【発明の詳細な説明】
記憶増強のための薬剤
発明の背景
「長期増強作用」(long-term potentiation)または「ＬＴＰ」と呼ばれるプロ
セスは、学習および記憶の基礎をなす細胞性メカニズムの主要な候補であると考
えられている。ＬＴＰは、シナプスにおける神経細胞間の正常な伝達を強く増強
し、そして比較的長期間持続する時に起こる。ＬＴＰは、例えば高周波数の電気
的刺激の軽い斉射を求心性神経繊維にかけることにより引き起こすことができる
。
認知障害は、アルツハイマー病、発作、神経疾患および精神遅滞を含む多くの
疾患および症状に関連している。ＬＴＰを強化することにより記憶を増強させ、
そして学習を容易にする薬剤は、これらの症状を持つ個体を処置するために有用
であろう。さらに、この種の薬剤は正常な個体において学習を強化するために価
値があろう。
発明の要約
本明細書では、ブレフラート(Breflate)(1)およびブレフラート同族体を使用
して、哺乳動物の認知機能を増強する新規方法および認知機能不全がある個体を
処置する方法を開示する。また、このような目的に使用することができる新規化
合物を開示する。
本発明の１つの態様は、認知機能不全がある哺乳動物の処置法である。この方
法は、治療的に効果的な用量の構造式（Ｉ）により表される化合物または生理学
的に許容できるそれらの塩を投与することを含んで成る。あるいは、この方法は
治療的に効果的な用量の構造式（II）により表される化合物または生理学的に許
容できるそれらの塩を投与することを含んで成る。
本発明の別の態様は、哺乳動物を対象とした認知機能、例えば記憶および学習
の増強法である。この方法は、記憶増強量の構造式（Ｉ）により表される化合物
または生理学的に許容できるそれらの塩を投与することを含んで成る。あるいは
、この方法は効果的な認知増強量の構造式（II）により表される化合物または生
理学的に許容できるそれらの塩を投与することを含んで成る。
構造式（Ｉ）は、以下により示される：
Ｘ1は、
から成る群から選択され：
Ｘ2は、 から成る群から選択され：
Ｘ3は、低級アルキル基、好ましくはメチルである。
Ｒ1は、
から成る群から選択され：
Ｒ2およびＲ3は独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換された脂肪族基、アリール基
、置換されたアリール基、単糖、NH2-CHR6-CO-、−OH、-O(脂
肪族または置換された脂肪族基)および-O-(アリールまたは置換されたアリール
基)から成る群から選択される。
Ｒ4およびＲ5は独立して、−Ｈ、脂肪族基、芳香族基、置換された脂肪族基お
よび置換された芳香族基から成る群から選択される。
Ｒ6は、アミノ酸の側鎖である。
構造式（II）を以下に示す：
Ｒ11およびＲ12の１つは−Ｈであり、そしてもう一方のＲ11およびＲ12は、塩
基性窒素原子または第４級アンモニウム基を含有する１〜12個の炭素原子を有す
る置換基であり、あるいはそれらの塩である。この置換基はより好ましくは１〜
８個の炭素原子、最も好ましくは１〜４個の炭素原子を有することができる。
好ましくは、Ｒ11およびＲ12の１つは式-COR13の基であり、式中、Ｒ13は１〜
12個の炭素原子、より好ましくは１〜８個の炭素原子、最も好ましくは１〜４個
の炭素原子を含有する脂肪族基；１〜12個の炭素原子、より好ましくは１〜９個
の炭素原子を有するアリール脂肪族基；および４〜６個の炭素原子を含有する複
素環式基から成る群から選択され、このような各基は塩基性窒素原子または第４
級アンモニウム基を含んでいる。アリール脂肪族基は、アリール基がベンゼン環
であることができ、そしてアルキル基が１〜３個の炭素原子を含有するアリール
アルキル基
であることができる。アリール脂肪族基は、化合物のエステル基に付いた脂肪族
部分またはアリール脂肪族基のアリール部分の側鎖に塩基性窒素原子または第４
級アンモニウム基を有することができる。
Ｒ11およびＲ12の１つは、式：の基であることができ、式中、ｎは１〜３の整数であり、そしてＲ14およびＲ15
は独立して、または等しく水素および１〜３個の炭素原子を有するアルキル基か
ら成る群から選択されるか、あるいはＲ14およびＲ15はそれらが結合している窒
素原子と一緒に、飽和もしくは不飽和の４〜６個の炭素原子を有する複素環式環
を形成し、ここで１〜２個の該炭素原子は場合によりヘテロ原子に置き換えるこ
とができる。これらのさらなるヘテロ原子は、Ｎ、ＳおよびＯから選択され得る
。複素環式環が唯一の窒素原子を有するならば、炭素原子の数は４〜６となるだ
ろう。複素環式環が２個のヘテロ原子を有するならば、その１つは窒素であり、
炭素原子の数は３〜５である。７員の複素環式環は２または３個のヘテロ原子を
含むことができる、その１つは窒素であり；２つのヘテロ原子を含むならば、炭
素原子数は５となり、そして３個のヘテロ原子を含むならば、炭素原子数は４と
なるだろう。
好ましくはＲ13は式-CH2N(CH3)2の基またはアミノ酸のカルボキシル基を除去
することにより得られる残基である。例には、グリシン、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、リシンおよびアルギニン
を含む。
１〜２個のヘテロ原子を有する適当な複素環式環は、ピペラジン環、メチルピ
ペラジン環、モルホリン環、メチルモルホリン環、ペルヒドロチアジン環、メチ
ルペルヒドロチアジン環、ピラゾリン環、イソキサゾリン環、オキサゾリン環、
1,2-オキサゾリン環、ペルヒドロピリダジン環、ペルヒドロトリアジン環、ペル
ヒドロオキサジアジン環、ペルヒドロオキサジアジン環、イミダゾリン環、チア
ゾリン環、イソチアゾリン環、1,2,4-オキサジアゾリン環、1,2,5-オキサジアゾ
リン環、1,2,3-トリアゾール、1,2,4-トリアゾール、アゼピン環、ペルヒドロア
ゼピン環、1,2,4-ジアゼピン環、ペルヒドロチアゼピン環、ペルヒドロオキサゼ
ピン環、ならびにペルヒドロチアゼピン環を含む。
本発明のさらに別の態様は、構造式（Ｉ）により表される化合物および生理学
的に許容できるそれらの塩である。Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＲ1〜Ｒ6は、構造式（
Ｉ）に関して上に記載した通りである。
本明細書に開示するブレフラート(１)およびブレフラート同族体は、研究用ラ
ットおよびマウスを対象として低用量でインビボのＬＴＰならびに記憶および学
習を増強することができる。さらに本明細書に開示するブレフラートおよびブレ
フラート同族体は、生理溶液中で高度に可溶性である。すなわちそれらは認知障
害を伴う疾患を処置するための、そしてヒトを含む意識的には正常な哺乳動物の
学習を強化させるための薬剤として有用となるだろう。
図面の簡単な説明
図１は、研究用マウスを対象とした抑制−回避タスクに関する訓練の２時間前
に投与した種々の用量のブレフラートの、秒での潜伏時間により測定した効果を
示すグラフである。
図２は、研究用ラットを対象とした抑制−回避タスクに関する訓練直後に投与
した種々の用量のブレフラートの、秒での潜伏時間により測定した効果を示す、
グラフである。
図３は、抑制−回避タスクに関するトレーニングについて種々の時点で研究用
マウスに投与された体重１kgあたり3.0mgのブレフラートの、秒での潜伏時間に
より測定した効果を示すグラフである。
図４は、試験期間中にマウスが間違えた数により測定するＹ−迷路識別試験に
おいて研究用マウスに投与した時、種々の濃度のブレフラートが学習に及ぼす効
果を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本明細書は、認知機能不全を有する哺乳動物の処置法を開示する。本明細書で
使用する「認知機能不全」とは、例えば記憶の喪失または疾患または症状が発生
する前よりも学習における困難が多いような認知障害をもたらす症状および／ま
たは疾患を称する。認知障害を引き起こす症状および疾患には、アルツハイマー
病、ダウン症、老衰、発作、精神遅滞および他の神経不全を含む。
また本明細書は、例えば哺乳動物の学習および記憶のような認知機能を増強す
る方法を開示する。「認知機能を増強する」とは、例えば認知機能不全のない哺
乳動物（例えば正常な個体）に、処置無しよりもより迅速な学習を、あるいは処
置の結果として処置無しよりも改善された記
憶を持たせることを言う。
「哺乳動物」とは、ヒト、研究用動物（例えば、ラット、マウス、モルモット
等）、農業用動物（例えば、ウマ、ブタ、ウシ等）および家畜（例えばイヌ、ネ
コ等）を含む。
脂肪族基とは、場合により炭化水素鎖中に１つ以上の不飽和単位および／また
は１〜２個のヘテロ原子（例えば硫黄、酸素および窒素）を含んでよい直鎖もし
くは分枝の低級アルキル基（例えばＣ１から約Ｃ８炭化水素）を含む。すなわち
、低級アルケンおよび低級アルキンアルキン（例えば、Ｃ２から約Ｃ８炭化水素
）は、本明細書で使用する「脂肪族基」という用語の意味に含まれる。また「脂
肪族基」という用語は、場合により環中に１個以上の不飽和単位および／または
１〜３個のヘテロ原子を含んでもよいＣ３から約Ｃ８シクロアルキル基を含む。
すなわちオキサゾリジンのような複素環式基は、本明細書で使用する「脂肪族基
」という用語の意味に含まれる。「置換された脂肪族基」は、１個以上の置換基
、例えばアリール基（炭環式アリール基またはヘテロアリール基を含む）、置換
されたアリール基、-O-(脂肪族基またはアリール基)、-O-(置換された脂肪族基
または置換されたアリール基)、アシル、-CHO、-CO-(脂肪族または置換された脂
肪族基)、-CO-(アリールまたは置換アリール)、-COO-(脂肪族または置換された
脂肪族基)、-NH-(アシル)、-O-(アシル)、ベンジル、置換されたベンジル、ハロ
ゲン化低級アルキル（例えばトリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）、フ
ルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ニトロ、−SH、-S-(脂肪族または置
換された脂肪族基)、-S-(アリールまたは置換されたアリール)、-S-(アシル)等
を含むことができる。アシルは、-CO-(脂肪族、置換された脂肪族、
アリールまたは置換されたアリール基)である。
適当な芳香族基（またはアリール基）は、フェニルおよびナフチルのような炭
環式芳香族基、ならびに酸素、窒素または硫黄のような１個以上のヘテロ原子を
含有する単環式または多環式芳香族基のようなヘテロアリール基を含む。適当な
単環式ヘテロアリール基の例には、イミダゾリル、チエニル、ピリジル、フラニ
ル、オキサゾリル、ピロリル、ピリミジニル、フラニル、ピラゾリル、ピロリル
、チアゾリル等を含む。多環式ヘテロアリール基は、キノリニル、イソキノリニ
ル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチオフェニル
、ベンゾフラニルおよびベンゾピラニルのような融合構造を含む。適当な置換基
は、脂肪族基、置換された脂肪族基および脂肪族基について上に記載した置換基
を含む。
本明細書で使用するように、「単糖」は環式ヘミアセタール形のキラルなポリ
ヒドロキシアルデヒド（「アルドース」と呼ぶ）であるか、あるいは環式ヘミケ
タール形のキラルなポリヒドロキシケトン（「ケトース」と呼ぶ）である。適当
なポリヒドロキシアルデヒドの例には、アルドトリオース、アルドテトロース(
例えば、D-およびL-エリトロースおよびトレオース)、アルドペントース（例え
ばD-およびL-アラビノース、キシロース、リボースおよびリキソース）、アルド
ヘキソース（例えばD-およびL-グルコース、アルロース、アルトロース、マンノ
ース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロース）、アルドヘプトース
、アルド−オクトースおよびアルドノノースを含む。ポリヒドロキシアルデヒド
はフラノース形（４個以上の炭素を有するアルドースについて）またはピラノー
ス形（５個以上の炭素原子を有するアルドースについて）
であることができる。
適当なポリヒドロキシケトンには、ペンツロース、ヘキスロース（例えばD-フ
ルクトース、D-ソルボース、D-ピシコースおよびD-タガトース）、ヘプツロース
、オクツロースおよびノヌロースを含む。ポリヒドロキシケトンは、フラノース
形（５個以上の炭素を有するケトースについて）、またはピラノース形（６個以
上の炭素原子を有するケトースについて）であることができる。
Ｒ2またはＲ3が単糖である時、Ｒ2またはＲ3は示した窒素原子と単糖のアノマ
ー炭素との間で１つの共有結合により構造式（Ｉ）中の示した窒素原子に結合し
ている。
適当なアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸を含む。また上記のような側鎖が
脂肪族基、置換された脂肪族基、芳香族基または置換された芳香族基である天然
には存在しないアミノ酸も含む。Ｒ2またはＲ3がアミノ酸である時、Ｒ2または
Ｒ3は示した窒素原子とアミノ酸のＣ−末端との間で１つのアミド結合により構
造式（Ｉ）中の示した窒素原子に結合している。
「治療に効果的な用量」とは、認知障害の哺乳動物に投与した時、哺乳動物に
化合物が存在しない場合よりも向上した認知機能を持つことをもたらす化合物量
である。「効果的な認知増強量」は、認知的な障害がない哺乳動物に投与した時
、哺乳動物に化合物が存在しない場合よりも向上した認知機能を持つことをもた
らす化合物量である。向上した認知機能には、例えば改善された記憶および学習
能力を含む。個々の認知機能は、例えばヒトを対象とした例えばブレスト デメ
ンチア レイティング スケール(Blessed Dementia Rating Scale)の情報−記憶
−集中サブ
テストまたはミニ メンタル ステータス エグザム(Mini Mental Status Exam
)(Corey-Bloomら、Neurology,45:211(1995))の標準法により測定できる。動物の
認知機能は、実施例２−４に記載する抑制回避試験および実施例５に記載するＹ
−迷路試験のような試験により測定できる。治療に効果的な、および効果的な認
知増強用量は、約0.005mg/kg体重〜約５mg/kg体重、好ましくは約0.01mg/kg体重
〜約0.5mg/kg体重の範囲である。
ブレフラートは、Malspeisらにより国際公開第96/00726号明細書に開示された
合成法により製造でき、その全教示内容は引用により本明細書に編入する。ブレ
フラートの同族体は、これらの合成法を適当に変更することにより製造できる。
化合物は経口的に、例えばカプセル、懸濁液または錠剤で投与することができ
る。好ましくは化合物を非経口的に投与する。使用できる非経口的投与様式には
、筋肉内、静脈内、皮下または腹腔注射のような全身投与を含む。
化合物は個体に許容できる医薬キャリアーと組み合わせて投与することができ
る。適当な医薬キャリアーは、化合物と相互反応しない不活性成分を含んでよい
。標準的な製薬技法は、レミングトンズ ファーマシューティカル サイエンス
(Remington's Pharmaceutical Science)、マック出版社(Mack Publishing Compa
ny)、イーストン、ペンシルバニア州に記載されているものを採用できる。非経
口的投与に適する医薬キャリアーは、例えば滅菌水、生理塩溶液、静菌塩溶液(
約0.9mg/ml％のベンジルアルコールを含有する塩溶液)、リン酸緩衝塩溶液、ハ
ンクス溶液、リンゲル−ラクテート等を含む。組成物のカプセル化法（例えば硬
質ゼ
ラチンまたはシクロデキストリン中のような）は、当該技術分野では周知である
（Bakerら、「生物的に活性な薬剤の制御された放出(Controlled Release of Bi
ological Active Agents)」、ジョン ウィリー アンド サンズ、1986）。
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、これはいずれの様式にも限
定することを意図するものではない。
実施例１−インビボでのブレフラートによる長期増強の誘導
横断スライス(500μm)を、４〜８週齢のラットの海馬から切断し、酸素を添加
した30℃の人工の脳脊髄液に沈め、そして連続的に２〜３ml/分で潅流した。興
奮性シナプス後電位は、双極性のタングステン刺激電極を持つシェーファー側副
／交連繊維の刺激により５秒間誘導し、そして細胞外流体の電位は、人工脳脊髄
液を満たしたガラス微電極を用いてブレフラート(0.01〜10μg/ml)を投与前およ
び後にCA1錐体細胞層から記録した。希釈HCl水(１mg/ml)中のブレフラート保存
溶液は、酸素を添加した人工脳脊髄液を用いて希釈し、そして２〜３ml／分で２
〜10分間、海馬スライスに投与した。薬剤の効果を評価するために、スパイク分
布（population spike）の増幅を薬剤投与前および後に監視した。
幾つかのスライスでは、ブレフラートが薬剤投与直後または10〜20分後にCA1
領域中のスパイク分布（PS）の増幅を増加させることが分かった。すべての場合
で、テタヌス（tetanus）はさらに増強を誘導した。
実施例２−ブレフラートを用いた処置によるマウスを対象とした抑制−回避タス
ク試験により測定した学習の増強
試験は、マウスを対象として記憶に及ぼすブレフラートの効果を調査するため
に行った。マウスは抑制-回避タスクの訓練２時間前にブレフ
ラート(0.1〜10mg/kg、i.p.)または塩水注射を与えられた。
個体は、60日齢(23〜28g)のオスのCFWマウス(チャールズリバーラボラトリー
ズ：Charles River Laboratories)であった。マウスは訓練開始前に１週間、研
究室の条件に順化した。動物を６匹づつケージに収容し、そして12時間の明−暗
サイクル(午前７時に点灯)を維持し、餌と水は自由に与えた。実験は午前９時か
ら午後２時の間に行った。
マウスは最初に溝−形の歩行抑制回避装置で訓練された。訓練トライアルでは
、各マウスを暗室からそれていて、暗室への導く戸が空いている明室に置いた。
マウスが戸を通り抜けて暗室へ歩いて行くと、戸が閉まり、そしてフットショッ
ク（0.7mA、60Hz、２秒）が送られた。24時間後の保持試験では、訓練期間のよ
うにマウスを明室に置き、そして歩行潜伏時間(最大300秒)を記録した。
結果は添付の図１に示す。0.1および3.0mg/kg用量の観察された平均保持潜伏
時間は、塩水対照の保持潜伏時間の平均よりも有意に大きく、記憶の増強を示し
ている。この時点では、何故0.3および1.0mg/kg用量での効果が見い出せなかっ
たのかは明らかではない。
実施例３−ブレフラートを用いて処置したラットを対象とした、抑制−回避タス
ク試験により測定した学習の増強
個体は、到着時に180〜200gの50日齢のオスのSprague-Dawleyラット(チャール
ズリバーラボズ)であった。ラットは個別に収容され、いつでも餌および水をい
つでも得ることができ、12時間の明−暗サイクル(午前７時に点灯)を維持し、行
動実験の前１週間、研究室の条件に順化された。実験は午前９時から午後３時の
間に行った。
ラットは、床に引き込むことにより開くスライド式戸により分けられ
た２つの部屋から成る溝−形の抑制−回避（1A）装置で訓練された。出発の部屋
は、試験室中の照明のみを提供するテンソルランプにより照明された。訓練トレ
ーニングについては、ラットを閉じた戸に面している明室に置いた。ラットが反
対方向に向きを変えると、暗室に導く戸が開いた。ラットが戸を通って暗室に進
むと戸が閉まり、フットショク（0.35mA、60Hz、0.7秒）が送られ、そして応答
の潜伏時間を記録した。
次にラットを直ぐに装置から取り出し、そしてブレフラート溶液(0.01、0.1ま
たは1.0mg/kg、i.p.)または塩水をi.p.注射した。保持試験は48時間後に試験し
た。保持試験については、ラットは訓練コースのように明室に置き、そして歩行
潜伏時間(最大500秒)を記録した。
結果は図２に示す。すべての３つの注射した群の薬剤の保持潜伏時間は、対照
よりも高く、記憶の増強を示しているが、この効果は0.01および1.0用量につい
て有意であった。
マウス（図１）およびラット（図２）の両方を対象としてブレフラートを用い
た初期の知見により、薬剤による記憶増強に関して、用量−依存的応答機能は双
峰性であることが示された。両種において、記録の有意な増強は２つの用量レベ
ルで見いだされたが、これらの間のレベルでは見いださなかった。
実施例４−抑制−回避タスク試験により測定した、マウスを対象とした学習に関
する訓練に及ぼすブレフラートの投与時の効果
実施例２および３で記載した抑制−回避試験を使用して、タイムコース実験を
研究用マウスを用いて行った。マウスにブレフラートまたは賦形剤を以下の時点
のいずれかで注射した：訓練２週間前；訓練１週間前；訓練２時間前；訓練直後
；訓練２時間後；または訓練６時間後。保持
時間は48時間後に試験した。結果を図３に示す。ブレフラートは、訓練２時間前
に投与した時に有意に保持時間を増強したが、訓練の１または２週間前に投与し
た時は増強しなかった。結果からこの薬剤が訓練の２週間前に与えられた時は記
憶に影響を及ぼさないことは明らかである。訓練２時間前の群、訓練直後の群お
よび訓練６時間後の群では有意な増強が観察された。しかし、訓練１週間前の薬
剤の増強効果の可能性は、正常な対照の達成度よりも高いことにより不明瞭であ
ったかもしれない。訓練２時間後のこの実験におけるブレフラートの効果が無い
ことについて、同じ説明をすることができる。
実施例５−Ｙ−迷路識別試験により測定した、研究用マウスを対象としたブレフ
ラートによる学習の増強
Ｙ−迷路試験タスク(Y-Maze Discrimination Task:YMD)では、動物は事前にフ
ットショクから逃避できるＹ−迷路の抜け道の選択を繰り返すことにより、フッ
トショックの逃避訓練の記憶を示す（たとえ、保持試験トライアルにおいて抜け
道の入り口でフットショックにより強打されても）。
このＹ−迷路装置は、各々が約１フィート長の３つのアームを具備したルーサ
イトチャンバーから成る。アームの床は、試験動物の脚に0.35mAのショックを送
るように、陽極および陰極末端につながれた１センチメートル未満で別れた２つ
のプレートを有する。Ｙ−迷路は動物が準備学習期間中に２つアームのどちらが
ショックを送ったかを思い出す能力を試験するために使用する。したがって試験
期間中は安全なアームを学習期間中に安全だったアームと逆にする。学習期間か
らの動物の記憶が多いほど、試験期間中により多くの間違えを起こすだろう。そ
の結果、
より高い誤りの割合がタスクの学習を示している。
Ｙ−迷路識別の逆タスクの訓練期間は次の通りであった。動物をスライド式戸
で分けられた各アームを具備する３つのアームのルーサイトＹ−迷路装置に置い
た。左アームは訓練中のように試験中に照明をつけ、一方中央アームおよび右ア
ームは暗いままであった。動物を暗い中央アームに置き（出発アーム）、（Ｙの
起点）；10秒後、フットショク（0.35mA、60Hz）を出発アームおよびすべての３
つのアームの交差点に送ったが、照明されたアームには動物が明るいアームに入
るまで送らなかった。60秒以内に明るいアームに入ることができなかった動物を
取り出し、そして再度出発アームに置いた。照明されたアームに完全に入った動
物は取り上げ、そして出発アームに戻した。訓練トライアルの間隔は40秒であっ
た。訓練の最終段階には、明るいまたは暗いアームの間で選択を与えた時に、マ
ウスが首尾よく明るいアームを連続３回選択する必要がある（基準）。次にすべ
てのマウスは、すべての動物に暗いアーム中で確実にフットショクを受けさせる
ために、マウスが５秒間のフットショクを受ける暗いアームに強制的に入れた。
ブレフラート溶液(３mg/kg体重)または塩水の投与は、訓練直後に与えた。
試験は48時間後に行ったが、安全なアームとして暗いアームを、そして照明し
たアームはフットショクを提供した。トライアル中の間違えの数を記録した。図
４に示すデータのように、訓練直後に投与された3.0mg/kg体重の用量でブレフラ
ートの投与は、統計的に有意な記憶増強を明らかにした。
均等物
当業者は日常的な実験だけで、本明細書に記載した具体的態様の多数
の均等物を認知することができ、あるいは確かめることができる。そのような均
等物は、以下の請求の範囲に包含されるものとする。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Drugs for memory enhancement
Background of the Invention
A professional called “long-term potentiation” or “LTP”
Seth is considered a key candidate for the cellular mechanisms underlying learning and memory.
Has been obtained. LTP strongly enhances normal transmission between nerve cells at synapses
And when it lasts for a relatively long time. LTP is, for example, high frequency electricity
Can be triggered by applying a mild stimulus of voluntary stimulation to afferent nerve fibers
.
Cognitive deficits are a number of symptoms, including Alzheimer's disease, stroke, neurological disorders and mental retardation.
It is associated with diseases and conditions. Enhance memory by strengthening LTP,
And drugs that facilitate learning are useful for treating individuals with these symptoms
Will. In addition, these drugs are valuable for enhancing learning in normal individuals.
There will be value.
Summary of the Invention
In this specification, Breflate (1) and the Breflate congener are used
A novel method of enhancing cognitive function in mammals and individuals with cognitive dysfunction
A method of treating is disclosed. Novelization that can also be used for such purposes
Disclose the compound.
One aspect of the invention is a method of treating a mammal having cognitive dysfunction. This one
The method comprises treating a therapeutically effective dose of a compound represented by structural formula (I)
Administering a chemically acceptable salt thereof. Alternatively, this method
A therapeutically effective dose of a compound represented by structural formula (II) or a physiologically acceptable dose
Administering an acceptable salt thereof.
Another aspect of the invention relates to cognitive functions in mammals, such as memory and learning.
This is an enhancement method. The method comprises providing a memory-enhancing amount of a compound represented by structural formula (I)
Or administering a physiologically acceptable salt thereof. Or
The method comprises the steps of providing an effective cognition-enhancing amount of a compound represented by Structural Formula (II)
Administering a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Structural formula (I) is represented by:
X1Is
Selected from the group consisting of:
XTwoIs Selected from the group consisting of:
XThreeIs a lower alkyl group, preferably methyl.
R1Is
Selected from the group consisting of:
RTwoAnd RThreeIs independently -H, an aliphatic group, a substituted aliphatic group, an aryl group
, Substituted aryl group, monosaccharide, NHTwo-CHR6-CO-, -OH, -O (fat
Aliphatic or substituted aliphatic groups) and -O- (aryl or substituted aryl)
Group).
RFourAnd RFiveIndependently represent -H, an aliphatic group, an aromatic group, a substituted aliphatic group,
And substituted aromatic groups.
R6Is the side chain of an amino acid.
The structural formula (II) is shown below:
R11And R12One is -H and the other R11And R12Is the salt
Has 1 to 12 carbon atoms containing a basic nitrogen atom or a quaternary ammonium group
Or a salt thereof. This substituent is more preferably 1 to
It can have 8 carbon atoms, most preferably 1 to 4 carbon atoms.
Preferably, R11And R12One of the formulas-COR13Wherein R is13Is 1
12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, most preferably 1 to 4
An aliphatic group containing 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 9 carbon atoms
An arylaliphatic group having 4 carbon atoms; and a complex containing 4 to 6 carbon atoms.
Selected from the group consisting of cyclic groups, each such group being a basic nitrogen atom or a quaternary
Contains quaternary ammonium groups. In the aryl aliphatic group, the aryl group is a benzene ring
And wherein the alkyl group contains 1 to 3 carbon atoms
Alkyl group
Can be An aryl aliphatic group is an aliphatic group attached to an ester group of a compound.
A basic nitrogen atom or a quaternary
It can have a quaternary ammonium group.
R11And R12One of the formulas:Wherein n is an integer from 1 to 3;14And RFifteen
Is independently or equally an alkyl group having hydrogen and 1 to 3 carbon atoms
Selected from the group consisting of14And RFifteenAre the
Heterocyclic ring having 4 to 6 carbon atoms, saturated or unsaturated, together with an elementary atom
Wherein one or two of the carbon atoms are optionally replaced with a heteroatom.
Can be. These further heteroatoms may be selected from N, S and O
. If the heterocyclic ring has only one nitrogen atom, the number of carbon atoms will be 4-6
Would. If the heterocyclic ring has two heteroatoms, one of which is nitrogen;
The number of carbon atoms is 3-5. A 7-membered heterocyclic ring has 2 or 3 heteroatoms.
One of which is nitrogen; if it contains two heteroatoms, it may be carbon
The number of elementary atoms will be 5, and if it contains 3 heteroatoms, the number of carbon atoms will be 4
It will be.
Preferably R13Is the formula -CHTwoN (CHThree)TwoRemove carboxyl groups of amino acids or amino acids
This is the residue obtained by Examples include glycine, alanine, leucine,
Isoleucine, valine, phenylalanine, proline, lysine and arginine
including.
Suitable heterocyclic rings having 1-2 heteroatoms are piperazine ring, methylpi
Perazine ring, morpholine ring, methylmorpholine ring, perhydrothiazine ring, methyl
Ruperhydrothiazine ring, pyrazoline ring, isoxazoline ring, oxazoline ring,
1,2-oxazoline ring, perhydropyridazine ring, perhydrotriazine ring, per
Hydrooxadiazine ring, perhydrooxadiazine ring, imidazoline ring, thia
Zoline ring, isothiazoline ring, 1,2,4-oxadiazoline ring, 1,2,5-oxadiazo
Phosphorus ring, 1,2,3-triazole, 1,2,4-triazole, azepine ring, perhydroa
Zepine ring, 1,2,4-diazepine ring, perhydrothiazepine ring, perhydrooxase
Includes pin rings, as well as perhydrothiazepine rings.
Yet another aspect of the present invention relates to compounds represented by structural formula (I) and physiology
And their salts are acceptable. X1, XTwo, XThreeAnd R1~ R6Is the structural formula (
As described above for I).
The bleflate (1) and bleflate homologs disclosed herein are useful in research laboratories.
LTP in vivo at low doses in rats and mice
Learning can be strengthened. In addition, the blephalts and bleaches disclosed herein
Flatoate homologs are highly soluble in physiological solutions. That is, they are cognitive disorders
For treating harmful diseases and in consciously normal mammals, including humans
It will be useful as a drug to enhance learning.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figure 1 shows two hours before training on suppression-avoidance tasks in research mice.
The effect of different doses of bleflate administered on the basis of the latency measured in seconds.
It is a graph shown.
FIG. 2 shows the administration immediately after training on suppression-avoidance tasks in research rats.
Shows the effect of different doses of bleflate as measured by latency in seconds,
It is a graph.
FIG. 3 shows the training at various time points for training on the suppression-avoidance task.
The latency in seconds of 3.0 mg blefrat per kg of body weight administered to mice
4 is a graph showing the effect measured more.
FIG. 4 shows a Y-maze discrimination test in which the number of mice measured during the test is determined by the number
Effects of various concentrations of bleflate on learning when administered to research mice
It is a graph which shows a result.
Detailed description of the invention
Disclosed herein are methods of treating a mammal having cognitive dysfunction. In this specification
As used, "cognitive dysfunction" refers to, for example, loss of memory or the occurrence of a disease or condition.
Symptoms and / or symptoms that lead to cognitive impairment, such as having more difficulty learning before
Or disease. Symptoms and diseases that cause cognitive impairment include Alzheimer's
Includes disease, Down's syndrome, senescence, seizures, mental retardation and other neurological deficits.
Also described herein is enhancing cognitive functions such as, for example, learning and memory in mammals.
A method is disclosed. “Enhancing cognitive function” refers to, for example, a baby without cognitive dysfunction.
Breast animals (eg, normal individuals) learn or process faster than no treatment.
Improved as a result of the placement
Say something to remember.
"Mammal" refers to humans, research animals (eg, rats, mice, guinea pigs)
), Agricultural animals (eg, horses, pigs, cattle, etc.) and livestock (eg, dogs,
C).
An aliphatic group is one or more unsaturated units and / or
Is a linear chain which may contain one or two heteroatoms (eg, sulfur, oxygen and nitrogen)
Or branched lower alkyl groups (eg, C1 to about C8 hydrocarbons). Ie
, Lower alkene and lower alkyne alkynes (eg, C2 to about C8 hydrocarbons)
) Is included in the meaning of the term "aliphatic group" as used herein. "Fat
The term "aliphatic group" refers to one or more unsaturated units and / or
Include C3 to about C8 cycloalkyl groups, which may contain 1-3 heteroatoms.
That is, a heterocyclic group such as oxazolidine is referred to as an “aliphatic group” as used herein.
"Is included in the meaning of the term. "Substituted aliphatic group" refers to one or more substituents
For example, aryl groups (including carbocyclic aryl or heteroaryl groups), substitution
Aryl group, -O- (aliphatic group or aryl group), -O- (substituted aliphatic group
Or substituted aryl group), acyl, -CHO, -CO- (aliphatic or substituted
Aliphatic), -CO- (aryl or substituted aryl), -COO- (aliphatic or substituted)
Aliphatic)), -NH- (acyl), -O- (acyl), benzyl, substituted benzyl, halo
Lower alkyls such as trifluoromethyl and trichloromethyl,
Luoro, chloro, bromo, iodo, cyano, nitro, -SH, -S- (aliphatic or
Substituted aliphatic group), -S- (aryl or substituted aryl), -S- (acyl), etc.
Can be included. Acyl is -CO- (aliphatic, substituted aliphatic,
Aryl or a substituted aryl group).
Suitable aromatic (or aryl) groups include those such as phenyl and naphthyl.
Cyclic aromatic groups and one or more heteroatoms such as oxygen, nitrogen or sulfur
Contains heteroaryl groups such as monocyclic or polycyclic aromatic groups. Appropriate
Examples of monocyclic heteroaryl groups include imidazolyl, thienyl, pyridyl, furanyl
, Oxazolyl, pyrrolyl, pyrimidinyl, furanyl, pyrazolyl, pyrrolyl
, Thiazolyl and the like. Polycyclic heteroaryl groups include quinolinyl, isoquinolini
, Indolyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl, benzothiophenyl
, Benzofuranyl and benzopyranyl. Appropriate substituent
Is an aliphatic group, a substituted aliphatic group, and a substituent described above for an aliphatic group.
including.
As used herein, “monosaccharide” is a cyclic hemiacetal form of a chiral polysaccharide.
Hydroxyaldehyde (called "aldose") or cyclic hemike
It is a chiral polyhydroxyketone in tar form (referred to as "ketose"). suitable
Examples of polyhydroxyaldehydes include aldtriose, aldotetroses (
For example, D- and L-erythrose and threose), aldopentoses (eg,
D- and L-arabinose, xylose, ribose and lyxose), aldo
Hexoses (eg D- and L-glucose, allulose, altrose, manno
, Growth, idose, galactose and talose), aldheptose
, Aldo-octose and aldononose. Polyhydroxyaldehyde
Is the furanose form (for aldoses with 4 or more carbons) or pyranose
Form (for aldoses with 5 or more carbon atoms)
Can be
Suitable polyhydroxyketones include pentulose, hexulose (eg,
Lactose, D-sorbose, D-picicose and D-tagatose), heptulose
, Octulose and nonulose. Polyhydroxyketone is furanose
(For ketoses with 5 or more carbons) or pyranose (for 6 or more carbons)
For ketoses with the above carbon atom).
RTwoOr RThreeIs a monosaccharide, RTwoOr RThreeIndicates the nitrogen atom and monosaccharide anoma
-Bonded to the nitrogen atom shown in structural formula (I) by one covalent bond with carbon
ing.
Suitable amino acids include naturally occurring amino acids. Also, the side chain as above
Natural, which is an aliphatic group, a substituted aliphatic group, an aromatic group or a substituted aromatic group
Also includes amino acids that are not present in. RTwoOr RThreeWhen is an amino acid, RTwoOr
RThreeIs represented by one amide bond between the indicated nitrogen atom and the C-terminus of the amino acid.
It is bonded to the nitrogen atom shown in the formula (I).
A “therapeutically effective dose” refers to a dose that, when administered to a mammal with cognitive impairment,
Amount of compound that results in improved cognitive function compared to absence of compound
It is. "Effective cognitive enhancement" refers to doses administered to mammals without cognitive impairment
Have improved cognitive function compared to the absence of the compound in mammals
The amount of the compound. Improved cognitive functions include, for example, improved memory and learning
Including abilities. Individual cognitive functions, for example,
Information and memory of the Blessed Dementia Rating Scale
-Centralized sub
Test or Mini Mental Status Exam
(Corey-Bloom et al.,Neurology,45: 211 (1995)). Animal's
The cognitive function was determined by the suppression avoidance test described in Examples 2-4 and Y described in Example 5.
-Can be measured by tests such as the maze test. Effective and effective recognition for treatment
The knowledge enhancing dose is about 0.005 mg / kg body weight to about 5 mg / kg body weight, preferably about 0.01 mg / kg body weight.
It ranges from about 0.5 mg / kg body weight.
Breflate was disclosed in WO 96/00726 by Malspeis et al.
It can be prepared by synthetic methods, the entire teachings of which are incorporated herein by reference. Blur
The homologs of the furates can be prepared by appropriately modifying these synthetic methods.
The compounds can be administered orally, for example, in capsules, suspensions or tablets.
You. Preferably, the compounds are administered parenterally. Parenteral modes of administration that can be used include
And systemic administration, such as intramuscular, intravenous, subcutaneous or intraperitoneal injection.
The compound can be administered in combination with an individual acceptable pharmaceutical carrier.
You. Suitable pharmaceutical carriers may include inert ingredients that do not interact with the compound.
. Standard pharmaceutical techniques include Remington's Pharmaceutical Sciences
(Remington's Pharmaceutical Science), Mac Publishing Company
ny), Easton, Pennsylvania. Extra meridian
Pharmaceutical carriers suitable for buccal administration include, for example, sterile water, saline, bacteriostatic salt solutions (
A salt solution containing about 0.9 mg / ml% benzyl alcohol), a phosphate buffered saline solution,
Solution, Ringer-lactate, etc. The method of encapsulating the composition (e.g., hard
Quality
(Such as in latin or cyclodextrin) are well known in the art
(Baker et al., "Controlled Release of Biologically Active Drugs"
biological Active Agents), John Willie and Sands, 1986).
The invention is illustrated by the following examples, which are not limited to either mode.
It is not intended to be specified.
Example 1-Induction of long-term potentiation by bleflate in vivo
Transverse slices (500 μm) are cut from the hippocampus of 4-8 week old rats and oxygenated
Submerged in 30 ° C. artificial cerebrospinal fluid and continuously perfused at 2-3 ml / min. Entertainment
The excitatory post-synaptic potential is determined by a Schaffer collateral with a bipolar tungsten stimulation electrode.
Induced by stimulation of commissure fibers for 5 seconds, and the potential of extracellular fluid
Bleflate (0.01 to 10 μg / ml) before and after administration using a glass microelectrode filled with liquid.
Afterwards, it was recorded from the CA1 pyramidal cell layer. Bleflate storage in diluted HCl water (1mg / ml)
The solution is diluted with oxygenated cerebrospinal fluid and added at 2-3 ml / min.
Administered to hippocampal slices for ~ 10 minutes. To assess the effect of the drug,
The amplification of the population spike was monitored before and after drug administration.
In some slices, Bleflate is treated with CA1 immediately after drug administration or 10-20 minutes later.
It was found to increase the spike distribution (PS) amplification in the region. In all cases
Thus, tetanus induced further enhancement.
Example 2-Suppression-avoidance tasks in mice by treatment with bleflate
Learning as measured by the
The study was designed to investigate the effects of bleflate on memory in mice
I went to. Mice bluff 2 hours before training for suppression-avoidance tasks
Rats (0.1-10 mg / kg, i.p.) or saline injections were given.
Individuals were 60 day old (23-28 g) male CFW mice (Charles River Laboratory)
: Charles River Laboratories). Mice are allowed to study for one week prior to training.
Adapted to the requirements of the ultimate room. Animals are housed in cages of 6 each, and 12 hours light-dark
The cycle (lights on at 7 am) was maintained and food and water were provided ad libitum. The experiment is 9 am
We went between 2pm.
Mice were initially trained on a ditch-shaped gait inhibitor. In the training trial
Each mouse was deviated from the dark room and placed in a light room with open doors leading to the dark room.
As the mouse walks through the door and walks into the darkroom, the door closes, and the foot
(0.7 mA, 60 Hz, 2 seconds) was sent. In the retention test after 24 hours,
The mice were placed in the light room and the walking latency (up to 300 seconds) was recorded.
The results are shown in the attached FIG. Observed mean retention latency at 0.1 and 3.0 mg / kg dose
Time was significantly greater than the mean retention latency of the saline control, indicating enhanced memory.
ing. At this point why no effect at 0.3 and 1.0 mg / kg dose was found
It is not clear whether he is.
Example 3-Inhibition-avoidance tasks in rats treated with bleflate
Learning as measured by the
Individuals are 180-200 g of 50-day-old male Sprague-Dawley rats (Charle
Zriver Labs). Rats are individually housed and have food and water available at all times.
And maintain a 12-hour light-dark cycle (lit at 7 AM)
One week prior to the motion experiment, they were acclimated to laboratory conditions. The experiment was from 9 am to 3 pm
I went in between.
Rats are separated by a sliding door that opens by pulling into the floor
Trained on a two-chamber gutter-shaped restraint-avoidance (1A) device. Departure room
Was illuminated by a tensor lamp providing only illumination in the test room. Training tray
For training, the rats were placed in the light room facing the closed door. Rat is anti
Turning to the opposite direction opened the door leading to the darkroom. Rat goes through door to darkroom
When the door closes, a foot shock (0.35 mA, 60 Hz, 0.7 seconds) is sent, and a response
The incubation time was recorded.
The rat is then immediately removed from the device and the blephalate solution (0.01, 0.1 or
Or 1.0 mg / kg i.p.) or saline was injected i.p. The retention test is performed after 48 hours.
Was. For the retention test, rats were placed in a light room as on a training course and walked.
The incubation time (up to 500 seconds) was recorded.
The results are shown in FIG. Drug retention latencies of all three injected groups were
Higher than that, indicating an increase in memory, but the effect was lower for the 0.01 and 1.0 doses.
Was significant.
Using Bleflate for both mice (Figure 1) and rats (Figure 2)
Early findings suggest that a dose-dependent response function is
It was shown to be ridged. In both species, the significant enhancement of the record was at two dose levels.
But found at a level in between.
Example 4 Suppression-Evasion Task Test
Of Bleflate Administration on Exercise Training
Using the suppress-avoidance test described in Examples 2 and 3, a time course experiment was performed.
This was performed using a research mouse. Bleflate or excipients into mice at the following times
2 weeks before training; 1 week before training; 2 hours before training; immediately after training
2 hours after training; or 6 hours after training. Retention
The time was tested after 48 hours. The results are shown in FIG. Brehrath 2 hours before training
Administration significantly increased retention time, but was administered one or two weeks prior to training.
Did not increase. The results indicate that this drug was given two weeks before training.
Clearly, it has no effect on memory. Group 2 hours before training, group immediately after training
Significant enhancement was observed in the group and 6 hours after training. However, the medicine one week before training
The potential for a potentiating effect of the agent is unclear due to higher than normal control achievement.
May have been. No effect of breflat in this experiment 2 hours after training
The same can be said about the matter.
Example 5-Breff for Research Mice Measured by Y-Maze Discrimination Test
Enhance learning with Rad
In the Y-Maze Discrimination Task (YMD), animals are pre-
By repeatedly selecting a Y-maze escape route that can escape from
Shows the memory of the shock shock training (e.g.,
(Even if you are hit by a foot shock at the entrance of the road).
This Y-maze device is a luster with three arms, each approximately one foot long.
Consists of a light chamber. Arm floor delivers 0.35 mA shock to test animal legs
Two separated by less than 1 cm, connected to the anode and cathode ends
Plate. In the Y-maze, the animal has one of two arms during the preparatory learning period
Use to test your ability to remember if you sent a shock. Test
Reverse the safe arm during the study period with the arm that was safe during the study period. Study period
The more memory these animals have, the more errors will be made during the test. So
As a result,
A higher error rate indicates task learning.
The training period for the reverse task of Y-maze identification was as follows. Animal sliding door
Placed in a three-arm Lucite Y-maze device with each arm separated by
Was. The left arm is illuminated during the test as during training, while the center arm and right arm
Team remained dark. Place the animal on the dark central arm (starting arm), (Y
Start); 10 seconds later, foot shock (0.35 mA, 60 Hz) with starting arm and all 3
Sent to the intersection of two arms, but the illuminated arm has animals in the bright arm
Did not send until Animals that could not enter the bright arm within 60 seconds
Removed and placed again in the starting arm. Movement completely in the illuminated arm
The thing was picked up and returned to the starting arm. The training trial interval was 40 seconds.
Was. The final stage of training is when you have a choice between bright or dark arms,
The mouse must successfully select the bright arm three consecutive times (reference). Then everything
Mice ensure that all animals are foot shocked in the dark arm
To do so, mice were forced into a dark arm that received a 5 second foot shock.
Administration of bleflate solution (3 mg / kg body weight) or saline was given immediately after training.
The test was performed after 48 hours, but with the dark arm as the safe arm, and illuminated.
The arm provided a foot shock. The number of mistakes made during the trial was recorded. Figure
As shown in the data shown in Fig. 4, Brefra was administered at a dose of 3.0 mg / kg body weight administered immediately after training.
Administration of the salt revealed a statistically significant memory enhancement.
Equivalent
Those skilled in the art will recognize, using only routine experimentation, many of the specific embodiments described herein.
Can be recognized or ascertained. Such a uniform
Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】平成１１年２月２３日（１９９９．２．２３）
【補正内容】
Ｘ2は、
から成る群から選択され：
Ｘ3は、Ｃ１〜Ｃ８炭化水素であり；
Ｒ1は、
から成る群から選択され：
Ｒ2およびＲ3は独立して、−Ｈ、脂肪族基、から成る群から選択され：
Ｘ3は、Ｃ１〜Ｃ８炭化水素であり；
Ｒ1は、
から成る群から選択され：
Ｒ2およびＲ3は独立して、−Ｈ、脂肪族基、
Ｘ1は、から成る群から選択され：
Ｘ2は、
から成る群から選択され：
Ｘ3は、Ｃ１〜Ｃ８炭化水素であり；
Ｒ1は、[Procedure amendment] Patent Law # 184 Article 8 paragraph 1 of [the filing date] 1999 February 23 (1999.2.23) [correction contents] X 2 is, X 3 is a C1-C8 hydrocarbon; R 1 is selected from the group consisting of: Selected from the group consisting of: R 2 and R 3 are independently -H, an aliphatic group, X 3 is a C1-C8 hydrocarbon; R 1 is selected from the group consisting of: Is selected from the group consisting of: R 2 and R 3 are independently -H, an aliphatic group, X 1 is Selected from the group consisting of: X 2 is X 3 is a C1-C8 hydrocarbon; R 1 is selected from the group consisting of:
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ
，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ
Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ
，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ
，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ，ＹＵ，ＺＷ────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, M
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, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM
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CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, E
S, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID
, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ,
LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, M
G, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT
, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL,
TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, V
N, YU, ZW