JP2001510342A

JP2001510342A - New microorganism

Info

Publication number: JP2001510342A
Application number: JP53395898A
Authority: JP
Inventors: マークウエルズジェレミー; ウイリアムファラルページリチャード; フランソワガイギルバートクリストフ
Original assignee: マイクロビアルテクニクスリミティッド
Priority date: 1997-01-17
Filing date: 1998-01-19
Publication date: 2001-07-31
Also published as: GB9700939D0; WO1998031786A2; AU5671998A; WO1998031786A3; EP0973864A1; ZA98387B

Abstract

(57)【要約】病原性細菌由来の多糖類免疫原の生産に責任のある一つ以上の酵素をコードするＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトされている新規な非侵襲性又は非病原性グラム陽性微生物が提供される。このような微生物を含んで成るワクチン及び治療におけるその使用も提供され、同様に、適当なＤＮＡ構築物及びベクターも提供される。 (57) [Summary] Novel non-invasive or non-pathogenic Gram-positive microorganisms that have been transformed or transfected with DNA encoding one or more enzymes responsible for the production of polysaccharide immunogens from pathogenic bacteria are provided. Vaccines comprising such microorganisms and their use in therapy are also provided, as are suitable DNA constructs and vectors.

Description

【発明の詳細な説明】新規微生物本発明は免疫原性炭水化物莢膜の生産をコードするＤＮＡで形質転換された新規な非侵襲性又は非病原性のグラム陽性細菌宿主微生物、特にラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）微生物に関する。このような細菌宿主微生物を含む組成物並びにワクチンにおけるその使用も提供される。一つの重要な病原性微生物は、普通肺炎球菌と呼ばれるストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）である。発展途上国及び先進国におけるヒトの病気との関連でストレプトコッカス・ニューモニエ感染の継続的重要性が権威ある総説により最近指摘された（１）。これは、地球規模で、この微生物が急性呼吸器感染の最も普通にみられる原因細菌であると信じられ、そしてほとんどは発展途上国であるが、その結果毎年１００万人の子供が死亡すると推定されていると指摘している（２）。アメリカ合衆国では、肺炎球菌はなお細菌性肺炎の最も普通の原因であり、そして病気の割合は若年の子供達、高齢者、そして無脾症、心臓、肺臓及び腎臓疾患、糖尿病、アルコール中毒症などの罹患し易い状態を持つ患者、又は免疫抑制疾患、特にエイズを患う患者で特に高いことが示唆されている（３）。これらのグループは肺炎球菌敗血症、従って髄膜炎のリスクが高くなり、従って肺炎球菌感染による死亡のリスクが大きくなる。肺炎球菌は、先進国の子供達の支配的な感染であり続け、そしてかなりの出費を招いている中耳炎や副鼻腔炎の主要な原因でもある。肺炎球菌感染に対する有効な予防戦略の必要性がペニシリン耐性肺炎球菌の最近の出現により注目を浴びている。米国の１２の州の１３の病院における肺炎球菌単離菌の６．６％がペニシリンに耐性であることが見出され、そして単離菌の一部は第３世代のシクロスポリンを含む他の抗生物質にも耐性であると最近報告された（４）。ペニシリン耐性の割合は一部の病院ではもっと高くなる（２０％まで）（５）。肺炎球菌の中でのペニシリン耐性の出現はペニシリンが有効な治療であった数十年の後に最近そして突然にやって来たので、これらの発見は警鐘と考えられる。従って、上記の理由で、肺炎球菌疾病の予防、制御、診断又は治療の諸手段の改善を検討することについては説得力のある根拠がある。全世界的な子供ワクチン接種プログラムに組み込まれうるであろう肺炎球菌ワクチンの開発に努力するとき、二つの主要な問題に遭遇することが良く知られている。これらは、（ａ）肺炎球菌の抗原的多様性、少なくとも８４種の免疫学的に異なる血清型が知られており、そのそれぞれがワクチンとして使用されるときそれ自身の血清型に対してのみ保護を誘発することができるだけであること、そして（ｂ）ワクチンとして精製し使用するとき、莢膜多糖類（そのそれぞれが血清型を決定し、そして主要な保護抗原である）が、侵襲性肺炎球菌感染及び髄膜炎の最高の発症率を示す年代グループである２歳未満の子供達では信頼できる程には保護的な抗体応答を誘発しないという事実（６）である。これらの問題は莢膜抗原（例えば、グループＢストレプトコッカス、ヘモフィルス・インフルエンゼ及びナイセリア・メニンゴコッカス）に基づく他のワクチン戦略にも当てはまる。ただし、これらの種内では、莢膜の型不均質性の程度は、より限定的であるようにみえる。肺炎球菌感染の予防に関して米国で行われている現在の戦略は、最も普通の肺炎球菌血清型の中の２３種由来の莢膜多糖類抗原を含むワクチンを製剤化することである。これらの株を合わせると、米国及び欧州の子供達由来の侵襲的肺炎球菌単離菌のほぼ９０％を、そしてアジアにおける肺炎球菌感染の７０％未満を占める（７、８）。実用的には、本質的に様々な異種の莢膜を製造し、その品質をコントロールし、そして適当な量で混合せねばならないので、これらのワクチンを製造する費用は高くつく。本発明は保護的免疫原をもっと単純な細菌醗酵（病原性の細菌であるストレプトコッカス・ニューモニエそれ自体ではなく、ラクトコッカス・ラクティスなどの非病原性細菌の生育を含む）で生産することができる手段を提供する。本発明は二つ以上の多糖類免疫原が同一細菌により生産され、それによって製造し、品質を管理し、そして混合せねばならない異種の免疫原の数を減少させる手段をも提供する。驚くべきことに、本発明者らは、病原性細菌の莢膜の合成に責任のある酵素をコードするオペロンの全部又は一部を含むＤＮＡを用いて、非侵襲性又は非病原性のグラム陽性細菌宿主微生物を形質転換又はトランスフェクトすると、病原性微生物の周囲に正常に見出される多糖類莢膜と免疫学的にそして構造的に同一の多糖類莢膜を持つ宿主微生物を生ずることを発見した。全オペロンを使用したときでさえもこの莢膜の正確な発現、分泌及び組立が生ずることは、これらのプロセスに伴う複雑さそしていわゆる「管理維持」遺伝子と呼ばれるもの、例えばこのオペロンそれ自体の一部を形成するものではないがこの病原性微生物由来の多糖類の移送に関与する遺伝子など、の関与の可能性を考慮すると、驚くべきことである。ラクトコッカス・ラクティスなどの非病原性グラム陽性細菌中で病原性細菌由来の多糖類免疫原の発現及び／又は産生に関する記録は科学的文献には存在しない。従って、本発明はラクトコッカス・ラクティスなどの非病原性グラム陽性微生物中で病原性細菌由来の多糖類免疫原の発現及び生産を達成する実用的方法を初めて開示するものである。さらに、本発明はこのような微生物の多糖類発現株により多糖類莢膜への免疫応答が引き出され得ることを開示する。本発明が多くの異なる種類の用途に用いることが可能であることを熟練者は認めるであろうが、抗莢膜に基づくワクチンそして殊に肺炎球菌用ワクチンの分野に対するその貢献は特に重要である。本発明によって開かれた別の重要な可能性は、免疫原性多糖類莢膜に対する、粘膜経由、例えば経鼻又は経口で送達できる、ワクチンの提供である。こうして、第１の側面で本発明は病原性細菌由来の多糖類免疫原の生産に責任のある一つ以上の酵素をコードするＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトされた非侵襲性又は非病原性のグラム陽性細菌を提供する。使用することができるグラム陽性細菌の例としては、リステリア・イノキュア (Listeria innocua)、スタフィロコッカス・キシローサス（Staphylococcus xyl osus）、スタフィロコッカス・カルノーサス(Staphylococcus carnosus)、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）、ラクトコッカス・スピーシーズ(Lactococcus species)又はラクトバシラス・スピーシーズ(Lactobac illus species)が挙げられる。本発明の一つの好ましい態様はラクトコッカス・ラクティスを使用するものである。また、本発明はグラム陽性病原性細菌の弱毒株、例えば、リステリア、例えば、リステリア・モノサイトトゲネス（Listeria monocytogenes）のワクチン株を利用することができる。好ましい態様では、多糖類免疫原は多糖類莢膜を形成する。このような莢膜の一つの実例はストレプトコッカス・ニューモニエ由来のものである。好ましい莢膜血清型の選択は場所等によって決定されると理解されよう。こうして、一般に、上記の２３個の最も普通の多糖類血清型の一つ以上を発現させたいと望むことになる。しかしながら、このグループ内でさえ、ある領域の許容可能なレベルの保護を達成するために、より少ない数の発現を提供する必要があるにすぎない。本発明は、おそらく、発現される莢膜多糖類の「ライブラリー」を構築し、ついで特定領域又は特定集団において最も普通の血清型用に特注されたワクチンを生産させるためそれを適当に混合することにより、エス．ニューモニエ由来の８４種の莢膜血清型の他のものを発現させるためにも勿論使用することができる。本明細書に記載した実施例はエス．ニューモニエ由来の多糖類免疫原を生産し及び／又は送達するためのエル．ラクティスの使用に関するけれども、本発明はいかなる病原性細菌由来の天然又は組換え多糖類免疫原の生産及び／又は送達にも適用することができる。これらの多糖類免疫原は、例えば、グループＢストレプトコッカス由来の多糖類免疫原、動物やヒトに病気を惹起する他の種のストレプトコッカス由来の多糖類免疫原、莢膜に包まれたスタフィロコッカス及び他のグラム陽性病原体由来の多糖類免疫原、又はたとえそれがグラム陽性であろうとグラム陰性であろうと（イー．コリ、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophi lus influenzae）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis ）の侵襲性莢膜化株など）、その多糖類莢膜生合成遺伝子がエル．ラクティスなどの微生物中で発現することができる如何なる他の微生物由来の多糖類免疫原などであってもよく、無害な宿主中で実用的に発現させることができるものである。グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ）の莢膜多糖類はエル．ラクティスなどの無害な微生物を用いて生産及び／又は送達されうる莢膜の例である。ヒトの疾病と関連するＧＢＳは一般に莢膜を有し、９種の血清学的に異なる莢膜多糖類の中の一つを含んでいる。小さな例外はあるが、これらの多糖類はグルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸又はシアル酸を含んでいる。単糖類の反復ユニット中への具体的配置が各莢膜の免疫学的特異性を決定する。タイプIII ＧＢＳオペロンの染色体領域の地図が作成され、ＤＮＡプローブを用いるサザン・ハイブリダイゼーション研究により、テストした血清型の中ではその全体領域が高度に保存されていることが明らかにされた（９、１０）。さらに、この領域の両側の遺伝子の配列は多糖類の合成に関与する酵素群をコードする他の細菌の遺伝子と著しい相同性を共有することが発見された。グループＢストレプトコッカスの莢膜生合成オペロンの両側には、こうしてｃｐｓＦ及びｃｐｓＥ（それぞれ、ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼ及びアセチルトランスフェラーゼをコードすると考えられる）と命名された遺伝子が一方の端に、そしてこのｃｐｓサブユニットの合成及び移送／重合に関与すると考えられる遺伝子が他方の端に位置するようにみえる。従って、他のオペロンの生合成遺伝子はタイプIII ｃｐｓオペロン中で同定された保存された遺伝子の公表された配列に基づくプライマーを用いてＰＣＲ増幅により容易に得ることができる。ＧＢＳｃｐｓ生合成遺伝子が容易に得ることができるとなれば、例えば、これらの酵素の不可欠な組合せを発現させそしてＧＢＳ莢膜多糖類を生産するエル．ラクティスの株を構築することが可能となりうる。宿主微生物を形質転換又はトランスフェクトするために使用するＤＮＡは多糖類莢膜の合成に必要な酵素類をコードするオペロンの全部か又は一部を含むことができる。本質的な要件は、もちろん、外因性ＤＮＡによりコードされる酵素が宿主微生物中に存在する一つ以上の酵素と一緒になって莢膜のための完全な合成経路を提供することである。以下に例示する一つの態様では、本発明者らは肺炎球菌タイプ３ｃｐｓ生合成オペロン由来のＤＮＡ断片をエル．ラクティス中のプラスミドベクター上にクローニングすることができることを示す。さらに、エル．ラクティスを肺炎球菌生合成オペロンの断片を保持するプラスミドで形質転換すると、エル．ラクティス中で多糖類莢膜の生産が起こり、そしてこの多糖類莢膜は肺炎球菌中で生産される莢膜に抗原的にそして構造的に同一である。下記の実施例１では、エル．ラクティスで発現されるこの莢膜遺伝子がそれ自身のプロモーターと翻訳シグナルを保持している。しかしながら、熟練者は他のプラスミド、プロモーター及び／又は翻訳シグナル、例えば宿主微生物由来のものを用いて本発明を実施することが可能であることを認めるであろう。実際、最近文献（１１、１２）に記載された構成的又は誘導的ラクトコッカスプロモーターを使用することにより、莢膜合成のレベルを変化させ、そしてエル．ラクティスにより生産される莢膜のレベルを高めることができる可能性がある。同様な結果がこのような「注文仕立ての」プロモーター等を用いて他の微生物でも得ることができるはずである。さらに、高レベルの多糖類発現がウエルズら（１３及びＧＢ−Ｂ−２２７８３５８号）により開発された誘導可能なＴ７発現システムを用いエル．ラクティスで達成することができるであろうことが予想されるであろう。二つ以上の異種莢膜多糖類の合成に必要な遺伝子を保持する細菌の株を構築することによるか（異種のｃｐｓオペロンが染色体の異なる遺伝子座に組み込まれたときは肺炎球菌中で可能であることが示された（１４））、又は二つ以上の血清型由来の保護的エピトープが同一多糖類内に存在するような組換え多糖類を生産する、例えばエル．ラクティスの株を構築することにより、ラクトコッカス・ラクティスなどのグラム陽性細菌で二つ以上の抗原を同時に生産することができるであろう。二つ以上の異種莢膜エピトープを含むように莢膜多糖類を工学処理することは、病原性細菌由来の莢膜生合成酵素類の不可欠な組合せを発現する例えばエル．ラクティスの株を構築することにより可能となりうる。肺炎球菌多糖類抗原などの多糖類抗原を生産するために、エル．ラクティスなどの非病原性ＧＲＡＳ微生物を使用することは、ワクチンとして多糖類を生産しそして製剤化する費用を大きく減少させる手段を提供する。エル．ラクティスの高生産株は多糖類（この多糖類はついで精製しそして選ばれた担体タンパク質に結合させられる）を生産するために使用することができるし、あるいは多糖類を生産するエル．ラクティスの細胞はワクチンとして直接使用することもできよう。こうして、第２の側面で、本発明は病原性細菌の多糖類免疫原を生産する方法であって、その多糖類免疫原の生産に責任のある一つ以上の酵素をコードするＤＮＡを用いて非侵襲性又は非病原性のグラム陽性細菌を形質転換する工程及び／又はその細菌を培養する工程を含む方法を提供する。上に論じたように、本発明のグラム陽性細菌は多糖類免疫原を送達するのに使用することができよう。こうして、第３の側面では本発明は医薬における使用のために本発明の微生物を提供する。特に、本発明は莢膜多糖類抗原に対するワクチンを提供する一つの代替手段を提供する。こうして、第４の側面では、本発明は本発明の非侵襲性又は非病原性グラム陽性細菌を含むワクチンを提供する。このようなワクチンは、多糖類を発現する微生物、例えばエル．ラクティスの生きた調製物か又は殺菌された調製物を含むことができよう。特に、粘膜経路を経て投与されるのに適するワクチンが提供される。このような粘膜経路の例としては、鼻、口、経気管支組織、眼、耳、直腸、膣、尿道、又は舌下が挙げられる。粘膜経路としては経鼻及び経口が特に好ましい。本発明のワクチンはヒトに使用するために特に提供される。もっとも、このようなワクチンは動物へのワクチン接種プログラムに使用するために製剤化することもできるであろう。本発明の微生物を製剤化するときは、熟練者はある範囲の遅延放出、時間を定めた放出、又は適当に保護された製剤、例えばワクチンがそれが最も有効となるような部位、例えばパイアー斑に送達されることを確保するための腸溶被覆カプセルを勿論利用することができる。さらに、本発明のワクチンは従来からのアジュバントを含んでもよい。このようなワクチンは粘膜経路の免疫処置を利用するであろう。そして発現された多糖類（単数又は複数）に対する粘膜の免疫応答及び全身的免疫応答の両方を引き出すことが予想されるであろう。エル．ラクティスなどのグラム陽性微生物はタンパク質抗原に対する有効な送達ビークルとして使用することもできることが示された（国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２５８０）。これらの研究では、抗原である破傷風毒素断片Ｃを発現する組換え体エル．ラクティスを用いてマウスを経口及び経鼻で免疫処置したところ、発現した抗原に対する高い保護レベルの血清抗体応答が誘導された。従って、第５の側面で、本発明は多糖類莢膜を有する病原性細菌に対するワクチンを主体に接種する方法であって、本発明のグラム陽性細菌の有効量を主体に投与する工程を含む方法を提供する。さらなる側面では、本発明は多糖類莢膜を有する病原性細菌に対する粘膜免疫を誘導する方法であって、本発明のグラム陽性細菌の有効量を主体に投与する工程を含む方法を提供する。粘膜経路の免疫処置の主要な利点の一つは、それが粘膜免疫システムを刺激する能力を有し、こうして身体の粘膜表面で抗原特異的抗体の分泌を誘発することである。粘膜表面のコロニー形成は莢膜を有する細菌（例えば、肺炎球菌、ヘモフィルス・インフルエンゼ、ナイセリア・メニンジティディス及びグループＢストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae））を含め多くの病原体による感染の前提条件であるから、粘膜表面に抗莢膜抗体を誘発するワクチンは感染予防に、そして集団でのこの微生物の無症候の移送の予防にもより有効であるかも知れない。他の側面では、本発明は下記のものを提供する、 i）病原性細菌由来の多糖類免疫原の生産に責任のある一つ以上の酵素をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、 ii） i）で規定された構築物を含むベクター、例えば、プラスミドベクター、 iii）非侵襲性又は非病原性グラム陽性細菌の形質転換又はトランスフェクションにおけるi）で規定された構築物の使用、そして iv）多糖類莢膜を有する病原性細菌に対するワクチンの調製における本発明の細菌の使用。本発明の各側面の好ましい性質は必要な変更を加えて他の側面のそれぞれにも同様に適用可能である。本発明は下記の実施例によりここに記述されるが、これらの実施例は如何なる意味でも制限として理解すべきでない。これらの実施例は下記の図面を参照する。図１はタイプ３莢膜多糖類合成に関与する酵素をコードする領域のＤＮＡ配列上のプライマーＳ１、Ａ１及びＡ２の位置を示す（ゲンバンク、受託番号Ｕ１５１７１（１９）。図２はｐＴＲＥＰにおけるｐＴＲＥＰカセットの配列及び不可欠な性質を示す。図３はストレプトコッカス・ニューモニエにおけるタイプ３莢膜多糖類（ｃｐｓ）の生合成経路を示す。グルコース−６−リン酸をエス．ニューモニエで見出されたタイプ３莢膜多糖類構造に変換するには４個の酵素が必要である。莢膜の移送及び結合のためには、さらなる機能が必要である。図４はエス．ニューモニエ中のタイプ３ｃｐｓ遺伝子座の遺伝的構成を示す。二つのプロモーターが存在する（Ｐと示す）。一方のプロモーターはｃｐｓ３Ｄ遺伝子及びｃｐｓ３Ｓ遺伝子を複製し、そして他方はｃｐｓ３Ｕ遺伝子及びｃｐｓ３Ｍ遺伝子を複製する。ＤＮＡ断片ＣＰＳ１及びＣＰＳ２は、鋳型としてタイプ３肺炎球菌染色体ＤＮＡを用い、そしてプライマーＳ１をプライマーＡ２及びプライマーＡ３とそれぞれ組み合わせて用いるＰＣＲにより作成した。これらのプライマーはｐＴＲＥＰ中にこの断片をクローニングし易いようにその５’末端にＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計した。図５は、プラスミドｐＴＲＥＰ、ｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ１及びｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ２の図式的表示を示す。ＭＬＳはマクロライド、リンコスアミド及びストレプトグラミンＢ耐性決定因子を表し、Ｔは下流のターミネーターを表す。不可欠な制限部位の位置が示してあり、クローニングされた肺炎球菌のＤＮＡ断片であるＣＰＳ１及びＣＰＳ２（上記の図１Ｂ）は太い線で示してある。図６は、実施例に記述されたようなタイプ３特異的抗血清を用いる、エル．ラクティスによるタイプ３ｃｐｓ生産の免疫検出を示す。（１）ｐＴＲＥＰを含むエル．ラクティスの非発現株、（２）エル．ラクティスのｃｐｓ発現株ＵＣＰ１６１９、及び（３）エル．ラクティスのｃｐｓ発現株ＵＣＰ１６１８。図７は、（１）ラクトコッカス・ラクティスの発現株ＵＣＰ１６１９及び（２）タイプ３ストレプトコッカス・ニューモニエの精製された多糖類の類似のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。４個の水素ピーク（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）の積分は莢膜多糖類の二つの試料について類似の割合を与えた（１では、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ＝１０．２：２８．３：５３．８：７．７であり、２では、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ＝１３．８：３１．１：４６．２：８．９である）。これらの結果はエル．ラクティスにより生産されるｃｐｓの構造はタイプ３エス．ニューモニエで天然に生ずるものと同じであるという証拠となる。図８は、タイプ３ｃｐｓを発現するエル．ラクティスの組換え体株で免疫処置したマウスにおける抗タイプ３ｃｐｓ−ＩｇＧ血清抗体応答を示す。免疫処置後２１日目と３５日目におけるｃｐｓ特異的抗体の平均タイターは未処置群マウスよりも有意に（ｐ＝０．００４）高かった。誤差のバーは平均値からの標準偏差を表す。これらの結果はｃｐｓを発現するエル．ラクティスでの免疫処置がマウスで特異的な抗ｃｐｓ血清抗体応答を誘発することを示す。図９は、（１）タイプ３エス．ニューモニエ（３３５Ｋで６０時間）及び（２）エル．ラクティス株１６１９（３２０Ｋで４４時間）由来の精製ｃｐｓの¹³ＣＮＭＲスペクトルを示す。両スペクトル共６００Ｍｈｚ装置で得られた。両スペクトルで、炭素ピークの位置は同一である。図１０は、生きたエス．ニューモニエでチャレンジした後４時間目における、実施例６に記述したようにエル．ラクティス１６１９で免疫処置したマウス又は対照マウスからのＢＡＬ中に存在するエス．ニューモニエの、チャレンジした接種物に対する％を示す。図１１は、生きたエス．ニューモニエでチャレンジした後４時間目における、実施例６に記述したようにエル．ラクティス１６１９で免疫処置したマウス又は対照マウスからのＢＡＬ中のエス．ニューモニエの細菌回収を示す。図１２は、ａ）長いＤＮＡ断片を合成するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーであって、グループＢストレプトコッカスの９種の血清型全てからの莢膜生合成遺伝子を含むプライマー、及びｂ）ＧＢＳの６種の異なる血清型から得られたＰＣＲ産物の制限エンドヌクレアーゼ消化物を示す。実施例１エス．ニューモニエのタイプ３ｃｐｓ生合成経路酵素のエル．ラクティスでのクローニング及び発現ｉ）生合成経路酵素をコードするＤＮＡ断片の調製タイプ３多糖類莢膜を生産するストレプトコッカス・ニューモニエ株ＷＵ２のゲノムＤＮＡを、グルコースを含むＢＴＳ培地（ディフコ）で生育させた細胞から標準的方法により調製した。この細菌はジュアン遠心分離機（モデルＣＲ３１２）中３０００ｇで１０分間の遠心分離により生育培地から回収し、そして１００μｌのＤＮＡプレプ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５％ｗ／ｖスクロース）中に再懸濁し、これに１０μｌの１０％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びプロテイナーゼＫ（シグマ）の２０ｍｇ／ｍｌ溶液０．６μｌを添加した。この溶液を３７℃で一晩インキュベートし、ついでＤＮＡをクロロホルム、フェノール及びイソアミルアルコール（ＩＡＡ）（２４：２４：２）の混合液で２回そしてクロロホルム：ＩＡＡ（９８：２）で２回抽出した。３Ｍ酢酸ナトリウム０．１倍容と絶対エタノール２倍容を添加することによりこのゲノムＤＮＡを２０分間−７０℃で沈澱させた。ＤＮＡのペレットを遠心分離により回収し、１００μｌのＴＥ（トリス−塩酸ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）で再懸濁し、４Ｍ塩化リチウムの２０μｌ及び２．５倍容のエタノールを添加することにより第２回目の沈澱を行った。精製したゲノムＤＮＡは最後にＴＥに再懸濁し、４℃に貯蔵した。タイプ３莢膜生合成に必要な遺伝子をコードするＤＮＡ断片は、次に鋳型としてエス．ニューモニエのゲノムＤＮＡを用い、タイプ３莢膜遺伝子座の公開された配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマー（センスプライマーＳ１とアンチセンスプライマーＡ２又はＡ３）を用いるＰＣＲにより取得した（ｃｐｓオペロンおよびプライマーの配列については図１を見よ）。このＰＣＲのセンスおよびアンチセンスプライマーは続くクローニング工程を容易にするためそれらの５’ 末端にＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計した。このＰＣＲ反応混合液は、製造者（ストラタジーン）により供給されたＴａｑプラス反応緩衝液中に、約１５ｎｇのＷＵ２株由来の染色体ＤＮＡ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２ユニットのＴａｑポリメラーゼ及び１μｌのＴａｑエクステンダー（ストラタジーン）を含んでいた。変性工程（９５℃で３０秒間）、アニーリング工程（６０℃で６０秒間）及びポリメラーゼ伸長工程（７２℃で１８０から２４０秒間）を含む３５サイクルの後、プライマーＳ１＋Ａ２及びＳ１＋Ａ３で得られたＰＣＲ産物を精製しそして標準的方法を用いるアガロース・ゲル電気泳動により予想されたサイズのもの（それぞれ約３及び４４ｋｂ）であることを測定した。 ii）ｐＴＲＥＸ及びｐＴＲＥＰの構築推定的ＲＮＳ安定化配列、翻訳開始領域及び標的遺伝子のための複数のクローニング部位をコードする合成オリゴヌクレオチド類は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１×ＴＢＥの２００μｌ中の各オリゴヌクレオチド２００μｇ中の各オリゴヌクレオチド２０μｇをボイルし、室温で冷却させることによりアニールした。アニールしたオリゴヌクレオチドは２５０μＭのデオキシヌクレオチド三リン酸及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む１×ＴＦ１緩衝液中、Ｔｆ１ＤＮＡポリメラーゼを用い、３５℃、４５℃、５５℃及び６５℃でそれぞれ１分間、その後７２ ℃で１０分間伸長させた。センス及びアンチセンス・オリゴヌクレオチドには、さらなるクローニングをし易くするためその５’末端にそれぞれＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩに対する認識部位を含めた。得られた２本鎖ＤＮＡをＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで切断しｐＵＣ１９の誘導体であるｐＵＣ１９ＮＴ７中のＸｂａＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間にクローニングした。このｐＵＣ１９ＮＴ７はＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄIII部位の間にクローニングされたｐＬＥＴ１由来のＴ７発現カセット（１７）を含んでいた。得られた構築物はｐＵＣＬＥＸと命名した。次いで、ｐＵＣＬＥＸ中の完全な発現カセットをＨｉｎｄIIIで切断しそして平滑化することにより取り出し、その後ＥｃｏＲＩで切断した後ｐＩＬ２５３のＥｃｏＲＩ部位及びＳａｃＩ（平滑化）部位中にクローニングしてベクターｐＴＲＥＸを作成した。プラスミドｐＴＲＥＰは次のようにして構築した。すなわち、ビー．リヘニフォルミスのペニシリナーゼ遺伝子の３’末端由来のｒｈｏ独立ターミネーター、ＰＵＣ逆配列プライマー、プロモーター挿入のための複数のクローニング部位及び普遍的翻訳停止配列（すなわち、３リーディング・フレームすべての停止コドン）をコードする合成オリゴヌクレオチド類を上述のようにアニールした。アニールしたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで切断し、ＥｃｏＲＩで切断しておいたｐＴＲＥＸ中にクローニングし、平滑化し、次いでＢａｍＩで切断した。生ずるプラスミドをｐＴＲＥＰと命名し、以下に述べるようにエス．ニューモニエ由来のｃｐｓオペロン遺伝子のクローニングに使用した。ｐＴＲＥＰの詳細は図２及び図５に示す。 iii）エス．ニューモニエ由来のｃｐｓオペロン遺伝子のｐＴＲＥＰへのクローニング精製したＤＮＡ断片（ｃｐｓ１及びｃｐｓ２は図５に示す）を標準的条件を用いＢａｍＨＩで消化し、ライゲーションキット（アマシャム）及び製造者により推奨された条件を用いてＢｇｌII及びＢａｍＨＩで切断し脱リン酸化し精製したプラスミドｐＴＲＥＰに連結した。この連結されたＤＮＡを先に記述された（１６）ようにコンピテントな（受容能力のある）エル．ラクティス中にエレクトロポレート（電気穿孔）し、プラスミドを保持する形質転換体を選択するため形質転換体を５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＧＭ１７寒天上で回収した。得られた、エス．ニューモニエタイプ３ｃｐｓ遺伝子座の３及び４ｋｂＤＮＡ断片を保持するプラスミドをそれぞれｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ１及びｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ２と命名した。これらを図５に示す。ｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ１にクローニングされた３ｋｂの肺炎球菌ＤＮＡ断片は、ＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ及びタイプ３莢膜多糖類シンテターゼ及びそれらの関連するプロモーターをコードするｃｐｓ３Ｄ及びｃｐｓ３Ｓ遺伝子を含んでいる（図５）。ｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ２中にクローニングされた肺炎球菌ＤＮＡ断片はほぼ１ｋｂ長くそしてｃｐｓ３Ｄ及びｃｐｓ３Ｓに加えてグルコース−１−リン酸・ウリジル・トランスフェラーゼに対するｃｐｓ３Ｕ遺伝子を含んでいる（図３）。ｃｐｓＭ遺伝子はクローニングしなかった。これはこの酵素がエル．ラクティス中に天然に存在すると予想されたからである。以下の実施例２に示すように、この予想は正しかった。プラスミドｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ１及びｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ２を保持するエル．ラクティス株はそれぞれＵＣＰ１６１８及びＵＣＰ１６１９と命名した。これらの株による多糖類莢膜の生産はスライドガラス上の細菌の薄い乾燥スメアをグラム及びニグロシンで染色した後光学顕微鏡により肉眼で見ることができる。実施例２エル．ラクティスにより生産される莢膜多糖類は肺炎球菌ｃｐｓタイプ３に特異的な抗血清により認識される。エル．ラクティス株、ＵＣＰ１６１８及びＵＣＰ１６１９を新鮮な一晩培養から０．５％ｗ／ｖグルコース（ＧＭ１７）及びエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むＭ１７ブロス中に１００倍に希釈し、３０℃で３時間生育させた。次いで、この細菌培養を遠心分離によりほぼ１０倍に濃縮し、そして５μlをニトロセルロース片上にスポットし乾燥させた。負の対照としてベクターｐＴＲＥＰを保持するエル．ラクティス株を同様に処理し、そしてニトロセルロース濾紙に適用した。既に記述されたように（１２）、タイプ３ｃｐｓ抗血清を用いてイミュノブロッティングを行った。ただし、ブロッキング剤として牛血清アルブミンの代わりに乾燥ミルク（２％ｗ／ｖ）を使用した。その結果、タイプ３ｃｐｓ抗血清はエル．ラクティス株ＵＣＰ１６１８及びＵＣＰ１６１９がその上にスポットされた濾紙の部分に特異的に結合するが、エル．ラクティスそれ自体（負の対照）には結合しないことが示された。予想したように、抗血清もイミュノブロッティングにより精製した肺炎球菌ｃｐｓを検出する（結果は示していない）。株ＵＣＰ１６１９が株ＵＣＰ１６１８よりも多くの莢膜物質を含むことは図６から明らかである。この結果は再現性がありそしてｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ１及びｐＴＲＥＰ−ＣＰＳ２を含むエル．ラクティスの別の実験で誘導された他のクローンでも観察された。これらの結果は肺炎球菌のｃｐｓ３Ｄ及びｃｐｓ３Ｓ遺伝子だけがエル．ラクティスによるタイプ３ｃｐｓ生産に必要であることを示す。もっとも、生産される莢膜の量は同一プラスミドにｃｐｓ３Ｕのための遺伝子を含めることにより大きく増加させることができる。推論により、ホスホグルコムターゼをコードする遺伝子（図３ではｃｐｓ３Ｍと命名した）はエル．ラクティス中に存在し、この宿主での効率的な莢膜生産を可能にする程に十分な量で存在するに違いない。しかしながら、肺炎球菌のｃｐｓ３Ｍ遺伝子を他の莢膜生合成遺伝子と同じプラスミド上に与えることによりエル．ラクティスの莢膜の収率をさらに増加させることが可能となりうる。実施例３組換えエル．ラクティスにより生産されるタイプ３多糖類莢膜のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析エル．ラクティスにより生産される莢膜多糖類は、ＭＯＰＳ緩衝化培地（ＭＯＰＳ，アレクシス・コウ，６．７ｇ／リットル、ｐＨ７．２、イースト・ナイトロジェン・ベース，ディフコ，２５．１１ｇ／リットル、カゼイン酵素水解物，シグマ，２ｇ／リットル、グルコース０．５％ｗ／ｖ及びエリスロマイシン５μ ｇ／ｍｌ）に一晩生育させたエル．ラクティス株ＵＣＰ１６１９から精製した。１００％トリクロロ酢酸０．２５倍容を添加し、ジュアン遠心分離機（モデルＣＲ３１２）中、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより培養液からタンパク質を除去した。ｃｐｓは、等容量のアセトンで沈殿させ、ジュアン遠心分離機（モデルＣＲ３１２）中、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより回収した。次いで、エル．ラクティスからのｃｐｓを５％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウム中に再溶解し、残りのタンパク質をクロロホルムとブタノールの混合液（５：１）で抽出することにより除去した。このｃｐｓを等容量のエタノールで再度沈殿させ、エタノールとアセトンの両方で１回洗浄し、そして脱イオン水中に再溶解した。ついで、このｃｐｓを長期間貯蔵のため凍結乾燥した。エル．ラクティス株ＵＣＰ１６１９により生産された精製ｃｐｓ及びエス．ニューモニエからの高度に精製したタイプ３ｃｐｓの市販品（メルク・シャープ・ドーム）を約３．３ｍｇ／ｍｌの濃度で重水Ｄ₂Ｏ中に再懸濁し、そしてＤＲＸ５００ＮＭＲスペクトル分光器（ブルーカー・コウ．ドイツ）中、３２０°ＫでプロトンＮＭＲスペクトルを分析した。天然の肺炎球菌ｃｐｓ調製物及びラクトコッカス誘導ｃｐｓ調製物のプロトンＮＭＲスペクトルは極めて類似している。各水素グループと関連する小さなピークの相対強度における僅かな変動は試料の粘度の差に帰するのが最も妥当である（図７）。同様に、これらの試料の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルは同一の位置にピークを示す。これらの結果はこの二つの多糖類試料の反復ユニットの分子構造が同じであるという証拠を提供する（図９）。実施例４単離された莢膜多糖類及び莢膜を有するエル．ラクティスに対する免疫応答の研究ｃｐｓを発現する組換えエル．ラクティス及びエス．ニューモニエ由来の精製ｃｐｓに対する免疫応答をＢＡＬＢ／ｃマウスの同系交配株の腹腔内（ｉ／ｐ）接種により比較した。５匹１群のマウスに、アジュバントなしで、ｃｐｓを発現する組換えエル．ラクティス（株ＵＣＰ１６１９）の種々の投与量又はエス．ニューモニエ由来の精製したタイプ３ｃｐｓ抗原の当量を用いて皮下に免疫処置した。免疫処置後７、２１、３５及び４９日目に血液試料を集め、その抗−ｃｐｓ抗体レベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡでは、ミクロタイター・プレート（ヌンク、マクシソーブ）を、各ウエルにエス．ニューモニエ由来のｃｐｓの５０μｇ／ｍｌ溶液を添加しそして３７℃で５時間っいで４℃で一晩インキュベートすることにより、エス．ニューモニエ由来の精製ｃｐｓで被覆した。非特異的タンパク結合部分は各ウエルにＰＢＳ中の１％ｗ／ｖＢＳＡの１００μlを添加しそして室温で１時間そのプレートをインキュベートすることによりブロックした。このプレートを洗浄緩衝液（ＷＢ、ＰＢＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）トゥイーン２０）中で３回洗浄した後、ＰＢＳ中の１％ｗ／ｖＢＳＡで希釈した血清試料をこのプレートに添加し（５０μl／ウエル）、室温で２時間インキュベートした。ついで、このプレートをＷＢで５回洗浄しそして１％ＢＳＡ（５０μl／ウエル）を含むＷＢで希釈した第２抗体（抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ複合体）と共に室温で１．５時間インキュベートした。最後にこのプレートをＷＢで５回洗浄しそしてジエタノールアミン緩衝液中の基質ニトロフェニルホスフェートと共にインキュベートし、そしてＥＬＩＳＡリーダーを用い４０５ｎｍの波長で検定した。各血清試料について、予め免疫化したマウスのプールした血清の５０倍希釈液と同じ吸光度（４０５ｎｍ）の値を示す終点タイターをＥＬＩＳＡデータを用いて計算した。免疫処置後７、２１、３５及び４９日目の異なる実験グループのマウスに対する特異的抗ｃｐｓ抗体レベルの平均終点タイターを示す棒グラフを図８に示す。これらの結果から、精製ｃｐｓ又は当量のｃｐｓを発現するエル．ラクティスの１回投与でマウスを免疫処置すると有意のｃｐｓ特異的ＩｇＧ血清抗体応答が引き出されることが明らかである。免疫処置後２１及び３５日目に、免疫処置グループのマウス全ての平均のｃｐｓ特異的抗体タイターは無処置のものよりも有意に高かった（ｐ＝０．００４、すべての統計分析は無パラメータ・マン・ホイットニーＵテストを用いて計算された）。２１日目には、ｃｐｓの当量を発現するエル．ラクティスの精製ｃｐｓで免疫処置したマウスグループのＩｇＧ抗体タイターの間には有意の差は存在しなかった（ｐ＞０．０５）。３５日目には、５ μｇのｃｐｓ（精製したものであろうとエル．ラクティスにより発現したものであろうと）を与えたマウスグループのｃｐｓ抗体タイターは、ｃｐｓ低投与量で免疫処置されたグループよりも有意に高かった（ｐ＝０．０４８）。免疫処置後４９日目までに、免疫処置グループマウスのｃｐｓ特異的血清ＩｇＧ抗体タイターは、未処置グループと有意に異ならないレベルまで減少し始めていた。実施例５エル．ラクティスで発現させるための他の肺炎球菌莢膜オペロン遺伝子のクローニング他の血清型のタイプ特異的ｃｐｓ生合成オペロンの上流に位置するＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）内の肺炎球菌ＤＮＡ配列の間には高い相同性がある。これはタイプ３肺炎球菌単離菌の莢膜遺伝子座由来の公表されたＤＮＡ配列（１８、１９）と、タイプ１４（ヌイテンら，ゲンバンク受託番号Ｘ８５７８５）及び１９Ｆ（２０）などの他の血清型との比較から明らかである。このＤＮＡ配列の相同性はその配列が未知である肺炎球菌の他の血清型由来のｃｐｓ生合成オペロンをコードするＤＮＡ断片の逆ＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計するために使用することができる（以下を見よ）。さらに、上に参照した保存されたＤＮＡ配列は他のグラム陽性細菌の莢膜生合成オペロンに隣接して発見されてもいる（２１及びその中の引用文献）。このことはこの方法が広い範囲の莢膜を有する細菌に適用可能であることを示唆する。ここに示す実施例では、肺炎球菌血清型４のｃｐｓ生合成オペロンを含むと予想される一つの断片を逆ＰＣＲにより増幅した。肺炎球菌血清型４由来のゲノムＤＮＡは実施例１に記述した方法で調製した。プライマーＳ２及びＡ４は上に引用した公表された保存配列を用いて設計し、そして公表された方法（２２）を用いて逆ＰＣＲのために使用した。約１３ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲ反応で増幅した（変性９４℃で３０秒間、アニーリング６０℃で６０秒間、伸長７２℃で８分間の３０サイクル、そして最終伸長期間７２℃で１０分間のインキュベーション）。この断片のＤＮＡ配列はタイプ４オペロンのｃｐｓ生合成酵素をコードすることが予想される。実施例６１．免疫処置のためのエル．ラクティスの調製エル．ラクティス１６０１（プラスミドを有する）及びエル．ラクティス１６１９（莢膜を有する）の生育のために、粉末状のＭ１７ブロスとグルコースをｄｄＨ₂Ｏ中に溶解し、オートクレーブし、ついで冷却する。エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）をこの培地に添加する。冷凍ストックからの細菌を使用して培地１００ｍｌ容量に接種する。振盪インキュベータ中、３０℃で一晩培養する。この細菌を１０，０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離により培地から分離する。この細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＰＢＳ中で遠心分離により２回洗浄する。最後の懸濁液を４０５ｎｍで光学密度を測定することによりコロニー形成ユニットを評価する。細胞の濃度を所望の濃度に調整する。２．免疫処置手順ラクトコッカス・ラクティス１６１９を５×１０⁹ＣＦＵ／ｍｌの濃度及び０．１ｍｌの総容量（５×１０⁸ＣＦＵ）に調整し、６ＢＡＬＢ／ｃ雄のＳＰＦマウス（７週齢）のそれぞれに２６ゲージ針を用い皮下注射により投与した。マウスを生きている細菌の同濃度で０、１４、及び２８日に免疫処置した。対照のマウスは６匹の未処置の動物であった。３．マウスの気管内細菌チャレンジストレプトコッカス・ニューモニエＮＴＣＣ１２６９５を用いる細菌チャレンジは４２日目に行った。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）を静脈内サファン（saffan）麻酔法（０．１５ｍｌ、ｋｇ体重当たりＰＢＳ中２０ｍｇのアルファドン、ピトマン−ムア、Nth Ryde，NSW,オーストラリア）により沈静化した。気管を口から露出させ、プラスチック中に引っ込められる針を持つ２２．５Ｇのカテーテル（テルモ、東京、日本）を気管開口部に０．５〜０．７５ｃｍの距離まで挿入した。カテーテルから針を取り除き、カテーテルのハブ中にＰＢＳ中のエス．ニューモニエの２０μｌ容（５×１０⁵コロニー形成ユニットを含む）を入れた。この種菌をカテーテル中のハブの中に１ｍｌのシリンジを封じこめることにより生ずる０．３ｍｌ容の空気２回で散布した。４．細菌チャレンジの後の試料の回収腹腔内注射によりペントバルビタールナトリウムを過剰投与することによりマウスを殺した。希釈していないペントバルビタールナトリウムの０．２ｍｌを１ｍｌシリンジ上の２６ゲージ針を用いて注射した。１．５ｍｌのエッペンドルフ内に置かれた１ｍｌのシリンジと２６ゲージの針を使って心臓穿刺により血液を採取し、血清を集めるために凝血させた。頸を経て気管を露出させ、背面の結合組織を切断することにより切り離し、喉頭の近くで切断し、そして気管の中に挿入された１ｍｌのシリンジが付いた２０ゲージのカニューレを用い、肺の中に０．５ｍｌのＰＢＳを注入しそして回収することにより気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を取得した。回収されたこのＢＡＬを１．５ｍｌのエッペンドルフの中に入れた。このＢＡＬについて、ＣＦＵ測定用ブラッド・アガー・プレート（血液寒天平板）上にその１０倍逐次希釈液を塗布することにより細菌の存在の有無を評価した。４℃、４５０×ｇで１０分間の遠心分離（ジュアンＢＲ３．１１、セントナザール、フランス）により血清を分離し、そして必要になるまで−８０℃で貯蔵した。１００μｌのＢＡＬを遠心分離機の中に置きそしてスライドガラス上に１０分間遠心分離した。スライドをディフ・クイックで染色し、そして白血球の別の集団をスライド当たり３視野からカウントし、動物当たりの平均％カウント、ついでグループ当たりの平均％カウントを求めた。ＢＡＬを４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（ジュアンＢＲ３．１１、セントナザール、フランス）した。その上清を取得し必要になるまで−８０℃で貯蔵する。そのペレットを５０μｌＰＢＳ及び５０μｌメチレンブルー中に再懸濁した。その白血球を血球計でカウントし、そして上述の分析のため計算はＢＡＬの除去に対して調整された。結果エス．ニューモニエＮＴＣＣ１２６９５と相同な多糖類莢膜を発現するエル．ラクティス１６１９の皮下注射により免疫処置された動物では、肺の気管支肺胞領域からの細菌のクリアランスの増強が示された。肺に感染させるために使用したエス．ニューモニエ株と相同な多糖類莢膜を発現するエル．ラクティス１６１９の皮下注射により免疫処置された動物のＢＡＬ中では、回収された総細菌数は少なくなっていた。実施例７タイプIII ＧＢＳオペロンの染色体領域の公表された地図（１）に基づいて、本発明者らはグループＢストレプトコッカスの９種の血清型すべてからの莢膜生合成遺伝子を含む長いＤＮＡ断片を合成する（ＰＣＲにより）ために使用されたオリゴヌクレオチドプライマー（図１２ａ）を設計した。ＰＣＲプライマーはｃｐｓＦ遺伝子に対して公表された配列（ＥＭＢＬデータベース受託番号ＳＡ１９８９９）及びｃｐｓＣ遺伝子（ＥＭＢＬデータベース受託番号ＳＡＣＰＳＡＢＤ）を用いて設計された。ＧＢＳの８種の異なる莢膜血清型由来のゲノムＤＮＡを用いて、１３ｋｂから１６ｋｂまでにわたるサイズのＤＮＡ断片がＰＣＲ反応によって増幅された。ＰＣＲ反応はタックプラスシステム（ストラタジーン・エルティーディー）、鋳型としてゲノムＤＮＡの約１５０ｎｇ及び製造者により推奨された緩衝液中の各プライマー４０ｐｍｏｌを用いて行われた。この反応はゲノムＤＮＡを変性するため９５℃で５分間インキュベートし、その後９５℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１５分間の伸長の５サイクル、次いで９５℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃ で１５分間の伸長の５サイクル、次いで９５℃で３０秒間の変性、６５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１５分間の伸長の２５サイクル、そして７２℃で１０分間の最終の伸長期間、インキュベートした。ＧＢＳの６種の異なる血清型から得られたＰＣＲ産物の制限エンドヌクレアーゼ消化により、予想された通り、莢膜生合成オペロンが共通に見られる一部の断片とその血清型に特異的な他の断片を含むことが示された（図１２ｂ）。生成した上記の断片はクローニングし、莢膜生合成に関与する遺伝子を同定するため直接配列決定をすることができる。これらの酵素の不可欠の組合せは、ＧＢＳ莢膜多糖類又は二つ以上のＧＢＳ血清型からのｃｐｓの保護的エピトープがその中に存在する組換え多糖類を生産するエル．ラクティスの無害の株を作成するために、例えばエル．ラクティス発現プラスミド中にクローニングすることができると予想される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION New microorganism SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a novel transformant transformed with DNA encoding the production of an immunogenic carbohydrate capsule. Non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacterial host microorganisms, especially Lactococcus It relates to a lactis (Lactococcus lactis) microorganism. Such a bacterial host microorganism Also provided are compositions comprising: and their use in vaccines. One important pathogenic microorganism is Streptococcus, commonly called pneumococcus. Pneumoniae (Streptococcus pneumoniae). For developing and developed countries Importance of Streptococcus pneumoniae infection in relation to human diseases Gender was recently pointed out by an authoritative review (1). It's a global, this microbe Is believed to be the most common cause of acute respiratory infections, and Most are developing countries, resulting in an estimated 1 million child deaths each year (2). In the United States, pneumococci are still bacterial It is the most common cause of pneumonia, and the rate of illness affects young children, the elderly, and Susceptibility to asplenia, heart, lung and kidney disease, diabetes, alcoholism, etc. Is particularly high in patients with severe conditions or those with immunosuppressive disorders, especially AIDS Suggested (3). These groups are responsible for pneumococcal sepsis and thus meningitis. The risk of death from pneumococcal infection is increased. Pneumonia The fungus continues to be the dominant transmission of children in developed countries, and has led to considerable expense It is also a major cause of otitis media and sinusitis. The need for effective prevention strategies against pneumococcal infections is paramount for penicillin-resistant pneumococci Attention has been paid to the recent appearance. Pneumonia in 13 hospitals in 12 US states 6.6% of the fungal isolates were found to be resistant to penicillin, and Some recently reported that some are resistant to other antibiotics, including third-generation cyclosporine (4). The rate of penicillin resistance is higher in some hospitals (20% Up to) (5). The emergence of penicillin resistance in pneumococci is a penicillin-effective cure These findings are alarming as they came recently and suddenly after decades of medical treatment it is conceivable that. Therefore, for the reasons set forth above, various means of preventing, controlling, diagnosing or treating pneumococcal disease are considered. There is compelling evidence to consider improvement. Pneumococcal virus could be integrated into a global child vaccination program It is well known that two major issues are encountered when working on Kuching development I have. These include (a) the antigenic diversity of pneumococci, at least 84 immunological Different serotypes are known, each of which is used as a vaccine That it can only induce protection against its own serotype, (B) When purified and used as a vaccine, capsular polysaccharides (each of which is Determines the type and is the major protective antigen), but is not invasive pneumococcal infection and meninges Reliable for children under 2 years of age group with highest incidence of flame Does not elicit a protective antibody response (6). These problems are pods Membrane antigens (eg, Group B Streptococcus, Haemophilus influenzae) And other vaccine strategies based on Neisseria meningococcus). You. However, within these species, the degree of capsule type heterogeneity is more limited Looks like. The current U.S. strategy for preventing pneumococcal infections is the most common Formulating a vaccine containing capsular polysaccharide antigens from 23 of the streptococcal serotypes And Taken together, these strains make invasive pneumonia from children in the United States and Europe Almost 90% of bacterial isolates and less than 70% of pneumococcal infections in Asia (7, 8). In practice, it essentially produces a variety of different capsular capsules, These vaccines must be controlled and mixed in appropriate amounts The cost of manufacturing is expensive. The present invention relates to the use of protective immunogens for simpler bacterial fermentation (Streptococcus Lactococcus lactis, not Tococcus pneumoniae itself (Including the growth of non-pathogenic bacteria). The present invention Means that two or more polysaccharide immunogens are produced by the same bacterium, Measures to control quality and reduce the number of heterogeneous immunogens that must be mixed provide. Surprisingly, we are not responsible for the synthesis of the capsule of pathogenic bacteria. DNA that contains all or part of the operon encoding the enzyme Transforms or transfects non-pathogenic Gram-positive bacterial host microorganisms , Immunologically and structurally with a polysaccharide capsule normally found around pathogenic microorganisms Yielded a host microorganism with the same polysaccharide capsule. Using all operons It is possible that accurate expression, secretion and assembly of this capsule, even when used, occur. The complexity associated with these processes and what is called the "management and maintenance" gene, For example, this pathogenic microorganism is not part of the operon itself, but Given the possible involvement of genes involved in the transfer of polysaccharides of It should be. Pathogenic bacteria among nonpathogenic Gram-positive bacteria such as Lactococcus lactis Records of the expression and / or production of native polysaccharide immunogens do not exist in the scientific literature. No. Therefore, the present invention relates to non-pathogenic Gram-positive microbes such as Lactococcus lactis. Practical methods to achieve expression and production of polysaccharide immunogens from pathogenic bacteria in organisms It is disclosed for the first time. Furthermore, the present invention relates to a polysaccharide-expressing strain of such a microorganism. Can elicit an immune response to the polysaccharide capsule. Those skilled in the art will recognize that the present invention can be used for many different types of applications. The field of anti-capsule based vaccines and especially vaccines for pneumococci Its contribution to is particularly important. Another important possibility opened by the present invention Can be delivered transmucosally to the immunogenic polysaccharide capsule, for example, nasally or orally , The provision of vaccines. Thus, in a first aspect, the present invention is responsible for the production of polysaccharide immunogens from pathogenic bacteria. Transformed or transfected with DNA encoding one or more enzymes And non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacteria. Examples of Gram-positive bacteria that can be used include Listeria innocure (Listeria innocua), Staphylococcus xyl osus), Staphylococcus carnosus, strike Leptococcus gordonii, Lactococcus sp. Pieces (Lactococcus species) or Lactobacillus species (Lactobac illus species). One preferred embodiment of the present invention is Lactococcus Use lactis. The invention also relates to attenuated strains of Gram-positive pathogenic bacteria, such as Listeria, e.g. To list vaccine strains of Listeria monocytogenes Can be used. In a preferred embodiment, the polysaccharide immunogen forms a polysaccharide capsule. Of such a capsule One example is from Streptococcus pneumoniae. Preferred pods It will be appreciated that the choice of membrane serotype is determined by location and the like. Thus, in general Wants to express one or more of the above 23 most common polysaccharide serotypes become. However, even within this group, an acceptable level of It is only necessary to provide a smaller number of expressions to achieve protection. The present invention presumably builds a "library" of capsular polysaccharides to be expressed, and then To produce a customized vaccine for the most common serotype in a specific area or population By mixing it appropriately to produce 84 from Pneumonia It can, of course, be used to express other capsular serotypes of the species. The examples described in this specification are based on S.I. Producing polysaccharide immunogens from Pneumoniae And / or L. for delivery. As for the use of Lactis, the present invention For the production and / or delivery of natural or recombinant polysaccharide immunogens from any pathogenic bacteria Can also be applied. These polysaccharide immunogens are, for example, Group B strains. Polysaccharide immunogens from Putococcus, strains of other species that cause disease in animals and humans Polysaccharide immunogens from Putococcus, staphylococci encapsulated in capsules and other A polysaccharide immunogen from a Gram-positive pathogen, or even if it is Gram-positive Gram-negative (E. coli, Haemophilus influenzae (Haemophi lus influenzae), Neisseria meningitidis )), And its polysaccharide capsular biosynthesis gene is L. Lactis A polysaccharide immunogen from any other microorganism that can be expressed in any microorganism Which can be expressed practically in a harmless host. . The capsular polysaccharide of Group B Streptococcus (GBS) is L. Lactis Examples of capsules that can be produced and / or delivered using any harmless microorganism. Human GBS associated with disease generally has a capsular and nine serologically distinct capsular polysaccharides Contains one of the With a few exceptions, these polysaccharides are glucose, Galactose, N-acetylglucosamine and N-acetylneuraminic acid or Contains arlic acid. Specific arrangement of monosaccharides in repetitive units depends on the immunology of each capsule Determine the specificity. A map of the chromosomal region of the Type III GBS operon was created. Tested by Southern hybridization studies using DNA probes Serotypes are found to be highly conserved throughout (9, 10). In addition, the sequences of the genes on either side of this region are involved in polysaccharide synthesis. Found to share significant homology with other bacterial genes encoding different enzymes Was. On both sides of the capsular biosynthetic operon of Group B Streptococcus, CpsF and cpsE (CMP-sialic acid synthetase and acetyl, respectively) Gene, which is thought to encode At the end, and thought to be involved in the synthesis and transport / polymerization of this cps subunit Gene appears to be located at the other end. Therefore, the biosynthesis of other operons Genes are published conserved genes identified in the type III cps operon Can be easily obtained by PCR amplification using primers based on the sequence. If the GBScps biosynthesis gene can be easily obtained, for example, Expressing an essential combination of enzymes of the present invention and producing GBS capsular polysaccharides. La It may be possible to construct a strain of Cutis. The DNA used to transform or transfect the host microorganism is a polysaccharide. Contains all or part of an operon encoding enzymes necessary for the synthesis of capsular capsules Can be. The essential requirement is, of course, that the enzyme encoded by the exogenous DNA Complete synthesis for the capsule together with one or more enzymes present in the host microorganism Is to provide a route. In one embodiment, exemplified below, we provide pneumococcal type 3 cps biosynthesis. The DNA fragment derived from the operon was identified as L. Cloning on plasmid vector in Lactis That it can be trained. In addition, El. Lactis on pneumococcal raw When transformed with a plasmid carrying a fragment of the synthetic operon, L. Lactis Production of a polysaccharide capsule occurs in the polysaccharide capsule, and the polysaccharide capsule is produced in pneumococcus. Antigenically and structurally identical to the capsule. In Example 1 below, L. Easy This capsular gene, expressed in tis, has its own promoter and translation signal. keeping. However, the skilled artisan will appreciate that other plasmids, promoters and / or Can be used to implement the present invention using translation signals, e.g., from a host microorganism. I will admit it is possible. In fact, recently described in the literature (11,12) Capsular synthesis by using constitutive or inducible Lactococcus promoters And change the level of The level of capsule produced by Lactis May be able to increase. Similar results can be obtained from such an "tailored" It should be possible to obtain other microorganisms using a motor or the like. Furthermore, high levels of polysaccharide expression were found in Wells et al. (13 and GB-B-22784). No. 58) using the inducible T7 expression system. Lactis It would be expected that this could be achieved with Construction of bacterial strains carrying genes required for the synthesis of two or more heterologous capsular polysaccharides (A heterologous cps operon is integrated at a different locus on the chromosome) Was shown to be possible in Streptococcus pneumoniae (14)) or two or more blood Produce a recombinant polysaccharide in which a clear type-derived protective epitope exists within the same polysaccharide. Produce, for example, L. By establishing Lactis strains, Lactococcus Two or more antigens can be produced simultaneously by Gram-positive bacteria such as Lactis Will be. Engineering capsular polysaccharides to include two or more heterologous capsular epitopes Is an example of expressing an essential combination of capsular biosynthetic enzymes from pathogenic bacteria For example, L. This may be possible by constructing Lactis strains. In order to produce a polysaccharide antigen such as a pneumococcal polysaccharide antigen, L. et al. Lactis Using any non-pathogenic GRAS microorganism produces polysaccharides as vaccines And it provides a means to greatly reduce the cost of formulation. El. Lactis High producing strains are polysaccharides (the polysaccharides are then purified and converted to selected carrier proteins). Can be used to produce El to produce. Lactis cells could be used directly as vaccines . Thus, in a second aspect, the invention relates to a method for producing a polysaccharide immunogen of a pathogenic bacterium. And encoding one or more enzymes responsible for the production of the polysaccharide immunogen Transforming non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacteria with NA; and / or Alternatively, there is provided a method comprising a step of culturing the bacterium. As discussed above, the Gram-positive bacteria of the invention are used to deliver polysaccharide immunogens. Could be used. Thus, in a third aspect, the invention relates to a method for use in medicine. Thus, a microorganism of the present invention is provided. In particular, the present invention provides one alternative for providing vaccines against capsular polysaccharide antigens. provide. Thus, in a fourth aspect, the invention relates to the non-invasive or non-pathogenic of the present invention. A vaccine comprising Gram-positive bacteria is provided. Such vaccines release polysaccharides The microorganisms that appear, for example, L. Live or sterilized preparation of Lactis Could be included. In particular, vaccines suitable for administration via the mucosal route Provided. Examples of such mucosal routes include nose, mouth, transbronchial tissue, eyes, ears , Rectum, vagina, urethra, or sublingual. Nasal and oral routes of mucosal route Preferred. The vaccine of the present invention is particularly provided for use in humans. More Even such vaccines are manufactured for use in animal vaccination programs. Could be formulated. When formulating the microorganisms of the present invention, the skilled worker defines a range of delayed release and time. Release, or a suitably protected formulation, such as a vaccine, for which it is most effective Enteric coated cap to ensure delivery to such sites, e.g., Peyer's patches Cells can of course be used. In addition, the vaccine of the present invention It may contain a vant. Such a vaccine would utilize immunization of the mucosal route. And expressed Mucosal and systemic immune responses to the selected polysaccharide (s) Would be expected. El. Gram-positive microorganisms such as Lactis Can also be used as effective delivery vehicles for protein antigens. (International Patent Application No. PCT / GB96 / 02580). These studies In the recombinant L., which expresses the tetanus toxin fragment C as an antigen, Using Lactis Mice were immunized orally and nasally with high protection against expressed antigens A level of serum antibody response was induced. Accordingly, in a fifth aspect, the present invention provides a vaccine against pathogenic bacteria having a polysaccharide capsule. A method of inoculating mainly tin, wherein the effective amount of the gram-positive bacteria of the present invention is mainly used. A method comprising the step of administering is provided. In a further aspect, the invention relates to mucosal immunity to pathogenic bacteria having a polysaccharide capsule. Comprising administering an effective amount of the Gram-positive bacteria of the present invention to a subject. Providing a method including the steps of: One of the major benefits of mucosal immunization is that it stimulates the mucosal immune system Ability to induce the secretion of antigen-specific antibodies on the mucosal surface of the body It is. Colonization of mucosal surfaces is due to the presence of capsular bacteria (eg, pneumococci, hemo Fils Influenza, Neisseria Meningitidis and Group Bs Many, including Streptococcus agalactiae Is a prerequisite for infection by pathogens of the Kuching is also good at preventing infection and preventing asymptomatic transmission of this organism in populations. May be effective. In another aspect, the invention provides: i) coding one or more enzymes responsible for the production of polysaccharide immunogens from pathogenic bacteria; A DNA construct comprising the DNA to be loaded, ii) a vector containing the construct defined in i), for example, a plasmid vector, iii) Transformation or transfection of non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacteria Use of the construct specified in i) in iv) The present invention in the preparation of a vaccine against pathogenic bacteria having a polysaccharide capsule. Use of bacteria. The preferred properties of each aspect of the invention are as for each of the other aspects mutatis mutandis. It is equally applicable. The present invention will now be described by the following examples, which are not intended to be limiting. In a sense, it should not be understood as a limitation. These examples refer to the following figures: . FIG. 1 shows the DNA sequence of the region encoding the enzyme involved in type 3 capsular polysaccharide synthesis. The positions of the primers S1, A1 and A2 above are shown (Genbank, accession number U15 171 (19). FIG. 2 shows the sequence and essential properties of the pTREP cassette in pTREP . FIG. 3 shows a type 3 capsular polysaccharide (cp) in Streptococcus pneumoniae. 2 shows the biosynthetic pathway of s). Glucose-6-phosphate was added to S.I. Found in Pneumonier Four enzymes are required to convert to the type 3 capsular polysaccharide structure. Capsular Additional functions are required for transport and coupling. FIG. 1 shows the genetic organization of the type 3 cps locus in Pneumoniae. There are two promoters (designated P). One promoter is cps3D Gene and the cps3S gene, and the other replicates the cps3U gene and cp Duplicate the s3M gene. DNA fragments CPS1 and CPS2 were used as templates Step 3 pneumococcal chromosomal DNA was used and primer S1 was replaced with primers A2 and It was prepared by PCR used in combination with the primer A3. these A primer was used at its 5 'end to facilitate cloning of this fragment in pTREP. Was designed to contain a BamHI restriction endonuclease site. FIG. 5 shows plasmids pTREP, pTREP-CPS1 and pTREP-CP. 4 shows a schematic representation of S2. MLS is macrolide, lincosamide and strep T represents a togramin B resistance determinant, and T represents a downstream terminator. Indispensable The location of the restriction site is indicated and is a cloned pneumococcal DNA fragment. CPS1 and CPS2 (FIG. 1B above) are indicated by bold lines. FIG. 6 shows the use of a type 3 specific antiserum as described in the Examples, L. et al. La Figure 3 shows immunodetection of type 3 cps production by Cutis. (1) Including pTREP El. Lactis non-expressing strain, (2) L. Lactis cps-expressing strain UCP1 619, and (3) L. Lactis cps expression strain UCP1618. FIG. 7 shows (1) Lactococcus lactis expression strains UCP1619 and (2) ) Similar analogs of purified polysaccharides of type 3 Streptococcus pneumoniae 2 shows a ton NMR spectrum. The integral of the four hydrogen peaks (A, B, C and D) is Similar ratios were given for the two samples of capsular polysaccharide (1 for A: B: C: D = 10.2: 28.3: 53.8: 7.7, and at 2, A: B: C: D = 1 3.8: 31.1: 46.2: 8.9). These results are from El. Rakti The structure of cps produced by the company is Type 3S. Naturally occurring in pneumonia Proof that they are the same as the ones. FIG. 8 shows the L. expression of type 3 cps. Immunization with a recombinant strain of Lactis 1 shows the anti-type 3 cps-IgG serum antibody response in isolated mice. After immunization Mean titers of cps-specific antibodies on days 21 and 35 are untreated group mice Significantly (p = 0.004). Error bars are standard deviations from the mean Represents These results indicate that cps-expressing L. Immunization with Lactis Elicits a specific anti-cps serum antibody response. FIG. 9 shows (1) Type 3S. Pneumonie (60 hours at 335K) and (2 ) El. Of purified cps from Lactis strain 1619 (44 h at 320 K)¹³C 3 shows an NMR spectrum. Both spectra were obtained on a 600 Mhz instrument. Both In the spectrum, the position of the carbon peak is the same. FIG. Four hours after the challenge at Numony, L. as described in Example 6. Mice immunized with Lactis 1619 or S. present in BAL from control mice. The challenge of Nyumonnier The percentage relative to the seed is shown. FIG. Four hours after the challenge at Numony, L. as described in Example 6. Mice immunized with Lactis 1619 or S. in BAL from control mice. Figure 5 shows bacterial recovery of P. monkey. Figure 12: a) Oligonucleotides used to synthesize long DNA fragments Primers from all nine serotypes of Group B Streptococcus Primers containing the capsular biosynthesis gene, and b) from six different serotypes of GBS 1 shows a restriction endonuclease digest of the obtained PCR product.Example 1 S. L. pneumoniae type 3 cps biosynthetic pathway enzyme. Quotes at Lactis Loaning and expression i) Preparation of DNA fragment encoding biosynthetic pathway enzyme Streptococcus pneumoniae strain WU2 producing type 3 polysaccharide capsule Genomic DNA from cells grown in BTS medium (Difco) containing glucose Prepared by standard methods. This bacterium is isolated from a Juan centrifuge (Model CR31). 2) Recovered from the growth medium by centrifugation at 3000 g for 10 minutes in 0 μl of DNA prep buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM E DTA, 25% w / v sucrose) to which 10 μl of 10% w / v 20m of sodium dodecyl sulfate (SDS) and proteinase K (Sigma) 0.6 μl of a g / ml solution was added. Incubate this solution at 37 ° C overnight. The DNA was then converted to chloroform, phenol and isoamyl alcohol (IAA). ) (24: 24: 2) twice and chloroform: IAA (98: 2) And extracted twice. Add 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of absolute ethanol The genomic DNA was precipitated for 20 minutes at -70 ° C. DNA The pellets were collected by centrifugation, and 100 μl of TE (Tris-HCl pH 8.0, (1 mM EDTA), 20 μl of 4 M lithium chloride and 2.5 volumes A second precipitation was performed by adding ethanol. Purified genomic DN A was finally resuspended in TE and stored at 4 ° C. The DNA fragment encoding the gene required for type 3 capsule biosynthesis was then used as a template. Es. Type 3 capsular loci have been published using Pseudomonas genomic DNA Oligonucleotide primers (sense primer S1 and antisense (Cps opero) obtained by PCR using sense primer A2 or A3) See Figure 1 for primer and primer sequences). The sense of this PCR and Antisense primers have their 5 'to facilitate the subsequent cloning step. It was designed to include a BamHI restriction endonuclease site at the end. This PCR reaction mixture was prepared using Taq supplied by the manufacturer (Stratagene). Approximately 15 ng of chromosomal DNA from strain WU2, 20 pmo in plus reaction buffer l of each primer, 250 μM of each dNTP, 2 units of Taq polymerase And 1 μl of Taq Extender (Stratagene). Denaturation step (95 ° C. for 30 seconds), annealing step (60 ° C. for 60 seconds) and polymerizer After 35 cycles including a step of elongation (180 ° to 240 seconds at 72 ° C.), The PCR products obtained with the mer S1 + A2 and S1 + A3 are purified and standard methods Of the size expected by agarose gel electrophoresis using 3 and 44 kb). ii) Construction of pTREX and pTREP Multiple Clones for Putative RNS Stabilizing Sequence, Translation Initiation Region, and Target Gene Synthetic oligonucleotides encoding the coding site were 150 mM NaCl. Each oligonucleotide in 200 μg of each oligonucleotide in 200 μl of 1 × TBE containing 20 μg of nucleotides were annealed by boiling and cooling at room temperature. Annealed oligonucleotide was 250 μM deoxynucleotide triphosphate And 1.5 mM MgCl_TwoTf1 DNA polymer in 1 × TF1 buffer containing For 1 minute each at 35 ° C., 45 ° C., 55 ° C. and 65 ° C .; Extended at 10 ° C. for 10 minutes. Sense and antisense oligonucleotides include: To facilitate further cloning, NheI and B Recognition sites for amHI were included. The resulting double-stranded DNA is cut with NheI and BamHI to obtain a pUC19 derivative. Between the XbaI and BamHI sites in pUC19NT7 did. This pUC19NT7 is closed between the EcoRI site and the HindIII site. Included the p7ET1 derived T7 expression cassette (17). Obtained The resulting construct was named pUCLEX. The complete expression cassette in pUCLEX is then cut with HindIII and Removed by blunting, then cutting with EcoRI followed by pIL253 The vector pT was cloned into EcoRI and SacI (blunt) sites. REX was created. Plasmid pTREP was constructed as follows. That is, bee. Liheniv A rho independent terminator from the 3 'end of the Olmis penicillinase gene, PUC reverse sequence primer, multiple cloning sites for promoter insertion and And the universal translation stop sequence (ie, the stop code for all three reading frames). Synthetic oligonucleotides encoding (d) were annealed as described above. Ani Digested DNA fragment with EcoRV and BamHI and digested with EcoRI. Cloned into the saved pTREX, blunted and then cut with BamI . The resulting plasmid was named pTREP and was used as described below. Pneumo It was used for the cloning of the cps operon gene from the fly. Details of pTREP Are shown in FIGS. 2 and 5. iii) S. Cloning of the cps operon gene from Pneumoniae into pTREP Learning Purified DNA fragments (cps1 and cps2 are shown in FIG. 5) were used under standard conditions. Digestion with BamHI, Ligation Kit (Amersham) and manufacturer Cleavage, dephosphorylation and purification with BglII and BamHI using recommended conditions Ligation to plasmid pTREP. This ligated DNA was described previously (1. 6) L. competent (acceptable). Electro during Lactis Transform to select for transformants that carry the plasmid (electroporation) and carry the plasmid. Transformants were recovered on GM17 agar containing 5 μg / ml erythromycin. Profit S. 3 and 4 kb DNA fragments of the Pneumoniae type 3cps locus Plasmids carrying pTREP-CPS1 and pTREP-CPS, respectively. No. 2. These are shown in FIG. cloned into pTREP-CPS1 The 3 kb pneumococcal DNA fragment was ligated with UDP glucose dehydrogenase and C encoding capsular polysaccharide synthetase and their associated promoters It contains the ps3D and cps3S genes (FIG. 5). in pTREP-CPS2 The pneumococcal DNA fragment cloned in is approximately 1 kb long and has cps3D and Glucose-1-phosphate uridyl transferase in addition to cps3S (Fig. 3). The cpsM gene is clonin Did not. This is because this enzyme is Expected to occur naturally in Lactis Because it was This expectation was correct, as shown in Example 2 below. L. carrying plasmids pTREP-CPS1 and pTREP-CPS2. The Lactis strains were named UCP1618 and UCP1619, respectively. these Production of polysaccharide capsules by strains of bacteria showed a thin dry smear of bacteria on glass slides. And can be visually observed by light microscopy after staining with serum and nigrosine.Example 2 El. Capsular polysaccharides produced by Lactis are specific for pneumococcal cps type 3 Is recognized by a specific antiserum. El. Lactis strains, UCP1618 and UCP1619, were cultured fresh overnight. 0.5% w / v glucose (GM17) and erythromycin (5 μg / ml) ) Was diluted 100-fold in M17 broth containing the mixture and grown at 30 ° C. for 3 hours. Next The bacterial culture was concentrated approximately 10-fold by centrifugation and 5 μl Spotted on a piece of cellulose and dried. Vector pTREP as negative control L holding. The Lactis strain is treated similarly and suitable for nitrocellulose filter paper. Used. As previously described (12), immunization with type 3 cps antiserum was performed. No blotting was performed. However, the use of bovine serum albumin as a blocking agent Instead, dry milk (2% w / v) was used. As a result, type 3 cps anti-blood Qing is L. Lactis strains UCP1618 and UCP1619 spot on top Specifically binds to the portion of the filtered paper, Lactis itself (negative contrast ) Showed no binding. As expected, the antiserum was The pneumococcal cps purified by winging is detected (results not shown). Stock U It is clear from FIG. 6 that CP1619 contains more capsular material than strain UCP1618. It is easy. The results are reproducible and pTREP-CPS1 and pTRE L. including P-CPS2. In other clones derived in another Lactis experiment Was observed. These results indicate that only the pneumococcal cps3D and cps3S genes are L. pneumoniae. Easy Indicates that it is required for Type 3 cps production by Tis. Most produced The amount of capsule can be increased by including the gene for cps3U in the same plasmid. Can be increased sharply. By inference, encodes phosphoglucomutase The gene (named cps3M in FIG. 3) was L. This exists in Lactis Must be present in sufficient amounts to allow efficient capsular production in the host. I However, the pneumococcal cps3M gene has the same positives as other capsular biosynthesis genes. L. by giving on E. mid. It is possible to further increase the yield of lactis capsules. And may be possible.Example 3 Recombinant L. Proton nuclear magnetism of type 3 polysaccharide capsule produced by Lactis Resonance (NMR) analysis El. The capsular polysaccharide produced by Lactis is a MOPS buffered medium (MO PS, Alexis Kou, 6.7 g / liter, pH 7.2, East Knight Rogen Base, Difco, 25.11 g / l, casein enzyme hydrolyzate, Sigma, 2 g / liter, glucose 0.5% w / v and erythromycin 5μ g / ml) grown overnight. Purified from Lactis strain UCP1619. Add 0.25 volume of 100% trichloroacetic acid and add Juan centrifuge (Model C). R312) by centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes to remove The protein was removed. cps is precipitated with an equal volume of acetone and centrifuged Centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes in a centrifuge (model CR312). Collected. Then, L. 5% (w / v) natoacetate cps from Lactis Redissolved in lium, and the remaining protein was mixed with a mixture of chloroform and butanol ( 5: 1) to remove. Re-use this cps with an equal volume of ethanol Precipitate, wash once with both ethanol and acetone, and place in deionized water. Redissolved. The cps was then lyophilized for long term storage. El. Purified cps produced by Lactis strain UCP1619 and S. aureus. D Highly purified type 3 cps commercial product from Mercury (Merck Sharp) Dome) at a concentration of about 3.3 mg / ml in heavy water D_TwoResuspend in O and DRX At 320 ° K in a 500 NMR spectrometer (Bruker Kow, Germany) The proton NMR spectrum was analyzed. Protons in native pneumococcal and Lactococcus-derived cps preparations The NMR spectra are very similar. Small peaks associated with each hydrogen group Small variations in the relative strength of the rocks are most likely attributed to differences in sample viscosity (FIG. 7). Similarly, these samples¹³C-NMR spectra are peaked at the same position. Show These results indicate that the molecular structures of the repeating units of the two polysaccharide samples are identical. Provide evidence that they are the same (Figure 9).Example 4 Isolated capsular polysaccharides and capsulated L. Study of immune response to Lactis Ultimate Recombinant L. expressing cps. Lactis and S. Purification from pneumoniae Immune response to cps was measured intraperitoneally (i / p) of inbred strains of BALB / c mice Comparison was made by inoculation. Expression of cps in mice in groups of 5 without adjuvant Recombinant L. Various doses of Lactis (strain UCP1619) or S. lactis. D Immunized subcutaneously with an equivalent amount of purified type 3 cps antigen Was. Blood samples were collected on days 7, 21, 35 and 49 after immunization and their anti-cps Antibody levels were measured by ELISA. In ELISA, microtiter plates (Nunc, Maxisorb) are placed on each plate. S to the well. Adding a 50 μg / ml solution of cps from Pneumoniae and By incubating at 37 ° C. for 5 hours and 4 ° C. overnight, S.D. new Coated with purified cps from Monier. Non-specific protein binding moiety is P Add 100 μl of 1% w / v BSA in BS and play for 1 hour at room temperature The cells were blocked by incubating. This plate is washed with a washing buffer (WB, PBS, 0.05% (w / v) Tween). After washing three times in 20), serum samples diluted with 1% w / v BSA in PBS were used. Added to this plate (50 μl / well) and incubated for 2 hours at room temperature . The plate was then washed 5 times with WB and 1% BSA (50 μl / well) Antibody diluted with WB containing anti-mouse IgG-alkaline phosphatase Conjugate) at room temperature for 1.5 hours. Finally, put this plate on W B five times and the substrate nitrophenylphosphine in diethanolamine buffer. Incubated at 405 nm using an ELISA reader. Assayed by wavelength. For each serum sample, a 50-fold dilution of pooled sera from previously immunized mice Using the ELISA data, an endpoint titer showing the same absorbance (405 nm) value as Calculated. On days 7, 21, 35 and 49 after immunization, FIG. 7 shows a bar graph showing the mean endpoint titer of specific anti-cps antibody levels against mouse FIG. These results indicate that L.p. expressing purified or equivalent cps. Lactis Immunization of mice with a single dose of caspase resulted in significant cps-specific IgG serum antibody responses Obviously it will be withdrawn. On days 21 and 35 after immunization, The average cps-specific antibody titer of all mice in the loop was better than the untreated one (P = 0.004, all statistical analyzes were parameter-free Calculated using the Tuney U test). On day 21, express equivalents of cps L. IgG antibody tags from a group of mice immunized with purified Lactis cps There were no significant differences between the iter (p> 0.05). On day 35, 5 μg cps (expressed by L. lactis, whether purified or not) Cps antibody titer in the group of mice given Significantly higher than the immunized group (p = 0.048). After immunization By day 49, cps-specific serum IgG antibody titers from immunized group mice 始め began to decrease to a level that was not significantly different from the untreated group.Example 5 El. Clones of other pneumococcal capsular operon genes for expression in Lactis Ning The ORF located upstream of the type-specific cps biosynthesis operon of other serotypes High homology between pneumococcal DNA sequences within the open reading frame There is. This is the published DNA from the capsular locus of a type 3 pneumococcal isolate. Sequence (18, 19) and type 14 (Nuiten et al., Genbank accession number X857) 85) and comparison with other serotypes such as 19F (20). This D The homology of the NA sequence is the cps production from other serotypes of pneumococci whose sequence is unknown. Design primers for reverse PCR amplification of DNA fragment encoding synthetic operon (See below). In addition, the conserved DNA sequence referred to above is capable of encapsulation of other Gram-positive bacteria. It has also been found adjacent to the adult operon (21 and references therein). this child Suggests that the method is applicable to bacteria with a wide range of capsules. In the examples shown here, it is predicted that the pneumococcal serotype 4 cps biosynthetic operon will be included. One envisaged fragment was amplified by inverse PCR. Genome from pneumococcal serotype 4 DNA was prepared as described in Example 1. Primers S2 and A4 are pulled up Designed using published conserved sequences used and published methods (22) And used for inverse PCR. Approximately 13 kb DNA fragment was amplified by PCR. (Denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 60 ° C for 60 seconds, extension at 72 ° C for 8 minutes) 30 cycles between, and a final extension period of 10 minutes at 72 ° C. ). The DNA sequence of this fragment encodes the type 4 operon cps biosynthetic enzyme It is expected that.Example 6 1.L. for immunization. Preparation of Lactis El. Lactis 1601 (with plasmid) and L. Lactis 16 For growth of 19 (with capsule), powdered M17 broth and glucose were added to d dH_TwoDissolve in O, autoclave, then cool. erythromycin( 5 μg / ml) is added to this medium. The bacteria from the frozen stock are used to inoculate a 100 ml volume of medium. Shaking in Incubate at 30 ° C. overnight in a cuvette. This bacterium is grown at 10,000 × g at 4 ° C. for 1 hour. Separate from the medium by centrifugation for 0 minutes. The cells are resuspended in PBS and Wash twice by centrifugation in S. Measure the optical density of the last suspension at 405 nm. To evaluate the colony forming unit. Cell concentration to desired concentration adjust. 2.Immunization procedure 5 × 10 Lactococcus lactis 1619⁹CFU / ml concentration and 0 . 1 ml total volume (5 × 10⁸CFU) and adjusted to 6 BALB / c male SPF Each mouse (7 weeks old) was administered by subcutaneous injection using a 26 gauge needle. Mau Were immunized on days 0, 14, and 28 with the same concentration of live bacteria. Contrast Ma The mice were 6 untreated animals. 3.Intratracheal bacterial challenge in mice Bacterial challenge using Streptococcus pneumoniae NTCC12695 The day went on day 42. Mice (BALB / c) were injected intravenously with saffan Intoxication (0.15 ml, 20 mg of alphadon in PBS per kg body weight, pitoma (N-Moor, Nth Ryde, NSW, Australia). Dew in trachea from mouth 22.5G catheter with needle retracted into plastic (telephone) (Lumo, Tokyo, Japan) was inserted into the tracheal opening to a distance of 0.5-0.75 cm. The needle was removed from the catheter and the S.D. Pneumo 20 μl volume of Nie (5 × 10^Five(Including colony forming units). This species Bacteria caused by sealing a 1 ml syringe into a hub in a catheter Sprayed twice with 0.3 ml air. 4.Sample recovery after bacterial challenge Overdose of pentobarbital sodium by intraperitoneal injection Killed Us. 0.2 ml of undiluted sodium pentobarbital Injections were made using a 26 gauge needle on a ml syringe. 1.5ml Eppendorf Blood by cardiac puncture using a 1 ml syringe and a 26 gauge needle placed inside Collected and allowed to clot to collect serum. Exposing the trachea through the neck and joining the back Dissect by cutting the tissue, cut near the larynx, and insert into the trachea. Using a 20 gauge cannula with a 1 ml syringe inserted, place 0 . Bronchoalveolar lavage (BAL) by injecting and withdrawing 5 ml of PBS I got The recovered BAL was placed in a 1.5 ml Eppendorf. . About this BAL, blood agar plate for CFU measurement (blood agar The presence or absence of bacteria was evaluated by applying a 10-fold serial dilution on the plate). Was. Centrifugation at 450 xg for 10 minutes at 4 ° C (Juan BR 3.11, Centna (Saar, France) and store at -80 ° C until needed did. Place 100 μl of BAL in centrifuge and place 1 on glass slide Centrifuged for 0 minutes. Stain slides with Diff Quick and discriminate leukocytes Population from 3 fields per slide, average% counts per animal, The average% count per group was then determined. BAL at 4 ° C, 1000 rpm centrifugation at 10 m for 10 minutes (Juan BR 3.11, St Nazar, France) did. Obtain the supernatant and store at -80 ° C until needed. 5 pellets Resuspended in 0 μl PBS and 50 μl methylene blue. Hemocytometer with the white blood cells And the calculations were adjusted for BAL removal for the above analysis. .result S. L. expressing a polysaccharide capsule homologous to P. pneumoniae NTCC12695. In animals immunized by subcutaneous injection of Lactis 1619, bronchoalveolar lung Enhanced clearance of bacteria from the region was shown. S. used to infect the lungs. Emits a polysaccharide capsule that is homologous to the Pneumoniae strain Elle appears. BAL of animals immunized by subcutaneous injection of Lactis 1619 Inside, the total bacterial count recovered was low.Example 7 Based on the published map (1) of the chromosomal region of the type III GBS operon, We have developed capsular growth from all nine serotypes of Group B Streptococcus. Used to synthesize long DNA fragments (by PCR) containing synthetic genes Oligonucleotide primers (Figure 12a) were designed. PCR primer is c Published sequence for the psF gene (EMBL database accession number SA19) 899) and cpsC gene (EMBL database accession number SACPSABD) ). Genomic DNA from eight different capsular serotypes of GBS DNA fragments ranging in size from 13 kb to 16 kb were used in PCR reactions. Therefore, it was amplified. The PCR reaction is performed by Tack Plus System (Stratagene L.) TD), about 150ng of genomic DNA as template and recommended by manufacturer Performed with 40 pmol of each primer in the buffer provided. This reaction is geno Incubate at 95 ° C for 5 minutes to denature DNA Denaturation for 2 sec, annealing at 60 ° C for 1 min, extension at 72 ° C for 15 min. , Then denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 1 minute, 72 ° C 5 cycles of 15 minutes extension at 95 ° C., then denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, 1 minute at 65 ° C. Annealing for 25 minutes at 72 ° C. for 15 minutes and 1 minute at 72 ° C. Incubated for a final extension period of 0 minutes. Restriction endonucleases of PCR products from six different serotypes of GBS As expected, digestion of some of the common capsular biosynthetic operons was It was shown to contain the fragment and other fragments specific for its serotype (FIG. 12b). Generate The above fragments were cloned and directly analyzed to identify genes involved in capsule biosynthesis. Tangent sequencing can be performed. An essential combination of these enzymes is the GBS capsule A protective epitope of cps from a polysaccharide or two or more GBS serotypes is contained therein. L. producing existing recombinant polysaccharides. To create a harmless strain of Lactis For example, L. Can be cloned into a lactis expression plasmid is expected.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:44 Ｃ１２Ｒ 1:44 1:46 1:46 1:225） 1:225）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者リチャードウイリアムファラルページ英国、シービー２１キューピー、ケンブリッジ、テニスコートロード、デパートメントオブパソロジー、ユニバーシティオブケンブリッジ (72)発明者クリストフフランソワガイギルバート英国、シービー２１キューピー、ケンブリッジ、テニスコートロード、デパートメントオブパソロジー、ユニバーシティオブケンブリッジ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // (C12N 1/21 C12R 1:44 C12R 1:44 1:46 1:46 1: 225) 1: 225) C12N 15/00 ZNAA (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ , DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT , UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Richard William Farrarpage UK, CB21 Kewpie, Cambridge, Tennis Court Road, Department of Pathology, University of Cambridge (72) Inventor Christophe François Guy Gilbert UK, CB21 Kewpie, Kembridge, Tennis Court Road, Department of Pathology, United Bashi tee of Cambridge

Claims

[Claims] 1. Coding one or more enzymes responsible for the production of polysaccharide immunogens from pathogenic bacteria Non-invasive or non-pathogenic transformants or transfected DNA Lamb positive bacteria. 2. The bacteria are Listeria inocua, Staphylococcus xylosus, Tafilococcus carnosus, Streptococcus gordoni, Lactococca The method according to claim 1, which is S.species or Lactobacillus species. Non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacteria. 3. The non-invasive or bacterium according to claim 2, wherein the bacterium is Lactococcus lactis. Is a non-pathogenic Gram-positive bacterium. 4. The non-invasive bacterium according to claim 1, wherein the bacterium is an attenuated strain of a gram-positive pathogenic bacterium. Gram-positive bacteria that are pathogenic or non-pathogenic. 5. The non-invasive bacterium according to claim 4, wherein the bacterium is Listeria monocytogenes. Or non-pathogenic Gram-positive bacteria. 6. 6. The polysaccharide immunogen forms a polysaccharide capsule. A non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacterium according to any one of the preceding claims. 7. Non-invasive or non-pathogenic gram according to any one of claims 1 to 6. A positive bacterium whose DNA is Streptococcus pneumoniae, group B streptococci, other species of streptococcus that cause disease in animals and humans C., Staphylococcus with capsular and other Gram-positive pathogens, e. Ko Capsule of Haemophilus influenzae or Neisseria meningitidis From Neisseria gonorrhea, Bacteroides Fragilis or other such gram-negative pathogens, A non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacterium according to any one of claims 1 to 6. . 8. The DNA is derived from Streptococcus pneumoniae A non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacterium according to claim 7. 9. The DNA is at least one complete source responsible for the production of the polysaccharide immunogen. Non-invasive according to any one of claims 1 to 8, which comprises peron or Nonpathogenic Gram-positive bacteria. 10. One or more enzymes whose DNA is responsible for the production of two or more polysaccharide serotypes The non-invasive method according to any one of claims 1 to 8, which encodes Nonpathogenic Gram-positive bacteria. 11. A method for producing a polysaccharide immunogen of a pathogenic bacterium, the method comprising producing the polysaccharide immunogen. Non-invasive or non-pathogenic gram with DNA encoding one or more enzymes responsible for One comprising the step of transforming a positive bacterium and / or culturing this bacterium Law. 12. Claim 11 modified with one or more of the features of claims 1 to 10. the method of. 13. A non-invasive composition according to any one of claims 1 to 10 for use in medicine. Aggressive or non-pathogenic Gram-positive bacteria. 14． A non-invasive or non-pathogenic gram according to any one of the preceding claims. A vaccine comprising a positive bacterium. 15. 15. The vaccine according to claim 14, which is suitable for nasal or oral administration. 16. This is a method for mainly performing vaccine treatment against pathogenic bacteria having a polysaccharide capsule. Thus, a non-invasive or non-pathogenic gram according to any one of claims 1 to 10. Administering to the subject an effective amount of a positive bacterium. 17． A method for inducing mucosal immunity against pathogenic bacteria having a polysaccharide capsule, A non-invasive or non-pathogenic Gram-positive cell according to any one of claims 1 to 10. Administering to the subject an effective amount of the bacterium. 18. 18. The method according to claim 16, wherein the bacterium is administered via a mucosa. The method described. 19. 19. The method according to claim 18, wherein the bacterium is administered nasally or orally. . 20. Coding one or more enzymes responsible for the production of polysaccharide immunogens from pathogenic bacteria A DNA construct comprising the DNA to be loaded. 21. Claim 20 modified by one or more of the features of claims 9 and 10. DNA construct as described. 22. A vector comprising the DNA construct according to claim 20 or 21. 23. 23. The vector according to claim 22, which is a plasmid vector. 24. Transformation or transfection of non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacteria The construction according to claim 20 or claim 21 or the construction according to claim 22 or claim 2 Use of the vector according to 3. 25. 25. The method according to claim 24, wherein the method is modified by one or more of the features of claims 2 to 8. use. 26. 2. The preparation of a vaccine against pathogenic bacteria having a polysaccharide capsule. Use of a non-invasive or non-pathogenic Gram-positive bacterium according to any one of claims 10 to 10. . 27. The use according to claim 26, wherein the vaccine is suitable for nasal or oral administration. for.