18記載の方法。 Information providing portion 26. The probe is shorter than the full length probe method of claim 18, wherein.
  27. 【請求項27】 標的核酸が標識を含み、相補的プローブが標的核酸上の標識により検出される、請求項18記載の方法。 27. comprise the target nucleic acid is labeled, complementary probe is detected by the label on the target nucleic acid, The method of claim 18, wherein.
  28. 【請求項28】 検出ステップが、個々の粒子を検出器に通すことにより、 28. detecting step, by passing the individual particles in the detector,
    個々の離散粒子に対して行われる、請求項17記載の方法。 Made to individual discrete particles, method of claim 17.
  29. 【請求項29】 相補的プローブのセットがオーバーラップする少なくとも2つのプローブを有する、請求項28記載の方法。 Set of 29. Complementary probes having at least two probes overlap The method of claim 28.
  30. 【請求項30】 標的核酸の配列が分析ステップにおいて1つにまとめられる、請求項28記載の方法。 30. A sequence of the target nucleic acid are combined into one in the analysis step, the method according to claim 28.
  31. 【請求項31】 相補的プローブが離散粒子の物理的性質により同定される、請求項28記載の方法。 31. Complementary probes are identified by the physical properties of the discrete particles The method of claim 28.
  32. 【請求項32】 物理的性質が色素、放射性ヌクレオチド、EMLおよび蛍光 分子からなる群より選択される分子と関連している、請求項28記載の方法。 32. Physical properties dye, radioactive nucleotides, are associated with the molecule selected from the group consisting of EML and fluorescent molecules The method of claim 28.
  33. 【請求項33】 物理的性質がサイズ、電荷、吸光度および重量からなる群より選択される、請求項28記載の方法。 33. Physical properties size, charge, is selected from the absorbance and the group consisting of weight, method of claim 28.
  34. 【請求項34】 物理的性質が物理的性質の強度と関連している、請求項3 34. The physical properties are associated with the intensity of physical properties, according to claim 3
    3記載の方法。 3 method as claimed.
  35. 【請求項35】 物理的性質が多数の異なる分子と関連している、請求項3 35. The physical properties are associated with a number of different molecules, according to claim 3
    3記載の方法。 3 method as claimed.
  36. 【請求項36】 プローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項28記載の方法。 Information providing portion 36. The probe is shorter than the full length probe The method of claim 28.
  37. 【請求項37】 標的核酸が標識を含み、相補的プローブが標的核酸上の標識により検出される、請求項28記載の方法。 37. comprise the target nucleic acid is labeled, complementary probe is detected by the label on the target nucleic acid, The method of claim 28.
  38. 【請求項38】 標的核酸を多数の遊離オリゴヌクレオチドと接触させ、そして標的核酸上のある部位に結合した相補的な遊離プローブを、遊離プローブが結合した部位に隣接する標的核酸上の部位に結合している離散粒子の相補的プローブに共有結合で結合させるステップをさらに含み、 検出ステップが離散粒子のプローブに共有結合で結合している遊離プローブを同定する、請求項28記載の方法。 38. A is contacted with a large number of free oligonucleotide target nucleic acid and the complementary free probe bound to a site that is on the target nucleic acid, binds to a site on the target nucleic acid adjacent to the portion where the free probe bound the method of to have further comprising the step of covalently binding to a complementary probe of the discrete particles, to identify free probe detection steps are covalently bound to the probe of discrete particles, according to claim 28.
  39. 【請求項39】 相補的な共有結合プローブのセットがオーバーラップする少なくとも2つの共有結合プローブを有する、請求項38記載の方法。 39. The set of complementary covalent probe having at least two covalent bonds probes overlap The method of claim 38.
  40. 【請求項40】 標的核酸の配列が分析ステップにおいて1つにまとめられる、請求項38記載の方法。 40. sequence of the target nucleic acid are combined into one in the analysis step, the method according to claim 38.
  41. 【請求項41】 離散粒子と複合体化されたプローブが離散粒子の物理的性質により同定される、請求項38記載の方法。 41. A discrete particles complexed with the probe are identified by the physical properties of the discrete particles, a method according to claim 38.
  42. 【請求項42】 離散粒子を分離して画分を得るステップをさらに含み、その際、離散粒子を物理的性質に基づいて分離する、請求項38記載の方法。 42. further comprising the step of obtaining the fractions were separated discrete particles, in which, separated based on the physical properties of the discrete particles, a method according to claim 38.
  43. 【請求項43】 フローサイトメーターで離散粒子を分離して画分を得る、 43. obtain fractions to separate discrete particles in the flow cytometer,
    請求項42記載の方法。 The method of claim 42, wherein.
  44. 【請求項44】 物理的性質が色素、放射性ヌクレオチド、EMLおよび蛍光 分子からなる群より選択される分子と関連している、請求項38記載の方法。 44. Physical properties dye, radioactive nucleotides, are associated with the molecule selected from the group consisting of EML and fluorescent molecules The method of claim 38, wherein.
  45. 【請求項45】 物理的性質がサイズ、電荷、吸光度および重量からなる群より選択される、請求項38記載の方法。 45. The physical properties size, charge, is selected from the absorbance and the group consisting of weight, method of claim 38.
  46. 【請求項46】 物理的性質が物理的性質の強度と関連している、請求項4 46. ​​Physical properties are associated with the intensity of physical properties, according to claim 4
    5記載の方法。 The method of 5, wherein the.
  47. 【請求項47】 物理的性質が多数の異なる分子と関連している、請求項4 47. The physical properties are associated with a number of different molecules, according to claim 4
    5記載の方法。 The method of 5, wherein the.
  48. 【請求項48】 遊離プローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項38記載の方法。 48. A shorter than the free probe information providing part full length probe 39. The method of claim 38, wherein.
  49. 【請求項49】 離散粒子と複合体化されたプローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項38記載の方法。 49. The information providing part of the discrete particles complexed probe is shorter than the full length probe method of claim 38.
  50. 【請求項50】 遊離プローブの情報提供部分および離散粒子と複合体化されたプローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項38記載の方法。 50. The information providing portion and discrete particles complexed with the information provided portion of the probe of the free probe is shorter than the full length probe method of claim 38.
  51. 【請求項51】 標的核酸を分析する方法であって、 標的核酸とプローブとを、完全な対合と誤対合との識別を可能とする条件下( 51. A method of analyzing a target nucleic acid, to allow identification of the target nucleic acid and the probe, erroneously perfect match pairing conditions (
    ここでは、完全な対合と誤対合との識別を向上させる薬剤を添加する)で接触させ、そして 該プローブが標的核酸に対して相補的であるかどうかを検出する、 各ステップを含む上記方法。 Here, in contact with the agent is added to improve the discrimination between mismatched and perfect match), and the probe detects whether complementary to the target nucleic acid, said comprising the steps Method.
  52. 【請求項52】 前記薬剤が塩、有機溶媒、尿素、グアニジニウム、アミノ酸類似体、ポリアミン、ホスフェート骨格の負電荷を中和する正に荷電した他の分子、界面活性剤、小溝/主溝結合剤、正に荷電したポリペプチドおよびインターカレート剤からなる群より選択される、請求項51記載の方法。 52. The pharmaceutical salts, organic solvents, urea, guanidinium, amino acid analogs, polyamine, other molecules positively charged to neutralize the negative charge of the phosphate backbone, surfactants, minor groove / major groove binding agent It is selected from the group consisting of positively charged polypeptides and intercalating agent the method of claim 51.
  53. 【請求項53】 前記塩がトリアルキルアンモニウム塩、塩化ナトリウム、 53. The salt is trialkyl ammonium salt, sodium chloride,
    リン酸塩およびホウ酸塩からなる群より選択される、請求項52記載の方法。 It is selected from phosphate and the group consisting of borate, method of claim 52.
  54. 【請求項54】 前記有機溶媒がホルムアミド、グリコール、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミドからなる群より選択される、請求項52記載の方法。 54. The organic solvent is formamide, glycol is selected from the group consisting of dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide, The method of claim 52, wherein.
  55. 【請求項55】 前記アミノ酸類似体がベタインである、請求項52記載の方法。 55. The amino acid analog is betaine method of claim 52.
  56. 【請求項56】 前記ポリアミンがスペルミジンおよびスペルミンからなる群より選択される、請求項52記載の方法。 56. The polyamine is selected from the group consisting of spermidine and spermine, method of claim 52.
  57. 【請求項57】 前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムおよびナトリウムラウリルサルコシネートからなる群より選択される、請求項52記載の方法。 57. The surfactant is selected from the group consisting of sodium dodecyl sulfate and sodium lauryl sarcosinate, method of claim 52.
  58. 【請求項58】 前記インターカレート剤がアクリジン、エチジウムブロミドおよびアントラシンからなる群より選択される、請求項52記載の方法。 58. The intercalating agent is acridine, it is selected from the group consisting of ethidium bromide and Antorashin The method of claim 52.
  59. 【請求項59】 複数の薬剤が添加される、請求項51記載の方法。 59. A plurality of agents are added, The method of claim 51.
  60. 【請求項60】 前記薬剤が塩、有機溶媒、尿素、グアニジニウム、アミノ酸類似体、ポリアミン、ホスフェート骨格の負電荷を中和する正に荷電した他の分子、界面活性剤、小溝/主溝結合剤、正に荷電したポリペプチドおよびインターカレート剤からなる群より選択される、請求項59記載の方法。 60. The pharmaceutical salts, organic solvents, urea, guanidinium, amino acid analogs, polyamine, other molecules positively charged to neutralize the negative charge of the phosphate backbone, surfactants, minor groove / major groove binding agent It is selected from the group consisting of positively charged polypeptides and intercalating agent the method of claim 59.
  61. 【請求項61】 標的核酸を分析する方法であって、 多数の固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用意し、 多数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用意し、 標的核酸と固定プローブおよび標識プローブとを、標的核酸と完全な対合を形成するプローブと、標的核酸と1塩基誤対合で結合したプローブとの識別を可能とする条件下(ここでは、完全な対合と1塩基誤対合との識別を向上させる薬剤を添加する)で接触させ、 標的核酸のある部位に結合した固定プローブを、固定プローブが結合された部位に隣接する標的核酸の部位にハイブリダイズしている標識プローブに共有結合で結合させ、そして 共有結合で結合された固定プローブと標識プローブを同定する、 各ステップを含む上記方法。 61. A method of analyzing a target nucleic acid, is prepared an array of multiple immobilized oligonucleotide probes, prepared an array of multiple labeled oligonucleotide probes, the immobilized probe and the labeled target nucleic acid a probe, a probe that forms a perfect match with the target nucleic acid, under conditions (in this case to allow identification of the probe bound with a target nucleic acid and 1 base mismatch, erroneous perfect match and single base labels for adding an agent to improve the identification of the pairing) contacting with the immobilized probe attached to a site of the target nucleic acid, which hybridizes to a site of the target nucleic acid adjacent to the site where the immobilized probe is bound probe was covalently bonded, and to identify the fixed probe and a labeled probe that is covalently bound, the method comprising the steps.
  62. 【請求項62】 前記薬剤が塩、有機溶媒、尿素、グアニジニウム、アミノ酸類似体、ポリアミン、ホスフェート骨格の負電荷を中和する正に荷電した他の分子、界面活性剤、小溝/主溝結合剤、正に荷電したポリペプチドおよびインターカレート剤からなる群より選択される、請求項61記載の方法。 62. The pharmaceutical salts, organic solvents, urea, guanidinium, amino acid analogs, polyamine, other molecules positively charged to neutralize the negative charge of the phosphate backbone, surfactants, minor groove / major groove binding agent It is selected from the group consisting of positively charged polypeptides and intercalating agent the method of claim 61, wherein.
  63. 【請求項63】 前記薬剤がホルムアミドである、請求項61記載の方法。 63. The agent is formamide The method of claim 61, wherein.
  64. 【請求項64】 複数の薬剤が添加される、請求項61記載の方法。 64. more agents are added, The method of claim 61, wherein.
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