JP2001512672A - 形態を変化させた遺伝子導入植物およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）から単離したエンド１，４−β−グルカナーゼ遺伝子、プロモーターおよびタンパク - Google Patents

形態を変化させた遺伝子導入植物およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）から単離したエンド１，４−β−グルカナーゼ遺伝子、プロモーターおよびタンパク

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Abstract

(57)【要約】 本発明は変更された構造あるいは形態を示すような遺伝的に操作された植物を開示する。遺伝子導入植物は細胞壁を調節するような導入遺伝子あるいは変更された構造や形態を生じるような遺伝子作成物を発現している。変更された構造や形態はたとえば、同じ種の遺伝子導入をしていない植物と比べた場合、変更された生物量、生育、収量、生体分解への抵抗性が大きいか小さい、反芻動物に対する消化性が良いか悪い、変更されたセルロース含有量、大きな葉/正常な胚軸あるいは小さな葉/長い胚軸などに関連している。 細胞壁を調節する導入遺伝子はセルロース結合ドメイン、セルロース結合タンパク、あるいは、エンドキシログルカン トランスフェラーゼ、キシログルカン エンド−トランスグリコシラーゼ、エクスパンシン、セルロースシンターゼあるいは新規に単離されたArabidopsis thaliana（シロイヌナズナ） のエンド−１，４−β−グルカナーゼのような細胞壁修飾タンパクあるいは酵素である可能性がある。発明はまた、細胞壁を調節するようなタンパクあるいはポリペプチド遺伝子に操作できるように連結されたプロモーターを備える遺伝子作成物を備えている遺伝子導入植物を開示し、さらに分泌シグナルペプチドをコードする配列を備えている可能性がある。特に、発明は、細胞シグナルペプチドおよびセルロース結合ドメインに操作できるように連結されたプロモーターを備える遺伝子作成物を含む遺伝子導入植物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は１９９７年７月２７日に提出されたイスラエル特許出願第１２１４０
４号に優先権を請求し、また、両者とも１９９８年１月１３日に提出された米国
特許出願Ｎｏｓ０９／００６，６３２号および０９／００６，６３６号の一部継
続出願である。開示されているものはすべてそのままここでは参考として取り入
れられる。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、変更した構造や形態を示すように遺伝子工学的な処理を施した植物
に一般的に関係している。変更した構造や形態はたとえば、生物量、収量、ある
いは生育、あるいはより大きな植物あるいはより小さな植物などに関連するもの
である。さらに特に本発明は、細胞壁調節導入遺伝子あるいは変更した構造や形
態を持っている遺伝子導入植物を生じるような遺伝子作成物を発現している遺伝
子導入植物に関係している。細胞壁調節導入遺伝子は、セルロース結合タンパク
、セルロース結合ドメインあるいは細胞壁修飾タンパクあるいは酵素をコードし
ている遺伝子である。発明はさらに、エンド−キシログルカン トランスフェラ
ーゼ、キシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ、セルロースシンターゼ
、あるいは新規に単離されたエンド−１，４−β−グルカナーゼをコードする遺
伝子のような導入遺伝子を発現している変更された構造や形態を持つ遺伝子導入
植物に関係している。発明はまた、構成的な、あるいは組織特異的なプロモータ
ーによって制御されている細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドとともに分
泌シグナルペプチドをコードしている遺伝子作成物を含む遺伝子導入植物にも関
係している。１つの実施例では、組織特異的なプロモーターは、Arabidopsis th
alianaにおける新規の伸長している組織に特異的なプロモーターで、すなわちｃ
ｅｌ１プロモーターである。発明はまた、新規に単離されたエンドグルカナーゼ
、すなわち、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子
（ｃｅｌ１）、そのプロモーター（ｃｅｌ１プロモーター）およびそれがコード
されたポリペプチド（Ｃｅｌ１）および分泌シグナルペプチド配列の存在下ある
いは非存在下でおよび/あるいはｃｅｌ１プロモーターｃｅｌ１遺伝子を含む組 換えベクターにも関係している。
【０００３】
【発明の背景】
２．１植物の伸長と生育 植物細胞の伸長は植物−組織の発生において主要な重要性を持った基本的な過
程である。細胞の伸長ではまず強固な細胞壁の弛緩が求められる（Carpita and
Gibeaut, 1993, Plant J. 3:1-30; Cosgrove, 1993, Plant Physiol. 102:1-6;
Fry, 1988, 生育している植物細胞壁の化学と代謝分析、Lonoman Scientific &
Technical, New York; Roberts, 1994, Curr. Opin. Cell Biol. 6:688-694)。 この弛緩についてはエンド−キシログルカン トランスフェラーゼ（Nishitani
and Tominaga, 1992, J. Biol. Chem. 267:21058-21064)、キシログルカン エ ンドトランスグリコシラーゼ（Fry at al., 1992, Biochem J. 282:821-828)お よびエクスパンシン(McQueen-Mason and Cosgrove, 1995, Plant Physiol. 107:
87-100)の活性化を含むいくつかのメカニズムが提案されている。エンド−１， ４−β−グルカナーゼ（下文ではＥＧａｓｅ）は伸長過程で重要な役割を担って
いることが示唆されている（Shoseyov and Dekel-Reichenbach, 1992, Acta Hor
t. 329:225-227; Verma et al., 1975, J. Biol. Chem. 250:1019-1026)。
【０００４】 １、３−１、４−β−グルカン特異的酵素が細胞の伸長に関わっているという
実質的な証明は単子葉植物に見られた(Hatfield and Nevins, 1987, Plant Phys
iol. 83:203-207; Hoson and Nevins, 1989, Plant Physiol. 90:1353-1358 198
9; Inouhe and Nevins, 1991, Plant Physiol. 96:426-431)。ＥＧａｓｅは植物
が生育する間および果実が成熟する間にキシログルカンの分解に関わっている（
Hayashi, 1989, Ann. Rev. Plant Physiol. 40:139-168; Hayashi et al., 1984
, Plant Physiol. 25:605-610)。この酵素の活性は、たとえば植物の発生と細胞
の伸長に含まれているシグナル分子であるオリゴサッカリンの生成に影響を与え
る（Darvill et al., 1992, Glycobiology 2:181-198の概説参照）。
【０００５】 現在までに単離されたＥＧａｓｅ遺伝子のほとんどは果実の成熟(Cass et al.
, 1990, Mol. Gen. Genet. 223:76-86; Fischer and Bennett, 1991, Ann. Rev.
Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:675-703; Lashbrook et al., 1994, Pla
nt Cell 6:1485-1493; Tucker et al., 1987, Plant Mol. Biol. 9:197-203)お よび器官脱離層(Kemmerer and Tucker, 1994, Plant Phyisiol. 104:557-562; T
ucker and Milligan, 1991, Plant Physiol. 95:928-933; Tucker et al., 1988
, Plant Physiol. 88:1257-1262)との関わりで研究されてきた。
【０００６】 ごく最近、Wu et al.（1996、Plant Physiol. 110:163-170)はエンドウ豆から
ＥＧａｓｅをクローニングし、伸長している上胚軸においてオーキシンによって
その発現が誘導されることを示した。
【０００７】 細胞の伸長における内因性の調節は細胞壁のメカニズムによって支配されてい
ると思われる。この過程は、内部の膨圧と細胞壁の機械的な強さとの相互作用に
よる結果である（Steer and Steer, 1989, New Phytol. 111:323-358で概説され
ている）。ほとんどの植物細胞とは異なって、花粉管と根毛の生育は先端層に限
局している（Cresti and Tiezzi, 1992, “花粉管の放射機構と先端生育”植物 の性的繁殖の中で ｐｐ89-97、Cresti and Tiezzi編、Springer-Verlag, Berli
nで概説されている）。花粉管の生育領域は完熟した場合、２つの異なった層か らなっている。内層はほとんどカロース−関連分子からなり、外層はペクチン、
キシログルカン（ＸＧ）、セルロース（結晶性は低いかほとんど無い）およびそ
のほかの多糖類を含んでいる(Steer and Steer, 1989, New Phytol. 111:323-35
8で概説されている）。
【０００８】 キシログルカン（ＸＧ）はβ−（１−４）−Ｄ−グルカンの直鎖であり、セル
ロースとは異なって、それらは直鎖におけるグルコシル単位の０−６部位に対し
て規則的な位置に付加されたキシロシル単位を数多く持っている（Carpita and
Gibeaut, 1993, Plant J. 3:1-30で概説されている）。ＸＧはアルカリ処理で抽
出することができ、in vitro で再びセルロースに結合することができる（Hayas
hi et al.,1994, Plant Cell Physiol. 35:1199-1205)。
【０００９】 ＸＧはすべての双子葉植物、および一部の単子葉植物の細胞壁におけるセルロ
ース微小繊維に結合している(Roberts, 1994, Curr. Opin. Cell Biol. 6:688-6
94に概説されている）。 セルロース微小繊維に結合しているＸＧは細胞壁枠組
みに架橋している。
【００１０】 伸長を含めて植物細胞の増殖には、局所細胞壁が緩むことと新しい細胞壁素材
の制御された沈着が統合することが求められる。Fry et al.(1992, Biochem J.
282:821-828)およびNishitani and Tominaga(1992, J. Biol. Chem. 267:21058-
21064)はそれぞれキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）お
よびエンド−キシログルカン トランスフェラーゼ（ＥＸＴ）を精製した。これ
ら２つの酵素は１つの断片からもう１つのＸＧ分子へと微小繊維間のＸＧを運搬
する役目を担っており、細胞壁弛緩酵素であることが示唆された。
【００１１】 しかしながら、McQueen-Mason et al.(1993, Planta 190:327-331)は、キュウ
リの胚軸におけるin vitro の細胞壁拡張にはＸＥＴの活性は関与していないこ とを示した。
【００１２】 生育している組織におけるＸＧの効果は広く研究されている。β−（１−４）
−Ｄ−グルカナーゼによる部分分解によって作成されたＸＧオリゴ糖類は、植物
細胞の成長を変更する“オリゴサッカリン”と呼ぶ(Aldington and Fry, 1993,
植物研究の進歩 19:1-101で概説されている）。そのようなオリゴサッカリンの １つである、ＸＸＦＧ（ＸＧ９）は約１ｎＭの濃度で、オーキシン２，４Ｄによ
って、エンドウ豆の葉柄断片に誘導された生長促進に対して拮抗する(York et a
l., 1984, Plant Physiol. 75:295-297; McDougall and Fry, 1988, Planta 175
:412-416)。その一方で、高い濃度(e.g.,100μｍ)ではオリゴサッカリンは軟白 化したエンドウ豆の葉柄断片の伸長を促進する(McDougall and Fry,1990, Plant
Physiol. 93:1042-1048)。オリゴサッカリンの作用様式は未だに判っていない 。
【００１３】 “エクスパンシン”と名付けられたもう１つの細胞壁弛緩タンパクはMcQueen-
Mason et al.によって単離された（1992, The Plant Cell 4:1425-1433)。 エ クスパンシンは細胞壁成分のいずれとも加水分解活性は示さない。それはセルロ
ース微小繊維と多糖類マトリックスとの界面で結合しており、この重合体ネット
ワークの中で非共有結合を可逆的に破壊することによって細胞壁の拡大を誘導す
ると示唆されている(McQueen-Mason and Cosgrove, 1995, Plant Physiol. 107:
87-100)。
【００１４】 セルロースに結合している有機物質の中にはｉｎ ｖｉｖｏで細胞の生育およ
びセルロース−微小繊維の会合を変更するものがある。直接染料、カルボキシメ
チルセルロース（ＣＭＣ）および蛍光光沢剤（ＦＢＡ，たとえばカルコフロー白
色ＳＴ）は、Acetobacter xylinumの微小繊維の結晶化を妨げ、それによって重 合を高めている。このような分子は細胞表面から突出した直後、多糖類と結合し
、微小繊維と細胞壁の正常な会合を妨げる（Haigler, 1991, “微小繊維の生物 発生における重合と結晶化の関係”セルロースの生合成と生物分解の中pp99-124
, Haigler and Weimer 編、Marcel Dekker Inc. New York)。Haiglerはセルロー
スに結合する染料や蛍光光沢剤はｉｎ ｖｉｖｏでセルロース微小繊維の会合を
変更すると議論している。紅藻(Waaland and Waaland , 1975, Planta 126:127-
138)および根端(Hughes and McCully, 1975, 染色技術50:319-329)を染料の存在
下で生育させると細胞の形に変形が観察された。今では、このような分子が原核
細胞や真核細胞の細胞表面からの突出直後にセルロース鎖に結合し（Haigler an
d Brown, 1979 Science 210:903-906; Benziman et al., 1980, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 77:6678-6682; Haigler et al., 1980, Science 210:903-906; B
rown et al., 1982, Science 218:1141-1142)、結晶構造の形成を妨げる(Haigle
r and Chanzy, 1988, J. Ultrastruct. Mol. Struct. Res. 98:299-311)のは明 らかである。さらに、セルロースの重合速度は染料の存在下では上昇することが
判った(Benziman et al., 1980)。結晶化はこのような連結した反応のボトルネ ックであり、それを妨害することはセルロースシンターゼ活性の増進を招くこと
になると提案された。
【００１５】 ２．２セルロース結合タンパクとドメイン 多くのセルラーゼやヘミセルラーゼ（たとえば、キシラナーゼおよびマンナーゼ
）はその基質に結合する能力を持っている。このような酵素は一般的に基質を加
水分解するための活性部位を含む触媒ドメインおよび不溶性のセルロース化合物
マトリックスあるいはヘミセルロース化合物マトリックスを結合するための炭水
化物結合ドメインあるいはセルロース結合ドメイン（ここでは一般に“ＣＢＤ”
と表す）を持っている。
【００１６】 現在までに１２０を越えるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）がＩ−Ｘと表さ
れる１０のファミリーに分類されている（Tomme et al., 1995, “セルロース結
合ドメイン：分類と特性”ＡＣＳシンポジウム、シリーズ６１８酵素性分解と不
溶性炭水化物、pp142-161, Saddler and Penner 編、全米化学会，ワシントンＤ
Ｃ）（ここでは参考として取り入れられる）。ほとんどのＣＢＤはセルラーゼお
よびキシラナーゼから同定されているが、中には多糖類や非触媒タンパクから同
定されたものもある。これまでに同定されたＣＢＤは、真菌、細菌および粘菌か
らのものである。
【００１７】 ＣＢＤの１０ファミリーは以下のとおりである：ファミリーＩ ＣＢＤはすべ
て真菌のβ−１，４−グルカナーゼに由来している；ファミリーＩＩ ＣＢＤは
細菌の加水分解酵素の中で見い出されている；ファミリーＩＩＩ ＣＢＤはβ−
１，４−グルカナーゼの中で見い出されている；ファミリーＩＶ ＣＢＤは元々
２つの保存的なシステイン残基を持っているものである；ファミリーＶはErwini
a chysanthemiに由来するＣＢＤを表している；ファミリーＶＩ ＣＢＤは元々 キシラナーゼ由来のものであり、ほとんどすべてタンパクのＣ末端に位置してい
る；ファミリーＶＩＩはClostridium thermocellumのＣＢＤを表している；ファ
ミリーＶＩＩＩはDictyostelium discoidum のＣＢＤを表している；ファミリー
ＩＸ ＣＢＤは熱安定性のキシラナーゼのＣ末端における直列反復として存在す
ることが知られている；およびファミリーＸはPseudomonas fluorescensのｓｐ ｐ．セルローザに由来するキシラナーゼＥである。本発明で有用なＣＢＤファミ
リーおよび個々のＣＢＤに関する詳細な記載については、ここで参考として取り
入れられるTomme et al.の表ＩＩを参照されたい。
【００１８】 ShoseyovとDoi(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2192-2195)は、セルロ
ース分解性細菌、Clostridium cellulovoransのセルラーゼ“複合体”から独特 のセルロース結合タンパク（ｃｂｐＡ）を単離した。セルラーゼ複合体の主なサ
ブユニットはセルロースに結合することが判明したが、加水分解活性は持たず、
結晶セルロースの分解に必須であった。
【００１９】 ｃｂｐＡ遺伝子がクローニングされ、配列決定された（Shoseyov et al., 199
2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3483-3487)。ｃｂｐＡのセルロース結合ド
メイン（ここではこの特殊なＣＢＤを“ｃｂｄ”と呼ぶ）に隣接したＰＣＲプラ
イマーを用いて、これを過剰発現ベクターにうまくクローニングしてEscherichi
a coli(大腸菌）でおよそ１７ｋＤａのｃｂｄを過剰生産することができた。組 換えｃｂｄはセルロースに対して極めて強い親和性を示した(米国特許第５，４ ９６，９３４号；Goldstein et al.,1993, J. Bacteriol. 175:5762-5768; ＰＣ
Ｔ国際出願 ＷＯ９４／２４１５８号、すべてここでは完全に述べているかのよ
うに参考として取り入れる）。
【００２０】 最近、数種のＣＢＤが別の原材料から単離されている。これらのほとんどは、
別の触媒領域、すなわちセルラーゼおよびセルロース結合ドメインを持っている
タンパクから単離されているが、２つだけは明らかな加水分解活性はないがセル
ロース結合活性は持っているようなタンパクから単離されている（Goldstein et
al., 1993, J. Bacteriol. 175:5762-5768; Morag et al., 1995, Appl. Envir
on. Microbiol. 61-1980-1986)。
【００２１】 ２．３ Clostridium cellulovoransのＣＢＤは苗と花粉管の伸長に影響を 与える 培養で生育させた場合、Clostridium cellulovoransのｃｂｄを外から加える ことによって花粉管や苗の伸長が調節されることが判った。ＰＣＴ国際出願 Ｗ
Ｏ９４／２４１５８ ７３〜７７ページを参照されたい。
【００２２】 C. cellulovoransのｃｂｄは、液体培養で生育しているモモの花粉粒の花粉管
生育を促進した。５０μｇ/ｍｌのｃｂｄにさらした花粉粒は、５０μｇ/ｍｌの
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）処理した花粉粒に比べて約２倍の大きさの花粉管
を作った。
【００２３】 C. cellulovoransのｃｂｄの存在下、蒸留水中で発芽させたArabidopsis thal
ianaの種子はｃｂｄの高い濃度と低い濃度によって別々に反応した。高い濃度の
ｃｂｄ（１〜１００μｇ/ｍｌ）では根の長さを劇的に減らした。低い濃度のｃ ｂｄ（１ｘ１０−６から１ｘ１０−４μｇ/ｍｌ）では根の伸長を促進したが、 ＢＳＡ処理では効果はなかった。苗の長さにおける効果も似たような傾向を示し
たが、処理による差異は根ほど劇的ではなく、統計的には差はなかった。
【００２４】 花粉管の細胞壁は先端層でセルロース小繊維に曝されていることが明らかにさ
れている（Steer and Steer, 1989, New Phytol. 111:323-358で概説されている
）。 花粉管の伸長は先端で起きることが知られている（Cresti and Tiezzi, 1
992 “花粉管の突出、機構および先端生育”、植物の性的繁殖pp89-97, Cresti
and Tiezzi編、Springer-Verlag, ベルリン で概説されている）。ｃｂｄのゴ ールド−免疫標識によってｃｂｄは主として先端層に存在していたことが示され
た。さらに、ｃｂｄ処理した花粉管の先端層でカルコフロー染色されないという
ことは結晶構造がないことを示していた。ＰＣＴ国際出願 ＷＯ９４/２４１５ ８を参照されたい。
【００２５】 細胞壁においてＸＧ鎖がセルロース化合物ネットワークと架橋していることは
すでに判っていることである（Roberts, 1995, Curr. Opin. Cell Biol. 6:688-
691)。細胞の伸長に必須の条件は、Inouhe and Nevins (1991. Plant Physiol.
96:426-431)により示されたように加水分解によって、あるいはグリコシド交換(
Fry et al., 1992, Biochem. J. 828:821-828; Nishitani and Tominaga, 1992,
J. Biol. Chem. 267:21058-21064)、あるいはＸＧ−セルロース結合と相互作用
するエクスパンシン(McQueen-Mason et al., 1992, The Plant Cell 4:1425-143
3)によって、架橋しているセルロースネットワークを緩めることであるというこ
とは受け入れられている。ｉｎ ｖｉｔｒｏの競合試験によって、ｃｂｄはセル
ロースとの結合でＸＧと競合することが判った。４時間後に達成されるＸＧのセ
ルロースへの結合(Hayashi et al., 1987, Plant Physiol. 83:384-389)に比べ て、セルロースへのｃｂｄの結合最大値は１時間後に得られる(Goldstein et al
. 1993, J. Bacteriol. 175:5762-5768)。伸長過程の間で、セルロース微小繊維
は露出され、ｃｂｄは露出したセルロース微小繊維との結合でＸＧと競合するこ
とが示唆されている。従って、この競合によって細胞壁の一時的な緩みが生じ、
その結果、伸長を高めるという可能性がある。
【００２６】 根の伸長におけるｃｂｄの抑制効果は、強固なセルロース小繊維のネットワー
クを緩めることを介して細胞の伸長を調節する酵素やタンパクがアクセスできな
いような過剰量のｃｂｄによって、セルロース小繊維が立体障害を受けるという
ことで説明することができる。この仮説は、抗−β−Ｄ−グルカン抗体（Hoson
and Nevins, 1989, Plant Physiol. 90:1353-1358)あるいは細胞壁グルカナーゼ
に特異的な抗体(Inouhe and Nevins, 1991, Plant Physiol. 96:426-431)により
オーキシンで誘導した伸長を阻害したNevinsによって支持されている。
【００２７】 C. cellulovoransにおけるＣｂｐＡタンパクのｃｂｄは細菌タンパクである。
細胞壁の伸長の調節におけるその作用様式は自然の過程とは異なっている可能性
がある。
【００２８】
【発明の要約】 本発明は、出来上がった植物が構造や形態を変えることができるように、植物
細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドの組換え核酸あるいは導入遺伝
子、組換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を発現するような遺伝子導入植
物の生産を提供する。本発明は特に、セルロース結合タンパク、セルロース結合
ドメインあるいは細胞壁修飾酵素に限定するものではないが、そのような植物の
細胞壁を調節するタンパクやポリペプチドを発現することにより変更された構造
や形態を提供する。特別に好ましい実施例では、細胞壁を調節するタンパクはセ
ルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）である。
【００２９】 本発明の１つの実施例に基づいて、変更された構造や形態を持つ望ましい植物
を完成することには、適切なプロモーターの調節の下で植物の細胞壁を調節する
タンパクやポリペプチドの発現が必要である。この実施例の１つの様式では、プ
ロモーターは、植物プロモーターで、組織特異的あるいは発生段階特異的なもの
である。適切なプロモーターには、たとえば伸長している組織に特異的なプロモ
ーター（たとえば、ｃｅｌ１プロモーター）、カルコンシンターゼ・プロモータ
ー（ＣＨＳ）、およびトマトに由来するＰＡＴＡＴＩＮプロモーターなどが含ま
れる。この実施例の別の様式では、プロモーターは植物の全組織において、全生
活環を通して構成的で活性のあるものである（たとえば、カリフラワーモザイク
ウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター）。しかしながら、細胞壁を調節する
タンパクやポリペプチドをコードする組換え核酸とプロモーターのどのような組
合せも発明に基づいて有用である。
【００３０】 また、発明に基づいて、何らかの適切な分泌シグナルペプチドに融合した細胞
壁を調節するタンパクやポリペプチドを持つことによって完成される、発現して
いる植物細胞から、細胞壁を調節する組換え核酸や導入遺伝子が分泌される可能
性もある。
【００３１】 発明はさらに、遺伝子導入植物の種子を提供し、その種子は植物の細胞壁を調
節する組換え核酸、導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を
持っている。発明はまた、植物の細胞壁を調節する組換え核酸、導入遺伝子、組
換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を持っている遺伝子導入植物の子孫、
クローン、細胞株あるいは細胞を含んでいる。
【００３２】 発明のもう１つの特徴に基づいて、Arabidopsis thalianaに由来する新規のエ
ンド−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＧａｓｅ）遺伝子（ｃｅｌ１）とタンパク
（Ｃｅｌ１）を提供する。 また、A. thalianaのＥＧａｓｅ遺伝子の伸長して いる組織に特異的なプロモーター（ｃｅｌ１プロモーター）あるいはその機能的
断片を提供する。
【００３３】 本発明のさらにもう１つの特徴に基づいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というAr
abidopsis ｃｅｌ１あるいはその変異体のアミノ酸配列をもつタンパクあるい はポリペプチドをコードしている単離された核酸分子を提供する。特にＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２という配列を持っている単離された核酸分子を提供する。
【００３４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９という配列を持つArabidopsis エンド−１，４−β −グルカナーゼ遺伝子のゲノムクローンを備える単離された核酸分子を提供する
。
【００３５】 特別の実施例によって例示されたさらにもう１つの特徴に基づいて、Arabidop
sis thaliana ｃｅｌ１遺伝子と同様に遺伝子および種の変異体、および自然に
起きる、あるいは人工的なその機能的変異体に相当するアミノ酸配列を含むよう
なポリペプチドを提供する。本発明はまた、Arabidopsis ｃｅｌ１ポリペプチ ドの誘導体あるいは類縁体も提供する。
【００３６】 さらに、本発明は上記ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドベクターおよび組
換え核酸ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３７】 さらにもう１つの特徴に基づいて、Arabidopsis エンド−１，４−β−グル カナーゼ（ｃｅｌ１）遺伝子、遺伝子および種の変異体、および自然に起きる、
あるいは人工的なその機能的変異体に相当するアミノ酸配列を備えるポリペプチ
ド、その誘導体および類縁体を提供する。 さらに、エンド−１，４−β−グル
カナーゼ活性あるいはセルロースあるいはヘミセルロースに結合する能力を持っ
ているタンパクは天然に生じるアミノ酸配列ではない可能性がある。後者をコー
ドする核酸配列は、たとえばスクリーニング物質としてセルロースを用いたラン
ダムディスプレイライブラリに由来する可能性がある。
【００３８】 本発明はさらに、分泌シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列および細
胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードする第２の核酸配列を備
える組換え核酸ベクターに関係している。さらに特別な実施例では、細胞壁を調
節するタンパクあるいはポリペプチドは、セルロース結合タンパク、セルロース
結合ドメインおよび細胞壁修飾酵素から選ばれる。
【００３９】 発明は部分的には数多くの予期しない驚くべき発見に基づいている。その１つ
が、遺伝子導入植物においてセルロース結合タンパクあるいはセルロース結合ド
メイン（ＣＢＤ）を発現するということは、変更された構造的形態を持った遺伝
子導入植物を生じるという発見である。そのほかには、遺伝子導入植物において
Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を発現するとい
うことは、変更された構造的形態を持った遺伝子導入植物を生じるという知見で
ある。このような知見はともに遺伝子導入植物において細胞壁を調節するような
導入遺伝子を発現するということが、変更された構造や形態を持った植物を生じ
るということを示している。
【００４０】 植物の形態を変えるためには、たとえば、生育を刺激したり阻害したりするた
めには、遺伝子導入植物においていかなるＣＢＤでも発現するということが発明
の目的である。１つの実施例では、ｃｅｌ１プロモーターの制御下で、ｃｅｌ１
シグナルペプチドとともにＣＢＤが細胞壁を標的として、いかなるＣＢＤでも発
現させて、組織特異的な生育の調節を生じさせることも発明の目的である。
【００４１】 発明は変更された構造や形態を持った植物を生産することに有用性を持ってい
る。そのように変更された構造や形態によって、生育率の改善された、生物量が
さらに大きいあるいは小さい植物、生物分解への抵抗性がさらに大きいあるいは
小さい植物、反芻動物にとって消化率がさらに優れたあるいは劣る植物、修飾さ
れた繊維を持つ植物あるいはセルロース含有量が変わった植物が提供される。
【００４２】 発明のｃｅｌ１遺伝子は、構造や形態を変更するために遺伝子導入植物におい
て細胞壁を調節するようなタンパクおよびポリペプチドをコードする導入遺伝子
としての有用性を持っている。本発明のｃｅｌ１プロモーターは、遺伝子導入植
物において組織特異的な様式で、関心のあるタンパク、ポリペプチドあるいはペ
プチドを発現するために伸長している組織に特異的な植物プロモーターとして利
用される可能性がある。発明のArabidopsis thaliana Ｃｅｌ１タンパクは生化
学的な応用にも利用できる可能性がある。発明のＣｅｌ１分泌ペプチドは関心の
あるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドの細胞性の分泌を促進するために
利用される可能性がある。
【００４３】 ３．１定義 ここで用いられている“変更された構造あるいは形態”という用語は、同一の
条件下で栽培された祖先植物と比較した場合の遺伝子導入植物の構造と形態にお
ける微視的あるいは巨視的変化について言う。変更された構造あるいは形態は、
同じ種の非遺伝子導入植物と比較して、たとえば、変更された生物量、生育、収
量、生物分解の対する抵抗性の大小、反芻動物の消化率の良し悪し、変更された
セルロース含有量、さらに大きい葉/正常な胚軸あるいはさらに小さい葉/さらに
長い胚軸、デンプン生産量および/あるいは含有量、修飾された繊維、開花期な どと関連付けることができる。
【００４４】 “タンパク”、“ポリペプチド”および“ペプチド”という用語は明細書およ
び請求項を通して相互に変換できるように用いる。このような用語はグリコシル
化されたタンパク、すなわち糖タンパクも含んでいる。
【００４５】 ここで用いられている“細胞壁を調節すること”という用語は植物の正常な生
育パターンから変更されたいかなるものについても言う。従って、本発明に基づ
いて、細胞壁を調節するようなタンパクあるいはポリペプチドの導入遺伝子発現
は結果として植物の構造や形態を変更することになる。
【００４６】 “セルロース結合タンパク”という用語は、セルロースあるいはヘミセルロー
スに特異的に結合する、糖タンパクを含むいかなるタンパク、ポリペプチドある
いはペプチドも言う。セルロース結合タンパクはセルロースあるいはセルロース
分解活性を持っていてもいなくてもよい。“セルロース結合ドメイン”（ＣＢＤ
）という用語は、セルロースあるいはヘミセルロースに特異的に結合する、さら
に大きなタンパクの領域や部分である、糖タンパクを含むいかなるタンパク、ポ
リペプチドあるいはペプチド、前記領域あるいは部分を言う。セルロース結合ド
メイン（ＣＢＤ）は、セルラーゼ、キシラナーゼあるいは、たとえばチチナーゼ
など、マルトース結合タンパクのような糖結合タンパクなど、あるいは非触媒性
多糖類結合タンパクのような、そのほかのポリサッカリダーゼの一部である可能
性がある。
【００４７】 現在までに１２０を越えるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）がＩ〜ＸＩＩＩ
と名付けられた少なくとも１３のファミリーに分類されている（Tomme et al.,
1995, “セルロース結合ドメイン：分類と特性”ＡＣＳシンポジウム、シリーズ
６１８酵素性分解と不溶性炭水化物、pp142-161, Saddler and Penner 編、全米
化学会，ワシントンＤＣ;Tomme et al., 1995, Adv. Microb. Physiol. 37:1;
Smant et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4906-4911)(ここでは参 考として取り入れる）。Tommeで記載されたＣＢＤあるいはその変異体、現在知 られているほかのＣＢＤあるいは同定される可能性のある新しいＣＢＤはいかな
るものも本発明において用いることができる。さらに、ＣＢＤはファージディス
プレイペプチドライブラリあるいはペプチド様ライブラリから、ランダムにそう
でなければスクリーニング物質としてセルロースを用いて選択してもよい。（Sm
ith, 1985, Science 228:1315-1317 およびLam, 1991, Nature 354:82-84を参 照されたい。） さらに、ＣＢＤは、キチンに特異的に結合するキチナーゼある
いはマルトース結合タンパクのような糖結合タンパクのようなセルロース（ヘミ
セルロース）以外の多糖類に結合して、セルロースに結合できるような前記部分
を持っているような、糖タンパクを含むタンパク、ポリペプチドあるいはペプチ
ドのある部分の突然変異に由来してもよい。どのような事象においても、ＣＢＤ
はセルロースあるいはヘミセルロースと結合する。
【００４８】 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、出来上がった植物が構造や形態を変えることができるように、植物
細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドの組換え核酸あるいは導入遺伝
子、組換え核酸作成物あるいは導入遺伝子作成物を発現するような遺伝子導入植
物の生産を提供する。本発明は特に、セルロース結合タンパク、セルロース結合
ドメインあるいは細胞壁修飾酵素に限定するものではないが、そのような植物の
細胞壁を調節するタンパクやポリペプチドを発現することにより変更された構造
や形態を提供する。特別に好ましい実施例では、遺伝子導入植物はセルロース結
合ドメインを発現している。いかなるセルロース結合ドメインもこの好ましい実
施例では有利に用いられる。
【００４９】 特別のメカニズムに限定するという意図はなく、発明者は、遺伝子操作の対象
が植物細胞壁におけるセルロースの合成および/あるいは再配列および/あるいは
分解に含まれるタンパクや酵素をコードしている組換え核酸や遺伝子であること
に注意している。
【００５０】 タンパク、ポリペプチドあるいは酵素を発現させて望ましい特性で植物を操作
することができる。遺伝子操作は、プロモーターや分泌シグナルペプチドも備え
る可能性のある、ここで記載されている核酸作成物で植物を形質転換することに
よって成し遂げられる。望ましいタンパク、ポリペプチドあるいは酵素を発現し
ている植物について、形質転換した植物あるいはその子孫はをスクリーニングす
る。
【００５１】 望ましい、変更した構造や形態を示すように遺伝子操作された植物は植物育種
あるいは農業生産や工業的な応用に直接利用することができる。酵素、タンパク
、あるいはポリペプチドの１つを変更した植物は、親や祖先植物と比べてさらに
著しく構造的形態の特徴を変えた系列を作るために、生育を調節する酵素、タン
パクあるいはポリペプチドで変更するように遺伝子操作されたほかの変更植物と
交配することができる。
【００５２】 もう１つの態様では、本発明は、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β
グルカナーゼ（ｃｅｌ１）、ｃｅｌ１プロモーターおよびＣｅｌ１タンパクをコ
ードする単離された核酸を提供する。発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９とい
うヌクレオチド配列によってコードされているArabidopsis thalianaのｃｅｌ１
遺伝子のゲノム配列を備えている単離された核酸分子を提供する。 本発明はさ
らに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というA. thalianaのＣｅｌ１およびその変異体 、誘導体あるいは類縁体のアミノ酸配列を持っているタンパクあるいはポリペプ
チドをコードしている核酸分子を提供する。発明はさらに、記載されている核酸
分子を含んでいる核酸ベクターおよび組換え核酸ベクターを含んでいる宿主細胞
を提供する。A. thaliana ｃｅｌ１核酸およびＣｅｌ１アミノ酸の配列の利用 法も提供する。
【００５３】 単に説明を容易にするために、発明の説明は以下のように区分する：（Ａ）細
胞壁を調節するタンパクを発現している遺伝子導入植物；（Ｂ）遺伝子導入植物
を作成する方法、それには（ｉ）核酸作成物の最適な発現を含む核酸作成物の調
製；（ｉｉ）植物および植物細胞の形質転換；（ｉｉｉ）形質転換した植物およ
び植物細胞の選択および同定；（Ｃ）遺伝子導入した植物における細胞壁を調節
するタンパクの発現に有用なA. thalianaの新規エンド−１，４−βグルカナー ゼ遺伝子の同定および単離、および（Ｄ）遺伝子導入した植物およびA. thalian
aの新規エンド−１，４−βグルカナーゼｃｅｌ１遺伝子、ｃｅｌ１シグナル配 列、ｃｅｌ１プロモーターおよびＣｅｌ１タンパクおよびそのポリペプチド同等
物の応用と利用法。A. thalianaの新規エンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子 の説明には、コードされているタンパク、ｃｅｌ１シグナル配列およびそれ自体
発明の遺伝子導入植物のための伸長している組織に特異的なプロモーターとして
も有用なｃｅｌ１プロモーターに関する説明も含まれる。
【００５４】 ５．１遺伝子導入植物 本発明は、細胞調節タンパクあるいはポリペプチドを発現するようにしむけた
組換え核酸あるいは導入遺伝子を備えている遺伝子導入植物含み、組換え核酸あ
るいは導入遺伝子を含んでいない祖先植物と遺伝子導入植物を似たようなあるい
は同等の生育条件下で栽培し、比べた場合、遺伝子導入植物は変更された構造や
形態を示す。細胞壁を調節する組換え核酸あるいは導入遺伝子はセルロース結合
タンパク、セルロース結合ドメインあるいは細胞壁修飾酵素をコードしている核
酸である。好ましい実施例に基づけば、細胞壁を調節する組換え核酸あるいは導
入遺伝子はセルロース結合ドメインをコードしている核酸である。ここで定める
ようにいかなるセルロース結合ドメインも用いることができる。決して限定する
例ではないが、実例としてセルロース結合ドメインは細菌、真菌、あるいは粘菌
のタンパクあるいはポリペプチドから入手することができる。さらに特別な実例
については、セルロース結合ドメインはClostridium cellulovorans、Clostrid
ium thermocellumあるいはCellulomonas fimi（たとえばＣｅｎＡ，ＣｅｎＢ 、ＣｅｎＤ、ＣｅｎＸ）から入手することができる。セルロース結合ドメインを
発現している遺伝子導入植物で機能している実例は、ここではあとで区分１３、
１５および１８に提示する。
【００５５】 用いる細胞壁調節タンパクはどのような型のものでもよい。 たとえば、タン
パクは、それに限定するものではないが、エンド−１，４−βグルカナーゼ（Ｅ
Ｇａｓｅ）、エンドキシログルカン トランスフェラーゼ、キシログルカン エ
ンドトランスグリコシラーゼ、セルロースシンターゼおよびエクスパンシンのよ
うな植物の生育伸長に関連することが知られている高等植物のタンパクでもよい
。特別な実施例では、ＥＧａｓｅは新規ＥＧａｓｅ、すなわちＣｅｌ１である。
ほかの特別な実施例では、ＥＧａｓｅはトマトあるいはアボガドから入手するこ
とができる。
【００５６】 しかしながら、代わりにタンパクは細菌、真菌あるいは粘菌の、植物の生育を
調節するようなタンパクでもよい。
【００５７】 Clostridium cellulovoransのＣＢＤを発現している遺伝子導入植物がその遺
伝子型（すなわち、ホモ接合体あるいはヘテロ接合体）と強く相関して生育を調
節されているということが、ここでは機能している実例で示されている。
【００５８】 組換え核酸あるいは導入遺伝子は植物のある組織あるいはある発生段階に選択
的に発現してもよいし、あるいは組換え核酸あるいは導入遺伝子は実質的に植物
のあらゆる組織、実質的に植物の全生活環を通して発現していてもよい。 しか
しながら、組合せた発現様式も適用することができる。
【００５９】 もう１つの特別な実施例では、遺伝子導入植物は、エンド−１，４−βグルカ
ナーゼであるような細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドを備えてい
る。さらに特別な実施例では、ＥＧａｓｅはArabidopsis thalianaから入手する
ことができる（下の区分５．３を参照）。
【００６０】 本発明はまた、細胞壁を調節するポリペプチドが遺伝子導入植物で発現される
ようにプロモーターに操作可能に連結した、細胞壁を調節するポリペプチドをコ
ードしている組換え核酸あるいは導入遺伝子を備える組換え核酸作成物あるいは
遺伝子作成物を持っている遺伝子導入植物を含み、遺伝子導入植物は組換え核酸
作成物あるいは遺伝子作成物を含まない祖先植物と遺伝子導入植物を同様の条件
下で栽培した場合、祖先植物と比べて変更した構造あるいは形態を示す。
【００６１】 特別な実施例では、プロモーターは構成的な植物プロモーターである。さらに
特別な実施例では、植物プロモーターは伸長している組織に特異的なｃｅｌ１プ
ロモーターである（下の区分５．３参照）。
【００６２】 もう１つの実施例では、植物プロモーターは、種子特異的、果実特異的、成熟
特異的、開花特異的などのような発生段階特異的なプロモーターである。
【００６３】 好ましい実施例では、遺伝子導入植物は、ｃｅｌ１プロモーターおよびＣｅｌ
１をコードしている核酸の組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を備えている
。
【００６４】 もう１つの好ましい実施例では、遺伝子導入植物は、ｃｅｌ１プロモーターお
よびＣＢＤをコードしている核酸の組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を備
えている。
【００６５】 さらにもう１つの好ましい実施例では、遺伝子導入植物は、分泌シグナルペプ
チド、さらに特別にはｃｅｌ１の分泌シグナルペプチドをさらに含むような核酸
の組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を含んでいる。
【００６６】 本発明はまた、上述した遺伝子導入植物の種子を含み、その種子は組換え核酸
、導入遺伝子、組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を持っている。
【００６７】 本発明はさらに、上述した遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株あるいは
細胞を含み、その子孫、クローン、細胞株あるいは細胞は組換え核酸、導入遺伝
子、組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物を持っている。
【００６８】 ５．２ 遺伝子導入植物の作成 ５．２．１ 核酸作成物 核酸配列の特性は、多様な可能性のある宿主植物細胞の遺伝的構造のように様
々である。本発明における模範的な実施例に関するこの説明は、熟練者が絶対的
に必須ではないけれども明らかに有利であるとして認識するような数多くの特徴
を含んでいる。これらには、組換え核酸作成物あるいは遺伝子作成物の単離、合
成、あるいは構築の方法、植物細胞に導入すべき遺伝子作成物の操作、遺伝子作
成物のある種の特徴、および遺伝子作成物に関連しているベクターのある種の特
徴を含んでいる。
【００６９】 さらに本発明の遺伝子作成物は、ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子にコードされても
よい。本発明に基づいて、外部から導入された核酸作成物、特に組換えＤＮＡ作
成物をゲノムに統合することを介して、対象植物の望ましい、安定な遺伝子型へ
の変化が影響を受けるのが好ましい。にもかかわらず、本発明に基づいて、その
ような遺伝子型の変化は自己複製し、体細胞的にも、胚の時期にも安定であるよ
うなエピソーム（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）の導入によって影響を受けこともある
。導入される核酸作成物がＲＮＡを備えている場合、このような作成物からの植
物の形質転換あるいは遺伝子発現は、逆転写によって作られるＤＮＡ中間体を介
して先に進んでもよい。
【００７０】 ここで説明されている核酸作成物は当業者に良く知られた方法によって作るこ
とができる。作成物自体を作るのと同様に、作成物の成分を分離し、特徴を調べ
、操作するために用いることができる組換えＤＮＡ法を教えてくれるものとして
、熟練者は、Sambrook et al., 1989, 分子クローニング：実験室マニュアル、C
old Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを引用する。望ましい成分の核
酸配列が判っているような場合では、生物原料から単離するよりも合成した方が
有利かもしれない。そのような場合、熟練者はCaruthers et al., 1980, Nuc Ac
ids Res. Symp. Ser. 7:215-233およびChow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res.
9:2807-2817のような参考文献の教えを引用することができる。ほかの場合では
、望ましい成分はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって有利に作成されるかも
しれない。 ＰＣＲ技術については、熟練者は、Gelfand, 1989, ＤＮＡ増幅の ためのＰＣＴ技術、原理および応用、H. A. Erlich 編 Stockton Press, New Yo
rk, 1988, 分子生物学の現代プロトコール２巻１５章 Ausebel et al編 John Wi
ley & Sonのような参考文献を引用することができる。
【００７１】 ５．２．１．１． 発現作成物 本発明に基づいて、細胞壁を調節するポリペプチドを発現する能力を持った遺
伝子導入植物は、細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードして
いる配列を備える遺伝子作成物で植物細胞を形質転換することによって遺伝子操
作される可能性がある。 １つの実施例では、植物プロモーターは植物細胞壁を
調節する望ましいタンパクあるいはポリペプチドに、操作できるように結合され
ている（“操作できるように結合された”あるいは“操作できるように連結され
た”ということはここでは、“結合された”あるいは“操作できるように連結さ
れた”プロモーターによって制御された転写により、その翻訳産物がポリペプチ
ドであるような機能的メッセンジャーＲＮＡが作られるということを意味するた
めに用いられている）。発明の好ましい実施例では、結合されたプロモーターは
、強力な、組織特異的でも発生段階特異的でもない、植物プロモーターである（
たとえば、多数の、あるいはすべての植物組織型で強く発現しているようなプロ
モーター）。そのような強力な、“構成的な”プロモーターには、それに限定さ
れるものではないが、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、Ｔ−ＤＮＡマンノパイン
シンセターゼ プロモーター、およびそれらの様々な誘導体が含まれる。
【００７２】 本発明のもう１つの実施例では、組織特異的あるいは発生段階特異的なプロモ
ーターで操作できるように結合された細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペ
プチドをコードしている配列を備える遺伝子作成物で植物を操作することが有利
かもしれない。そのようなプロモーターには、それに限定されるものではないが
、ｃｅｌ１プロモーター、ＣＨＳプロモーター、ＰＡＴＡＴＩＮプロモーターな
どがある。たとえば、伸長している組織や器官での発現が望ましい場合、ｃｅｌ
１プロモーターのようなプロモーターを用いる可能性がある。
【００７３】 本発明のさらに別の実施例では、変更した、あるいは人工的なプロモーターで
操作できるように連結された細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドを
コードしている配列を備える遺伝子作成物で植物を形質転換することが有利かも
しれない。通常は、そのようなプロモーターは別々のプロモーターの構造的要素
を再結合することによって構築され、天然のプロモーターには見られない独特の
発現パターンおよび/あるいはレベルを持っている。プロモーターコアとシス調 節要素の再結合で構築された人工プロモーターの例については、Salina et al.,
1992, Plant Cell 4:1485-1493を参照されたい。
【００７４】 本発明のさらに別の実施例では、細胞壁を調節する遺伝子の発現は望ましいタ
ンパクあるいはポリペプチドをコードしている遺伝子のコピー数を増やすことに
よって操作する可能性がある。望ましい遺伝子のコピー数を増やした植物細胞を
作る方法の１つは遺伝子を複数コピー含んでいる核酸作成物で形質転換すること
である。別の方法としては、望ましいポリペプチドをコードしている遺伝子を、
グルタミン シンセターゼ（ＧＳ）あるいはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の
ような増幅−選択可能マーカー（ＡＳＭ）遺伝子を含む核酸構造物に入れること
ができる。そのような作成物で形質転換した細胞は、ＡＳＭ遺伝子のコピー数が
増加することによって細胞株を選抜するという培養法の対象となる。ＧＳ遺伝子
の増幅したコピーを含んでいる植物細胞株を分離するために用いられる選抜プロ
トコールについては、Donn et al., 1984, J. Mol. Appl. Genet. 2:549-562を 参照されたい。望ましい遺伝子がＡＳＭ遺伝子に密接に連関しているので、ＡＳ
Ｍを増幅した細胞株は生育を調節する望ましいポリペプチドをコードしている遺
伝子も増幅することになるのである。
【００７５】 本発明のさらにもう１つの実施例では、細胞壁を調節するタンパクあるいはポ
リペプチドの発現は調節遺伝子をコードしている核酸作成物で植物細胞を形質転
換することにより操作される可能性があり、調節遺伝子は内因性の遺伝子あるい
は望ましいポリペプチドをコードしている導入遺伝子の発現を制御し、導入され
た調節遺伝子は変更され、望ましい組織や発生段階においてポリペプチドを強く
発現できるようにする。
【００７６】 ５．２．１．２．組換え核酸作成物のそのほかの特徴 本発明の組換え作成物は作成物を増殖させるために選択できるマーカーを含ん
でいる可能性がある。たとえば、細菌の中で増殖させるような作成物は、好まし
くは、カナマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシンあるいはクロラム
フェニコールに抵抗性を示すもののような抗生物質抵抗性遺伝子を含んでいる。
作成物を増殖させるために適切なベクターは、ほんの数例しかないが、プラスミ
ド、コスミドあるいはウイルスが含まれる。
【００７７】 さらに、組換え作成物は、このような作成物で形質転換された植物細胞を分離
し、同定し、あるいは追跡するために、植物で発現できる、選択可能な、スクリ
ーニングできるようなマーカー遺伝子を含んでいる可能性がある。選択可能なマ
ーカーには、それに限定されるものではないが、抗生物質抵抗性（たとえば、カ
ナマイシンあるいはハイグロマイシン抵抗性）を示す遺伝子、あるいは除草剤抵
抗性（たとえば、スルホニル尿素、ホスフィノスリシン、グリフォセート抵抗性
）を示す遺伝子が含まれる。スクリーニングできるマーカーには、それに限定さ
れるものではないが、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（Jefferson, 1
987, Plant Molec. Biol. Rep. 5:387-405)、ルシフェラーゼをコードする遺伝 子（Ow et al., 1986, Science 234:856-859)、およびアントシアニン色素産物 を調節するＢおよびＣ１遺伝子産物（Goff et al., 1990, EMBO J 6:2517-2522)
が含まれる。
【００７８】 植物を形質転換するためにAgrobacterium （アグロバクテリウム属）系を利用
する、本発明の実施例では、組換えＤＮＡ作成物はさらに、植物細胞で形質転換
すべきＤＮＡ配列に隣接して少なくとも右側Ｔ−ＤＮＡ境界配列を備える。好ま
しい実施例では、移入されるべき配列には右側および左側Ｔ−ＤＮＡ境界配列が
隣接する。形質転換ベクターに基づいたそのようなＴ−ＤＮＡの設計と構築は当
業者には良く知られている。
【００７９】 ５．２．２．植物および植物細胞の形質転換 本発明に基づいて、望ましい植物は、ここで説明されている核酸作成物で植物
細胞を形質転換することによって得られる可能性がある。ある場合には数種の別
々の遺伝子作成物で植物あるいは植物細胞を操作するのが望ましい可能性がある
。そのような操作は、望ましい遺伝子作成物すべてで同時に植物および植物細胞
を形質転換することによって達成される。別の方法としては、操作は順次行われ
る可能性がある。換言すれば、遺伝子操作は、１つの遺伝子作成物で形質転換し
、選抜とスクリーニングを経て望ましい形質転換体を手に入れ、形質転換体を次
の遺伝子作成物で形質転換し、以下同様にすることによって達成する。ある実施
例では、各遺伝子作成物は別々の選択可能な、あるいはスクリーニングできるマ
ーカー遺伝子と連関していて、複数の遺伝子挿入を含んでいる植物形質転換体の
同定を円滑にできるようにしている。別の実施例では、各遺伝子について操作さ
れた親株と交配することによって、数種の別々の遺伝子を１つの植物に取り入れ
る可能性がある。
【００８０】 本発明の実施例では、遺伝子作成物を植物に導入するためにアグロバクテリウ
ム属を採用する。そのような形質転換では２つのアグロバクテリウム属Ｔ−ＤＮ
Ａベクター（Bevan, 1984, Nuc. Acid Res. 12:8711-8721)および共培養法(Hors
ch et al., 1985, Science 227:1229-1231)を用いる。一般に、アグロバクテリ ウム属の形質転換系は双子葉植物の遺伝子操作に用いられる（Bevan et al., 19
82, Ann. Rev. Genet. 16:357-384; Rogers et al., 1986, Methods Enzymol. 1
18:627-641)。アグロバクテリウム属の形質転換系は単子葉植物および植物細胞 への遺伝子移入および形質転換にも用いられる（Hernalsteen et al., 1984, EN
BO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al., 1974, Nature 311:763-76
4; Grimsley et al., 1987, Nature 325:1677-179; Boulton et al., 1989, Pla
nt Mol. Biol. 12:31-40; およびGould et al., 1991, Plant Physiol. 95:426-
434を参照されたい）。
【００８１】 ほかの実施例では、組換え核酸作成物を植物および植物細胞に導入するために
様々な代替方法を利用してもよい。このようなほかの方法は対象が単子葉植物あ
るいは植物細胞である場合、特に有用である。代わりの遺伝子移入および形質転
換法には、それに限定するものではないが、カルシウム−ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を介したプロトプラスト形質転換、あるいはエレクトロポレーショ
ンによるむき出しＤＮＡの取りこみ（Paszkowski et al., 1984, ENBO J 3:2717
-2722, Potrykus et al., 1985, Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et a
l., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; およびShimamoto, 198
9, Nature 338: 274-276を参照されたい）および植物組織のエレクトロポレーシ
ョン(D'Halluin et al., 1992, Plant Cell 4:1495-1505)が含まれる。植物細胞
の形質転換のための別の方法には微量注入法、シリコン炭化カルシウムによるＤ
ＮＡの取りこみ(Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Reporter 9:415-418)、お
よび微粒子銃（Klein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-430
9; およびGordon-Kamm et al., 1990, Plant Cell 2:603-618を参照されたい） が含まれる。
【００８２】 本発明に基づいて、多種多様な植物および植物細胞系が、本発明の核酸作成物
および上述した様々な形質転換法を用いて、ここで説明されている望ましい生理
学的なおよび農学的な特徴のために操作される可能性がある。 好ましい実施例
では、遺伝子操作のための対象植物および植物細胞には、それに限定するもので
はないが、穀類（たとえば、小麦、トウモロコシ、米、雑穀、大麦）、果実類（
たとえば、トマト、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（たとえ
ば、アルファルファ）、根菜類（たとえば、ニンジン、ジャガイモ、砂糖大根、
山芋）、葉菜類（たとえば、レタス、ほうれん草）のような作物；顕花植物（た
とえば、ペチュニア、バラ、菊）、針葉樹および松の木（たとえば松 モミ、エ
ゾマツ）；環境浄化に用いる植物（たとえば、重金属が蓄積しつつある植物）；
油料作物（たとえばヒマワリ、菜種）および実験目的で用いられる植物（たとえ
ば、Arabidopsis)のような単子葉および双子葉植物が含まれる。
【００８３】 ５．２．３ 形質転換した植物および植物細胞の選抜および同定 本発明に基づいて、それに限定されるものではないが、プロトプラスト、組織
培養細胞、組織および器官の外植体、花粉、胚および植物全体を含むような様々
な植物細胞の中で１つか複数の開示されている遺伝子作成物を操作することによ
り、望ましい植物が得られる可能性がある。本発明の実施例では、以下に説明す
るアプローチや方法のあとで、形質転換体（導入された遺伝子作成物を取りこん
でいるあるいは統合しているようなもの）について遺伝子操作された植物材料を
選抜し、スクリーニングする。形質転換体は植物の中で再生してもよい。別の方
法としては、マーカー遺伝子の追跡のために由来した植物や未熟植物を選抜やス
クリーニングの対象とする前に、遺伝子操作された植物材料を植物や未熟植物の
中で再生する可能性がある。植物細胞、組織あるいは器官から植物を再生するた
めの方法は、選抜やスクリーニングの前であれ、後であれ、当業者には良く知ら
れている。
【００８４】 形質転換された植物細胞、カルス、組織あるいは植物は、形質転換ＤＮＡ上に
存在するマーカー遺伝子にコードされている追跡のために操作された植物材料を
選抜し、スクリーニングすることによって同定し、分離してもよい。たとえば、
形質転換遺伝子作成物が抵抗性を示すような抗生物質あるいは除草剤を阻害量含
んだ培地上で遺伝子操作された植物材料が増殖することによって、選抜を行って
もよい。さらに、本発明の組換え核酸作成物上に存在する可能性のある目に見え
るマーカー遺伝子（たとえばβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、Ｂあるい
はＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって形質転換された
植物および植物細胞を同定してもよい。そのような選抜とスクリーニングの方法
論は当業者には良く知られている。
【００８５】 本発明の遺伝子作成物を含んでいる植物あるいは植物細胞形質転換体を同定す
るためには物理的および生化学的な方法を用いてもよい。このような方法には、
それらに限定されるものではないが：１）組換えＤＮＡの挿入の構造を検出し、
決定するためのサザン分析あるいはＰＣＲ増幅；２）遺伝子作成物のＲＮＡ転写
物を検出し、調べるためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮエース プロテクショ
ン、プラーマ−延長あるいは逆転写酵素−ＰＣＲ増幅；３）そのような遺伝子が
遺伝子作成物にコードされている場合、酵素活性あるいはリボザイム活性のため
の酵素アッセイ；４）遺伝子作成物の産物がタンパクの場合、タンパクのゲル電
気泳動、ウエスタンブロット技術、免疫沈降、あるいは酵素結合イムノアッセイ
、が含まれる。植物の特異的な組織や器官における組換え作成物の存在あるいは
発現を検出するために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成、酵素染色および免疫
染色のような別の方法を用いてもよい。このようなアッセイについてはすべて、
それを行うための方法は当業者によく知られている。
【００８６】 ５．３．Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ ５．３．１．ｃｅｌ１遺伝子、プロモーターおよび組換えベクター もう１つの態様では、本発明は、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β
−グルカナーゼ（Ｃｅｌ１）ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を
含む新規に単離した核酸分子を提供する。１つの実施例では、ポリペプチドはＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列を持っている。
【００８７】 特別の実施例では、単離された核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２というヌク
レオチド配列を持っている。
【００８８】 もう１つの特別の実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列を
もっているポリペプチドをコードしている単離された核酸分子は、遺伝子変異体
、種の変異体、自然に起きる変異体、人工的なあるいは誘導された変異体のよう
な変異体である。核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というポリペプチドの誘導
体あるいは類縁体をコードしてもよい。
【００８９】 実施例やあとで示すように、ｃｅｌ１遺伝子の単離は、アボガドとトマトのＥ
Ｇａｓｅで保存されているアミノ酸配列に従って設計された同義性プラーマ−を
用いて２６０塩基対断片のＰＣＲ増幅によって行い、その後A. thalianaのゲノ ムライブラリをスクリーニングするのに用いた。
【００９０】 ２６０塩基対のＰＣＲ断片とハイブリッドを形成した７．５ｋｂのＳＡｌＩ断
片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を単離し、分析した。A. thalianaのｃｅｌ１遺 伝子は６つのイントロンで分断された７つのエクソンを含んでいることが判った
。
【００９１】 本発明はまた、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼの
ゲノムクローンであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９というヌクレオチド配列を持って
いる単離された核酸分子を提供する。
【００９２】 エクソンの核酸配列を利用して、伸長している組織におけるｃｅｌ１のｍＲＮ
Ａの存在を調べるためにおよびｃｅｌ１のオープンリーディングフレームを含む
ｃｅｌ１のｃＤＮＡを単離するためにＲＴ−ＰＣＲを用いた。ｃｅｌ１の１．５
ｋｂのｃＤＮＡ断片がうまくクローニングされ、配列決定された（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）。ｃＤＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９から推定されたよう
に、組合せたエクソンのＤＮＡ配列に完全に一致していた。
【００９３】 １４７６塩基対のｃｅｌ１オープンリーディングフレームは推定分子量５４キ
ロダルトンで４２９個のアミノ酸からなるポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４）をコードしていることが判った。
【００９４】 あとで、機能している実施例で示すように、７６８塩基対のｃｅｌ１ｃＤＮＡ
断片をプローブとしてｃｅｌ１のノーザンブロット分析を行った。開花している
葉柄の基底節間部と同様に完全に伸びきった葉ではＲＮＡ転写物は検出されなか
った。しかしながら、正常な植物における開花している葉柄の伸長している層で
は強い転写シグナルが検出された。
【００９５】 β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子（ｇｕｓ）と結合したｃｅ
ｌ１の推定プロモーター領域で形質転換した遺伝子導入タバコで組織特異的な発
現を調べた。
【００９６】 ８つの別々の遺伝子導入植物から生じた１６本の苗木で充分なＧＵＳ活性が認
められた。活性は苗条および根両方の伸長している層で見られた。
【００９７】 発明のｃｅｌ１核酸分子には：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＤＮ
Ａ配列；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列をコードしてい
るヌクレオチド配列；（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるｃＤＮＡを補完
してハイブリッド形成する、および機能的に同等な産物をコードするヌクレオチ
ド配列；（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコードし、機
能的に同等な産物をコードしているヌクレオチド配列；および（ｅ）ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４に示されるエンド−１，４−β−グルカナーゼのアミノ酸配列を含
む植物タンパクをコードしているヌクレオチド配列が含まれる。ｃｅｌ１の機能
的な同等物には、ほかの植物種の中で自然に生じた植物のｃｅｌ１、および自然
に生じているあるいは人為的に操作された突然変異ｃｅｌ１が含まれる。発明は
また、配列（ａ）から（ｅ）までの同義性変異体も含んでいる。
【００９８】 発明はまた、先行する段落における（ａ）から（ｅ）のヌクレオチド配列とハ
イブリッドを形成する、従って相補性を持つ核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列を
含んでいる。そのようなハイブリッド形成条件は以下に説明するように、厳密性
が高いか、さほど高くなくてもよい。 核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド
（“オリゴ”）であるような場合では、厳密性の高い条件は、たとえば、３７℃
（１４塩基のオリゴについて）、４８℃（１７塩基のオリゴについて）、５５℃
（２０塩基のオリゴについて）および６０℃（２３塩基のオリゴについて）にて
６ｘＳＳＣ/０．０５％ピロリン酸ナトリウム中で洗浄することを参考にする。
【００９９】 もう１つの特別な実施例では、発明は相同性のある配列を持つヌクレオチド配
列を提供する。たとえば相同性のある配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と同一の
大きさのヌクレオチド配列で、あるいは技術的に知られているコンピュータ相同
性プログラムによって配置された配列と比べた場合、あるいはその配列の核酸が
高い、中程度の、あるいは低い厳密性の条件下でｃｅｌ１コード配列とハイブリ
ッドを形成することができるようなヌクレオチド配列で、６０％あるいは７０％
あるいは８０％あるいは９０％あるいは９５％の相同性あるいは同一性を分かち
合っているような配列である。
【０１００】 限定するものではなく、一例として低い厳密性の条件を用いる方法は以下のと
おりである（Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789
-6792を参照されたい）：３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，５０ｍＭ トリス −ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％フィコ
ール、１％ＢＳＡおよび５００μｇ/ｍｌサケの精子の変性ＤＮＡを含む溶液で 、ＤＮＡを含むフィルターを４０℃にて６時間前処理する。以下の変更を伴った
同じ溶液でハイブリッド形成を行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール
、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ/ｍｌサケの精子のＤＮＡ、１０％（重量/容積）
硫酸デキストラン、および５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐを標識したプローブ
を用いる。フィルターはハイブリッド形成用混合物中で４０℃にて１８〜２０時
間インキュベートし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５
ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で５５℃にて１．５時間洗浄
する。洗浄溶液を新鮮な溶液に取替え、６０℃にてさらに１．５時間インキュベ
ートする。ブロットしたフィルターを乾燥し、オートラジオグラフィを行う。必
要であれば、フィルターは６５〜６８℃にて３回目の洗浄を行い、フィルムに再
び露出する。用いられる可能性のある厳密性の低いほかの条件は技術的によく知
られている。
【０１０１】 限定ではなく１つの例として、厳密性の高い条件で用いられる方法は以下のと
おりである：ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６ｘＳ
ＣＣ、 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％
ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡおよび ５００μｇ／ｍｌサ ケの精子の変性ＤＮＡで構成される緩衝液中で、６５℃にて８時間から一晩かけ
て行う。１００μｇ／ｍｌのサケ精子の変性ＤＮＡ、および５〜２０ｘ１０６ｃ
ｐｍの３２Ｐを標識したプローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で
６５℃にて４８時間はハイブリッド形成を行う。２ｘＳＣＣ、０．０１％ＰＶＰ
、０．０１％フィコールおよび０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で３７℃にて１時
間フィルターの洗浄を行う。その後オートラジオグラフィの前に０．１ｘＳＣＣ
中で５０℃にて４５分間洗浄する。用いられる可能性のある厳密性の高いほかの
条件は技術的によく知られている。
【０１０２】 限定ではなく１つの例として、厳密性の適度に高い条件で用いられる方法は以
下のとおりである：６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ
／ｍｌサケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で５５℃にて６時間から一晩前処理
した。ハイブリッド形成は５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐで標識したプローブ
を加えた同じ溶液中で行い、５５℃にて８〜４８時間インキュベートした。フィ
ルターの洗浄は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて、３０分後に２回
交換することによって行った。適度に高い厳密性のスクリーニングに対するほか
の条件は技術的によく知られている。ハイブリッド形成の条件に関するなお一層
の指針については、たとえば、Sambrook et al., 1989, 分子クローニング、実 験室マニュアル、Cold Spring Harbor Press, New York;およびAusubel et al.,
1989, 分子生物学における現代プロトコール、Green Publishing Associates a
nd Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。
【０１０３】 上述した植物のｃｅｌ１ヌクレオチド配列に加えて、同じ種に存在する完全長
のｃｅｌ１ｃＤＮＡあるいは遺伝子および/あるいは別の植物種に存在するｃｅ ｌ１遺伝子のホモログは、技術的によく知られた分子生物学の技術を用いて、過
度の実験操作なしで同定でき、容易に単離することができる。関連した種におい
てｃｅｌ１遺伝子のホモログを同定するということは、以下の過程を陽性にも陰
性にも変更する：つまり植物の形態を大きくしたり、小さくしたりするように植
物におけるｃｅｌ１を変更するための、植物ｃｅｌ１の作用物質あるいは拮抗物
質を発見するという目的で植物のモデル系を開発するのに役立てることができる
。別の方法としては、そのようなｃＤＮＡライブラリあるいは関心のある生物に
由来するゲノムライブラリについて、ここで説明しているヌクレオチドをハイブ
リッド形成プローブあるいは増幅プローブとして用いてハイブリッド形成法によ
ってスクリーニングすることができる。さらにゲノム中の別の遺伝子座における
遺伝子で、ｃｅｌ１遺伝子産物の１つか複数のドメインと広範囲にわたる相同性
を持つタンパクをコードするものも同様の技術を介して同定することができる。
ｃＤＮＡライブラリの場合は、そのようなスクリーニング技術によって、同一の
種あるいは別の種において代わりにスプライシングを受けた転写物に由来するク
ローンを同定することができる。
【０１０４】 スクリーニングは２つ組のフィルターを用いたフィルターハイブリッド形成に
よる可能性がある。標識されたプローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に見られる
ようにｃｅｌ１ヌクレオチド配列の少なくとも１５〜３０塩基対を含むことがで
きる。ｃＤＮＡライブラリが、標識された配列が由来する生物の型とは別の生物
に由来する場合、用いるハイブリッド形成の洗浄条件は上述したように厳密性を
低くすべきである。
【０１０５】 別の方法としては、関心のある生物に由来するゲノムライブラリをスクリーニ
ングするために、再び適切に厳密な条件を用いて、標識したｃｅｌ１のヌクレオ
チドプローブを用いてもよい。植物ゲノムのクローンを同定し、特徴付けること
は植物の構造的形態を調節するために遺伝子導入植物を利用するのに役立つ。た
とえば、植物遺伝子のイントロン/エクソン境界域に隣接する領域に由来する配 列は、エクソン、イントロン、スプライス部位における（たとえばスプライス・
アクセプターおよび/あるいはドナー部位）突然変異を検知するために増幅アッ セイで用いる際にプライマーを設計するのに役に立つことができる。
【０１０６】 さらに、ｃｅｌ１遺伝子ホモログは、ここで開示されている植物のｃｅｌ１遺
伝子産物の中にあるアミノ酸配列に基づいて設計された２つのオリゴヌクレオチ
ドプラーマープールを用いてＰＣＲを行うことによって関心のある生物の核酸か
ら単離してもよい。反応の鋳型は、たとえばｃｅｌ１遺伝子の発現が判っている
あるいは推測されている植物の細胞株あるいは組織から調製したｍＲＮＡの逆転
写のよって得たｃＤＮＡであってもよい。
【０１０７】 ＰＣＲ産物はサブクローニングし、増幅した配列が植物のｃｅｌ１遺伝子の配
列を示すことを確認するために配列決定を行ってもよい。様々な方法によって完
全長のｃＤＮＡクローンを単離するために、それからＰＣＲ断片を用いてもよい
。たとえば、増幅した断片は、植物ｃＤＮＡライブラリのようなｃＤＮＡライブ
ラリをスクリーニングするために、標識して用いてもよい。別の方法としては、
ゲノムライブラリのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するために、
標識した断片を用いてもよい。
【０１０８】 ＰＣＲ技術は完全長のｃＤＮＡ配列を単離するために利用してもよい。たとえ
ば、常法に従って適切な細胞材料あるいは組織（すなわち、植物のｃｅｌ１遺伝
子の発現が判っているもの、あるいは推測されているもの）からＲＮＡを単離し
てもよい。最初の鎖合成の開始に対して増幅される断片の最５’末端に特異的な
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡ上で逆転写反応を行ってもよい
。 出来上がったＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは通常のターミナルトランスフェ
ラーゼを用いてグアニンの“尾を付加し”ハイブリッドをＲＮエースＨで分解し
、ポリＣプライマーで２番目の鎖合成を開始してもよい。このようにして、増幅
された断片の上流のＤＮＡ配列は容易に単離してもよい。用いる可能性があるク
ローニング戦略の概説については、たとえばSambrook et al., 1989 上記を参照
されたい。
【０１０９】 ｃｅｌ１遺伝子はさらに突然変異を起したｃｅｌ１遺伝子を単離するために用
いてもよい。植物の形態の変更に寄与するような遺伝子型を持っていることが判
っている、あるいは持っていると提案されている植物種から、そのような突然変
異遺伝子が単離される可能性がある。さらに、そのような植物のｃｅｌ１遺伝子
配列は、植物の生育に影響を与えるような、植物のｃｅｌ１遺伝子の調節（たと
えばプロモーターあるいはプロモーター/エンハンサー）欠失を検知するために 用いることができる。
【０１１０】 植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子のｃＤＮＡはたとえば、当業者にはよく知られた
技術である、ＰＣＲを用いて単離してもよい。推定上、植物ｃｅｌ１突然変異遺
伝子を持っている植物種において発現が判っている、あるいは推測される組織か
ら単離したｍＲＮＡに対してオリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドでハイブリッド形
成し、逆転写酵素によって新しい鎖を延長することによって最初のｃＤＮＡ鎖を
合成してもよい。ｃＤＮＡの２番目の鎖はそれから、正常遺伝子の５’末端に特
異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを用いて合成する。このような
２つのプライマーを用いて、産物をＰＣＲで増幅し、適切なベクターでクローニ
ングして、当業者にはよく知られた方法によってＤＮＡの配列解析を行う。正常
な植物ｃｅｌ１遺伝子のＤＮＡ配列と植物ｃｅｌ１の突然変異遺伝子のＤＮＡ配
列を比べることによって、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子の産物の機能を欠損して
いる、あるいは変更しているような突然変異を突きとめることができる。
【０１１１】 別の方法として、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を持っていることが推測される
、あるいは判っている植物種から得たＤＮＡを用いて、ゲノムライブラリを構築
することができる、あるいは植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を発現していることが
推測される、あるいは判っている組織から得たＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラ
リを構築することができる。正常な植物ｃｅｌ１遺伝子あるいはその適切な断片
を標識し、プローブとして用いて、そのようなライブラリにおいて相当する植物
ｃｅｌ１突然変異遺伝子を同定してもよい。当業者にはよく知られている方法に
従って、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子の配列を含んでいるクローンを精製し、配
列解析を行う。
【０１１２】 さらに、たとえば、そのような突然変異遺伝子を持っていることが推測される
、あるいは判っている植物種において、植物ｃｅｌ１突然変異遺伝子を発現して
いることが推測される、あるいは判っている組織から単離したＲＮＡをから合成
したｃＤＮＡを利用することによって、発現ライブラリを構築することができる
。こんな具合で推定上の突然変異体組織で作られた遺伝子産物は発現され、 区
分５．３で、下に説明するように、正常の植物ｃｅｌ１遺伝子産物に対して作成
した抗体と組合せた通常の抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングして
もよい。（スクリーニング技術については、たとえば、Harlow, E. and Lane編 、1988, 抗体：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring ha
rborを参照されたい。）さらに、スクリーニングは、標識したＣｅｌ１融合タン
パクでスクリーニングすることによって達成される。植物Ｃｅｌ１の突然変異に
よって別の機能を持った遺伝子産物が発現するような場合（たとえばミスセンス
やフレームシフト突然変異の結果として）、植物ｃｅｌ１に対する一連のポリク
ローナル抗体は、突然変異植物ｃｅｌ１遺伝子産物との間でおそらく交叉反応を
するはずである。当業者にはよく知られている方法に従って、そのような標識し
た抗体との反応を介して検出されたライブラリ・クローンを精製し、配列解析を
行うことができる。
【０１１３】 発明はまた、突然変異植物ｃｅｌ１をコードしているヌクレオチド配列、植物
Ｃｅｌ１のペプチド断片、切断された植物Ｃｅｌ１および植物Ｃｅｌ１融合タン
パクを含んでいる。これらには、それに限定するものではないが、ここで説明さ
れている突然変異植物Ｃｅｌ１をコードしているヌクレオチド配列が含まれる。
融合タンパクをコードしているヌクレオチドには、限定はされないが、完全長の
植物Ｃｅｌ１、切断された植物Ｃｅｌ１あるいは、たとえば分泌シグナルペプチ
ドのような、関係のないタンパクあるいはペプチドに融合された植物Ｃｅｌ１の
ペプチド断片が含まれてもよい。
【０１１４】 発明はまた、エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を伴った分子を提供する
ような置換、付加あるいは欠失によりｃｅｌ１配列を変更することによるＣｅｌ
１誘導体あるいは類縁体に関係している、従って、Ｃｅｌ１誘導体は、変更され
た配列を含むＣｅｌ１アミノ酸配列の全部あるいは一部をアミノ酸の１次配列と
して含むようなポリペプチドを含めている。変更された配列とは、機能的に同等
なアミノ酸残基が配列の中で機能的に活性のあるポリペプチドを生じるような残
基で置換されているものである。たとえば、配列の中の１つか複数のアミノ酸残
基は、機能的に同等に作用し、結果的には表現として現れないような変更となる
、似たような極性を持った別のアミノ酸で置換することができる。配列の中のア
ミノ酸に対する保存的な置換については、アミノ酸が属しているクラスの別のメ
ンバーから選択してもよい。たとえば、非極性（疎水性）のアミノ酸には、アラ
ニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプ
トファンおよびメチオニンが含まれる。中性極性アミノ酸には、グリシン、スレ
オニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽
性に荷電している（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジン
が含まれる。陰性に荷電している（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグ
ルタミン酸が含まれる。そのようなＣｅｌ１誘導体は、ペプチドの化学合成によ
って、あるいは核酸を変化させたＣｅｌ１をコードしている核酸を用いた組換え
生成によって作成することができる。限定するものではないが、化学的突然変異
誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特定突然変異誘発(Hutchinson et al., 1978, J. B
iol. Chem. 253:6551)、ＴＡＢリンカーの利用、突然変異を含んだプライマーを
用いたＰＣＲなどを含む技術的に知られている突然変異誘発のどのような技術も
用いることができる。
【０１１５】 さらに、望めば非古典的アミノ酸あるいは化学的なアミノ酸類縁体を置換ある
いは付加として、Ｃｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類縁体に導入することがで
きる。非古典的アミノ酸には、限定するものではないが、普通のアミノ酸のＤ型
異性体、２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチ
ル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキ
サン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチ
ン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン
、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、
フェニルグリシン、サイクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ
酸、およびβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸
のような設計したアミノ酸、および一般のアミノ酸類縁体が含まれる。さらに、
アミノ酸はＤ型（右旋性）であってもＬ型（左旋性）であってもよい。
【０１１６】 発明はまた、ｃｅｌ１プロモーターのヌクレオチド配列を備えた、単離した核
酸分子に関係している。
【０１１７】 特別の実施例では、単離された核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１あるいはそ
の機能的断片のヌクレオチド配列を備える、あるいはそれらからなる。
【０１１８】 発明はまた、（ａ）前述の植物ｃｅｌ１コード配列および／あるいはその相補
物（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むような組換え核酸ベクター；（ｂ
）コード配列の発現を行うような調節要素に操作できるように結合した前述の植
物ｃｅｌ１コード配列のいずれかを含むような組換え核酸発現ベクター；および
（ｃ）宿主細胞においてコード配列の発現を行うような調節要素に操作できるよ
うに結合した前述の植物ｃｅｌ１コード配列のいずれかを含むような遺伝子操作
された宿主細胞、を含んでいる。ここで用いられるように、調節要素は、誘発性
および非誘発性のプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を行い
、調節するような、当業者には知られているそのほかの要素を含むが、これに限
るものではない。そのような調節要素は、植物細胞のゲノムに由来するプロモー
ター（たとえば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに
対するプロモーター；葉緑素ａ／ｂ結合タンパクに対するプロモーター）あるい
は植物ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、ＣａＭＶの３５５ＲＮＡプ
ロモーター；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のコートタンパクプロモーター
、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ即時型遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期
あるいは後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム
、ＴＲＣシステム、ファージＡのオペレーターおよびプロモーター主領域、ｆｄ
コートタンパクの制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモー
ター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子）を含むが
、それに限定されるものではない。
【０１１９】 本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列を持つタンパクあ
るいはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；（ｂ）遺伝子変異体、
種変異体、および自然に起きるあるいは人工的なそれらの変異体であるような、
ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の変異体；（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
のＣｅｌ１ポリペプチド誘導体あるいは類縁体をコードしている核酸分子；ある
いは（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２というヌクレオチド配列、を備えている核酸分
子を備える組換え核酸ベクターを含んでいる。
【０１２０】 発明はまた、上述の組換え核酸ベクターを含んでいる宿主細胞に関係している
。
【０１２１】 本発明はさらに、分泌シグナルペプチドをコードしている第1の核酸配列およ び細胞壁を調節するポリペプチドをコードしている第２の核酸配列を備えている
組換え核酸ベクターに関係している。
【０１２２】 もう１つの特別な実施例では、分泌シグナルペプチドはArabidopsis thaliana
から入手できる、ｃｅｌ１に由来する。
【０１２３】 特別な実施例では、組換え核酸ベクターは、ここで上に定めたようにセルロー
ス結合ドメインであるような細胞壁を調節するタンパクポリペプチドを持ってい
る。
【０１２４】 ５．３．２．ｃｅｌ１タンパクおよびポリペプチド 本発明は、Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ｃｅ
ｌ１）遺伝子、遺伝子および種変異体、および自然に起きるおよび人工的な機能
的変異体、およびそれらの誘導体および類縁体に相当するアミノ酸配列を備えて
いるポリペプチドを含んでいる。
【０１２５】 特別な実施例では、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４というアミノ酸配列を持つ
ポリペプチドを提供する。
【０１２６】 発明はまた、エンド−１，４−β−グルカナーゼに限定するものではないが、
それを含む数多くの基準のいずれかによって判断される、上の区分５．３．１で
説明されているような核酸配列によりコードされているｃｅｌ１に機能的に同等
であるようなタンパクを含んでいる。そのような機能的に同等なＣｅｌ１タンパ
クは、表現に現れない変化を生じるので、機能的に同等な遺伝子産物を生産する
、区分５．３．１において上で説明されている植物ｃｅｌ１ヌクレオチド配列に
よりコードされているアミノ酸配列に中におけるアミノ酸残基の付加あるいは置
換に限定されるものではないが、それを含んでいる。アミノ酸の置換は、含まれ
る残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／あるいは両親媒性の性
質における類似性に基づいて行ってもよい。たとえば、非極性（疎水性）のアミ
ノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルア
ラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。中性極性アミノ酸には、
グリシン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン
が含まれる。陽性に荷電している（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンお
よびヒスチジンが含まれる。陰性に荷電している（酸性）アミノ酸にはアスパラ
ギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【０１２７】 ｃｅｌ１ＤＮＡにランダム突然変異を起こし（当業者にはよく知られているラ
ンダム突然変異誘発技術を用いて）、生じた突然変異体の活性を調べる一方で、
ｃｅｌ１コード配列の部位特異的突然変異（当業者にはよく知られている部位特
異的突然変異誘発技術を用いて）を操作して機能を高めた変異体植物細胞を作成
する。
【０１２８】 ｃｅｌ１コード配列に対するそのほかの突然変異は、選択した宿主細胞におけ
る発現や規模拡大などにさらにふさわしいＣｅｌ１タンパクを生成するために行
うことができる。たとえば、ジスルフィド結合を除くためにシステイン残基を削
除したり、ほかのアミノ酸に置換したりすることができる；たとえば、超グリコ
シル化Ｎ−連鎖部位で知られている酵母宿主から容易に回収され、精製される同
質産物の発現を達成するために、Ｎ−連鎖グリコシル化部位を変更したり、削除
したりすることができる。
【０１２９】 Ｃｅｌ１ポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成することができるけれど
も（たとえば、Creighton, 1983, タンパク：構造と分子の本質、W. H. Freeman
& Co, New Yorkを参照されたい）、Ｃｅｌ１に由来する大きなポリペプチドお よび完全長のＣｅｌ１自体は、植物Ｃｅｌ１遺伝子配列および/あるいはコード 配列を含んでいる核酸を発現するために技術的によく知られている組換えＤＮＡ
技術によって有利に作成してもよい。そのような方法は、区分５．１に説明した
ｃｅｌ１ヌクレオチド配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含んでい
る発現ベクターを構築するために用いることができる。このような方法にはたと
えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺
伝的組換えが含まれる。たとえば、Sambrook et al., 1989, 上記およびAusubel
et al., 1989, 上記に記載されている技術を参照されたい。別の方法としては 、ｃｅｌ１ヌクレオチド配列をコードすることができるＲＮＡをたとえばシンセ
ザイザーを用いて化学的に合成してもよい。たとえば、ここでは全体を参考とし
て取り入れている1984, Gait M. J.編、IRL Press Oxfordの、オリゴヌクレオチ
ドの合成の中に記載されている技術を参照されたい。
【０１３０】 たとえば知られている保護基/阻害基のビオチン化、ベンジル化、グリコシル 化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ペギル化、誘導体化、タンパク分解性の
開裂、抗体分子あるいはほかの細胞性リガンドなど、合成の間あるいは後で区別
して修飾されるようなＣｅｌ１タンパク、誘導体および類縁体もまた、発明の範
囲に含まれる。特別な実施例では、ＭＤＣタンパク、誘導体あるいは類縁体はＮ
末端でアセチル化され、および/あるいはＣ末端でアミド化される。数多くの化 学修飾のいかなるものも、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシ
ン存在下での代謝的合成などに限定されるものではないが、これらを含む知られ
ている技術によって行ってもよい。このような修飾は、発明のペプチドの安定性
、生体利用性および/あるいは阻害作用を高めるよう働く可能性がある。
【０１３１】 上で説明したＣｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類縁体のいかなるものも、そ
のアミノ末端および/あるいはカルボキシ末端に共有結合した非ペプチド巨大分 子の担体基を持ってもよい。そのような巨大分子の担体基にはたとえば、脂質−
脂肪酸結合あるいは炭水化物を含めてもよい。
【０１３２】 エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性および/あるいはＣｅｌ１タンパクあ るいはその誘導体（タンパク断片およびキメラタンパク）あるいはその類縁体の
セルロースへの結合能は、以下の区分５．４および６で説明されている方法、あ
るいは当業者に知られている方法のいずれかによって測定することができる。
【０１３３】 発明の植物ｃｅｌ１ヌクレオチド配列を発現させるために多様な宿主発現ベク
ター系を利用してもよい。
【０１３４】 植物ｃｅｌ１コード配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベク ターを構築するために、当業者にはよく知られている方法を用いてもよい。この
ような方法にはたとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およ
びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝的組換えが含まれる。たとえば、Sambrook et al., 1989,
分子クローニング実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory, New Yo
rkおよびAusubel et al., 1989, 分子生物学における現代プロトコール、Greene
Publishing Associates and Wiley Interscience, New York に記載されている
技術を参照されたい。
【０１３５】 ｃｅｌ１コード配列を発現するために多様な宿主−発現ベクター系を利用して
もよい。これらには、限定されるものではないが、以下のようなものが含まれる
：植物ＧｌｕＲコード配列を含んでいる組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラ
スミドＤＮＡあるいはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のよう
な微生物；植物ＧｌｕＲコード配列を含んでいる組換え酵母発現ベクターで形質
転換された酵母；ｃｅｌ１コード配列を含んでいる組換えウイルス発現ベクター
（たとえばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ｃｅｌ１コード配列を
含んでいる組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイ
ルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、あるいは組
換えプラスミド発現ベクターで形質転換した植物細胞系；あるいは、二重微小染
色体で安定的に増幅した（ＣＨＯ/ｄｈｆｒ）あるいは不安定に増幅した（たと えばマウスの細胞株）複数コピーのｃｅｌ１を含むように操作した細胞株を含ん
でいる組換えウイルス発現ベクター（たとえばアデノウイルス、ワクシニアウイ
ルス）に感染させた動物細胞系。
【０１３６】 このような系における発現要素の強さや特異性は様々である。利用する宿主/ ベクター系によって、構成的な、誘発性のプロモーターを含む数多くの適切な転
写および翻訳要素のいかなるものも発現ベクターにおいて用いてもよい。たとえ
ば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、
ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等を用いて
もよい；昆虫系でクローニングする場合、バキュロウイルス・ポリヘドリンプロ
モーターのようなプロモーターを用いてもよい；植物系でクローニングする場合
、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば、ｃｅｌ１プロモーター
、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに対するプロモー
ター； 葉緑素ａ／ｂ結合タンパクに対するプロモーター）、あるいは植物ウイ
ルスに由来するプロモーター（たとえば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモータ
ー；ＴＭＶのコートタンパクプロモーター）を用いてもよい； 哺乳類細胞系で
クローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば
、メタロチオネイン プロモーター）あるいは哺乳類ウイルスに由来するプロモ
ーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．
５Ｋプロモーター）を用いてもよい；複数コピーのｃｅｌ１ＤＮＡを含む細胞株
を作成する場合、ＳＶ４０−，ＢＰＶ−およびＥＢＶ−に基づいたベクターを適
切な選択を行えるマーカーとともに用いてもよい。
【０１３７】 細菌系では、発現されたＣｅｌ１に対して目的とする用途によって、数多くの
発現ベクターを有利に選択してもよい。たとえば、抗体を作成するために、ある
いはペプチドライブラリをスクリーニングするために、大量のＣｅｌ１を生産す
べき場合は、容易に精製される融合タンパク産物を高レベルで発現するようなベ
クターが望ましいかもしれない。そのようなベクターには、限定されるものでは
ないが、以下のようなものがある：ベクターにおいてｃｅｌ１コード配列がｌａ
ｃＺコード領域とフレーム内で連結しているのでＣｅｌ１とｌａｃＺのハイブリ
ッドタンパクが生産されるようなE. coli発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther at
al., 1983, EMBO J. 2:1791)；我々がすでにウサギからの抗体を作成し、精製す
るのに用いているように、ノバゲン(Madison, Wisconsin)から入手したE. coli 発現ベクターｐＥＴ３ｄ；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic A
cid Res. 13:3101-3109; Van heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:55
03-5509)など。
【０１３８】 酵母では、構成的な、あるいは誘発性の数多くのプロモーターを用いてもよい
。 概説のためには以下を参照されたい：分子生物学の現代プロトコール、第２
巻、1988, Ausubel, et al.編、Green Publish. Assoc．Wiley Interscience, c
h12; Grant et al., 1978, 酵母のための発現および分泌ベクター、「酵素学の 方法」の中でWu & Grossman編、1987, Acad. Press, N.Y., Vol 153, pp516-544
; Glover, 1986, ＤＮＡクローニングVol. II. IRL Press, Wash. D.C. ch,3;
およびBitter, 1987, “酵母におけるヘテロ接合体遺伝子の発現”酵素学の方法
、Berger & Kimmel編、Acad. Press, N.Y., Vol 152, pp673-684; および、酵母
サッカロミセスの分子生物学、1982, Strathern et al.編、Cold Spring Harbor
Press, Volおよび I II）。
【０１３９】 植物の発現ベクターを用いる場合、数多くのプロモーターのどのようなもので
ｃｅｌ１コード配列の発現を操作してもよい。たとえば、ＣａＭＶの３５ｓＲＮ
Ａおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（Brisson et al., 1984, Nature 310:511
-514)、あるいはＴＭＶののコートタンパクプロモーター(Takamatsu et al., 19
87, EMBO J. 6:307-311)のようなウイルスプロモーターを用いてもよい；別の方
法としては、ｃｅｌ１プロモーターあるいはその機能的断片、ＲＩＢＩＳＣＯの
小サブユニット(Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al.
, 1984, Science 224:838-834)のような植物プロモーター；たとえば大豆ｈｓｐ
１７．５−Ｅあるいはｈｓｐ１７．３−Ｂ(Gurley et al., 1986, Mol. Cell. B
iol. 6:559-565)のような熱ショックプロモーターを用いてもよい。このような 作成物はＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、ＤＮＡの直
接的な形質転換、微量注入、エレクトロポレーションなどによって植物細胞に注
入することができる。そのような技術の概説については、たとえば、Weissbach
& Weissbach, 1988, 植物の分子生物学のための方法、Academic Press NY, Sect
ion VIII, pp421-463; およびGrierson & Corey, 1988, 植物の分子生物学、2nd
Ed., Blackie, London, ch 7-9を参照されたい。
【０１４０】 組換えタンパクを長期にわたって高い収量で生産するためには、安定的な発現
が好ましい。たとえば、植物Ｃｅｌ１タンパクを安定的に発現している細胞株を
操作してもよい。ウイルス由来の複製物を含むような発現ベクターを用いるので
はなくて、適切な発現制御要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列
、転写終結区、ポリアデニル化部位など）と選択可能なマーカーによって制御さ
れるｃｅｌ１ＤＮＡで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導
入に続いて、操作された細胞は、栄養に富んだ培地で１〜２日増殖させ、選択培
地に移す。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーによって選択に対し抵抗性
を示し、細胞は安定的にプラスミドを染色体に取りこむことができ、増殖巣を形
成し、順にクローン化され、細胞株になっていくことができる。
【０１４１】 様々な選択系を用いてもよく、以下に限定されるものではないが、以下のよう
なものを含んでいる：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, et al.,
1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフ ェラーゼ(Szybalska & Szybalska, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA45:2026)
、およびアデノシン ホスフォリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980
, Cell 22:817)遺伝子がそれぞれｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-あるいはａｐｒｔ-細胞で 用いることができる。また、抗代謝物抵抗性も選択の基礎に用いることができ、
ｄｈｆｒはメソトレキセート抵抗性があり（Wigler et al., 1980, Natl. Acad.
Sci. USA77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:152
7)；ｇｐｔはフェノール酸抵抗性であり（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78:2072)；ｎｅｏはアミノグリコシドＧ−４１８に抵抗性であ
り(Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)；およびｈｙｇｒｏ
はハイグロマイシン抵抗性(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147)である。最 近、追加の選択可能な遺伝子が説明された、すなわち、ｔｒｐＢは細胞がトリプ
トファンの代わりにインドールを利用できるようにし；ｈｉｓＤはヒスチジンの
代わりにヒスチノールを利用できるようにし(Hartman & Mulligan, 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:8047)；およびＯＤＣ（オルニチン デカルボキシラ
ーゼ）はオルニチン デカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−
ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯ抵抗性（McConlogue L., 1987, 分子生物学におけ る現在のコミュニケーションの中、Cold Spring Harbor Laboratory編）である 。発明はまた、（ａ）前述のコード配列および/あるいはその相補物（すなわち アンチセンス）を含むようなＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発現に向けた
調節要素と操作できるように結合した前述のコード配列を含むようなＤＮＡ発現
ベクター；および（ｃ）宿主細胞におけるコード配列の発現に向けた調節要素と
操作できるように結合した前述のコード配列を含むような遺伝的に操作された宿
主細胞および/あるいは植物、を含んでいる。ここで用いられている調節要素は 、誘発性あるいは非誘発性の、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよ
び当業者には知られている、発現を操作し、調節するような、そのほかの要素に
限定されるものではないが、それらを含んでいる。
【０１４２】 ５．３．３．Ｃｅｌ１タンパク、誘導体および類縁体の調製 エンド−１，４−β−グルカナーゼ（Ｃｅｌ１）、およびその誘導体あるいは
その類似体は、技術的に知られている組換えあるいは合成技術によって作成され
た生物組織あるいは細胞培養から精製することができる。
【０１４３】 未処置のＣｅｌ１は様々な材料から得ることができる。望ましいエンド−１，
４−β−グルカナーゼ（Ｃｅｌ１）を含む、あるいは産生することが判っている
どのような材料からでも、たとえば、Ｃｅｌ１は植物組織のような材料から単離
してもよい、通常のタンパク精製方法を用いて、エンド−１，４−β−グルカナ
ーゼを単離し、および精製し、あるいは部分精製してもよい。そのような通常の
タンパク精製技術は、限定されるわけではないが、以下のものを含んでいる：ク
ロマトグラフィ（たとえば、イオン交換、アフィニティ、ゲル濾過/分子排除ク ロマトグラフィおよび逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ））、遠
心分離、差次的溶解性、および電気泳動（タンパク精製技術の概説については、
Scopes, 1987, タンパク精製；原理と方法、第２版 C. R. Cantor編、Springer
Verlag, New York, New York, およびParvez et al., 1985, ＨＰＬＣの進歩 V
ol.1, Science Press, Utrecht, The Netherlands を参照されたい）。
【０１４４】 発明のＣｅｌ１タンパク、誘導体および類似体を得るために組換え発現技術を
応用することができる（たとえばSambrook et al., 1989, 分子クローニング、 実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory, 2d Ed, Cold Spring Harb
or, New York; Glover, D. M. 編、1985, ＤＮＡクローニング：実用的方法、MR
L Press, LTD., Oxford, U.K., Vol I, IIを参照されたい）。ｃｅｌ１のヌクレ
オチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されている。ライブラリのスクリーニ
ング、化学合成あるいはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるような、技術的に
よく知られている技術を用いて、ｃｅｌ１クローンを単離することができる。ク
ローニングされたｃｅｌ１遺伝子の配列は、技術的に知られている数多くの方法
のいずれかによって修飾することができる。
【０１４５】 組換えＣｅｌ１タンパク、誘導体あるいは類似体を作成するために、Ｃｅｌ１
タンパク、誘導体あるいは類似体が前記配列から生産されるように、Ｃｅｌ１タ
ンパク、誘導体あるいは類似体ををコードしている核酸配列を操作できるように
プロモーターにつなぐ。たとえば、ベクターを細胞に導入し、その細胞の中でベ
クターあるいはその一部が発現され、Ｃｅｌ１あるいはその一部を生産する。好
ましい実施例では、ＲＮＡポリメラーゼの材料がＤＮＡに向けられたＲＮＡポリ
メラーゼである場合、核酸はＤＮＡである。しかし、ＲＮＡポリメラーゼの材料
がＲＮＡに向けられたＲＮＡポリメラーゼである場合、あるいは逆転写酵素が細
胞に存在した場合、あるいはＲＮＡからＤＮＡを作るために提供された場合も、
核酸はＲＮＡである。そのようなベクターは、望ましいＲＮＡを作るために転写
されている限り、エピソームにとどまる、あるいは染色体に統合されて行く。そ
のようなベクターは、当該技術において標準であるような組換えＤＮＡ技術の方
法によって構築することができる。
【０１４６】 Ｃｅｌ１を生産する方法は：（ａ）組換え発現ベクターを含んでいる宿主細胞
を培養すること、Ｃｅｌ１が細胞によって発現されるような条件下でＣｅｌ１を
コードしているヌクレオチド配列を備えている前記ベクター；および（ｂ）細胞
によって発現されたＣｅｌ１を回収することを、備えている。
【０１４７】 タンパク−コード配列を発現するために、多様な宿主−ベクター系を利用して
もよい。限定するものではないが、これらには、ウイルスを感染させた哺乳類細
胞系（たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）；ウイルス（たと
えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含んでいる酵
母、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはコスミドＤＮＡで形
質転換した細菌のような微生物が含まれている。ベクターの発現要素の強さや特
異性は宿主−ベクター系によって異なっており、数多くの転写および翻訳要素の
いずれか１つを用いてもよい。
【０１４８】 Ｃｅｌ１タンパク、誘導体、あるいは類似体は当技術分野で知られているプロ
モーター/エンハンサー要素のどのようなもので制御してもよい。そのようなプ ロモーターは限定するものではないが、以下のようなものを含んでいる：ＳＶ４
０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310) 、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれているプロモーター(Yamamoto
et al., 1980, Cell 22:787-797)、ＨＳＶ−１（１型単純性ヘルペスウイルス）
、チミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al.,
1982, Nature 296:39-42)；β−ラクラマーゼプロモーター(Villa-Kamaroff et
al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731)、」あるいはｔａｃプ ロモーター(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25)のよ
うな原核細胞の発現ベクター；Scientific American 1980, 242:74-94の“組換 え細菌由来の有用なタンパク”を参照；ｃｅｌ１プロモーターあるいはその機能
的断片、ノパリンシンセターゼプロモーター領域(Herrera-Estrella et al., Na
ture 303:209-213)あるいはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロ モーター(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵 素リブロースニリン酸カルボキシラーゼのプロモーター (Herrera-Estrella et
al., 1984, Nature 310:115-120)を備えている植物の発現ベクター；Ｇａｌ４プ
ロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスフォ
グリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターの
ような酵母あるいはそのほかの真菌由来のプロモーター要素、および以下のよう
な動物の転写制御領域で、組織特異性を示し、遺伝子導入動物で利用されている
もの：膵臓の腺房細胞で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swift et al
.,1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Q
uant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hematology 7:425-515)；膵臓のβ
細胞で活性のあるインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-1
22)、リンパ系細胞で活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域 (Grosschedl et
al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Al
exander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳腺、リンパ 系および肥満細胞で活性のあるマウス乳腺癌ウイルス制御領域 (Leder et al.,
1986, Cell 45:485-495)、肝臓で活性のあるアルブミン遺伝子制御領域 (Pinker
t et al., 1987, Genes and Devel.1:268-276)、肝臓で活性のあるα−フェトプ
ロテイン遺伝子制御領域 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1
648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58)、 肝臓で活性のあるα１−ア ンチトリプシン遺伝子制御領域(Kalsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161
-171)、骨髄細胞で活性のあるβ−グロビン遺伝子制御領域 (Mogram et al., 19
85, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94）、脳の乏突 起膠細胞で活性のあるミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域 (Readhead et al
., 1987, Cell 48:703-712);骨格細胞で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御
領域 (Sani, 1985, Nature 314:283-286)、および視床下部で活性のある性腺刺 激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986, Science 234:137
2-1378)。Ｃｅｌ１タンパク、誘導体、あるいは類縁体をコードしている核酸に 操作できるように連結しているプロモーター要素はまた、バクテリオファージプ
ロモーターである可能性もある。そのプロモーターは、別のプラスミドのＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子から発現されたバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼに由
来している。たとえば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている別のプラスミ
ドによってＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと操作できるように連結された
ケモカイン、誘導体あるいは類似体をコードしている核酸。
【０１４９】 さらに、挿入された配列を調節したり、あるいは望ましい特異的な様式で遺伝
子産物を変更したり、処理したりするような宿主細胞を選択してもよい。特定の
誘導物質の存在下で特定のプロモーターからの発現を上昇させることができる；
このようにして遺伝的に操作されたケモカイン、誘導体あるいは類似体の発現を
制御することができる。さらに、別の宿主細胞は、翻訳や翻訳後のプロセッシン
グや修飾について特徴的なおよび特異的なメカニズムを持っている（たとえば、
グリコシル化、タンパクのリン酸化）。発現された外来タンパクの望ましい修飾
やプロセッシングを確実なものにするために適切な細胞株や宿主系を選ぶことが
できる。たとえば、グリコシル化されないコアタンパク産物を作るためには細菌
系での発現を用いることができる。酵母や昆虫細胞における発現はグリコシル化
された産物を作ることになる。哺乳類細胞あるいは植物細胞における発現は異種
構造タンパクの“天然の”グリコシル化を保証するために用いられる。さらに、
いろいろなベクター/宿主発現システムは、いろいろな程度でプロセッシング反 応に影響する可能性がある。
【０１５０】 Ｃｅｌ１をコードしている核酸配列は、翻訳開始および/あるいは翻訳停止配 列を創るおよび/あるいは破壊するために、あるいはコード領域に変異を創るた めに、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで変化させることができる。当
分野で知られている突然変異誘発に関するどのような技術も、たとえばｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発(Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 2
53:6551)、ＴＡＢリンカー（ファルマシア）の利用、突然変異を含んだＰＣＲプ
ライマーなどに限定するわけではないが、これらを含めて用いることができる。
【０１５１】 突然変異誘発に含まれる実験は主として部位特異的突然変異誘発からなり、そ
の後変更した遺伝子産物の表現型を調べる。さらに一般的に用いられている部位
特異的突然変異誘発プロトコールは必要に応じて２本鎖ＤＮＡ同様に１本鎖ＤＮ
Ａを提供するベクターをうまく利用している。一般に、そのようなベクターを用
いる突然変異誘発プロトコールは以下のようなものである。変異誘発性プライマ
ー、すなわち、変えられるべき、しかし１つか少数の変更された、付加された、
あるいは欠失した塩基を含む配列に相補的なプライマーを合成する。ＤＮＡポリ
メラーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏでプラーマーを延長し、いくつかの操作を経
たのち、２本鎖ＤＮＡを細菌細胞に形質移入する。次に様々な方法によって、望
ましい変異を持ったＤＮＡを同定し、変異を持った配列を含むクローンから望ま
しいタンパクを精製する。さらに長い配列については、そのようなベクターでは
長い挿入（２キロベースよりも長い）は不安定なので、追加のクローニングステ
ップが求められる。プロトコールは当業者に知られており、部位特異的突然変異
誘発に関するキットはバイオテクノロジー関係の供給会社、たとえばアマシャム
ライフサイエンス社（アーリントンハイツ、ＩＬ）およびストラタジーンクロー
ニングシステム（ラホヤ、ＣＡ）から広く入手することができる。
【０１５２】 そのほかの特別な実施例では、Ｃｅｌ１誘導体あるいは類縁体は、融合タンパ
クあるいはキメラタンパク産物として発現されてもよい（異質構造タンパクの配
列（別のタンパクの）に結合したペプチドを介して連結されたタンパク、断片、
類縁体あるいは誘導体を備える）。そのようなキメラ産物は、望ましいアミノ酸
配列をコードしている然るべき核酸配列を適切なコードフレーム中で技術的に知
られている方法で連結し、一般に技術的に知られている方法によってキメラ産物
を発現させることによって作ることができる。
【０１５３】 さらに、Ｃｅｌ１タンパク、誘導体（断片およびキメラタンパクを含む）、お
よび類縁体は化学的に合成することができる。Clark-Lewis et al., 1991, Bioc
hem. 30:3128-3135およびMerrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-215
6を参照されたい。たとえば、Ｃｅｌ１、誘導体および類縁体は固相技術によっ て合成し、樹脂から外し、調製用高速液体クロマトグラフィによって精製する（
たとえば、Creighton, 1983, タンパク、構造と分子の本質、W. H. Freeman and
Co., N. Y. pp50-60を参照されたい）。タンパクであるようなＣｅｌ１、誘導 体および類縁体はペプチド合成機を用いて合成することもできる。合成ペプチド
の組成はアミノ酸分析あるいは配列決定によって確認してもよい（たとえば、エ
ドマン分解法；Creighton, 1983, タンパク、構造と分子の本質、W. H. Freeman
and Co., N. Y. pp34-49を参照されたい）。
【０１５４】 発明のＣｅｌ１タンパク、誘導体および類縁体は、アミノ酸残基の連続的付加
によって、あるいは別の方法としては、たとえば断片縮合として技術的にはよく
知られている技術を用いて組み合わせられた断片サブコンポーネントとして全体
を合成してもよい（Shin et al., 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56:404-40
8; Nyfeler et al., 1992, Peptides, Proc. 12th Amer. Pep. Soc., Smith and
River 編、Leiden, pp 661-663; Nokihara et al., 1990, タンパク研究財団、
Yanaihara 編、大阪 pp315-320）。
【０１５５】 さほど好ましくない実施例としては、Ｃｅｌ１誘導体をタンパクのタンパク分
解によって得、その後上述のような常法を用いて精製する（たとえば免疫アフィ
ニティ精製）。
【０１５６】 ５．４．応用 本発明は、以下に掲げるようなものに限定されるわけではないが、それらを含
む様々な応用にその用途がある。
【０１５７】 第１に本発明は、成長し続けるパルプおよび製紙業のために早く成長する遺伝
子移入林木を提供するために用いることができる。それによって熱帯雨林の枯渇
に関連した生態荒廃効果を軽減する。
【０１５８】 第２に本発明は、変更された異なった特性を有する細胞壁を持っている遺伝子
導入植物を提供するために用いることができる。異なった特性とは以下のような
ものをいうが、それに限定するわけではない。さらに長いあるいはさらに短い繊
維を持つ植物；生物分解への抵抗性がさらに高いかさらに低い植物；反芻動物に
おいて消化率がさらに良いか悪い植物；および昆虫、真菌、ウイルスおよび細菌
のような害毒に対する抵抗性がさらに高いかさらに低い植物。
【０１５９】 第３に本発明は、綿や亜麻などのような有用な繊維を持った遺伝子導入植物を
提供するために用いることができる。それらは、さらに長いあるいは短い繊維を
持ち；化学的に変更されたセルロースの“外観”、吸収性、強度およびレオロジ
ーのような変更された特性を持っている変更された繊維を高い収量で生産する。
【０１６０】 第４に本発明は、デンプンの生産量および/あるいは含有量の高い遺伝子導入 植物を提供するために用いることができる。
【０１６１】 第５に本発明は、熱抵抗性を高めた遺伝子導入植物を提供するために用いるこ
とができる。
【０１６２】 本発明はさらに、トマトなどのような果実をつける遺伝子導入植物を提供する
ために用いることができる。それによってセルロース量の高い、糖含有量の高い
果実が得られ、ケチャップやトマトピューレ業界で用いることができる。本発明
はまた、早く成長する天蓋と短いライフサイクルで植えてから収穫までの期間を
短くし、および/あるいは高い塊茎収量が得られるような遺伝子導入ジャガイモ を提供するために用いることができる。本発明はさらに、普通より長いか短い葉
柄、普通より大きいか小さい花弁などを持った花の咲く遺伝子導入植物を提供す
るために用いることができる。 さらに、発明は水から早く出現するような従っ
て残存率や収率が高くなるような成長の早い米を提供するために用いることがで
きる。さらに本発明は、普通より大きいか小さい葉を特徴とするようなレタスを
提供するために用いることができる。そして最後に、発明は生物量の高い、反芻
動物における消化率を変更した、アルファルファやクローバなどのような飼料作
物を提供するために用いることができる。
【０１６３】 本発明のさらなる有用性は、天然に起きている金属や毒素を過剰に吸収する植
物の生育率を改善してその生物量を高め、それによって植物による環境浄化の速
度と程度を改善することである（Glass, October 1, 1997, Genetic Engineerin
g News, p8, 41-43を参照されたい）。
【０１６４】 発明のｃｅｌ１遺伝子は、植物の構造や形態を変更するために遺伝子導入植物
の中で細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコードする導入遺伝子
としての有用性を持っている。ｃｅｌ１遺伝子はまた、Ｃｅｌ１タンパクを発現
するように宿主細胞に挿入される組換えベクターの中でＣｅｌ１タンパクをコー
ドすることに関する有用性を持っている。さらに、発明のｃｅｌ１遺伝子は、
（１）その他のエンド−１，４−β−グルカナーゼあるいはその変異体を同定す
るために核酸ライブラリをスクリーニングする核酸プローブとして；（２）Ｃｅ
ｌ１タンパク変異体あるいは誘導体を作るために変えられるべきあるいは変更さ
れるべき核酸配列として；（３）Ｃｅｌ１分泌シグナルペプチドをコードしてい
る核酸配列の単離で；および（４）当業者に一般的に知られている分子生物学上
の技術あるいは産業上の応用においてエンド−１，４−β−グルカナーゼをコー
ドしている核酸として利用される可能性がある。
【０１６５】 ｃｅｌ１核酸分子はたとえば植物のｃｅｌ１遺伝子の調節に有用な植物のｃｅ
ｌ１アンチセンス分子として、あるいは植物ｃｅｌ１遺伝子の核酸配列の増幅反
応におけるアンチセンスプライマーとして用いられる可能性がある。植物ｃｅｌ
１遺伝子の調節に関しては、そのような技術はたとえば、植物の生育、発生ある
いは遺伝子発現を調節するために用いることができる。さらに、そのような配列
は、ｃｅｌ１遺伝子調節にも有用なリボザイムおよび/あるいは三重螺旋配列の 一部として用いられる可能性がある。
【０１６６】 本発明のｃｅｌ１プロモーターは、遺伝子導入植物において組織特異的な様式
で、関心のあるタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドを発現するために伸長
している組織に特異的な植物プロモーターとして利用される可能性がある。 特
に、ｃｅｌ１プロモーターは、変更された構造を持つ遺伝子導入植物を作るため
に伸長している組織に特異的な様式で、細胞壁を調節するタンパクあるいはポリ
ペプチドを発現するために用いられる可能性がある。さらに、ｃｅｌ１プロモー
ターは、変更された構造を持つ植物を作るために遺伝子導入植物の伸長している
組織においてＣＢＤを発現するために用いられる可能性がある。
【０１６７】 発明のArabidopsis thaliana のＣｅｌ１タンパクは、エンド−１，４−β−
グルカナーゼ活性が望ましいような生化学的な応用（実験的なあるいは工業的な
）に用いることができる。たとえば、多糖類の消化、セルロースの修飾、伸長し
ている植物の構造の変更、および当業者に知られている実験的あるいは工業的な
生化学的応用があるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】 発明のＣｅｌ１分泌シグナルペプチドは、関心のあるタンパクをコードしてい
る配列に融合したＣｅｌ１分泌シグナルペプチドをコードする組換え核酸を構築
し、組換えタンパクを発現することによって関心のあるタンパク、ポリペプチド
あるいはペプチドの細胞における分泌を促進するために利用される可能性がある
。
【０１６９】 以下の実施例は例証だけを目的として提示するものであって、どのような方法
であれ、発明の範囲に制限を加えようと意図するものではない。
【０１７０】 ６．実施例における実験的プロトコール 以下のプロトコールおよび実験材料が以下に続く実施例の中で用いられた。
【０１７１】 ６．１．植物材料および生育条件 Arabidopsis thaliana cv. Columbiaおよび Nicotiana tabaccum-SR1（タバコ
）は２４〜２５℃にて、冷白色蛍光灯（５０〜６０μＥｍ-2Ｓ-1）を用いて１６
時間明期で生育させた。矮性A. thalianaは、種を撒く前に鉢植え用混合物を２ ５０ｐｐｂのユニコナゾール[（Ｅ）−１−（４−クロロフェニル）−４，４− ジメチル−２−(１，２，４−トリアゾール−１−いる）１ペンタン−３−オル]
（Agan Chemicals Inc.,イスラエル）、ジベレリン生合成阻害剤で処理すること
によって作成した(Henry, 1985, Bull Plant Growth Regul. Soc. Am. 13:9-11)
。
【０１７２】 ６．２．植物組織からの植物核酸の単離 Doyle and Doyle (1987, Phytochem Bull 19:11-15)によって記載されている ようにArabidopsis thaliana cv. Columbia の葉柄と葉からＤＮＡを抽出した。
ＲＮＡは“ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴＴＭ”（Molecular Research Center Inc.,
Cincinnati, OH)を用いて製造者の指示書に従って、伸長している葉柄から抽出 した。
【０１７３】 ６．３．染色体ＤＮＡから得たＥＧａｓｅＤＮＡプローブのＰＣＲ増幅 同義性プライマー（Compton, 1990, “ＤＮＡ増幅のための同義性プラーマ− ”は ＰＣＲプロトコール：方法と応用への指針の中、Innis, Gelfand, Sninsk
y, and White編、Academic Press , San Diego, CA)は、アボガドとトマトのセ ルラーゼアミノ酸配列からの保存的な領域、ＧＧＹＹＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１０）およびＣＷＥＲＰＥＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）に基づいて合成
した。
【０１７４】 プライマー＃１ＧＧＹＹＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：５’−ＧＡＡＴ
ＴＣＧＧＡ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）ＧＧＡ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）ＴＡＴ（Ｃ）ＴＡＴ（Ｃ）ＧＡ
Ｃ（Ｔ）ＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。プライマー＃２ＣＷＥＲＰ
ＥＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：５’ＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡ（Ｇ）ＴＣＴ
（Ｃ）ＴＣＡ（Ｇ／Ｃ／Ｔ）ＧＧＡ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｃ）ＴＣＣＡＡ（Ｇ
）ＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）。
【０１７５】 ＰＣＲ混合物には、２μｌの染色体ＤＮＡ（０．５μｇ/μｌ）、２．５ｍｌ １０ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）、
１μｌのｄＮＴＰ混合物(１０ｍＭ）、１．５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０ ．５μｌの（２５μＭ）の各プライマー、１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（プ
ロメガ、マジソン、ウィスコンシン）が含まれ、さらに二重に蒸留したＨ２Ｏ（
ｄｄＨ２Ｏ）で最終用量を２５μｌにした。蒸発を防ぐために鉱油（２５μｌ）
を加えた。ＰＣＲプログラムはCompton（1990, “ＤＮＡ増幅のための同義性プ ラーマ−”は ＰＣＲプロトコール：方法と応用への指針の中、Innis, Gelfand
, Sninsky, and White編、Academic Press , San Diego, カリフォルニア)が記 載しているように行った。
【０１７６】 ＰＣＲ反応で増幅した２６０ｂｐの断片はSambrook et al.,(1989,分子クロー
ニング：実験室マニュアル Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) による記載どおりに２％（ｗ/ｖ）アガロース/ＴＢＥゲル上で精製し、図１に示
す。単離した２６０ｂｐ断片は、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｍ１３ＲＦＤＮＡｍｐ１
８ベクター（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)のＥｃｏＲＩクロ
ーニング部位にクローニングした。
【０１７７】 ６．４．A. thalianaのゲノムＥＧａｓｅ遺伝子のクローニング ＥＧａｓｅのゲノムクローンは、ＥＭＢＬ３ベクター（プロメガ、マジソン、
ウィスコンシン）に詰めこまれたA. thalianaのゲノムライブラリを用いて単離 した。ライブラリは、ＳａｕＡ３で部分的に消化したA. thalianaのゲノムＤＮ Ａから構築し、ＥＭＢＬ３ベクターのＢａｍＨＩクローニング部位にクローニン
グした。Sambrook et al.(1989)に従ってＰＣＲに由来したＤＮＡ ＥＧａｓｅ プローブ（２６０塩基対断片、図１）を用いて、合計で２．５ｘ１０５のプラー
クをスクリーニングした。ハイブリッド形成する組換えファージを１つ検出し、
精製して均質にした。λゲノムクローンあるいはその後のｐＵＣ１８（New Engl
and Biolabs Beverly Massachusetts) プラスミドサブクローンの中にあるＥＧ ａｓｅ遺伝子を含む断片はサザンブロット分析によって突きとめた(Southern, 1
975 J. Mol. Biol. 98:503-517)。図２に示した遺伝子作成物模式図に見られる ように、サブクローンをＥｘｏＩＩＩで消化することによって、ゲノムのサブク
ローンで重複連続欠失を作った。ArabidopsisのＥＧａｓｅ配列（ｃｅｌ１）は 、ＥＭＢＬヌクレオチド配列サブミッション、欧州生体情報研究所（European B
ioinformation Institute、Hinxton Hall, Hinxton, Cambridgeでは開示されて いないものとされ、受入番号＃９８５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を取得し
た。
【０１７８】 ６．５．ｃｅｌ１ＤＮＡのクローニング A. thalianaの伸長している葉柄から抽出したＲＮＡを逆転写酵素ポリメラー ゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲキット、ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア）の
鋳型として用いた。全ｃＤＮＡをＰＣＲ反応に用いた。末端のエクソン配列に従
って２つの特異的なプライマーを設計した。プライマー＃３：５’−ＡＴＧＧＣ
ＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）また（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の中のヌクレオチド１６６６〜１６８５）；およびプライ
マー＃４：５’−ＴＣＡＴＣＧＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１５）または（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の中のヌクレオチド５２５８〜５２
７３）。出来上がった１．５ｋｂのＰＣＲ断片(図３）をｐＧＥＭ−Ｔベクター 系（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）でクローニングし、配列決定した。
この配列はＥＭＢＬヌクレオチド配列サブミッション、欧州生体情報研究所、Hi
nxton Hall, Hinxton, Cambridgeでは開示されていないものとされ、受入番号＃
９８５４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を取得した。
【０１７９】 ６．６．ヌクレオチド配列の決定 自動シーケンサー３７３型（パーキンエルマー、カリフォルニア、ＵＳＡ）を
用い、製造者の指示書に従って、ヌクレオチド配列を決定した。
【０１８０】 ノーザンブロット分析 ｃｅｌ１ｃＤＮＡクローン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）から作成した７６８ｂ
ｐのＤＮＡプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド３９９から開始）
をノーザンブロット分析に用いた。各実験では以下の組織から全ＲＮＡを抽出す
るために４０〜５０のA. thalianaを用いた:完全に開いた葉、開花している葉柄
の基底節間部、正常植物の開花している葉柄における伸長層および矮性植物の開
花している葉柄における伸長層（上述したようにユニコナゾールで処理した）。
【０１８１】 全ＲＮＡ（１０μｇ）を１．６％アガロースゲル上で分画し、“ＨＹＢＯＮＤ
−Ｎ”膜（アマシャム、英国）に移した。“ＲＥＤＩ ＰＲＩＭＥ”キット（ラ
ンダムプライム標識キット、アマシャム、英国）によってＤＮＡプローブを３２ Ｐで標識した。膜を５５℃にて１６時間ハイブリッド形成させた。最終洗浄は、
０．５ｘＳＳＣ、０．１％（ｗ・ｖ）ＳＤＳ中で６０℃にて１０分間行った。１
８ＳｒＲＮＡを内部標準として用いた。ＲＮＡのレベルはデンシトメーターを用
いて測定した。
【０１８２】 ６．８．ｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓニ成分ベクターの構築 A. thalianaエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ｃｅｌ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１あるいは９のヌクレオチド５〜１６１８）のｃｅｌ１プロモーター領域
のＤＮＡ断片をｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)で
クローニングした。手短に言えば、以下のプライマーを用いてＰＣＲ断片を作成
し：プライマー＃５（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＴＣＡＡＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）およびプライマ
ー＃１０（ＳａｌＩ）：５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＧＧ
ＡＣＣＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、制限エンドヌクレアーゼＨｉ
ｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly,
Massachusetts)のＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩクローニング部位にクローニングし
た。１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を上の作成物から切りだし、ｇ
ｕｓ遺伝子の５’末端で(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)
ニ成分ベクターｐＢＩ１０１（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア）の
ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩクローニング部位にサブクローニングし、ｐＰＣＧＵ
Ｓと命名した。
【０１８３】 ６．９．構築/ｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓ融合を発現している遺伝子導 入植物 上述の作成物、すなわちｐＰＣＧＵＳは、三親交配により（An, 1987, Meth E
nzymol. 153:292-305)、安全化したＬＢ４４０４Agrobacterium tumefaciensに 移行させた。以前報告されたように(DeBlock et al., 1984, EMBO J. 3:1681)、
Nicotiana tabaccum-SR1で葉−花盤形質転換を行った。再生された遺伝子導入植
物はカナマイシンで選抜した。作成物で別々に形質転換された８株から得たＦ１ 種子を機能的アッセイに用いた。
【０１８４】 推定ｃｅｌ１プロモーター領域の存在についてサザンブロットにより植物を分
析した。タバコにおけるＧＵＳ活性の基礎レベルに関する対照として、プロモー
ターのないｐＢＩ１０１で植物を形質転換した。遺伝子導入植物は２５℃の温室
にて１６時間明期で生育した。
【０１８５】 ６．１０．遺伝子導入植物の組織学的ＧＵＳ染色 ＧＵＳの染色は以前記載されたように(Jefferson et al., 1987, Plant Mol.
Biol. Rep. 5:387-405)Ｘ−Ｇｌｕｃを用いて行った。１０日令の苗をＸ−Ｇｌ ｕｃとともに３７℃にて一晩インキュベートしたのち、７０％エタノール溶液に
入れた。写真を撮影する前に、植物を９０℃で９０％の乳酸中で２，３分インキ
ュベートし、２時間かけて室温に冷ました。
【０１８６】 ６．１１．ｃｅｌ１プロモーター−ｃｅｌ１シグナル−ｃｂｄニ成分ベクター
（ｐＣＣ１）の構築 ｃｅｌ１プロモーター領域を含み、ｃｅｌ１シグナルペプチドをコードしてい
るＤＮＡ断片、すなわち、A. thalianaエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ｃ ｅｌ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１あるいは９のヌクレオチド５〜１７７０）の一
部をｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)でクローニン
グした。手短に言えば、以下のプライマーを用いてＰＣＲ断片を作成し：プライ
マー＃５（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧ
ＴＣＡＡＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）およびプライマー＃６（Ｓ
ａｌＩ）：５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧ
Ｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ
ＩとＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachu
setts)のＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩクローニング部位にクローニングした。
【０１８７】 Clostridium cellulovorans（前記セルロース結合ドメイン、ここでは“ｃｂ ｄ”と呼ぶ）（特許第５，４９６，９３４号参照）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の
ヌクレオチド３〜４９４）のｃｂｐＡタンパク断片をコードしているヌクレオチ
ド配列を含んでいるセルロース結合ドメインＤＮＡ断片は、以下のプライマーを
用いてＰＣＲ増幅により作成し：プライマー”７（ＳａｌＩ）５’−ＡＡＡＡＧ
ＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１８）およびプライマー＃８（ＢａｍＨＩ）５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣ
ＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、そ
れはＳａｌＩとＢａｍＨＩの制限部位を含んでいた。
【０１８８】 ＳａｌＩとＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化に続いて、ｃｂｄを
コードしているＤＮＡ断片を上述の変更したｐＵＣ１８ベクターのＳａｌＩとＢ
ａｍＨＩ部位にクローニングし、インフレームでｃｅｌ１のシグナルペプチドと
融合した。
【０１８９】 ｃｂｄ遺伝子のＣ末端に対するプライマーは停止コドンを含んでいた。２つの
断片間のＳａｌＩ部位はインフレームで２つのアミノ酸：バリンとアスパラギン
を付加し、それらはｃｅｌ１シグナルペプチドとｃｂｄコード領域の間に存在し
ていることになる。
【０１９０】 ｃｅｌ１プロモーター領域、ｃｅｌ１シグナルペプチドおよび融合したｃｂｄ
がこの順番で含まれているＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩと
ＳａｃＩで事前に消化したニ成分ベクターｐＢＩ１０１（クロノテック、パロア
ルト、カリフォルニア）でサブクローニングした。このベクターをｐＣＣ１と命
名した。
【０１９１】 ６．１２．ＣａＭＶ３５Ｓ Ω プロモーター−ｃｅｌ１シグナル−ｃｂｄ
ニ成分ベクター（ｐ３５ＳＣ１）の構築 ｃｅｌ１シグナル配列およびｃｂｄ配列に融合したＣａＭＶ３５Ｓ Ω プロ
モーターを含むベクターは以下のように構築した。ｃｅｌ１シグナルペプチド（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド１〜１０５）をコードしているＤＮＡ断
片をｐＵＣ１８（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)でクローニン
グした。手短に言えば、以下のプライマーを用いてｃｅｌ１のＰＣＲ断片を作成
し：プライマー＃９（ＳｐｈＩ）５’−ＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＡＡＡＡ
ＴＣＣＣＴＡＡＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）およびプライマー＃
６（ＳａｌＩ）５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧ
Ｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩとＳａ
ｌＩで消化し、ｐＵＣ１８のＳｐｈＩとＳａｌＩのクローニング部位でクローニ
ングした。ＳｐｈＩ制限部位の含有物は、開始部位後の最初のアミノ酸をアラニ
ンからプロリンに置き換えていた。さらに、ｃｂｄ遺伝子のＣ末端に対するプラ
イマーは、停止コドンを含んでいた。２つの断片間のＳａｌＩ部位はインフレー
ムで２つのアミノ酸：バリンとアスパラギンを付加し、それはｃｅｌ１シグナル
ペプチドおよびｃｂｄコード領域の間に存在することになる。
【０１９２】 ｃｂｄをコードしているＤＮＡ断片は（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のヌクレオチ
ド３〜４９４）は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって作成し：＃７
（ＳａｌＩ）５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣ
ＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）および＃１０（ＥｃｏＲＩ）５’−Ａ
ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２１）、それはＳａｌＩとＥｃｏＲＩの制限部位を含んでいた。
【０１９３】 ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化したのち、ｃｂｄをコードしているＤＮＡ断片は
上記の変更したｐＵＣ１８ベクターのＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニ
ングし、ｃｅｌ１のシグナルペプチドとインフレームで融合した。
【０１９４】 ｃｅｌ１シグナル−ｃｂｄ融合物を含むＤＮＡは、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ
クローニング部位を用いてｐＣｄクローニングカセット（Broido et al., 1993,
Physiologia Plantarum 88:259-266)にクローニングした。ｐＣｄカッセットは
、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Guilley et al., 1982, Cell 30:763-773)およ びタバコモザイクウイルスのコートタンパク遺伝子に由来するΩＤＮＡ配列（Ga
llie et al., 1987, Nucl. Acid Res. 15:3257-3273)の下流にポリリンカーを含
んでいる。ＣａＭＶ３５ＳΩ ｃｅｌ１−シグナルペプチド−ｃｂｄおよびオク
トピン ポリアデニル化部位を含んでいるＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＳａｃＩを
用いて切り出し、ニ成分ベクターｐＢＩ１０１のＢａｍＨＩとＳａｃＩクローニ
ング部位にサブクローニングした（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア
）。出来上がったベクターをｐ３５ＳＣ１と命名した。
【０１９５】 ６．１３．ｃｂｄ遺伝子導入植物の構築 ニ成分ベクター（ｐ３５ＳＣ１、ｐＣＣ１およびｐＢＩ１０１、対照として）
は、安全化したＬＢ４４０４ Agrobacterium tumefaciensに三親交配によって 移した(An, 1987, Meth Enzymol. 153:292-305)。以前記載されたように（DeBlo
ck et al., 1984, EMBO J. 3:1681)、葉−花盤形質転換はNicotiana tabaccum-S
R1で行った。再生された遺伝子導入植物はカナマイシンで選抜した。各ベクター
で別々に形質転換した植物からＦ１種子を回収した。植物はサザンブロット（Sa
mbrook et al., 1989, 分子クローニング：実験室マニュアル、Cold Spring Har
bor Laboratory Press, New York; Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517
)およびプライマー＃７と＃８（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８と１９）を 用いたＰＣＲによって分析した。遺伝子導入植物は２５℃の温室にて１６時間の
明期で生育した。
【０１９６】 ６．１４．ｃｂｄの転写に関する分析 ｃｂｄ導入遺伝子の転写物を定めるために、伸長している葉柄および若葉から
抽出したＲＮＡを逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲキット）の鋳型として用いた（スト
ラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア）。プライマー＃７と＃８（それぞれＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１８と１９）を用いたＰＣＲ増幅には全ｃＤＮＡを用いた。
【０１９７】 ７．実施例：Arabidopsis thaliana ＥＧＡＳＥのＤＮＡプローブのクローニ ング ＥＧＡＳＥ遺伝子、すなわちA. thalianaのｃｅｌ１を単離した。様々な植物 から得た様々なＥＧａｓｅ遺伝子の間にはかなりの相同性がある（Lashbrook et
al., 1994, Plant Cell 6:1485-1493; Tucker and Milligan, 1991 Plant Phys
iol. 95:928-933; Wu et al., 1996, Plant Physiol. 110:163-170)。アボガド とタバコのセルラーゼのアミノ酸配列に由来する２つの保存的領域に基づいて、
同義性プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２と１３）を合成し(Lashbrook et al
., 1994, Plant Cell 6:1485-1493; Tucker and Milligan, 1991 Plant Physiol
. 95:928-933)、A. thalianaのゲノムｃｅｌ１をクローニングするためのプロー
ブとして働くような２６０ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。このようなプライマー
は、緑豆でＥＧａｓｅ遺伝子をコードしているいくつかのＤＮＡ断片を単離する
のに使われ、うまくいったことがある（Shoseyov, L., 1992, “切断緑豆の不定
根形成におけるエンド−１，４−β−グルカナーゼ遺伝子の発現”修士論文、エ
ルサレムのヘブライ大学）。
【０１９８】 鋳型としての染色体ＤＮＡおよびアボガドとトマトのＥＧａｓｅにおける保存
的アミノ酸配列に従って設計された２つの同義性プライマーを用いて、ＰＣＲに
よる増幅を行った(Lashbrook et al., 1994, The Plant Cell 6:1485-1493; Tuc
ker and Milligan, 1991 Plant Physiol. 95:928-933)。ＰＣＲ増幅によって約 ２６０ｂｐおよび３７０ｂｐの２つのＤＮＡ断片が得られた(図１）。単離され た２６０ｂｐの断片はＭ１３ｍｐ１８でクローニングした。その後１本鎖ＤＮＡ
を配列分析に用いた。２６０ｂｐ断片の推定アミノ酸配列はアボガドＥＧａｓｅ
と６２％の相同性を示した。
【０１９９】 ８．実施例：ＥＧａｓｅゲノムクローンの単離と特性評価 A thalianaのｃｅｌ１ゲノム遺伝子とアボガドｃｅｌ１との比較によれば、ア
ボガド遺伝子のエクソン２とエクソン３の間には大きなイントロンが介在してい
る。このイントロンはA thalianaのｃｅｌ１にはない。A thaliana ｃｅｌ１の
ｃＤＮＡ遺伝子は５４−ｋＤａのタンパクをコードしていた。アボガドＥＧａｓ
ｅとの配列の比較は５６％の配列が同一であることを示していた(図４）。さら に、タンパク間で、システイン残基の数と位置に高い保存性が見られたというこ
とは、立体構造が保存されていることを示唆している。A thalianaのｃｅｌ１と
アボガドＥＧａｓｅ（Ｃｅｌ１）のカイト−ドリトル疎水性親水性指標分析を比
べることによっても、このことは支持されている（図５）。ｃｅｌ１の推定アミ
ノ酸配列はグリコシル化の可能性のある部位を１つ含んでいた。Ｃｅｌ１をＥフ
ァミリーのグリコシダーゼに分類する、１７個のアミノ酸モチーフも検出された
（グリコシダーゼについては一般にGilkes et al., 1991, Microbiol. Rev. 55:
303-315を参照されたい）。Ｎ末端における最初の２５個のアミノ酸は疎水性で あり、典型的なシグナル−ペプチド配列で予想されるような、Ｎ末端間近に陽性
に荷電したアルギニンが含まれていた（Von Heijne et al., 1983, Eur. J. Bio
chem. 133:17-21)。
【０２００】 ゲノムのｃｅｌ１遺伝子を単離するために、A thalianaのゲノムライブラリを
スクリーニングした。２６０ｂｐのＰＣＲ断片（図１）をプローブとして用い、
合計２．５ｘ１０５の組換えプラーク形成ユニットから１つの陽性クローンを単
離した。陽性クローンをＳａｌＩで消化した後、サザンブロットを行ったところ
、７．５ｋｂの断片であることが判った。ＳａｌＩ ＤＮＡ断片の制限地図を図
２に示す。図２にさらに示すように、３つの別のサブクローンをｐＵＣ１８で構
築した。ＥｘｏＩＩＩ欠失のあとの配列分析で完全長のｃｅｌ１遺伝子の１次Ｄ
ＮＡ配列が明らかにされた。図２に示すように、遺伝子は６つのイントロンで区
切られた７つのエクソンからなっている。
【０２０１】 ９．実施例：ｃｅｌ１ ｃＤＮＡの単離と特性評価 伸長している組織におけるｃｅｌ１ ｍＲＮＡの存在を調べるために、および
完全長のｃＤＮＡを単離するためにＲＴ−ＰＣＲを用いた。１．５−ｋｂのｃｅ
ｌ１ ｃＤＮＡ断片(図３）をうまくクローニングし、配列を決定した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。ｃＤＮＡ配列はエクソン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌク
レオチド１６６６〜１８７５、１９５９〜２３６６、２７４７〜２３８６、２９
３６〜３０９７、４３８３〜４４９３、４６６１〜４８２５および４９４１〜５
２７０）を繋ぎ合わせたＤＮＡ配列に完全に一致していた。２６０−ｂｐＤＮＡ
プローブとｃｅｌ１ ｃＤＮＡとの間には配列の矛盾もいくつか認められた。こ
の時点では、このような変化は別の遺伝子を示しているのか、単にＰＣＲによる
変異なのかは決めなかった。１４７６塩基対のオープンリーディングフレーム（
読み取り枠）（ヌクレオチド１〜１４７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および３）
は４９２個のアミノ酸のポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をコードし、
その推定分子量は５４ｋＤａであることが判明した。アボガドＥＧａｓｅとの配
列を比較すると５６％の同一性が見られた(図４）。A. thaliana Ｃｅｌ１とア ボガドＥＧａｓｅ（Ｃｅｌ１）におけるカイト−ドリトル疎水性親水性指標分析
（Kyte and Doolittle, 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132)の比較を図５に示す
。
【０２０２】 １０．実施例：Arabidopsisの様々な組織におけるｃｅｌ１ＲＮＡの転写レベ ル ７６８−ｂｐのｃｅｌ１ ｃＤＮＡ断片をプローブとしてｃｅｌ１のノーザン
ブロット分析を行った(図６）。正常なA. thalianaの開花している葉柄の基底節
間部と同様に、完全に開いた葉ではＲＮＡ転写物は検出されなかった。しかしな
がら、正常植物の開花している葉柄の伸長層では強い転写シグナルが検出された
。ユニコナゾールで処理したA. thalianaは矮性植物となった。矮性植物で開花 している葉柄の伸長層におけるｃｅｌ１ ＲＮＡの転写レベルは、正常植物のそ
れよも有意に低かった（図６）。３つの別々に行ったノーザンブロットのデンシ
トメーター分析では、矮性植物に対する正常植物の転写レベルは２〜５倍異なっ
ていることを示していた。
【０２０３】 １１．実施例：遺伝子導入植物の組織学的ＧＵＳ染色分析 ｐＢＩ１０１ニ成分発現ベクター（クロノテック、パロアルト、カリフォルニ
ア）に入れたｇｕｓリポーター遺伝子に融合した推定上のｃｅｌ１プロモーター
領域（ヌクレオチド５〜１６１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で形質転換した遺
伝子導入タバコについて、組織特異的な発現について調べた。８株の別々の遺伝
子導入植物から作った１６本の苗で充分なＧＵＳ活性が認められた。苗条および
根の伸長層は両方とも染色された（図７Ａ〜Ｃ）。 若葉も程度は低かったが染
色された（データは示さず）。推定上のｃｅｌ１プロモーター領域を含まない同
じ作成物を導入した対照遺伝子導入植物ではＧＵＳ染色は見られなかった。
【０２０４】 １２．実施例：ｃｂｄ遺伝子導入タバコの構築 １５から２０の別々の遺伝子導入植物（Ｆ０ 親世代）をｐＣＣ１、ｐ３５Ｓ
ＣＩおよびｐＢＩ１０１の各ベクターから作成した。ｐＢＩ１０１はｃｂｄをコ
ードしていないので陰性対照として働く。導入遺伝子の存在確認は、ＰＣＲ分析
（たとえば図９を参照）、サザンブロット分析（示していない）およびカナマイ
シン耐性によって行った。結果はＦ０世代ではｐＣＣ１およびｐ３５ＳＣ１作成
物に対してｃｂｄ作成物が１コピー存在すること、および対照植物ではｐＢＩ１
０１が少なくとも２コピー存在することを示していた。ｐＣＣ１およびｐ３５Ｓ
Ｃ１両遺伝子導入植物におけるｃｂｄの転写物はＲＴ−ＰＣＲによって確認した
（たとえば図１０を参照）
【０２０５】 ｐＣＣ１およびｐ３５ＳＣ１で形質転換したＦ１世代の遺伝子導入植物（後者
は図１１Ｂに示す）は大きさに大きな変異を示した。図１１Ａに示すように、ｐ
ＢＩ１０１で形質移入したＦ１対照植物は極めて適度な変異を示した。後の例で
はカナマイシン感受性の植物が見られなかったということは、導入遺伝子の活性
のあるコピーが複数存在し、各コピーは独立して分離していることを示している
。
【０２０６】 ｐＣＣＩあるいはｐ３５ＳＣ１の単一コピーで形質転換された親のＦ１形質移
入植物は３つの異なった表現型に分離した。約４分の１の植物がカナマイシン感
受性であるということは導入遺伝子が存在していないことを示している。別の４
分の１の植物は小型の表現型を示し、半分は大型の表現型を示した。後者の２つ
に分離したものはさらに表現型の変異を示した。小型植物の中には発芽の初期の
段階で曲がった胚軸を示すものがあった。大型植物の中では変異は普通の大きさ
（カナマイシンの中で生育しているｐＢＩ１０１対照遺伝子導入植物に比べて）
から巨大な大きさまでであった。まとめてみると、これらの結果は、カナマイシ
ン感受性の植物は導入遺伝子を持たないホモ接合体であり、大型植物はヘテロ接
合体であり、小型植物は導入遺伝子の活性のあるコピーを２つ含んでいることを
示している。この結果は、高い濃度のｃｂｄタンパクは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで植
物の生育を阻害し、適度な濃度では植物の生育を促進するという報告（ＰＣＴ出
版物ＷＯ９４/２４１５８）に極めてよく相関している。カナマイシンなしで生 育させると、ｐＣＣ１あるいはｐ３５ＳＣ１で形質転換させたＦ１遺伝子導入タ
バコは、大型と小型の表現型に分離した。このような生育条件下では、カナマイ
シン感受性植物は、大型表現型のヘテロ接合体正常サイズの集団とは区別するこ
とができなかった。このような結果は、ｃｂｄ遺伝子型は観察された表現型に対
応している、すなわち、遺伝子導入植物におけるｃｂｄの発現は、その生育を調
節しているということを確認していることになる。
【０２０７】 表現型上区別できるグループ（大型および小型）間におけるサイズの差異は、
成熟後も維持されていた（図１２）。
【０２０８】 さらに、植物として増殖している遺伝子導入植物は植物としての発生の後期段
階（図１４）と同様に幼若な間（図１３）もその表現型を維持していた。このよ
うな結果は、変更された生育表現型を示しているｃｂｄ遺伝子導入植物は、植物
として増殖している場合でも、変更された表現型を維持していることを示してい
る。
【０２０９】 １３．実施例：ｃｂｄを発現している遺伝子導入植物の生物量生産 ｐ３５ＳＣ１のＦ１タバコ（３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現する）お
よびｐＢＩ１０１（クロノテック社、パロアルト、カリフォルニア）で形質転換
した対照植物をプレート上で発芽させ、４週間生育した。ｃｂｄを発現している
導入遺伝子によって生じた２つの特異的な表現型（大きな葉/正常の胚軸および 小さな葉/長い胚軸）および対照植物の大きなおよび小さな苗を選択し、新しい 培地に移して、さらに室内で３〜４週間生育して、それから３〜４週間温室に移
した。植物の葉積、生重量および乾燥重量を測定した。結果は、対照植物に比べ
てｃｂｄ−遺伝子導入植物は有意に多くの生物量を生産することを示している( 図１５）。ｐＣＣ１で形質転換したＦ１タバコ（ｃｅｌ１プロモータによって制
御されるＣＢＤ発現）でも同様の結果が得られた（図１６）。
【０２１０】 １４．実施例：ポプラ(Populus tremula)におけるｃｅｌ１プロモーターの 発現 １４．１．材料と方法 １４．１．１．ｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓ融合を発現している遺伝子導
入植物の構築 １．６ｋｂのｃｅｌ１プロモーター領域（受入番号＃９８５４３（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：９）のヌクレオチド５〜１６１８）をニ成分ベクターｐＢＩ１０１で
、β−グルクロニダーゼｇｕｓ遺伝子の５’にクローニングした。作成物は三親
交配で安全化したＥＨＡ１０１Agrobacterium tumefaciensに移した（An, 1987,
Meth. Enzymol. 153:292-305)。形質転換はPopulus tremulaの葉柄の外植で行 った(Tzfira et al., 1997, Physiologia Plantarum 99:554-561)。再生した遺 伝子導入植物はカナマイシンで選抜した。別々に作成物で形質転換した１１株の
植物を調べた。植物はサザンブロット分析によってｃｅｌ１プロモーター領域の
存在について分析した。遺伝子導入ポプラは成長用実験槽で２５℃にて１６時間
の明期で生育させた。
【０２１１】 １４．１．２．遺伝子導入植物の組織学的ＧＵＳ染色分析 ＧＵＳ染色は以前記載されたように(Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6:390
1-3907)Ｘ−Ｇｌｕｃで行った。３０日令の苗をＸ−Ｇｌｕｃとともに３７℃に て一晩インキュベートし、写真撮影の前に７０％エタノール溶液に入れた。
【０２１２】 １４．２．結果 図１７および１８に見られるように、ＧＵＳの染色は、若葉や葉柄の伸長層の
ような早く成長している組織にｃｅｌ１プロモーターが特異的に発現しているこ
とを示していた。図１９に示すように、青い染色パターンは、発育している葉に
おける細胞の自然の生育パターンに相関していた。
【０２１３】 このような結果は実施例１１および実施例１７と合わせて、ポプラやタバコ（
上記実施例１１参照）やArabidopsis（下記実施例１７参照）のような様々な遺 伝子導入植物の成長している器官において、ｃｅｌ１プロモーターはＧＵＳの組
織特異的な発現を調節していることを示している。
【０２１４】 １５．実施例：ポプラにおけるｃｂｄの発現 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現しているポプラは区別できる
表現型を示した（図２０）。対照に比べて樹高が短く、葉が大きかった（図２１
）。根は充分に厚く、対照よりも密度が高く、長い、多くの根毛で覆われていた
（図２２〜２４）。カルコフロー染色によって、このような植物は多くの根毛の
先端層でセルロースを蓄積していることが示されたということは、ｃｂｄはセル
ロースの合成率を高めていることを示している（図２５〜２８）。このような観
察結果は、図３０で見られるようにｃｂｄはセルロースの合成率を促進するとい
うことを示したｉｎ ｖｉｔｒｏの実験と一致している。
【０２１５】 １６．ｃｅｌ１を発現している遺伝子導入ポプラ ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現している別々の遺伝子導入ポ
プラ６株（１０株のうち）で異なった表現型が見られた(図２９）。このような 植物は対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｇｕｓを含むベクターで形
質転換した）に比べて大きく見えた。
【０２１６】 １７．実施例：Arabidopsisにおけるｃｅｌ１の発現 ｃｅｌ１のｃＤＮＡは大腸菌の発現ベクターｐＥＴ３ｄ（ノバゲン、マジソン
、ウィスコンシン）でクローニングした。ウサギでポリクローナル抗体を作成す
るために組換えタンパクを用いた。特異抗体は６５ｋＤのタンパクと反応した。
このタンパクは、早く生育している器官にのみ検出され、古いあるいは完全に発
育した組織には見られなかった（図３０）。
【０２１７】 １８．実施例：Acetobacter xylinumにおけるセルロース合成に対するＣＢ Ｄの影響 １８．１．はじめに セルロースの微小繊維合成が細胞壁形成から分離できるので、グラム陰性細菌
Acetobacter xylinumは長い間、セルロース合成のモデルと見なされてきている(
Ross et al., 1991, Microbiological Reviews 55:35-58)。A. xylinumのセルロ
ース合成では重合化と結晶化が連結した過程なので、結晶化を妨害することは重
合化を進めることになる(Benziman et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:6678-6682)。セルロース結合性の有機物質の中には、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞
の生育やセルロース−微小繊維の会合を変更するものもある。たとえば、直接染
料やカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および蛍光光沢剤（ＦＢＡ、たとえ
ばカルコフローホワイトＳＴ）は、細胞表面からの突出直後、多糖類の鎖に結合
して微小繊維と細胞壁の正常な会合を妨害する。このような分子は結晶化を妨げ
、従って重合化を高める(Haigler, 1991, “微小繊維の生物発生における重合化
と結晶化の関係”はセルロースの生合成と生体分解の中、pp99-124, Haigler an
d P. J. Weimer編、Marcel Dekker Inc., New York)。
【０２１８】 この実験はセルロース合成におけるｃｂｄ発現の影響を調べるために行った。
【０２１９】 １８．２．材料と方法 Acetobacter xylinum株はＡＴＣＣ２３７６９を用いた。０．５％バクトペプト ン、０．５％酵母抽出物、２％グルコースおよび０．３％Ｋ２ＨＰＯ４ ｐＨ
６、および１．５ユニット/ｍｌのTrichoderma virideセルラーゼ（Fluka, Buch
s, スイス）からなる培地中で３０℃にて連続的に撹拌しながら、細胞を２４時 間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、事前に冷却しておいたリン酸緩
衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ６）で２回洗浄した。乾燥重量２ｍｇ/ ｍｌ（２．５ Ｏ．Ｄ６００＝１ｍｇ/ｍｌ）の濃度で細菌をリン酸緩衝液に再 浮遊した。各反応混合物を１ｍｌずつ、０．８ｍｇの細胞/ｍｌリン酸緩衝液を 含んだ２０ｍｌのシンチレーションバイアルに入れた。セルロース合成は、４０
ｍＭのグルコース（比活性４０，０００ｃｐｍ/ｍｏｌのＤ−［Ｕ１４Ｃ」グル コース（アマシャム、イングランド））を加えることによって開始し、連続的に
撹拌しながら３０℃にて１〜２時間合成を続けた。形成された１４ＣＯ２は、反
応バイアルの中に置いた、０．２ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを含む蓋のないエッペン
ドルフ管に回収した。細菌懸濁液に０．５ＭのＨＣｌを０．１ｍｌ加えることに
より反応を停止し、１５分間インキュベートした。 回収した１４ＣＯ２を含む
ＮａＯＨ溶液を１５０μｌシンチレーション管に移した。細胞とセルロースは１
．５ｍｌのエッペンドルフ管に移し、遠心して、水にて３回洗浄した。０．２Ｎ
のＮａＯＨ、１％のＳＤＳとともに混合することにより細胞を溶解した。セルロ
ースはＧＦ/Ａフィルター（ワットマン、Shrewbury, MA)上で回収し、１５ｍｌ の水で洗浄して、６０℃のオーブンで乾燥した。フィルターおよび回収した１４ ＣＯ２を含むＮａＯＨは、グルコースの取り込み（セルロースシンターゼ活性）
と呼吸を測定するために、“ＯＰＴＩ−ＦＬＵＯＲ”（パッカード）シンチレー
ション液を用いてシンチレーションカウンターにて計測した。
【０２２０】 室温で銅製のグリッドの上に然るべき溶液を１滴のせることによって電子顕微
鏡観察を行った。セルロース合成反応は、３００μｇ/ｍｌの濃度のＣＢＤ存在 下あるいは非存在下で、４０ｍＭのグルコース、乾燥重量０．５ｍｇ／ｍｌでリ
ン酸緩衝液に入っている細胞を含んでいた。 反応は３０分インキュベートした
後２．５％のグルタールジアルデヒド（メルク、ローウェー、ニュージャージー
）を３０分間加えることによって停止し、水で３回洗浄して乾燥した。１．５％
のリンタングステン酸にてグリッドを陰性染色し、８０ｋｖで操作するＪｅｏｌ
１００ＣＸ電子顕微鏡にて調べた。
【０２２１】 １８．３．結果 Acetobacter xylinumの休止状態の細胞は、放射性グルコースおよび様々な濃 度のｃｂｄあるいはカルコフロー（陽性対照として）およびＢＳＡ（陰性対照と
して）を含むリン酸緩衝液中で１時間、あるいは示された時間、セルロース合成
を行うことができた。セルロースシンターゼ活性は取り込まれたグルコースの量
によって定めた。図３０は、１ｍＭのカルコフローおよび１００μｇ/ｍｌのＢ ＳＡ（１．５μＭ）と比較した、様々な濃度（１０〜５００μｇ/ｍｌ、０．６ 〜３０μＭ）におけるｃｂｄの影響を示している。ｃｂｄは、５００μｇ/ｍｌ で濃度依存性にグルコースの取り込みを５倍まで高めた。カルコフローは２倍に
高め、ＢＳＡは影響しなかった。グルコースのＣＯ２への酸化率はわずかに影響
を受けただけだった。従ってグルコースの取り込みはセルロース合成によるもの
と考えられた。
【０２２２】 A. xylinumによって作られたセルロースリボンの電子顕微鏡観察によれば、図
３１に示されるように、対照における薄くて均一なリボンに比べて、ＣＢＤ処理
によって個々の原繊維サブユニットで構成された、広がったリボンを生じている
ことが判った。
【０２２３】 この実施例では、モデル系(Acetobacter xylinum)を用いて、蛍光光沢剤、カ ルコフローの効果に比べて、ｃｂｄはセルロースシンターゼ活性を高めることを
示している。セルロースシンターゼ活性におけるｃｂｄの効果は、濃度依存性反
応であり、至適反応はおよそ１０ｍｇ/ｍｌで得られた。
【０２２４】 １８．４．考察 Acetobacter xylinum細菌におけるセルロース合成では重合化と結晶化が連結 した反応であることは明らかである(Benziman et al., 1980 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77:6678-6682)。培養液にｃｂｄを加えることによってA. xylinumに おける放射性グルコースの取り込みが高められた。何か特別なセルロース合成の
作用機序に限定するつもりはないが、本発明者は、ｃｂｄが結晶化過程を妨害す
ることにより放射性グルコースの取り込みを高めたと信じている。我々の仮説は
、セルロースに結合する染料や蛍光光沢剤はｉｎ ｖｉｖｏにおいてセルロース
の微小繊維の会合を変化させるということを示したHaiglerの概説（1991、“微 小繊維の生物発生における重合化と結晶化の関係”はセルロースの生合成と生物
分解の中pp.99-124, Haigler and Weimer 編、Marcel Dekker, Inc., New York)
に支持されている。紅藻(Waaland and Waaland, 1975, Planta 126:127-138)や 根端(Hughes and McCully, 1975, EMBO J. 6:3901-3907)を染料の存在下で生育 させると、細胞の形状に変形が観察された。今では、このような分子は、原核細
胞および真核細胞の細胞表面から突出直後にセルロース鎖に結合でき(Haigler a
nd Brown, 1979, J. Cell Biol. 82, 70a;Benziman et al., 1980, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77:6678-6682; Haigler et al., 1980, Science 210:903-906;
Brown et al., 1982, Science 218:1141-1142)、結晶形成を妨害する（Haigler
and Chanzy, 1988, J. Ultrastruct. Mol. Struct. Res. 98:299-311)のは明ら
かである。さらに、染料の存在下では重合化の速度は４倍に上昇することが示さ
れた(Benziman et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6678-6682)。結
晶化はこの連結反応のボトルネックであり、それを妨害することは重合化を促進
するということが提案された。電子顕微鏡で観察されたように、ｃｂｄの効果は
カルコフローの効果よりもむしろＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）の効果
に、両方の場合でセルロースリボンが広がるという点で、匹敵する（Haigler、1
991、“微小繊維の生物発生における重合化と結晶化の関係”はセルロースの生 合成と生物分解の中pp.99-124, Haigler and Weimer 編、Marcel Dekker, Inc.,
New York)。セルロースシンターゼ活性におけるｃｂｄの効果は、ＣＭＣよりも
高く、カルコフローに匹敵するか、高いくらいである（図３１）。ｃｂｄ，ＣＭ
Ｃおよびカルコフローの効果が異なるのは、分子量やセルロースに対する親和性
の差異によるものであると考えることができる。ＣＭＣ（９０ｋＤａ）は大きな
原繊維サブユニットの正常な会合を妨害するにすぎず、従って結晶化を変えるこ
とはほとんどない。しかし、小さな分子であるカルコフローは開始直後のグルカ
ン鎖会合を妨害する。ｃｂｄの大きさはカルコフローとＣＭＣの中間くらいであ
る。一方でカルコフローで見られるような極めて小さな繊維の会合を妨げるほど
小さくなく、他方で、セルロースへの親和性が高いのでセルロース挿入剤として
充分に作用し、セルロース合成の速度を５倍まで高めている。
【０２２５】 上に示した結果に基づけば、ｃｂｄを含むしかしそれには限定しないが、たと
えばＣＢＤを発現しているアルファルファのような遺伝子導入植物は、生物量の
レベルが高くなるだけではなく、反芻動物による分解を受け易いセルロースを持
っているので、遺伝子導入をしていない普通の植物よりも高い栄養価を持ってい
る。
【０２２６】 １９．実施例：ｃｂｄを発現している遺伝子導入植物における植物細胞壁の
変更と機械的な強さ ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現しているポプラと対照植物（
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下で（ｃｂｄの代わりに）ｇｕｓを含むベクター
で形質転換した）の葉柄をパラフィン包埋した。横断切片をＣｌＺｎＩで染色し
た（図３３Ａ〜Ｄ）．ｃｂｄを発現している植物の葉柄のほうが厚い細胞壁を持
っていると思われた。 葉柄はその構造を維持するものとして物理的に強かった
が、同じ切断過程では対照の葉柄は粉砕された。
【０２２７】 根のカルコフロー染色によれば（図３４Ａ〜Ｂ）、ｃｂｄを発現している植物
の根の細胞壁は厚く見えることが示された。根はその構造を維持するものとして
物理的に強かったが、同じ切断過程では対照の根は粉砕された。
【０２２８】 このような結果は、植物におけるｃｂｄの発現によって物理的および環境的な
生物および無生物ストレスに耐えるような植物の能力を改善できることを示して
いる。
【０２２９】 ２０．実施例：ｃｂｄを発現している植物における植物多糖類の変更 ｃｂｄを発現しているポプラの細胞が、対照植物にはほとんどないか全くない
ような黒っぽい顆粒を蓄積していることに気付いた。葉柄の細胞については図３
３のＡおよびＣに対してＢとＤを、根の細胞については図３５Ｂに対してＡを参
照されたい。ｃｂｄを発現しているポプラおよび対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターの下でｇｕｓを含むベクターで形質転換した）の葉柄を特異的にデンプ
ンを染めるＩＫＩで染色した（図３６ＡおよびＢ）。ジャガイモの塊茎も陽性対
照としてＩＫＩで染色した。結果は黒っぽい顆粒はデンプンであることを示して
いた。
【０２３０】 ｃｂｄを発現している植物においてデンプンが蓄積するというメカニズムに対
する可能性のある説明は、決して本発明に制限を加えるものではないが、植物細
胞壁の生合成で運搬された糖および主な代謝産物としてサッカロースが提案され
ているということである。サッカロースシンターゼはサッカロースとＵＤＰを利
用してＵＤＰ−グルコースとフルクトースを作る。ＵＤＰ−グルコースはセルロ
ースシンターゼの基質として作用する。蓄積したフルクトースはいくつかの段階
を経てデンプン利用物に変換される可能性がある。たとえば、フルクトキナーゼ
はフルクトース６リン酸を作り、グルコースリン酸イソメラーゼはグルコース６
リン酸を作り、リン酸グルコムターゼはグルコース１リン酸を作り、ＡＤＰＧ−
ピロホスフォリラーゼはＡＤＰ−グルコースを作り、それはデンプンシンターゼ
の基質となる。植物におけるｃｂｄの発現は一般的な多糖類の分布にも影響を与
えるので、別の作物の栄養価にも影響を与える。
【０２３１】 ２１．実施例：生育への刺激 ２つのプロモーター（ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとA. thalianaのｃｅｌ１ プロモーター）を用いて、タバコにおけるｃｂｄの発現を調べた。どちらのプロ
モーターの下でもｃｂｄを発現している植物は、対照植物よりも早く生育し、有
意に早く開花した（図３７）。植物におけるｃｂｄの発現は作物の収穫を早める
と思われる。
【０２３２】 ２２．実施例：Ｃｅｌ１を発現している遺伝子導入植物は樹高および繊維の
長さに影響を与える。
【０２３３】 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｅｌ１を発現している遺伝子導入ポプラ
の個体をｉｎ ｖｉｔｒｏで微細繁殖させ、生育した。植物は対照植物（ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターの下でｇｕｓを含むベクターで形質転換した）に比べて樹
高が高くなった。ｃｅｌ１を発現している植物の節間部の平均長は対照よりも有
意に高かった（図３８）。
【０２３４】 ｃｅｌ１を発現している２つの遺伝子導入植物（Ｃｅｌ１．５およびＣｅｌ１
．１８）における繊維細胞の平均長を野生型と比較した（図３９）。遺伝子導入
植物の繊維細胞の長さは有意に高かった。
【０２３５】 繊維細胞の長さはＣｅｌ１を発現している遺伝子導入植物の機械的な特性に影
響を与える可能性がある。
【０２３６】 ２３．実施例：遺伝子導入ポプラのノーザンブロット解析 この実施例では対照植物および遺伝子導入植物から得たＲＮＡのノーザンブロ
ット解析の結果を示し、ｃｂｄ遺伝子の発現を確認している（図４０、レーン１
は対照の野生型を、レーン２は遺伝子導入植物を示している）。ノーザンブロッ
トは実施例６および７に記載したように行った。
【０２３７】 ２４．実施例：熱抵抗性が改善された遺伝子導入植物 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下でｃｂｄを発現している遺伝子導入ポプラ；
対照植物（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下で（ｃｂｄの代わりに）ｇｕｓと組
合せたベクターで形質転換した）；および野生型植物を２５℃に維持され、環境
的に制御された栽培室から温度が３２〜３８℃の範囲にある温室に移した。次の
日健全なままの植物、衰弱したものあるいは枯れた植物の比率をスコア化した。
表１に表したデータは、ｃｂｄ遺伝子導入植物は、野生型および対照植物に比べ
て熱に対する抵抗性が改善されていることを示している。
【０２３８】
【表１】
【０２３９】 ２５．プラスミドの供託 以下のプラスミドは１９９８年１月１２日、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ユニバシティ通り、マナッサス市、Ｖ
Ａに供託し、以下の受入番号を割り振られた： プラスミド 受入番号 ｐＰＳ ２０９５７７ ｐＣＥＬ１ ２０９５７６
【０２４０】 発明はその特別な実施例に関して詳細を説明しているけれども、機能的に同等
であるような変異は本発明の範囲内にあることは理解されるであろう。実際、こ
こで示し、説明したものに加えて発明の様々な変更が、前述の説明および添付し
てある図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は添付した請
求項の範囲内に収まることを意図している。
【０２４１】 ここでは様々な出版物を引用し、公開されているものは全体を参考として取り
入れる。
【０２４２】
【配列リスト】
（１）一般情報 （ｉ）出願者 エルサレムのヘブライ大学、Ｙｉｓｓｕｍ研究開発会社 Ｓｈｏｓｅｙｏｖ、 Ｏｄｅｄ Ｓｈａｎｉ、 Ｚｉｖ Ｓｈｐｉｇｅｌ、Ｅｔａｉ （ｉｉ）発明の名称 ：形態を変化させた遺伝子導入植物およびArabidopsis th
aliana（シロイヌナズナ）から単離したエンド１，４−β−グルカナーゼ遺伝子
、プロモーターおよびタンパク （ｉｉｉ）配列の数：２１ （ｉｖ）通信住所 （Ａ）受取り人：ドクター・マーク・フリードマン社 （Ｂ）通り：Ｈａｏｍａｎｉｍ通り７番地 （Ｃ）都市：テルアビブ （Ｄ）国：イスラエル （Ｅ）郵便番号：６７８９７ （ｖ）コンピューター読み出し形式 （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ対応 （Ｃ）操作システム：ＣＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：ＦａｓｔＳＥＱバージョン２．０ （ｖｉ）現出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類 （ｖｉｉｉ）代理人/代理業者情報 （Ａ）氏名：フリードマン、マーク （Ｂ）登録番号： （Ｃ）参考/整理番号 （ｉｘ）通信情報 （Ａ）電話：９７２−３−５６２５５５３ （Ｂ）ファックス：９７２−３−５６２５５５４ （Ｃ）テレックス：
【０２４３】 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（配列番号１）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７７０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：二本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１
【０２４４】
【表２】
【０２４５】 （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（配列番号２）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１４７９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：二本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号２
【０２４６】
【表３】
【０２４７】 （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（配列番号３）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１４７９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：二本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称/鍵：コード配列 （Ｂ）位置：１・・・１４７６ （Ｃ）そのほかの情報 （ｘｉ）配列の説明：配列番号３
【０２４８】
【表４】
【０２４９】 （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（配列番号４）に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４９２個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：タンパク （ｘｉ）配列の説明：配列番号４
【０２５０】
【表５】
【０２５１】 （６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（配列番号５）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４９９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：二本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号５
【０２５２】
【表６】
【０２５３】 （７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（配列番号６）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号６ ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣ ＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡ ＧＧＡＣＣＡＡＣ
【０２５４】 （８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（配列番号７）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１６３個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ペプチド （ｘｉ）配列の説明：配列番号７
【０２５５】
【表７】
【０２５６】 （９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（配列番号８）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４９４個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ペプチド （ｘｉ）配列の説明：配列番号８
【０２５７】
【表８】
【０２５８】 （１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（配列番号９）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：６０００塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：ニ本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号９
【０２５９】
【表９】
【０２６０】 （１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（配列番号１０）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：６個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ペプチド （ｘｉ）配列の説明：配列番号１０ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ １ ５
【０２６１】 （１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（配列番号１１）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：８個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ペプチド （ｘｉ）配列の説明：配列番号１１ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ １ ５
【０２６２】 （１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（配列番号１２）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１２ ＧＡＡＴＴＣＧＧＮＧ ＧＮＴＡＮＴＡＮＧＡ ＮＧＣ
【０２６３】 （１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（配列番号１３）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１３ ＧＡＡＴＴＣＣＡＴＮ ＴＣＮＴＣＮＧＧＮＣ ＧＮＴＣＣＡＮＣＡ
【０２６４】 （１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（配列番号１４）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１４ ＡＴＧＧＣＧＣＧＡＡ ＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴ
【０２６５】 （１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（配列番号１５）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１５ ＴＣＡＴＣＧＣＣＡＡ ＧＴＡＧＡＡ
【０２６６】 （１７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（配列番号１６）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１６ ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴ ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴ ＣＡＡＣＧＧ
【０２６７】 （１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（配列番号１７）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１７ ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣ ＴＴＴＡＣＧＧＡＧＡ ＧＣＧＴＣＧＣ
【０２６８】 （１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（配列番号１８）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１８ ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣ ＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡ ＣＡＴＣＡＴＣＡＡ
【０２６９】 （２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（配列番号１９）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号１９ ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣ ＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴ ＧＴＡＣＣＡＡＧ
【０２７０】 （２１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（配列番号２０）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号２０ ＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣ ＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣ ＣＣＴＡＡＴＴＴ
【０２７１】 （２２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（配列番号２１）に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖状：一本鎖 （Ｄ）位相：線形 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の説明：配列番号２１ ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ ＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴ ＧＴＡＣＣＡＡＧ
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 アガロースゲル上で展開したＰＣＲ産物を示す。レーンＡ：ＰＣＲ産物。２６
０塩基対の断片を用いてさらに調べた。Ｍ：ラダーＤＮＡのサイズマーカーｘ１
２３塩基対（ｂｐ）（ギブコＢＲＬ）
【図２】 Arabidopsis thaliana のｃｅｌ１ゲノム遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
の模式図でそのＤＮＡ構造と制限部位を示している。ＥｃｏＲＩ−ＲＩ，Ｅｃｏ
ＲＶ−Ｒ， ＮｃｏＩ−Ｎ， ＳａＩＩ−Ｓ， ＳｐｈＩ−Ｓｐ， ＸｈｏＩ−
Ｘ。翻訳領域は四角で囲んだ。エクソン−縞模様の四角、イントロン−白抜きの
四角、５’および３’非翻訳領域−陰をつけた四角。マップの下の３つの線はＥ
ｘｏＩＩＩ欠失のためのサブクローンを示している。数字はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：９におけるヌクレオチドを表している。５’および３’非翻訳領域の範囲は決
めなかったので、疑問符で示した。
【図３】 完全長の逆転写したA． thaliana ｃｅｌ１のｃＤＮＡ（ヌクレオチド１−１
４７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＰＣＲ増幅を示す。レーンＡ：ｃＤＮＡ断
片。レーンＢ：対照、逆転写酵素で事前処理していない全ｍＲＮＡで行ったＰＣ
Ｒ。Ｍ：１ｋｂのラダーＤＮＡサイズマーカー（ギブコＢＲＬ）
【図４】 A． thaliana ｃｅｌ１（上、アミノ酸２〜４９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
およびＮＯ：４）およびアボガドｃｅｌ１（下、アミノ酸５〜４９２、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８）にコードされている推定アミノ酸配列の最適配置を示す。並べ
られたシステイン残基は下線で示した。グリコシル化の可能性のある部位（Ａｓ
ｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を四角で囲んだ。グリコシル加水分解酵素モチーフは
上と下に線を引いた。
【図５】 アボガドのＥＧａｓｅ（Ｃｅｌ１、下）と比較したA． thaliana Ｃｅｌ１タ
ンパク（上）のカイト−ドリトル疎水性親水性指標分析を示す。
【図６】 ｃｅｌ１のノーザンブロット分析を示す。レーン１：完全に広がった葉；レー
ン２：開花している茎の基底節間部； レーン３：正常植物の開花している茎に
おける伸長層；レーン４：矮性植物の開花している茎における伸長層（ユニコナ
ゾール処理）。下のレーンは内部標準としてのｒＲＮＡを示す。
【図７Ａ−Ｃ】 ｇｕｓリポーター遺伝子に結合したｃｅｌ１プロモーター領域（核酸５〜１６
１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で形質転換した遺伝子導入タバコの組織学的グ
ルクロニダーゼ（ＧＵＳ）染色を示す。 図７Ａ：矢印は苗条および根における
青く染まった伸長層を指している。図７Ｂ：拡大した苗条頂点。 図７Ｃ：拡大
した根の先端。
【図８】 ｃｅｌ１のA． thalianaプロモーター領域（ヌクレオチド１〜１７７０、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１）の核酸配列を示す。保存的プロモーターモチーフＴＡＴＡ
、ＣＡＴ（ｘ２）およびＧＣ、および翻訳開始ＡＵＧコドンは下線で示す。
【図９】 遺伝子導入植物のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。５００ｂｐのバンドはｃ
ｂｄ導入遺伝子の存在を示している。レーン１およびレーン２：ｐ３５ＳＣ１．
１およびｐ３５ＳＣ１．２遺伝子導入植物クローン。レーン３およびレーン４：
ｐＣＣ１．２およびｐＣＣ１．２遺伝子導入植物クローン。レーン５およびレー
ン６：ｐＢＩ１１０.１およびｐＢＩ１１０.２遺伝子導入植物クローン。レーン
７：非遺伝子導入植物。レーン８：陽性対照−ｐ３５ＳＣ１ＤＮＡ。Ｍ：１ｋｂ
のラダーＤＮＡサイズマーカー（ギブコＢＲＬ）。
【図１０】 遺伝子導入植物から得た逆転写したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）を
（陰性的に）示す。５００ｂｐのバンドはｃｂｄ導入遺伝子の発現を示している
。レーン１：陽性対照−ｐ３５ＳＣ１ＤＮＡ。レーン２：逆転写なしの陰性対照
。レーン３：ｐＢＩ１１０.１遺伝子導入植物クローン。レーン４および５：ｐ ３５ＳＣ１．１（小さい表現型）およびｐ３５ＳＣ１．２（大きい表現型）遺伝
子導入植物クローン。Ｍ：１ｋｂのラダー（ギブコＢＲＬ）
【図１１Ａ−Ｂ】 １４日目の発芽プレートの写真である。（Ａ）ｐＢＩ１０１遺伝子導入植物ク
ローンを自家受粉することによって得たＦ１種子に由来したタバコ；および（Ｂ
）Ｐ３５ＳＣ１遺伝子導入植物クローンを自家受粉することによって得たＦ１種
子に由来したタバコ。
【図１２Ａ−Ｂ】 大型（左）と小型（右）表現型を示している８週令のＦ１ｐ３５ＳＣ１タバコ
の上からと横からの写真である。植物は発芽４週間後、発芽プレートから移した
。
【図１３Ａ−Ｂ】 大型（Ａ）および小型（Ｂ）表現型のＦ１Ｐ３５ＳＣ１遺伝子導入植物クロー
ンを植物として増殖させた４週間後の発芽プレートの写真である。
【図１４Ａ−Ｂ】 大型（右）および小型（左）表現型を示しているＦ１Ｐ３５ＳＣ１タバコを植
物として増殖させた１０週令の上からと横からの写真である。
【図１５Ａ−Ｆ】 大型表現型（大きな葉／正常な胚軸）（図１５Ａ〜Ｃ）あるいは小型表現型（
小さな葉／長い胚軸）（図１５Ｄ〜Ｆ）のどちらかを持っているプラスミド（ｐ
ＢＩ１２１）で形質転換した対照植物と比較した、プラスミド（ｐ３５ＳＣ１）
で形質転換した遺伝子導入タバコ草木の生物量生産の比較をグラフで示す。測定
は生重量（図１５ＡとＤ）、乾燥重量（図１５ＢとＥ）および葉積（図１５Ｃと
Ｆ）で行った。
【図１６Ａ−Ｂ】 野生型タバコ（野生型）とプラスミドｐＣＣ１（ｐＣＣ１５．５）においてｃ
ｅｌ１プロモーターの下でｃｂｄを発現している遺伝子導入タバコの生物量生産
を比較してグラフで示す。重量（１６Ａ）および葉積（１６Ｂ）を測定した。
【図１７】 ポプラにおけるｃｅｌ１−ｇｕｓの発現を示す。
【図１８】 ポプラの苗条におけるｃｅｌ１−ｇｕｓの発現を示す。
【図１９】 形質転換したポプラの葉におけるｃｅｌ１プロモーター−ｇｕｓの発現を示す
。
【図２０】 形質転換していない対照ポプラ（左）に比べて、 ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ ーの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラ（右）の構造的
形態が変化していることを示す。
【図２１】 対照ポプラの葉（上）と比較した、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもと
でｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラの葉（下）を示す。
【図２２】 対照ポプラの根（左）と比較した、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもと
でｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラの根（右）を示す。
【図２３】 対照ポプラの根端の写真である（４０倍に拡大したもの）。
【図２４】 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝
子導入ポプラの根端の写真である（４０倍に拡大したもの）。
【図２５】 形質転換していない対照ポプラの根をカルコフロー染色した写真である（４０
０倍に拡大したもの）。
【図２６】 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝
子導入ポプラの根をカルコフロー染色した写真である（４００倍に拡大したもの
）。
【図２７】 形質転換していない対照ポプラの根毛をカルコフロー染色した写真である（４
００倍に拡大したもの）。
【図２８】 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｂｄ遺伝子を発現している遺伝
子導入ポプラの根毛をカルコフロー染色した写真である（４００倍に拡大したも
の）。
【図２９】 対照ポプラ（左）およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御のもとでｃｅｌ１
遺伝子を発現している遺伝子導入ポプラ（右）の写真である。
【図３０】 ArabidopsisにおけるＣＥＬ１タンパクのウエスタンブロット分析の写真であ る。古い葉（ＯＬ）、若い葉（ＹＬ）、低い茎（ＬＳ）、中間の茎（ＭＳ）、上
方の茎（ＵＳ）、古い実／さや（ＯＦ）、若い実／さや（ＹＦ）、花（ＦＬ）。
【図３１】 Acetobacter xylinumのグルコースの取り込み量（ｎｍ）を測定することによ るセルロースシンターゼ活性におけるｃｂｄ濃度の影響を示すグラフである。対
照（ＢＳＡ）およびカルコフローと比較した。ｃｂｄの濃度は、０，１０，１０
０および５００ｍｇ／ｍｌであった。縦棒は標準誤差を表す。
【図３２Ａ−Ｂ】 ｃｂｄを含まない対照（Ｂ）あるいはｃｂｄを含んだAcetobacter xylinumに より生産されたセルロースリボンの型におけるｃｂｄの影響に関する電子顕微鏡
検査の写真である。
【図３３Ａ−Ｄ】 ポプラの茎に発現したｃｂｄ（ＢおよびＤ）の植物細胞壁の厚さに対する影響
を対照ポプラ（ＡおよびＣ）と比較した光学顕微鏡写真である。
【図３４Ａ−Ｂ】 遺伝子導入ポプラの根（Ａ）におけるｃｂｄ発現の影響を対照ポプラの根（Ｂ
）と比較してカルコフロー染色によって示した光学顕微鏡写真である。
【図３５Ａ−Ｂ】 根の細胞（Ａ）におけるｃｂｄ発現の影響を対照の根の細胞（Ｂ）と比較して
ＣｌＺｎＩ染色によって示した光学顕微鏡写真である。
【図３６Ａ−Ｂ】 ポプラの茎（Ａ）におけるｃｂｄ発現によるデンプン顆粒蓄積への影響を対照
植物（Ｂ）と比較してＩＫＩ染色によって示した光学顕微鏡写真である。図３６
Ｃは、比較のために提供したジャガイモの結節におけるデンプン顆粒をＩＫＩ染
色して光学顕微鏡で調べた写真である。
【図３７】 ポプラの開花日について、対照ポプラと比較して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ーあるいはｃｅｌ１プロモーターの制御の下でｃｂｄ遺伝子発現の影響を示した
グラフである。ＰＢＩ１０１（（クロノテック、パロアルト、カリフォルニア）
は、組換え核酸のコード配列あるいは導入遺伝子の挿入がない、ニ成分ベクター
のみである。
【図３８】 個別遺伝子導入植物のポプラの葉柄におけるｃｂｄを発現している節間部の平
均長を野生型と比較して示したグラフである。
【図３９】 ｃｅｌ１を発現している植物（遺伝子導入株ｃｅｌ１．５およびｃｅｌ１．８
）から得た繊維細胞の長さにおける影響を、野生型ポプラと比較して示した図で
ある。
【図４０】 ｃｂｄ遺伝子発現のノーザンブロット分析を示す。レーン１：対照の野生型ポ
プラ；およびレーン２：ＣＢＤをコードしている核酸を発現している遺伝子導入
ポプラ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０９／００６，６３６ (32)優先日 平成10年１月13日(1998．1．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シュピーグル エタイ イスラエル国、キブッツメギド 79230 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD09 CD13 CD17 4B024 AA08 BA12 CA04 DA01 DA05 FA02 FA18 GA11 HA01 HA12 4B050 CC03 DD13 LL10 4B065 AA11X AA88X AA88Y AC14 BA01 BA25 CA31 CA53

Claims (84)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドが遺伝子導
    入植物において発現されるように分泌シグナルペプチドをコードする核酸に操作
    できるように連結した、細胞壁を調節するタンパクあるいはポリペプチドをコー
    ドする核酸を備える核酸作成物を持つ遺伝子導入植物であって、作成物を持って
    いない祖先植物と遺伝子導入植物を同一の条件下で栽培した場合、祖先植物に比
    べて変更された形態を示す前記遺伝子導入植物。
  2. 【請求項２】 請求項１の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁調節タンパ
    クあるいはポリペプチドは、セルロース結合タンパク、多糖類結合ドメインある
    いは細胞壁修飾タンパクあるいは酵素である。
  3. 【請求項３】 請求項１の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁調節タンパ
    クあるいはポリペプチドはセルロース結合ドメインを備えている。
  4. 【請求項４】 請求項３の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結合ド
    メインは細菌、真菌あるいは粘菌から入手できる。
  5. 【請求項５】 請求項３の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結合ド
    メインはファージディスプレイ・ライブラリから入手できる。
  6. 【請求項６】 請求項２の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結合ド
    メインは、Clostridium sp., Ceullolomonas sp.、 Agaricus bisporus、 Fusar
    ium oxysporum、 Humicola sp.、 Neocallimastix patriciarum、Neurospora cr
    assa、 Penicillium janthinellum、 Phanerochaete chrysosporium、Porphyrs
    purpurea、Trichoderma sp.、 Butyrivibrio fibrisolvens、Microbispora bisp
    ora、Micromonospora cellulolyticum、 Pseudomonas fluorescens、 Streptomy
    ces sp.、Thermomonospora fusca、Bacillus sp.、 Caldocellum saccharolytic
    um、 Erwinia sp.、Myxococcus xanthus、 Limulus sp.、 Dictyostelium disco
    idum、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、 Thermotoga maritimaあるい はCellvibro mixtusから入手することができる。
  7. 【請求項７】 請求項６の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結合ド
    メインはC. cellulovoransタンパクあるいはポリペプチドから入手できる。
  8. 【請求項８】 請求項１の遺伝子導入植物であって、分泌シグナルペプチド
    をコードする前記核酸はＣｅｌ１分泌シグナルペプチドをコードしている。
  9. 【請求項９】 請求項１の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁調節タンパ
    クあるいはポリペプチドはエンド−キシログルカン トランスフェラーゼ、キシ
    ログルカン エンドトランスグリコシラーゼ、セルロースシンターゼ、エクスパ
    ンシンおよびポリサッカリダーゼからなるグループから選択される。
  10. 【請求項１０】 請求項１の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁調節タン
    パクあるいはポリペプチドはエンド−１，４−β−グルカナーゼである。
  11. 【請求項１１】 請求項１０の遺伝子導入植物であって、前記エンド−１，
    ４−β−グルカナーゼはArabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）から入手でき
    るＣｅｌ１である。
  12. 【請求項１２】 請求項１から１０までのいずれかの遺伝子導入植物の子孫
    、クローン、細胞株あるいは細胞であって、前記子孫、クローン、細胞株あるい
    は細胞は核酸作成物を持っている。
  13. 【請求項１３】 分泌シグナルペプチドをコードする核酸に操作できるよう
    に連結した細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドをコードする核酸を備え、
    さらに細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドが遺伝子導入植物で発現される
    ようにプロモーターを備えている核酸作成物を持つ遺伝子導入植物であって、遺
    伝子導入植物と核酸作成物を含まない祖先植物を同じ条件下で栽培した場合、祖
    先植物に比べて変更された形態を示すような前記遺伝子導入植物。
  14. 【請求項１４】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、プロモーターは構
    成的な植物プロモーターである。
  15. 【請求項１５】 請求項１４の遺伝子導入植物であって、構成的な植物プロ
    モーターはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである。
  16. 【請求項１６】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、プロモーターは組
    織特異的な植物プロモーターである。
  17. 【請求項１７】 請求項１６の遺伝子導入植物であって、組織特異的な植物
    プロモーターはｃｅｌ１機能的プロモーターである。
  18. 【請求項１８】 請求項１７の遺伝子導入植物であって、組織特異的な植物
    プロモーターはArabidopsis thalianaのｃｅｌ１機能的プロモーターである。
  19. 【請求項１９】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁調節タ
    ンパクあるいはポリペプチドはセルロース結合タンパク、多糖類結合ドメインあ
    るいは細胞壁修飾タンパクあるいは酵素である。
  20. 【請求項２０】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁調節タ
    ンパクあるいはポリペプチドは、セルロース結合ドメインである。
  21. 【請求項２１】 請求項２０の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結
    合ドメインは細菌、真菌あるいは粘菌から入手できる。
  22. 【請求項２２】 請求項２０の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結
    合ドメインは、ファージディスプレイ・ライブラリーから入手できるものである
    。
  23. 【請求項２３】 請求項２０の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結
    合ドメインは、Clostridium sp., Ceullolomonas sp.、 Agaricus bisporus、 F
    usarium oxysporum、 Humicola sp.、 Neocallimastix patriciarum、Neurospor
    a crassa、 Penicillium janthinellum、 Phanerochaete chrysosporium、Porph
    yrs purpurea、Trichoderma sp.、 Butyrivibrio fibrisolvens、Microbispora
    bispora、Micromonospora cellulolyticum、 Pseudomonas fluorescens、 Strep
    tomyces sp.、Thermomonospora fusca、Bacillus sp.、 Caldocellum saccharol
    yticum、 Erwinia sp.、Myxococcus xanthus、 Limulus sp.、 Dictyostelium d
    iscoidum、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、 Thermotoga maritimaあ るいはCellvibro mixtusから入手することができる。
  24. 【請求項２４】 請求項２０の遺伝子導入植物であって、前記セルロース結
    合ドメインはC. cellulovoransから入手できるものである。
  25. 【請求項２５】 請求項１９の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁修飾酵
    素はエンド−キシログルカン トランスフェラーゼ、キシログルカン エンドト
    ランスグリコシラーゼ、セルロースシンターゼ、エクスパンシンおよびポリサッ
    カリダーゼからなるグループから選択される。
  26. 【請求項２６】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、前記細胞壁調節タ
    ンパクあるいはポリペプチドはエンド−１，４−β−グルカナーゼである。
  27. 【請求項２７】 請求項２６の遺伝子導入植物であって、前記エンド−１，
    ４−β−グルカナーゼはＣｅｌ１である。
  28. 【請求項２８】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、核酸作成物はｃｅ
    ｌ１プロモーター−ｃｅｌ１に操作できるように連結した分泌シグナルペプチド
    をコードする核酸を備えている。
  29. 【請求項２９】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、核酸作成物はｃｅ
    ｌ１プロモーター−ＣＢＤに操作できるように連結した分泌シグナルペプチドを
    コードする核酸を備えている。
  30. 【請求項３０】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁調節タンパ
    クあるいはポリペプチドはエクスパンシンである。
  31. 【請求項３１】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、分泌シグナルペプ
    チドはｃｅｌ１分泌シグナルペプチドである。
  32. 【請求項３２】 請求項３１の遺伝子導入植物であって、ｃｅｌ１分泌シグ
    ナルペプチドはArabidopsis thalianaから入手できる。
  33. 【請求項３３】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁調節タンパ
    クあるいはポリペプチドは細胞壁修飾酵素である。
  34. 【請求項３４】 請求項３３の遺伝子導入植物であって、細胞壁修飾酵素は
    Ｃｅｌ１である。
  35. 【請求項３５】 請求項３４の遺伝子導入植物であって、前記Ｃｅｌ１はAr
    abidopsis thalianaから入手できる。
  36. 【請求項３６】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、プロモーターは誘
    発性プロモーターである。
  37. 【請求項３７】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、核酸作成物は、両
    方ともArabidopsis thalianaから入手できるｃｅｌ１分泌シグナルペプチドに操
    作できるように連結したｃｅｌ１プロモーターでClostridium cellulovoransの セルロース結合ドメインに連結したものである。
  38. 【請求項３８】 請求項１３の遺伝子導入植物の種子であって、種子は核酸
    作成物を持っている。
  39. 【請求項３９】 請求項１３の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株あ
    るいは細胞であって、前記子孫、クローン、細胞株あるいは細胞は核酸作成物を
    持っている。
  40. 【請求項４０】 Arabidopsis thalianaのＣｅｌ１タンパクあるいはポリ ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を持つ単離した核酸分子。
  41. 【請求項４１】 アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を持つタンパクある
    いはポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を持つ請求項４０の単離し
    た核酸分子。
  42. 【請求項４２】 請求項４０の核酸分子の変異体であって、前記変異体はAr
    abidopsis thalianaの遺伝子変異体、種の変異体、および天然に起きた、ある いは人工的なそれらの機能的変異体からなるグループから選択される。
  43. 【請求項４３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を持っている
    単離した核酸分子。
  44. 【請求項４４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を持つポリペプチ
    ドの誘導体あるいは類縁体をコードしているヌクレオチド配列を持つ単離した核
    酸分子。
  45. 【請求項４５】 請求項４０、４１、４２、４３、あるいは４４の核酸分子
    を備える組換え核酸ベクター。
  46. 【請求項４６】 請求項４５の組換え核酸ベクターを含んでいる宿主細胞。
  47. 【請求項４７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチド配列を持つ単離し
    た核酸分子。
  48. 【請求項４８】 Arabidopsis thalianaのエンド−１，４−β−グルカナ ーゼ（ｃｅｌ１）遺伝子に相当するアミノ酸配列を持つ単離したポリペプチド。
  49. 【請求項４９】 遺伝子変異体、種の変異体、および天然に起きた、あるい
    は人工的なそれらの機能的変異体からなるグループから選択された請求項４８の
    ポリペプチドの変異体
  50. 【請求項５０】 請求項４８のポリペプチドの誘導体あるいは類縁体。
  51. 【請求項５１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を持つポリペプチ
    ド。
  52. 【請求項５２】 Arabidopsis thalianaのｃｅｌ１の機能的プロモーター を備えている単離した核酸分子。
  53. 【請求項５３】 請求項５２の単離した核酸分子であって、前記ｃｅｌ１の
    機能的プロモーターはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の機能的断片からなる。
  54. 【請求項５４】 Arabidopsis thalianaのｃｅｌ１の分泌シグナルペプチ ドをコードしている第１のヌクレオチド配列とタンパクあるいはポリペプチドを
    コードしている第２のヌクレオチド配列を備えている組換え核酸ベクター。
  55. 【請求項５５】 請求項５４の組換え核酸ベクターであって、タンパクある
    いはポリペプチドは細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドである。
  56. 【請求項５６】 請求項５５の組換え核酸ベクターであって、細胞壁調節ポ
    リペプチドはエンド−１，４−β−グルカナーゼである。
  57. 【請求項５７】 請求項５５の組換え核酸ベクターであって、細胞壁調節タ
    ンパクあるいはポリペプチドはセルロース結合ドメインあるいは細胞壁修飾酵素
    である。
  58. 【請求項５８】 請求項５５の組換え核酸ベクターであって、細胞壁調節タ
    ンパクあるいはポリペプチドはセルロース結合ドメインを備える。
  59. 【請求項５９】 請求項５８の組換え核酸ベクターであって、セルロース結
    合ドメインは細菌、真菌あるいは粘菌から入手できる。
  60. 【請求項６０】 請求項５５の組換え核酸ベクターであって、前記細胞壁調
    節タンパクあるいはポリペプチドは、Clostridium cellulovorans ｃｂｐＡ遺
    伝子、Clostridium thermocellum ｃｉｐＡ遺伝子あるいはCellulomonas fim
    i セルラーゼ遺伝子によってコードされているタンパクあるいはポリペプチド からなるグループから選択される。
  61. 【請求項６１】 植物において細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドを
    コードしている組換え核酸を発現することを備えた植物の生育率を高める方法。
  62. 【請求項６２】 遺伝子導入植物を作成する方法であって、 （ａ）分泌シグナルペプチドをコードする核酸および細胞のプロモーターに操作
    できるように連結した、細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドをコードして
    いる組換え核酸を植物細胞に導入すること、および （ｂ）植物の細胞において組換え核酸を発現することを 備えている。
  63. 【請求項６３】 請求項６２に基づいた遺伝子導入植物を作成する方法であ
    って、さらに： （ｃ）植物を栽培すること、および （ｄ）遺伝子導入植物から種子を回収することを 備えている。
  64. 【請求項６４】 組換え核酸を含んでいない祖先植物と同じように栽培し、
    繊維あるいは繊維細胞を比較した場合、変更された繊維あるいは繊維細胞の方が
    長いあるいは短い、異なった吸収性、強度あるいはレオロジーを持つような遺伝
    子導入植物において、細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドをコードしてい
    る組換え核酸の発現を備え、変更されたセルロース化合物繊維あるいは繊維細胞
    を持つ遺伝子導入植物を作成する方法。
  65. 【請求項６５】 組換え核酸を含んでいない祖先植物と同じように栽培した
    場合、祖先植物のセルロース含有量よりも高い含有量のセルロースを持つ遺伝子
    導入植物において、細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドをコードしている
    組換え核酸の発現を備え、セルロース含有量の高い遺伝子導入植物を作成する方
    法。
  66. 【請求項６６】 組換え核酸を含んでいない祖先植物と同じように栽培した
    場合、祖先植物のデンプン生産量あるいは含有量よりも高いデンプン生産量ある
    いは含有量を持つ遺伝子導入植物において、細胞壁調節タンパクあるいはポリペ
    プチドをコードしている組換え核酸の発現を備え、デンプン生産量あるいは含有
    量の高い遺伝子導入植物を作成する方法。
  67. 【請求項６７】 組換え核酸を含んでいない祖先植物と同じように栽培した
    場合、祖先植物の開花期と異なった開花期を持つような遺伝子導入植物において
    、細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドをコードしている組換え核酸の発現
    を備え、開花期の異なる遺伝子導入植物を作成する方法。
  68. 【請求項６８】 組換え核酸を含んでいない祖先植物と同じように栽培した
    場合、祖先植物の熱抵抗性よりも高い熱抵抗性を持つような遺伝子導入植物にお
    いて、細胞壁調節タンパクあるいはポリペプチドをコードしている組換え核酸の
    発現を備え、熱抵抗性の高い遺伝子導入植物を作成する方法。
  69. 【請求項６９】 請求項１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁調節タンパ
    クあるいはポリペプチドをコードする核酸を含んでいない祖先植物と同じように
    栽培し、繊維あるいは繊維細胞を比較した場合、前記遺伝子導入植物は、異なっ
    た吸収性を持つより長いあるいは短い繊維あるいは繊維細胞、あるいは異なった
    強度あるいはレオロジーを持つ繊維あるいは繊維細胞を示す。
  70. 【請求項７０】 請求項６９の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
  71. 【請求項７１】 請求項１あるいは１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁
    調節タンパクあるいはポリペプチドをコードする核酸を含んでいない祖先植物と
    同じように栽培して比較した場合、前記遺伝子導入植物の方が早い生育を示す。
  72. 【請求項７２】 請求項７１の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
  73. 【請求項７３】 請求項１あるいは１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁
    調節タンパクあるいはポリペプチドをコードする核酸を含んでいない祖先植物と
    同じように栽培して比較した場合、前記遺伝子導入植物の方が生物分解に大きい
    あるいは小さい抵抗性を示す。
  74. 【請求項７４】 請求項７３の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
  75. 【請求項７５】 請求項１あるいは１３の遺伝子導入植物であって、前記遺
    伝子導入植物の方が反芻動物において大きいあるいは小さい消化率を示す。
  76. 【請求項７６】 請求項７５の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
  77. 【請求項７７】 請求項１あるいは１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁
    調節タンパクあるいはポリペプチドをコードする核酸を含んでいない祖先植物と
    同じように栽培して比較した場合、前記遺伝子導入植物の方が害虫に対して大き
    いあるいは小さい抵抗性を示す。
  78. 【請求項７８】 請求項７７の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
  79. 【請求項７９】 請求項１あるいは１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁
    調節タンパクあるいはポリペプチドをコードする核酸を含んでいない祖先植物と
    同じように栽培して比較した場合、前記遺伝子導入植物の方が高いデンプン生産
    量および/あるいは含有量を示す。
  80. 【請求項８０】 請求項７９の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
  81. 【請求項８１】 請求項１あるいは１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁
    調節タンパクあるいはポリペプチドをコードする核酸を含んでいない祖先植物と
    同じように栽培して比較した場合、前記遺伝子導入植物の方が高い熱抵抗性を示
    す。
  82. 【請求項８２】 請求項８１の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
  83. 【請求項８３】 請求項１あるいは１３の遺伝子導入植物であって、細胞壁
    調節タンパクあるいはポリペプチドをコードする核酸を含んでいない祖先植物と
    同じように栽培して比較した場合、前記遺伝子導入植物の方が、セルロースが多
    いことを示す。
  84. 【請求項８４】 請求項８３の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株、
    細胞あるいは種子。
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