【発明の詳細な説明】
細胞培養システム
この発明は、細胞培養法に用いられる基質及び容器に関するものである。この
発明は特に、細胞を増殖させ次いで細胞の層を必要とする患者へ移着するための
基質に関するものである。
国際特許出願第ＷＯ９１／１３６３８号公報には、１つの面に固定された培養
哺乳類細胞の層を有するポリマー材料層を備えた創傷被覆材に関する記載がある
。そのような被覆材は、火傷や皮膚供与部位のような、部分的に厚くなった傷の
治療に用いるのに適している。細胞は好ましくは、生検により得られた自家皮膚
細胞からまたは他の供給源から培養することのできる上皮細胞である。細胞は、
それが付着されるポリマー基質の存在下で培養されて増殖する。この基質が患者
の用意された部位に適用されるときに、その細胞は、基質から患者へ移着されて
、表皮細胞の層を形成するために増殖し続ける。記載された被覆材は、ポリマー
の被覆材基質の表面に接触している細胞を培養し、培地からその基質を取り外し
、次いで、その細胞が患者の傷に接触するようにその被覆材を患者に施すように
される。
この発明の１つの目的は、細胞の培養、細胞の基質への固定、及び細胞の患者
への移着を促進するために、基質システム及び／または培養容器の改良された形
態を提供することである。
この発明によれば、
（ａ）哺乳類細胞が培養されるための液体培地を収容するのに適した、内面
及び外面を有する容器と、
（ｂ）細胞毒性のない培養基質材であって、培養された哺乳類細胞が付着す
るための第１面及びその反対側の第２面を有する培養基質材を備えた創傷被覆材
システムとを備え、
この創傷被覆材システムが、基質材の第１面が容器の内部に露出するように、
容器の内面の少なくとも一部に取り外し可能に固着されている細胞培養システム
が提供される。
この容器は、長方形または、例えば六角形のような多角形の形状と、平坦な２
つの対向壁と、側壁または、側壁の一方に設けられた閉鎖可能なアクセス部を有
しその間に延出する壁とを一般に有する公知の種類の培養フラスコの外観を都合
よく有していてもよい。これに代えて、容器は、閉鎖可能なアクセス部または蓋
を任意に有する皿や、ペトリ皿または円筒のような、他のいかなる適切な形状を
有していてもよい。容器は、容器の内部にアクセスすることのできる剥離可能な
蓋を有していてもよい。容器は、細胞に対して毒性がなく、液体を通すことがな
く、かつ、好ましくは殺菌することのできる材料から形成される。容器が形成さ
れる材料は透明であるのが好都合であるが、このことはこの発明を遂行するのに
必須ではない。容器は、部分的に透明または半透明のものでも、部分的に不透明
のものでもよい。容器に適した材料は、ポリスチレン、ポリエステル（例えば、
ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート）、一方または他方の
材料のコポリマー、例えばポリエ
チレンテレフタレート−コ−イソフタレートのコポリマー、ポリカーボネート、
アクリル材料、ポリエーテルイミド、ポリオレフィン、エチレンエチルアクリレ
ートコポリマー、エチレンメチルアクリレートコポリマー、エチレン酢酸ビニル
コポリマー、及びその他の合成ポリマーを含んでいる。
この容器は、実質的に水密の容器を形成するために互いに嵌まり合う２つまた
は３つの部材を備えていてもよい。そのような部材は基部と蓋を形成してもよい
。これらの部材は締まり嵌めを形成するために成型されてもよい。例えば、容器
の１つの形態は浅い皿と深い蓋とを備えている。基部は、基部の周縁の周りまた
は基部の縁の近傍に形成された成型リップ、またはその蓋の一部と締まり嵌めを
形成してもよい縁を有する中央隆起部分を有している。深い蓋は、平坦な上壁と
、基部の成型リップまたは隆起部分とで締まり嵌めを形成するような形状にされ
た垂下側壁とを有している。培養基質は、基部の平坦部に、任意の支持層によっ
て取り付けられている。基部と蓋とは、漏れを防ぐために、収縮包装またはヒー
トシールによって互いにシールされていてもよい。蓋は培地と細胞とを容器内に
導入するためのアクセス部を有しているのが好ましい。容器は、上方へ延出する
側壁と浅いかまたは平坦な蓋とを有する深い基部から同様に形成されてもよい。
このような形態は容器の水密性の点で有益であると思われる。側壁にはリップが
任意に存在してもよく、または、協働する２つのリップが容器の各部に１つずつ
存在してもよい。
容器は、その残り部分から剥離可能な１以上の壁を含んでいてもよい。この剥
離可能な壁は、ヒートシールまたは剥離可能な接着剤により、容器の残り部分に
シールされてもよい。このシールは、防水性のものでなければならず、また、容
器内へ細胞毒性のある物質が導入されないようなものでなければならない。培養
基質は剥離可能な壁の内面または壁に配されるのが好ましい。好ましい形態では
、剥離可能な壁は、容器から剥離されると、培養基質のための支持層を形成する
。この代わりに、支持層は、培養基質の第２面に取り付けられた一方の面と、剥
離可能な壁の内面に取り付けられた他方の面とを有している。
容器は、代わりに、必要なときに取り外し可能な部分を形成するように切り取
ることのできる単一片として形成されてもよい。この形態では、容器には、切取
操作を補助するための案内線または脆弱化線が設けられてもよい。
容器の内面に取り外し可能に固着されるこの創傷被覆材システムは細胞培養基
質材を備えている。適切な細胞培養基質材は、国際特許出願第ＷＯ９１／１３６
３８号公報で挙げられたものを含んでいる。すなわち、それは、ポリエステル、
ポリプロピレン、例えばエチレン−酢酸ビニルコポリマーのような酢酸ビニルの
混合物またはコポリマー、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリブタジエン
、例えばサーリン（ＳＵＲＬＹＮ，登録商標）のようなポリエチレンイオノマー
、またはこれらの化合物を含むコポリマー及び混合物である。
これに代えて、親水性ポリウレタンのような親水性ポリマー
が培養基質を形成してもよい。培養基質は、培養された哺乳類細胞が付着するた
めの第１面を有している。この面は、その性質を変えるために、コラーゲン基物
質のような別の物質によるコーティングや、例えばコロナ放電またはプラズマ処
理のような他の手段により、処理されてもよい。基質材はポリマー材料からなる
フィルムであるのが好ましい。基質材は身体の輪郭線に比較的合致することので
きるものであるのが好ましい。基質は、連続的なものであってもよく、窓孔が開
けられてもよい。
この創傷被覆材システムは、細胞培養基質材から形成された１以上の面を有す
る被覆材部分を備えていてもよい。したがって、この被覆材システムは、２層以
上の材料層を具備する被覆材を備えていてもよい。そのような被覆材の１つの層
の少なくとも１つの面は、したがって、培養された哺乳類細胞が付着するために
、培養基質面の第１面を形成するであろう。
この創傷被覆材システムは、培養基質材に、好ましくはその基質材の第２面に
、少なくとも培養基質の縁の領域またはその縁に沿ったあるいは近い領域で取り
外し可能に取り付けられる支持層をさらに備えていてもよい。この支持層は、基
質材の少なくとも縁の部分の周りで培養基質を支持するように、枠の形態を有し
ていてもよく、あるいは、前記第２面の少なくとも主要部を覆って基質材の第２
面に取り付けられる連続状のシート材またはフィルム材であってもよい。この支
持層は、その基質材の縁の１つ以上の箇所でその縁を越えて延びていてもよい。
この支持層は、容器の壁の少なくとも一部に形成されていても
よく、あるいは容器の内面に取り外し可能に取り付けられていてもよい。
この発明の好ましい実施態様では、この創傷被覆材システムは、培養された哺
乳類細胞が付着するための第１面と、培養基質のための支持層を形成する連続状
のポリマーフィルムの第１面に少なくともいっそう大きい部分にわたって取り外
し可能に取り付けられる反対側の第２面とを有する、細胞培養基質材の層を備え
ていてもよい。この支持層の反対側の第２面は、細胞培養容器、例えば培養フラ
スコの内面に取り外し可能に取り付けられている。
培養基質は、過度の困難性を要することなく培養容器の内面からその基質を取
り外すことのできる適切な手段であればどのような手段によって、同内面に取り
付けられてもよい。そのような手段は、細胞の増殖に対して毒性がないかまたは
その細胞に触れないような接着性材料を含んでいてもよい。細胞毒性物質を潜在
的に容器内へ導入するのを避けるために、非接着性取付法が用いられてもよく、
またそれが好ましい。そのような非接着性手段は、ヒートシール、同軸押出法、
容器への基質のラミネート処理を含んでいてもよい。より抜きの方法は、用いら
れる特別の材料に適したものを選ばなければならない。
培養基質は好ましくは、細胞培養液が容器へ導入されるときにその基質の少な
くとも実質的部分が平坦さを維持するような方法で、容器の内面または支持層に
取り付けられるべきである。これは、培養液の泡が基質と容器との間で形成され
るようにす
るために、培養基質の表面はしわになったり変形したりすべきではない、という
ことを意味する。これは、基質の表面における起伏は、それがどのようなもので
も、他よりも低い基質の領域に細胞を溜めることを助長するという理由による。
大抵の場合、このことは、いくつかの細胞培養法が平坦でない培養基質に有利で
ありまたは寛大であっても、望ましくない。容器が円筒として形成されている場
合、基質は、それが平坦ではなく湾曲するように、容器の円筒状内面の周りに取
り付けられる。
これらの方法は、培養基質材を支持層に結合するため、あるいは支持層を培養
容器の内面に結合するためにもまた、適しているかも知れない。
細胞培養システムの代わりの形態では、創傷被覆材システムは、容器内に設け
られた対応面に弾性的に係合するための係合面を具備した支持部を備えている。
支持部か容器かのどちらかの係合面は、それそれの支持部または容器から延出す
る突出部の面であってもよい。係合面の他方は溝の部分を形成してもよい。支持
部は、使用時に創傷被覆材システムに接触する被覆材支持部分と、係合面を含む
係合部分とを含むように形成されたポリマー材料の層を備えているのが好ましい
。この支持部は、支持部が容器の係合面から係合解除するときにつかむための把
手手段をさらに備えていてもよい。
支持部は、創傷被覆材システムに接着されていてもよく、接着されていなくて
もよい。支持部は、創傷被覆材システムを例えば容器の基部に対して平坦な形態
に保持するように機能し
てもよい。これに代えて、支持部は、創傷被覆材システムの少なくとも一部に、
好ましくは被覆材システムの縁の領域に、接着されていてもよい。支持部は、枠
または枠組の外観を有していてもよく、容器内に収容された培養液によって培養
基質にアクセスできる他の構造にされていてもよい。
この形態のシステムの１つの例では、容器は、上方へ延出する側壁を有する多
角形の基部と、任意に蓋とを備えている。支持部は、容器の基部に類似した多角
形形状と寸法とを有していてもよいポリマーフィルムの半剛性層から形成されて
いる。支持部は、把手を形成するために延出する１つの隆起部分である周囲の縁
またはフランジを有している。細胞培養基質を備えた創傷被覆材システムは、支
持部の表面に取り外し可能に固着されている。容器は、蓋または、側壁の少なく
とも一部の周りで側壁から内方へ延出する保持用リブを備えている。支持部は、
その隆起した周囲の縁またはフランジが保持用リブのすぐ下に位置し、それによ
って支持部の係合面を容器の係合面に係合させるように、容器の中に置かれても
よい。
被覆材システムは、患者に対する取り付けのための培養基質の正しい向きを指
示するために目印を含んでいてもよい。例えば、培養基質の反対側の第２面また
は支持層は、例えば、印刷、型押、または他の手段によって、そのように目印が
付けられてもよい。代わりに、支持層または基質材は色が付けられてもよい。
被覆材システムは、培養基質、支持層または両者に、把手ま
たはつまみを含んでいてもよい。２以上の把手またはつまみがあってもよい。把
手またはつまみは、支持層または培養基質が容器から取り外すことができるよう
にかつ／または支持層が基質から取り外すことができるように、配されてもよい
。つまみまたは把手は、支持層及び／または培養基質の１以上の縁にまたはその
近傍に配されているのが好ましく、また、使用者がつかんで引くように設計され
ているのが好ましい。もしも、培養基質に把手またはつまみが設けられていると
、把手またはつまみは取り外すことができる。把手またはつまみは、培養基質に
取り付けられる領域に、把手を裂き取ることができるように、ミシン目が入れら
れてもよく、またはその代わりに、把手またはつまみは、裏返し可能に基質に付
着されたり、クリップのような機械的手段により基質に取り付けられたりしてい
てもよい。把手またはつまみは、支持層または基質層と一体の部分として形成さ
れてもよく、被覆材システムの関連部分に別体としてかつ連なるように形成され
てもよい。把手またはつまみは、識別を補助するために、色付けされまたは目印
が付けられてもよい。
この発明によれば、
（ａ）容器の第１部分を形成するステップと、
（ｂ）容器の第２部分を形成するステップと、
（ｃ）創傷被覆材システムを形成するステップと、
（ｄ）取り外し可能な手段により、その創傷被覆材システムを容器の第１部
分に固着するステップと、
（ｅ）内面に固着された創傷被覆材システムを有する液
密性容器を形成するために、容器の第１部分及び第２部分をともに固着するステ
ップと
を備え、
第１部分及び第２部分を有する容器と、この容器の第１部分及び第２部分の少
なくとも一方に取り外し可能に固着されている細胞培養基質材を具備する創傷被
覆材システムとを備えた細胞培養システムの製造方法がさらに提供される。
第１部分及び第２部分は、溶接や接着によって、あるいは締まり嵌めによって
、互いに固着されてもよい。クリップ、収縮包装、テープなどの付加的な固着手
段が用いられてもよい。第１部分及び第２部分は互いから容易に取り外しできる
のが好ましい。
第１部分及び／または第２部分は、射出成形、ブロー成形、加圧成形、あるい
は押出成形のような他の手段、またはこれらの方法のどれかの組み合わせによっ
て形成されてもよい。
創傷被覆材システムは、常温ラミネート処理を含むラミネート処理、剥離可能
な接着、またはヒートシールのような解除可能な手段によって、容器の第１部分
及び／または第２部分に固着される。
この発明は、例示としてのみ、添付図面を参照しながら、以下でさらに説明さ
れる。
図１はこの発明に係る細胞培養システムの第１実施態様の分解斜視図である。
図２は図１に示された細胞培養システムの一部の斜視図である。
図３はこの発明の第２実施態様の分解斜視図である。
図４は図３に示されたシステムの一部の平面図である。
図５は図４の線５−５に沿う断面図である。
図６はこの発明の第３実施態様の分解斜視図である。
図７は図６に示されたシステムの一部の平面図である。
図８は図７の線８−８に沿う断面図である。
図９はこの発明のさらに別の実施態様の斜視図である。
図１０は図９のシステムの平面図である。
図１１は図１０の線１１−１１に沿う断面図である。
図１２はこの発明のさらに別の実施態様の一部の斜視図である。
図１３は図１２に示されたシステムの断面図である。
図１において、細胞培養フラスコ１０は浅い基部１１と深い「蓋」１２とを備
えている。蓋１２は、細胞に対する毒性のない透明品位のポリスチレンから成型
されたものであり、上壁１３と、そこから垂下する側壁１４とを有している。側
壁１４には、アクセス部１５と閉鎖具１６とが設けられている。側壁１４はその
下部周縁の周りにフランジ１７を含んでいる。
浅い基部１１は、蓋部分の周縁フランジ１７によって囲まれた領域に比べて少
なくともそれと同じ大きさの透明フィルム層１８を備えている。基部１１は、液
密性シールを生じさせるた
めに、例えばヒートシール手段または剥離可能な接着剤により、フランジ１７か
ら剥離できるような方法で蓋部分のフランジ１７にシールされている。
被覆材システムは、図２ａに示すように、フィルム１９に剥離可能に取り付け
られている。被覆材システムは、被覆材を形成する培養基質２０と把手部分２１
とを備えている。把手部分は、図２bに示すように、ミシン目２２に沿って引き
裂くことで被覆材から取り外すことができる。被覆材２０は、細胞が付着するこ
とのできる上面、すなわち、フィルム１９の近傍でない面を有している。この面
は例えば、コロナ放電によって処理されたエチレン酢酸ビニルのコポリマーフィ
ルムからなっていてもよい。基部１９に対向する被覆材２０の表面だけが細胞を
受けるので、被覆材は２以上の層が組み合わされたものでもよい。
この細胞培養システムは、フラスコ１０の基部フィルム１９に取り付けられた
被覆材システムと、フランジ１７にシールされた基部フィルム１９とを供給する
。このフラスコは殺菌されている。このフラスコは、表皮細胞を患者の必要領域
へ移着するために、１つの面に取り付けられた細胞の層を有する創傷被覆材を調
整するのに特に適しており、その調整の際に用いられてもよい。このような被覆
材を調整する適切な方法は以下に説明される。所望数の細胞がこの被覆材に取り
付けられると、培養液は口部１５を通して容器から流出させてもよく、また所望
であれば、その中に含まれた被覆材システムは、例えば通常の
塩類溶液を用いて洗浄してもよい。基部１９は次いで、被覆材システムへのアク
セスをするために、それを剥離することでフラスコから取り外してもよい。被覆
材２０は次いで、把手２１を持って剥離することで基部フィルム１９から取り外
すことができる。被覆材は次いで、細胞が付着している面を患者の方に向けるこ
とで、患者に当てがってもよい。把手２１は次いで、ミシン目線２２に沿って引
き裂いて外してもよい。
図３〜図５はこの発明の第２実施態様の様子を示す。この形態において、容器
は、基部の中央領域に位置する隆起部分２４を含む成型基部２３を含んでいる点
で、図１における容器とは異なっている。隆起部分の縁２５は、フランジ１７の
下面が基部の縁領域２７に載ることで、蓋部分１２の側壁１４の下縁２６の周り
に締まり嵌めを形成するような寸法にされている。基部２３は、細胞に対する毒
性のない材料、好ましくは透明な材料から成型されている。
この被覆材システム２８は、基部２３の中央隆起部分２４に配されており、把
手領域２１と枠状にされた支持層２９とを有する被覆材２０を備えている。支持
層２９は被覆材２０と基部２３との間に配されている。支持層２９は把手領域３
１を含んでいる。被覆材２０は、図５に示すように、枠２９によって境界の付け
られた領域における中央部分を覆って、取り外し可能に基部２３に取り付けられ
ている。被覆材２０の縁は、枠２９に取り外し可能に取り付けられ、かつ枠２９
によって支持されている。
フラスコには、壁１４への縁２５の締まり嵌めによって蓋１２に対して所定位
置に嵌められた基部２３が備えられている。フラスコの縁は、水密性フラスコを
形成するために、互いに収縮包装されまたはテープ貼りされているのが好ましい
。この被覆材システムが患者への適用のために取り外される必要のあるときには
、どのような上包装も取り除かれ、また、基部２３の取り外しを補助するために
、つまみまたは把手としての隅部３０を任意に用いて、基部２３が蓋１２から取
り外される。被覆材システムは次いで、把手２１・３１を引き上げて基部２３か
ら被覆材２０を剥離することで、取り外される。被覆材システムは次いで、その
被覆材を身体の所望箇所に運用するために、枠の最上部を持ってそれを用いるこ
とで患者に当てがってもよい。枠２９と把手２１とはその後、取り除かれてもよ
い。この実施態様においては支持層２９が備えられており、被覆材が支持枠で支
持されかつ取扱中にしわが寄るおそれがきわめて少ないので、いっそう寸法適合
性がよく、使用する上でおそらく洗練された被覆材２０がもたらされる。
図６〜図８はこの発明の第３実施態様を示す。この形態において、適切な材料
から成型された基部３２は、基部の縁領域２７の近傍にある基部の周りに延びる
リップ３３を含んでいる。リップ３３の外向縁２５は、蓋部分１２の壁１４との
間で締まり嵌めを形成するとともに、縁部といっしょにあるときは、不浸透性の
フィルム、テープ、接着手段またはヒートシールで重ね合わされることでさらに
シールされてもよい。
この被覆材システムは、２つの把手部分２１と支持層３４とを有する寸法適合
性のよい被覆材２０を備えている。支持層３４は、被覆材２０に比べて相対的に
堅い連続したポリマーフィルム（透明であるのが好ましい）である。支持層３４
も、被覆材の把手２１のすぐ下に配された２つの把手３１を有している。被覆材
２０は、２つの把手２１の間の領域で、支持層３４に取り外し可能に付着されて
いる。支持層３４は、少なくとも２つの把手３１の間の領域で、基部３２に取り
外し可能に付着されている。この被覆材システムがフラスコから取り外されるよ
うになるとき、基部３２は蓋部分１２から取り外される。次いで、被覆材システ
ムは、被覆材２０を基部３２から離して支持する支持層３４を持ち上げるために
把手３１の１つを引くことで、基部３２から取り外すことができる。把手３１・
２１は、患者に被覆材を運用することを補助するために、そのとき用いられても
よく、そのとき、支持層３４が被覆材の背面から取り外される。そのとき、把手
２１は、被覆材２０の残り部分から引き裂かれてもよい。
図９〜図１１において、培養容器４０は、上方へ延びる側壁４２を有する基部
４１と、蓋４３とを備えている。蓋４３は、ここでは、側壁４２から外方へ延出
するフランジ４４に剥離可能に接着されている透明な可撓性フィルムである。側
壁４２の内面からかつその内面をめぐってリブ４５が延びている。被覆材システ
ムの支持部４６は、比較的平坦な被覆材支持部分４７と、その周縁の周りに延出
する隆起部分４８とを含んでいる。
支持部４６は、半剛性の、すなわち、手による標準的な圧力によってわずかに変
形可能なポリマーのシートから形成されている。支持部４６には把手４９がある
。細胞培養基質フィルム５０と担持層５１とを備えた被覆材システムは、その縁
をめぐって支持部４６の下面にラミネートされている。細胞培養基質５０は、支
持部４６を通って延出する窓によって容器４０の内部に露出している。
この支持部は、それをわずかに変形させて隆起部分４８をリブ４５のすぐ下に
位置させることて、容器に嵌め込まれる。培養基質５０を取り外すためには、剥
離可能な蓋４３を把手４９を用いて取り外し、次いで、被覆材システムを担持す
る支持部４６をリブ４５から引き離す。その後、被覆材システムは支持部４６か
ら外されて患者に当てがわれてもよい。
図１２及び図１３において、支持部５２は、被覆材支持部分５３と隆起縁５４
とを備えている。被覆材支持部分５３は、基部に対して平坦に露出された枠の形
態であり、隆起縁５４は、被覆材支持部分５３に対して鈍角を形成するようにわ
ずかに角度が付けられている。その枠と縁とで、支持部５２のすぐ下に置かれた
創傷被覆材システムへ栄養素などを届けることのできる空間が区画される。支持
部は、成型されたポリエステルシートのような、弾性に富んだ半剛性の材料から
形成されている。基部５５は隆起部５６を含んでいる。隆起部５６は図１３に示
すように、支持部が基部に嵌まるときに縁５４の外向面５８に当たる内向面５７
を有している。
被覆材システム５９は、基部５５の中央部の上に置かれ、支持部５３が被覆材
システムを覆って置かれかつ面５７と面５８との係合によって定位置に保持され
ることで、定位置に保持される。もちろん、基部５５は、容器の一部を形成する
とともに、容器の他の部分、例えば側壁と一体であってもよく、あるいは別体と
して容器に組み入れられてもよい。
記載されたフラスコの実施態様はどのようなものでも、記載されたどのような
被覆材システムとともに用いてもよいということは、認識されるであろう。例え
ば、支持層を組み入れた被覆材システムを剥離可能な基部に付着させてもよい。
示された被覆材システムはどのようなものでも、１つまたは２つの把手を備えて
いてもよく、また把手を備えていなくてもよい。
この発明の製造例と使用例とは以下に説明される。
創傷被覆材の調整例
この発明に係る細胞培養システムを用いて細胞を付着させる１つの面を有する
創傷被覆材は、次のようにして調整することができる。
人間の表皮細胞の試料は、被覆材の対象受容体からの皮膚の生検から、あるい
は商業上の細胞系から調整される。アールの最小必須培地（ＭＥＭ）＋１０％胎
児牛血清からなる培養液は、前記のような細胞培養システム容器の中に入れられ
た。その容器は、容器の中へ上向きに対向する面を有し容器の基部に付着された
培養基質材を備える被覆材システムを含んでいた。培養
液は次のようにして作られた。
３４８ｍｌ ギブコＢＲＬにより供給されたアールの最小必須培地（Ｌグ
ルタミンなし）
４０ｍｌ 熱不活性化された胎児牛血清
４ｍｌ ギブコＢＲＬにより供給されたペニシリン／ストレプトマイ
シン（５０００ＩＵ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌ）
４ｍｌ 非必須アミノ酸
４ｍｌ ギブコＢＲＬにより供給されたＬグルタミン（１００ｘ）２
９９ｍＭ
次いで、細胞は、培養液３ｍｌ当たり約１０6個の濃度で、培養液に接種され
た。
培養液、細胞及び被覆材システムを含んだ容器は次いで、３７℃で３日間、イ
ンキュベートされた。この時間は、細胞が細胞培養基質材に付着して、亜集合体
（sub-confluence）に増殖するまでの時間である。この時間の経過後、培養液が
取り除かれ、被覆材システムが塩類溶液で洗浄された。次いで、被覆材システム
が前記のようにして容器から取り外された。それによって、この被覆材システム
は、１つの面に付着された培養表皮細胞の層を有する培養基質材を具備する被覆
材を備えていた。
細胞培養システムの製造例
ほぼ長方形の外観を有し、平坦な方形壁と直立した側壁とからなる容器は、プ
ラスチック成形の分野における当業者になじ
みの適切な設備を用いて、透明で剛性を有するポリスチレンから射出成形するこ
とで、形成されている。成型品は、頭部のねじ式閉鎖具を受けるために、雄ねじ
の切られたアクセス部を含んでいる。側壁は、平坦な壁からもっとも遠い側壁の
縁から外方へ延出するフランジを含んでいる。
フラスコのための剥離可能な基部は、厚さ１５０μｍの「メリネックス」（Ｍ
ＥＬＩＮＥＸ，ＩＣＩ ｐｌｃの登録商標）ＰＥＴフィルムがフランジの外縁内
における面積よりもわずかに大きくなるように切り取られることで、形成されて
いる。被覆材システムは、エチレン酢酸ビニルフィルムのシートを長方形被覆材
形状に切り取り、その被覆材の１つの縁に一片の接着テープを取り付けてその縁
に沿った把手を形成することで、形成されている。被覆材は次いで、把手と被覆
材の残り部分との間の線に沿ってミシン目が設けられる。これによって、把手は
、そのミシン目に沿って引き裂くことで、取り外される。被覆材は次いで、ラミ
ネート処理によってＰＥＴの基部材に取り付けられる。剥離可能な基部のＰＥＴ
は次いで、剥離可能な接着剤を用いて容器のフランジに接着される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Cell culture system The present invention relates to a substrate and a container used for a cell culture method. The invention particularly relates to a substrate for growing cells and then transferring them to a patient in need of a layer of cells. International Patent Application No. WO 91/13638 describes a wound dressing comprising a layer of polymeric material having a layer of cultured mammalian cells fixed on one side. Such dressings are suitable for use in treating partially thickened wounds, such as burns and skin donor sites. The cells are preferably epithelial cells that can be cultured from autologous skin cells obtained by biopsy or from other sources. Cells are cultured and grown in the presence of a polymer substrate to which they are attached. When the substrate is applied to the prepared site of the patient, the cells are transferred from the substrate to the patient and continue to proliferate to form a layer of epidermal cells. The dressing described describes culturing cells in contact with the surface of a polymeric dressing substrate, removing the substrate from the culture medium, and then applying the dressing to the patient so that the cells contact the patient's wound. To be applied. One object of the present invention is to provide an improved form of a substrate system and / or culture vessel to facilitate cell culture, fixation of cells to a substrate, and transfer of cells to a patient. is there. According to the present invention, (a) a container having an inner surface and an outer surface suitable for containing a liquid medium for culturing mammalian cells, and (b) a culture substrate material having no cytotoxicity, A wound dressing system comprising a culture substrate material having a first surface for attaching the isolated mammalian cells and a second surface opposite to the first surface, wherein the wound dressing system has a first surface of the substrate material. A cell culture system is provided that is removably secured to at least a portion of an inner surface of a container so as to be exposed inside the container. The container has a rectangular or polygonal shape, for example a hexagon, two flat opposing walls, and a side wall or a closable access provided on one of the side walls and extending therebetween. It may conveniently have the appearance of a known type of culture flask that generally has a wall. Alternatively, the container may have any other suitable shape, such as a dish with an optional closable access or lid, or a Petri dish or cylinder. The container may have a peelable lid that allows access to the interior of the container. The container is formed from a material that is non-toxic to cells, impermeable to liquids, and is preferably sterilizable. Conveniently, the material from which the container is formed is transparent, but this is not required to practice the invention. The container may be partially transparent or translucent, or partially opaque. Suitable materials for the container include polystyrene, polyester (eg, polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate), copolymers of one or the other material, eg, polyethylene terephthalate-co-isophthalate copolymer, polycarbonate, acrylic material, polyetherimide, polyolefin. , Ethylene ethyl acrylate copolymer, ethylene methyl acrylate copolymer, ethylene vinyl acetate copolymer, and other synthetic polymers. The container may include two or three members that fit together to form a substantially watertight container. Such a member may form a base and a lid. These members may be molded to form an interference fit. For example, one form of container has a shallow dish and a deep lid. The base has a molded lip formed around or near the periphery of the base, or a central raised portion having an edge that may form an interference fit with a portion of the lid. The deep lid has a flat top wall and a depending side wall shaped to form an interference fit with the molded lip or raised portion of the base. The culture substrate is attached to the flat part of the base by an optional support layer. The base and lid may be sealed together by shrink wrap or heat sealing to prevent leakage. The lid preferably has an access for introducing the medium and the cells into the container. The container may also be formed from a deep base having upwardly extending side walls and a shallow or flat lid. Such a configuration would be beneficial in terms of the water tightness of the container. There may optionally be a lip on the side wall, or there may be two cooperating lips, one on each part of the container. The container may include one or more walls that can be peeled from the remainder. The peelable wall may be sealed to the rest of the container by heat sealing or a peelable adhesive. The seal must be waterproof and must not allow the introduction of cytotoxic substances into the container. Preferably, the culture substrate is disposed on the inner surface or wall of the peelable wall. In a preferred form, the peelable wall forms a support layer for the culture substrate when peeled from the container. Instead, the support layer has one surface attached to the second surface of the culture substrate and the other surface attached to the inner surface of the peelable wall. The container may alternatively be formed as a single piece that can be cut off to form a removable portion when needed. In this embodiment, the container may be provided with a guide line or a weakening line to assist the cutting operation. The wound dressing system removably secured to the interior surface of the container includes a cell culture matrix material. Suitable cell culture substrate materials include those listed in International Patent Application No. WO 91/13638. That is, it can be a polyester, a polypropylene, a mixture or copolymer of vinyl acetate such as, for example, an ethylene-vinyl acetate copolymer, a polyvinylidene chloride, a polystyrene, a polybutadiene, a polyethylene ionomer such as, for example, SURLYN®, or a compound thereof. And mixtures thereof. Alternatively, a hydrophilic polymer such as a hydrophilic polyurethane may form the culture substrate. The culture substrate has a first surface for attachment of cultured mammalian cells. This surface may be treated by another material, such as a collagen-based material, or other means, such as a corona discharge or plasma treatment, to change its properties. The substrate material is preferably a film made of a polymer material. Preferably, the substrate material is one that can relatively conform to the contours of the body. The substrate may be continuous or perforated. The wound dressing system may include a dressing portion having one or more surfaces formed from a cell culture substrate material. Thus, the dressing system may include a dressing comprising more than one layer of material. At least one side of one layer of such a dressing will therefore form the first side of the culture substrate side for the cultured mammalian cells to attach. The wound dressing system further comprises a support layer removably attached to the culture substrate, preferably to the second surface of the substrate, at least in the area of or along or near the edge of the culture substrate. May be. The support layer may be in the form of a frame to support the culture substrate around at least an edge portion of the substrate material, or alternatively, may cover at least a major portion of the second surface and provide a support for the substrate material. It may be a continuous sheet or film attached to the second surface. The support layer may extend beyond the edge of the substrate material at one or more locations. The support layer may be formed on at least a portion of the container wall, or may be removably attached to the inner surface of the container. In a preferred embodiment of the present invention, the wound dressing system comprises a first surface for attachment of cultured mammalian cells and a first surface of a continuous polymer film forming a support layer for a culture substrate. A layer of cell culture substrate material having an opposing second surface removably attached over at least a larger portion. The opposite second surface of the support layer is removably attached to the inner surface of a cell culture vessel, for example, a culture flask. The culture substrate may be attached to the inner surface of the culture vessel by any suitable means that can remove the substrate from the inner surface without undue difficulty. Such means may include an adhesive material that is not toxic to or proliferates the cells. To avoid potentially introducing cytotoxic agents into the container, a non-adhesive attachment method may be used, and is preferred. Such non-adhesive means may include heat sealing, coaxial extrusion, laminating the substrate to the container. The selection method must be selected for the particular material used. The culture substrate should preferably be attached to the inner surface or the support layer of the container in such a way that at least a substantial part of the substrate remains flat when the cell culture is introduced into the container. This means that the surface of the culture substrate should not be wrinkled or deformed in order for foam of the culture to form between the substrate and the container. This is because undulations at the surface of the substrate, whatever it may be, help to accumulate cells in areas of the substrate that are lower than others. In most cases, this is undesirable even if some cell culture methods are advantageous or generous for uneven culture substrates. If the container is formed as a cylinder, the substrate is mounted around the cylindrical inner surface of the container such that it is curved rather than flat. These methods may also be suitable for bonding the culture substrate material to the support layer, or for bonding the support layer to the inner surface of the culture vessel. In an alternative form of the cell culture system, the wound dressing system includes a support having an engaging surface for resiliently engaging a corresponding surface provided in the container. The engagement surface of either the support or the container may be the surface of the protrusion extending from the respective support or container. The other of the engagement surfaces may form a groove portion. The support preferably comprises a layer of polymeric material formed to include a dressing support portion that contacts the wound dressing system during use, and an engagement portion that includes an engagement surface. The support may further comprise handle means for gripping when the support disengages from the engagement surface of the container. The support may or may not be adhered to the wound dressing system. The support may function to hold the wound dressing system in a flat configuration, for example, with respect to the base of the container. Alternatively, the support may be adhered to at least a part of the wound dressing system, preferably in the region of the edge of the dressing system. The support may have the appearance of a frame or framework and may have another structure that allows access to the culture substrate by the culture solution contained in the container. In one example of this form of the system, the container comprises a polygonal base having upwardly extending side walls and, optionally, a lid. The support is formed from a semi-rigid layer of a polymer film that may have a polygonal shape and dimensions similar to the base of the container. The support has a peripheral edge or flange that is one raised portion that extends to form a handle. The wound dressing system with the cell culture substrate is removably secured to the surface of the support. The container includes a lid or retaining ribs extending inwardly from the sidewall about at least a portion of the sidewall. The support is placed in the container such that its raised peripheral edge or flange is located immediately below the retaining ribs, thereby engaging the engagement surface of the support with the engagement surface of the container. You may. The dressing system may include indicia to indicate the correct orientation of the culture substrate for attachment to the patient. For example, the second side or support layer opposite the culture substrate may be so marked, for example, by printing, embossing, or other means. Alternatively, the support layer or substrate material may be colored. The dressing system may include a handle or knob on the culture substrate, support layer, or both. There may be more than one handle or knob. The handle or knob may be arranged such that the support layer or culture substrate can be removed from the container and / or the support layer can be removed from the substrate. The knob or handle is preferably located at or near one or more edges of the support layer and / or the culture substrate, and is preferably designed to be grasped and pulled by the user. If a handle or knob is provided on the culture substrate, the handle or knob can be removed. The handle or knob may be perforated in the area to be attached to the culture substrate to allow the handle to be torn, or alternatively, the handle or knob may be flipped over or attached to the substrate. And may be attached to the substrate by mechanical means such as clips. The handle or tab may be formed as an integral part of the support or substrate layer, or may be formed separately and connected to the relevant part of the dressing system. Handles or tabs may be colored or marked to aid identification. According to the invention, (a) forming a first portion of the container; (b) forming a second portion of the container; (c) forming a wound dressing system; Securing the wound dressing system to the first portion of the container by removable means; and (e) forming a liquid tight container having the wound dressing system secured to the interior surface. Fixing a first part and a second part together; a container having the first part and the second part; and a cell culture medium detachably fixed to at least one of the first part and the second part of the container. There is further provided a method of manufacturing a cell culture system comprising a wound dressing system comprising a dressing. The first and second portions may be secured to one another by welding or gluing, or by an interference fit. Additional fastening means such as clips, shrink wrap, tape, etc. may be used. Preferably, the first part and the second part are easily removable from each other. The first portion and / or the second portion may be formed by other means, such as injection molding, blow molding, pressure molding, or extrusion, or any combination of these methods. The wound dressing system is secured to the first and / or second portions of the container by releasable means such as laminating, including cold laminating, peelable bonding, or heat sealing. The present invention is further described below, by way of example only, with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 is an exploded perspective view of a first embodiment of the cell culture system according to the present invention. FIG. 2 is a perspective view of a part of the cell culture system shown in FIG. FIG. 3 is an exploded perspective view of the second embodiment of the present invention. FIG. 4 is a plan view of a portion of the system shown in FIG. FIG. 5 is a sectional view taken along line 5-5 in FIG. FIG. 6 is an exploded perspective view of the third embodiment of the present invention. FIG. 7 is a plan view of a portion of the system shown in FIG. FIG. 8 is a cross-sectional view taken along line 8-8 of FIG. FIG. 9 is a perspective view of still another embodiment of the present invention. FIG. 10 is a plan view of the system of FIG. FIG. 11 is a cross-sectional view taken along line 11-11 of FIG. FIG. 12 is a partial perspective view of still another embodiment of the present invention. FIG. 13 is a cross-sectional view of the system shown in FIG. In FIG. 1, a cell culture flask 10 has a shallow base 11 and a deep “lid” 12. The lid 12 is molded from transparent grade polystyrene that is nontoxic to cells, and has an upper wall 13 and side walls 14 depending therefrom. The side wall 14 is provided with an access portion 15 and a closure 16. Side wall 14 includes a flange 17 around its lower periphery. The shallow base 11 has a transparent film layer 18 at least as large as the area surrounded by the peripheral flange 17 of the lid part. The base 11 is sealed to the flange 17 of the lid part in such a way that it can be peeled off from the flange 17 in order to create a liquid-tight seal, for example by means of heat sealing or a peelable adhesive. The dressing system is releasably attached to the film 19, as shown in FIG. 2a. The dressing system comprises a culture substrate 20 forming a dressing and a handle portion 21. The handle portion can be removed from the dressing by tearing along perforations 22, as shown in FIG. 2b. The covering material 20 has an upper surface to which cells can adhere, that is, a surface that is not near the film 19. This surface may comprise, for example, a copolymer film of ethylene vinyl acetate treated by corona discharge. Since only the surface of the dressing 20 facing the base 19 receives cells, the dressing may be a combination of two or more layers. This cell culture system provides a dressing system attached to the base film 19 of the flask 10 and a base film 19 sealed to the flange 17. This flask has been sterilized. This flask is particularly suitable for preparing a wound dressing having a layer of cells attached to one side to transfer epidermal cells to the required area of the patient, and is used in that preparation. You may. Suitable methods for preparing such coatings are described below. Once the desired number of cells have been attached to the dressing, the culture may be drained from the container through mouth 15 and, if desired, the dressing system contained therein may be, for example, a conventional saline solution. You may wash using. The base 19 may then be removed from the flask by peeling it off to gain access to the dressing system. The dressing 20 can then be removed from the base film 19 by holding the handle 21 and peeling. The dressing may then be applied to the patient by directing the surface on which the cells are attached to the patient. The handle 21 may then be torn off along the perforation line 22. 3 to 5 show a second embodiment of the present invention. In this configuration, the container differs from the container in FIG. 1 in that it includes a molded base 23 that includes a raised portion 24 located in a central region of the base. The ridge 25 of the raised portion is dimensioned such that the lower surface of the flange 17 rests on the edge region 27 of the base to form an interference fit around the lower edge 26 of the side wall 14 of the lid portion 12. The base 23 is molded from a material that is not toxic to cells, preferably a transparent material. The dressing system 28 includes a dressing 20 disposed on a central raised portion 24 of a base 23 and having a handle region 21 and a framed support layer 29. The support layer 29 is provided between the covering material 20 and the base 23. The support layer 29 includes a handle area 31. As shown in FIG. 5, the covering material 20 is detachably attached to the base 23 so as to cover a central portion in a region bounded by the frame 29. The edge of the dressing 20 is removably attached to and supported by the frame 29. The flask is provided with a base 23 fitted in place with respect to the lid 12 by an interference fit of the rim 25 on the wall 14. The rims of the flasks are preferably shrink-wrapped or taped together to form a watertight flask. When the dressing system needs to be removed for application to the patient, any overwrap is removed and the corners 30 as knobs or handles are optionally provided to assist in removing the base 23. , The base 23 is removed from the lid 12. The dressing system is then removed by pulling up on the handles 21, 31 to release the dressing 20 from the base 23. The dressing system may then be applied to the patient by using it with the top of the frame to apply the dressing to the desired location on the body. The frame 29 and the handle 21 may then be removed. In this embodiment, a support layer 29 is provided, which is more dimensionally adaptable and possibly more sophisticated in use since the coating is supported by the support frame and the risk of wrinkling during handling is very low. Material 20 is provided. 6 to 8 show a third embodiment of the present invention. In this configuration, the base 32 molded from a suitable material includes a lip 33 extending around the base near the edge region 27 of the base. The outward edge 25 of the lip 33 forms an interference fit with the wall 14 of the lid portion 12 and, when together with the edge, is overlaid with an impermeable film, tape, adhesive means or heat seal. It may be further sealed. The dressing system comprises a dimensionally compatible dressing 20 having two handle portions 21 and a support layer 34. The support layer 34 is a continuous polymer film (preferably transparent) that is relatively stiff relative to the covering 20. The support layer 34 also has two handles 31 arranged directly below the dressing handle 21. The dressing 20 is detachably attached to the support layer 34 in the area between the two handles 21. The support layer 34 is removably attached to the base 32 in the area between the at least two handles 31. When the dressing system is to be removed from the flask, the base 32 is removed from the lid portion 12. The dressing system can then be removed from the base 32 by pulling on one of the handles 31 to lift the support layer 34 that supports the dressing 20 away from the base 32. The handles 31 and 21 may then be used to assist the patient in applying the dressing, when the support layer 34 is removed from the back of the dressing. At that time, the handle 21 may be torn from the remaining portion of the covering material 20. 9 to 11, the culture vessel 40 includes a base 41 having a side wall 42 extending upward and a lid 43. The lid 43 is here a transparent flexible film that is releasably adhered to a flange 44 that extends outwardly from the side wall 42. A rib 45 extends from and about the inner surface of the side wall 42. The dressing system support 46 includes a relatively flat dressing support portion 47 and a raised portion 48 extending around its periphery. The support 46 is formed from a sheet of polymer that is semi-rigid, ie, slightly deformable by standard hand pressure. The support part 46 has a handle 49. A dressing system comprising a cell culture substrate film 50 and a carrier layer 51 is laminated to the lower surface of the support 46 over its edges. The cell culture substrate 50 is exposed inside the container 40 by a window extending through the support 46. This support fits into the container by slightly deforming it so that the raised portion 48 is located just below the rib 45. To remove the culture substrate 50, the peelable lid 43 is removed using a handle 49, and then the support 46 carrying the dressing system is pulled away from the rib 45. Thereafter, the dressing system may be removed from support 46 and applied to the patient. In FIGS. 12 and 13, the support portion 52 includes a coating material support portion 53 and a raised edge 54. The dressing support portion 53 is in the form of a frame that is exposed flat to the base, and the raised rim 54 is slightly angled to form an obtuse angle with the dressing support portion 53. The frame and rim define a space in which nutrients and the like can be delivered to the wound dressing system placed just below the support 52. The support is made of an elastic, semi-rigid material, such as a molded polyester sheet. The base 55 includes a raised portion 56. As shown in FIG. 13, the raised portion 56 has an inward surface 57 that contacts the outward surface 58 of the edge 54 when the support fits into the base. The dressing system 59 is positioned over the central portion of the base 55, and the support 53 is placed over the dressing system and held in place by the engagement of the surfaces 57 and 58 to provide a fixed position. Held in position. Of course, the base 55 may form part of the container and be integral with the other part of the container, for example the side wall, or may be incorporated into the container separately. It will be appreciated that any of the described flask embodiments may be used with any of the dressing systems described. For example, a dressing system incorporating a support layer may be applied to a peelable base. Any dressing system shown may be provided with one or two handles and may not be provided. Examples of manufacture and use of the present invention will be described below. Example of adjusting wound dressing A wound dressing having one surface to which cells are attached using the cell culture system according to the present invention can be prepared as follows. Samples of human epidermal cells are prepared from skin biopsies from the dressing's target recipient or from a commercial cell line. A culture consisting of Earl's Minimum Essential Medium (MEM) + 10% fetal calf serum was placed in a cell culture system container as described above. The vessel included a dressing system having a culture substrate material having an upwardly facing surface into the vessel and attached to the base of the vessel. The culture solution was prepared as follows. 348 ml Earl's minimum essential medium (without L-glutamine) supplied by Gibco BRL 40 ml Heat-inactivated fetal calf serum 4 ml Penicillin / streptomycin (5000 IU / ml to 5000 μg / ml) supplied by Gibco BRL 4 ml Non-essential amino acids 4 ml L-glutamine (100 ×) 2 99 mM supplied by Gibco BRL The cells were then treated with approximately 6 Cultures were inoculated at individual concentrations. The container containing the culture, cells and dressing system was then incubated at 37 ° C. for 3 days. This time is the time it takes for cells to attach to the cell culture substrate material and proliferate into sub-confluence. After this time, the culture was removed and the dressing system was washed with saline. The dressing system was then removed from the container as described above. Thereby, the dressing system was provided with a dressing comprising a culture substrate material having a layer of cultured epidermal cells attached to one surface. Example of manufacturing cell culture system Containers having a substantially rectangular appearance, consisting of flat square walls and upright side walls, can be injection molded from transparent, rigid polystyrene using suitable equipment familiar to those skilled in the field of plastic molding. In, is formed. The molding includes an externally threaded access for receiving a threaded closure on the head. The side wall includes a flange extending outwardly from an edge of the side wall furthest from the flat wall. The peelable base for the flask is formed by cutting a 150 μm thick “Melinex” (registered trademark of M ELINEX, ICI plc) PET film to be slightly larger than the area within the outer edge of the flange. Have been. The dressing system is formed by cutting a sheet of ethylene vinyl acetate film into a rectangular dressing shape and attaching a piece of adhesive tape to one edge of the dressing to form a grip along that edge. . The dressing is then perforated along the line between the handle and the rest of the dressing. Thus, the handle is detached by tearing along the perforation. The dressing is then attached to the PET base by lamination. The peelable base PET is then glued to the container flange using a peelable adhesive.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
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，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
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ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
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，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，
ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ
，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，
ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 リチャードソン，マーク クリストファー
イギリス、ノース ヨークシャー ワイオ
ー６ １エイチエス、ヨーク、ハビー、メ
イン ストリート、ピア トゥリー コテ
ッジ（番地なし)
(72)発明者 ブロット，パトリック ルイス
イギリス、ヨーク ワイオー１ ３エイチ
ダブリュ、ニューランド パーク クロー
ズ ３
(72)発明者 マシューズ，ジェイン ブリジット
イギリス、ヨーク ワイオー２ １ディー
ピー、サウス バンク アベニュー 84────────────────────────────────────────────────── ───
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S
D, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG)
, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT
, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA,
CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, F
I, GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP
, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR,
LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M
W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD
, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR,
TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW
(72) Inventor Richardson, Mark Christopher
North Yorkshire Wyo, United Kingdom
-6 1H, York, Hubby,
Inn Street, Pier Tree Cotte
Judge (no address)
(72) Inventor Blot, Patrick Lewis
United Kingdom, York Wyo 13 H
W. Newland Park Claw
3
(72) Inventor Matthews, Jane Bridget
United Kingdom, York Wyo 2 1D
P, South Bank Avenue 84